EP1230384A2 - Dna zum nachweis von veränderungen des chromosoms 8 - Google Patents

Dna zum nachweis von veränderungen des chromosoms 8

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EP1230384A2
EP1230384A2 EP00954353A EP00954353A EP1230384A2 EP 1230384 A2 EP1230384 A2 EP 1230384A2 EP 00954353 A EP00954353 A EP 00954353A EP 00954353 A EP00954353 A EP 00954353A EP 1230384 A2 EP1230384 A2 EP 1230384A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
deposited
under dsm
chromosome
dsmz under
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00954353A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Lichter
Stefan Joos
Andreas RÄTSCH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1230384A2 publication Critical patent/EP1230384A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to DNA which is suitable for the detection of changes in chromosome 8, in particular of 8q24 and very particularly of the c-myc region.
  • the invention further relates to the use of the DNA and a kit suitable for detecting the above changes.
  • changes in chromosome 8 in particular the chromosomal region 8q24, can be found.
  • the changes can be numerical or structural. Translocations, amplifications, duplications, deletions and / or inversions of larger areas of DNA are frequently found.
  • Changes in chromosome 8 are often detected using the chromosome banding technique. With this technique, changes at the chromosomal level can only be detected in viable dividable cells. Their resolution is only in the range of several megabases (> 5 MB). The identity of the amplified, rearranged or lost sequences therefore remains unknown in the chromosome banding technique.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which changes in chromosome 8, in particular chromosomal region 8q24, can be detected while avoiding the above disadvantages.
  • the agent should be suitable for clinical purposes, i.e. on a large scale.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that in the case of tumor diseases which show changes in chromosome 8, in particular the chromosomal region 8q24, these frequently relate to the c-myc gene or a region of approximately 1 MB around the c-myc gene. The applicant found this, for example, in Burkitt's lymphoma. He also recognized that the changes can be detected by one or more DNAs listed in Table I:
  • DNAs are located in a region of approximately 1 MB encompassing the c-myc gene (cf. FIG. 1). Furthermore, the DNAs were deposited with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) on November 24, 1998: the DNA of (A x ) under DSM 12523, the DNA of (A 2 ) under DSM 12524, the DNA of (B) under DSM 12521, the DNA from (C) under DSM 12520, the DNA from (D) under DSM 12525, the DNA from (E) under DSM 12528, the DNA from (F) under DSM 12526, the DNA from (G) under DSM 12522, the DNA from (H) under DSM 12529 and the DNA from (I) under DSM 12527.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • a DNA above or a part thereof, in particular that which comprises an overlap of two or more of the DNAs can be used to detect a change in chromosome 8, especially 8q24, and especially the c-myc region.
  • This can be done using conventional methods. It is expedient to carry out an in situ hybridization reaction or a matrix CGH “Comparative Genomic Hybridization” method. In such reactions or methods, any cellular sample containing chromosomal DNA, for example cells from bone marrow or blood, can be tested with a DNA according to the invention.
  • an in situ hybridization reaction or a matrix CGH method reference is made to the following examples.
  • the present invention it is possible to detect tumor diseases at the molecular level.
  • the importance of c-myc for the development and manifestation of tumor diseases can be determined.
  • the detection of the tumor diseases can be carried out in a clinically relevant manner, i.e. on a large scale.
  • the present invention also provides a kit.
  • This contains one or more DNAs according to the invention, customary auxiliary substances such as carriers, buffers, solvents and controls.
  • chips can be mentioned as carriers on which the DNAs according to the invention are applied in a conventional manner.
  • the chips can then be loaded with DNA from cellular samples and tested for changes in chromosome 8, especially 8q24 and especially the c-myc region.
  • a kit is also the subject of the present invention.
  • the present invention provides the basis for treating tumor diseases causally.
  • the DNAs according to the invention can be used as such or in conjunction with conventional gene transfer vectors, such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus vectors, for gene therapy.
  • gene transfer vectors such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus vectors
  • the present invention provides means of being able to intervene diagnostically and / or therapeutically for tumor diseases.
  • 1 shows the genomic localization of DNAs according to the invention in a region of about 1 MB spanning the c-myc gene.
