EP1204760A2 - Polynucleotides dirigeant l'activation de l'expression d'un gene dans le coeur et ses applications a la therapie genique - Google Patents

Polynucleotides dirigeant l'activation de l'expression d'un gene dans le coeur et ses applications a la therapie genique

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EP1204760A2
EP1204760A2 EP00956629A EP00956629A EP1204760A2 EP 1204760 A2 EP1204760 A2 EP 1204760A2 EP 00956629 A EP00956629 A EP 00956629A EP 00956629 A EP00956629 A EP 00956629A EP 1204760 A2 EP1204760 A2 EP 1204760A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
dna molecule
expression
sequence
transcription
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00956629A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Margaret Buckingham
Marguerite Lemonnier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of EP1204760A2 publication Critical patent/EP1204760A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to a novel " polynucleotide sequence which stimulates transcription in myocardial cells and its use for directing the activation of gene expression and maintaining this activation at a high level.
  • the invention also relates to the use of such a sequence in transgenesis and gene therapy.
  • LCR Locus Control Region
  • the annex sequences ensuring a good level of expression are: the promoter and optionally an activator sequence ("enhancer").
  • the promoter is preferably chosen from the group of strong promoters such as, for example, viral promoters; the promoter can also be the endogenous promoter of the gene of interest to be expressed; it can be used in its entirety or in a truncated form ensuring minimal expression.
  • the enhancers are capable of activating in CIS the transcription of the gene of interest, whatever its orientation, its location upstream or downstream of the initiation site and within certain limits whatever the distance which separates it from the promoter. In the context of transgenesis of heart cells and gene therapy of the heart, it is of great interest to have enhancers which make it possible to target and stimulate the expression of a gene of interest in the majority of myocardial cells specifically.
  • the present invention therefore proposes to provide such a transcription activating sequence which allows a broad expression of a gene of interest in only myocardial cells of the adult individual; this transcription activator sequence precedes in its natural state, the minimal promoter sequence of the ⁇ -cardiac actin gene and the coding sequence associated with it.
  • the ⁇ -cardiac actin gene is expressed early during the differentiation of the heart and skeletal muscles. In mice, after birth, transcription of the ⁇ -cardiac actin gene ceases in the skeletal muscles but persists throughout the heart during development as well as in adulthood where the transcription rate is high. Expression of the ⁇ -cardiac actin gene at a high level is necessary for proper functioning of the heart. Indeed, any event causing a decrease in the production of ⁇ -cardiac act (gene invalidation or duplication of the promoter region, overexpression of skeletal actin in mice, point mutations in humans) at best results in a modification of the contractile properties of the heart, at worst in a cardiomyopathy leading to death.
  • transgene (- 9 kb ⁇ -cardiac actin nLacZ) uniting these two enhancers (later called skeletal and cardiac) has demonstrated that it is regulated like that of the endogenous gene. Expression takes place in the embryonic skeletal muscles, with a high level of expression in the embryonic heart and in the adult heart; however the expression is decreased in the right ventricle. In transgenesis experiments the minimum promoter is also specific for the heart, but it is not very active and exclusively in the embryo.
  • the heart and skeletal muscles differ significantly at the molecular level in terms of their composition of proteins that regulate transcription.
  • the family of proteins with the MyoD helix-turn-helix motif regulates the transcription of many muscle-specific genes (Wemtraub et al., 1991).
  • This family of transcription factors is not present at any time of development in the heart muscle and in smooth muscle.
  • a number of transcription factors are specific to the heart muscle; one of these factors, called GATA-4, which is present specifically in myocardial cells and in certain endothelial cells (Arceci et al., (1993); Grépm et al., (1995)), is necessary to transcription of a number of cardiac genes (Grépin et al., (1995)).
  • a specific transcription factor for the heart muscle is the hoobob protein Nkx2-5 (Lints et al. (1993)). Certain factors that play an important role in regulating the expression of specific muscle genes are common to both the heart and skeletal muscles; the family of factors MEF2 is an example (Martin et al. (1994; Edmondson et al., (1994)). It appears to be extremely interesting to identify the regulatory sequences which activate the transcription of the gene for the actin ⁇ - cardiac in the myocardium undergoing differentiation and those which maintain transcription in adult animals.
  • the present invention relates to a purified DNA molecule activating the transcription (“enhancer”) of the 5 ′ region upstream of the locus of the murine ⁇ -cardiac actin gene, characterized in that said DNA molecule is purified from '' a DNA fragment located in a region between -5.3 kb and -0.7 kb upstream of the CAP site of the murine ⁇ -cardiac actin gene and characterized in that said molecule comprises at least the sequence SEQ ID No. 1. More particularly, the invention relates to the purified DNA molecule of sequence SEQ ID No. 1.
  • SEQ ID No. 1 means the sequence of the 0.2 Kb enhancer located approximately between -1.6 Kb and - 1.4 Kb upstream of the CAP site. It designates the sequence described below which is the antisense sequence, and also the corresponding sense sequence of polarity 5'-3 'or 3'-5'.
  • SEQ ID NO: l Sequence 1 insert "GMD 133 antisense" "TCTAGTGCTTGGACTTCTAATGCTGTGCTTTTCCTTCAGTTCACACCAGTTAAAA ATAGAAAACTGGGCACCGGCATCTCTGTCTAGAGTGGGCTTGGATTGATATGCTG AGCAGGACTGCTGATTAGATACTTCAGGGGCCGGGCAGTGCTGGGTCCTCCCCTC AGAGCTTCTCAACCATGTTTGGGATGGTCTAGGGATGAAACTGCTGGACAGTCGA CCTGCAGGCATGCAAGCTT
  • the purified DNA molecule according to the invention can also comprise the sequence SEQ ID No. 2. More particularly, the invention relates to the purified DNA molecule of sequence SEQ ID No. 2.
  • the sequence SEQ ID N ° 2 corresponds to the sequence of the enhancer of 0.9 Kb located between -2, 1Kb and -1.2 Kb upstream of the CAP site of the gene. It is in "GMD 134 insert". In the plasmid GMD134, deposited on March 25, 1999 at the CNCM (Institut Pasteur, France) under the number I-2177, this insert was cloned in front of the promoter of the ⁇ -cardiac actin. This sequence is represented by the following sequence SEQ ID N ° 2:
  • the invention also relates to a purified DNA molecule characterized in that it comprises a molecule chosen from: a) a DNA molecule whose sequence is complementary to the sequence of the DNA molecule as defined above , b) a DNA molecule whose sequence has at least 80% identity with a DNA molecule as defined above, c) a DNA molecule hybridizing under " high stringency " conditions with a molecule d DNA as defined above, d) a fragment of at least 20 consecutive nucleotides, preferably 100 consecutive nucleotides, and preferably 210 consecutive nucleotides of a DNA molecule as defined above, said fragment exhibiting transcription activating activity.
  • the purified DNA molecule according to the invention is characterized in that said DNA molecule exerts its activating activity of transcription in eukaryotic cells, preferably human cells, preferably human myocardial cells.
  • eukaryotic cells preferably human cells, preferably human myocardial cells.
  • the expression “DNA molecule or polynucleotide” will be understood to mean a double stranded or single stranded DNA molecule purified naturally or synthetically, with or without unnatural nucleotides, designating a precise sequence of nucleotides, modified or no, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid.
  • the DNA molecules according to the invention can be synthesized by techniques well known to those skilled in the art described in the scientific literature (see Curruthers et al., 1982 Cold Spring Harbor Symp.
  • Double stranded DNA fragments can be obtained either by synthesizing the complementary strand and hybridizing the strands together under appropriate conditions or by polymerizing the complementary strand using DNA polyerase with an " appropriate primer sequence.
  • DNA molecule of complementary sequence is meant any DNA whose nucleotides are complementary to those of SEQ ID No 1 or No 2 or part of SEQ ID No 1 or No 2 and whose the orientation is reversed.
  • DNA molecules of homologous nucleic sequence have a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, preferably 95%, more preferably 97%. Sequence comparisons between two
  • DNA molecules are traditionally produced by comparing sequences of two optimally aligned sequences, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (1981) [Ad.App. Math. 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the degree of stringency can be controlled by temperature, by ionic strength, pH and p Resistance of partially denatured solvent such as formamide.
  • the stringency of the hybridization is modified so as to change the concentration of the formamide in the hybridization reaction medium in a range going from 0 to 50% of formamide.
  • DNA-DNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC ( 1 x SSC " corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5% dextran sulfate and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA; (2) hybridization proper for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C., for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC +
  • the recombinant DNA technologies used in the present invention use well-known protocols and techniques commonly used by those skilled in the art. Standard techniques are used for cloning, DNA isolation, amplification and purification. In general, enzymatic reactions use DNA ligase, DNA polymerase, restriction endonucleases, kinases, phosphatases, and other enzymes. according to the manufacturer's instructions. These protocols and techniques are generally carried out according to Sambrook et al. (1989).
  • the DNA molecule exerts its stimulatory activity "transcription in eukaryotic cells, preferably human cells, preferably human myocardial cells.
  • this molecule is fused to a gene of interest.
  • the gene of interest can comprise a promoter operably linked to said gene of interest.
  • a promoter operably linked to said gene of interest.
  • the purified DNA molecule is characterized in that said gene of interest codes for an expression product selected from growth factors, blood coagulation factors, tissue plasminogen activator, antithrombin III, cytokines, anticoagulants, enzymes or their inhibitors, hormones or their receptors, structural proteins, selection markers.
  • the present invention also relates to an expression cassette comprising a gene of interest, a promoter operably linked to said gene of interest and which mediates the expression of said gene and a DNA molecule as described above capable of modulating, increase, decrease or inhibit CIS transcription of said gene in myocardial cells.
  • the DNA molecule according to the invention increases the transcription into CIS of said gene.
  • the expression cassette according to the invention is characterized in that the promoter is a gene promoter expressed in myocardial cells.
  • the expression cassette according to the invention is characterized in that said promoter is the minimal POX promoter of ⁇ -cardiac actin of the sequence SEQ ID No. 3 or of a segment of this sequence.
  • operably linked refers to the functional link between a promoter and a second DNA sequence, which is characterized in that said promoter initiates and controls the transcription of said DNA sequence.
  • operably linked means that the linked nucleic acid sequences are contiguous, and when it comes to joining two regions coding for proteins, the linked nucleic acid sequences are contiguous and in the same phase of reading.
  • the gene of interest present in the expression cassette generally codes for a heterologous protein.
  • heterologous is intended to denote nucleic acids or polypeptides which originate from a foreign species, or if they originate from the same species, are modified substantially compared to their original form.
  • a promoter operably linked to a heterologous gene is from a species different from the species from which the heterologous gene is derived, or if it comes from the same species, it is substantially modified from its original form.
  • the gene of interest encodes an expression product selected from the factors of "cr-owth, blood clotting factors, tissue plasminogen activator, antithrombin III, cytokines, anticoagulants, enzymes or their inhibitors, hormones or their receptors, structural proteins, selection markers.
  • the invention relates to a recombinant vector for cloning a DNA molecule according to the invention and / or for expressing a polypeptide characterized in that it contains a polynucleotide as previously described.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods such as, for example, calcium phosphate precipitation transfection, lipofection, electroporation, thermal shock.
