EP1224184A1 - Nouveaux limono des utiles en particulier dans le traitement du cancer et leur procede de preparation - Google Patents

Nouveaux limono des utiles en particulier dans le traitement du cancer et leur procede de preparation

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Publication number
EP1224184A1
EP1224184A1 EP00971487A EP00971487A EP1224184A1 EP 1224184 A1 EP1224184 A1 EP 1224184A1 EP 00971487 A EP00971487 A EP 00971487A EP 00971487 A EP00971487 A EP 00971487A EP 1224184 A1 EP1224184 A1 EP 1224184A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
haperforin
nmr
compounds
evaporated
dryness
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00971487A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Jean-Paul Potier
Françoise Claudine Christiane KHUONG-HUU
Qui Khuong-Huu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1224184A1 publication Critical patent/EP1224184A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to new limonoids, their method of purification, as well as their preparation, and their use, in particular in the treatment of cancer, or the treatment of malaria.
  • These new limonoids can be isolated from the plant organs of certain plants, in particular of the genus Harrisonia, but also of any other genus, which may contain them.
  • the species Harrisonia perforata Merr. occurs in Vietnam, South China, Laos, Cambodia, Thailand, the Philippines, and Indonesia.
  • This species has been shown to be particularly suitable for use as starting material in the present invention, but it is obvious that the methods implemented in the present invention can be used with other species, of the same botanical family. , or other families.
  • Limonoids are compounds already described in the literature, and can be found in many plant species. Some representatives of this type of compound have been reported in plants of the genus Harrisonia (Kubo et al.
  • liminoids can have an effect against certain types of cancer, or in the treatment of malaria.
  • the Applicant has shown that some of the products according to the invention have remarkable cytotoxic activity against cell proliferation.
  • the use of the compounds according to the invention in the treatment of cancer or malaria, or for the preparation of medicaments for such use is also one of the objects of the invention.
  • the compounds according to the invention are obtained from plants of the genus Harrisonia, preferably Harrisonia perforata, according to a simple and inexpensive process.
  • the process of the invention essentially consists in treating plant organs of Harrisonia perforata, in particular the dried leaves, reduced to powder beforehand, with an aqueous-alcoholic solution, which provides a hydro-alcoholic solution of bitter active ingredients.
  • This solution is then treated with an aqueous solution of lead acetate and the precipitate formed is separated by filtration.
  • the filtrate obtained is treated with an aqueous solution of sodium sulfate. After decantation and filtration, a hydroalcoholic filtrate of bitter principles is obtained which can be treated in two different ways.
  • the hydroalcoholic filtrate is treated, with stirring, with activated carbon which absorbs the bitter principles.
  • the charcoal is collected by filtration. This charcoal is dried at 50 ° and reduced to powder.
  • the bitter principles retained by this coal powder are extracted with chloroform.
  • the chloroform extract is evaporated to dryness.
  • the crude extract of active ingredients is obtained.
  • the crude extract thus obtained containing a mixture of numerous active principles is also one of the objects of the invention, as well as the compounds capable of being isolated from this crude extract.
  • An additional treatment of this crude extract is then carried out to isolate the pure limonoids by chromatography, either on a column or on a silica plate, using different solvents, in particular toluene, cyclohexane, heptane, chloroform, ether, ethyl acetate. , ethanol, methanol, methylene chloride.
  • the limonoids thus obtained can then be modified by adapting chemical methods known to those skilled in the art, in order to substitute certain radicals, with the aim, for example, of obtaining compounds having different stereochemistry, or an improved biological activity.
  • Examples 7 and 10 describe certain modifications known to those skilled in the art.
  • the compounds according to the invention all have centers of asymmetry and can therefore exist in the form of optical isomers.
  • the present invention also includes all of these isomers, either separately or as a mixture.
  • the compounds according to the invention will preferably have a general formula:
  • R6 to RI 3 identical or different, represent a hydrogen atom or a lower C1-C4 alkyl group, linear or branched, substituted or not, preferably a methyl group,
  • RI is the OH group, or forms with R2 a structural bridge
  • R3 is chosen from the hydrogen atom or an OH group, or forms with R5 a structural bridge
  • R4 is the OH group or the OCOCH or R4 group is absent in order to form the double bond as indicated in dotted lines,
  • R5 is a hydrogen atom or forms with R3 the bridge as described above, as well as their derivatives, in free form, or in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • derivatives all the metabolic intermediates produced during the biochemical synthesis of these compounds by the plant, that is to say the compounds which can be obtained downstream of the metabolic pathway, as well as the compounds present upstream of this same pathway, and the compounds which result therefrom.
  • salts which can be formed from these compounds, in particular by association with conventional and non-toxic, organic or inorganic bases.
  • Salts derived from mineral bases include aluminum, copper, ferrous or ferric iron, lithium, manganese, zinc, and more particularly ammonium, calcium, potassium, magnesium and sodium.
  • the salts derived from organic bases include the salts of primary, secondary or tertiary amines, substituted amines, cyclic amines or basic ion exchange resins, such as arginine, betaine, caffeine, choline, ethylenediamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, trimethylamine, tromethamine, lysine, arginine, methylglucamine, piperazine, piperidine, polyamine resins, purines, N-ethylpiperidine, glucamine , or glucosamine.
  • Particular preference will be given to the compounds of formula (I), having the specific formula:
  • compositions containing a compound according to the invention, and pharmaceutically acceptable excipients also form part of the invention. These compositions can be formulated for administration to mammals, including humans. We can thus use all kinds of binding agents, surfactant, coating, dispersion, wetting in order to promote the stability, conservation, and release of these compounds. In particular, conventional excipients will be used, for example gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic, or the like. We can thus define all kinds of pharmaceutical compositions, in particular injectable, or allowing oral administration.
  • the compositions allowing an oral intake may be tablets, capsules, powders, granules or oral suspensions or solutions. They also include forms of sublingual and oral administration.
  • the injectable compositions may be by the subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular route.
  • a compound according to the invention for the preparation of a medicament, in particular intended for the treatment of cancer or malaria is also part of the invention.
  • the dosage varies depending on the treatment and the condition in question.
  • a precipitate is formed which is removed by filtration.
  • the filtrate obtained is then treated with 120 ml of a 15% aqueous sodium sulfate solution.
  • the precipitate of lead sulphate which has formed is removed by filtration.
  • An hydroalcoholic solution of active ingredients is thus obtained.
  • This solution is treated, in three stages, by stirring with vegetable charcoal (in total 30 g of charcoal) which retains the active ingredients.
  • the carbon is separated by filtration and dried at 50 ° for 24 h. This charcoal containing the active ingredients is introduced into a Soxhlet and extracted with chloroform.
  • Extract No. 1 obtained according to Example 1 (175 g) is dissolved in toluene (400 ml) and subjected to a chromatographic treatment on a 60 H silica column.
  • the first fraction Fi (4 L) by evaporation under dry vacuum provides a residue of 74.80 g called extract No. 2.
  • haperforin A (HA, compound II.2) (1.30 g) which has the following characteristics:
  • the second fraction F (7 L) is evaporated to dryness under vacuum and redissolved in methanol.
  • the separated and purified formed crystals provide 12.05 g of haperforin E (HE, compound IV)
  • Allocations were carried out using 2D NMR experiments, COZY 'H-'H and 13 C-'H.
  • Extract No. 2 (91 g) from Example 2 is dissolved in toluene and subjected to a chromatographic treatment on a 60 H silica column (1 kg). The silica column is eluted with 1 L solvent fractions (toluene-ether (1: 1).
  • the crystals, formed after concentration and standing at low temperature (3 °) are separated and purified by recrystallization from this same solvent, provide the haperforin A (225 mg), described in Example 2.
  • Fraction 3 (91 g) obtained in Example 4 is dissolved in toluene (400 ml) and the solution obtained is subjected to a chromatographic treatment on a 60 H silica column (1 kg).
  • the silica column is eluted in 1000 ml fractions of a toluene-ether mixture (7: 3). Each fraction is evaporated to dryness under vacuum and weighed.
  • Fraction 1 (2 L) provides a residue of 1.55 g.
  • Fraction 2 (1 L) provides a residue of 10.95 g.
  • haperforin Ai 200 mg
  • crystallization of the residue remaining in methanol provides haperforin A (440 mg).
  • Extract No. 1 obtained according to Example 1 (1.48 g) is dissolved in methylene chloride (40 ml) and subjected to a chromatographic treatment on a silica column (75 g).
  • This residue (137 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, the ether being used as eluent.
  • haperforin B (HB, compound 1.5) which has the following characteristics:
  • Extract No. 1 obtained according to Example 1 (3.24 g) is dissolved in toluene and subjected to a chromatographic treatment on a silica column (150g).
  • the eluate constituted by the toluene-ether mixture is collected in 8 ml fractions.
  • Hperforin B 2 (83 mg) has the following characteristics:
  • Haperforin B 2 C 25 H 28 O 7 - 440 not crystallized ;
  • HR ICSM MH + 441.1926 (hold. 441.1913 for C 25 H 29 O 7 ), 423.1808 (hold. 423.1807 for C 25 H 27 O 6 );
  • haperforin B 3 Two pure products are obtained: haperforin B 3 and haperforin C.
  • Hperforin B 3 (HB 3 , compound II.1) has the following characteristics:
  • haperforin B 3 22 mg
  • acetic anhydride 0.5 ml
  • pyridine 0.5 ml
  • the organic products are extracted with ether (3 times 3 ml).
