EP1157276A1 - Procede d'evaluation de l'intensite de la proteolyse musculaire - Google Patents

Procede d'evaluation de l'intensite de la proteolyse musculaire

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Publication number
EP1157276A1
EP1157276A1 EP00909402A EP00909402A EP1157276A1 EP 1157276 A1 EP1157276 A1 EP 1157276A1 EP 00909402 A EP00909402 A EP 00909402A EP 00909402 A EP00909402 A EP 00909402A EP 1157276 A1 EP1157276 A1 EP 1157276A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cathepsin
mrna
content
proteolysis
probe
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00909402A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marc Ferrara
Christiane Deval
Daniel Bechet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1157276A1 publication Critical patent/EP1157276A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the intensity of muscle proteolysis as well as an agent for evaluating the intensity of muscle proteolysis.
  • DD-RT-PCR Differential Display - Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction
  • the principle of this technique is based on the combinatorial amplification of DNA fragments from all of the messenger RNAs, hereinafter called mRNAs, present in the muscle tissue of rats of the model described above, that is ie rats in a situation of sepsis, and control rats, not in a situation of proteolysis.
  • the mRNAs, isolated from these tissues, are subjected to the action of reverse transcriptase in the presence of a primer anchored in 3 'to the poly A tail of the mRNAs.
  • an amplification step is carried out by PCR in the presence of a decamer playing the role of primer in 5 '.
  • the amplification of the fragments representing all of the messengers is obtained by the successive use of several decamer-3 'primer combinations.
  • the amplification step is then carried out in the presence of a dNTP labeled with 33 P.
  • the DNA fragments thus obtained are separated according to their size by electrophoresis on polyacrylamide gel.
  • the gels are then revealed in conventional autoradiography. The bands of the gels obtained using the DNA of rats in a situation of sepsis are compared with the bands of the gels obtained using the DNA of the control rats.
  • differential fragments that is to say the bands present only on the gel obtained using the DNA of rats in a situation of sepsis, are then removed, re-amplified, cloned, then sequenced. This sequence is then compared with all of the nucleotide sequences present in DNA libraries.
  • the differential fragment can be identical to a known DNA sequence.
  • FIG. 1 represents the gel obtained after electrophoresis of DNA from control rats and from rats with sepsis, a differential fragment present only in the DNA samples from rats with sepsis is visible.
  • the Applicant has determined the content of cathepsin L mRNA in muscle in proteolytic situation induced by other causes than bacterial infection.
  • Cathepsin L mRNA is specific to muscle tissue, since it has been observed in two types of sampled muscles, Gastrocnemius and
  • Tibialis While it is absent in the liver of animals from which muscles have been removed.
  • cathepsin L should be understood to mean the zymogenic form, also called M.E.P. (Major Excreted
  • Protein and the active form of this protein.
  • the Applicant based on these variations in the content of cathepsin L and / or its mRNA, has thus unexpectedly isolated an indicator of the intensity of muscle proteolysis.
  • the present invention therefore relates to a method for evaluating muscular proteolysis, essentially characterized in that it consists in determining the content of cathepsin L and / or its mRNA of a muscular or blood sample from the human body or animal. Any conventionally used analyzes making it possible to determine the content of a protein qualitatively and / or quantitatively can be used in the context of the present invention.
  • the content of cathepsin L can be determined, for example, using an antibody directed against all or part of the structure of cathepsin L, a zymogenic or active form of this protein.
  • This antibody can itself be labeled, that is to say for example coupled to a labeling enzyme (direct immunological analysis).
  • Anti-cathepsin L antibody / cathepsin L can also be revealed by a second labeled antibody directed against the anti-cathepsin L antibody (indirect immunoassay).
  • Analyzes using such antibodies are, for example, those known to those skilled in the art called "Western-blot", "ELIS A” or “Histo-Immuno”.
  • the semi-quantitative Western-blot technique consists essentially in migrating the proteins from a muscle or blood sample onto a gel, transferring them to a nylon membrane, then putting the gel in the presence of monoclonal anti-cathepsin antibodies. L, to reveal these Antibody-cathepsin L pairs by labeled antibodies, and finally to read the gel thus obtained.