  • the invention relates to a recombinant vector characterized in that said vector is contained in a bacterium designated GMD 132, GMD 133, GMD 134, GMD 137 or GMD 138 as deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Institut Pasteur, 25 rue du Dondel-Roux, 75724 Paris Cedex 15 (France) on March 25, 1999 under the numbers: 1-2175.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • Plasmid GMD 132 contains the promoter region (-0.65 kb + 0.12 kb) of the mouse gene coding for ⁇ -cardiac actin, cloned into a plasmid pBLCAT6 derived from modified pucl ⁇ , conferring resistance with ampicillin. This plasmid is used as a reference for testing in cultivation of primary cardiocytes the enhancer activity of different 5 ′ regions of the mouse heart actin ⁇ gene.
  • Plasmid GMD 133 contains two regions of the mouse gene coding for cardiac ⁇ actin, cloned into a plasmid pBLCAT6 derived from modified pucl ⁇ , conferring resistance to ampicillin:. the promoter region of the gene (- 0.65 kb + 0.12 kb)
  • the enhancer sequence (0.21 kb) located approximately - 1.4 kb from the transcription initiation site, cloned upstream of the promoter region. This sequence increases transcription (x 10 to 20) specifically in cultures of rat embryonic primary cardiocytes, not in cultures of skeletal myogenic cells or fibroblasts.
  • Plasmid GMD 134 contains two regions of the mouse gene coding for cardiac ⁇ actin, cloned into a plasmid pBLCAT6 derived from modified pucl ⁇ , conferring resistance to ampicillin:. the promoter region of the gene (- 0.65 kb + 0.12 kb) . the enhancer sequence (0.98 kb) located between - 1 kb and
  • this region specifically increases transcription (x 10 to 20). There is no increase in transcription in cultures of skeletal myogenic cells or fibroblasts.
  • Plasmid GMD 137 contains two regions of the mouse gene coding for cardiac ⁇ actin, cloned into a plasmid pBLCAT6 derived from modified pucl ⁇ , conferring resistance to ampicillin:
  • Plasmid GMD 138 contains two regions of the mouse gene coding for cardiac ⁇ actin, cloned into a plasmid pBLCAT6 derived from modified pucl ⁇ , conferring resistance to ampicillin:
  • the promoter region of the gene (- 0.65 kb + 0.12 kb).
  • the enhancer sequence (0.21 kb) located approximately - 1.4 kb from the transcription initiation site, cloned upstream of the promoter region, in which the MEF2 site has been mutated and replaced by a SmaI site. In primary cultures of rat embryonic cardiocytes, this sequence with the mutated MEF2 site does not stimulate transcription.
  • the cloning vector according to the invention is useful for transforming host cells in order to clone the nucleotide sequences of the invention.
  • the recombinant expression vector according to the invention is characterized in that it contains an expression cassette according to the invention.
  • the vector according to the invention further comprises the elements allowing the secretion of the expression product encoded by said gene of interest outside the host cell.
  • expression vector is meant both expression vectors with autonomous replication of the plasmid type as systems intended to ensure integration into cells, but these expression vectors may also be " expression vectors of the viral type or even, when it is desired carry out, for example, gene therapy, naked DNA.
  • the viral vectors those derived from adenovirus, from virus associated with adenovirus (AAV), from retroviruses, from lentiviruses, from viruses derived from HIV are preferred.
  • naked polynucleotides are preferred such as naked DNA or naked RNA according to the technique developed by the company VICAL, yeast artificial chromosomes (YAC) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably chromosomes Human artificial chromosome (HAC) for expression in human cells.
  • the invention further comprises host cells, in particular eukaryotic and prokaryotic cells, characterized in that they are transformed with an expression cassette or a vector according to the invention.
  • the host cells are transformed under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide.
  • the cell host can be chosen from bacterial cells but also from yeast cells, as well as from plant and animal cells; according to a particular embodiment, the invention relates to the host cell as deposited at the CNCM under the numbers 1-2175, 12176, 1-2177, 1-2178 and 1-2179. "- Preferably, the cellular host is a mammalian cell. According to a preferred mode, the host cell is a myocardial cell.
  • the host cell is a mouse myocardial cell, and more preferably a myocardial cell
  • These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the invention also applies to cells which must be modified for gene therapy purposes or to embryonic stem cells (ES cells) modified to create a transgenic animal or an animal in which one of these cells has undergone a recombination event. counterpart. It is therefore within the scope of the invention to provide an animal, comprising at least one cell according to the invention.
  • Such transgenic animals can be obtained, for example, by injecting a DNA molecule, an expression cassette or a vector according to the invention into a fertilized egg which is left to develop until adulthood as described by Brinster et al. (1985) [PNAS, USA 82: 4438-4442).
  • the animal according to the invention is a mammal, chosen from the group composed of mice, rats, hamsters, pigs, cattle, sheep, goats.
  • the invention also relates to the use of a DNA molecule according to the invention as a primer for the amplification or polymerization of nucleic sequences and / or as a probe for the detection of nucleic sequences.
  • the DNA molecule according to the invention is used as a primer for the amplification or polymerization of nucleic sequences; the invention also relates to the use of a DNA molecule according to the invention as a probe for the detection of nucleic sequences.
  • the DNA molecule fragments which can be used as a probe or as a primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence will have a minimum size of 9 bases, preferably of 18 bases, and more preferably 36 bases.
  • the DNA molecule according to the invention is or is not labeled, directly or indirectly, with a radioactive compound or a non-radioactive compound.
  • the DNA molecule is labeled to obtain sequences usable for many applications known to those skilled in the art.
  • the labeling of primers, probes, oligonucleotides according to the invention is carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules; among the radioactive isotopes used, mention may be made of 32P, 33P, 35S, 3H or 1251.
  • the non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as " radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the DNA molecule according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods implementing in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (Erlich (1989); Innis et al. (1990) , and Rolfs et al. (1991)).
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after an electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography.
  • the specificity of the amplification can be controlled by molecular hybridization using as probe the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention, plasmids containing these sequences or their amplification products.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleotide fragments capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • PCR-like is will mean all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known, in general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, it is necessary to carry out a reverse transcription beforehand.
  • thermostable ligase the technique of RCR (Repair Chain Reaction) described by Segev in 1992, the CPR technique (Cycling Probe Reaction) described by Duck et al. in 1990, the Q-beta-replicase amplification technique described by Miele et al. in 1983 and "perfected in particular by Chu et al. in 1986 and Lizardi et al. in 1988, then by Burg et al. (1996) as well as by Stone et al. (1996).
  • the invention relates to the use of a DNA molecule according to the invention as a transcription stimulating sequence (“enhancer”); this use is preferably done in myocardial cells.
  • the invention also relates to the use of homologous DNA molecule in which, naturally or not, truncations, substitutions, deletions and / or additions of nucleotide residues exist.
  • the homologous DNA molecules according to the invention can thus have a stimulatory activity (“enhancer”) of transcription but they can have an activity which modulates, decreases or inhibits transcription.
  • the invention also relates to a ligand screening process capable of mediating or modulating the activity stimulating the transcription of the DNA molecule according to the invention, said method comprising the steps of (î) bringing the cassette into contact of expression or of a vector according to the invention and of said ligand in the presence of reagents necessary for the implementation of a transcription reaction, then (n) of detection and / or measurement of the transcriptional activity.
  • the invention also relates to a kit for screening a ligand capable of mediating or modulating the stimulatory activity of transcription according to the invention, characterized in that it comprises a DNA molecule and / or an expression cassette and / or a vector and / or a cell according to the invention, said kit comprising, where appropriate, the reagents necessary for carrying out a transcription reaction.
  • the invention also relates to the ligand obtained by the method or with the kit previously described.
  • the term “ligand” is intended to define all of the compounds capable of interacting with the DNA molecule according to the invention to form a complex capable of affecting the transcriptional activity, that is to say to increase, to decrease, modulate or inhibit the transcription of a gene.
  • the ligand according to the invention is characterized in that it is capable of binding to a DNA sequence and in that it is comprising at least one of the known protein motifs capable of interacting with DNA, for example the thimble structure with which a zinc atom is associated (“zinc-finger”), the propeller-turn-propeller structure, the propeller-loop-propeller structure and the leucine zipper (“leucine-zipper”) .
  • the known protein motifs capable of interacting with DNA for example the thimble structure with which a zinc atom is associated (“zinc-finger”), the propeller-turn-propeller structure, the propeller-loop-propeller structure and the leucine zipper (“leucine-zipper”) .
  • the ligand can exert its action in the form of a monomer or by associating with other monomers or polypeptides by protein-protein interactions.
  • the ligand according to the invention can dimerize to form homodimers or heterodimers, or combine in the form of homomultimers or heteromultimers.
  • the polypeptide according to the invention can also interact with another polypeptide to exert its action; thus, the polypeptide according to "1'-invention can possess, in addition to its binding domain to the DNA, a field of action on transcription which exerts its action via protein-protein interactions with other protein components of Transcriptional machinery:
  • the term protein component of the transcriptional machinery is understood to designate all the transcription factors necessary for carrying out and regulating the transcription reaction.
  • the MEF-2 proteins as well as these co-activators constitute ligands according to the invention.
  • the transcription factors which bind at the level of sequences or regulatory boxes for transcription constitute ligands according to the invention.
  • the computer tools available to those skilled in the art allow him easily to identify the promoter regulatory sequences or boxes necessary and sufficient for the control of gene expression and at the level of which ligands or transcription factors according to the invention bind. ; the MEF2 factors are examples.
  • the ligands and more particularly the transcription factors which bind to the activating sequence therefore constitute molecular targets for controlling the level of expression of the ⁇ -cardiac actin or of a heterologous gene under the control of a promoter sequence comprising at least the activator sequence according to the invention, such as a promoter sequence for the ⁇ -cardiac actin gene.
  • a promoter sequence comprising at least the activator sequence according to the invention, such as a promoter sequence for the ⁇ -cardiac actin gene.
  • the invention therefore relates to a compound as a medicament, characterized in that it is chosen from the group composed of a DNA molecule, an expression cassette, a vector, a host cell and of a ligand according to the invention. More particularly, the compound according to the invention is used as a medicament intended for the treatment and / or prevention of heart diseases.
  • the compound according to the invention is used for the preparation of a medicament intended to mediate, to modulate, to increase, to decrease or to inhibit the expression of a gene of interest, in particular in a myocardial cell.
  • Figure 1 Expression profile of the different constructs derived from the ⁇ -cardiac actin gene.
  • the CAT activity is represented in black for the cardiocytes, in gray for the fibroblasts and with black stripes for the C2 cells.
  • Figure 3 Tissue specificity of the MEF2 site of ⁇ -cardiac actin.
  • Three constructs corresponding respectively to the plasmid tkCAT, to the plasmid (mef2) 4-tkCAT, and to the plasmid (mef2) 3-tkCAT were transfected in primary cultures of rat embryo cardiocytes, in cultures of skeletal myoblasts as they were made to differentiate in vi tro, and in cultures of non-muscular cells. All CAT activities measurements are corrected according to the Luc activity generated in the same extract. The activity of the enhancers is then evaluated by comparing the corrected CAT activity which they generate with the corrected activity measured for the " construction containing the only promoter.
  • the corrected CAT activities are expressed relative to the CAT activity of the tkCAT construction alone reduced to 1 for each tissue
  • the CAT activity is represented in black for the cardiocytes, in gray for the fibroblasts and with black stripes for the C2 cells.
  • Figure 4 Delayed gel experiments with nuclear extracts of cells or skeletal or cardiac muscle.
  • Figure 5 Diagram of the 5 'part of the cardiac actin gene.
