EP1137800A1 - Method for purifying or isolating viral nucleic acids - Google Patents

Method for purifying or isolating viral nucleic acids

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EP1137800A1
EP1137800A1 EP99950544A EP99950544A EP1137800A1 EP 1137800 A1 EP1137800 A1 EP 1137800A1 EP 99950544 A EP99950544 A EP 99950544A EP 99950544 A EP99950544 A EP 99950544A EP 1137800 A1 EP1137800 A1 EP 1137800A1
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EP
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buffer
nucleic acid
nucleic acids
plasma
virus
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EP99950544A
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EP1137800B1 (en
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Thomas Fenner
Heiko Petersen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating viral nucleic acids from liquids containing virus particles, such as e.g. Plasma or other liquids, the nucleic acids being obtained in pure form.
  • the invention relates to the detection of viruses present in liquids, especially in plasma pools.
  • the present invention relates in particular to a method for preparing samples for nucleic acid amplification techniques and a kit for carrying out the method.
  • RNA amplification techniques are now often used assays such as assays based on polymerase chain reaction (PCR), branched DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) are used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • bDNA branched DNA detection
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • the detection limit of the commercially available assays is around 100 to 400 DNA / RNA copies / ml plasma .
  • Amplicor HCV Amplicor HBV monitor
  • Amplicor HIV-1 monitor Amplicor HIV-1 monitor
  • the detection limit of the commercially available assays for the detection of viruses is a problem. If, for example, only one out of 96 samples were virus-positive, the total virus concentration would drop to about 1/100 due to the dilution factor in the plasma pool , ie a value that is usually below the detection limit of the particular assay used. For example, if 1000-4000 RNA copies / ml HCV are measured in a single sample, there would only be about 10-40 copies / ml HCV in a 96-fold plasma pool (using this one contaminated and 95 virus-free individual samples with the same volume). which have so far not been detected by the commercially available assays. This would result in the contamination of the entire plasma pool and the transmission of the viruses to a large number of plasma receivers.
  • the precipitation of virus particles from liquids using polyethylene glycol (PEG) has been a standard technique for concentrating viruses with low centrifugal force since the early 1970s (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1534-38).
  • PEG polyethylene glycol
  • the liquid is mixed with PEG and NaCl. Precipitation takes place in the cold, and the virus (protein) / PEG precipitates are then obtained by centrifugation.
  • the further processing steps preservation of the vital virus particles, disruption of the virus particles etc. ultimately depend on the scientific question.
  • An alternative method is the ultracentrifugation of viruses in liquids.
  • the concentration of the virus particles on the bottom of the centrifugation vessel is achieved solely by the centrifugal force acting over a long period of time.
  • this method can only be used to a limited extent for HCV, since the HCV particles are often in the lipid layer and therefore cannot be prepared quantitatively.
  • RNA viruses e.g. HCV or HIV-1
  • chaotropic denaturans guanidine isothiocyanate GIT denatures all proteins (including RNA-degrading RNases) so that the nucleic acids are freely available in solution and are protected against degradation.
  • phenol / chloroform can be used as the denaturing agent (Cox, Methods Enzymol. 12B (1968) 120; Glisen et al., Biochemistry 13 (1974) 2633; Ullrich et al., Science 196 (1977) 1313).
  • this is disadvantageous because of the toxicity, disposal, etc. of the agents used.
  • the extracted nucleic acids can finally be purified by various methods.
  • the binding of the nucleic acids to silicon matrices is a widely used method.
  • Kits for carrying out the silicon method are commercially available from the companies QIAGEN (Hilden, DE), Macherey-Nagel (Düren, DE), Boehringer-Mannheim (Mannheim, DE), Organon Teknika (Turnhout, BE) and various other providers.
  • the end product obtained is a mostly highly purified nucleic acid present in neutral solution (H 2 O or Tris buffer) (Vogelstein and Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) pages 615-619; Boom et al., J Clin Microbiol. 28 (1990) 495).
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which viruses, in particular HBV, HCV and HIV, can be detected and / or quantified in blood plasma pools. It is also an object of the present invention to provide a virus detection method that enables highly sensitive and rapid testing of blood products (such as required for platelets) that can only be kept for a relatively short time.
  • the present invention thus relates to a method for the purification or isolation of nucleic acids from virus particles which may be present in liquid biological sample material, which is characterized in that
  • GIT buffer 6 M guanidine isothiocyanate (GIT), 200 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM Tris, pH 6.5).
  • the biological sample material can be e.g. Plasma samples (preferably from plasma pools), other blood products or other liquids that can be contaminated with viruses.
  • RNA or DNA samples obtained in step c) can then, after purification, be examined by NAT for possible contamination with viruses.
  • the virus-enriched mixture from stage c) can preferably be transferred directly to a commercially available kit for isolating viral DNA / RNA.
  • the invention relates to a method for purifying viral nucleic acids, which the above.
  • Steps a) to c) and the additional stages d) and e) comprises, wherein one
  • stage d) the mixture obtained in stage c) optionally with the same volume of lysis buffer from a commercially available virus RNA / DNA isolation kit (for example "Buffer AVL” from the “QIAmp Viral RNA Kit", QIAGEN or “binding") Buffer "of the” High Pure Viral RNA Kit “Boehringer Mannheim or other manufacturers) mixes, then the double volume of 96-99% ethanol is added, and one
  • step e) cleaning is carried out on a silicon matrix.
  • the addition of the lysis buffer can be dispensed with in stage d) and ethanol can be added immediately.
  • the same volume of GIT buffer can be added instead of the lysis buffer.
  • the purified nucleic acids are then present in the eluate.
  • lysis buffers All buffers that are supplied by the manufacturer of the virus DNA / RNA isolation kits are preferred as lysis buffers, but other lysis buffers that preferably contain GIT are also suitable.
  • the silicon matrices usually supplied with the kits (.B. As a filter, in the form of beads, etc.) are preferred in the context of the present invention. However, other materials can also be used which bind RNA or DNA and thereby enable their purification.
  • the method is preferably used to prepare biological samples, in particular samples from plasma pools, for subsequent use in NAT, the purified nucleic acids obtained being able to be used directly in the amplification process without further pretreatment.
  • NAT PCR, bDNA, NASBA etc.
  • the nucleic acids are in particular DNA or RNA from HCV, HBV and HIV (in particular HIV-1). According to a particular embodiment of the invention, the method is carried out by
  • a plasma sample is used and the sample volume is max.
  • step b) centrifuged for 15-20 minutes at 4 ° C and approx. 3000 g,
  • step c) add 300 to 400 ⁇ l GIT buffer (see above) to dissolve the pellet and dissolve for approx. 10 min at 56 ° C and
  • step d) the solution is mixed with the lysis buffer of a commercial virus RNA kit (see above) in a ratio of 1: 1.
  • the lysate is mixed with 300 to 400 ⁇ l GIT-containing AVL buffer (see above) in a ratio of 1: 1 and then mixed with 600 to 800 ⁇ l 96-99% ethanol, e) cleaning is carried out on silicon matrix,
  • the purified nucleic acids being present in the eluate.
  • the nucleic acids initially bound are washed and then eluted from the column.
  • This method is preferably used for sample preparation for the detection of HCV, HBV or HIV (in particular HIV-1) from pooled plasmas from blood donors.
  • the virus RNA is then used using known nucleic acid amplification techniques (e.g. PCR, bDNA or NASBA) amplified and detected according to generally known methods (such as by hybridization with the help of labeled probes etc.).
  • the invention further relates to a kit for carrying out the cleaning or isolation method according to the invention or for carrying out the method for preparing biological samples for NATs, which contains defined amounts of PEG, sodium chloride, GIT buffer and ethanol in suitable storage containers, which make it possible to e.g. to subject a predetermined plasma sample volume to the method.
  • the kit preferably contains polyethylene glycol PEG 6000 and sodium chloride in the form of an aqueous solution, according to a particular embodiment 50% PEG 6000 and 5 M aqueous NaCl solution.
  • the kit contains for preparing a plasma sample of 4.8 ml volume each a) 300 ⁇ l of 50% PEG 6000,
  • kits for the detection of HCV, HBV or HIV from pooled plasmas from blood donors is made available for the first time. or isolation method or sample preparation method.
  • the present invention has the advantage that the (highly) purified nucleic acids obtained in stage e) of the method are not contaminated with PEG, since this is completely removed by washing the nucleic acids bound to the matrix. They are also enriched in such a way that about 6 IU / ml HCV-RNA (corresponding to approx. 20 RNA copies per ml) can still be detected with the help of commercially available NAT assays. A corresponding detection limit is reached for HBV and HIV-1.
