EP1242449A1 - Fibre adenovirable modifiee et utilisations - Google Patents

Fibre adenovirable modifiee et utilisations

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EP1242449A1
EP1242449A1 EP00985308A EP00985308A EP1242449A1 EP 1242449 A1 EP1242449 A1 EP 1242449A1 EP 00985308 A EP00985308 A EP 00985308A EP 00985308 A EP00985308 A EP 00985308A EP 1242449 A1 EP1242449 A1 EP 1242449A1
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EP
European Patent Office
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fiber
residue
substituted
adenoviral
adenovirus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00985308A
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German (de)
English (en)
Inventor
Valérie LEGRAND
Philippe Leissner
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Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the subject of the present invention is in particular an adenoviral fiber, mutated in a region involved in the recognition and the binding to the natural cellular receptor of adenoviruses. It also relates to viral particles, more particularly adenoviral, and pseudoparticles, carrying on their surface such a fiber, possibly combined with a ligand which confers on said particles and pseudo-particles a modified host specificity, see targeted.
  • the invention is of particular interest in the context of the development of vectors or compositions which can be used in the context of the implementation of gene therapy protocols.
  • Adenoviruses have long been described as a very efficient natural system for transferring biological material into target cells. This is the reason why adenoviral vectors are today widely used in many gene therapy applications.
  • the adenoviral genome consists of a linear, double-stranded DNA molecule of approximately 36kb containing two inverted repeat regions (designated ITR for Inverted Terminal Repeat) surrounding the genes coding for the viral proteins.
  • the early genes are distributed in 4 regions dispersed in the adenoviral genome (E1 to E4; E for early in English), comprising 6 transcriptional units provided with their own promoters.
  • the late genes (L1 to L5; L for late in English) partially cover the early transcription units and are, for the most part, transcribed from the major late promoter LP (for Major Late Promoter).
  • the intracellular infectious cycle of adenoviruses is well documented in the literature and is based on two essential stages:
  • the late phase which follows the replication of the genome, during which the structural proteins which constitute the base of the viral adenoviral particles (or capsids) are synthesized.
  • the assembly of the new viruses is then carried out in the nucleus: first, the viral proteins assemble so as to form empty capsids of icosahedral structure in which the newly formed genome is packaged.
  • the released adenoviruses can then infect other permissive cells. More particularly, during infection, adenoviruses enter cells by an endocytosis process following the attachment of the adenoviral particle to a specific receptor present on the surface of permissive cells.
  • the fiber and the base penton present on the surface of the adenoviral particle play a critical role in the cellular attachment of viruses and their internalization (Wickham et al., 1993, Cell, 73, 309-319).
  • the adenovirus binds to a cellular receptor (in particular CAR) present on the surface of permissive cells via said fiber in its trimeric form (Philipson et al.,
  • the viral particle is internalized by endocytosis thanks to the binding of the penton base to the cellular integrins ⁇ v ⁇ 3 and ⁇ v ⁇ 5 (Mathias et al., 1994,
  • adenoviruses are capable of promoting the transfer, in vitro and in vivo, of macromolecules of non-viral origin, such as for example dextrans (Otero et al., 1987, Virology, 160, 75-80), proteins (Carrasco et al., 1981, Virology, 113, 623-629; Fitzgerald et al. , 1983, Cell, 32, 607-617; Defer et al., 1990, J.
  • Virol., 64, 3661-3673 a plasmid DNA associated with a ligand (Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; Cotton et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6094-6098), possibly in the presence of an antibody neutralizing adenoviral infection (Michael et al., 1993, J Biol. Chem., 268: 6866-6869), naked nucleic acids (DNA, RNA, PNA), or optionally in the presence of cationic compounds such as cationic lipids (US Patent 5,928,944; patent application WO 95/21259).
  • Adenoviruses have been the subject of numerous studies and several scientific teams have also developed adenoviral vectors defective for replication, that is to say whose genome has been manipulated so that these adenoviral vectors are incapable of dividing or proliferate in the cells they infect.
  • the defective adenoviral vectors are in particular obtained by deletion of at least part of the E1 region (for examples of defective adenoviral vectors, see in particular patent applications WO 94/28152 and WO 94/12649).
  • the adenoviral fiber is made up of three distinct domains (Chroboczek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200): (a) at its N-terminal end is the tail, the sequence of which is very conserved from one adenoviral serotype to another. It interacts with the penton base and ensures the anchoring of the molecule in the capsid; (b) in the center is the rod; it is a stick structure made up of a certain number of leaf repetitions, the number of which varies according to the serotypes considered;
  • each monomer comprises 8 antiparallel sheets designated A to D and G to J and 6 major loops of 8 to 55 residues.
  • the CD loop connects sheet C to sheet D.
  • the minor sheets E and F are considered to be part of the loop DG located between sheets D and G.
  • table 1 indicates the location of these structures in the amino acid sequence of the Ad ⁇ fiber as shown in sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO: 1), the +1 representing the initiating Met residue.
  • the sheets form an ordered and compact structure while the loops are more flexible.
  • the four sheets A, B, C and J constitute the sheets V directed towards the viral particle.
  • the other four (D, G, H and I) form the R sheets, supposed to face the cell receptor.
  • the V sheets seem to play an important role in the trimerization of the structure while the sheets
  • R would be involved in the interaction with the receptor.
  • WO 94/10323 describes adenoviral particles of type 5 (Ad5), the fiber of which has been mutated so as to understand the sequence of an antibody fragment specific for a given antigen (of type scFv) inserted at the end of one of the 22 repeat units of the stem.
  • the specificity of infection of the adenoviral particles thus mutated is modified in such a way that the adenoviruses produced are capable of binding to cells presenting the target antigen.
  • US 5,543,328 describes a chimeric adenoviral fiber in which the head domain is replaced by the sequence of tumor necrosis factor (TNF), or that of the ApoE peptide, so as to redirect the binding of the modified adenoviral particles to cells expressing the TNF cell receptor or LDL (low density lipoprotein) receptor, respectively.
  • TNF tumor necrosis factor
  • LDL low density lipoprotein
  • WO 95/26412 describes a fiber modified by the incorporation of a ligand at its C-terminal end.
  • WO 96/26281 describes a chimeric fiber obtained by replacing part of the native fiber and, in particular of the head, by the equivalent part of an adenoviral fiber of another serotype and, optionally, by insertion into the C-terminus of an RGD peptide specific for vitronectin.
  • French patent application FR 2758821 (97 01 005) has demonstrated the role of the antigens of the major histocompatibility class I complex and of fibronectin modules III as primary receptor and co- adenovirus factor.
  • mutants of the Ad5 fiber obtained (i) by substitution of one or more amino acid (s) in these regions, said substitutions being able in particular to be selected from the following group: the glycine residue in position 443 is substituted by an aspartic acid, the serine residue in position 444 is substituted with a lysine, the leucine residue in position 445 is substituted with a phenylalanine, the alanine residue in position 446 is substituted with a threonine, the serine residue in position 449 is substituted with an aspartic acid, the glycine residue in position 450 is substituted by an asparagine or a lysine, - the threonine residue at position 451 is substituted by a lysine or a leucine, the valine residue at position 452 is substituted by an asparagine or a threonine, the alanine residue at position 455 is substituted by a phenyla
  • the mutated residue is selected from threonine residues in position 404, alanine in position 406 and serine in position 408.
  • the mutation carried out consists of at least one substitution of an amino acid chosen from the substitutions following: the serine residue in position 408 is substituted by a residue having at least two carboxyl groups, and in particular by a residue selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid, the threonine residue in position 404 is substituted by a glycine residue, the alanine residue at position 406 is substituted by a lysine residue.
  • the inventors have now identified new mutants consisting of a modification, in particular a substitution or a deletion of one or more residues from the region of the adenoviral fiber comprised between residues 491 and 505 and shown to be of interest in order to inhibit or prevent the infectivity of adenoviral particles exhibiting such a modified fiber with regard to normally permissive cells.
  • the aim of the present invention is in particular to propose a new alternative making it possible to reduce the therapeutic amounts of adenoviral particles to be used and to target the infection towards the cells to be treated. This specificity is particularly advantageous when an adenoviral particle expressing a cytotoxic gene is used in order to avoid the propagation of the cytotoxic effect to healthy cells.
  • the advantages provided by the present invention are mainly to reduce the risks of dissemination and the side effects associated with adenoviral technology. Furthermore, the teachings of the present invention allow the development of other targeting systems intended for the development of methods of treatment by administration of viral vectors, especially recombinant viral vectors, or of non-viral vectors.
  • viral particles which have the following properties: (i) the viral particle comprising said mutated fiber does not bind substantially to the natural adenoviral cellular receptors, that is to say that the host specificity of these viral particles carrying the mutated fiber is reduced, or even inhibited, compared to the host specificity of the viral particles carrying the wild fiber, that is to say non-mutated;
  • the viral particle comprising said mutated fiber when the viral particle comprising said mutated fiber also comprises a specific ligand for an anti-ligand, it is possible to confer on said modified particle a new tropism towards one or more specific cell types carrying on their surface said anti- ligand compared to the non-mutated viral particle.
  • These new mutants of the adenoviral fiber also make it possible to obtain pseudo-particles, in particular viral or synthetic, as described below.
  • the mutated fiber does not bind substantially to natural cellular receptors
  • the fiber is modified so as to reduce or abolish its ability to bind to the natural cellular receptor.
  • Such a property can be verified by studying the infectivity or the cellular binding of the corresponding viral particles by applying the techniques known to those skilled in the art, and in particular by competition experiments of infection of the virus carrying the fiber. modified performed in the presence of a competitor made up of all or part of the wild adenoviral fiber (for more details on this measurement technique, see the Experimental Part of this application).
  • the loss of natural specificity can also be evaluated by cell attachment studies carried out in the presence of labeled viruses (for example with 3H thymidine according to the technique of Roelvink et al., 1996, J.
  • a mutated fiber does not bind in a substantial way to natural cellular receptors
  • the percentage of residual infection measured by a competition experiment as disclosed in the Examples which follows, is between approximately 0 and 60%, preferably between 0 and 40% and most preferably between 0 and 20%.
  • the trimerization and penton-base binding properties of the mutated adenoviral fiber are not affected. These properties are easily verified according to the technique used in the Examples which follow.
  • residues and “amino acids” are synonyms.
  • sheets and “loops” are defined according to Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270).
  • virus or “adenovirus” are synonyms for "viral particles” or “adenoviral particles”, respectively.
  • particle is meant a structure comprising peptides and / or lipids which is organized so as to consist of a capsid which may also contain a macromolecule (in particular viral genome, dextrans, proteins, nucleic acids (DNA, RNA, PNA, plasmid DNA, etc.).
  • viral pseudo-particles or "adenoviral pseudo-particles” it is intended to denote viral or adenoviral particles which do not contain a viral or adenoviral genome, respectively (the presence of a non-viral or non-adenoviral genome not being excluded); it is also possible, in the particular case where none genome is not present, refer to so-called “empty” particles.
  • non-viral pseudo-particles we mean artificial particles, produced for example by the association of amino- or carboxyterminal protein sequences, peptides or glycoproteins with lipids. Such modified lipids can then be incorporated into a liposome-like structure.
  • liposomes carrying the surface glycoproteins of the influenza virus can of course further comprise a macromolecule which they transport in the target cell, and in particular a nucleic acid.
  • mutation is meant a deletion, a substitution or an addition of one or more residues or a combination of these possibilities.
  • such a “mutation” can also consist in a modification, in particular chemical, of at least one residue.
  • modifications consist in particular of an esterification, an alkylation, PEGylation, hydroxyalkylation, ....
  • nucleic acid sequence denote a fragment of DNA and / or RNA and / or PNA, double strand or single strand, linear or circular, natural isolated or synthetic, designating a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid without limitation of size. According to a preferred embodiment, it is a nucleic acid chosen from the group consisting of cDNA (complementary DNA); genomic DNA; plasmid DNA; an RNA; a viral genome.
  • part of an amino acid sequence is meant an amino acid sequence comprising at least 6 consecutive amino acids, preferably 10, more preferably 15, even more preferably 20, most preferred 30, and / or having the same biological activity as the sequence from which said part is derived, in particular the ability to recognize and bind to the target cells of the virus.
  • part of a nucleic sequence is meant a nucleic sequence comprising at least 18 consecutive nucleotides, preferably 30, more preferably 45, even more preferably 60, most preferably 90, and / or coding for an amino acid sequence having the same biological activity as the amino acid sequence encoded by the nucleic sequence from which said part is derived.
  • elements ensuring the expression of said gene in vivo is meant the elements necessary to ensure the expression of said gene after its transfer to a target cell. These include promoter sequences and / or regulatory sequences effective in said cell, and optionally the sequences required to allow expression on the surface of target cells of said polypeptide.
  • the promoter used can be a viral, ubiquitous or tissue-specific promoter or a synthetic promoter.
  • promoters such as the promoters of the RSV virus (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) or of the vaccinia virus, the promoters of the gene coding for creatine muscle kinase, for actin, for the lung surfactant. It is also possible to choose a promoter sequence specific for a given cell type, or activatable under defined conditions (see for example US Pat. No. 5,874,534). The literature provides a great deal of information relating to such promoter sequences.
  • said "nucleic acid sequence” also contains a "heterologous" gene, that is to say the origin of which is different from that of the nucleic acid sequence which contains it. Examples of such genes are given below. Otherwise, said nucleic acid sequence may comprise at least two sequences, identical or different, having transcriptional promoter activity and / or at least two genes, identical or different, located relative to each other in a contiguous, distant manner , in the same direction or in the opposite direction, provided that the function of transcriptional promoter or transcription of said genes is not affected. Similarly, in this type of nucleic acid construction, it is possible to introduce “neutral” nucleic sequences or introns which do not interfere with transcription and are spliced before the translation step.
  • nucleic acid may also contain sequences required for intracellular transport, for replication and / or for integration, for transcription or translation. Such sequences are well known to those skilled in the art.
  • nucleic acids which can be used according to the present invention can also be nucleic acids modified so that it is not possible for them to integrate into the genome of the target cell or nucleic acids stabilized using agents, such as for example spermine, which as such have no effect on the efficiency of the introduction of the nucleic acid into the cells.
  • the fiber according to the present invention can be derived from an adenovirus of human, canine, avian, bovine, murine, ovine, porcine or simian origin, or even comprise fragments of various origins, including fragments of heterologous origin. , ie not derived from adenoviral fiber or derived from non-adenoviral fibers (we will then preferentially speak of "hybrid fiber").
  • human adenoviral fiber it is preferable to refer to that derived from serotype C and, in particular, derived from adenovirus type 2 or 5 (Ad2 or Ad5).
  • Ad2 fiber contains 580 amino acids (aa), the sequence of which is disclosed in Hérissé et al.
  • Ad ⁇ was determined by Chroboczek and Jacrot (1987, Virology 161, 549-554) and has 582 amino acids (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 1 amino acids
  • a person skilled in the art can identify the adenoviral fiber sequences available on databases such as GenBank and determine the equivalent positions of the different sheets, loops and residue positions as described above. For information, let us cite in particular the GenBank references for the adenoviral fiber sequences of human serotype 2 (# AAA92223), 3 (# CAA26029), 5 (#M 18369), 31 (# CAA54050 or 41 (# X17016).
  • the fiber of the present invention is of animal origin, use is preferably made of bovine adenoviruses and, in particular, those of the BAV-3 strain, which have been the subject of numerous studies and the sequence of the fiber. is disclosed in application WO 95/16048.
  • the fiber of the present invention may, in addition to the modifications described in the present invention, present other modifications with respect to the native sequence as far as they do not affect the characteristics of the fibers proposed in the application.
  • the contents of the publications or GenBank references cited above are incorporated by reference into the present application in their entirety.
  • the invention also relates to a fiber modified as dec laughs in the present application and which also contains other mutations such as for example those described in the patent application WO 98/44121 or in the patent application benefiting from French priority N ° 99/10859 (see above in this application).
  • the region of the Ad5 adenoviral fiber between the residues 491 and 505 and modified as described in the present application can of course be introduced into a heterology adenoviral fiber, that is to say ie different from the adenoviral fiber Ad5 in addition to or in substitution for the equivalent region of said heterologous fiber.
  • the invention relates to a fiber of an adenovirus which is modified by mutation of one or more residues of the region between residues 491 and 505 of SEQ ID NO: 1.
  • it is an adenoviral fiber comprising all or part of the fiber sequence of an adenovirus type 5 (Ad5) such as shown in sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO: 1) and modified by mutation of one or more residues from the region between residues 491 and 505 of said sequence.
  • the Ad ⁇ fiber carries at least one mutation chosen from the following mutations: the tyrosine residue at position 491 is substituted with an aspartic acid, the alanine residue at position 494 is substituted with a aspartic acid, - the valine residue at position 495 is substituted by an arginine, the glycine residue at position 496 is substituted by a serine, the phenylalanine residue at position 497 is substituted by an aspartic acid, the methionine residue at position 498 is substituted by an aspartic acid, the praline residue at position 499 is substituted by a glycine, the asparagine residue at position 500 is substituted by an aspartic acid, the alanine residue at position 503 is substituted by an aspartic acid, the tyrosine residue at position 504 is substituted with
  • the invention relates to a fiber of an adenovirus type 5 characterized in that the mutated residue is selected from the residues alanine at position 494 and alanine at position 503. Due to their spatial location in the native fiber, these residues are capable of recognizing and / or interacting directly or indirectly with the natural cellular receptor of the adenovirus concerned.
  • a fiber according to the invention is characterized in that it comprises, in addition to the modifications described previously, one or more mutations in: AB, CD, DG, GH, Hl and / or IJ loops and / or sheets A, B, C, D, G, H, I and / or J, and more particularly, one or more mutations as described above by the applicant in application WO 98/44121 and the patent application benefiting from French priority N ° 99/10859 (see also above).
  • the amino acids forming a bend will be replaced by residues forming a similar structure such as those cited in Xia et al. 1994.
  • the fiber of the present invention can also be modified by deletion.
  • the deleted residues when at least one of the modifications is a deletion of at least 3 consecutive residues of a loop and / or of a sheet, the deleted residues can be replaced by residues of a loop and / or an equivalent sheet derived from a fiber of a second adenovirus capable of interacting with a cellular receptor different from that recognized by the first adenovirus.
  • This makes it possible to maintain the structure of the fiber according to the invention while giving it a host specificity corresponding to that of the second adenovirus.
  • the region of the fiber involved during infection and interacting with the cellular receptor is different for types 3 and 7 adenoviruses.
  • an Ad ⁇ or Ad2 fiber deleted by at least 3 consecutive residues among those specified above may be substituted by residues from an equivalent region of the Ad3 fiber or Ad7 to reduce its ability to bind the Ad ⁇ receptor and thus give it a new specificity towards the cellular Ad3 or Ad7 receptor.
  • the present invention also relates to a fiber of an adenovirus having a substantially reduced capacity for binding to the natural cellular receptor as presented above and nevertheless capable of trimerizing. Such a property is notably determined by the technique described in the experimental part of the application.