  • the ELISA technique which is more suitable for quantitative determination, consists first of all in establishing a standard range using known concentrations of cathepsin L and defining the corresponding optical values, then in measuring the optical value of the sample and to determine, using the standard range, the concentration of cathepsin L, in a precise manner.
  • the Histo-Immuno technique more suitable for qualitative determination, consists of performing a direct or indirect immunological analysis on the muscle tissue. By comparing the intensity of labeling of cathepsin L with the intensity of labeling of a reference protein, the content of cathepsin L and thus the presence of proteolysis can also be determined.
  • the concentration of the reference protein is relatively close to that of cathepsin L, and its concentration does not vary according to proteolysis, two relatively similar markings will be observed in the absence of proteolysis, while a much more pronounced labeling, corresponding to cathepsin L, will be observed in the presence of proteolysis.
  • Such reference proteins are in particular proteins
  • Reference proteins can also be chosen from proteins of the contractile structure. These contractile structure proteins include actin and myosins.
  • a reference protein may also be a protein whose content decreases during proteolysis; thus allowing an even higher amplitude of variation to be obtained.
  • An example of such a protein is GAPDH.
  • any technique conventionally used for a qualitative or quantitative determination of mRNA can be used.
  • the mRNA content of cathepsin L can in particular be determined by hybridizing the mRNA of the muscular or blood sample from the human or animal body with a labeled probe complementary to this mRNA.
  • Such techniques are, for example, techniques called
  • probes can also be specific to the species for which proteolysis is evaluated.
  • the preferred probe is the probe of sequence No. 1 corresponding to the oligonucleotide starting at the 141st nucleotide and ending at 1161st nucleotide in the cDNA sequence of the human cathepsin L gene.
  • FIG. 2 relates to the cDNA sequence of the human cathepsin L gene. Also shown on this sequence are the probe of sequence No. 1 and the primers in 5 ′ and 3 ′ used to amplify this sequence No. 1 by PCR.
  • the so-called Northern technique is preferably used.
  • the technique called competitive RT-PCR it is preferred to use the technique called competitive RT-PCR.
  • Another object of the present invention is to determine the mRNA content of cathepsin L, and further to determine the content of
  • MRNA of a reference protein whose mRNA content is independent of proteolysis or whose mRNA content decreases with the proteolysis, and then compare the results obtained.
  • the comparison of the two signals reflecting the mRNA content will thus make it possible to compare proteolysis.
  • muscle proteolysis is preferentially evaluated by comparing the content of
  • the present invention also relates to an agent for evaluating muscle proteolysis essentially characterized in that it comprises at least one means making it possible to determine the content of cathepsin L and / or of its mRNA from a muscle or blood sample from the human or animal body.
  • L can in particular comprise antibodies directed specifically against all or part of the structure of cathepsin L. These antibodies can be labeled in the case of direct immunological analyzes or the means can comprise other antibodies labeled anti (Antibodies anti -cathepsin L) in the case of indirect immunological analyzes.
  • the means for determining the mRNA content of cathepsin L comprises, inter alia, a probe complementary to said
  • This means can also comprise a solid support, such as a nylon membrane, a glass or silicon plate, on which is fixed the complementary probe of the mRNA of cathepsin L.
  • this means may in particular include the probe described in FIG. 2.
  • Another object of the present invention consists of an agent for evaluating muscle proteolysis containing a first means making it possible to determine the content of cathepsin L and / or its mRNA, and furthermore a second means making it possible to determine the content of a reference protein and / or its mRNA present in the sample and whose content is independent of proteolysis or whose content decreases with proteolysis.
  • These means can for example be solid supports such as those described above, on which is fixed the complementary sequence of the mRNA.
  • the content of cathepsin L, zymogenic ("Pro") and active (“Active”) form was determined by western-blot analysis.
  • the separated proteins are electrotransfered onto a polyvinylidene difluoride membrane in a 48 mM-30 mM glycine buffer pH 8.3 containing 20% (V N) of methanol.