  • This detection limit enables in particular testing of samples from plasma pools, whereby the requirements set by the Paul Ehrlich Institute with regard to a minimum sensitivity of 5000 IU HCV / ml per individual sample not only meet but also by a lot (by a factor of at least about 8 in pools of 96).
  • the present invention makes it possible for the first time to test plasma pools in which only one of 96 individual samples is contaminated with 1000 IU / ml HCV, which corresponds to a concentration of approximately 10 IU / ml in the pool.
  • Plasma pools can thus be tested for the first time with commercial NAT tests with high sensitivity for the presence of virus particles, whereby the need for single-sample analysis is eliminated due to the greatly improved sensitivity and significantly reduced detection limit due to the sample preparation.
  • the invention is preferably used for the detection of HCV, HBV and HIV-1 from pooled plasmas from blood donation services, which currently comprise 96 individual samples as standard.
  • the cleaning or isolation method according to the invention is distinguished from an ultracentrifugation protocol for the enrichment of virus particles from liquids in that expensive ultracentrifuge equipment can be dispensed with, since each standard cooling centrifuge which can hold 5-15 ml tubes, is suitable for performing the method.
  • a parallel processing of a large number of samples is also possible in the context of the present invention, i.e. usually more than 60 samples, while when using ultracentrifuges, due to the usually very small number of available spaces for tubes in the centrifuge (often fewer than 12), only a few samples can be processed at the same time.
  • the method of the present invention Compared to ultracentrifugation, the method of the present invention also achieves faster sedimentation of the virus particles (approx. 40 min over several hours).
  • the entire method for the detection of viruses in liquid samples using commercially available NAT assays thus requires no more than about 7 hours.
  • it can also be used successfully if the test only releases blood products that are stable for a short time (3-4 days), such as thrombo- bozyten, depends.
  • the enrichment of the virus particles is achieved exclusively by ultracentrifugation, it takes about 2 days, which cannot be used for the release of platelets.
  • the present invention thus allows for the first time the highly sensitive testing of blood products (such as platelets) that can only be kept for a relatively short time.
  • the method according to the invention is further characterized in that less sample material has to be used to carry out the NAT assays, since the entire plasma pool can be tested instead of the individual samples. Furthermore, the method is particularly suitable because of the lower cost and the enormous time saving for blood donation services and blood banks, where several 1000 samples have to be tested per day.
  • the invention also has the particular advantage that lipid-associated virus particles (e.g. HCV) can also be prepared quantitatively and detected with high sensitivity, while they can remain in the fat phase floating above when enriched by ultracentrifugation.
  • lipid-associated virus particles e.g. HCV
  • the method according to the invention Compared to standard protocols for isolating virus nucleic acids from liquids, the method according to the invention has the advantage that it is not limited to very small test volumes (100-200 ⁇ l), since samples of up to 10 ml volume can be used.
  • the sample preparation according to the invention compared to the prior art, the sensitivity of virus copies / ml detectable by 20 or less, compared to the prior art, makes it possible to detect or quantify viruses even in samples with a very low virus titer. In this way, increased safety is achieved when using blood (plasma) products.
  • Virus particles are concentrated from a large (plasma) sample volume (max. 10 ml). This is done by precipitation with PEG 6000 (approx. 3% by weight, ie 50 g PEG ad 100 ml H 2 0 (w / v)) and NaCl (approx. 150 mM of an aqueous solution) for approx. 15-20 min in the cold (4 ° C) with subsequent centrifugation (15-20 min, 4 ° C, 3000 g).
  • PEG 6000 approximately 3% by weight, ie 50 g PEG ad 100 ml H 2 0 (w / v)
  • NaCl approx. 150 mM of an aqueous solution
  • the pellet After decanting the supernatant, the pellet is dissolved in 300-400 ⁇ l GIT buffer (6 M GIT, 200 mM DTT, 100 mM Tris, pH 6.5) by incubation at approx. 56 ° C for approx. 10 min.
  • GIT buffer 6 M GIT, 200 mM DTT, 100 mM Tris, pH 6.5
  • the lysate is mixed with the lysis buffer (see above) of a commercial virus RNA isolation kit (eg QIAamp Viral RNA Kit, QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) in a ratio of 1 : 1 mixed and then mixed with twice the volume of EtOH (96-99%).
  • a commercial virus RNA isolation kit eg QIAamp Viral RNA Kit, QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer
  • the nucleic acid-GIT-EtOH mixture is placed on a nucleic acid-binding silicon membrane (as a centrifugation column in the manual or as a Multiwell 96 system in the machine variant of various commercial suppliers, see above) and according to the test instructions of the Manufacturer processed until the elution of the purified RNA / DNA.
  • a nucleic acid-binding silicon membrane as a centrifugation column in the manual or as a Multiwell 96 system in the machine variant of various commercial suppliers, see above
  • the tubes are then centrifuged at 3000 g for 15-20 min at 4 ° C. in order to sediment the precipitated PEG / virus complexes.
  • the lysate is mixed with 300-400 ⁇ l lysis buffer of a commercial virus RNA isolation kit (eg QIAamp Viral RNA Kit (see below), QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) in a ratio of 1: 1 and then with 600-800 ⁇ l 96-99% EtOH added.
  • a commercial virus RNA isolation kit eg QIAamp Viral RNA Kit (see below), QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer
  • the mixture is e.g. In the manual variant using the QIAamp Viral RNA Kit, put it in two 630 ⁇ l portions on the centrifugation columns (part of the "Viral RNA Kit", see above) and proceed according to the manufacturer's instructions. In the machine version (QIAamp 96 Viral RNA Test Kit), the 7 ml tubes with the lysis mixture are placed in the primary tube adapter of the BioRobot 9604 (QIAGEN) and processed automatically until the nucleic acids are eluted.
  • any established NAT method for example PCR
  • 10-50 ⁇ l of H 2 0 or in an elution buffer supplied by the kit manufacturer
  • Example 2 The method shown in Example 2 was tested on the basis of several hundred samples defined in terms of their virus quantity and a detection limit of approximately 20 virus copies / ml by using the nucleic acid eluates in the Amplicor test systems HBV Monitor, HCV Test and HIV-1 Monitor (Hoffmann -La Röche) determined. The results are shown in Tab. 1.

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Abstract

The invention relates to a method for isolating viral nucleic acids from liquids such as plasma or other liquids containing viral particles. According to the inventive method, the nucleic acids are obtained in purified form. The invention especially relates to the detection of viruses present in liquids, especially in plasma pools. The invention particularly refers to a method for preparing samples for nucleic acid amplification techniques (NAT) and to a kit for carrying out said method.

Description

Verfahren zur Reinigung bzw. Isolierung viraler Nukleinsäuren Process for the purification or isolation of viral nucleic acids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung viraler Nukleinsäuren aus Viruspartikel enthaltenden Flüssigkeiten, wie z.B. Plasma oder anderen Flüssigkeiten, wobei die Nukleinsäuren in reiner Form erhalten werden. Insbesondere betrifft die Erfindung den Nachweis von in Flüssigkeiten, vor allem in Plasma-Pools, vorhandenen Viren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Vorbereitung von Proben für Nukleinsäure-Amplifikationstechniken sowie ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.The present invention relates to a method for isolating viral nucleic acids from liquids containing virus particles, such as e.g. Plasma or other liquids, the nucleic acids being obtained in pure form. In particular, the invention relates to the detection of viruses present in liquids, especially in plasma pools. The present invention relates in particular to a method for preparing samples for nucleic acid amplification techniques and a kit for carrying out the method.
Die Freigabe von Blutplasma und anderen Blutprodukten, wie z.B. Thrombozyten, zur Applikation beim Menschen hängt in entscheidendem Maße davon ab, ob die Produkte beispielsweise mit Viren kontaminiert sind. Für den hochsensitiven Nachweis und/oder die Quantifizierung verschiedener Viren, wie z.B. Hepatitis B oder C Virus (HBV, HCV) bzw. Humanes Immundefizienzvirus (HIV)-l oder -2, werden inzwischen häufig auf Nukleinsäure-Amplifikations- techniken (NAT) basierende Assays, wie z.B. auf Polymerase-Ket- tenreaktion (PCR), branched-DNA-Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) basierende Assays, verwendet. Die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Assays, wie z.B. Amplicor HCV , Amplicor HBV-Monitor (Hoffmann-La Röche) oder Amplicor HIV-1 Monitor (Hoffmann-La Röche), liegt bei etwa 100 bis 400 DNA-/RNA-Kopien/ml Plasma. Diese Sensitivität ist für die Untersuchung der Plasmaprobe und den Nachweis der genannten Viren in Plasmaproben von Einzelspendern zwar zufriedenstellend, jedoch ist das Testen von Einzelproben bei steigendem Plasmabedarf aufgrund des hohen Zeit- und Kostenfaktors routinemäßig praktisch nicht durchführbar. Aus diesem Grund ist es zweckmä- ßiger, Plasma-Pools zu testen, die z.B. aus 96 verschiedenen Einzelproben bestehen.The release of blood plasma and other blood products, such as platelets, for application in humans depends crucially on whether the products are contaminated with viruses, for example. For the highly sensitive detection and / or quantification of various viruses, such as hepatitis B or C virus (HBV, HCV) or human immunodeficiency virus (HIV) -l or -2, nucleic acid amplification techniques (NAT) are now often used Assays such as assays based on polymerase chain reaction (PCR), branched DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) are used. The detection limit of the commercially available assays, such as Amplicor HCV, Amplicor HBV monitor (Hoffmann-La Röche) or Amplicor HIV-1 monitor (Hoffmann-La Röche), is around 100 to 400 DNA / RNA copies / ml plasma . Although this sensitivity is satisfactory for the investigation of the plasma sample and the detection of the viruses mentioned in plasma samples from individual donors, the testing of individual samples with increasing plasma requirements is routinely practically not feasible due to the high time and cost factor. For this reason, it is more convenient to test plasma pools, which consist of 96 different individual samples, for example.
