EP1173228A1 - Procede d'elimination des protozoaires, notamment des amibes libres d'un flux aqueux colonise, procede de traitement d'un flux aqueux par electropulsation et son application pour eliminer des protozoaires - Google Patents

Procede d'elimination des protozoaires, notamment des amibes libres d'un flux aqueux colonise, procede de traitement d'un flux aqueux par electropulsation et son application pour eliminer des protozoaires

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EP1173228A1
EP1173228A1 EP00920806A EP00920806A EP1173228A1 EP 1173228 A1 EP1173228 A1 EP 1173228A1 EP 00920806 A EP00920806 A EP 00920806A EP 00920806 A EP00920806 A EP 00920806A EP 1173228 A1 EP1173228 A1 EP 1173228A1
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EP
European Patent Office
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flow
protozoas
pulses
protozoa
aqueous flux
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00920806A
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German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Christine Vernhes
Pierre-André René CABANES
Justin Teissie
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Electricite de France SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Electricite de France SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/48—Treatment of water, waste water, or sewage with magnetic or electric fields
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor
    • A61L2/02—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor using physical processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/42—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from bathing facilities, e.g. swimming pools
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2303/00—Specific treatment goals
    • C02F2303/04—Disinfection

Definitions

  • PROCESS FOR REMOVING PROTOZOA ESPECIALLY FREE AMIBES FROM A COLONIZED AQUEOUS STREAM
  • the present invention relates to a process for the elimination of protozoa colonizing an aqueous medium by the application of an electric field drawn from the medium, as well as a process for the treatment of an aqueous medium colonized by electropulsation and its application to elimination protozoa.
  • Thermophilic amoebas are said to be free because they can reproduce without going through an intermediate host.
  • Free amoebas exist in several forms:
  • N. fowleri causes meningoencephalitis.
  • the exclusive route of contamination is the nasal mucosa, the amoebae then crossing the mucous and bone barriers to reach the brain. If any risk of contamination by the digestive tract, particularly for drinking water, is excluded from all of the cases reported, a large number of cases appear to be associated with aquatic exposure in relatively warm water, by swimming or water sports. , which could explain why the disease strikes children and young people more frequently due to a greater practice of water sports. This fact can also correspond to a less developed immunity than in adults vis-à-vis of these protozoa. The disease is very rare, since only 180 cases were reported on January 1, 1998 for the whole planet.
  • E the intensity of the applied electric field
  • f the shape factor of the cell (1, 5 in the case of a sphere)
  • g ( ⁇ ) factor related to the conductivities of the external and internal environments and to that of the membrane permeability membrane ⁇
  • r the radius of the cell
  • ⁇ the angle between the macroscopic electric field vector and the normal to the plane of the membrane at the point considered M
  • x p is the charging time of the membrane capacity (of the order of a microsecond)
  • t time d field application.
  • electro-waterproofing is an irreversible phenomenon which leads to cell death or electromortality [Sale and Hamilton (1967) :( 9), (1968) :( 10), Kekez et al . (1996) :( 14),].
  • This property has been used either to lyse cells in order to recover a metabolite of interest, not naturally excreted by the cell, or to eradicate cells from the environment (disinfection) or having the prospect of sterilizing food fluids in a non-thermal manner [ Jayaram et al. (1992) :( 16), Knorr et al. (1994) :( 17); Qin et al. (1996) :( 18); Qin et al. (1998) :( 19)].
  • pulsation systems There are two pulsation systems according to the volume treated (a) a fixed bed pulsation system also called batch, which only allows to treat small volumes according to the dimensions of the electrodes and (b) a flow pulsation system which allows to treat a flowing cell suspension.
  • the advantage of the flow system is that it can process large volumes.
  • the latter relates to a process for destroying protozoa, characterized in that an colonized aqueous flow is subjected to an electric field with an intensity greater than 1 kV / cm.
  • the intensity varies from 1 to 30 kV / cm, and even more preferably 1.5 to 15 kV / cm.
  • the profile of the pulses it can be in particular of the square wave type, exponential declines, trapezoid, sinusoidal or bipolar.
  • total decontamination of free amoebae in certain aqueous media can be achieved.
  • total decontamination of the free amoebae is achieved, ie a reduction of the order of 95% in the number of free amoebae.
  • the invention also relates to the application of the process for treating a colonized aqueous medium of the invention to the elimination of protozoa.
  • FIGS. 1a and 1b schematically represent the installations that can be used to implement the methods described.
  • FIG. 2 represents the parallel evolution of the rate of cell permeabilization and of the viability of the amoebae as a function of the intensity of the applied electric field.
  • FIG. 3 represents the percentage of residual viability (illustrates the mortality) for different values of the intensity of the field, for parallel orientations, perpendicular to the flow of the flow and in batch.
