EP1179048A2 - CULTURES DE CELLULES D'INSECTE SE MULTIPLIANT A 37oC, LEUR P ROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS UTILISATIONS - Google Patents

CULTURES DE CELLULES D'INSECTE SE MULTIPLIANT A 37oC, LEUR P ROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS UTILISATIONS

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Publication number
EP1179048A2
EP1179048A2 EP00927335A EP00927335A EP1179048A2 EP 1179048 A2 EP1179048 A2 EP 1179048A2 EP 00927335 A EP00927335 A EP 00927335A EP 00927335 A EP00927335 A EP 00927335A EP 1179048 A2 EP1179048 A2 EP 1179048A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cultures
culture
temperature
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00927335A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gérard Devauchelle
Martine Cerruti
Muriel Militello-Gerbal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1179048A2 publication Critical patent/EP1179048A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to cultures of insecre cells capable of growing at 37 ° C., and allowing the multiplication of baculoviruses, as well as to the use of these cell lines for the expression of genes of interest cloned into baculoviruses.
  • the optimum temperature for insect cells in culture is between 26 and 28 ° C. At temperatures above 30 ° C, their growth slows considerably, and they die quickly if kept at temperatures above 35 ° C.
  • These cells are obtained by carrying out a random mutagenesis by ultraviolet rays, then a selection of the mutants by acclimatization to alternating temperatures (30 ° C for 2 to 5 days, 25 ° C for 4 to 7 days, 33 ° C for 2 to 5 days, 25 ° C for 5 to 7 days, 35 ° C for 2 to 5 days, 25 ° C for 5 to 7 days, 37 ° C for 2 to 5 days, 25 ° C for 4 to 7 days) .
  • the cells thus obtained allow, when cultivated at temperatures of 33 to 37 ° C, the multiplication of baculovirus patnogenes for insects of the genus Agrot-is.
  • demand J03094674 gives no indication on the st 'ao ⁇ léclairage of these cell lines, or their ability to multiply indefinitely at 37 ° C, or the possibility of using them as host cells for the expression of recombinant genes clones in baculoviruses.
  • the subject of the present invention is a process for obtaining cultures of insect cells, and in particular of pidoptera, capable of multiplying at 37 ° C; this process comprises the following stages: a) culturing said insect cells at a temperature of approximately 27 ⁇ 2 ° C; b) increasing the culture temperature to about 37 ⁇ 1 ° C, c) maintaining said cells in culture at this temperature for about 4 to 6 days; d) recovering the cells from step c) and re-cultivating them at a temperature of approximately 37 ⁇ 1 ° C.
  • step b) can be carried out in a single step, by raising the temperature of the culture directly from 28 ° C to 37 ° C.
  • the process according to the invention does not require any mutagenesis step.
  • Insect cells which can advantageously be used, in accordance with the invention, for obtaining cultures of cells capable of multiplying at 37 ° C. are in particular cells of Spodoptera frugiperda, for example those of the line Sf21 or of the Sf9 line.
  • the culture media conventionally used for the culture of insect cells are suitable for implementing the process according to the invention, and for maintaining the cultures resulting therefrom; for example, in the case of the Sf9 or Sf21 lines, one of them can use one of the media described by O'REILLY et al. [Baculovirus
  • the present invention also relates to cultures of insect cells which are susceptible of being obtained by a process in accordance with the invention, as defined above, and the lines derived from these cultures. These lines will be referred to below as “HT lines”, and designated by the name of the original line, followed by the letters “HT”. For example, or will denote: “Sf9-HT” and “Sf21-HT” the lines respectively derived, according to the invention, from the Sf9 and Sf21 cells.
  • the lines thus denoted differ from the mother lines from which they originate by their number of chromosomes, which is 2 times higher (endodiploidy). They can be maintained in culture at 37 ° C, and multiply indefinitely at this temperature; they can also be stored in frozen form, and can be returned to culture directly at 37 ° C. They retain the ability to grow and multiply at 27 ° C (although slower than the cells from which they originate), as well as the ability to support thawing.
  • the cells in accordance with the invention are permissive for the same baculoviruses as the mother cells from which they are derived. In cell cultures according to the invention, these baculoviruses multiply at 37 ° C. and produce infectious particles.
  • genes of interest inserted into recombinant baculoviruses can be expressed at 37 ° C. in cell cultures according to the invention, and make it possible to obtain functional proteins.
  • the cell cultures according to the invention can therefore be used, in the same way as cultures of the cells from which they are derived, to express genes of interest cloned in baculoviruses.