  • FIG. 2 shows the result of in situ hybridization reactions with the DNA DSM 12527 according to the invention (cf. Table 1).
  • Figure 2 (A) shows normal human metaphase chromosomes. The red signals come from a c-myc cosmid sample, the green signals from the DNA according to the invention. It can be seen that both samples hybridize at the same chromosomal site (chromosome 8q24) and the signals from the combination of red and green therefore appear partially yellow. This experiment was repeated and confirmed with all DNAs according to the invention.
  • 2 (B) shows human metaphase chromosomes from a cell line of a Burkitt lymphoma. The red signals come from the DNA according to the invention, the green signals from a DNA from chromosome 22.
  • the hybridization signal from the DNA according to the invention is not shown, as in normal Cells on two but on three different chromosomes.
  • the DNA signals from chromosome 22, however, are only present on two chromosomes.
  • Example 1 Detection of a translocation relating to the c-myc gene by means of in situ hybridization
  • biotinylated dUTP can be used.
  • the DNA fragments should be in a size range between 500 and 800 base pairs.
  • the denaturing solution was placed in a cuvette and heated to 70 ° C. in a water bath.
  • Deionized formamide for molecular biology, cat. No. 112027, Merck, Darmstadt. Deionization was carried out by stirring the formamide with an ion exchanger (e.g. AG 501-X8 (D) Resin, Cat.No. 142-6425, Biorad,
  • an ion exchanger e.g. AG 501-X8 (D) Resin, Cat.No. 142-6425, Biorad
  • 2 x hybridization buffer 2x SSC, 20% dextran sulfate.
  • the precipitated DNA was taken up in 6 ⁇ l deionized formamide and shaken for 30 min at room temperature (vortex).
  • the DNA was then denatured at 75 ° C. for 5 minutes and then incubated at 37 ° C. for 20-30 minutes (“preannealing”).
  • Wash solution B 0.1 x SSC
  • Wash solution C 4 x SSC, 0.1% Tween 20
  • Blocking solution 3% BSA, 4 x SSC, 0.1% Tween 20 - detection buffer: 1% BSA, 4 x SSC, 0.1% Tween 20
  • washing solutions A and B were heated in a cuvette to 42 ° C in a water bath.
  • wash solution B which was preheated to 60 ° C, washed 3 x 5 min at 42 ° C.
  • the hybridization signals were evaluated using an epifluorescence microscope equipped with suitable filters for fluorescein and rhodamine (cf. FIG. 2).
  • Example 2 Detection of an over- or underrepresentation affecting chromosome 8 or chromosomal band 8q24 or the c-myc gene using a matrix CGH
  • the precipitated DNA was taken up in 12 ⁇ l hybridization buffer (10% dextran sulfate, 33.5% formamide, 2 x SSC) and shaken for 30 min at room temperature (vortex).
  • Washing solution A 50% formamide (p.A. Cat.No. 9684, Merck,
  • Wash solution C 4 x SSC, 0.1% Tween 20
  • Detection buffer 1% BSA, 4 x SSC, 0.1% Tween 20 - mouse anti-digoxigenin antibody (Röche Diagnostics).
  • Biotinylated anti-avidin Vector Laboratories Inc.
  • washing solutions A and B were heated in a cuvette to 42 ° C in a water bath.
  • the signals were then compared with biotinylated-anti-avidin, followed by fluorescein-conjugated avidin, or with a digoxigenin-conjugated sheep anti-mouse F (ab) 2 fragment and a rhodamine-conjugated sheep anti-digoxigenin -F (ab) 2 fragment amplified.
  • concentration was 5 ⁇ g / ml in detection buffer.
  • the incubation each time lasted 30 min at 37 ° C in a humid chamber. After each antibody incubation, the slide was washed 3 x 5 min in washing solution C at 42 ° C.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 8, besonders von 8q24 und ganz besonders des c-myc Gens. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und einen zum Nachweis vorstehender Veränderungen geeigneten Kit.

Description

DMA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 8
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die sich zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 8, besonders von 8q24 und ganz besonders der c-myc Region, eignet. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und einen zum Nachweis vorstehender Veränderungen geeigneten Kit.
