EP1180154A1 - PROMOTEUR DE LA THIOREDOXINE TaTrxh2 DE BLE - Google Patents

PROMOTEUR DE LA THIOREDOXINE TaTrxh2 DE BLE

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Publication number
EP1180154A1
EP1180154A1 EP00927350A EP00927350A EP1180154A1 EP 1180154 A1 EP1180154 A1 EP 1180154A1 EP 00927350 A EP00927350 A EP 00927350A EP 00927350 A EP00927350 A EP 00927350A EP 1180154 A1 EP1180154 A1 EP 1180154A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
trxh2
promoter
expression
gus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00927350A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Françoise Gautier
Tania Ihorai
Philippe Joudrier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1180154A1 publication Critical patent/EP1180154A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • the invention is: relating to the cloning and characterization of a wheat thioredoxin promoter.
  • Thioredcxins are proteins of low molecular weight, which have been demonstrated in a large number of organisms, where they catalyze different oxidation-reduction reactions involving dithiolsulfhydryl exchanges. Their catalytic site includes the conserved sequence: -Trp-Cys-Gly / Pro / Ala- Pro-Cys-.
  • the thioredoxins in oxidized form comprise a disulfide bridge, the reduction of which into -SH groups, by reduced ferredoxin or by NADPH, is catalyzed via a specific system.
  • thioredoxins In plants, 3 types of thioredoxin have been highlighted: the first 2 (thioredoxins m and f), are ferredoxin-dependent thioredoxins, located in chloroplasts, where they are involved in the regulation of photosynthesis. A third type, called thioredoxin h, has been identified in the cytosol. Thioredoxin h is part of an NADP-dependent thioredoxin system (NTS), where it is associated with NADPH and an enzyme called NADP-thioredoxin reductase (NTR).
  • NTS NADP-dependent thioredoxin system
  • NTR NADP-thioredoxin reductase
  • the thioredoxins h intervene during the germination of the wheat grain, where they participate, at the level of the endosperm, in the mobilization of the reserves necessary for the growth of the embryo. They act in particular: by reducing the disulphide bridges of certain reserve proteins, such as gliadins and glutenins (KOBREH ⁇ L et al., Plant Physiol. 99,
  • the inventors have undertaken the study of the expression of thioredoxins h in cereal seeds, in particular in wheat, in order to provide means of controlling this expression.
  • Ta Trxh2 a gene hereinafter called Ta Trxh2 coding for a common wheat thioredoxin h (Tri ticum aestivum), hereinafter called TaTrxh2, the primary structure of which has 97% similarity to that of thioredoxin h TaTrxhl of common wheat (GAUTIER et al., 1998, publication cited above).
  • the inventors also isolated the promoter of the Ta Trxh2 gene, and expressed, in rice, the reporter gene gus under the control of this promoter. They thus observed that the expression of the reporter gene was localized exclusively in the grain of rice and more particularly in the starchy endosperm. They also highlighted regions involved in the spatial and temporal regulation of this promoter.
  • the sequence of the Ta Trxh2 gene and of the 5 'region comprising the promoter are represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1.
  • the subject of the present invention is a promoter consisting of a nucleic acid fragment comprising at least one functional domain specific for the promoter of the Ta Trxh2 gene.
  • promoter is understood to mean a double-stranded DNA sequence comprising at least the sequences necessary for the initiation of transcription of a gene, optionally associated with cis-control sequences of said transcription;
  • functional domain specific to a promoter means a sequence of said promoter comprising one or more DNA motifs involved in the initiation of transcription, or else a double-stranded DNA sequence constituting a regulatory domain comprising one or more of the DNA motifs involved in the cis control of transcription by said promoter.
  • Promoters in accordance with the invention can comprise in particular: a) the nucleic acid fragment represented in the annexed sequence list by the sequence SEQ ID NO: 2, as well as in FIG. 1, and which corresponds to the region 5 'non-coding of the Ta Trxh ⁇ gene extending from position -1 to position -1111 relative to the ATG initiation codon, or portions of said fragment, in particular:
  • nucleic acid fragments comprising functional domains involved in the regulation of the transcription of the Ta Trxh.2 gene, and in particular in its tissue specificity and / or in its expression at different stages of plant development; these are in particular: - the nucleic acid fragment whose sequence extends from position -591 to position -1111 relative to the ATG codon of the Ta Trxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the inhibition of the expression of the Ta Trxh2 gene in the epithelium of the scutellum; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position -228 to position -451 relative to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the induction of the expression of the Ta Trxh2 gene at the start of grain maturation; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position -451 to -591 relative to the ATG codon of the Ta Trxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the induction of the expression of the Ta Tr
  • this fragment could include a type of regulatory domain enhancer, increasing the level of expression of the Ta Trxh2 gene.
  • fragments comprising at least one functional domain of the promoter of the Ta Trxh2 gene specified above more precisely identify the limits of these functional domains, as well as the DNA motifs involved in the function of each of them, by techniques known in themselves, for example by the technique of DNA fingerprints (footprints), by incubating these fragments with nuclear extracts of grain albumen cells, as well as with nuclear extracts of cells in which the promoter of the Ta Trxh2 gene is inactive.
  • the invention encompasses in particular any promoter obtainable from a nucleic acid fragment comprising at least one functional domain of the promoter of the Ta Trxh2 gene, by conventional techniques of genetic engineering, in particular by mutagenesis and / or genetic recombination . It is thus possible to produce artificial promoters having the level of activity, and the degree of specificity desired.
  • the functional regulatory domains located in the 5 ′ non-coding region of the Ta Trxh2 gene for example by deleting at least one nucleotide or a nucleotide sequence of the motifs d 'DNA involved in the function of the domain (s) concerned. It is also possible to associate the nucleic acid molecules comprising functional domains of the promoter of the Ta Trxh2 gene together, and / or with functional domains originating from promoters other than that of the Ta Trxh2 gene.
  • a promoter in accordance with the invention, it comprises at least the Ta Trxh2 promoter sequences which allow a specific expression in the grain, especially in starchy endosperm.
  • the invention also includes: expression cassettes, comprising, in addition to a promoter in accordance with the invention, a gene of interest placed under transcriptional control of said promoter, or a site allowing the insertion of said gene of interest; recombinant vectors, resulting from the insertion of a promoter or of an expression cassette in accordance with the invention in a host vector.
  • the promoters in accordance with the present invention can be used to control the expression of a gene of interest in plant cells, in particular of monocots.
  • Said gene of interest can for example be either the Ta Trxh2 gene, placed under the control of an artificial promoter, as defined above, derived from the promoter
  • Ta Trxh2 either a heterologous gene encoding a thioredoxin other than TaTrxh2, or any other protein of interest.
  • the subject of the invention is also plant cells and transgenic plants, in particular monocots, and in particular cereals, transformed with at least one nucleic acid molecule comprising a promoter according to the invention.
  • the inventors have thus obtained transgenic rice, in which a heterologous gene has been placed under transcriptional control of the gene promoter.
  • Ta Trxh2 was observed in these plants a specific expression in the endosperm cells of the grain.
  • the transformed cells and the transgenic plants in accordance with the invention can also be used as models for studying and / or modifying the expression of different genes in the albumen cells of the grain.
