EP1194591A2 - Verfahren und kit zur bestimmung von dna-doppel-/einzelstrangbrüchen und vorrichtung zum kontrollierten filtrieren von insbesondere dna-molekülen mit well-filterplatten - Google Patents

Verfahren und kit zur bestimmung von dna-doppel-/einzelstrangbrüchen und vorrichtung zum kontrollierten filtrieren von insbesondere dna-molekülen mit well-filterplatten

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Publication number
EP1194591A2
EP1194591A2 EP00949369A EP00949369A EP1194591A2 EP 1194591 A2 EP1194591 A2 EP 1194591A2 EP 00949369 A EP00949369 A EP 00949369A EP 00949369 A EP00949369 A EP 00949369A EP 1194591 A2 EP1194591 A2 EP 1194591A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
substance
lysis
strand breaks
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00949369A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner E. G. MÜLLER
Heinz C. SCHRÖDER
Renato Batel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Schroder Heinz C
Original Assignee
Schroder Heinz C
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schroder Heinz C filed Critical Schroder Heinz C
Publication of EP1194591A2 publication Critical patent/EP1194591A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B01L3/50255—Multi-well filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Definitions

  • the invention relates generally to Methods and kits for determining DNA double or single strand breaks.
  • the invention relates in particular to a method and a kit for determining DNA double-strand breaks, corresponding uses, devices for the controlled filtration of liquid media containing well, in particular DNA molecules and / or other molecules / molecular complexes, with well filter plates and various uses.
  • a number of assays for determining DNA double-strand breaks are known from the prior art. These are in particular neutral filter elution, pulsed field gel electrophoresis and the neutral comet assay (Elia et al., Pharmacol. Ther. 51: 291-327; 1991; Sarkaria et al, Radiat. Res. 150 : 17-22; 1998; Prize et al .. Int. J. Radiat. Biol. 74: 173-184; 1998).
  • the cells to be examined for DNA damage are placed on filters and first treated with a neutral lysis solution to remove non-DNA components.
  • the DNA remains on the filter.
  • the filter with the DNA on it is then slowly passed through with a suitable solution for several hours, the washed-out solution being collected in several fractions. The distribution of the DNA between the collected fractions is measured.
  • This procedure is very time-consuming (work usually takes more than 10 hours), complicated to carry out; susceptible to failure (frequent leakage of the filter and filter holder), and it can only be used for the simultaneous determination of double-strand breaks in a relatively small number of samples.
  • Pulse field gel electrophoresis is an agarose gel electrophoresis which can detect double-strand breaks, which were only induced with a 1 Gy ionizing radiation, but which has inherent problems in measuring the strand break repair. Pulsed field gel electrophoresis is best performed with cell suspensions, but not with tissue samples. Costly equipment is required to implement this method. The procedure is time-consuming (approx. 24 hours) and allows only a relatively small number of samples to be determined at the same time.
  • DNA strand breaks are measured in single cells.
  • the cells are suspended in "low melting point” agarose on a slide.
  • the slide is then placed in a lysis buffer and then in the electrophoresis buffer.
  • the damaged DNA migrates towards the anode, forming a comet's tail.
  • the greater the extent of the damage (number of strand breaks) the larger the resulting tail.
  • Double strand breaks are measured under neutral conditions and single strand breaks under alkaline conditions.
  • a disadvantage of this method is that it is not possible to determine DNA damage in tissues.
  • the method for evaluation requires a costly image analyzer and experienced personnel for the interpretation of the results.
  • the time for sample preparation before lysis is relatively long.
  • EP 0 359 249 discloses i.a. an apparatus and a method for filtering liquid media with well filter plates in combination with microtiter plates.
  • a connection for applying a vacuum is provided below the respective filter.
  • the disadvantage here is the relatively complicated design of the device, and in addition, a controlled filtering of liquid media is not always guaranteed during the method.
  • MultiScreen vacuum filtration system Millipore GmbH
  • the vacuum required for slowly sucking through the samples which is necessary for the method described in this application for determining DNA double-strand breaks, cannot be obtained with the aid of the vacuum slide switch on this device build up.
  • the problem arises of at least partially eliminating the disadvantages listed above.
  • the problem that arises in particular is to provide a method and a kit for the determination of DNA double-strand breaks, which have a high sensitivity and accuracy and at the same time a rapid determination of the DNA damage (working time less than 3 hours) with a high sample throughput (e.g. parallel Allow determination of a larger number of samples, for example of 96 samples when using 96-well microtiter plates).
  • the problem is to provide an apparatus and a method that ensure improved controllability of the filtration. There is an urgent need for such a procedure, for example in medicine (determination of the optimal radiation dose for radiation therapy patients) or in environmental monitoring (proof of the effect of genotoxic substances).
  • the cells and / or tissues to be examined are first placed on specific filters.
  • filters can be commercially available filter types suitable for this purpose, for example MultiScreen filtration plates from Millipore GmbH (Eschborn, Germany) with Durapore membranes (e.g. 0.22 ⁇ m pore size).
  • MultiScreen filtration plates from Millipore GmbH (Eschborn, Germany) with Durapore membranes (e.g. 0.22 ⁇ m pore size).
  • membranes with smaller or larger pore sizes can be advantageous.
  • the cells / tissues are then lysed in the presence of at least one detergent, for example SDS (sodium dodecyl sulfate), at least one chaotropic substance, for example urea, and at least one substance which complexes metal ions and inhibits DNA repair enzymes, for example EDTA, or at least one protease, for example proteinase K.
  • at least one fluorescent dye that binds a specific DNA double strand can be added.
  • the substance that complexes metal ions and inhibits DNA repair enzymes is necessary because firstly metal ions for cross-linking can lead to wetting of the DNA and thereby impair its elution and can lead to an incorrect assessment of the proportion of intact DNA and secondly because DNA repair enzymes lead to an elimination of the DNA damage to be measured.
  • a protease can be used, since this lyses DNA repair enzymes during lysis, which would otherwise lead to an elimination of the DNA damage to be measured.
  • the DNA fragments released by the lysis are then eluted through the filters at a controlled, constant elution rate and a fluorescence spectroscopic evaluation is then carried out.
  • the elution is carried out in particular by the devices according to the invention for the controlled filtration of liquid media with filter plates.
  • the concentration of the chaotropic substance is advantageously 2 to 4 mol / 1. since sufficient cell lysis and denaturation is effected in this area without the quench effect becoming too strong.
  • the concentration of the substance complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes is advantageously 0.005 to 0.05 mol / 1, since sufficient activity is guaranteed in this range. It is advantageous if the pH value is set to 7 to 11 during the lysis step, since optimal cell lysis is observed in this area without DNA unwinding (separation of the two DNA strands at higher ones) pH values).
  • the concentration of the chaotropic substance in the lysis step is 2.25 mol / 1, since at this concentration there is an optimum between denaturation on the one hand and colorability (with the fluorescent dye; only a slight quench effect) on the other hand. Furthermore, it is advantageous if the concentration of the metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance of the lysis step is 0.02 mol / 1, since this means that sufficient traces of heavy metals (which can lead to crosslinking of the DNA) are removed with a strong reduction of the quench effect impairing the measurements can be ensured.
  • the concentration of the detergent in particular SDS
  • the concentration of the protease in the lysis step is 0.5 mg / ml
  • Proteinase K is used as protease
  • SDS is used as detergent
  • the pH during lysing is 10.0.
  • the fluorescent dye PicoGreen has proven to be extremely reliable and therefore advantageous.
  • the method has the following advantages: 1. The method requires only a small amount of time (approximately one hour). 2. The process is highly sensitive; only small amounts of sample DNA are required (about 30 ng DNA per well; this corresponds to about 3000 cells or 25 ⁇ g tissue).
  • the method allows a high sample throughput (96 determinations per hour when using a filtration device with a 96-well microfilter plate).
  • the procedure can be carried out with non-radioactive DNA.
  • the method can be used not only for cells but also for tissue samples.
  • the procedure is simple and does not require any special expertise.
  • the following kit for determining DNA double-strand breaks has the advantages mentioned above:
  • the kit contains at least one detergent, at least one chaotropic substance, at least one fluorescent dye which binds a specific DNA double-strand and at least one specific filter type.
  • the kit contains at least one substance which complexes metal ions and inhibits DNA repair enzymes.
  • the kit contains at least one protease.
  • the concentration of the chaotropic substance during lysis is 2 to 4 mol / 1.
  • the concentration of the metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance during lysis is 0.005 to 0.05 mol / l.
  • the protease is Proteinase K.
  • the concentration of the protease in the lysis step is 0.01 to 5 mg / ml.
  • the devices according to the invention for the controlled filtering of liquid media containing in particular DNA molecules and / or other molecules / molecular complexes with well filter plates, with at least one well filter plate and at least one corresponding microtiter plate are the following embodiments:
  • the first embodiment (the first device) is characterized by two separate gas spaces arranged above and below the filter plate, at least one sealing device which interacts with a container and the well filter plate and thus creates a separation of the two gas spaces, a device for connecting the two Gas spaces and a device for pressure equalization between the environment and a gas space.
  • One gas space is located above the filter plate and the micro titer plate arranged below it. in the wells of which the medium to be filtered is applied beforehand (before inserting the filter plate into the device).
  • both gas spaces are connected to one another by means of a tap arranged in a bore (this embodiment has proven itself in an advantageous manner), so that the pressure in both gas spaces is the same.
  • Both gas spaces are via the suction device, for example a suction pipe connected to a corresponding vacuum pump. evacuated or a negative pressure was established with respect to the environment and then the two gas spaces were separated from one another (for example by closing the tap).
  • the previously closed device for pressure equalization between the surroundings and the upper gas space is now carefully opened to the surroundings (i.e. to the outside atmosphere), so that the pressure in the upper gas space can be increased very slowly and in a metered manner compared to the gas pressure in the lower gas space.
  • a controlled filtering of the liquid medium is possible, in particular for the solutions for measuring DNA double-strand breaks.
  • the "suction pressure" required in conventional devices and methods contact pressure of the sealing device arranged between the filtration plate and the corresponding microtiter plate, in particular in the form of a rubber ring, for sealing between the two gas spaces
  • the advantage of the principle used in the device according to the invention is that the filtration process can be carried out at a constant speed without the occurrence of the initial pressure jump which occurs in suction devices which are operated by applying a negative pressure as a result of the suction process (pressing process on the sealing ring).
  • the second embodiment (second device) is characterized by two separate gas spaces arranged above and below the filter plate, at least one sealing device which interacts with a container and the well filter plate and thus creates a separation of the two gas spaces, and a pressurizing device which functions for a gas space ,
  • One gas space is located above the filter plate and the microtiter plate arranged below, in the wells of which the medium to be filtered is applied beforehand (before inserting the filter plates into the device).
  • a second gas space, separated from the first gas space, is located below the feed plate.
  • a pressure which is higher than the lower gas space, in particular 0.01 bar is applied to the medium to be filtered in one of the two gas spaces, preferably in the upper one, by means of the pressurizing device. In this way, a controlled filtering of the liquid medium is possible, in particular for the solutions for measuring DNA double-strand breaks.
  • a method according to the invention which uses one of the filtration devices according to the invention, has the surprising and advantageous properties mentioned above. This also applies to the corresponding uses.
  • the invention further relates to a method for determining DNA single-strand breaks, the use of several fluorescent dyes, a kit for determining DNA single-strand breaks, use of the kit and uses of the method and the kit.
  • DE 197 24 781 AI discloses inter alia a micro method for the rapid determination of DNA damage and its repair using the fluorescent dye Picogreen.
  • the cells to be examined are first lysed with the aid of SDS with a 9 molar urea solution.
  • About 200 mmol / l EDTA and a corresponding fluorescent dye, in particular Picogreen, which binds specifically DNA single-strand or DNA double-strand are added.
  • a sodium hydroxide solution with a pH of approx. 12.5 is added and then evaluated by fluorescence spectroscopy. With this method, the high concentration of urea is necessary to ensure the desired denaturation. In addition, approx.
  • the problem arises to at least partially eliminate the disadvantages listed above.
  • the problem that arises in particular is to provide a method and a kit for the determination of single-strand DNA breaks which have a low quench effect, a high sensitivity and accuracy and a good reproducibility and at the same time a rapid determination of the DNA damage (working time less than 3 hours ) with a high sample throughput (eg parallel determination of 96 samples in 96-well microtiter plates or determination of even larger numbers of samples by using microtiter plates with an even larger number of wells).
  • cells and / or tissues to be examined are first lysed with at least one detergent, for example SDS (sodium dodecyl sulfate) and at least one chaotropic substance solution, for example urea.
  • the lysis takes place in the presence of at least one substance which complexes metal ions and inhibits DNA repair enzymes.
  • At least one fluorescent dye that specifically binds single or double-stranded DNA is added in the lysis step or the subsequent step.
  • the step following the lysis is to add at least one solution to the suspensions containing the lysed cells and / or tissue, which allows the cell / tissue suspension to be adjusted to an alkaline pH and the at least one metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibitory substance.