In diesem Zusammenhang stellt die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Assays zum Nachweis von Viren jedoch ein Problem dar. Sollte beispielsweise nur eine von 96 Proben Virus-positiv sein, so würde die Gesamt-Viruskonzentration aufgrund des Verdünnungsfaktors im Plasma-Pool auf etwa 1/100 absinken, d.h. einen Wert, der in der Regel unterhalb der Nachweisgrenze des jeweils verwendeten Assays liegt. Werden zum Beispiel in einer Einzelprobe 1000-4000 RNA-Kopien/ml HCV gemessen, lägen in einem 96er Plasma-Pool (bei Verwendung dieser einen kontaminierten und 95 virusfreien Einzelproben mit jeweils gleichem Volumen) nur etwa 10-40 Kopien/ml HCV vor, die durch die kommerziell erhältlichen Assays bislang nicht nachweisbar sind. Dies hätte die Kontamination des gesamten Plasma-Pools und die Übertragung der Viren auf eine Vielzahl von Plasma-Empfängern zur Folge.In this context, however, the detection limit of the commercially available assays for the detection of viruses is a problem. If, for example, only one out of 96 samples were virus-positive, the total virus concentration would drop to about 1/100 due to the dilution factor in the plasma pool , ie a value that is usually below the detection limit of the particular assay used. For example, if 1000-4000 RNA copies / ml HCV are measured in a single sample, there would only be about 10-40 copies / ml HCV in a 96-fold plasma pool (using this one contaminated and 95 virus-free individual samples with the same volume). which have so far not been detected by the commercially available assays. This would result in the contamination of the entire plasma pool and the transmission of the viruses to a large number of plasma receivers.
Das für die Überprüfung der Blutbanken verantwortliche Paul- Ehrlich-Institut (PEI) hat ab April 1999 beispielsweise die Freigabe von Erythrozyten- und Thrombozythenkonzentraten über eine Testung auf HCV mittels Nukleinsäure-Amplifikationstechni- ken (NATs) vorgeschrieben, wobei eine Empfindlichkeit von 5000 IU HCV/ml pro Einzelprobe zu gewährleisten ist (1 IU = 2-6 RNA(Virus )-Kopien) .From April 1999, the Paul Ehrlich Institute (PEI) responsible for checking the blood banks prescribed, for example, the release of erythrocyte and thrombocyte concentrates by testing for HCV using nucleic acid amplification techniques (NATs), with a sensitivity of 5000 IU HCV / ml per single sample must be guaranteed (1 IU = 2-6 RNA (virus) copies).
Dieser Nachweis kann aufgrund der Sensitivität des derzeit erhältlichen NAT-Assays (Amplicor HCV Test) bislang nur an Ein- zelproben oder kleinen Pools (die bis 48 Proben enthalten) durchgeführt werden. Eine Testung auf HBV und HIV ist dabei nicht möglich.Due to the sensitivity of the currently available NAT assay (Amplicor HCV test), this detection can only be samples or small pools (containing up to 48 samples). Testing for HBV and HIV is not possible.
Bei Blutprodukten, wie z.B. Thrombozyten, die nur für sehr kurze Zeit (3-4 Tage) haltbar sind, stellt der Nachweis kontaminierender Viren ein Problem dar, da der Test mit bislang durchgeführten Anreicherungsverfahren etwa 2 Tage dauert, während kommerziellen Nachweisverfahren, die innerhalb kürzerer Zeiträume durchgeführt werden können, die erforderliche Sensitivität fehlt. Die Verwendbarkeit dieser Produkte nach Abschluß der Viren-Tests ist daher aufgrund der begrenzten Haltbarkeit entweder zeitlich stark eingeschränkt, oder die Applikation ist für den Empfänger (Patienten) mit einem vergleichsweise hohen Infek- tionsrisiko verbunden.For blood products such as Platelets that can only be kept for a very short time (3-4 days) pose a problem when it comes to the detection of contaminating viruses, since the test with the previously carried out enrichment methods takes about 2 days, while commercial methods of detection, which can be carried out within a shorter period of time, the required sensitivity is missing. The usability of these products after completion of the virus tests is therefore either limited in time due to the limited shelf life, or the application is associated with a comparatively high risk of infection for the recipient (patient).
Im Zusammenhang mit den bislang eingesetzten Nukleinsäure-Ampli- fikationstechniken ist der Fachmann vor ein weiteres Problem gestellt. Bei der hochsensitiven Isolierung von viralen Nuklein- säuren aus Flüssigkeiten für mehr als einen Parameter (d.h. bei Nachweis von mehr als einem Virustyp pro Probe) ist es generell erforderlich, relativ große Volumina (ca. 5-10 ml) zu bearbeiten. Alle kommerziellen Testsysteme sind jedoch auf den Einsatz von kleinen Volumina (100-200 μl) für nur einen Parameter (d.h. nur einen Virustyp) ausgerichtet.In connection with the nucleic acid amplification techniques used hitherto, the person skilled in the art is faced with a further problem. In the highly sensitive isolation of viral nucleic acids from liquids for more than one parameter (i.e. if more than one virus type per sample is detected), it is generally necessary to process relatively large volumes (approx. 5-10 ml). However, all commercial test systems are designed for the use of small volumes (100-200 μl) for only one parameter (i.e. only one virus type).
Um z.B. noch eine Viruskonzentration von ca. 20 Partikeln pro ml Plasma (bei HCV entsprechend ca. 6 IU/ml) nachweisen zu können, sind sie deshalb nur dann geeignet, wenn zuvor eine Konzentrie- rung der Viren durch Fällung, Ultrazentrifugation oder Filtrierung erfolgt.To e.g. to be able to detect a virus concentration of approx. 20 particles per ml plasma (corresponding to approx. 6 IU / ml with HCV), they are therefore only suitable if the viruses have been concentrated beforehand by precipitation, ultracentrifugation or filtration.
Die Präzipitation von Viruspartikeln aus Flüssigkeiten mittels Polyethylenglykol (PEG) ist seit Anfang der 70er Jahre eine Standardtechnik zur Konzentrierung von Viren bei geringer Zen- trifugationskraft (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1534-38). In man- nigfaltigen Abwandlungen (z.B. Konzentration und Art des verwendeten PEGs) wird hierbei die Flüssigkeit mit PEG und NaCl gemischt. Die Präzipitation erfolgt in der Kälte, und die Virus (Protein) /PEG-Präzipitate werden anschließend durch Zentrifu- gation gewonnen. Die weiteren Bearbeitungsschritte (Erhalt der vitalen Viruspartikel, Aufschluß der Viruspartikel etc.) hängen schließlich von der wissenschaftlichen Fragestellung ab.The precipitation of virus particles from liquids using polyethylene glycol (PEG) has been a standard technique for concentrating viruses with low centrifugal force since the early 1970s (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1534-38). In some- manifold modifications (eg concentration and type of PEG used) the liquid is mixed with PEG and NaCl. Precipitation takes place in the cold, and the virus (protein) / PEG precipitates are then obtained by centrifugation. The further processing steps (preservation of the vital virus particles, disruption of the virus particles etc.) ultimately depend on the scientific question.
Eine alternative Methode stellt die Ultrazentifugation von Viren in Flüssigkeiten dar. Hierbei wird alleine durch die über längere Zeit einwirkende Zentrifugalkraft eine Anreicherung der Viruspartikel am Boden des Zentrifugationsgefäßes erreicht. Diese Methode ist allerdings für HCV nur eingeschränkt anwendbar, da sich die HCV-Partikel oftmals in der Lipidschicht befinden und somit nicht quantitativ präparierbar sind.An alternative method is the ultracentrifugation of viruses in liquids. In this case, the concentration of the virus particles on the bottom of the centrifugation vessel is achieved solely by the centrifugal force acting over a long period of time. However, this method can only be used to a limited extent for HCV, since the HCV particles are often in the lipid layer and therefore cannot be prepared quantitatively.