  • genomic DNA bank was produced from DNA extracted from common wheat leaves (Tri ticum aestivum) of the Andain variety. After partial digestion of genomic DNA with Mbol, the medium-sized fragments 15 kb were cloned at the BamH.1 site of the phage EMBL3 SP6 / T7, which was propagated in the host bacterium K802 -K 802 (galK2, gal T22 , HsdR2, (r k-, mk +), mcrA,
  • 6.10 clones of the genomic DNA library were spread and screened with a 669 bp probe (TRX) containing the entire sequence coding for thioredoxin h of common wheat TaTrxhl (GAUTIER et al., 1998, cited above), and the positive clones were then screened by PCR (polymerase chain reaction) using a pair of primers (THP2 and THM2) derived from the same sequence.
  • TTP2 and THM2 primers
  • One of the selected clones ( ⁇ 4) which contains a wheat genomic DNA fragment of approximately 10 kb, was digested with PstI, releasing two fragments, one of 1.5 kb and the other of 3, 8 kb, both recognized by the TRX probe.
  • the inventors chose two primers (THP8 and THM8) making it possible to amplify a thioredoxin h gene over a length of approximately 2.6 kb.
  • the PCR was carried out on the undigested DNA of the ⁇ 4 clone, and a fragment of the expected size was cloned in the vector pGEM-T (PROMEGA).
  • the clone obtained contains the Ta Trxh2 gene coding for a common wheat thioredoxin h.
  • the coding region of the Ta Trxh ⁇ gene comprises three exons of 120, 123 and 135 bp separated by two introns, of 972 bp and of 93 bp.
  • the first exon codes for a 40 amino acid polypeptide
  • the second exon codes for a 41 amino acid polypeptide containing the active site
  • the third exon codes for a 45 amino acid polypeptide.
  • the nucleotide sequence of the Ta Trxh2 gene codes for a common wheat thioredoxin h, named TaTrxh2, of 126 amino acids, of calculated molecular mass 13435 Da and of calculated pi 5.0.
  • TaTrxh2 a common wheat thioredoxin h
  • the comparison of the sequences of the translation products of the Ta Trxh2 gene and of the Ta Trxhl genes previously described by GAUTIER et al. (1998, publication cited above) and TdTrxhl (thioredoxin h of durum wheat) shows that they are very conserved. Indeed, the peptide sequence of TaTrxh2 has 97% similarity and 94% identity with that of TaTrxhl and 95% similarity and 90% identity with that of TdTrxhl.
  • the N-terminal domain of TaTrxh2 is shorter than that of TaTrxhl and TdTrxhl.
  • the primary structure of TaTrxh2 does not contain a signal peptide, suggesting that the protein is localized in the cytoplasm.
  • it has an N-terminal extension already demonstrated in the primary structure of TaTrxhl and TdTrxhl, which may correspond to a transmembrane domain.
  • Analysis of the N-terminal extension of TaTrxh2 with the RAO ARGOS program (PC / gene, RAO et al., Biochem. Biophys. Acta 869, 197-214, 1986) reveals a putative transmembrane domain between residues 2 and 19.
  • the active site formed of the following 5 amino acids: WCGPC, is conserved between the 3 h thioredoxins of wheat TaTrxh2, TaTrxhl and TdTrxhl.
  • the introns have different sizes from those of the wheat thioredoxin h gene introns previously highlighted by ROBERT (1994) indicating that the Ta Trxh2 gene is different from these.
  • the introns of the Ta Trxh2 gene are of type 0 and are limited in 5 'by the GTA sequence and in 3' by the CAG sequence, which correspond to consensus sequences of the intron-exon limits.
  • the 3 'non-coding region of the Ta Trxh2 gene presents the AATAAA polyadenylation signal common to the genes transcribed by RNA polymerase II.
  • EXAMPLE 2 STRUCTURAL ANALYSIS OF THE TaTrxh ⁇ GENE PROMOTER
  • the promoter of the Ta Trxh ⁇ gene was analyzed to find putative regulatory motifs capable of intervening in the control of expression, and was notably compared to that of the thioredoxin h genes of C. reinhardtii (STEIN et al., Plant Mol. Biol. 28, 487-503, 1995), tobacco (BRUGIDOU et al., Mol. Gen. Genêt 238, 285-293, 1993) and rice (ISHIWATARI et al., 1995), thioredoxin m from C.
  • Ta Trxh2 gene promoter sequence is shown in Figure 1.
  • the transcription initiation site (represented in FIG. 1 in bold and underlined with a double line) is an adenine located at -65 bp from the ATG.
  • the Ta Trxh2 gene promoter does not contain a consensus sequence corresponding to a TATAn box or a CAAT box at the positions expected for the genes transcribed by RNA polymerase II.
  • GC box (GGGCCGGG, underlined in dotted lines in FIG. 1) located at -84 bp from the ATG of the Ta Trxh2 gene.
  • the GC boxes are recognized by Spl type transcription factors (DYNAN et al. Nature 316, 774-778, 1985), and are involved in the constitutive expression of genes.
  • GC boxes are present in all known promoters of thioredoxin genes.
  • a sequence rich in adenine, interrupted by a residue G (AAAAAAAGAAAAAAAAA, in bold type underlined with a single line in FIG. 1), is located at -227 bp from the ATG of the Ta Trxh2 gene; sequences of this type have also been identified previously in the promoters of the ⁇ e thioredoxin h genes of tobacco and rice.
  • BHLH (CANNTG) sequences, recognized by transcription factors of the helix / loop / helix family, are located at -206 bp and -411 bp from the ATG of the Ta Trxh2 gene; they are shown in Figure 1 in lowercase letters.
  • ACGT leucine zipper family
  • CCTTTCTCT and TCTTTCTTC Two pyrimidine boxes (CCTTTCT and TCTTTCTTC, boxed in FIG. 1) are respectively located at -553 bp and -541 bp from the ATG of the Ta Trxh2 gene.
  • the pyrimidine boxes (CCTTTT) are involved in the regulation of expression by giberellic acid, generally in association with GARE (GA-responsive element) (TAACAAA) sequences (HUANG et al., Plant Mol. Biol.
  • a TGTGTGAGCA motif (in bold type, and underlined with a dotted line in FIG. 1) is located at -403 bp from the ATG of the Ta Trxh2 gene. This motif differs only in the presence of an additional G residue, of the consensus sequence "GCN4-like" (TGTGTGACA) of the "albumen box” involved in the albumen-specific expression of wheat glutenin genes (HAMMOND- KOSACK et al., EMBO J. 12, 545-554, 1993).
  • Trimeric diades CAA and TTG (in italics in FIG. 1) separated by 10 bases, are present at -107 bp and -97 bp respectively from the ATG of the Ta Trxh2 gene. These motifs are associated with a specific expression in the aleurone layer (THOMAS et al., Plant Cell 2, 1171-1180, 1990).
  • EXAMPLE 3 FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE TaTrxh GENE PROMOTER. 2.
  • the vector pSPORTl-GUS (DIGEON, 1997) contains the coding sequence of the gus gene ( ⁇ -glucuronidase E 'E. coli) and the nos-ter terminator of the nopaline synthase gene, inserted at the EcoRI-HindIII site of the vector pSPORTl ( GIBCO BRL).