Bei vielen Tumorerkrankungen finden sich Veränderungen des Chromosoms 8, insbesondere der chromosomalen Region 8q24. Die Veränderungen können numerischer oder struktureller Art sein. Häufig finden sich Translokationen, Amplifikationen, Duplikationen, Deletionen und/oder Inversionen von größeren DNA-Bereichen.
Der Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 8 erfolgt vielfach über die Chromosomen-Bänderungstechnik. Mit dieser Technik können Veränderungen auf chromosomaler Ebene nur in lebensfähigen teilungsfähigen Zellen nachgewiesen werden. Auch liegt ihr Auflösungsvermögen nur im Bereich mehrerer Megabasen (> 5 MB) . Die Identität der vermehrten, umgelagerten oder in Verlust geratenen Sequenzen bleibt daher bei der Chromosomen- Bänderungstechnik unbekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Veränderungen des Chromosoms 8, insbesondere der chromosomalen Region 8q24, unter Vermeidung vorstehender Nachteile nachgewiesen werden können. Insbesondere soll das Mittel geeignet sein, für klinische Zwecke, d.h. in großem Maßstab, verwendet werden zu können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß bei Tumorerkrankungen, die Veränderungen des Chromosoms 8, insbesondere der chromosomalen Region 8q24 aufzeigen, diese häufig das c-myc Gen bzw. einen Bereich von etwa 1 MB um das c-myc Gen betreffen. Der Anmelder hat dies z.B. bei Burkitt Lymphomen gefunden. Ferner hat er erkannt, daß die Veränderungen durch eine oder mehrere DNAs nachgewiesen werden können, die in der Tabelle I aufgeführt sind:
Tabelle I
Bezeichnung der DNAs Länge der DNAs
(Ax) LLNLP704H027Q13 104 kb
(A2) LLNLP704J1287Q13 105 kb
(B) LLNLP704F15291Q13 140 kb
(C) LLNLP704C07126Q13 166 kb (D) LLNLP704K19268Q13 159 kb
(E) LLNLP704K2280Q13 146 kb
(F) LLNLP704K20264Q13 97 kb
(G) LLNLP704G05103Q13 142 kb (H) LLNLP704M14318Q13 80 kb (I) LLNLP704K22117Q13 115 kb
Diese DNAs sind in einem das c-myc Gen umspannenden Bereich von etwa 1 MB lokalisiert (vgl. Fig. 1). Ferner wurden die DNAs bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 24. November 1998 hinterlegt: die DNA von (Ax) unter DSM 12523 , die DNA von (A2) unter DSM 12524, die DNA von (B) unter DSM 12521, die DNA von (C) unter DSM 12520, die DNA von (D) unter DSM 12525, die DNA von (E) unter DSM 12528, die DNA von (F) unter DSM 12526, die DNA von (G) unter DSM 12522, die DNA von (H) unter DSM 12529 und die DNA von (I) unter DSM 12527. Erfindungsgemäß kann eine vorstehende DNA oder ein Teil davon, insbesondere jener, der eine Überlappung von zwei oder mehreren der DNAs umfaßt, zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 8, besonders von 8q24, und ganz besonders der c-myc Region, verwendet werden. Dies kann mittels üblicher Verfahren erfolgen. Günstig ist es, eine in si tu Hybridisierungsreaktion oder ein Matrix CGH-"Comparative Genomic Hybridization" - Verfahren durchzuführen. In solchen Reaktionen bzw. Verfahren kann jegliche zelluläre Probe, die chromosomale DNA enthält, z.B. Zellen aus Knochenmark oder Blut, mit einer erfindungsgemäßen DNA getestet werden. Für die Durchführung einer in si tu Hybridisierungsreaktion bzw. einem Matrix CGH- Verfahren wird auf nachstehende Beispiele verwiesen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Tumorerkrankungen auf molekularer Ebene nachzuweisen. Insbesondere kann