  • a fluorescent dye which is either specifically single-stranded or specifically double-stranded.
  • the background to this requirement is the fact that the dye must adhere specifically to either single or double strands of the DNA. to determine the proportion of the respective strand types.
  • cyanine dyes such as PicoGreen can be used as selective or as approximately selective double-strand binding and OliGreen as selective single-strand binding.
  • the method according to the invention is based on the following principle: In the double-stranded DNA, two polynucleotide chains (DNA single strands) are linked to one another via hydrogen bonds between two complementary bases. Both polynucleotide chains are wound around each other to form a right-handed double spiral (helix).
  • the proportion of double-stranded DNA can then be determined with the aid of fluorescent dyes which bind specifically DNA double-strand or which bind specific DNA single-strand by means of fluorescence spectroscopic analysis.
  • the fluorescence of these dyes is dependent on the amount of double-stranded or single-stranded DNA, so that by measuring the intensity of the fluorescence emission in the region of the maximum of the fluorescence emission spectrum, either the increase in the single strands or the decrease in the double strands is determined is to be determined.
  • the lysis which is cooled in the dark and with ice, takes place directly in the corresponding wells of a microtiter plate and takes about 30 to 60 minutes.
  • the lysed cells and / or tissues are mixed with at least one solution (particularly pH 11 to 12) which is used to adjust the DNA unwinding (step b) and which has a concentration, in particular from 0.005 to 0.01 mol / 1, a substance complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes, for example EDTA (see above).
  • the double strands of the DNAs evolve - as explained above - so that the DNA single-strand breaks can be determined at regular, preferably regular intervals by conventional fluorescence spectroscopic analysis.
  • the individual steps should take place under temperature-controlled conditions to ensure good reproducibility. Typical temperature values in the range from 0 ° C to + 30 ° C can be used depending on the individual case.
  • the concentration of the chaotropic substance in the lysis step is 2 to 4 mol / 1, since sufficient lysis and denaturation is achieved only in this concentration range, without the fluorescence being excessively reduced as a result of the quench effect chaotropic substance is coming. Furthermore, the concentration of the substance complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes in the lysis step is advantageously from 0.005 to 0.05 mol / l. This is also advantageous in step b.).
  • the pH value is advantageously (since it has been tried and tested) set to 11 to 12, since lower pH values do not lead to sufficient detoxification of the DNA and higher pH values impair the ability to be colored with the fluorescent dye.
  • the concentration of a substance solution complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes can surprisingly be less than 200 mmol / 1, whereby this concentration range also apparently suffices for a sufficient removal of heavy metal traces and, moreover, the disruptive quenching effect could be unexpectedly reduced.
  • the entire process (lysis, unwinding and fluorescence spectroscopic evaluation) can also be carried out on 96-well microtiter plates (or microtiter plates with another Well number) can be made.
  • the method according to the invention it is also possible for the first time to carry out a continuous measurement of the DNA unwinding kinetics in one and the same approach without stopping the reaction.
  • the concentration of the chaotropic substance is 2.25 mol / 1, since at this concentration there is an optimum between denaturation on the one hand and colorability on the other hand. It is also advantageous if the concentration of the metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance solution of the first step is 0.02 mol / 1, since a sufficient removal of traces of heavy metals can be ensured while at the same time greatly reducing the quenching effect.
  • the concentration of the metal solution complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance solution of the second step is advantageously 0.02 mol / 1, since higher concentrations of some of these substances such as EDTA themselves can induce strand breaks and lower concentrations do not have an efficient metal ion complexing effect or DNA -Repairing enzyme inhibitory effect and no longer sufficient buffer effect.
  • the following embodiments are advantageous because they have proven themselves in practice: the concentration of the detergent (SDS) is 0.00175 mol / 1; it is used as a chaotropic substance urea; it is used as a metal ion complexing substance and DNA repair enzyme inhibiting substance EDTA; during lysis the pH is 10.0; the pH of the resulting solution after adding the solution of the second step is 11.5.
  • the following kit for the determination of single DNA strands has the advantages mentioned above:
  • the kit contains at least one detergent, at least one chaotropic substance solution, the concentration of which is 2 to 4 mol / l during lysis, at least one metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance solution, at least one solution for adjusting the pH required for DNA unwinding (step b.), which contains a substance complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes, and at least one fluorescent dye specifically binding single-stranded DNA or double-stranded DNA.
  • the concentration of the substance complexing metal ions and inhibiting DNA repair enzymes during lysis is 0.005 to 0.1 mol / 1;
  • the pH when the suspensions containing the lysed cells / tissue are mixed with the solution for adjusting the pH required for DNA unwinding is 11 to 12;
  • the concentration of the metal ion complexing and DNA repair enzyme inhibiting substance after setting the pH required for DNA unwinding is 0.005 to 0.1 mol / 1;
  • SDS is used as detergent; urea is used as the chaotropic substance;
  • EDTA is used as the substance which complexes metal ions and inhibits DNA repair enzymes; PicoGreen is used as the fluorescent dye.
  • Figure 1 This figure shows the DNA strand breaks (indicated as SSF x (-1)) in the gills of Mytilus galloprovincialis after treatment of the DNA in the TE homogenate (TE: 10 mmol / 1 Tris-HCl, 1 mmol / 1 EDTA; pH 7.4) with bleomycin, determined using the method according to the invention (single-strand method) (black bars) and the method disclosed in DE 197 24 761 AI (white bars). Examples of performing the assay (single-strand method):
  • DNA unwinding is carried out as follows at pH 11.50: 250 ⁇ l of the NaOH-EDTA solution are added to each sample (to a pH of 11) To obtain 50, d.) Measurement of the intensity of the fluorescence emission over a period of up to 1 h, for example every 5 min; when using PicoGreen: excitation: 480 nm; Emission: 520 ran.
  • the fluorescence blank value is measured as the fluorescence of a mixture of 25 ⁇ l TE buffer, 25 ⁇ l lysis solution with PicoGreen and 250 ⁇ l of the NaOH-EDTA working solution, e.) Calculation: Since every sample has to be corrected with regard to the blank value subtracted from the values of the mean of the blank. Multiple determinations are carried out (usually 4 - 6 determinations). The percentage of double-stranded DNA (dsDNA) for the untreated (e.g. unirradiated or untreated cells) at time 0 is set as 100% dsDNA.
  • dsDNA double-stranded DNA
  • SSF Strand Scission Factor
  • the tissue must be kept in liquid nitrogen immediately after removal.
  • tissue per well of a 96-well microtiter plate is approx. 25 ⁇ g.
  • Homogenization buffer TE buffer (see above) or other suitable buffer with 10% cryoprotector (dimethyl sulfoxide).
  • the method described here is able to detect the DNA single-strand breaks that occur during bleomycin treatment even when incubated in the presence of a concentration of 2.5 ⁇ mol / 1 bleomycin. As the bleomycin concentration increases, there is a concentration-dependent increase in DNA single-strand breaks (increase in SSF x (-1)).
  • FIG. 2 shows the dependence of the occurrence of DNA double-strand breaks, expressed in the form of the SSF x (-1) value, in HeLa cells after incubation of the cells for 4 hours in the presence of different concentrations of bleomycin (double-strand method; 3800 cells / well).
  • Figure 3 is a perspective view of an embodiment according to the inventive device for controlled filtration by means of suction;
  • Figure 4 is a perspective view of an embodiment according to the inventive device for controlled filtration by means of a pressurizing device.
  • 96-well filter plates (filtration plates), on the wells of which 96 independent membranes are welded, e.g. MultiScreen filtration plates from Millipore GmbH (Eschborn, Germany) (e.g. GV, 0.22 ⁇ m Durapore).
  • a device for controlled filtration shown in detail below by means of a suction device or a pressurizing device.
  • TE buffer 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.4
  • Lysis solution 40 mM EDTA, 4.5 M urea, 0.1% by weight SDS, pH 10
  • a cell suspension is prepared in TE buffer with a pH of 7.4 with a cell density of 150,000 / ml. (approx. 3500 - 4500 cells / 25 ⁇ l, approx. 30 ng DNA).
  • the lysis of the cells takes place in the wells of the 96-well filtration plates for 40 min at room temperature in the dark. 25 ⁇ l of lysis solution with PicoGreen are slowly added to 25 ⁇ l of cell suspension (pipetted on the filter membrane surface).
  • Fluorescence blank values are obtained by pipetting 25 ⁇ l lysis solution with PicoGreen to 25 ⁇ l water (or TE buffer) in portions of the cell suspension in steps 2 and 3.
  • DFR DNA Filter Ratio
  • the tissue must be frozen and stored in liquid nitrogen immediately after removal (storage for shorter periods can also take place at - 80 ° C).
  • the amount of tissue per well of the microtiter plate is usually approx. 25 ⁇ g.
  • Homogenization buffer TE buffer (see above) or other suitable buffer with 10% cryoprotector (dimethyl sulfoxide, glycerin etc.).
  • FIG. 2 shows a concentration-dependent increase in the DNA double-strand breaks [SSF x (-1) values] after incubation of the lines with bleomycin.
  • the suction filtration device shown in FIG. 3 consists of the following parts:
  • 1 acrylic glass attachment consisting of an outer acrylic glass frame and an acrylic glass plate sitting on it.
  • a fitted ventilation pipe (la) with a valve connected to it for regulating the vacuum in the upper vacuum chamber (not shown in FIG. 3).
  • the upper flow valve (lb) can be used to separate or connect the upper vacuum chamber, (lc) hole in the acrylic glass attachment, which can be opened or closed by the flow valve.
  • the filtration device has an acrylic glass attachment (1) which is placed on a base plate (7). Thanks to the silicone seal (6) in the lower edge of the acrylic glass attachment, the space under the attachment can be sealed airtight. An empty microtiter plate (5) and a feed plate (3) already loaded with samples are arranged under this acrylic glass attachment in such a way that the feed plate comes to rest on the microtiter plate and on the bottom plate (see FIG. 3). The fact that there is a white of the feed plate directly above the corresponding white of the microtiter plate is ensured by the fact that the two plates are fitted exactly into the acrylic glass attachment, so that it is not possible to move the plates against each other.
  • the suction pipe forms the end of a hole in the base plate, the other end of which is in the middle of the base plate of the lower chamber.
  • Two narrow spacers (4) which are placed between the feed plate and the microtiter plate, prevent the wells of the microtiter plate from being closed when the vacuum is applied by sitting too tightly on the feed plate and thus being separated from the lower chamber space. If the connection between the lower and upper chamber with the hoof of the flow valve is open, both the lower and the upper chamber are evacuated after the vacuum has been applied. When the vacuum is applied, this connection must always be open to ensure a uniform evacuation of the two chambers. Then the connection between the two chambers is closed by turning the flow valve by 180 °. The two chamber rooms are then completely separated from each other.
  • the upper chamber is ventilated by opening the valve on the ventilation pipe integrated in the acrylic glass attachment, the lower chamber remaining evacuated. Due to the resulting higher negative pressure in the lower chamber compared to the upper chamber, the samples pipetted into the weus of the feed plate are sucked through the feeds that bleed the bottom of the weus into the lower chamber. the filtrate being collected in the microtiter plate.
  • the filtration speed can be regulated using the valve on the ventilation pipe. A filtration rate of 300 ⁇ l / 15 min per weü is recommended to carry out the procedure for the determination of DNA double strand breaks.
  • the vacuum applied remains switched on during the entire feeding process. After complete feeding, the acrylic attachment can be removed, whereby the feed in the microtiter plates is available for further examinations.
  • the new feature of the apparatus shown in FIG. 3 in comparison to conventional apparatuses is that first by connecting the opening 7a to the vacuum source both in the The same negative pressure is present in the upper and in the lower chamber, thus sealing the apparatus from the outside.
  • DNA is separated from the upper and lower chamber by reversing the flow valve 1b.
  • the pressure in the upper chamber is then set in such a way that the solution is sucked through the feeds at a continuous speed which is adapted to the experimental conditions.
  • Patent application EP 0359249 describes a feeding device in which a microfilter plate and a microtiter plate are also used.
  • the principle underlying this apparatus differs from that of the first feeding device described in the previous application.
  • a vacuum is first generated in both chambers in the device described here, which is then reduced in one (upper) chamber until the filtration process takes place at the desired speed.
  • a clamp is not used in the device described here.
  • the advantage of the construction described in the present application is that it avoids the contact pressure which is required in other apparatuses for the production of the airtight seal and which would lead to an initial rapid passage of liquid through the feed.
  • a constant liquid flow through the feed is essential for the application of the feeding devices we need for the DNA strand break determinations.
  • the pore size of the feeds of the feed plates we use for DNA strand breakage determination is so small that feeding due to gravity is not possible. Due to the small pore size, feeding according to the principle described in the patent application EP 0359249 for the example cell culture could not take place.
