EP1144634A2 - Novel complex-forming proteins - Google Patents

Novel complex-forming proteins

Info

Publication number
EP1144634A2
EP1144634A2 EP00906186A EP00906186A EP1144634A2 EP 1144634 A2 EP1144634 A2 EP 1144634A2 EP 00906186 A EP00906186 A EP 00906186A EP 00906186 A EP00906186 A EP 00906186A EP 1144634 A2 EP1144634 A2 EP 1144634A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
component
proteins
jun
protein
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00906186A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Valerie Jerome
Hans-Harald Sedlacek
Rolf Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Publication of EP1144634A2 publication Critical patent/EP1144634A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Definitions

  • these proteins can be assigned to the following groups:
  • the mutations in the binding domains of the same or different proteins therefore have the purpose of preventing the ability to complex between an unmutated monomer and a mutant monomer of a pair of identical or different proteins or peptides that would complex in the unmutated state.
  • the mutations give such a pair of mutant proteins the ability to bind to one another with high specificity.
  • the mutations thus occur in pairs, one mutation being present in component b) and the other in component c) in such a way that a molecular interaction between the respective amino acids of such a pair is possible.
  • Such cells can be used to produce the protein according to the invention or can be administered to an organism itself for the purpose of prophylaxis or therapy.
  • Such nucleic acid constructs, inserted into a vector can, however, also be administered directly to an organism for the purpose of prophylaxis or therapy.
  • VZV varicella zoster virus
  • HHV-6 Herpes virus 6
  • the ligands include antibodies or antibody fragments directed against the virus antigens expressed on the cell membrane of virus-infected cells.
  • Retinoids e.g. "Retinoic acid” in acute promyelocytic leukemia.
  • cytostatic or cytotoxic antibodies include those directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)). In particular, these include antibodies against the VEGF receptors.
  • MCP-2 - RANTES
  • Effectors Enzymes for the activation of precursors of cytostatics, for example for enzymes which cleave inactive pre-substances (prodrugs) into active cytostatics (drugs).
  • Oxidase in particular human lysyloxidase or human acidic D-aminooxidase
  • NGF Nerve growth factor
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • Target structures proteins of the blood coagulation system such as
  • a component a) When used as a multifunctional ligand, a component a) must be selected which is directed against a cellular target structure. Examples of ligands (component a) specific for cellular target structures have already been listed in section 3).
  • the effector (component d) should be selected so that it binds to a viral vector or to a non-viral vector.
  • Such effectors are for example:
  • the murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Antibody fragments and recombinant Fv fragments are produced in accordance with the prior art and as already described.
  • These carriers include cationic polymers, peptides, proteins, polyamines or cationic lipids such as cationic lipids and phospholipids. Examples of antibodies against such carriers are
  • component d) is the receptor for the coat protein of the virus harboring the transgene.
  • viruses also have glycoproteins which are responsible both for virus attachment and subsequently for cell membrane fusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
  • the invention further relates to multifunctional protein complexes which have a peptide sequence between component a) and b) or between component c) and d) which is cleavable for proteases.
  • the effector can be split off from the ligand (component a) or from the ligand and the mutated proteins [components a), b) and c)] and, for example, develop its effect in free form at the site of the enrichment of the multivalent protein complexes.
  • NLS nuclear localization signal
  • the cyclin A promoter regulates cell cycle-specific the transcription of the combined cDNAs for the activation domain of VP16 and the mutant leucine zipper of c-jun (activation subunit A) (FIG. 3)
  • the tyrosinase promoter restricts the transcription of the combined cDNAs for the Gal4 binding domain, the NLS of SV40 and the mutant leucine zipper of c-fos to melanoma cells (activation subunit B) (FIG. 3).
  • the individual components of the construct are linked and inserted into a plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (FIG. 6) via suitable restriction sites which are carried out at the termini of the various elements via PCR amplification.
  • the linkage takes place with the aid of enzymes and DNA ligases which are known to the person skilled in the art and are specific for the restriction sites. These enzymes are commercially available.
  • Lung carcinoma xenografts were introduced into nude mice by subcutaneous injection of 2.10 7 H322 cells (H3 22, bronchoalveolar carcinomas, human ATCC No. CRL 5806).
  • Plasmid combination When the xenografts reached a size of 4 mm, they were co-injected intratumorally with the following plasmid combination in a carrier solution of 5% glucose, 0.01% Triton X100. Plasmid combination:
  • the pRL-SV40 vector was used as an internal control to standardize the results of the various xenografts.
  • MeWo (human melanoma) and H322 (bronchoalveolar lung carcinoma) cell lines were transfected with Lipofectin (Gibco BRL Inc.) and DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.) as described by the manufacturer.
  • the cells were co-transfected with the following plasmids: pCDNA3 (Invitrogen Inc .; control): 1 ng CMV-luc + 1 ⁇ g Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 ⁇ g pCDNA3
  • CMV-bax (Bax cDNA, cloned in pCDNA3): 1 ng CMV-luc + 1 ⁇ g Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 ⁇ g CMV-bax
  • the luciferase values measured in the case of cotransfection with pCDNA3 and pBax (control plasmids which do not express Bax cDNA) were assumed to be 100% survival of the transfected cells.
  • the cells were collected 48 h after the transfection and the luciferase activity was measured.
  • the percentage of surviving transfected cells decreased in both cell types, to 9-10% for MeWo cells and to 32-36% for H322 cells.
  • the Tyr-m-fos-CycA-VP16, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun and the 10 x BS Gal4-SV40-luc transcription cassettes were determined by bacterial recombination as described by He et al. (1998), cloned in a human E1 / E3-deleted adenovirus (serotype 5).
  • the MeWo and H322 cells were either with for 6 hours

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

The invention relates to a complex comprised of unnaturally occurring, specifically complex-forming proteins containing the following components: a) at least one ligand which is specific for a target structure; b) at least one protein containing a mutated dimerization domain, whereby the mutated dimerization domain has been derived by mutating a naturally occurring dimerization domain, said mutated dimerization domain being able to specifically interact with component c), and component b) is covalently bound to component a); c) at least one protein containing a mutated dimerization domain, whereby the mutated dimerization domain has been derived by mutating a naturally occurring dimerization domain, said mutated dimerization domain being able to specifically interact with component b), and component c) is covalently bound to component d), and; d) at least one effector. The invention also relates to the utilization and production of these complexes as well as to nucleic acid constructs which code for said proteins and to the use thereof.