  • the blots are saturated for 1 hour with a phosphate buffer containing 0.2% (W / V) of skimmed milk and 0.1% of newt X-100.
  • Cathepsin L is revealed by chemiluminescence using the Aurora kit (IC ⁇ ).
  • the primary polyclonal antibody used is a rabbit IgG specific for cathepsin L (gift from Mr. M. GOTTESMA ⁇ , Bethesda, USA).
  • the secondary antibody is an anti-rabbit IgG obtained in goats and conjugated with alkaline phosphatase.
  • the signals are revealed by the STORM 484 and analyzed with the ImageQuant software (Molecular Dynamics).
  • the content of cathepsin L prozymogenic or active form corresponds to 2 to 4.5 times the content of cathepsin L of the muscles of control animals.
  • the Gastrocnemius and Tibialis muscles of control (T) and infected (S) rats by an injection of E. coli were collected 6 days after infection.
  • RNAs of these Gastrocnemius and Tibialis muscles are extracted according to the technique of Chomczynski and Sacchi (1987. Anal Biochem. 162,
  • the Cathepsin L mRNA content is then determined by a Northern-Blot analysis. After migration under denaturing conditions on 1% agarose gel, 10 to
  • RNAs are transferred onto nylon membranes (Hybond N + - Amersham).
  • the probes used in hybridization are marked with the "ready to go DNA labeling" kit (Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions.
  • Hybridizations are carried out at 65 ° C. for 16 to 20 h in the "Rapid-Hyb Buffer” buffer (Amersham Life Science).
  • the membranes are washed successively with the SSC 2X-SDS 0.1%, SSC 0.5X-SDS 0.1% and SSC 0.1X-SDS 0.1% buffers for 20 min at 65 ° C. They are then placed on a "Phosphor Screen” and the signals are revealed and quantified using the PhospoFluroImager STORM 484 (Molecular Dynamics).
  • the ratio of the slopes of the 2 lines in this figure represents the ratio of the Cathepsin L mRNA contents.
  • the reference protein used is GAPDH. It has been found that the content of GADPH mRNA decreases slightly during muscle proteolysis. Gastrocnemius (Ga.) And Tibialis (Ti.) Muscles of control rats (T) and infected rats (S) by injection of E. Coli are collected
  • RNA from each of the targets namely Cathepsin L and GAPDH
  • 5 to 25 ⁇ g of total RNA extracted from the muscles of control and infected animals are denatured by treatment at 70 ° C. for 10 min in a volume of 14 ⁇ l in the presence of 2 ⁇ l of oligonucleotide dT25.
  • the synthesis of the first complementary strands of the messenger RNAs is carried out using the Super-Script II kit (BRL) in the following reaction mixture:
  • the RNAs are degraded by a treatment with sodium hydroxide and the synthesized cDNAs are purified on a column of sephadex G50.
  • the membranes are then prehybridized for 24 h at 68 ° C and then hybridized at the same temperature for 60 h. After washing and exposure of the membranes on PhoporScreen, the signals are revealed (STORM Molecular Dynamics) and quantified using the ImageQuant software (Molecular Dynamics). The ratio of cathepsin L and GADPH mRNAs is then calculated.
  • Cathepsin L / GADPH mRNA ratio makes it possible to assess muscle proteolysis with certainty.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire essentiellement caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal et un agent d'évaluation de la protéolyse musculaire pour la mise en oeuvre de ce procédé.

Description

Procédé d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire.
La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire ainsi qu'un agent d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire.
Chez l'homme et les mammifères, l'importance des processus de protéolyse intracellulaire transparaît dans la multiplicité des secteurs où il est impliqué. A travers le renouvellement protéique, les activités protéolytiques conditionnent l'accrétion des protéines déterminant ainsi, au même titre que la synthèse protéique, l'intensité de la croissance. Ces activités interviennent aussi dans les phénomènes de prolifération et de transformation cellulaires et dans plusieurs affections. Certaines situations de stress (sepsis, polytraumatismes, brûlures étendues, SIDA, présence de tumeurs, ...) s'accompagnent d'une fonte protéique musculaire, première manifestation visible d'une activation de l'ensemble des systèmes intracellulaires de protéolyse. Les pertes d'azote urinaire de l'ordre de 10 à 25 g/j chez les patients traumatisés peuvent être doublées en cas d'infection, ce qui correspond à la perte quotidienne de 300 à 600 g de muscle. H est donc apparu opportun de pouvoir évaluer la protéolyse musculaire à un stade précoce, avant de constater une perte musculaire importante.
