EP1238111A1 - Biopuces, preparation et utilisations - Google Patents

Biopuces, preparation et utilisations

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Publication number
EP1238111A1
EP1238111A1 EP00988947A EP00988947A EP1238111A1 EP 1238111 A1 EP1238111 A1 EP 1238111A1 EP 00988947 A EP00988947 A EP 00988947A EP 00988947 A EP00988947 A EP 00988947A EP 1238111 A1 EP1238111 A1 EP 1238111A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
biochip according
support
arm
biochip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00988947A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Todor Vujasinovic
Sylvie Dumas
Jacques Mallet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1238111A1 publication Critical patent/EP1238111A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology and genetics. It relates in particular to new compositions and methods for the preparation of biochips and their uses. It relates in particular to biochips comprising populations of particular nucleic acids and / or prepared from molecules of anchors or particular supports.
  • the methods and biochips according to the present invention can be used for the detection or analysis of gene expression, for the search for genes of interest, or for diagnostic applications, for example.
  • DNA microarrays or, more generally, nucleic acid chips are miniaturized systems of large-scale genetic analysis, allowing for example to study the transcriptional activity of a large number of genes (analysis of gene expression), determining the sequence of a large number of DNA fragments (including analyzes of genetic polymorphisms), etc.
  • biochips nucleic acid chips
  • Their general principle consists in:
  • the biochip is the assembly formed by the support and the nucleic acid fragments fixed on this support.
  • the nucleic acids attached to the biochip are referred to as "targets".
  • Each nucleic acid (or group of nucleic acids) corresponding to a specific DNA or RNA sequence is attached to a specific location on the support ("spot").
  • the biochips have a density greater than 500 spots per cm 2 , preferably greater than 1000 spots per cm 2 and even more preferably greater than 5000 spots per cm 2 .
  • This measurement can be carried out either by fluorescent or radioactive labeling of the probes and reading of the quantity of labeling present after hybridization on each target, or by other types of measurement of the quantity of probe-target hybridization for each target (such that, for example and in a non-exhaustive manner, the measurement of micro-currents induced by the formation of a double-stranded probe-target electrical capacitance, or the direct measurement of the probe molecular mass fixed on each target).
  • biochips have a certain number of drawbacks or limitations linked in particular to the nature of the target nucleic acids used and / or to the conditions of preparation of the biochips, which make their production and their use difficult.
  • the single-strand nucleic acid chip technology developed by the company Affymetrix consists in synthesizing oligonucleotides directly on the support of the chip, by photolithography and DNA synthesis in solid phase.
  • This principle which can be obtained with other synthetic methods, is commonly known by the expression "in situ synthesis".
  • this principle does not allow the synthesis with sufficient efficiency of oligonucleotides of more than 25 bases long, and the use of such oligonucleotides (25 bases long or less) results in the presence of numerous non-specific hybridizations of the probes, and consequently poor reproducibility of the experiments using this system.
  • the specificity of hybridization between two fragments of nucleic acids depends on the conditions under which the hybridization reaction is carried out, on the composition in bases of these nucleic acids, their similarity or sequence identity, and the identical sequence length.
  • the greater the identical sequence length between the two fragments the more specific the hybridization.
  • the secondary molecular structures can hinder the yield of the hybridization reaction (folding of the molecules on themselves, or even hybridization of the molecules on themselves).
  • spot of each deposit on the chip
  • the deposited molecules are in sufficient number and density to allow the measurement of the hybridization thereon of the nucleic acid molecules to be analyzed (probes).
  • this density must not be such that the access of the probe molecules to the target molecules is hampered by the spatial obstruction of the targets.
  • the conditions for fixing the targets on the biochip are also important. In fact, this fixation must be stable, ideally of the covalent type, without however reducing the capacity of the targets to be hybridized on the probes.
  • the targets should ideally be fixed by one of the ends of the target (5 'or 3') and not over their length.
  • the question is not resolved whether it is better to fix the targets directly on the support. the chip or if it is better to fix them there by means of an "arm" (polymer molecule, whatever its nature and its size).
  • the present invention now provides advantageous solutions to the difficulties and limitations of the techniques and products of the prior art. These solutions relate in particular to the conditions for fixing the targets on the support, as well as on the nature and / or the physico-chemical characteristics of the fixing molecules used.
  • the invention also describes biochips on which particular populations of target molecules are deposited, in particular populations of target nucleic acids of defined size.
  • the present invention describes in particular a new approach for fixing target nucleic acids on biochip supports. It can be implemented with any type of target nucleic acids as defined below, and with any type of support, as defined below. It can also be implemented both with target nucleic acids synthesized directly on the support of the biochip (in situ synthesis) or synthesized independently and then fixed on the biochip in a second step. In addition, it can also be implemented with molecules of interest other than polynucleotides.
  • the present invention resides in the use, for fixing the targets on the chip, of arms (or “spacer” or “linker” molecules) having a spatial structure (primary or secondary structure of the molecule ) in the form of a tree.
  • the invention relates, in general, to the use of any molecule whose spatial structure is organized according to a tree structure principle, whether the latter is at one or more degrees of freedom, as "fixing arms" targets on a biochip support.
  • a first object of the present invention resides in a biochip, characterized in that it comprises nucleic acids immobilized on a support by means of arms in the form of a tree structure.
  • Another aspect of the present invention resides in a biochip composed of single-stranded nucleic acids attached to a support, in which the single-stranded nucleic acids are between 25 and 100 nucleotides in length, preferably between 30 and 60 nucleotides about.
  • Another aspect of the invention also resides in a biochip comprising nucleic acids immobilized on a support carrying a uniform negative electrical charge or by means of arms carrying a negative electrical charge.
  • the invention also relates to the preparation and use of biochips as defined above, for genetic analyzes, sequencing, gene research, diagnosis, etc.
  • Biochip A biochip is understood within the meaning of the invention of any support on which target nucleic acids are deposited. Generally, the nucleic acids are immobilized on the support, preferably by covalent bond. They can be immobilized directly on the support, or indirectly, by means of "arms". They can be biochips for which the targets have been produced beforehand and then fixed on the support, or for which the targets are synthesized directly on the support (including by photolithography and DNA synthesis in solid phase).
  • the biochips according to the invention can comprise a low or very high number of targets, and the size of the total surface of the support occupied by the targets can be variable.
  • the term “arm” designates any molecule which can be used to fix target nucleic acids to a support. These are molecules incapable of specifically forming hybrids with probe nucleic acids. They are therefore preferably molecules of essentially non-nucleic nature.
  • the arm molecule can be an organic polymer of protein, carbohydrate or lipid nature, or a synthetic non-organic polymer.
  • the “target” nucleic acids present on the support of the biochip can be of diverse nature and origin.
  • it can be single or double-stranded nucleic acids, of natural, synthetic and / or semi-synthetic origin.
  • they may be synthetic oligonucleotides, PCR products, genes or gene fragments, plasmids, single or double-stranded cDNA, RNA, etc.
  • They may be populations of nucleic acids isolated from biological samples, such as biopsies, samples of cells, tissues or mammalian organs, in particular human, samples of plant, animal, viral or bacterial origin, etc.
  • oligonucleotides they are more particularly defined as fragments of single-stranded nucleic acids of length between 25 and 100 nucleotides, whether these are of DNA or RNA nature.
  • the biochip support can be varied. Thus, it can be any support adapted to receive, directly or indirectly, target nucleic acids.
  • the support may have a flat and / or curved surface, and be of a solid or semi-solid nature.
  • the support can have a variable shape and dimension. Mention may in particular be made of circular, rectangular, square supports, etc.
  • the surface of the support is preferably between 300 and 3000 mm 2 , preferably between 400 and 1800 mm 2 .
  • material entering into the constitution of the supports of glass, silica (in particular the silica of glass after deprotection with ammonia), poly-lysine, amino-silanes and or amino-reactive silanes.
  • Figure N ° 1 Use of tree target fixation arms; Use of non-arborescent target fixation arms
  • Figure N ° 2 Uridine diphosphate glucose (UDPGluc), according to Harper biochemistry, RK Murray, DK Granner, PA Mayes, VW Rodwell, Publisher Me Graw-Hill International (UK) Ltd ..
  • UDPGluc Uridine diphosphate glucose
  • Figure N ° 4 O bond within a glycoprotein.
  • Figure N ° 7 Structure of the glycogen molecule at a branching point, according to Harper Biochemistry.
  • Figure N ° 8 Amylopectin showing the branching 1 - »6, according to Harper Biochimie.
  • Figure N ° 9 Schematic representation of the bovine nasal cartilage agrecan, according to Harper Biochemistry.
  • Figure N ° 10 Schematic representation of polymers of human immunoglobulins.
  • the polypeptide chains are represented by thick lines; the disulfide bridges connecting the various polypeptide chains are represented by thin lines.
  • a first object of the present invention resides in a biochip, characterized in that it comprises nucleic acids immobilized on a support by means of arms in the form of a tree structure.
  • This principle new to our knowledge, has the advantage of being able to limit the difficulties linked to the steric bulk of the molecules. Indeed, the fact of fixing the target nucleic acids at the end of the tree structure of such "arms” makes it possible to increase the presentation surface of these targets to the probe nucleic acids studied (see FIG. 1). Furthermore, this makes it possible to reduce the number of molecules to be fixed directly on the support of the DNA chips (only the trunks of these "arms" are fixed).
  • the arm is a polymer having a spatial organization in tree structure, preferably of oblong shape.
  • the arm is a branched polymer, having one or more levels of branching.
  • the arborescent arm can be prepared from different organic molecules, in particular organic polymers (existing in nature), their derivatives, or mixed compounds, comprising an organic part and a synthetic part.
  • the arm according to the invention comprises an organic polymer of biological origin.