  • the ethereal phase washed, dried over MgSO and evaporated under reduced pressure provides a residue which, purified by chromatography on silica plate (eluent ether), provides Tacetylhaperforin B3 (5 mg) whose physical characteristics ('H NMR, MS, TLC) are identical to those of haperforin A.
  • Hperforin C (HC, compound 1.2) has the following characteristics
  • the extract No. 1 obtained according to Example 1 (10 g) is subjected to a chromatographic treatment on a silica column (350 g).
  • the eluate consisting of a mixture of heptane-ethyl acetate (80:20) is collected in 20 ml fractions
  • Eluate 5 (toluene-ether; 40:60).
  • the eluate 5 evaporated to dryness provides a residue of 500 mg.
  • This mixture (500 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, ether is used as eluent.
  • Hperforin D (HD, compound 1.4) (66 mg) has the following characteristics:
  • Hperforin D ⁇ (83 mg) has the following characteristics:
  • Eluate 9 (toluene - ether; 40:60): the eluate 9 evaporated to dryness provides a residue of 440 mg.
  • This mixture (440 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol; 95: 5) being used as eluent. Two products are thus obtained: haperforin Ei and haperforin G.
  • Hperforin G (HG, compound III.1) (38 mg) has the following characteristics:
  • Eluate 10 (toluene - ether; 40:60).
  • the eluate 10 evaporated to dryness provides a residue of 350 mg.
  • This mixture (350 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol; 95: 5) being used as eluent.
  • Eluate 11 (toluene - ether; 40:60).
  • the eluate 1 1 evaporated to dryness provides a residue of 320 mg.
  • This mixture (320 mg) is purified by preparative chromatography on a silica plate, the mixture (methylene chloride - methanol 95: 5) being used as eluent.
  • Hperforin F 3 (11 mg) crystallized from ethanol has the following characteristics:
  • haperforin C 25 mg, 0.05 is added to a solution of lithium diisopropylamide (0.3 ml of a 0.35 M solution in THF, ie 0.10 mM) mM). After 1 h, the reaction is neutralized by addition of acetic acid (15 mM). Ether is added and the organic solution washed successively with an aqueous solution of sodium bicarbonate and water, is evaporated to dryness under reduced pressure. This gives a 1/1 mixture of haperforin C and the retroMicha ⁇ l product of haperforin C called isohaperforin C. This mixture is purified by chromatography on a preparative plate. Pure isohaperforin C is thus obtained, which has the following characteristics:
  • EXAMPLE 1 1 Use of haperforins against cell proliferation The anti-turnoral power exerted in vitro by a family of products containing around twenty examples was evaluated using the MTT colorimetric test on 6 human cancer lines.
  • the principle of the MTT test is based on the reduction carried out at the level of mitochondrial enzymes (of living cells since metabolically active) of the MTT product (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide) yellow in color to a blue product, formazan.
  • the quantity of formazan thus obtained is directly proportional to the quantity of living cells in the culture medium. This quantity of formazan is measured by spectrophotometry.
  • the experimental method consists in inoculating 20,000 to 50,000 (depending on the cell type used) cells / ml of culture medium in multi-well plates of 96 wells each containing 100 ⁇ l of culture medium with the appropriate cell concentration. The cells are left to stand for 24 hours in order to maximize their adhesion to the support of the plate, then the various products are added for which the anti-tumor activity is to be evaluated. Each product was tested at concentrations of 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 and 100 ⁇ g / ml, each concentration of product being studied in hexaplicate.
  • a control is carried out, which corresponds to the experimental condition in which the solvent is added.
  • the solvent is DMSO used at a final concentration of less than 0.1% relative to the total volume of cell culture. Indeed, it is known that DMSO concentrations of up to 5% of the total volume of cell culture do not disturb the growth of the lines used for the test.
  • the cells are left in the presence of the products for 72 hours, then the yellow MTT product is added and this product is left in the presence of the cells for 3 hours.
  • the intensity of the blue coloration resulting from the transformation of the yellow MTT product into blue formazan by the cells still alive at the end of the experiment is quantified by spectrophotometry using a device of the DYNA TECH IMMUNOASSA Y SYSTEM type.
  • the numbers appearing in Table I represent the average value (calculated on 6 values for each of the experimental conditions) of the percentage of cells present at the end of the experiment in relation to the control condition, the latter being arbitrarily calibrated at 100%.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux limonoïdes, leur procédé de purification, ainsi que de préparation, et leur utilisation, en particulier dans le traitement du cancer, ou le traitement du paludisme.

Description

NOUVEAUX LIMONOIDES UTILES EN PARTICULIER DANS LE TRAITEMENT DU CANCER ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION
La présente invention concerne de nouveaux limonoïdes, leur procédé de purification, ainsi que de préparation, et leur utilisation, en particulier dans le traitement du cancer, ou le traitement du paludisme.
Ces nouveaux limonoïdes peuvent être isolés à partir des organes végétaux de certaines plantes, en particulier du genre Harrisonia, mais aussi de toute autre genre, qui pourrait les contenir. On trouve les plantes du genre Harrisonia, appartenant à la famille des simaroubacées principalement en Asie du Sud-Est. Par exemple, l'espèce Harrisonia perforata Merr. se rencontre au Viêt-nam, en Chine du Sud, au Laos, au Cambodge, en Thaïlande, aux Philippines, et en Indonésie. Cette espèce s'est montrée particulièrement apte à être utilisée en tant que matériel de départ dans la présente invention, mais il est évident que les procédés mis en œuvre dans la présente invention pourront être utilisés avec d'autres espèces, de la même famille botanique, ou d'autres familles.
Les limonoïdes sont des composés déjà décrits dans la littérature, et peuvent être trouvés dans de nombreuses espèces végétales. Quelques représentants de ce type de composés ont été signalés dans des plantes du genre Harrisonia (Kubo et al.
Heterocycles, 1976, 5, 485-98 ; Rajab et al. J. Nat. Prod, 1997, 60, 822-5 ; Koike et al. Tetrahedron, 1993, 49, 2209-16 ; Mitsunaga et al. Phytochemistry, 1994, 37,
1443-6) et des limonoïdes différents de ceux décrits dans la présente invention ont été isolés d 'Harrisonia perforata (Byrne et al. Austr. J Chem. 1991, 44, 165-9 ; Wei et al. Jiegou Huaxue, 1985, 4, 281-7 ; TranVan et al. Phytochemistry, 1995,
38, 213-5 ; Kamiuchi et al. Heterocycles, 1996, 43, 653-64).
C'est un des objets de la présente invention que de caractériser les nouveaux liminoïdes isolés de plantes d'un tel genre, ainsi que de fournir un procédé d'extraction. Ces nouveaux liminoïdes peuvent être modifiés, et les produits obtenus par les modifications chimiques sont également des objets de la présente invention, de même que les procédés de modification.
Il est connu que les liminoïdes peuvent avoir un effet contre certains types de cancer, ou dans le traitement du paludisme. La Demanderesse a montré que certains des produits selon l'invention possèdent une activité cytotoxique remarquable contre la prolifération cellulaire. Ainsi, l'utilisation des composés selon l'invention dans le traitement du cancer ou du paludisme, ou pour la préparation de médicaments pour une telle utilisation est également un des objets de l'invention.
Les composés selon l'invention sont obtenus à partir de plantes du genre Harrisonia, de manière préférée Harrisonia perforata, suivant un procédé simple et bon marché.
Le procédé de l'invention consiste essentiellement à traiter des organes végétaux de Harrisonia perforata, en particulier les feuilles desséchées, réduites en poudre au préalable, par une solution hydroalcoolique, ce qui fournit une solution hydroalcoolique de principes actifs amers. Cette solution est ensuite traitée par une solution aqueuse d'acétate de plomb et le précipité formé est séparé par filtration. Le filtrat obtenu est traité par une solution aqueuse de sulfate de sodium. Après décantation et filtration on obtient un filtrat hydroalcoolique de principes amers que l'on peut traiter de deux façons différentes.
1. Le filtrat hydroalcoolique est traité, sous agitation, par du charbon actif qui absorbe les principes amers. On recueille le charbon par filtration. Ce charbon est desséché à 50° et réduit en poudre. Les principes amers retenus par cette poudre de charbon sont extraits par du chloroforme.
L'extrait chloroformique est évaporé à sec. On obtient l'extrait brut de principes actifs.
2. Le filtrat hydroalcoolique est évaporé à sec sous vide. L'extrait brut est extrait au chloroforme. La solution chloroformique, évaporée à sec, fournit l'extrait brut de principes actifs
L'extrait brut ainsi obtenu, contenant un mélange de nombreux principes actifs est également un des objets de l'invention, ainsi que les composés susceptibles d'être isolés à partir de cet extrait brut. On effectue alors un traitement complémentaire de cet extrait brut pour en isoler les limonoïdes purs par chromatographie, soit sur colonne soit sur plaque de silice, en utilisant différents solvants, en particulier les toluène, cyclohexane, heptane, chloroforme, éther, acétate d'éthyle, éthanol, méthanol, chlorure de méthylène.
Les limonoïdes ainsi obtenus peuvent ensuite être modifiés en adaptant des procédés chimiques connus de l'homme du métier, afin de substituer certains radicaux, dans le but, par exemple, d'obtenir des composés possédant des stéréochimies différentes, ou une activité biologique améliorée. Ainsi, les exemples 7 et 10 décrivent certaines modifications connues de l'homme du métier.