  • FIG. 4 illustrates the evolution at constant energy 25 J / cm 3 of the long-term viability and the rate of permeabilization of the cells.
  • Figure 5 illustrates energy optimization.
  • colonized medium means any domestic, natural or industrial aqueous medium which may include or include protozoa, in particular amoebae, and in particular free amoebae, such as natural or heated bathing water, swimming pools and baths, water industrial discharges, aqueous media from cooling or heating circuits, aqueous media from ventilation and air conditioning circuits, potable water, and generally any environment where protozoa and in particular amoebae, and especially free amoebae are likely to live, survive or multiply.
  • protozoa in particular amoebae, and in particular free amoebae, such as natural or heated bathing water, swimming pools and baths, water industrial discharges, aqueous media from cooling or heating circuits, aqueous media from ventilation and air conditioning circuits, potable water, and generally any environment where protozoa and in particular amoebae, and especially free amoebae are likely to live, survive or multiply.
  • the methods of the invention are implemented in installations in continuous flow, or in sequential flow.
  • their number can vary from 1 to
  • 100 successive pulses in particular from 1 to 50, preferably 1 to 10.
  • Their duration can vary from 0.5 ⁇ s to 24 ms, in particular 1 ⁇ s to approximately 10 ms.
  • the profile of the pulses it can be in particular of the square wave type, exponential declines, trapezoid, sinusoidal or bipolar.
  • the pulses can be delivered with a frequency ranging from 1 to 2000 Hz.
  • ten 10 ms pulses are applied at 1.5 kV / cm, or a 10 ⁇ s pulse at 11 kV / cm, or a 50 ⁇ s pulse at 9 kV / cm.
  • Example 1 Preferably, ten 10 ms pulses are applied at 1.5 kV / cm, or a 10 ⁇ s pulse at 11 kV / cm, or a 50 ⁇ s pulse at 9 kV / cm.
  • lovanensis Ar-9M1 have a size of 18.2 ⁇ m (8.5-31.5) x 10.9 ⁇ m (4-21).
  • the cysts have a diameter of 10.3 ⁇ m (7.5-12.5).
  • the size characteristics are close to those of N. fowleri.
  • axenic culture In this type of culture the nutrients are not provided by bacteria but by a nutritive medium. The culture is carried out in axenic condition on plastic boxes at 37 ° C. using the Chang culture medium.
  • the pulsation medium is Garonne water, filtered with a conductance of the order of 200 ⁇ s / cm.
  • the generators used in this study (CNRS and Cober 605p) generate kinetic pulses in square waves of negative polarity.
  • the duration of the pulses is variable between 5 ⁇ s and 24 ms and the application frequency from 0.1 to 10 Hz in internal control and from 2000 Hz in external control.
  • the voltage delivered by the device is 1500 volts maximum (8 A).
  • the Cober 605P was used to deliver intense fields (7 kV / cm ⁇ E ⁇ 10 kV / cm) by applying a single pulse of duration ⁇ 300 ⁇ s. The latter is capable of delivering an output voltage of 2 kV (10A).
  • the permeabilization of cells is quantified by flow cytometry by the use of a naturally non-permeable fluorescent marker, propidium iodide.
  • the pulsation chamber C consists of two electrodes with flat steel blades, held in parallel by insulating shims connected to an electropulser (E) and an oscilloscope (O).
  • the distance 2 between the electrodes is 0.4 cm or 0.25 cm.
  • the arrow indicates the deposition of the cells.
  • the pulsation system developed in the laboratory is made up of different elements: a cell reservoir 1 provided in particular with a stirring device 2, a peristaltic pump 3, a pulsation chamber 4 connected to an electropulser 5 and a oscilloscope 6 and a collector system 7 allowing the cells to be recovered (cf. FIG. 1 b).
  • the peristaltic pump (pump, minipuls 3, Gilson) ensures an overpressure in the cell reservoir, which makes it possible to entrain the cell suspension towards the electropulsing chamber, without passage between the rollers of the pump.
  • This is equipped with a flow system which allows the flow to be adjusted precisely.
  • the electrodes are formed by two parallel steel blades separated by an interelectrode distance of 0.4 cm.
  • the volume of the pulsation chamber is 0.2 ml.
  • the electrodes used are grids, made up of a mesh (80 ⁇ m x 100 ⁇ m), through which the cells pass.
  • the inter-electrode distance is 0.93 cm and the volume of the pulsation chamber is 0.117 ml.
  • the electrodes in the two systems are connected to a high-voltage generator, either CNRS or COBER 605P connected to an oscilloscope (Enertec), thus making it possible to view the electrical parameters delivered.
  • a high-voltage generator either CNRS or COBER 605P connected to an oscilloscope (Enertec), thus making it possible to view the electrical parameters delivered.
  • the kinetic profile of the pulses delivered by the generator is said to be in square waves, the intensity of the field remaining constant throughout the duration of the pulses (T).
