EP1248799A2 - Glycoproteine d'enveloppe du vih modifiee chimiquement - Google Patents

Glycoproteine d'enveloppe du vih modifiee chimiquement

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Publication number
EP1248799A2
EP1248799A2 EP00991292A EP00991292A EP1248799A2 EP 1248799 A2 EP1248799 A2 EP 1248799A2 EP 00991292 A EP00991292 A EP 00991292A EP 00991292 A EP00991292 A EP 00991292A EP 1248799 A2 EP1248799 A2 EP 1248799A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
moles
glycoprotein
chemically modified
molar ratio
groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00991292A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Florence Boudet
Michel Chevalier
Jean Dubayle
Raphaelle El Habib
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur Inc
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur SA filed Critical Aventis Pasteur SA
Publication of EP1248799A2 publication Critical patent/EP1248799A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the present invention is a new antigen and its use in an NIH vaccine and more particularly relates to a chemically modified NIH envelope glycoprotein capable of inducing antibodies neutralizing primary NIH isolates.
  • the NIH envelope glycoprotein has been shown to be an oligomer composed of an extracellular domain, gpl20, and a transmembrane domain gp41 (Gallaher et al AIDS Research & Human Retro viruses 11 (2): 191- 202, 1995). Léonard et al showed that gpl60 included 20 cysteine residues forming 10 disulfide bridges.
  • NIH binding and cell membrane fusion and / or exposing initially hidden epitopes have proposed to modify the structure of gpl60 in order to obtain a protein closer to that present on the surface of the virus during the stage.
  • RAXaCasse et al (Science, 283: 357-362, 01/15/1999) described the preparation of a vaccine comprising whole cells fixed to formaldehyde which would reproduce the transient structure of envelope protein / CD4 / co-receptor present at during HIV infection. The use of such a preparation would lead in a transgenic mouse model to the neutralization of many primary HIV isolates. The reproduction of this experiment could not be carried out.
  • Neutralizing antibody responses as described in the prior art mentioned above, have the disadvantage of either being specific for a given serotype, or of being incapable of leading to the neutralization of primary isolates of HTV. Due to the very large genetic variability of the AIDS virus, such immune responses are therefore of little or no interest from a vaccine point of view. There is therefore a need for a vaccine capable of inducing neutralizing immunity against the primary HIV isolates.
  • the present invention therefore relates to an HIV envelope glycoprotein in purified form capable of being obtained by a process comprising the following steps:
  • the glycoprotein (1) is in dimeric form and preferably corresponds to a gpl60MN / LAI.
  • step (2) is implemented by adding a reducing agent in a molar ratio (moles of reducing agent) / (moles of sulfhydryl groups) from 1 to 500 times.
  • step (3) is implemented by adding an alkylating agent in a molar ratio (moles of alkylating agent)
  • EM is used as an alkylating agent in a molar ratio (moles of NEM) / (moles of sulfhydryl groups) from 1 to 100, preferably 10.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a mixture of chemically modified proteins as defined above.
  • the present invention relates to an antibody directed against a chemically modified envelope glycoprotein as defined above; this antibody preferably being monoclonal.
  • the subject of the present invention is an HIV vaccine comprising:
  • the vaccine according to the invention is used to induce antibodies neutralizing the VEH in a human subject as a therapeutic or prophylactic.
  • the present invention relates to a diagnostic method comprising bringing a biological fluid into contact with an antibody as defined above and determining the immune complexes thus formed.
  • envelope glycoprotein is meant in the context of the present invention a glycosylated protein gpl60, gp 120 or gp 140.
  • the envelope protein is in monomeric, dimeric or multimeric form, it will preferably be in dimeric form.
  • This envelope protein may or may not be a recombinant protein and may also consist of a hybrid protein; the hybrid term being used here in its conventional acceptance, namely a protein comprising sequences originating from envelope proteins of different strains of virus adapted in the laboratory or from primary isolates from NIH.
  • Envelope proteins whose amino acid sequence differs from that of the native protein by mutation (s), deletion (s), insertion (s), or substitution (s) of amino acid (s) are also included in the definition above as long as these modifications do not eliminate the formation of antibodies capable of neutralizing primary isolates of NIH. This characteristic can easily be determined using the tests provided in the present application.
  • the gpl60M ⁇ / LAI as described in Example 1 below;
  • the envelope glycoprotein of step (1) is used in a substantially purified isolated form.
  • isolated and substantially purified protein means a protein having a purity level of at least 75%, preferably at least 80%, as determined by the method of electrophoresis on acrylamide gel (SDS PAGE) (LAEMMLI UK 1970. Nature 27: 680-685.) And densitometric analysis. Reference is made in the present application to such a protein under the term of “protein in purified form”.
  • Various methods for purifying the NEH envelope protein, natural or recombinant have been described in the literature. One can refer for example to the articles of Pialoux et al (Aids Res. Hum. Retr., 11, 373-381, 1995) and of Sakmon-Ceron et al (Aids Res. Hum. Retr., 12, 1479-1486 , 1995) or in the text WO91 / 13906.
  • glycoproteins thus purified have inter-chain disulfide bridges, regardless of the nature of the host or of the vector used.
  • the glycoproteins thus associate in part in covalent dimers visible on SDS PAGE gel.
  • the envelope glycoprotein in purified form is first subjected to a step of partial or total reduction of the intra-chain and / or inter-chain disulfide bridges in which at least one disulfide bridge is reduced.
  • the reduction step is carried out by reaction of the envelope glycoprotein of step (1) with a reducing agent, at ambient temperature and with gentle stirring.
  • the reducing agent can be chosen from the molecules of dithiothreitol (DIT), beta-mercaptoethanol, reduced glutathione and sodium borohydride, for example.
  • the quantity of reducing agent expressed by the molar ratio (moles of reducing agent) / (moles of sulfhydryl groups) varies between 1 and 0.5 ⁇ 10 4 and preferably corresponds to a molar ratio of 50.
  • the reduction is carried out works at a basic pH of 7 to 10, preferably at a pH of 7.8. Control of the pH value is obtained by adding a buffer; any suitable buffer for this can be used.
  • a sodium phosphate buffer is used.
  • the reaction is carried out for approximately 15 minutes, the molar ratio moles of DTT / moles of SH used is from 1 to 0.510 4 and preferably 50 times.
  • the duration of the reduction reaction is variable and depends on the molar ratio and the reducing agent chosen.
  • the conditions of the reduction reaction allowing the reduction of at least one disulfide bridge are easily determinable by a person skilled in the art from the teaching provided here.
  • the reduction can be checked by SDS PAGE analysis insofar as the reduction of the interchain disulphide bridges transforms the dimers into monomers. Finer controls of this reduction are possible by using N-ethyl-maleimide (NEM) labeled with 14 C or more simply by the use of a colorimetric assay based on dithio-nitro-benzoic acid (DTNB).
  • NEM N-ethyl-maleimide
  • DTNB dithio-nitro-benzoic acid
  • alkylating agent in the context of the present invention means any reagent capable of reacting specifically with the -SH groups to give a covalent bond.
  • N-ethyl-maleimide N-ethyl-maleimide
  • iodo-acetamide N-ethyl-maleimide
  • the amount of alkylating agent used, expressed by the molar ratio (moles of alkylating agent) / (moles of sulfydryl groups) is from 1 to 100 times, preferably from 10 to 100 times. It is necessary to ensure that there is an excess of alkylating agent relative to the reducing agent to neutralize the action of the latter.
  • the alkylation reaction is carried out at a pH of 6 to 8, preferably at a pH of 7, at room temperature.
  • Control of the pH value is obtained by adding a buffer; any suitable buffer for this can be used.
  • a sodium phosphate buffer is used.
  • the conditions of the alkylation reaction allowing the alkylation of at least two -SH groups are readily determinable by a person skilled in the art from the teaching provided here.