Um an Virus-Nukleinsäuren zu gelangen, bedarf es des Aufschlusses (mechanische oder chemische Desintegration) der Virionen. Dazu findet im Falle von RNA Viren (z.B. HCV oder HIV-1) mei- stens das chaotrope Denaturans Guanidinisothiocyanat (GIT) Verwendung. GIT denaturiert alle Proteine (auch RNA abbauende RNa- sen), so daß die Nukleinsäuren frei in Lösung vorliegen und vor Abbau geschützt sind.In order to obtain virus nucleic acids, the virions have to be digested (mechanical or chemical disintegration). In the case of RNA viruses (e.g. HCV or HIV-1), the chaotropic denaturans guanidine isothiocyanate (GIT) is mostly used for this. GIT denatures all proteins (including RNA-degrading RNases) so that the nucleic acids are freely available in solution and are protected against degradation.
Alternativ kann Phenol/Chloroform als denaturierendes Agens eingesetzt werden (Cox, Methods Enzymol. 12B (1968) 120; Glisen et al., Biochemistry 13 (1974) 2633; Ullrich et al., Science 196 (1977) 1313). Dies ist jedoch wegen Toxizität, Entsorgung etc. der verwendeten Agenzien nachteilig.Alternatively, phenol / chloroform can be used as the denaturing agent (Cox, Methods Enzymol. 12B (1968) 120; Glisen et al., Biochemistry 13 (1974) 2633; Ullrich et al., Science 196 (1977) 1313). However, this is disadvantageous because of the toxicity, disposal, etc. of the agents used.
Die extrahierten Nukleinsäuren können schließlich durch verschiedene Methoden aufgereinigt werden. Neben einer einfachen Alkohol-Fällung aus dem Lösungsgemisch ist die Bindung der Nukleinsäuren an Silicia-Matrices eine weitverbreitete Methode. Kommerziell werden Kits zur Durchführung der Silicia-Methode von den Firmen QIAGEN (Hilden, DE), Macherey-Nagel (Düren, DE), Boehringer-Mannheim (Mannheim, DE), Organon Teknika (Turnhout, BE) und diversen anderen Anbietern vertrieben.The extracted nucleic acids can finally be purified by various methods. In addition to simple alcohol precipitation from the mixed solution, the binding of the nucleic acids to silicon matrices is a widely used method. Kits for carrying out the silicon method are commercially available from the companies QIAGEN (Hilden, DE), Macherey-Nagel (Düren, DE), Boehringer-Mannheim (Mannheim, DE), Organon Teknika (Turnhout, BE) and various other providers.
Als Endprodukt erhält man eine in neutraler Lösung (H20 oder Tris-Puffer) vorliegende, meist hochgereinigte Nukleinsäure (Vogelstein und Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) Seite 615-619; Boomet al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495).The end product obtained is a mostly highly purified nucleic acid present in neutral solution (H 2 O or Tris buffer) (Vogelstein and Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) pages 615-619; Boom et al., J Clin Microbiol. 28 (1990) 495).
Während die Extraktion von Viruspartikeln aus Ultrazentrifuga- tions-Pellets außer im Falle von HCV (s.o.) im allgemeinen kein Problem darstellt, sind durch PEG-Fällung aufkonzentrierte Viren schlecht zu extrahieren. Nach einer von Morandi et al. beschriebenen Methode wird ein Extraktionspuffer verwendet und nachfolgend mit Alkohol präzipitiert (J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1534-38). Die so gewonnene Nukleinsäure ist allerdings noch mit PEG kontaminiert und eignet sich nur ungenügend für Folgeanwendungen, bei denen hochreine Nukleinsäuren erforderlich sind.While the extraction of virus particles from ultracentrifugation pellets is generally not a problem except in the case of HCV (see above), viruses concentrated by PEG precipitation are difficult to extract. According to one of Morandi et al. described method, an extraction buffer is used and subsequently precipitated with alcohol (J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1534-38). However, the nucleic acid obtained in this way is still contaminated with PEG and is only unsuitable for follow-up applications in which high-purity nucleic acids are required.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Viren, insbesondere HBV, HCV und HIV, in Blutplasma-Pools nachgewiesen und/oder quantifiziert werden können. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nachweisverfahren für Viren zur Verfügung zu stellen, das eine hochsensitive und schnelle Testung von Blutprodukten (wie z.B. für Thrombozyten erforderlich) ermöglicht, die nur für relativ kurze Zeit haltbar sind.The object of the present invention is therefore to provide a method with which viruses, in particular HBV, HCV and HIV, can be detected and / or quantified in blood plasma pools. It is also an object of the present invention to provide a virus detection method that enables highly sensitive and rapid testing of blood products (such as required for platelets) that can only be kept for a relatively short time.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7 und durch ein Kit nach den Ansprüchen 8 bis 12 gelöst.The object is achieved by a method according to claims 1 to 7 and by a kit according to claims 8 to 12.
Zur Lösung der Aufgabe wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem man Gesamtnukleinsäuren aus Viruspartikeln, die in Plasma oder anderen Flüssigkeiten vorhanden sind, extrahiert und in reiner Form für nachfolgende Anwendungen, insbesondere NATs, isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Reinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren von in flüssigen biologischem Probenmaterial gegebenenfalls vorhanden Viruspartikeln, das dadurch gekennzeichnet ist, daß manTo achieve the object, a method is proposed in which total nucleic acids are extracted from virus particles that are present in plasma or other liquids and isolated in pure form for subsequent applications, in particular NATs. The present invention thus relates to a method for the purification or isolation of nucleic acids from virus particles which may be present in liquid biological sample material, which is characterized in that
a) eine Probe mit Polyethylenglykol (PEG) und Natriumchlorid versetzt und die Viruspartikel in der Kälte, vorzugsweise bei etwa 4°C, ausfällt,a) mixed with polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride in a sample and the virus particles precipitate in the cold, preferably at about 4 ° C.,
b) eine Zentrifugation durchführt undb) carry out a centrifugation and
c) erhaltene Pellets in Guanidinisothiocyanat-Puffer (GIT- Puffer: 6 M Guanidinisothiocyanat (GIT), 200 mM Di- thiothreitol (DTT), 100 mM Tris, pH 6,5) löst.c) pellets obtained in guanidine isothiocyanate buffer (GIT buffer: 6 M guanidine isothiocyanate (GIT), 200 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM Tris, pH 6.5).
Bei dem biologischen Probenmaterial kann es sich um z.B. Plasma- Proben (vorzugsweise aus Plasma-Pools), andere Blutprodukte oder andere Flüssigkeiten handeln, die mit Viren kontaminiert sein können.The biological sample material can be e.g. Plasma samples (preferably from plasma pools), other blood products or other liquids that can be contaminated with viruses.
Die in Stufe c) erhaltenen RNA- bzw. DNA-Proben können anschließend, nach Aufreinigung, durch NAT auf eine mögliche Kontamination mit Viren untersucht werden. Vorzugsweise kann das Virusangereicherte Gemisch aus Stufe c) unmittelbar in einen kommer- ziell erhältlichen Kit zur Isolierung viraler DNA/RNA überführt werden.The RNA or DNA samples obtained in step c) can then, after purification, be examined by NAT for possible contamination with viruses. The virus-enriched mixture from stage c) can preferably be transferred directly to a commercially available kit for isolating viral DNA / RNA.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung viraler Nukleinsäuren, das die o.g. Schritte a) bis c) sowie die zusätzlichen Stufen d) und e) umfaßt, wobei manAccording to a particular embodiment, the invention relates to a method for purifying viral nucleic acids, which the above. Steps a) to c) and the additional stages d) and e) comprises, wherein one
in Stufe d) die in Stufe c) erhaltene Mischung gegebenenfalls mit dem gleichen Volumen Lysis-Puffer eines kommer- ziell erhältlichen Virus-RNA/DNA-Isolierungskits (z.B. "Buffer AVL" des "QIAmp Viral RNA Kits", QIAGEN oder "Binding Buffer" des "High Pure Viral RNA Kits" Boehringer Mannheim oder anderer Hersteller) mischt, anschließend das doppelte Volumen 96-99 %iges Ethanol zugibt, und manin stage d) the mixture obtained in stage c) optionally with the same volume of lysis buffer from a commercially available virus RNA / DNA isolation kit (for example "Buffer AVL" from the "QIAmp Viral RNA Kit", QIAGEN or "binding") Buffer "of the" High Pure Viral RNA Kit "Boehringer Mannheim or other manufacturers) mixes, then the double volume of 96-99% ethanol is added, and one
in Stufe e) eine Reinigung an einer Silicia-Matrix durchführt .in step e) cleaning is carried out on a silicon matrix.