  • the region of the mouse genome surrounding the site of initiation of transcription of the cardiac actin gene is represented in the form of a diagram:
  • Figure 6 Matrix of homology between region A and the human contig. "-. Creation of a homology matrix between the region A sequence and the human contig extracted from databases comprising the gene for human cardiac actin.
  • DNA matrix program stringency 13 nt, window 15 nt.
  • the linear human contig is on the x-axis
  • Figure 7 Homology matrix between region B and the human contig.
  • the linear human contig is on the x-axis
  • Figure 8 Homology matrix between region C and the human contig.
  • the linear human contig is on the abscissa (8410 " bp): TAG ATG GCT ACA ... TTC CCT CCC TTT; the linear murine sequence is on the ordinate (2447 bp): GGA TCC ATT
  • Figure 9 Alignment of region A and human contig.
  • the alignment was carried out between the region A of mice (in capital letters) (798 bp) along the human contig (in small letters) (8410 bp) thanks to the program DNA alignment: block method (Martinez), with standard display; mismatch penalty: smaller; gap penalty: medium) available in DNA Strider.
  • the identity percentage is 432/8546, or 5.1%.
  • Figure 10 Alignment of region B and human contig.
  • the alignment was carried out between mouse C region (2447 bp) (uppercase) along the contig "human (6410 pb) (lowercase) thanks to the DNA alignment program: block method (Martinez), with standard display ; mismatch penalty: smaller; gap penalty: medium) available in DNA Strider.
  • the identity percentage is 1345/9091, or 14.8%.
  • Example 1 Construction of the plasmids and localization of the specific enhancer activity of the cardiac tissue.
  • mice ⁇ -cardiac actin The promoter of mouse ⁇ -cardiac actin was cloned into a plasmid called pBLCAT ⁇ containing the CAT gene coding for the bacterial chloramphenicol-acetyl-transferase: this construction is GMD 132.
  • GMD 132 Fragments of the mouse genome located upstream of the ⁇ -cardiac actin promoter were then cloned into this GMD 132. Plasmid cloning was carried out by taking advantage of natural restriction sites and the techniques used are referenced in the book. of protocols by Sambrook et al. to which reference is made elsewhere). These fragments are shown in the figure by black lines in front of the promoter. These are the GMD 134 plasmids. (0.9 Kb enhancer, fragment ranging from approximately - 2.1 Kb to -1.2 Kb) and GMD 133 (0.2 Kb enhancer).
  • the CAT gene has been put under the control of the minimum promoter of ⁇ -cardiac actin
  • the enzymatic activities are then assayed in the extracts: the luciferase activity is assayed by luminescence and the CAT activity is assayed after incubation of an aliquot of the cell extract in the presence of radiolabelled chloramphenicol, extraction and assay of the radioactivity incorporated). All CAT activities measured are corrected according to the Luc activity generated in the same extract. The activity of the enhancers is then evaluated by comparing the corrected CAT activity that they generate with the corrected activity measured for the construction containing the only promoter.
  • the results of FIG. 2 illustrate a strong CAT activity in the cardiocytes for the enhancer 0.2 Kb (minimum region) and 0.9 Kb. The results obtained in culture of C2 cells have shown that the activating regions thus delimited consist of composite elements, none of which alone is decisive.
  • Example 2 ex vivo by transfection of non-myogenic, myogenic and cardiac cells
  • a sequence of 0.9 kb (-2.1, -1.2 kb) upstream of the promoter has an exclusively cardiac enhancer action on the POX promoter (x 21 in cardiocytes, no increase in fibroblasts or cells C2). This region can be reduced to 200 nt in front of the POX promoter (200-POX) and retains much of the activity of the 2 kb fragment.
  • This sequence contains two sites which are " capable of fixing transcription factors present in the heart: a MEF2 site and a GATA site.
  • the mutation of the GATA site has little effect on the enhancer activity.
  • the site of fixation of the proteins MEF2 is responsible for the activity since its mutation results in the inactivation of the enhancer
  • a construction in which this multimerise MEF2 site is located in front of POX also has cardiac specificity (Figure 3).
  • Multimerized construction (mef2x4-POX) and construction (200nt-POX) transactivation experiments with different MEF2 isoforms were performed in fibroblasts to determine whether the forced expression of MEF2 proteins in naive cells would be able to 'activate the transcription of these two constructions. No transactivation was observed: this could be linked to the absence of one or more cofactors acting in synergy with the MEF2 proteins.
  • Example 3 Tissue specificity of the MEF2 site of the ⁇ -cardiac actin.
  • Antisens 5 'cacaccagttaaaaatagaaaactgccc SEQ ID N ° 6)
  • the MEF2 site is indicated in bold.
  • the nucleotides allowing the cloning are in italics.
  • Antisense 5 'cacaccagtcccgggtagaaaactgccc (SEQ ID N ° 8) The mutation is indicated in bold. The nucleotides allowing the cloning are in italics.
  • these oligonucleotides were cloned at the Sfil site introduced by Frédéric Relaix into the linker located upstream from the tk promoter in the tkCAT plasmid.
  • plasmid tkCAT the promoter of the herpes virus thymidine kinase gene directs the transcription of the CAT gene mentioned above.
  • the sequence of the recombinant plasmids was checked and we kept the plasmids (mef2) 4- tkCAT and (mef2muted) 3-tkCAT in which 4 native mef2 motifs and 3 mutated motifs were cloned in tandem in tkCAT.
  • Three constructs corresponding respectively to the plasmid tkCAT, to the plasmid (mef2) -tkCAT, and to the plasmid (mef2) 3-tkCAT were transfected in primary cultures of rat embryo cardiocytes, in cultures of skeletal myoblasts which are differentiated in vitro, and in non-muscle cell cultures by the Calcium phosphate process.
  • a plasmid containing the Luciferase reporter gene under the control of the promoter RSV was added to each reaction to serve as an indicator of transfection efficiency.
  • the cells are rinsed, harvested and the cell extracts were obtained "after cell lysis by three cycles of brutal freeze-thaw and centrifugation.
  • the enzymatic activities are then assayed in the extracts: the luciferase activity is assayed by luminescence and the CAT activity is assayed after incubation of an aliquot of the cell extract in the presence of radiolabelled chloramphenicol, extraction and assay of the incorporated radioactivity) . All CAT activities measured are corrected according to the Luc activity generated in the same extract. The activity of the enhancers is then evaluated by comparing the corrected CAT activity that they generate with the corrected activity measured for the construction containing the only promoter. The results are presented in FIG. 3 and show a strong CAT activity for MEF2 (not mutated).
  • Example 4 In vitro gel delay experiments with nuclear extracts of cells or of skeletal or cardiac muscle. An oligonucleotide containing the site binding the MEF2 proteins forms a complex with nuclear extracts from an adult heart which the oligo whose sequence is mutated does not form. This complex is abolished by competition with an oligonucleotide containing the MEF2 consensus sequence. The ⁇ - actin sequence cardiac appears to have more affinity during complex formation than the consensus oligonucleotide MEF2 itself ( Figure 4).
  • the 2 kb fragment has the same expression pattern as the transgene -9 kb ⁇ -cardiac actin nLacZ from C.
  • Biben strong expression in the embryonic heart and in the adult heart, with a very intense marking in the left ventricle, weak and punctiform in the right ventricle, as well as in the lines of C. Biben. The differences observed relate to the absence of expression in certain skeletal muscles. The absence of the distal skeletal enhancer and the "skeletal" part of the cardiac enhancer in our construction is probably at the origin of these differences. This line could be useful for mapping the modules activating cardiac actin in different types of muscles.
  • the proximal promoter which alone can ensure the activation of the gene in the skeletal muscles and the heart, but not the maintenance of expression in the adult heart, this promoter is not very effective in vivo: only two lines out of seven express the transgene; the DNA molecule according to the invention, which can maintain expression in the heart in the embryo and the adult, at a high level, and the use of which in gene therapy could be envisaged;
  • this element which is active in skeletal myogenic cell cultures, and which participates in the expression of the ⁇ -cardiac actin gene in embryonic skeletal muscles and in certain fibers of adult skeletal muscles, this element would have LCR properties and isolate the genomic sequences which it delimits from the surrounding sequences.
  • Example 6 Sequence homologies between murine and human sequences.
  • the publication of large contigs of the human genome has made it possible to address the possible significance of the regulatory sequences of the ⁇ -cardiac actin gene by comparing the upstream sequences of the cardiac actin gene of mice and humans.
  • the inventors have thus discovered the existence of very conserved regions, including one corresponding to the sequence which is the subject of the patent. These conserved regions effectively correspond to sequences which have shown activation of transcription in mice.
  • FIG. 5 shows schematically the cardiac actin gene with three regions A (SEQ ID No 9), B (SEQ ID No 10) and C (SEQ ID No 11), starting at approximately -7Kb, -5Kb respectively , and -2Kb from the gene transcription initiation site.
  • the search for homologies between the mouse sequences and the corresponding sequences in humans was done with two types of program provided in the DNA Strider TM 1.3f8 sequence analysis software (a C ++ software for DNA and protein sequence analysis ) created by Christian Mack, Bâtiment 142, CEA Saclay, F-91191 Gif-sur-Yvette Cedex. Two series of analyzes were made. The first analyzes consisted in the creation of homology matrices with each of the regions A (SEQ ID N ° 9), B (SEQ ID N ° 10) and C (SEQ ID N ° 11), sequenced in the laboratory, and a 9Kb human contig extracted from databases (SEQ ID No. 12).
  • the conservation region between the human and mouse sequences relates to an active sequence in the cultures of differentiated skeletal myoblasts and in the skeletal muscles of the embryo. These results have been previously published (Biben et al. (1996)). These regions have no activity in cultured cardiocytes, nor in adult heart muscle.
  • the conserved region corresponds to a region which has transcriptional activity in cultures of differentiated skeletal myoblasts (Biben et al. (1994)) and in cultured cardiocytes (Marguerite Lemonnier, personal observation). This region is located between 4 and 5Kb upstream of the mouse cardiac actin promoter and was included in the -5kb sequence which activates the transcription of a transgene in the adult heart (Biben et al.
  • antisense DNA arrays does not give any alignment between human and mouse sequences, as does an alignment of one or more of the mouse sequences with any human sequence.
  • Example 7 Location of sequence homologies between human and human sequences.
  • the second type of analysis consisted in locating these regions of homology more finely at the nucleotide level.
  • the program used was DNA alignment which uses the block method (Martinez), with standard display, mismatch penalty: smaller, gap penalty: medium) also provided by DNA Strider.
  • FIG. 9 shows the alignment (in capital letters) of the region A of mice (SEQ ID No. 9) along the human contig (in small letters) (SEQ ID No. 12) and the region of homology between the human sequence (from nt 795 to nt 1048) and the mouse sequence.
  • This region contains the Ev box, the role of which has been shown in activating transcription (Biben et al. (1994)).
  • the alignment of the deleted human sequence of this region of homology with the same mouse sequence A shows no significant alignment.
  • FIG. 10 shows the alignment of the sequence B (SEQ ID No. 10) with the human contig (SEQ ID No. 12).
  • the region of homology located between nt 3645 and 4080 of the human sequence corresponds to a region in which transcriptional activation activities have been found with respect to the cardiac actin promoter and with respect to the TK promoter in the cultures of differentiated skeletal myoblasts (Biben et al. (1994)) and cardiocytes (M Lemonnier, personal results).
  • Figure 11 shows the alignment of region C (SEQ ID No 11) with the human contig (SEQ ID No 12).