die Bedeutung von c-myc für die Entstehung und Manifestierung von Tumorerkrankungen bestimmt werden. Der Nachweis der Tumorerkrankungen kann in klinisch-relevanter Weise, d.h. in großem Maßstab, erfolgen. Hierzu stellt die vorliegene Erfindung auch einen Kit zur Verfügung. Dieser enthält eine oder mehrere erfindungsgemäße DNAs, übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen. Als Träger sind insbesondere Chips zu nennen, auf denen die erfindungsgemäßen DNAs in üblicher Weise aufgebracht werden. Die Chips können dann mit DNA aus zellulären Proben beladen und diese hinsichtlich Veränderungen des Chromosoms 8, besonders von 8q24 und ganz besonders der c-myc Region getestet werden. Ein solcher Kit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Desweiteren liefert die vorliegende Erfindung die Basis, Tumorerkrankungen ursächlich zu therapieren. Hierzu können die erfindungsgemäßen DNAs als solche oder in Verbindung mit üblichen Gentransfervektoren, wie Retrovirus-, Adenovirus- oder Vacciniavirus-Vektoren, für eine Gentherapie verwendet. Der Fachmann kennt Materialien und Bedingungen, die sich hierfür eignen. Insgesamt gesehen, stellt die vorliegende Erfindung Mittel bereit, diagnostisch und/oder therapeutisch bei Tumor erkrankungen eingreifen zu können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die genomische Lokalisation von erfindungsgemäßen DNAs in einem das c-myc Gen umspannenden Bereich von etwa 1 MB.
Fig. 2 zeigt das Ergebnis von in situ Hybridisierungs- Reaktionen mit der erfindungsgemäßen DNA DSM 12527 (vgl. Tab. 1) . In Fig. 2 (A) sind normale humane Metaphasenchromosomen gezeigt. Die roten Signale stammen von einer c-myc Cosmid-Probe, die grünen Signale von der erfindungsgemäßen DNA. Es zeigt sich, daß beide Proben an derselben chromosomalen Stelle (Chromosom 8q24) hybridisieren und die Signale daher aus der Kombination von rot und grün teilweise gelb erscheinen. Dieses Experiment wurde mit allen erfindungsgemäßen DNAs wiederholt und bestätigt. In Fig. 2 (B) sind humane Metaphasenchromosomen aus einer Zellinie eines Burkitt Lymphoms gezeigt. Die roten Signale stammen von der erfindungsgemäßen DNA, die grünen Signale von einer DNA von Chromosom 22. Durch die in dieser Zellinie vorhandene Chromosomentranslokation, bei der der c-myc Locus betroffen ist, zeigt sich das Hybridisierungssignal von der erfindungsgemäßen DNA nicht, wie in normalen Zellen auf zwei, sondern auf drei verschiedenen Chromosomen. Die Signale der DNA von Chromosom 22 sind dagegen nur auf zwei Chromosomen vorhanden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert. Beispiel 1: Nachweis einer das c-myc Gen betreffenden Translokation mittels in situ Hybridisierung
1.1 Markierung einer erfindungsgemäßen DNA (DSM 12527) durch Nick-Translation
Reagenzien, Puffer und Lösungen
10 x Reaktionspuffer mit 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml Rinder Serum Albumin (Fraktion V, Kat-
Nr. 735078, Röche Diagnostics Mannheim)
0 , 1 M ß-Mercaptoethanol
10 x Nukleotidstammlösung mit 0,5 mM dATP, 0 , 5 mM dCTP,
0,5 mM dGTP, 0,125 mM Digoxigenin-11-dUTP (Röche Diagnostics Mannheim, Kat.-Nr. 1558706), 0,375 mM dTTP
(alternativ kann biotinyliertes dUTP verwendet werden) .
Escherichia coli-DNA-Polymerase I (New England Biolabs
GmbH, Schwalbach/Taunus, Kat.-Nr. 209L) .