  • the fiber according to the invention further comprises a ligand, or targeting element.
  • ligand defines any entity capable of recognizing and binding or interacting, preferably with a strong affinity, with a cellular “anti-ligand” different from the natural cellular receptor of the fiber. non-mutated adenoviral (ie class I histocompatibility system antigens, fibronectin or the coxsackie virus (CAR) cell receptor.
  • CAR coxsackie virus
  • a ligand can be for example an antibody or an antibody fragment, a lipid, a glycolipid, a hormone, a polypeptide, a peptide of short size, a polymer (PEG, polylysine, PEI, ...), a sugar, an oligonucleotide, an antigen, a vitamin, all or part of a lectin, of the peptide JTS-1 (WO 94/40958) or else a combination of such compounds.
  • antibody denotes in particular monoclonal antibodies, antibody fragments (such as for example Fab) and single chain antibodies (scFv). These names and abbreviations are conventional in the field of immunology.
  • targeting elements make it possible to direct the particle or the pseudo-particle towards certain cell types or certain particular tissues (tumor cells, cells of the pulmonary epithelium, hematopoietic cells, muscle cells, nerve cells, etc.). They may also be elements facilitating the penetration into the cell or possibly lysis of the endosomes.
  • they may be galactosyl residues making it possible to target the asialoglycoprotein receptor on the surface of liver cells, ligands which can interact with receptors such as growth factor receptors, cytokine receptors, lectins, adhesion proteins, it can also be an antibody fragment such as the Fab fragment, a fusogenic peptide INF-7 derived from the HA-2 subunit of the hemagglutinin of the influenza virus (Plank and al., 1994, J. Biol. Chem.
  • the ligand can be an antibody fragment directed against fusine, the CD4 receptor or against a viral protein (envelope glycoprotein ) or also the part of the TAT protein of the HIV virus extending from residues 37 to 72 (Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668).
  • a tumor cell In the case of a tumor cell, the choice will be made on a ligand recognizing a specific tumor antigen (for example the protein MUC-1 in the case of breast cancer, certain epitopes of the E6 or E7 proteins of the HPV papilloma virus) or overexpressed (IL-2 receptor overexpressed in certain lymphoid tumors). If it is desired to target T cells, a T cell receptor ligand can be used. In addition, transferrin is a good candidate for liver targeting. In general, the ligands which can be used in the context of the invention are widely described in the literature and the genes coding for such ligands can be cloned by standard techniques (for example by amplification of cDNA, .. .).
  • said ligand is inserted at the C-terminal end of the fiber according to the invention or as a replacement for the deleted residues when at least one of the modifications is a deletion of at least 3 residues consecutive.
  • the ligand can be incorporated into the modified fiber according to the invention in different ways, and more particularly: - by cloning the nucleic sequence coding for said ligand into the nucleic sequence coding for fiber d interest changed.
  • said nucleic acid sequence coding for the ligand is introduced at or near the region of the nucleic acid sequence of the fiber coding for the mutated region of said fiber; by incorporation directly on the fiber previously modified and produced, for example by chemical grafting.
  • Another subject of the invention relates to a peptide fragment characterized in that it comprises the region extending from residue 491 to residue 505 of SEQ ID NO: 1 and in that said region is modified as described above.
  • Such a peptide fragment has in particular the following properties: (i) when this peptide fragment is incorporated in place of a region extending from residues 491 to 505 of SEQ ID NO:
  • the adenoviral particle comprising said modified fiber does not bind substantially to the natural cellular receptors of the unmodified adenoviral fiber;
  • the adenoviral particle comprising said mutated fiber according to (i) further comprises a specific ligand for an anti- ligand, it is possible to confer on said modified adenoviral particle a new tropism towards one or more specific cell types carrying on their surface an anti-ligand surface in comparison with the adenoviral particle comprising said unmodified adenoviral fiber.
  • the present invention also relates to a viral particle, in particular an adenoviral particle, which comprises on its surface a modified fiber or a peptide according to the invention, and optionally a ligand as defined above.
  • this viral particle is devoid of functional native fiber or of any other peptide naturally involved in the binding of said viral particle to its target cell.
  • a particle contains a viral genome
  • a recombinant viral virus for example a recombinant adenovirus, and preferably a recombinant adenovirus defective for replication.
  • the invention therefore also relates to such viruses and recombinant viruses.
  • the modified fiber or said peptide, and optionally said ligand are identical to each other.
  • (i) can be expressed by the viral genome itself, in particular when said viral particle ultimately contains such a genome.
  • said genome contains the nucleic sequences necessary for the expression of said modified fiber or of a said peptide according to the invention, and optionally of a said ligand
  • (ii) can be provided in trans by a complementation cell line, such as those defined below, which contains the nucleic sequences necessary for the expression of said modified fiber or of said peptide according to the invention, and optionally d 'undit ligand
  • said viral particles are not adenoviral particles, and preferably are non-enveloped viral particles.
  • viruses are widely described in general virology works, such as for example Fields et al. (1990, Virology, Raven Press, NY).
  • the viral particle of the invention is as presented above and is characterized in that said ligand is inserted into a protein of the viral capsid other than the fiber, in particular hexon or penton in the specific case of adenoviral particles.
  • said genomes and viral particles are genomes and adenoviral particles.
  • the invention also relates to a viral pseudo-particle, in particular an adenoviral pseudo-particle, which comprises on its surface a mutated fiber or a peptide according to the invention, and optionally a ligand as defined above.
  • said viral pseudo-particle of the invention is "empty", that is to say that it does not contain nucleic acid.
  • the invention also relates to the cases in which such a viral pseudo-particle contains a macromolecule, and more particularly a nucleic acid which is not a viral or adenoviral genome.
  • the use of such viral pseudo-particles is in particular illustrated in the document WO 95/21259 or US 5,928,944 cited above.
  • the invention also relates to pseudo-particles which can also be called “artificial particles”.
  • Such particles can in particular be produced after
  • polar compounds such as lipids or glycolipids associated with amino- or carboxyterminal protein sequences, peptides or glycoproteins containing or consisting of the peptide sequences or the adenoviral fiber modified according to the invention and (ii) incorporation of said modified polar compounds into a structure of the liposome type.
  • polar compounds such as lipids or glycolipids associated with amino- or carboxyterminal protein sequences, peptides or glycoproteins containing or consisting of the peptide sequences or the adenoviral fiber modified according to the invention
  • incorporation of said modified polar compounds into a structure of the liposome type.
  • said pseudo-particle is produced after
  • lipids or cationic polymers modified so as to include in their structure such sequences or said modified adenoviral fiber.
  • the literature provides a large number of examples of lipids which can be used according to the invention. Mention may also be made of the case of lipids or cationic polymers generally used as synthetic vectors for the transfer of nucleic acid into cells by transfection. By way of illustration but not limitation, they may be compounds such as those described in Feigner et al.,
  • cationic compounds are capable of forming complexes (also called lipoplexes or polyplexes, or more generally posiplexes) with nucleic acids in order to allow their introduction into cells (transfection).
  • complexes also called lipoplexes or polyplexes, or more generally posiplexes
  • nucleic acids in order to allow their introduction into cells (transfection).
  • the incorporation of such peptide or adenoviral fiber sequences modified according to the invention in said complexes allows for example to obtain posiplexes capable of targeting a cell type of interest.
  • a ligand When a ligand is further included in the particle or pseudo-particle (viral or artificial), it can be chemically coupled to it.
  • the variant according to which the sequences coding for the ligand are inserted within the viral and preferably adenoviral genome is preferred.
  • said sequences are preferably inserted within the sequences coding for the modified fiber according to the invention, and more specifically in phase in order to preserve the reading frame.
  • the insertion of the ligand coding sequence can take place anywhere in the viral genome, however the preferred insertion site is upstream of the stop codon at the C-terminus or in place of the deleted residues. It is also conceivable to introduce the ligand sequences within other viral sequences, in particular those coding for another capsid protein, such as the adenoviral hexon or penton.
  • the invention relates to adenoviral particles containing a recombinant adenovirus defective for replication, ie incapable of autonomous replication in a host cell.
  • the deficiency is obtained by mutation or deletion of one or more essential viral genes and, in particular, of all or part of the E1 region in the adenoviral genome. Deletions within the E3 region can be considered to increase the cloning capacities. However, it may be advantageous to keep the sequences coding for the protein gp19k (Gooding and Wood, 1990, Critical Revie s of Immunology 10, 53-71) in order to modulate the immune responses of the host.
  • a recombinant virus (especially an adenovirus) of the invention comprises one or more gene (s) of interest placed under the control of the elements necessary for its (their) expression in a host cell .
  • the gene in question can be of any origin, genomic, cDNA (complementary DNA) or hybrid
  • polypeptide may be all or part of a polypeptide as found in nature, a chimeric polypeptide originating from the fusion of sequences of various origins, or a polypeptide mutated with respect to the sequence native with improved and / or modified biological properties.
  • cytokines or lymphokines interferons and interleukins and in particular IL-2, IL-6, IL-10 or IL-12, tumor necrotizing factors (TNF), colony stimulating factors (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...); cellular or nuclear receptors, in particular those recognized by pathogenic organisms (viruses, bacteria, or parasites) and, preferably, by the VI H virus or their ligands; proteins involved in a genetic disease (factor VII, factor VIII, factor IX, dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) , growth hormones (hGH); enzymes (urease, renin, thrombin ....); enzyme inhibitors (1-antitrypsin, antithrombin III, viral protease inhibitors ...); polypeptides with anti-t
  • HSV-1 HSV-1
  • ricin ricin
  • cholera toxin diphtheria
  • immunotoxins immunotoxins
  • markers ⁇ -galactosidase, luciferase .
  • a recombinant adenovirus according to the invention can, in addition, comprise a selection gene making it possible to select or identify the infected cells.
  • neo genes coding for neomycin phosphotransferase which confer resistance to the antibiotic G418, dhfr (Dihydrofolate Reductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transferase), pac (Puromycin Acetyl-Transferase) or gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase) ).
  • the selection genes are known to those skilled in the art.
  • elements necessary for the expression of a gene of interest in a host cell is meant all of the elements allowing its transcription into RNA and the translation of an mRNA into protein.
  • the promoter is of particular importance. In the context of the present invention, it can originate from any gene of eukaryotic or even viral origin and can be constitutive or regulable. Furthermore, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to make a constitutive promoter regulable or vice versa, introduce a restriction site ... Alternatively, it may be the natural promoter of the gene to be expressed.
  • CMV Cytomegalovirus
  • RSV Raster Sarcoma Virus
  • TK gene of the HSV-1 virus early SV40 virus (Simian Virus 40)
  • adenoviral MLP or promoters eukaryotes of murine or human PGK (Phospho Glycerate kinase) genes
  • 1-antitrypsin liver-specific
  • immunoglobulins lymphocyte-specific
  • a gene of interest in use in the present invention may also comprise additional elements necessary for expression (intronic sequence, signal sequence, nuclear localization sequence, transcription terminator sequence, site of initiation of the IRES or other translation ...) or its maintenance in the host cell. Such elements are known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to viral particles for which the incorporated genome is not an adenoviral genome.
  • the viral genome is preferably selected from the viral genomes corresponding to non-enveloped viruses (Fields et al., 1990,
  • the modified fiber or the peptide sequence of the invention can be incorporated into the particle either
  • the present invention also relates to a DNA fragment coding for a fiber or a peptide fragment according to the invention, as well as to an expression vector comprising such a DNA fragment.
  • any type of vector can be used for this purpose, whether it is of plasmid or viral origin, integrative or not.
  • Such vectors are commercially available or described in the literature.
  • a person skilled in the art is capable of adapting the regulatory elements necessary for the expression of the DNA fragment according to the invention.
  • said vector will be an adenoviral vector capable of producing, under appropriate culture conditions, adenoviral particles according to the invention, namely adenoviruses or recombinant adenoviruses as described above.
  • the invention also relates to a process for the preparation of adenoviral pseudo-particles according to the invention according to which: (i) the adenoviral genome coding for a modified fiber according to the invention is transfected into an appropriate cell line, for example line 293, PERC6, or a derivative or equivalent line); (ii) cultivating said transfected cell line is cultivated under conditions suitable for allowing the production of said adenovirus or of said recombinant adenovirus, and (iii) recovering the empty pseudo-particles by purifying the cell lysate on a density gradient, in particular a gradient cesium chloride for example.
  • an appropriate cell line for example line 293, PERC6, or a derivative or equivalent line
  • cultivating said transfected cell line is cultivated under conditions suitable for allowing the production of said adenovirus or of said recombinant adenovirus
  • recovering the empty pseudo-particles by purifying the cell lysate on a density gradient, in particular
  • the empty pseudo-particles sediment for example at 1.3 g / ml of cesium chloride while the recombinant adenoviruses (particles containing the adenoviral genome) sediment at 1.34 g / ml (D'Hallivin, 1995, Cur Top. Microbiol. Immunol, 199, 47-66).
  • the invention also relates to a process for preparing an adenovirus or a recombinant adenovirus (adenoviral or recombinant adenoviral particles) according to the invention, according to which:
  • said transfected cell line is cultured under conditions suitable for allowing the production of said adenovirus or of said recombinant adenovirus (one can also say, adenoviral particles), and
  • 96022940 are particularly suitable for complementing the E1 function (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72 or WO 97/00326, respectively).
  • E1 and E2 or E4 For a double deficiency E1 and E2 or E4, one can use a line among those described in the French patent application FR 2737222 (96/04413).
  • FR 2737222 96/04413
  • a helper virus to complement the defective adenovirus according to the invention in any host cell or else a mixed system using complementation cell and helper virus in which the elements are dependent on each other.
  • the means of propagation of a defective adenovirus are known to a person skilled in the art who can refer for example, Graham and Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, p 190-128; Ed EJ Murey, The Human Press Inc.).
  • the adenoviral genome is preferably reconstituted in vitro in Escherichia coli (E. coli) by ligation or even homologous recombination (see for example French application FR 2727689 (94/14470)).
  • the purification methods are described in the state of the art. Mention may be made of the density gradient centrifugation technique.
  • the present invention also relates to a cell line comprising either in the form integrated into the genome or in the form of an episome a DNA fragment coding for a fiber according to the invention placed under the control of the elements allowing its expression.
  • Said line can be derived from a complementation cell of one or more adenoviral functions selected from those encoded by the regions E1, E2, E4 and L1-L5. It preferably derives from line 293 or from line PERC6.
  • Such a line can be useful for the preparation of an adenovirus, in particular a recombinant one, the genome of which lacks all or part of the sequences coding for the fiber (so as to produce a non-functional or "redirected" fiber or not to produce fiber).
  • the invention also relates to a method for producing adenoviral particles containing an adenoviral genome devoid of all or part of the sequences coding for a fiber, characterized in that:
  • the said genome is transfected into a cell line presented above, (ii) the said transfected cell line is cultured under conditions suitable for allowing the production of the said adenoviral particle, and (iii) the said adenoviral particle is recovered in the culture of said transfected cell line and, optionally, (iv) purifying said adenoviral particle.
  • the present invention also covers a host cell which can be infected with an adenovirus according to the invention or which can be obtained by a method according to the invention.
  • a mammalian cell and, in particular, a human cell.
  • It can be primary or tumor and of any origin, for example hematopoietic (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscular, nasal, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial, retinal (for example HER for Human Embryonic retinocyte) or fibroblast.
  • the subject of the invention is also a composition
  • a composition comprising, as therapeutic or prophylactic agent, a host cell, a viral particle, in particular adenoviral, or a pseudo-particle (viral or artificial), according to the invention or capable of being obtained by a process according to the invention, in combination with a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • composition according to the invention is, in particular, intended for the preventive or curative treatment of diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or Duchenne, Becker's myopathy ...), cancers, such as those induced by oncogenes or viruses, viral diseases, such as hepatitis B or C and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome resulting from HIV infection), and recurrent viral diseases, such as viral infections caused by the virus herpes.
  • diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or Duchenne, Becker's myopathy )
  • cancers such as those induced by oncogenes or viruses
  • viral diseases such as hepatitis B or C and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome resulting from HIV infection)
  • recurrent viral diseases such as viral infections caused by the virus herpes.
  • the composition containing a viral particle, in particular adenoviral or a viral or artificial pseudo-particle of the invention further comprises a nucleic acid and a cationic substance such as for example monocationic lipids (for example DOTMA, lipofectin, DOTAP, DOPE ...), polycationic lipids (DOGS, ffransfectam, Lipofectamine, ...), cholesterol or its derivatives, phospholipids, polycarbenes ( polybrene, %), carbohydrates (DEAE-dextran, polyamino acids, ...), cationic polymers, ... It can also include neutral or uncharged lipids.
  • monocationic lipids for example DOTMA, lipofectin, DOTAP, DOPE
  • polycationic lipids DOGS, ffransfectam, Lipofectamine, ...)
  • cholesterol or its derivatives cholesterol or its derivatives
  • phospholipids polycarbenes ( polybrene, %)
  • carbohydrates DEAE-dextran, poly
  • said nucleic acid contains one or more gene (s) of interest placed under the control of the elements necessary for its (their) expression in a host cell and / or a selection marker as described above.
  • a composition according to the invention can be produced in a conventional manner.
  • the therapeutic or prophylactic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a carrier or such a diluent is non-toxic to the patient. It may be a solution for injection, an isotonic solution, the pH of which is compatible with in vivo use, a solution of dextrose, glycerol, mannitol, or the like and also optionally containing dispersing agents and / or pharmacologically compatible wetting agents.
  • a composition according to the invention can be administered by the local, systemic or aerosol route, in particular by the intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intratumoral, intrapulmonary, intranasal or intratracheal route.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary depending on various parameters, for example, the individual or disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • the viral particles according to the invention can be formulated in doses of between 10 4 and 1 ⁇ 1 4 pfu (units forming plaques), advantageously 10 ⁇ and 1 ⁇ 13 pfu and, preferably, 10 ⁇ and 10 ⁇ 2 pfu .
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable adjuvant or excipient.
  • the composition according to the invention can also be formulated in the form of a solid, semi-solid preparation, in particular in the form of a gas, a tablet, a capsule, a powder, a capsule, a granule, a cream, a solution, a suppository, an aerosol, depending on the route of administration selected.
  • the active ingredient can be formulated with conventional pharmaceutical carriers known to those skilled in the art.
  • These supports include in particular a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, sucrose, gum arabic or the like.
  • a preparation of capsules can also be obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the mixture obtained into soft or hard capsules.
  • a preparation in the form of a syrup or elixir may contain the active ingredient together with a sweetener, an antiseptic, as well as a flavoring agent and an appropriate color.
  • the water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersing agents or wetting agents, or suspending agents, as well as with flavor correctors or sweeteners.
  • Suppositories are used for rectal administration which are prepared with binders that melt at rectal temperature, for example cocoa butter or polyethylene glycols.