  • this construction comprises the entire sequence of 1111 bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene;
  • - P2 this construction comprises the sequence of 589 bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene;
  • - P3 this construction comprises the sequence of 481 bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene
  • - P4 this construction comprises the sequence of 228 bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene
  • this construction comprises the 83 bp sequence upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene.
  • the vector pUGCl was used (CHAIR et al., 1996), which allows the constitutive and ubiquitous expression of the gus gene under the control of the promoter, the first exon and the first intron of the gene encoding corn ubiquitin.
  • the vector pSPORTl-GUS was used as a negative control.
  • the bombardment is carried out using a PDS-1000 / He particle gun (PARTICULE DELIVERY SYSTEM, BIORAD).
  • the bombarded embryogenic calluses are then screened on a selection medium containing hygromycin. Callals resistant to hygromycin are selected and placed on a regeneration medium devoid of hygromycin. The regenerated plants (generation F0) were then transferred to pots, and, after acclimatization in phytotron, are grown in the greenhouse.
  • the expression of the gus gene was sought in the vegetative organs and in the seeds of rice of the generations T0 and Tl. Only the fertile plants and having a normal phenotype, were retained for the analysis. The integration of the transgene in the plants analyzed was verified by PCR 'and Southern blot.
  • ⁇ -glucuronidase activity was carried out by histochemical test, detecting the blue coloration resulting from the hydrolysis of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-glucuronic acid (X-GLU ), and its quantification was carried out by fluorometric test, by measuring 4-methylumbelliferone (MU) formed from 4-methylumbellirefyl ⁇ -glucuronic acid, according to the protocols described by JEFFERSON et al. (Plant Mol. Biol. Report 5, 387-405, 1987). 1. Expression of the gus gene in the vegetative organs The analysis was carried out on the roots, stubble, and leaves.
  • the rice grains, taken at 35 JAF (days after fertilization) were cut longitudinally and then incubated in the presence of X-GLU.
  • GUS activity was measured on the one hand on embryos and on the other hand on the endosperm of rice grains.
  • GUS activity is zero or very weak in rice grains transformed with the vector pSPORTl-
  • GUS as in unprocessed rice grains.
  • it is very strong (> 500 pmol / MU / min / mg of protein) in the embryo and the endosperm of rice grains transformed with the vector pUGCI.
  • the GUS activity measured in the embryos of rice grains transformed with the constructs PI, P2 P3, P4 or P5 is not significantly different from that measured in non-transformed rice grains or of rice transformed with the vector pSPORTl- GUS.
  • the activity measured in the endosperm of rice grains transformed with the constructions PI, P2, P3 or P4 is 25 to 40 times higher than that measured in the endosperm of untreated or transformed rice grains with the vector pSPORTl-GUS. It varies from 40 pmol / MU / min / mg of protein for the rice grains transformed with the construction P2, to 25 pmol / MU / min / mg of protein for those transformed with the construction P4. For construction P5, no GUS activity is detected in the grains.
  • the GCN4-like motif identified during the analysis of the structure of the Ta Trxh2 gene promoter is therefore apparently not solely responsible for the tissue specificity of the expression; in fact, despite its deletion in constructs P3 and P4, the expression of the gus gene remains specific to the endosperm of the grain.
  • AACAAATCC Two sequences: AACAAATCC, and AACAAAGTG (shown in bold in Figure 1), are present at -51 bp and -381 bp, respectively, relative to the ATG of the Ta Trxh2 gene. These sequences have a similarity with AACA motifs (AACAAACTCTATC) recently highlighted in the promoters of 6 genes coding for rice glutelins, and intervening in the albumen-specific expression of these genes.
  • the expression of the gus gene was followed during the maturation and germination of rice grains transformed with the constructs PI, P2, P3, P4 or P5. 1. During maturation Three stages were analyzed: 10 JAF, 25 JAF and 35 JAF. The expression of the gus gene was evaluated, either by histochemical localization of the GUS activity, or by detection of the transcripts by Northern blot.
  • GUS activity is detected in the starchy endosperm, at the periphery of the embryo.
  • the GUS activity progresses towards the middle zone of the starchy endosperm.
  • GUS activity is detected on the entire surface of the starchy endosperm.
  • the intensity of the coloring varies with the nature of the construction and the stage of maturation, in particular in the case of construction P4, for which the coloration is very difficult to detect at the start of maturation.
  • the GUS activity is very strong in the cells of starchy endosperm at the periphery of the embryo, and it is not detected in cells in the middle area of starchy endosperm.
  • the GUS activity in the cells of the starchy endosperm is very low, or even not detectable.
  • GUS activity is also detected in the cells of the epithelium of the scutellum.
  • the GUS activity is much weaker than at 25 JAF in all the starchy endosperm cells of rice grains transformed with PI, P2 or P3; in rice grains transformed with the P4 construct, GUS activity is detected in cells in the middle zone of starchy endosperm.
  • RNAs extracted at the various stages of maturation, from the rice grains transformed with constructions PI, P2, P3, P4 or P5. Detection was carried out by Northern blot, using the P3 + GUS probe.
  • This 2.6 kb probe comprises the sequence of 481 bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene, the coding sequence of the gus gene and the terminator of the nos gene.
  • this probe makes it possible to detect the presence of transcripts whose expected size is between 1.9 and 2.4 kb, depending on the construction.
  • the presence of these transcripts varies according to the construction used for the transformation, and the stage of maturation.
  • the transcripts are detected at the 3 stages of maturation with a maximum at mid-maturation.
  • the transcripts are detected at the start of maturation.
  • the transcripts are detected at the beginning and at the end of the grain maturation.
  • the transcripts are detected at mid-ripening and at the end of the grain's ripening.
  • the GUS activity was analyzed by histochemistry in rice grains transformed with the constructs PI, P2, P3, P4 or P5.
  • the PI, P2, P3 constructs allow expression of the gus gene earlier than the P4 construct during maturation.
  • Construction P5 does not allow expression of the gus gene since no transcript is detected. Indeed, transcripts of the gus gene are detected at 10 JAF for the 3 constructions PI, P2, P3, and only 25 JAF for the construction P4. This suggests that the differences in expression level previously reported between the constructs P2 and P4, probably result from a delay in the expression of the gus gene under the control of the P4 promoter, rather than of a lower level of expression.
  • the Ta Trxh2 promoter region between -1111 bp and - 228 bp certainly contains regulatory sequences which allow expression of the gus gene in the early stages of maturation.
  • the region of the Ta Trxh2 gene promoter between -1111 bp and -591 bp probably contains a sequence inhibiting the expression of the gene in the epithelium of the scutellum. Indeed, when it is deleted (construction P2) the expression of the gus gene is observed in this tissue. Conversely, the region between -591 bp and -451 bp would contain a sequence activating expression in the epithelium of the scutellum, because when it is deleted (construction P3) there is no more expression of the gus gene in this tissue.
  • the promoter of the TaTrxh2 gene allows expression of the gus gene specific for starchy endosperm. This expression is detected in a limited number of cells distributed in a central area of the endosperm and at the periphery of the embryo.

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Abstract

L'invention est relative au clonage du promoteur de la thiorédoxine TaTrxh2 de blé, et à son utilisation pour contrôler l'expression de gène d'intérêt dans des plantes transgéniques ou des cellules végétales.