DNase I-Stammlösung: 3 mg in 1 ml 0,15 M NaCl, 50% Glycerin
Säulenpuffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1%
SDS
Säulen: Sephadex G50 (Medium) , 1 ml Tuberkulinspritzen
(z.B. "Primo" von Pharmaplast A/S, DK-4970 Rodby) , Glaswolle
Minigel: Agarose; TBE-Puffer; 1 kb-Größenmarker (Gibco
BRL, Eggenstein, Kat.-Nr. 15615-016); Gelladepuffer
Ablauf :
1. 2 μg der erfindungsgemäßen DNA wurden zusammen mit 10 μl des 10 x Reaktionspuffers, 10 μl ß-Mercaptoethanol, 10 μl der Nukleotidstammlösung, 20 U der DNA-Polymerase I und 2 μl einer 1 : 1000-Verdünnung der DNase-Stammlösung (in Wasser) in ein Reaktionsgefäß pipettiert.
2. Die Markierungsreaktion erfolgte bei 15°C für 120 min. 3. Mittels Gel-Elektrophorese wurde die markierte erfindungsgemäße DNA auf die für die in situ Hybridisierung geeignete Fragmentgröße (etwa 500-800 bp) getestet. 10 μl des Reaktionsansatzes wurden mit 3 μl Gelladepuffer versetzt, in kochendem Wasser 2-3 min denaturiert und anschließend 3 min auf Eis gekühlt. Danach wurde das Aliquot auf ein 1-2% Agarose-Minigel zusammen mit dem 1 kb-Größenmarker aufgetragen. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte bei 15 V/cm für 30 min. Nach der Anfärbung mit Ethidiumbromid konnte das Gel unter UV-Licht photographiert und die Größe der DNA- Fragmente ermittelt werden.
4. Im optimalen Fall sollten die DNA-Fragmente in einem Größenbereich zwischen 500 und 800 Basenpaaren liegen.
Lag die durchschnittliche Größe der Fragmente oberhalb dieses Bereiches, wurde die verbliebene DNA nochmals mit DNase I inkubiert, bis die optimale Größe der Fragmente erreicht war.
Zur Inaktivierung der DNase wurden dem Reaktionsansatz 2 μl 0,5 M EDTA (Endkonzentration 10 mM) und 1 μl 10% SDS (Endkonzentration 0,1%) zugesetzt und dieser bei 68°C für 10 min erhitzt.
6. Nichtinkorporierte Nukleotide wurden von der DNA-Probe durch Gelfiltration mittels Trennsäulen entfernt, die wie folgt hergestellt worden waren:
(a) Eine 1 ml-Tuberkulinspritze wurde zunächst mit Glaswolle bis zur 0,2 ml-Markierung gepackt und dann mit gepuffertem Sephadex G50 bis zur 1 ml-Marke aufgefüllt. Anschließend wurde die Säule in ein 15 ml-Röhrchen überführt und bei Raumtemperatur zentrifugiert (2000 g, 6 min) . (b) Nach Zugabe von je 100 μl Säulenpuffer wurden die
Säulen erneut zentrifugiert (2000 g, 6 min) . Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, (c) Die DNA wurde auf die Säule gegeben, zentrifugiert (2000 g, 6 min) und in einem Reaktionsgefäß aufgefangen. Die Endkonzentration dieser DNA-Probe beträgt etwa 20 ng/μl . Sie kann über längere Zeit
(Monate bis Jahre) bei -20°C aufbewahrt werden.
1.2 In situ Hybridisierung der markierten erfindungsgemäßen DNA (DSM 12527) auf Metaphasechromosomen und Interphase- Zellkernen
1.2.1 Denaturierung der Metaphasechromosomen und
Interphase-Zellkerne
Reagenzien, Puffer und Lösungen:
- Denaturierungslösung: 70% deionisiertes Formamid (für die Molekularbiologie, Kat.-Nr. 112027, Merck, Darmstadt), 2 x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7,0), pH 7,0 mit konz . HC1 Ethanol (eiskalt): 70%, 90% und 100%.
Ablauf :
1. Die Denaturierungslösung wurde in eine Küvette gegeben und in einem Wasserbad auf 70°C erhitzt.
2. Der Objektträger mit den zu untersuchenden Metaphasechromosomen und Interphase-Zellkernen von Zellen eines Burkitt Lymphoms wurde 2 min in dieser Lösung inkubiert und dann in kaltes 70% Ethanol überführt.