  • the active principle can also be formulated in the form of microcapsules, optionally with one or more additive supports.
  • the viral particles, in particular adenoviral, or the pseudo-particles according to the invention can also be complexed or associated with synthetic compounds or natural as described in the introductory part of this application, in O'Riordan et al., (1999, Human Gene Therapy, 10, 1349-1358) or in patent application WO 98/44143 or US patent 5,928,944 .
  • the content of these documents is incorporated into the present request by reference.
  • the present invention relates to the use of a peptide fragment, of a modified adenoviral fiber, of a viral particle, in particular adenoviral, of a pseudo-particle or of a host cell according to the invention or of an adenovirus capable of being obtained by a method according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment of the human or animal body.
  • the drug can be administered directly in vivo (for example by intravenous injection, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol ).
  • the invention also extends to a treatment method according to which a therapeutically effective amount of an adenovirus or of a host cell or of a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a patient in need of such treatment .
  • a therapeutically effective amount is such that it makes it possible to observe a desired effect in the organism treated which can be followed by various techniques well known to those skilled in the art.
  • a desired effect may consist of the transfer of a nucleic acid into the target cells of the host.
  • Such a transfer can be evaluated by any method demonstrating either said transfer or the expression of a gene encoded by said nucleic acid (by polymerase chain reaction, PCR, by hybridization analyzes by Northern or by Southern, by immunodetection of the encoded peptide .).
  • PCR polymerase chain reaction
  • hybridization analyzes by Northern or by Southern, by immunodetection of the encoded peptide .
  • the invention relates to the use of a peptide fragment, of a modified adenoviral fiber, of a viral particle, in particular adenoviral, of a pseudo-particle or of a host cell according to the invention.
  • invention or an adenovirus capable of being obtained by a method according to the invention to allow the transfer of a nucleic acid (plasmid, DNA, RNA, PNA, viral genome, etc.) of interest into target cells , in vivo or in vitro.
  • the invention relates to antibodies specifically directed against a modified adenoviral fiber according to the invention.
  • Such antibodies, and especially monoclonal antibodies, are easily obtained by immunization of animals immunocompetent with the peptide sequences or the fibers modified according to the invention in accordance with the usual practices in the field of the production of antibodies from a peptide or an identified polypeptide.
  • Such antibodies, and in particular specific antibodies can be useful for the implementation, for example, of monitoring the treatment of patients to which the particles or pseudo-particles of the invention are administered. They can also be used for the preparation of a composition intended for administration in vivo in the patient treated with the particles or pseudo-particles of the invention in order to allow the interruption of said treatment.
  • An antibody can also be modified to allow its detection, for example by incorporating a marker or an enzyme capable of reacting with a substrate, in particular a chromogenic substrate. Such applications are well known in the field of diagnostics.
  • the NM522 (Stratagene) strain is suitable for the propagation of phage vectors M13.
  • Amplification techniques by PCR are known to those skilled in the art (see for example PCR Protocols-A guide to methods and applications, 1990, published by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 'ends with the large fragment of DNA polymerase I from E. coli (Klenow).
  • the Ad5 nucleotide sequences are those used in the Genbank database under the reference M73260.
  • the cells are transfected according to standard techniques well known to those skilled in the art. Mention may be made of the calcium phosphate technique (Maniatis et al., Supra), but any other protocol can also be used, such as the DEAE dextran technique, electroporation, methods based on osmotic shock, microinjection or methods based on the use of cationic lipids. As for the growing conditions, they are classic.
  • EXAMPLE 1 Construction of an adenovirus having a host tropism towards cells expressing the GRP receptor (for qastrin releasing peptide in English).
  • the plasmid pTG6593 is derived from p poly II (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) by introduction of the complete gene coding for the Ad ⁇ fiber in the form of an EcoRI-Smal fragment (nucleotides (nt) 30049 to 33093).
  • the Hind ⁇ - Sma ⁇ fragment (nt 31994-33093) is isolated and cloned into M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) digested with these same enzymes, to give M13TG6526.
  • the latter is subjected to a directed mutagenesis using the oligonucleotide OTG7000 (SEQ ID NO: 2) (Sculptor kit, in vitro mutagenesis, Amersham) in order to introduce an adapter coding for a spacer arm of 12 amino acids of PSASASASAPGS sequence.
  • the mutated vector thus obtained, M13TG6527 is subjected to a second mutagenesis making it possible to introduce the sequence coding for the 10 residues of the GRP peptide (GNHWAVGHLM; Michael and al., 1995, Gene Ther. 2, 660-668).
  • the oligonucleotide OTG7001 (SEQ ID NO: 3) is used for this purpose.
  • the H / ⁇ dlll-S al fragment is isolated from the mutated phage M13TG6528 and introduced by the homologous recombination technique (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810) into the plasmid pTG6590 carrying the adenoviral genome fragment Ad5 extending from nt 27081 to 35935 and linearized by Mun ⁇ (nt 32825).
  • the Spel-Scal fragment (carrying nt 27082 to 35935 of the Ad5 genome modified by introduction of the spacer arm and of the GRP peptide) is isolated from the preceding vector designated pTG8599 then is exchanged for the equivalent fragment of pTG6591 previously digested with these same enzymes.
  • pTG6591 comprises the wild adenoviral sequences from positions 21562 to 35935.
  • pTG4600 from which the BsfEII fragment (nt 24843 to 35233) is isolated.
  • the vector pTG4601 is generated.
  • a cassette allowing the expression of the LacZ gene is introduced in place of the adenoviral region E1 by homologous recombination between the plasmid pTG4601 linearized by C / al and a BsrG ⁇ -Pst ⁇ fragment comprising the LacZ gene coding for ⁇ -galactosidase under control of the MLP promoter of Ad2 and the polyadenylation signal of the SV40 virus.
  • This fragment is isolated from the vector pTG8526 containing the 5 ′ end of the viral genomic DNA (nt 1 to 6241) in which the E1 region (nt 459 to 3328) is replaced by the LacZ expression cassette. Its construction is within the reach of the skilled person.
  • the final vector is designated pTG4628.
  • the corresponding viruses AdTG4601 and AdTG4628 are obtained by transfection of the adenoviral fragments released from the plasmid sequences by Pacl digestion in line 293.
  • AdTG4601 carries the complete Ad5 genome in which the fiber gene comprises at its 3 ′ end an arm spacer followed by the GRP peptide.
  • the recombinant virus AdTG4628 further carries the expression cassette for the LacZ reporter gene under the control of the adenoviral promoter MLP.
  • the expression of the messengers coding for the latter is studied in 293 cells and in Swiss-3T3 murine cells (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620) by Northern-blot .
  • a mixture of 2 DNA fragments complementary to the sequence coding for the GRP receptor, labeled by conventional techniques with the 32p isotope is used.
  • the fragments are produced by reverse PCR from cellular RNA. totals using the oligonucleotides OTG10776 (SEQ ID NO: 4) and oTG10781 (SEQ ID NO: 5) (Battey et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the competitor consists of the head of the Ad ⁇ fiber produced in E. coli, the properties of which have been shown to bind to the adenoviral cellular receptor (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246).
  • the monolayer cells are previously incubated for 30 min in the presence of PBS or of increasing concentrations of recombinant Ad5 head (0.1 to 100 ⁇ g / ml) in DMEM medium (Gibco BRL) supplemented with 2% fetal calf serum ( FCS).
  • the AdTG4628 virus the fiber of which contains the GRP peptide
  • the recombinant AdLacZ virus (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630) which carries a native fiber gene is used as a control and under the same experimental conditions.
  • the cells are then fixed and the expression of the LacZ gene evaluated (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142).
  • the number of blue cells is representative of the effectiveness of the viral infection.
  • Competitive inhibition results in a reduction in the number of stained cells compared to an uninfected control (PBS).
  • EXAMPLE 2 Construction of an adenovirus exhibiting a tropism towards tumor cells expressing mucins
  • EXAMPLE 3 Construction of an adenovirus exhibiting a tropism towards tumor cells expressing ⁇ 4 ⁇ 1 integrins
  • EXAMPLE 4 Construction of an adenovirus having a host tropism towards cells expressing the EGF receptor (Epidermal Growth Factor in English).
  • This example describes a fiber carrying the EGF sequences at its C-terminal end.
  • the oligonucleotides OTG11065 (SEQ ID NO: 6) and oTG11066 (SEQ ID NO: 7) are used to amplify a Hind ⁇ - Xba ⁇ fragment from the plasmid M13TG6527.
  • the oligonucleotides OTG11067 (SEQ ID NO: 8) and 0TGHO68 (SEQ ID NO: 9) make it possible to generate an Xho ⁇ -Sma ⁇ fragment (ranging from the stop codon to nt 33093) from M13TG6527.
  • the complementary EGF DNA obtained from ATCC (# 59957), is amplified in the form of an Xho ⁇ -Xba ⁇ fragment using the oligonucleotides oTG 11069 (SEQ ID NO: 10) and OTG11070 ( SEQ ID NO: 11).
  • the 3 fragments digested with the appropriate enzymes are then religated to give a Hind ⁇ - Sma ⁇ fragment containing the EGF fused at the C-terminal end of the fiber.
  • the same homologous recombination procedure as that described in Example 1 is applied to place this fragment in its genomic context.
  • the cloning steps can be simplified by introducing a single Ss BI site into the region targeted by conventional mutagenesis techniques on the M13TG6526 matrix using the oligo oTG7213 (SEQ ID NO: 57).
  • the plasmid carrying the total genome of the modified Ad ⁇ pTG4609 is obtained. Its equivalent carrying the LacZ expression cassette in place of the E1 region is obtained as previously described in Example 1 and is named pTG4213.
  • the homologous recombination between pTG4609 or pTG4213 linearized by ⁇ sfBI and the preceding Hind ⁇ - Sma ⁇ fragment generates the plasmid pTG4225 and pTG4226 carrying the E1 region respectively. wild or the LacZ expression cassette.
  • the AdTG4225 and AdTG4226 viruses can be produced conventionally by transfection of an appropriate cell line, for example overexpressing the EGF receptor. To test the specificity of infection of these viruses, murine fibroblast cells NR6 and NR6-hEGFR cells expressing the human EGF receptor can be used. Competitions with the recombinant Ad ⁇ head or with EGF make it possible to evaluate the intervention of natural cellular receptors and EGF to mediate virus infection.
  • the mutation of the adenoviral fiber region involved in the interaction with the natural cellular receptor has been undertaken in order to eliminate the ability of the fiber to bind its natural receptor and the addition of a ligand will modify the tropism of corresponding adenoviruses.
  • the Ad5 fiber sequences encoding the region extending from residues 443 to 462 have been subjected to various mutations.
  • the deletion of sheet D implements the mutagenesis oligonucleotide oTG7414 (SEQ ID NO: 12) and the deletion of the CD loop the oligonucleotide oTGA (SEQ ID NO: 13).
  • the oligonucleotide oTGB (SEQ ID NO: 14) allows the deletion of the CD loop and of sheet D.
  • oligonucleotides contain a ⁇ amHI site making it possible to easily detect the mutants and, also, to insert the sequences coding for a ligand, for example the EGF peptide.
  • Another series of modifications consists in replacing these deleted regions by the equivalent sequences originating from the Ad3 fiber. Indeed, numerous data show that Ad ⁇ and Ad3 do not bind to the same receptor, so that such a substitution should abolish infection mediated by the Ad5 receptor and target the cells carrying the Ad3 receptor.
  • This target region of the adenoviral head was also modified by a series of point mutations: - replacement of the elbow aa GSLA in elbow aa DKLT: oTGC
  • G443 in D oTGE (SEQ ID NO: 20), - L44 ⁇ in F: oTGF (SEQ ID NO: 21),
  • OTGE to I introduce mutations in the CD loop of the adenoviral fiber on amino acids which are non-conservative between Ad ⁇ and Ad3 whereas oTGJ to K relate to amino acids of the D sheet not committed in a hydrogen bond stabilizing the structure.
  • Mutagenesis can be carried out on the vector M13TG6 ⁇ 26 or M13TG6528.
  • the first carries the wild Hind ⁇ - Sma ⁇ fragment and the second this same fragment modified by the insertion of GRP sequences.
  • the plasmids carrying the adenoviral genome can be reconstituted as described above for the plasmids pTG422 ⁇ (wild E1) and pTG4226 (LacZ in place of the E1 region).
  • Viruses are generated by transfection of 293 cells or of cells overexpressing the ligand-binding receptor concerned. Such cells can be generated by transfection of the corresponding complementary DNA.
  • Cells which do not naturally express the natural cellular receptor for adenoviruses are preferably used, for example the Daudi line (ATCC CCL213).
  • EXAMPLE 6 Modifications of the fiber head to eliminate the binding to the natural cellular receptor.
  • the mutation of the AB region (residues 404-418) of the adenoviral fiber was undertaken in order to eliminate the ability of the fiber to bind its natural receptor and the addition of a ligand will make it possible to modify the tropism of the corresponding adenoviruses.
  • Mutagenesis can be carried out on the vector M13TG6526 or M13TG6528.
  • the first carries the wild H / n III-SmaI fragment and the second this same fragment modified by the insertion of GRP sequences.
  • the plasmids carrying the adenoviral genome can be reconstituted as described previously for the plasmids pTG422 ⁇ (wild E1) and pTG4226 (LacZ in place of the E1 region) (by homologous recombination with the plasmid pTG4609 or else pTG4213).
  • Viruses are generated by transfection of cells 293, 293 expressing wild fiber (Legrand et al., 1999; J.
  • Virol., 73, 907-919 or else cells overexpressing the ligand-binding receptor concerned.
  • Such cells can be generated by transfection of the corresponding complementary DNA.
  • Cells which do not naturally express the natural cellular receptor for adenoviruses are preferably used, for example the Daudi line (ATCC CCL213).
  • the viruses purified after amplification in 293 cells are deposited on 10% acrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE).
  • the different proteins are detected by staining with silver nitrate.
  • the fiber is revealed specifically by performing a westem-blot using a serum directed against the head of the Ad ⁇ fiber (Henry et al., 1994, supra).
  • An intense signal at the expected size indicates that the viruses incorporate stoichiometric amounts of the protein of interest. Since only the trimeric fiber is capable of binding the penton base (Novelli and Boulanger, 1991, supra) and of being incorporated into the particle, detection of the protein in the above experiment indicates that the modified fiber is still capable of forming trimer.
  • the use of the modified fiber to allow the entry of the corresponding mutated virus can be studied by carrying out the competition experiments using a recombinant head as described above in Example 1B. Effective infection in the presence of saturated concentrations of wild peptide indicates infection independent of receptor binding natural primaries. This suggests a greatly reduced affinity of the modified fiber for its receptors.
  • EXAMPLE 7 Insertion of the ligand into a capsid protein other than the fiber in combination with one of the modifications of the aforementioned fiber.
  • This example describes the insertion of the EGF ligand into the hexon capsid protein.
  • the corresponding adenovirus has lost its capacity for attachment to the natural cellular receptor.
  • Its genome may for example include a modified fiber gene or be devoid of at least part of the fiber sequences.
  • a transfer plasmid is constructed for homologous recombination covering the region of the Ad ⁇ genome coding for hexon (nt 18842-21700).
  • the Ad ⁇ Hin ⁇ ⁇ - Xho ⁇ fragment (nt 18836-24816) is cloned into pBSK + (Stratagene) digested with these same enzymes to give the plasmid pTG4224.
  • the sequences encoding the EGF peptide are introduced into the hypervariable loop L1 of the hexon by creation of chimeric fragments by PCR: hexon (nt19043-19647) -X6al-EGF- ⁇ stGI- hexon (nt19699-20312).
  • the fragment nt19043 to 19647 is obtained by PCR amplification from the plasmid pTG3602 with the oligonucleotides 0 OTG11102 (SEQ ID NO: 28) and OTG11103 (SEQ ID NO: 29).
  • the nt19699 to 20312 fragment is amplified from the same DNA with the oligonucleotides OTG11104 (SEQ ID NO: 30) and oTG11105 (SEQ ID NO: 31).
  • EGF is cloned from the cDNA using the oligonucleotides OTG11106 (SEQ ID NO: 32) and oTG11107 (SEQ ID NO: 33) making it possible to ⁇ put the coding sequence of EGF in phase with hexon.
  • the PCR products are digested with the appropriate enzymes and then religated.
  • the chimeric fragment can then be inserted by homologous recombination into the plasmid pTG4224 linearized with Nde ⁇ (nt 19549), to give pTG4229.
  • the sequences coding for the modified hexon can be obtained by 0 Hin ⁇ ⁇ - Xho ⁇ digestion and replaced in their genomic context by homologous recombination.
  • One can use the vector pTG3602, pTG4607, pTG4629 linearized by Sgf ⁇ or a vector carrying the adenoviral genome deleted sequences from the fiber (as pTG4607 described below) or expressing a modified fiber.
  • the adenoviral genome incapable of producing a functional native fiber is obtained by a deletion touching the initiator codon but not extending to the other adenoviral ORFs.
  • the procedure is as follows: the adenoviral fragment at ⁇ 'of the deletion (nt 30664 to 31041) is amplified by PCR using the primers oTG7171 and oTG727 ⁇ (SEQ ID NO: 34 and 3 ⁇ ). Amplification of the 3 ′ fragment (nt 31129 to 33099) uses the primers oTG7276 and OTG7049 (SEQ ID NO: 36 and 37).
  • the PCR fragments are digested with Xho ⁇ and ligated before being introduced by homologous recombination into the vector pTG6591 linearized by Nde ⁇ , to give pTG4602. Then the BstEW fragment isolated from the latter is subjected to homologous recombination with the vector pTG3602 digested with Spel. We obtain pTG4607.
  • the vector pTG4629 is equivalent to pTG4607, but also carries the LacZ expression cassette in place of E1.
  • the corresponding viruses can be obtained after transfection of cells 293, 293 expressing wild fiber (Legrand et al., 1999, supra) or cells overexpressing the EGF receptor.
  • the study of the specificity of infection can be carried out as described previously using the EGF as a competitor (see Example 1).
  • EXAMPLE 8 Construction of an adenovirus exhibiting a tropism with regard to cells expressing particular glycoproteins, namely heparan sulfate qlycoproteins
  • This example describes a fiber carrying seven lysine residues located following the linker polypeptide (PSASASASAPGS) coded by SEQ ID NO: 2, at the C-terminal end and which confer the property of binding to glycoproteins called "heparan sulfate glycoproteins" .
  • the oligonucleotide oTG12125 (SEQ ID NO: 43) is hybridized to the construct M13TG6527 in order to generate by mutagenesis the construct M13TG6670.
  • the homologous recombination step between the linearized plasmid pTG4213 by cleavage with SsfBI and the H / ⁇ III-SmaI fragment of M13TG6670 makes it possible to obtain the plasmid pTG4274.
  • the corresponding adenoviral virus AdTG4274 is obtained after transfection of said plasmid in the complementation line 293 and culture under the usual culture conditions, ⁇
  • competition experiments with a recombinant adenovirus can be performed (Example 1).