  • the present invention relates to a method for expressing at least one recombinant protein in insect cells, which proceeds is characterized in that said recomoining protein is expressed in the cells of a culture according to the invention.
  • said recombinant protein is expressed at a temperature above 35 ° C, preferably between 35 and 39 ° C.
  • All expression vectors used in hao ⁇ tuellement lines Sf21 and Sf9 • can also be used for the expression of genes of interest in Sf21-HT cell cultures and Sf9-HT according to the invention. It is in particular possible to use vectors in which the gene of interest to be expressed is placed under the control of a very early promoter, such as the IE-1 promoter, of an early promoter, such as the 39K promoter, of a late promoter, such as the gp67 promoter or that of the capsid protein, or of a very late promoter, such as that of the polyhedron or of the P10 protein.
  • Cellular promoters capable of functioning at 37 ° C. can also be used, such as, for example, the Actme 3 promoter from Bombyx mon
  • vectors of the “multi-recombinant” type in which 2 or more genes of interest are placed under ⁇ e 2 control or more promoters.
  • ⁇ e cell cultures in accordance with the invention derived from the Sf9-HT monoclonal line the very early, early or late promoters appear to be more active at 37 ° C. than the very late promoters (polyedrine or P10); we can therefore choose the promoter used according to the level of expression that we wish to obtain.
  • vectors derived from baculovirus such as those described for example in Application EP 0 638 647 to the names of the NATIONAL INSTITUTE OF AGRONOMIC RESEARCH and the NATIONAL CENTER OF SCIENTIFIC RESEARCH.
  • the cell lines used are on the one hand, the lines Sf21 (IPL3-SF-21) and Sf9 (ATCC CRL 1711) originating from the Lepidoptera Spodoptera frugiperda, and on the other hand, by way of comparison, the line S2 originating from the fly Drosophila melanogas ter, the line C3 1225 from the Aedes albopi ctus mosquito, and the line Mb, from the Lepidoptera Mamestra brassicae.
  • the cells of the lepidopteran lines Sf21, Sf9, and Mb, and ⁇ e the line Drosophila S2 are subcultured in TC-100 medium (LIFE TECHNOLOGIES, INC.), Supplemented with 5% fetal calf serum.
  • the mosquito cells CB 1225 are maintained in the medium of MITSUHASHI-MARAMOROSCH [Cont ⁇ b. Boyce Thompson Inst., 22, 435-460, (1964)]. Cultures of Sf9 or Sf21 cells, as well as cultures of Mb, S2, and CB 1225 cells are placed in an oven at 28 ° C; the temperature is gradually increased over four days, up to 37 ° C. The cells are kept at this temperature and their growth is monitored daily.
  • the growth of the Sf9-HT line at 37 ° C and 28 ° C was compared with that of the Sf-9 mother line at 28 ° C.
  • the growth curves, which are represented in FIG. 1, show that at 28 ° C, the Sf9-HT (O) cells grow slower (doubling time 33.6 hours) than the Sf9 (D) cells (time doubling 26.4 hours).
  • Sf9-HT cells at 37 ° C ( ⁇ ) grow faster (doubling time 19.2 hours) than Sf9 cells at 28 ° C.
  • the stationary phase is reached more quickly (4 days) and corresponds to a lower cell density (1.2.10 6 cells) in the case of Sf9-HT cells than in that of Sf9 cells (8 days, and 2.7.10 6 cells ).
  • Sf9-HT cells Examination of Sf9-HT cells under a microscope shows that they have a normal morphology; however their average diameter is larger than that of Sf9 cells. Analysis by flow cytometry shows that the DNA content of Sf9-HT cells is 2 times greater than that of Sf9 cells.
  • the Sf9-HT cells are taken up in the TC-100 medium used in Example 1, without fetal calf serum and distributed in new dishes. One hour later, when the cells adhere to the bottom of the dishes of culture, the culture medium is eliminated and the viral inoculum, produced on Sf9 cells cultured at 28 ° C., is added at the rate of 10 infectious viral units per cell. After one hour of incubation at room temperature, complete medium is added, and the cultures are placed at 28 ° C., or at 37 ° C. The viral cycle is observed by electron microscopy.
  • the titer in infectious viral particles produced is 10 times lower than at 28 ° C.
  • viral particles secreted by infected Sf9-HT cells cultured at 37 ° C. are used as an inoculum for a new cycle of viral infection in Sf9-HT cells cultured at 37 ° C.