  • the alkylation can be controlled by the use of 14 C-NEM as described below in the examples.
  • the product from step (3) can be subjected to an oxidation step during which the remaining free sulfhydryl groups are oxidized in the presence of an oxidizing agent. If free sulfhydryl groups are still present at the end of step (3), an oxidation step is preferably carried out before the denaturation step.
  • the term “oxidizing agent” means any molecule linked by disulfide bridges such as oxidized glutathione or cystine, but it may also be other molecules such as quinones, oxygen, etc.
  • the reduced glutathione / oxidized glutathione mixture In this mixture, the reduced glutathione allows the disulfide bridges to dissociate to reassociate in a more stable thermodynamic state.
  • the oxidation reaction is carried out at a pH of 7 to 9, preferably at pH 7.8, at a temperature of 4 to 25 ° C.
  • the oxidizing agent is used in a molar ratio (moles of oxidizing agent) / (moles of sulfhydryl groups) of 50 to 5000, preferably 500.
  • the reaction is carried out with an oxidized glutathione level from 1 to 1000 times higher than the reduced glutathione level.
  • a ratio of 500 molecules of oxidized glutathione per mole of gpl60MN / LAI can be advantageously used.
  • the duration of the oxidation step can vary between 5 minutes and 24 hours and preferably corresponds to 30 minutes.
  • the conditions of the oxidation reaction allowing the oxidation of the free sulfhydryl groups are easily determinable by a person skilled in the art from the teaching provided here. Oxidation can be controlled by a process similar to that used for the control of the reduction step, paying close attention to the positive controls of the test.
  • the product from step (3) or (4) is then denatured by the action of one or more denaturing agent (s). Used at a rate of 0.1 to 5% ( weight / vol) so as to modify the conformation of the glycoprotein.
  • one or more detergent (s) preferably ionic (s) or one or more chaotropic agent (s) can be used for example.
  • ionic detergents the salts of dodecyl sulfate, in particular sodium dodecyl sulfate (SDS) or of lithium, the dioctyl sulfosuccinate salts (of sodium, for example), the cetryltrimethylammonium salts (of bromine , for example), DTAB, cetylpyridinium (chlorine, for example) salts, N-dodecyl- or N-tetradecyl-sulfobetaine, zwittergents 3-14, and 3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylamino] -l-propane sulfonate (CHAPS), and the following neutral detergent (s): tween20®, tween80®, octylglucoside, lauryl-maltoside, hecameg®, lauryl-dimethylamine,
  • SDS sodium dodecyl sulf
  • SDS is preferably used in the context of the present invention, in particular at a concentration of 0.1% (weight / vol.).
  • the denaturation reaction is carried out at neutral or alkaline pH at room temperature.
  • Denaturation can be controlled by spectrophotometric measurement by measuring the absorbance of the tyrosine, phenylalanine and tryptophan residues of the molecule or by circular dichroism.
  • the glycoprotein thus denatured is then subjected to a renaturation step which can be carried out by dialysis against 1000 volumes of a buffer free of detergent, preferably a phosphate buffer containing sodium chloride (PBS).
  • a buffer free of detergent preferably a phosphate buffer containing sodium chloride (PBS).
  • the efficiency of the dialysis step can be easily determined by colorimetric analysis of the residual oxidizing agents or by HPLC by showing the disappearance of certain reagents used in the manufacture of the antigen.
  • the dialysis can be carried out overnight at room temperature, with gentle stirring, against a PB S buffer.
  • the gpl60MN LAI in purified form (1) is chemically modified by a process comprising steps of: (2) reduction by incubation with DTT in a molar ratio (moles of DTT) / (moles of SH groups) of 50 at a pH of 7, for a period of approximately 15 minutes at room temperature, ( 3) alkylation by incubation with NEM in a molar ratio (moles of NEM) / (moles of SH groups) of 10 at a pH of 7, for a period of approximately 15 minutes, at room temperature, (4) oxidation by incubation of the product of step (3) with a reduced glutathione / oxidized glutathione mixture in a molar ratio (moles of oxidized glutathione) / (moles of SH groups) of 500 with a reduced glutathione / oxidized glutathione ratio of 10, to pH 7.8 for approximately 30 minutes, (5) denat uration of the product from step 4
  • the present invention relates to a composition comprising a mixture of chemically modified glycoproteins as defined above.
  • these chemically modified glycoproteins can be differentiated, for example, by the nature of the constitutive envelope glycoprotein (for example glycoproteins originating from different primary strains or isolates, some of which may also correspond to hybrid proteins) or by their preparation process; the parameters of the latter may vary, such as the concentration and the nature of the reagents. Any conceivable mixture comprising one or more chemically modified envelope glycoprotein (s) is included within the scope of the present invention.
  • the subject of the present invention is also the antibodies directed against the chemically modified envelope glycoproteins as described above.
  • the preparation of such antibodies is carried out by conventional techniques for obtaining polyclonal and monoclonal antibodies (Kohler G et al European Journal of Immunology. 6 (7): 511-9, 1976 Jul). These antibodies are particularly suitable for use in a passive immunization scheme.
  • the present invention also relates to vaccines useful for therapeutic and prophylactic purposes.
  • the vaccines according to the present invention comprise a chemically modified envelope glycoprotein as defined above or a mixture of such glycoproteins, a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and optionally an adjuvant.
  • the vaccine according to the present invention can therefore contain a single type of chemically modified envelope glycoprotein or a mixture of various types of chemically modified envelope glycoprotein as defined above.
  • the vaccine according to the present invention comprises chemically modified envelope anti-glycoprotein antibodies.
  • any mixture of antibodies, monoclonal or polyclonal, directed against different parts of the same chemically modified envelope glycoprotein or against different chemically modified envelope glycoproteins is part of the present invention.
  • the amount of chemically modified envelope glycoprotein in the vaccine according to the present invention depends on many parameters as will be understood by those skilled in the art, such as the nature of the chemically modified glycoprotein, the route of administration and the state of the person to be treated (weight, age, clinical condition, etc.).
  • An appropriate amount is an amount such that a humoral immune response capable of neutralizing primary HIV isolates is induced after administration of the latter.
  • the vaccines according to the present invention may also contain an adjuvant. Any pharmaceutically acceptable adjuvant or mixture of adjuvants may be used for this purpose.
  • Conventional auxiliary agents such as wetting agents, fillers, emulsifiers, buffers etc. can also be added to the vaccine according to the invention.
  • the vaccines according to the present invention can be prepared by any conventional method known to those skilled in the art.
  • the antigens are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, such as water or phosphate-buffered saline.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent such as water or phosphate-buffered saline.
  • the support or diluent will be selected according to the dosage form chosen, method and route of administration as well as pharmaceutical practice.
  • the appropriate carriers or diluents as well as the pharmaceutical formulation requirements are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, which represents a reference work in this field.
  • the vaccines mentioned above can be administered by any conventional route, usually used in the field of vaccines, such as the parenteral route (intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.).
  • the administration can be carried out by the injection of a single dose or of repeated doses, for example on D0, at 1 month, at 3 months, at 6 months and at 12 months.
  • the present invention also intends to cover a chemically modified envelope glycoprotein as defined above and the vaccine containing such a glycoprotein or mixture of such glycoproteins for their use for inducing antibodies neutralizing primary isolates of VEH.
  • the Applicant has surprisingly demonstrated that the chemically modified envelope glycoproteins according to the invention are capable, after administration, of inducing antibodies capable of neutralizing primary isolates of HIV. These antigens therefore represent valuable candidates for the development of a vaccine usable for the protection and / or treatment of a large number, even all of those at risk or infected with HIV.
  • Example 1 Preparation of the gpl60MN / LA1 glycoprotein
  • the gpl60MN / LAI glycoprotein is a soluble hybrid glycoprotein in which the gpl20 subunit derives from VEH-1 MN and the gp41 subunit derives from the LAI isolate.