  • the pressure feeding device shown in FIG. 4 consists of the following parts:
  • a control valve (lg ", eg Festo GR-M5B) with a connection hole to the space above the plate, which is also used for connection a compressed air source (e.g. house compressed air, nitrogen bottle or aquarium pump) is used.
  • a compressed air source e.g. house compressed air, nitrogen bottle or aquarium pump
  • the strength of the pressure must be easily adjustable at the pressure queue itself.
  • the liquid that has passed through the feed is removed from the microtiter plate A feeding rate of approximately 300 ⁇ l / 15 min per WeU is suitable for carrying out the method for determining DNA double-strand breaks.
  • the two plates can be removed from the acrylic glass housing and the FUtrate in the microtiter plate can be further examined (The funct The staple in this apparatus is simply to provide an airtight seal above the feeding plate and an exact positioning of the feeding plate and the microtiter plate.)
  • the new feature of the apparatus shown in FIG. 4 compared to conventional apparatuses is that the feeding of the solutions pipetted into the water of the 96-WeU feed plate by applying an overpressure above the feed plate and not by applying a vacuum ( Vacuum) is carried out below the feed plate.
  • An advantage of the principle used in this apparatus is that the feeding process can be carried out at a constant speed without the occurrence of the initial pressure jump which occurs in suction devices which are operated by applying a negative pressure as a result of the suction process (pressing process on the sealing ring).
  • the overpressure in the room above the 96-WeU feed plate can be, in addition to the pressure queues mentioned above, e.g. can also be generated by applying an aquarium air pump.
  • people are protected from radiation by the 10 mm thick radiation-absorbing acrylic plates.
  • the advantages of the pressure feeding device described here compared to conventional apparatus are particularly easy to use. They enable feeding even when there is no compressed air source. This means that this device can also be used for examinations outside of a laboratory equipped with a compressed air source, for example on a research ship (examination of DNA damage in marine organisms). Furthermore, the special construction of the pressure feeding device enables shielding of radiation when using the devices for the filtration of radioactive materials. Pressurized cylinders containing inert gases can be used for the filtration processes of oxygen-sensitive substances. Comparable devices for microfilter plates are not currently available.

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Abstract

Es wird unter anderem ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen bereitgestellt, mit folgenden Schritten: a) Aufgabe von zu untersuchenden Zellen und/oder Geweben auf spezifische Filter; b) Lyse der Zellen/Gewebe mit mindestens einem Detergens, mindestens einer chaotropen Substanz und mindestens einem spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff; c) Elution der durch die Lyse freigesetzten DNA-Bruchstücke durch die spezifischen Filter; d) Durchführen einer fluoreszenzspektroskopischen Auswertung, wobei pro Well nur eine Eluat-Fraktion gesammelt wird.

Description

Verfahren und Kit zur Bestimmung von DNA-Doppel-/Einzelstrangbriichen und Vorrichtung zum kontrollierten Filtrieren von insbesondere DNA-Molekülen mit Well-Filterplatten
Die Erfindung betrifft im allgemeinen u.a. Verfahren und Kits zur Bestimmung von DNA-Doppeloder DNA-Einzelstrangbrüchen.
Die Erfindung betrifft im besonderen zum einen ein Verfahren und einen Kit zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen, entsprechende Verwendungen, Vorrichtungen zum kontrollierten Filtrieren von insbesondere DNA-Moleküle und/oder andere Moleküle/Molekülkomplexe enthaltenden flüssigen Medien mit Well-Filterplatten und verschiedene Verwendungen.
Vom Stand der Technik ist eine Reihe von Assays zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen bekannt. Es handelt sich insbesondere um die neutrale Filterelution, die Pulsed-Field-Gel- elektrophorese und den neutralen Komet-Assay (Elia et al., Pharmacol. Ther. 51:291-327; 1991; Sarkaria et al, Radiat. Res. 150:17-22; 1998; Prise et al.. Int. J. Radiat. Biol. 74:173-184; 1998).
Bei der Filterelution werden die auf DNA-Schäden zu untersuchenden Zellen auf Filter gegeben und zunächst mit einer neutralen Lyselösung zur Entfernung von Nicht-DNA-Anteilen behandelt. Die DNA bleibt dabei auf dem Filter zurück. Danach werden die Filter mit der darauf befindlichen DNA langsam über mehrere Stunden mit einer geeigneten Lösung durchströmt, wobei die ausgewaschene Lösung in mehreren Fraktionen gesammelt wird. Die Verteilung der DNA zwischen den gesammelten Fraktionen wird gemessen. Diese Prozedur ist sehr zeitaufwendig (Arbeitsdauer in der Regel mehr als 10 Stunden), kompliziert in der Durchführung; störanfällig (häufiges Undichtwerden der Filter und Filterhalter), und sie kann nur zur gleichzeitigen Bestimmung von Doppelstrangbrüchen bei einer relativ kleinen Anzahl von Proben angewandt werden.
Bei der Pulse-Field-Gelelektrophorese handelt es sich um eine Agarose-Gelelektrophorese, mit der zwar DNA-Doppelstrangbrüche detektiert werden können, die nur mit einem 1 Gy ionisierender Strahlung induziert wurden, die jedoch inhärente Probleme bei der Messung der Strangbruch- Reparatur aufweist. Die Pulsed-Field-Gelelektrophorese läßt sich am besten mit Zellsuspensionen nicht jedoch mit Gewebeproben durchführen. Zur Durchführung dieser Methode ist eine kostenaufwendige Apparatur erforderlich. Die Prozedur ist zeitaufwendig (ca. 24 Stunden) und ermöglicht nur eine gleichzeitige Bestimmung von relativ wenig Proben.
Beim Komet-Assay ("single-cell gel electrophoresis") werden DNA-Strangbrüche in Einzelzellen gemessen. Zu diesem Zweck werden die Zellen in "low melting point"- Agarose auf einem Objektträger suspendiert. Der Objektträger wird dann in einen Lysepuffer gegeben und anschließend in den Elektrophoresepuffer. Während der Elektrophorese wandert die geschädigte DNA in Richtung Anode unter Ausbildung eines Kometenschweifs. Je größer das Ausmaß des Schadens (Anzahl der Strangbrüche), desto größer ist der resultierende Schweif. Doppelstrangbrüche werden unter neutralen Bedingungen und Einzelstrangbrüche unter alkalischen Bedingungen gemessen. Nachteilig bei dieser Methode ist, daß Bestimmungen von DNA-Schäden in Geweben nicht möglich sind. Darüberhinaus benötigt das Verfahren zur Auswertung einen kostenaufwendi- gen Image-Analyser sowie erfahrenes Personal für die Interpretation der Ergebnisse. Schließlich ist die Zeitdauer für die Probenvorbereitung vor der Lyse verhältnismäßig hoch.
EP 0 359 249 offenbart u.a. eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Filtrieren von flüssigen Medien mit Well-Filterplatten im Verbund mit Mikrotiterplatten. Bei dieser Vorrichtung ist ein Anschluß zum Anlegen eines Unterdrucks unterhalb der jeweiligen Filter vorgesehen. Nachteilig hierbei ist die relativ komplizierte Ausgestaltung der Vorrichtung, wobei darüberhinaus beim Verfahren nicht immer ein kontrolliertes Filtrieren von flüssigen Medien gewährleistet ist. Bei dem kommerziell erhältlichen MultiScreen- Vakuumfiltrationssystem (Firma Millipore GmbH) läßt sich das für ein langsames Hindurchsaugen der Proben erforderliche Vakuum, das für das in dieser Anmeldung beschriebene Verfahren zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen notwendig ist, auch mit Hilfe des Vakuumschiebeschalters an diesem Gerät nicht aufbauen.
Aus dem vorgenannten ergibt sich das Problem, die oben aufgeführten Nachteile zumindest teilweise zu beseitigen. Das sich ergebende Problem besteht insbesondere darin, ein Verfahren und ein Kit zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen bereitzustellen, die eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit aufweisen und gleichzeitig eine Schnellbestimmung der DNA-Schäden (Arbeitsdauer weniger als 3 Stunden) bei einem hohen Probendurchsatz (z.B. parallele Bestimmung einer größeren Anzahl von Proben, beispielsweise von 96 Proben bei Verwendung von 96- Well-Mikrotiterplatten) ermöglichen. Darüberhinaus besteht das Problem darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die eine verbesserte Kontrollierbarkeit der Filtration gewährleisten. Für ein solches Verfahren besteht ein dringender Bedarf, beispielsweise in der Medizin (Bestimmung der optimalen Strahlendosis bei Strahlentherapiepatienten) oder beim Umwelt-Monitoring (Nachweis des Effektes genotoxischer Substanzen).
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1, einen Kit nach Anspruch 3, Vorrichtungen nach den Ansprüchen 4 und 5, Verfahren nach Anspruch 6, und Verwendungen nach Anspruch 10 gelöst.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst die zu untersuchenden Zellen und/oder Gewebe auf spezifische Filter gegeben. Bei diesen kann es sich um handelsübliche, für diese Zwecke geeignete Filtertypen handeln, beispielsweise MultiScreen Filtrationsplatten der Firma Millipore GmbH (Eschborn, Deutschland) mit Durapore-Membranen (z.B. 0,22 μm Porengröße). In Abhängigkeit von der DNA-Länge können Membranen mit kleineren oder größeren Porengrößen vorteilhaft sein.
Anschließend werden die Zellen/Gewebe lysiert in Gegenwart von mindestens einem Detergens, beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat), mindestens einer chaotropen Substanz, beispielsweise Harnstoff, und mindestens einer Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz, beispielsweise EDTA, oder mindestens einer Protease, beispielsweise Proteinase K. Schon in diesem Schritt kann mindestens ein spezifisch DNA-Doppelstrang bindender Fluoreszenzfarbstoff hinzugegeben werden. Die Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz ist notwendig, da erstens Metallionen zur Querver- netzung der DNA führen können und dadurch deren Elution beeinträchtigen und zu einer fehlerhaften Einschätzung des Anteils an intakter DNA führen können und da zweitens DNA-Reparaturenzyme zu einer Elimination der zu messenden DNA- Schäden führen. Alternativ dazu kann eine Protease verwendet werden, da dadurch bei der Lyse DNA-Reparaturenzyme abgebaut werden, die sonst zu einer Elimination der zu messenden DNA-Schäden führen würden.
Danach werden die durch die Lyse freigesetzten DNA-Bruchstücke durch die Filter mit einer kontrollierten, konstanten Elutionsgeschwindigkeit eluiert und danach eine fluoreszenzspektro- skopische Auswertung durchgeführt. Die Elution wird insbesondere durch die erfindungsgemäßen Vorrichtungen zum kontrollierten Filtrieren von flüssigen Medien mit Filterplatten durchgeführt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren macht man sich die Erkenntnis zunutze, daß nach der Zellyse und der gleichzeitig in der Lyselösung stattfindenden Disintegration der DNA-Histon- Komplexe die freigesetzten DNA-Moleküle mit der Lyse/Elutions-Lösung ausgewaschen werden. Die Elution der DNA- Moleküle verläuft dabei umso schneller, je kürzer sie sind ("Siebeffekt"). Das Verfahren erlaubt somit die Bestimmung der Zahl der Doppelstrangbrüche der DNA.
Beim Lyse-Schritt beträgt vorteilhafterweise die Konzentration der chaotropen Substanz 2 bis 4 mol/1. da in diesem Bereich eine ausreichende Zell-Lyse und Denaturierung bewirkt wird, ohne daß der Quencheffekt zu stark wird. Darüberhinaus beträgt die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz vorteilhafterweise 0,005 bis 0,05 mol/1, da in diesem Bereich eine ausreichende Wirksamkeit gewährleistet ist. Von Vorteil ist es, wenn der pH- Wert beim Lyse-Schritt auf 7 bis 1 1 eingestellt wird, da in diesem Bereich eine optimale Zell-Lyse beobachtet wird, ohne daß eine DNA-Entwindung eintritt (Trennung der beiden DNA-Stränge bei höheren pH- Werten).
Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Konzentration der chaotropen Substanz beim Lyse- Schritt 2,25 mol/1 beträgt, da bei dieser Konzentration ein Optimum zwischen Denaturierung einerseits und Anfarbbarkeit (mit dem Fluoreszenzfarbstoff; nur geringer Quencheffekt) andererseits vorliegt. Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz des Lyseschrittes 0,02 mol/1 beträgt, da dadurch eine ausreichende Entfernung von Spuren an Schwermetallen (die zu Quervernetzungen der DNA führen können) bei gleichzeitig starker Herabsetzung des die Messungen beeinträchtigenden Quencheffekts sichergestellt werden kann.
Die nachfolgenden Ausführungsformen sind vorteilhaft, da sich diese in der Praxis bewährt haben: Die Konzentration des Detergens (insbesondere von SDS) beträgt 0,00175 mol/1; die Konzentration der Protease beträgt beim Lyse-Schritt 0,5 mg/ml; es wird als chaotrope Substanz Harnstoff verwendet; es wird als Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA verwendet; als Protease wird Proteinase K verwendet; als Detergens wird SDS verwendet; der pH- Wert bei der Lysierung beträgt 10,0. Schließlich hat sich der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen aus ausgesprochen zuverlässig und somit vorteilhaft bewährt.