De plus, pour des raisons pratiques, un procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire devra être d'une mise en oeuvre facile et permettre d'obtenir des résultats rapidement. Ces résultats devront être quantitatifs et/ou qualitatifs.
Après de longues recherches qui vont être décrites ci-après, la demanderesse a mis au point un nouveau procédé permettant d'évaluer la protéolyse musculaire, remplissant les conditions pratiques énoncées ci- dessus, tout comme un agent d'évaluation de la protéolyse permettant de mettre en oeuvre ce nouveau procédé.
Dans un premier temps, la demanderesse a cherché à inventorier les gènes dont le niveau d'expression était modifié de manière appréciable lors d'une induction de la protéolyse musculaire. Parmi les modèles d'induction de la protéolyse musculaire, l'injection unique de bactéries vivantes, E. coli, chez des rats, permet de maintenir ces animaux dans une situation catabolique durant plusieurs jours et reproduit ainsi les modifications métaboliques les plus proches de celles observées chez l'homme. Cette situation catabolique est dans la suite du texte dénommée "sepsis".
Pour mettre en évidence les gènes surexprimés lors de la protéolyse musculaire, la demanderesse a utilisé la méthode dite "DD-RT- PCR" (Differential Display - Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Le principe de cette technique est basé sur l'amplification combinatoire de fragments d'ADN à partir de la totalité des ARN messagers, ci-après appelés ARNm, présents dans le tissu musculaire de rats du modèle ci-dessus décrit, c'est-à-dire de rats en situation de sepsis, et des rats témoins, n'étant pas en situation de protéolyse. Les ARNm, isolés de ces tissus, sont soumis à l'action de la reverse transcriptase en présence d'une amorce ancrée en 3' sur la queue poly A des ARNm. Puis, une étape d'amplification est réalisée par PCR en présence d'un décamère jouant le rôle d'amorce en 5'. L'amplification des fragments représentant la totalité des messagers est obtenue par l'emploi successif de plusieurs combinaisons décamères-amorces 3'. L'étape d'amplification est ensuite réalisée en présence d'un dNTP marqué au 33P. Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les gels sont alors révélés en autoradiographie classique. Les bandes des gels obtenus en utilisant l'ADN des rats en situation de sepsis sont comparées aux bandes des gels obtenus en utilisant l'ADN des rats témoins. Les fragments différentiels, c'est-à-dire les bandes présentes uniquement sur le gel obtenu en utilisant l'ADN des rats en situation de sepsis, sont ensuite prélevés, réamplifiés, clones, puis séquences. Cette séquence est alors comparée à l'ensemble des séquences nucléotidiques présentes dans des banques d'ADN. Ainsi, le fragment différentiel peut être identique à une séquence d'ADN connue. En procédant de cette manière, la demanderesse a, de façon surprenante, identifié un fragment différentiel.
La figure 1 représente le gel obtenu après électrophorèse d'ADN de rats témoins et de rats en situation de sepsis, un fragment différentiel présent uniquement dans les échantillons d'ADN de rats en situation de sepsis est visible.
Ce fragment de 256 nucléotides, après avoir été séquence, a été comparé à 325 789 séquences présentes dans une banque de données d'ADN. D'une façon inattendue, il a été constaté qu'il correspond au messager codant pour la cathepsine L. Cette dernière est une cystéine protéinase du lysosome.
Le caractère différentiel de ce fragment a été confirmé par une analyse par protection aux RNases et par une analyse en Northern-blot. Ces expériences ont permis de démontrer que la teneur en ARNm de la cathepsine L était entre 15 à 20 fois supérieure chez les rats en situation de "sepsis", par rapport à la teneur en ARNm de la cathepsine L chez des rats témoins.