  • the biological compound used for the preparation of the arm can be a sugar, a polypeptide, a glycoprotein, a glycopolypeptide, an immunoglobulin, etc. optionally in isolated, complexed or multimerized form, if necessary functionalized or modified, in particular by means of synthetic molecules or polymers, or reactive chemical groups.
  • the organic polymer is a polymer of sugars or polysaccharides.
  • sugar polymers for the preparation of biochips or, more generally, the immobilization of nucleic acids, has multiple advantages and advantages, linked in particular to their chemical properties and to their primary and secondary structure.
  • the polysaccharides are hydrophilic, which is a favorable condition for the hybridization of the probes on the targets and in particular that of the probes of nucleotide nature (DNA, RNA) or derivative (PNA).
  • the latter are hydrophilic and their hybridization takes place in an aqueous solution.
  • a hydrophobic anchoring polymer would therefore risk hindering hybridization by having a repellent effect on the hybridization solution.
  • polysaccharides, in particular those described have radicals allowing the creation of covalent bonds at the chain ends (at all ends), due to the presence of hydroxyl (OH) functions.
  • the covalent bonds can be, for example, phosphate bonds (CPC or CPPC or C-Pn-C) such as exist in the nucleotide sugars or in the sugar donor polynucleotides which are involved in the synthesis of polysaccharides and glycoproteins.
  • CPC or CPPC or C-Pn-C phosphate bonds
  • a possible example of anchoring is based on the stages of natural glycogen synthesis and in particular the reaction of glucose-1-phosphate with uridine triphosphate (UTP) in the presence of the enzyme UDPGluc-pyrophosphorylase to form uridine diphosphate glucose (UDPGluc, Figure 2).
  • CNCC nitrogen bonds
  • COC oxygen bonds
  • This property therefore makes it possible to establish simple covalent bonds between the polysaccharides and other polymers (such as, for example, proteins, other polysaccharides, or nucleic acids).
  • nucleotide sugars complexes, for example during one of the intermediate stages of the natural synthesis of glycogen as a glucose donor (in this precise case, the sugar-nucleotide bond is a diphosphate bond, resulting in uridine diphosphate glucose, with a glucose-ribose bond, see Figure No. 2) illustrates this type of interaction and the establishment of covalent bonds between sugars and nucleic acids.
  • the polysaccharide-polynucleotide bond can involve links of type 1 -> 5, sugar1-sugar2, sugar 1 being at the end of the polysaccharide, sugar 2 being that of the nucleotide being at the 5 'end of the polynucleotide.
  • polysaccharides according to the invention derives from their primary and secondary structure.
  • the polysaccharides used in the present invention are polyramified (see Figure No. 5).
  • their size 21 nm in diameter for glycogen
  • the difference between the branches allows 'Advantageously, avoiding excessive steric bulk of the targets fixed on the ends of the branched polymer.
  • a branch every 2 to 5 residues would risk, in fact, hindering the hybridization of the probes.
  • polysaccharides, like glycogen have a spherical shape adapted to the surfaces, according to the invention, of presentation of the probes (see Figures 5 and 6).
  • polymers based on sugars also makes it possible to fix, covalently and thanks to one of the chemical bonds as described above, the sugars to the support of the chip, either by any of their ends, or, preferably, by their core.
  • This bond can be a direct bond on the support or an indirect bond via an anchoring molecule, such a molecule possibly being, in particular, of protein nature.
  • an anchoring molecule such a molecule possibly being, in particular, of protein nature.
  • glycogenin in this case by a tyrosine residue.
  • the polysaccharide is therefore used in these applications in the form of a glycoprotein.
  • glycogen molecule in particular endogenous glycogen in humans.
  • This molecule is a polymer of sugars of which, from a common core, many ramifications extend, themselves polymers of sugars.
  • a particular object of the present application therefore relates to the use of glycogen or glycogen derivatives for this purpose.
  • Glycogen has all of the properties listed above. It is commercially available and inexpensive (See Figures 5, 6 and 7: microchip-glycogen-polynucleotide).
  • a glycogen molecule can have more than 60 free carbohydrate ends, thus making it possible to fix more than 60 probes, which corresponds to a very high fixing capacity, and very difficult to obtain by artificial synthesis of polymers, while keeping a spatial bulk. which is compatible with the intended use according to the invention.
  • amylopectin or any other polymer derived from the structure of starch (see FIG. 8), glycosaminoglycans (in particular mucopolysaccharides), as well as any other polysaccharide, whatever the sugar or sugars used in its composition (galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N'acétylgalactosamine, N-acetylglucosamine, etc.), which may have a branched structure.
  • the tree organic polymer or compound can also be a glycoprotein-based polymer.
  • Such molecules exist in nature and have the property of having a structure having a protein nucleus, around which polysaccharides can be covalently linked (O- or N- bond depending on the amino acids which serve as residue and on which chain polysaccharide is fixed) (see Figures 3 and 4). These polysaccharides can be fixed in variable number, and in particular in number greater than 2.
  • the same glycoprotein can have several polysaccharides differing in length, in number of residues between the branches and in chemical nature of the residues (pentoses, hexoses etc.) without this does not affect the general principle of their use in these applications.
  • the general structure of these molecules can be branched.
  • the capture probes are covalently attached to the end of the polysaccharide chains.
  • the bonding of the glycoprotein on the support of the chip can take place either at the level of the protein nucleus, or at the level of a polysaccharide chain, but, in this case, preferentially at the level of the protein nucleus, and even more preferably by an O- or N- bond with an amino acid residue, either to an intermediate anchoring molecule itself directly fixed on the support, or directly to the support.
  • these molecules have the properties required for their application in the context of the biochips according to the invention, as is the case of the glycogen-glycogenin complex previously mentioned.
  • the spatial characteristics may vary (size of the molecule, number of branches, and number of residues between the branches), but they remain in the same orders of magnitude (factor 10) as those mentioned for the glycogen or aggregate, and are therefore compatible with their use for biochips.
  • the present invention also works with glycoproteins having several polysaccharide chains, in the case where these chains are not themselves branched, but where the external structure of the molecule remains globally spherical and has, at the periphery, numerous attachment sites of probes (general structure of the "sea urchin” type), and a molecular size of the same order of magnitude as that of glycogen or agregane.
  • proteoglycans proteins containing covalently linked glycosaminoglycans.
  • proteins form the “protein nucleus” of the molecule, and glycosaminoglycans form its ramifications.
  • the invention relates to the use of aggrecan.
  • Aggrecan (see figure n ° 9), is a glycoprotein naturally present in particular in the cartilages.
  • proteoglycan molecules can be in the natural form of multiple proteoglycan molecules aggregated on a central motif (polymer), such as hyaluronic acid, this aggregation being able to be made, via covalent bonds or not, with the central polymer, and resulting in the formation of a multi-branched "super molecule", whose general structural properties are compatible with the invention, and whose free ends, which are sugars, can be linked to the targets.
  • the proteoglycans are generally negatively charged, which can promote the specificity of probe-target hybridization in the case where these are nucleic acids (DNA, RNA).
  • the polymer can also be a polymer of amino acids, or of any type of molecules having amino groups reactive to a nucleophilic attack or other types of chemical groups which can be covalently linked to a nucleic acid.
  • the organic polymer can thus be a polymer based on proteins or protein complexes (formed of several subunits, themselves linked together by covalent bonds such as disulfide bonds), which have a structure of branched type.
  • immunoglobulins An example of a polypeptide compound is represented by immunoglobulins (Ig), whether these are in simple form or in the form of complexes (as in the case of immunoglobulins of type A, see Figure n ° 10).
  • Immunoglobulins natural molecules, are easy to produce in large quantities after selection of suitable clones (monoclonal immunoglobulins). In this application, immunoglobulins are used as molecules for anchoring capture probes.
  • the probes are linked to the Fab ends of the immunoglobulins, either by a classic antigen-antibody type bond, in the case where the immunoglobulin is directed against a portion of the probe, or, preferably by a covalent bond of the amino acid (Ig) - sugar (polynucleotide) type.
  • the trunk of the molecule serving as a fixing arm is fixed on the support of the chip, preferably covalently, and the target nucleic acids are fixed (or synthesized directly) at the end of several or all the trees of the molecule, preferably covalently.
  • Figure 1 gives a representation in space of a biochip constructed by means of such an arm, in comparison with the biochips manufactured with linear arms.
  • a single type of arm molecule is used on the same biochip, at a density which can be adapted by a person skilled in the art.
  • molecules of different structure and / or length and / or shape can be used on the same biochip.
  • the nucleic acids can, for example, be attached to the arm by means of an amino group which is reactive to a nucleophilic attack, whatever the nature of this attack.
  • an amino group N 3 can be covalently linked with a nucleic acid under the action of exposure to light.
  • the polymer arm preferably contains, at the end of the chain of its arms, an activatable chemical group, whatever it may be, which has the capacity to be covalently linked with a phosphate group (or other ) at the end of the chain of a nucleic acid. This activatable chemical group can be present during the synthesis of the polymer or be added thereto.
  • tree arms according to the present invention offers numerous advantages in terms of density of target nucleic acids. For example, in the case of "spots" of 2 ⁇ ⁇ m in diameter:
  • spot to reduce their density by a factor of 2 and therefore to improve the accessibility of targets for the probes (reduction in steric bulk).
  • spot to reduce their density by a factor of 2 and therefore to improve the accessibility of targets for the probes (reduction in steric bulk).
  • the density of target fixation on tree arms is, a priori, all the higher as that obtained by direct fixation of the targets on the support of the chip or by fixation of the targets by means of linear arms (not arborescent) because, for the same number of targets fixed by "spot" of the chip, the steric space requirement of the arms themselves on the surface of the support of the chip is lower in the case of arborescent arms compared to the linear arms . Consequently, in reality, the density of the targets must be able to be increased by more than a factor 2 according to this principle, or the steric bulk of the targets must be reduced by more than a factor 2.