  • the DNA sequences corresponding to these two components are fused using of a Smal restriction site which does not modify either the amino acid sequence of gpl20 or that of gp41. The preparation of this protein is described below.
  • sequence coding for gpl20MN is amplified by PCR from the SupT1 cells infected with VEH-MN, using oligonucleotides introducing the restriction sites SphI and Smal respectively immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide and upstream of the cleavage sites located between gpl20 and gp41.
  • the sequence coding for the gp41 subunit is produced as follows: the complete sequence coding for the env protein of VEH 1 -LAI is placed under the control of the promoter pH5R of the vaccinia virus. Several modifications are introduced in this coding region.
  • a SphI restriction site is created immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide, without alteration of the amino acid sequence.
  • a Smal restriction site is created immediately upstream of the sequence coding for the cleavage sites located between gpl20 and gp41, without alteration of the amino acid sequence.
  • the two cleavage sites in position 507-516 were mutated (ie the original sequence KRR ... REKR has been transferred to QNH ... QEHN).
  • the plasmid into which the LAI sequence is inserted between the homologous regions of the TK gene of the vaccinia virus is cut with SphI and SmaI then ligated with the sequence of gpl20MN.
  • the WTG9150 virus is then constructed by conventional homologous recombination.
  • the recombinant vaccinia virus vector WTG9150 thus produced is used for the production of gpl60MN / LAI.
  • the vector is propagated on BHK21 cells.
  • Gpl60 MN / LAI is produced on BHK21 cells infected for 72 hours with the recombinant vaccinia virus NVTG9150.
  • the supernatant is collected, filtered and ultrafiltered to give the concentrated harvest.
  • the purification takes place in three stages. Certain contaminants of gpl60 M ⁇ / LAI are fixed on an anion exchange column.
  • the unfixed fraction is chromatographed on an immunoafinity column using a monoclonal antibody.
  • the gpl60 MN / LAI is desalted by gel filtration chromatography in PBS buffer. To inactivate the residual vaccinia, the glycoprotein is heated at 60 ° C for 1 hour before being filtered to give the purified antigen.
  • concentration of gpl60 MN / LAI used for the preparation of the chemically modified proteins is 1 mg / ml of proteins (determined by colorimetric assay kit BCA, Pierce TM) and its purity of 77% (determined by SDS PAGE electrophoresis and analysis by optical densitometry using the ScannerGS700 from Biorad TM).
  • the glycoprotein is in a phosphate buffer of the following composition: 137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; Na 2 HPO 4 6.5 mM; KH 2 PO 1.5 mM; pH 7.4 (PBS).
  • the gpl ⁇ OMNZLAI thus obtained, has a molecular weight of 140kD in SDS-PAGE.
  • Example 2 Preparation of chemically modified glycoproteins according to the invention From 172 ⁇ l of purified gp160 (1 mg / ml), 21 ⁇ l of 1M sodium phosphate buffer pH7.8 is added; 2 ⁇ l of distilled water and 19.5 ⁇ l of 50 mM dithiothreitol (DTT), the mixture is vortexed for 15 s, and incubated for 15 min at 25 ° C.
  • DTT dithiothreitol
  • 16 ⁇ l of 1M sodium phosphate buffer (NaH2PO4) are added to lower the pH to 7, then the sulfhydryl groups are blocked by the addition of 14 ⁇ l of 100 mM N-ethyl-maleimide (NEM) and incubated for 15 min at 25 ° vs.
  • the sulfhydryl groups are reoxidized by addition of sodium phosphate buffer at pH 7.8 and a mixture of 4.8 ⁇ l of glutathione reduced to 150 mM and 71.6 ⁇ l of oxidized glutathione at 100 mM is added, the mixture is incubated for 30 min at 25 ° C.
  • the gp160 dimers are then dissociated by the addition of 12 ⁇ l of sodium dodecyl sulfate (SDS) at 3%.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the sample is placed in a dialysis cassette with a capacity of 3 ml against 1000 volumes of PBS buffer (without detergent). Dialysis is carried out overnight at room temperature with gentle stirring.
  • the gpl60 thus treated are found in the form of monomers and dimers.
  • the protein thus obtained is called BA29.
  • Example 3 Preparation of chemically modified glycoproteins with variation in the concentration of alkylating agent.
  • the BA53 preparation is carried out according to the method described in Example 2 for BA29 in which the NEM has been omitted.
  • the BA55 preparation is carried out according to the method described in Example 2 for the
  • the BA56 preparation is carried out according to the method described in Example 2 for BA29 in which the NEM concentration used is 10 times greater than that indicated in Example 2.
  • antigens were prepared in parallel to be injected into animals and for a biochemical measurement of the quantity of NEM fixed per molecule of gpl60. For this, the NEM marked with 14 C was used. About 4MBq of 14 C NEM was added per mM of
  • Non-radioactive EOD The radioactivity measured is then directly proportional to the concentration of NEM. It was checked during the final dialysis step that the elimination of radioactive NEM was well done exhaustively and that only the radioactivity covalently attached to the protein remained in the sample. Aliquots of the antigens produced according to the different protocols were then placed in the scintillation vials and the ⁇ radiation emitted by the decay of the 1 C atoms was recorded for one minute. The radioactivity counts are directly proportional to the amount of NEM fixed. Knowing the amount of gpl60 present in each aliquot, the ratio of the number of NEM molecules per molecule of g l60 could be established.
  • the results obtained show that unreduced gpl60 cannot fix NEM (control).
  • the gpl60 treated according to the invention (BA29) fixes 8 molecules of NEM by gpl60 molecule. Therefore, there are at least 4 modified disulfide bridges inside this antigen. It has been shown that the use of a concentration of NEM ten times lower (BA55) made it possible to fix the NEM only on 2 (1.6 to 1.8) sulfydryls per molecule of gpl60. It is possible that only one disulfide bridge is modified within this antigen. The use of a concentration of NEM ten times higher (BA56) has been shown to abolish the immunological properties of the molecule.
  • the chemically modified glycoproteins are diluted sterile in a stabilizing medium and then adsorbed on aluminum phosphate.
  • the stabilizing mixture is composed of a mixture of amino acids and "Dulbecco's Modified Eagle" medium.
  • DMEM-F12 Medium “DMEM-F12 (Gibco, France).
  • the chemically modified glycoproteins prepared in Examples 2-4 (BA29, BA29 (7.8), BA52, BA53 and BA55 and BA56) are diluted in the stabilizer mixture before an equal volume 6.3 mg / ml aluminum phosphate in PBS is added to this mixture.
  • the chemically modified glycoproteins named BA53 and BA52 are obtained by using the method described in Example 2 for BA29 in which the step of alkylation with NEM has been omitted (preparation BA53); or the denaturation step by SDS has been omitted (preparation BA52).
  • a group of 5 female Dunkin-Hartley (Charles River) albino guinea pigs of 400 g is used. Each guinea pig receives 5 ⁇ g of antigen intramuscularly, in the right and left thighs (0.5 ml in each thigh) on Dl and D29. A volume of 3 ml of blood is taken by cardiac puncture under anesthesia on days -1, 28 and 56 (final bleeding about 30 ml).
  • the guinea pig sera thus obtained were analyzed by ELISA assay against the native gpl60 MN / LAI.
  • the gpl60 MN / LAI is immobilized on the solid phase at a rate of 130 ng per well for 1 hour at 37 ° C.
  • the plate is emptied then saturated with a PBS buffer, 0.1% Tween 20 containing 5% of skimmed milk powder.
  • Each serum is diluted on the plate according to serial dilutions of reason 3, between l / 100 e and 1/100000 6 as the case may be, in saturation buffer and incubated for 1 hour 30 minutes at 37 ° C.
  • a rabbit anti-guinea pig antibody (Sigma, St Louis) coupled with peroxidase, diluted to 1/3000 e , makes it possible to reveal the presence of antibodies specific for gpl ⁇ OMNZLAI.