Afin de s'assurer que cette augmentation du taux en ARNm de la cathepsine L observée chez les rats en situation de sepsis n'est pas une réponse spécifique à l'infection bactérienne, la demanderesse a déterminé la teneur en ARNm de la cathepsine L dans le muscle en situation protéolytique induite par d'autres causes que l'infection bactérienne.
Il a été constaté que chez le rat porteur du sarcome de Yoshida (tumeur), la teneur en ARNm de la cathepsine L est fortement augmentée.
Lors de traitements par des inhibiteurs de la protéolyse musculaire tels que la pentoxyfilline et Hw 448, il a été constaté que la teneur en ARNm de la cathepsine L diminue notablement.
Une importante augmentation de la teneur en ARNm de la cathepsine L de muscles provenant de rats traités à la dexaméthasone, hormone induisant une protéolyse musculaire, par rapport à des rats témoins non traités, a aussi été constatée.
Il a également été observé que la différence de la teneur en
ARNm de la cathepsine L est spécifique du tissu musculaire, puisqu'elle a été observée dans deux types de muscles prélevés, Gastrocnemius et
Tibialis, alors qu'elle est absente dans le foie des animaux chez lesquels les muscles ont été prélevés.
La demanderesse a également étudié la corrélation entre le niveau d'ARNm et la quantité de protéine présente dans le muscle. Dans le cadre de la présente invention, il faut entendre par cathepsine L, la forme zymogène, aussi appelée M.E.P. (Major Excreted
Protein) et la forme active de cette protéine.
Pour ce faire, la demanderesse a effectué une analyse en
Western-blot qui a permis de constater que la teneur en forme zymogène et active de la cathepsine L augmentait chez des rats en situation de "sepsis" dans des proportions de 2 à 5 fois par rapport à leur teneur chez des rats témoins non infectés.
La demanderesse, en se basant sur ces variations de teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm, a ainsi isolé, de manière inattendue, un indicateur de l'intensité de la protéolyse musculaire.
La présente invention est donc relative à un procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire, essentiellement caractérisé par le fait qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. Toutes analyses classiquement utilisées permettant de déterminer la teneur d'une protéine qualitativement et/ou quantitativement, peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention.
La teneur en cathepsine L peut être déterminée, par exemple, en utilisant un anticorps dirigé contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L, forme zymogène ou active de cette protéine. Cet anticorps peut lui-même être marqué, c'est-à-dire par exemple couplé à un enzyme de marquage (analyse immunologique directe). Le couple
Anticorps anti-cathepsine L/cathepsine L peut aussi être révélé par un deuxième anticorps marqué dirigé contre l'anticorps anti-cathepsine L (analyse immunologique indirecte).
Des analyses mettant en oeuvre de tels anticorps sont, par exemple, celles connues de l'homme du métier appelées "Western-blot", "ELIS A" ou "Histo-Immuno". La technique semi-quantitative du Western-blot consiste essentiellement à faire migrer les protéines d'un prélèvement musculaire ou sanguin sur un gel, à les transférer sur une membrane de nylon, puis à mettre le gel en présence d'anticorps monoclonaux anti-cathepsine L, à révéler ces couples Anticorps-cathepsine L par des anticorps marqués, et finalement à lire le gel ainsi obtenu.
La technique ELISA, plus appropriée pour une détermination quantitative, consiste, dans un premier temps, à établir une gamme étalon en utilisant des concentrations connues de cathepsine L et en définissant les valeurs optiques correspondantes, puis à mesurer la valeur optique de l'échantillon et à déterminer, à l'aide de la gamme étalon, la concentration de cathepsine L, de façon précise.
La technique Histo-Immuno, plus appropriée pour une détermination qualitative, consiste à effectuer une analyse immunologique directe ou indirecte sur le tissu musculaire. En comparant l'intensité du marquage de la cathepsine L à l'intensité du marquage d'une protéine de référence, la teneur en cathepsine L et ainsi la présence de protéolyse, pourra aussi être déterminée.