Description

Neue komplexbildende ProteineNew complex-forming proteins
1. Einleitung1 Introduction
Komplexverbindungen zwischen Proteinen sind in der Natur weit verbreitet.Complex connections between proteins are widespread in nature.
Grundsätzlich können diese Proteine folgenden Gruppen zugeordnet werden:Basically, these proteins can be assigned to the following groups:
- Antikörper, welche mit ihrer Antigenbindestelle spezifisch an das korrespondierende Epitop eines Antigens (welches auch ein anderer Antikörper sein kann) binden können- Antibodies which can bind specifically to the corresponding epitope of an antigen (which can also be another antibody) with their antigen binding site
- Proteinkomplexe, wie sie beispielsweise bei der Aktivierung des Gerinnungssystems oder des Komplementsystems vorkommen- Protein complexes, such as those that occur when activating the coagulation system or the complement system
- Liganden-Rezeptorinteraktionen der unterschiedlichsten Art, beispielsweise- Ligand-receptor interactions of various types, for example
* von Antigenen oder deren Epitopen mit dem T-Zell- oder B-Zell-Rezeptor* of antigens or their epitopes with the T cell or B cell receptor
* von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen, Steroidhormonen und Mediatoren mit ihren jeweiligen Rezeptoren* of growth factors, cytokines, chemokines, peptide hormones, steroid hormones and mediators with their respective receptors
* von Enzymen wie beispielsweise uPA oder tPA mit ihrem Rezeptor* of enzymes such as uPA or tPA with their receptor
* von Virusproteinen mit ihrem zugehörigen zellulären Rezeptor* of virus proteins with their associated cellular receptor
- Adhäsionen zwischen Adhäsionsmolekülen- Adhesions between adhesion molecules
- Proteinkomplexe bei der Signalübertragung, der Zellzykluskontrolle und der Transkriptionskontrolle von Genen- Protein complexes in signal transmission, cell cycle control and gene transcription control
Zahlreiche Beispiele hierfür sind in der Literatur zusammengefaßt, so von Hardie et al., The Protein Kinase Facts Book I and II, Academic Press 1995, Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press 1994, Pigott et al., The Adhesion Molecule Facts Book, Academic Press 1994, Barclay et al., The Leukocyte Antigen Facts Book, Academic Press 1994, Watson et al., G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press 1994, Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press 1995, Leid et al., Cell 68, 377 (1992), Murre et al., Cell 58, 537 (1989), Bbeneza et al., Cell 61 , 49 (1990), Brügge, Curr. Top.Microbiol. Immunolbiol. 123, 1 (1981), Callebaut et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6270 (1992), Nadeau et al., J. Biol. Chem. 268, 1479 (1993), Burbach et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8185 (1992), Hoffman et al., Science 252, 954 (1991 ), Stress-induced Proteins, M.L. Pardue, J.R. Feramisco and S. Lindquist Ed, A.R. Liss, New York (1989), Eukaryotic Transcription Factor, D.S. Lachman, Academic Press (1991 ), Transcriptional Regulations, Eds. S. McKnight and K.R. Yamamoto, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York (1992).Numerous examples of this are summarized in the literature, such as by Hardie et al., The Protein Kinase Facts Book I and II, Academic Press 1995, Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press 1994, Pigott et al., The Adhesion Molecule Facts Book, Academic Press 1994, Barclay et al., The Leukocyte Antigen Facts Book, Academic Press 1994, Watson et al., G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press 1994, Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press 1995 , Leid et al., Cell 68, 377 (1992), Murre et al., Cell 58, 537 (1989), Bbeneza et al., Cell 61, 49 (1990), Bruges, Curr. Top.Microbiol. Immunolbiol. 123: 1 (1981), Callebaut et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 89, 6270 (1992), Nadeau et al., J. Biol. Chem. 268, 1479 (1993), Burbach et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 89, 8185 (1992), Hoffman et al., Science 252, 954 (1991), Stress-induced Proteins, ML Pardue, JR Feramisco and S. Lindquist Ed, AR Liss, New York (1989), Eukaryotic Transcription Factor, DS Lachman, Academic Press (1991), Transcriptional Regulations, Eds. S. McKnight and KR Yamamoto, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York (1992).
In einigen Fällen werden die von der Natur vorgegebenen, weitgehend spezifischen Verbindungen zwischen mindestens zwei Proteinen benutzt für die Analyse bzw. Detektion von Proteinen bei der Diagnose von Krankheiten (siehe hierzu EP 0 491 362 B1 ) und die Bindungspartner solcher Proteine für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen. Steht ein Partner der jeweiligen Proteinkomplexe zur Verfügung, kann mit Hilfe dieses Partners die Menge des zweiten oder weiterer Partner, seien es beispielsweise Komplement- oder Gerinnungsfaktoren, Antigene, Rezeptoren oder Signalproteine ermittelt werden. Darüber hinaus werden spezifische Proteinkompiexe benutzt für die Suche nach kleinmolekularen Aktivatoren oder Inhibitoren. Des weiteren werden gereinigte Antikörper oder Liganden für Rezeptoren, wie beispielsweise Cytokine und Peptidhormone, für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen Patienten oder Tieren verabreicht.In some cases, the largely specific connections between at least two proteins specified by nature are used for the analysis or detection of proteins in the diagnosis of diseases (see EP 0 491 362 B1) and the binding partners of such proteins for prophylaxis or therapy of diseases. If a partner of the respective protein complexes is available, the amount of the second or further partner, be it complement or coagulation factors, antigens, receptors or signal proteins, can be determined with the help of this partner. In addition, specific protein complexes are used to search for small-molecule activators or inhibitors. Purified antibodies or ligands for receptors, such as cytokines and peptide hormones, for the prophylaxis or therapy of diseases are also administered to patients or animals.
Bei diesen unterschiedlichen Anwendungsmögiichkeiten für Proteine, die Proteinkomplexe bilden, ist von entscheidender Bedeutung die Spezifität, mit welcher die jeweiligen Proteine eine Komplexbildung eingehen, des weiteren die Verbreitung der jeweiligen Proteine im Organismus. Je geringer die Spezifität ist, um so häufiger werden unspezifische Bindungen eines Partners mit fremden Proteinen auftreten.With these different possible uses for proteins that form protein complexes, the specificity with which the respective proteins form a complex is of crucial importance, as is the spread of the respective proteins in the organism. The lower the specificity, the more often non-specific bindings of a partner with foreign proteins will occur.
Beispielsweise sind unspezifische, d.h. unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern bekanntermaßen das wesentliche Problem der Analytik und Diagnose mit Antikörpern. Unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern können auch in vivo die Ursache für Nebenwirkungen beispielsweise nach Injektion von Antikörpern sein. Des weiteren ist die spezifische ausschließliche Bindung zwischen zwei Proteinen eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung und spezifische Funktionsweise von komplexen Transkriptionsfaktoren, insbesondere von künstlichen Transkriptionsfaktorkomplexen, wie sie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 beschrieben wurden.For example, unspecific, ie undesired complex formation with foreign protein partners is known to be the main problem of analysis and diagnosis with antibodies. Undesired complex formation with foreign protein partners can also cause in vivo, for example, side effects after injection of antibodies. Furthermore, the specific exclusive binding between two proteins is an essential prerequisite for the production and specific functioning of complex transcription factors, in particular of artificial transcription factor complexes, as described in the patent application EP-A 0 805 209.
Es besteht somit ein erheblicher Bedarf an neuen, hochspezifisch, nicht mit fremden Partnern reagierenden komplexbildenden Proteinen.There is therefore a considerable need for new, highly specific complex-forming proteins which do not react with foreign partners.
2. Kurzbeschreibung der Erfindung2. Brief description of the invention
Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch kompiexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:The invention relates to a complex of non-naturally occurring, specifically complex-forming proteins, characterized in that the following components are contained in the complex:
a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,a) at least one ligand specific for a target structure,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,b) at least one protein containing a mutated dimerization domain, the mutated dimerization domain having been derived by mutation from a naturally occurring dimerization domain, this mutated dimerization domain can interact specifically with component c) and component b) is covalently linked to component a),
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimensierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, undc) at least one protein containing a mutated dimerization domain, the mutated dimenization domain having been derived by mutation from a naturally occurring dimerization domain, this mutant dimerization domain can interact specifically with component b) and component c) is covalently linked to component d), and
d) mindestens einen Effektor. Entsprechend der Erfindung sind die Komponenten b) und c) dadurch charakterisiert, daß in natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen gleicher oder unterschiedlicher Art Aminosäuren ausgetauscht oder eingefügt werden, so daß die so mutierten Peptide oder Proteine praktisch nur noch ausschließlich miteinander komplexieren können. Eine Komplexierung so mutierter Peptide oder Proteine mit den entsprechenden nichtmutierten Wildtyp-Proteinen oder -Peptiden unterbleibt hingegen. Auf diese Weise können Homodimere oder Heterodimere aus mutierten Monomeren (mutierte Peptide oder Proteine) gebildet werden.d) at least one effector. According to the invention, components b) and c) are characterized in that amino acids are exchanged or inserted in naturally occurring peptides or proteins of the same or different types, so that the mutated peptides or proteins can practically only complex with one another. A complexation of mutated peptides or proteins with the corresponding non-mutated wild-type proteins or peptides does not occur. In this way, homodimers or heterodimers can be formed from mutated monomers (mutated peptides or proteins).
Die Mutationen in den Bindungsdomänen der gleichen oder verschiedenen Proteine haben daher den Zweck, die Fähigkeit zur Komplexbildung zwischen einem unmutierten Monomeren und einem mutierten Monomeren eines Paares gleicher oder verschiedener Proteine oder Peptide, die im unmutierten Zustand komplexieren würden, zu verhindern. Gleichzeitig verleihen die Mutationen einem solchen Paar von mutierten Proteinen die Fähigkeit, mit hoher Spezifität aneinander zu binden. Die Mutationen treten also paarweise auf, wobei eine Mutation in Komponente b), die andere in Komponente c) vorliegt, und zwar so, daß eine molekulare Interaktion zwischen den jeweiligen Aminosäuren eines solchen Paares möglich ist.The mutations in the binding domains of the same or different proteins therefore have the purpose of preventing the ability to complex between an unmutated monomer and a mutant monomer of a pair of identical or different proteins or peptides that would complex in the unmutated state. At the same time, the mutations give such a pair of mutant proteins the ability to bind to one another with high specificity. The mutations thus occur in pairs, one mutation being present in component b) and the other in component c) in such a way that a molecular interaction between the respective amino acids of such a pair is possible.
Aminosäuren gemäß der Erfindung eingefügt in natürlich vorkommende Peptide oder Proteine können beispielsweise sein (die paarweise Auflistung soll die molekulare Interaktion im Rahmen eines dimeren Proteinkomplexes andeuten):Amino acids according to the invention inserted into naturally occurring peptides or proteins can be, for example (the listing in pairs is intended to indicate the molecular interaction in the context of a dimeric protein complex):
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)Component b) or c) component c) or b)
3-18 Cysteine 3-18 Cysteine3-18 cysteines 3-18 cysteines
3-24 basische Aminosäuren wie 3-24 saure Aminosäuren wie3-24 basic amino acids like 3-24 acidic amino acids like
Histidin, Asparagin,Histidine, asparagine,
Arginin, Asparaginsäure,Arginine, aspartic acid,
Lysin Glutamin,Lysine glutamine,
Glutaminsäure 3-24 hydrophobe Aminosäuren wie 3-24 aromatische Aminosäuren wie Methionin, Phenylalanin, Isoleucin, Tyrosin, Leucin, Tryptophan ValinGlutamic acid 3-24 hydrophobic amino acids such as 3-24 aromatic amino acids such as methionine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine, leucine, tryptophan valine
3-24 aromatische Aminosäuren 3-24 aromatische Aminosäuren3-24 aromatic amino acids 3-24 aromatic amino acids
Die Ausgangsproteine für Komponenten b) und c) können hierbei gleich oder unterschiedlich sein.The starting proteins for components b) and c) can be the same or different.
Die Bindungskonstante eines Komplexes zweier erfindungsgemäßer Proteine beträgt mindestens K = 10"7 mol I"1, bevorzugt mindestens KM = 10"8 mol I"1.The binding constant of a complex of two proteins according to the invention is at least K = 10 "7 mol I " 1 , preferably at least KM = 10 "8 mol I " 1 .
Im Sinne dieser Erfindung werden beispielsweise folgende gleiche oder ungleiche Partner (für die Herstellung von Komponente b) oder c) und mit dem Ziel Heteromere zu binden) bevorzugt in ihrer jeweiligen Bindedomäne mutiert und diese oder das gesamte Protein verwendet:For the purposes of this invention, for example the following identical or different partners (for the production of component b) or c) and with the aim of binding heteromers) are preferably mutated in their respective binding domains and these or the entire protein are used:
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)Component b) or c) component c) or b)
Fos Jun oder Jun B oder Jun DFos Jun or Jun B or Jun D
FRAU-1 Jun oder Jun B oder Jun DMRS-1 Jun or Jun B or Jun D
FRAU-2 Jun oder Jun B oder Jun DMRS-2 Jun or Jun B or Jun D
FOS-B Jun oder Jun B oder Jun DFOS-B Jun or Jun B or Jun D
OCT-1 Jun oder Jun B oder Jun DOCT-1 Jun or Jun B or Jun D
NFKB (p65) IKBNFKB (p65) IKB
Ras RAFRas RAF
CD4 p56LcK bcl-2 bad oder bax cyclin A cdklCD4 p56LcK bcl-2 bad or bax cyclin A cdkl
E2F DP CD40 CD40LE2F DP CD40 CD40L
Myc MaxMyc Max
Myc N MaxMyc N Max
Myc L Max p105 (Rb1 ) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F oder Myc p130 E7, E2F oder MycMyc L Max p105 (Rb1) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F or Myc p130 E7, E2F or Myc
CBL GagCBL gag
TRP TRPTRP TRP
Met MetMet Met
Myb p67 oder p160Myb p67 or p160
VAV p67 oder p160VAV p67 or p160
APC α- oder ß-CateninAPC α- or β-catenin
APC APCAPC APC
VD Rezeptor h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder ßVD receptor h- (retinoid x receptor) RXR α or ß
T3 Rezeptor hRXR α oder ßT3 receptor hRXR α or ß
MyoD E12MyoD E12
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)Component b) or c) component c) or b)
E12 IdE12 Id
E47 Id hHSP90 Progesteron-Rezeptor hHSP90 Glucocorticoid-Rezeptor hHSP90 Mineralocorticoid-Rezeptor hHSP90 DioxinrezeptorE47 Id hHSP90 progesterone receptor hHSP90 glucocorticoid receptor hHSP90 mineralocorticoid receptor hHSP90 dioxin receptor
Dioxinrezeptor AmtDioxin receptor office
HPS90 FKBP59HPS90 FKBP59
HSP90 Cyclosporin-bindendes ProteinHSP90 cyclosporin binding protein
HPS90 pp60v-src HPS90 pp60 v - src
HSP70 HSF1 Heat shock Faktor 1HSP70 HSF1 Heat shock factor 1
HSP70 HSF2 Heat shock Faktor 2 Bevorzugt werden sollten solche Proteinpaare, welche natürlicherweise über eine Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper-Bindesequenz verfügen.HSP70 HSF2 Heat shock factor 2 Those protein pairs which naturally have a helix-loop-helix / leucine-zipper binding sequence should be preferred.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren die unterschiedlichsten Verwendungen dieser erfindungsgemäßen kompiexbildenden Proteine, beispielsweiseThe invention further relates to the most varied uses of these complex-forming proteins according to the invention, for example
- als multivalente Protein komplexe für die Prophylaxe und Therapie- as a multivalent protein complex for prophylaxis and therapy
- als multivalente Liganden für Vektoren zur Gentherapie- as multivalent ligands for vectors for gene therapy
- als künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen- As artificial transcription factors for the control of the expression of genes
- und als diagnostische oder analytische Systeme.- and as diagnostic or analytical systems.
Hierbei werden die Komponenten a) und d) je nach der gewählten Verwendungsart ausgewählt.Components a) and d) are selected depending on the selected type of use.
Gegenstand der Erfindung sind besonders neue komplexbildende Proteine, dadurch charakterisiert, daß in natürlicherweise Homodimere oder Heterodimere bildenden Proteinen die aufgeführten Aminosäuren eingefügt worden sind, so daß diese derartig mutierten Proteine (Komponenten b) und c)) nur noch mit sich selber (Homodimere) oder mit dem entsprechend mutierten Partner (Heterodimere) Komplexe bilden, jedoch nicht mehr mit den natürlicherweise vorkommenden, nicht mutierten Ausgangsproteinen.The invention particularly relates to new complex-forming proteins, characterized in that the amino acids listed have been inserted into proteins which naturally form homodimers or heterodimers, so that these mutated proteins (components b) and c)) only with themselves (homodimers) or form complexes with the corresponding mutated partner (heterodimers), but no longer with the naturally occurring, non-mutated starting proteins.
Neue komplexbildende Proteine mit den Komponenten a), b), c) und d) können in beispielsweise zwei Ausführungsformen verwendet werden.New complex-forming proteins with components a), b), c) and d) can be used in two embodiments, for example.
In der ersten Ausführungsform (siehe Figur 1 a) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)mu.timer dar [Komponente b)1-b)n], an welche die jeweils korrespondierenden gleichen (oder unterschiedlichen) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.In the first embodiment (see FIG. 1 a), component b) is a homo- (or hetero) mu.timer [component b) 1-b) n] to which the respectively corresponding (or different) components c ) bind each as a monomer and in each case connected to component d).
Mit dieser Ausführungsform werden viele Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden. In der zweiten Ausführungsform (siehe Figur 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität der Bindung der Komponenten c) und d) an die Zielstruktur erhöhen kann.With this embodiment, many components d) (effectors) are bound to the target structure. In the second embodiment (see FIG. 2), both component b) and component c) are multimers, only one or a few components d) being bound to component c). With this embodiment, only a few components d) (effectors) are bound to the target structure, but the binding between components c) and d) is extremely strong, which can increase the specificity of the binding of components c) and d) to the target structure .
Gegenstand der Erfindung sind neue, komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b), c) und d), wie auch Nukleinsäurekonstrukte, welche für diese komplexbildenden Proteine kodieren. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Komplexe bestehend aus den Komponenten d), b), c) und d), d. h. die Komponente a) ist durch d) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.The invention relates to new, complex-forming proteins consisting of components a), b), c) and d), as well as nucleic acid constructs which code for these complex-forming proteins. The invention also relates to complexes consisting of components d), b), c) and d), d. H. component a) is replaced by d), and nucleic acid constructs coding therefor.
Desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Komplex bestehend aus den Komponenten a), b), c) und a); d. h. die Komponente d) ist durch a) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.The invention furthermore relates to a complex consisting of components a), b), c) and a); d. H. component d) is replaced by a), and nucleic acid constructs coding therefor.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b), c) und d) oder oben beschriebenen Varianten davon, die zusätzlich ein fusiogenes Peptid, ein Translokationspeptid oder zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.The invention also relates to complex-forming proteins consisting of components a), b), c) and d) or variants thereof described above, which additionally contain a fusogenic peptide, a translocation peptide or between components c) and d) or a) and b) contain a cleavage sequence for a protease and nucleic acid constructs coding therefor.
Alle solchen derartigen Nukleinsäurekonstrukte können in Bakterien, Hefen oder Säugerzellen mit Hilfe von viralen oder nichtviralen, dem Fachmann bekannten Vektoren eingeführt werden.All such nucleic acid constructs can be introduced into bacteria, yeasts or mammalian cells with the aid of viral or non-viral vectors known to the person skilled in the art.
Derartige Zellen können der Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins dienen oder selbst zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einem Organismus verabeicht werden. Derartige Nukleinsäurekonstrukte, eingefügt in einen Vektor, können jedoch auch direkt einem Organismus zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie verabreicht werden.Such cells can be used to produce the protein according to the invention or can be administered to an organism itself for the purpose of prophylaxis or therapy. Such nucleic acid constructs, inserted into a vector, can, however, also be administered directly to an organism for the purpose of prophylaxis or therapy.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung einer der o. g. Komplexe, in dem ein Protein dieses Komplexes mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstruktes exprimiert wird und eine weiteres Protein dieses Komplexes, welches von ersterem verschieden ist, mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstrukts exprimiert wird, die exprimierten Proteine isoliert und miteinander komplexiert werden. Im Falle von Komplexen bestehend aus Homodimeren oder Homooligomeren erfolgt die Herstellung ohne die Expression eines zweiten, vom ersten verschiedenen Protein.Another object of the invention is the production of one of the above. Complexes in which a protein of this complex is expressed with the aid of a nucleic acid construct coding therefor and another protein of this complex, which is different from the former, is expressed with the aid of a nucleic acid construct coding therefor, the expressed proteins are isolated and complexed with one another. In the case of complexes consisting of homodimers or homooligomers, the production takes place without the expression of a second protein different from the first.
3. Multivalente Proteinkomplexe für die Prophylaxe und Therapie3. Multivalent protein complexes for prophylaxis and therapy
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinkomplexe für die Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung. Hierbei stellt die Komponente a) einen Liganden für eine Zielstruktur dar. Diese Zielstruktur kann auf einer Zellmembran, in der extrazellulären Matrix oder in einer Gewebe- oder Blutflüssigkeit vorhanden sein.The present invention relates to the use of the protein complexes according to the invention for the prophylaxis or therapy of a disease. Component a) represents a ligand for a target structure. This target structure can be present on a cell membrane, in the extracellular matrix or in a tissue or blood fluid.
Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellenAccording to the invention, component a) can represent
- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor, beispielsweisea ligand for a cellular receptor, for example
* Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin- 1* Growth factors such as VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin - 1
+ Cytokine wie IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15+ Cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 , IL-13, IL-14, IL-15
* Interferon α, ß und γ* Interferon α, ß and γ
^ Tumomekrosefaktoren TNFα, -ß * Chemokine wie RANTES, MCAF, MIP-1α oder -ß, NAP, ß-Thromboglobulin^ Tumor necrosis factors TNFα, -ß * Chemokines such as RANTES, MCAF, MIP-1α or -ß, NAP, ß-thromboglobulin
* Peptidhormone wie SRH, SIH oder STH, MRH oder MSH, PRH, PIH oder Prolaktin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH oder FSH, TRH oder TSH, CRH oder ACTH* Peptide hormones such as SRH, SIH or STH, MRH or MSH, PRH, PIH or prolactin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH / ICSH or FSH, TRH or TSH, CRH or ACTH
* Angiotensin, Kinine, Histamin, Homologe oder Analoge hiervon* Angiotensin, kinins, histamine, homologs or analogues thereof