Erfindungsgemäß kann in Stufe d) auf die Zugabe des Lysis-Puf- fers verzichtet und gleich Ethanol zugegeben werden. Alternativ kann anstelle des Lysis-Puffers auch das gleiche Volumen GIT- Puffer zugegeben werden.According to the invention, the addition of the lysis buffer can be dispensed with in stage d) and ethanol can be added immediately. Alternatively, the same volume of GIT buffer can be added instead of the lysis buffer.
Die gereinigten Nukleinsäuren liegen anschließend im Eluat vor.The purified nucleic acids are then present in the eluate.
Als Lysis-Puffer kommen vorzugsweise alle Puffer in Frage, die vom Hersteller der Virus-DNA/RNA-Isolierungskits mitgeliefert werden, es kommen jedoch auch andere Lysis-Puffer in Frage, die vorzugsweise GIT enthalten.All buffers that are supplied by the manufacturer of the virus DNA / RNA isolation kits are preferred as lysis buffers, but other lysis buffers that preferably contain GIT are also suitable.
Zur Reinigung der Virus RNA/DNA sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung die üblicherweise mit den Kits mitgelieferten Silicia- Matrices (.B. als Filter, in Form von Perlen etc.) bevorzugt. Es können jedoch auch andere Materialien eingesetzt werden, die RNA bzw. DNA binden und dadurch deren Reinigung ermöglichen.For the purification of the virus RNA / DNA, the silicon matrices usually supplied with the kits (.B. As a filter, in the form of beads, etc.) are preferred in the context of the present invention. However, other materials can also be used which bind RNA or DNA and thereby enable their purification.
Das Verfahren dient vorzugsweise zur Vorbereitung von biologischen Proben, insbesondere von Proben aus Plasma-Pools, für den anschließenden Einsatz in NAT, wobei die erhaltenen gereinigten Nukleinsäuren ohne weitere Vorbehandlung direkt in das Amplika- tionsverfahren eingesetzt werden können. Die vorzugsweise zur Anwendung kommenden NAT (PCR, bDNA, NASBA etc.) sind dem Fachmann wohlbekannt.The method is preferably used to prepare biological samples, in particular samples from plasma pools, for subsequent use in NAT, the purified nucleic acids obtained being able to be used directly in the amplification process without further pretreatment. The NAT (PCR, bDNA, NASBA etc.) that are preferably used are well known to the person skilled in the art.
Bei den Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um DNA bzw. RNA von HCV, HBV und HIV (insbesondere HIV-1). Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren durchgeführt, indem manThe nucleic acids are in particular DNA or RNA from HCV, HBV and HIV (in particular HIV-1). According to a particular embodiment of the invention, the method is carried out by
in Stufe a) eine Plasmaprobe verwendet und zu einem Proben- volumen von max. ca. 10 ml etwa 3 Vol.-% PEG 6000 und ca. 150 mM einer wässrigen Natriumchloridlösung zugibt und für ca. 15-20 Min. bei ca. 4°C stehenläßt,in stage a) a plasma sample is used and the sample volume is max. Add about 10 ml of about 3% by volume of PEG 6000 and about 150 mM of an aqueous sodium chloride solution and let it stand for about 15-20 minutes at about 4 ° C.
in Stufe b) für 15-20 Min. bei 4°C und ca. 3000 g zentrifu- giert,in step b) centrifuged for 15-20 minutes at 4 ° C and approx. 3000 g,
in Stufe c) zum Lösen des Pellets 300 bis 400 μl GIT-Puffer (s.o.) zugibt und für ca. 10 Min. bei 56°C löst undin step c) add 300 to 400 μl GIT buffer (see above) to dissolve the pellet and dissolve for approx. 10 min at 56 ° C and
in Stufe d) die Lösung mit dem Lysis-Puffer eines kommerziellen Virus-RNA Kits (s.o.) im Verhältnis 1:1 mischt.in step d) the solution is mixed with the lysis buffer of a commercial virus RNA kit (see above) in a ratio of 1: 1.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem manA particularly preferred embodiment of the invention relates to a method in which
a) 4,8 ml eines 96er Plasmapools in einem 7 ml Zentri- fugationsröhrchen mit 300 μl 50%igem PEG 6000 und 150 μl einer 5 M wässrigen Natriumchloridlösung versetzt, mischt und für ca. 15-20 Minuten bei 4°C inkubiert,a) 4.8 ml of a 96 plasma pool in a 7 ml centrifuge tube are mixed with 300 μl of 50% PEG 6000 and 150 μl of a 5 M aqueous sodium chloride solution, mixed and incubated at 4 ° C. for about 15-20 minutes,
b) die Mischung für 15-20 Min. bei 4°C mit 3000 g zentri- fugiert,b) centrifuge the mixture for 15-20 minutes at 4 ° C with 3000 g,
c) 300 bis 400 μl GIT-Puffer (s.o.) zu dem Pellet gibt und dieses durch Inkubation bei ca. 56°C für ca. 10 Min. löst,c) add 300 to 400 μl of GIT buffer (see above) to the pellet and dissolve it by incubation at approx. 56 ° C for approx. 10 minutes,
d) das Lysat mit 300 bis 400 μl GIT-haltigem AVL-Buffer (s.o.) im Verhältnis 1:1 mischt und anschließend mit 600 bis 800 μl 96-99 %igem Ethanol versetzt, e) eine Reinigung an Silicia-Matrix durchführt,d) the lysate is mixed with 300 to 400 μl GIT-containing AVL buffer (see above) in a ratio of 1: 1 and then mixed with 600 to 800 μl 96-99% ethanol, e) cleaning is carried out on silicon matrix,
wobei die gereinigten Nukleinsäuren im Eluat vorliegen.the purified nucleic acids being present in the eluate.
Bei der Reinigung an Silicia-Matrix (SI02, z.B. in Form eines Filters , Perlen etc . ) werden die zunächst gebundenen Nukleinsäuren gewaschen und anschließend von der Säule eluiert.When cleaning on a silicon matrix (SI0 2 , for example in the form of a filter, beads, etc.), the nucleic acids initially bound are washed and then eluted from the column.
Dieses Verfahren dient vorzugsweise der Probenvorbereitung für den Nachweis von HCV, HBV oder HIV (insbesondere HIV-1) aus gepoolten Plasmen von Blutspendern, wobei man nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Probenvorbereitung die Virus-RNA anschließend mittels bekannter Nukleinsäure-Amplifika- tionstechniken (z.B. PCR, bDNA oder NASBA) amplifiziert und nach allgemein bekannten Methoden (wie z.B. durch Hybridisierung mit Hilfe markierter Sonden etc.) nachweist.This method is preferably used for sample preparation for the detection of HCV, HBV or HIV (in particular HIV-1) from pooled plasmas from blood donors. After carrying out the method for sample preparation according to the invention, the virus RNA is then used using known nucleic acid amplification techniques (e.g. PCR, bDNA or NASBA) amplified and detected according to generally known methods (such as by hybridization with the help of labeled probes etc.).
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Reinigungs- bzw. Isolierungsverfahrens oder zur Durchführung des Verfahrens zur Vorbereitung von biologischen Proben für NATs, der definierte Mengen an PEG, Natriumchlorid, GIT-Puffer und Ethanol in geeigneten Aufbewahrungsgefäßen enthält, die es ermöglichen, z.B. ein vorgegebenes Plasma-Probenvolumen dem Verfahren zu unterziehen.The invention further relates to a kit for carrying out the cleaning or isolation method according to the invention or for carrying out the method for preparing biological samples for NATs, which contains defined amounts of PEG, sodium chloride, GIT buffer and ethanol in suitable storage containers, which make it possible to e.g. to subject a predetermined plasma sample volume to the method.
Vorzugsweise enthält der Kit als Polyethylenglykol PEG 6000 und Natriumchlorid in Form einer wässrigen Lösung, gemäß einer besonderen Ausführungsform 50 % PEG 6000 und 5 M wässrige NaCl- Lösung.The kit preferably contains polyethylene glycol PEG 6000 and sodium chloride in the form of an aqueous solution, according to a particular embodiment 50% PEG 6000 and 5 M aqueous NaCl solution.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält der Kit zur Vorbereitung einer Plasmaprobe von je 4,8 ml Volumen a) 300 μl 50%-iges PEG 6000,According to a special embodiment of the invention, the kit contains for preparing a plasma sample of 4.8 ml volume each a) 300 μl of 50% PEG 6000,
b) 150 μl einer 5 M wässrigen Natriumchlorid-Lösung,b) 150 μl of a 5 M aqueous sodium chloride solution,
c) 400 μl GIT-Puffer undc) 400 ul GIT buffer and
d) 800 μl 96-99 % Ethanol.d) 800 ul 96-99% ethanol.