Par exemple, si la concentration de la protéine de référence est relativement proche de celle de la cathepsine L,et que sa concentration ne varie pas en fonction de la protéolyse, deux marquages relativement similaires seront observés en l'absence de protéolyse, tandis qu'un marquage bien plus prononcé, correspondant à la cathepsine L, sera observé en présence de protéolyse. De telles protéines de référence sont notamment des protéines
"de ménage" participant au métabolisme cellulaire basai. Des protéines de références peuvent aussi être choisies parmi les protéines de la structure contractile. Ces protéines de la structure contractile sont notamment l'actine et les myosines. Une protéine de référence pourra aussi être une protéine dont la teneur diminue lors de la protéolyse; permettant ainsi d'obtenir une amplitude de variation encore plus élevée. Un exemple d'une telle protéine est la GAPDH.
Dans le cadre de la présente invention, toute technique classiquement utilisée pour une détermination qualitative ou quantitative d'ARNm, peut être utilisée.
La teneur en ARNm de la cathepsine L pourra notamment être déterminée en hybridant l'ARNm du prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal avec une sonde marquée complémentaire de cet ARNm.
De telles techniques sont, par exemple, les techniques appelées
Dot-blot, Slot-blot, Northern-blot, RPA, cinétique RT-PCR, RT-PCR compétitive, mini et micro Array, Chips. Ces techniques sont connues de l'homme du métier. Ces techniques nécessitent toutes l'utilisation d'une sonde spécifique à l'ARNm de la cathepsine L. Cette sonde peut être un segment ou toute séquence complémentaire de l'ARNm de la cathepsine L.
Ces sondes peuvent aussi être spécifiques de l'espèce pour laquelle la protéolyse est évaluée. Chez l'homme, la sonde préférée est la sonde de séquence n°l correspondant à l'oligonucléotide débutant au 141ème nucléotide et se terminant au 1 161ème nucléotide de la séquence de l'ADNc du gène de la cathepsine L humaine.
La figure 2 a pour objet la séquence d'ADNc du gène de la cathepsine L humaine. Sur cette séquence, sont aussi représentées la sonde de séquence n° 1 et les amorces en 5' et 3' utilisées pour amplifier par PCR cette séquence n° 1.
Pour une analyse qualitative, la technique dite Northern est préférentiellement utilisée. Pour une analyse quantitative, on préfère utiliser la technique appelée RT-PCR compétitive.
Un autre objet de la présente invention consiste à déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L, et en outre, à déterminer la teneur en
ARNm d'une protéine de référence dont la teneur en ARNm est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur en ARNm diminue avec la protéolyse, puis à comparer les résultats obtenus. La comparaison des deux signaux reflétant la teneur en ARNm, permettra ainsi d'évaluer comparativement la protéolyse.
Dans le cadre de la présente invention, on évalue préférentiellement la protéolyse musculaire en comparant la teneur en
ARN messager de la cathepsine L à la teneur en ARNm d'une protéine de référence.
La présente invention a encore comme objet un agent d'évaluation de la protéolyse musculaire essentiellement caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal.
Ce moyen permet la mise en oeuvre des procédés ci-dessus décrits. Ainsi, le moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine
L peut notamment comprendre des anticorps dirigés spécifiquement contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L. Ces anticorps peuvent être marqués dans le cas d'analyses immunologiques directes ou le moyen peut comprendre d'autres anticorps marqués anti- (Anticorps anti-cathepsine L) dans le cas d'analyses immunologiques indirectes.
Le moyen permettant de déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L comprend, entre autres, une sonde complémentaire dudit
ARNm. Ce moyen peut aussi comprendre un support solide, tel qu'une membrane en nylon, une plaque de verre ou de silicium, sur lequel est fixée la sonde complémentaire de l'ARNm de la cathepsine L.
Pour l'évaluation de la protéolyse chez l'homme, ce moyen pourra notamment comprendre la sonde décrite à la figure 2.