* Steroidhormone wie Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Homologe oder Analoge hiervon* Steroid hormones such as estrogens, progestogens, androgens, glucocorticoids, mineralocorticoids, homologues or analogues thereof
* Vitamine wie z.B. Folsäure* Vitamins such as Folic acid
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Adhäsionsmolekül, ein Teil des Adhäsionsmoleküls oder ein Analogon eines Adhäsionsmoleküls sein, welches an ein korrespondierendes zellmembranständiges Adhäsionsmolekül oder an eine andere spezifische Bindestruktur für ein Adhäsionsmolekül auf der Zielzelle bindet.In the context of the present invention, component a) can also be an adhesion molecule, part of the adhesion molecule or an analogue of an adhesion molecule which binds to a corresponding adhesion molecule on the cell membrane or to another specific binding structure for an adhesion molecule on the target cell.
Derartige als Komponente a) funktionsfähige Adhäsionsmoieküle sind beispielsweiseAdhesion molecules such as component a) are, for example
- Lewis X (für GMP-140)- Lewis X (for GMP-140)
- S-Lewis X (für ELAM-l ).- S-Lewis X (for ELAM-l).
- LFA-1 (für ICAM-1 und ICAM-2)- LFA-1 (for ICAM-1 and ICAM-2)
- MAC-1 (für lCAM-1 )- MAC-1 (for lCAM-1)
- VLA-4 (für VCAM-1 )- VLA-4 (for VCAM-1)
- PECAM (für PECAM)- PECAM (for PECAM)
- Vitronectin (für den Vitronectinrezeptor)- Vitronectin (for the Vitronectin receptor)
- GMP-140 (für Lewis X)- GMP-140 (for Lewis X)
- S-Lewis X (für ELAM-l )- S-Lewis X (for ELAM-l)
- ICAM-1 , ICAM-2 (für LFA-1 , MAC-1 )- ICAM-1, ICAM-2 (for LFA-1, MAC-1)
- VCAM-1 (für VLA-4)- VCAM-1 (for VLA-4)
- Fibronectin (für VLA-4)- Fibronectin (for VLA-4)
- Laminin (für VLA-6)- Laminin (for VLA-6)
- Fibronectin, Laminin (für VLA-1 , VLA-2, VLA-3)- Fibronectin, Laminin (for VLA-1, VLA-2, VLA-3)
- Fibronectin (für VLA-4) - Fibrinogen (für GPIIb-llla)- Fibronectin (for VLA-4) - fibrinogen (for GPIIb-llla)
- B7 (für CD28)- B7 (for CD28)
- CD28 (für B7)- CD28 (for B7)
- CD40 (für CD40L)- CD40 (for CD40L)
- CD40L (für CD40)- CD40L (for CD40)
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Protein sein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzym .In the context of the present invention, component a) can also be a protein which binds to a partner protein and thereby participates in a biological reaction chain, for example a complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system, the fibrinolysis system or a plasmatic or cellular enzyme inhibitor or a plasmatic or cellular enzyme.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch einen Rezeptor für einen der zuvor erwähnten Proteine darstellen.In the context of the present invention, component a) can also represent a receptor for one of the aforementioned proteins.
Im Rahmen der vorliegenden Verbindung kann die Komponente a) auch der extrazelluläre Teil eines Fc-Rezeptors sein (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), an welchem ein Antikörper spezifisch für die Zielzelle über seinen Fc-Teii gebunden wird.In the context of the present compound, component a) can also be the extracellular part of an Fc receptor (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), to which an antibody is bound specifically for the target cell via its Fc part .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Antikörpermolekül oder den epitopbindenden Teil eines Antikörpermoleküls darstellen. Humane Antikörper sind zu bevorzugen.In the context of the present invention, component a) can also be an antibody molecule or the epitope-binding part of an antibody molecule. Human antibodies are preferred.
Die murinen monoklonalen Antikörper können in humanisierter Form eingesetzt werden. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 )) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., (Nature 349, 293 (1991 )), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 )) oder Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)) beschriebenen Weise.The murine monoclonal antibodies can be used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Antibody fragments are produced in accordance with the prior art, for example in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)) or Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)).
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert. Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für weitere Manipulationen (z.B. der Fusion mit anderen Proteinen) eingesetzt.Recombinant antibody fragments are produced directly from existing hybridomas or are isolated from libraries of murine or human antibody fragments using "phage display" technology. These antibody fragments are then used directly on the genetic level for further manipulations (e.g. fusion with other proteins).
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Poiymerasekettenreaktion und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z.B. in Form von Fv-Fragmenten, einzelkettigen Fv- Fragmenten (scFv) oder als Fab-Fragmente kloniert.For the production of recombinant antibody fragments from hybridomas, the genetic information coding for the antigen-binding domains (VH, VL) of the antibodies is complementary to the 5 by isolating the mRNA, reverse transcribing the RNA into cDNA and then amplifying it using the polymerase chain reaction and oligonucleotides '- or 3' ends of the variable fragments obtained. The VH and VL fragments are then converted into bacterial expression vectors e.g. cloned in the form of Fv fragments, single-chain Fv fragments (scFv) or as Fab fragments.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage-display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom oder in Phagemid-Vektoren in Form von scFv-Fragmenten oder als Fab-Fragmente kloniert. Antigen-bindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen ("panning"), an antigenkonjugierten, paramagnetischen Kügelchen ("beads") oder durch Bindung an Zelloberflächen selektioniert.New antibody fragments can also be isolated directly from antibody libraries (immune libraries, naive libraries) of murine or human origin using the "phage display" technology. In the "phage display" of antibody fragments, the antigen-binding domains are cloned as fusion proteins with the coat protein g3P of filamentous bacteriophages either in the phage genome or in phagemid vectors in the form of scFv fragments or as Fab fragments. Antigen-binding phages are selected on antigen-loaded plastic vessels ("panning"), on antigen-conjugated, paramagnetic beads ("beads") or by binding to cell surfaces.
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere oder Patienten. Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden die spezifisch sind für murine oder humane Immunglobulingene bzw. für die humanen Immunglobulin-Genfamilien verwendet.Immune libraries are prepared by PCR amplification of the variable antibody fragments from B lymphocytes of immunized animals or patients. Combinations of oligonucleotides that are specific for murine or human immunoglobulin genes or used for the human immunoglobulin gene families.
Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen. Alternativ können Immunglobulin- Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird. Diese sogenannten "Single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können.Naive libraries can be made using non-immunized donors as the source of the immunoglobulin genes. Alternatively, immunoglobulin germline genes can be used for the production of semisynthetic antibody repertoire, the complementarity-determining region 3 of the variable fragments being supplemented by PCR using degenerate primers. These so-called "single pot" libraries have the advantage over immune libraries that antibody fragments against a large number of antigens can be isolated from a single library.
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neu Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige, kodonbasierende oder gezielte Mutagenese, durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus nativen Repertoires oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers.The affinity of antibody fragments can be further increased by means of the "phage display" technology, new libraries of already existing antibody fragments by random, codon-based or targeted mutagenesis, by "chain shuffling" individual domains with fragments from native repertoires or with the aid of bacterial mutator strains are produced and antibody fragments with improved properties are isolated by reselection under stringent conditions. In addition, murine antibody fragments can be humanized by gradually replacing one of the variable domains with a human repertoire and subsequent selection with the original antigen ("guided selection"). Alternatively, the humanization of murine antibodies takes place by targeted exchange of the hypervariable regions of human antibodies by the corresponding regions of the original murine antibody.
Entsprechend der Erfindung können mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche Liganden für die Zielstruktur, z.B. auf der Zielzelle im erfindungsgemäßen Liganden (Komponente a) enthalten sein. Eine besondere Form von bispezifischen oder multispezifischen, rekombinanten Antikörpern stellen einzelkettige, zweifach- oder mehrfach-antigenbindende Moleküle dar. Die Herstellung dieser Moleküle wurde in der Patentanmeldung DE 19816141.7 (nicht veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird zur beispielsweisen Herstellung der Komponente a) ausdrücklich Bezug genommen.According to the invention, at least two identical or different ligands for the target structure, for example on the target cell, can be contained in the ligand (component a) according to the invention. A special form of bispecific or multispecific, recombinant antibodies are single-chain, double or multiple antigen-binding molecules. The preparation of these molecules was described in patent application DE 19816141.7 (not published). To this Patent application is expressly referred to, for example, the production of component a).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch das Hüllprotein oder ein Teil des Hüllproteins von Viren darstellen, welche über ihr Hüllprotein an ausgewählte Zellen spezifisch binden.In the context of the present invention, component a) can also be the coat protein or a part of the coat protein of viruses which specifically bind to selected cells via their coat protein.
Die Wahl der Komponente a) richtet sich nach der Zielstruktur, an welche das erfindungsgemäße komplexbildende Protein binden soll.The choice of component a) depends on the target structure to which the complex-forming protein according to the invention is to bind.
Als Beispiele hierfür gelten:Examples include:
- Liqanden für aktivierte Endothelzellen- Liqanden for activated endothelial cells
Hierzu gehören im Sinne der Erfindung Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.For the purposes of the invention, this includes antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)). In particular, these include antibodies against the VEGF receptors.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten, des weiteren IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).The ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on endothelial cells. For example, these include substances that contain mannose, IL-1 or growth factors or their fragments or partial sequences thereof that bind to receptors expressed by endothelial cells, such as PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J Pathol. 169, 191 (1993)).
Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1 , MAC-1 , LECAM-1 , VLA-4, Vitronectin oder RGD-Peptide wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).This also includes adhesion molecules that bind to activated and / or proliferating endothelial cells. Adhesion molecules of this type, such as, for example, Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, vitronectin or RGD peptides have already been described (reviews by Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119: 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Zu diesen Viren gehören beispielsweise:The ligands for the purposes of this invention include in particular glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for endothelial cells. These viruses include, for example:
- Filoviren, beispielsweise- Filoviruses, for example
* das Marburg-Virus mit seinem Hüllprotein GP (glycoprotein) und sGP (second glycoprotein)* the Marburg virus with its coat protein GP (glycoprotein) and sGP (second glycoprotein)
* oder das Ebola-Virus jeweils mit seinem Hüllprotein GP und sG* or the Ebola virus with its coat protein GP and sG
- das Cytomegalovirus besonders mit seinem gB-Protein- the cytomegalovirus especially with its gB protein
- das Herpes Simplex-Virus Type I- the herpes simplex virus type I
- das HIV-1 Virus- the HIV-1 virus
- das Masern-Virus- the measles virus
- das Hantaan-Virus- the Hantaan virus
- Alphaviren, wie Semliki Forest-Virus- Alpha viruses, such as Semliki Forest virus
- das Virus des epidemischen, haemorrhagischen Fiebers- the epidemic haemorrhagic fever virus
- das Poliovirus- the poliovirus
- Enteroviren (wie z.B. Echo 9, Echo 12, Cocksackie B3)- Enteroviruses (such as Echo 9, Echo 12, Cocksackie B3)
Liqanden für aktivierte Makrophaqen und/oder aktivierte LvmphozytenLiqands for activated macrophages and / or activated lymphocytes
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören des weiteren Substanzen, welche an die Oberfläche von Immunzellen spezifisch binden. Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Immunzellen, wie sie beispielsweise von Powelson et al. (Biotech. Adv. 1_1, 725 (1993)) beschrieben wurden. Des weiteren gehören zu den Liganden auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihrem antigenbindenden variablen Teil an Fc-γ - oder Fc-ε - oder Fc-μ Rezeptoren von Immunzelien binden (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11 , 1731 (1994)).For the purposes of the invention, the ligands also include substances which specifically bind to the surface of immune cells. These include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of immune cells, as described, for example, by Powelson et al. (Biotech. Adv. 1_1, 725 (1993)). The ligands also include monoclonal or polyclonal antibodies or antibody fragments which, with their antigen-binding variable part, bind to Fc-γ - or Fc-ε - or Fc-μ receptors of immune cells (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).
Des weiteren gehört hierzu das Fc-Fragment von humanem monoklonalem oder polyklonalem Immunglobulin. Derartige Fc-Fragmente werden beispielsweise gentechnisch mit Hilfe rekombinierter DNA oder entsprechend der Methoden von Haupt et al. (Klin. Wschr. 47, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) oder Menninger et al. (Immunochem. 13, 633 (1976)) hergestellt.This also includes the Fc fragment of human monoclonal or polyclonal immunoglobulin. Such Fc fragments are, for example, genetically engineered using recombinant DNA or according to the methods of Haupt et al. (Klin. Wschr. 47, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) or Menninger et al. (Immunochem. 13, 633 (1976)).
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen binden. Hierzu gehören Zytokine wie beispielsweise IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF, M- CSF, des weiteren Wachstumsfaktoren wie beispielsweise EGF, TGF, FGF, IGF oder PDGF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Immunzellen binden.The ligands also include all substances that bind to membrane receptors on the surface of immune cells. These include cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF, M-CSF, further growth factors such as EGF, TGF, FGF, IGF or PDGF or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by immune cells.
Hierzu gehören des weiteren Adhäsionsmoleküle und andere Liganden, welche an Zellmembranstrukturen, wie beispielsweise an den Mannose 6-Phosphat- Rezeptor auf Makrophagen in Milz, Leber, Lunge und andere Gewebe binden.These also include adhesion molecules and other ligands that bind to cell membrane structures such as the mannose 6-phosphate receptor on macrophages in the spleen, liver, lungs and other tissues.
Eine Auswahl dieser Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.A selection of these ligands and membrane structures are clear from Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)).
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Lymphozyten und/oder Makrophagen haben.For the purposes of this invention, however, the ligands also include glycoproteins of the envelope of those viruses which have a tropism for lymphocytes and / or macrophages.
Zu diesen Makrophagen infizierenden Viren gehören beispielsweise: - HIV-1 besonders solche Stämme mit Mutationen in der V3-Region von gp120, die zu einer erhöhten Bindung an Makrophagen führenViruses that infect macrophages include, for example: - HIV-1 particularly those strains with mutations in the V3 region of gp120 which lead to an increased binding to macrophages
- HIV-2- HIV-2
- Hantaviren, beispielsweise das PunmalavirusHantaviruses, for example the punmalavirus
- Cytomegaiovirus- Cytomegaiovirus
- Respiratory Syncytial Virus- Respiratory Syncytial Virus
- Herpes simplex-Virus- herpes simplex virus
- Filoviren.- Filoviruses.
Zu den Lymphozyten infizierenden Viren gehören beispielsweise:Viruses that infect lymphocytes include, for example:
- Varizella-Zoster-Virus (VZV); VZV infiziert besonders T-Zellen- varicella zoster virus (VZV); VZV particularly infects T cells
- Herpes Virus 6 (HHV-6);Herpes virus 6 (HHV-6);
HHV-6 infiziert besonders T-ZellenHHV-6 particularly infects T cells
- Rabies-Virus; das Rabies-Virus Hüllprotein bindet besonders an TH2-Zellen- Rabies virus; the Rabies virus coat protein binds particularly to TH2 cells
- HIV-1 ; das Glykoprotein gp120 bindet bevorzugt an das CD4 Molekül von T-Zellen- HIV-1; the glycoprotein gp120 preferentially binds to the CD4 molecule of T cells
- HTLV-II;- HTLV-II;
HTLV-II infiziert besonders B-ZellenHTLV-II particularly infects B cells
- HTLV-I;- HTLV-I;
HTLV-I infiziert besonders T-ZellenHTLV-I particularly infects T cells
- Influenza C-Viren;- influenza C viruses;
Influenza-C-Viren binden über das Haemagglutinin-Esterase-Fusions-(HEF)- Protein an N-acetyl-9-ß-acetylneuraminsäure (Neu 5,9 Ac), welche bevorzugt auf B-Lymphozyten, weniger oder nicht auf T-Lymphozyten vorkommtInfluenza C viruses bind via the hemagglutinin esterase fusion (HEF) protein to N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid (Neu 5.9 Ac), which preferentially on B lymphocytes, less or not on T- Lymphocyte occurs
- Influenza C-Viren mit Mutation in der Nukleotidposition 872 (die die Position 284 des HEF der Aminosäuresequenz kodiert), beispielsweise ein Austausch des Threonins durch Isoleucin. Das Oberflächenprotein HEF mit dieser Mutation hat eine deutlich stärkere Affinität zum N-acetyl-9-ß- acetylneuraminsäure-Rezeptor als das WildvirusInfluenza C viruses with mutation in nucleotide position 872 (which encodes position 284 of the HEF of the amino acid sequence), for example an exchange of the threonine by isoleucine. The surface protein HEF with this Mutation has a significantly stronger affinity for the N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid receptor than the wild virus
- HEF Spaltprodukte des Influenza C-Virus, welche die Bindestruktur für N- acetyl-9-ß-acetylneuraminsäure enthalten. Diese Bindestruktur ist definiert durch die katalytische Triade Serin-71 , Histidin 368 oder - 369 und Arsparaginsäure 261- HEF cleavage products of the influenza C virus, which contain the binding structure for N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid. This binding structure is defined by the catalytic triad serine-71, histidine 368 or - 369 and arpartic acid 261
- Epstein-Barr Virus;- Epstein-Barr virus;
EBV infiziert besonders B-ZellenEBV particularly infects B cells
- Herpes simplex-Virus-2;- herpes simplex virus-2;
HSV-2 infiziert besonders T-ZellenHSV-2 particularly infects T cells
- Masernvirus- measles virus
Liqanden für MuskelzellenLiqanden for muscle cells
Hierzu gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Muskelzellen, insbesondere von glatten Muskelzellen. Derartige Antikörper sind beispielsweiseThese include, for example, antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells. Such antibodies are, for example
- der Antikörper 10F3- the antibody 10F3
- Antikörper gegen Actin- Antibodies against actin
- Antikörper gegen Angiotensin Il-Rezeptoren- Antibodies against angiotensin II receptors
- Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren oder Antikörper gerichtet beispielsweise gegen- Antibodies against receptors for growth factors or antibodies directed against, for example
- EGF-Rezeptoren- EGF receptors
- oder gegen PDGF-Rezeptoren- or against PDGF receptors
- oder gegen FGF-Rezeptoren- or against FGF receptors
- oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren.- or antibodies against endothelin A receptors.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirksubstanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Muskelzellen binden (Übersicht bei Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991 )). Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch glatte Muskelzellen binden wie beispielsweiseThe ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on muscle cells (review by Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991)). For example, this includes growth factors or their fragments or partial sequences of them, which bind to receptors expressed by smooth muscle cells, for example
- PDGF- PDGF
- EGF- EGF
- TGFß- TGFß
- TGFα- TGFα
- FGF- FGF
- Endothelin A- endothelin A
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Muskelzellen haben. Zu diesen Viren gehört beispielsweise das Cytomegalovirus.For the purposes of this invention, however, the ligands also include glycoproteins of the envelope of those viruses which have a tropism for muscle cells. These viruses include, for example, the cytomegalovirus.
- Liqanden für blutbildende Zellen- Liqanden for hematopoietic cells
Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Rezeptoren exprimiert auf gering differenzierten Blutzellen.The ligands include antibodies or antibody fragments directed against receptors expressed on poorly differentiated blood cells.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für folgende Rezeptoren beschrieben worden:Such antibodies have been described, for example, for the following receptors:
- Stern Cell Factor Receptor- Stern Cell Factor Receptor
- IL-1 -Rezeptor (Type I)- IL-1 receptor (Type I)
- IL-1 -Rezeptor (Type II)- IL-1 receptor (Type II)
- IL-3-Rezeptor α- IL-3 receptor α
- IL-3-Rezeptor ß- IL-3 receptor ß
- IL-6-Rezeptor- IL-6 receptor
- GM-CSF-Rezeptor. Des weiteren gehören zu den Liganden auch monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-γ Rezeptoren von Immunzelien binden.- GM-CSF receptor. The ligands also include monocional or polyclonal antibodies or antibody fragments which bind with their constant domains to Fc-γ receptors of immune cells.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von gering differenzierten Blutzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie SCF, IL-1 , IL-3, IL-6, GM-CSF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Blutzellen binden.The ligands also include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on the surface of poorly differentiated blood cells. For example, this includes growth factors, such as SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by blood cells.
Liqanden für Synovialzellen und EntzündunqszellenLiqanden for synovial and inflammatory cells
Hierzu gehören monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Synovialzellen oder Entzündungszellen binden. Solche Membranstrukturen sind beispielsweiseThese include monocional or polyclonal antibodies or antibody fragments that bind with their variable domains to membrane structures of synovial cells or inflammatory cells. Such membrane structures are, for example
- Vimentin- Vimentin
- Fibronectin oder- fibronectin or
- Fc-Rezeptoren.- Fc receptors.
Hierzu gehören auch monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-Rezeptor binden.This also includes monocional or polyclonal antibodies or antibody fragments that bind to the Fc receptor with their constant domains.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Synovialzellen binden. Beispielsweise gehören hier Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Synovialzellen binden wie beispielsweise IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß. Des weiteren gehören hierzu Liganden, deren wesentlicher Bestandteil endständige Mannose ist, welche an Mannose-6-Phosphatrezeptoren auf Makrophagen bindet.This also includes all active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on synovial cells. For example, cytokines or growth factors or their fragments or partial sequences belong to them, which bind to receptors expressed by synovial cells, such as IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß. This also includes ligands, the essential component of which is terminal mannose, which binds to mannose-6-phosphate receptors on macrophages.
- Liqanden für mit Viren infizierte Zellen- Liqanden for cells infected with viruses
Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen die Virusantigene exprimiert auf der Zellmembran von virusinfizierten Zellen.The ligands include antibodies or antibody fragments directed against the virus antigens expressed on the cell membrane of virus-infected cells.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für mit folgenden Viren infizierten Zellen beschrieben worden:Such antibodies have been described, for example, for cells infected with the following viruses:
- HBV- HBV
- HCV- HCV
- HSV- HSV
- HPV- HPV
- HIV- HIV
- EBV- EBV
- HTLV.- HTLV.
- Liqanden für Leberzellen und weitere Gewebezellen- Liqanden for liver cells and other tissue cells
Zu den Liganden gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie Zytokine, EGF, TGF, FGF oder PDGF, oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch derartige Zellen binden.The ligands include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on the surface of liver cells. For example, this includes growth factors, such as cytokines, EGF, TGF, FGF or PDGF, or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by such cells.
Hierzu gehören des weiteren Liganden, welche an Zellmembranstrukturen binden, welche selektiv sind für bestimmte Gewebe. Hierzu zählen beispielsweise: Membranstruktur Ligand GewebezellenThese also include ligands that bind to cell membrane structures that are selective for certain tissues. These include, for example: Membrane structure of ligand tissue cells
Asialoglycoprotein- Asialoorosomucoid Leberzellen Rezeptor NeoglycoproteinAsialoglycoprotein- Asialoorosomucoid liver cell receptor neoglycoprotein
GalactoseGalactose
Transferrin-Rezeptor Transferrin Leber, andere GewebezellenTransferrin receptor, transferrin liver, other tissue cells
Insulin-Rezeptor Insulin Leber, andere GewebezellenInsulin receptor insulin liver, other tissue cells
Mannose-6-Phosphat- Mannose Makrophagen in Milz, Rezeptor Leber, Lunge, andere GewebeMannose-6-phosphate-mannose macrophages in spleen, receptor liver, lungs, other tissues
Fc-γ-Rezeptoren immunglobulin G retikuloendotheliales System, andere GewebeFc-γ receptors immunoglobulin G reticuloendothelial system, other tissues
Diese Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.These ligands and membrane structures are clearly shown in Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)).
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören jedoch besonders Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für ausgewählte Zellen haben, wie beispielsweise fürFor the purposes of the invention, however, the ligands include, in particular, glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for selected cells, for example for
- Bronchialepithelzellen- bronchial epithelial cells
* Respiratory syncytial virus* Respiratory syncytial virus
- Leberzellen- liver cells
* Hepatitis C-Virus, Hepaptitis B-Virus, Hepatitis A-Virus* Hepatitis C virus, Hepaptitis B virus, Hepatitis A virus
* Filoviren* Filoviruses
Leberzellen binden z.B. das Marburg-Virus über den Asialoglykoprotein- Rezeptor * Hepatitis B-VirusFor example, liver cells bind the Marburg virus via the asialoglycoprotein receptor * Hepatitis B virus
Leberzellen binden bevorzugt über den Asiaioglykoprotein-Rezeptor an der preS2 und preS1 Domäne von HBVLiver cells preferentially bind to the preS2 and preS1 domains of HBV via the asiaioglycoprotein receptor
* Hepatitis D-Virus* Hepatitis D virus
- lebersinusoidale Zellen- liver sinusoidal cells
* Hepatitis V-Virus* Hepatitis V virus
HBV wird gebunden über Fibronectin.HBV is bound via fibronectin.
Liqanden für GliazellenLiqanden for glial cells
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Gliazellen, wie sie beispielsweise von Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) und McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991 )) berichtet wurden. Zu diesen Membranstrukturen gehören des weiteren Neuraladhäsionsmoleküle wie N-CAM, insbesondere dessen Polypeptidkette C.These include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of glial cells, as described, for example, by Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) and McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991)). These membrane structures also include neural adhesion molecules such as N-CAM, in particular its polypeptide chain C.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Gliazellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose tragen und an den Mannose-6- Phosphatrezeptor binden, Insulin und Insulin-like growth factor, PDGF und diejenigen Fragmente dieser Wachstumsfaktoren, welche an die zugehörigen Membranrezeptoren binden.This also includes all active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on glial cells. For example, these include substances that carry mannose at the end and bind to the mannose 6 phosphate receptor, insulin and insulin-like growth factor, PDGF and those fragments of these growth factors that bind to the associated membrane receptors.
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben.For the purposes of the invention, the ligands include, in particular, glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for glial cells.
Zu diesen Viren gehören beispielsweise:These viruses include, for example:
- HIV-1 Subtyp JRF1- HIV-1 subtype JRF1
- Herpes simplex-Virus I Liqanden für Leukämiezellen- Herpes simplex virus I Liqanden for leukemia cells
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 4_1, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente mit Spezifität für folgende Antigene geeignet:These include antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of leukemia cells. A large number of such monoclonal antibodies have already been described for diagnostic and therapeutic methods (reviews by Kristensen, Danish Medical Bulletin 4_1, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Depending on the type of leukemia, suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments with specificity for the following antigens:
Zellen MembranantigenCells membrane antigen
AML CD13AML CD13
CD14CD14
CD15CD15
CD33CD33
CAMALCAMAL
Sialosyl-LeSialosyl-Le
B-CLL CD5B-CLL CD5
CD1c CD23CD1c CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmun- globulineIdiotypes and isotypes of membrane immunoglobulins
T-CLL CD33T-CLL CD33
M38M38
IL-2-Rezeptoren T-Zell-RezeptorenIL-2 receptors T cell receptors
ALL CALLAALL CALLA
CD19 Non-Hodgkin LymphomaCD19 Non-Hodgkin's Lymphoma
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen binden.The ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors of leukemia cells. For example, growth factors or their fragments or Partial sequences of them that bind to receptors expressed by leukemia cells.
Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). Beispielsweise gehören zu ihnen:Such growth factors have already been described (reviews by Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). For example, they include:
- IFNα bei Non-Hodgkin Lymphomen- IFNα in non-Hodgkin lymphomas
- IL-2, besonders bei T-Zell-Leukämien- IL-2, especially in T cell leukemia
- FGF bei T-Zell-, monozytären, myeloiden, erythroiden und megakaryoblastischen Leukämien- FGF in T cell, monocytic, myeloid, erythroid and megakaryoblastic leukaemias
- TGFß bei Leukämien- TGFß in leukaemias
- Retinoide, z.B. "Retinoic acid" bei akuter promyelozytärer Leukämie.Retinoids, e.g. "Retinoic acid" in acute promyelocytic leukemia.
Liqanden für TumorzellenLiqanden for tumor cells
Hierzu gehören Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.These include antibodies and fragments of these antibodies, directed against membrane structures on tumor cells. Such antibodies have been described, for example, by Sedlacek et al. (Contrib. To Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) and Contrib. To Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)).
Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:Antibodies against:
- Sialyl Lewis- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden- Peptides on tumors that are recognized by T cells
- von Onkogenen exprimierte Proteine- proteins expressed by oncogenes
- Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1- Gangliosides such as GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer- blood group antigens and their precursors
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin- Antigens on the polymorphic epithelial mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen Gemäß der Erfindung kann die Komponente d) entweder fehlen oder ist, je nach Art der Erkrankung, welche verhütet oder behandelt werden soll, gemeinsam mit der Komponente a) beispielsweise wie folgt auszuwählen:- Antigens on heat shock proteins According to the invention, component d) may either be absent or, depending on the type of disease which is to be prevented or treated, may be selected together with component a) as follows, for example:
a) Therapie von Tumoren a.1 ) Zielzellen:a) Therapy of tumors a.1) Target cells:
- prolife erende Endothelzellen oder- proliferating endothelial cells or
- der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder- Stromal cells and muscle cells adjacent to the endothelial cell or
- Tumorzellen oder Leukämiezeilen- tumor cells or leukemia cells
a.2) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiela.2) Effectors: inhibitors of cell proliferation, for example
- das Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine- the retinoblastoma protein (pRb = p110) or the related p107 and p130 proteins
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110. In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.The retinoblastoma protein (pRb / p110) and the related p107 and p130 proteins are inactivated by phosphorylation. Those genes of these cell cycle inhibitors which have mutations for the inactivation sites of the expressed proteins are preferably to be used without their function being impaired thereby. Examples of these mutations have been described for p110. The DNA sequence for the p107 protein or the p130 protein is mutated in an analogous manner.
- das p53 Protein- the p53 protein
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.The protein p53 is inactivated in the cell either by binding to special proteins, such as MDM2, or by oligomerizing the p53 via the dephosphorylated C-terminal serine. A DNA sequence is therefore preferably used for a p53 protein which is shortened at the C-terminal by the serine 392.
- das p21 (WAF-1 )- the p21 (WAF-1)
- das p16 Protein- the p16 protein
- andere cdk-lnhibitoren- other CDK inhibitors
- das GADD45 Protein- the GADD45 protein
- das Bak Protein - das Bax Protein a.3) Effektoren: Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:- the Bak protein - the Bax protein a.3) effectors: coagulation-inducing factors and angiogenesis inhibitors, for example:
- Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1 )- Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)
- PAI-2- PAI-2
- PAI-3- PAI-3
- Angiostatin und/oder Endostatin- angiostatin and / or endostatin
- Interferone (IFNα, IFNß oder IFNγ)- interferons (IFNα, IFNß or IFNγ)
- Platelet factor 4- Platelet factor 4
- IL-12- IL-12
- TIMP-1- TIMP-1
- TIMP-2- TIMP-2
- TIMP-3- TIMP-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)- Leukemia inhibitory factor (LIF)
- Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente- Tissue Factor (TF) and its coagulation-active fragments
a.4) Effektoren: zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiela.4) Effectors: cytostatic and cytotoxic proteins, for example
- Perforin- Perforin
- Granzym- Granzym
- IL-2- IL-2
- IL-4- IL-4
- IL-12- IL-12
- Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNß oder IFNγ- Interferons, such as IFN-α, IFNß or IFNγ
- TNF, wie TNFα oder TNFß- TNF, such as TNFα or TNFß
- Oncostatin M- Oncostatin M
- Sphingomyelinase- sphingomyelinase
- Magainin und Magainin-Derivate- Magainin and Magainin derivatives
a.5) Effektoren: zytostatische oder zytotoxische Antikörper - Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.a.5) Effectors: cytostatic or cytotoxic antibodies - The cytostatic or cytotoxic antibodies include those directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)). In particular, these include antibodies against the VEGF receptors.
- Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T- Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1 ; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen- This also includes cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells. Such antibodies have been described, for example, by Sedlacek et al. (Contrib. To Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) and Contrib. To Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)). Further examples are antibodies against Sialyl Lewis; against peptides on tumors that are recognized by T cells; against proteins expressed by oncogenes; against gangliosides such as GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; against blood group antigens and their precursors; against antigens on the polymorphic epithelial mucin; against antigens on heat shock proteins
- Des weiteren gehören hierzu Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet: Zellen Membranantigen- This also includes antibodies directed against membrane structures of leukemia cells. A large number of such monoclonal antibodies have already been described for diagnostic and therapeutic methods (reviews by Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988) ; Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Depending on the type of leukemia, suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments directed against the following membrane antigens: Cells membrane antigen
AML CD13AML CD13
CD15CD15
CD33CD33
CAMALCAMAL
Sialosyl-LeSialosyl-Le
B-CLL CD5 CD1cB-CLL CD5 CD1c
CD23CD23
Idiotypen und Isotypen der MembranimmunglobulineIdiotypes and isotypes of membrane immunoglobulins
T-CLL CD33T-CLL CD33
M38M38
IL-2-Rezeptoren T-Zell-RezeptorenIL-2 receptors T cell receptors
ALL CALLAALL CALLA
CD19 Non-Hodgkin LymphomaCD19 Non-Hodgkin's Lymphoma
- Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit der Komponente b) und/oder Komponente c) erfolgt mit dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik durch Expression eines Genes kodierend für das Fusionsprotein.- The humanization of murine antibodies, the production and optimization of genes for Fab and rec. Fragments are carried out according to the technique known to the person skilled in the art (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28 , 1379 (1991) or Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). The merger of the rec. Fv fragments with component b) and / or component c) are carried out using the prior art known to the person skilled in the art by expressing a gene coding for the fusion protein.
a.6) Effektoren: Induktoren von Entzündungen, zum Beispiela.6) Effectors: inducers of inflammation, for example
- IL-1- IL-1
- IL-2- IL-2
- RANTES (MCP-2)- RANTES (MCP-2)
- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
- IL-8- IL-8
- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -ß)- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -ß)
- neutrophil activating protein-2 (NAP-2) - IL-3- neutrophil activating protein-2 (NAP-2) - IL-3
- IL-5- IL-5
- human leukemia inhibitory factor (LIF)- human leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-7- IL-7
- IL-11- IL-11
- IL-13- IL-13
- GM-CSF- GM-CSF
- G-CSF- G-CSF
- M-CSF- M-CSF
- Cobra venom factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktioneil entsprechen, d.h. welche an den Kompiementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen- Cobra venom factor (CVF) or partial sequences of the CVF which functionally correspond to the human complement factor C3b, i.e. which can bind to complement factor B and, after cleavage by factor D, represent a C3 convertase
- der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b- the human complement factor C3 or its partial sequence C3b
- Spaltprodukte des menschlichen Kompiementfaktors C3, welche funktioneil und strukturell dem CVF ähneln- Fission products of the human complement factor C3, which are functionally and structurally similar to the CVF
- bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhimurium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.bacterial proteins which activate complement or trigger inflammation, such as, for example, porins from Salmonella typhimurium, "clumping" factors from Staphylococcus aureus, modulins especially from gram-negative bacteria, "major outer membrane protein" from Legionella or from Haemophilus influenza type B or from Streptococcal group G adhesive or M molecules.
a.7) Effektoren: Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.a.7) Effectors: Enzymes for the activation of precursors of cytostatics, for example for enzymes which cleave inactive pre-substances (prodrugs) into active cytostatics (drugs).
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Müllen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist eines der folgenden Enzyme zu verwenden: - Herpes Simplex Virus ThymidinkinaseSuch substances and the associated prodrugs and drugs have already been described by Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Müllen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) and Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)). For example, one of the use the following enzymes: - Herpes simplex virus thymidine kinase
- Varizella Zoster Virus Thymidinkinase- Varizella zoster virus thymidine kinase
- bakterielle Nitroreduktase- bacterial nitroreductase
- bakterielle ß-Glucuronidase- bacterial ß-glucuronidase
- pflanzliche ß-Glucuronidase aus Seeale cereale- vegetable ß-glucuronidase from Seeale cereale
- humane ß-Glucuronidasehuman β-glucuronidase
- humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxypeptidase- Human carboxy peptidase (CB) for example CB-A of the mast cell, CB-B of the pancreas or bacterial carboxypeptidase
- bakterielle ß-Laktamase- bacterial ß-lactamase
- bakterielle Cytosine Deaminase- bacterial cytosine deaminase
- humane Catalase bzw. Peroxidase- Human catalase or peroxidase
- Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase- Phosphatase, in particular human alkaline phosphatase, human acidic prostate phosphatase or type 5 acidic phosphatase
- Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase- Oxidase, in particular human lysyloxidase or human acidic D-aminooxidase
- Peroxidase, im besonderen humane Glutathion Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase- Peroxidase, in particular human glutathione peroxidase, human eosinophil peroxidase or human thyroid peroxidase
- Galaktosidase- galactosidase
b) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen b.1 ) Zielzellen:b) Therapy of autoimmune diseases and inflammation b.1) Target cells:
- proliferierende Endothelzellen oder- proliferating endothelial cells or
- Makrophagen und/oder Lymphozyten oder- macrophages and / or lymphocytes or
- Synovialzellen- synovial cells
b.2) Effektoren zur Therapie von Allergien, zum Beispielb.2) Effectors for the treatment of allergies, for example
- IFNß- IFNß
- IFNγ- IFNγ
- IL-10- IL-10
- Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4- Antibodies or antibody fragments against IL-4
- lösliche IL-4-Rezeptoren - IL-12- soluble IL-4 receptors - IL-12
- TGFß b.3) Effektoren zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel- TGFß b.3) effectors to prevent rejection of transplanted organs, for example
- IL-10- IL-10
- TGFß- TGFß
- lösliche IL-1 -Rezeptoren- soluble IL-1 receptors
- lösliche IL-2-Rezeptoren- soluble IL-2 receptors
- IL-1-Rezeptorantagonisten- IL-1 receptor antagonists
- lösliche IL-6-Rezeptoren- soluble IL-6 receptors
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL- Fragmente.- immunosuppressive antibodies or their VH and VL-containing fragments or their VH and VL fragments connected via a linker.
Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1 -Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1 , CD28 oder CD40Immunosuppressive antibodies are, for example, antibodies specific for the T cell receptor or its CD3 complex, against CD4 or CD8 furthermore against the IL-2 receptor, IL-1 receptor or IL-4 receptor or against the adhesion molecules CD2, LFA-1, CD28 or CD40
b.4) Effektoren für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispielb.4) Effectors for the therapy of antibody-mediated autoimmune diseases, for example
- TGFß- TGFß
- IFNα- IFNα
- IFNß- IFNß
- IFNγ- IFNγ
- IL-12- IL-12
- lösliche IL-4-Rezeptoren- soluble IL-4 receptors
- lösliche IL-6-Rezeptoren- soluble IL-6 receptors
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL-enthaltende Fragmente- immunosuppressive antibodies or their VH and V L -containing fragments
b.5) Effektoren für die Therapie von zellmediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel - IL-6b.5) Effectors for the therapy of cell-mediated autoimmune diseases, for example - IL-6
- IL-9- IL-9
- IL-10- IL-10
- IL-13- IL-13
- TNFα oder TNFß- TNFα or TNFß
- IL-13- IL-13
- einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL-enthaltende Fragmente- an immunosuppressive antibody or its VH and V L -containing fragments
b.6) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika Beispiele für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt a.7) aufgeführt.b.6) Effectors: inhibitors of cell proliferation, cytostatic or cytotoxic proteins and enzymes for the activation of precursors of cytostatics. Examples of such proteins are already listed in section a.7).
b.7) Effektoren für die Therapie der Arthritisb.7) Effectors for the therapy of arthritis
Im Sinne der Erfindung werden Effektoren ausgewählt, die die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmen und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördern.For the purposes of the invention, effectors are selected which directly or indirectly inhibit the inflammation in the joint, for example, and / or promote the reconstitution of extracellular matrix (cartilage, connective tissue) in the joint.
Hierzu gehören zum BeispielThese include, for example
- IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA); IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, ß- IL-1 receptor antagonist (IL-1-RA); IL-1-RA inhibits the binding of IL-1α, ß
- löslicher IL-1 -Rezeptor; löslicher IL-1 -Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1- soluble IL-1 receptor; soluble IL-1 receptor binds and inactivates IL-1
- IL-6- IL-6
IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und ChondrozytenIL-6 increases the secretion of TIMP and superoxides and decreases the secretion of IL-1 and TNFα by synovial cells and chondrocytes
- löslicher TNF-Rezeptor löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.- soluble TNF receptor soluble TNF receptor binds and inactivates TNF.
- IL-4- IL-4
IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFα und MMP - IL-10IL-4 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNFα and MMP - IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFσ und MMP und erhöht die Sekretion von TIMPIL-10 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNFσ and MMP and increases the secretion of TIMP
- Insulin-like growth factor (IGF-1 )- insulin-like growth factor (IGF-1)
IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.IGF-1 stimulates the synthesis of extracellular matrix.
- TGFß, im speziellen TGFßl und TGFß2- TGFß, especially TGFßl and TGFß2
TGFß stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.TGFß stimulates the synthesis of extracellular matrix.
- Superoxiddismutase- superoxide dismutase
- TIMP, im speziellen TIMP-1 , TIMP-2 oder TIMP-3- TIMP, in particular TIMP-1, TIMP-2 or TIMP-3
c) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes c.1 ) Zielzelien:c) Therapy of deficient formation of blood cells c.1) Target cells:
- proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder- proliferating, immature cells of the hematopoietic system or
- Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen- Stromal cells adjacent to the hematopoietic cells
c.2) Effektoren für die Therapie der Anämie, zum Beispielc.2) effectors for the therapy of anemia, for example
- Erythropoietin- erythropoietin
c.3) Effektoren für die Therapie der Leukopenie, zum Beispielc.3) Effectors for the therapy of leukopenia, for example
- G-CSF- G-CSF
- GM-CSF- GM-CSF
- M-CSF- M-CSF
c.4) Effektoren für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispielc.4) Effectors for the therapy of thrombocytopenia, for example
- IL-3- IL-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)- Leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-11- IL-11
- Thrombopoietin- thrombopoietin
d) Therapie von Schäden des Nervensystems d.1) Zielzellen:d) Therapy of damage to the nervous system d.1) Target cells:
- Gliazellen oder - proliferierende Endothelzellen- glial cells or - proliferating endothelial cells
d.2) Effektoren: neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispield.2) effectors: neuronal growth factors, for example
- FGF- FGF
- Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)- Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
- Neurotrophin-3 (NT-3)- Neurotrophin-3 (NT-3)
- Neurotrophin-4 (NT-4)- Neurotrophin-4 (NT-4)
- Ciliary neurotrophic factor (CNTF)- Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
d.3) Effektoren: Enzyme, zum Beispield.3) effectors: enzymes, for example
- Tyrosinhydroxylase- tyrosine hydroxylase
- Dopadecarboxylase- dopadecarboxylase
d.4) Effektoren: Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispield.4) effectors: cytokines and their inhibitors which inhibit or neutralize the neurotoxic effect of TNFα, for example
- TGFß- TGFß
- lösliche TNF-Rezeptoren TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα- soluble TNF receptors TNF receptors neutralize TNFα