Les composés selon l'invention possèdent tous des centres d'asymétrie et peuvent donc exister sous forme d'isomères optiques. La présente invention comprend aussi bien tous ces isomères, soit séparément, soit en tant que mélange.
Les composés selon l'invention auront de préférence une formule générale:
dans laquelle B représente, soit le radical :
la liaison s'effectuant au niveau du carbone porteur de R4, soit B forme avec R3 un composé de formule
et dans laquelle
• les pointillés représentent, de façon indépendante, des simples liaisons ou des doubles liaisons,
• R6 à RI 3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, linéaire ou ramifié, substitué ou non, de préférence un groupe méthyle,
• RI est le groupe OH, ou forme avec R2 un pont de structure
• R2 est le groupe =O ou forme avec RI un pont comme défini ci- dessus,
• lorsque R3 est présent, R3 est choisi parmi l'atome d'hydrogène ou un groupe OH, ou forme avec R5 un pont de structure
^O
\
• R4 est le groupe OH ou le groupe OCOCH ou R4 est absent afin de former la double liaison telle qu'indiquée en pointillé,
• R5 est un atome d'hydrogène ou forme avec R3 le pont tel que décrit précédemment, ainsi que leurs dérivés, sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.
Par « dérivés », on entend tous les intermédiaires métaboliques produits lors la synthèse biochimique de ces composés par le végétal, c'est-à-dire les composés qui peuvent être obtenus en aval de la voie métabolique, ainsi que les composés présents en amont de cette même voie, et les composés qui en découlent.
Par « sels pharmaceutiquement acceptables », on entend les sels pouvant être formés à partir de ces composés, en particulier par association avec des bases classiques et non toxiques, organiques ou minérales. Les sels dérivés de bases minérales incluent les sels d'aluminium, de cuivre, de fer ferreux ou ferrique, de lithium, de manganèse, de zinc, et plus particulièrement les sels d'ammonium, de calcium, de potassium, de magnésium et de sodium. Les sels dérivés de bases organiques incluent les sels d'aminés primaires, secondaires ou tertiaires, d'aminés substitués, d'aminés cycliques ou de résines échangeuses d'ions basiques, comme l'arginine, la bétaïne, la caféine, la choline, l'éthylènediamine, la diéthylamine, la triéthylamine, la tripropylamine, la triméthylamine, la trométhamine, la lysine, l'arginine, la méthylglucamine, la pipérazine, la pipéridine, les résines de polyamine, les purines, la N-éthylpipéridine, la glucamine, ou la glucosamine. On préférera tout particulièrement les composés de formule (I), ayant pour formule particulière :
1.3 1.4 ou
Parmi les dérivés des composés de formule générale (I), on entend comprendre les composés qui peuvent également être extraits du végétal considéré, font partie de la même voie métabolique que les composés de formule générale I, et font donc partie de l'invention.
Les exemples montreront que les composés suivants, qui possèdent la même structure que les composés de formule générale (I), peuvent être isolés et caractérisés à partir de l'extrait brut. Ils font donc partie de l'invention.
II.1 II.2
IV V Les compositions pharmaceutiques contenant un composé selon l'invention, et des excipients pharmaceutiquement acceptables font également partie de l'invention. Ces compositions peuvent être formulées pour l'administration aux mammifères, y compris l'homme. On pourra ainsi utiliser toute sorte de d'agents liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, de mouillage afin de favoriser la stabilité, la conservation, et la libération de ces composés. En particulier, on utilisera des excipients classiques, par exemple la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique, ou analogues. On pourra ainsi définir toutes sortes de compositions pharmaceutiques, en particulier injectables, ou permettant une prise orale. Les compositions permettant une prise orale pourront être des comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également les formes d'administration sublinguale et buccale. Les compositions injectables pourront l'être par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire.
L'utilisation d'un composé selon l'invention pour la préparation d'un médicament, en particulier destiné au traitement du cancer ou du paludisme fait également partie de l'invention. La posologie varie selon le traitement et selon l'affection en cause.
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'invention, sans qu'ils ne représentent une quelconque limitation à l'invention. Il est entendu que les méthodes d'extraction chromatographiques peuvent être optimisées. En particulier, l'homme du métier reconnaîtra qu'un changement dans les solvants décrits dans ces exemples pourra éventuellement permettre d'obtenir les mêmes composés.
* EXEMPLE 1 :
1 000 g de feuilles séchées et pulvérisées de Harrisonia perforata sont mis en macération avec de l'éthanol aqueux titrant 25°, à la température du laboratoire. On extrait ensuite, par lixiviation, avec au total, 10 L d'alcool titrant 25°. Le lixiviat hydroalcoolique est traité par 400 ml de solution aqueuse d'acétate de plomb à 30%.
Il se forme un précipité que l'on élimine par filtration. Le filtrat obtenu est ensuite traité par 120 ml d'une solution aqueuse de sulfate de sodium à 15%. Le précipité de sulfate de plomb qui s'est formé est éliminé par filtration. On obtient ainsi une solution hydroalcoolique de principes actifs. Cette solution est traitée, en trois fois, par agitation avec du charbon végétal (en tout 30 g de charbon ) qui retient les principes actifs. Le charbon est séparé par filtration et séché à 50° pendant 24 h. Ce charbon renfermant les principes actifs est introduit dans un Soxhlet et extrait par du chloroforme.
On évapore l'extrait chloroformique à sec sous vide pour obtenir 2,42 g d'extrait sec, nommé extrait N° 1. Le rendement en extrait sec est de 0,25%. * EXEMPLE 2 :
L'extrait N°l obtenu selon l'exemple 1 (175 g) est dissous dans du toluène (400 ml) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H.
On effectue une élution de la colonne de silice (1 kg) par des fractions de 1 L d'un mélange de toluène-éther (1 :1). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée. Les différentes fractions sont analysées par chromatographie en couche mince de silice (CCM).
La première fraction Fi (4 L) par évaporation sous vide à sec fournit un résidu de 74,80 g nommé extrait N° 2.
Par cristallisation dans le méthanol ce résidu fournit l'haperforine A (HA, composé II.2) (1,30 g) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine A
C 31 H36 , O 14 = 632 Haperforine A : C31H36O14 = 632; F 238°-240° (MeOH), [a]D = + 51,8 (CHC13, c = 1,05); HR ICSM : MH+ 633,2180 (cale. 633,2183 pour C31H37O14); Analyse : % tr. C 58,84, H 5,74, O 35,42, cale. C 58,86, H 5, 74, O 35,42 pour C3,H36θ14 ; UV : lmax (EtOH) : 272,6 nm (e = 13750); IR lnm: 3468 (OH), 1743 (C=O), 1712 (C=O conjugué), 1243 (C-O), 1200 (C-O),1050 (C-O); Η RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,18 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH3-I8), 1,40 (6H, s, 2 CH3), 1,58 (3H, s, CH3), 2,0 (3 H, s, COCH3), 2,50 (3H, s, COCH3), 3,0 (IH, d, J= 4, H-9), 3,80 ((3H, s, CO2CH3), 4,30 (IH, s, H-15), 5,16 (IH, d, J = 4, H-12), 5,80 et 6,08 (2H, AB J = 12, H-5 et H-6), 5,86 (IH, t, J = 4, H-l 1), 6,0 (IH, s, H-17), 6,30 (IH, s, H-22), 7,30 (IH, s, H-23), 7,40 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 16,09 (CH3-18), 16,50 (CH3), 19,41 (CH3), 21,45 (COCH3), 21,60 (COCH3), 24,50 (CH3), 27,92 (CH3), 42,77 (C), 48,47 (CH-9), 49,83 (C), 51,09 (C), 52,69 (OCH3), 54,99 (CH- 15), 63,89 (CH-11), 66,53 (C), 71,77 (CH-12), 75,90 (CH-17), 81,68 (C), 87,85 (C), 108,49 (C-3), 109,87,34 (CH-22), 120,14 (C-20), 123,98 (CH-6), 142,04 (CH-23), 144,25 (CH-21), 152,17 (CH-5), 167,20 (C=O ), 167,44 (C=O), 170,07 (C=O), 170,50 (C=O), 204,17 (C-O, C-l). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY 'H-'H et 13C-Η.
La deuxième fraction F (7 L) est évaporée à sec sous vide et redissoute dans le méthanol. Les cristaux formés séparés et purifiés fournissent 12,05 g d'haperforine E (HE, composé IV)
L'haperforine E présente les caractéristiques suivantes
Haperforine E : C27H34O8 = 486; F 225-226° (EtOH), [a]D = - 52 (CHC13, c = 1); HR ICSM : MH+ 487,2343 (cale. 487,2331 pour C27H35O8); Analyse : % tr. C 66;18 H 7,01, O 26,82 cale. C 66,65, H 7,05, O 26,32 pour C27H34O8 ;UV : lmax (EtOH) : ; IR (laque) n cm"1 : 1767 et 1744 (C=O), 1658 (C=C), 1507 et 3136 (furanne), 1405, 1250, 1039 (C-O) ; Η RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,86 (3H, s, CH3), 1,04 (3H, s, CH3), 1,16 (IH, m, H-12a), 1,50 (3H, s, CH3), 1,62 (3H, s, CH3), 1,83 (2H, m, CH2-12b, CH2-l la),),2,04 ((IH, m, CH2-l lb), 2, 24 (IH, dd, J = 6, J' = 11, H-3), 2,40 (2H, m, CH2-6), 2, 50 (IH, d, J = 4, H-9), 2, 78 et 2,87 (2H, AB, J ≈ 18, CH2-15), 2,92 (IH, ABX, J = 11, J' = 18, H-2a), 3,32 (IH, dd, J = 6, J' = 18, H- 2b), 3,62 (IH, dd, J = 4, J' ≈ 10, H-5), 3,70 ((3H, s, OCH3), 4, 90 (IH, s, H-30a), 5,18 (IH, s, H-30b), ), 5,62 (IH, s, H-17), 6,38 (IH, s, H-22), 7,38 (IH, s, H-23), 7,45 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 14,52 (CH3), 24,80 (CH3), 26,35 (CH2-11), 26,72 (CH3), 30,28 (CH2-12), 32,65 (CH2-15), 33,19 (CH3), 33,70 (CH2-2), 35,08 (CH2-6), 41,52 (C), 48,04 (C), 48,82 (CH-9), 50,80 (CH-3), 52,32 (OCH3), 78,42 (CH-5), 79,56 (CH-17), 81,95 (C), 87,59 (C), 109,78 (CH-22), 111,72 (CH2-30), 120,76 (C-20), 140,60 (CH-23), 142,88 (CH-21), 146,50 (C-8), 169,81 (C=O ), 171,28 (C=O ), 175,44 (C=O).
Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY 'H-'H et 13C-'H.
* EXEMPLE 3 :
L'extrait N°2 (91 g) de l'exemple 2 est dissous dans le toluène et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H (1 kg). La colonne de silice est éluée par des fractions de solvants de 1 L (toluène-éther (1 :1).
La troisième fraction de 1 L est évaporée à siccité sous pression réduite et conduit à un résidu N°3 ( 52 g ) qui sera décrit dans l'exemple 4.
La quatrième fraction (4 L) par cristallisation du méthanol fournit l'haperforine E ( 6,20 g) décrite dans l'exemple 2.
* EXEMPLE 4 :
Les résidus des chromatographies des exemples 2 et 3 (127 g) sont dissous dans du toluène (400 ml) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H (1kg). La colonne de silice est éluée par fraction de 1 000 ml d'un mélange de toluène-éther (7 : 3). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée. La fraction 1 (2 L) fournit un résidu de 4 g, que l'on dissout dans du méthanol.
Les cristaux, formés après concentration et repos à basse température (3°) sont séparés et purifiés par recristallisation dans ce même solvant, fournissent l'haperforine A (225 mg), décrite dans l'exemple 2.
La fraction 3 ( 7 L) évaporée à sec ( 91 g) est traitée selon l'exemple 5.
* EXEMPLE 5 : Chromatographie N° 1
La fraction 3 ( 91 g) obtenue dans l'exemple 4 est dissoute dans du toluène (400 ml) et la solution obtenue est soumise à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H (1kg).
La colonne de silice est éluée par fraction de 1 000 ml d'un mélange de toluène-éther (7 : 3). Chaque fraction est évaporée à sec sous vide et pesée.
La fraction 1 (2 L) fournit un résidu de 1,55 g. La fraction 2 (1 L) fournit un résidu de 10,95 g.
Par cristallisation dans le méthanol, on obtient l'haperforine ^2 (210 mg) qui présente les caractéristiques suivantes : Haperforine A2 : C29H32O13 - 588, F 222° (MeOH), [a]D = + 77,8 (CHC13, c -
1), ; HR ICSM : MH+ 589,1955 (cale. 575,1921 pour C29H33O13) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,16 (3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,46 (3H, s, CH3), 1,70 (3H, s, CH3), 2,14 (3H, s, COCH3), 3,40 (2H, s), 3,70 (3H, s. OCH3), 3,88 (IH, s, OH), 3,93 (IH, s), 4,30 (IH, s), 5,03 (IH, s), 5,17 (IH, s, OH), 5,67 et 5,92 (IH, AB, J = 12), 5, 90 (IH, s), 6,26 (IH, S, H-22), 7,30 (IH, s, H-23), 7,35 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 16,73 (CH3), 17,34 (CH3), 18,58 (CH3), 20,65 (COÇ_H3), 23,66 (CH3), 26,87 (CH2), 42,65 (C), 48,98 (C), 50,53 (C), 51,91 (CH?), 54,24 (OCH3), 59,75 (CH), 65,54 (C), 73,96 (CH), 75,07 (CH), 81,27 (C), 87,16 (C), 105,56 (C), 109,01 (CH-22), 118,90 (C-20), 121,76 (CH), 141,58 (CH-23), 143,55 (CH-21), 151,56 (CH), 166,30 (C-O), 168,15 (C-O), 199,67 (C-O ), 215,58 (C-O ).
Par recristallisation des eaux-mères, on obtient l'haperforine Ai (200 mg). Par ailleurs, la cristallisation du résidu restant dans le méthanol fournit l'haperforine A (440 mg).
L'haperforine Ai présente les caractéristiques suivantes : Haperforine A, : C29H34O12= 574 F 265° (MeOH), [a]D = + 47,5 (CHC13, C = 0,9),; HR ICSM : MH+ 575,2175 (cale. 575,2128 pour C29H35O12), 557,2007 (cale. 557,2022 pour C29H33O„), 529,2118 (cale, pour C28H33O10 529,2073), 515,1941 (cale. 515,1917 pour C27H31O10) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,18 (3H, s, CH3), 1,22 (3H, s, CH3), 1,29 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s, CH3), 1,47 (3H, s, CH3), 1,64 (IH, s, OH), 1,79 (IH, t, J = 14, Ha de CH2), 2;26 (3H, s, COCH3), 2,28 (IH, m, He de CH2), 2,90 (IH, dd, J = 14, J' = 6, CH),3,69 (IH, s), 3,80 (3H, s, OCH3), 4,27,95 (IH, s), 4,78 (IH, d, J = 8), 5,13 (IH, s), 5,77 et 5,93 (IH, AB, J = 12), 6, 03 (IH, s), 6,17 (IH, S, H-22), 7,35 (IH, s, H-23), 7,41 (IH, s, H-21); 13C RMN d ppm : 13,65 (CH3), 16,38 (CH3), 16,60 (CH3), 20,79 (COÇ_H3), 23,49 (CH3), 25,48 (CH2), 26,80 (CH3), 41,90 (C), 45,41 (CH), 48,85 (C), 49,12 (C), 51,52 (OCH3), 54,78 (CH), 66,22 (C), 72,01 (CH), 74,65 (CH), 80,54 (C), 87,82 (C), 107,77 (C), 108,50 (CH-22), 119,42 (C-20), 122,93 (CH), 140,69 (CH-23), 143,08 (CH-21), 152,44 (CH), 166,06, 166,54, 169,32 et 215,90 (4 C-O ).
Chromatographie N° 2
Les eaux mères de la fraction 2 de l'exemple 5 sont évaporées à sec, et le résidu obtenu (8,5 g), redissout dans l'heptane est soumis à une chromatographie sur colonne de silice (450 g). L'éluat heptane-acétate d'éthyle ( 4 : 1) est recueilli par fraction de 25 ml dans des tubes.
On évapore les fractions 13-15 à sec. Leur cristallisation dans le mélange de solvants, heptane-acétate d'éthyle (4:l)permet d'obtenir 373 mg ^haperforine A3 qui présente les caractéristiques suivantes : Haperforine A3 : C27H32O10 = 516, F 146-147° (MeOH) ; HR ICSM : MH+
517,2051 (cale. 517,2073 pour C27H33O10) ; ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,17 (3H, s, CH3), 1,19 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH3), 1,37 (3H, s, CH3), 1,47 (3H, s, CH3), 1, 51 (IH, m, partie de CH2), 1,75 (2H, m, parties de CH2), 1,85 (IH, m, partie de CH2), 1,97 (IH, s, OH), 2,14 (IH, s, OH), 2,98 (IH, dd, J = 6, J' - 14, CH), 3,64 (IH, s, OH), 3,80 (3H, s, OCH3), 4,30 (IH, s), 5,07 (IH, s), 5,68 (IH, s), 5,46 et 6,01 (IH, AB, J - 12), 5, 80 (IH, s), 6,34 (IH, s, H-22), 7,42 (IH, s, H-23), 7,43 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 14,37 (CH3), 14,84 (CH2), 15,34 (CH3), 17,43 (CH3), 24,27 (CH3), 26,47 (CH2), 27,55 (CH3), 39,72 (C), 46,97 (CH), 49,88 (C), 50,13 (C), 52,17 (OCH3), 57,50 (CH), 68,74 (C), 78,57 (CH), 81,08 (C), 88,78 (C), 108,46 (C), 110,04 (CH-22), 121,18 (C-20), 123,32 (CH), 141,32 (CH-23), 143,14 (CH-21), 154,04 (CH), 166,83 (C-O), 167,95 (C-O), 217,09 (C-O ). * EXEMPLE 6 :
L'extrait N°l obtenu selon l'exemple 1 (1,48 g ) est dissous dans le chlorure de méthylène (40 ml ) et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice (75 g).
L'éluat dans un mélange de chlorure de méthylène-acétate d'éthyle (90:10) est collecté par fractions de 8 ml.
On réunit les fractions (62-102), et on les évapore sous vide à sec (833 mg). Le produit obtenu (833 mg) est dissous dans le toluène et chromatographie sur la silice 60 H (30 g).
L'éluat obtenu avec le mélange toluène-éther (50:50) est évaporé à sec sous vide, pour donner 350 mg de résidu.
Ce résidu (350 mg) est chromatographie ensuite sur une colonne de silice (10g). L'éluat constitué par le mélange toluène-éther (95:5) est recueilli par fraction de 4 ml. Les fractions (51-90) évaporées à sec fournissent 137 mg de résidu.