  • the regions of homology found relate on the one hand to the promoter regions (human sequence nt 7658- 7840) for which these data were already known: conservation of the E box, of the CarG boxes (Minty and Kedes (1986)).
  • the other region of homology is a region (human sequence nt 6368 to 6558) which is found in the sequences deposited with the CNCM: 1-2176 and 1-2177 object of the present invention.
  • This sequence contains inter alia a MEF2 site, the mutation of which abolishes the transcriptional activity in cultures of cardiocytes.

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Abstract

La présente invention concerne notamment une nouvelle séquence polynucléotidique stimulatrice de la transcription dans les cellules du myocarde et son utilisation pour diriger l'activation de l'expression de gène et maintenir cette activation à un niveau élevé.

Description

« POLYNUCLEOTIDES DIRIGEANT L'ACTIVATION DE L'EXPRESSION D'UN GENE DANS LE CŒUR ET SES APPLICATIONS A LA THERAPIE GENIQUE ». La présente invention concerne une nouvelle "séquence polynucléotidique stimulatrice de la transcription dans les cellules du myocarde et son utilisation pour diriger l' activation de l'expression de gène et maintenir cette activation à un niveau élevé. L'invention concerne également l'utilisation d'une telle séquence en transgenèse et en thérapie génique.
La transgenèse animale, au niveau de la cellule ou d'un organisme entier, ainsi que la thérapie génique effectuée sur les cellules somatiques d'un individu affecté d'un défaut génétique pose de multiples problèmes méthodologiques. En effet, le gène greffé ou réparé doit être exprimé normalement de façon régulière, au bon moment et en quantité normale adaptée aux besoins ; dans le cadre de la thérapie génique, les exigences sont encore plus grandes car le gène à réparer doit être exprimé normalement au bon endroit, au bon moment, sans affecter l'expression des gènes environnants. Dans les deux cas, le contrôle de l'expression du transgène apparaît donc comme l'un des paramètres centraux à maîtriser lors des expériences de transgenèse ou au cours d'une thérapie génique.
Ces expériences utilisent en général des constructions nucléotidiques comportant un gène d'intérêt, muni de séquences annexes assurant un bon niveau d'expression, éventuellement des séquences assurant la sécrétion, auquel on adjoint éventuellement un gène auxiliaire conférant un avantage sélectif. Accessoirement, la construction peut contenir une séquence génomique qui a les propriétés d'un « Locus Control Région » (LCR) .
Les séquences annexes assurant un bon niveau d'expression sont : le promoteur et éventuellement une séquence activatrice (« enhancer » ) . Le promoteur est de préférence choisi parmi le groupe des promoteurs forts tels par exemple les promoteurs viraux ; le promoteur peut être également le promoteur endogène du gène d'intérêt à exprimer ; il peut être utilisé dans sa totalité ou sous une forme tronquée assurant une expression minimale. Les enhancers sont capables d'activer en CIS la transcription du gène d'intérêt, quelque soit son orientation, sa localisation en amont ou en aval du site d' initiation et dans certaines limites quelque soit la distance qui le sépare du promoteur. Dans le cadre de la transgenese des cellules cardiaques et de la thérapie génique du cœur, il est d'un grand intérêt de disposer d' enhancers qui permettent de cibler et de stimuler l'expression d'un gène d'intérêt dans la majorité des cellules du myocarde spécifiquement.
La présente invention se propose donc de fournir une telle séquence activatrice de la transcription qui permet une large expression d'un gène d'intérêt dans les seules cellules du myocarde de l'individu adulte; cette séquence activatrice de la transcription précède à l'état naturel la séquence promotrice minimale du gène de l'actine α-cardiaque et la séquence codante qui lui est associée.
Le gène de l'actine α-cardiaque est exprimé de façon précoce au cours de la différenciation des muscles cardiaque et squelettiques . Chez la souris, après la naissance, la transcription du gène de l'actine α-cardiaque cesse dans les muscles squelettiques mais persiste dans tout le cœur au cours du développement ainsi qu'a l'âge adulte ou le taux de transcription est élevé. L'expression du gène de l'actine α-cardiaque a un haut niveau est nécessaire pour un bon fonctionnement du cœur. En effet, tout événement a l'origine d'une diminution de la production d'actme α-cardiaque (invalidation du gène ou duplication de la région promotrice, surexpression de l'actine squelettique chez la souris, mutations ponctuelles chez l'homme) se traduit au mieux par une modification des propriétés contractiles du cœur, au pire par une cardiomyopathie entraînant le deces .
Les connaissances actuelles concernant la régulation du gène de l'actine α-cardiaque restent somme toute assez sommaires. Un travail antérieur des inventeurs a permis de démontrer l'existence de deux sites hypersensibles a la DNAse 1 a -7,8/-7 kb, and - 5,4/-3,5 kb) en amont du CAP site du gène (Biben et al, 1994) dans les cellules C2. Par transgenese, il a ete montre que le site distal présente les propriétés d'un enhancer du muscle squelettique embryonnaire, tandis qu'une région avec - 5,4 kb en amont du CAP site du gène agit comme un enhancer de type cardiaque, embryonnaire et adulte, et squelettique embryonnaire. L'expression d'un transgène (- 9 kb actine α-cardiaque nLacZ) réunissant ces deux enhancers (appelés squelettique et cardiaque ultérieurement) a démontré que celle-ci est régulée comme celle du gène endogène. L'expression a lieu dans les muscles squelettiques embryonnaires, avec un haut niveau d'expression dans le cœur embryonnaire et dans le cœur adulte ; cependant l'expression est diminuée dans le ventricule droit. Dans les expériences de transgenèse le promoteur minimum est également spécifique du cœur, mais il est peu actif et exclusivement chez l'embryon.
Les muscles cardiaque et squelettique diffèrent de manière significative au niveau moléculaire en ce qui concerne leur composition en protéines régulatrices de la transcription. Dans le muscle squelettique, la famille de protéines possédant le motif hélice-tour-hélice MyoD régule la transcription de nombreux gènes spécifiques des muscles (Wemtraub et al . , 1991). Cette famille de facteurs de transcription n'est présente à aucun moment du développement dans le muscle cardiaque et dans le muscle lisse. Un certain nombre de facteur de transcription sont spécifiques du muscle cardiaque ; l'un de ces facteurs dénommé GATA-4, qui est présent de manière spécifique dans les cellules du myocarde et dans certaines cellules endothéliales (Arceci et al . , (1993) ; Grépm et al . , (1995)), est nécessaire a la transcription d'un certain nombre de gènes cardiaques (Grépin et al . , (1995)). La protéine ho éobox Nkx2-5 constitue un autre exemple de facteur de transcription spécifique du muscle cardiaque (Lints et al . (1993)). Certains facteurs qui jouent un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes spécifiques des muscles sont communs à la fois aux muscles cardiaque et squelettique ; la famille de facteurs MEF2 en est un exemple (Martin et al . (1994 ; Edmondson et al . , (1994) ) . II apparaît comme extrêmement intéressant d'identifier les séquences régulatrices qui activent la transcription du gène de l'actine α-cardiaque dans le myocarde en cours de différenciation et celles qui assurent le maintien de la transcription chez l'animal adulte.
La présente invention concerne une molécule d'ADN purifiée activatrice de la transcription (« enhancer ») de la région 5' amont du locus du gène de l'actine α- cardiaque murine, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN est purifiée d'un fragment d'ADN situé dans une région comprise entre -5,3 kb et -0,7 kb en amont du CAP site du gène de l'actine α-cardiaque murine et caractérisé en ce que ladite molécule comprend au moins la séquence SEQ ID N°l. Plus particulièrement l'invention porte sur la molécule d'ADN purifiée de séquence SEQ ID N°l.
On entend par « SEQ ID N°l » la séquence de l' enhancer de 0,2 Kb situé environ entre -1,6 Kb et - 1,4 Kb en amont du CAP site. Elle désigne la séquence décrite ci-dessous qui est la séquence antisens, et également la séquence sens correspondante de polarité 5'-3' ou 3'-5' .
SEQ ID N°l : Séquence de 1 ' insert "GMD 133 antisens" "TCTAGTGCTTGGACTTCTAATGCTGTGCTTTTCCTTCAGTTCACACCAGTTAAAA ATAGAAAACTGGGCACCGGCATCTCTGTCTAGAGTGGGCTTGGATTGATATGCTG AGCAGGACTGCTGATTAGATACTTCAGGGGCCGGGCAGTGCTGGGTCCTCCCCTC AGAGCTTCTCAACCATGTTTGGGATGGTCTAGGGATGAAACTGCTGGACAGTCGA CCTGCAGGCATGCAAGCTT
Sont indiqués en gras :
- le site 3' de clonage Xbal/Spel perdus tous les deux
- le site MEF2
- le site 5' de clonage pvu2/ Sali rempli, perdus tous les deux.
La molécule d'ADN purifiée selon l'invention peut également comprendre la séquence SEQ ID N°2. Plus particulièrement l'invention porte sur la molécule d'ADN purifiée de séquence SEQ ID N°2. La séquence SEQ ID N°2 correspond à la séquence de l' enhancer de 0,9 Kb situé entre -2, 1Kb et -1,2 Kb en amont du CAP site du gène. Elle se trouve dans "insert GMD 134". Dans le plasmide GMD134, déposé le 25 mars 1999 à la CNCM (Institut Pasteur, France) sous le n° I- 2177, cet insert a été clone devant le promoteur de l'actine α- cardiaque. Cette séquence est représentée par la séquence SEQ ID N°2 suivante :
SEQ ID N°2 : Séquence de 1 ' insert GMD 134 (ML634) GGATCCATTCATCTTTAGAAACAATTAGGCCACCTACAGTCCCAGCGCTCAGGAG GTAGAAATTGGGATGTCAGGAGTTCAAGGTCATCTTCTGTTACCCATTTTGTAGG GGGGCTTATCCTGGCCTATATGAATATATCTCAATGATGCCAAAAAAAAAAATAA AACAAAAACTTAAATGATATTTCAAAAAAGGCTATCTGTGAAACTCCATTTAGAT "GGTTTCTGGCCCATTTCTAAATAACCCAGTGACACCACCTCTCCCTTCCAAGGAT GTTCCACGTCTCTGACTTCCACAATTACCACTGAGGATAAATCCTGTTGTGTGCT AGTTACCACTGAACTCTGCTTCATAATCAATAGAACATTGTTGAATGGAGGAATG AATGGTAGTGACCCAATTTTTCCAAACAGAAAGCTAATCCCACCTCTAAAAGTAT CGAATGGTGACAGAGCAGGTTCAGTCTGTCTTGCGTCTGACTTACTTTGCTTGTC TCTTTGTGGGCCAGTCCTCAGTAACTCAATAGAACTGAGTTACTATGCCACTTTT CAGGGGGGTGAAAATGGGGTCTTGATGAGTTAACTGGCCTGCCCGAGACCAAACG TGCGGAACGTAGTTAAGTGTTAGAGGTAGGATTTGAAGCCTGTCGATCATTCTGA TTCTCCTTTTCTCAACGTCTGCTTCCTGTCAATGGGCATCCTCACTGTCAAATGC TACAGCAGGGCTTGGTCTCAGCCAGGCAGGCCTCTCCCCAGTCTCCATGGCTCAG CTGTCCAGCAGTTTCATCCCTAGACCATCCCAAACATGGTTGAGAAGCTCTGAGG GGAGGACCCAGCACTGCCCGGCCCCTGAAGTATCTAATCAGCAGTCCTGCTCAGC ATATCAATCCAAGCCCACTCTAGACAGAGATGCCGGTGCCCAGTTTTCTATTTTT AACTGGTGTGAACTGAAGGAAAAGCACAGCATTAGAAGTCCAAGCACTAGA
Sont indiqués en gras
- le site de clonage 5' BamHl
- le site MEF 2
- le site de clonage 3' Spel/ Xbal perdus
L'invention concerne également une molécule d'ADN purifiée caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule choisie parmi : a) une molécule d'ADN dont la séquence est complémentaire de la séquence de la molécule d'ADN telle que défini ci-dessus, b) une molécule d'ADN dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec une molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, c) une molécule d'ADN hybridant dans des conditions "de forte stringence avec une molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, d) un fragment d'au moins 20 nucléotides consécutifs, de préférence 100 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 210 nucléotides consécutifs d'une molécule d'ADN telle que défini ci-dessus, ledit fragment présentant une activité activatrice de la transcription.