  • the flexibility of the electropulser makes it possible to modulate the voltage (U), the duration (T), the number (N), and the frequency (F) of the pulses.
  • the efficiency of destruction of amoebae (% of viability) by the electric field was compared according to the configuration used (batch, parallel field in flow, perpendicular field in flow).
  • the cells in the three cases, are electropulsed by ten pulses of 10 ms delivered with a frequency of 1 Hz.
  • the two pulsating chambers in flow have different volumes, which explains why the flow rates used to have the same conditions of electropulses are different.
  • FIG. 4 represents the evolution at constant energy 25 J / cm 3 of the long-term viability (M) and of the permeabilization rate (D).
  • the intensity of the electric field (E) and the total cumulative duration of pulsation (T) were varied while keeping the value of the product E 2 xT constant.
  • the duration of the pulses is arbitrarily fixed at 10 ms and the pulses are delivered at the frequency of IHz. Viability is revealed at 24 h by the crystal violet staining technique.
  • the permeabilization (D) is quantified by flow cytometry, by the entry of a fluorescent non-permeable marker, propidium iodide. Five electropulsing conditions are used:
  • Amoebas are more sensitive to the use of short but high intensity pulses than to the use of low intensity pulses for very long pulsation times.
  • the destruction of the amoebas depends essentially on the intensity of the applied electric field and not on the duration of effective pulsation.
  • the following table represents for various field intensities the times of the pulses necessary to obtain 95% of mortality and the associated energy. It shows that the higher the intensity of the field, the less energy to bring to the system.
  • Figure 5 shows the results of the experiments carried out for fields up to 8.8 kV / cm under the following conditions:
  • the amoebae are electropulsed at varying electric field strengths for a single short pulse.
  • the viability (% of viability) is evaluated 24 hours after the electropulsation by the crystal violet staining technique.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par application d'un champ électrique pulsé, dans lequel on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique d'une intensité variant de 1 à 30 kV/cm ainsi que son application à la destruction des protozoaires, et des amibes libres notamment. Elle concerne aussi un procédé de destruction de protozoaires.

Description

PROCEDE D'ELIMINATION DES PROTOZOAIRES, NOTAMMENT DES AMIBES LIBRES D'UN FLUX AQUEUX COLONISE, PROCEDE DE TRAITEMENT D'UN FLUX AQUEUX PAR ELECTROPULSATION ET SON APPLICATION POUR ELIMINER DES PROTOZOAIRES.
La présente invention concerne un procédé d'élimination de protozoaires colonisant un milieu aqueux par l'application d'un champ électrique puisé au milieu, ainsi qu'un procédé de traitement d'un milieu aqueux colonisé par électropulsation et son application à l'élimination des protozoaires.
Des amibes thermophiles sont dites libres car elles peuvent se reproduire sans passer par un hôte intermédiaire. Parmi les nombreuses espèces d'amibes libres, certaines peuvent être à l'origine de pathologies chez l'homme : il s'agit des amibes appartenant aux genres Naegleria (espèce fowleri), Acanthamoeba (plusieurs espèces), et Balamuthia (espèce mandrillaris). Les amibes libres existent sous plusieurs formes :
- la forme végétative ou trophozoïte, infectante, et sous laquelle elles peuvent se multiplier,
- la forme kystique, de résistance, lorsque les conditions extérieures sont défavorables (par exemple température inférieure à 20°C, présence d'agents oxydants ...),
- et la forme flagellée, seulement pour certaines d'entre elles (notamment Naegleria fowleri).
Le milieu naturel de développement des amibes libres est l'eau douce. Acanthamoeba semble pouvoir survivre dans l'eau de mer, Naegleria ne tolère pas une salinité supérieure à 5 g/1. N. Fowleri croît et se multiplie au-dessus d'une température de 20°C, avec une température optimale de 25 à 45°C. D'autres facteurs, tels que la présence de particules organiques en suspension, de bactéries ou de nutriments, semblent également nécessaires à leur multiplication. Enfin, la présence d'une interface solide chaude, notamment s'il y a peu de courant, serait particulièrement propice à leur développement.
Dans les milieux naturels, dans les régions tempérées, l'abondance des amibes est essentiellement observée lors d'étés chauds. On peut également la retrouver dans les eaux artificiellement réchauffées (piscines, rejet de sites industriels). Par exemple, une eau chaude naturelle en Australie a pu contenir 900 à 1000 N. fowleri par litre. Dans une eau artificiellement réchauffée, comme dans la lagune de rejet de certaines centrales thermiques, les concentrations ne dépassaient pas 1 ,6 par litre. En revanche, pour les centrales ayant un circuit tertiaire de refroidissement fermé dans lequel l'eau tourne "en boucle" (avec toutefois un appoint extérieur accompagné d'un faible rejet), les concentrations de N. fowleri sont plus importantes. Acanthamoeba est couramment retrouvée dans les eaux domestiques et dans les eaux douces naturelles. Par ailleurs, un portage humain a été observé de façon directe dans de nombreux pays, dans les cavités nasales, la gorge ou le tube digestif dans une faible proportion des populations étudiées. En revanche, dans les pays chauds, une majorité de sujets peut présenter des anticorps sanguins dirigés contre N. fowleri et Acanthamoeba, et on conclut qu'il y a donc une large exposition aux amibes libres dans ces populations.