Ce résidu (137 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant.
Cette opération conduit à l'obtention de 57 mg d'haperforine B (HB, composé 1.5) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine B
C 27 H 30 09 = 498
Haperforine B : C27H30O9= 498;non cristallisé, HR ICSM : MH+ 499, 1935
(cale. 499,1967 pour C27H31O9) ; IR (CHC13) n cm ': 2993 (CH), 1756, 1731, 1700,
1668 (C-O), 1310, 1025 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,06 (3H, s, CH3), 1,16 (3H, s, CH3), 1,36 (3H, d, J = 6, CH3), 1,46 (IH, d, J = 7, H-12b), 1,59 (3H, s,
CH3), 1,62 (3H, s, CH3), 1,80 ((2H, m, CH2-11), 2,60 (2H, m, H-9, H-12a), 3,49 (IH, s, H-15), 3,75 (3H, s, CO2CH3), 3,85 (IH, m, H-10), , 5,48 (IH, d, J = 2, H-2), 5,96 (IH, d, J = 2, H-5), 6,92 (IH, s, H-22), 7,40 (IH, s, H-23), 8,42 (IH, s, H-21) ; 13C RMN d ppm : 16,06 (CH3), 19,0 (CH2-11), 20,46 (CH3-19), 24,23 (CH3), 30,25 (CH3), 30,40 (CH3), 36,92 (CH2-12), 50,20 (CH), 52,95 (OCH3), 53,02 (C-13), 54,56 (C)?, 58,79 (CH-15), 69,52 (C-8), 78.65 (CH-10), 79,23 (C-14), 91,39 (CH- 2), 111,18 (CH-22), 123,35 (C-l ou C-3)?, 126,16 (C-20), 126,40 (CH-5), 140,98 (C-3 ou 1), 142,99 (CH-23), 149,73 (CH-21), 165,36 (C-O ), 166,45 (C-O ), 168,37 (C-O), 196,58 (C-O C-17). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY 'H-'H et 13C-'H.
Les fractions (103-134) évaporées à sec fournissent 230 mg de résidu. Ce résidu (230 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, en utilisant le mélange (chlorure de méthylène - méthanol : 95 / 5) en tant qu'éluant.
Cette opération conduit à l'obtention de 71 mg d'haperforine F (HF, composé V) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine F
C27 H 32 O 10 = 516
Haperforine F : C27H32O,0= 516.F 224° (MeOH), [a]D = + 16,9 (CHC13, C = 0,93), ; HR ICSM : MH+ 517,2101 (cale. 517,2073 pour C27H33O10) ; IR (laque) n cm"1: 1762, 1740, 1690, 1658 (C-O), 1272 ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,45 (3H, s, CH3), 1,48 (IH, m, CH2-l la), 1,53 (3H, s, CH3), 1,61 (3H, s, CH3), 1,67 (3H, s, CH3), 1,77 (IH, m, CH2-12a), 1,85 (3H, s, CH3), 2,0 (IH, dm, J - 12, CH2-l lb), 2,26 (IH, tt, J = 12, J' = 2, H-12b), 2,54 (IH, dd, J - 12, J' - 2, H-9), 2,82 et 3,05 (2H, AB, J = 20, CH2-2), 2,96 et 3,15 (2H, ABX, J = 17, JAX = 7, JBX = 9, CH2-6), 3,44 (IH, t, J = 8, H-5), 3,76 (3H, s, OCH3), 3,95 (IH, s, OH), 6,77 (IH, s, H-22), 7,44 (IH, s, H-23), 7,99 (IH, s, H-21) ; 13C RMN d ppm : 21,71 (CH3), 24,08 (CH2- 11), 26,54 (CH3), 27,58 (CH3), 27,60 (CH3), 27,84 (CH3), 32,32 (CH2-6), 35,23 (CH2-12), 46,02 (CH-2), 50,05 (CH-5), 53,08 (OCH3), 56,14 (C),56,61 (C), 59,30 (CH-9), 59,55 (C), 81,56 (C), 87,68 (C), 94,59 (C), 110,02 (CH-22), 124,87 (C-20), 142,85 (CH-23), 145,76 (CH-21), 171,97 (C-O), 172,06 (C-O), 174,21 (C-O ), 196,47 (C-O C-17), 208,93 (C-O C-15). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY Η-'H et 1 C-'H.
* EXEMPLE 7 :
L'extrait N°l obtenu selon l'exemple 1 (3,24 g) est dissous dans du toluène et soumis à un traitement chromatographique sur colonne de silice (150g). L'éluat constitué par le mélange toluène-éther est récolté par fraction de 8 ml.
On réunit les fractions (161-174) et on les évapore à sec pour obtenir un résidu de 503 mg. Ce résidu (503 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant. On obtient ainsi deux produits purs : l'haperforine B2 non cristallisée et l'haperforine Cp
L'haperforine B2 (83 mg) présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine B2 : C25H28O7 - 440 non cristallisé; HR ICSM : MH+ 441,1926 (cale. 441,1913 pour C25H29O7), 423,1808 (cale. 423,1807 pour C25H27O6) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,69 (3H, s, CH3), 1,14 (3H, s, CH3), 1,51 (3H, s, CH3), 1,54 (3H, s, CH3), 1,55 (IH, m), 1 ;68 (2H, m), 2,10 (IH, m), 2,45 (IH, dd, J = 14, J' = 6, CH), 2,60 (IH, d, J = 14), 3,30 (lH,m), 5,30 (IH, s), 5,68 (IH, q, J = 3), 5,88 (IH, d, J = 6), 6,60 (IH, s, H-22), 7,30 (IH, d, J - 6), 7,43 (IH, s, H-23), 7,45 (IH, s, H- 21) ; ,3C RMN d ppm : 13,03 (CH3), 22,17 (CH2), 23,78 (CH3), 25,13 (CH3), 31,90 (CH3), 32,60 (CH2), 39,75 (CH2), 40,80 (CH2), 52,68 (CH), 82,55 (C), 83,54 (CH), 83,62 (C), 87,43 (C), 110,17 (CH-22), 120,05 (CH), 122,03 (CH), 122,33 (C-22), 132,66 (C), 141,62 (CH-23), 143,15 (CH-21), 152,44 (CH), 161,15 (C-O), 172,50.
L'haperforine C/ (19 mg) présente les caractéristiques suivantes : Haperforine C, : C25H28O7 = 440 non cristallisé; HR ICSM : MH+ 441 , 1944
(cale. 441,1913 pour C25H29O7) ; Η RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,77 (3H, s, CH3), 1,14 (3H, s, CH3), 1,31 (3H, s, CH3), 1,50 (3 H, s, CH3), 1,75 (2H, m), 2,10 (2H, m), 2,35 (2H, m ), 2,60 (IH, d, J = 14), 3,20 (lH,m), 4,99 (IH, s), 5,75 (IH, q, J = 3), 6,01 (IH, d, J = 6), 6,58 (IH, s, H-22), 7,42 (IH, d, J = 6), 7,43 (2H, s, H-23 et H- 21). Les fractions (201-225) sont réunies et évaporées à sec pour donner un résidu de 308 mg. Ce mélange (308 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé comme éluant.
On obtient deux produits purs : l'haperforine B3 et l'haperforine C.
L'haperforine B3 (HB3, composé II.1) présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine B 3
C 24 H 39 013 = 590
Haperforine B3 : C24H34O13 = 590; F 185° (MeOH), [a]D = + 49 (CHC13, c = 0,9); HR ICSM : MH+ 591,2119 (cale. 591,2077 pour C29H35O13), 573, 2006 (cale. 573, 1972 pour C29H33O12, MH+-H2O), 555, 1848 (cale. 555, 1866 pour C29H3,O,„ MH+-H2O-H2O); UV : lmax (EtOH) : ; IR (laque) n cm 1: 3440 (OH), 1729 (C-O), 1622 (C-C), 1436, 1390, 1271 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1.16 (3H, s, CH3), 1,18 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s, CH3), 1,40 (3H, s, CH3), 1,65 (3H, s, CH3), 2,18 (3H, s, COCH3), 2;34 (IH, d, J = 4, OH), 2,98 (IH, d, J = 7, H-9), 3,89 (IH, s , OH), 3,93 (3H, s, OCH3), 3,98 (IH, dd, J - 7, J' = 4, H-12a), 4,24 (IH, s, H-15), 5,12 (IH, s large, OH), 5,40 (IH, t, J - 7, H-l l), 5,80 (IH, d. J = 12, H-6), 6,08 (IH, d, J = 12, H-5), 6,28 (IH, s, H-17), 6,45 (IH, s, H-22), 7,40 (IH, s, H-23), 7,50 (IH, s, H-21) ; l3C RMN d ppm : 16,14 (CH3), 16,80 (CH3), 19,83 (CH3), 22,04 (COÇ_H3), 24,55 (CH3), 27,98 (CH3), 43,64 (C), 49,03 (CH-9), 49,56 (C), 51,15 (C), 52,75 (OCH3), 54,82 (CH-15), 65,90 (CH ?), 67,51 (CH-11), 70,42 (CH), 76,53 (CH), 88, 06 (C-2), 108,54 (C-3), 110,47 (CH-22), 120,83 (C-20), 124,0 (CH-6), 142,0 (CH-23), 143,80 (CH-21), 152,55 (CH-5), 167,17 (C-O ), 168,20 (C-O ), 170,83 (C-O), 196,0 (C-O C-17), 205 (C-O). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY 'H-'H et ,3C-'H. L'acétylation de l'haperforine B3 selon le procédé suivant conduit à l'obtention de l'acétyl-haperforine B3 :
Une solution d'haperforine B3 (22 mg) dans l'anhydride acétique (0,5 ml) et la pyridine (0,5 ml) est laissée à la température ambiante pendant 24 h. Après addition d'eau (5 ml), les produits organiques sont extraits par de l'éther (3 fois 3 ml). La phase éthérée lavée, séchée sur MgSO et évaporée sous pression réduite fournit un résidu qui, purifié par chromatographie sur plaque de silice (éluant éther), fournit Tacétylhaperforine B3 (5 mg) dont les caractéristiques physiques ('H RMN, SM, CCM) sont identiques à celles de l'haperforine A.