- IL-10- IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4IL-10 inhibits the formation of IFNγ, TNFα, IL-2 and IL-4
- lösliche IL-1 -Rezeptoren- soluble IL-1 receptors
- I L-1 -Rezeptor I- I L-1 receptor I
- I L-1 -Rezeptor II lösliche I L-1 -Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1- I L-1 receptor II soluble I L-1 receptors neutralize the activity of IL-1
- IL-1-Rezeptor-Antagonist- IL-1 receptor antagonist
- lösliche IL-6-Rezeptoren- soluble IL-6 receptors
e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems e.1 ) Zielzellen:e) Therapy of disorders of the blood coagulation and blood circulation system e.1) Target cells:
- Endothelzellen oder - proliferierende Endothelzellen oder- endothelial cells or - proliferating endothelial cells or
- somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder- somatic cells in the vicinity of endothelial cells and smooth muscle cells or
- Makrophagen- macrophages
e.2) Zielstrukturen: Proteine des Blutgerinnungssystems wie beispielsweisee.2) Target structures: proteins of the blood coagulation system such as
- Thrombin- thrombin
- Fibrin- fibrin
e.3) Effektoren für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiele.3) effectors for inhibiting coagulation or for promoting fibrinolysis, for example
- Tissue Plasminogen Activator (tPA)- Tissue plasminogen activator (tPA)
- Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)- Urokinase-type plasminogen activator (uPA)
- Hybride von tPA und uPA- Hybrid of tPA and uPA
- Protein CProtein C
- Hirudin- Hirudin
- Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1 S-lnhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III- Serine proteinase inhibitors (serpins), such as C-1 S inhibitor, α1-antitrypsin or antithrombin III
- Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)- Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
e.4) Effektoren für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiele.4) Effectors for promoting coagulation, for example
- F VIII- F VIII
- F IX- F IX
- von Willebrand factor- from Willebrand factor
- F XIII- F XIII
- PAI-1- PAI-1
- PAI-2- PAI-2
- Tissue Factor and Fragmente hiervon- Tissue factor and fragments thereof
e.5) Effektoren: Angiogenesefaktoren, zum Beispiele.5) Effectors: angiogenesis factors, for example
- VEGF - FGF- VEGF - FGF
- Tie-1- Tie-1
- Tie-2- Tie-2
e.6) Effektoren für die Blutdrucksenkung, zum Beispiele.6) effectors for lowering blood pressure, for example
- Kallikrein- Kallikrein
- Endothelzell "nitric oxide synthase"- endothelial cell "nitric oxide synthase"
e7) Effektoren für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiele7) Effectors for inhibiting the proliferation of smooth muscle cells after injuries to the endothelial layer, for example
- ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder- an antiproliferative, cytostatic or cytotoxic protein or
- ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (Abschnitt a.7) aufgeführt- an enzyme for the breakdown of precursors of cytostatics into cytostatics as already listed above (section a.7)
e.8) Effektoren: weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiele.8) Effectors: other blood plasma proteins, for example
- C1-lnaktivator- C1 activator
- Serum Cholinesterase- serum cholinesterase
- Transferrin- Transferrin
- 1-Antritrypsin- 1-antitrypsin
f) Impfungen f.1 ) Zielzellen:f) vaccinations f.1) target cells:
- Muskelzellen oder- muscle cells or
- Makrophagen und/oder Lymphozyten- macrophages and / or lymphocytes
f.2) Effektoren für die Prophylaxe von Infektionserkrankungenf.2) Effectors for the prophylaxis of infectious diseases
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.The possibilities of producing effective vaccines by conventional means are limited.
Als Effektor ist ein vom Infektionserreger gebildetes Protein, Glykoprotein oder Lipoprotein, auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d.h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T- Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).A protein, glycoprotein or lipoprotein, formed by the infectious agent is selected as the effector Immune response, ie through antibody binding and / or through cytotoxic T lymphocytes leads to neutralization and / or to the killing of the pathogen. Such neutralization antigens are already used as vaccine antigens (see overview in Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden Neutralisationsantigene folgender Erreger eingesetzt:For the purposes of the invention, neutralization antigens of the following pathogens are preferably used:
- Influenza A-Virus- Influenza A virus
- HIV- HIV
- Tollwut-Virus- rabies virus
- HSV (Herpes Simplex Virus)- HSV (Herpes Simplex Virus)
- RSV (Respiratory Syncytial Virus)- RSV (Respiratory Syncytial Virus)
- Parainfluenza-Virus- Parainfluenza virus
- Rotavirus- rotavirus
- VZV (Varizella Zoster Virus)- VZV (Varizella Zoster Virus)
- CMV (Cytomegalo-Virus)- CMV (cytomegalo virus)
- Masern-Virus- measles virus
- HPV (Humanes Papillomvirus)- HPV (Human Papilloma Virus)
- HBV (Hepatitis B-Virus)- HBV (hepatitis B virus)
- HCV (Hepatitis C-Virus)- HCV (hepatitis C virus)
- HDV (Hepatitis D-Virus)- HDV (hepatitis D virus)
- HEV (Hepatitis E-Virus)- HEV (hepatitis E virus)
- HAV (Hepatitis A-Virus)- HAV (hepatitis A virus)
- Vibrio Cholera-Antigen- Vibrio cholera antigen
- Borrelia Burgdorferi- Borrelia Burgdorferi
- Helicobacter pylori- Helicobacter pylori
- Malaria-Antigen- malaria antigen
- Zu Effektoren im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch ein Antiidiotyp- Antikörper oder seine Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementarity determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.- Effectors within the meaning of the invention also include an anti-idiotype antibody or its antigen-binding fragments, whose antigen-binding structures (the "complementarity determining regions") Represent copies of the protein or carbohydrate structure of the neutralizing antigen of the infectious agent.
Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.Such anti-idiotype antibodies can replace carbohydrate antigens in particular in bacterial infectious agents.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.Such anti-idiotypic antibodies and their cleavage products have been described by Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) and Westerink and Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) are clearly described.
f.3) Effektoren: Tumorantigenef.3) Effectors: tumor antigens
- Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.- This includes antigens on tumor cells. Such antigens have been described, for example, by Sedlacek et al. (Contrib. To Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) and Contrib. To Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992)).
Weitere Beispiele stellen folgende Antigene bzw. für Antiidiotypantikörper korrespondierend mit folgenden Antigenen dar:The following antigens or, for anti-idiotypic antibodies, correspond to the following antigens:
- Sialyl Lewis- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden- Peptides on tumors that are recognized by T cells
- von Onkogenen exprimierte Proteine- proteins expressed by oncogenes
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer- blood group antigens and their precursors
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin- Antigens on the polymorphic epithelial mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen- Antigens on heat shock proteins
g) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen g.1 ) Zielzelle:g) the therapy of chronic infectious diseases g.1) target cell:
- Leberzelle- liver cell
- Lymphozyt und/oder Makrophage- lymphocyte and / or macrophage
- Epithelzelle - Endothelzelle- epithelial cell - endothelial cell
g.2) Effektoren beispielsweiseg.2) effectors, for example
- ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist.- a protein that has cytostatic, apoptotic or cytotoxic effects.
- ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.an enzyme that cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance.
g.3) Effektoren: antivirale Proteineg.3) Effectors: antiviral proteins
- antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNß, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 oder TGFß- antiviral cytokines and growth factors. These include, for example, IFNα, IFNß, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 or TGFß
- Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.Antibodies of a specificity which inactivates the respective virus or which produces fragments containing V H and V L or whose VH and V L fragments are linked via a linker, as already described.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:Antibodies against virus antigens include:
anti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLVanti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLV
Anti Coxsackie Virus anti Hantaan VirusAnti Coxsackie Virus anti Hantaan Virus
- ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:- a Rev binding protein. These proteins bind to the Rev-RNA and inhibit Rev-dependent post-transcriptional stages of retrovirus gene expression. Examples of Rev binding proteins are:
RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D Pseudogene von RBP1-8RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D pseudogenes of RBP1-8
g.4) Effektoren: antibakterielle Proteineg.4) Effectors: antibacterial proteins
Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegenAntibacterial proteins include, for example, antibodies that neutralize bacterial toxins or opsonize bacteria. For example, antibodies against
Meningokokken C oder B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureusMeningococcal C or B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureus
h) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Effektorenh) Combination of the same or different effectors
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind zwei unterschiedliche Komponenten d), welche zumindest eine additive Wirkung aufweisen, über die Komponenten b) und c) miteinander zu komplexieren.For the purposes of the invention, two different components d), which have at least one additive effect, are to be complexed with one another via components b) and c).
Im Sinne der Erfindung bevorzugt sind Kombinationen von Effektoren beispielsweise fürCombinations of effectors are preferred for the purposes of the invention, for example for
h.1 ) die Therapie von Tumorenh.1) the therapy of tumors
- gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische und/oder entzündungserregende Proteine oder- Same or different, cytostatic, apoptotic, cytotoxic and / or inflammatory proteins or
- gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums h.2) die Therapie von Autoimmunerkrankungen- Same or different enzymes for cleaving the precursor of a cytostatic h.2) the therapy of autoimmune diseases
- unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder- Different cytokines or receptors with a synergistic effect to inhibit the cellular and / or humoral immune response or
- unterschiedliche oder gleiche TIMPs- different or identical TIMPs
h.3) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutesh.3) the therapy of deficient formation of blood cells
- unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise IL-1 , IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin- Different, hierarchically consecutive cytokines, such as IL-1, IL-3, IL-6 or GM-CSF and erythropoietin, G-CSF or thrombopoietin
h.4) die Therapie von Nervenzellschädenh.4) the therapy of nerve cell damage
- ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokinsa neuronal growth factor and a cytokine or the inhibitor of a cytokine
h.5) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystemsh.5) the therapy of disorders of the blood coagulation and blood circulation system
- ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z.B. tPA oder uPA) oder- an antithrombotic and a fibrinolytic (e.g. tPA or uPA) or
- ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum- a cytostatic, apoptotic or cytotoxic protein and an antithrombotic or fibrinolytic
- mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX- Several different, synergistic blood coagulation factors, for example F VIII and vWF or F VIII and F IX
h.6) Impfungenh.6) Vaccinations
- ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise IL- 1α, IL-1 ß, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptoran antigen and an immunostimulating cytokine, such as IL-1α, IL-1β, IL-2, GM-CSF, IL-3 or IL-4 receptor
- unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder- Different antigens of an infectious agent or different infectious agents or
- unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen- Different antigens of a tumor type or different tumor types
h.7) Therapie von viralen Infektionserkrankungen - ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Proteinh.7) Therapy of viral infectious diseases - an antiviral protein and a cytostatic, apoptotic or cytotoxic protein
- Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren- Antibodies against different surface antigens of a virus or several viruses
h.8) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungenh.8) Therapy of bacterial infectious diseases
- Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes- Antibodies against different surface antigens and / or toxins of a germ
4. Multifunktioneller Ligand für virale und nichtvirale Vektoren zur Gentherapie4. Multifunctional ligand for viral and non-viral vectors for gene therapy
Multifunktionelle Liganden wurden bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 846 772 ausführlich beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird ausdrücklich Bezug genommen.Multifunctional ligands have already been described in detail in patent application EP-A 0 846 772. Reference is expressly made to this patent application.
Bei Verwendung als multifunktioneller Ligand ist eine Komponente a) auszuwählen, welche gegen eine zelluläre Zielstruktur gerichtet ist. Beispiele für Liganden (Komponente a) spezifisch für zelluläre Zielstrukturen sind im Abschnitt 3) bereits aufgeführt worden.When used as a multifunctional ligand, a component a) must be selected which is directed against a cellular target structure. Examples of ligands (component a) specific for cellular target structures have already been listed in section 3).
In einem multifunktionellen Liganden ist der Effektor (Komponente d) so auszuwählen, daß er an einen viralen Vektor oder an einen nichtviralen Vektor bindet. Derartige Effektoren sind beispielsweise:In a multifunctional ligand, the effector (component d) should be selected so that it binds to a viral vector or to a non-viral vector. Such effectors are for example:
- ein zellulärer Rezeptor für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HJVa cellular receptor for a virus, such as for AdV, AAV, a lentivirus, an RTV, vaccinia virus, HSV, influenza virus, HJV
- ein rekombinanter Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab)2> Fab, rec. Fv, Diabody oder einzel kettiges, doppelantigenbindendes Protein- a recombinant antibody specific for a virus protein, for a non-viral vector or for a nucleic acid, such as an IgG, F (ab) 2> Fab, rec. Fv, diabody or single chain, double antigen binding protein
- ein Peptid mit einer reaktiven Gruppe zur Konjugation an ein Virusprotein- a peptide with a reactive group for conjugation to a virus protein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz Bevorzugterweise stellt die Komponente d) ein ganzes Antikörpermolekül oder ein Epitop-bindendes Fragment eines humanen Antikörpers dar.- A peptide with binding affinity to a defined nucleic acid sequence Component d) preferably represents a whole antibody molecule or an epitope-binding fragment of a human antibody.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 )) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente und rekombinante Fv-Fragmente werden entsprechend dem Stand der Technik, und wie bereits beschrieben, hergestellt.The murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Antibody fragments and recombinant Fv fragments are produced in accordance with the prior art and as already described.
Ob ein bivalentes oder ein monovalentes Fragment Verwendung findet, ist von der Wahl der Antikörperspezifität und des Genkonstruktes abhängig. Wenn der gewählte Antikörper die Fusionsaktivität des Hüllproteins eines viralen Genkonstruktes beeinträchtigt (wie z.B. von Ubol et al. (J. Virol. 69 1990 (1995)) beschrieben), so ist ein monovalentes Antikörperfragment zu bevorzugen.Whether a bivalent or a monovalent fragment is used depends on the choice of the antibody specificity and the gene construct. If the selected antibody interferes with the fusion activity of the coat protein of a viral gene construct (as described, for example, by Ubol et al. (J. Virol. 69 1990 (1995)), a monovalent antibody fragment is preferred.
Die Spezifität des Antikörpers richtet sich nach der Art des verwendeten Genkonstruktes.The specificity of the antibody depends on the type of gene construct used.
- Ist das Genkonstrukt ein nackte RNA oder eine nackte DNA alleine oder im Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine der erfindungsgemäßen Ausführungsformen dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen solche Epitope, welche in die DNA eingeführt wurden.If the gene construct is a naked RNA or a naked DNA alone or in complex with a non-viral carrier, one of the embodiments of this invention according to the invention is that the specificity of the antibody is directed against those epitopes which have been introduced into the DNA.
Derartige Epitope können erzeugt werden durch Bindung von xenogenen Substanzen an die DNA. Beispiele hierfür sindSuch epitopes can be generated by binding xenogenic substances to the DNA. examples for this are
* Kreuzvernetzungen der DNA durch Cisplatin* Cross-linking of DNA through cisplatin
* Alkylierung am N7 von Guanin durch Alkylantien wie Nitrogen-Mustard, Melphalan, Chlorambucil* Alkylation on N 7 of guanine by alkylating agents such as nitrogen mustard, melphalan, chlorambucil
* Interkalation in die Doppelhelix der DNA von Anthracyclinen wie Doxorubicin, Daunomycin Monokionale Antikörper gegen derartige neu eingeführte Epitope auf der DNA sind beispielsweise:* Intercalation in the double helix of the DNA of anthracyclines such as doxorubicin, daunomycin Monocional antibodies against such newly introduced epitopes on the DNA are for example:
- Antikörper gegen methylierte DNA- Antibodies against methylated DNA
- Antikörper gegen O6-ethyl deoxyguanosin (nach Behandlung der DNA mit Ethylnitrosoharnstoff)- Antibodies against O 6 -ethyl deoxyguanosine (after treating the DNA with ethyl nitrosourea)
- Antikörper gegen N7-ethylguanin- Antibodies against N 7 -ethylguanine
- Antikörper gegen N5-methyl-N5-formyl-2,5,6-triamino-4-hydroxy pyrimidine- Antibodies against N 5 -methyl-N 5 -formyl-2,5,6-triamino-4-hydroxy pyrimidine
- Antikörper gegen 06-methyl-2'-deoxyguanosin- Antibodies against 0 6 -methyl-2'-deoxyguanosine
06-ethyl-2'-deoxyguanosin0 6- ethyl-2'-deoxyguanosine
O6-n-butyl-2'-deoxyguanosinO 6 -n-butyl-2'-deoxyguanosine
O6-isopropyl-2'-deoxyguanosinO 6 -isopropyl-2'-deoxyguanosine
O4-methyl-2'-deoxythymidinO 4 -methyl-2'-deoxythymidine
O4-ethyl-2'-deoxythymidinO 4 -ethyl-2'-deoxythymidine
- Antikörper gegen Melphalan Addukte mit DNA- Antibodies against Melphalan adducts with DNA
- Antikörper gegen Anthracycline- Antibodies against anthracyclines
Neue Epitope in die DNA entstehen jedoch auch durch Methylierung der DNA im Rahmen des DNA-Stoffwechsels.However, new epitopes in the DNA also arise from the methylation of the DNA as part of the DNA metabolism.
Von einer Reihe von E. coli Stämmen ist bekannt, daß sie die DNA der in sie eingeführten Plasmide am N6 des Adenins methylieren (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). Bakterien besitzen das Enzym DNA-Adenin-Methylase, das während der Replikation spezifisch Adenine an der N6-Position methyliert (Hartman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)).A number of E. coli strains are known to methylate the DNA of the plasmids introduced into them at N 6 of adenine (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). Bacteria have the enzyme DNA adenine methylase, which specifically methylates adenines at the N 6 position during replication (Hartman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)).
Ein besonderer Gegenstand dieser Erfindung ist somit die Verwendung vom monoklonalen Antikörpern gegen methylierte DNA - im besonderen gegen methyliertes N6 des Adenins - im erfindungsgemäßen Ligandensystem. Ist das Genkonstrukt in Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine weitere besondere Ausführungsform dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen ein Epitop auf dem Träger.A particular subject of this invention is thus the use of monoclonal antibodies against methylated DNA - in particular against methylated N 6 of adenine - in the ligand system according to the invention. If the gene construct is complex with a non-viral carrier, a further particular embodiment of this invention is that the specificity of the antibody is directed against an epitope on the carrier.
Zu diesen Trägern gehören kationische Polymere, Peptide, Proteine, Polyamine oder kationische Lipide wie beispielsweise kationische Lipide und Phospholipide. Beispiele für Antikörper gegen derartige Träger sindThese carriers include cationic polymers, peptides, proteins, polyamines or cationic lipids such as cationic lipids and phospholipids. Examples of antibodies against such carriers are
* Antikörper gegen Spermidin, Spermin oder Putrescin* Antibodies against spermidine, spermine or putrescine
* Antikörper gegen Polylysin* Antibodies against polylysine
* Antikörper gegen Albumin* Antibodies against albumin
* Antikörper gegen Phospholipid* Antibodies against phospholipid
* Antikörper gegen Polyethylenimin* Antibodies against polyethyleneimine
Ist das Genkonstrukt ein Virus, so ist die Spezifität des Antikörpers gerichtet gegen ein oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Epitope auf den Hüllproteinen des Virus. Da der Linker im verwendeten Ligandensystem bevorzugterweise ein fusiogenes Peptid oder Protein darstellt, können auch Antikörper verwendet werden, welche durch Bindung an das Hüllprotein die Zelladhäsion und/oder die fusiogene Aktivität des Virus beeinträchtigen.If the gene construct is a virus, the specificity of the antibody is directed against one or more identical or different epitopes on the envelope proteins of the virus. Since the linker in the ligand system used is preferably a fusiogenic peptide or protein, it is also possible to use antibodies which, by binding to the coat protein, impair the cell adhesion and / or the fusiogenic activity of the virus.
Antikörper gegen Hüllproteine von Viren, die als Vektoren Verwendung finden können, sind beispielsweise Antikörper gegen dasAntibodies against the envelope proteins of viruses which can be used as vectors are, for example, antibodies against the
* murine Leukämie Virus* murine leukemia virus
* HIV-Virus* HIV virus
* Adenovirus* Adenovirus
* Herpes Simplex Virus* Herpes Simplex Virus
* Cytomegalovirus* Cytomegalovirus
* Minute Virus of mice* Minute virus of mice
* adenoassoziiertes Virus* adeno-associated virus
* Sindbis-Virus * Vaccinia Virus* Sindbis virus * Vaccinia virus
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Komponente d) den zellexternen Teil eines Fc-Rezeptors dar. An diesen Fc-Rezeptor bindet über sein Fc-Teil einer der bereits erwähnten Antikörper, welcher mit seinem antigenbindenden Teil direkt oder indirekt an das Genkonstrukt bindet.In a further preferred embodiment of the invention, component d) represents the cell-external part of an Fc receptor. One of the antibodies mentioned above binds to this Fc receptor via its Fc part, which binds directly or indirectly to the gene construct with its antigen-binding part .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Komponente d) eine kationische Struktureinheit, wie beispielsweise eine kationische Aminosäure, ein kationisches Peptid oder Protein oder ein biogenes Amin dar, welche mit dem Genkonstrukt komplexieren können.In a further preferred embodiment, component d) is a cationic structural unit, such as a cationic amino acid, a cationic peptide or protein or a biogenic amine, which can complex with the gene construct.
Zu diesen kationischen Struktureinheiten gehören beispielsweise:These cationic structural units include, for example:
- Lysin oder Polylysin- lysine or polylysine
- Arginin oder Polyarginin- arginine or polyarginine
- Histidin oder Polyhistidin- histidine or polyhistidine
- Peptide enthaltend mindestens 1 Lysin, 1 Arginin und/oder 1 Histidin- Peptides containing at least 1 lysine, 1 arginine and / or 1 histidine
- Polyamine wie beispielsweise Cadaverin, Spermidin, Spermin, Agmatin oder Putrescin- Polyamines such as cadaverine, spermidine, spermine, agmatine or putrescine
In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform stellt die Komponente d) den Rezeptor für das Hüllprotein des das Transgen beherbergenden Virus dar.In a further preferred embodiment, component d) is the receptor for the coat protein of the virus harboring the transgene.
Derartige Rezeptoren sind beispielsweise für folgende Viren beschrieben worden:Such receptors have been described, for example, for the following viruses:
- HIV- HIV