  • EXAMPLE 9 Construction of adenoviruses having a host specificity 0 directed to tumor cells expressing mucins.
  • This example describes the production of a fiber carrying at its C terminal end the peptide EPPT (described in US Pat. No. 6,691,693) which confers specificity with regard to the mucins overexpressed on the surface of certain 6 tumor cells.
  • Construction M13TG6627 is subjected to a mutagenesis step directed using the oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) in order to generate the construction M13TG6672.
  • the plasmid pTG4278 is obtained according to the procedure described above. The introduction of the mutation into the viral genome is carried out as described in Example 8.
  • Virus 0 AdTG4278 is produced after transformation and culture in line 293.
  • Competitive experiments of viral infection using the adenoviral head and with the soluble peptide EPPT shows that it is possible to assess the implication natural cellular receptors and mucins in the infectious process of adenovirus. ⁇
  • Example 10 Construction of an adenovirus exhibiting specificity with respect to tumor cells expressing the ⁇ 4 ⁇ 1 integrins.
  • This example describes an adenoviral fiber carrying the peptide sequence LDV 0 (see US 6,628,979) at its C-terminal end in order to confer on the protein the ability to bind to expressing the ⁇ 4 ⁇ 1 integrins which are overexpressed on the surface of certain tumor cells.
  • the vector M13TG6627 is subjected to a mutagenesis step directed using OTG11991 (SEQ ID NO: 4 ⁇ ) in order to generate the modified vector M13TG 13265.
  • the incorporation of this mutation into the viral genome is carried out according to the protocol described in Example 6.
  • the virus is then produced using the complementation line 293. Competition experiments are carried out according to the protocol described in Example 1 using the fiber head of 'Ad ⁇ produced in E.
  • Example 11 Modification of the fiber head so as to eliminate the binding to its natural cellular receptor.
  • the mutagenesis is carried out using the vectors M13TG6626, ⁇ M13TG6628, M13TG6670, M13TG6572 or M13TG13265 described in the previous examples.
  • the plasmids carrying the adenoviral genome are produced as indicated above and the viral particles are obtained by transfection and culture in: the cell line 293, 0 - or the cell line 293 expressing the wild adenoviral fiber (Legrand et al., 1999, J. Virol, 73, 907-919), or cells overexpressing the receptor corresponding to the ligand used. Such cells can be generated by transfection with the corresponding cDNA.
  • ⁇ cells which do not express the natural adenoviral receptor are preferably used, such as for example the Daudi (ATCC CCL213) or CHO (ATCC Ccl61) line.
  • the modified viral particles are deposited on a 10% SDS polyacrylamide gel.
  • the different viral proteins are revealed by silver staining.
  • the fiber protein is then specifically detected by "western blot" using antibodies directed against the adenoviral head (Henry et al., 6 1994, supra). In the present case, a strong signal is observed for a band whose migration corresponds to the expected size. This clearly shows that the viruses incorporated during their production a stoichiometric amount of mutated fiber. Since only the fiber in its trimeric form can bind the penton base and then be packaged (Novelli 0 and Boulanger, 1991, supra), the presence of this signal at the expected position indicates that the fiber modified according to the invention is always capable of trimerizing.

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Abstract

La présente invention a pour objet une fibre d'un adénovirus modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 491 et 505 de la SEQ ID NO: 1, les particules virales ou les pseudo-particules comprenant une telle fibre et leurs utilisations.

Description

FIBRE ADENOVIRALE MODIFIEE ET UTILISATIONS
La présente invention a notamment pour objet une fibre adénovirale, mutée dans une région impliquée dans la reconnaissance et la liaison au récepteur cellulaire naturel des adenovirus. Elle concerne également des particules virales, plus particulièrement adénovirales, et des pseudoparticules, portant à leur surface une telle fibre, éventuellement combinée à un ligand qui confère auxdites particules et pseudo-particules une spécificité d'hôte modifiée, voir ciblée. L'invention présente un intérêt tout particulier dans le cadre de la mise au point de vecteurs ou de compositions utilisables dans le cadre de la mise en œuvre de protocoles de thérapie génique.
Depuis longtemps, les adenovirus sont décrits comme un système naturel très efficace pour transférer un matériel biologique dans des cellules cibles. C'est la raison pour laquelle les vecteurs adénoviraux sont aujourd'hui largement utilisés dans de nombreuses applications de thérapie génique.
Mis en évidence dans de nombreuses espèces animales, ils sont peu pathogènes, non-intégratifs et se répliquent aussi bien dans les cellules en division que quiescentes. En outre, ils présentent un large spectre d'hôte et sont capables d'infecter un très grand nombre de types cellulaires tels que par exemple les cellules épithéliales, endothéliales, les myocytes, les hépatocytes, les cellules nerveuses et les synoviocytes (Bramson et al., 1995, Curr. Op. Biotech. 6, 590-595).
Le génome adénoviral est constitué d'une molécule d'ADN linéaire, bicatenaire d'environ 36kb contenant deux régions répétées inversées (désignées ITR pour Inverted Terminal Repeat) encadrant les gènes codant pour les protéines virales. Les gènes précoces sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome adénoviral (E1 à E4 ; E pour early en anglais), comportant 6 unités transcriptionnelles munies de leurs propres promoteurs. Les gènes tardifs (L1 à L5 ; L pour late en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif LP (pour Major Late Promoter en anglais). Le cycle infectieux intracellulaire des adenovirus est bien documenté dans la littérature et repose sur deux étapes essentielles :
(i) la phase précoce, qui précède l'initiation de la réplication, permet de produire les protéines précoces régulant la réplication et la transcription de l'ADN viral,
(ii) la phase tardive, qui suit la réplication du génome, au cours de sont laquelle synthétisées les protéines structurales qui constituent la base des particules adénovirales virales (ou capsides). L'assemblage des nouveaux virus s'effectue ensuite dans le noyau : dans un premier temps, les protéines virales s'assemblent de manière à former des capsides vides de structure icosaédrique dans lesquelles le génome néo formé est encapsidé. Les adenovirus libérés sont ensuite susceptibles d'infecter d'autres cellules permissives. Plus particulièrement, au cours de l'infection, les adenovirus pénètrent dans les cellules par un processus d'endocytose faisant suite à la fixation de la particule adénovirale sur un récepteur spécifique présent à la surface des cellules permissives. Lors de ce processus, la fibre et le penton base présents à la surface de la particule adénovirale jouent un rôle critique dans l'attachement cellulaire des virus et leur internalisation (Wickham et al., 1993, Cell, 73, 309-319). En effet, l'adénovirus se lie à un récepteur cellulaire (notamment le CAR) présent à la surface des cellules permissives par l'intermédiaire de ladite fibre sous sa forme trimérique (Philipson et al.,
1968, J. Virol. 2, 1064-1075 ; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673) puis la particule virale est internalisee par endocytose grâce à la liaison du penton base aux intégrines cellulaires αvβ3 et αvβ5 (Mathias et al., 1994,
J. Virol. 68, 6811-6814).
Cette faculté naturelle qu'ont les adenovirus à pénétrer dans les cellules a été largement exploitée afin de permettre le transport de macromolécules dans les cellules (Otero et al., 1987, Virology, 160, 75-80 ;
Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617 ; Seth et al., 1984, Mol. Cell Biol.,
4, 1528-1533 ; Defer et al., 1990, J. Virol., 64, 3661-3673 ; Rosenfeld et al., 1991 , Science, 252, 431-434 ; Curiel et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 8850-8854 ; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143-155 ; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2581-2584 ; Curiel et al., 1992, Hum. Gène Therapy, 3, 147-154). Par exemple, outre le transfert du génome adénoviral lui-même, comprenant préférentiellement en outre une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt (adenovirus recombinant), les adenovirus sont capables de favoriser le transfert, in vitro et in vivo, de macromolécules d'origine non virale, telles que par exemple des dextranes (Otero et al., 1987, Virology, 160, 75-80), des protéines (Carrasco et al. ,1981 , Virology, 113, 623-629 ; Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617 ; Defer et al., 1990, J. Virol., 64, 3661-3673), un ADN plasmidique associé à un ligand (Curiel et al., 1992, Hum. Gène Therapy, 3, 147-154 ; Cotton et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6094-6098), éventuellement en présence d'un anticorps neutralisant l'infection adénovirale (Michael et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 6866-6869), d'acides nucléiques (ADN, ARN, PNA) nus, ou éventuellement en présence de composés cationiques tels que des lipides cationiques (brevet US 5,928,944 ; demande de brevet WO 95/21259). Ainsi, il a été montré que l'utilisation de particules adénovirales dans le cadre de protocole de transfection de plasmide in vitro permet d'augmenter l'efficacité de transfection de 100 à 1000 fois. Les contenus des publications et demandes de brevet citées ci-dessus sont incorporés dans la présente demande à titre de références dans leur intégralité.
Les adenovirus ont fait l'objet de nombreuses études et plusieurs équipes scientifiques ont également développé des vecteurs adenoviraux defectifs pour la réplication, c'est à dire dont le génome a été manipulé de telle sorte que ces vecteurs adenoviraux soient incapables de se diviser ou de proliférer dans les cellules qu'ils infectent. Les vecteurs adenoviraux defectifs sont notamment obtenus par délétion d'au moins une partie de la région E1 (pour des exemples de vecteurs adenoviraux defectifs, voir notamment les demandes de brevet WO 94/28152 et WO 94/12649).
La fibre adénovirale est composée de trois domaines distincts (Chroboczek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200) : (a) à son extrémité N-terminale, se situe la queue, dont la séquence est très conservée d'un sérotype adénoviral à l'autre. Elle interagit avec le penton base et assure l'ancrage de la molécule dans la capside ; (b) au centre, se situe la tige ; il s'agit d'une structure en bâtonnet composée d'un certain nombre de répétitions de feuillets, dont le nombre varie selon les sérotypes considérés ;
(c) à son extrémité C-terminale, se situe la tête qui présente une structure globulaire sphérique renfermant les signaux de trimérisation (Hong et Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078 ; Novelli et Boulanger, 1991 , J. Biol. Chem. 266, 9299-9303 ; Novelli et Boulanger, 1991 , Virology 185, 365-376) et est responsable de la liaison aux cellules permissives (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246 ; Louis et al., 1994, J. Virol. 68, 4104-4106). Par ailleurs, Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270) ont déterminé la structure crystallographique tridimensionnelle de la tête adénovirale. Chaque monomère comporte 8 feuillets antiparallèles désignés A à D et G à J et 6 boucles majeures de 8 à 55 résidus. Par exemple, la boucle CD relie le feuillet C au feuillet D. On indique que les feuillets mineurs E et F sont considérés comme faisant partie de la boucle DG située entre les feuillets D et G. A titre indicatif, le tableau 1 indique la localisation de ces structures dans la séquence en acides aminés de la fibre d'Adδ telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1), le +1 représentant le résidu Met initiateur. D'une manière générale, les feuillets forment une structure ordonnée et compacte alors que les boucles sont plus flexibles. Ces termes sont classiques dans le domaine de la biochimie des protéines et sont définis dans les ouvrages de base (voir par exemple Stryer, Biochemistry, 2ième édition, Chap 2, p 11 à 39, Ed Freeman et Compagny, San Francisco). Tableau 1
Les quatre feuillets A, B, C et J constituent les feuillets V dirigés vers la particule virale. Les quatre autres (D, G, H et I) forment les feuillets R, supposés faire face au récepteur cellulaire. Les feuillets V semblent jouer un rôle important dans la trimérisation de la structure alors que les feuillets
R seraient impliqués dans l'interaction avec le récepteur.
Plusieurs équipes ont déjà décrit des particules adénovirales pour lesquelles la fibre native a été mutée de manière à modifier leur tropisme naturel et changer la spécificité de liaison de cette fibre de manière à ce qu'elle reconnaisse un récepteur cellulaire différent.
Ainsi, WO 94/10323 décrit des particules adénovirales de type 5 (Ad5) dont la fibre a été mutée de manière à comprendre la séquence d'un fragment d'anticorps spécifique d'un antigène donné (de type scFv) inséré à la fin de l'une des 22 unités répétées de la tige. La spécificité d'infection des particules adénovirales ainsi mutées est modifiée de telle façon que les adenovirus produits sont capables de se fixer à des cellules présentant l'antigène cible.
US 5,543,328 décrit une fibre adénovirale chimère dans laquelle le domaine de la tête est remplacé par la séquence du facteur de nécrose des tumeurs (TNF), ou celle du peptide ApoE, de manière à rediriger la fixation des particules adénovirales modifiées vers des cellules exprimant le récepteur cellulaire du TNF ou le récepteur LDL (low density lipoprotein), respectivement.
WO 95/26412 décrit une fibre modifiée par l'incorporation d'un ligand à son extrémité C-terminale. WO 96/26281 décrit une fibre chimère obtenue par remplacement d'une partie de la fibre native et, en particulier de la tête, par la partie équivalente d'une fibre adénovirale d'un autre sérotype et, de manière optionnelle, par insertion à l'extrémité C-terminale d'un peptide RGD spécifique de la vitronectine. En outre, la demande de brevet français FR 2758821 (97 01005) a mis en évidence le rôle des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et des modules III de la fibronectine à titre, respectivement, de récepteur primaire et de co-facteur des adenovirus. De manière identique, Tomko et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci 94, 3352-3356) , Bergelson et al. (1997, Science 275, 1320-1323) et Roelvink et al. (1998, J. Virol. 72, 7909-7915) ont décrit un autre récepteur de la fibre de différents sérotypes d'adénovirus. Il s'agit d'une molécule de surface de 46 kDa, le CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor).
Dans la demande WO 98/44121 , dont le contenu fait partie intégrante de la présente demande, les inventeurs de la présente demande ont déjà décrit des modifications de la fibre adénovirale présentant un intérêt et touchant plus particulièrement le domaine s'étendant de la boucle CD au feuillet I et plus particulièrement s'étendant des résidus 441 à 557 de la fibre de l'adénovirus de type 5 (Ad5) (SEQ ID NO : 1) et 441 à 558 de la fibre de l'adénovirus de type 2 (Ad2). Ils ont par ailleurs montré qu'au sein de cette région, il peut être avantageux de modifier la partie qui comprend la boucle CD, le feuillet D et la partie proximale de la boucle DG (positions 441 à 478 de la fibre d'Ad2 et d'Adδ) et, plus particulièrement, la région s'étendant des résidus 443 à 462 pour ce qui est de l'Adδ ou 451 à 466 dans le cas de l*Ad2.
Plus spécifiquement, ils ont décrit l'intérêt de mutants de la fibre Ad5 obtenus : (i) par substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans ces régions, lesdites substitutions pouvant notamment être sélectionnées dans le groupe suivant : le résidu glycine en position 443 est substitué par un acide aspartique, le résidu serine en position 444 est substitué par une lysine, le résidu leucine en position 445 est substitué par une phénylalanine, le résidu alanine en position 446 est substitué par une thréonine, le résidu serine en position 449 est substitué par un acide aspartique, le résidu glycine en position 450 est substitué par une asparagine ou une lysine, - le résidu thréonine en position 451 est substitué par une lysine ou une leucine, le résidu valine en position 452 est substitué par une asparagine ou une thréonine, le résidu alanine en position 455 est substitué par une phénylalanine, le résidu leucine en position 457 est substitué par une alanine, le résidu isoleucine en position 459 est substitué par une alanine, et/ou (ii) par délétion de tout ou partie desdits domaines de la fibre, notamment de la boucle CD, du feuillet D et/ou de la boucle DG, et préférentiellement une délétion choisie parmi les délétions: de la région s'étendant de la serine en position 454 à la phénylalanine en position 461 , - de la région s'étendant de la valine en position 441 à la glutamine en position 453, ou de la région s'étendant de la valine en position 441 à la phénylalanine en position 461.
De façon similaire, les inventeurs de la présente demande ont précédemment mis en évidence (voir demande de brevet bénéficiant de la priorité française N°99/10859) l'intérêt que présente une fibre d'un adenovirus modifiée comprenant au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus compris dans la région de la fibre s'étendant du feuillet A au feuillet B, et incluant la boucle AB. Plus particulièrement, des mutations ont été proposées qui résident au niveau d'un ou de plusieurs résidus compris dans la boucle AB, notamment compris entre les résidus 400 et
428, plus particulièrement entre les résidus 404 et 418, et préférentiellement entre les résidus 404 et 408 de la SEQ ID NO: 1 présentant la fibre Ad5 (ou des équivalents définis dans la séquence de la fibre d'Ad2). Selon un cas préféré, le résidu muté est sélectionné parmi les résidus thréonine en position 404, alanine en position 406 et serine en position 408. Selon un cas particulier la mutation réalisée consiste en au moins une substitution d'un acide aminé choisie parmi les substitutions suivantes : le résidu serine en position 408 est substitué par un résidu présentant au moins deux groupements carboxyle, et notamment par un résidu sélectionné dans le groupe consistant en l'acide aspartique et l'acide glutamique, le résidu thréonine en position 404 est substitué par un résidu glycine, le résidu alanine en position 406 est substitué par un résidu lysine.
Ces deux inventions réalisées précédemment par les inventeurs de la présente invention, et dont les contenus sont incorporés par référence à la présente demande, décrivent des régions de la fibre adénovirale ainsi que des mutants définis dans lesdites régions qui présentent l'avantage d'inhiber ou d'empêcher la liaison au récepteur cellulaire naturel des adenovirus.
Les inventeurs ont à présent identifié de nouveaux mutants consistant en une modification, notamment en une substitution ou une délétion d'un ou plusieurs résidus de la région de la fibre adénovirale comprise entre les résidus 491 et 505 et montré leur intérêt en vue d'inhiber ou d'empêcher l'infectivité des particules adénovirales présentant une telle fibre modifiée à l'égard des cellules normalement permissives. Le but de la présente invention est notamment de proposer une nouvelle alternative permettant de diminuer les quantités thérapeutiques de particules adénovirales à utiliser et de cibler l'infection vers les cellules à traiter. Cette spécificité est particulièrement intéressante lorsque l'on met en oeuvre une particule adénovirale exprimant un gène cytotoxique afin d'éviter la propagation de l'effet cytotoxique aux cellules saines. Les avantages procurés par la présente invention sont principalement de réduire les risques de dissémination et les effets secondaires liés à la technologie adénovirale. En outre, les enseignements de la présente invention permettent la mise au point d'autres systèmes de ciblage destinés aux développement de méthodes de traitement par administration de vecteurs viraux, spécialement des vecteurs viraux recombinants, ou de vecteurs non viraux.