N. fowleri provoque une méningo-encéphalite. La voie exclusive de contamination est la muqueuse nasale, les amibes traversant ensuite les barrières muqueuses et osseuses pour atteindre le cerveau. Si tout risque de contamination par voie digestive, notamment pour l'eau de boisson, est exclu de l'ensemble des cas rapportés, un grand nombre de cas paraît associé à l'exposition aquatique dans une eau relativement chaude, par baignade ou sports nautiques, ce qui pourrait expliquer que la maladie frappe plus fréquemment les enfants et les jeunes gens en raison d'une pratique plus importante des sports nautiques. Ce fait peut aussi correspondre à une immunité moins développée que chez l'adulte vis-à-vis de ces protozoaires. La maladie est très rare, puisque seulement 180 cas ont été rapportés au 1er janvier 1998 pour l'ensemble de la planète. La disparité entre l'ubiquité du protozoaire et la rareté des manifestations pathologiques qu'il entraîne est donc frappante, même s'il est très probable que certains cas ont pu échapper au diagnostic, en raison même de la rareté de la maladie, et du fait de l'absence de spécificité du tableau clinique. Après l'exposition à un milieu aquatique contaminé, le délai d'apparition des signes cliniques semble être de trois à cinq jours. De très nombreux traitements antibiotiques ont été tentés. Les résultats sont décevants ; la littérature ne rapporte que six cas de survie. Par ailleurs, diverses espèces du genre Acanthamoeba peuvent provoquer des kératites, notamment chez les porteurs de lentilles de contact (problème du rinçage avec de l'eau non stérile). Enfin, diverses espèces du genre Acanthamoeba et du genre Balamuthia peuvent entraîner des encéphalites granulomateuses, chez des personnes dont les défenses immunitaires sont déficientes. Dans ce cas, la porte d'entrée est souvent cutanée.
En terme de prévention, il faut souligner que le risque croît de façon exponentielle avec le niveau de colonisation, ce qui explique le peu de cas observés de par le monde, mais aussi la possibilité d'émergence de cas groupés si une même source est très contaminée (16 décès liés à des baignades dans une piscine en République Tchèque). Ainsi lorsque la surveillance métrologique d'un milieu fait apparaître un risque trop élevé de méningo-encéphalite, un traitement s'impose.
Jusqu'à présent ce traitement a essentiellement été basé sur la chloration (lacs américains), ou la chloramination, comme en Australie dans le réseau d'eau potable. En France, la constatation d'une multiplication de ces amibes dans certaines centrales peut amener l'entreprise EDF à pratiquer des chlorations durant certains étés. Cette méthode est efficace si les niveaux de chlore libre résiduels sont suffisamment importants et si le traitement est continu. Dans le cas de forts débits à traiter, surtout en eau brute, ce traitement entraîne la production de sous-produits qui sont alors relâchés dans l'environnement. Ces produits pouvant avoir une toxicité pour l'homme à long terme, il a paru nécessaire de rechercher une autre méthode de traitement. II existe un besoin pour un procédé et des installations capables de détruire des protozoaires et notamment des amibes libres de façon efficace, sans entraîner d'effet secondaire et qui fonctionnent en permanence dans de bonnes conditions économiques.
Certains effets liés à l'application d'un champ électrique sur une suspension cellulaire ont déjà été décrits : lorsque l'on place une cellule dans un champ électrique, les lignes de champ sont déviées par celle-ci, ce qui provoque une accumulation des charges à la surface de la cellule. Ainsi, il en résulte une différence de potentiel transmembranaire induite ΔV qui se superpose à la différence native ΔΨ0 [Bernhardt J. et Pauly H. (1973):(1 )].
La formule la plus complète retenue dans le cas d'un champ à cinétique en vague carrée et d'une cellule sphérique en suspension est la suivante [Kinosita et Tsong (1979) (2)] :
ΔV(t) = fg(λ) r E(t) cos θ (1 -&**) éq 1
L'expression de cette différence de potentiel induite en un point M au temps t est fonction de :
E : l'intensité du champ électrique appliqué, f : le facteur forme de la cellule (1 ,5 dans le cas d'une sphère), g (λ) : facteur lié aux conductivités des milieux externe et interne et à celle de la membrane de la perméabilité membranaire λ, r : le rayon de la cellule, θ : l'angle entre le vecteur champ électrique macroscopique et la normale au plan de la membrane au point considéré M, xp : est le temps de charge de la capacité membranaire (de l'ordre de la microseconde), t : temps d'application du champ.