  • This aspect of the invention therefore makes it possible, at the same time, on the one hand to increase the density of targets per "spot" of the chip (and consequently to increase the detection sensitivity during the measurement of the hybridization of the probes on the targets), and on the other hand simultaneously reduce the steric bulk of the targets (and consequently favor the hybridization of the probes on the targets, which also increases the detection sensitivity).
  • the biochips comprising this type of arm can be composed of a support comprising a flat and / or curved surface, of solid or semi-solid nature.
  • these supports can include materials such as glass, silica, poly-lysine, amino-silanes and / or amino-reactive silanes, or negatively charged supports, as will be described in detail in the text below.
  • the target nucleic acids immobilized on the trees of the arms can also be of varied nature, composition and origin. Thus, it can be single or double-stranded nucleic acids, of natural, synthetic and / or semi-synthetic origin.
  • nucleic acids may be synthetic oligonucleotides, PCR products, genes or gene fragments, plasmids (or other vectors such as cosmids, YAC, phages, etc.), single or double cDNA -strand or RNA.
  • the length of the nucleic acids can be varied. However, it is preferred, however, that the acids nucleic acids are less than about 1000 bases (or base pairs) in length.
  • the target nucleic acids consist of single-stranded nucleic acids, in particular single-stranded nucleic acids having a length of less than 1000 bases.
  • the target nucleic acids consist of single-stranded RNA, preferably having a length of less than 1000 bases. It may in particular be total RNA or mRNA, taken from a biological sample.
  • the present invention indeed describes for the first time the use of single-stranded RNA as targets on a biochip. This constitutes another particular object of the present application.
  • it is single-stranded DNA, or mixtures of DNA and single-stranded RNA.
  • the single-stranded target nucleic acids have a length of between approximately 25 and 100 nucleotides, preferably between approximately 30 and 60 nucleotides.
  • a particular object of the present invention also resides in a biochip composed of single-stranded nucleic acids fixed on a support, the single-stranded nucleic acids having a length of between 25 and 100 nucleotides approximately, preferably between 30 and 60 nucleotides.
  • the invention also resides in the use, as target nucleic acids, of a population (of fragments) of single-stranded nucleic acids having a length of between approximately 30 and 60 nucleotides, designated in the present application by the expression " long oligonucleotides ".
  • the single-stranded nucleic acids are single-stranded DNA with a length between approximately 30 and 60 nucleotides. According to another particular variant, the single-stranded nucleic acids are single-stranded RNAs of length between approximately 30 and 60 nucleotides.
  • these are nucleic acids produced by chemical synthesis in vitro, according to techniques known to those skilled in the art (synthesizers). These oligonucleotides are then, secondly immobilized on the support.
  • nucleic acids of such length makes it possible, in contrast to the products currently available, to obtain a specific hybridization of the probes on their corresponding targets on the biochips.
  • the use of oligonucleotides long with 25 bases or less, as described in the prior art results in the presence of numerous non-specific hybridizations of the probes, and consequently poor reproducibility of the experiments using this system.
  • the use according to the invention of longer oligonucleotides, in particular with a length of between 30 and 60 nucleotides, can on the contrary make it possible to obtain absolute specificity for hybridization.
  • the long oligonucleotides can, once synthesized, be fixed on the support of the biochip, in an orderly manner. This fixation can be either direct
  • fixation of the long oligonucleotide directly on the support or indirect (covalent fixation of the long oligonucleotide on a "arm" as defined and described above, this arm being fixed on the support).
  • the advantage of fixing the long oligonucleotide indirectly is to increase the accessibility of the probes to the sequence of the oligonucleotide, compared to the situation of direct fixation where the steric bulk is greater.
  • direct attachment of the long oligonucleotide is possible and may allow sufficient specificity of hybridization for the reproducible use of the oligonucleotide biochips.
  • the oligonucleotides are attached by one of their ends (5 ′ or 3 ′) and not over their entire length, in order to give the probes good accessibility to the oligonucleotides.
  • an indirect fixation two choices are possible: either the long oligonucleotides are fixed by one of their ends to the arm, and the oligonucleotide-arm complexes are then deposited in an orderly fashion on the support and fixed to it, or the arm is first fixed to the support, and the long oligonucleotides are then deposited in an orderly fashion on the arm-support complex and fixed to the arms.
  • the type of support and arms used can be as described above.
  • the use of this type of biochips with long oligonucleotides chemically synthesized according to the present invention offers certain advantages, compared to the use of shorter single-strand targets and / or double-strand and longer targets produced by PCR:
  • the fact that the target is of a single-stranded nature makes it possible to improve the yield of the hybridization reaction of the probe on the target. Indeed, if the target is double stranded, a large number of targets will hybridize on themselves during this reaction (the second strand of the target is in competition with the probe for hybridization).
  • direct chemical synthesis of targets is easier to manage than synthesis of targets by PCR.
  • PCR amplification produces a population of heterogeneous double stranded nucleic acids with, in the vast majority of cases, the presence of contaminating fragments, even if these fragments are a minority in the final product of the reaction. This results in the presence of non-specific probe-target hybridizations and therefore background noise when measuring hybridization rates.
  • the direct synthesis of single-stranded targets makes it possible to obtain nucleic acid fragments of very homogeneous sequence and ultimately makes it possible to obtain purer targets and consequently less aspecific probe-target hybridization. This specificity is all the more ensured when the biochips have arms, tree or not, electrically charged as will be described later.
  • the chemical synthesis of single-stranded probes can be automated in order to obtain purified targets, while the double-stranded targets produced by PCR must be purified before being fixed on the support.
  • biochips with long synthetic oligonucleotides according to the invention therefore represent an important technical advantage compared to the products and methods described in the prior art. This advantage is all the greater when these biochips have arborescent arms or electrically charged arms or supports.
  • the present invention also describes new approaches for controlling the spatial arrangement of nucleic acids and / or arms on the biochip, so as to favor the conditions of presentation, and therefore of hybridization of the probes on the targets.
  • the present invention now shows that it is possible to determine (and modify) the electrical characteristics of the arms (whether these are organic polymers of protein, carbohydrate or lipid nature, or synthetic non-organic polymers ) or biochip supports, so as to improve the hybridization conditions, in particular the selectivity and the sensitivity of the biochips.
  • This aspect of the invention can be implemented on all possible natures of oligonucleotide fixing arms on biochip supports, whether their primary structure is linear or tree-like, and whatever the nature of the support of the chip.
  • nucleic acids are negatively charged (because they are weak acids which are, under usual conditions, in environments with a pH greater than their pKa; their acid functions are located on the phosphate groups which provide the bond between the sugars of the nucleotides).
  • the interactions between nucleic acid sequences can be, for simplicity, schematized as follows: on the one hand, these sequences can be hybrid to each other by the establishment of hydrogen bonds and Van der Waals forces between complementary bases (this who can be considered as an affinity between them), on the other hand they can repel themselves because of their negative charges at the level of the phosphate groups.
  • the arms for fixing the targets on the support of the chip are subjected to atomic constraints of secondary structure and steric bulk, but they do not exhibit any phenomenon of attraction and hybridization such as those described for nucleic acids. These stresses exerted on the arms are also influenced by the fact that strands of nucleic acids are attached to their end (s).
  • Double stranded DNA is that of the accessibility of these targets to the probe molecules that we want to analyze and that we wants to specifically hybridize to their corresponding targets.
  • This accessibility conditions the efficiency of the hybridization reactions and therefore the sensitivity and specificity of the probe analysis.
  • This accessibility to probe-target hybridization is reduced in particular by the steric bulk of the targets fixed on the chip, by the interactions between targets located close to each other due to the steric bulk (partial hybridizations) and by the secondary structures of these (intramolecular folding of the targets).
  • the present invention overcomes these drawbacks. It describes in fact the use of particular arms or supports, reducing ionic interference between the targets, and thus ensuring better hybridization, including when the targets are present at high densities. More particularly, the present application shows that it is possible to use, for fixing the targets on the support of the biochips, fixing arms having a negative electrical charge or negatively charged supports.
  • the present invention also resides in the use of negatively charged molecules or negatively charged supports, for the preparation of biochips.
  • the arms exert repulsive electrical forces with respect to the adjacent arms, which has the consequence of reducing both their own folds and their steric bulk, in particular at their ends fixed on the targets;
  • the arms exert repulsive electric forces with respect to the targets which are fixed at their ends, which has the consequence of pushing the targets to move towards the "outside", that is to say move away from the chip holder, making them more accessible to probes;
  • These mutual repulsion constraints have the consequence of limiting the attractive interactions between adjacent probes by distancing them from each other, making them more accessible to the probes and reducing the risks of mutual attractions linked to Van der Waals forces or to hydrogen bonds ;
  • This particular aspect of the invention therefore brings a clear technological improvement to the methods of the art, ensuring better selectivity and sensitivity to biochips.
  • this aspect of the invention is not limited to biochips in which arms are used.
  • a negatively charged chip carrier in a uniform manner, in situations where the targets are directly fixed on the support without intermediate arms. This is valid whether the establishment of negative charges on the support is carried out before or after the fixing of the targets on the support.
  • This is a different principle from that which consists in depositing the targets on micro-electrodes to which an electric current can be applied, because in the latter case the electric charge of the support is not homogeneous.
  • the biochips can comprise any type of target nucleic acid population as defined above, and the negatively charged arms can also comprise a tree-like form, as mentioned above.
  • the present invention also resides in a process for the preparation of biochips, as described above, comprising the immobilization (or fixation) of the nucleic acids on a support by means of arms in the form of a tree comprising an original polymer organic.