  • Figure 2 shows the evolution of the viral titer in SF9-HT and Sf9 cells during the different passages, from the same initial inoculum
  • messenger RNAs corresponding to very early proteins IE1
  • early 39K
  • late gp67 and vp39
  • very late polysomal RNAs corresponding to very early proteins (IE1), early (39K), late (gp67 and vp39) or very late (polyed ⁇ ne and P10).
  • the messenger RNAs mainly present are those of the gp61, iel, vp39 and 39k genes; from 48 hours after infection, the most expressed messenger RNAs are those of very late genes (polyhedrin and P10); at 37 ° C. no expression of the mRNA is observed, with the exception of a weak expression of the 39k mRNA.
  • the expression of the iel, 39K, gp67 and Vp39 genes is reduced, with only 6, 20, 20 and 30% of expression at 24 h post-infection, by compared to what is observed at 28 ° C with Sf9 cells.
  • the expression of the very late polyhedrin and PI C genes it is only 15 to 20% (at 24 hours).
  • the probes used to measure the synthesis of the RNAs expressed under the control of the PI O and iel promoters are of comparable size (iel: 278bp / P10 233bp). However, their content of residues C is however lower for P10 (70 for iel and 44 for P10).
  • the polyhedrin and 39K probes are of comparable size (513bp for the 39K probe and 460 for the polyhedrin probe), but the content of residues C is 104 for the 39K probe and 125 for the polyhedrin probe, respectively).
  • the iel, PI O and polyhedrin genes are transcribed with the same efficiency; and the 39K gene is best expressed under these conditions.
  • a culture of Sf21-HT cells capable of multiplying at 37 ° C. was infected with the baculovirus AcMNPV according to the protocol indicated in Example 2 above.
  • the viral cycle was observed by electron microscopy in cells cultured at 27 ° C, and those cultured at 37 ° C.
  • the appearance of the infected Sf21-HT cells cultivated at 27 ° C. is identical to that of the Sf9-HT cells cultivated under the same conditions, described in Example 2.
  • the major part of the Sf21- cells HT infected cultured at 37 ° C also has the same appearance as that of Sf9-HT cells cultured under the same conditions.
  • the presence of polyhedra is also observed in approximately 1 to 2% of the Sf21-HT cells.
  • EXAMPLE 4 EXPRESSION IN SF9-HT CELLS CULTIVATED AT 37 ° C OF A HETEROLOGOUS GENE CLONED IN A BACULOVIRUS.
  • the cZ gene coding for ⁇ -galactosidase was placed under the control of the promoter of the P10 protein gene, or else under the control of the promoter of the polyhedrin gene, in recombinant baculoviruses derived from the AcMNPV virus.
  • the ⁇ -galactosidase activity is revealed in the cells, using as chromogenic substrate, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- mdoyl- ⁇ -D-galactopyranoside) and the cultures are observed under a microscope.
  • a recombinant baculovirus expressing the heavy and light chains of a human immunoglobulin [POUL et ai. , Eur. J. Immunol., 25, 2005-2009, (1995)] was used to infect a culture of cells according to the invention. After 4 days of culture at 37 ° C., cultures are recovered in the supernatant up to 2 mg / l of functional antibodies (ie approximately 2 mg of antibody for 5.10 8 cells).

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Abstract

L'invention est relative à un procédé d'obtention de cellules d'insectes, notamment de S. frugiperda, capables de se multiplier à 37 DEG C, et à l'utilisation desdites cellules pour la production de protéines recombinantes.

Description

CULTURES DE CELLULES D'INSECTE SE MULTIPLIANT A 37 °C, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention est relative à des cultures de cellules d' insecre capables de croître à 37°C, et permettant la multiplication de baculovirus, ainsi qu'à l'utilisation de ces lignées cellulaires pour l'expression de gènes d'intérêt clones dans des baculovirus .
L'expression, dans des cultures de cellules d'insectes, de gènes d'intérêt clones dans des vecteurs dérivés de baculovirus, est une des méthodes de production de protéines recombinantes les plus utilisées à l'heure actuelle.
L' optimum de température pour les cellules d'insecte en culture est compris entre 26 et 28°C. A des températures supérieures à 30°C, leur croissance ralentit considérablement, et elles meurent rapidement si elles sont maintenues à des températures supérieures à 35 °C.