Ces nouveaux mutants de la fibre adénovirale permettent notamment l'obtention de particules virales qui présentent les propriétés suivantes : (i) la particule virale comprenant ladite fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires adenoviraux naturels, c'est à dire que la spécificité d'hôte de ces particules virales portant la fibre mutée est réduite, voir inhibée, par comparaison à la spécificité d'hôte des particules virales portant la fibre sauvage, c'est à dire non mutée ;
(ii) lorsque la particule virale comprenant ladite fibre mutée comprend en outre un ligand spécifique d'un anti-ligand, il est possible de conférer à ladite particule modifiée un nouveau tropisme envers un ou plusieurs types cellulaires spécifiques portant à leur surface ledit anti-ligand par comparaison à la particule virale non mutée. Ces nouveaux mutants de la fibre adénovirale permettent également l'obtention de pseudo-particules, notamment virales ou synthétiques, telles que décrites ci-après.
Par "la fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels", on entend indiquer que la fibre est modifiée de manière à réduire ou abolir sa capacité de liaison au récepteur cellulaire naturel. Une telle propriété peut être vérifiée par l'étude de l'infectivité ou de la liaison cellulaire des particules virales correspondantes en appliquant les techniques connues de l'homme du métier, et notamment par des expériences de compétition d'infection du virus portant la fibre modifiée réalisées en présence d'un compétiteur constitué par tout ou partie de la fibre adénovirale sauvage (pour plus de détail relatif à cette technique de mesure, voir la Partie Expérimentale de la présente demande). La perte de la spécificité naturelle peut être également évaluée par des études d'attachement cellulaire réalisées en présence de virus marqués (par exemple à la 3H thymidine selon la technique de Roelvink et al., 1996, J. Virol. 70, 7614-7621) ou par des études d'infectivité de cellules permissives ou exprimant la molécule de surface ciblée par le ligand (voir les exemples qui suivent). Avantageusement, "une fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels" lorsque le pourcentage d'infection résiduelle, mesurée par une expérience de compétition telle que divulguée dans les Exemples qui suivent, est compris entre environ 0 et 60%, de manière préférée entre 0 et 40% et de façon tout à fait préférée entre 0 et 20 %. En outre, selon un mode de réalisation avantageux, les propriétés de trimérisation et de liaison au penton-base de la fibre adénovirale mutée ne sont pas affectées. Ces propriétés sont aisément vérifiées selon la technique mise en oeuvre dans les Exemples qui suivent.
Au sens de l'invention, "résidus" et "amino acides" sont des synonymes. Les termes "feuillets" et "boucles" sont définis selon Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270). Les termes "virus" ou "adenovirus" sont des synonymes de "particules virales" ou "particules adénovirales", respectivement. Par particule, on entend désigner une structure comprenant des peptides et/ou des lipides qui est organisée de manière à consister en une capside pouvant en outre renfermer une macromolécule (en particulier génome viral, dextranes, protéines, acides nucléiques (ADN, ARN, PNA, ADN plasmidique,...). Par "pseudo-particules virales" ou "pseudo-particules adénovirales", on entend désigner des particules virales ou adénovirales qui ne renferment pas de génome viral ou adénoviral, respectivement (la présence d'un génome non-viral ou non-adénoviral n'étant pas exclue) ; on pourra également, dans le cas particulier où aucun génome n'est présent, se référer à des particules dites "vides". De manière alternative, par "pseudo-particules non virales", on désignera des particules artificielles, produites par exemple par l'association de séquences proteiques amino- ou carboxyterminales, de peptides ou de glycoprotéines avec des lipides. De tels lipides modifiés peuvent ensuite être incorporés dans une structure de type liposome. Une telle technique est bien connue de l'homme du métier et a déjà été appliquée par exemple pour produire des liposomes portant les glycoprotéines de surface du virus influenza (Tikchonenko et al., 1988, Gène, 63, 321-330). Ces pseudo-particules liposomales peuvent bien entendu comprendre en outre une macromolécule dont elles assurent le transport dans la cellule cible, et notamment un acide nucléique. Par "mutation", on entend désigner une délétion, une substitution ou encore une addition d'un ou plusieurs résidus ou une combinaison de ces possibilités. Selon un autre cas particulier, une telle "mutation" peut également consister en une modification, notamment chimique, d'au moins un résidu. De telles modifications consistent en particulier en une estérification, une alkylation, PEGylation, hydroxyalkylation,.... Par «séquence d'acide nucléique», on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN et/ou PNA, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un cADN (ADN complémentaire) ; un ADN génomique ; un ADN plasmidique ; un ARN ; un génome viral. Par « partie » d'une séquence d'acides aminés, on entend une séquence d'acides aminés comprenant au minimun 6 acides aminés consécutifs, de préférence 10, de manière plus préférée 15, de manière encore plus préférée 20, de manière la plus préférée 30, et/ou possédant la même activité biologique que la séquence dont ladite partie est dérivée, notamment la capacité de reconnaître et de se lier aux cellules cibles du virus.
Par « partie » d'une séquence nucléique, on entend une séquence nucléique comprenant au minimun 18 nucléotides consécutifs, de préférence 30, de manière plus préférée 45, de manière encore plus préférée 60, de manière la plus préférée 90, et/ou codant pour une séquence d'acides aminés possédant la même activité biologique que la séquence d'acides aminées codée par la séquence nucléique dont ladite partie est dérivée. Par «éléments assurant l'expression dudit gène in vivo», on entend désigner les éléments nécessaires afin d'assurer l'expression dudit gène après son transfert dans une cellule cible. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requises pour permettre l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. Le promoteur utilisé peut être un promoteur viral, ubiquitaire ou spécifique de tissu ou encore un promoteur synthétique. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs tels que les promoteurs des virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) ou du virus de la vaccine, les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies (voir par exemple le brevet US 5,874,534). La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices. Selon un cas préféré, ladite "séquence d'acide nucléique" renferme en outre un gène "hétérologue" c'est à dire dont l'origine est différente de celle de la séquence d'acide nucléique qui le renferme. Des exemples de tels gènes sont indiqués ci après. Par ailleurs, ladite séquence d'acide nucléique peut comprendre au moins deux séquences, identiques ou différentes, présentant une activité de promoteur transcriptionnel et/ou au moins deux gènes, identiques ou différents, situés l'un par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que la fonction de promoteur transcriptionnel ou la transcription desdits gènes ne soit pas affectée. De même, dans ce type de construction d'acide nucléique, il est possible d'introduire des séquences nucléiques «neutres» ou introns qui ne gênent pas la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature (WO 94/29471). Ledit acide nucléique pourra également renfermer des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration, pour la transcription ou la traduction. De telles séquences sont bien connues de l'homme de l'art. Par ailleurs, les acides nucléiques utilisables selon la présente invention peuvent également être des acides nucléiques modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des acides nucléiques stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine, qui en tant que tels n'ont pas d'effet sur l'efficacité de l'introduction de l'acide nucléique dans les cellules. La fibre selon la présente invention peut être issue d'un adenovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne, ou encore comprendre des fragments d'origines diverses, y compris des fragments d'origine hétérologue, c'est à dire non issus de fibre adénovirale ou issus de fibres non-adénovirales (on parlera alors préférentiellement de "fibre hybride"). Concernant la fibre adénovirale humaine, on préfère se référer à celle issue du sérotype C et, notamment, issue de l'adénovirus de type 2 ou 5 (Ad2 ou Ad5). La fibre d'Ad2 comporte 580 acides aminés (aa) dont la séquence est divulguée dans Hérissé et al. (1981 , Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042), dont le contenu est incorporé à la présente demande par référence. Celle d'Adδ a été déterminée par Chroboczek et Jacrot (1987, Virology 161, 549-554) et présente 582 acides aminés (SEQ ID NO: 1). Afin de simplifier l'exposé de la présente demande, seules les positions relatives à l'Adδ sont indiquées. Toutefois, il est à la portée de l'homme du métier d'identifier les positions équivalentes des différents feuillets et boucles sur la base des séquences de fibres adénovirales d'autres origines (ceci constituant un mode de réalisation équivalent à celui détaillé dans la présente demande). Par exemple, l'homme du métier peut identifier les séquences de fibres adénovirales disponibles sur les bases de données telles que GenBank et déterminer les positions équivalentes des différents feuillets, boucles et positions de résidus tels que décrits plus avant. A titre informatif, citons en particulier les références GenBank pour les séquences de la fibre adénovirales du sérotype humain 2 (# AAA92223), 3 (# CAA26029), 5 (#M 18369), 31 (#CAA54050 ou 41 (#X17016). Lorsque la fibre de la présente invention est d'origine animale, on a de préférence recours aux adenovirus bovins et, en particulier, ceux de la souche BAV-3. Ces derniers ont fait l'objet de nombreuses études et la séquence de la fibre est divulguée dans la demande WO 95/16048. Bien entendu, la fibre de la présente invention peut, outre les modifications décrites dans la présente invention, présenter d'autres modifications par rapport à la séquence native pour autant qu'elles n'affectent pas les caractéristiques des fibres proposées dans la demande. Les contenus des publications ou des références GenBank cités ci-dessus sont incorporés par référence à la présente demande dans leur intégralité. L'invention concerne également une fibre modifiée comme décrit dans la présente demande et qui renferme en outre d'autres mutations telles que par exemple celles décrites dans la demande de brevet WO 98/44121 ou dans la demande de brevet bénéficiant de la priorité française N°99/10859 (voir plus haut dans la présente demande).
Il convient de préciser que selon l'invention, la région de la fibre adénovirale Ad5 comprise entre les résidus 491 et 505 et modifiée comme décrit dans la présente demande peut bien entendue être introduite au sein d'une fibre adénovirale hétérologie, c'est-à-dire différente de la fibre adénovirale Ad5 en addition ou en substitution de la région équivalente de la dite fibre hétérologue.
Selon un premier mode de réalisation, l'invention concerne une fibre d'un adenovirus qui est modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 491 et 505 de la SEQ ID NO: 1. Préférentiellement, il s'agit d'une fibre adénovirale comprenant tout ou partie de la séquence de la fibre d'un adenovirus de type 5 (Ad5) telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1) et modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 491 et 505 de ladite séquence.
Comme indiqué précédemment, selon une variante, on peut opérer par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dans les régions exposées. On peut citer à ce titre les exemples suivants selon lesquels la fibre d'Adδ porte au moins une mutation choisie parmi les mutations suivantes : le résidu tyrosine en position 491 est substitué par un acide aspartique, le résidu alanine en position 494 est substitué par un acide aspartique, - le résidu valine en position 495 est substitué par une arginine, le résidu glycine en position 496 est substitué par une serine, le résidu phénylalanine en position 497 est substitué par un acide aspartique, le résidu méthionine en position 498 est substitué par un acide aspartique, le résidu praline en position 499 est substitué par une glycine, le résidu asparagine en position 500 est substitué par un acide aspartique, le résidu alanine en position 503 est substitué par un acide aspartique, le résidu tyrosine en position 504 est substitué par un acide aspartique, le résidu proline en position 505 est substitué par une glycine. De manière préférée, l'invention concerne une fibre d'un adenovirus de type 5 caractérisée en ce que le résidu muté est sélectionné parmi les résidus alanine en position 494 et alanine en position 503. Du fait de leur localisation spatiale dans la fibre native, ces résidus sont susceptibles de reconnaître et/ou interagir directement ou indirectement avec le récepteur cellulaire naturel de l'adénovirus concerné. Selon un mode de réalisation particulier, une fibre selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend outre les modifications décrites précédemment une ou plusieurs mutations au niveau : des boucles AB, CD, DG, GH, Hl et/ou IJ et/ou des feuillets A, B, C, D, G, H, I et/ou J, et plus particulièrement, une ou plusieurs mutations telles que décrites précédemment par le déposant dans la demande WO 98/44121 et la demande de brevet bénéficiant de la priorité française N°99/10859 (voir également plus haut).
Conformément à l'invention, il est préférable de ne pas modifier de façon drastique la structure tridimensionnelle de la fibre adénovirale ; ainsi, les acides aminés formant un coude seront remplacés par des résidus formant une structure similaire tels que ceux cités dans Xia et al. 1994.
La fibre de la présente invention peut également être modifiée par délétion. Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque l'une au moins des modifications est une délétion d'au moins 3 résidus consécutifs d'une boucle et/ou d'un feuillet, les résidus délétés peuvent être remplacés par des résidus d'une boucle et/ ou d'un feuillet équivalent dérivé d'une fibre d'un second adenovirus susceptible d'interagir avec un récepteur cellulaire différent de celui reconnu par le premier adenovirus. Ceci permet de maintenir la structure de la fibre selon l'invention tout en lui conférant une spécificité d'hôte correspondant à celle du second adenovirus. Comme indiqué dans Xia et al. (1994), la région de la fibre impliquée au cours de l'infection et interagissant avec le récepteur cellulaire est différente pour les adenovirus de types 3 et 7. Ainsi, une fibre d'Adδ ou d'Ad2 délétée d'au moins 3 résidus consécutifs parmi ceux spécifiés ci-dessus peut-être substituée par les résidus issus d'une région équivalente de la fibre d'Ad3 ou d'Ad7 pour réduire sa capacité à lier le récepteur d'Adδ et lui conférer ainsi une nouvelle spécificité envers le récepteur cellulaire d'Ad3 ou d'Ad7.
La présente invention concerne également une fibre d'un adenovirus présentant une capacité de liaison au récepteur cellulaire naturel substantiellement réduite telle que présentée ci-dessus et néanmoins capable de trimériser. Une telle propriété est notamment déterminée par la technique décrite dans la partie expérimentale de la demande.
Selon un mode de réalisation également avantageux, la fibre selon l'invention comprend en outre un ligand, ou élément de ciblage. Au sens de la présente invention, le terme "ligand" définit toute entité capable de reconnaître et de se lier ou d'interagir, de préférence avec une forte affinité, à un "anti-ligand" cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de la fibre adénovirale non mutée (i.e. les antigènes du système d'histocompatibilité de classe I, la fibronectine ou le récepteur cellulaire du virus de coxsackie (CAR). Cet anti-ligand peut être exprimé ou exposé à la surface de la cellule que l'on désire cibler (marqueur de surface cellulaire, récepteur, peptide antigénique présenté par les antigènes d'histocompatibilité...), de façon naturelle ou suite à une modification de ladite cellule cible visant à lui faire exprimer ou exposer un tel anti-ligand à sa surface. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un tel ligand peut être par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps, un lipide, un glycolipide, une hormone, un polypeptide, un peptide de courte taille, un polymère (PEG, polylysine, PEI, ...), un sucre, un oligonucléotide, un antigène, une vitamine, tout ou partie d'une lectine, du peptide JTS-1 (WO 94/40958) ou encore une combinaison de tels composés. Le terme "anticorps" désigne notamment les anticorps monoclonaux, les fragments d'anticorps (tels que par exemple le Fab) et les anticorps simple chaîne (scFv). Ces dénominations et abréviations sont conventionnelles dans le domaine de l'immunologie. Par ailleurs, de tels éléments de ciblage permettent de diriger la particule ou la pseudo-particule vers certains types cellulaires ou certains tissus particuliers (cellules tumorales, cellules de l'épithélium pulmonaire, cellules hématopoïétiques, cellules musculaires, cellules nerveuses...). Il peut en outre s'agir d'éléments facilitant la pénétration à l'intérieur de la cellule ou éventuellement la lyse des endosomes. En particulier, il peut s'agir de résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur des asialoglycoprotéines à la surface des cellules hépatiques, de ligands pouvant interagir avec des récepteurs tels que des récepteurs de facteurs de croissance, des récepteur de cytokines, de lectines, de protéines d'adhésion, il peut également s'agir d'un fragment d'anticorps tel que le fragment Fab, d'un peptide fusogénique INF-7 dérivé de la sous unité HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924), d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr, du ligand GRP (pour Gastrin Releasing Peptide), du peptide EPPT (US 5,591 ,593), du peptide LDV (US 5,628,979).
Dans le cadre de la présente invention, il peut être intéressant de cibler plus particulièrement une cellule tumorale, une cellule infectée, un type cellulaire particulier ou une catégorie de cellules portant un marqueur de surface spécifique. Par exemple, si la cellule hôte à cibler est une cellule infectée par le virus HIV (Human Immunodeficiency Virus), le ligand peut être un fragment d'anticorps dirigé contre la fusine, le récepteur CD4 ou contre une protéine virale (glycoprotéine d'enveloppe) ou encore la partie de la protéine TAT du virus HIV s'étendant des résidus 37 à 72 (Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668). S'agissant d'une cellule tumorale, le choix se portera sur un ligand reconnaissant un antigène spécifique de tumeur (par exemple la protéine MUC-1 dans le cas du cancer du sein, certains épitopes des protéines E6 ou E7 du papilloma virus HPV) ou surexprimé (récepteur à l'IL-2 surexprimé dans certaines tumeurs lymphoïdes). Si l'on désire cibler les lymphocytes T, on peut employer un ligand du récepteur de cellule T. Par ailleurs, la transferrine est un bon candidat pour un ciblage hépatique. D'une manière générale, les ligands qui peuvent être utilisés dans le contexte de l'invention sont largement décrits dans la littérature et les gènes codant pour de tels ligands peuvent être clones par les techniques standards (par exemple par amplification du cDNA,...). Il est également possible de les synthétiser par voie chimique et de les coupler à la fibre modifiée selon l'invention. A cet égard, le couplage de résidus galactosyl permet de conférer une spécificité hépatique en raison de l'interaction avec les récepteurs aux asialoglycoprotéines. Enfin, selon un mode de réalisation préféré, ledit ligand est inséré à l'extrémité C-terminale de la fibre selon l'invention ou en remplacement des résidus délétés lorsque l'une au moins des modifications est une délétion d'au moins 3 résidus consécutifs.
En fonction notamment de la nature chimique du ligand, il pourra être incorporé à la fibre modifiée selon l'invention de différentes manières, et plus particulièrement : - par clonage de la séquence nucléique codant pour ledit ligand dans la séquence nucléique codant pour la fibre d'intérêt modifiée. A cet égard on préférera la cas particulier selon lequel ladite séquence nucléique codant pour le ligand est introduite au niveau ou à proximité de la région de la séquence nucléique de la fibre codant pour la région mutée de ladite fibre; par incorporation directement sur la fibre préalablement modifiée et produite, par exemple par greffage chimique.
Un autre objet de l'invention concerne un fragment peptidique caractérisé en ce qu'il comprend la région s'étendant du résidu 491 au résidu 505 de la SEQ ID NO: 1 et en ce que ladite région est modifiée comme décrit ci-dessus.
Un tel fragment peptidique possède notamment les propriétés suivantes: (i) lorsque ce fragment peptidique est incorporé en lieu et place d'une région s'étendant des résidus 491 à 505 de la SEQ ID
NO: 1 d'une fibre adénovirale donnée (ou en des positions équivalentes), la particule adénovirale comprenant ladite fibre modifiée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels de la fibre adénovirale non modifiée ;
(ii) lorsque la particule adénovirale comprenant ladite fibre mutée selon (i) comprend en outre un ligand spécifique d'un anti- ligand, il est possible de conférer à ladite particule adénovirale modifiée un nouveau tropisme envers un ou plusieurs types cellulaires spécifiques portant à leur surface undit anti-ligand par comparaison à la particule adénovirale comprenant ladite fibre adénovirale non modifiée.