Das Verfahren besitzt folgende Vorteile: 1. Das Verfahren benötigt nur einen geringen Zeitaufwand (etwa eine Stunde). 2. Das Verfahren ist hochsensitiv; nur geringe Mengen an Proben-DNA sind erforderlich (etwa 30 ng DNA pro Well; dies entspricht etwa 3000 Zellen oder 25 μg Gewebe).
3. Das Verfahren erlaubt einen hohen Probendurchsatz (Durchführung von 96 Bestimmungen pro Stunde bei Verwendung einer Filtrationsvorrichtung mit einer 96-Well-Mikrofilterplatte).
4. Das Verfahren kann mit nichtradioaktiver DNA durchgeführt werden.
5. Das Verfahren kann nicht nur für Zellen sondern auch für Gewebeproben angewendet werden.
6. Die Durchführung des Verfahrens ist einfach und erfordert keine besonderen Fachkenntnisse. Der nachfolgende Kit zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen weist die oben genannten Vorteile auf: Der Kit enthält mindestens ein Detergens, mindestens eine chaotrope Substanz, mindestens einen spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff und mindestens einen spezifischen Filtertyp.
Die folgenden Ausführungsformen des Kits sind aus obigen Gründen vorteilhaft: Der Kit enthält mindestens eine Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz. Der Kit enthält mindestens eine Protease. Die Konzentration der chaotropen Substanz bei der Lyse beträgt 2 bis 4 mol/1. Die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA- Reparaturenzyme hemmenden Substanz bei der Lyse beträgt 0,005 bis 0,05 mol/1. Die Protease ist Proteinase K. Die Konzentration der Protease beim Lyse-Schritt beträgt 0,01 bis 5 mg/ml.
Die nachfolgenden Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Kits weisen die oben aufgeführten überraschenden und vorteilhaften Eigenschaften ebenso auf. Es geht hierbei insbesondere um Verwendungen zum:
• Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen und Quervernetzungen in humanen, tierischen oder pflanzlichen Geweben und Zeilen, in Bakterien und Einzellern, in Zellinien humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs und subzellulären Fraktionen, sowie in isolierter DNA;
• Nachweis von DNA-Reparatur in humanen, tierischen oder pflanzlichen Geweben und Zellen, in Bakterien und Einzellern, in Zellinien humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, subzellulären Fraktionen, Zell-Lysaten und Zeil-Extrakten (isolierte Moleküle);
• Zur Messung des Auftretens von DNA-Doppelstrangbrüchen und Quervernetzungen und deren Reparatur nach Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Behandlung mit Gentoxinen in humanem und tierischem Probenmaterial, Gewebeschnitten und Zellsuspensionen;
• Messung des Auftretens von DNA-Doppelstrangbrüchen und Quervernetzungen und deren Reparatur in Geweben und Zellen von Patienten bei Strahlentherapie;
• Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in gefrorenen Untersuchungsmaterialien (beispielsweise Biopsieproben) nach deren schonender Homogenisatiön in flüssigem Stickstoff oder flüssiger Luft in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels (beispielsweise Dimethylsulfoxid);
• Nachweis des Auftretens von DNA-Doppelstrangbrüchen und Quervernetzungen und deren Reparatur bei berufsbedingter Exposition von Personen, die entweder bei ihrer beruflichen Arbeit (beispielsweise Flugpersonal, Röntgenärzte) oder infolge von Unfällen (beispielsweise Reaktorunfalle) mit DNA-schädigenden Substanzen oder Strahlen in Kontakt kommen; „ „„.-,„,
5 PCT/EP00/06842
• Messung des Auftretens von DNA-Doppelstrangbrüchen und Quervernetzungen und deren Reparatur in Testorganismen, Geweben, Zellen oder Zellinien bei der Gewässerüberwachung.
Bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen zum kontrollierten Filtrieren von flüssigen insbesondere DNA-Moleküle und/oder andere Moleküle/Molekülkomplexe enthaltenden Medien mit Well- Filterplatten, mit mindestens einer Well-Filterplatte und rnindestens einer korrespondierenden Microtiterplatte handelt es sich um folgende Ausführungsformen:
Die erste Ausfuhrungsform (das erste Gerät) ist gekennzeichnet durch zwei voneinander getrennte, ober- und unterhalb der Filterplatte angeordnete Gasräume, mindestens eine mit einem Behältnis und der Well-Filterplatte zusammenwirkende und damit eine Trennung der beiden Gasräume erzeugende Dichtungseinrichtung, eine Einrichtung zum Verbinden beider Gasräume und eine Einrichtung zum Druckausgleich zwischen Umgebung und einem Gasraum.
Der eine Gasraum befindet sich oberhalb der Filterplatte und der darunter angeordneten Mikro- titerplatte. in deren Wells zuvor (vor dem Einlegen der Filterplatte in die Vorrichtung) das zu filtrierende Medium appliziert wird. Unterhalb der Filterplatte befindet sich ein zweiter, vom ersten Gasraum getrennter Gasraum. Zunächst werden beide Gasräume mittels eines in einer Bohrung angeordneten Hahns (diese Ausführungsform hat sich in vorteilhafter Weise bewährt) miteinander verbunden, so daß in beiden Gasräumen der Druck gleich hoch ist. Beide Gasräume werden über die Absaugeinrichtung, beispielsweise ein mit einer entsprechenden Vakuumpumpe verbundenes Saugrohr. evakuiert bzw. ein Unterdruck bezüglich der Umgebung hergestellt und danach beide Gasräume voneinander getrennt (beispielsweise durch Zudrehen des Hahns). Die vorher geschlossene Einrichtung zum Druckausgleich zwischen Umgebung und dem oberen Gasraum wird nun vorsichtig zur Umgebung hin (also zur Außenatmosphäre hin) geöffnet, so daß der Druck im oberen Gasraum sehr langsam und dosiert im Vergleich zum Gasdruck des unteren Gasraums erhöht werden kann. Auf diese Art und Weise ist ein kontrolliertes Filtrieren des flüssigen Mediums möglich, insbesondere für die Lösungen zur Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen.
Der bei herkömmlichen Vorrichtungen und Verfahren notwendige "Ansaugdruck" (Anpreßdruck der zwischen Filtrationsplatte und korrespondierender Microtiterplatte angeordneten Dichtungseinrichtung, insbesondere in Form eines Gummirings, zum Abdichten zwischen den beiden Gasräumen) ist in der Regel so hoch, daß ein kontrolliertes Filtrieren nicht möglich ist. Der Vorteil des in der erfindungsgemäßen Vorrichtung angewandten Prinzips besteht darin, daß der Filtrationsvorgang mit konstanter Geschwindigkeit durchgeführt werden kann, ohne Auftreten des bei Absaugvorrichtungen, die durch Anlegen eines Unterdrucks betrieben werden, auftretenden initialen Drucksprungs infolge des Ansaugvorgangs (Anpreßvorgang an den Dichtungsring).
Insbesondere die beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen notwendigen niedrigen Filtrations/Elutionsgeschwindigkeiten im Bereich von wenigen Mikrolitern je Minute sind mittels konventioneller Vorrichtungen und Verfahren nicht zu realisieren, stellen jedoch für die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren kein Problem dar. Die zweite Ausführungsform (zweites Gerät) ist gekennzeichnet durch zwei voneinander getrennte, ober- und unterhalb der Filterplatte angeordnete Gasräume, mindestens eine mit einem Behältnis und der Well-Filterplatte zusammenwirkende und damit eine Trennung der beiden Gasräume erzeugende Dichtungseinrichtung und eine für einen Gasraum fungierende Druckbeaufschlagungseinrichtung. Der eine Gasraum befindet sich oberhalb der Filterplatte und der darunter angeordneten Mikrotiterplatte, in deren Wells zuvor (vor dem Einlegen der Filterplatten in die Vorrichtung) das zu filtrierende Medium appliziert wird. Unterhalb der Füterplatte befindet sich ein zweiter, vom ersten Gasraum getrennter Gasraum. Nach der Applizierung des Mediums in die jeweiligen Wells der Füterplatte wird in einem der beiden Gasräume, vorzugsweise im oberen, mittels der Druckbeaufschlagungseinrichtung ein gegenüber dem unteren Gasraum höherer Druck, insbesondere 0,01 bar, auf das zu filtrierende Medium beaufschlagt. Auf diese Art und Weise ist ein kontrolliertes Filtrieren des flüssigen Mediums möglich, insbesondere für die Lösungen zur Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, welches eine der erfindungsgemäßen Filtrationsvorrichtungen verwendet, weist die oben genannten überraschenden und vorteilhaften Eigenschaften auf. Dies gilt auch für die entsprechenden Verwendungen.
Es geht hierbei um Verwendungen: zum Nachweis und Quantifizierung von DNA- Strangbrüchen, von Quervernetzungen von DNA-Molekülen untereinander oder mit anderen Molekülen sowie von weiteren DNA-Schäden; für Bindungsstudien, zur Untersuchung von DNA-Proteinoder Rezeptor-Ligand- Wechselwirkungen und zur Bestimmung der Dissoziations-/ Assoziations- Konstanten dieser Reaktionen; zur Filtration radioaktiver Materialien mit optionaler autoradiographischer Detektion der auf den Filtern gebliebenen Radioaktivität; zur Filtration infektiöser Proben; zur Filtration sauerstoffempfindlicher Proben; zur Filtration unter sterilen Bedingungen.
Die Erfindung betrifft insbesondere weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Einzelstrangbrüchen, eine Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe, ein Kit zur Bestimmung von DNA-Einzelstrangbrüchen, eine Verwendung des Kits sowie Verwendungen des Verfahrens und des Kits.
DE 197 24 781 AI offenbart u.a. eine Mikromethode zur Schnellbestimmung von DNA-Schäden und deren Reparatur unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes Picogreen. Bei dem dort beschriebenen Verfahren werden die zu untersuchenden Zellen zunächst unter Zuhilfenahme von SDS mit einer 9 molaren Harnstofflösung lysiert. Dabei werden ca. 200 mmol/1 EDTA und ein entsprechender spezifisch DNA-Einzelstrang- oder DNA-Doppelstrang bindender Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere Picogreen, hinzugegeben. Eine Natronlauge-Lösung mit einem pH-Wert von ca. 12,5 wird hinzugesetzt und anschließend fluoreszenzspektroskopisch ausgewertet. Bei diesem Verfahren ist die hohe Konzentration des Harnstoffs notwendig, um die gewünschte Denaturierung sicherzustellen. Darüber hinaus müssen ca. 200 mmol/1 EDTA verwendet werden, um eine vollständige Komplexierung von die DNA vernetzenden Metallionen zu gewährleisten. Nachteilig bei diesem Verfahren ist der Einsatz von hohen Substanzmengen, die zu einem hohen Quencheffekt bei der Fluoreszenzauswertung führen und die Ergebnisse unter Umständen stark verfälschen können. Darüber hinaus ist die Empfindlichkeit der vorstehenden Methode teilweise nicht befriedigend, insbesondere für die Bestimmung von DNA-Strangbrüchen in (kürzeren) DNA-Molekülen von niederen Organismen (wichtig für die Untersuchung der Effekte von Umweltpollutionen) sowie für die Bestimmung von DNA- Strangbrüchen bei Strahlentherapiepatienten in dem bei der Strahlentherapie angewandten Dosisbereich (0,5 - 3,0 Gy Einzeldosis).
Aus dem vorgenannten ergibt sich das Problem die oben aufgeführten Nachteile zumindest teilweise zu beseitigen. Das sich ergebende Problem liegt insbesondere darin, ein Verfahren und ein Kit zur Bestimmung von DNA-Einzelstrangbrüchen bereitzustellen, die einen geringen Quencheffekt, eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit und eine gute Reproduzierbarkeit aufweisen und gleichzeitig eine Schnellbestimmung der DNA-Schäden (Arbeitsdauer weniger als 3 Stunden) bei einem hohen Probendurchsatz (z.B. parallele Bestimmung von 96 Proben in 96-Well-Mikro- titerplatten oder Bestimmung noch größerer Probenzahlen durch Verwendung von Mikrotiterplatten mit einer noch größeren Anzahl an Wells) ermöglichen.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 7 und einen Kit nach Anspruch 9 gelöst. Außerdem werden erfindungsgemäß nach Anspruch 10 eine Verwendung des Verfahrens sowie Verwendungen des Kits beansprucht.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst zu untersuchende Zellen und/oder Gewebe mit mindestens einem Detergens beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat) und mindestens einer chaotropen Substanzlösung, beispielsweise Harnstoff, lysierend versetzt. Die Lyse findet in Gegenwart mindestens einer Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz statt. Mindestens ein spezifisch DNA-Einzel- oder DNA-Doppelstrang bindender Fluoreszenzfarbstoff wird beim Lyse-Schritt oder dem danach folgenden Schritt zugesetzt.