Lorsque la durée des impulsions est très supérieure au temps de charge de la membrane (t » τp), le terme (1-e""'0) devient très proche de 1 , on retrouve alors, à l'état stationnaire la formulation classique :
ΔV = fg(λ) r E cos θ éq 2
Le terme en cos θ indique que pour une valeur de champ donnée, l'amplitude de cette différence de potentiel n'est pas identique en tout point de la cellule. Elle est maximale aux points faisant face aux électrodes (pôles) et diminue le long de la surface cellulaire pour s'annuler à l'équateur.
Cette différence de potentiel généré par le champ s'ajoute à la différence de potentiel de repos ΔΨ0. Il en résulte une différence de potentiel résultante ΔVr.
ΔVr = ΔΨ„ + ΔV éq 3
Au niveau de l'hémisphère cellulaire situé face à l'anode, les valeurs numériques de ΔΨ0 et de ΔV s'additionnent pour tenir compte de la vectorialité de l'effet du champ, ce qui entraîne une hyperpolarisation de la membrane. En revanche, au niveau de l'hémisphère situé face à la cathode, les valeurs numériques de ΔΨ0 et de ΔV se retranchent, et la membrane subit une dépolarisation. Lorsque cette différence de potentiel membranaire résultante devient supérieure à une valeur seuil estimée à 200-250 mV [Teissié et Tsong (1981 ):(3)], il y a induction d'un phénomène de perméabilisation [Ho et Mlttal (1996):(4)]. La structure membranaire responsable de cette perméabilité membranaire est inconnue à ce jour, et on emploie préférentiellement le terme de structure transitoire de perméabilisation (STP), ce qui est exprimé de façon usuelle par le terme de "pores".
Si les conditions d'électroperméabilisation sont contrôlées, ce phénomène de perméabilisation est transitoire et réversible, et affecte peu ou pas la viabilité cellulaire. Cette propriété induite par le champ permet d'avoir un accès direct au contenu cytoplasmique [Mir et al. (1988):(5) ; Tsong (1991 ):(6) ; Hapala, (1997):(7)]. Ceci permet de faire pénétrer dans la cellule des molécules étrangères et naturellement non perméantes et de modifier ainsi son contenu de façon soit transitoire (électrochargement,), soit permanente, dans des techniques d'électrotransformation, électroinsertion, par exemple.
En revanche, dans des conditions d'électropulsation particulières drastiques, l'électroperméabilisation est un phénomène irréversible qui conduit à la mort cellulaire ou électromortalité [Sale et Hamilton (1967):(9), (1968):(10), Kekez et al. (1996):(14),]. Cette propriété a été utilisée soit pour lyser des cellules afin de récupérer un métabolite d'intérêt, non excrété naturellement par la cellule, soit pour éradiquer des cellules en environnement (désinfection) ou ayant comme perspective de stériliser de façon non thermique des fluides alimentaires [Jayaram et al. (1992):(16), Knorr et al. (1994):(17) ; Qin et al. (1996):(18) ; Qin et al. (1998):(19)].
Cette technique a été appliquée à de nombreux types cellulaires : des bactéries [(Sale et Hamilton, (1967):(8); (Hϋlsheger et al., (1981 , 1983):(11 , 12);(Mizuno et Hori, (1988):(13); Jayaram et al., (1992):(16); Grahl et MârkI, (1996):(15); Pothakamory et al., (1996):(26); des levures [Saie et Hamilton, (1967):(9); Hϋlsheger et al., (1983):(12); Mizuno et Hori, (1988):(13); Grahl et MârkI, (1996):(15); Gaskova et al., (1996):(28); (Qin et al., (1996):(18), Martin-Belloso et al., (1997):(27)], des cellules animales [Hamilton et Sale, (1967):(8); Sale et Hamilton, (1968):(10)], et des cellules végétales [Hamilton et Sale, (1967):(8); Sale et Hamilton, (1968):(10); Knorr et al., 1994.(17)]. Néanmoins, les protozoaires et notamment les amibes libres n'ont jusqu'à présent pas fait l'objet de tels traitements.
Il existe deux systèmes de pulsation suivant le volume traité (a) un système de pulsation à lit fixe encore appelé batch, qui ne permet de traiter que de faibles volumes suivant les dimensions des électrodes et (b) un système de pulsation en flux qui permet de traiter une suspension cellulaire en écoulement.
La majorité des auteurs ayant publié dans ce domaine ont travaillé en batch [(9);(10);(11);(12);(13);(16);(28);(26)]. Concernant le processus en écoulement, deux stratégies ont été décrites : le flux continu et le flux séquentiel.