  • the preparation process can comprise a first step of fixing the tree-shaped arm to the support, followed by a second step of fixing the target molecule to the tree-shaped arm.
  • the method for preparing the biochip can comprise a first step of fixing the target molecule to the tree-shaped arm then a second step of fixing the complex, obtained during the first step, to support.
  • the present invention also resides in the use of biochips as described above, for an experimental, therapeutic, diagnostic purpose.
  • the invention relates to the use of the biochips described above
  • the biochips are brought into contact with a population of “probe” nucleic acids, generally marked beforehand, then the hybridization profile of the probes on the biochip is determined, according to techniques known to those skilled in the art.
  • An object of the invention therefore also resides in a method of analyzing polynucleotides, comprising bringing a population of polynucleotides, preferably labeled, into contact with a biochip according to the invention, and demonstrating the formation of hybrids. It is understood that the present invention is not limited to the specific embodiments described above, but also extends to variant embodiments which fall within the normal knowledge of those skilled in the art.

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Abstract

La présente invention concerne des biopuces, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence et/ou de bras portant une charge négative et/ou directement sur des supports portant une charge négative. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérêt, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.

Description

BIOPUCES, PREPARATION ET UTILISATIONS
La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la génétique. Elle concerne en particulier de nouvelles compositions et méthodes pour la préparation de biopuces et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des populations d'acides nucléiques particulières et/ou préparées à partir de molécules d'ancrages ou de supports particuliers. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérêt, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Les puces à ADN (« DNA microarrays ») ou, plus généralement, les puces à acides nucléiques (« biopuces ») sont des systèmes miniaturisés d'analyse génétique à grande échelle, permettant par exemple d'étudier l'activité transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes (analyse de l'expression génique), de déterminer la séquence d'un grand nombre de fragments d'ADN (dont les analyses de polymorphismes génétiques), etc. Leur principe général consiste à:
- Fixer de façon ordonnée des fragments d'acides nucléiques sur un support, et ceci de manière miniaturisée afin de pouvoir fixer un grand nombre de fragments différents sur une surface réduite. La biopuce est l'ensemble constitué par le support et les fragments d'acides nucléiques fixés sur ce support. Dans la présente invention, les acides nucléiques fixés sur la biopuce sont désignés sous le nom de "cibles". Chaque acide nucléique (ou groupe d'acides nucléiques) correspondant à une séquence d'ADN ou d'ARN spécifique, est fixé à un endroit précis du support (« spot »). Préférentiellement, les biopuces ont une densité supérieure à 500 spots par cm2, de préférence supérieure à 1000 spots par cm2 et encore plus préférentiellement supérieure à 5000 spots par cm2.
- Hybrider sur la puce une population d'acides nucléiques à analyser (quelle que soit leur nature et leur origine biologique). Nous désignons ici les acides nucléiques à analyser sous le nom de "sondes". Lors de l'hybridation, les acides nucléiques présents dans la sonde vont se fixer de façon spécifique aux cibles présentes sur la puce, dont la séquence nucléique est similaire à tout ou partie de la séquence de ces sondes, - Mesurer la quantité de sondes spécifiquement hybridées sur chacune des cibles de la puce. Cette mesure peut être effectuée soit par marquage fluorescent ou radioactif préalable des sondes et lecture de la quantité de marquage présente après hybridation sur chaque cible, soit par d'autres types de mesure de la quantité d'hybridation sonde-cible pour chaque cible (telles que, par exemple et de façon non exhaustive, la mesure de micro-courants induits par la formation d'une capacité électrique sonde-cible double brin, ou la mesure directe de la masse moléculaire de sonde fixée sur chaque cible).
Un certain nombre de biopuces ont été décrites dans l'art antérieur.
Cependant, ces biopuces présentent un certain nombre d'inconvénients ou de limitations liés notamment à la nature des acides nucléiques cibles utilisés et/ou aux conditions de préparation des biopuces, qui rendent leur production et leurs utilisation difficiles.
Ainsi, la technologie de puces à acides nucléiques simple brin développée par la société Affymetrix consiste à synthétiser des oligonucléotides directement sur le support de la puce, par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide. Ce principe, qui peut être obtenu avec d'autres méthodes de synthèse, est communément désigné par l'expression « synthèse in situ". Cependant, à ce jour, ce principe ne permet pas de synthétiser avec une efficacité suffisante des oligonucléotides de plus de 25 bases de long, et l'utilisation de tels oligonucléotides (longs de 25 bases ou moins) entraîne la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des expériences utilisant ce système.
A cet égard, il est connu que la spécificité de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques (par exemple le complexe sonde-cible pour les biopuces) dépend des conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite, de la composition en bases de ces acides nucléiques, de leur similitude ou identité de séquence, et de la longueur de séquence identique. Ainsi, plus la longueur de séquence identique entre les deux fragments est grande, plus l'hybridation est spécifique. Cependant, au delà d'une certaine longueur, variable en fonction des séquences, mais en général de l'ordre de plus de 1000 bases, les structures moléculaires secondaires peuvent gêner le rendement de la réaction d'hybridation (repliement des molécules sur elles-mêmes, voire hybridation des molécules sur elles-mêmes).
Il serait donc utile de disposer de technologies permettant de produire des biopuces comportant tout type d'acides nucléiques, dans des conditions compatibles avec une lecture efficace et sensible des hybridations. Toutefois, la fixation des acides nucléiques sur les supports de biopuces reste problématique à ce jour, en raison notamment des problèmes d'encombrement sterique et des modes physico-chimique actuels de fixation sur les supports.
La question de l'encombrement sterique lié au dépôt d'un grand nombre de molécules sur une surface très petite ("spot" de chaque dépôt sur la puce) est importante. Il faut en effet que les molécules déposées (cibles) soient en nombre et en densité suffisants pour permettre la mesure de l'hybridation sur celles-ci des molécules d'acides nucléiques à analyser (sondes). Cependant, il ne faut pas que cette densité soit telle que l'accès des molécules sondes aux molécules cibles soit gêné par l'encombrement spatial des cibles. Par ailleurs, les conditions de fixation des cibles sur la biopuce sont également importantes. En effet, il faut que cette fixation soit stable, idéalement de type covalent, sans toutefois diminuer la capacité des cibles à être hybridées sur les sondes. De ce point de vue, il faut idéalement que la fixation des cibles soit effectuée par l'une des extrémités de la cible (5' ou 3') et non sur leur longueur. Enfin, pour des questions à la fois d'encombrement sterique et de disponibilité des cibles sur toute leur longueur, mais aussi de faisabilité technique, la question n'est pas résolue de savoir s'il vaut mieux fixer directement les cibles sur le support de la puce ou s'il vaut mieux les y fixer par l'intermédiaire d'un "bras" (molécule polymère, quelle que soit sa nature et sa taille).
La présente invention apporte maintenant des solutions avantageuses aux difficultés et aux limitations des techniques et produits de l'art antérieur. Ces solutions portent notamment sur les conditions de fixation des cibles sur le support, ainsi que sur la nature et/ou les caractéristiques physico-chimiques des molécules de fixation utilisées. L'invention décrit également des biopuces sur lesquelles des populations particulières de molécules cibles sont déposées, notamment des populations d'acides nucléiques cibles de taille définie.
La présente invention décrit notamment une nouvelle approche de fixation d'acides nucléiques cibles sur des supports de biopuces. Elle peut être mise en œuvre avec tout type d'acides nucléiques cibles tels que définis ci-après, et avec tout type de supports, tels que définis ci-après. Elle peut en outre être mise en œuvre aussi bien avec des acides nucléiques cibles synthétisés directement sur le support de la biopuce (synthèse in situ) ou synthétisés indépendamment puis fixés sur la biopuce dans un second temps. En outre, elle peut également être mise en œuvre avec des molécules d'intérêt autres que des polynucléotides.
Plus particulièrement, selon un premier aspect, la présente invention réside dans l'utilisation, pour fixer les cibles sur la puce, de bras (ou molécules « espaceur » ou « linker ») ayant une structure spatiale (structure primaire ou secondaire de la molécule) en forme d'arborescence. En particulier, l'invention concerne, de manière générale, l'utilisation de toute molécule dont la structure spatiale est organisée selon un principe d'arborescence, que celle-ci soit à un ou plusieurs degrés de liberté, comme "bras" de fixation de cibles sur un support de biopuce.
Ainsi, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, dans laquelle les acides nucléiques simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucleotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucleotides environ. Un autre aspect de l'invention réside également dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme ou au moyen de bras portant une charge électrique négative.
L'invention concerne également la préparation et l'utilisation des biopuces telles que définies ci-dessus, pour des analyses génétiques, du séquençage, la recherche de gènes, le diagnostic, etc.
Pour permettre une meilleure compréhension de la présente invention, les définitions suivantes sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur sens habituel.
Biopuce : Une biopuce s'entend au sens de l'invention de tout support sur lequel sont déposés des acides nucléiques cibles. Généralement, les acides nucléiques sont immobilisés sur le support, de préférence par liaison covalente. Ils peuvent être immobilisés directement sur le support, ou de manière indirecte, par l'intermédiaire de « bras ». Il peut s'agir de biopuces pour lesquelles les cibles ont été préalablement produites puis fixées sur le support, ou pour lesquelles les cibles sont synthétisées directement sur le support (y compris par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide). Les biopuces selon l'invention peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de cibles, et la taille de la surface totale du support occupée par les cibles peut être variable.