Der nach der Lyse folgende Schritt ist das Versetzen der die lysierten Zellen und/oder Gewebe enthaltenden Suspensionen mit mindestens einer Lösung, die es erlaubt, die Zell- /Gewebesuspension auf einen alkalischen pH- Wert einzustellen und die mindestens eine Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz aufweist.
Durch den nochmaligen Zusatz mindestens einer Metallionen komplexierenden und DNA- Reparaturenzyme hemmenden Substanz bei dem auf die Lyse folgenden Schritt ist völlig überraschend die Empfindlichkeit und Genauigkeit höher als die beim in DE 197 24 781 AI offenbarten Verfahren.
Wichtig beim erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß man einen Fluoreszenzfarbstoff verwendet, der entweder spezifisch einzelstrang- oder spezifisch doppelstrangbindend ist. Hintergrund für diese Anforderung ist die Tatsache, daß sich der Farbstoff spezifisch entweder spezifisch an Einzel- oder an Doppelstränge der DNA heften muß. um den Anteil der jeweiligen Strangtypen zu ermitteln. Beispielsweise können als selektiv oder als annähernd selektiv doppelstrangbindend Cyaninfarbstoffe wie PicoGreen und als selektiv einzelstrangbindend OliGreen verwendet werden. Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt folgendes Prinzip zugrunde: In der doppelsträngigen DNA sind zwei Polynucleotidketten (DNA-Einzelstränge) über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen jeweils zwei komplementären Basen miteinander verknüpft. Beide Polynucleotidketten sind dabei unter Ausbildung einer rechtsgängigen Doppelspirale (Helix) umeinander gewunden. Aufgrund dieser Struktur bleiben die beiden DNA-Einzelstränge der DNA auch dann noch aneinander haften, wenn in ihnen Brüche auftreten. Solche DNA-Einzelstrangbrüche gehören zu den häufigsten DNA-Schäden. Voraussetzung dafür, daß die beiden DNA-Einzelstränge noch zusammenbleiben, ist, daß die Brüche - was meist der Fall ist - auf den beiden Strängen gegeneinander versetzt sind. Setzt man nun die DNA oder die gesamte Zelle einer stark alkalischen Lösung aus, lösen sich die Wasserstoffbrücken zwischen den DNA-Einzelsträngen. Da die Moleküle jedoch umeinandergewickelt sind, fallen sie nicht sofort auseinander. Beide Einzelstränge müssen zunächst voneinander entwunden werden. DNA-Moleküle, deren Einzelstränge Brüche aufweisen, entwinden sich dabei schneller als intakte DNAs.
Der Anteil an doppelsträngiger DNA läßt sich dann mit Hilfe von spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden oder spezifisch DNA-Einzelstrang bindenden fluoreszierenden Farbstoffen über eine fluoreszenzspektroskopische Analyse ermitteln. Die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ist von der Menge an Doppel- bzw. Einzelstrang-DNA abhängig, so daß über die Messung der Intensität der Fluoreszenz-Emission im Bereich des Maximums des Fluoreszenz-Ernissions-Spektrums entweder die Zunahme der Einzelstränge bzw. die Abnahme der Doppelstränge zu ermitteln ist. In der Regel findet die im Dunkeln und mit Eis gekühlte Lyse direkt in den entsprechenden Wells einer Mikrotiterplatte statt und dauert ca. 30 bis 60 Minuten. Anschließend werden die lysierten Zellen und/oder Gewebe mit mindestens einer zur Einstellung des zur DNA-Entwindung (Schritt b) benötigten pH- Wertes (insbesondere pH 11 bis 12) dienenden Lösung versetzt, die eine Konzentration, insbesondere von 0,005 bis 0,01 mol/1, einer Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz, beispielsweise EDTA, aufweist (s. o.).
Bei diesem pH- Wert entwinden sich - wie oben erläutert - die Doppelstränge der DNAs, so daß in zeitlich vorzugsweise regelmäßigen Abständen über eine konventionelle fluoreszenzspektroskopische Analyse die DNA-Einzelstrangbrüche bestimmt werden können. Die einzelnen Schritte sollten dabei unter temperaturkontrollierten Bedingungen ablaufen, um eine gute Reproduzierbarkeit gewährleisten zu können. Dabei können übliche Temperaturwerte im Bereich von 0 °C bis + 30 °C je nach Einzelfall verwendet werden.
In bewährter und somit vorteilhafter Weise beträgt die Konzentration der chaotropen Substanz beim Lyse-Schritt 2 bis 4 mol/1, da nur in diesem Konzentrationsbereich eine ausreichende Lyse und Denaturierung erreicht wird, ohne daß es zu einer zu starken Herabsetzung der Fluoreszenz infolge des Quencheffektes der chaotropen Substanz kommt. Weiterhin beträgt in vorteilhafter da bewährter Weise die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz beim Lyse-Schritt 0,005 bis 0,05 mol/1. Dies ist ebenso beim Schritt b.) vorteilhaft. In diesem Konzentrationsbereich wird erstens eine ausreichende Entfernung von Metallionen erzielt, die zu einer Quervernetzung der DNA und damit zu einer Beeinträchtigung der DNA-Entwindung führen können und zweitens eine ausreichende Hemmung der DNA-Reparaturenzyme, welche die vorhandenen DNA-Schäden wieder eliminieren, ohne daß hierbei ein zu starker Quencheffekt eintritt. Der pH- Wert wird vorteilhaft (da bewährt) auf 11 bis 12 eingestellt, da niedrigere pH- Werte zu keiner ausreichenden Entwindung der DNA führen und höhere pH- Werte die Anfarbbarkeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff beeinträchtigen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren sind - neben den oben aufgeführten - mehrere Tatsachen überraschend und für den Erfolge des Verfahrens mit ausschlaggebend: Durch den auf nochmaligen Zusatz mindestens einer Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz bei dem auf die Lyse folgenden Schritt ist völlig überraschend die Empfindlichkeit und Genauigkeit höher als die beim in DE 197 24 781 AI offenbarten Verfahren. Darüberhinaus ist beim Lyse-Schritt die Verwendung einer weniger als 4,5 molar konzentrierten Lösung einer chaotropen Substanz, beispielsweise Harnstoff, überraschend, da aus der DE 197 24 781 AI diese hohe Konzentration als zwingend vorausgesetzt angesehen worden ist (siehe auch allgemeine Lehrbücher wie beispielsweise: "Biochemie", Stryer, 4. Auflage, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg, 1990, S: 32 - 33; Verwendung einer 8 molaren Harnstofflösung bei der Lyse zur Denaturierung). Unerwarteterweise verbessert sich die Anfarbbarkeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff (Bindung des Farbstoffs an die DNA). Aufgrund dieser Tatsache erhöht sich die Genauigkeit gegenüber der in DE 197 24 781 AI offenbarten Methode dramatisch. Weiterhin kann die Konzentration einer Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanzlösung überraschenderweise weniger als 200 mmol/1 betragen, wobei auch dieser Konzentrationsbereich offenbar für eine ausreichende Entfernung von Schwermetallspuren ausreicht und darüberhinaus unerwarteterweise der störende Quencheffekt herabgesetzt werden konnte.
Die Durchführung des gesamten Verfahrens (Lyse. Entwindung, und fluoreszenzspektroskopische Auswertung) kann im Gegensatz zur FADU-Methode (Birnboim and Jevcak, Cancer Res. 1981. 41 :1889-1892) auch auf 96-Well-Mikrotiterplatten (oder Mikrotiterplatten mit einer anderen Well-Zahl) vorgenommen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch erstmals möglich, eine kontinuierliche Messung der DNA-Entwindungskinetik in ein und demselben Ansatz ohne Abstoppen der Reaktion vorzunehmen.
Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Konzentration der chaotropen Substanz 2.25 mol/1 beträgt, da bei dieser Konzentration ein Optimum zwischen Denaturierung einerseits und Anfarbbarkeit andererseits vorliegt.Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanzlösung des ersten Schrittes 0,02 mol/1 beträgt, da eine noch ausreichende Entfernung von Spuren an Schwermetallen bei gleichzeitig starker Herabsetzung des Quencheffekts sichergestellt werden kann. Die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanzlösung des zweiten Schrittes (Entwindung) beträgt vorteilhafterweise 0,02 mol/1, da höhere Konzentrationen einiger dieser Substanzen wie z.B. EDTA selbst Strangbrüche induzieren können und niedrigere Konzentrationen keinen effizienten Metallionen komplexierenden Effekt bzw. DNA-Reparaturenzyme hemmenden Effekt und keine ausreichende Pufferwirkung mehr ausüben. Die nachfolgenden Ausführungsformen sind vorteilhaft, da sich diese in der Praxis bewährt haben: Die Konzentration des Detergens (SDS) beträgt 0,00175 mol/1; es wird als chaotrope Substanz Harnstoff verwendet; es wird als Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA verwendet; der pH- Wert beträgt bei der Lyse 10,0; der pH- Wert der entstehenden Lösung nach Zugabe der Lösung des zweiten Schrittes beträgt 11,5.
Grundsätzlich sollte ein solcher pH- Wert (11,5) für die Entwindung (Denaturierung) ungeeignet sein, da beispielsweise bei der Methode der alkalischen Filterelution (siehe auch Kohn, Pharmacol. Ther., 1991, 49: 55-77; Kohn et al., Bioche istry 1976, 15: 4629-4637) ein pH- Wert zwischen 12,3 und 12,7 zwingend verwendet werden muß. Trotz des relativ niedrigen pH-Wertes findet dennoch eine Entwindung statt, die es darüberhinaus erlaubt, kinetische Bestimmungen der Entwindung vorzunehmen.
Völlig überraschend stellte es sich weiterhin heraus, daß bei diesem pH- Wert die Fluoreszenzwerte stabiler sind. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber dem bekannten Verfahren (DE 197 24 761 AI) ist die Möglichkeit, nicht nur den sogenannten SSF-Wert (Strand scission factor, Meyn and Jenkins, Cancer Res. 43, 5668; 1983) aus den Fluoreszenzwerten nach ca. 20 Minuten nach Zugabe der entsprechenden Lösungen zu den Zellen und/oder Geweben zu bestimmen, sondern auch die Neigung der DNA-Denaturierungskurve (Auftragung der Intensität der Fluoreszenz- Emission, die dem Anteil an Doppelstrang-DNA proportional ist, gegen die Zeit) zu ermitteln. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der Neigung x (-1) und dem SSF x (-l)-Wert.
Schließlich hat sich der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen als ausgesprochen zuverlässig und somit vorteilhaft bewährt.
Die Vorteile des hier beschriebenen Verfahrens liegen darin, daß
1. es die Bestimmung der DNA-Integrität auch bei niedrigen Taxa ermöglicht, deren DNA eine vergleichsweise geringe Komplexität besitzt;
2. es die Bestimmung von DNA-Integrität mit einer mehr als zweifach höheren Empfindlichkeit als das bekannte Verfahren (DE 197 24 761 AI) erlaubt;
3. es auf Mikrotiterplaten (hoher Probendurchsatz) in drei Stunden durchgeführt werden kann;
4. die Ergebnisse sowohl als SSF als auch als Geschwindigkeit der zeitabhängigen DNA-Denaturierung (= Neigung der DNA-Denaturierungskurve) angegeben werden können; und
5. der pH- Wert bei der bei dem Entwindungsschritt der DNA stabil ist und somit mit der Zeit keiner Verschiebung unterliegt, die zu einer Veränderung der Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs und damit zu einer Verfälschung des Meßergebnisses führt.
Der nachfolgende Kit zur Bestimmung von DNA-Einzelsträngen weist die oben genannten Vorteile auf: Der Kit enthält mindestens ein Detergens, mindestens eine chaotrope Substanzlösung, deren Konzentration bei der Lyse 2 bis 4 mol/1, beträgt, mindestens eine Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanzlösung, mindestens eine Lösung zur Einstellung des zur DNA-Entwindung (Schritt b.) benötigten pH- Wertes, die eine Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz enthält, und mindestens einen spezifisch DNA-Einzelstrang- oder DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff. Die nachfolgenden Ausführungsformen des Kits sind aus obigen Gründen und wegen ihrer Bewährung in der Praxis als vorteilhaft anzusehen: Die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz bei der Lyse beträgt 0,005 bis 0,1 mol/1; der pH-Wert beim Versetzen der die lysierten Zellen/Gewebe enthaltenden Suspensionen mit der Lösung zur Einstellung des zur DNA-Entwindung benötigten pH-Wertes beträgt 11 bis 12; die Konzentration der Metallionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz nach der Einstellung des zur DNA-Entwindung benötigten pH- Wertes beträgt 0,005 bis 0,1 mol/1; als Detergens wird SDS verwendet; als chaotrope Substanz wird Harnstoff verwendet; als Metallionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz wird EDTA verwendet; als Fluoreszenzfarbstoff wird PicoGreen verwendet.