Dans le modèle du flux séquentiel, la chambre de pulsation est remplie, le flux est arrêté, le champ est ensuite appliqué puis la chambre est vidée. Ce modèle en flux séquentiel a été développé pour des travaux d'électrofusion où le contact est médié par diélectrophorèse.
L'avantage du système en flux est de pouvoir traiter des volumes importants.
La plupart des auteurs ont utilisé des systèmes à champ perpendiculaire à l'écoulement de la solution [(20);(21 );(22);(23);(24);(25);(18)] ou des systèmes avec des électrodes coaxiales donnant un champ non uniforme mais également perpendiculaire à l'écoulement [(18);(27);(19)].
Les demandeurs ont maintenant mis au point un procédé de traitement de milieux contaminés par des protozoaires, par application d'un champ électrique puisé. Ce procédé peut être appliqué soit en écoulement, soit en pulsation statique. Ce procédé de traitements des milieux colonisés, comparé à la chloration et la chloramination, a la particularité d'être une méthode moins invasive vis à vis de l'environnement. Ce procédé remédie aux inconvénients des procédés connus, notamment pour de grands volumes à traiter.
Selon un objet de l'invention, celle-ci concerne un procédé de destruction des protozoaires caractérisé en ce que l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique d'une intensité supérieure à 1 kV/cm. De préférence, l'intensité varie de 1 à 30 kV/cm, et de façon encore préférée 1 ,5 à 15 kV/cm.
Concernant le profil des impulsions, il peut être notamment de type vague carrée, déclins exponentiels, trapèze, sinusoïdal ou bipolaire.
Dans ces procédés, on peut parvenir à une décontamination totale des amibes libres dans certains milieux aqueux. Selon les conditions électriques utilisées, on parvient à une décontamination totale des amibes libres, soit à une réduction de l'ordre de 95% du nombre d'amibes libres.
Ainsi, l'invention concerne également l'application du procédé de traitement d'un milieu aqueux colonisé de l'invention à l'élimination des protozoaires.
L'invention sera mieux comprise au vu des figures annexées et de la description détaillée ci-après.
Les figures 1a et 1 b représentent schématiquement les installations utilisables pour mettre en oeuvre les procédés décrits. La figure 2 représente l'évolution en parallèle du taux de perméabilisation cellulaire et de la viabilité des amibes en fonction de l'intensité du champ électrique appliquée.
La figure 3 représente le pourcentage de viabilité résiduelle (illustre la mortalité) pour différentes valeurs de l'intensité du champ, pour des orientations parallèles, perpendiculaires à l'écoulement du flux et en batch. La figure 4 illustre l'évolution à énergie constante 25 J/cm3 de la viabilité à long terme et du taux de perméabilisation des cellules. La figure 5 illustre l'optimisation de l'énergie. Par milieu colonisé selon l'invention, on entend tout milieu aqueux domestique, naturel ou industriel pouvant comporter ou comportant des protozoaires, notamment des amibes, et particulièrement des amibes libres, comme des eaux de baignade naturelles ou réchauffées, piscines et bains, des eaux de rejets industriels, des milieux aqueux des circuits de refroidissement ou de chauffage, des milieux aqueux des circuits de ventilation et de climatisation, des eaux potables, et de façon générale tout milieu où des protozoaires et notamment des amibes, et particulièrement des amibes libres sont susceptibles de vivre, survivre ou se multiplier.
Les procédés de l'invention sont mis en oeuvre dans des installations en flux continu, ou en flux séquentiel. En ce qui concerne les impulsions, leur nombre peut varier de 1 à
100 impulsions successives, notamment de 1 à 50, de préférence 1 à 10. Leur durée peut varier de 0,5 μs à 24 ms, notamment 1 μs à 10 ms environ.
Concernant le profil des impulsions, il peut être notamment de type vague carrée, déclins exponentiels, trapèze, sinusoïdal ou bipolaire.
Les impulsions peuvent être délivrées avec une fréquence allant de 1 à 2000 Hz.
Ainsi, on a déterminé des conditions d'application efficaces pour des intensités de l'ordre de 1 ,5 kV/cm à 30 kV/cm, des impulsions de 0,5 μs à 24 ms et un nombre d'impulsions appliquées à la cellule allant de 1 à 100.