* das CD4-Molekül (löslich oder nativ)* the CD4 molecule (soluble or native)
* Galactosylceramid* Galactosylceramide
* Rezeptoren für Chemokine* Chemokine receptors
- HBV- HBV
* der IL-6 Rezeptor * Annexin oder Apolipoprotein* the IL-6 receptor * Annexin or apolipoprotein
- HTLV- HTLV
* der IL-2 Rezeptor (die ß- wie auch die γ-Kette)* the IL-2 receptor (the ß as well as the γ chain)
- Masern Virus- measles virus
* das CD46 Molekül* the CD46 molecule
- Friend Leukemia Virus- Friend Leukemia Virus
* der Erythropoietin Rezeptor* the erythropoietin receptor
- Varizella Zoster- Varizella zoster
* das Fc-Fragment von humanem Immunglobulin G* the Fc fragment of human immunoglobulin G
- Sendai Virus- Sendai virus
* das Glycophorin* the glycophorin
- Influenza C-Virus- Influenza C virus
* die N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminsäure* the N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminic acid
* die 9-ß-acetyl-N-acetyl-neuraminsäure* 9-ß-acetyl-N-acetyl-neuraminic acid
- Foot and Mouth Disease Virus- Foot and Mouth Disease Virus
* das integrin αVß3* the integrin αVß3
- EBV- EBV
* der Complement Rezeptor 2 (CD21 )* the complement receptor 2 (CD21)
- Herpes Simplex Virus- Herpes simplex virus
* der 275-kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder der 46-kDa Mannose-6- Phosphat-Rezeptor* the 275-kDa mannose-6-phosphate receptor or the 46-kDa mannose-6-phosphate receptor
- adenovirales Virus- adenoviral virus
* der CAR (Cocksackie-Adenovirus-Rezeptor)* the CAR (cocksackie adenovirus receptor)
5. Einfügung eines fusiogenen Peptids oder eines Translokalisationspeptids5. Insertion of a fusiogenic peptide or a translocalization peptide
Bei multivalenten Proteinkomplexen, bei denen der Effektor (Komponente d) intrazellulär einzudringen hat, um prophylaktisch oder therapeutisch zu wirken oder die als multifunktionelle Liganden einen Vektor in das Zytoplasma einer Zelle einführen sollen, ist dem Effektor ein fusiogenes Peptid anzufügen. Dieses fusiogene Peptid kann zwischen der Komponente c) und d) eingefügt oder der Komponente d) angefügt werden. Zu den fusiogenen Peptiden gehören beispielsweise:In the case of multivalent protein complexes in which the effector (component d) has to penetrate intracellularly in order to have a prophylactic or therapeutic effect or which are intended to introduce a vector into the cytoplasm of a cell as multifunctional ligands, a fusiogenic peptide must be added to the effector. This fusiogenic Peptide can be inserted between component c) and d) or added to component d). The fusiogenic peptides include, for example:
- Peptide enthaltend die Translokationsdomäne (Domäne II) des Exotoxins A von Pseudomonas- Peptides containing the translocation domain (domain II) of exotoxin A from Pseudomonas
- Peptide enthaltend das Peptid GLFEALLELLESLWELLLEA (SEQ ID NO.: 1)- Peptides containing the peptide GLFEALLELLESLWELLLEA (SEQ ID NO .: 1)
- Peptide enthaltend das Peptid- Peptides containing the peptide
- AALAEA[LAEA]4LAAAAGC (SEQ ID NO.: 2)- AALAEA [LAEA] 4 LAAAAGC (SEQ ID NO .: 2)
- Peptide enthaltend das Peptid FAGV-VLAGAALGVAAAAQI (SEQ ID NO.: 3) des Fusionsproteins des Masern-Virus- Peptides containing the peptide FAGV-VLAGAALGVAAAAQI (SEQ ID NO .: 3) of the fusion protein of the measles virus
- Peptide enthaltend das Peptid GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (SEQ ID NO.: 4) des HA2 Proteins von Influenza A- Peptides containing the peptide GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (SEQ ID NO .: 4) of the HA2 protein from influenza A
- Peptide enthalten das Peptid GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO.: 5) oder das Peptid- Peptides contain the peptide GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO .: 5) or the peptide
GLFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 6)GLFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.6)
ALFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 7)ALFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.7)
LFLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 8)LFLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.8)
LLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 9)LLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.9)
LILGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 10)LILGAIAGFIE; (SEQ ID NO.10)
GIFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 11 )GIFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.11)
GLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 12)GLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.12)
GLFAAIAGFIE; (SEQ ID NO. 13)GLFAAIAGFIE; (SEQ ID NO.13)
GLFEAIAGFIE; (SEQ ID NO. 14)GLFEAAGFIE; (SEQ ID NO. 14)
GLFGAM/ÄGFIE; (SEQ ID NO. 15)GLFGAM / ÄGFIE; (SEQ ID NO.15)
GLFGAIAGLIE; (SEQ ID NO. 16)GLFGAIAGLIE; (SEQ ID NO.16)
GLFGAIAGFJV; (SEQ ID NO. 17) GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (SEQ ID NO.: 18) oder GLLEALAELLEGGWEGLLEG (SEQ ID NO.: 19).GLFGAIAGFJV; (SEQ ID NO.17) GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (SEQ ID NO .: 18) or GLLEALAELLEGGEGEGLLEG (SEQ ID NO .: 19).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden desweiteren Proteine von Viren verwendet, welche fusiogene Eigenschaften haben. Eine Reihe von Viren besitzt fusiogene und/oder translozierende Hüllproteine, so beispielsweise Paramyxoviren, Retroviren und Herpesviren. Hierzu gehören beispielsweise das TAT-Protein von HIV oder dessen translokalisierende Aminosäuresequenz oder das VP22-Protein von HSV.In the context of the present invention, proteins of viruses which have fusiogenic properties are also used. A number of viruses have fusiogenic and / or translocating coat proteins, such as paramyxoviruses, retroviruses and herpes viruses. These include, for example, the TAT protein from HIV or its translocalizing amino acid sequence or the VP22 protein from HSV.
Eine Reihe von Viren besitzen des weiteren Glykoproteine, die verantwortlich sind sowohl für die Virusanheftung als auch nachfolgend für die Zellmembranfusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).A number of viruses also have glycoproteins which are responsible both for virus attachment and subsequently for cell membrane fusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
Derartige Proteine werden beispielsweise von Alpha-, Rhabdo- und Orthomyxoviren gebildet.Such proteins are formed, for example, by alpha, rhabdo and orthomyxoviruses.
Virale fusiogene Proteine im Sinne der Erfindung wurden übersichtlich beschrieben von Hughson (Curr. Biol. 5, 265 (1995)), Hoekstra (J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675 (1990)), und White (Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)).Viral fusiogenic proteins in the sense of the invention have been clearly described by Hughson (Curr. Biol. 5, 265 (1995)), Hoekstra (J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675 (1990)), and White (Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)).
Fusiogene Proteine im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise:Fusiogenic proteins in the sense of this invention are, for example:
- das Haemagglutinin von Influenza A- oder B-Viren, insbesondere die HA2-Kom- ponente- the hemagglutinin from influenza A or B viruses, in particular the HA2 component
- das M2-Protein von Influenza A-Viren alleine oder in Kombination mit dem Haemagglutinin des Influenza-Virus eingesetzt oder mit Mutanten von Neuraminidase von Influenza A, denen die Enzymaktivität fehlt, die jedoch Haemagglutination bewirken.- The M2 protein of influenza A viruses used alone or in combination with the hemagglutinin of the influenza virus or with mutants of neuraminidase from influenza A which lack enzyme activity but which do cause hemagglutination.
- Peptidanaloga des Influenza-Virus Haemagglutinins - peptide analogues of the influenza virus haemagglutinin
6. Einfügung von Proteasespaltsequenzen6. Insertion of protease cleavage sequences
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multifunktionelle Proteinkomplexe, welche zwischen der Komponente a) und b) oder zwischen der Komponente c) und d) eine Peptidsequenz besitzen, welche für Proteasen spaltbar ist. Durch diese Proteasen kann der Effektor von dem Liganden (Komponente a) oder von dem Liganden und den mutierten Proteinen [Komponenten a), b) und c)] abgespalten werden und beispielsweise am Ort der Anreicherung der multivalenten Proteinkomplexe in freier Form seine Wirkung entfalten.The invention further relates to multifunctional protein complexes which have a peptide sequence between component a) and b) or between component c) and d) which is cleavable for proteases. By means of these proteases, the effector can be split off from the ligand (component a) or from the ligand and the mutated proteins [components a), b) and c)] and, for example, develop its effect in free form at the site of the enrichment of the multivalent protein complexes.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Spaltsequenzen, weiche durch Proteasen, die in Tumoren oder von Tumorzellen oder von Entzündungszellen gebildet werden, gespalten werden.The invention relates in particular to cleavage sequences which are cleaved by proteases which are formed in tumors or by tumor cells or by inflammatory cells.
Beispiele von Spaltsequenzen für die EnzymeExamples of cleavage sequences for the enzymes
- Plasminogenaktivator- plasminogen activator
- prostataspezifisches Antigen- prostate specific antigen
- Cathepsin- Cathepsin
- Stromelysin- Stromelysin
- Collagenase und- collagenase and
- Plasminogen sind in der Patentanmeldung EP-A 0 859 058 aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.- Plasminogen are listed in patent application EP-A 0 859 058, to which express reference is made.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkomplexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die von Viren gebildet werden, gespalten werden.The invention further relates to multivalent protein complexes with cleavage sequences which are cleaved by proteases which are formed by viruses.
Beispiele von Spaltsequenzen für Enzyme von Retroviren, Polioviren, Influenzaviren, Epstein-Barr Viren, Herpes Simplex Viren, Hepatitisviren, Pockenviren, Cytomegalieviren und Dengue Viren sind in der deutschen Patentanmeldung DE 198 50987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.Examples of cleavage sequences for enzymes from retroviruses, polioviruses, influenza viruses, Epstein-Barr viruses, herpes simplex viruses, hepatitis viruses, pox viruses, cytomegaloviruses and dengue viruses are in German patent application DE 198 50987.1 (not published) to which express reference is made.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkompiexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die in der Zelle freigesetzt werden können, gespalten werden.The invention furthermore relates to multivalent protein complexes with cleavage sequences which are cleaved by proteases which can be released in the cell.
Beispiele von derartigen Proteasen sind beispielsweise Caspasen, wie Caspasen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9.Examples of such proteases are, for example, caspases, such as caspases 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9.
Die zugehörigen Spaltsequenzen sind in der Patentanmeldung DE 198 50987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.The associated gap sequences are listed in patent application DE 198 50987.1 (not published), to which express reference is made.
7. Künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen7. Artificial transcription factors for controlling the expression of genes
In der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 sind aktivatorresponsive Promotoren beschrieben worden. Auf diese Erfindung wird in dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen. Diese aktivatorresponsiven Promotoren werden durch einen künstlichen Transkriptionsfaktor aktiviert, welcher im Prinzip aus zwei Aktivatorsubeinheiten besteht: die Subeinheit A und die Subeinheit B. Beide Subeinheiten enthalten Bindeproteine (A, B). In der EP-A 0 805 209 wurden Bindeproteine (A, B) ausgewählt, welche natürlicherweise den Komplex AB bilden, so daß die Subeinheit A sich mit der Subeinheit B zu einem funktionsfähigen Transkriptionsfaktorkomplex verbindet. Gegenstand der Erfindung sind nunmehr künstliche Transkriptionsfaktoren für aktivatorresponsive Promotoren, bei denen die Bindeproteine A+B mutierte Bindeproteine darstellen.Patent application EP-A 0 805 209 has described activator-responsive promoters. This invention is expressly referred to in this invention. These activator-responsive promoters are activated by an artificial transcription factor, which in principle consists of two activator subunits: subunit A and subunit B. Both subunits contain binding proteins (A, B). In EP-A 0 805 209 binding proteins (A, B) were selected which naturally form the complex AB, so that the subunit A combines with the subunit B to form a functional transcription factor complex. The invention now relates to artificial transcription factors for activator-responsive promoters in which the binding proteins A + B represent mutated binding proteins.
In der einfachsten Form besteht dieser künstliche Transkriptionfaktorkomplex aus folgenden Komponenten:In its simplest form, this artificial transcription factor complex consists of the following components:
Komponente a) mindestens einem Liganden für einen Reaktionspartner =Component a) at least one ligand for one reactant
Aktivierungsdomäne Komponente b) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente c) verbindetActivation domain Component b) mutates a binding protein in such a way that it binds exclusively to component c)
Komponente c) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente b) verbindetComponent c) mutates a binding protein such that it binds exclusively to component b)
Komponente d) mindestens einen Effektor = eine DNA-BindedomäneComponent d) at least one effector = a DNA binding domain
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Nukleinsäurekonstrukte, welche für einen Transkriptionsfaktorkomplex entsprechend dieser Erfindung kodieren. Die Expression dieses Nukleinsäurekontruktes steht hierbei unter der Kontrolle von Promotoren wie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.The invention further relates to nucleic acid constructs which code for a transcription factor complex according to this invention. The expression of this nucleic acid construct is under the control of promoters as listed in patent application EP-A 0 805 209, to which express reference is made.
8. Neue analytische und diagnostische Systeme8. New analytical and diagnostic systems
Gegenstand der Erfindung sind neue komplexbildende Proteine für analytische oder diagnostische Systeme zur qualitativen oder quantitativen Analyse oder Diagnose eines Reaktionspartners.The invention relates to new complex-forming proteins for analytical or diagnostic systems for qualitative or quantitative analysis or diagnosis of a reaction partner.
In solchen diagnostischen Systemen stelle die Komponente a) mindestens einen Liganden dar, welche eine spezifische Bindung mit dem zu analysierenden Reaktionspartner eingeht. Dieser Ligand ist direkt oder indirekt verbunden mit mindestens einem mutierten Bindeprotein [ Komponenten b)1-b)n], so daß sich die Komponente ab ergibt. Des weiteren ist mindestens ein mutiertes Bindeprotein [Komponente c)1-c)n], welches mit der Komponente b) über mindestens zwei Bindestellen dimerisieren kann, verbunden mit mindestens einem Effektor (Komponente c), wobei dieser Effektor eine signalgebende Substanz (Analyten) darstellt. Aus der Verbindung der Komponente b) mit der Komponente c) ergibt sich die Komponente cd.In such diagnostic systems, component a) represents at least one ligand which forms a specific bond with the reaction partner to be analyzed. This ligand is directly or indirectly connected to at least one mutated binding protein [components b) 1-b) n], so that the component results. Furthermore, at least one mutated binding protein [component c) 1-c) n], which can dimerize with component b) via at least two binding sites, is connected to at least one effector (component c), this effector being a signaling substance (analyte) represents. The component cd results from the connection of component b) with component c).
Die Komponente ab bindet über a) an den Reaktionspartner. Durch Komplexbildung der Komponente ab mit der Komponente bc läßt sich die Menge des Reaktionspartners, an welchen die Komponente ab über Komponente a) gebunden ist, ermitteln.The component ab binds via a) to the reaction partner. By complexing the component ab with the component bc, the amount of Determine the reactant to which the component is bound via component a).
Dieses diagnostische System kann beispielsweise in den zwei aufgeführten Ausführungsformen (siehe Figur 1 und 2) verwendet werden:This diagnostic system can be used, for example, in the two listed embodiments (see FIGS. 1 and 2):
In der ersten Ausführungsform (siehe Figur 1 ) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)multimer dar [Komponente b)1-b)n], an welche viele gleiche (oder unterschiedliche) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.In the first embodiment (see FIG. 1), component b) is a homo- (or hetero-) multimer [component b) 1-b) n], to which many identical (or different) components c) are each present as a monomer and bind each connected to component d).
Mit dieser Ausführungsform werden viele signalgebende Komponenten [Analyten, Komponente d)] an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, was die Empfindlichkeit des Systems steigert.With this embodiment, many signaling components [analyte, component d)] are bound to the reaction partner to be analyzed, which increases the sensitivity of the system.
In der zweiten Ausführungsform (siehe Figur 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität des Nachweises von dem zu analysierenden Reaktionspartners erhöhen kann.In the second embodiment (see FIG. 2), both component b) and component c) are multimers, only one or a few components d) being bound to component c). With this embodiment, although only a few components d) are bound to the reaction partner to be analyzed, the binding between components c) and d) is extremely strong, which can increase the specificity of the detection of the reaction partner to be analyzed.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente c) [ci-cn] mit mindestens einer weiteren Komponente b [b bn] gebunden, an welche mindestens eine weitere Komponente cd dimerisieren kann. Ein Beispiel hierfür ist in Figur 1 b dargestellt.In a further particular embodiment of the invention, component c) [ci-cn] is bound to at least one further component b [b bn], to which at least one further component can dimerize cd. An example of this is shown in Figure 1 b.
Diese besondere Ausführungsform steigert die Empfindlichkeit des Testsystems beträchtlich. Mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen analytischen oder diagnostischen Systems kann ein Reaktionspartner in oder auf einer festen Phase, in einer Flüssigkeit, beispielsweise in einer Körperflüssigkeit, auf Zellen und in Geweben bestimmt werden.This particular embodiment significantly increases the sensitivity of the test system. With the help of this analytical or diagnostic system according to the invention, a reaction partner can be determined in or on a solid phase, in a liquid, for example in a body fluid, on cells and in tissues.
Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellen:According to the invention, component a) can represent:
- eine Nukleotidsequenz. Bei Wahl einer Nukleotidsequenz ist diese endständig so zu derivatisieren [beispielsweise entsprechend WO95/02422 oder durch Einfügung einer Bindesequenz für ein Nukleotidbindeprotein (wie beispielsweise für LexA, Gal4 oder für einen Transkriptionsfaktor) oder für einen Antikörper, daß an sie direkt oder indirekt über ein Nukleotidbindeprotein oder über einen antigenbindenden Teil eines Antikörpers die Komponente b) gekoppelt werden kann.- a nucleotide sequence. If a nucleotide sequence is selected, it must be derivatized at the end [for example in accordance with WO95 / 02422 or by inserting a binding sequence for a nucleotide binding protein (such as for LexA, Gal4 or for a transcription factor) or for an antibody that is directly or indirectly via a nucleotide binding protein or component b) can be coupled via an antigen-binding part of an antibody.
- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor- a ligand for a cellular receptor
- ein Virushüllprotein- a virus envelope protein
- einen zellulären Rezeptor für ein Virushüllprotein- a cellular receptor for a virus envelope protein
- einen zellulären Rezeptor für einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Peptidhormon, einen Mediator oder ein Steroida cellular receptor for a growth factor, a cytokine, a chemokine, a peptide hormone, a mediator or a steroid
- ein Protein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzyma protein which binds to a partner protein and thereby participates in a biological reaction chain, for example a complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system, of the fibrinolysis system or a plasmatic or cellular enzyme inhibitor or a plasmatic or cellular enzyme
- den extrazellulären Teil eines Fc-Rezeptors, an welchem ein Antikörper spezifisch für eine Zielzelle über seinen Fc-Teil gebunden wird- The extracellular part of an Fc receptor, to which an antibody is bound specifically for a target cell via its Fc part
- ein Antikörpermolekül oder der epitopbindende Teil eines murinen oder humanen Antikörpermoleküls.- an antibody molecule or the epitope-binding part of a murine or human antibody molecule.
Rekombinante Antikörperfragmente werden hergestellt wie bereits in Abschnitt 3) aufgeführt. In einem analytischen oder diagnostischen System gemäß der Erfindung kann die signalgebende Komponente, der Analyt (Komponente d) beispielsweise darstellen ein fluoreszierendes Molekül, ein Molekül, welches eine Chemolumineszenzreaktion auslöst, ein Enzym, wie beispielsweise eine Phosphatase oder Peroxydase zur Spaltung eines zu messenden Substrates, ein Isotop oder ein Metall.Recombinant antibody fragments are produced as already listed in section 3). In an analytical or diagnostic system according to the invention, the signaling component, the analyte (component d) can, for example, be a fluorescent molecule, a molecule that triggers a chemiluminescent reaction, an enzyme, such as a phosphatase or peroxidase for cleaving a substrate to be measured, an isotope or a metal.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen analytischen und diagnostischen Systems wird ein zu bestimmender Reaktionspartner vermischt mit einem Überschuß der Komponente ab. Der nicht an den zu bestimmenden Reaktionspartner gebundene Anteil von Komponente ab wird beispielsweise durch Waschen entfernt. Nachfolgend wird die an den Reaktionspartner gebundene Komponente ab mit einem Überschuß von Komponente cd versetzt, der nicht an die Komponente ab gebundene Anteil der Komponente bc beispielsweise durch Waschen entfernt und die an den Reaktionspartner über die Komponenten ab und c) gebundene Komponente d) bestimmt.With the help of the analytical and diagnostic system according to the invention, a reaction partner to be determined is mixed with an excess of the component. The portion of component ab not bound to the reaction partner to be determined is removed, for example, by washing. Subsequently, the component ab bound to the reactant is mixed with an excess of component cd, the portion of component bc not bound to the component ab is removed, for example by washing, and the component d) bound to the reactant via the components ab and c) is determined.
Beispiele zur Verdeutlichung des ErfindungsgegenstandesExamples to illustrate the subject matter of the invention
Herstellung und Prüfung einer Aktivator-responsiven PromotoreinheitProduction and testing of an activator-responsive promoter unit
Es wurde eine Aktivator-responsive Promotereinheit hergestellt, bei welcher sich eine Aktivatorsubeinheit A mit einer Aktivatorsubeinheit B (siehe Figur 3) verbindet. Die Verbindung erfolgt über mutiertes c-jun und mutiertes c-fos (siehe Figur 4). Der Komplex ist ein Transkriptionsfaktor, welcher einen Aktivator-responsiven Promoter aktiviert.An activator-responsive promoter unit was produced, in which an activator subunit A connects to an activator subunit B (see FIG. 3). The connection takes place via mutated c-jun and mutated c-fos (see FIG. 4). The complex is a transcription factor that activates an activator-responsive promoter.
Diese erfindungsgemäße Aktivator-responsive Promotereinheit besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen: Aktivatorsubeinheit A:This activator-responsive promoter unit according to the invention consists of the following different nucleotide sequences which follow one another downstream: Activator subunit A:
- der Promoter des Cyclin A Gens (Nukleinsäuren -214 bis +100; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995))- the promoter of the cyclin A gene (nucleic acids -214 to +100; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991 ))- the nuclear localization signal (NLS) of SV40 (SV40 Large T, amino acids 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO .: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (VP16, Aminosäuren 411 bis 455; Triezenberg et al., Genes Dev. 2, 718 (1988))the acidic transactivation domain (TAD) of HSV-1 VP16 (VP16, amino acids 411 to 455; Triezenberg et al., Genes Dev. 2, 718 (1988))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c-jun Proteins (Aminosäuren 276 bis 312; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 283, 288 und 302 mutiert sind (m-jun).- The cDNA for the leucine zipper part of the c-jun protein (amino acids 276 to 312; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in which the amino acids 283, 288 and 302 are mutated (m-jun).