La molécule d'ADN purifiée selon l'invention se caractérise en ce que ladite molécule d'ADN exerce son activité activatrice de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules myocardiques humaines. Dans la présente description, on entendra désigner par molécule d'ADN ou polynucléotide, une molécule d'ADN double brin ou simple brin purifié naturellement, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent être synthétisées par les techniques bien connues de l'homme de l'art décrites dans la littérature scientifique (voir Curruthers et al . , 1982 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47 :411-418 ; Adams et al . , 1983 J. Am. Chem. Soc. 105 : 661) . Les fragments d'ADN double brin peuvent être obtenus soit en synthétisant le brin complémentaire et en hybridant les brins ensemble dans des conditions appropriées ou en polymérisant le brin complémentaire en utilisant une ADN-poly érase avec une "séquence amorce appropriée.
Par molécule d'ADN de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N°l ou N°2 ou d'une partie de la SEQ ID N°l ou N°2 et dont l'orientation est inversée.
Par « pourcentage d' identité » au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de bases identiques entre les molécules d'ADN, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux molécules d'ADN étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Selon l'invention, les molécules d'ADN de séquence nucléique homologue présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80%, de préférence 90%, de manière préférée 95%, de manière encore préférée 97%. Les comparaisons de séquences entre deux
(ou plus) molécules d'ADN sont traditionnellement réalisées en comparant des séquences de deux séquences alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad.App .Math. 2 :482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA "85 : 2444] , au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Il est dans l'étendue de l'invention d'introduire des mutations ou de sélectionner des mutants naturels des molécules d'ADN selon l'invention ; de telles molécules d'ADN de séquences nucléique homologue permettent ainsi de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber l'activité transcriptionnelle. Les hommes de l'art sont à même d'apprécier les différents degrés de stringence employés au cours des réactions d'hybridation ou lors des lavages consécutifs à l'hybridation. Lorsque les conditions d'hybridation deviennent plus stringentes, il existe un plus grand degré de complémentarité entre la sonde et la cible pour que la formation d'un duplexe se réalise. Le degré de stringence peut être contrôlé par la température, par la force ionique, le pH et la présence de solvant partiellement dénaturé tel la formamide. Par exemple, la stringence de l'hybridation est modifiée à façon en changeant la concentration de la formamide dans le milieu réactionnel d'hybridation dans une gamme allant de 0 à 50% de formamide. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucleotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : L'hybridation ADN-ADN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42 °C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC "correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium) , 50% de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5 % de dextran sulfate et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1% SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al . (1989) .
Les technologies de l'ADN recombinant utilisées dans la présente invention font appel à des protocoles et à des techniques bien connus et employés couramment par l'homme de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement d'ADN, l'amplification et la purification. En général, les réactions enzymatiques utilisent l'ADN-ligase, l'ADN- polymérase, les endonucléases de restrictions, les kinases, les phosphatases, et les autres enzymes en accord avec les instructions du fabricant. Ces protocoles et ces techniques sont généralement réalisées selon Sambrook et al . (1989).
La molécule d'ADN exerce son activité stimulatrice "de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules myocardiques humaines.
De préférence, cette molécule est fusionnée à un gène d'intérêt. Le gène d'intérêt peut comprendre un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt.. Par exemple, on peut mettre le gène d' intérêt sous le contrôle du promoteur minimal POX de l'actine α- cardiaque de la séquence SEQ ID N°3 suivante ou d'un segment de cette séquence.
SEQ ID N°3 : Séquence de l' insert GMD 132
TCTAGATGAGCATAGTCCCAGCTCAGGCTAAAGGAGACCAGAAGATGCACTACCC
AGGTGCCCCTTTTGCATCCAGGTACTCAAATATCCTGTCAAGCTGCTCTTTGTGC CTATGACTCTGCTCCTCTGTCTCCCAGTACTGGAAGATGAGAAGCTGCTGTCTGT CCCCTGCAGCCCCAGCCCAGCTGTCAGGACCCTTCTCCAAGGGCAGGGCGCCAAG TCTTCCGGCATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGACTCATTGTCCCTTAGTTTGGAAGGGCTGAAGAGCAATAAGCCCACTCCAC AACTAGGGAGCTCCCCCACCCAAGGGGCGCATTGGCATCACATAGCCTTTCCCCG TCCCCCACCCCTTGCTGGCCTGCCCCTCCCTAGCTCCCTATATGGCCATTGCTCT GACTGCCCCCTCCCCTTCCTTACATGGTCTGGGAGCCCCCTGGCTGATTCAGCGG TCCTAGATGGTGCTAAGGCGACCAAATAAGGCAAGGTGGCAGATCAGGGGCCCCC CACCCCTGCCCCCGGCTGCTCCAACTGACCCCGTCCATCAGAGAGCTATAAAGCT GCGCTCCAGGCGACTGACACCC +1 AGTGCCTGCCACCAGCGCCAGCCCAGCTGAATCCAGCCGCCCCTAGCACGGTGAGTCCCAG CCTTGCTCCCTGCAGGACCTTGTCAGCACTGTGCTTTTGTGCTCTTGGATCC
Sont indiqués en caractères gras : "—le site 5' de clonage Xbal
- la boite TATA soulignée
- le nucléotide d'initiation de la transcription le site 3' de clonage BamHl
Avantageusement, la molécule d'ADN purifiée se caractérise en ce que ledit gène d' intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l' antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
La présente invention concerne également une cassette d'expression comprenant un gène d'intérêt, un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt et qui médie l'expression dudit gène et une molécule d'ADN telle que décrite précédemment capable de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber la transcription en CIS dudit gène dans les cellules du myocarde. Selon un mode préféré de réalisation, la molécule d'ADN selon l'invention augmente la transcription en CIS dudit gène. Selon un autre mode préféré de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur de gène exprimé dans les cellules du myocarde. Selon un autre mode préféré de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine α-cardiaque de la séquence SEQ ID N°3 ou d'un segment de cette séquence. Bien entendu, l'utilisation de promoteur de l'actine α-cardiaque remplissant une fonction équivalente à celle de la SEQ ID N°3 est visée par l'invention. « lié de manière opérationnelle » se réfère au lien fonctionnel entre un promoteur et une seconde séquence d'ADN, qui se caractérise en ce que ledit promoteur initie et contrôle la transcription de la dite séquence d'ADN. Généralement, « lié de manière opérationnelle » signifie que les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës, et lorsqu'il s'agit de joindre deux régions codant pour des protéines, les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës et dans la même phase de lecture. Le gène d'intérêt présent dans la cassette d'expression code en général pour une protéine hétérologue. On entend désigner par « hétérologue » , des acides nucléiques ou des polypeptides qui ont pour origine une espèce étrangère, ou si il proviennent de la même espèce, sont modifiés substantiellement par rapport à leur forme originale. Par exemple, un promoteur lié de manière opérationnelle à un gène hétérologue provient d'une espèce différente de l'espèce dont dérive le gène hétérologue, ou si il provient de la même espèce, il est modifié substantiellement par rapport à sa forme originale.
Le gène d' intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de "cr-oissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l' antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
L' invention concerne un vecteur recombinant de clonage d'une molécule d'ADN selon l'invention et/ou d'expression d'un polypeptide caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide tel que précédemment décrit. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l' electroporation, le choc thermique .
Selon un mode préféré de réalisation, l'invention concerne un vecteur recombinant caractérisé en ce que ledit vecteur est contenu dans une bactérie désignée GMD 132, GMD 133, GMD 134, GMD 137 ou GMD 138 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15 (France) le 25 mars 1999 respectivement sous les numéros : 1-2175. Le plasmide GMD 132 (ML616) contient la région promotrice (-0,65 kb + 0,12 kb) du gène de la souris codant pour l'actine α-cardiaque, clonée dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de puclδ modifié, conférant la résistance à l' ampicilline . Ce plasmide est utilisé comme référence pour tester en culture de cardiocytes primaires l'activité enhancer de différentes régions 5' du gène de l'actine α cardiaque de souris.
1-2176. Le plasmide GMD 133 (ML643) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine α cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de puclδ modifié, conférant la résistance à l' ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb)
. la séquence enhancer (0,21 kb) située à environ - 1,4 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice. Cette séquence augmente la transcription (x 10 à 20) spécifiquement dans les cultures de cardiocytes primaires embryonnaires de rats, pas dans les cultures de cellules myogé iques squelettiques ou de fibroblastes .
1-2177. Le plasmide GMD 134 (ML634) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine α cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de puclδ modifié, conférant la résistance à 1' ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb) . la séquence enhancer (0,98 kb) située entre - 1 kb et
- 2 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice.
Dans des cultures primaires de cardiocytes "embryonnaires de rats, cette région augmente spécifiquement la transcription (x 10 à 20). Il n'y a pas d' augmentation de la transcription dans des cultures de cellules myogéniques squelettiques ou de fibroblastes .
1-2178. Le plasmide GMD 137 (ML648) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine α cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de puclδ modifié, conférant la résistance à l' ampicilline :
. la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb)
. la séquence enhancer (0,98 kb) située entre - 1 kb et
- 2 kb du site d' initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice, dans laquelle le site MEF2 a été muté et remplacé par un site Smal .
Dans des cultures primaires de cardiocytes embryonnaires de rats, cette séquence avec le site MEF2 muté ne stimule pas la transcription. La séquence partielle antisens avec l'amorce "-20" de la mutation du site MEF2 (caractères gras) présente dans GMD 137 et GMD 138 est représentée par la séquence SEQ ID N°4 suivante :
SEQ ID N°4 A/CTAGTGCTTGGACTTCTAATGCTGTGCTTTTCCTTCAGTTCACACCAGTccc gggTaGAAAACTGGGCACCGGCATCTCTGTCTAGAGTGGGCTTGGATTGATATG CTGAGCAGGACTGCTGATTAGATACTTCAGGGGCCGGGCAGTGCTGGGTCCTCC CCTCAGAGCTTCTCAACCATGTTTGGGATGGTCTACGGATGAAACTGCTGGACA "GGTGAGCCATGGA
1-2179. Le plasmide GMD 138 (ML679) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine α cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de puclδ modifié, conférant la résistance à l' ampicilline :
. la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb) . la séquence enhancer (0,21 kb) située à environ - 1,4 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice, dans laquelle le site MEF2 a été muté et remplacé par un site Smal. Dans des cultures primaires de cardiocytes embryonnaires de rats, cette séquence avec le site MEF2 muté ne stimule pas la transcription.