Die nachfolgenden Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Kits weisen die oben aufgeführten überraschenden und vorteilhaften Eigenschaften ebenso auf. Es geht hierbei um Verwendungen zum:
• Nachweis von DNA-Einzelstrangbrüchen in humanen, tierischen oder pflanzlichen Geweben und Zellen, in Bakterien und Einzellern, in Zellinien humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs und subzellulären Fraktionen, sowie in isolierter DNA;
• Nachweis von DNA-Reparatur in humanen, tierischen oder pflanzlichen Geweben und Zellen, in Bakterien und Einzellern, in Zellinien humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, subzellulären Fraktionen, Zell-Lysaten und Zeil-Extrakten (isolierte Moleküle);
• Messung des Auftretens von DNA-Einzelstrangbrüchen und deren Reparatur nach Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Behandlung mit Gentoxinen in humanem und tierischem Probenmaterial, Gewebeschnitten und Zellsuspensionen;
• Nachweis von DNA-Einzelstrangbrüchen in gefrorenen Untersuchungsmaterialien (beispielsweise Biopsieproben) nach deren schonender Homogenisation in flüssigem Stickstoff oder flüssiger Luft in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels (beispielsweise Dimethylsulfoxid);
• Nachweis des Auftretens von DNA-Einzelstrangbrüchen und deren Reparatur bei berufsbedingter Exposition von Personen, die entweder bei ihrer beruflichen Arbeit (beispielsweise Flugpersonal, Röntgenärzte) oder infolge von Unfällen (beispielsweise Reaktorunfalle) mit DNA-schädigenden Substanzen oder Strahlen in Kontakt kommen;
• Messung des Auftretens von DNA-Einzelstrangbrüchen und deren Reparatur in Testorganismen, Geweben. Zellen oder Zellinien bei der Gewässerüberwachung.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Figur 1 : Diese Figur stellt die DNA-Strangbrüche (angegeben als SSF x (-1)) in den Kiemen von Mytilus galloprovincialis dar nach der Behandlung der DNA im TE-Homogenat (TE:10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA; pH 7,4) mit Bleomycin, bestimmt mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens (Einzelstrang-Verfahren) (schwarze Balken) und des in DE 197 24 761 AI offenbarten Verfahrens (weiße Balken). Beispiele für die Durchführung des Assays (Einzelstrang- Verfahren):
Materialien: Die bei den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendeten Chemikalien wurden von E. Merck (Darmstadt, Deutschland) oder von Sigma (St. Louis, USA) bezogen. Der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen wurde von Molecular Probes, Leiden, Niederlande, erworben. Durchführung des Assays: Die Detektion erfolgte in den geschilderten Beispielen mittels eines Fluoreszenz-ELISA-Platten-Readers (Fluoroskan II, Labsystems, Helsinki, Finnland). Lösungen:
PicoGreen dsDNA-Quantifϊzierungsreagenz Stock in DMSO (Molecular Probes); TE-Puffer: 10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, pH= 7,4; Lyselösung: 4,5 mol/1 Harnstoff, 0,1 % SDS, 40 mmol/1 EDTA, pH=10,0; Lyselösung mit PicoGreen: Verdünnung der Original-PicoGreen-Lösung: 20 μl/ml Lyselösung NaOH-EDTA-Lösung: Aus einer 0,4 molaren NaOH-Lösung, enthaltend 20 mmol/1 EDTA, wird durch Verdünnung mit einer 20 mmolaren EDTA-Lösung eine 0,2 molare NaOH-EDTA-Lösung hergestellt. Aus dieser Lösung wird die NaOH-EDTA- Arbeitslösung durch weitere Verdünnung mit der 20 mmolaren EDTA-Lösung unmittelbar vor den Experimenten hergestellt (pH = 11,50). Vorgehensweise: a.) Es wird eine Zellsuspension in TE-Puffer mit einem pH von 7,4 (falls bequemer, im Zentrifu- gationsmedium) hergestellt mit einer Zelldichte von 150 x 103 Zellen/ml. (Anmerkung: in Experimenten mit Lymphozyten etwa 3500 - 4500 Zellen/25μl, ca. 30 ng DNA), b.) Die Lyse der Zellen findet direkt in den Wells von schwarzen Mikrotiterplatten für 40 min bis 1 h im Dunkeln auf Eis statt. Zu 25 μl Zellsuspension pro Well werden langsam 25 μl Lyselösung mit PicoGreen hinzugefügt. Es darf nicht gemischt und nicht geschüttelt werden, c.) Die DNA-Entwindung läßt man bei pH 11,50 wie folgt ablaufen: Zu jeder Probe (pro Well) werden 250 μl der NaOH-EDTA-Lösung hinzugegeben, um einen pH von 11,50 zu erhalten, d.) Messung der Intensität der Fluoreszenz-Emission über einen Zeitraum von bis zu 1 h, z.B. alle 5 min; bei Verwendung von PicoGreen: Exzitation: 480 nm; Emission: 520 ran. Als Fluoreszenz-Leerwert wird die Fluoreszenz einer Mischung von 25 μl TE-Puffer, 25 μl Lyselösung mit PicoGreen und 250 μl der NaOH-EDTA-Arbeitslösung gemessen, e.) Berechnung: Da jede Probe im Hinblick auf den Leerwert korrigiert werden muß, wird von den Werten der Mittelwert des Leerwertes subtrahiert. Es werden Mehrfachbestimmungen durchgeführt (in der Regel 4 - 6 Bestimmungen). Der Prozentsatz an doppelsträngiger DNA (dsDNA) für die nichtbehandelten (beispielsweise nicht bestrahlte oder nicht mit Substanz behandelte Zellen) zum Zeitpunkt 0 wird als 100 % dsDNA gesetzt. Die gemessenen Effekte werden als "Strand Scission Factor" (SSF) ausgedrückt und nach einem Entwindungs- Zeitraum von 20 Minuten folgendermaßen berechnet: SSF = log(% dsDNA in der behandelten Probe/ % dsDNA in der Kontrollprobe). Negative Werte für SSF zeigen eine erhöhte Frequenz von DNA-Strangbrüchen an. Für graphische Auftragungen werden die im Falle von DNA-Strangbrüchen negativen SSF- Werte mit (-1) multipliziert (Darstellung der SSF x (-1) - Werte). Durchführung des Assays bei Gewebeproben:
Das Protokoll für Gewebe entspricht dem für Zellsuspensionen mit folgenden Modifikationen:
1. Das Gewebe muß sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
2. Die benötigte Gewebe-Menge pro Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte beträgt ca. 25 μg.
3. Man homogenisiert 10 mg des Gewebes in 1 ml Homogenisationspuffer in einem Mörser mit einem Pistill unter flüssigem Stickstoff. Homogenisationspuffer: TE-Puffer (siehe oben) oder anderer geeigneter Puffer mit 10 % Cryoprotektor (Dimethylsulfoxid).
4. Man verdünnt das Homogenisat 10-fach mit TE-Puffer.
5. In jede Vertiefung (Well) wird 25 μl des Homogenisats gegeben; dann werden 25 μl der Lyselösung mit PicoGreen (siehe oben) hinzugegeben.
6. Weiter wird entsprechend der Prozedur für Zellsuspensionen vorgegangen.
Bestimmung der DNA-Einzelstrangbrüche in der Miesmuschel Mvtilus galloprovincialis nach Behandlung der DNA im TE-Homogenat von Kiemen mit Bleomycin
Durchführung: Kiemen der Miesmuschel Mytilus galloprovincialis wurden homogenisiert nach dem in DE 197 24 761 AI beschriebenen Verfahren in TE-DMSO-Puffer (DMSO = Dimethylsulfoxid), verdünnt zu einer Konzentration von 30 ng DNA/25 μl und anschließend mit Eisen aktiviertem Bleomycin für 3 min auf Eis behandelt. Danach wurde die DNA sowohl nach dem in DE 197 24 761 AI beschriebenen Verfahren als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Die Bestimmung der DNA-Einzelstrangbrüche erfolgte unmittelbar nach der Inkubation. Ergebnis: Figur 1 zeigt, daß mit dem herkömmlichen Verfahren kein Nachweis einer Induktion von DNA-Schäden (Einzelstrangbrüche) möglich ist. Dagegen ist das hier beschriebene Verfahren in der Lage, die bei Bleomycin-Behandlung auftretenden DNA-Einzelstrangbrüche bereits bei Inkubation in Gegenwart von einer Konzentration von 2.5 μmol/1 Bleomycin nachzuweisen. Mit zunehmendem Anstieg der Bleomycin-Konzentration kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Zunahme der DNA-Einzelstrangbrüche (Zunahme von SSF x (-1)).
Figur 2: stellt die Abhängigkeit des Auftretens von DNA-Doppelstrangbrüchen, ausgedrückt in Form des SSF x (-1)- Wertes, in HeLa-Zellen nach Inkubation der Zeilen für 4 Stunden in Gegenwart verschiedener Konzentration an Bleomycin dar (Doppelstrang-Verfahren; 3800 Zellen/Well). Figur 3: eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform gemäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum kontrollierten Filtrieren mittels Absaugeinrichtung;
Figur 4: eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform gemäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum kontrollierten Filtrieren mittels Druckbeaufschlagungseinrichtung.
Beispiele für die Durchführung des Assavs (Doppelstrang-Verfahren):
Materialien: Die bei den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendeten Chemikalien wurden von E. Merck (Darmstadt) oder Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) erworben. Der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen wurde von Molecular Probes, Leiden, Niederlande, bezogen. Durchführung des Assays: Die Detektion erfolgt in den geschilderten Beispielen mittels eines Fluorimeters (Fluoreszenz-Miktrotiterplatten-Readers; z.B. Fluoroskan II der Firma Labsystems). Benötigte Materialien:
1. 96- Well-Filterplatten (Filtrationsplatten), an deren Wells 96 unabhängige Membranen verschweißt sind, z.B. MultiScreen Filtrationsplatten der Firma Millipore GmbH (Eschborn, Deutschland) (z.B. GV, 0,22 μm Durapore).
2. 96-Well-Mikrotiterplatten.
3. Eine weiter unten ausführlich dargestellte Vorrichtung zum kontrollierten Filtrieren mittels einer Absaugeinrichtung oder einer Druckbeaufschlagungseinrichtung.
Lösungen:
1. PicoGreen dsDNA-Quantifizierungsreagenz Stock in DMSO (Molecular Probes)
2. TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4
3. Lyselösung: 40 mM EDTA, 4,5 M Harnstoff, 0,1 Gew.-% SDS, pH 10
4. Lyselösung mit PicoGreen: Verdünnung der Original-PicoGreen-Lösung: 20 μl/ml Lyselösung
5. Elutionslösung: aus 10 ml TE-Puffer plus 10 ml Lyselösung plus 100 ml bidest. Wasser Vorgehensweise:
1. Es wird eine Zellsuspension in TE-Puffer mit einem pH von 7,4 hergestellt mit einer Zelldichte von 150.000/ml. (etwa 3500 - 4500 Zellen/25 μl, ca. 30 ng DNA).
2. Die Lyse der Zellen findet in den Wells der 96-Well-Filtrationsplatten für 40 min bei Raumtemperatur im Dunkeln statt. Zu 25 μl Zellsuspension (pipettiert auf der Filter-membranober- fläche) werden langsam 25 μl Lyselösung mit PicoGreen hinzugefügt.
3. In einem Parallelansatz (zur Bestimmung der Gesamt-DNA pro Well; = Totalwert) wird die Lyse der Zellen in den Wells einer schwarzen 96-Well-Mikrotiterplatte wie unter 2. beschrieben durchgeführt. Vom Totalwert wird anschließend die Fluoreszenz gemessen.
4. Zugabe von 250 μl Aqua bidest. pro Well der 96-Well-Filtrationsplatten und der schwarzen 96-Well-Mikrotiterρlatte.
5. Nach Anstellen der Vakuumpumpe werden die Lösungen in den Wells der 96-Well- Filtrationsplatten mit niedriger Geschwindigkeit (35 μl pro Well pro Minute) durch die Filter hindurchgesaugt (Dauer: 7 min). Die Filtrate werden in einer sich im Vakuumhalter unter der Filtrationsplatte befindenden schwarzen 96-Well-Mikrotiterplatte gesammelt. Die Fluoreszenz der DNA-PicoGreen-Komplexe in den Filtraten wird anschließend gemessen.
6. Messung der Fluoreszenz (bei PicoGreen: Exzitation: 480 ran; Emission: 520 nm). Fluoreszenz-Leerwerte werden erhalten, indem in den Schritten 2 und 3 25 μl Lyselösung mit PicoGreen zu 25 μl Wasser (oder TE-Puffer) ansteile der Zellsuspension pipettiert wird.