3. Die Objektträger wurden jeweils 5 min in 70%, 90% und 100% Ethanol entwässert und anschließend luftgetrocknet.
1.2.2 Präzipitation und Denaturierung der markierten erfindungsgemäßen DNA für die in situ Hybridisierung
Reagenzien, Puffer und Lösungen: 3 M Natriumacetat, pH 5,2
Deionisiertes Formamid (für die Molekularbiologie, Kat.- Nr. 112027, Merck, Darmstadt) . Die Deionisierung erfolgte durch Rühren des Formamids mit einem Ionenaustauscher (z.B. AG 501-X8 (D) Resin, Kat.-Nr. 142-6425, Biorad,
München) . 2 x Hybridisierungspuffer: 2x SSC, 20% Dextransulfat .
Ablauf:
1. Je 100 ng einer Digoxigenin-, bzw. Biotin-markierten DNA- Sonde und 10 μg humaner Cotl-DNA (Gibco-BRL, Eggenstein, Kat.-Nr. 5279SA) wurden durch Zugabe von 1/20 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100% kaltem Ethanol präzipitiert .
2. Nach einer Zentrifugation (12000 rpm, 15 min, 4°C) wurde der Überstand abgenommen, das DNA-Pellet mit 500 μl 70% Ethanol gewaschen, erneut zentrifugiert (12000 rpm, 10 min, 4°C) und schließlich lyophilisiert .
3. Die präzipitierte DNA wurde in 6 μl deionisiertem Formamid aufgenommen und 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt (Vortex) .
4. Nach Zugabe von 6 μl 2 x Hybridisierungspuffer wurde der Ansatz nochmals 30 min geschüttelt.
5. Anschließend wurde die DNA bei 75°C für 5 min denaturiert und danach 20-30 min bei 37°C inkubiert ( "preannealing" ) .
1.2.3 In situ Hybridisierung
Ablauf :
12 μl des Hybridisierungsansatzes wurden auf einen Obj ektträger mit den zu untersuchenden Metaphasechromosomen und Interphase-Zellkernen gegeben (sowohl von normalen humanen Zellen als auch von Zellen eines humanen Burkitt Lymphoms) .
2. Ein 18 x 18 mm Deckglas wurde aufgelegt, mit Flüssigklebstoff abgedichtet und das Präparat in einer feuchten Kammer für 48 h bei 37°C inkubiert.
1.2.4 Waschen und Detektion der hybridisierten Metaphasechromosomen und Interphase-Zellkerne
Reagenzien, Puffer und Lösungen:
Waschlösung A: 50% Formamid (p.A. Kat.-Nr. 9684, Merck, Darmstadt) , 2 x SSC
Waschlösung B: 0,1 x SSC
Waschlösung C: 4 x SSC, 0,1% Tween 20
Waschlösung D: 2 x SSC, 0,05% Tween 20
"Blocking"-Lösung: 3% BSA, 4 x SSC, 0,1% Tween 20 - Detektionspuffer: 1% BSA, 4 x SSC, 0,1% Tween 20
Rhodamin-konjugiertes Schaf-anti-Digoxigenin-Fab-Fragment
(Röche Diagnostics Mannheim)
Fluorescein-konjugiertes Avidin (Vector Laboratories
Inc., Burlingame, USA) - "Antifade-Lösung" : 0,233 g DABCO (1, 4-Diazabicyclo-2.2.2- octane) , 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 90% Glycerin
4, 6-diamino-2-Phenylindol (DAPI)
Ablauf:
1. Die Waschlösungen A und B wurden in einer Küvette auf 42°C im Wasserbad erwärmt .
2. Der Dichtring aus Flüssigklebstoff wurde von dem Objektträger entfernt und dieser dann 3 x 5 min in
Waschlösung A bei 42°C gewaschen.