Le vecteur de clonage selon l'invention est utile pour transformer des cellules hôtes afin de cloner les séquences nucléotidiques de l'invention.
Le vecteur recombinant d'expression selon l'invention est caractérisé en ce qu'il contient un cassette d'expression selon l'invention. Le vecteur selon l'invention comporte en outre les éléments permettant la sécrétion du produit d'expression codé par ledit gène d'intérêt hors de la cellule hôte. Par « vecteur d'expression », on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs "d^expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l' adénovirus, du virus associé à l'adénovirus (AAV) , de rétrovirus, des lentivirus, les virus dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpès pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, ouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préféré les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines. L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne la cellule hôte telle que déposée a la CNCM sous les numéros 1-2175, 12176, 1-2177, 1-2178 et 1-2179. " - De préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères. Selon un mode préfère, la cellule hôte est une cellule du myocarde. De préférence, la cellule hôte est une cellule myocardique de souris, et de manière plus préférée une cellule myocardique humaine. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucleotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucleotidique transfectee.
L'invention s'applique également aux cellules qui doivent être modifiées à des fins de thérapie génique ou aux cellules embryonnaires souches (cellules ES) modifiées pour créer un animal transgénique ou un animal dont l'une de ces cellules a subi un événement de recombinaison homologue. Il est donc dans l'étendue de l'invention de fournir un animal, comprenant au moins une cellule selon l'invention. De tels animaux transgéniques peuvent être obtenus, par exemple, en injectant une molécule d'ADN, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention dans un œuf fertilise que l'on laisse se développer jusqu'à l'âge adulte tel que décrit par Brinster et al . (1985) [PNAS, USA 82 :4438-4442). De préférence, l'animal selon l'invention est mammifère, choisi parmi le groupe composé de souris, rat, hamster, cochon, bovin, ovin, caprin.
L'invention concerne également l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant qu'amorce pour 1 ^amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques et/ou en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
La molécule d'ADN selon l'invention est utilisée en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques ; l'invention porte également sur l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques. Selon l'invention, les fragments de molécule d'ADN pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases. Selon un mode de réalisation de l'invention, la molécule d'ADN selon l'invention est ou non marquée, directement ou indirectement, par un composé radioactif ou un composé non radioactif. En général, la molécule d'ADN est marquée pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications connues de l'homme de l'art. Le marquage des amorces, des sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives ; parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents "radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
La molécule d'ADN selon l'invention peut ainsi être utilisée comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en œuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich (1989) ; Innis et al . (1990), et Rolfs et al . (1991)). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d' agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. L' invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d' être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide "nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription inverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al . , 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al . en 1989, la technique 3SR (Self-Sustamed Séquence Replication) décrite par Guatelli et al . en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al . en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification) , la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al . en 1988 et perfectionnée par Barany et al . en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al . en 1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al . en 1983 et "perfectionnée notamment par Chu et al . en 1986 et Lizardi et al . en 1988, puis par Burg et al . (1996) ainsi que par Stone et al . (1996) .
L'invention porte sur l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant que séquence stimulatrice (« enhancer ») de la transcription ; cette utilisation se fait de préférence dans les cellules du myocarde. L'invention concerne également l'utilisation de molécule d'ADN homologue dans lesquelles existent de manière naturelle ou non des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus nucléotidiques. Les molécules d'ADN homologues selon l'invention peuvent ainsi avoir une activité stimulatrice (« enhancer ») de la transcription mais elle peuvent avoir une activité qui module, diminue ou inhibe la transcription.
L' invention concerne également un procède de criblage de ligand susceptible de medier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription de la molécule d'ADN selon l'invention, ledit procédé comportant les étapes de (î) mise en contact de la cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention et dudit ligand en présence de reactifs nécessaires a la mise en œuvre d'une reaction de transcription, puis (n) de détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle . L'invention concerne également un nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN et/ou une cassette d'expression et/ou un vecteur et/ou une cellule selon l'invention, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription. L'invention concerne également le ligand obtenu par le procédé ou avec le nécessaire précédemment décrit. Par ligand, on entend définir tous les composés susceptibles d' interagir avec la molécule d'ADN selon l'invention pour former un complexe susceptible d'affecter l'activité transcriptionnelle, c'est-à-dire d'augmenter, de diminuer, de moduler ou d'inhiber la transcription d'un gène. Le ligand selon l'invention est caractérisé en ce qu' il est capable de se lier à une séquence d'ADN et en ce qu'il est comporte au moins un des motifs protéiques connus susceptibles d' interagir avec l'ADN, par exemple la structure en doigt de gant à laquelle est associée un atome de zinc (« zinc-finger ») , la structure hélice-tour-hélice, la structure hélice-boucle-hélice et la fermeture éclair à leucines (« leucine-zipper ») .
Le ligand peut exercer son action sous la forme d'un monomère ou en s' associant à d'autres monomères ou polypeptides par des interactions protéine-protéine. Ainsi, le ligand selon l'invention peut se dimériser pour former des homodimères ou des hétérodimeres, ou s'associer sous la forme d' homomultimères ou d' hétéromultimères . Le polypeptide selon l'invention peut également interagir avec un autre polypeptide pour exercer son action ; ainsi, le polypeptide selon "1'-invention peut posséder, en plus de son domaine de liaison a l'ADN, un domaine d'action sur la transcription qui exerce son action via des interactions protéine-protéine avec d' autres composants protéique de la machinerie transcriptionnelle. On entend designer par composant protéique de la machinerie transcriptionnelle tous les facteurs de transcription nécessaires à la réalisation et a la régulation de la réaction de transcription.
Les protéines MEF-2 ainsi que ces co-activateurs constituent des ligands selon l'invention. De même, les facteurs de transcription qui se lient au niveau de séquences ou boîtes régulatrices de la transcription constituent des ligands selon l'invention. Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui permettent aisément d'identifier les séquences ou boites régulatrices promotrices nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique et au niveau desquelles se lient les ligands ou facteurs de transcription selon l'invention ; les facteurs MEF2 en sont des exemples.
Les ligands et plus particulièrement les facteurs de transcription se liant a la séquence activatrice constituent donc des cibles moléculaires pour contrôler le taux d'expression de l'actine α-cardiaque ou d'un gène hétérologue sous le contrôle d'une séquence promotrice comportant au moins la séquence activatrice selon l'invention, tel que une séquence promotrice du gène de l'actine α-cardiaque. En intervenant sur ces facteurs, il est possible dTienvisager de contrôler l'expression du gène dans le cœur.
L' invention concerne donc un composé à titre de médicament caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe composé d'une molécule d'ADN, d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une cellule hôte et d'un ligand selon l'invention. Plus particulièrement, le composé selon l'invention est utilisé à titre de médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies cardiaques. Le composé selon l'invention est utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à médier, à moduler, à augmenter, à diminuer ou à inhiber l'expression d'un gène d'intérêt, notamment dans une cellule du myocarde.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.
Légendes
Figure 1 : Profil d'expression des différentes constructions dérivées du gène de l'actine α-cardiaqrue .
Les flèches vers le bas représentent les sites d'hypersensibilité à la DNAse. Figure 2 : Localisation de l'activité enhancer spécifique du tissu cardiaque.
Des fragments du génome de la souris situés en amont du promoteur de l'actine α-cardiaque sont matérialisés dans la figure par des lignes noires devant le promoteur. Ce sont les plasmides GMD 134
(enhancer de 0,9 Kb, fragment se situant environ de -
2,1 Kb à -1,2 Kb) et GMD 133 (enhancer de 0,2 Kb,
(220nt) ) . Ces fragments mutés ont été également clones dans le plasmide GMD 132 et la mutation est indiquée par une croix sur le fragment d'ADN dans la figure. Ce sont les plasmides GMD 137 et GMD 138 (qui sont les formes mutées respectives de GMD 134 et GMD 133) . Les activités CAT corrigées sont exprimées par rapport l'activité CAT de la construction portant le promoteur seul ramenée à 1 pour chaque tissu.
L'activité CAT est représentée en noir pour les cardiocytes, en gris pour les fibroblastes et avec des rayures noires pour les cellules C2.
Figure 3 : Spécificité tissulaire du site MEF2 de l'actine α-cardiaque.
Trois constructions correspondant respectivement au plasmide tkCAT, au plasmide (mef2 ) 4-tkCAT, et au plasmide (mef2) 3-tkCAT ont été transfectées dans des cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats, dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier in vi tro, et dans des cultures de cellules non musculaires. Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la "construction contenant le seul promoteur. Sur le schéma, les activités CAT corrigées sont exprimées par rapport l'activité CAT de la construction tkCAT seul ramenée à 1 pour chaque tissu. L'activité CAT est représentée en noir pour les cardiocytes, en gris pour les fibroblastes et avec des rayures noires pour les cellules C2.
Figure 4 : Expériences de gel retard avec des extraits nucléaires de cellules ou de muscle squelettique ou cardiaque.
Figure 5 : Schéma de la partie 5' du gène de l'actine cardiaque.
La région du génome de souris entourant le site d'initiation de la transcription du gène de l'actine cardiaque est représentée sous forme d'un schéma:
- les exons 1 et 2 sont matérialisés par deux boites grisées (exl et ex 2) ;
- le site d'initiation de la traduction est identifié (ATG) ;
- le site d'initiation de la transcription est représenté par une flèche brisée ;
- les boîtes A, B, et C représentent les trois régions conservées entre le génome de souris et celui de l'homme. La figure n'est pas à l'échelle.
Figure 6 : Matrice d' homologie entre la région A et le contig humain . " -. Création d'une matrice d'homologie entre la séquence région A et le contig humain extrait des banques de données comprenant le gène de l'actine cardiaque humaine.
Programme DNA matrix, stringence 13 nt, fenêtre 15 nt . Le contig humain linéaire est en abscisse
(8410 pb) : TAG ATG GCT ACA...TTC CCT CCC TTT ; la séquence murine linéaire est en ordonnée (79δ pb) : AGA
TCT CAG TGT...TGG TTC AGA TCT .
Figure 7 : Matrice d'homologie entre la région B et le contig humain.
Création d'une matrice d'homologie entre la séquence région B et le contig humain extrait des banques de données comprenant le gène de l'actine cardiaque humaine.
Programme DNA matrix ; stringence 13 nt ; fenêtre
15 nt . Le contig humain linéaire est en abscisse
(6410 pb) : TAG ATG GCT ACA...TTC CCT CCC TTT ; la séquence murine linéaire est en ordonnée (1623 pb) : AAG CTT AGT GAC...TTC GCA TAG ATC .
Figure 8 : Matrice d'homologie entre la région C et le contig humain.
Création d'une matrice d'homologie entre la séquence région C et le contig humain extrait des banques de données comprenant le gène de l'actine cardiaque humaine.
Programme DNA matrix, stringence 13 nt ; fenêtre
15 nt. Le contig humain linéaire est en abscisse (8410 "pb) : TAG ATG GCT ACA...TTC CCT CCC TTT ; la séquence murine linéaire est en ordonnée (2447 pb) : GGA TCC ATT
CAT...GCT CTT GGA TCC.
Figure 9 : Alignement de la région A et du contig humain.
L'alignement a été réalisé entre la région A de souris (en majuscules) (798 pb) le long du contig humain (en minuscules) (8410 pb) grâce au programme DNA alignment : méthode des blocs (Martinez) , avec affichage standard ; mismatch penalty : smaller ; gap penalty : médium) disponible dans DNA Strider. Le pourcentage d'identité est de 432/8546, soit 5,1%.