L'haperforine C (HC, composé 1.2) présente les caractéristiques suivantes
Haperforine C
C29 H 36 O ιι = 560
Haperforine C : C29H36Oπ = 560, non cristallisée, [a]D = - 87 (CHC13, c = 1);
HR ICSM : MH+ 561,2366 (cale. 561,2335 pour C29H37O„) ; UV : lmax (EtOH) : ; IR (laque) n cm"': 1742, 1655 (C-O), 1237 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,91 (3H, s, CH3), 1,06 (3H, s, CH3), 1,23 (3H, d, J = 6, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,35 (IH, m, CH2-12a), 1,40 (3H, s, CH3), 1,80 ((2H, m, CH2-11), 2,10 (3H, s, COCH3), 2,42 (IH, m, H-9), 2,58 (2H, m, H-3, H-12b), 2,80 (2H, ABX, J = 18, J' = 8, H-6), 3,55 (IH, s, OH), 3,66 (IH, dd, J = 10, J' = 6, H-10), 3,82 (3H, s, CO2CH3), 3,98 (IH, d, J - 4, H-2), 4, 72 ( IH, td, J - 8, J' = 1, H-7), 5,08 (IH, s, H-15), 6,92 (IH, d, 3=2, H-22), 7,38 (IH, dd, J-2, J'=l, H-23), 8,35 (IH, d, J=l, H-21) ; l3C RMN d ppm : 14,98 (CH3), 19,29 (CH2-11), 20,67 (CH3-19), 23,93 (CH3), 27,23 (CH3), 28,73 (CH3), 34,72 (CH2-6), 37,11 (CH2-12), 46,15 (CH-3), 51,69 (C-13), 52,15 (CH-9), 52,45 (OCH3), 52,80 (C-8), 59,04 (CH-15), 69,88 (C-4), 71.98 (CH-7), 72,63 (CH-2), 75,66 (CH-10), 79,43 (C-14), 110,59 (CH-22), 117,30 (C-l), 125,59 (C-20), 142,61 (CH-23), 149,34 (CH-21), 167,83 (C=O), 170,40 (C-O ), 197,42 (C-O C-l 7). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY Η-Η et 13C-'H.
Les fractions (226-270), réunies et évaporées à sec, donnent un résidu de 97 mg. Ce mélange (97 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther étant utilisé comme éluant. On obtient ainsi 34 mg d'haperforine 5/ (HBi, composé 1.1) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine Bj
C 27 H 32 09 = 500
Haperforine B, : C27H32O9 = 500; F 200° (MeOH), [a]D = - 72,8 (CHC13, c =
1,02); HR ICSM : MH+ 501,2116 (cale. 501,2124 pour C27H33O9); UV : lmax (EtOH) : 272,6 nm (e - 13750); IR (laque) n cm"1: 3437 (OH), 1757, 1728, 1714, 1651 (C-O), 1302, 1124 (C-O) ; Η RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,96 (3H, s, CH3), 1,19 (3H, s, CH3), 1,24 (3H, d, J = 6, CH3), 1,34 (IH, d, J = 7, H-12b), 1,50 (3H, s, CH3), 1,57 (3H, s, CH3), 1,66 ((2H, m, CH2-11), 2,47 (IH, dd, J- 7, J' = 3, H-12a), 2;56 (IH, t; J - 8, H-9), 3,30 (IH, m, H-10), 3,49 (IH, s, H-15), 3,79 ((3H, s, CO2CH3), 5,25 (IH, s, OH), 6,06 (IH, dd, J = 10, J' = 2, H-6), 6,32 (IH, s, H-2), 7,01 (IH, s, H-22), 7,46 (IH, s, H-23), 7,68 (IH, d, J = 10, H-5), 8,53 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 15,39 (CH3), 22,77 (CH2-11), 23,33 (CH3-19), 24,39 (CH3), 29,14 (CH3), 29,72 (CH3), 34,93 (CH2-12), 49,69 (CH-9), 51,65 (C-13), 52,72 (OCH3), 56,07 (C- 8), 58,74 (CH-15), 69,87 (CH-10), 70,44 (C-14), 83,45 (C-4), 110,34 (CH-22), 122,63 (CH-6), 126,55 (C-20), 127,42 (CH-2), 138,16 (CH-5), 143,60 (CH-23), 145,88 (C-3), 149,21 (CH-21), 163,80 (C-O ester C-16), 166,27 (C-O lactone C- 7), 196,0 (C-O C-17), 204,85 (C-O, C-l). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY 'H-'H et ,3C-'H.
Les fractions (330-406), réunies et évaporées à sec, donnent un résidu de 63mg. Ce mélange (63 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé comme éluant. On obtient ainsi l'haperforine H qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine H : C25H28O7 = , F 208° (MeOH) ; HR ICSM : MH+ 441,1939
(cale. 441,1913 pour C25H29O7) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13 : 0,96 (3H, s, CH3),
1,25 (3H, s, CH3), 1,48 (3H, s, CH3),1,56 (3H,s, CH3), 2,66 (IH, t, J = 8), 2,75 et
3,25 (2H, ABX, J - 16, J' = 2, J" = 1), 4,25 (IH, m), 4,96 (IH, s), 6,03 (IH, d, J = 5), 6,31 (IH, s large, H-22), 7,41 (IH, d, J = 5), 7,45 (IH, s large, H-23), 7,46 (IH, s large, H-21).
* EXEMPLE 8 :
On soumet l'extrait N°l obtenu selon l'exemple 1 (10g) à un traitement chromatographique sur colonne de silice (350 g). L'éluat constitué d'un mélange d'heptane-acétate d'éthyle (80:20) est recueilli par fraction de 20 ml
Les fractions (311-330), réunies et évaporées à sec, donnent un résidu de 530 mg qui, après dissolution et cristallisation dans le méthanol, fournit 100 mg d'haperforine C2 (HC2, composé III.2) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine C2
C25 H26 O7 = 438 Haperforine C2 : C25H26O7= 438; F 270° (MeOH), [a]D - - 284 (CHC13, c -
0,9); HR ICSM : MH+ 439,(calc. 439,pour C25H27O7) ; UV : lmax (EtOH) : ; IR
(laque) n cm 1: 1768, 1712, 1668 (C-O), 1381, 1306, 1131, 1025, 1000 (C-O) ; 'H
RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,90(3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,40 (3H, s, CH3), 1,68 (3H, s, CH3), 1,74 ((2H, m, CH2-12), 1,94 (2H, m, H-9, H-l la), 2,13 (IH, m,
H-l lb), 3,07 (IH, s, H-6), 3,48 (IH, s, H-14), 5,0 (IH, s, H-l 7), 5, 76 ( IH, s, H-
30), 5,92 et 6,14 (2H, AB, J = 15, H-l et H-2), 6,20 (IH, s, H-22), 7,30 (IH, s, H-
23), 7,37 (IH, s, H-21) ; 13C RMN d ppm : 20,22 (CH3), 25,04 (CH3), 26,77 (CH3),
27,68 (CH3), 28,25 (CH2-11), 37,02 (CH2-12), 47,93 (C), 48,52 (C), 53,86 (CH-9), 58,35 (CH-6), 64,34 (CH-14), 72,13 (CH-17), 83,09 (C-4), 83.40 (C-5), 109,03
(CH-22), 121,26 (C-20), 123,58 (CH-1), 126,82 (CH-30), 140,48 (CH-23), 144,56
(CH-21), 148,97 (CH-2), 150,47 (C-8), 165,37 (C-O), 174,73 (C-O ), 197,03 (C-O
C-7). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY
Η-Η et 13C-'H.
* EXEMPLE 9 :
On dissous l'extrait N°l obtenu selon l'exemple 1 (6,40 g) dans du toluène et on le soumet à un traitement chromatographique sur colonne de silice 60 H. On élue par fractions de volume de 300 ml. Eluat 1 = (toluène-éther ; 80:20);
Eluat 2 (toluène-éther ; 70:30);
Eluat 3 (toluène-éther ; 60:40);
Eluat 4 (toluène-éther ; 50:50);
Eluat 5 (toluène-éther ; 40:60). L'éluat 5 évaporé à sec fournit un résidu de 500 mg. Ce mélange (500 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, l'éther est utilisé comme éluant.