Dans le cas de cellules de Spodoptera frugiperda en culture, il a été constaté qu'un choc thermique de courte durée (30 min.) à 42 °C ne diminuait pas leur viabilité [CLEM et MILLER, Mol. Cell. Biol . , 14,
5212-5222, (1994)]. Cependant, lorsque ces cellules sont maintenues à des températures supra-optimales pendant une plus longue durée, leur croissance est affectée ; HARA et al . [Biosc. Biotech. Biochem. , 57 (6), 996-997, ,(1993)] rapportent par exemple que l'on n'observe aucune croissance des cultures de cellules Sf21 à 37°C. Lorsque ces cellules sont infectées par un baculovirus recombinant exprimant le gène de la β-galactosidase sous contrôle du promoteur de la polyédrine, l'expression de ce gène est maximale pour des températures de l'ordre de
30°C, décroît considérablement à 33°C, et devient nulle à
35°C. La production de protéines recombinantes dans des systèmes baculovirus/cellules d'insectes est donc classiquement effectuée à des températures avoismant les 27 °C. Ceci peut présenter des inconvénients, particulièrement lorsque l'on sounaite exprimer certaines protéines qui sont naturellement synthétisées à une température plus élevée (par exemple des protéines d' animaux a sang chaud, et en particulier de mammifères) ; en effet, il est connu que la température peut avoir une influence directe sur le repliement des chaînes polypeptic- ques, et que pour certaines protéines, une variation de quelques degrés C de la température à laquelle elles sont synthétisées peut modifier leur activité de manière notable. De plus, on sait que la composition lipidique des membranes est différente à 27°C et a 37 °C, ce qui est important pour l'environnement de certaines protéines et en particulier des protéines membranaires .
C'est pourquoi il est souhaitable de pouvoir maintenir en culture et multiplier des cellules d' insectes permettant la multiplication de baculovirus et l'expression de gènes d'intérêt clones dans ceux-ci, à une température la plus procne possible de la température corporelle des mammifères.
La demande japonaise au nom de NORINSUISANSHO KAJU SKIKEN publiée le 19/04/91 sous le numéro J03094074 mentionne l'obtention d'une lignée de cellules dérivées de larves d'Λgrot-is segetum, et capables de survivre à 37 °C. Ces cellules sont obtenues en procédant à une mutagenèse aléatoire par rayons ultraviolets, puis à une sélection des mutants par acclimatation à une alternance de températures (30°C pendant 2 à 5 jours, 25°C pendant 4 à 7 jours, 33°C pendant 2 à 5 jours, 25°C pendant 5 a 7 jours, 35°C pendant 2 à 5 jours, 25°C pendant 5 a 7 jours, 37°C pendant 2 à 5 jours, 25°C pendant 4 à 7 jours) . Les cellules obtenues ainsi permettent, lorsqu'elles sont cultivées a des températures de 33 à 37 °C, la multiplication de baculovirus patnogenes pour des insectes du genre Agrot-is. Toutefois, la demande J03094674 ne donne aucune indication sur la st'aoïlité de ces lignées cellulaires, ni sur leur capacité à se multiplier indéfiniment a 37°C, ou sur la possibilité de les utiliser comme cellules-hôte pour l'expression de gènes recombinants clones dans des baculovirus.
Les Inventeurs ont maintenant constate que de manière surprenante, des cellules des lignées Sf9 et Sf21 de Spodop tera frugiperda (qui sont classiquement utilisées pour la proαuction de baculovirus recombinants), pouvaient lorsqu'elles étaient placées dans certaines conditions, donner naissance a des cultures capables de pousser et de se multiplier normalement et indéfiniment a 37°C et convenant parfaitement pour la multiplication de oaculovirus et l'expression dans ceux-ci de protéines recombinantes actives .
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures de cellules d'insectes, et en particulier αe l pidoptères, capables de se multiplier à 37 °C ; ce procédé comprend les étapes suivantes : a) la mise en culture desdites cellules d'insecte à une température d'environ 27±2°C ; b) l'augmentation de la température αe culture jusqu'à environ 37+l°C, c) le maintien en culture desdites cellules à cette température pendant 4 à 6 jours environ ; d) la récupération des cellules issues de l'étape c) et leur remise en culture à une température d'environ 37±1°C.
L'augmentation de température de l'étape b) peut être effectuée en une seule étape, en élevant la température de la culture directement de 28 °C à 37 °C.
Elle peut également être effectuée en plusieurs étapes, par exemple une première élévation de température de 27 a
30°C environ, suivie au maintien à la température de 30°C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 30°C, de l'élévation de la température de cette culture de 30 à 33°C environ, suivie du maintien à la température de 33°C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 33°C, de l'élévation de la température de cette culture de 33 à 35°C environ, suivie du maintien à la température de 35°C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 35°C, et de l'élévation de la température de cette culture de 35 à 37 °C environ. Chacune des étapes d'élévation de la température de la culture peut s'effectuer simplement par passage d'une étuve maintenue à la température la plus basse à une étuve maintenue à la température la plus élevée.