D'une manière générale, le terme « bras » (ou « espaceur » ou « linker ») désigne toute molécule, utilisable pour fixer des acides nucléiques cibles à un support. Il s'agit de molécules incapables de former, de manière spécifique, des hybrides avec des acides nucléiques sondes. Il s'agit donc préférentiellement de molécules de nature essentiellement non nucléique. Dans la constitution des biopuces de l'invention, un seul type de « bras » ou encore « espaceur » ou « linker » peut être utilisé par biopuce ou, des mélanges de bras de structure différente. Toutefois, on préfère généralement utiliser un type unique de bras sur une seule biopuce, de façon à obtenir un signal homogène. A titre d'exemple, la molécule de bras peut être un polymère organique de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou un polymère non organique de synthèse.
Dans le contexte de la présente invention, les acides nucléiques « cibles » présents sur le support de la biopuce peuvent être de nature et d'origine diverses. Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides, d'ADNc simple ou double-brin, d'ARN, etc. Il peut s'agir de populations d'acides nucléiques isolées à partir d'échantillons biologiques, tels que des biopsies, des échantillons de cellules, tissus ou organes mammifères, notamment humain, des échantillons d'origine végétale, animale, virale ou bactérienne, etc. S'agissant d'oligonucléotides, ils sont définis plus particulièrement comme des fragments d'acides nucléiques simple brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucleotides, que ceux-ci soient de nature ADN ou ARN.
Le support de la biopuce peut être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout support adapté à recevoir, de manière directe ou indirecte, des acides nucléiques cibles. En particulier, le support peut comporter une surface plane et/ou bombée, et être de nature solide ou semi-solide. Par ailleurs, le support peut avoir une forme et une dimension variables. On peut citer notamment les supports circulaires, rectangulaires, carrés, etc. La surface du support est préférentiellement comprise entre 300 et 3000 mm2, de préférence entre 400 et 1800 mm2. A titre d'exemple, on peut citer comme matériau entrant dans la constitution des supports le verre, silice (notamment la silice du verre après déprotection par l'ammoniaque), poly-lysine, amino-silanes et ou silanes amino-réactifs.
Les figures annexées illustrent des modes de réalisation de l'invention et décrivent plus particulièrement :
Figure N°1 : Utilisation de bras de fixation des cibles arborescents ; Utilisation de de bras de fixation des cibles non arborescents Figure N°2 : Uridine diphosphate glucose (UDPGluc), selon Harper biochimie, R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Editeur Me Graw-Hill International (UK) Ltd..
Figure N°3 : Liaison N au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°4 : Liaison O au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°5 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°6 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°7 : Structure de la molécule de glycogène en un point de ramification, selon Harper Biochimie.
Figure N°8 : Amylopectine montrant la ramification 1 -» 6, selon Harper Biochimie.
Figure N°9 : Représentation schématique de l'agrécane du cartilage nasal bovin, selon Harper Biochimie.
Figure N°10 : Représentation schématique de polymères d'immunoglobulines humaines. Les chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes épaisses ; les ponts disulfure reliant les différentes chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes fines.
Comme indiqué ci-avant, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence. Ce principe, nouveau à notre connaissance, présente l'intérêt de pouvoir limiter les difficultés liées à l'encombrement sterique des molécules. En effet, le fait de fixer les acides nucléiques cibles au bout de l'arborescence de tels "bras" permet d'augmenter la surface de présentation de ces cibles aux acides nucléiques sondes étudiés (voir Figure 1 ). Par ailleurs, cela permet de diminuer le nombre de molécules à fixer directement sur le support des puces à ADN (seuls les troncs de ces "bras" sont fixés). Ceci permet donc d'obtenir une forte densité d'acides nucléiques cibles sur chaque "spot" de la puce tout en ayant un encombrement sterique de ces cibles diminué par rapport aux situations où les cibles sont soit directement fixées sur le support, soit fixées sur le support par l'intermédiaire d'un "bras" linéaire.
Plusieurs natures physiques de bras ont été proposées dans l'art antérieur pour la fixation d'oligonucléotides sur des supports. On peut citer, de façon non limitative, des oligoethylene glycols linéaires de 26 à 105 atomes de longueur, sélectionnés pour leur capacité à être liés de façon covalente à l'une des extrémités de l'oligonucléotide d'une part, et d'autre part à être fixés de façon covalente à divers supports de biopuce. Toutefois, à ce jour, tous les bras qui ont été proposés présentent une structure primaire linéaire et/ou sont de nature synthétique (voir WO 00/43539 et WO 99/10362). La présente invention réside dans la mise en évidence que des bras non linéaires peuvent être utilisés pour fixer les acides nucléiques aux supports, notamment des bras en forme d'arborescence, à base de préférence d'un polymère d'origine biologique.
Dans un mode plus particulier, le bras est un polymère ayant une organisation spatiale en arborescence, de préférence de forme oblongue. Avantageusement, le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
Le bras arborescent peut être préparé à partir de différentes molécules organiques, notamment de polymères organiques (existant dans la nature), leurs dérivés, ou de composés mixtes, comportant une partie organique et une partie synthétique. Dans un mode particulier de mise en œuvre, le bras selon l'invention comprend un polymère organique d'origine biologique. Le composé biologique utilisé pour la préparation du bras peut être un sucre, un polypeptide, une glycoprotéine, un glycopolypeptide, une immunoglobuline, etc. éventuellement sous forme isolée, complexée ou multimérisée, le cas échéant fonctionnalisé ou modifié, notamment au moyen de molécules ou polymères synthétiques, ou de groupes chimiques réactifs.
S'agissant de composés organiques existant dans la nature, ceux-ci peuvent être purifiés à partir d'extraits biologiques ou synthétisées artificiellement.
Selon un premier mode avantageux de mise en oeuvre, le polymère organique est un polymère de sucres ou polysaccharides.
L'utilisation de tels polymères de sucres pour la préparation de biopuces ou, plus généralement, l'immobilisation d'acides nucléiques, présente de multiples intérêts et avantages, liés notamment à leurs propriétés chimiques et à leur structure primaire et secondaire.
Ainsi, les polysaccharides sont hydrophiles, ce qui est une condition favorable à l'hybridation des sondes sur les cibles et notamment à celle des sondes de nature nucleotidique (ADN, ARN) ou dérivée (PNA). En effet, ces dernières sont hydrophiles et leur hybridation se fait en solution aqueuse. Un polymère d'ancrage hydrophobe risquerait donc de gêner l'hybridation en ayant un effet répulsif sur la solution d'hybridation. D'autre part, les polysaccharides, notamment ceux décrits, ont des radicaux permettant la création de liaisons covalentes en bouts de chaîne (à toutes les extrémités), du fait de la présence de fonctions hydroxyles (OH). Les liaisons covalentes, peuvent être, par exemple, des liaisons phosphate (C-P-C ou C-P-P-C ou C-Pn-C) telles qu'il en existe dans les sucres nucléotidiques ou dans les polynucléotides donneurs de sucres qui interviennent dans la synthèse des polysaccharides et des glycoproteines. Un exemple possible d'ancrage est basé sur les étapes de la synthèse naturelle du glycogène et notamment la réaction du glucose-1 -phosphate avec l'uridine triphosphate (UTP) en présence de l'enzyme UDPGluc-pyrophosphorylase pour former l'uridine diphosphate glucose (UDPGluc, Figure n°2). Il peut encore s'agir de liaisons azote (C-N-C-C) telles qu'elles existent dans les glycoproteines (voir Figure n°3), de liaisons oxygène (C-O-C) comme c'est également le cas dans certaines glycoproteines ou dans la structure même des polysaccharides (voir Figure n°4). Cette propriété permet donc d'établir de façon simple des liaisons covalentes entre les polysaccharides et d'autres polymères (tels que, par exemple, des protéines, d'autres polysaccharides, ou des acides nucléiques).
La formation dans la nature de complexes « sucres nucléotidiques », par exemple lors de l'une des étapes intermédiaires de la synthèse naturelle du glycogène comme donneur de glucose (dans ce cas précis, la liaison sucre-nucléotide est une liaison diphosphate, aboutissant à l'uridine diphosphate glucose, avec une liaison glucose-ribose, voir Figure n°2) illustre ce type d'interaction et l'établissement de liaisons covalentes entre des sucres et des acides nucléiques. A titre d'exemple, la liaison polysaccharide-polynucléotide peut faire intervenir des liens de type 1 -> 5, sucre1-sucre2, le sucre 1 étant à l'extrémité du polysaccharide, le sucre 2 étant celui du nucléotide se trouvant à l'extrémité 5' du polynucléotide.
Un autre avantage de l'utilisation de polysaccharides selon l'invention découle de leur structure primaire et secondaire. En effet, les polysaccharides utilisés dans la présente invention sont polyramifiés (voir Figure n°5). Par ailleurs, leur taille (21 nm de diamètre pour le glycogène) est tout à fait adaptée au format miniaturisé des puces à ADN, et l'écart entre les embranchements (environ 13 résidus de glucose en ce qui concerne le glycogène naturel) permet d'éviter, de manière avantageuse, un encombrement sterique trop important des cibles fixées sur les extrémités du polymère ramifié. Un embranchement tous les 2 à 5 résidus, risquerait, en effet, de gêner l'hybridation des sondes. D'autre part, les polysaccharides, comme le glycogène, ont une forme sphérique adaptée aux surfaces, selon l'invention, de présentation des sondes (voir Figures 5 et 6).
Enfin, l'utilisation de polymères à base de sucres permet également de fixer, de façon covalente et grâce à l'une des liaisons chimiques telles que décrites précédemment, les sucres au support de la puce, soit par l'une quelconque de leurs extrémités, soit, préférentiellement, par leur noyau. Cette liaison peut être une liaison directe sur le support ou une liaison indirecte par l'intermédiaire d'une molécule d'ancrage, une telle molécule pouvant être, notamment, de nature protéique. Ainsi, dans le cas du glycogène naturel, celui-ci est lié de façon covalente par son noyau à une protéine, la glycogénine (en l'occurrence ici par un résidu tyrosine). Dans ce cas de figure, le polysaccharide est donc utilisé dans ces applications sous forme d'une glycoprotéine.