7. Berechnung: Für jede Probe sowie für den Leerwert werden Mehrfachbestimmungen durchgeführt (4 - 6 Bestimmungen). Die Proben werden im Hinblick auf den Leerwert korrigiert, indem von den gemessenen Werten der Mittelwert des Leerwertes subtrahiert wird. Die Ergebnisse werden angegeben als "DNA Filter Ratio" (DFR). Die Berechnung des DFR erfolgt nach der Formel: [(tDNA - Σ fDNA„) / tDNA] x 100, mit n = Fraktionsnummer; tDNA - Totalwert der Fluoreszenz; fDNAn - Fluoreszenz der Fraktion n. Im Falle der Sammlung einer Fraktion ist n=l. Niedrige DFR- Werte zeigen eine erhöhte Zahl von DNA- Doppelstrangbrüchen an. Alternativ können die Ergebnisse in Form des "Strand Scission Factors" (SSF) angegeben werden. In diesem Fall erfolgt die Berechnung nach der Formel: SSF = log (DFRp/ DFRk). DFRp = DFR- Wert für die zu bestimmende Probe; DFRk = DFR- Wert für die Kontrolle. Negative SSF- Werte zeigen eine erhöhte Zahl an Doppelstrangbrüchen an.
Durchführung des Assays bei Gewebeproben:
Das Protokoll für Gewebe entspricht dem für Zellsuspensionen mit folgenden Modifikationen:
1. Das Gewebe muß sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und aufbewahrt werden (eine Aufbewahrung über kürzere Zeiträume kann auch bei - 80 °C erfolgen).
2. Die Gewebe-Menge pro Well der Mikrotiterplatte beträgt üblicherweise ca. 25 μg.
3. Man homogenisiert 10 mg des Gewebes in 1 ml Homogenisationspuffer in einem Mörser mit einem Pistill unter flüssigem Stickstoff. Homogensationspuffer: TE-Puffer (siehe oben) oder anderer geeigneter Puffer mit 10 % Cryoprotektor (Dimethylsulfoxid, Glycerin etc.).
4. Man verdünnt das Homogenisat 10-fach mit TE-Puffer.
5. In jedes Well der 96-Well-Filtrationsplatte wird 25 μl des Homogenisats gegeben; DNA werden 25 μl der Lyselösung mit PicoGreen (siehe oben) hinzugegeben.
6. Weiter wird entsprechend der Prozedur für Zellsuspensionen vorgegangen.
Bestimmung der DNA-Doppelstrangbrüche in HeLa-Zellen nach Inkubation mit Bleomycin Durchführung: HeLa-Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Bleomycin (Induzent von DNA-Doppelstrangbrüchen; Byrnes and Petering, Rad. Res. 137: 162; 1994) für 4 Stunden inkubiert. Ergebnis: Figur 2 zeigt eine konzentrationsabhängige Zunahme der DNA- Doppelstrangbrüche [SSF x (-1) - Werte] nach Inkubation der Zeilen mit Bleomycin.
Vorrichtungen zum kontrollierten Filtrieren von flüssigen Medien mit Well-Filterplatten
Beschreibung der Absaug-Filtrationsvorrichtung
Die in Figur 3 wiedergegebene Absaugfiltrationsvorrichtung besteht aus folgenden Teilen:
1 Acrylglasaufsatz bestehend aus einem äußeren Acrylglasrahmen und einer darauf aufsitzenden Acrylglasplatte. In dem äußeren Acrylglasrahmen befindet sich ein eingepaßtes Belüftungsrohr (la) mit damit verbundenem Ventil zur Regulation des Vakuums in der oberen Vakuumkammer (nicht gezeigt in Figur 3). Durch den Umströmhahn (lb) kann je nach Stellung die obere von der unteren Vakuumkammer getrennt oder verbunden werden, (lc) Bohrung im Acrylglasaufsatz, die durch den Umstömhahn geöffnet bzw. geschlossen werden kann.
2 Dichtungsring zwischen dem Acrylglasaufsatz und der 96- Well-Filterplatte (angebracht an der Innenseite des Deckels des Acrylglasaufsatzes).
3 96- Well-Filterplatte mit eingeschweißten Filtern (z.B. Millipore MAGV N22). 4 Spacer zwischen der 96- Well-Filterplatte und der schwarzen 96-Well-Mikrotiterplatte.
5 Schwarze 96-Well-Mikrotiterplatte (z.B. Maxisorb der Fa. Nunc).
6 Dichtungsring, der am unteren Rand des Acrylglasaufsatzes befestigt ist (aus Abbildung nicht erkenntlich) und der den Acrylglasaufsatz gegen die Bodenplatte abschließt.
7 Bodenplatte mit 4 Füßen und in der Mitte der Bodenplatte nach obenhin endender Bohrung sowie eingesetztem Saugrohr (7a) für den Anschluß an eine Vakuumquelle.
Arbeitsprinzip: Die Filtrationsvorrichtung weist einen Acrylglasaufsatz (1) auf, der auf eine Bodenplatte (7) plaziert wird. Durch die im unteren Rand des Acrylglasaufsatzes vorhandene Silicondichtung (6) kann der Raum unter dem Aufsatz luftdicht abgeschlossen werden. Unter diesen Acrylglasaufsatz werden eine leere Mikrotiterplatte (5) und eine bereits mit Proben bestückte Füterplatte (3) so angeordnet, daß die Füterplatte auf der Mikrotiterplatte und diese auf der Bodenplatte zu liegen kommt (s. Fig. 3). Daß sich dabei ein WeU der Füterplatte direkt über dem entsprechenden Weü der Mikrotiterplatte befindet, wird dadurch gewährleistet, daß die beiden Platten exakt in den Acrylglasaufsatz eingepaßt sind, so daß ein Verschieben der Platten gegeneinander nicht möglich ist. Unter dem Acrylglasaufsatz befinden sich zwei getrennte Lufträume, einen oberen Luftraum, der sich zwischen Acrylglasaufsatzdeckel und Füterplattenoberseite befindet, und einen unteren, der von der Füterplattenunterseite bis zur Bodenplatte reicht. Die Trennung der beiden Lufträume wird durch eine Silicondichtung erreicht, die sich nach dem Aufbau des Gerätes zwischen der Deckenplatte des Acrylglasaufsatzes und der Oberseite (randständige Partien) der Füterplatte befindet. Diese beiden Kammern (Lufträume) stehen jedoch zunächst durch eine Bohrung (lc) in der Wand des Acrylglasaufsatzes miteinander in Verbindung. Über einen Umströmhahn (lb) kann diese Verbindung geschlossen bzw. geöffnet werden. Nach korrekter Zusammensetzung der einzelnen Komponenten der Apparatur kann nun eine Vakuumqueüe an das Saugrohr (7a) angeschlossen werden. Das Saugrohr büdet den Abschluß einer Bohrung in der Bodenplatte, deren anderes Ende sich in der Mitte der Bodenplatte der unteren Kammer befindet. Zwei schmale Spacer (4), die zwischen Füterplatte und Mikrotiterplatte gelegt werden, verhindern, daß bei Anlegen des Vakuums durch ein zu dichtes Aufsitzen der Füterplatte die Wells der Mikrotiterplatte verschlossen werden und damit vom unteren Kammerraum abgetrennt werden. Wenn die Verbindung zwischen der unteren und oberen Kammer mit Hufe des Umströmhahns geöffnet ist, wird nach Anlegen des Vakuums sowohl die untere als auch die obere Kammer evakuiert. Bei Anlegen des Vakuums muß diese Verbindung immer geöffnet sein, um ein gleichmäßiges Evakuieren der beiden Kammern zu gewährleisten. Danach wird die Verbindung zwischen den beiden Kammern geschlossen, indem der Umströmhahn um 180° gedreht wird. Die beiden Kammerräume sind danach vollständig voneinander getrennt. Nun wird die obere Kammer durch Öffnen des Ventils am im Acrylglasaufsatz integrierten Belüftungsrohr belüftet, wobei die untere Kammer evakuiert bleibt. Durch den dadurch entstehenden höheren Unterdruck in der unteren Kammer im Vergleich zur oberen Kammer werden die in die Weüs der Füterplatte pipet- tierten Proben durch die den Boden der Weüs büdenden Füter in die untere Kammer gesaugt, wobei das Filtrat in den Weüs der Mikrotiterplatte aufgefangen wird. Die Filtrationsgeschwindigkeit kann mittels des Ventils am Belüftungsrohr reguliert werden. Zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen wird eine Filtrationsgeschwindigkeit von 300 μl/15 min pro Weü empfohlen. Das angelegte Vakuum bleibt während des gesamten Fütrati- onsvorgangs angeschaltet. Nach voüständiger Fütration kann der Acrylaufsatz abgenommen werden, wobei das Fütrat in den Mikrotiterplatten für weitere Untersuchungen zur Verfügung steht.
Unterschied zu anderen Apparaten: Das im Vergleich zu herkömmlichen Apparaten (z.B. Ab- saugfütrationsvorrichtung "Vakuum-Manifbld" der Fa. Millipore GmbH) Neue des in Figur 3 gezeigten Apparates besteht darin, daß zunächst durch Verbindung der Öffnung 7a mit der Vakuumquelle sowohl in der oberen als auch in der unteren Kammer der gleiche Unterdruck anliegt und somit eine Abdichtung der Apparatur nach außen hergesteüt wird. Im zweiten Schritt wird DNA durch UmsteUen des Umströmhahns lb die Verbindung zwischen oberer und unterer Kammer getrennt. Durch Öffnen der Bohrung la und den über das Ventü kontrollierten Einstrom von Außenluft wird dann der Druck in der oberen Kammer so eingesteüt, daß ein Durchsaugen der Lösung durch die Füter mit kontinuierlicher und den experimenteüen Bedingungen angepaßter Geschwindigkeit stattfindet. Das Prinzip dieser Konstruktion erlaubt ein langsames und kontinuierliches Hindurchsaugen von Lösung durch die Füter bei nur geringen Druckunterschieden zwischen der oberen und der unteren Kammer. Dies ist bei herkömmlichen Absaugfiltrationsvorrich- tungen (z.B. Vakuum-Manifbld der Firma Mülipore GmbH) nicht möglich, da der für das Ingangsetzen des Saugvorgangs notwendige Ansaugdruck (Anpreßdruck an den Dichtungsring) bei diesen Geräten eine größere Druckdifferenz zwischen den Räumen oberhalb und unterhalb des Füters erfordert. Auch läßt sich das Regelventü nicht soweit herunterregeln, daß die erforderliche langsame Filtrationsgeschwindigkeit (20 μl/min und darunter bei Verwendung von 96-Weü-Mi- kro filterplatten mit einem Fassungsvolumen von 300 μl/Weü) erreicht wird, die zur Messung von DNA-Doppelstrangbrüchen bei Anwendung des hier vorliegenden Verfahrens benötigt werden.
Abgrenzung dieser Fütrationsvorrichtung von der in der Patentanmeldung EP 0359249 beschriebenen Fütrationsvorrichtung: In der Patentanmeldung EP 0359249 wird eine Fütrationsvorrichtung beschrieben, bei der ebenfalls eine Mikrofilterplatte und eine Mikrotiterplatte verwendet wird. Das dieser Apparatur zugrundeliegende Prinzip unterscheidet sich jedoch von demjenigen der in der vorüegenden Anmeldung beschriebenen ersten Fütrationsvorrichtung. So wird bei dem hier beschriebenen Gerät im Gegensatz zu der in der Patentanmeldung EP 0359249 beschriebenen Fütrationsvorrichtung zunächst in beiden Kammern ein Unterdruck erzeugt, der dann in der einen (oberen) Kammer soweit herabgesetzt wird, bis der Filtrationsvorgang mit der gewünschten Geschwindigkeit abläuft. Eine Klammer wird bei der hier beschriebenen Vorrichtung im Gegensatz zu der in EP 0359249 beschriebenen Filtrationsvorrichtung nicht verwendet.
Der Vorteil der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Konstruktion besteht darin, daß hierbei der bei anderen Apparaturen für die Erzeugung des luftdichten Verschlusses notwendige Anpreßdruck, der zu einem zu schnellen initialen Durchtritt von Flüssigkeit durch die Füter führen würde, umgangen wird. Für die Anwendung der von uns für die DNA-Strangbruchbestimmungen benötigten Fü- trationsvorrichtungen ist ein konstanter Flüssigkeitsstrom durch die Füter essentieU. Weiterhin muß betont werden, daß die Porenweite der Füter der von uns für die DNA-Strangbruchbestimmungen verwendeten Füterplatten so gering ist, daß eine Fütration infolge Gravitation nicht möglich ist. Aufgrund der geringen Porenweite könnte eine Fütration nach dem in der Patentanmeldung EP 0359249 für das Beispiel Zellkultur beschriebenen Prinzip nicht Zustandekommen.
Weiterhin ist das in der Patentanmeldung EP 0359249 durch die dort beschriebene Apparatur gelöste Problem insofern nicht mehr aktueü, da die Mikrofilterplatten inzwischen kommerzieU als relativ preiswerte "Wegwerfartikel" erhältUch sind (Firma Müüpore). Bei den in der vorUegenden Anmeldung beschriebenen Fütrationsvorrichtungen kommen bei dem Fütrationsvorgang lediglich die benutzten Mikrofilterplatten und die Mikrotiterplatten (beides "Wegwerfartikel") mit den untersuchten Proben in Kontakt, es entfäUt also die komplizierte (oder nach Fütration radioaktiver oder infektiöser Proben eventueU nur schwer durchzuführende Reinigung der Geräte.