Ce moyen peut également comprendre des composés nécessaires au marquage des ARN à tester. Les marqueurs utilisés de façon préférentielle ne sont pas radioactifs et peuvent être lus par fluorescence. Un autre objet de la présente invention consiste en un agent d'évaluation de la protéolyse musculaire contenant un premier moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm, et en outre un deuxième moyen permettant de déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse.
Ces moyens peuvent par exemple être des supports solides tels que ceux décrits précédemment, sur lesquels est fixée la séquence complémentaire de l'ARNm.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer la présente invention, sans pour autant présenter un caractère limitatif.
Exemple 1
Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la quantité de protéine Cathepsine L
La teneur en cathepsine L, forme zymogène ("Pro") et active ("Active") a été déterminée par une analyse en western-blot. Les muscles Gastrocnemius de rats témoins (PF) et infectés (S) par une injection d'E. Coli, ont été prélevés 2 et 6 jours après infection. 200 mg de muscle sont homogénéisés dans un tampon 20mM phosphate pH 6,25, 0,l% triton. L'homogénat est centrifugé à 15000 g durant 15 min a 4°C. Le surnageant est dilué avec un volume identique de tampon SDS-PAGE (Laemmly). Des échantillons (20μg de protéines totales) sont soumis à une électrophorèse en présence de SDS sur un gel de polyacrylamide- 12,5%. Les protéines séparées sont électrotransférées sur une membrane de polyvinylidène difluoride dans un tampon tris 48mM-Glycine 30mM pH 8,3 contenant 20% (V N) de méthanol. Les blots sont saturés durant 1 h par un tampon phosphate contenant 0,2% (W/V) de lait écrémé et 0, 1 % de triton X-100. La cathepsine L est révélée par chimioluminescence en utilisant le kit Aurora (ICΝ). L'anticorps polyclonal primaire utilisé est un IgG de lapin spécifique de la cathepsine L (don de Mr. M. GOTTESMAΝ, Bethesda, USA). L'anticorps secondaire est un anti-IgG de lapin obtenu chez la chèvre et conjugué à la phosphatase alcaline. Les signaux sont révélés par le STORM 484 et analysés avec le logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics).
Les résultats obtenus sont les suivants Les valeurs sont exprimées en Unités Arbitraires Molecular Dynamics. - Moyenne (écart-type)-n=3
Ainsi, il a été constaté que la teneur en cathepsine L forme prozymogène ou active correspond à 2 à 4,5 fois la teneur en cathepsine L des muscles d'animaux témoins.
Exemple 2
Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la teneur en ARNm cathepsine L
Les muscles Gastrocnemius et Tibialis de rats témoins (T) et infectés (S) par une injection d'E. coli ont été prélevés 6 jours après infection.
Les ARNs totaux de ces muscles Gastrocnemius et Tibialis sont extraits selon la technique de Chomczynski et Sacchi (1987. Anal Biochem. 162,
156-159 : Single step method ofRNA isolation by uanidium thiocyanate- phenol-chlorofor e extraction).
On procède ensuite à la détermination de la teneur en ARNm Cathepsine L par une analyse en Northern-Blot. Après migration en conditions dénaturantes sur gel d'agarose 1 %, 10 à
30μg d'ARNs sont transférés sur membranes de nylon (Hybond N+ - Amersham). Les sondes utilisées en hybridation sont marquées avec le kit "ready to go DNA labelling" (Pharmacia Biotech) selon les instructions du fabricant. Les hybridations sont réalisées à 65° C durant 16 à 20 h dans le tampon "Rapid-Hyb Buffer" (Amersham Life Science). Les membranes sont lavées successivement avec les tampons SSC 2X-SDS 0,1%, SSC 0.5X-SDS 0,1 % et SSC 0,1X-SDS 0,1 % durant 20 min à 65°C. Elles sont ensuite placées sur un écran "Phosphor Screen" et les signaux sont révélés et quantifiés à l'aide du PhospoFluroImager STORM 484 (Molecular Dynamics).
Les résultats obtenus sont repris dans la figure 3.
Le rapport des pentes des 2 droites de cette figure représente le rapport des teneurs en ARNm Cathepsine L.