Description

PROMOTEUR DE LA THIORÉDOXINE TaTrxh2 DE BLE
L'invention es: relative au clonage et à la caractérisation d'un promoteur de thiorédoxine de blé.
Les thiorédcxines sont des protéines de faible poids moléculaire, qui ont été mises en évidence chez un grand nombre d'organismes, où elles catalysent différentes réactions d' oxydoréduction impliquant des échanges dithiolsulfhydryles . Leur site catalytique comprend la séquence conservée : -Trp-Cys-Gly/Pro/Ala- Pro-Cys-. Les thiorédoxines sous forme oxydée comprennent un pont disulfure, dont la réduction en groupes -SH, par la ferrédoxine réduite ou par le NADPH, est catalysée par l'intermédiaire d'un système spécifique.
Chez les plantes, on a mis en évidence 3 types de thiorédoxine : les 2 premières (thiorédoxines m et f) , sont des thiorédoxines ferrédoxine-dépendantes, localisées dans les chloroplastes, où elles interviennent dans la régulation de la photosynthèse. Un troisième type, dénommé thiorédoxine h, a été mis en évidence dans le cytosol. La thiorédoxine h fait partie d'un système thiorédoxine NADP-dépendant (NTS) , où elle est associée au NADPH et à une enzyme dénommée NADP-thiorédoxine réductase (NTR) .
Initialement, 2 thiorédoxines h ont été extraites et partiellement purifiées à partir du grain de blé (VOGT et FOLLMANN, Biochem. Biophys . Acta 873, 415- 418, 1986). Récemment, l'équipe des Inventeurs a isolé et caractérisé 2 clones d'ADNc codant une thiorédoxine h de blé tendre (TaTrxhl) , et une thiorédoxine h de blé dur (TdTrxhl) (GAUTIER et al . , Eur. J. Biochem. 252, 314-324, 1998) . Les structures primaires déduites des clones d'ADNc des thiorédoxines h TaTrxhl et TdTrxhl sont très conservées (96% d'identité entre elles). Elles possèdent une extension N-terminale très riche en résidus Ala, dont l'analyse révèle un domaine transmembranaire putatif de 20 résidus. Elles présentent de fortes homologies avec les thiorédoxines h de céréales (70 à 80%) et les thiorédoxines h de dicotylédones (60%).
Les thiorédoxines h interviennent au cours de la germination du grain de blé, où elles participent, au niveau de l'albumen, à la mobilisation des réserves nécessaires à la croissance de l'embryon. Elles agissent notamment : en réduisant les ponts disulfure de certaines protéines de réserve, telles que les gliadines et les gluténines (KOBREHΞL et al . , Plant Physiol. 99,
919-924, 1992), ce qui augmente leur sensibilité à la protéolyse ;
- en réduisant des enzymes impliquées dans la mobilisation des réserves, ou des inhibiteurs de ces enzymes, ce qui entraîne l'activation des premières, et la désactivation des seconds .
Il a également été proposé d'utiliser les thiorédoxines h pour améliorer la qualité d'aliments, notamment à base de céréales ; il a en effet été constaté qu'elles favorisaient la formation de la pâte lors de la fabrication du pain ( ONG et al . r Cereal Chem. 70, 113- 114, 1993), et qu'en outre elles diminuaient l' allergénicité de certains aliments.
Les Inventeurs ont entrepris l'étude de l'expression des thiorédoxines h dans les graines de céréales, notamment dans le blé, afin de fournir des moyens de contrôle de cette expression.
Dans le cadre de ces travaux, ils ont isolé un gène dénommé ci-après Ta Trxh2, codant une thiorédoxine h de blé tendre ( Tri ticum aestivum) , dénommée ci-après TaTrxh2, dont la structure primaire présente 97% de similarité avec celle de la thiorédoxine h TaTrxhl de blé tendre (GAUTIER et al . , 1998, publication précitée).
Les Inventeurs ont également isolé le promoteur du gène Ta Trxh2, et ont exprimé, chez le riz, le gène rapporteur gus sous contrôle de ce promoteur. Ils ont ainsi observé que l'expression du gène rapporteur était localisée exclusivement dans le grain de riz et plus particulièrement dans l'albumen amylacé. Ils ont en outre mis en évidence des régions impliquées dans la régulation spatiale et temporelle de ce promoteur.
La séquence du gène Ta Trxh2 et de la région en 5' comprenant le promoteur sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La présente invention a pour objet un promoteur constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène Ta Trxh2.
On entend par « promoteur » une séquence d'ADN double-brin comprenant au moins les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription d'un gène, éventuellement associées à des séquences de contrôle en cis de ladite transcription ; on entend par : « domaine fonctionnel spécifique d'un promoteur», une séquence dudit promoteur comprenant un ou plusieurs motifs d'ADN intervenant dans l'initiation de la transcription, ou bien une séquence d'ADN double-brin constituant un domaine de régulation comprenant un ou plusieurs des motifs d'ADN intervenant dans le contrôle en cis de la transcription par ledit promoteur. Des promoteurs conformes à l'invention peuvent comprendre en particulier : a) le fragment d'acide nucléique représenté dans la liste de séquences en annexe par la séquence SEQ ID NO : 2, ainsi que sur la figure 1, et qui correspond à la région 5' non codante du gène Ta TrxhΣ s' étendant de la position -1 à la position -1111 par rapport au codon d'initiation ATG, ou des portions dudit fragment, notamment :
* le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -1 à la position -83 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; ce fragment comprend les séquences intervenant dans l'initiation de la transcription, et nécessaires à l'activité de base du promoteur ;
* des fragments d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels intervenant dans la régulation de la transcription du gène Ta Trxh.2, et en particulier dans sa spécificité tissulaire et/ou dans son expression à différents stades du développement de la plante ; il s'agit en particulier : - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -591 à la position -1111 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'inhibition de l'expression du gène Ta Trxh2 dans l'épithélium du scutellum ; du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -228 à la position -451 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène Ta Trxh2 en début de maturation du grain ; du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -451 à -591 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène Ta TrxhΣ dans l'épithélium du scutellum ; du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -83 à la position -228 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; ce fragment comprend des séquences intervenant dans l'induction de l'expression au niveau de l'albumen amylacé. b) du fragment d'acide nucléique constituant le premier intron (positions 1232-2203 sur la séquence SEQ ID NO: 1) du gène Ta Trxh2 ; ce fragment pourrait comprendre un domaine de régulation de type amplificateur, augmentant le niveau d'expression du gène Ta Trxh2.
L'homme du métier peut, à partir des fragments comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène Ta Trxh2 spécifiés ci-dessus, identifier plus précisément les limites de ces domaines fonctionnels, ainsi que les motifs d'ADN impliqués dans la fonction de chacun d'entre eux, par des techniques connues en elles- mêmes, par exemple par la technique des empreintes sur l'ADN (footprints) , en incubant ces fragments avec des extraits nucléaires de cellules de l'albumen du grain, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules dans lesquels le promoteur du gène Ta Trxh2 est inactif.