3. Anschließend wurde der Objektträger in Waschlösung B, die auf 60°C vorgewärmt war, 3 x 5 min bei 42°C gewaschen.
4. 200 μl der "Blocking" -Lösung wurden auf den Objektträger pipettiert, ein Deckglas aufgelegt und 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
5. Das Deckglas wurde abgenommen, 200 μl Detektionspuffer mit 5 μg/ml Rhodamin-konjugiertem Schaf-anti-Digoxigenin- Fab-Fragment und 5μg/ml Fluorescein-konjugiertem Avidin auf den Objektträger gegeben, ein Deckglas aufgelegt und 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
6. Der Objektträger wurde dann 3 x 5 min in Waschlösung C bei 42°C gewaschen.
7. Anschließend wurde die DNA 20 min in 2 x SSC gegengefärbt, in welchem 200 ng/ml (DAPI) gelöst waren.
8. Der Objektträger wurde in Waschlösung D für 1-2 min bei Raumtemperatur gewaschen.
9. Abschl ießend wurden die hybridis ierten Metaphasechromosomen und Interphase-Zellkerne mit "Anti fade "-Lösung eingebettet.
Die Hybridisierungssignale wurden mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops, ausgestattet mit geeigneten Filtern für Fluorescein und Rhodamin, ausgewertet (vgl. Fig. 2) .
Beispiel 2: Nachweis einer das Chromosom 8 bzw. die chromosomale Bande 8q24 bzw. das c-myc Gen betreffende Über- oder Unterrepresentation mittels Matrix CGH
2.1 Immobilisierung einer erfindungsgemäßen DNA DSM 12527 Die erfindungsgemäße DNA (Konz.: 400-1000 μg/ml) wird mit Hilfe geeigneter Mikrokapillare auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gegeben. Die Objektträger werden dann 5 min bei 80°C in einem Ofen gebacken, danach 5 min mit kaltem Methanol- Eisessig (3:1) fixiert und anschließend 30 min bei 80°C gebacken. Diese Behandlung wird dreimal wiederholt. Zuletzt wird die DNA auf dem Objektträger 2 min bei 70°C in 70% Formamid/2 x SSC (pH 7,0) denaturiert.
2.2 Hybridisierung
1. Je 1 μg Biotin-markierte Tumor-DNA und Digoxigenin- markierte Kontroll-DNA wurden mit 80 μg humaner Cotl-DNA
(Gibco-BRL, Eggenstein, Kat.-Nr. 5279SA) durch Zugabe von 1/20 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100%
Ethanol präzipitiert .
2. Nach einer Zentrifugation (12000 rpm, 10 min, 4°C) wurde der Überstand abgenommen, das Pellet mit 500 μl 70% Ethanol gewaschen, wieder zentrifugiert (12000 rpm, 10 min, 4°C) und anschließend lyophilisiert .
3. Die präzipitierte DNA wurde in 12 μl Hybridisierungspuffer (10% Dextransulfat, 33,5% Formamid, 2 x SSC) aufgenommen und 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt (Vortex) .
4. Nachdem die DNA gelöst war, wurde sie 5 min bei 75°C denaturiert und anschließend 25 min bei 37°C inkubiert ("preannealing") .
5. 12 μl des Hybridisierungsansatzes wurden auf den Objektträger mit den immobilisierten erfindungsgemäßen DNA-Proben gegeben und ein Deckglas (18 x 18 mm) aufgelegt .
6. Das Deckglas wurde mit Flüssigklebstoff abgedichtet und das Präparat in einer feuchten Kammer 4 Tage bei 60°C inkubiert.
2.3 Detektion
Reagenzien, Puffer und Lösungen:
Waschlösung A: 50% Formamid (p.A. Kat.-Nr. 9684, Merck,
Darmstadt) , 2 x SSC - Waschlösung B: 1 x SSC
Waschlösung C: 4 x SSC, 0,1% Tween 20
Waschlösung D: 2 x SSC, 0,05% Tween 20
"Blocking" -Lösung: 3% BSA, 4 x SSC, 0,1% Tween 20
Detektionspuffer: 1% BSA, 4 x SSC, 0,1% Tween 20 - Maus-anti-Digoxigenin-Antikörper (Röche Diagnostics
Mannheim)
Digoxigenin-konjugiertes Schaf-anti-Maus-F (ab) 2-Fragment
(Röche Diagnostics Mannheim)
Rhodamin-konjugiertes Schaf-anti-Digoxigenin-Fab-Fragment (Röche Diagnostics Mannheim)
Fluorescein-konjugiertes Avidin (Vector Laboratories
Inc., Burlingame, USA)
Biotinyliertes-anti-Avidin (Vector Laboratories Inc.,
Burlingame, USA) - "Antifade-Lösung" : 0,233 g DABCO (1, 4-Diazabicyclo-2.2.2- octane) , 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 90% Glycerin
4, 6-diamino-2-Phenylindol (DAPI)
Ablauf :