Im Rahmen dieser Erfindung wird erstmals ein Kit zum Nachweis von HCV, HBV oder HIV aus gepoolten Plasmen von Blutspendern zur Verfügung gestellt, der zusätzlich zu den zur Durchführung der Nukleinsäure-Amplifikation erforderlichen Bestandteilen die Bestandteile eines der oben genannten Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Reinigungs- bzw. Isolierungsverfahrens oder Probenvorbereitungsverfahrens enthält.Within the scope of this invention, a kit for the detection of HCV, HBV or HIV from pooled plasmas from blood donors is made available for the first time. or isolation method or sample preparation method.
Die vorliegende Erfindung weist den Vorteil auf, daß die in Stufe e) des Verfahrens erhaltenen (hoch)gereinigten Nukleinsäuren nicht mit PEG kontaminiert sind, da dieses durch das Waschen der an der Matrix gebundenen Nukleinsäuren vollständig entfernt wird. Sie sind ferner derart angereichert, daß mit Hilfe kommerziell erhältlicher NAT-Assays noch etwa 6 IU/ml HCV-RNA (entsprechend ca. 20 RNA-Kopien pro ml) nachgewiesen werden können. Für HBV und HIV-1 wird eine entsprechende Nachweisgrenze er- reicht.The present invention has the advantage that the (highly) purified nucleic acids obtained in stage e) of the method are not contaminated with PEG, since this is completely removed by washing the nucleic acids bound to the matrix. They are also enriched in such a way that about 6 IU / ml HCV-RNA (corresponding to approx. 20 RNA copies per ml) can still be detected with the help of commercially available NAT assays. A corresponding detection limit is reached for HBV and HIV-1.
Diese Nachweisgrenze ermöglicht insbesondere ein Testen von Proben aus Plasma-Pools, wobei die vom Paul-Ehrlich-Institut gesetzten Anforderungen im Hinblick auf eine Mindest-Empfindlich- keit von 5000 IU HCV/ml pro Einzelprobe nicht nur erfüllt sondern um einiges (um einen Faktor von mind. etwa 8 in 96er-Pools) übertroffen werden. Durch die vorliegende Erfindung ist es beispielsweise erstmals möglich, Plasma-Pools zu testen, bei denen nur eine von 96 Einzelproben mit 1000 IU/ml HCV kontaminiert ist, was einer Konzentration von etwa 10 IU/ml im Pool entspricht. Plasma-Pools lassen sich somit erstmals mit kommerziellen NAT- Tests mit hoher Sensitivität auf das Vorhandensein von Viruspartikeln testen, wobei aufgrund der durch die Probenvorbereitung stark verbesserten Sensitivität bzw. deutlich herabgesetz- ten Nachweisgrenze das Erfordernis zur Einzelproben-Untersuchung entfällt.This detection limit enables in particular testing of samples from plasma pools, whereby the requirements set by the Paul Ehrlich Institute with regard to a minimum sensitivity of 5000 IU HCV / ml per individual sample not only meet but also by a lot (by a factor of at least about 8 in pools of 96). For example, the present invention makes it possible for the first time to test plasma pools in which only one of 96 individual samples is contaminated with 1000 IU / ml HCV, which corresponds to a concentration of approximately 10 IU / ml in the pool. Plasma pools can thus be tested for the first time with commercial NAT tests with high sensitivity for the presence of virus particles, whereby the need for single-sample analysis is eliminated due to the greatly improved sensitivity and significantly reduced detection limit due to the sample preparation.
Die Erfindung findet vorzugsweise Anwendung zum Nachweis von HCV, HBV und HIV-1 aus gepoolten Plasmen von Blutspendediensten, die derzeit als Standard 96 Einzelproben umfassen.The invention is preferably used for the detection of HCV, HBV and HIV-1 from pooled plasmas from blood donation services, which currently comprise 96 individual samples as standard.
Das erfindungsgemäße Reinigungs- bzw. Isolierungsverfahren zeichnet sich gegenüber einem Ultrazentrifugations-Protokoll zur Anreicherung von Viruspartikeln aus Flüssigkeiten dadurch aus, daß auf teure Ultrazentrifugen-Ausstattung verzichtet werden kann, da jede Standard-Kühl-Zentrifuge, die 5 - 15 ml Röhrchen aufnehmen kann, zur Durchführung des Verfahrens geeignet ist. Dadurch ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere auch eine parallele Bearbeitung einer großen Anzahl von Proben möglich, d.h. in der Regel mehr als 60 Proben, während bei Verwendung von Ultrazentrifugen infolge der meist sehr geringen Anzahl vorhandener Plätze für Röhrchen in der Zentrifuge (oft weniger als 12) nur wenige Proben gleichzeitig bearbeitet werden können.The cleaning or isolation method according to the invention is distinguished from an ultracentrifugation protocol for the enrichment of virus particles from liquids in that expensive ultracentrifuge equipment can be dispensed with, since each standard cooling centrifuge which can hold 5-15 ml tubes, is suitable for performing the method. As a result, a parallel processing of a large number of samples is also possible in the context of the present invention, i.e. usually more than 60 samples, while when using ultracentrifuges, due to the usually very small number of available spaces for tubes in the centrifuge (often fewer than 12), only a few samples can be processed at the same time.
Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird im Vergleich zur Ultrazentrifugation ferner eine schnellere Sedimentierung der Viruspartikel (ca. 40 min genüber mehreren Stunden) erreicht .Compared to ultracentrifugation, the method of the present invention also achieves faster sedimentation of the virus particles (approx. 40 min over several hours).
Bei erfindungsgemäß durchgeführter ProbenVorbereitung erfordert das gesamte Verfahren zum Nachweis von Viren in Flüssigproben unter Einsatz kommerziell erhältlicher NAT-Assays somit nicht mehr als etwa 7 Stunden. Dadurch kann es auch dann mit Erfolg eingesetzt werden, wenn von der Testung die Freigabe nur für kurze Zeit (3-4 Tage) haltbarer Blutprodukte, wie z.B. Throm- bozyten, abhängt. Im Gegensatz dazu benötigt man derzeit für Nachweisverfahren, bei denen die Anreicherung der Viruspartikel ausschließlich durch Ultrazentrifugation erreicht wird, etwa 2 Tage, welches für die Freigabe von Thrombozyten nicht anwendbar ist. Durch die vorliegende Erfindung wird somit erstmals die hochsensitive Testung von Blutprodukten (wie z.B. von Thrombozyten) gestattet, die nur für relativ kurze Zeit haltbar sind.With sample preparation carried out according to the invention, the entire method for the detection of viruses in liquid samples using commercially available NAT assays thus requires no more than about 7 hours. As a result, it can also be used successfully if the test only releases blood products that are stable for a short time (3-4 days), such as thrombo- bozyten, depends. In contrast, for detection methods in which the enrichment of the virus particles is achieved exclusively by ultracentrifugation, it takes about 2 days, which cannot be used for the release of platelets. The present invention thus allows for the first time the highly sensitive testing of blood products (such as platelets) that can only be kept for a relatively short time.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß insgesamt weniger Probenmaterial zur Durchführug der NAT- Assays eingesetzt werden muß, da anstelle der Einzelproben der gesamte Plasma-Pool getestet werden kann. Ferner ist das Verfahren aufgrund des geringeren Kostenaufwands sowie der enormen Zeitersparnis für Blutspendedienste und Blutbanken, wo mehrere 1000 Proben pro Tag getestet werden müssen, besonders geeignet.The method according to the invention is further characterized in that less sample material has to be used to carry out the NAT assays, since the entire plasma pool can be tested instead of the individual samples. Furthermore, the method is particularly suitable because of the lower cost and the enormous time saving for blood donation services and blood banks, where several 1000 samples have to be tested per day.
Die Erfindung weist außerdem den besonderen Vorteil auf, daß auch lipid-assoziierte Viruspartikel (z.B. HCV) quantitativ präparierbar und mit hoher Sensitivität nachweisbar sind, wäh- rend sie bei Anreicherung durch Ultrazentrifugation in der oben schwimmenden Fettphase verbleiben können.The invention also has the particular advantage that lipid-associated virus particles (e.g. HCV) can also be prepared quantitatively and detected with high sensitivity, while they can remain in the fat phase floating above when enriched by ultracentrifugation.