L' invention englobe en particulier tout promoteur pouvant être obtenu à partir d'un fragment d' acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène Ta Trxh2 , par les techniques classiques du génie génétique, notamment par mutagénèse et/ou recombinaison génétique. Il est ainsi possible de produire des promoteurs artificiels possédant le niveau d'activité, et le degré de spécificité souhaité.
On peut ainsi par exemple inactiver un ou plusieurs des domaines fonctionnels de régulation localisés dans la région 5' non codante du gène Ta Trxh2, par exemple en procédant à la délétion d' au moins un nucléotide ou d'une séquence de nucléotides des motifs d'ADN impliqués dans la fonction du ou des domaines concernés. On peut également associer les molécules d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels du promoteur du gène Ta Trxh2 entre elles, et/ou avec des domaines fonctionnels provenant de promoteurs autres que celui du gène Ta Trxh2.
Selon un mode de réalisation préféré d'un promoteur conforme à l'invention, il comprend au moins les séquences du promoteur de Ta Trxh2 qui permettent une expression spécifique dans le grain, notamment dans l'albumen amylacé.
L' invention englobe également : les cassettes d'expression, comprenant, outre un promoteur conforme à l'invention, un gène d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site permettant l'insertion dudit gène d' intérêt ; les vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conformes à l'invention dans un vecteur hôte.
Les promoteurs conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules de plantes, notamment de monocotylédones .
Ledit gène d'intérêt peut par exemple être soit le gène Ta Trxh2, placé sous contrôle d'un promoteur artificiel, tel que défini ci-dessus, dérivé du promoteur
Ta Trxh2, soit un gène hétérologue codant une thiorédoxine autre que TaTrxh2, ou toute autre protéine d'intérêt.
On peut par exemple introduire un gène d'intérêt sous contrôle du promoteur du gène Ta Trxh2, ou d'un promoteur artificiel construit à partir des éléments de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules de l'albumen, afin d'exprimer ledit gène d'intérêt uniquement dans les cellules de l'albumen du grain. On peut également procéder à la délétion sélective des séquences du promoteur du gène Ta Trxh2 responsables de la spécificité d'expression, afin de construire un promoteur artificiel permettant d'assurer une expression ubiquitaire d'une thiorédoxine h, ou d'une autre protéine d'intérêt.
L'invention a en outre pour objet des cellules végétales et des plantes transgéniques, en particulier des monocotylédones, et notamment des céréales, transformées par au moins une molécule d'acide nucléique comprenant un promoteur conforme à l'invention.
Les Inventeurs ont ainsi obtenu des riz transgéniques, dans lesquelles un gène hétérologue a été placé sous contrôle transcriptionnel du promoteur du gène
Ta Trxh2 et ont observé chez ces plantes une expression spécifique dans les cellules de l'albumen du grain.
Les cellules transformées et les plantes transgéniques conformes à l'invention sont également utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules de l'albumen du grain.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant le clonage et la caractérisation du gène Ta Trxh2 et de son promoteur. EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU GENE TaTrx Σ
1. - Criblage d' une banque d' ADN génomique de blé Une banque d'ADN génomique a été réalisée à partir de l'ADN extrait de feuilles de blé tendre ( Tri ticum aestivum) de la variété Andain. Après digestion partielle de l'ADN génomique par Mbol , les fragments de taille moyenne 15 kb ont été clones au site BamH.1 du phage EMBL3 SP6/T7, qui a été propagé dans la bactérie hôte K802 -K 802 ( galK2 , gal T22 , HsdR2 , (r k- , m k +) , mcrA ,
+ mcrB , metBl , mrr , supE44) .
6
6.10 clones de la banque d'ADN génomique ont été étalés et criblés avec une sonde de 669 pb (TRX) contenant la totalité de la séquence codant la thiorédoxine h de blé tendre TaTrxhl (GAUTIER et al . , 1998, publication précitée), et les clones positifs ont ensuite été criblés par ACP (amplification en chaine par polymérase) à l'aide d'un couple d'amorces (THP2 et THM2) dérivées de la même séquence. L'un des clones sélectionnés (λ4), qui contient un fragment d'ADN génomique de blé de 10 kb environ, a été digéré par PstI, libérant deux fragments, l'un de 1,5 kb et l'autre de 3,8 kb, tous les deux reconnus par la sonde TRX. Ces deux fragments ont été clones dans le vecteur pLITMUS 29 (BIOLAB) au site de restriction PstI. Les deux clones obtenus sont dénommés CTRX3 et CTRX4. Le clone CTRX3 correspond au fragment de 1,5 kb et le clone CTRX4 au fragment de 3,8 kb . L'analyse des séquences nucléotidiques des clones CTRX4 et CTRX3 montre qu'ils contiennent chacun une partie d'un même gène codant une thiorédoxine h de blé, tronqué lors de la digestion par PstI.
A partir des séquences nucléotidiques de ces 2 clones, les Inventeurs ont choisi deux amorces (THP8 et THM8) permettant d'amplifier un gène de thiorédoxine h sur une longueur d'environ 2,6 kb. L'ACP a été réalisée sur l'ADN non digéré du clone λ4, et un fragment de la taille attendue a été clone dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA) . Le clone obtenu contient le gène Ta Trxh2 codant une thiorédoxine h de blé tendre.
Il comprend une région promotrice de 1111 pb, une région codante de 1447 pb, et une région 3' non codante de 131 pb. La région codante du gène Ta TrxhΣ comprend trois exons de 120, 123 et 135 pb séparés par deux introns, de 972 pb et de 93 pb. Le premier exon code un polypeptide de 40 acides aminés, le deuxième exon code un polypeptide de 41 acides aminés contenant le site actif, et le troisième exon code un polypeptide de 45 acides aminés .
La séquence nucléotidique du gène Ta Trxh2 code une thiorédoxine h de blé tendre, nommée TaTrxh2, de 126 acides aminés, de masse moléculaire calculée 13435 Da et de pi calculé 5,0. La comparaison des séquences des produits de traduction du gène Ta Trxh2 et des gènes Ta Trxhl précédemment décrite par GAUTIER et al . (1998, publication précitée) et TdTrxhl (thiorédoxine h de blé dur) montre qu'elles sont très conservées. En effet, la séquence peptidique de TaTrxh2 présente 97% de similarité et 94% d'identité avec celle de TaTrxhl et 95% de similarité et 90% d'identité avec celle de TdTrxhl.
Le domaine N-terminal de TaTrxh2 est plus court que celui de TaTrxhl et TdTrxhl. La structure primaire de TaTrxh2 ne contient pas de peptide signal, suggérant que la protéine est localisée dans le cytoplasme. Cependant, elle présente une extension N- terminale déjà mise en évidence dans la structure primaire de TaTrxhl et TdTrxhl, pouvant correspondre à un domaine transmembranaire. L'analyse de l'extension N- terminale de TaTrxh2 avec le programme RAO ARGOS (PC/gene, RAO et al . , Biochem. Biophys . Acta 869, 197- 214, 1986) révèle un domaine transmembranaire putatif entre les résidus 2 et 19. Le site actif, formé des 5 acides aminés suivants : WCGPC, est conservé entre les 3 thiorédoxines h de blé TaTrxh2, TaTrxhl et TdTrxhl.