La présente invention concerne également une particule virale, notamment une particule adénovirale, qui comprend à sa surface une fibre modifiée ou un peptide selon l'invention, et éventuellement un ligand tel que défini ci-dessus. Selon un cas préféré, cette particule virale est dépourvue de fibre native fonctionnelle ou de tout autre peptide naturellement impliqué dans la fixation de ladite particule virale à sa cellule cible.
Lorsqu'une telle particule renferme un génome viral, on parle préférentiellement de virus viral et dans le cas particulier selon lequel ledit génome est en outre modifié, on parlera plus spécialement de virus viral recombinant (par exemple un adenovirus recombinant, et préférentiellement un adenovirus recombinant défectif pour la réplication). De tels cas sont décrits plus en détail ci-après. L'invention concerne donc également de tels virus et virus recombinant.
Afin d'obtenir des particules virales, notamment adénovirales, selon l'invention, la fibre modifiée ou ledit peptide, et éventuellement ledit ligand :
(i) peut être exprimé par le génome viral lui-même, notamment lorsque ladite particule virale renferme à terme un tel génome.
Dans ce cas, ledit génome renferme les séquences nucléiques nécessaires à l'expression de ladite fibre modifiée ou d'undit peptide selon l'invention, et éventuellement d'undit ligand
(ii) peut être apporté en trans par une lignée cellulaire de complémentation, telle que celles définies ci-après, qui renferme les séquences nucléiques nécessaires à l'expression de ladite fibre modifiée ou d'undit peptide selon l'invention, et éventuellement d'undit ligand
(iii) peut être incorporé à la surface de ladite particule virale par modification chimique, plus particulièrement après obtention de particules virales selon les techniques largement employées par l'homme du métier spécialisé dans la production virale. Selon un cas particulier, selon (iii), lesdites particules virales ne sont pas des particules adénovirales, et préférentiellement sont des particules virales non enveloppées. De tels virus sont largement décrits dans des ouvrages généraux de virologie, tel que par exemple Fields et al. (1990, Virology, Raven Press, NY).
Selon un mode de réalisation particulier, la particule virale de l'invention est telle que présentée ci-dessus et est caractérisée en ce que ledit ligand est inséré dans une protéine de la capside virale autre que la fibre, notamment l'hexon ou le penton dans le cas précis de particules adénovirales. Selon un mode de réalisation avantageux, lesdits génomes et particules virales sont des génomes et particules adenoviraux.
L'invention concerne également une pseudo-particule virale, notamment une pseudo-particule adénovirale, qui comprend à sa surface une fibre mutée ou un peptide selon l'invention, et éventuellement un ligand tel que défini précédemment. Selon un cas particulier de l'invention, ladite pseudo-particule virale de l'invention est "vide", c'est à dire qu'elle ne renferme pas d'acide nucléique. Toutefois, l'invention concerne également les cas pour lesquels une telle pseudo-particule virale renferme une macromolécule, et plus particulièrement un acide nucléique qui n'est pas un génome viral ou adénoviral. L'utilisation de telles pseudo-particules virales est notamment illustrée dans le document WO 95/21259 ou US 5,928,944 cité plus haut. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne en outre des pseudo-particules que l'on peut également désigner "particules artificielles".
De telles particules peuvent notamment être produites après
(i) formation de composés polaires tels que des lipides ou des glycolipides associés à des séquences proteiques amino- ou carboxyterminales, de peptides ou de glycoprotéines renfermant ou consistant en les séquences peptidiques ou la fibre adénovirale modifiée selon l'invention et (ii) incorporation desdits composés polaires modifiés dans une structure de type liposome. Une telle technique est bien connue de l'homme du métier et a déjà été appliquée par exemple pour produire des liposomes portant les glycoprotéines de surface du virus influenza (Tikchonenko et al., 1988, Gène, 63, 321-330).
Selon un autre cas particulier de l'invention, ladite pseudo-particule est produite après
(i) formation de composés polaires tels que des lipides ou des glycolipides associés à des séquences proteiques amino- ou carboxyterminales, de peptides ou de glycoprotéines renfermant ou consistant en les séquences peptidiques ou la fibre adénovirale modifiée telles que décrites dans la demande WO 98/44121 ou la demande de brevet bénéficiant de la priorité française N°99/10859 (voir également plus haut) et
(ii) incorporation desdits composés polaires modifiés dans une structure de type liposome.
Il est également possible d'obtenir des lipides ou des polymères cationiques modifiés de manière à comprendre dans leur structure de telles séquences ou ladite fibre adénovirale modifiée. La littérature procure un grand nombre d'exemples de lipides utilisables selon l'invention. On peut également citer le cas des lipides ou des polymères cationiques généralement utilisés comme vecteurs synthétiques pour le transfert d'acide nucléique dans les cellules par transfection. A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de composés tels que ceux décrits dans Feigner et al.,
1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121 ; Hodgson et Solaiman ,
1996, Nature Biotechnology 14, 339-342 ; Remy et al., 1994, Bioconjugate
Chemistry 5, p647-654 ou dans les demandes de brevet WO 98/08489, WO
98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 ou WO 99/05183. Ces composés cationiques sont capables de former des complexes (également appelés lipoplexes ou polyplexes, ou plus généralement posiplexes) avec des acides nucléiques afin de permettre leur introduction dans les cellules (transfection). L'incorporation de telles séquences peptidiques ou de fibre adénovirale modifiée selon l'invention dans lesdits complexes permet par exemple d'obtenir des posiplexes capables de cibler un type cellulaire d'intérêt.
Lorsqu'un ligand est en outre compris dans la particule ou la pseudo- particule (virale ou artificielle), il peut être couplé de manière chimique à celle-ci. Toutefois, on préférera la variante selon laquelle les séquences codant pour le ligand sont insérées au sein du génome viral et préférentiellement adénoviral. Dans ces cas, lesdites séquences sont préférentiellement insérées au sein des séquences codant pour la fibre modifiée selon l'invention, et plus spécifiquement en phase afin de préserver le cadre de lecture. L'insertion de la séquence codant pour le ligand peut avoir lieu à un endroit quelconque du génome viral, toutefois le site d'insertion préféré est en amont du codon stop à l'extrémité C-terminale ou à la place des résidus délétés. Il est également envisageable d'introduire les séquences du ligand au sein d'autres séquences virales, notamment celles codant pour une autre protéine de capside, comme l'hexon ou le penton adenoviraux.
Avantageusement, l'invention concerne des particules adénovirales renfermant un adenovirus recombinant défectif pour la réplication, c'est à dire incapable de réplication autonome dans une cellule hôte. La déficience est obtenue par mutation ou délétion d'un ou plusieurs gènes viraux essentiels et, notamment, de tout ou partie de la région E1 dans le génome adénoviral. Des délétions au sein de la région E3 peuvent être envisagées pour accroître les capacités de clonage. Cependant, il peut être avantageux de conserver les séquences codant pour la protéine gp19k (Gooding et Wood, 1990, Critical Revie s of Immunology 10, 53-71) afin de moduler les réponses immunitaires de l'hôte. Bien entendu, le génome d'un adenovirus selon l'invention peut également comprendre des délétions ou mutations supplémentaires affectant d'autres régions, notamment les régions E2, E4 et/ou L1-L5 (voir par exemple WO9 4/28152 ou WO 94/12649 ou Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339 décrivant la mutation thermosensible du gène DBP de E2). Selon un mode de réalisation préféré, un virus (spécialement un adenovirus) recombinant de l'invention comprend un ou plusieurs gène(s) d'intérêt placé(s) sous le contrôle des éléments nécessaires à son (leur) expression dans une cellule hôte. Le gène en question peut être d'une origine quelconque, génomique, ADNc (ADN complémentaire) ou hybride
(minigène dépourvu d'un ou plusieurs introns). Il peut être obtenu par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire ou par synthèse chimique. Il peut coder pour un ARN anti-sens, un ribozyme ou un ARNm qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt. Celui-ci peut être cytoplasmique, nucléaire, membranaire ou être sécrété par la cellule hôte.
Par ailleurs, il peut s'agir de tout ou partie d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature, d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses, ou d'un polypeptide muté par rapport à la séquence native présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées.
Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser les gènes codant pour les polypeptides suivants : cytokines ou lymphokines (interférons et interleukines et notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou l'IL-12, facteurs nécrosant des tumeurs (TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...) ; récepteurs cellulaires ou nucléaires, notamment ceux reconnus par des organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence, par le virus VI H ou leurs ligands ; protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur VII, facteur VIII, facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de croissance (hGH) ; enzymes (uréase, rénine, thrombine....) ; inhibiteurs d'enzymes ( 1-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de protéases virales...) ; polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le système immunitaire....) ; protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes correspondants ; polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants trans-dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition...) ; toxines (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-
HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique ) ou immunotoxines ; et marqueurs (β -galactosidase, luciférase....) tout ou partie d'un anticorps, notamment d'un anticorps monoclonal.
Il est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.
Par ailleurs, un adenovirus recombinant selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules infectées. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme du métier.
Par éléments nécessaires à l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule hôte, on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN et la traduction d'un ARNm en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Dans le cadre de la présente invention, il peut avoir pour origine un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction... Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène à exprimer. On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), du gène TK du virus HSV-1 , précoce du virus SV40 (Simian Virus 40), adénoviral MLP ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, 1-antitrypsine (foie- spécifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique).
Bien entendu, un gène d'intérêt en usage dans la présente invention peut en outre comprendre des éléments additionnels nécessaires à l'expression (séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatrice de la transcription, site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre....) ou encore à sa maintenance dans la cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme du métier. Toutefois, l'invention concerne également des particules virales pour lesquelles le génome incorporé n'est pas un génome adénoviral. Dans ce cas, le génome viral est préférentiellement sélectionné parmi les génomes viraux correspondant à des virus non enveloppés (Fields et al., 1990,
Virology, Raven Press, NY). Selon ce mode de réalisation particulier, la fibre modifiée ou la séquence peptidique de l'invention peut être incorporée dans la particule soit
(i) par clonage de la séquence d'acide nucléique correspondante dans le génome viral en question (expression d'une protéine de fusion par exemple), (ii) par modification de la particule naturellement obtenue dans le cadre de la production du virus en question (par exemple par post-greffage chimique) ou encore (iii) par modification du génome viral de manière à ce qu'il présente les signaux requis pour son encapsidation (séquence psi,...) dans une particule d'origine adénovirale comprenant ladite fibre modifiée de l'invention (lignée cellulaire de complémentation produisant les protéines recombinées de la capside adénovirale et utilisation d'un vecteur helper). La présente invention a également trait à un fragment d'ADN codant pour une fibre ou un fragment peptidique selon l'invention, ainsi qu'à un vecteur d'expression comprenant un tel fragment d'ADN. Tout type de vecteur peut être employé à cet effet, qu'il soit d'origine plasmidique ou virale, integratif ou non. De tels vecteurs sont disponibles commercialement ou décrits dans la littérature. De même, l'homme du métier est capable d'adapter les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN selon l'invention. Selon un cas particulier de l'invention, undit vecteur sera un vecteur adénoviral capable de produire dans des conditions appropriées de culture des particules adénovirales selon l'invention, à savoir des adenovirus ou des adenovirus recombinants tels que décrits précédemment.
L'invention concerne également un procédé de préparation de pseudo-particules adénovirales selon l'invention selon lequel : (i) on transfecte le génome adénoviral codant pour une fibre modifiée selon l'invention dans une lignée cellulaire appropriée, par exemple la lignée 293, PERC6, ou une lignée dérivée ou équivalente); (ii) on cultive cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production dudit adenovirus ou dudit adenovirus recombinant, et (iii) on récupère les pseudo-particules vides en purifiant le lysat cellulaire sur un gradient de densité, notamment un gradient de chlorure de césium par exemple. Les pseudo-particules vides sédimentent par exemple à 1 ,3 g/ml de chlorure de césium tandis que les adenovirus (particules renfermant le génome adénoviral) recombinants sédimentent pour leur part à 1 ,34 g/ml (D'Hallivin, 1995, Cur. Top. Microbiol. Immunol, 199, 47-66).
Selon un autre procédé, il est possible d'obtenir des pseudo- particules vides après transfection d'un génome adénoviral portant une séquence d'encapsidation modifiée et renfermant en outre un fragment d'ADN codant pour une fibre modifiée selon l'invention dans des cellules appropriées. La modification de la région d'encapsidation permet de réduire, voir éliminer, le phénomène d'encapsidation du génome adénoviral dans les particules (Grâble et Hearing, 1992, J. Virol. 66, 723-731). Les étapes de production qui suivent la culture sont identiques à celles précédemment décrites. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un adenovirus ou d'un adenovirus recombinant (particules adénovirales ou adénovirales recombinantes) selon l'invention, selon lequel :
(i) on transfecte le génome dudit adenovirus, recombinant ou non, défectif pour la réplication ou non, dans une lignée cellulaire appropriée (293, PERC6, ou lignées dérivées ou équivalentes),
(ii) on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production dudit adenovirus ou dudit adenovirus recombinant (on peut également dire, particules adénovirales), et
(iii) on récupère ledit adenovirus ou ledit adenovirus recombinant dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement,
(iv) on purifie ledit adenovirus. Le choix de la lignée cellulaire dépend le cas échéant des fonctions déficientes de l'adénovirus selon l'invention. On utilisera notamment une lignée de complémentation capable de fournir en trans la ou les fonction(s) défectueuse(s). Les lignées 293 (ATCC CRL1573) ou PERC6 (ECACC
96022940) conviennent tout particulièrement pour complémenter la fonction E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72 ou WO 97/00326, respectivement). Pour une double déficience E1 et E2 ou E4, on peut employer une lignée parmi celles décrites dans la demande de brevet français FR 2737222 (96/04413). On peut également mettre en oeuvre un virus auxiliaire pour complémenter l'adénovirus défectif selon l'invention dans une cellule hôte quelconque ou encore un système mixte utilisant cellule de complémentation et virus auxiliaire dans lequel les éléments sont dépendants les uns des autres. Les moyens de propagation d'un adenovirus défectif sont connus de l'homme du métier qui peut se référer par exemple à Graham et Prevec, 1991 , Methods in Molecular Biology, vol 7, p 190-128 ; Ed E.J. Murey, The Human Press Inc.). Le génome adénoviral est de préférence reconstitué in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou encore recombinaison homologue (voir par exemple la demande française FR 2727689 (94/14470)). Les procédés de purification sont décrits dans l'état de la technique. On peut citer la technique de centrifugation sur gradient de densité.
La présente invention concerne également une lignée cellulaire comprenant soit sous forme intégrée dans le génome ou sous forme d'épisome un fragment d'ADN codant pour une fibre selon l'invention placé sous le contrôle des éléments permettant son expression. Ladite lignée peut dériver d'une cellule de complémentation d'une ou plusieurs fonctions adénovirales sélectionnées parmi celles codées par les régions E1 , E2, E4 et L1-L5. Elle dérive de préférence de la lignée 293 ou de la lignée PERC6. Une telle lignée peut être utile à la préparation d'un adenovirus, notamment recombinant, dont le génome est dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour la fibre (de manière à produire une fibre non fonctionnelle ou "redirigée" ou à ne pas produire de fibre ).
C'est pourquoi, l'invention concerne en outre un procédé pour produire des particules adénovirales renfermant un génome adénoviral dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour une fibre, caractérisé en ce que :
(i) on transfecte ledit génome dans une lignée cellulaire présentée ci-dessus, (ii) on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale , et (iii) on récupère ladite particule adénovirale dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, (iv) on purifie ladite particule adénovirale.
La présente invention couvre également une cellule hôte qui peut être infectée par un adenovirus selon l'invention ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention. Il s'agit avantageusement d'une cellule de mammifère et, notamment, d'une cellule humaine. Elle peut être primaire ou tumorale et d'une origine quelconque, par exemple hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage ...), musculaire, nasale, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale, rétinienne (par exemple HER pour Human Embryonic retinocyte) ou fibroblaste.
L'invention a également pour objet une composition comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, une cellule hôte, une particule virale, notamment adénovirale, ou une pseudo-particule (virale ou artificielle), selon l'invention ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention est, en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que les maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabète ou myopathie de Duchenne, de Becker...), les cancers, comme ceux induits par des oncogènes ou des virus, les maladies virales, comme l'hépatite B ou C et le SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise résultant de l'infection par le VIH), et les maladies virales récurrentes, comme les infections virales provoquées par le virus de l'herpès. Selon un mode de réalisation particulier, et comme il est décrit dans le brevet US 5,928,944, la composition renfermant une particule virale, notamment adénovirale ou une pseudo-particule virale ou artificielle de l'invention, comprend en outre un acide nucléique et une substance cationique telle que par exemple des lipides monocationiques (par exemple la DOTMA, la lipofectine, le DOTAP, le DOPE...), des lipides polycationiques (DOGS, ffransfectam, Lipofectamine,...), cholestérol ou ses dérivés, phospholipides, polycarbenes (polybrène,...), hydrates de carbone (DEAE-dextrane, acides polyaminés,...), polymères cationiques,... Elle peut en outre comprendre des lipides neutres ou non chargés. De façon préférée, ledit acide nucléique renferme un ou plusieurs gène(s) d'intérêt placé(s) sous le contrôle des éléments nécessaires à son (leur) expression dans une cellule hôte et/ou un marqueur de sélection tels que décrits plus haut. Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support ou un diluent acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support ou un tel diluent est non toxique pour le patient. Il peut s'agir de solution injectable, de solution isotonique, dont le pH est compatible avec un usage in vivo, de solution de dextrose, de glycérol, de mannitol, ou analogues et contenant également de façon optionnelle des agents de dispersion et/ou de mouillage pharmacologiquement compatibles. Une composition selon l'invention peut être administrée par voie locale, systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale, intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. En particulier, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1θ14 ufp (unités formant des plages), avantageusement 10^ et 1θ13 ufp et, de préférence, 10^ et 10^2 ufp. La formulation peut également inclure un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention peut en outre être formulée sous la forme d'une préparation solide, semi-solide, en particulier sous forme de gaz, de tablette, capsule, poudre, gélule, granule, crème, solution, suppositoire, aérosol, en fonction de la voie d'administration sélectionnée.
Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention, l'ingrédient actif peut être formulé avec des supports pharmaceutiques classiques, connus de l'homme du métier. Ces supports comprennent en particulier un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, le saccharose, la gomme arabique ou analogues.
On peut également obtenir une préparation de gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants.
Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols.
Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs.
En vue de leur utilisation pour favoriser l'introduction dans les cellules de macromolécules (notamment des acides nucléiques), les particules virales, notamment adénovirales, ou les pseudo-particules selon l'invention peuvent en outre être complexées ou associées à des composés synthétiques ou naturels comme cela est décrit dans la partie introductive de la présente demande, dans O'Riordan et al., (1999, Human Gène Therapy, 10, 1349-1358) ou dans la demande de brevet WO 98/44143 ou le brevet US 5,928,944. Le contenu de ces documents est incorporé dans la présente demande par référence.
Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation d'un fragment peptidique, d'une fibre adénovirale modifiée, d'une particule virale, notamment adénovirale, d'une pseudo-particule ou d'une cellule hôte selon l'invention ou d'un adenovirus susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques connues de l'homme du métier et de les réadminister au patient.
L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un adenovirus ou d'une cellule hôte ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Une telle quantité thérapeutiquement effective est telle qu'elle permet d'observer un effet désiré chez l'organisme traité qui peut être suivi par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, un effet souhaité peut consister en le transfert d'un acide nucléique dans les cellules cibles de l'hôte. Un tel transfert peut être évalué par toute méthode mettant en évidence soit ledit transfert soit l'expression d'un gène codé par ledit acide nucléique (par réaction de polymération en chaîne, PCR, par analyses d'hybridation par Northern ou par Southern, par immunodétection du peptide codé....). L'homme du métier est capable d'effectuer les ajustements nécessaires pour déterminer la quantité thérapeutiquement efficace la mieux appropriée.
D'une manière plus générale, l'invention concerne l'utilisation d'un fragment peptidique, d'une fibre adénovirale modifiée, d'une particule virale, notamment adénovirale, d'une pseudo-particule ou d'une cellule hôte selon l'invention ou d'un adenovirus susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention pour permettre le transfert d'un acide nucléique (plasmide, ADN, ARN, PNA, génome viral,..) d'intérêt dans des cellules cibles, in vivo ou in vitro. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne des anticorps spécifiquement dirigés contre une fibre adénovirale modifiée selon l'invention. De tels anticorps, et tout particulièrement des anticorps monoclonaux, sont aisément obtenus par immunisation d'animaux immunocompétents avec les séquences peptidiques ou les fibres modifiées selon l'invention conformément aux pratiques habituelles dans le domaine de la production d'anticorps à partir d'un peptide ou d'un polypeptide identifié. De tels anticorps, et notamment des anticorps spécifiques, peuvent être utiles pour la mise en œuvre par exemple d'un suivi de traitement des patients auxquels les particules ou pseudo-particules de l'invention sont administrées. Ils peuvent également être utilisés pour la préparation d'une composition destinée à l'administration in vivo chez le patient traité à l'aide des particules ou pseudo-particules de l'invention afin de permettre l'interruption dudit traitement. Undit anticorps peut en outre être modifié pour permettre sa détection, par exemple par l'incorporation d'un marqueur ou d'un enzyme capable de réagir avec un substrat, notamment un substrat chromogénique. De telles applications sont bien connues dans le domaine du diagnostic.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif. Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont réalisées de préférence dans la souche E. coli 5K (Hubacek et Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) ou BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). On utilise préférentiellement cette dernière souche pour les étapes de recombinaison homologue. La souche NM522 (Stratagène) convient à la propagation des vecteurs phagiques M13. Les techniques d'amplification par PCR sont connues de l'homme du métier (voir par exemple PCR Protocols-A guide to methods and applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press Inc). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Les séquences nucléotidiques Ad5 sont celles utilisées dans la banque de donnée Genbank sous la référence M73260. En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al., supra), mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de lipides cationiques. Quant aux conditions de culture, elles sont classiques. Dans les exemples qui suivent, on a recours à la lignée humaine 293 (ATCC CRL1573) et aux lignées murines Swiss 3T3 (ATCC CCL92), NR6 (Wells et al., 1990, Science 247: 962-964) et NR6-hEGFR (Schneider et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 333-336). Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées.
EXEMPLE 1 : Construction d'un adenovirus présentant un tropisme d'hôte envers les cellules exprimant le récepteur du GRP (pour qastrin releasing peptide en anglais).
A. Insertion des séquences codant pour le ligand GRP (fibre-GRP).
Le plasmide pTG6593 dérive du p poly II (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201) par introduction du gène complet codant pour la fibre d'Adδ sous la forme d'un fragment EcoRI-Smal (nucléotides (nt) 30049 à 33093). Le fragment Hind\\\-Sma\ (nt 31994-33093) est isolé et clone dans M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gène 26, 91-99) digéré par ces mêmes enzymes, pour donner M13TG6526. Ce dernier est soumis à une mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide OTG7000 (SEQ ID NO: 2) (kit Sculptor, in vitro mutagenesis, Amersham) afin d'introduire un adaptateur codant pour un bras espaceur de 12 acides aminés de séquence PSASASASAPGS. Le vecteur muté ainsi obtenu, M13TG6527, est soumis à une seconde mutagénèse permettant d'introduire la séquence codant pour les 10 résidus du peptide GRP (GNHWAVGHLM ; Michael et al., 1995, Gène Ther. 2, 660-668). On utilise à cet effet l'oligonucléotide OTG7001 (SEQ ID NO: 3). Le fragment H/πdlll-S al est isolé du phage muté M13TG6528 et introduit par la technique de recombinaison homologue (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810) dans le plasmide pTG6590 portant le fragment de génome adénoviral Ad5 s'étendant des nt 27081 à 35935 et linéarisé par Mun\ (nt 32825). Le fragment Spel-Scal (portant les nt 27082 à 35935 du génome Ad5 modifiés par introduction du bras espaceur et du peptide GRP) est isolé du vecteur précédent désigné pTG8599 puis est échangé contre le fragment équivalent de pTG6591 préalablement digéré par ces mêmes enzymes. A titre indicatif, pTG6591 comprend les séquences adénovirales sauvages des positions 21562 à 35935. On obtient pTG4600 dont on isole le fragment BsfEII (nt 24843 à 35233). Après recombinaison homologue avec le plasmide pTG3602 qui comprend le génome Ad5 (décrit plus en détail dans la demande internationale WO96/17070), on génère le vecteur pTG4601.
Une cassette permettant l'expression du gène LacZ est introduite à la place de la région adénovirale E1 par recombinaison homologue entre le plasmide pTG4601 linéarisé par C/al et un fragment BsrG\-Pst\ comprenant le gène LacZ codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur MLP d'Ad2 et le signal de polyadénylation du virus SV40. Ce fragment est isolé du vecteur pTG8526 contenant l'extrémité 5' de l'ADN génomique viral (nt 1 à 6241) dans lequel la région E1 (nt 459 à 3328) est remplacée par la cassette d'expression LacZ. Sa construction est à la portée de l'homme du métier. Le vecteur final est désigné pTG4628. Les virus correspondants AdTG4601 et AdTG4628 sont obtenus par transfection des fragments adenoviraux libérés des séquences plasmidiques par digestion Pacl dans la lignée 293. A titre indicatif, AdTG4601 porte le génome Ad5 complet dans lequel le gène de la fibre comprend en son extrémité 3' un bras espaceur suivi du peptide GRP. Le virus recombinant AdTG4628 porte en outre la cassette d'expression du gène rapporteur LacZ sous le contrôle du promoteur adénoviral MLP. B. Etude du tropisme du virus portant la fibre-GRP. La présence du peptide GRP au niveau de la fibre adénovirale permet de cibler les cellules exprimant à leur surface le récepteur au GRP. L'expression des messagers codant pour ce dernier est étudiée dans les cellules 293 et dans les cellules murines Swiss-3T3 (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620) par Northern-blot. On utilise à titre de sonde un mélange de 2 fragments d'ADN complémentaires à la séquence codant pour le récepteur au GRP marqués par les techniques conventionnelles à l'isotope 32p A titre indicatif, les fragments sont produits par PCR réverse à partir des ARN cellulaires totaux à l'aide des oligonucléotides OTG10776 (SEQ ID NO: 4) et oTG10781 (SEQ ID NO: 5) (Battey et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 395-399 ; Corjay et al., 1991 , J. Biol. Chem. 266, 18771-18779). L'intensité des ARNm détectés est beaucoup plus importante dans le cas des cellules Swiss-3T3 que dans les cellules 293, indiquant la surexpression du récepteur GRP par la lignée murine.
Des expériences de compétition sont réalisées sur les 2 types de cellules. Le compétiteur est constitué par la tête de la fibre d'Adδ produite dans E.coli dont les propriétés de liaison au récepteur cellulaire adénoviral ont été montrées (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246). Les cellules en monocouche sont préalablement incubées pendant 30 min en présence de PBS ou de concentrations croissantes de tête Ad5 recombinante (0,1 à 100 μg/ml) dans du milieu DMEM (Gibco BRL) complémenté avec du sérum de veau foetal 2% (FCS). Puis, le virus AdTG4628 dont la fibre contient le peptide GRP est ajouté à une multiplicité d'infection de 0,001 unité infectieuse/cellule pour 24h à 37°C. On utilise à titre de contrôle et selon les mêmes conditions expérimentales, le virus recombinant AdLacZ (Stratford- Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630) qui porte un gène de la fibre natif. Les cellules sont ensuite fixées et l'expression du gène LacZ évaluée (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142). Le nombre de cellules bleues est représentatif de l'efficacité de l'infection virale. Une inhibition par compétition se traduit par une réduction du nombre de cellules colorées par rapport à un témoin non infecté (PBS). L'addition de tête Ad5 recombinante à une concentration de 100 μg/ml inhibe fortement l'infection des cellules 293 par les virus AdLacZ et AdTG4628 (taux d'inhibition de 95 et 98%). Ceci suggère que la présence du compétiteur empêche l'interaction de la fibre adénovirale avec son récepteur cellulaire naturel. Par contre, les deux virus ont un comportement différent sur les cellules Swiss-3T3. L'infection du virus AdTG4628 en présence de 100 μg/ml de compétiteur n'est que partiellement inhibée alors que, dans les mêmes conditions expérimentales, celle du virus AdLacZ ayant la fibre native est totalement inhibée. Ces résultats suggèrent que l'infection des cellules Swiss-3T3 par l'AdTG4628 est en partie médiée par un récepteur indépendant, probablement le récepteur au GRP que ces cellules surexpriment. En conclusion, l'addition du ligand GRP à l'extrémité C-terminale de la fibre favorise l'infection des cellules exprimant le récepteur au GRP d'une manière indépendante de l'interaction fibre-récepteur cellulaire naturel.
EXEMPLE 2 : Construction d'un adenovirus présentant un tropisme envers les cellules tumorales exprimant des mucines
Construction: Insertion du peptide EPPT, tel que décrit dans le brevet US 5,591 ,593, à l'extrémité C-terminale de la fibre. Cette modification confère une liaison à l'égard des mucines surexprimées sur cellules tumorales.
Pour cela, à l'aide de l'oligonucléotide OTG11992: SEQ ID N° 38 et en appliquant la procédure de mutagénèse présentée à l'Exemple 1 à partir du vecteur M13TG6527, nous avons obtenu le vecteur M13TG6572.
Recombinaison homologue avec pTG4213 (voir exemple 4) pour donner pTG4278.
EXEMPLE 3. Construction d'un adenovirus présentant un tropisme envers les cellules tumorales exprimant des intégrines α4β1
Construction: Insertion du peptide LDV, comme décrit dans le brevet US 5,628,979, à l'extrémité C-terminale de la fibre. Cette modification confère une liaison à l'égard des intégrines α4β1 surexprimées sur les cellules tumorales.
Pour cela, à l'aide de l'oligonucléotide OTG 11991 : SEQ ID N° 39 et en appliquant la procédure de mutagénèse présentée à l'Exemple 1 à partir du vecteur M13TG6527 nous avons obtenu le vecteur M13TG13265.
EXEMPLE 4: Construction d'un adenovirus présentant un tropisme d'hôte envers les cellules exprimant le récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor en anglais). Cet exemple décrit une fibre portant les séquences EGF à son extrémité C-terminale. Pour cela, on met en oeuvre les oligonucléotides OTG11065 (SEQ ID NO: 6) et oTG11066 (SEQ ID NO: 7) pour amplifier un fragment Hind\\\-Xba\ à partir du plasmide M13TG6527. Les oligonucléotides OTG11067 (SEQ ID NO: 8) et 0TGHO68 (SEQ ID NO: 9) permettent de générer un fragment Xho\-Sma\ (allant du codon stop jusqu'au nt 33093) à partir de M13TG6527. L'ADN complémentaire de l'EGF, obtenu de l'ATCC (#59957), est amplifié sous forme d'un fragment Xho\-Xba\ à l'aide des oligonucléotides oTG 11069 (SEQ ID NO: 10) et OTG11070 (SEQ ID NO: 11). Les 3 fragments digérés par les enzymes adéquates sont ensuite religués pour donner un fragment Hind\\\-Sma\ contenant l'EGF fusionné à l'extrémité C-terminale de la fibre. On applique la même procédure de recombinaison homologue que celle décrite à l'exemple 1 pour replacer ce fragment dans son contexte génomique.
Cependant, on peut simplifier les étapes de clonage en introduisant un site unique Ss BI dans la région ciblée par les techniques classiques de mutagénèse sur la matrice M13TG6526 à l'aide de l'oligo oTG7213 (SEQ ID NO : 57). A la fin des étapes successives de clonage telles que décrites dans l'exemple 1 , on obtient le plasmide portant le génome total de l'Adδ modifié pTG4609. Son équivalent portant la cassette d'expression LacZ à la place de la région E1 est obtenu comme précédemment décrit à l'exemple 1 et est nommé pTG4213. La recombinaison homologue entre pTG4609 ou pTG4213 linéarisé par βsfBI et le fragment Hind\\\-Sma\ précédant génère le plasmide pTG4225 et pTG4226 portant respectivement la région E1 sauvage ou la cassette d'expression LacZ. Les virus AdTG4225 et AdTG4226 peuvent être produits classiquement par transfection d'une lignée cellulaire appropriée par exemple surexprimant le récepteur de l'EGF. Pour tester la spécificité d'infection de ces virus, on peut utiliser les cellules fibroblastiques murines NR6 et les cellules NR6-hEGFR exprimant le récepteur de l'EGF humain. Des compétitions avec la tête d'Adδ recombinante ou avec l'EGF permettent d'évaluer l'intervention des récepteurs cellulaires naturels et EGF pour médier l'infection des virus.
EXEMPLE 5 : Modifications de la tête de la fibre pour éliminer la liaison au récepteur cellulaire naturel.
La mutation de la région de la fibre adénovirale impliquée dans l'interaction avec le récepteur cellulaire naturel a été entreprise afin d'éliminer la capacité de la fibre à lier son récepteur naturel et l'addition d'un ligand permettra de modifier le tropisme des adenovirus correspondants. Les séquences de la fibre Ad5 codant pour la région s'étendant des résidus 443 à 462 ont été soumises à diverses mutations. La délétion du feuillet D met en oeuvre l'oligonucléotide de mutagénèse oTG7414 (SEQ ID NO: 12) et la délétion de la boucle CD l'oligonucléotide oTGA (SEQ ID NO: 13). L'oligonucléotide oTGB (SEQ ID NO: 14) permet quant à lui la délétion de la boucle CD et du feuillet D. Tous ces oligonucléotides contiennent un site βamHI permettant de détecter facilement les mutants et, également, d'insérer les séquences codant pour un ligand, par exemple le peptide EGF. Une autre série de modifications consiste à remplacer ces régions délétées par les séquences équivalentes issues de la fibre d'Ad3. En effet, de nombreuses données montrent que l'Adδ et l'Ad3 ne se lient pas au même récepteur, de sorte qu'une telle substitution devrait abolir l'infection médiée par le récepteur Ad5 et cibler les cellules portant le récepteur Ad3. Le remplacement de la boucle CD Ad5 par celle de l'Ad3 met en oeuvre OTG11135 (SEQ ID NO: 15), le remplacement du feuillet D de la fibre Ad5 par celui de la fibre Ad3 est effectué par l'oligonucléotide oTG 10350 (SEQ ID NO: 16) et le remplacement du feuillet D et de la boucle CD de l'Adδ par ceux de l'Ad3 est réalisé sur le mutant précédent à l'aide de oTG11136 (SEQ ID NO: 17).
On a également modifié cette région cible de la tête adénovirale par une série de mutations ponctuelles : - remplacement du coude aa GSLA en coude aa DKLT: oTGC
(SEQ ID NO: 18), remplacement du coude aa SGTV en coude aa DKLT : oTGD (SEQ ID NO: 19),
G443 en D : oTGE (SEQ ID NO: 20), - L44δ en F : oTGF (SEQ ID NO: 21),
G450 en N : oTGG (SEQ ID NO: 22), T451 en K : oTGH (SEQ ID NO: 23), V452 en N : oTGI (SEQ ID NO: 24), A 455 en F : oTGJ (SEQ ID NO: 25), - L457 en A : oTGK (SEQ ID NO: 26),
I459 en A : oTG L (SEQ ID NO: 27).
Les oTGE à I introduisent des mutations dans la boucle CD de la fibre adénovirale sur des acides aminés qui sont non conservatifs entre l'Adδ et l'Ad3 alors que les oTGJ à K concernent des acides aminés du feuillet D non engagés dans une liaison hydrogène stabilisant la structure.
Les mutagénèses peuvent être réalisées sur le vecteur M13TG6δ26 ou M13TG6528. Le premier porte le fragment Hind\\\-Sma\ sauvage et le second ce même fragment modifié par l'insertion des séquences GRP. Les plasmides portant le génome adénoviral peuvent être reconstitués comme décrit auparavant pour les plasmides pTG422δ (E1 sauvage) et pTG4226 (LacZ à la place de la région E1). Les virus sont générés par transfection des cellules 293 ou bien de cellules surexprimant le récepteur liant le ligand concerné. De telles cellules peuvent être générées par transfection de l'ADN complémentaire correspondant. On utilise de préférence des cellules qui n'expriment pas naturellement le récepteur cellulaire naturel des adenovirus, par exemple la lignée Daudi (ATCC CCL213). EXEMPLE 6 : Modifications de la tête de la fibre pour éliminer la liaison au récepteur cellulaire naturel.
A. Modifications des séquences de la fibre
La mutation de la région AB (résidus 404-418) de la fibre adénovirale a été entreprise afin d'éliminer la capacité de la fibre à lier son récepteur naturel et l'addition d'un ligand permettra de modifier le tropisme des adenovirus correspondants.
- le remplacement dans la boucle AB de la serine en position 408 par le résidu acide glutamique du sérotype 3 à l'aide de l'oligo oTG 12499 (SEQ ID NO 40);
- le remplacement dans la boucle AB de l'Alanine en position 406 par le résidu lysine du sérotype 3 à l'aide de l'oligo OTG12498 (SEQ ID NO 41);
- le remplacement dans la boucle AB de la thréonine en position 404 par le résidu glycine du sérotype 3 à l'aide de l'oligo oTG12740
(SEQ ID NO 42).