Gegenüber Standard-Protokollen zur Isolierung von Virus-Nukleinsäuren aus Flüssigkeiten besitzt das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß man nicht auf nur sehr geringe Test-Volumina (100-200 μl) festgelegt ist, da Proben von bis zu 10 ml Volumen eingesetzt werden können. Durch die infolge der erfindungsgemäßen Probenvorbereitung gegenüber dem Stand der Technik um einen Faktor 8 bis 100 erhöhte Empfindlichkeit von 20 oder weniger nachweisbaren Viruskopien/ml ist es möglich, Viren auch in Proben mit sehr geringem Virustiter nachzuweisen bzw. zu quantifizieren. Auf diese Weise wird eine erhöhte Sicherheit bei der Verwendung von Blut(plasma)Produkten erzielt.Compared to standard protocols for isolating virus nucleic acids from liquids, the method according to the invention has the advantage that it is not limited to very small test volumes (100-200 μl), since samples of up to 10 ml volume can be used. As a result of the sample preparation according to the invention compared to the prior art, the sensitivity of virus copies / ml detectable by 20 or less, compared to the prior art, makes it possible to detect or quantify viruses even in samples with a very low virus titer. In this way, increased safety is achieved when using blood (plasma) products.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert. Beispiel 1The present invention is explained in more detail below using examples. example 1
Allgemeines Protokoll zur Isolierung/Reinigung viraler NukleinsäurenGeneral protocol for the isolation / purification of viral nucleic acids
Fällung:Precipitation:
Aus einem großen (Plasma-) Probenvolumen (max. 10 ml) werden Viruspartikel konzentriert. Dies geschieht duch Fällung mit PEG 6000 (ca. 3% Gewichts-Volumenanteil, d.h. 50 g PEG ad 100 ml H20 (w/v)) und NaCl (ca. 150 mM einer wässrigen Lösung) für ca. 15- 20 min in der Kälte (4°C) mit anschließender Zentrifugation (15- 20 min, 4°C, 3000 g) .Virus particles are concentrated from a large (plasma) sample volume (max. 10 ml). This is done by precipitation with PEG 6000 (approx. 3% by weight, ie 50 g PEG ad 100 ml H 2 0 (w / v)) and NaCl (approx. 150 mM of an aqueous solution) for approx. 15-20 min in the cold (4 ° C) with subsequent centrifugation (15-20 min, 4 ° C, 3000 g).
Extraktion:Extraction:
Nach Dekantieren des Überstandes wird das Pellet in 300-400 μl GIT-Puffer (6 M GIT, 200 mM DTT, 100 mM Tris, pH 6,5) durch Inkubation bei ca. 56°C für ca. 10 min gelöst.After decanting the supernatant, the pellet is dissolved in 300-400 μl GIT buffer (6 M GIT, 200 mM DTT, 100 mM Tris, pH 6.5) by incubation at approx. 56 ° C for approx. 10 min.
Reinigung der Nukleinsäuren:Purification of the nucleic acids:
Zur Vorbereitung der Bindung der Nukleinsäuren an die Silicia- Membran wird das Lysat mit dem Lysis-Puffer (s.o.) eines kom- merziellen Virus RNA Isolierungskits (z.B. QIAamp Viral RNA Kit, QIAGEN, oder High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) im Verhältnis 1:1 gemischt und anschließend mit dem doppelten Volumen EtOH (96-99 %) versetzt.To prepare the binding of the nucleic acids to the silicon membrane, the lysate is mixed with the lysis buffer (see above) of a commercial virus RNA isolation kit (eg QIAamp Viral RNA Kit, QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) in a ratio of 1 : 1 mixed and then mixed with twice the volume of EtOH (96-99%).
Das Nukleinsäure-GIT-EtOH Gemisch wird im nächsten Schritt auf eine Nukleinsäure-bindende Silicia-Membran gegeben (als Zentri- fugations-Säulchen in der manuellen oder als Multiwell 96er- System in der maschinellen Variante verschiedener kommerzieller Anbieter, s.o.) und nach Testvorschrift des Herstellers bis zur Elution der gereinigten RNA/DNA weiter verarbeitet. Beispiel 2In the next step, the nucleic acid-GIT-EtOH mixture is placed on a nucleic acid-binding silicon membrane (as a centrifugation column in the manual or as a Multiwell 96 system in the machine variant of various commercial suppliers, see above) and according to the test instructions of the Manufacturer processed until the elution of the purified RNA / DNA. Example 2
Spezielles Anwendungsprotokoll - Nachweis von HCV in BlutplasmaSpecial application protocol - detection of HCV in blood plasma
4,8 ml eines 96er-Plasmapools werden in einem 7 ml Zentrifuga- tionsröhrchen mit 300 μl 50 % PEG 6000 und 150 μl 5 M wässrigem NaCl versetzt, gemischt und für ca. 15-20 min bei 4°C inkubiert.In a 7 ml centrifugation tube, 300 ml 50% PEG 6000 and 150 ml 5 M aqueous NaCl are added to 4.8 ml of a 96 plasma pool, mixed and incubated at 4 ° C for approx. 15-20 min.
Anschließend werden die Röhrchen für 15-20 min bei 4°C mit 3000 g zentrifugiert, um die ausgefällten PEG/Virus-Komplexe zu sedi- mentieren.The tubes are then centrifuged at 3000 g for 15-20 min at 4 ° C. in order to sediment the precipitated PEG / virus complexes.
Nach Dekantieren des Überstandes werden je nach Protokoll der Nukleinsäure-Reinigung (manuell oder maschinell, s.u.) 300-400 μl GIT-Puffer zum Pellet gegeben und dieses durch Inkubation bei ca. 56°C für ca. 10 min gelöst.After decanting the supernatant, 300-400 μl of GIT buffer are added to the pellet, depending on the nucleic acid purification protocol (manual or machine, see below), and this is dissolved by incubation at approx. 56 ° C for approx. 10 min.
Das Lysat wird mit 300-400 μl Lysis-Puffer eines kommerziellen Virus RNA Isolierungskits (z.B. QIAamp Viral RNA Kit (s.u.), QIAGEN, oder High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) im Verhältnis 1:1 gemischt und anschließend mit 600-800 μl 96-99 %igem EtOH versetzt.The lysate is mixed with 300-400 μl lysis buffer of a commercial virus RNA isolation kit (eg QIAamp Viral RNA Kit (see below), QIAGEN, or High Pure Viral RNA Kit, Boehringer) in a ratio of 1: 1 and then with 600-800 μl 96-99% EtOH added.
Das Gemisch wird z.B. bei der manuellen Variante unter Verwen- düng des QIAamp Viral RNA Kits in zwei 630 μl Portionen auf die Zentrifugationssäulchen (Bestandteil des "Viral RNA Kits" , s.o.) gegeben und nach Herstellervorschrift weiter vorgegangen. Bei der maschinellen Variante (QIAamp 96 Viral RNA Test Kit) werden die 7 ml Röhrchen mit dem Lysis-Gemisch in die Primärröhrchen- Adapter des BioRobot 9604 (QIAGEN) gestellt und entsprechend automatisch bis zur Elution der Nukleinsäuren prozessiert.The mixture is e.g. In the manual variant using the QIAamp Viral RNA Kit, put it in two 630 μl portions on the centrifugation columns (part of the "Viral RNA Kit", see above) and proceed according to the manufacturer's instructions. In the machine version (QIAamp 96 Viral RNA Test Kit), the 7 ml tubes with the lysis mixture are placed in the primary tube adapter of the BioRobot 9604 (QIAGEN) and processed automatically until the nucleic acids are eluted.
Zur nachfolgenden Detektion von Virusnukleinsäuren kann jedes etablierte NAT-Verfahren (z.B. PCR) Anwendung finden, das den Einsatz von 10-50 μl in H20 (oder in einem vom Kit-Hersteller gelieferten Elutionspuffer) eluierter Nukleinsäure gestattet. Beispiel 3For the subsequent detection of virus nucleic acids, any established NAT method (for example PCR) can be used which allows the use of 10-50 μl of H 2 0 (or in an elution buffer supplied by the kit manufacturer) eluted nucleic acid. Example 3
Das in Beispiel 2 dargestellte Verfahren wurde anhand von mehreren hundert von ihrer Virusmenge her definierten Proben getestet und eine Nachweisgrenze von ca. 20 Viruskopien/ml durch Einsatz der Nukleinsäure-Eluate in die Amplicor Testsysteme HBV Monitor, HCV Test und HIV-1 Monitor (Hoffmann-La Röche) ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 dargestellt.The method shown in Example 2 was tested on the basis of several hundred samples defined in terms of their virus quantity and a detection limit of approximately 20 virus copies / ml by using the nucleic acid eluates in the Amplicor test systems HBV Monitor, HCV Test and HIV-1 Monitor (Hoffmann -La Röche) determined. The results are shown in Tab. 1.