Les introns ont des tailles différentes de celles des introns des gènes de thiorédoxines h de blé précédemment mis en évidence par ROBERT (1994) indiquant que le gène Ta Trxh2 est différent de ceux-ci. Les introns du gène Ta Trxh2 sont du type 0 et sont limités en 5' par la séquence GTA et en 3' par la séquence CAG, qui correspondent à des séquences consensus des limites intron-exon.
La région 3' non codante du gène Ta Trxh2 présente le signal de polyadenylation AATAAA commun aux gènes transcrits par l'ARN polymérase II. EXEMPLE 2 : ANALYSE STRUCTURELLE DU PROMOTEUR DU GENE TaTrxhΣ
Le promoteur du gène Ta TrxhΣ a été analysé pour rechercher des motifs de régulation putatifs susceptibles d' intervenir dans le contrôle de l'expression, et a notamment été comparé à celui des gènes de thiorédoxines h de C. reinhardtii (STEIN et al . , Plant Mol. Biol . 28, 487-503, 1995), de tabac (BRUGIDOU et al . , Mol. Gen. Genêt 238, 285-293, 1993) et de riz (ISHIWATARI et al . , 1995), de la thiorédoxine m de C. reinhardtii (STEIN et al . , 1995), et des thiorédoxines murine (MATSUI et al . , Gène 152, 165-171, 1995) et humaine (TONISSEN et ai., Gène 102, 221-228, 1992 ; KAGHAD et al . , Gène 140, 6643-6653, 1994). La séquence du promoteur du gène Ta Trxh2 est représentée sur la figure 1.
Le site d'initiation de la transcription (représenté sur la figure 1 en gras et souligné d'un double trait) est une adénine située à -65 pb de l'ATG. Le promoteur du gène Ta Trxh2 ne contient aucune séquence consensus correspondant à une boîte TATAn ou à une boîte CAAT aux positions attendues pour les gènes transcrits par l'ARN polymérase II.
En revanche, il contient une boîte TATA-like (AATTTAT, soulignée d'un double trait sur la figure 1) à -105 pb de l'ATG.
Il contient également une boîte GC (GGGCCGGG, soulignée en pointillés sur la figure 1) située à -84 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2. Les boites GC sont reconnues par des facteurs de transcription de type Spl (DYNAN et al . Nature 316, 774-778, 1985), et interviennent dans l'expression constitutive des gènes. Des boîtes GC sont présentes dans tous les promoteurs connus de gènes de thiorédoxines . Une séquence riche en adénine, interrompue par un résidu G (AAAAAAAGAAAAAAAAA, en caractères gras soulignés d'un trait simple sur la figure 1), est située à -227 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; des séquences de ce type ont également été identifiées précédemment dans les promoteurs des gènes αe thiorédoxine h de tabac et de riz .
Des séquences bHLH (CANNTG) , reconnues par des facteurs de transcription de la famille hélice/boucle/hélice, sont localisées à -206 pb et -411 pb de l'ATG dα gène Ta Trxh2 ; elles sont représentées sur la figure 1 en lettres minuscules.
Des séquences bzip (ACGT, soulignées d'un trait simple sur la figure 1) reconnues par des facteurs de transcription de la famille des fermetures éclair à leucine (bZIP) , sont localisées à -251 pb et -184 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2. Les protéines bZIP ont été décrites dans l'activation de l'expression de gènes codant des protéines de réserve du grain. Des motifs ACGT, ont également été décrits dans des séquences consensus ABRE (ABA-responsive élément) des promoteurs de gènes dont l'expression est régulée par l'acide abscissique (ABA) (MUNDY et al . , Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 87, 1406-1410, 1990) .
Deux boîtes pyrimidine (CCTTTCTCT et TCTTTCTTC, encadrées sur la figure 1) sont respectivement localisées à -553 pb et -541 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2. Les boîtes pyrimidine (CCTTTT) interviennent dans la régulation de l'expression par l'acide gibérellique, généralement en association avec des séquences GARE (GA- responsive élément) (TAACAAA) (HUANG et al . , Plant Mol. Biol. 14, 115-121, 1990), et des séquences 02S (opaque-2- binding séquence) ou boîte I (TATCCAT) (GUBLER et al . , Plant Cell 4, 1435-1441, 1992 ; LANAHAN et al . , Plant Cell, 4, 203-211, 1992), avec lesquelles elles s'organisent en un complexe appelé GARC (GA-responsive complex) (BETHKE et al . , Bot. 48, 1337-1356, 1997). Aucune séquence GARE ou 02S n'a été mise en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2.
Un motif TGTGTGAGCA (en caractères gras, et souligné d'un trait en pointillés sur la figure 1) est situé à -403 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2. Ce motif ne diffère que par la présence d'un résidu G supplémentaire, de la séquence consensus « GCN4-like » (TGTGTGACA) de la « boîte albumen » impliquée dans l'expression albumen- spécifique de gènes de gluténines de blé (HAMMOND-KOSACK et al . , EMBO J. 12, 545-554, 1993). Cependant, l'autre motif de la boîte albumen, dénommé EM (TGTAAAAGT) , et dont la présence est également nécessaire pour l'expression albumen-spécifique (ALBANI et al . , Plant Cell 9, 171-184, 1997), n'a pas été mis en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta TrxhΣ .
Des diades trimériques CAA et TTG (en italique sur la figure 1) séparées par 10 bases, sont présentes respectivement à -107 pb et -97 pb de l'ATG du gène Ta Trxh2. Ces motifs sont associés à une expression spécifique dans la couche à aleurone (THOMAS et al . , Plant Cell 2, 1171-1180, 1990) .
EXEMPLE 3 : ANALYSE FONCTIONNELLE DU PROMOTEUR DU GENE TaTrxh.2.
La séquence de 1111 pb en 5' de l'ATG du gène Ta Trxh2 , ou différents fragments de cette séquence ont été clones en amont de la séquence codante du gène rapporteur gus dans le vecteur pSPORTl-GUS. Le vecteur pSPORTl-GUS (DIGEON, 1997) contient la séquence codante du gène gus (β-glucuronidase ά' E . coli ) et le terminateur nos-ter du gène de la nopaline synthase, insérés au site EcoRI-HindIII du vecteur pSPORTl (GIBCO BRL) .
Les constructions réalisées sont les suivantes :
- PI : cette construction comprend la totalité de la séquence de 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P2 : cette construction comprend la séquence de 589 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ;
- P3 : cette construction comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P4 : cette construction comprend la séquence de 228 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ;
- P5 : cette construction comprend la séquence de 83 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2.
Les limites des régions du promoteur du gène Ta Trxh2 utilisées dans les constructions sont indiquées sur la figure 1.
A titre de témoin positif, on a utilisé le vecteur pUGCl (CHAIR et al . , 1996), qui permet l'expression constitutive et ubiquitaire du gène gus sous le contrôle du promoteur, du premier exon et du premier intron du gène codant l'ubiquitine du mais.
Le vecteur pSPORTl-GUS a été utilisé comme contrôle négatif.
Ces différentes constructions ont été transférées par bombardement selon le protocole décrit par FAUQUET et al . (Proc. Third. Int. Rice Genêt. Symp., Ed. G. S. Khush, 153-165, 1996), dans de jeunes cals embryogènes de riz (var. japonica IRAT 349) dérivant de la prolifération du scutellum de l'embryon mature. Toutes les constructions testées ont été co-transférées avec le vecteur pILTAB227 (FAUQUET et al . , 1997), qui confère la résistance à l' hygromycine et qui permet la sélection des cellules transformées.