  • the titles are calculated automatically by the reader from the optical density read and from the straight line obtained with a standard serum.
  • the mean values of the immunoglobulin specific for gp160 MN / LAI for each group of guinea pigs are between 10. 5 and 10. 6 .
  • the control group injected with untreated gpl60 MN / LAI is identified under the code BAI.
  • Preparations BA55 and BA29 induce specific antibodies; BA29 leading to a titer higher than 5.10 5 . No specific antibody to gpl60 MN / LAI was detected in the pre-immune sera.
  • the figures indicate the inverse of the dilution of the serum for which neutralization was observed.
  • the antigens according to the present invention are produced from a gpl60MN / LAI, from an NIH-1 virus adapted in the laboratory.
  • these antigens make it possible to induce in the immunized animal a humoral response capable of neutralizing primary isolates of the NEH-1 virus, which constitutes an improvement compared to current knowledge on this subject.

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Abstract

La présente invention a pour objet une glycoprotéine d'enveloppe du VIH sous forme purifiée susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivants: (1) obtention d'une glycoprotéine d'enveloppe sous forme purifiée, (2) réduction d'au moins un pont disulfure de la protéine de l'étape (1), (3) alkylation d'au moins deux groupes sulfhydryls libres, (4) éventuellement oxydation des groupes sulfhydryls libres restants, (5) dénaturation et (6) renaturation et son utilisation dans un vaccin contre le VIH utilisable pour induire des anticorps neutralisants le VIH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique.

Description

Glycoprotéine d'enveloppe du VTH modifiée chimiquement
La présente invention a pour objet un nouvel antigène et son utilisation dans un vaccin contre le NIH et concerne plus particulièrement une glycoprotéine d'enveloppe du NIH modifiée chimiquement capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du NIH.
Ces travaux ont été co-financés par l'AΝRS.
Au cours des dix dernières années plusieurs vaccins contre le NIH ont été proposés et testés chez le singe ou chez l'homme. Aucun des vaccins proposés à ce jour n'a apporté de solution totalement satisfaisante. Les obstacles majeurs que sont la grande variabilité génétique du virus (Saragosti S., 1997, Virologie, 1 : 313-320) et la faible exposition au système immunitaire d'épitopes viraux susceptibles d'être neutralisés, freinent considérablement l'élaboration d'un vaccin permettant l'induction d'une immunité neutralisante. La glycoprotéine d'enveloppe du NIH qui est requise pour conférer au virus son caractère infectieux représente la cible des anticorps neutralisants. Ces caractéristiques ont fait de cette dernière un sujet d'investigations intenses. Il a été montré que la glycoprotéine d'enveloppe du NIH est un oligomère composé d'un domaine extracellulaire, la gpl20, et d'un domaine transmembranaire la gp41 (Gallaher et al AIDS Research & Human Rétro viruses 11(2): 191-202, 1995). Léonard et al ont montré que la gpl60 comprenait 20 résidus cystéine formant 10 ponts disulfures.
Différentes approches visant à l'obtention d'anticorps neutralisant les isolats primaires du NIH ont été proposées mais aucune n'a apporté de solution réellement satisfaisante. Parren et al. ont mis en évidence une corrélation entre l'obtention d'anticorps pouvant neutraliser in vitro l'infection de cellules par le NIH et la nature oligomérique de la gpl20 (J. of Nirology, 72, 3512-3519, 1998). D'autre part, Earl et al ont montré que des anticorps spécifiques de la structure oligomérique de la gplόO peuvent être générés et participent de fait à un effet neutralisant contre l'infection in vitro de cellules par le VIH (PΝAS 87, 648-652, 1990).
Plusieurs auteurs ont proposé de modifier la structure de la gpl60 dans le but d'obtenir une protéine plus proche de celle présente à la surface du virus durant l'étape de liaison du NIH et de fusion des membranes cellulaires et/ou d'exposer des épitopes initialement cachés.
A. Benjouad et al (J. Nirology, p 2473-2483, 1992) ont proposé l'utilisation d'une gpl60 déglycosylée par voie enzymatique pour induire des anticorps neutralisants. Les résultats obtenus montrent que les anticorps issus d'antisérums produits contre une gpl60 désialylée neutralisent le pouvoir infectieux du NIH-1 (TCLA) et inhibent la formation de syncytium entre les cellules infectées par le VIH-1 et les cellules CD4+ non-infectées.
RAXaCasse et al (Science, 283 : 357-362, 15/01/1999) ont décrit la préparation d'un vaccin comprenant des cellules entières fixées au formaldéhyde qui reproduirait la structure transitoire protéine d'enveloppe/CD4/co-récepteur présente au cours de l'infection par le HIV. L'utilisation d'une telle préparation conduirait dans un modèle de souris transgénique à la neutralisation de nombreux isolats primaires du VIH. La reproduction de cette expérience n'a pas pu être réalisée. Les réponses en anticorps neutralisants, telles que décrites dans l'art antérieur mentionné ci-dessus, ont pour inconvénient d'être soit spécifiques d'un sérotype donné, soit d'être incapables de conduire à la neutralisation des isolats primaires du VTH. Du fait de la très grande variabilité génétique du virus du SIDA de telles réponses immunitaires présentent donc peu, voire pas d'intérêt d'un point de vue vaccinal. II existe donc un besoin pour un vaccin capable d'induire une immunité neutralisante contre les isolats primaires du VIH.
La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante qu'une glycoprotéine d'enveloppe du VDH modifiée chimiquement permettait d'atteindre cet objectif.
La présente invention concerne donc une glycoprotéine d'enveloppe du VIH sous forme purifiée susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(1) obtention d'une glycoprotéine d'enveloppe sous forme purifiée,
(2) réduction d'au moins un pont disulfure de la glycoprotéine de l'étape (1),
(3) alkylation d'au moins deux groupes sulfhydryls libres, (4) éventuellement oxydation des groupes sulfhydryls libres restants
(5) dénaturation et
(6) renaturation. Selon un mode de réalisation particulier la glycoprotéine (1) est sous forme dimérique et correspond de préférence à une gpl60MN/LAI. Selon un mode de réalisation particulier l'étape (2) est mise en œuvre par addition d'un agent réducteur selon un rapport molaire (moles d'agent réducteur) /(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 500 fois.
Selon un autre mode de réalisation particulier l'étape (3) est mise en œuvre par addition d'un agent alkylant selon un rapport molaire (moles d'agent alkylant)
/(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 1000. Selon un mode de réalisation particulier on utilise comme agent alkylant le EM selon un rapport molaire (moles de NEM) /(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 100, de préférence 10.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de protéines modifiées chimiquement telles que définies ci- dessus.
Selon un autre aspect, la présente invention est relative à un anticorps dirigé contre une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement telle que définie ci-dessus ; cet anticorps étant de préférence monoclonal.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un vaccin contre le VIH comprenant :
(a) Une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement telle que définie ci- dessus ou une composition telle que définie ci-dessus, ou un anticorps tel que défini ci-dessus ou un mélange de ces anticorps,
(b) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et
(c) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvants.