Contrairement au procédé décrit dans la demande japonaise J03094674, le procédé conforme à l'invention ne nécessite aucune étape de mutagenèse.
Des cellules d'insectes qui peuvent avantageusement être utilisées, conformément à l'invention, pour l'obtention de cultures de cellules capables de se multiplier à 37°C sont en particulier des cellules de Spodoptera frugiperda , par exemple celles de la lignée Sf21 ou de la lignée Sf9. Les milieux de culture classiquement utilisés pour la culture des cellules d' insecte conviennent pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention, et pour le maintien des cultures en résultant ; par exemple, dans le cas des lignées Sf9 ou Sf21, en peut utiliser l'un des milieux décrits par O'REILLY et al. [Baculovirus
Expression Vectors : A Laboratory Manual ; Freeman -and
Cie, New York, (1992)], tels que le milieu de GRACE, le milieu IPL-41, le milieu TC-100, etc.. ou tout autre milieu . La présente Invention a également pour objet les cultures de cellules d' insecte susceotibles d' être obtenues par un procède conforme a l'invention, tel que défini ci-dessus, et les lignées issues de ces cultures. Ces lignées seront dénommées ci-apres « lignées HT », et désignées par la dénomination de la lignée d'origine, suivie des lettres « HT ». Par exemple, ou dénommera : « Sf9-HT » et « Sf21-HT » les lignées respectivement issues, conformément à l'invention, des cellules Sf9 et Sf21.
Les lignées ainsi ootenues diffèrent des lignees-meres dont elles sont issues par leur nombre de chromosomes, qui est 2 fois plus élevé (endodiploidie) . Elles peuvent être maintenues en culture à 37°C, et se multiplier indéfiniment à cette température ; elles peuvent également être conservées sous forme congelée, et être remises en culture directement a 37°C. Elles conservent la possibilité de pousser et de se multiplier à 27 °C (bien que plus lentement que les cellules dont elles sont issues) , ainsi que la capacité de supporter la décongélation . Les cellules conformes à l'invention sont permissives pour les mêmes baculovirus que les cellules mères dont elles sont issues. Dans des cultures de cellules conformes a l'invention, ces baculovirus se multiplient à 37 °C et produisent des particules infectieuses.
Les Inventeurs ont en outre constaté que des gènes d' intérêt insérés dans des baculovirus recombinants peuvent être exprimés à 37°C dans les cultures de cellules conformes à l'invention, et permettent d'obtenir des protéines fonctionnelles. Les cultures de cellules conformes à l'invention sont donc utilisables, de la même manière que des cultures des cellules dont elles sont issues, pour exprimer des gènes d'intérêt clones dans des baculovirus . La présente invention a pour oojet un procédé d'expression d'au moins une protéine recombinante dans des cellules d'insecte, lequel procède est caractérise en ce que ladite protéine recomoinante est exprimée dans les cellules d'une culture conforme a l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre préfère du procède conforme à l'invention, ladite protéine recombinante est exprimée a une température supérieure à 35°C, de préférence comprise entre 35 et 39°C.
Tous les vecteurs d' expression haoïtuellement utilisables dans les lignées Sf21 et • Sf9 peuvent également être utilisés pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules Sf21-HT et Sf9-HT conformes à l'invention. On peut notamment utiliser des vecteurs dans lesquels le gène d' intérêt à exprimer est place sous contrôle d'un promoteur très précoce, comme le promoteur IE-1 , d'un promoteur précoce, comme le promoteur 39K, d'un promoteur tardif, comme le promoteur gp67 ou celui de la protéine de capside, ou d'un promoteur très tardif, comme celui de la polyédπne ou de la protéine P10. On peut également utiliser des promoteurs cellulaires capables de fonctionner à 37°C, tels que par exemple le promoteur Actme 3 de Bombyx mon
(ver à soie) ou des promoteurs de cellules de mammifères.
On peut également utiliser des vecteurs du type « multi-recombmant », dans lesquels 2 ou plusieurs gènes d' intérêt sont places sous contrôle αe 2 ou plusieurs promoteurs. Dans des cultures αe cellules conformes à l'invention dérivées de la lignée monoclonale Sf9-HT, les promoteurs très précoces, précoces ou tardifs apparaissent comme plus actifs à 37°C que les promoteurs très tardifs (polyédrine ou P10) ; on pourra donc choisir le promoteur utilisé selon le niveau d'expression que l'on souhaite obtenir.
Pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules conformes a l'invention, on peut également utiliser des vecteurs dérivés de baculovirus, tels que ceux décrits par exemple dans la Demande EP 0 638 647 aux noms αe l' INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE et au CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qu va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de cultures de cellules conformes à l'invention, et d'utilisation de ces cultures pour l'expression αe gènes clones dans des oaculovirus. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CULTURES DE CELLULES SE MULTIPLIANT A 37°C
Les lignées cellulaires utilisées sont d'une part, les lignées Sf21 ( IPL3-SF-21 ) et Sf9 (ATCC CRL 1711) issues du lépidoptère Spodoptera frugiperda , et d'autre part, a titre comparatif, la lignée S2 issue αe la mouche Drosophila melanogas ter, la lignée C3 1225 issue du moustique Aedes albopi ctus, et la lignée Mb, issue du lépidoptère Mamestra brassicae .
Les cellules des lignées de lépidoptères Sf21, Sf9, et Mb, et αe la lignée S2 de Drosophile sont repiquées en milieu TC-100 (LIFE TECHNOLOGIES, INC.), supplementé avec 5% de sérum de veau fœtal.
Les cellules de moustique CB 1225 sont entretenues dans le milieu de MITSUHASHI-MARAMOROSCH [Contπb. Boyce Thompson Inst., 22, 435-460, (1964)]. Des cultures de cellules Sf9 ou Sf21, ainsi que des cultures des cellules Mb, S2, et CB 1225 sont placées dans une étuve a 28 °C ; la température est augmentée graduellement pendant quatre jours, jusqu'à 37°C. Les cellules sont maintenues à cette température et leur croissance est surveillée quotidiennement.
Après une semaine à 37°C, seules les cellules issues des cultures Sf9 et Sf21 sont capables de survivre. Les cellules issues des lignées Mb, S2 et CB 1225 cessent toute croissance à partir d'une température de 30°C, et meurent à partir de 35°C. Des prélèvements des cultures issues des lignées Sf9 et Sf21 sont diluées dans du milieu frais à raison de l/5eme, et remis en culture à 37 °C. Les lignées stables obtenues après plusieurs passages en culture dans ces conditions sont dénommées Sf9-HT et Sf21-HT.
La croissance de la lignée Sf9-HT à 37°C et 28°C a été comparée à celle de la lignée mère Sf-9 à 28°C. Les courbes de croissance, qui sont représentées sur la figure 1, montrent qu'à 28°C, les cellules Sf9-HT (O) poussent moins vite (temps de doublement 33,6 heures) que les cellules Sf9 (D) (temps de doublement 26,4 heures). En revanche les cellules Sf9-HT à 37°C (Δ) poussent plus vite (temps de doublement 19,2 heures) que les cellules Sf9 à 28°C. La phase stationnaire est atteinte plus rapidement (4 jours) et correspond à une densité cellulaire plus faible (1,2.106 cellules) dans le cas des cellules Sf9-HT que dans celui des cellules Sf9 (8 jours, et 2,7.106 cellules) . L'examen des cellules Sf9-HT au microscope montre qu'elles ont une morphologie normale ; cependant leur diamètre moyen est plus important que celui des cellules Sf9. L'analyse en cytométrie de flux montre que le contenu en ADN des cellules Sf9-HT est 2 fois plus important que celui des cellules Sf9.
L' analyse comparative des lipides membranaires des cellules Sf9 et Sf9-HT a été effectuée. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous .
Dans la lignée Sf9-HT, on observe une augmentation de la sphingomyeline et du phosphatidylinositol, et une diminution de la phosphatidylcholine et de la phosphatidyléthanolamine, ce qui entraîne une augmentation du rapport sphingomyéline/phosphatidylcholine . On observe également une augmentation globale du pourcentage d'acides gras saturés, principalement due à une augmentation de l'acide palmitique.
EXEMPLE 2 : MULTIPLICATION DU BACULOVIRUS ACMNPV, ET EXPRESSION DES PROMOTEURS DANS DES CELLULES SF9-HT CULTIVEES A 37°C
Des cultures de la lignée Sf9-HT ont été infectées par le baculovirus AcMNPV, à 28°C ou à 37°C, selon le protocole suivant :
Les cellules Sf9-HT sont reprises dans le milieu TC-100 utilisé à l'Exemple 1, sans sérum de veau fœtal et réparties dans des boîtes neuves. Une heure après, lorsque les cellules adhérent au fond des boîtes de culture, le milieu de culture est éliminé et on ajoute 1 ' inoculum viral, produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28°C, à raison de 10 unités virales infectieuses par cellule. Après une heure d'incubation à température ambiante, on ajoute du milieu complet, et l'on place les cultures à 28°C, ou à 37°C. Le cycle viral est observé en microscopie électronique.