Figure 10 : Alignement de la région B et du contig humain.
L' alignement a été réalisé entre la région B de souris (ligne du bas) (1823 pb) le long du contig humain (8410 pb) (ligne du haut) grâce au programme DNA alignment : méthode des blocs (Martinez), avec affichage standard ; mismatch penalty : smaller ; gap penalty : médium) disponible dans DNA Strider. Le pourcentage d'identité est de 1050/8752, soit 12%. Figure 11 : Alignement de la région C et du contig humain.
L'alignement a été réalisé entre la région C de souris (2447 pb) (en majuscules) le long du contig "humain (6410 pb) (en minuscules) grâce au programme DNA alignment : méthode des blocs (Martinez) , avec affichage standard ; mismatch penalty : smaller ; gap penalty : médium) disponible dans DNA Strider. Le pourcentage d'identité est de 1345/9091, soit 14,8%.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction des plasmides et localisation de l'activité enhancer spécifique du tissu cardiaque.
Le promoteur de l'actine α-cardiaque de souris a été clone dans un plasmide appelé pBLCATβ contenant le gène CAT codant pour la chloramphenicol-acetyl- transferase bactérienne : cette construction est GMD 132.
Des fragments du génome de la souris situés en amont du promoteur de l'actine α-cardiaque ont alors été clones dans ce plasmide GMD 132. Les clonages ont été faits en profitant de sites de restriction naturels et les techniques utilisées sont référencées dans le livre de protocoles de Sambrook et al . auquel il est fait référence par ailleurs). Ces fragments sont matérialisés dans la figure par des lignes noires devant le promoteur Ce sont les plasmides GMD 134 (enhancer de 0,9 Kb, fragment se situant environ de - 2,1 Kb à -1,2 Kb) et GMD 133 (enhancer de 0,2 Kb) .
Ces fragments contenant des séquences d'ADN susceptibles de fixer des protéines nucléaires, ces "séquences ont été mutées grâce à des kits commerciaux (gène editod, Promega)et les fragments ainsi modifiés ont été également clones dans le plasmide GMD 132 et la mutation est indiquée par une croix sur le fragment d'ADN dans la figure. Ce sont les plasmides GMD 137 et GMD 138 (qui sont les formes mutées respectives de GMD 134 et GMD 133) .
Le gène CAT a été mis sous le contrôle du promoteur minimum de l'actine α-cardiaque
(construction POX) et des séquences variables situées entre -5,3 Kb et -0.7 Kb ont été testées pour leur capacités d1 enhancer par rapport à la construction POX témoin.
Des cultures de cardiocytes primaires de cœur de ratons embryonnaires ont été mises au point dans le laboratoire, pour rechercher les régions actives dans le cœ r. Les constructions indiquées ci-dessus ont été transfectées dans les cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats , dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier m vitro, et dans des cultures de cellules non musculaires par le procédé au phosphate de Calcium. Un plasmide contenant le gène rapporteur Luciférase sous le contrôle du promoteur RSV a été ajouté dans chaque réaction pour servir d'indicateur d'efficacité de transfection. Après incubation, les cellules sont rincées, récoltées et les extraits cellulaires ont été obtenus après lyse cellulaire par trois cycles de congélation-décongélation brutale et centrifugation. -- Les activités enzymatiques sont alors dosées dans les extraits : l'activité luciférase est dosée par luminescence et l'activité CAT est dosée après incubation d'une aliquote de l'extrait cellulaire en présence de chloramphenicol radiomarque, extraction et dosage de la radioactivité incorporée) . Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la construction contenant le seul promoteur. Les résultats de la figure 2 illustrent une forte activité CAT dans les cardiocytes pour l' enhancer 0.2 Kb (région minimum) et 0,9 Kb. Les résultats obtenus en culture de cellules C2 ont montré que les régions activatrices ainsi délimitées étaient constituées d'éléments composites dont aucun n'est déterminant à lui seul.
Exemple 2 : ex vivo par transfection de cellules non myogéniques, myogéniques et cardiaques
Une séquence de 0,9 kb (-2,1, -1,2 kb) en amont du promoteur a une action d' enhancer exclusivement cardiaque sur le promoteur POX (x 21 dans les cardiocytes, pas d'augmentation dans les fibroblastes ou cellules C2) . Cette région peut être réduite a 200nt devant le promoteur POX (200-POX) et retient une grande partie de l'activité du fragment de 2 kb.
Cette séquence contient deux sites qui sont "susceptibles de fixer des facteurs de transcription présents dans le cœur : un site MEF2 et un site GATA. La mutation du site GATA a peu d'effet sur l'activité enhancer. Au contraire, le site de fixation des protéines MEF2 est responsable de l'activité puisque sa mutation entraîne 1 ' inactivation de l' enhancer. Ces résultats sont rassemblés dans la figure 2. Ces plasmides ont été séquences et déposes dans la collection Pasteur.
Une construction dans laquelle ce site MEF2 multimerise se trouve devant POX (mef2x4-POX) présente également une spécificité cardiaque (figure 3) .
Des expériences de transactivation de la construction multimerisée (mef2x4-POX) et de la construction (200nt-POX) par différentes isoformes de MEF2 ont ete faites dans des fibroblastes pour déterminer si l'expression forcée des protéines MEF2 dans des cellules naïves serait capable d'activer la transcription de ces deux constructions. Aucune transactivation n'a ete observée : ceci pouvait être lie a l'absence d'un ou de plusieurs cofacteurs agissant en synergie avec les protéines MEF2.
Nous avons donc réalise des expériences de transactivation dans les cellules musculaires C2 avec la construction (mef2 x4-POX) , les protéines MEF2 étant également impliquées dans l' activation des gènes au cours de la myogenèse squelettique. Il n'a pas été possible d'observer de transactivation : ceci suggère qu'il puisse exister un cofacteur spécifique cardiaque nécessaire à l'activité de MEF2 .Des expériences de transactivation dans les cellules cardiaques sont en cours pour répondre à cette question.
Exemple 3 : Spécificité tissulaire du site MEF2 de 1' actine α-cardiaque .
Deux oligonucléotides complémentaires ont été synthétisés. La partie centrale reproduit le site MEF 2 de la région enhancer dont l'importance de l'intégrité a été montrée dans la figure 2. Par ailleurs, des séquences permettant le clonage directionnel de 1 Oligonucléotide double brin dans un site Sfil ont été rajoutées en 3 ' de chaque oligo.
Séquences des oligonucléotides natifs Sens 5' cagttttctatttttaactggtgtgggg (SEQ ID
N°5)
Antisens 5' cacaccagttaaaaatagaaaactgccc (SEQ ID N°6) Le site MEF2 est indiqué en caractères gras. Les nucléotides permettant le clonage sont en italiques.
Deux oligonucléotides équivalents dans lesquels le site MEF 2 a subi une mutation identique à celle utilisée au cours des transfections ont également été synthétisés avec des extrémités permettant leur clonage.
Séquences des oligonucléotides mutés 3ens 5' cagttttctacccgggactggtgtgggg (SEQ ID
N°7)
Antisens 5' cacaccagtcccgggtagaaaactgccc (SEQ ID N°8) La mutation est indiquée en caractères gras . Les nucléotides permettant le clonage sont en italiques.
Après annellation, ces oligonucléotides ont été clones au site Sfil introduit par Frédéric Relaix dans le linker situé en amont du promoteur tk dans le plasmide tkCAT. (Dans le plasmide tkCAT, le promoteur du gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès dirige la transcription du gène CAT mentionné plus haut) . La séquence des plasmides recombinants a été vérifiée et nous avons gardé les plasmide (mef2)4- tkCAT et (mef2muté) 3-tkCAT dans lesquels 4 motifs natifs mef2 et 3 motifs mutés ont été clones en tandem dans tkCAT.
Trois constructions correspondant respectivement au plasmide tkCAT, au plasmide (mef2 ) -tkCAT, et au plasmide (mef2) 3-tkCAT ont été transfectées dans des cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats, dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier in vitro, et dans des cultures de cellules non musculaires par le procédé au phosphate de Calcium. Un plasmide contenant le gène rapporteur Luciférase sous le contrôle du promoteur RSV a été ajouté dans chaque réaction pour servir d'indicateur d'efficacité de transfection.
Après incubation, les cellules sont rincées, récoltées et les extraits cellulaires ont été obtenus "après lyse cellulaire par trois cycles de congélation- décongélation brutale et centrifugation.
Les activités enzymatiques sont alors dosées dans les extraits : l'activité luciférase est dosée par luminescence et l'activité CAT est dosée après incubation d'une aliquote de l'extrait cellulaire en présence de chloramphenicol radiomarque, extraction et dosage de la radioactivité incorporée) . Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la construction contenant le seul promoteur. Les résultats sont présentés à la figure 3 et montrent une forte activité CAT pour MEF2 (non muté) .
Exemple 4 : Expériences in vitro de retard sur gel avec des extraits nucléaires de cellules ou de muscle squelettique ou cardiaque. Un oligonucléotide contenant le site liant les protéines MEF2 forme un complexe avec les extraits nucléaires de cœur adulte que ne forme pas l'oligo dont la séquence est mutée. Ce complexe est aboli par compétition avec un oligonucléotide contenant la séquence consensus MEF2. La séquence de l'actine α- cardiaque semble avoir plus d'affinité lors de la formation du complexe que 1 ' oligonucléotide consensus MEF2 lui-même (figure 4).
-Exemple 5 : Expériences in vivo par transgenèse
Dans les cœurs des animaux d'une des deux lignées analysées exprimant le transgène, le fragment de 2 kb a le même patron d'expression que le transgène -9 kb α-cardiaque actine nLacZ de C. Biben : forte expression dans le cœur embryonnaire et dans le cœur adulte, avec un marquage très intense dans le ventricule gauche, faible et punctiforme dans le ventricule droit, de même que dans les lignées de C. Biben. Les différences observées concernent l'absence d'expression dans certains muscles squelettiques. L'absence de l' enhancer squelettique distal et de la partie "squelettique" de 1 ' enhancer cardiaque dans notre construction est vraisemblablement a l'origine de ces différences. Cette lignée pourrait être utile pour cartographier les modules activant l'actine cardiaque dans différents types de muscles.
Dans l' enhancer cardiaque, situe a environ 1Kb du CAP site du gène de l'actine α-cardiaque, que nous avons caractérisé, un site MEF2 joue un rôle important. Ceci est en accord avec l'observation chez les souris MEF2C-/- d'une diminution severe de l'expression de l'actine cardiaque, (Oison et al . ) . En ce qui concerne les éléments qui assurent l'expression de l'α-actine cardiaque au cours du développement, l'ensemble des résultats obtenus en culture de cellules et en transgenèse suggèrent que quatre régions sont impliquées dans l'expression du gène au cours du développement :
- le promoteur proximal qui à lui seul peut assurer l' activation du gène dans les muscles squelettiques et le cœur, mais pas le maintien de l'expression dans le cœur adulte, ce promoteur est peu efficace in vivo : seulement deux lignées sur sept expriment le transgène ; la molécule d'ADN selon l'invention, qui peut assurer le maintien de l'expression dans le cœur chez l'embryon et l'adulte, à un niveau élevé, et dont l'utilisation en thérapie génique pourrait être envisagée ;
- un élément distal qui est actif dans des cultures de cellules myogéniques squelettiques, et qui participe à l'expression du gène de l'actine α-cardiaque dans les muscles squelettiques embryonnaires et dans certaines fibres des muscles squelettiques de l'adulte, cet élément aurait des propriétés de LCR et isole les séquences génomiques qu'il délimite des séquences environnantes.