Beschreibung der Mutationen (Figur 2): Aminosäure 283 K → E Aminosäure 288 K → E Aminosäure 302 R → EDescription of the mutations (Figure 2): amino acid 283 K → E amino acid 288 K → E amino acid 302 R → E
Aktivatorsubeinheit B:Activator subunit B:
- der Promoter des Tyrosinase Gens (2X die Enhancer Sequenz, Nukleinsäuren -2014 bis -1820 und der Kernpromotor Nukleinsäuren -209 bis +51 ; Shibata et al., J. Biol: Chem. 267, 20584 (1992))- the promoter of the tyrosinase gene (2X the enhancer sequence, nucleic acids -2014 to -1820 and the core promoter nucleic acids -209 to +51; Shibata et al., J. Biol: Chem. 267, 20584 (1992))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991 ))- the nuclear localization signal (NLS) of SV40 (SV40 Large T, amino acids 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO .: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins (Aminosäuren 1 bis 147, Chasman und Kornberg , Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990))- the cDNA for the DNA binding domain of the Gal4 protein (amino acids 1 to 147, Chasman and Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c-fos Proteins (Aminosäuren 160 bis 196; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 167, 172 und 181 mutierten sind (m-fos).- The cDNA for the leucine zipper part of the c-fos protein (amino acids 160 to 196; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in which amino acids 167, 172 and 181 are mutated (m-fos).
Beschreibung der Mutationen (Figur 2): Aminosäure 167 E → K Aminosäure 172 E → K Aminosäure 181 E → KDescription of the mutations (Figure 2): amino acid 167 E → K Amino acid 172 E → K amino acid 181 E → K
Dimerisierung von mutiertem c-fos mit mutiertem c-junDimerization of mutant c-fos with mutant c-jun
Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung des mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper.The expression products of the activator subunits A and B dimerize by binding the mutated c-fos leucine zipper to the mutated c-jun leucine zipper.
Die Dimerisierung der Aktivatorsubeinheiten A und B, d.h. die Bindung des mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper, wurde wie folgt geprüft:The dimerization of activator subunits A and B, i.e. the binding of the mutated c-fos leucine zipper to the mutated c-jun leucine zipper was tested as follows:
Die Proteine wurden in einem "in vitro transiation" System (TNT T7 quick coupled transcription/translation System, Promega, Madison, Wl) mit oder ohne (S35)- Methionin synthetisiert. Nachfolgend wurden die synthetisierten Proteine (m-jun- VP16 und m-fos-Gal4) im Verhältnis 1 :1 vermischt und die Komplexe gelelektrophoretisch getrennt und nach Immunpräzipitation mit einem Antikörper anti-GAL4 analysiert. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:The proteins were synthesized in an "in vitro transmission" system (TNT T7 quick coupled transcription / translation system, Promega, Madison, Wl) with or without (S 35 ) methionine. Subsequently, the synthesized proteins (m-jun-VP16 and m-fos-Gal4) were mixed in a 1: 1 ratio and the complexes were separated by gel electrophoresis and, after immunoprecipitation, analyzed with an anti-GAL4 antibody. The following results were achieved:
- Das Protein m-jun-VP16 kann sich mit dem Protein m-fos-GAL4 verbinden.- The protein m-jun-VP16 can combine with the protein m-fos-GAL4.
- Das Protein m-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein wt-fos-GAL4 und das Protein wt-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein m-fosGAL4 verbinden (siehe Tabelle 1 ).- The protein m-jun-VP16 cannot combine with the protein wt-fos-GAL4 and the protein wt-jun-VP16 cannot combine with the protein m-fosGAL4 (see Table 1).
Das dimere Protein stellt einen Chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator- responsiven Promotor 10x (Gal4-SV40) dar.The dimeric protein represents a chimeric transcription factor for the activator-responsive promoter 10x (Gal4-SV40).
Aktivator-responsiver Promotor und das EffektorsystemActivator-responsive promoter and the effector system
Der Aktivator-responsive Promotor hat folgende Zusammensetzung: - 10x die Bindesequenz für Gal4-Bindeprotein mit der Nukleotidsequenz 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3' (Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEQ ID NO.:21)The activator-responsive promoter has the following composition: 10x the binding sequence for Gal4 binding protein with the nucleotide sequence 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3 '(Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEQ ID NO.:21)
- der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191 ; Tooze (Ed). DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory))- the basal promoter of SV40 (nucleic acids 48 to 5191; Tooze (Ed). DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory))
- die cDNA für das Reportergen Luciferase (Luc) (Nordeen, BioTechniques 6, 454 (1988))- the cDNA for the reporter gene Luciferase (Luc) (Nordeen, BioTechniques 6, 454 (1988))
Die Reihenfolge der Nukleotidsequenzen und deren Aktivierungseinheiten ist in Figur 5 dargestellt.The sequence of the nucleotide sequences and their activation units is shown in FIG. 5.
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in den pGL3 Plasmidvektor (Promega; Madison, USA) einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt wird.The nucleotide construct thus produced is cloned into the pGL3 plasmid vector (Promega; Madison, USA), which is used directly or in colloidal dispersion systems for in vivo application.
Die Funktionsweise der gesamten Aktivator-responsiven Promotoreinheit ist wie folgt:The entire activator-responsive promoter unit works as follows:
Der Promotor Cyclin A reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNAs für die Aktivierungsdomäne von VP16 und den mutierten leucine Zipper von c-jun (Aktivierungsuntereinheit A) (Fig. 3)The cyclin A promoter regulates cell cycle-specific the transcription of the combined cDNAs for the activation domain of VP16 and the mutant leucine zipper of c-jun (activation subunit A) (FIG. 3)
Der Promotor Tyrosinase beschränkt die Transkription der kombinierten cDNAs für die Gal4-Bindungsdomäne, das NLS von SV40 und den mutierten leucine Zipper von c-fos auf Melanomzellen (Aktivierungsuntereinheit B) (Fig. 3).The tyrosinase promoter restricts the transcription of the combined cDNAs for the Gal4 binding domain, the NLS of SV40 and the mutant leucine zipper of c-fos to melanoma cells (activation subunit B) (FIG. 3).
Das dimere Protein stellt einen Chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator- responsiven Promotor (DNA-Sequenz für die Gal4-Bindedomäne/SV40 Promotor) und für die Transkription des Effektorgenes (= Reportergen = Luciferasegen) dar (Fig. 5). Die Herstellung des KonstruktesThe dimeric protein represents a chimeric transcription factor for the activator-responsive promoter (DNA sequence for the Gal4 binding domain / SV40 promoter) and for the transcription of the effector gene (= reporter gene = luciferase gene) (FIG. 5). The construction of the construct
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes und die Einfügung in ein Plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (Figur 6) erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzyme und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.The individual components of the construct are linked and inserted into a plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (FIG. 6) via suitable restriction sites which are carried out at the termini of the various elements via PCR amplification. The linkage takes place with the aid of enzymes and DNA ligases which are known to the person skilled in the art and are specific for the restriction sites. These enzymes are commercially available.
Mit den beschriebenen Plasmiden werden in Kultur gehaltene Tumorzellen (MeWo: Humanmelanom Zellen, PC3: Humanprostata Zellen) mit dem Fachmann bekannter Methode DOTAP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) transfiziert und die Menge an Luciferase produziert von den Zellen gemessen (Herber et al. , Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) und Jeröme et al., Hum. Gen. Ther., im Druck (1998)).With the plasmids described, tumor cells kept in culture (MeWo: human melanoma cells, PC3: human prostate cells) are transfected with the DOTAP method known to the person skilled in the art (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) and the amount of luciferase produced by the cells is measured (Herber et al. , Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) and Jerome et al., Hum. Gen. Ther., In press (1998)).
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden die Tumorzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert. BrdU-Einbau zeigt , daß sich MeWo und PC3 Zellen nach Methionientzug synchronisieren lassen (Jeröme et al., Hum. Gen. Ther., in press (1998)). To check the cell cycle specificity, the tumor cells are synchronized by withdrawing methionine over 48 hours in G0 / G1. BrdU incorporation shows that MeWo and PC3 cells can be synchronized after methionia deprivation (Jerome et al., Hum. Gen. Ther., In press (1998)).
ErgebnisseResults
Folgende Ergebnisse werden erzielt: in transfizierten MeWo und PC3 Zellen kann eine deutliche Zunahme der Luciferase im Vergleich mit nichttransfizierte Tumorzellen ermittelt werden (Tabellen 2 und 3).The following results are achieved: In transfected MeWo and PC3 cells, a significant increase in luciferase can be determined in comparison with non-transfected tumor cells (Tables 2 and 3).
Proliferierende MeWo (DNA>2S) bilden deutlich mehr Luciferase als in G0/G1 synchronisierte Tumorzellen (DNA = 2S) und als proliferierende PC3 Zellen (Tabellen 2 und 3).Proliferating MeWo (DNA> 2S) form significantly more luciferase than tumor cells synchronized in G0 / G1 (DNA = 2S) and as proliferating PC3 cells (Tables 2 and 3).
Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierte leucine Zipper enthalten, können nicht mit den endogenen c-fos und c-jun binden (Tabelle 2).Activator subunits A and B, which contain mutant leucine zippers, cannot bind to the endogenous c-fos and c-jun (Table 2).
Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierten leucine Zipper enthalten, sind durch die starke Bindung von dem mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c- jun leucine Zipper wirksamer als das System mit CD4 und LCK (Tabelle 2), im Detail beschrieben in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209.The activator subunits A and B, which contain mutant leucine zippers, are more effective than the system with CD4 and LCK (Table 2), described in detail in, by the strong binding of the mutant c-fos leucine zipper to the mutant c-jun leucine zipper of patent application EP-A 0 805 209.
Somit führt die beschriebene Aktivator-responsive Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zelizyklusabhängigen Expression des Gens Luciferase (Tabelle 4). Thus, the activator-responsive promoter unit described leads to cell-specific, cell cycle-dependent expression of the luciferase gene (Table 4).
Weitere Ergebnisse mit dem Fos/jun-SystemFurther results with the Fos / jun system
Die Aktivität des neuen komplexbildenden Proteins in Melanom- und LungenkarzinomxenotransplantatenThe activity of the new complex-forming protein in melanoma and lung carcinoma xenografts
Melanomxenotransplantate wurden durch intradermale Injektion von 106 MeWo- Zellen in Nacktmäuse eingebracht.Melanoma xenografts were introduced into nude mice by intradermal injection of 10 6 MeWo cells.
Lungenkarzinomxenotransplantate wurden durch subkutane Injektion von 2.107 H322-Zellen (H3 22, bronchoalveoläre Karzinome, menschliche ATCC Nr. CRL 5806) in Nacktmäuse eingebracht.Lung carcinoma xenografts were introduced into nude mice by subcutaneous injection of 2.10 7 H322 cells (H3 22, bronchoalveolar carcinomas, human ATCC No. CRL 5806).
Wenn die Xenotransplantate eine Größe von 4 mm erreichten, wurden sie mit folgender Plasmidkombination in einer Trägerlösung von 5 % Glukose, 0,01 % Triton X100 intratumoral coinjiziert. Plasmidkombination:When the xenografts reached a size of 4 mm, they were co-injected intratumorally with the following plasmid combination in a carrier solution of 5% glucose, 0.01% Triton X100. Plasmid combination:
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)- 6ng of the pRL-SV40 vector (Promega, Incorporated)
+ 30 μg des pGL3-Promotor-Vektors (Promega, Incorporated)+ 30 μg of the pGL3 promoter vector (Promega, Incorporated)
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)- 6ng of the pRL-SV40 vector (Promega, Incorporated)
+ 15 μg 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 μg des Tyr-m-fos-CycA-VP16+ 15 ug 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 ug of the Tyr-m-fos-CycA-VP16
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)- 6ng of the pRL-SV40 vector (Promega, Incorporated)
+ 15 μg 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun.+ 15 μg 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun.
Alle diese Plasmide wurden mit dem endofreien QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN Inc.) isoliert.All of these plasmids were isolated using the endofree QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN Inc.).
Der pRL-SV40-Vektor wurde als interne Kontrolle verwendet, um die Ergebnisse der verschiedenen Xenotransplantate zu standardisieren.The pRL-SV40 vector was used as an internal control to standardize the results of the various xenografts.
24 h nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, die Tumoren wurden herauspräpariert und mechanisch zerkleinert, und die Luciferaseaktivität im Lysat wurde mit Hilfe des Dual-Luciferase Reportergen-Assay-Systems (Promega, Incorporated) gemessen. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis der Leuchtkäfer- Luciferaseaktivität zur pRL-SV40-Aktivität angegeben und auf die Proteinkonzentration übertragen.24 hours after the injection, the mice were sacrificed, the tumors were dissected out and mechanically ground, and the luciferase activity in the lysate was determined using the dual luciferase reporter gene assay system (Promega, Incorporated). The results were reported as the ratio of firefly luciferase activity to pRL-SV40 activity and were transferred to the protein concentration.
Ergebnisse (siehe Tabelle 5):Results (see Table 5):
1. In beiden Xenotransplantattypen, dem Melanom- und dem Lungenkarzinom- xenotransplantat, führt der konstitutiv exprimierte Promotor SV40 (pGL3- Promotor-Konstrukt) zum Nachweis der Leuchtkäfer-Luciferaseaktivität.1. In both xenograft types, the melanoma and the lung carcinoma xenograft, the constitutively expressed promoter SV40 (pGL3 promoter construct) leads to the detection of firefly luciferase activity.
2. In beiden Xenotransplantattypen wurde nach der Injektion von 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 keine Leuchtkäfer- Luciferaseaktivität festgestellt.2. In both xenograft types, no firefly luciferase activity was found after the injection of 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16.
3. Leuchtkäfer-Luciferaseaktivität wurde nur in Melanomxenotransplantaten nach der Injektion von 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA- VP16-m-jun festgestellt. Das zeigt, daß das fos-jun-System eine selektive Expression der Luciferaseaktivität im Melanomxenotransplantat bewirkt.3. Firefly luciferase activity was only found in melanoma xenografts after the injection of 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun. This shows that the fos-jun system causes a selective expression of the luciferase activity in the melanoma xenograft.
Die durch das fos/jun-System gesteuerte Expression eines Effektorgens hat einen biologischen EffektThe expression of an effector gene controlled by the fos / jun system has a biological effect
Zur Analyse der Fähigkeit des fos/jun-Systems, eine biologische Wirkung hervorzurufen, wurde die Reportergen-Luciferase durch Bax cDNA (Oltvai et al., 1993) ersetzt. Um die transfizierten Zellen analysieren zu können, wurden die Zellen mit CMV-luc cotransfiziert. Eine große Menge Luciferase wurde konstitutiv exprimiert, die mit einem Luciferase-Assay leicht meßbar ist, so daß der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen berechnet werden kann.To analyze the ability of the fos / jun system to produce a biological effect, the reporter gene luciferase was replaced by Bax cDNA (Oltvai et al., 1993). In order to be able to analyze the transfected cells, the cells were cotransfected with CMV-luc. A large amount of luciferase was expressed constitutively, which is easily measurable with a luciferase assay, so that the percentage of surviving transfected cells can be calculated.
Die MeWo (menschlichen Melanom-) und die H322 (bronchoalveolären Lungenkarzinom-) Zellinien wurden, wie vom Hersteller beschrieben, mit Lipofectin (Gibco BRL Inc.) bzw. DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.) transfiziert. Die Zellen wurden mit den folgenden Plasmiden cotransfiziert: pCDNA3 (Invitrogen Inc.; Kontrolle): 1 ng CMV -luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA- VP16 + 1 μg pCDNA3The MeWo (human melanoma) and H322 (bronchoalveolar lung carcinoma) cell lines were transfected with Lipofectin (Gibco BRL Inc.) and DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.) as described by the manufacturer. The cells were co-transfected with the following plasmids: pCDNA3 (Invitrogen Inc .; control): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 μg pCDNA3
CMV-bax (Bax cDNA, kloniert in pCDNA3): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos- CycA-VP16-m-jun + 1 μg CMV-baxCMV-bax (Bax cDNA, cloned in pCDNA3): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 μg CMV-bax
pBax (Kontrolle): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 μg pBaxpBax (control): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 μg pBax
10xBS Gal4-SV40-bax: 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 μg 10xBS Gal4-SV40-bax.10xBS Gal4-SV40-bax: 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 μg 10xBS Gal4-SV40-bax.
Die im Falle der Cotransfektion mit pCDNA3 und pBax (Kontrollplasmide,die keine Bax cDNA exprimieren) gemessenen Luciferasewerte wurden als 100 % Überleben der transfizierten Zellen angenommen.The luciferase values measured in the case of cotransfection with pCDNA3 and pBax (control plasmids which do not express Bax cDNA) were assumed to be 100% survival of the transfected cells.
48 h nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und die Luciferaseaktivität wurde gemessen.The cells were collected 48 h after the transfection and the luciferase activity was measured.
Ergebnisse (siehe Tabelle 6)Results (see table 6)
1. Wenn die Bax cDNA vom konstitutiven CMV-Promotor gesteuert wurde, ging der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen in beiden Zelltypen zurück, auf 9-10 % bei MeWo-Zellen und auf 32-36 % bei H322-Zellen.1. When the Bax cDNA was controlled by the constitutive CMV promoter, the percentage of surviving transfected cells decreased in both cell types, to 9-10% for MeWo cells and to 32-36% for H322 cells.
2. Wenn die Bax cDNA durch den 10xBS Gal4-SV40-Promotor gesteuert wurde, betrug der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen 100 %, wenn die Me Wo-Zellen mit dem Kontrollplasmid (Tyr-m — fos-CycA-VP16) cotransfiziert wurden und ging auf 36 % zurück, wenn Tyr-m-fos-CycA-VP16- m-jun verwendet wurde. In den H3 22-Zellen betrug in beiden Fällen der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen 100 %. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Aktivierung des fos-jun-Systems in Melanomen ausreicht, um einen biologischen Effekt (Zellabtötung) hervorzurufen, was bei Nicht-Melanomzellen nicht festzustellen ist.2. When the Bax cDNA was controlled by the 10xBS Gal4-SV40 promoter, the percentage of surviving transfected cells was 100% when the Me Wo cells were cotransfected with the control plasmid (Tyr-m-fos-CycA-VP16) and decreased to 36% when Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun was used. In the H3 22 cells, the percentage of surviving transfected cells was 100% in both cases. These results showed that activation of the fos-jun system in melanomas is sufficient to produce a biological effect (cell killing), which cannot be seen in non-melanoma cells.
Selektive Expression des fos-jun-Systems in Melanomen nach der Übertragung des AdenovirusSelective expression of the fos-jun system in melanoma after adenovirus transmission
Die Tyr-m-fos-CycA-VP16, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun und die 10 x BS Gal4-SV40- luc-Transkriptionskassetten wurden mittels baktierieller Rekombination, wie von He et al. (1998) beschrieben, in einem humanen E1/E3-deletierten Adenovirus (Serotyp 5) kloniert.The Tyr-m-fos-CycA-VP16, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun and the 10 x BS Gal4-SV40-luc transcription cassettes were determined by bacterial recombination as described by He et al. (1998), cloned in a human E1 / E3-deleted adenovirus (serotype 5).
Die MeWo- und H322-Zellen wurden 6 Stunden lang entweder mitThe MeWo and H322 cells were either with for 6 hours
AdTyr-m-fos-CycA-VP16+ AdlOxBS Gal4-SV40-luc oder mitAdTyr-m-fos-CycA-VP16 + AdlOxBS Gal4-SV40-luc or with
AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + AdlOxBS Gal4-SV40-lucAdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + AdlOxBS Gal4-SV40-luc
coinfiziert, und die Luciferaseaktivität wurde 48 h nach der Infektion gemessen. Die Aktivitäten in beiden Zellinien wurden mit den Ergebnissen verglichen, die mit AdSV40-luc (humanes E1/E3-deletiertes Adenovirus (Serotyp 5) mit einem SV40- Promotor (-138/+45), D.M. Nettelbeck, unveröffentlichte Daten) erzielt wurden.coinfected, and luciferase activity was measured 48 h after infection. Activities in both cell lines were compared to the results obtained with AdSV40-luc (human E1 / E3 deleted adenovirus (serotype 5) with an SV40 promoter (-138 / + 45), D.M. Nettelbeck, unpublished data).
Ergebnisse (siehe Tabelle 7):Results (see Table 7):
In beiden Zellinien führte die Coinfektion mit dem Kontroll-Adenovirus (AdTyr-m-fos- CycA-VP16) zu einer schwachen Expression der Luciferaseaktivität, während eine hohe Aktivität, das 70-fache der mit AdSV40-luc gemessenen, nur in MeWo-Zellen nach der Infektion mit AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun festgestellt wurde.In both cell lines, the co-infection with the control adenovirus (AdTyr-m-fos-CycA-VP16) led to a weak expression of the luciferase activity, while a high activity, 70 times that measured with AdSV40-luc, only occurred in MeWo cells after infection with AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun.
Die selektive Expression des fos-jun-Systems in Melanomen wird nach der Übertragung des fos-jun-Systems auf einen Adenovirus-Vektor aufrechterhalten. Figurenlegende:The selective expression of the fos-jun system in melanoma is maintained after transfer of the fos-jun system to an adenovirus vector. Figure legend:
Fig. 1 : (a) Schematische Darstellung der neuen komplexbildendenFig. 1: (a) Schematic representation of the new complex-forming
Proteine, Möglichkeit 1 (b) Variante der Möglichkeit 1Proteins, Option 1 (b) Variant of Option 1
Fig. 2: Schematische Darstellung der neuen komplexbildenden Proteine,2: Schematic representation of the new complex-forming proteins,
Möglichkeit 2.Possibility 2.
Fig. 3: Aktivatorresponsive Promotoreinheiten A und B gemäß den Beispielen.3: Activator-responsive promoter units A and B according to the examples.
Fig. 4: Mutationen von c-jun und c-fos gemäß den Beispielen.Fig. 4: mutations of c-jun and c-fos according to the examples.
Fig. 5: Der Aktivator responsive Promotor und das Effektorgen.Fig. 5: The activator responsive promoter and the effector gene.
Fig. 6: Nukleinsäurekonstrukte zur Expression der erfindungsgemäßen komplexbildenden Proteine. 6: Nucleic acid constructs for the expression of the complex-forming proteins according to the invention.
Tabelle 1Table 1
Protein-Protein-Interaktion nach ImmunprecipitationProtein-protein interaction after immunoprecipitation
Tabelle 2Table 2
Luciferase Aktivitäten in MeWo ZellenLuciferase activities in MeWo cells
Tabelle 3 Table 3
Luciferase Aktivitäten in PC3 ZellenLuciferase activities in PC3 cells
Tabelle 4Table 4
Zellspezifische, zelizyklusabhängige Expression des LuciferasegensCell-specific, cell cycle-dependent expression of the luciferase gene
Tabelle 5 Table 5
Luciferaseaktivitäten in Melanom- und LungenkarzinomxenotransplantatenLuciferase activities in melanoma and lung cancer xenografts
Für Standardabweichung n = 5For standard deviation n = 5
Tabelle 6Table 6
Prozentsatz überiebender transfizierter Zellen bei MeWo- und H322-ZellenPercentage of exaggerated transfected cells in MeWo and H322 cells
Alle Zellen wurden mit 1 n CMV-luc als "Marker" der transfizierten Zellen cotransfiziertAll cells were cotransfected with 1N CMV-luc as a "marker" of the transfected cells
Tabelle 7 Table 7
Selektive Genexpression in Melanomen nach der AdenovirusübertragungSelective gene expression in melanoma after adenovirus transmission