72 heures après l'infection, on observe, dans les cellules Sf9-HT cultivées à 28°C, des particules virales présentes en grand nombre dans le noyau, ainsi que des polyèdres et des . structures fibrillaires correspondant à la protéine P10. Dans les cellules à
37 °C, en revanche, on ne distingue clairement que les particules virales intranucléaires . Dans les 2 cas, les cellules Sf9-HT sécrètent des particules virales infectieuses dans le milieu de culture ; dans le cas des cellules infectées cultivées à
37 °C, le titre en particules virales infectieuses produites est 10 fois moindre qu'à 28°C. Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées à 37°C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d' infection virale dans des cellules Sf9-HT cultivées à
28 °C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique à celui observé avec l' inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28°C.
La Figure 2 représente l'évolution du titre viral dans les cellules SF9-HT et Sf9 au cours des différents passages, à partir d'un même inoculum initial
(10 unités virales infectieuses par cellule) obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28°C :
(^) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28°C ; passage sur des cellules Sf9. à 28°C, puis 4 passages successifs a 28°C avec l' inoculum du passage précèdent obtenu a 28 °C ;
(A) inoculum initial ootenu sur des cellules Sf9 cultivées a 28°C ; passage sur des cellules Sf9-HT a 37°C, puis à passages successifs a 37°C avec l' inoculum du passage précèdent obtenu a 37 °C ,
(Ξ) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées a 28°C , passage sur des cellules Sf9-HT cultivées a 28°C, puis 4 passages successifs a 28°C avec l' inoculum au passage précèdent obtenu a 28 °C ;
( M ) (témoin) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées a 28°C ; passage sur des cellules Sf9 cultivées a 37°C puis 4 passages successifs a 37°C avec l' inoculum du passage précèdent. Dans ce cas, on n'observe aucune replication virale.
Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées a 37°C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d'infection virale dans des cellules Sf9-HT ou Sf9 cultivées a 28°C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique a celui observe avec l' inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées a 28°C. Le profil d'expression des gènes des baculovirus infectant ces cultures de cellules est différent a 28°C et a 37°C, comme le montrent les Figures 3a a 3f, qui illustrent la comparaison des cinétiques d'expression dans les cellules Sf9 a 28°C (§^i) , et a 37°C (≡≡) ou dans les cellules Sf9-HT a 28°C {££ et a 37°C
( ) , des ARN messagers correspondant a des protéines très précoces (IE1), précoces (39K), tardives (gp67 et vp39) ou très tardives (polyedπne et P10) .
En abscisse, le temps de culture après infection (heures) ; en ordonnée, la quantité d'ARN (exprimée en cpm) pour les gènes des protéines IE1 (3a), 39K (3b), gp67 (3c), vp39 (3d) , P10 (3e), et polyédrine (ph) (3f), à 28°C et 37°C. Ces ARNm sont extraits et dosés en utilisant des sondes spécifiques d'ARNc marquées au 32P sur les résidus C, obtenues à l'aide du KIT RIBOPROBE PROMEGA.
Dans le cas des cellules Sf9 : à 28°C, 24 heures après l'infection, les ARN messagers principalement présents sont ceux des gènes gp61 , iel , vp39 et 39k ; à partir de 48 heures après l'infection, les ARN messagers les plus exprimés sont ceux des gènes très tardifs (polyédrine et P10) ; à 37°C on n'observe aucune expression des ARNm, à l'exception d'une faible expression de l'ARNm 39k.
Dans le cas des cellules Sf9-HT infectées à 37°C, l'expression des gènes iel , 39K, gp67 et Vp39 est diminuée, avec seulement 6, 20, 20 et 30% d'expression à 24 h post-infection, par rapport à ce que l'on observe à 28°C avec les cellules Sf9. Quant à l'expression des gènes très tardifs polyédrine et PI C, elle est seulement de 15 à 20% (à 24 heures) .
Bien que les productions des ARNm des gènes polyédrine et P10 apparaissent faibles en valeurs relatives (surtout à 48 h) , elles sont cependant du même ordre de grandeur que ce que l'on observe pour les gènes iel et 39K.