1. Die Waschlösungen A und B wurden in einer Küvette auf 42°C im Wasserbad erwärmt.
2. Der Dichtring aus Flüssigklebstoff wurde von dem Objektträger entfernt und dieser dann 3 x 5 min in
Waschlösung A bei 42°C gewaschen.
3. Anschließend wurde der Objektträger in Waschlösung B, die auf 50°C vorgewärmt war, 3 x 5 min bei 42°C gewaschen.
4. 200 μl der "Blocking" -Lösung wurden auf den Objektträger pipettiert, ein Deckglas aufgelegt und 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
5. Das Deckglas wurde abgenommen, 200 μl Detektionspuffer mit 5 μg/ml Maus-anti-Digoxigenin-Antikörper und 5μg/ml Fluorescein-konjugiertem Avidin auf den Objektträger gegeben, ein Deckglas aufgelegt und 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
6. Der Objektträger wurde dann 3 x 5 min in Waschlösung C bei 42°C gewaschen.
7. Danach wurden die Signale mit biotinyliertem-anti-Avidin, gefolgt von Fluorescein-konjugiertem Avidin, bzw. mit einem Digoxigenin-konjugierten Schaf-anti-Maus-F (ab) 2- Fragment und einem Rhodamin-konjugierten Schaf-anti- Digoxigenin-F(ab)2-Fragment amplifiziert . Die Konzentration betrug jeweils 5 μg/ml in Detektionspuffer. Die Inkubation dauerte jedesmal 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer. Nach jeder Antikörperinkubation wurde der Objektträger 3 x 5 min in Waschlösung C bei 42°C gewaschen.
8. Abschließend wurden die hybridisierten immobilisierten DNA-Proben mit "Antifade" -Lösung eingebettet.
Die HybridisierungsSignale wurden mit Hilfe eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops, geeigneten Filtern und einer speziellen Bildverarbeitungs-Software ausgewertet .

Claims

Patentansprüche
1. DNA, geeignet zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 8, wobei die DNA ausgewählt ist aus:
(Ax) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12523,
(A2) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12524,
(B) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12521, (C) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12520,
(D) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12525,
(E) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12528,
(F) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12526,
(G) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12522, (H) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12529,
(I) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 12527, oder Teilen davon.
2. DNA nach Anspruch 1, wobei die Veränderung den chromosomalen Bereich 8q24 betrifft.
3. DNA nach Anspruch 1 oder 2 , wobei die Veränderung das c- myc Gen oder einen es umspannenden Bereich von etwa 1 MB betrifft.
4. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei die Veränderung bei Tumorerkrankungen vorliegt.
5. DNA nach Anspruch 4, wobei die Tumorerkrankungen ein Burkitt Lymphom umfassen.
6. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Reagenz zur Diagnose und/oder Therapie von Veränderungen des Chromosoms 8.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Veränderung den chromosomalen Bereich 8q24 betrifft.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Veränderung das c-myc Gen oder einen es umspannenden Bereich von etwa 1 MB betrifft.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei mehrere der DNAs (A) bis (I) oder Teile davon eingesetzt werden.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Veränderungen bei Tumorerkrankungen vorliegen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Tumorerkrankungen ein Burkitt Lymphom umfassen.
12. Kit, umfassend ein oder mehrere der DNAs (A) bis (I) oder Teile davon, nach Anspruch 1 und übliche Hilfsstoffe.
13. Kit nach Anspruch 12, wobei die Hilfsstoffe Puffer, Lösungsmittel, Träger und Kontrollen umfassen.
14. Kit nach Anspruch 13, wobei die Träger Chips umfassen.
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