Beschreibung der Druckfiltrationsvorrichtung
Die in Figur 4 wiedergegebene Druckfütrationsvorrichtung besteht aus folgenden Teüen:
1" Acrylglasgehäuse (1") bestehend aus rechteckiger Bodenplatte (la") und zwei mit den Längsseiten fest verbundenen Seitenplatten (lb" und lc"), sowie einem aufklappbaren Acrylglasdeckel (ld"). An der Innenseite des Aufklappdeckels befindet sich eine Gummidichtung (le"), die nach dem SchUeßen des Deckels auf dem äußeren Rahmen der 96- Weü-Füterplatte aufsitzt. Weiterhin befindet sich an der vorderen Seite des Acrylglas- deckels eine Verschlußklemme (lf ') zum sicheren Andrücken der Gummidichtung an die 96-WeU-FUterplatte nach Schließen der Apparatur. Auf der Hinterseite des Acrylglas- deckels befindet sich ein Regelventil (lg", z.B Festo GR-M5B) mit Verbindungsbohrung zum Raum oberhalb der Füterplatte, das gleichzeitig zum Anschüeßen an eine Preßluftquelle (z.B. Hauspreßluft, Stickstofflasche oder Aquarienpumpe) dient.
2" 96-WeU-Füterplatte, eingeführt über die vordere Öfiiung des Acrylglasgehäuses entlang den beiden an den Seitenplatten angebrachten Führungsleisten (lh") bis zum Anschlag an den mit der unteren Acrylglasplatte verbundenen Acrylglasblock (li").
3" schwarze 96-WeU-Mikrotiterplatte zum Auffangen des FUtrats.
Arbeitsprinzip: Der Deckel (ld") des Acrylglasgehäuses (1"), der über ein Scharnier mit diesem verbunden ist, wird nach oben geöffnet, um das Plazieren der Füterplatte (2") und der Mikrotiterplatte (3") im Innern des Gehäuses zu ermögüchen. Die leere Mikrotiterplatte wird auf den Boden (la") des Gehäuses gesteUt. Die bereits mit Proben gefüUte Füterplatte wird in die zwei Führungsleisten (lh"), die sich auf halber Höhe in Innern des Gehäuses an dessen Seitenwänden (lb" und lc") befinden, eingeschoben (siehe Figur 4). Durch SchUeßen des Deckels und Anziehen der Verschlußklemme (lf ') werden die beiden Platten gegen einen Anschlag (li") geschoben, der sich an dem der Öffnung gegenüberüegenden Ende befindet. Dadurch werden die beiden Platten automatisch so positioniert, daß ein WeU der Füterplatte direkt über dem entsprechenden WeU der Mücrotiterplatte gelegen ist. Durch SchUeßen des Deckels wird außerdem die in der Unterseite des Acrylglasdeckeis integrierte Gummidichtung auf die Oberseite der Füterplatte gedrückt. Dadurch entsteht ein kleiner luftdicht abgeschlossener Raum zwischen Acrylglasdeckel und Füterplatte. Nun kann eine DruckqueUe, die über die Bohrung und das Regelventü (lg") mit dem Raum zwischen Acrylglasdeckel und Füterplatte in Verbindung steht, aktiviert werden. Der somit auf die Flüssigkeitssäule in den Wells der Füterplatte ausgeübte Druck ermögücht die Fütration, wobei die Fütrationsgeschwindigkeit durch das Regelventü, welches die Gasmenge (Luftmenge), die auf die Füterplatte strömt, bis auf nahezu Null herabregeln kann, bestimmt wird. Die Stärke des Druckes soüte mögüchst an der DruckqueUe selbst gut einsteUbar sein. Die durch die Füter durchgetretene Flüssigkeit wird von der Mikrotiterplatte aufgefangen. Zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen ist eine Fütrationsgeschwindigkeit von etwa 300 μl/15 min pro WeU geeignet. Nach voUendeter Fütration und Unterbrechung der Gaszufuhr können die beiden Platten aus dem Acrylglasgehäuse entfernt werden und das FUtrat in der Mikrotiterplatte weiter untersucht werden. (Die Funktion der Klammer bei dieser Apparatur besteht darin, ledigUch einen luftdichten Abschluß oberhalb der Fütrationsplatte sowie eine genaue Positionierung der Füterplatte und der Mikrotiterplatte herzusteUen.)
Unterschied zu anderen Apparaten: Das im Vergleich zu herkömmüchen Apparaten Neue des in Figur 4 gezeigten Apparates besteht darin, daß die Fütration der in die Weüs der 96-WeU- Füterplatte pipettierten Lösungen durch Anlegen eines Überdruckes oberhalb der Füterplatte und nicht durch Anlegen eines Unterdruckes (Vakuum) unterhalb der Füterplatte durchgeführt wird. Ein Vorteil des in dieser Apparatur angewandten Prinzips besteht darin, daß der Fütrationsvor- gang mit konstanter Geschwindigkeit durchgeführt werden kann ohne Auftreten des bei Absaugvorrichtungen, die durch Anlegen eines Unterdrucks betrieben werden, auftretenden initialen Drucksprungs infolge des Ansaugvorgangs (Anpreßvorgang an den Dichtungsring). Der Überdruck im Raum oberhalb der 96-WeU-Füterplatte kann neben den oben genannten DruckqueUen z.B. auch durch Anlegen einer Aquarienluftpumpe erzeugt werden. Außerdem sind Personen bei der Benutzung des Gerätes zur Fütration radioaktiver Materiaüen während des Fütrationsvorgan- ges vor Strahlung durch die 10 mm dicken strahlenabsorbierenden Acrylplatten geschützt.
Vorteüe der zweiten Apparatur: Die Vorteü der hier beschriebenen Druck-Fütrationsvorrich- tung im Vergleich zu herkömmüchen Apparaturen üegt insbesondere in ihrer einfachen Handhabbarkeit. Sie ermögUchen eine Fütration auch dann, wenn keine DruckluftqueUe vorhanden ist. Somit ist mit diesem Gerät auch für Untersuchungen außerhalb eines mit einer Druckluftquelle ausgestatteten Labors, zum Beispiel auf einem Forschungsschiff (Untersuchung von DNA-Schäden in marinen Organismen), mögUch. Weiterhin ermögUcht die besondere Konstruktion der Druck-Fütrationsvorrichtung eine Abschirmung von Strahlung im FaUe der Benutzung der Geräte für die Filtration radioaktiver Materiaüen. Für Filtrationsvorgänge von sauerstoffempfindUchen Substanzen können ansteüe der Druckluft inerte Gase enthaltende Druckflaschen benutzt wer- den.Vergleichbare Apparaturen für Mikrofilterplatten sind kommerzieU nicht erhältUch.

Claims

Patentansprüche
1.) Verfahren zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen mit folgenden Schritten: (a) Aufgabe von zu untersuchenden ZeUen und/oder Geweben auf spezifische Füter; (b) Lyse der ZeUen Gewebe mit mindestens einem Detergens, mindestens einer chaotropen Substanz, mindestens einer MetaUionen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz und mindestens einem spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff, oder Lyse der ZeUen/Gewebe mit mindestens einem Detergens, mindestens einer chaotropen Substanz, mindestens einer Protease und mindestens einem spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff; (c) Elution der durch die Lyse freigesetzten DNA-Bruchstücke durch die spezifischen Füter, wobei pro WeU nur eine Eluat-Fraktion gesammelt wird; (d) Durchrühren einer fluoreszenzspektroskopischen Auswertung.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Lyse-Schritt als chaotrope Substanz Harnstoff mit einer Konzentration von 2,25 mol 1 und als MetaUionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA mit einer Konzentration von 0,02 mol/1 verwendet wird, die Konzentration des Detergens 0,00175 mol/1 beträgt und der pH- Wert bei der Lyse 10 beträgt.
3.) Kit zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen, enthaltend: mindestens ein Detergens, mindestens eine chaotrope Substanz, mindestens eine MetaUionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz, mindestens einen spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff und mindestens einen spezifischen Fütertyp oder mindestens ein Detergens, mindestens eine chaotrope Substanz, mindestens eine Protease, mindestens einen spezifisch DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff und mindestens einen spezifischen Fütertyp
4.) Vorrichtung zum kontrollierten FUtrieren von flüssigen insbesondere DNA-Moleküle enthaltenden Medien mit WeU-Füterplatten, mit mindestens einer Weü-Füterplatte (3), mindestens einer korrespondierenden Mikrotiterplatte (5) und einer Absaugeinrichtung (7a), gekennzeichnet durch: zwei voneinander getrennte, ober- und unterhalb der Füterplatte angeordnete Gasräume; mindestens eine mit einem Behältnis (1) und der WeU-Füterplatte (3) zusammenwirkende und damit eine voüständige Trennung der beiden Gasräume erzeugende Dichtungseinrichtung (2); eine Einrichtung (lb,lc) zum Verbinden beider Gasräume; eine Einrichtung (la) zum Druckausgleich zwischen Umgebung und einem Gasraum.
5.) Vorrichtung zum kontroUierten FUtrieren von flüssigen insbesondere DNA-Moleküle enthaltenden Medien mit WeU-Füterplatten, mit mindestens einer WeU-Füterplatte (2"), mindestens einer korrespondierenden Mikrotiterplatte (3"), gekennzeichnet durch: zwei voneinander getrennte, ober- und unterhalb der Füterplatte angeordnete Gasräume; mindestens eine mit einem Behältnis (1") und der WeU-Füterplatte (2") zusammenwirkende und damit eine voüständige Trennung der beiden Gasräume erzeugende Dichtungseinrichtung (le"); eine für einen Gasraum fungierende Druckbeaufschlagungseinrichtung (lg").
6.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Bestimmung von DNA-Doppelstrangbrüchen und zum kontroUierten FUtrieren von flüssigen insbesondere DNA-Moleküle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 und 5 verwendet wird.
7.) Verfahren zur Bestimmung von DNA-Einzelstrangbrüchen mit folgenden Schritten: (a) Lyse von zu untersuchenden ZeUen und/oder Geweben mit mindestens einem Detergens, mindestens einer chaotropen Substanz in Gegenwart mindestens einer MetalUonen komplexierenden und DNA-Reparaturenzyme hemmenden Substanz und mindestens einem spezifisch DNA-Einzelstrang oder DNA-Doppelstrang bindenden Fluoreszenzfarbstoff; (b) Versetzen der die lysierten ZeUen und/oder Gewebe enthaltenden Suspension mit mindestens einer Lösung, die es erlaubt, diese Suspension auf einen alkaüschen pH- Wert einzustellen und die mindestens eine MetalUonen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz aufweist; (c) Durchführen einer fluoreszenzspektroskopischen Auswertung,
8.) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß beim Lyse-Schritt als chaotrope Substanz Harnstoff mit einer Konzentration von 2,25 mol/1, als MetalUonen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA mit einer Konzentration 0,02 mol/1 und als Detergens SDS mit einer Konzentration von 0,00175 mol/1, bei Schritt b.) als MetaUionen komplexierende und DNA-Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA mit einer Konzentration 0,02 mol/1 verwendet wird und der pH- Wert beim Lyse-Schritt 10 und im Schritt b.) 11,5 beträgt.
9.) Kit zur Bestimmung von DNA-Einzelstrangbrüchen, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergens SDS, als chaotrope Substanz Harnstoff, als MetaUionen komplexierende und DNA- Reparaturenzyme hemmende Substanz EDTA und als Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen verwendet wird.
10.) Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 2, 6, 7 und 8 und des Kits nach einem der Ansprüche 3 und 9 (a) zum Nachweis von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen in humanen, tierischen oder pflanzUchen Geweben und Zellen, in Bakterien und Einzellern, in ZeUinien humanen, tierischen oder pflanzUchen Ursprungs und subzeUulären Fraktionen, sowie in isoUerter DNA; (b) zum Nachweis von DNA-Reparatur in humanen, tierischen oder pflanzUchen Geweben und ZeUen, in Bakterien und EinzeUern, in ZeUinien humanen, tierischen oder pflanzUchen Ursprungs, subzellulären Fraktionen, Zell-Lysaten und ZeU-Extrakten (isoUerte Moleküle); (c) zur Messung des Auftretens von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen und deren Reparatur nach Bestrahlung, Chemotherapie und/oder Behandlung mit Gentoxinen, Muta- genen und Cancerogenen in humanem und tierischem Probenmaterial, Gewebeschnitten und ZeU- suspensionen; (d) zum Nachweis von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen in gefrorenen UntersuchungsmateriaUen nach deren schonender Homogenisation in flüssigem Stickstoff oder flüssiger Luft in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels; (e) zum Nachweis des Auftretens von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen und deren Reparatur bei berufsbedingter Exposition von Personen, die entweder bei ihrer beruflichen Arbeit oder infolge von Unfällen mit DNA- schädigenden Substanzen oder Strahlen in Kontakt kommen.
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