Un exemple spécifique d'une telle molécule est la molécule de glycogène, notamment de glycogène endogène chez l'être humain. Cette molécule est un polymère de sucres dont, à partir d'un tronc commun, de nombreuses ramifications s'étendent, elles-mêmes polymères de sucres. Un objet particulier de la présente demande concerne donc l'utilisation de glycogène ou de dérivés du glycogène dans ce but. Le glycogène possède toutes les propriétés citées ci-dessus. Elle est disponible commercialement et peu coûteuse (Voir Figures n° 5, 6 et 7 : puce-glycogène- polynucléotide). Une molécule de glycogène peut présenter plus de 60 extrémités glucidiques libres, permettant donc de fixer plus de 60 sondes, ce qui correspond à une capacité de fixation très importante, et très difficile à obtenir par synthèse artificielle de polymères, tout en gardant un encombrement spatial limité qui soit compatible avec l'utilisation prévue selon l'invention.
D'autres exemples de tels composés à base de sucres biologiques sont l'amylopectine ou tout autre polymère dérivé de la structure de l'amidon (voir Figure n°8), les glycosaminoglycanes (notamment les mucopolysaccharides), ainsi que tout autre polysaccharide, quels que soient le ou les sucres entrant dans sa composition (galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N'acétylgalactosamine, N-acétylglucosamine, etc.), pouvant présenter une structure ramifiée.
Le polymère ou composé organique arborescent peut encore être un polymère à base de glycoproteines. De telles molécules existent dans la nature et ont pour propriété d'avoir une structure présentant un noyau protéique, autour duquel peuvent être liés de façon covalente des polysaccharides (liaison O- ou N- en fonction des acides aminés qui servent de résidu et sur lesquels la chaîne polysaccharidique est fixée) (voir Figures n° 3 et 4). Ces polysaccharides peuvent être fixés en nombre variable, et notamment en nombre supérieur à 2. Une même glycoprotéine peut présenter plusieurs polysaccharides différant en longueur, en nombre de résidus entre les ramifications et en nature chimique des résidus (pentoses, hexoses etc.) sans que ceci n'affecte le principe général de leur utilisation dans ces applications. La structure générale de ces molécules peut être ramifiée. Dans ce cas de figure, les sondes de capture (ADN, ARN, PNA..) sont fixées de façon covalente à l'extrémité des chaînes de polysaccharides. La liaison de la glycoprotéine sur le support de la puce peut se faire soit au niveau du noyau protéique, soit au niveau d'une chaîne polysaccharidique, mais, dans ce cas, préférentiellement au niveau du noyau protéique, et de façon encore plus préférée par une liaison O- ou N- avec un résidu d'acide aminé, soit à une molécule intermédiaire d'ancrage elle même directement fixée sur le support, soit directement au support.
Ces molécules possèdent les propriétés requises pour leur application dans le cadre des biopuces selon l'invention, comme c'est le cas du complexe glycogène- glycogénine précédemment évoqué. Dans le cas d'autres glycoproteines, les caractéristiques spatiales peuvent varier (taille de la molécule, nombre de ramifications, et nombre de résidus entre les ramifications), mais elles restent dans les mêmes ordres de grandeur (facteur 10) que ceux cités pour le glycogène ou l'aggrégane, et sont donc compatibles avec leur utilisation pour des biopuces.
La présente invention fonctionne également avec des glycoproteines présentant plusieurs chaînes polysaccharidiques, dans le cas de figure où ces chaînes ne sont pas elles mêmes ramifiées, mais où la structure externe de la molécule reste globalement sphérique et possède, en périphérie, de nombreux sites de fixation de sondes (structure générale de type « oursin »), et une taille moléculaire du même ordre de grandeur que celle du glycogène ou de l'aggrégane.
Des exemples particuliers de tels composés sont les protéoglycannes, protéines renfermant des glycosaminoglycannes liés de façon covalente. Dans ces molécules, les protéines forment le « noyau protéique » de la molécule, et les glycosaminoglycannes forment ses ramifications. Préférentiellement, l'invention porte sur l'utilisation de l'aggrécane. L'aggrécane (voir figure n°9), est une glycoprotéine présente de façon naturelle notamment dans les cartilages. Elle peut se présenter sous la forme naturelle de multiples molécules de protéoglycannes agrégées sur un motif (polymère) central, tel que l'acide hyaluronique, cette agrégation pouvant se faire, par l'intermédiaire de liaisons covalentes ou non, avec le polymère central, et aboutissant à la formation d'une « super molécule » multi- ramifiée, dont les propriétés générales de structure sont compatibles avec l'invention, et dont les extrémités libres, qui sont des sucres, peuvent être liées aux cibles. Enfin, les protéoglycannes sont globalement chargés de façon négative, ce qui peut favoriser la spécificité de l'hybridation sonde-cible dans le cas où celles-ci sont des acides nucléiques (ADN, ARN).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le polymère peut aussi être un polymère d'acides aminés, ou de tout type de molécules possédant des groupements aminé réactifs à une attaque nucléophile ou d'autres types de groupements chimiques pouvant être liés de façon covalente à un acide nucléique.
Le polymère organique peut ainsi être un polymère à base de protéines ou de complexes protéiques (formés de plusieurs sous-unités, elles-mêmes reliées entre elles par des liaisons covalentes telles que des liens disulfure), qui présentent une structure de type ramifiée.
Un exemple particulier de composé polypeptidique est représenté par les immunoglobulines (Ig), que celles-ci soient sous forme simple ou sous forme de complexes (comme dans le cas des immunoglobulines de type A, voir Figure n°10). Les immunoglobulines, molécules naturelles, sont faciles à produire en grande quantité après sélection de clones adéquats (immunoglobulines monoclonales). Dans cette application, les immunoglobulines sont utilisées en tant que molécules d'ancrage des sondes de capture. Les sondes sont liées aux extrémités Fab des immunoglobulines, soit par une liaison de type antigène-anticorps classique, dans le cas où l'immunoglobuline est dirigée contre une portion de la sonde, soit, de manière préférentielle par une liaison covalente de type acide aminé (de l'Ig) - sucre (du polynucléotide).
Il est entendu que l'homme du métier peut sélectionner d'autres composés d'origine biologique ayant les caractéristiques requises pour une utilisation dans la présente invention, à savoir la possibilité de créer de multiples liaisons avec une molécule d'intérêt (il peut s'agir par exemple d'acides nucléiques), une forme en arborescence assurant une excellente disponibilité et permettant d'augmenter la densité, et une absence d'interférence avec la réaction d'hybridation.
Pour la mise en œuvre de l'invention, le tronc de la molécule servant de bras de fixation est fixé sur le support de la puce, de préférence de manière covalente, et les acides nucléiques cibles sont fixés (ou synthétisés directement) au bout de plusieurs ou de toutes les arborescences de la molécule, de préférence de manière covalente. La Figure 1 donne une représentation dans l'espace d'une biopuce construite au moyen d'un tel bras, en comparaison avec les biopuces fabriquées avec des bras linéaires. Préférentiellement, un type unique de molécules de bras est utilisé sur une même biopuce, à une densité qui peut être adaptée par l'homme du métier. Toutefois, il est entendu que des molécules de structure et/ou de longueur et/ou de forme différentes peuvent être utilisées sur une même biopuce.
Les acides nucléiques peuvent, à titre d'exemple, être fixés sur le bras par l'intermédiaire d'un groupement aminé qui soit réactif à une attaque nucléophile, quelle que soit la nature de cette attaque. Par exemple, un groupement aminé N3 peut être lié de façon covalente avec un acide nucléique sous l'action d'une exposition à la lumière. D'une façon plus générale, le bras polymère contient préférentiellement, en bout de chaîne de ses bras, un groupe chimique activable, quel que soit celui-ci, qui ait la capacité à être lié de façon covalente avec un groupe phosphate (ou autre) en bout de chaîne d'un acide nucléique. Ce groupe chimique activable peut être présent lors de la synthèse du polymère ou lui être ajouté dans un second temps. Il peut être actif d'emblée lors de la synthèse du polymère ou lors de sa fixation sur le polymère, ou bien être activé chimiquement dans un second temps. Un certain nombre de modes chimiques d'établissement de liaison covalente entre un nucléotide ou un acide nucléique d'une part, et un support de nature non nucléique d'autre part, ont été décrits dans l'art antérieur, par exemple pour la synthèse d'oligonucléotides in vitro ou pour la fixation d'oligonucléotides sur un support métallique. Ces techniques peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention pour fixer des acides nucléiques sur une puce à ADN, notamment en les fixant par l'intermédiaire de bras tels que définis ci-avant. Ceci inclut la possibilité d'effectuer cette fixation par l'intermédiaire d'un système du type streptavidine. La fixation du bras sur le support peut se faire par l'intermédiaire d'un groupe chimique activable, en bout de tronc, qui puisse interagir avec des molécules du support de façon à créer une liaison, idéalement de type liaison covalente.
Comme indiqué ci-avant, l'utilisation de bras arborescents selon la présente invention offre de nombreux avantages en termes de densité d'acides nucléiques cibles. Par exemple, dans le cas de "spots" de 2Θ μm de diamètre:
- Dans le cas "A" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras de fixation non arborescents (rapport moléculaire stochiométrique bras/cibles = 1 ), ou de la fixation directe des cibles sur le support, la surface de présentation des cibles (surface à laquelle les sondes vont accéder pour être hybridees aux cibles) est de: (π) x (rayon)2 = (π) x θ 2 = α (μm2).