De préférence, on applique dix impulsions de 10 ms à 1 ,5 kV/cm, ou encore une impulsion de 10 μs à 11 kV/cm, ou encore une impulsion de 50 μs à 9 kV/cm. Exemple 1
Les expériences ont été réalisées sur des amibes Naegleria lovaniensis Ar9M1. La souche choisie se dénomme Ar-9M1. Cette dernière a été isolée dans les eaux chaudes (45°C) d'une centrale thermique de Floride en 1976 (Stevens et al., 1979). Cette espèce est la plus proche du point de vue phylogénique de l'espèce pathogène : N. fowleri Pernin et al., 1985 montrent que N. lovaniensis et N. fowleri descendent d'un ancêtre commun. Ces deux espèces sont toutes les deux thermophiles et se développent particulièrement bien à une température d'environ 44°C. Par ailleurs, le fait qu'elles aient des profils isoenzymatiques très proches montre qu'elles ont également des caractéristiques physiologiques similaires. Les trophozoïtes de N. lovanensis Ar-9M1 ont une taille de 18,2 μm (8,5-31 ,5) x 10,9 μm (4-21 ). Les kystes ont quant à eux un diamètre de 10,3 μm (7,5-12,5). Les caractéristiques de taille sont proches de celles de N. fowleri. Pour travailler sur la forme végétative, on utilise la culture axénique. Dans ce type de culture les éléments nutritifs ne sont pas apportés par des bactéries mais par un milieu nutritif. La culture est réalisée en condition axénique sur des boîtes de plastique à 37°C en utilisant le milieu de culture de Chang. Le milieu de pulsation est de l'eau de la Garonne, filtrée ayant une conductance de l'ordre de 200 μs/cm. Les générateurs
Les générateurs utilisés dans cette étude (CNRS et Cober 605p) génèrent des impulsions à cinétique en vague carrée de polarité négative. La durée des impulsions est variable entre 5 μs et 24 ms et la fréquence d'application de 0,1 à 10 Hz en pilotage interne et de 2000 Hz en pilotage externe. Le voltage délivré par l'appareil est de 1500 volts maximum (8 A). Le Cober 605P a été utilisé pour délivrer des champs intenses (7 kV/cm < E < 10 kV/cm) en appliquant une seule impulsion de durée < 300 μs. Ce dernier est susceptible de délivrer une tension de sortie de 2 kV(10A).
Le montage expérimental
Il est placé à l'intérieur d'un hotte au flux laminaire afin de travailler dans les conditions de sécurité requises. La viabilité est évaluée à 24 heures après le traitement électrique par la technique de coloration au cristal violet.
La perméabilisation des cellules est quantifiée en cytométrie de flux par l'utilisation d'un marqueur fluorescent naturellement non perméant, l'iodure de propidium.
Batch : la chambre de pulsation C est constituée de deux électrodes à lames planes en acier, maintenues parallèles par des cales isolantes reliées à un électropulsateur (E) et un oscilloscope (O). La distance 2 entre les électrodes est de 0,4 cm ou de 0,25 cm. Sur la figure 1a, la flèche indique le dépôt des cellules.
Flux : le système de pulsation mis au point au laboratoire est constitué de différents éléments : un réservoir 1 de cellules doté notamment d'un dispositif d'agitation 2, une pompe péristaltique 3, une chambre de pulsation 4 reliée à un électropulsateur 5 et un oscilloscope 6 et un système collecteur 7 permettant de récupérer les cellules (cf. figure 1 b).
La pompe péristaltique (pompe, minipuls 3, Gilson) assure une surpression dans le réservoir de cellules, ce qui permet d'entraîner la suspension cellulaire vers la chambre d'électropulsation, sans passage entre les galets de la pompe. Celle-ci est dotée d'un système débimét que qui permet de régler le débit de manière précise. Le débit Q utilisé est basé sur la notion de temps de résidence de façon à ce que chaque cellule qui rentre dans la chambre de pulsation subisse les mêmes conditions électriques. Il est défini par la fréquence (F), le nombre (N) des impulsions et par le volume (V) de la chambre de pulsation par la relation suivante : fréquence (Hz) x 60 x Volume de la chambre (ml) Q(ml/minute) = nombre d'impulsions appliquées
Descriptif des électrodes en écoulement
1 - Champ perpendiculaire à l'écoulement : les électrodes sont constituées par deux lames parallèles en acier séparées par une distance interélectrode de 0,4 cm. Le volume de la chambre de pulsation est de 0,2 ml.
2 - Champ parallèle à l'écoulement : les électrodes utilisées sont des grilles, constituées d'un maillage (80 μm x 100 μm), au travers duquel les cellules transitent. La distance interélectrode est de 0,93 cm et le volume de la chambre de pulsation est de 0,117 ml.
Les électrodes dans les deux systèmes sont connectées à un générateur de haute tension soit CNRS, soit COBER 605P relié à un oscilloscope (Enertec) permettant ainsi de visualiser les paramètres électriques délivrés. Le profil cinétique des impulsions délivrées par le générateur est dit en vague carrée, l'intensité du champ demeurant constante durant toute la durée des impulsions (T). La flexibilité de l'électropulsateur permet de moduler la tension (U), la durée (T), le nombre (N), et la fréquence (F) des impulsions.