Selon un mode de réalisation particulier, le vaccin selon l'invention est utilisé pour induire des anticorps neutralisants le VEH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de diagnostic comprenant la mise en contact d'un fluide biologique avec un anticorps tel que défini ci- dessus et la détermination des complexes immuns ainsi formés. Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit. Par « glycoprotéine d'enveloppe » on entend dans le cadre de la présente invention une protéine glycosylée gpl60, gp 120 ou gp 140. La protéine d'enveloppe est sous forme monomérique, dimérique ou multimérique, elle sera de préférence sous forme dimérique. Cette protéine d'enveloppe pouvant être une protéine recombinante ou non et peut également être constituée d'une protéine hybride ; le terme hybride étant utilisé ici dans son acceptation classique à savoir une protéine comprenant des séquences provenant de protéines d'enveloppe de différentes souches de virus adaptées en laboratoire ou d' isolats primaires du NIH. Les protéines d'enveloppe dont la séquence en acides aminés diffère de celle de la protéine native par des mutation(s), délétion(s), insertion(s), ou substitution(s) d'acide(s) aminé(s) sont également inclues dans la définition ci-dessus pour autant que ces modifications n'abolissent pas la formation d'anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du NIH. Cette caractéristique est aisément déterminable à l'aide des tests fournis dans la présente demande. On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention la gpl60MΝ/LAI telle que décrite dans l'exemple 1 ci-dessous ;
La glycoprotéine d'enveloppe de l'étape (1) est utilisée sous une forme isolée substantiellement purifiée. On entend par protéine isolée et substantiellement purifiée, une protéine présentant un taux de pureté d'au moins 75% , de préférence d'au moins 80% , tel que déterminé par la méthode d'électrophorèse sur gel d'acrylamide (SDS PAGE) (LAEMMLI U.K. 1970. Nature 27 : 680-685.) et analyse par densitométrie. Il est fait référence dans la présente demande à une telle protéine sous le terme de « protéine sous forme purifiée ». Divers procédés de purification de la protéine d'enveloppe du NEH, naturelle ou recombinante, ont été décrits dans la littérature. On peut se reporter par exemple aux articles de Pialoux et al (Aids Res. Hum. Retr., 11, 373-381, 1995) et de Sakmon-Ceron et al (Aids Res. Hum. Retr., 12, 1479-1486, 1995) ou encore au texte WO91/13906.
En ce qui concerne les protéines recombinantes, il faut noter que les glycoprotéines ainsi purifiées présentent des ponts disulfures inter-chaînes, quel que soit la nature de l'hôte ou du vecteur utilisé. Les glycoprotéines s'associent ainsi en partie en dimères covalents visibles sur gel SDS PAGE. (Owens RJ. Compans RW. Virology, 179 (2) : 827-833, DEC. 1990) La glycoprotéine d'enveloppe sous forme purifiée est soumise dans un premier temps à une étape de réduction partielle ou totale des ponts disulfures intra-chaînes et/ou inter-chaînes dans laquelle au moins un pont disulfure est réduit.
L'étape de réduction est réalisée par réaction de la glycoprotéine d'enveloppe de l'étape (1) avec un agent réducteur, à température ambiante et sous agitation douce. L'agent réducteur peut être choisi parmi les molécules de dithiothréitol (DIT), beta- mercaptoéthanol, glutathion réduit et borohydrure de sodium, par exemple. La quantité d'agent réducteur, exprimée par le rapport molaire (moles d'agent réducteur)/ (moles de groupes sulfhydryls)varie entre 1 et 0,5.104 et correspond de préférence à un rapport molaire de 50. La réduction est mise en œuvre à un pH basique de 7 à 10, de préférence à un pH de 7,8. Le contrôle de la valeur du pH est obtenu par l'addition d'un tampon; tout tampon approprié pour ce faire peut être utilisé. On utilise de préférence un tampon phosphate de sodium. A titre indicatif, dans le cas du DTT, la réaction est mise en œuvre pendant environ 15 minutes, le rapport molaire moles de DTT/moles de SH utilisé est de 1 à 0,5104 et de préférence de 50 fois.
La durée de la réaction de réduction est variable et dépend du rapport molaire et de l'agent réducteur choisis.
Les conditions de la réaction de réduction permettant la réduction d'au moins un pont disulfure sont aisément déterminables par l'homme du métier à partir de l'enseignement fourni ici. La réduction peut être contrôlée par analyse SDS PAGE dans la mesure où la réduction des ponts disulfures interchaînes transforme les dimères en monomères. Des contrôles plus fins de cette réduction sont possibles par utilisation de N-éthyl-maléimide (NEM) marqué au 14C ou plus simplement par l'utilisation d'un dosage colorimétrique basé sur l'acide dithio-nitro-benzoique (DTNB). Les groupes sulfhydryls libres ainsi obtenus sont ensuite soumis à une réaction d'alkylation dans laquelle le produit de l'étape (2) réagit avec un agent alkylant.
On entend par agent alkylant dans le cadre de la présente invention tout réactif capable de réagir spécifiquement avec les groupes -SH pour donner une liaison covalente. A titre illustratif, on peut citer : N-éthyl-maléimide, iodo-acétamide. La quantité d'agent alkylant utilisée, exprimée par le rapport molaire (moles d'agent alkylant)/(moles de groupes sulfydryls) est de 1 à 100 fois, de préférence de 10 à 100 fois. Il est nécessaire de veiller à avoir un excès d'agent alkylant par rapport à l'agent réducteur pour neutraliser l'action de ce dernier.
La réaction d'alkylation est mise en œuvre à un pH de 6 à 8, de préférence à un pH de 7, à température ambiante. Le contrôle de la valeur du pH est obtenu par l'addition d'un tampon ; tout tampon approprié pour ce faire peut être utilisé. On utilise de préférence un tampon phosphate de sodium.
Les conditions de la réaction d'alkylation permettant l'alkylation d'au moins deux groupes -SH sont aisément déterminables par l'homme du métier à partir de l'enseignement fourni ici. L'alkylation peut être contrôlée par l'utilisation de 14C-NEM comme cela est décrit ci-dessous dans les exemples.
Le produit issu de l'étape (3) peut être soumis à une étape d'oxydation au cours de laquelle les groupes sulfhydryls libres restants sont oxydés en présence d'un agent oxydant. Si des groupes sulfhydryls libres sont encore présents à l'issue de l'étape (3), on réalise de préférence une étape d'oxydation avant l'étape de dénaturation. On entend dans le cadre de la présente invention par agent oxydant toute molécule liée par ponts disulfures comme le glutathion oxydé ou la cystine mais il peut s'agir également d'autres molécules comme les quinones, l'oxygène, etc. A titre illustratif on peut citer le mélange glutathion réduit/glutathion oxydé. Dans ce mélange, le glutathion réduit permet aux ponts disulfures de se dissocier pour se réassocier dans un état thermodynamique plus stable.
La réaction d'oxydation est mise en œuvre à un pH de 7 à 9 de préférence à pH7,8, à une température de 4 à 25°C. L'agent oxydant est utilisé selon un rapport molaire (moles d'agent oxydant)/( moles de groupes sulfhydryls) de 50 à 5000, de préférence de 500. A titre illustratif, dans le cas de l'utilisation du mélange glutathion réduit/glutathion oxydé, la réaction est mise en œuvre avec un taux de glutathion oxydé de 1 à 1000 fois supérieur au taux de glutathion réduit. Par exemple un rapport de 500 molécules de glutathion oxydé par mole de gpl60MN/LAI peut être avantageusement utilisé.
La durée de l'étape d'oxydation peut varier entre 5 minutes et 24 heures et correspond de préférence à 30 minutes. Les conditions de la réaction d'oxydation permettant l'oxydation des groupes sulfhydryls libres sont aisément déterminables par l'homme du métier à partir de l'enseignement fourni ici. L'oxydation peut être contrôlée par un procédé similaire à celui utilisé pour le contrôle de l'étape de réduction en veillant bien aux contrôles positifs du test.