Tab. 1 : minimale Nachweisgrenzen (Mittelwerte in Nukleinsäure- kopien/ml) der Amplicor HCV v2.0, HBV Monitor und HIV-1 Monitor ® v 1.5 Tests gemäß Standardprotokollen imTab. 1: Minimum detection limits (mean values in nucleic acid copies / ml) of the Amplicor HCV v2.0, HBV Monitor and HIV-1 Monitor ® v 1.5 tests according to standard protocols in the
Vergleich zur erfindungsgemäßen Durchführung des VerfahrensComparison to the implementation of the method according to the invention
bezogen auf die Probenvorbereitung (Nukleinsäure-Extraktio ) gemäß Beispiel 2; zum Amplifizieren wurden die Reagenzien der Amplicor-Tests verwendet. based on sample preparation (nucleic acid extraction) according to Example 2; the reagents of the Amplicor tests were used for amplification.

Claims

Patentansprüche: Claims:
1. Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren von in biologischem Probenmaterial vorhanden Viruspartikeln, dadurch gekennzeichnet, daß man1. A method for the purification and isolation of nucleic acids from virus particles present in biological sample material, characterized in that
a) eine Virus-enthaltende Probe mit Polyethylenglycol und Natriumchlorid versetzt und bei etwa 4°C Viruspartikel ausfällt,a) a virus-containing sample is mixed with polyethylene glycol and sodium chloride and virus particles precipitate at about 4 ° C,
b) eine Zentrifugation durchführt,b) carry out a centrifugation,
c) erhaltene Pellets in Guanidinisothiocyanat-Puffer löst,c) dissolving pellets obtained in guanidine isothiocyanate buffer,
d) zu der in c) erhaltenen Mischung Ethanol zugibt, undd) adding ethanol to the mixture obtained in c), and
e) eine Reinigung an einer Silicia-Matrix durchführt,e) cleaning is carried out on a silicon matrix,
wobei die gereinigten Nukleinsäuren anschließend im Eluat vorliegen.the purified nucleic acids are then present in the eluate.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daO man in Stufe d) die in c) erhaltene Mischung zunächst mit dem gleichen Volumen Lysis-Puffer oder GIT-Puffer mischt und anschließend das doppelte Volumen Ethanol zugibt.2. The method according to claim 1, characterized in that in step d) the mixture obtained in c) is first mixed with the same volume of lysis buffer or GIT buffer and then double the volume of ethanol is added.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Probenmaterial aus der Gruppe bestehend aus Plasma, anderen Blutprodukten sowie anderen Flüssigkeiten ausgewählt ist.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the biological sample material is selected from the group consisting of plasma, other blood products and other liquids.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that one
in Stufe a) eine Plasmaprobe verwendet und zu einem Probenvolumen von max. ca. 10 ml 3 Vol.% Polyethylenglycol 6000 und ca. 150 mM einer wässrigen Natriumchloridlösung zugibt und man für ca. 15-20 Min. bei ca. 4°C stehenläßt,in stage a) a plasma sample is used and a sample volume of max. approx. 10 ml 3 vol.% polyethylene glycol 6000 and about 150 mM of an aqueous sodium chloride solution are added and the mixture is left to stand at about 4 ° C. for about 15-20 minutes,
in Stufe b) für 15-20 Min. bei 4°C und ca. 3000 g zentrifu- giert,in step b) centrifuged for 15-20 minutes at 4 ° C and approx. 3000 g,
in Stufe c) zum Lösen des Pellets 300 bis 400 μl Guanidinisothiocyanat-Puffer zugibt und für ca. 10 Min. bei 56°C löst undin step c) to dissolve the pellet, add 300 to 400 μl of guanidine isothiocyanate buffer and dissolve at 56 ° C. for about 10 minutes and
in Stufe d) die Lösung mit Lysis-Puffer im Verhältnis 1:1 mischt.in stage d) the solution is mixed with lysis buffer in a ratio of 1: 1.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that
a) 4,8 ml eines 96er Plasmapools in einem 7 ml Zentri- fugationsröhrchen mit 300 μl 50%igem Polyethylenglykol 6000 und 150 μl einer 5M-wässrigen Natriumchloridlösung ersetzt, mischt und für ca. 15-20 Minuten bei 4°C inkubiert,a) replacing 4.8 ml of a 96 plasma pool in a 7 ml centrifuge tube with 300 μl of 50% polyethylene glycol 6000 and 150 μl of a 5M aqueous sodium chloride solution, mixing and incubating at 4 ° C. for about 15-20 minutes,
b) für 15-20 Min. bei 4°C mit 3000 g zentrifugiert,b) centrifuged for 15-20 min at 4 ° C with 3000 g,
c) 300 bis 400 μl Guanidinisothiocyanat-Puffer zu dem Pellet gibt und man dieses durch Inkubation bei ca. 56°C für ca. 10 Min. löst,c) 300 to 400 μl of guanidine isothiocyanate buffer are added to the pellet and this is dissolved by incubation at about 56 ° C. for about 10 minutes,
d) das Lysat mit 300 bis 400 μl Guanidinisothiocyanat-hal- tigem Lysispuffer im Verhältnis 1:1 mischt und anschließend mit 600 bis 800 μl Ethanol versetzt undd) the lysate is mixed with 300 to 400 μl guanidine isothiocyanate-containing lysis buffer in a ratio of 1: 1 and then mixed with 600 to 800 μl ethanol and
e) eine Reinigung an Silicia-Matrix durchführt,e) cleaning is carried out on silicon matrix,
wobei die gereinigten Nukleinsäuren im Eluat vorliegen. the purified nucleic acids being present in the eluate.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren zur Vorbereitung von Proben für Nukleinsäure- Amplifikationstechniken dient.6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the method is used to prepare samples for nucleic acid amplification techniques.
7. Verfahren zum Nachweis von HCV, HBV oder HIV aus gepoolten Plasmen von Blutspendern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren zur Probenvorbereitung nach Anspruch 6 durchführt und anschließend die Virus-RNA mit Hilfe einer bekannten Nukleinsäure-Amplifikationstechnik amplifiziert und durch bekannte Methoden nachweist.7. A method for the detection of HCV, HBV or HIV from pooled plasmas from blood donors, characterized in that one carries out a method for sample preparation according to claim 6 and then amplifies the virus RNA using a known nucleic acid amplification technique and detects it by known methods.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Amplifikationstechnik PCR, bDNA oder NASBA ist.8. The method according to claim 7, characterized in that the nucleic acid amplification technique is PCR, bDNA or NASBA.
9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er Polyethylenglykol, Natriumchlorid, Guanidinisothicyanat-Puffer und Ethanol in geeigneten Aufbewahrungsgefäßen in definierten Mengen enthält, die es ermöglichen, ein vorgegebenes Plasma-Probenvolumen dem Verfahren zu unterziehen.9. Kit for carrying out the method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it contains polyethylene glycol, sodium chloride, guanidine isothicyanate buffer and ethanol in suitable storage vessels in defined amounts, which make it possible to subject the method to a predetermined plasma sample volume .
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Polyethylenglykol 6000, Natriumchlorid, gegebenenfalls in Form einer wässrigen Lösung, Guanidin-Isothiocyanat-Puffer und Ethanol in getrennten Gefäßen enthält.10. Kit according to claim 9, characterized in that it contains polyethylene glycol 6000, sodium chloride, optionally in the form of an aqueous solution, guanidine isothiocyanate buffer and ethanol in separate vessels.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Vorbereitung einer Plasmaprobe von je 4,8 ml Volumen11. Kit according to claim 10, characterized in that it is used to prepare a plasma sample of 4.8 ml volume
a) 300 μl 50%iges Polyethylenglykol 6000,a) 300 μl of 50% polyethylene glycol 6000,
b) 150 μl einer 5 M wässrige Natriumchlorid-Lösung,b) 150 μl of a 5 M aqueous sodium chloride solution,
c) 400 μl Guanidinisothiocyanat-Puffer undc) 400 ul guanidine isothiocyanate buffer and
d) 800 μl Ethanol enthält .d) 800 ul ethanol contains.
12. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zu den zur Durchführung der Nukleinsäure-Amplifikation und Nukleinsäure-Nachweis erforderlichen Bestandteilen die Bestandteile eines Kits nach den Ansprüchen 9 bis 11 enthält.12. Kit for carrying out the method according to claim 7, characterized in that it contains, in addition to the components required for carrying out the nucleic acid amplification and nucleic acid detection, the components of a kit according to claims 9 to 11.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Amplifikation PCR, bDNA Oder NASBA ist. 13. Kit according to claim 12, characterized in that the nucleic acid amplification is PCR, bDNA or NASBA.
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