Les mutagénèses peuvent être réalisées sur le vecteur M13TG6526 ou M13TG6528. Le premier porte le fragment H/n lll-Smal sauvage et le second ce même fragment modifié par l'insertion des séquences GRP. Les plasmides portant le génome adénoviral peuvent être reconstitués comme décrit auparavant pour les plasmides pTG422δ (E1 sauvage) et pTG4226 (LacZ à la place de la région E1) (par recombinaison homologue avec le plasmide pTG4609 ou bien pTG4213). Les virus sont générés par transfection des cellules 293, 293 exprimant la fibre sauvage (Legrand et al., 1999; J. Virol., 73, 907-919) ou bien de cellules surexprimant le récepteur liant le ligand concerné. De telles cellules peuvent être générées par transfection de l'ADN complémentaire correspondant. On utilise de préférence des cellules qui n'expriment pas naturellement le récepteur cellulaire naturel des adenovirus, par exemple la lignée Daudi (ATCC CCL213).
B. Etude de l'incorporation de la fibre modifiée dans la particule virale et de son utilisation dans l'entrée de l'adénovirus correpondant.
Pour s'assurer que les virus mutés portent bien dans leur capside les protéines fibres modifiées, les virus purifiés après amplification dans les cellules 293 sont déposés sur gel d'acrylamide 10% en conditions dénaturantes (PAGE-SDS). Les différentes protéines sont détectées par coloration au nitrate d'argent. Da manière alternative, la fibre est révélée spécifiquement en réalisant un westem-blot à l'aide d'un sérum dirigé contre la tête de la fibre d'Adδ ( Henry et al., 1994, supra). Un signal intense à la taille attendue indique que les virus incorporent des quantités stoechiométriques de la protéine d'intérêt. Etant donné que seule la fibre trimérique est capable de lier le penton base (Novelli et Boulanger, 1991, supra) et d'être incorporée dans la particule, la détection de la protéine dans l'expérience ci-dessus indique que la fibre modifiée est toujours capable de former des trimères.
L'utilisation de la fibre modifiée pour permettre l'entrée du virus muté correspondant peut être étudiée en réalisant les expériences de compétition à l'aide de tête recombinante comme décrit ci-dessus dans l'exemple 1B. Une infection efficace en présence de concentrations saturantes du peptide sauvage indique une infection indépendante de la liaison aux récepteurs primaires naturels. Ceci suggère une affinité fortement réduite de la fibre modifiée pour ses récepteurs.
EXEMPLE 7: Insertion du ligand dans une protéine de capside autre que la fibre en association avec une des modifications de la fibre précitées.
Cet exemple décrit l'insertion du ligand EGF dans la protéine de capside hexon. Bien entendu, il est préférable que l'adénovirus correspondant ait perdu sa capacité d'attachement au récepteur cellulaire naturel. Son génome peut par exemple inclure un gène de la fibre modifié ou être dépourvu d'une partie au moins des séquences de la fibre.
On construit un plasmide de transfert pour la recombinaison homologue couvrant la région du génome d'Adδ codant pour l'hexon (nt 18842-21700). Le fragment d'Adδ Hinό\\\-Xho\ (nt 18836-24816) est clone dans pBSK+ (Stratagène) digéré par ces mêmes enzymes pour donner le 5 plasmide pTG4224. Les séquences codant pour le peptide EGF sont introduites dans la boucle hypervariable L1 de l'hexon par création de fragments chimériques par PCR : hexon (nt19043-19647)-X6al-EGF-βstGI- hexon (nt19699-20312). Le fragment nt19043 à 19647 est obtenu par amplification PCR à partir du plasmide pTG3602 avec les oligonucléotides 0 OTG11102 (SEQ ID NO: 28) et OTG11103 (SEQ ID NO: 29). Le fragment nt19699 à 20312 est amplifié à partir du même ADN avec les oligonucléotides OTG11104 (SEQ ID NO: 30) et oTG11105 (SEQ ID NO: 31). L'EGF est clone à partir de l'ADNc à l'aide des oligonucléotides OTG11106 (SEQ ID NO: 32) et oTG11107 (SEQ ID NO: 33) permettant de δ mettre la séquence codante de l'EGF en phase avec l'hexon. Les produits PCR sont digérés par les enzymes adéquates puis religués. Le fragment chimérique peut alors être inséré par recombinaison homologue dans le plasmide pTG4224 linéarisé par Nde\ (nt 19549), pour donner pTG4229. Les séquences codant pour l'hexon modifié peuvent être obtenues par 0 digestion Hinά\\\-Xho\ et replacées dans leur contexte génomique par recombinaison homologue. On peut utiliser le vecteur pTG3602, pTG4607, pTG4629 linéarisé par Sgf\ ou un vecteur portant le génome adénoviral délété des séquences de la fibre (comme pTG4607 décrit ci-dessous) ou exprimant une fibre modifiée.
Le génome adénoviral incapable de produire une fibre native fonctionnelle est obtenu par une délétion touchant le codon initiateur mais ne s'étendant pas aux autres ORFs adenoviraux. On procède de la façon suivante: le fragment adénoviral en δ' de la délétion (nt 30664 à 31041) est amplifié par PCR à l'aide des amorces oTG7171 et oTG727δ (SEQ ID NO: 34 et 3δ). L'amplification du fragment en 3' (nt 31129 à 33099) met en oeuvre les amorces oTG7276 et OTG7049 (SEQ ID NO: 36 et 37). Les fragments PCR sont digérés par Xho\ et mis en ligation avant d'être introduits par recombinaison homologue dans le vecteur pTG6591 linéarisé par Nde\, pour donner pTG4602. Puis le fragment BstEW isolé de ce dernier est soumis à une recombinaison homologue avec le vecteur pTG3602 digéré par Spel. On obtient pTG4607. Le vecteur pTG4629 est équivalent à pTG4607, mais porte en outre la cassette d'expression LacZ à la place de E1.
Les virus correspondants peuvent être obtenus après transfection de cellules 293, 293 exprimant la fibre sauvage (Legrand et al., 1999, supra) ou de cellules surexprimant le récepteur de l'EGF. L'étude de la spécificité d'infection pourra être réalisée comme décrit auparavant en utilisant l'EGF en tant que compétiteur (voir Exemple 1).
EXEMPLE 8: Construction d'un adenovirus présentant un tropisme à l'égard de cellules exprimant des glycoprotéines particulières à savoir des heparan sulfate qlycoproteins
Cet exemple décrit une fibre portant sept résidus lysine localisés à la suite du polypeptide linker (PSASASASAPGS) codé par SEQ ID NO :2, à l'extrémité C-terminale et qui confèrent la propriété de se fixer aux glycoprotéines dites "heparan sulfate glycoproteins". A cet effet, l'oligonucléotide oTG12125 (SEQ ID NO :43) est hybride à la construction M13TG6527 afin de générer par mutagénèse la construction M13TG6670. L'étape de recombinaison homologue entre le plasmide pTG4213 linéarisé par coupure avec SsfBI et le fragment H/π lll-Smal de M13TG6670 permet d'obtenir le plasmide pTG4274. Le virus adénoviral correspondant AdTG4274 est obtenu après transfection dudit plasmide dans la lignée de complémentation 293 et culture dans les conditions de culture habituelles, δ Afin d'évaluer la spécificité de l'infection avec ce virus, des expériences de compétition avec un adenovirus recombinant peuvent être réalisées (Exemple 1).
EXEMPLE 9 : Construction d'adénovirus présentant une spécificité d'hôte 0 dirigée vers des cellules tumorales exprimant des mucines.
Cet exemple décrit l'obtention d'une fibre portant à son extrémité C terminale le peptide EPPT (décrit dans le brevet US 6,691 ,693) qui confère une spécificité à l'égard des mucines surexprimées à la surface de certaines 6 cellules tumorales. La construction M13TG6627 est soumise à une étape de mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide ( SEQ ID NO :44) afin de générer la construction M13TG6672. Le plasmide pTG4278 est obtenu selon le mode opératoire décrit précédemment. L'introduction de la mutation dans le génome viral est effectuée comme décrit à l'Exemple 8 . Le virus 0 AdTG4278 est produit après transformation et culture dans la lignée 293. Des expériences de compétition de l'infection virale à l'aide de la tête adénovirale et avec le peptide soluble EPPT montre qu'il est possible d'évaluer l'implication des récepteurs cellulaires naturels et des mucines dans le processus infectieux de l'adénovirus. δ
Exemple 10: Construction d'un adenovirus présentant une spécificité vis à vis de cellules tumorales exprimant les intégrines α4β1 .
Cet exemple décrit une fibre adénovirale portant la séquence 0 peptidique LDV (voir US 6,628,979) à son extrémité C-terminale afin de conférer à la protéine la capacité de se fixer sur exprimant les intégrines α4β1 qui sont surexprimées à la surface de certaines cellules tumorales. Pour cela, le vecteur M13TG6627 est soumis à une étape de mutagénèse dirigée à l'aide de OTG11991 ( SEQ ID NO :4δ) afin de générer le vecteur modifié M13TG 13265. L'incorporation de cette mutation dans le génome viral est effectuée selon le protocole décrit à l'Exemple 6. Le virus est ensuite produit à l'aide de la lignée de complémentation 293. Des expériences de compétition sont réalisées selon le protocole décrit à l'Exemple 1 à l'aide de la tête de la fibre d'Adδ produite dans E.coli dont les propriétés de liaison au récepteur cellulaire adénoviral ont été montrées (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246) ou à l'aide de peptides solubles comprenant la séquence LDV qui permettent d'évaluer le pouvoir infectieux des adenovirus médié par la fixation aux intégrines α4β1.
Exemple 11 : Modification de la tête de la fibre de manière à éliminer la fixation à son récepteur cellulaire naturel.
Les mutations décritent précédemment étaient plus particulièrement destinées à empêcher la fixation aux molécules du MHC-I. Afin de réduire de manière substantielle la fixation au CAR, d'autres mutations ont été réalisées. L'analyse tridimentionnelle de la structure de la tête et la comparaison des séquences de fibres adénovirales issues de serotypes CAR- et non- CAR (Roelvink et al., 1998, J. Virol. 72, 7909-7915) nous ont conduit à identifier plus spécifiquement les amino acides impliqués dans la reconnaissance et la fixation au CAR. Ces résidus ont été modifiés comme présenté ci dessous (entre parenthèses sont indiqués les oligonucléotides utilisés lors des expériences de mutagénèse dirigée):
Tyr 491 en Asp (Y491 D) : oTG12727 (SEQ ID NO : 46) Ala 494 en Asp (A494D) : oTG12728 (SEQ ID NO : 47) Val 495 en Arg (V495R): oTG12729 (SEQ ID NO : 48) Gly 496 en Ser (G496S): OTG12730 (SEQ ID NO : 49) - Phe 497 en Asp (F497D): OTG12731 (SEQ ID NO : 50)
Met 498 en Asp (M498D) : OTG12732 (SEQ ID NO : 51) Pro 499 en Gly (P499G) : OTG12733 (SEQ ID NO : 52) Asn 500 en Asp (N500D) : oTG12734 (SEQ ID NO : 53) Ala 503 en Asp ( A503D) : oTG12735 (SEQ ID NO : 54) Tyr 504 en Asp ( Y504D): OTG12736 (SEQ ID NO :55) Pro 505 en Gly (P506G) : oTG12737 (SEQ ID NO :56). Les mutagénèses sont réalisées à partir des vecteurs M13TG6626, δ M13TG6628, M13TG6670, M13TG6572 ou M13TG13265 décrits dans les exemples précédents. Les plasmides portant le génome adénoviral sont produits comme indiqué précédemment et les particules virales sont obtenues par transfection et culture dans : la lignée cellulaire 293, 0 - ou la lignée cellulaire 293 exprimant la fibre adénovirale sauvage (Legrand ét al., 1999, J. Virol , 73, 907-919), ou des cellules surexprimant le récepteur correspondant au ligand utilisé. De telles cellules peuvent être générées par transfection avec le cADN correspondant. Toutefois, on utilise δ de préférence des cellules qui n'expriment pas le récepteur adénoviral naturel, telles que par exemple la lignée Daudi (ATCC CCL213) ou CHO (ATCC Ccl61).
Afin de vérifier que les virus mutés portent bien au sein de leur 0 capside la protéine de la fibre modifiée selon l'invention, les particules virales modifiées sont déposées sur un gel 10 % SDS polyacrylamide. Les différentes protéines virales sont révélées par coloration à l'argent. La protéine de la fibre est ensuite détectée de manière spécifique par "western blot" à l'aide d'anticorps dirigés contre la tête adénovirale (Henry et al., 6 1994, supra). Dans le cas présent, un fort signal est observé pour une bande dont la migration correspond à la taille attendue. Ceci montre clairement que les virus ont incorporé lors de leur production une quantité stoechiométrique de fibre mutée. Etant donné que seule la fibre sous sa forme trimérique peut lier le penton base et être ensuite encapsidée (Novelli 0 and Boulanger, 1991 , supra), la présence de ce signal à la position attendue indique que la fibre modifiée selon l'invention est toujours capable de trimériser.

Claims

Revendications
1. Fibre d'un adenovirus modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus de 5 la région comprise entre les résidus 491 et 606 de la SEQ ID NO: 1.
2. Fibre d'un adenovirus selon l'a revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation choisie parmi les mutations suivantes : le résidu tyrosine en position 491 est substitué par un acide 0 aspartique, le résidu alanine en position 494 est substitué par un acide aspartique, le résidu valine en position 496 est substitué par une arginine, le résidu glycine en position 496 est substitué par une serine, 6 - le résidu phénylalanine en position 497 est substitué par un acide aspartique, le résidu méthionine en position 498 est substitué par un acide aspartique, le résidu praline en position 499 est substitué par une glycine, 0 - le résidu asparagine en position 600 est substitué par un acide aspartique, le résidu alanine en position 603 est substitué par un acide aspartique le résidu tyrosine en position 604 est substitué par un acide δ aspartique, le résidu praline en position δOδ est substitué par une glycine.
3. Fibre d'un adenovirus selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le résidu muté est sélectionné parmi les résidus alanine en position 494 et alanine en position 503. 0
4. Fibre d'un adenovirus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est en outre modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus sélectionnés parmi : les résidus des boucles AB, CD, DG, GH, Hl et/ou IJ et/ou les résidus des feuillets A, B, C, D, G, H, I et/ou J.
5. Fibre d'un adenovirus selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est en outre modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus dans le
5 domaine s'étendant de la boucle CD au feuillet I.
6. Fibre d'un adenovirus selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite mutation consiste en :
(i) au moins une substitution choisie parmi les substitutions suivantes : 0 - le résidu glycine en position 443 est substitué par un acide aspartique, le résidu serine en position 444 est substitué par une lysine, le résidu leucine en position 446 est substitué par une phénylalanine, δ - le résidu alanine en position 446 est substitué par une thréonine, le résidu serine en position 449 est substitué par un acide aspartique, le résidu glycine en position 460 est substitué par une 0 asparagine ou une lysine, le résidu thréonine en position 461 est substitué par une lysine ou une leucine, le résidu valine en position 462 est substitué par une asparagine ou une thréonine, δ - le résidu alanine en position 4δδ est substitué par une phénylalanine, le résidu leucine en position 467 est substitué par une alanine, le résidu isoleucine en position 469 est substitué par une alanine. 0 et/ou
(ii) une délétion choisie parmi les délétions : de la région s'étendant de la serine en position 464 à la phénylalanine en position 461 , de la région s'étendant de la valine en position 441 à la glutamine en position 453, ou de la région s'étendant de la valine en position 441 à la phénylalanine en position 461.
7. Fibre d'un adenovirus selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est en outre modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus compris dans la région de la fibre s'étendant du feuillet A au feuillet B, et incluant la boucle AB.
8. Fibre d'un adenovirus selon la revendication 7 caractérisée en ce que ladite mutation consiste en au moins une substitution d'un acide aminé choisie parmi les substitutions suivantes : le résidu serine en position 408 est substitué par un résidu présentant au moins deux groupements carboxyle, et notamment par un résidu sélectionné dans le groupe consistant en l'acide aspartique et l'acide glutamique, le résidu thréonine en position 404 est substitué par un résidu glycine, le résidu alanine en position 406 est substitué par un résidu lysine.
9. Fibre d'un adenovirus selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ligand capable de reconnaître un anti-ligand cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de la fibre non mutée.
10. Fibre d'un adenovirus selon la revendication 9, caractérisée en ce que le ligand est sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps ou un fragment d'anticoprs, un peptide, un oligonucléotide, un lipide, un glycolipide, une hormone, un polymère ou un sucre.
11. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins la région modifiée de la fibre adénovirale selon la revendication 1.
12. Fragment d'ADN ou vecteur d'expression codant pour une fibre d'un adenovirus selon l'une des revendications 1 à 10, ou un fragment peptidique selon la revendication 11.
13. Lignée cellulaire caractérisée en ce qu'elle comprend sous forme intégrée dans le génome ou sous forme d'épisome un fragment d'ADN selon la revendication 12 placé sous le contrôle des éléments permettant son expression dans ladite lignée cellulaire.
14. Lignée cellulaire selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est en outre capable de complémenter un adenovirus déficient pour une ou plusieurs fonctions sélectionnées parmi les fonctions codées par les régions E1. E2, E4 et L1-L5.
15. Particule virale caractérisée en ce qu'elle est dépourvue d'une fibre native fonctionnelle et qu'elle comprend une fibre selon l'une des revendications 1 à 10.
16. Particule virale selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ligand capable de reconnaître un anti-ligand cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de ladite particule.
17. Particule virale selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce que ledit ligand est inséré dans une protéine de la capside adénovirale autre que la fibre, notamment l'hexon ou le penton.
18. Pseudo particule virale caractérisée en ce qu'il s'agit d'une particule virale selon l'une des revendications 15 à 17 et en ce qu'elle est vide.
19. Particule virale selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce qu'elle renferme un génome adénoviral.
20. Particule virale selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit génome adénoviral est un génome adénoviral recombinant défectif pour la réplication.
21. Procédé pour produire une particule virale selon la revendication 20, caractérisé en ce que :
(i) on transfecte undit génome adénoviral recombinant défectif pour la réplication dans une lignée cellulaire appropriée, (ii) on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale, (iii) on récupère ladite particule virale de ladite culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, (iv) on purifie ladite particule adénovirale.
22. Procédé pour produire une particule virale renfermant un génome adénoviral dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour une fibre, caractérisé en ce que : (i) on transfecte ledit génome dans une lignée cellulaire selon l'une des revendications 13 ou 14, (ii) on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale , (iii) on récupère ladite particule adénovirale dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, (iv) on purifie ladite particule adénovirale.
23. Composition comprenant une particule virale ou une pseudo particule selon l'une des revendications 15 à 20 ou susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'un des revendications 21 ou 21 en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
24. Composition selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé sélectionné parmi un acide nucléique nu ou un acide nucléique combiné à au moins un composé cationique.
?5. Utilisation d'une particule virale ou une pseudo particule selon l'une des revendications 16 à 20 ou susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 21 ou 22 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal.
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