On obtient ainsi deux produits: l'haperforine D et l'haperforine Dp
L'haperforine D (HD, composé 1.4) (66 mg) présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine D
C2 H 34 0 -|o= 518
Haperforine D : C27H34O10 = 518, F 239° (EtOH), [a]D - - 98 (CHC13, c = 0,98); HR ICSM : MH+ 519,2244 (cale. 519,2230 pour C27H35O10), 501, 2099 (cale. 501, 2124 pour C27H33O9, MH+-H2O); UV : lmax (EtOH) : ; IR (CHC1,) n cm"1 : 1762, 1725, 1662 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,0 (3H, s, CH3), 1,06 (3H, s, CH3), 1 ,24 (3H, d, J = 6, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,40 (IH, m, CH2-12a), 1,48 (3H, s, CH3), 1,80 ((2H, m, CH2-11), 2,42 (IH, m, H-9), 2,58 (2H, m, H-3, H-12b), 2,80 (2H, ABX, J = 18, J' = 8, H-6), 3,55 (IH, s, OH), 3,66 (IH, dd, J = 10, J' - 6, H-10), 3,82 (3H, s, CO2CH3), 3,98 (IH, d, J = 4, H-2), 4, 72 ( IH, td, J = 8, J' = 1, H-7), 5,08 (IH, s, H-15), 6,92 (IH, s, H-22), 7,38 (IH, s, H-23), 8,35 (IH, s, H-21) ; 13C RMN d ppm : 14,35 (CH3), 19,08 (CH2-11), 20,67 (CH3-19), 23,93 (CH3), 27,23 (CH3), 28,73 (CH3), 34,72 (CH2-6), 37,11 (CH2-12), 46,15 (CH-3), 51,69 (C-13), 52,15 (CH-9), 52,45 (OCH3), 52,80 (C-8), 59,04 (CH-15), 69,88 (C-4), 71.98 (CH- 7), 72,63 (CH-2), 75,66 (CH-10), 79,43 (C-14), 110,59 (CH-22), 117,30 (C-l), 125,59 (C-20), 142,61 (CH-23), 149,34 (CH-21), 167,83 (C-O), 169,51 (C=O ), 196,46 (C-O C-17). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de RMN 2D, COSY Η-1H et 13C-1H.
L'haperforine Dι (83 mg) présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine D, : C25H28O7 = 440, F 208° (MeOH) ; ICSM : MH+ 441, 423 ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,98 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, s, CH3), 1,35 (IH, m), 1,46 (3H, s, CH3),1,46 (lH,m), 1,60 (3H, s, CH3), 1,80 (IH, m), 1, 85 et 2,0 (2H, ABX, J = 13, J' = 7), 2,20 (IH, m), 2,70 (IH, dd, J =14, J' = 7), 2,97 et 3,10 (2H, ABX, J = 19, J' - 3, J" = 2),3,69 (IH, s), 4,48 (IH, td, J = 6, J' = 2), 4,88 (IH, s), 6,03 (IH, d, J = 6), 6,38 (IH, s, H-22), 7,42 (IH, d, J = 6), 7,44 (IH, s, H-23), 7,48 (IH, s, H-21) ; ,3C RMN d ppm : 22,55 (CH3), 23,33 (CH3), 24,80 (CH3), 27,77 (CH2), 28,27 (CH2), 31,42 (CH3), 36,68 (CH2), 38,97 (CH2), 43,25 (C), 52,39 (CH), 74,67 (CH), 81,51 (CH), 83,18 (C), 86,83 (C), 108,50 (CH-22), 110,28 (C), 1 19,36 (C-20), 119,48 (CH), 126,19 (C), 139,68 (CH-23), 143,09 (CH-21), 151,98 (C), 160,40 (CH), 167,96 (C-O), 171,85.
Eluat 9 (toluène - éther; 40 : 60) : l'éluat 9 évaporé à sec fournit un résidu de 440 mg. Ce mélange (440 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol ; 95 : 5) étant utilisé comme éluant. On obtient ainsi deux produits: l'haperforine Ei et l'haperforine G.
L'haperforine Ei (32 mg) présente les caractéristiques suivantes : Haperforine E, : C25H30O7 = 442. non cristallisée ; HR ICSM : MH+ 443,2076 (cale. 443,2063 pour C25H31O7), 425,2002 (cale. 425,1963 pour C25H29O6) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,94 (3H, s, CH3), 1,10 (3H, s, CH3), 1 ,30 (3H, s, CH3), 1,32 (3H, s, CH3), 1,50 (2H, m), 2,1 (IH, m), 2,40 (IH, dd, j = 15, J' - 6), 2,60 (IH, m), 2,60 et 2,75 (2H, ABX, J = 20, J' = 1, J" = 6), 3,69 (IH, s), 2,65 (IH, dd, J = 4, J' = 10), 2,90 (IH, s large), 3, 28 (IH, d, J = 18), 3,65 (IH, td, J = 6, J* = 2), 3,72 (IH, t, J - 3), 4,18 (IH, d, J - 6), ), 5,22 (IH, s), 5,74 (IH, q, J = 2), 6,30 (IH, s, H-22), 7,40 (IH, s, H-23), 7,45 (IH, s, H-21).
L'haperforine G (HG, composé III.1) (38 mg) présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine G
C 25 H28 ° 6 ~ 424
Haperforine G : C25H28O6 = 424; , F 251° (CH2C12 / AcOEt), [a]D = + 24,1
(CHCI3, c = 0,9); HR ICSM : MH+ 425, 1972 (cale. 425, 1963 pour C25H29O6) ; IR (laque) n cm"1: 3650 (OH), 1764, 1707 (C+O), 1271, 1201, 1089 (C-O) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,89(3H, s, CH3), 1,42 (3H, s, CH3), 1,55 (3H, s, CH3), 1,72
((2H, m, CH2-1 la, CH2-12a), 1,91 (3H, s, CH3-30), 2,04 (IH, dd, J = 10, J' = 5, CH2-
1), 2,30 (2H, m, H-l lb, H- ), 2,35 (IH, s, OH), 2,61 (IH, dd, J = 16, J' = 2, CH2-),
2,88 et 3,04 (2H, AB, J = 21, CH2-7), 3,48 (IH, m, H-9), 4, 96 ( IH, s, H-l 7), 5,39 (IH, s, H-l), 6,34 (IH, s, H-22), 7,44 (IH, s, H-23), 7,47 (IH, s, H-21) ; 13C RMN d ppm : 18,58 (CH2), 21,42 (CH3), 23,45 (CH3), 27,44 (CH3), 28,59 (CH3), 31,27
(CH2), 38,30 (CH2), 42,44 (C), 46,33 (CH2), 46,99 (CH), 48,20 (CH-), 61 ,30 (C),
82,83 (C), 83.63 (CH-17), 85,26 (C), 107,96 (CH-22), 118,77 (CH-1), 1 19,84 (C-
20), 125,65 (C), 139,34 (CH-23), 143,08 (CH-21), 145,38 (C), 151,77 (C), 168,14 (C-O), 168,76 (C-O). Les attributions ont été réalisées à l'aide d'expériences de
RMN 2D, COSY 'H-'H et 13C-'H.
Eluat 10 (toluène - éther ; 40 : 60). L'éluat 10 évaporé à sec fournit un résidu de 350 mg. Ce mélange (350 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol ; 95 : 5 ) étant utilisé comme éluant.
On obtient ainsi l'haperforine Fi (9 mg) qui présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine F, : C27H32O9 = 500; F 209 (MeOH) ; HR ICSM : Mff
501,2122 (cale. 501,2124 pour C27H33O9), 483,2021 (cale. 483,2018 pour C27H3,O8) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 0,98 (3H, s, CH3), 1,25 (3H, s, CH3), 1,38 (3H, s,
CH3),1,55 (3H,s, CH3), ), 1,66 (3H, s, CH3), 2,10 (IH, m), 2,18 (IH, d, J =14), 2,61 (IH, dt, J = 14, J' = 2), 3,20 (IH, d, J = 14), 3,82 (3H, s OCH3), 6,18 et 6,36 (2H, AB, J = 18), 6,92 (IH, s, H-22), 7,38 (IH, s, H-23), 8,60 (IH, s, H-21).
Eluat 11 (toluène - éther ; 40 : 60). L'éluat 1 1 évaporé à sec fournit un résidu de 320 mg. Ce mélange (320 mg) est purifié par chromatographie préparative sur plaque de silice, le mélange (chlorure de méthylène - méthanol 95 : 5) étant utilisé comme éluant.
On obtient ainsi deux produits : l'haperforine F3 et l'haperforine F6. L'haperforine F 3 (1 1 mg) cristallisée dans l'éthanol présente les caractéristiques suivantes :
Haperforine F3 : C27H32O10 = 516; F > 220° (MeOH) ; HR ICSM : MH+ 517,2098 (cale. 517,2073 pour C27H33O,0) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13: 1,42 (3H, s, CH3), 1,52 (3H, s, CH3), 1,62 (3H, s, CH3),1,65 (3H,s, CH3), 1,80 (IH, m), 2, 02 (IH, td, J = 14, J' = 3), 2,56 et 2,96 (IH, AB, J = 18), 2,85 (IH, m), 3,42 (IH, dd, J = 4, J' = 9), 3,78 (3H, s, OCH3), 4,25 (lH,s,), 6,25 et 6,80 (2H, AB, J = 10), 6,76 (IH, d, J - 1, H-22), 7,21 (IH, t, J - 1, H-23), 8,0 (IH, s, H-21).