Le produit issu de l'étape (3) ou (4) est ensuite dénaturé par l'action d'un ou de plusieurs agent(s) dénaturant(s).utilisé(s) à raison de 0,1 à 5% (poids/vol) de façon à modifier la conformation de la glycoprotéine. Pour ce faire un ou plusieurs détergent(s), de préférence ionique(s) ou un ou plusieurs agent(s) chaotropique(s) peuvent être utilisés par exemple. On peut citer à titre illustratif les détergents ioniques suivants : les sels de dodécyl sulfate, notamment le dodécyl sulfate de sodium (SDS) ou de lithium, les sels de dioctyl sulfosuccinate (de sodium, par exemple), les sels de cétryltriméthylammonium (de brome, par exemple), DTAB, les sels de cétylpyridinium (de chlore, par exemple), les N- dodécyl- ou N-tétradécyl-sulfobétaïne, les zwittergents 3-14, et le 3-[(3- cholamidopropyl)-diméthylamino]-l-propane sulfonate (CHAPS), et les détergent(s) neutre(s) suivants : le tween20®, le tween80®, l'octylglucoside, le lauryl-maltoside, l'hecameg®, le lauryl-diméthylamine, le décanoyl-N-méthyl-glucamide, le polyéthylène- glycol-lauryl-éther, le triton XI 00®, le Lubrol PX®, par exemple. A titre illustratif on peut citer comme agent chaotropique utilisable dans le cadre de la présente invention l'urée, la guanidine, le thiocyanate de sodium.
On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention le SDS, en particulier à une concentration de 0,1% (poids/vol.). La réaction de dénaturation est mise en œuvre à pH neutre ou alcalin à la température ambiante.
Les conditions de la réaction de dénaturation permettant des modifications conformationnelles de la molécule sont aisément déterminables par l'homme du métier à partir de l'enseignement fourni ici. La dénaturation peut être contrôlée par mesure spectrophotométrique en mesurant l'absorbance des résidus tyrosine, phénylalanine et tryptophane de la molécule ou par dichroïsme circulaire.
La glycoprotéine ainsi dénaturée est ensuite soumise à une étape de renaturation qui peut être mise en œuvre par dialyse contre 1000 volumes d'un tampon exempt de détergent, de préférence un tampon phosphate contenant du chlorure de sodium (PBS). L'efficacité de l'étape de dialyse est facilement déterminable par analyse colorimétrique des agents oxydants résiduels ou par HPLC en montrant la disparition de certains réactifs servant à la fabrication de l'antigène. A titre illustratif, la dialyse peut être effectuée en une nuit à température ambiante, sous agitation douce, contre un tampon PB S. Selon un mode de réalisation préféré, la gpl60MN LAI sous forme purifiée (1) est modifiée chimiquement par un procédé comprenant les étapes de : (2) réduction par incubation avec du DTT selon un rapport molaire (moles de DTT) /(moles de groupes SH) de 50 à un pH de 7, pendant une durée d'environ 15 minutes à la température ambiante, (3) alkylation par incubation avec du NEM selon un rapport molaire (moles de NEM)/(moles de groupes SH) de 10 à un pH de 7, pendant une durée d'environ 15 minutes, à la température ambiante, (4) oxydation par incubation du produit de l'étape (3) avec un mélange glutathion réduit/glutathion oxydé selon un rapport molaire(moles de glutathion oxydé)/(moles de groupes SH) de 500 avec un rapport glutathion réduit/glutathion oxydé de 10, à un pH de 7,8 pendant une durée d'environ 30 minutes, (5) dénaturation du produit de l'étape 4 par incubation avec 0,1% de SDS
(poids/vol.) pendant une durée d'environ 15 minutes et à un pH de 7,8 , puis (6) renaturation par dialyse contre du tampon PB S pendant la durée d'une nuit à la température ambiante.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de glycoprotéines chimiquement modifiées telles que définies ci- dessus. Dans un tel cas de figure, ces glycoprotéines modifiées chimiquement peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoprotéines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par leur procédé de préparation ; les paramètres de ce dernier pouvant varier, tels que la concentration et la nature des réactifs. Tout mélange envisageable comprenant une ou plusieurs glycoprotéine(s) d'enveloppe modifiée(s) chimiquement est inclus dans la portée de la présente invention.
La présente invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe modifiées chimiquement telles que décrites ci-dessus. La préparation de tels anticorps est mise en œuvre par les techniques classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et monoclonaux (Kohler G et al European Journal of Immunology. 6(7) :511-9, 1976 Jul). Ces anticorps sont particulièrement appropriés pour être utilisés dans un schéma d'immunisation passive.
La présente invention a également pour objet des vaccins utiles à des fins thérapeutiques et prophylactiques. Les vaccins selon la présente invention comprennent une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement telle que définie ci-dessus ou un mélange de telles glycoprotéines, un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant.
Le vaccin selon la présente invention peut donc contenir un seul type de glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement ou un mélange de divers types de glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement tel que défini ci-dessus.
Selon un autre aspect, le vaccin selon la présente invention comprend des anticorps anti-glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement. Dans ce cas de figure également tout mélange d'anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre différentes parties d'un même glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement ou contre différentes glycoprotéines d'enveloppe modifiées chimiquement fait partie de la présente invention.
La quantité de glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement dans le vaccin selon la présente invention dépend de nombreux paramètres comme le comprendra l'homme de l'art, tels que la nature de la glycoprotéine modifiée chimiquement, la voie d'administration et l'état de la personne à traiter (poids, âge, état clinique, etc....). Une quantité appropriée est une quantité telle qu'une réponse immunitaire humorale capable de neutraliser des isolats primaires du VIH est induite après administration de cette dernière. Les vaccins selon la présente invention peuvent également contenir un adjuvant. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. Des agents auxiliaires classiques tels que agents mouillants, charges, émulsifiants, tampons etc. peuvent également être additionnés au vaccin selon l'invention.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé classique connu de l'homme de d'art. Classiquement les antigènes sont mélangés avec un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que eau ou solution saline tamponnée au phosphate. Le support ou diluant va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Pharmaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine. Les vaccins mentionnés ci-dessus peuvent être administrés par toute voie classique, habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, etc.). L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple à J0, à 1 mois, à 3 mois, à 6 mois et à 12 mois. On utilisera de préférence les injections à J0 , à 1 mois et à 3 mois.
La présente invention entend également couvrir une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement telle que définie ci-dessus et le vaccin contenant une telle glycoprotéine ou mélange de telles glycoprotéines pour leur utilisation pour induire des anticorps neutralisant des isolats primaires du VEH. La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que les glycoprotéines d'enveloppe modifiées chimiquement selon l'invention étaient capables après administration d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces antigènes représentent donc des candidats de valeur pour l'élaboration d'un vaccin utilisable pour la protection et/ou le traitement d'un grand nombre, voire la totalité des sujets à risques ou infectés par le VIH.
La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent.
Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière. A des fins de clarté, les exemples sont limités à des glycoprotéines d'enveloppe modifiées chimiquement constituées de gpl60MN/LAI.
Exemple 1 Préparation de la glycoprotéine gpl60MN/LAl La glycoprotéine gpl60MN/LAI est une glycoprotéine soluble hybride dans laquelle la sous-unité gpl20 dérive du VEH-1 MN et la sous-unité gp41 dérive de l'isolât LAI. Les séquences d'ADN correspondant à ces deux composants sont fusionnés à l'aide d'un site de restriction Smal qui ne modifie ni la séquence en acides aminés de la gpl20 ni celle de la gp41. La préparation de cette protéine est décrite ci-dessous.
La séquence codant pour la gpl20MN est amplifiée par PCR à partir des cellules SupTl infectées par le VEH-MN, à l'aide d'oligonucléotides introduisant les sites de restrictions SphI et Smal respectivement immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader et en amont des sites de clivage localisés entre la gpl20 et la gp41. La séquence codant pour la sous-unité gp41 est produite de la façon suivante : la séquence complète codant pour la protéine env du VEH 1 -LAI est placée sous le contrôle du promoteur pH5R du virus de la vaccine. Plusieurs modifications sont introduites dans cette région codante. Un site de restriction SphI est créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader, sans altération de la séquence des acides aminés. Un site de restriction Smal est créé immédiatement en amont de la séquence codant pour les sites de clivage situées entre gpl20 et gp41, sans altération de la séquence en acides aminés. Les deux sites de clivage en position 507-516 (acides aminés numérotés selon la méthode de Myers et al, décrite dans Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) ont été mutés (i.e. la séquence d'origine KRR ... REKR a été mutée en QNH ... QEHN). La séquence codant pour le peptide hydrophobe transmembranaire IFIMIVCTGLVGLRIVFAVLSIV (i.e. acides aminés 689-710 selon Myers et al supra) a été délété. Enfin, le second codon E de la séquence codant pour PEGIEE a été remplacé par un codon stop (i.e. acides aminés 735-740 selon Myers et al (supra)), correspondant au 29eme acide aminé du domaine intracytoplasmique.