Un mélange du vecteur portant la construction à tester, et du vecteur pILTAB227 (rapport molaire : vecteur à tester/pILTAB227 = 4/1) est utilisé pour enrober des microparticules d'or, à raison de 5 μg d'ADN total (3 μg d'ADN à tester + 2 μg de pILTAB227) à une concentration de 1 μg/μl, pour 3 mg d'un mélange en quantité égale de microparticules d'or de diamètres 1,0 μ et 1,6 μm, en suspension dans 50 μl d'eau distillée .
Le bombardement est effectué à l'aide d'un canon à particules PDS-1000/He (PARTICULE DELIVERY SYSTEM, BIORAD) .
Les cals embryogènes bombardés sont ensuite criblés sur un milieu de sélection contenant de l' hygromycine . Les cals résistants à l' hygromycine sont sélectionnés et placés sur milieu de régénération dépourvu d' hygromycine . Les plants régénérés (génération F0) ont ensuite été transférés dans des pots, et, après acclimatation en phytotron, sont cultivés en serre.
L'expression du gène gus a été recherchée dans les organes végétatifs et dans les graines des riz des générations T0 et Tl. Seules les plantes fertiles et présentant un phénotype normal, ont été retenues pour l'analyse. L'intégration du transgène dans les plantes analysées a été vérifiée par ACP ' et transfert de Southern . La détection de l'activité β-glucuronidase a été effectuée par test histochimique, en détectant la coloration bleue résultant de l'hydrolyse de l'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronique (X-GLU) , et sa quantification a été effectuée par test fluorometrique, en mesurant la 4-méthylumbélliférone (MU) formée à partir d'acide 4-méthylumbélliréfyl β- glucuronique, selon les protocoles décrits par JEFFERSON et al . (Plant Mol. Biol. Report 5, 387-405, 1987). 1. Expression du gène gus dans les organes végétatifs L'analyse a été effectuée sur les racines, les chaumes, et les feuilles.
Dans le cas des plants de riz non-transformes, ou de ceux transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS, l'analyse histochimique ne révèle pas d'activité GUS, et les mesures fluorimétriques ne font apparaître qu'une activité très faible voire nulle. Dans le cas des plants de riz transformés avec le vecteur pUGCI, on observe une activité GUS élevée (supérieure à 500 pmol MU/min/mg de protéine) dans tous les organes végétatifs testés. Dans le cas des plants de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3, P4 ou P5, on n'observe aucune coloration dans les organes végétatifs incubés en présence de X-GLU, et l'activité GUS mesurée par fluorométrie n'est pas significativement différente de celles mesurée pour les plantes transformées avec le vecteur pSPORTl-GUS ou les plantes non transformées. Ces résultats montrent que le promoteur du gène Ta Trxh2 ne permet pas l'expression du gène gus dans les organes végétatifs . 2. Expression du gène gus dans les grains
Analyse histochimique
Au niveau des grains entiers
Les grains de riz, prélevés à 35 JAF (jours après fécondation) ont été coupés dans le sens longitudinal puis incubés en présence de X-GLU.
Aucune coloration n'est détectée dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS.
On détecte au contraire une coloration intense de la totalité du grain pour les grains de riz transformés avec le vecteur pUGCI .
Dans le cas des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3 ou P4, une coloration bleue est détectée dans l'albumen des grains, mais pas dans l'embryon (axe cotylédonaire et scutellum), les enveloppes ou les epillets. Au niveau de l'albumen, cette coloration apparaît notamment à la périphérie de l'embryon, au dessus de l'épithélium du scutellum, et dans une zone médiane de l'albumen sur toute la longueur du grain. Cette coloration est moins intense, et apparaît moins rapidement que celle observée dans les grains de riz transformés avec pUGCI. L'intensité de la coloration semble varier selon la construction (PI, P2, P3 ou P4) concernée. L'intensité la plus élevée est observée dans les grains de riz transformés avec la construction P2, et la plus faible dans ceux transformés avec la construction P . Ces résultats sont confirmés par l'analyse des grains Tl, où la coloration apparaît plus rapidement que dans les grains T0 et est plus intense.
Dans le cas des grains de riz transformés avec la construction P5, aucune coloration n'est détectée, ni dans l'embryon, ni dans l'albumen, ni dans les enveloppes . Au niveau des différents tissus du grain
Pour déterminer précisément la localisation de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène Ta Trxh2, des coupes histologiques ont été réalisées et observées au microscope photonique. Ces observations montrent que, pour les constructions PI, P2, P3 ou P4, le marquage est localisé dans un petit nombre de cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale de l'albumen amylacé. Les cellules de l'embryon, de la couche à aleurone et des enveloppes, ne sont pas marquées. Pour la construction P5, aucun marquage n'est visible. Analyse fluorimétrique
L'activité GUS a été mesurée d'une part sur les embryons et d'autre part sur l'albumen des grains de riz .
L'activité GUS est nulle ou très faible dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-
GUS, comme dans les grains de riz non-transformes . En revanche, elle est très forte (>500 pmol/MU/min/mg de protéine) dans l'embryon et l'albumen des grains de riz transformés avec le vecteur pUGCI.
L'activité GUS mesurée dans les embryons des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2 P3, P4 ou P5 n'est pas significativement différente de celle mesurée dans les grains de riz non-transformes ou de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS.
En revanche, l'activité mesurée dans l'albumen des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3 ou P4, est 25 à 40 fois plus élevée que celle mesurée dans l'albumen des grains de riz non-transformes ou transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS. Elle varie de 40 pmol/MU/min/mg de protéine pour les grains de riz transformés avec la construction P2 , à 25 pmol/MU/min/mg de protéine pour ceux transformés avec la construction P4. Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée dans les grains.
Ces résultats montrent que la région (-1111 pb à -83 pb) du promoteur du gène Ta Trxh2 permet l'expression du gène gus uniquement dans les cellules de l'albumen amylacé, et que seule la délétion ne laissant subsister que 83 pb en amont de l'ATG a supprimé les séquences responsables de l'expression spatiale, dont certaines sont probablement localisées dans la région du promoteur comprise entre -228 pb et -83 pb.
Le motif GCN4-like identifié lors de l'analyse de la structure du promoteur du gène Ta Trxh2 n'est donc apparemment pas le seul responsable de la spécificité tissulaire de l'expression ; en effet, malgré sa délétion dans les constructions P3 et P4, l'expression du gène gus demeure spécifique de l'albumen du grain.
Deux séquences : AACAAATCC, et AACAAAGTG (représentées en caractères gras sur la figure 1) , sont respectivement présentes à -51 pb et -381 pb par rapport à l'ATG du gène Ta Trxh2. Ces séquences présentent une similitude avec des motifs AACA (AACAAACTCTATC) récemment mis en évidence dans les promoteurs de 6 gènes codant des glutélines de riz, et intervenant dans l'expression albumen-spécifique de ces gènes.