L'haperforine F6 (27 mg) présente les caractéristiques suivantes : Haperforine F6 : C27H34O9 = 502; non cristallisée; HR ICSM : MH+ 503,2281 (cale. 503,2280 pour C27H35O9), 485,2191 (cale, pour C27H33O8 485,2175) ; 'H RMN d ppm, J Hz, CDC13 : 0,86 (3H, s, CH3), 0,98 (3H, s, CH3), 1,56 (3H, s, CH3),1 ,77 (3H,s, CH3), 1,97 (IH, td, J = 14, J' - 6), 2,22 (IH, t, J = 10), 2,47 (2H, m), 2,87 (2H, m), 3,25 (IH, dd, J = 10, J' = 18), 3,67 (3H, s, OCH3), 5,07 et 5,58 (2H, 2s, =CH2), 5,45 (IH, s), 6,35 (IH, s large, H-22), 7,38 (IH, s large, H-23), 7,41 (IH, s large, H-21) ; l C RMN d ppm C5H5N : 14,98 (CH3), 22,10 (CH3), 25,27 (CH3), 31,21 (CH2), 32,83 (C), 33,84 (CH2), 34,62 (CH2), 36,06 (CH2), 37,89 (CH2), 41,48 (C), 52,92 (OCH3), 53,59 (CH), 53,22 (C), 77,78 (CH), 79,79 (CH), 80,36 (CH), 83,51 (C), 89,05 (C), 110,17 (CH-22), 110,35 (CH2), 121,25 (C-20), 141,16 (CH-23), 143,56 (CH-21), 150,48 (C), 171,66 (C=O).
Eluat 13 (chlorure de méthylène). L'éluat 13 évaporé à sec fournit un résidu de 66mg. Par cristallisation dans le chlorure de méthylène, on obtient ainsi l'haperforine Edéjà décrite dans l'exemple 6. * EXEMPLE 10 : Traitement de l'haperforine C
A une solution de diisopropylamidure de lithium (0,3 ml d'une solution 0,35M dans le THF, soit 0,10 mM), on ajoute à -78°C une solution d'haperforine C (25 mg, 0,05 mM). Après lh, la réaction est neutralisée par addition d'acide acétique (15 mM). De l'éther est ajouté et la solution organique lavée successivement avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et de l'eau, est évaporée à sec sous pression réduite. On obtient un mélange 1/1 d'haperforine C et du produit de retroMichaël de l'haperforine C dénommée isohaperforine C. Ce mélange est purifié par chromatographie sur plaque préparative. On obtient ainsi l'isohaperforine C pure qui présente les caractéristiques suivantes:
Isohaperforine C : C29 H36 0,, = 560, F 186° (MeOH), [a]D = + 12 (CHC13, c - 0,52) spectre de 'H RMN du mélange d ppm, J Hz, CDC13: 0,92 (3H, s, CH3), 1,0 (3H, s, CH3), 1,28 (3H, d, J - 6, CH3), 1,35 (6H, s, CH3), 2,10 (3H, s, COCH3), 3,40 (IH, m, H-3), 3,82 (3H, s, CO2CH3), 5,02 (IH, s large, H-2), 5, 88 (IH, dd, J = 9, J' = 2, H-6), 5,08 (IH, dd, J = 9, J' = 4, H-7), 6,92 (IH, d, J = 2, H-22), 7,38 (IH, dd, J = 2, J' = 1, H-23), 8,35 (IH, d, J-l, H-21).
* EXEMPLE 1 1 : Utilisation des haperforines contre la prolifération cellulaire Le pouvoir anti-turnoral exercé in vitro par une famille de produits contenant une vingtaine d'exemples fut évalué à l'aide du test colorimétrique MTT sur 6 lignées cancéreuses humaines.
Le principe du test MTT est basé sur la réduction réalisée au niveau d'enzymes mitochondriales (de cellules vivantes puisque métaboliquement actives) du produit MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) de couleur jaune en un produit de couleur bleue, le formazan. La quantité de formazan ainsi obtenue est directement proportionnelle à la quantité de cellules vivantes dans le milieu de culture. Cette quantité de formazan est mesurée par spectrophotométrie.
Six lignées cellulaires cancéreuses humaines ont été utilisées, à savoir les modèles Al 72, U373 et U87 (ghoblastomes), A549 (cancer du poumon non-à-petites-cellules), et HCT-15 et LoVo (cancers colorectaux). Ces lignées cellulaires ont été obtenues auprès d'une banque de tissus tumoraux située aux USA, à savoir V American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).
Le procédé expérimental consiste à ensemencer 20 000 à 50 000 (selon le type cellulaire utilisé) cellules/ml de milieu de culture dans des plaques multi-puits de 96 puits contenant chacun 100 μl de milieu de culture avec la concentration cellulaire adéquate. Les cellules sont laissées au repos pendant 24 heures afin de favoriser au maximum leur adhérence sur le support de la plaque, puis on ajoute les différents produits dont on veut évaluer l'activité anti-tumorale. Chaque produit a été testé aux concentrations de 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 et 100 μg/ml, chaque concentration de produit étant étudiée en hexaplicat.
On effectue un contrôle, qui correspond à la condition expérimentale dans laquelle est ajouté le solvant. Dans le cas présent, le solvant est du DMSO utilisé à une concentration finale inférieure à 0.1% par rapport au volume total de culture cellulaire. En effet, on sait que des concentrations de DMSO allant jusqu'à 5% du volume totale de culture cellulaire ne perturbent pas la croissance des lignées utilisées pour le test.
On laisse les cellules en présence des produits pendant 72 heures, puis on ajoute le produit MTT jaune et on laisse ce produit en présence des cellules pendant 3 heures. L'intensité de la coloration bleue résultant de la transformation du produit MTT jaune en formazan bleu par les cellules encore vivantes au terme de l'expérience est quantifiée par spectrophotométrie à l'aide d'un appareil de type DYNA TECH IMMUNOASSA Y SYSTEM.
Un logiciel intégré au spectrophotomètre calcule les valeurs moyennes de densité optique ainsi que les valeurs de déviation standard (Dév. Std.) et d'erreur standard sur la moyenne (ESM). Les évaluations statistiques se font à l'aide de tests paramétriques (analyse de la variance selon le test de Student) ou non paramétriques (test de rang de Mann-Whitney) selon que les distributions de valeurs de densité optique répondent ou non à une distribution normale (testées par un test Chi2) et que les variances sont ou ne sont pas égales (testées par le test de Levene).
Les résultats obtenus figurent dans le Tableau I, qui détaille l'activité observée pour 7 produits à chacune des concentrations testées pour chacune des 6 lignées utilisées dans le test.
On observe donc que les composés selon l'invention possèdent une activité remarquable de cytotoxicité pour les cellules cancéreuses, le produit HBl se révélant le plus intéressant en termes d'inhibition de la croissance tumorale. Tableau I
* HB1 = Haperforine Bl
Les nombres figurant dans le tableau I représentent la valeur moyenne (calculée sur 6 valeurs pour chacune des conditions expérimentales) du pourcentage de cellules présentes en fin d'expérimentation par rapport à la condition contrôle, cette dernière étant calibrée à 100% de manière arbitraire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés ayant pour formule générale
dans laquelle
• B représente, soit le radical
la liaison s' effectuant au niveau du carbone porteur de R4, soit B forme avec R3 un composé de formule
et dans laquelle
• les pointillés représentent, de façon indépendante, des simples liaisons ou des doubles liaisons,
• R6 à RI 3, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, linéaire ou ramifié, substitué ou non,
• RI est le groupe OH, ou forme avec R2 un pont de structure
• R2 est le groupe =O ou forme avec RI, un pont comme défini ci- dessus,
• lorsque R3 est présent, R3 est choisi parmi l'atome d'hydrogène ou un groupe OH, ou forme avec R5 un pont de structure
\
• R4 est le groupe OH ou le groupe OCOCH3, ou R4 est absent afin de former la double liaison telle qu'indiquée en pointillé,
• R5 est un atome d'hydrogène ou forme avec R3 le pont tel que décrit précédemment, ainsi que leurs dérivés, sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Composés selon la revendication 1, ayant pour formule :
ou
sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Dérivés des composés de formule générale I selon la revendication 1, choisis parmi les dérivés de formule :
III.1 III.2
sous forme libre, ou sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables.
4. Composition pharmaceutique contenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.
5. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer ou du paludisme.
6. Procédé d'extraction de produits actifs bruts de limonoïdes à partir de végétaux, caractérisé en ce que : a. les feuilles des végétaux sont réduites en poudre, b. on traite les feuilles par une solution hydroalcoolique, pour obtenir la dissolution des principes actifs amers dans ladite solution hydroalcoolique, c. on traite la solution hydroalcoolique de principes amers par une solution aqueuse d'acétate de plomb, d. on sépare le précipité formé par filtration, e. on traite le filtrat obtenu par une solution aqueuse de sulfate de sodium, f. on filtre après décantation pour obtenir un filtrat hydroalcoolique de principes amers,
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape (f) est suivi des étapes suivantes : g. on traite le filtrat hydroalcoolique, sous agitation, par du charbon actif pour absorber les principes amers h. on recueille le charbon par filtration, on le dessèche et le réduit en poudre, i. on extrait les principes amers retenus par la poudre de charbon par du chloroforme, que l'on évapore ultérieurement à sec pour obtenir l'extrait brut de principes actifs.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape (f) est suivie des étapes suivantes : g. on évapore le filtrat hydroalcoolique à sec sous vide h. on extrait l'extrait brut au chloroforme, que l'on évapore ultérieurement à sec pour obtenir l'extrait brut de principes actifs.
. Procédé selon l'une quelconque des revendication 6 à 8, caractérisé en ce que les végétaux sont du genre Harrisonia, en particulier de l'espèce Harrisonia perforata.
10. Extrait brut susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9.
1 1. Composés susceptibles d'être obtenus à partir de l'extrait brut selon la revendication 10.
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