Le plasmide dans lequel la séquence LAI est insérée entre les régions homologues du gène TK du virus de la vaccine est coupé par SphI et Smal puis ligaturé avec la séquence de la gpl20MN. Le virus WTG9150 est ensuite construit par une recombinaison homologue classique.
Le vecteur recombinant du virus de la vaccine, WTG9150, ainsi produit est utilisé pour la production de la gpl60MN/LAI. Pour ce faire, le vecteur est propagé sur des cellules BHK21. La gpl60 MN/LAI est produite sur cellules BHK21 infectées pendant 72 heures par le virus de la vaccine recombinante NVTG9150. Après culture en biogénérateur, le surnageant est récolté, filtré et ultrafiltré pour donner la récolte concentrée. La purification se déroule en trois étapes. Certains contaminants de la gpl60 MΝ/LAI sont fixés sur une colonne échangeuse d'anions. La fraction non fixée est chromatographiée sur colonne d'immunoafïinité à l'aide d'un anticorps monoclonal. Après élution, la gpl60 MN/LAI est dessalée par chromatographie de filtration sur gel en tampon PBS. Pour inactiver la vaccine résiduelle, la glycoprotéine est chauffée à 60°C pendant 1 heure avant d'être filtrée pour donner l'antigène purifié. La concentration de la gpl60 MN/LAI utilisée pour la préparation des protéines modifiées chimiquement est de 1 mg/ml de protéines (déterminée par dosage colorimétrique kit BCA, Pierce™) et sa pureté de 77% (déterminée par électrophorèse SDS PAGE et analyse par densitométrie optique à l'aide du ScannerGS700 de Biorad™). La glycoprotéine est dans un tampon phosphate de composition suivante : NaCl 137 mM; KC1 2,7 mM ; Na2HPO4 6,5 mM ; KH2PO 1,5 mM ; pH 7,4 (PBS). La gplόOMNZLAI ainsi obtenue, présente un poids moléculaire de 140kD en SDS-PAGE.
Exemple 2 : Préparation de glycoprotéines modifiées chimiquement selon l'invention A partir de 172 μl de gpl60 purifiée (lmg/ml) on ajoute 21 μl de tampon 1M phosphate de sodium pH7,8 ; 2 μl d'eau distillée et 19,5 μl de dithiothreitol 50 mM (DTT), on agite au vortex pendant 15 s, et on incube 15 min à 25°C. On ajoute 16 μl de tampon phosphate de sodium 1M (NaH2PO4) pour abaisser le pH à 7, puis on bloque les groupes sulfhydryls par addition de 14 μl de N-éthyl-maléimide (NEM) lOOmM, on incube pendant 15 min à 25°C. On réoxyde les groupes sulfhydryls par addition de tampon phosphate de sodium à pH 7,8 et on ajoute un mélange de 4,8 μl de glutathion réduit à 150 mM, et 71,6 μl de glutathion oxydé à 100 mM, on incube pendant 30 min à 25°C. On dissocie ensuite les dimères de gpl60 par addition de 12 μl de dodécyl sulfate de sodium (SDS) à 3%. On place l'échantillon dans une cassette de dialyse d'une capacité de 3 ml contre 1000 volumes de tampon PBS (sans détergent). On effectue la dialyse pendant la nuit à température ambiante sous agitation douce. Les gpl60 ainsi traitées se retrouvent sous forme de monomères et dimères. La protéine ainsi obtenue est nommée BA29.
En suivant le mode opératoire tel que décrit ci-dessus dans lequel le pH de 7 de l'étape d'alkylation par le NEM est remplacé par un pH de 7,8, on prépare une glycoprotéine BA29(7.8). L'analyse SDS PAGE en condition réductrice (DTT) obtenue avec la gpl60 dialysée, et fixée le cas échéant par l'agent de pontage bi-fonctionnnel éthylène-glycol- bis-succinimidyl-succinate (EGS) montre la présence de monomères et de dimères dans la solution de gpl60 dialysée.
Exemple 3 : Préparation de glycoprotéines modifiées chimiquement avec variation de la concentration en agent alkylant.
Pour déterminer le rôle de l'agent alkylant qui est utilisé pour la préparation des protéines selon l'invention, plusieurs glycoprotéines modifiées chimiquement ont été préparées en présence de différentes concentrations en agent alkylant.
La préparation BA53 est réalisée selon le procédé décrit dans l'exemple 2 pour le BA29 dans lequel le NEM a été omis.
La préparation BA55 est réalisée selon le procédé décrit dans l'exemple 2 pour le
BA29 dans lequel la concentration en NEM utilisée est 10 fois inférieure à celle indiquée à l'exemple 2. La préparation BA56 est réalisée selon le procédé décrit dans l'exemple 2 pour le BA29 dans lequel la concentration en NEM utilisée est 10 fois supérieure à celle indiquée à l'exemple 2.
Ces antigènes ont été préparés en parallèle pour être injectés aux animaux et pour une mesure biochimique de la quantité de NEM fixé par molécule de gpl60. Pour cela, le NEM marqué au 14C a été utilisé. Environ 4MBq de 14C NEM ont été ajouté par mM de
NEM non radioactif. La radioactivité mesurée est alors directement proportionnelle à la concentration de NEM. Il a été vérifié au cours de l'étape finale de dialyse que l'élimination du NEM radioactif était bien faite de façon exhaustive et que seule la radioactivité fixée de manière covalente à la protéine subsistait dans l'échantillon. Des aliquotes des antigènes fabriqués selon les différents protocoles ont alors été placés dans les fioles à scintillation et le rayonnement β émis par la désintégration des atomes de 1 C a été enregistré pendant une minute. Les comptages de la radioactivité sont directement proportionnels à la quantité de NEM fixé. Connaissant la quantité de gpl60 présente dans chaque aliquote, le rapport du nombre de molécule de NEM par molécule de g l60 a pu être établi.
Les résultats obtenus montrent que la gpl60 non réduite ne peut pas fixer de NEM (témoin). La gpl60 traitée selon l'invention (BA29) fixe 8 molécules de NEM par molécule de gpl60. Par conséquent , il y a au moins 4 ponts disulfures modifiés à l'intérieur de cet antigène. Il a été montré que l'utilisation d'une concentration de NEM dix fois moindre (BA55) permettait de ne fixer le NEM que sur 2 (1,6 à 1,8) sulfydryls par molécule de gpl60. Il est possible qu'un seul pont disulfure soit modifié à l'intérieur de cet antigène. Il a été montré que l'utilisation d'une concentration de NEM dix fois supérieure (BA56) abolissait les propriétés immunologiques de la molécule.
Exemple 4 : Analyse de Pimmunogénicité chez le cobaye des glycoprotéines modifiées chimiquement Formulation des glycoprotéines modifiées chimiquement
Les glycoprotéines modifiées chimiquement sont diluées stérilement en milieu stabilisateur puis adsorbées sur du phosphate d'aluminium. Le mélange stabilisant est composé d'un mélange d'acides aminés et de milieu "Dulbecco's Modified Eagle
Médium" DMEM-F12 (Gibco, France). Les glycoprotéines modifiées chimiquement préparées dans les exemples 2-4 (BA29, BA29(7.8), BA52, BA53 et BA55 et BA56) sont diluées dans le mélange stabilisateur avant qu'un volume égal de phosphate d'aluminium à 6,3 mg/ml en PBS soit ajouté à ce mélange.