EXEMPLE 4 : EVOLUTION DE L'EXPRESSION DU GENE GUS AU COURS DU DEVELOPPEMENT DES GRAINS DES RIZ TRANSGENIQUES
L'expression du gène gus a été suivie au cours de la maturation et de la germination de grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3, P4 ou P5. 1. Au cours de la maturation Trois stades ont été analysés : 10 JAF, 25 JAF et 35 JAF. L'expression du gène gus a été évaluée, soit par localisation histochimique de l'activité GUS, soit par détection des transcrits par transfert de Northern.
Activité GUS L'analyse histochimique montre que pour les trois stades de maturation étudiés, 10, 25, et 35 JAF, une activité GUS est toujours détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions Pi, P2, P3 ou P4. Par contre pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée.
A 10 JAF, l'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé, à la périphérie de l'embryon. A 25 JAF, l'activité GUS progresse vers la zone médiane de l'albumen amylacé. A 35 JAF, l'activité GUS est détectée sur toute la surface de l'albumen amylacé.
L' intensité de la coloration varie avec la nature de la construction et le stade de maturation, en particulier dans le cas de la construction P4, pour laquelle la coloration est très difficile à détecter en début de maturation.
Ces résultats sont confirmés par les observations plus détaillées au niveau de chaque tissu du grain, qui montrent que :
- A 10 JAF : pour les constructions PI, P2 ou P3, l'activité GUS est très forte dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon, et elle n'est pas détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé. Pour la construction P4, l'activité GUS dans les ce-llules de l'albumen amylacé est très faible, voire non détectable. En outre, dans les grains de riz transformés avec la construction P2, une activité GUS est également détectée dans les cellules de l'épithélium du scutellum.
- A 25 JAF : pour les constructions PI, P2 ou P3, l'activité GUS a diminué dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon et augmente dans celles de la zone centrale de l'albumen amylacé ; pour les grains de riz transformés avec la construction P2, on ne détecte plus d'activité GUS dans les cellules de l'épithélium du scutellum. Dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS a augmenté dans les cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale. - A 35 JAF : l'activité GUS est beaucoup plus faible qu'à 25 JAF dans toutes les cellules de l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec PI, P2 ou P3 ; dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS est détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé.
Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée quel que soit le stade de maturation ou le tissu du grain analysé.
Quelle que soit la construction utilisée, aucune activité GUS n'est détectée au cours de la maturation, dans les cellules de l'axe embryonnaire, de la couche à aleurone, ou des enveloppes des grains.
Détection des transcrits du gène gus
La présence des transcrits du gène gus a été recherchée dans les ARN totaux extraits, aux différents stades de maturation, des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3, P4 ou P5. La détection a été réalisée par transfert de Northern, en utilisant la sonde P3+GUS. Cette sonde de 2,6 kb comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 , la séquence codante du gène gus et le terminateur du gène nos .
Pour chacune des constructions PI, P2, P3, P4 ou P5, cette sonde permet de détecter la présence de transcrits dont la taille attendue est comprise entre 1,9 et 2,4 kb, selon la construction. La présence de ces transcrits varie en fonction de la construction utilisée pour la transformation, et du stade de maturation.
Pour les riz transformés avec la construction PI, les transcrits sont détectés aux 3 stades de la maturation avec un maximum à mi-maturation.
Pour les riz transformés avec la construction P2, les transcrits sont détectés au début de la maturation.
Pour les riz transformés avec la construction P3, les transcrits sont détectés au début et à la fin de la maturation du grain.
Pour les riz transformés avec la construction P4, les transcrits sont détectés à mi-maturation et en fin de maturation du grain. Pour les riz transformés avec la construction
P5, aucun transcrit du gène gus n'est détecté quel que soit le stade de maturation analysé.
2. Au cours de la germination
Pour l'étude de l'expression du gène gus au cours de la germination, l'activité GUS a été analysée par histochimie dans des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3, P4 ou P5.
Pour chaque construction, 10 grains ont été mis à germer à l'obscurité et prélevés à différents temps après imbibition : 0, 12, 24, 48 et 72 heures. L'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2 , P3 ou P4 quel que soit le stade de germination. Par contre pour les grains de riz transformés avec la construction P5 aucune activité GUS n'est détectée.
L'étude de l'accumulation des transcrits du gène gus dans les grains transformés avec les constructions PI, P2, P3 ou P4 montre que ceux-ci ne sont pas accumulés au cours de la germination quelle que soit la construction.
Ces résultats indiquent que le promoteur (1111 pb en amont de l'ATG) du gène Ta Trxh2 ne permet pas l'expression du gène gus au cours de la germination. L' activité GUS détectée dans les grains germes est certainement une activité résiduelle due à la très grande stabilité de la β-glucoronidase dans le grain.
Conclusion
L'analyse de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène Ta Trxh2 au cours du développement des grains de riz transformés avec les constructions PI, P2, P3, P4 ou P5 met en évidence un effet des délétions du promoteur du gène Ta Trxh2 sur l'expression temporelle et spatiale du gène gus dans les grains des riz transformés.
Les constructions PI, P2, P3 permettent une expression du gène gus plus précoce que la construction P4 au cours de la maturation. La construction P5 ne permet pas l'expression du gène gus puisqu' aucun transcrit n'est détecté. En effet, des transcrits du gène gus sont détectés à 10 JAF pour les 3 constructions PI, P2, P3, et seulement 25 JAF pour la construction P4. Ceci suggère que les différences de niveau d' expression précédemment signalées entre les constructions P2 et P4, résultent probablement d'un retard dans l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur P4, plutôt que d'un niveau d'expression plus faible. La région du promoteur du gène Ta Trxh2 comprise entre -1111 pb et - 228 pb contient certainement des séquences de régulation qui permettent une expression du gène gus dans les premiers stades de la maturation.
Concernant l'expression spatiale, la région du promoteur du gène Ta Trxh2 comprise entre -1111 pb et -591 pb contient probablement une séquence inhibant l'expression du gène dans l'épithélium du scutellum. En effet, lorsqu'elle est délétée (construction P2) l'expression du gène gus est observée dans ce tissu. A l'inverse, la région comprise entre -591 pb et -451 pb contiendrait une séquence activant l'expression dans l'épithélium du scutellum, car lorsqu'elle est délétée (construction P3) il n'y a plus d'expression du gène gus dans ce tissu.
Les résultats montrent qu'au cours de la maturation des grains de riz, le promoteur du gène TaTrxh2 permet une expression du gène gus spécifique de l'albumen amylacé. Cette expression est détectée dans un nombre restreint de cellules réparties dans une zone centrale de l'albumen et à la périphérie de l'embryon.

Claims

REVENDICATIONS
1) Promoteur caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène Ta Trxh2.
2 ) Promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'acide nucléique est choisi dans le groupe constitué par : le fragment d' acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -1 à la position -1111 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d' acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -1 à la position -83 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d' acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -451 à la position -591 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -591 à la position -1111 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -228 à la position -451 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -451 à -591 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position -83 à la position -228 par rapport au codon ATG du gène Ta Trxh2 ; le fragment d' acide nucléique dont la séquence est celle du premier intron du gène Ta Trxh2.
3) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
5) Cellule végétale transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
6) Plante transgénique transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
7) Plante transgénique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une monocotylédone .
8) Utilisation d'un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule végétale.
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