Claims

Patentansprüche: Claims:
1. Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:1. A complex of non-naturally occurring, specifically complex-forming proteins, characterized in that the following components are contained in the complex:
a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,a) at least one ligand specific for a target structure,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,b) at least one protein containing a mutated dimerization domain, the mutated dimerization domain having been derived by mutation from a naturally occurring dimerization domain, this mutated dimerization domain can interact specifically with component c) and component b) is covalently linked to component a),
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechseiwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, undc) at least one protein containing a mutated dimerization domain, the mutated dimerization domain having been derived by mutation from a naturally occurring dimerization domain, this mutated dimerization domain can specifically interact with component b) and component c) is covalently linked to component d), and
d) mindestens einen Effektor.d) at least one effector.
2. Komplex gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente a) ersetzt ist durch die Komponente d).2. Complex according to claim 1, characterized in that component a) is replaced by component d).
3. Komplex gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente d) ersetzt ist durch die Komponente a). 3. Complex according to claim 1, characterized in that component d) is replaced by component a).
4. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich ein fusiogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält.4. Complex according to one of claims 1 to 3, characterized in that it additionally contains a fusiogenic peptide or a translocalization peptide.
5. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthält.5. Complex according to one of claims 1 to 4, characterized in that it contains a cleavage sequence for a protease between components c) and d) or a) and b).
6. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand (Komponente a) ausgewählt is aus einer Gruppe enthaltend einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, TNF, ein Chemokin, ein Peptidhormon, ein Mediator, ein Steroidhormon, ein Vitamin, einen Komplementfaktor, einen Gerinnungsfaktor, einen Faktor des Kininsystems oder des Fibrinoiysesystems, ein plasmatisches oder zelluläres Enzym, einen plasmatischen oder zellulären Enzyminhibitor, eine Virushüllprotein, einen zellulären Rezeptor für einen der zuvor aufgeführten Proteine und Wirkstoffe, einen Antikörper, ein Antikörperspaltprodukt wie F(ab)2, ein einzelkettiges Fv, ein einzelkettiges, doppelantigenbindendes Molekül, ein Fc-Fragment, ein DNA-Bindeprotein, die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors und die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors.6. Complex according to one of claims 1 to 5, characterized in that the ligand (component a) is selected from a group containing a growth factor, a cytokine, TNF, a chemokine, a peptide hormone, a mediator, a steroid hormone, a vitamin, a Complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system or of the fibrinoysis system, a plasmatic or cellular enzyme, a plasmatic or cellular enzyme inhibitor, a virus envelope protein, a cellular receptor for one of the previously listed proteins and active substances, an antibody, an antibody cleavage product such as F (ab) 2 , a single chain Fv, a single chain, double antigen binding molecule, an Fc fragment, a DNA binding protein, the DNA binding domain of a transcription factor and the activation domain of a transcription factor.
7. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten b) und c) von natürlich sich miteinander verbindenden Proteinen abgeleitet werden.7. Complex according to any one of claims 1 to 6, characterized in that components b) and c) are derived from naturally binding proteins.
8. Komplex gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine ausgewählt werden aus einer Gruppe von natürlichen Dimerisierungspartnern enthaltend:8. Complex according to claim 7, characterized in that the naturally binding proteins are selected from a group of natural dimerization partners containing:
Fos Jun oder Jun B oder Jun DFos Jun or Jun B or Jun D
FRAU-1 Jun oder Jun B oder Jun DMRS-1 Jun or Jun B or Jun D
FRAU-2 Jun oder Jun B oder Jun DMRS-2 Jun or Jun B or Jun D
FOS-B Jun oder Jun B oder Jun D OCT-1 Jun oder Jun B oder Jun DFOS-B Jun or Jun B or Jun D OCT-1 Jun or Jun B or Jun D
NFKB (p65) IKBNFKB (p65) IKB
Ras RAFRas RAF
CD4 p56LcK bcl-2 bad oder baxCD4 p56LcK bcl-2 bad or bax
Cyclin A cdklCyclin A cdkl
E2F DPE2F DP
CD40 CD40LCD40 CD40L
Myc MaxMyc Max
Myc N MaxMyc N Max
Myc L Max p105 (Rb1 ) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F oder Myc p130 E7, E2F oder MycMyc L Max p105 (Rb1) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F or Myc p130 E7, E2F or Myc
CBL GagCBL gag
TRP TRPTRP TRP
Met MetMet Met
Myb p67 oder p160Myb p67 or p160
VAV p67 oder p160VAV p67 or p160
APC α- oder ß-CateninAPC α- or β-catenin
APC APCAPC APC
VD Rezeptor h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder ßVD receptor h- (retinoid x receptor) RXR α or ß
T3 Rezeptor HRXR α oder ßT3 receptor HRXR α or β
MyoD E12MyoD E12
E12 IdE12 Id
E47 IdE47 Id
HHSP90 Progesteron-RezeptorHHSP90 progesterone receptor
HHSP90 Glucocorticoid-RezeptorHHSP90 glucocorticoid receptor
HHSP90 Mineralocorticoid-RezeptorHHSP90 mineralocorticoid receptor
HHSP90 DioxinrezeptorHHSP90 dioxin receptor
Dioxinrezeptor Amt HPS90 FKBP59 HSP90 Cyclosporin-bindendes Protein HPS90 Pp60v"src HSP70 HSF1 Heat shock Faktor 1 HSP70 HSF2 Heat shock Faktor 2Dioxin receptor office HPS90 FKBP59 HSP90 Cyclosporin binding protein HPS90 Pp60 v "src HSP70 HSF1 Heat shock factor 1 HSP70 HSF2 Heat shock factor 2
9. Komplex gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine, der Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper Familie angehören.9. Complex according to claim 8, characterized in that the naturally interconnecting proteins belong to the helix-loop-helix / leucine-zipper family.
10. Komplex gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutationen der Dimerisierungsdomänen der Komponenten b) und c) erfolgt sind durch Einführung von10. Complex according to one of claims 7 to 9, characterized in that the mutations of the dimerization domains of components b) and c) have been carried out by introducing
- 3 - 18 Cysteinen in die jeweils zugrundeliegenden natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;- 3 - 18 cysteines in the respectively underlying naturally occurring dimerization domains;
- 3 - 24 basischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 sauren Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;3 to 24 basic amino acids in each of one of the underlying, naturally occurring dimerization domains and 3 to 24 acidic amino acids in each of the underlying, naturally occurring dimerization domains;
- 3 - 24 hydrophoben Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen; und/oder3 to 24 hydrophobic amino acids in each of one of the underlying, naturally occurring dimerization domains and 3 to 24 aromatic amino acids in each of the underlying, naturally occurring dimerization domains; and or
- 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen. - 3 - 24 aromatic amino acids in each of the underlying, naturally occurring dimerization domains and from 3 - 24 aromatic amino acids in each of the underlying, naturally occurring dimerization domains.
11. Komplex nach Anspruch 10, bei welchen die Komponenten b) und c) die mutierten Bindedomänen von c-fos und c-jun darstellen, wobei folgende Mutationen vorliegen:11. Complex according to claim 10, in which components b) and c) represent the mutated binding domains of c-fos and c-jun, the following mutations being present:
c-fos Aminosäure 167E → Kc-fos amino acid 167E → K
172E → K172E → K
181 E → K c-jun Aminosäure 283K → E181 E → K c-jun amino acid 283K → E
288 K → E288 K → E
302K → E302K → E
12. Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, daß die Komponente d) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Inhibitoren der Zellproliferation, Apoptose induzierende Proteine, zytostatische oder zytotoxische Proteine, Gerinnung induzierende Faktoren, Angiogenese induzierende Faktoren, Angiogenese hemmende Faktoren, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Mediatoren, bakterielle Proteine, Rezeptoren (für Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Steroidhormone, Mediatoren oder Virushüllproteine), virale Antigene, parasitäre Antigene, Tumorantigene, Autoantigene, Gewebsantigene, Adhäsionsmoleküle, Antikörper oder Antikörperspaltprodukte wie F(ab)2, Fab, einzelkettiges Fv, einzelkettige doppelantigenbindende Proteine, Enzyme zur Umsetzung einer signalgebenden Komponente, Enzyme zur Überführung einer Vorstufe einer Wirksubstanz in eine Wirksubstanz, Fluoreszenzfarbstoffe, Isotope, metallbindende Proteine, eine DNA-Bindedomäne.12. Complex according to one of the preceding claims, characterized in that component d) is selected from a group comprising inhibitors of cell proliferation, apoptosis-inducing proteins, cytostatic or cytotoxic proteins, coagulation-inducing factors, angiogenesis-inducing factors, angiogenesis-inhibiting factors, growth factors, Cytokines, chemokines, interleukins, interferons, complement factors, coagulation factors, fibrinolysis inducing proteins, peptide hormones, mediators, bacterial proteins, receptors (for growth factors, cytokines, chemokines, interleukins, interferons, complement factors, coagulation factors, fibrinolysis or inducing proteins, medoid hormones Virus envelope proteins), viral antigens, parasitic antigens, tumor antigens, autoantigens, tissue antigens, adhesion molecules, antibodies or antibody cleavage products such as F (ab) 2 , Fab, single-chain Fv, single-chain double-antigen-binding proteins , Enzymes for converting a signaling component, Enzymes for converting a precursor of an active substance into an active substance, fluorescent dyes, isotopes, metal-binding proteins, a DNA binding domain.
13. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes, Schäden des Nervensystems, Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems, Tumoren, viralen- und bakteriellen Infektionen und zur Herstellung eines Impfstoffes.13. Use of a complex according to one of claims 1 to 12 for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammation, Autoimmune diseases, insufficient formation of blood cells, damage to the nervous system, disorders of the blood coagulation and blood circulation system, tumors, viral and bacterial infections and for the production of a vaccine.
14. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Komplexierung mit einem viralen oder nicht viralen Vektor und zur zielzellspezifischen Einführung dieses Vektors in die Zelle eines Organismus oder einer Zellkultur.14. Use of a complex according to one of claims 1 to 12 for complexing with a viral or non-viral vector and for target cell-specific introduction of this vector into the cell of an organism or a cell culture.
15. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für den Nachweis eines Reaktionspartners in vitro oder in vivo.15. Use of a complex according to one of claims 1 to 12 for the detection of a reactant in vitro or in vivo.
16. Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein Protein nach Ansprüchen 1 bis 12.16. Nucleic acid construct coding for a protein according to claims 1 to 12.
17. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 16, kodierend für die Aktivatorsubeinheiten einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit.17. Nucleic acid construct according to claim 16, coding for the activator subunits of an activator-responsive promoter unit.
18. Wirtszelle enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß dem Anspruch 16 oder 17.18. Host cell containing a nucleic acid construct according to claim 16 or 17.
19. Wirtszelle gemäß Anspruch 18 ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend ein Bakterium, eine Hefe und eine Säugerzelle.19. Host cell according to claim 18 selected from a group comprising a bacterium, a yeast and a mammalian cell.
20. Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 18 und 19 zur Herstellung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.20. Use of a host cell according to one of claims 18 and 19 for the production of the complexes according to one of claims 1 to 12.
21. Herstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß21. Preparation of a complex according to one of claims 1 to 12, characterized in that
(a) ein Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit(a) a protein of the complex according to one of claims 1 to 12 with
Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird, (b) ein weiteres, von dem unter (a) beschriebenen Protein verschiedenes Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird,Is expressed using a nucleic acid construct according to one of claims 16 or 17, (b) another protein of the complex according to one of claims 1 to 12, which is different from the protein described under (a), is expressed with the aid of a nucleic acid construct according to one of claims 16 or 17,
(c) die Proteine aus den Schritten (a) und (b) isoliert und(c) isolating the proteins from steps (a) and (b) and
(d) miteinander komplexiert werden. (d) complexed together.
EP00906186A 1999-01-12 2000-01-05 Novel complex-forming proteins Withdrawn EP1144634A2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19900743 1999-01-12
DE19900743A DE19900743A1 (en) 1999-01-12 1999-01-12 New complexing proteins
PCT/EP2000/000029 WO2000042179A2 (en) 1999-01-12 2000-01-05 Complex-forming proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1144634A2 true EP1144634A2 (en) 2001-10-17

Family

ID=7893962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP00906186A Withdrawn EP1144634A2 (en) 1999-01-12 2000-01-05 Novel complex-forming proteins

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6495346B1 (en)
EP (1) EP1144634A2 (en)
JP (1) JP2002534121A (en)
KR (1) KR20010089817A (en)
CN (1) CN1340103A (en)
AU (1) AU2796000A (en)
CA (1) CA2359479A1 (en)
DE (1) DE19900743A1 (en)
HK (1) HK1042520A1 (en)
MX (1) MXPA01006988A (en)
WO (1) WO2000042179A2 (en)
ZA (1) ZA200105427B (en)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6346510B1 (en) * 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
KR100474114B1 (en) * 2001-12-24 2005-03-08 대한민국 Fusion protein having the enhanced immunogenecity to bovine theilerosis, and preparation process and use thereof
US7906118B2 (en) * 2005-04-06 2011-03-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
AU2003255250A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Insert Therapeutics, Inc. Compositions and uses of motor protein-binding moieties
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
WO2005056752A2 (en) 2003-10-24 2005-06-23 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
CA2576971A1 (en) * 2004-08-20 2006-03-02 Entremed, Inc. Compositions and methods comprising proteinase activated receptor antagonists
ES2325344B1 (en) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma MULTIFUNCTIONAL AND MULTIVALENT ANGIOGENESIS INHIBITORS.
CN102740894B (en) * 2009-08-28 2015-07-15 克利夫兰临床医学基金会 SDF-1 delivery for treating ischemic tissue
EA020171B1 (en) * 2009-11-09 2014-09-30 Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ Fused protein, comprising fibroplast growth factor or a fragment thereof and receptor of fibroplast growth factor or a fragment thereof and use of protein for treatment or prophylaxis of diseases or conditions associated with vessels pathology
RU2486918C1 (en) * 2011-10-25 2013-07-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Method for stimulating recovered peripheral tissue innervation
RU2538621C2 (en) * 2013-05-08 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Method for stimulating restoration of tissue innervation following injuries and ischemia by means of vector construct
CN113150086B (en) * 2021-04-22 2022-10-11 成都欧林生物科技股份有限公司 Helicobacter pylori HefC recombinant protein and application thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057133A (en) * 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
DE19524720A1 (en) 1995-07-12 1997-01-16 Hoechst Ag Cell-specific gene therapy using a new promoter for the "tissue inhibitor of metalloproteinase-3"
DE19605274A1 (en) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Nucleic acid constructs for the cell cycle regulated expression of genes, cells containing such constructs and their use for the production of medicinal products
DE19605279A1 (en) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Target cell-specific vectors for the introduction of genes into cells, drugs containing such vectors and their use
DE19617851A1 (en) * 1996-05-03 1997-11-13 Hoechst Ag Nucleic acid constructs with genes coding for transport signals
US6110698A (en) * 1996-05-31 2000-08-29 American Cyanamid Company Screen for ultraspiracle inhibitors
DE19710643A1 (en) 1997-03-14 1998-09-17 Hoechst Ag The promoter of the cdc25B gene and its use in gene therapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0042179A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200105427B (en) 2002-07-16
US6495346B1 (en) 2002-12-17
KR20010089817A (en) 2001-10-08
HK1042520A1 (en) 2002-08-16
JP2002534121A (en) 2002-10-15
CA2359479A1 (en) 2000-07-20
MXPA01006988A (en) 2002-04-24
WO2000042179A2 (en) 2000-07-20
WO2000042179A3 (en) 2000-11-16
DE19900743A1 (en) 2000-07-13
US20030054409A1 (en) 2003-03-20
CN1340103A (en) 2002-03-13
AU2796000A (en) 2000-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1144634A2 (en) Novel complex-forming proteins
DE3546806C2 (en)
US20200157534A1 (en) Methods and systems for conditionally regulating gene expression
Zeitlin et al. Pre-mRNA splicing and the nuclear matrix
EP0532525B1 (en) New protein-polycation conjugates
EP1427837B1 (en) Modular transfection systems based on nucleoprotein filaments
US20210070830A1 (en) Gene regulation via conditional nuclear localization of gene modulating polypeptides
DD202045A5 (en) METHOD FOR CLONING A DEOXYNUCLEOTIDE SEQUENCE
US6380170B1 (en) Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes
EP1857555A1 (en) Method for the production of a cell and/or tissue disease phase specific treatment
EP0926237A2 (en) Nucleic acid constructs for gene therapy, whose activity is influenced by inhibitors of cyclin-dependent kinases
DE4110409C2 (en) New protein-polycation conjugates
EP0805209A2 (en) Nucleic acid construct with genes coding for transportsignals
DE19649645A1 (en) Multiple functional ligand system for target cell-specific transfer of nucleotide sequences
EP1000154B1 (en) Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation
WO1992011370A2 (en) Polypeptides derived from proteins of the hepatitis c virus
DE19910419A1 (en) Target Cell-Specific Multivalent Proteins (MVP)
DE69333106T2 (en) polypeptide production
EP0199091B1 (en) Process for the production of a herpes simplex virus type 2 specific antigen, suitable agents therefor and the use of this antigen
CN114149990A (en) Method for editing BCL11A gene in hematopoietic stem/progenitor cells
DE3632038A1 (en) TISSUE-SPECIFIC VIRAL VECTORS BASED ON THE LPV AND THEIR USE
EP1196618A2 (en) Novel vector complexes and their use in gene therapy
US20070031409A1 (en) Recombinant DNA-molecule complex for the expression of anti-human-interferon-gamma chimeric antibodies or antibody fragments
DE4411718A1 (en) RFB retrovirus genome
DE4110410A1 (en) New conjugates of poly:cation and protein

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20010813

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

AX Request for extension of the european patent

Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20031211