- Dans le cas "B" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras arborescents, on peut estimer que chaque bras forme une structure hémisphérique au niveau de la surface de présentation des cibles (surface de fixation des cibles sur le bras), soit, en d'autres termes, que la surface totale de présentation des cibles est de: (1/2) x (4) x (π) x (rayon)2 = 2 x (ττ) x θ 2 = 2 x α (μm2).
Cela revient donc à doubler la surface de présentation du cas "A", pour une densité de cibles constante. Ou inversement, pour une même quantité de cibles par
"spot", de diminuer d'un facteur 2 leur densité et donc d'améliorer l'accessibilité des cibles pour les sondes (diminution de l'encombrement sterique). Par extension, si la surface des bras arborescents est de forme oblongue, la surface de présentation des cibles est d'autant plus augmentée.
Par ailleurs, la densité de fixation des cibles sur des bras arborescents est, a priori, d'autant plus forte que celle obtenue par fixation directe des cibles sur le support de la puce ou par fixation des cibles par l'intermédiaire de bras linéaires (non arborescents) car, pour un même nombre de cibles fixées par "spot" de la puce, l'encombrement sterique des bras eux-mêmes à la surface du support de la puce est inférieur dans le cas de bras arborescents par rapport aux bras linéaires. Par conséquent, en réalité, la densité des cibles doit pouvoir être augmentée de plus d'un facteur 2 selon ce principe, ou l'encombrement sterique des cibles doit être diminué de plus d'un facteur 2.
Cet aspect de l'invention permet donc à la fois, d'une part d'augmenter la densité de cibles par "spot" de la puce (et par conséquent d'augmenter la sensibilité de détection lors de la mesure de l'hybridation des sondes sur les cibles), et d'autre part simultanément de diminuer l'encombrement sterique des cibles (et par conséquent de favoriser l'hybridation des sondes sur les cibles, ce qui augmente aussi la sensibilité de détection).
Comme indiqué ci-avant, les biopuces comprenant ce type de bras peuvent être composées d'un support comportant une surface plane et/ou bombée, de nature solide ou semi-solide. En outre, ces supports peuvent comprendre des matériaux tels que verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino- réactifs, ou des supports chargés négativement, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte. D'autre part, les acides nucléiques cibles immobilisés sur les arborescences des bras peuvent également être de nature, de composition et d'origine variées. Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides (ou autres vecteurs tels que cosmides, YAC, phages, etc.), d'ADNc simple ou double-brin ou d'ARN. De même, la longueur des acides nucléiques peut être variée. Toutefois, on préfère cependant que les acides nucléiques aient une longueur inférieure à environ 1000 bases (ou paires de bases).
Dans un mode particulier de mise en œuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'acides nucléiques simple-brin, notamment d'acides nucléiques simple-brin ayant une longueur inférieure à 1000 bases.
Dans un mode particulier de mise en œuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'ARN simple brin, de préférence ayant une longueur inférieure à 1000 bases. Il peut s'agir notamment d'ARN totaux ou d'ARNm, prélevés à partir d'un échantillon biologique. La présente invention décrit en effet pour la première fois l'utilisation d'ARN simple-brins comme cibles sur une biopuce. Ceci constitue un autre objet particulier de la présente demande.
Dans une autre variante de l'invention, il s'agit d'ADN simple-brin, ou de mélanges d'ADN et d'ARN simple-brins.
Dans un mode préféré de mise en œuvre de l'invention, les acides nucléiques cibles simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucleotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucleotides environ.
A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside également dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, les acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 25 et 100 nucleotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucleotides. L'invention réside également dans l'utilisation, comme acides nucléiques cibles, d'une population (de fragments) d'acides nucléiques simple brin ayant une longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ, désignés dans la présente demande par l'expression "oligonucléotides longs".
Selon une première variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ. Selon une autre variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ.
Avantageusement, il s'agit d'acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro, selon les techniques connues de l'homme du métier (synthétiseurs). Ces oligonucléotides sont ensuite, dans un deuxième temps immobilisés sur le support.
L'utilisation (de fragments) d'acides nucléiques de telle longueur permet, par opposition aux produits disponibles actuellement, d'obtenir une hybridation spécifique des sondes sur leurs cibles correspondantes sur les biopuces. En effet, comme indiqué précédemment, l'utilisation d'oligonucléotides longs de 25 bases ou moins, tels que décrits dans l'art antérieur, entraîne la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des expériences utilisant ce système. L'utilisation selon l'invention d'oligonucléotides plus longs, notamment d'une longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides, peut au contraire permettre d'obtenir une spécificité absolue d'hybridation.
Les oligonucléotides longs peuvent, une fois synthétisés, être fixés sur le support de la biopuce, de manière ordonnée. Cette fixation peut être soit directe
(fixation de l'oligonucléotide long directement sur le support), soit indirecte (fixation covalente de l'oligonucléotide long sur un "bras" tel que défini et décrit ci-avant, ce bras étant fixé sur le support). L'intérêt de fixer l'oligonucléotide long de façon indirecte est d'augmenter l'accessibilité des sondes à la séquence de l'oligonucléotide, par rapport à la situation de fixation directe où l'encombrement sterique est plus important. Cependant, la fixation directe de l'oligonucléotide long est possible et peut permettre une spécificité d'hybridation suffisante pour l'utilisation reproductible des biopuces à oligonucléotides. Quel que soit le mode de fixation (directe ou indirecte), les oligonucléotides sont fixés par une de leurs extrémités (5' ou 3') et non sur toute leur longueur, afin de donner aux sondes une bonne accessibilité aux oligonucléotides. Par ailleurs, dans le cas d'une fixation indirecte, deux choix sont possibles: soit les oligonucléotides longs sont fixés par une de leurs extrémités sur le bras, et les complexes oligonucléotide-bras sont ensuite déposés de façon ordonnée sur le support et fixés à celui-ci, soit le bras est d'abord fixé au support, et les oligonucléotides longs sont ensuite déposés de manière ordonnée sur le complexe bras-support et fixés aux bras.
Dans ce mode de mise en œuvre, le type de support et de bras utilisés peuvent être comme décrits ci-avant. L'utilisation de ce type de biopuces à oligonucléotides longs synthétisés chimiquement selon la présente invention offre certains avantages, par rapport à l'utilisation de cibles simple brin plus courtes et/ou de cibles double brin et plus longues produites par PCR : Tout d'abord, le fait que la cible soit de nature simple brin permet d'améliorer le rendement de la réaction d'hybridation de la sonde sur la cible. En effet, si la cible est de nature double brin, un nombre important de cibles vont s'hybrider sur elles-mêmes lors de cette réaction (le deuxième brin de la cible est en compétition avec la sonde pour l'hybridation). Ensuite, la synthèse chimique directe des cibles est de gestion plus simple que la synthèse des cibles par PCR. Dans le premier cas, seule la connaissance des séquences des cibles que l'on veut disposer sur la puce est nécessaire, alors que dans le second cas il est nécessaire de disposer matériellement d'acides nucléiques contenant ces séquences (en général sous forme de clones) afin de pratiquer leur amplification spécifique par PCR.
D'autre part, l'amplification par PCR produit une population d'acides nucléiques double brin hétérogène avec, dans l'immense majorité des cas, la présence de fragments contaminants, même si ces fragments sont minoritaires dans le produit final de la réaction. Ceci entraîne la présence d'hybridations sondes-cibles aspécifiques et par conséquent un bruit de fond lors de la mesure des taux d'hybridation. A l'inverse, la synthèse directe des cibles simple brin permet d'obtenir des fragments d'acides nucléiques de séquence très homogène et permet à terme d'obtenir des cibles plus pures et par conséquent moins d'hybridation sonde-cible aspécifique. Cette spécificité est d'autant plus assurée lorsque les biopuces comportent des bras, arborescents ou non, chargés électriquement comme il sera décrit plus loin. Enfin, la synthèse chimique des sondes simple brin est automatisable de manière à obtenir des cibles purifiées, alors que les cibles double brin produites par PCR doivent être purifiées avant leur fixation sur le support.
Les biopuces à oligonucléotides synthétiques longs selon l'invention représentent donc un avantage technique important par rapport aux produits et aux procédés décrits dans l'art antérieur. Cet avantage est d'autant plus grand lorsque ces biopuces comportent des bras arborescents ou des bras ou supports chargés électriquement.
En effet, la présente invention décrit en outre de nouvelles approches pour contrôler l'arrangement spatial des acides nucléiques et/ou des bras sur la biopuce, de manière à favoriser les conditions de présentation, et donc d'hybridation des sondes sur les cibles. En particulier, la présente invention montre à présent qu'il est possible de déterminer (et de modifier) les caractéristiques électriques des bras (que ceux-ci soient des polymères organiques de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou des polymères non organiques de synthèse) ou des supports de biopuce, de façon à améliorer les conditions d'hybridation, notamment la sélectivité et la sensibilité des biopuces.
Cet aspect de l'invention peut être mis en oeuvre sur toutes les natures possibles de bras de fixation d'oligonucléotides sur les supports de biopuces, que leur structure primaire soit linéaire ou arborescente, et quelle que soit la nature du support de la puce.