On constate qu'il y a 8,7 fois (1,649/0, 189) plus de messager Cathepsine L dans le muscle de l'animal infecté(S) que dans celui de l'animal témoin (T). Exemple 3
Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la variation relative d'un ARN messager Cathepsine L par rapport à celui d'une protéine de référence
La protéine de référence utilisée est la GAPDH. Il a été constaté que la teneur en ARNm de GADPH, diminue faiblement lors de la protéolyse musculaire. Des muscles Gastrocnemius (Ga.) et Tibialis (Ti.) de rats témoins (T) et de rats infectés (S) par une injection d'E. Coli sont prélevés
2 (J2) et 6 jours (J6) après l'infection.
On dispose 50 ng d'ADN de chacune des cibles, à savoir la Cathepsine L et la GAPDH, en dot sur une membrane de nylon Hybond N+ (Amersham). On dénature 5 à 25 μg d'ARNs totaux extraits des muscles d'animaux témoins et infectés, par un traitement à 70°C pendant 10 min dans un volume de 14 μl en présence de 2 μl d'oligonucléotide dT25. La synthèse des premiers brins complémentaires des ARN messagers est effectuée à l'aide du kit Super-Script II (BRL) dans le mélange réactionnel suivant:
- RNAsin 40 u lμl
- Tampon 5X 6μl - DTT 0,1 M 2μl
- dATp, dGTP, dTTP 20 mM 1 μl - dCTP 120 μM lμl
- dCTP 32P 50μCi 5μl
- Enzyme SuperScript lμl
Après 1 heure à 42°C, lμl de superScript est rajouté au mélange et la réaction est poursuivie durant lh à la même température.
En fin de réaction, les ARNs sont dégradés par un traitement à la soude et les ADNc synthétisés sont purifiés sur colonne de sephadex G50. Les membranes sont ensuite prehybridées durant 24h à 68 °C puis hybridees à la même température pendant 60 h. Après lavages et exposition des membranes sur PhoporScreen, les signaux sont révélés (STORM Molecular Dynamics) et quantifiés à l'aide du logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). Le rapport des ARNm de cathepsine L et de GADPH est ensuite calculé.
Les résultats suivants ont été obtenus:
Les amplitudes de variation observées sont très importantes.
Ainsi, le rapport ARNm Cathepsine L/ GADPH permet d'évaluer de manière certaine la protéolyse musculaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé par le fait qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en cathepsine L est déterminée en utilisant un anticorps dirigé contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en ARNm de la cathepsine L est déterminée en hybridant ledit ARNm avec une sonde marquée complémentaire dudit ARNm.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la sonde complémentaire dudit ARNm correspond à la sonde de séquence n° l .
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il consiste en outre à déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur respective est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse, puis à comparer les teneurs ainsi déterminées.
6. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal.
7. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L comprend des anticorps dirigés contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L.
8. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen permettant de déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L comprend une sonde marquée complémentaire dudit ARNm.
9. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé en ce que la sonde complémentaire dudit ARNm correspond à la sonde de séquence n° 1.
10. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il contient en outre un deuxième moyen permettant de déterminer la teneur d'une protéine de référence et ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur respective est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse.
REVENDICATIONS MODIFIEES
[reçues par le Bureau international le 19 Juin 2000 (19.06.00); revendications 1-10 remplacées par les revendications 1-5 modifiées (1 page)]
1. Procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé par le fait qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en cathepsine L est déterminée en utilisant un anticorps dirigé contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en ARNm de la cathepsine L est déterminée en hybridant ledit ARNm avec une sonde marquée complémentaire dudit ARNm.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la sonde complémentaire dudit ARNm correspond à la sonde de séquence n°l.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il consiste en outre à déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur respective est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse, puis à comparer les teneurs ainsi déterminées.
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WO1992019756A1 (fr) * 1991-05-02 1992-11-12 Idemitsu Kosan Company Limited Anticorps monoclonal specifique de la cathepsine l, hybridome produisant cet anticorps et procede d'utilisation de cet anticorps

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