Exemple 6 : Homologies de séquences entre les séquences murines et humaines . La publication de grands contigs du génome humain a permis d'aborder la signification possible des séquences régulatrices du gène de l'actine α-cardiaque en comparant les séquences amont du gène de l'actine cardiaque de la souris et de l'homme. Les inventeurs ont ainsi découvert l'existence de régions très conservées, dont une correspondant à la séquence faisant l'objet du brevet. Ces régions conservées correspondent effectivement à des séquences qui ont montré une activation de la transcription chez la souris .
La figure 5 schématise le gène de l'actine cardiaque avec trois régions A (SEQ ID N° 9) , B (SEQ ID N° 10) et C (SEQ ID N° 11), démarrant respectivement à environ -7Kb, -5Kb, et -2Kb du site d'initiation de la transcription du gène.
La recherche d'homologies entre les séquences de souris et les séquences correspondantes chez l'homme ont été faites avec deux types de programme fournis dans le logiciel d'analyse de séquence DNA Strider™ 1.3f8 (a C++ software for DNA and protein séquence analysis) créé par Christian Mack, Bâtiment 142, CEA Saclay, F-91191 Gif-sur-Yvette Cedex. Deux séries d'analyse ont été faites. Les premières analyses ont constitué en la création de matrices d'homologie avec chacune des régions A (SEQ ID N° 9), B (SEQ ID N° 10) et C (SEQ ID N° 11), séquencées au laboratoire, et un contig humain de 9Kb extrait des banques de données (SEQ ID N° 12) . Ce contig a été sélectionné grâce aux séquences promotrices du gène de l'actine cardiaque humaine qui ont été publiées (Minty et Kedes (1986) . Ces matrices ont été réalisées en utilisant le programme DNA Matrix (DNA StriderT)M 1.3f8), les spécifications étant une st-ringence de 13 nucléotides pour une fenêtre de 15 nucléotides .
Dans ce programme qui donne une information globale, les régions conservées sont matérialisées par des traits. Le contig humain apparaît en abscisse, les séquences souris sont en ordonnées. Le cap site du gène se situe à la position 7853 du contig.
Dans la figure 6, la région de conservation entre les séquences humaines et de souris concerne une séquence active dans les cultures de myoblastes squelettiques différenciés et dans les muscles squelettiques de l'embryon. Ces résultats ont été précédemment publiés (Biben et al . (1996)). Ces régions n'ont pas d'activité dans les cardiocytes en culture, ni dans le muscle cardiaque adulte. Dans la figure 7, la région conservée correspond à une région qui a une activité transcriptionnelle dans les cultures de myoblastes squelettiques différenciés, (Biben et al . (1994)) et dans les cardiocytes en culture (Marguerite Lemonnier, observation personnelle) . Cette région est localisée entre 4 et 5Kb en amont du promoteur de l'actine cardiaque de souris et était incluse dans la séquence de -5kb qui active la transcription d'un transgène dans le cœur adulte (Biben et al . (1996) ) . Dans la figure 8, deux régions sont homologues dont l'une correspond aux régions promotrices dont la conservation était connue depuis plusieurs années (Minty et Kedes (1986)), et l'autre correspond à la séquence polynucleotidique de la présente invention et qui contient le site MEF2 et la région environnante.
Il faut signaler que l'établissement de matrices d'ADN antisens ne donne aucun alignement entre les séquences humaine et de souris, de même qu'un alignement de l'une ou l'aurre des séquences de souris avec une quelconque séquence humaine.
Exemple 7 : Localisation des homologies de séquences entre les séquences muπnes et humaines .
Le deuxième type d'analyse a consisté à localiser plus finement ces régions d'homologie au niveau nucleotidique. Le programme utilise a été DNA alignment qui fait appel à la méthode des blocs (Martinez) , avec affichage standard, mismatch penalty : smaller, gap penalty : médium) fourni également par DNA Strider.
La figure 9 montre l'alignement (en majuscules) de la région A de souris (SEQ ID N° 9) le long du contig humain (en minuscules) (SEQ ID N° 12) et la région d'homologie entre la séquence humaine (du nt 795 jusqu'au nt 1048) et la séquence souris. Cette région contient la boîte E îv dont le rôle a été montre sur 1' activation de la transcription (Biben et al . (1994)). L'alignement de la séquence humaine déletee de cette région d'homologie avec la même séquence de souris A ne montre aucun alignement significatif.
La figure 10 montre l'alignement de la séquence B (SEQ ID N° 10) avec le contig humain (SEQ ID N° 12) . La égion d'homologie située entre les nt 3645 et 4080 de la séquence humaine correspond à une région dans laquelle ont été trouvées des activités d' activation transcriptionnelle par rapport au promoteur de l'actine cardiaque et par rapport au promoteur TK dans les cultures de myoblastes squelettiques différenciés (Biben et al . (1994)) et de cardiocytes (M Lemonnier, résultats personnels) .
La figure 11 montre l'alignement de la région C (SEQ ID N° 11) avec le contig humain (SEQ ID N° 12) . Les régions d'homologie trouvées concernent d'une part les régions promotrices (séquence humaine nt 7658- 7840) pour lesquelles ces données étaient déjà connues : conservation de la boite E, des boîtes CarG (Minty et Kedes (1986)). L'autre région d'homologie est une région (séquence humaine nt 6368 à 6558) qui se trouve dans les séquences déposées auprès de la CNCM : 1-2176 et 1-2177 objet de la présente invention. Cette séquence contient entre autres un site MEF2, dont la mutation abolit l'activité transcriptionnelle en cultures de cardiocytes.
L'existence de régions d'ADN très conservées entre deux séquences d'espèces différentes peut avoir plusieurs significations, la présence d' exons ou la présence de séquences régulatrices au sens large du terme : - Les trois régions A, B, et la partie 5' de la région C nouvellement reconnues comme conservées sont situées sur le même brin d'ADN. Cependant les résultats des essais de recherche de phase ouverte de lecture et là delétion d'un nucleotide à quelques endroits de ces régions homologues semblent favoriser l'hypothèse qu'il ne s'agit pas de séquences codantes.
- Ces mêmes séquences possèdent une capacité d'activer la transcription chez la souris, et du fait de la conservation des facteurs de régulation de la transcription entre les Mammifères pourraient avoir les mêmes propriétés chez l'homme. De telles conservation de séquences régulatrices ont été trouvées dans d'autres gènes par exemple le gène MCK (Yi TM. et al . (1991) ) .
Les éléments ainsi réunis suggèrent que ces séquences homologues sont plutôt des éléments de régulation. Il faut noter également que leur distance par rapport aux régions promotrices sont très conservées. Enfin, ces séquences régulatrices contribuent à réguler la transcription du gène de l'actine cardiaque chez la souris : or, l'intérêt de ce gène est qu' il reste exprimé dans tous les compartiments du cœur adulte, à l'inverse d'autres gènes dont l'expression se restreint à des compartiments spécifiques au cours du développement. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule d'ADN purifiée activatrice de la transcription (« enhancer ») de la région 5' amont -= du locus du gène de l'actine α-cardiaque murine, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN est purifiée d'un fragment d'ADN situé dans une région comprise entre -5,3 kb et -0,7 kb en amont du CAP site du gène de l'actine α-cardiaque murine et caractérisé en ce que ladite molécule comprend la séquence SEQ ID N°l.
2. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 1 de séquence SEQ ID N°l.
3. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 1 comprenant la séquence SEQ ID N°2.
4. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 3 de séquence SEQ ID N°2.
5. Molécule d'ADN purifiée caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule choisie parmi : a) une molécule d'ADN dont la séquence est complémentaire de la séquence de la molécule d'ADN selon les revendications 1 à 4, b) une molécule d'ADN dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec une molécule d'ADN définie en a) ou selon les revendications 1 à 4, c) un fragment d'au moins 100 nucléotides consécutifs, d'une molécule d'ADN défini en a) ou selon les revendications 1 à 4, ou un fragment homologue dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec ledit fragment, ledit fragment présentant une activité stimulatrice de la transcription.
6. Molécule d'ADN purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN exerce son activité stimulatrice de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules myocardiques humaines.
7. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 1 à 6 fusionnée à un gène d'intérêt.
8. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 7 caractérisée en ce que le gène d'intérêt comprend un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d' intérêt .
9. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 7 à 8 ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine α-cardiaque de la séquence SEQ ID N°3.
10. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l' antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
11. Cassette d'expression comprenant : - un gène d'intérêt ;
- un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt et qui médie l'expression dudit gène ;
- une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 capable de moduler, d'augmenter ou de diminuer la transcription dudit gène en CIS dans les cellules du myocarde.
12. Cassette d'expression selon la revendication 11 caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur de gène exprime dans les cellules du myocarde.
13. Cassette d'expression selon la revendication 12 caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine α-cardiaque de la séquence SEQ ID N°3.
14. Cassette d'expression selon l'une des revendications 11 a 13 caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l' antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs " -.inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
15. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
16. Vecteur recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit vecteur est contenu dans une bactérie désignée GMD 132, GMD 133, GMD 134, GMD 137 ou GMD 136 telle que déposée à la CNCM respectivement sous les numéros 1-2175, 12176, I- 2177, 1-2176 et 1-2179.
17. Vecteur recombinant d'expression caractérise en ce qu'il contient un cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 11 a 14.
18. Vecteur selon la revendication 15 caractérise en ce qu' il comporte en outre les éléments permettant la sécrétion du produit d'expression code par ledit gène d'intérêt hors de la cellule hôte.
19. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 14 ou un vecteur selon l'une des revendications 15 à 18.
20. Cellule hôte telle que déposée à la CNCM sous les numéros 1-2175, 12176, 1-2177, 1-2178 et 1-2179.
21. Animal comprenant au moins une cellule selon l'une " --des revendications 19 ou 20.
22. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 5 en tant qu' amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
23. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 5 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
24. Utilisation in vi tro d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en tant que séquence stimulatrice (« enhancer ») de la transcription.
25. Utilisation selon la revendication 24 caractérisée en ce que ladite utilisation se fait dans les cellules du myocarde .
26. Procédé de criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription de la molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit procédé comportant les étapes suivantes : a) mise en contact de la cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 14 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 15 à 18 et dudit ligand en présence de réactifs nécessaires à la mise Λ "-en œuvre d'une réaction de transcription; b) détection et/ou mesure de l'activité transcriptionnelle .
27. Nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription selon la revendication 26 caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : une molécule d'ADN selon l'une des revendications 1 à 6 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 14 et/ou un vecteur selon l'une des revendications 15 à 18 et/ou une cellule selon l'une des revendications 19 et 20, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription.
28. Ligand obtenu par le procédé selon la revendication 26 ou avec le nécessaire de la revendication 27.
29. Composé à titre de médicament caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe composé de : une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 ; un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 ; - " une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 et 20 ; un ligand selon la revendication 28.
30. Composé selon la revendication 29 à titre de médicament destiné au traitement et/ou la prévention des maladies cardiaques.
31. Utilisation d'un composé selon la revendication 29 pour la préparation d'un médicament destiné à médier, à moduler, à augmenter ou à diminuer l'expression d'un gène d'intérêt.
32. Utilisation d'un composé selon la revendication 29 pour la préparation d'un médicament destiné à médier, à moduler, à augmenter, ou à diminuer l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule du myocarde.
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