Il est possible d'optimiser la méthode tout en minimisant le coût énergétique. Il a été montré que la perte de viabilité n'était pas tant liée à l'énergie apportée au système durant l'électropulsation qu'à la façon dont cette énergie est apportée.
Comme cela est illustré à la figure 2, on peut évaluer l'évolution en parallèle, du niveau de perméabilisation et de la perte de viabilité, en fonction de l'intensité du champ électrique. Les amibes ont été électropulsées à des intensités de champs variables par dix impulsions de 10 ms, délivrées à la fréquence d'1 Hz. La viabilité est évaluée 24 heures après l'électropulsation par la technique de coloration au crystal violet. La perméabilisation est quantifiée en cytométrie de flux, par l'entrée d'un marqueur non perméant fluorescent, l'iodure de propidium.
De plus, comme cela est illustré à la figure 3, on a comparé l'efficacité de destruction des amibes (% de viabilité) par le champ électrique selon la configuration utilisée (batch, champ parallèle en flux, champ perpendiculaire en flux). Les cellules, dans les trois cas, sont électropulsées par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence de 1 Hz. Les deux chambres de pulsation en flux ont des volumes différents, ce qui explique pourquoi les débits utilisés pour avoir les mêmes conditions d'électropulsation sont différents.
Le débit dans le cas où le champ est perpendiculaire à l'écoulement (2-grisé) est de 1 ,2 ml/min alors que celui dans la configuration du champ parallèle à l'écoulement (1-noir) est de 0,71 ml/min. La figure 4 représente l'évolution à énergie constante 25 J/cm3 de la viabilité à long terme (M) et du taux de perméabilisation (D).
On a fait varier l'intensité du champ électrique (E) et la durée cumulée totale de pulsation (T) tout en maintenant la valeur du produit E2xT constante. La durée des impulsions est fixée arbitrairement à 10ms et les impulsions sont délivrées à la fréquence d'IHz. La viabilité est révélée à 24h par la technique de coloration au crystal violet. La perméabilisation (D) est quantifiée en cytométrie de flux, par l'entrée d'un marqueur non perméant fluorescent, l'iodure de propidium. Cinq conditions d'électropulsation sont utilisées :
(1 ) 10 msx1 , E = 3,46 kV/cm
(2) 10 msx2, E = 2,5 kV/cm
(3) 10 msx3, E = 2 kV/cm (4) 10 msx10, E = 1 ,1 kV/cm (5) 10 msx50, E = 0,5 kV/cm
Les amibes sont plus sensibles à l'utilisation d'impulsions de courte durée mais de forte intensité qu'à l'utilisation pendant des temps de pulsation très longs d'impulsions de faible intensité. La destruction des amibes dépend essentiellement de l'intensité du champ électrique appliqué et non de la durée de pulsation effective.
Le tableau suivant représente pour diverses intensités de champ les temps des impulsions nécessaires à obtenir 95% de mortalité et l'énergie associée. Il montre que plus l'intensité du champ est forte, moins l'énergie à apporter au système est importante.
La figure 5 montre les résultats des expérimentations menées pour des champs allant jusqu'à 8,8 kV/cm dans les conditions suivantes :
(1 ) 250 μs, 7 kV/cm
(2) 100 μs, 8 kV/cm
(3) 75 μs, 8,43 kV/cm
(4) 50 μs, 8,8 kV/cm
(5) 0 μs, 0 kV/cm Les amibes sont électropulsées à des intensités de champ électrique variables pour une seule impulsion de faible durée. La viabilité (% de viabilité) est évaluée 24 heures après l'électropulsation par la technique de coloration au crystal violet. Ces paramètres obéissent à la loi suivante E = 5,4 - 2,7 log T avec T en ms et E en kV/cm et T inférieur à 100ms.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de destruction de protozoaires dans un flux aqueux colonisé par des protozoaires, caractérisé en ce qu'un champ électrique puisé est appliqué au flux à une intensité supérieure à 1 kV/cm.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le champ électrique appliqué au flux a une intensité allant de 1 à 30 kV/cm.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électrique appliqué au flux a une intensité allant de 1 ,5 à 15 kV/cm.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le nombre d'impulsions appliquées varie de 1 à 50.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le flux est continu.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le flux est séquentiel.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les pulsations ont un profil de type vague carrée, à déclin exponentiel, sinusoïdal, bipolaire ou trapèze.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les impulsions sont délivrées avec une fréquence de 1 Hz à
2000 Hz.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 8, caractérisé en ce que les impulsions ont une durée de l'ordre de 1 μs à environ 10 ms.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le champ est sensiblement parallèle au flux.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le champ est sensiblement perpendiculaire au flux.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que les protozoaires sont des amibes.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les protozoaires sont des amibes libres.
14. Application du procédé selon les revendications 1 à 11 à l'élimination des protozoaires.
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