Les glycoprotéines modifiées chimiquement nommées BA53 et BA52 sont obtenues par utilisation du procédé décrit dans l'exemple 2 pour le BA29 dans lequel l'étape d'alkylation par le NEM a été supprimée (préparation BA53) ; ou l'étape de dénaturation par le SDS a été supprimée (préparation BA52) .
Immunisations
Pour chaque glycoprotéine modifiée chimiquement, on utilise un groupe de 5 cobayes femelle albinos Dunkin-Hartley (Charles River) de 400 g. Chaque cobaye reçoit 5μg d'antigène par voie intramusculaire, dans les cuisses droite et gauche (0,5 ml dans chaque cuisse) à Jl et à J29. Un volume de 3 ml de sang est prélevé par ponction cardiaque sous anesthésie aux jours -1, 28 et 56 (saignée finale environ 30 ml).
Titrages des sérums par ELIS A contre la gp!60 MN/LAI
Les sérums des cobayes ainsi obtenus ont été analysés par dosage ELISA contre la gpl60 MN/LAI native. La gpl60 MN/LAI est immobilisée sur la phase solide à raison de 130 ng par cupule pendant 1 heure à 37°C. La plaque est vidée puis saturée par un tampon PBS, Tween 20 0,1% contenant 5% de lait écrémé en poudre. Chaque sérum est dilué sur la plaque selon des dilutions sériées de raison 3, entre l/100e et 1/1000006 selon les cas, en tampon de saturation et incubé pendant 1 heure 30 à 37°C.
Un anticorps de lapin anti-cobaye (Sigma, St Louis) couplé à la peroxydase, dilué au 1/3000e, permet de révéler la présence d'anticorps spécifiques de la gplόOMNZLAI. Les titres sont calculés automatiquement par le lecteur à partir de la densité optique lue et de la droite obtenue avec un sérum étalon. Les valeurs moyennes du titre des immunoglobulines spécifiques de la gpl60 MN/LAI pour chaque groupe de cobayes sont comprises entre 10.5 et 10.6.
Le groupe témoin injecté avec de la gpl60 MN/LAI non traitée est identifié sous le code BAI. Les préparations BA55 et BA29 induisent des anticorps spécifiques ; le BA29 conduisant à un titre supérieur à 5.105. Aucun anticorps spécifique de la gpl60 MN/LAI n'a été détecté dans les sérums pré immuns.
Ces résultats montrent clairement que les glycoprotéines modifiées chimiquement selon la présente invention sont capables d'induire des anticorps reconnaissant spécifiquement la glycoprotéine d'enveloppe du VEH.
Exemple 5 : Test de neutralisation des isolats primaires de VEH Les tests de neutralisation des isolats primaires de VEH ont été mis en œuvre sur les isolats Bxl7 et T051 par utilisation de la méthode de C. Moog et al, telle que décrite dans AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997, 13, 19-27 dont l'intégralité est incorporée ici à titre de référence.
Ce test a été mis en œuvre contre plusieurs isolats primaires de VTH-1; seuls les résultats obtenus avec l' isolats Bxl7 et T051 sont détaillés ici. Les résultats obtenus montrent clairement que les glycoprotéines modifiées chimiquement selon la présente invention sont supérieures aux glycoprotéines non traitées ou soumises à des traitements différents et permettent la neutralisation d'isolats primaires du virus bien qu'elles soient obtenues à partir d' une gpl60 isolée à partir d'une souche adaptée en laboratoire (TCLA). On peut dans ces conditions raisonnablement penser que les mélanges de glycoprotéines modifiées chimiquement selon l'invention puissent conduirent à la neutralisation de nombreux isolats primaires du VTH. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 page suivante : Tableau 1 : titre de neutralisation des isolats primaires des virus H Vl, exprimés en inverse de la dilution
NN : Non Neutra
Les chiffres indiquent l'inverse de la dilution du sérum pour laquelle, une neutralisation a été observée.
Conclusions
Les antigènes selon la présente invention sont fabriqués à partir d'une gpl60MN/LAI, d'un virus NIH-1 adapté en laboratoire. Cependant ces antigènes permettent d'induire chez l'animal immunisé une réponse humorale capable de neutraliser des isolats primaires du virus NEH-1, ce qui constitue un progrès par rapport aux connaissances actuelles sur ce sujet.

Claims

Revendications
1.- Une glycoprotéine d'enveloppe du VEH sous forme purifiée susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(1) obtention d'une glycoprotéine d'enveloppe sous forme purifiée, (2) réduction d'au moins un pont disulfure de la glycoprotéine de l'étape (1),
(3) alkylation d'au moins deux groupes sulfhydryls libres,
(4) éventuellement oxydation des groupes sulfhydryls libres restants
(5) dénaturation et
(6) renaturation.
2.- La glycoprotéine selon la revendication 1 dans laquelle, la glycoprotéine (1) est sous forme dimérique.
3.- La glycoprotéine selon la revendication 2 dans laquelle la glycoprotéine de l'étape (1) est une gpl60MN/LAI.
4.- La glycoprotéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle l'étape (2) est mise en œuvre par addition d'un agent réducteur selon un rapport molaire (moles d'agent réducteur) /(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 500 fois.
5.- La glycoprotéine selon la revendication 4 dans laquelle on utilise comme agent réducteur du DTT selon un rapport molaire (moles d'agent réducteur)/(moles de groupes sulfhydryls) de 50 fois.
6.- La glycoprotéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle l'étape (3) est mise en œuvre par addition d'un agent alkylant selon un rapport molaire (moles d'agent alkylant) /(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 1000.
7.- La glycoprotéine selon la revendication 6 dans laquelle on utilise comme agent alkylant le NEM selon un rapport molaire (moles de NEM) /(moles de groupes sulfhydryls) de 1 à 100, de préférence 10.
8.- La glycoprotéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle l'étape de dénaturation est mise en œuvre par addition d' un détergent ionique en une quantité de 0,1 à 5% (poids/vol), de préférence du SDS en une quantité de 0,1 % (poids/vol).
9.- La glycoprotéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans laquelle la gplόOMNZLAI sous forme purifiée (1) est modifiée chimiquement par : (2) réduction par incubation avec du DTT selon un rapport molaire (moles de DTT)/(moles de groupes SH) de 50 à un pH de 7, pendant une durée d'environ 15 minutes à la température ambiante, (3) alkylation par incubation avec du NEM selon un rapport molaire (moles de NEM)/(moles de groupes SH) de 10 à un pH de 7, pendant une durée d'environ 15 minutes, à la température ambiante, (4) oxydation par incubation du produit de l'étape (3) avec un mélange glutathion réduit/glutathion oxydé selon un rapport molaire (moles de glutathion oxydé)/(moles de groupes SH) de 500 avec un rapport glutathion réduit/glutathion oxydé de 10, à un pH de 7,8 pendant une durée d'environ 30 minutes, (5) dénaturation du produit de l'étape 4 par incubation avec 0,1% de SDS
(poids/vol.) pendant une durée d'environ 15 minutes et à un pH de 7,8 , puis (6) renaturation par dialyse contre du tampon PBS pendant la durée d'une nuit à la température ambiante.
10.- Composition comprenant un mélange de glycoprotéines selon l'une quelconque des revendications là 9.
I L- Anticorps dirigé contre la glycoprotéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
12.- Vaccin contre le VEH comprenant:
(a) Une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou une composition selon la revendication 10, ou un anticorps selon la revendication 11 ou un mélange de ces anticorps, (b) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et
(c) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvants.
13.- Le vaccin selon la revendication 12 comprenant une glycoprotéine d'enveloppe modifiée chimiquement selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou une composition selon la revendication 10 pour son utilisation pour induire des anticorps neutralisants le VEH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique.
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