Ainsi, il est connu que les acides nucléiques sont chargés négativement (du fait que ce sont des acides faibles qui sont, dans les conditions habituelles, dans des environnements de pH supérieur à leur pKa; leurs fonctions acides sont situées sur les groupements phosphates qui assurent la liaison entre les sucres des nucleotides). Les interactions entre séquences d'acides nucléiques peuvent être, en simplification, schématisées comme suit: d'une part, ces séquences peuvent être hybridees entre elles par l'établissement de liaisons hydrogène et de forces de Van der Waals entre des bases complémentaires (ce qui peut être considéré comme une affinité entre elles), d'autre part elles peuvent se repousser du fait de leurs charges négatives au niveau des groupes phosphate. Pour obtenir une hybridation stable entre deux molécules simple brin d'acides nucléiques, il faut que l'attraction liée aux liaisons hydrogène et de Van der Waals soit supérieure à la répulsion liée aux charges négatives, ce qui est le cas lorsque le nombre de bases complémentaires adjacentes est suffisant pour obtenir une attraction supérieure à la répulsion. Un autre paramètre qui entre en compte est celui des contraintes atomiques de repliement des molécules (structures secondaires et tertiaires). Ces principes généraux concernant les acides nucléiques sont aussi valides au sein d'une même molécule simple brin d'acide nucléique, quelle que soit sa longueur. Ils permettent d'expliquer la capacité ou non d'une telle molécule à s'hybrider ou non sur elle-même. En ce qui concerne les bras de fixation des cibles sur le support de la puce, eux aussi sont soumis à des contraintes atomiques de structure secondaire et d'encombrement sterique, mais ils ne présentent pas de phénomène d'attraction et d'hybridation tels que ceux décris pour les acides nucléiques. Ces contraintes s'exerçant sur les bras sont aussi influencées par le fait que des brins d'acides nucléiques soient fixés à leur(s) extrémité(s).
Un des problèmes posés par la fabrication des biopuces, que les cibles fixées soient des oligonucléotides simple brin (quelle que soit leur longueur) ou des
ADN double brin (qu'il s'agisse de plasmides entiers ou de produits de réaction de polymérisation en chaîne (PCR)), est celui de l'accessibilité de ces cibles aux molécules sondes que l'on veut analyser et que l'on veut hybrider de façon spécifique sur leurs cibles correspondantes. Cette accessibilité conditionne le rendement des réactions d'hybridation et par conséquent la sensibilité et la spécificité de l'analyse des sondes. Cette accessibilité à l'hybridation sonde-cible est diminuée notamment par l'encombrement sterique des cibles fixées sur la puce, par les interactions entre cibles situées à proximité les unes des autres en raison de l'encombrement sterique (hybridations partielles) et par les structures secondaires de celles-ci (repliements intra-moléculaires des cibles). Les difficultés liées à l'encombrement sterique sont générées par la nécessité de disposer les cibles avec une forte densité sur chaque "spot" de la puce si l'on veut pouvoir détecter de faibles taux d'acides nucléiques spécifiques (sensibilité de détection) et diminuer les effets de saturation des capacités d'hybridation qui risquent de gêner la quantification des signaux d'hybridation. C'est pourquoi un principe général est de déposer des quantités moléculaires de cibles telles qu'elles soient en large excès par rapport aux molécules correspondantes des sondes.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. Elle décrit en effet l'utilisation de bras ou de supports particuliers, réduisant les interférences ioniques entre les cibles, et assurant ainsi une meilleure hybridation, y compris lorsque les cibles sont présentes à des densités élevées. Plus particulièrement, la présente demande montre qu'il est possible d'utiliser, pour fixer les cibles sur le support des biopuces, des bras de fixation ayant une charge électrique négative ou des supports chargés négativement.
Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras portant une charge électrique négative. Un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme
La présente invention réside également dans l'utilisation de molécules chargées négativement ou de supports chargés négativement, pour la préparation de biopuces.
L'utilisation de bras de fixation qui soient chargés négativement de façon uniforme, dans les conditions expérimentales d'hybridation des sondes sur les cibles, permet avantageusement d'obtenir les phénomènes suivants:
- Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des bras adjacents, ce qui a pour conséquence de diminuer à la fois leurs repliements propres et leur encombrement sterique, notamment au niveau de leurs extrémités fixées sur les cibles ; - Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des cibles qui sont fixées à leurs extrémités, ce qui a pour conséquence de pousser les cibles à se disposer vers "l'extérieur", c'est-à-dire à s'éloigner du support de la puce, les rendant plus accessibles aux sondes ; - Ces contraintes mutuelles de répulsion ont pour conséquence de limiter les interactions attractives entre sondes adjacentes en les éloignant les unes des autres, les rendant plus accessibles aux sondes et diminuant les risques d'attractions mutuelles liées aux forces de Van der Waals ou aux liaisons hydrogène ;
- Ce champ électrique négatif exercé du coté des cibles fixé aux bras a tendance à défaire les structures secondaires des cibles (c'est-à-dire à les linéariser) et par conséquent à diminuer le repliement des cibles sur elles-mêmes, les rendant plus accessibles aux sondes ; - La couche située près du support de la puce et formée par les bras est globalement chargée de façon négative, ce qui a pour conséquence d'exercer une force de répulsion électrique vis à vis des sondes (elles-mêmes chargées négativement) et donc de diminuer les phénomènes d'hybridations aspécifiques sondes-cibles. Ceci permet de diminuer les phénomènes de bruit de fond lors de l'analyse des résultats d'hybridation, et par conséquent d'augmenter à la fois la sensibilité et la spécificité des analyses pratiquées par la technologie des puces à ADN.
Cet aspect particulier de l'invention apporte donc une amélioration technologique claire aux méthodes de l'art, assurant meilleures sélectivité et sensibilité aux biopuces.
Bien entendu, cet aspect de l'invention n'est pas limité aux biopuces dans lesquelles des bras sont utilisés. Au contraire, il s'applique également à l'utilisation d'un support de puce chargé négativement de façon uniforme, dans les situations où les cibles sont directement fixées sur le support sans bras intermédiaires. Ceci est valable que l'établissement des charges négatives sur le support soit effectué préalablement ou après la fixation des cibles sur le support. Ceci est un principe différent de celui qui consiste à déposer les cibles sur des micro-électrodes auxquelles on peut appliquer un courant électrique, car dans ce dernier cas la charge électrique du support n'est pas homogène. Dans cet aspect de l'invention, les biopuces peuvent comporter tout type de population d'acides nucléiques cibles telles que définies ci-avant, et les bras chargés négativement peuvent également comporter une forme en arborescence, telle que mentionnée ci-avant.
La présente invention réside également dans un procédé de préparation des biopuces, telles que décrites ci-avant, comprenant l'immobilisation (ou la fixation) des acides nucléiques sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique. Le procédé de préparation peut comprendre une première étape de fixation du bras en forme d'arborescence sur le support, suivie d'une deuxième étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le procédé de préparation de la biopuce peut comprendre une première étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence puis une deuxième étape de fixation du complexe, obtenu lors de la première étape, au support.
La présente invention réside également dans l'utilisation des biopuces telles que décrites ci-avant, dans un but expérimental, thérapeutique, diagnostic. En particulier, l'invention concerne l'utilisation des biopuces décrites ci-avant
- pour étudier la régulation de l'expression génétique, ou
- pour la recherche de gènes ou fragments de gènes, ou
- pour l'identification de cibles, ou encore
- pour le diagnostic génétique.
Dans ces applications, les biopuces sont mises en contact avec une population d'acides nucléiques « sondes », généralement préalablement marquée, puis le profil d'hybridation des sondes sur la biopuce est déterminé, selon les techniques connues de l'homme du métier. Un objet de l'invention réside donc également dans un procédé d'analyse de polynucléotides, comprenant la mise en contact d'une population de polynucléotides, préférentiellement marqués, avec une biopuce selon l'invention, et la mise en évidence de la formation d'hybrides. Il est entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes spécifiques de réalisation décrits ci-avant, mais s'étend également aux variantes d'exécution entrant dans les connaissance normales de l'homme du métier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
2. Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
3. Biopuce selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le bras est un polymère organique.
4. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un polymère de sucres, par exemple le glycogène ou un dérivé du glycogène ou l'amylopectine.
5. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un polymère ramifié comprenant une répétition de monomères de galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N-acétylgalactosamine et/ou N- acétylglucosamine.
6. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un glycopolypeptide, par exemple l'aggrécane.
7. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un composé polypeptidique, par exemple une immunoglobuline.
8. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont fixés de manière covalente aux extrémités de l'arborescence des bras.
9. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les bras sont fixés au support, de manière covalente, par la partie tronc de la molécule.
10. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le support comporte une surface plane et/ou bombée.
11. Biopuce selon la revendication 10, caractérisée en ce que le support est un support solide ou semi-solide.
12. Biopuce selon la revendication 11 , caractérisée en ce que le support est composé de verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
13. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique.
14. Biopuce selon la revendication 13, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont choisis parmi les oligonucléotides de synthèse, les produits de PCR, les gènes ou fragments de gènes, des plasmides, des ADNc simple ou double-brin ou des ARN.
15. Biopuce selon la revendication 14, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple-brin, notamment des molécules d'acides nucléiques simple-brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucleotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucleotides environ.
16. Utilisation d'un polymère d'origine biologique (notamment d'un polymère de sucres, en particulier dérivés du glycogène) ayant une organisation spatiale en forme d'arborescence, pour la fixation d'acides nucléiques sur des supports.
17. Biopuce selon la revendication 13, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ.
18. Biopuce selon la revendication 17, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ.
19. Biopuce selon la revendication 17, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucleotides environ.
20. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro.
21. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des ARN immobilisés sur un support solide ou semi-solide au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
22. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques produits de PCR immobilisés sur un support solide ou semi-solide au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
23. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et 17 à 22, caractérisée en ce que le bras porte une charge électrique négative.
24. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et 17 à 22, caractérisée en ce que le support porte une charge électrique négative uniforme.
25. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, pour étudier la régulation de l'expression génétique.
26. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, pour la recherche de gènes ou fragments de gènes.
27. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, pour l'identification de cibles.
28. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, pour le diagnostic génétique.
29. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une étape de fixation du bras en forme d'arborescence surle support, et, b) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence obtenu en a).
30. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence, b) une étape de fixation du complexe obtenu en a) sur le support.
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