En effet, les sondes utilisées pour mesurer la synthèse des ARN exprimés sous le contrôle des promoteurs PI O et iel sont de taille comparable ( iel : 278bp/P10 233bp) . Cependant, leur contenu en résidus C est cependant plus faible pour P10 (70 pour iel et 44 pour P10) . De même, les sondes polyédrine et 39K sont de taille comparable (513bp pour la sonde 39K et 460 pour la sonde polyédrine) , mais le contenu en résidus C est respectivement de 104 pour la sonde 39K et de 125 pour la sonde polyédrine) . Ainsi, à 24 heures post-infection, les gènes iel , PI O et polyédrine sont transcrits avec la même efficacité ; et le gène 39K est le mieux exprimé dans ces conditions . EXEMPLE 3 : MULTIPLICATION DU BACULOVIRUS ACMNPV DANS DES CELLULES SF21-HT CULTIVEES A 37°C
Une culture de cellules Sf21-HT capables de se multiplier à 37 °C, a été infectée par le baculovirus AcMNPV selon le protocole indiqué à l'Exemple 2 ci- dessus. Le cycle viral a été observé en microscopie électronique dans les cellules cultivées à 27°C, et celles cultivées à 37°C.
72 heures après l'infection, l'aspect des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 27°C est identique à celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions, décrit à l'exemple 2. La majeure partie des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 37°C a également le même aspect que celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions. Cependant, on observe en outre la présence de polyèdres dans 1 à 2% environ des cellules Sf21-HT.
EXEMPLE 4 : EXPRESSION DANS DES CELLULES SF9-HT CULTIVEES A 37°C D'UN GENE HETEROLOGUE CLONE DANS UN BACULOVIRUS.
Le gène la cZ codant pour la β-galactosidase a été placé sous contrôle du promoteur du gène de la protéine P10, ou bien sous contrôle du promoteur du gène de la polyédrine, dans des baculovirus recombinants issus du virus AcMNPV.
Des cultures de cellules Sf9-HT capables de se multiplier à 37°C, ont été infectées par l'un ou l'autre de ces baculovirus recombinants, selon le même protocole que celui indiqué ci-dessus pour le baculovirus AcMNPV.
Après 3 jours de culture à 37°C, l'activité β- galactosidase est révélée dans les cellules, en utilisant comme substrat chromogène, le X-Gal ( 5-bromo-4-chloro-3- mdoyl-β-D-galactopyranoside) et les cultures sont observées au microscope.
Dans le cas du promoteur du gène de la protéine PIO, une proportion importante des cellules (environ 95%) présente une coloration bleue, indiquant l'expression de β-galactosidase active.
Dans le cas du promoteur du gène de la polyédrine environ 5% des cellules présentent une coloration bleue. - Immunoglobulmes
Un baculovirus recombinant exprimant les chaînes lourdes et légères d'une immunoglobuline humaine [POUL et ai . , Eur . J. Immunol., 25, 2005-2009, (1995)] a été utilisée pour infecter une culture de cellules conformes à l'invention. Au bout de 4 jours de culture à 37°C, on récupère dans le surnageant des cultures jusqu'à 2mg/l d'anticorps fonctionnels (soit environ 2mg d'anticorps pour 5.108 cellules).

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'obtention de cultures de cellules d'insecte capables de se multiplier à 37°C, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en culture desdites cellules d'insecte à une température d'environ 27±2°C ; b) l'augmentation de la température de culture jusqu'à environ 37±1°C, c) le maintien en culture desdites cellules à cette température pendant 4 à 6 jours ; d) la récupération des cellules issues de l'étape c) et leur remise en culture à une température d'environ 37±1°C.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules mises en culture sont des cellules de Spodoptera frugiperda .
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que lesdites cellules de Spodoptera frugiperda appartiennent à la lignée Sf9 ou à la lignée Sf21.
4) Culture de cellules d'insecte, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Procédé de culture de cellules d'insecte, caractérisé en ce que l'on met en culture à 37°C des cellules issues d'une culture selon la revendication 4.
6) Procédé d'expression d'une protéine recombinante en cellules d'insecte, lequel procédé est caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée dans les cellules d'une culture selon la revendication 4.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée à une température supérieure à 35 °C, de préférence comprise entre 35 et 39°C. 8) Utilisation des lignées cellulaires Sf9 et Sf21 de Spodoptera frugiperda , pour l'obtention de cultures de cellules capables de se multiplier à 37°C.
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