DE102006032610C5

DE102006032610C5 - Method for the parallel isolation of viral nucleic acids

Info

Publication number: DE102006032610C5
Application number: DE102006032610.5A
Authority: DE
Inventors: Dr. Hillebrand Timo
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2016-09-15
Anticipated expiration: 2026-07-12
Also published as: WO2008006865A1; EP2041310A1; DE102006032610A1; DE102006032610B4

Abstract

Verfahren zur parallelen Isolierung viraler doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger viralen Nukleinsäuren zu trennen, wobei die nukleinsäureenthaltende Proben mit einem Lyse-Puffer, der aus einer Salzlösung aus chaotropen Salzen mit einer Ionenstärke, die kleiner als 100 mM ist und anderen nichtchaotropen Salzen, versetzt wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) die nukleinsäurehaltigen Proben (vor deren Lyse) oder die bereits lysierte oder homogenisierten Proben werden in Abwesenheit von Alkohol mit einem Bindungspuffer, der mindestens ein nichtionisches Detergenz in einer Konzentration von 10–50% enthält, so eingestellt, dass die Detergenz-Konzentration zur Anbindung der Nukleinsäuren 10–50%; im finalen Gemisch von Lysepuffer/Bindungspuffer beträgt und so die Gesamtnukleinsäure an einen festen Träger adsorbiert wird b) Entfernen des Trägers mit der adsorbierten Gesamtnukleinsäure c) Waschen und Eluieren der adsorbierten Gesamtnukleinsäure nach bekannten Verfahren.A method for parallel isolation of viral double and single stranded nucleic acids from samples containing these substances, without separating the double and single stranded viral nucleic acids, wherein the nucleic acid containing samples with a lysis buffer consisting of a salt solution of chaotropic salts with an ionic strength, the smaller 100 mM and other non-chaotropic salts, characterized by the following steps: a) the nucleic acid-containing samples (before lysis) or the already lysed or homogenized samples are incubated in the absence of alcohol with a binding buffer comprising at least one nonionic detergent in one Concentration of 10-50%, adjusted so that the detergent concentration for binding of nucleic acids 10-50%; in the final mixture of lysis buffer / binding buffer, and thus the total nucleic acid is adsorbed to a solid support. b) Removal of the carrier with the adsorbed total nucleic acid. c) Washing and elution of the adsorbed total nucleic acid by known methods.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, einfachen und hochsensitiven Isolierung viraler Nukleinsäuren.The invention relates to a method for the rapid, simple and highly sensitive isolation of viral nucleic acids.

Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben (Serum, Plasma, Blut, Liquor, Tupferproben, Organabriebe etc.) zum Nachweis infektiöser Erreger gewinnt immer mehr an Bedeutung. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV breiten sich weltweit immer stärker aus. Darüber hinaus erfordert das massenhafte Auftreten neuartiger Viruserkrankungen (z. B. Vogelgrippe) ein schnelles und flexibles Reagieren für den sensitiven diagnostischen Virusnachweis. Neue Testverfahren auf Basis der Verwendung sensitiver Amplifikationstechniken wie Real Time-PCR ermöglichen einen hocheffizienten Virusnachweis und werden immer stärker als diagnostische Instrumentarien eingesetzt. Dem Schritt der molekularen Probenvorbereitung in der Form der Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren kommt immer größere Bedeutung zu.The examination of diagnostically relevant biological samples (serum, plasma, blood, cerebrospinal fluid, swab samples, organ abrasions, etc.) for the detection of infectious agents is becoming increasingly important. Viral infections such as HIV, HCV or HBV are spreading worldwide. In addition, the mass occurrence of novel viral diseases (eg bird flu) requires rapid and flexible response for sensitive diagnostic virus detection. New testing methods based on the use of sensitive amplification techniques such as real-time PCR enable highly efficient virus detection and are increasingly being used as diagnostic instruments. The step of molecular sample preparation in the form of isolation of the nucleic acids to be detected is becoming increasingly important.

Die Sensitivität des Testsystems wird durch den Prozess der Isolierung der Nukleinsäure maßgeblich beeinflusst.The sensitivity of the test system is significantly influenced by the process of isolating the nucleic acid.

Es existieren eine Reihe von Extraktionsverfahren, welche die Isolierung viraler Nukleinsäuren ermöglichen. Das Patent US 5,234,809 A beschreibt einen Prozess zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase. Die dann bindende feste Phase besteht dabei aus silikatischen mineralischen Partikeln, welche > 50 nm sind. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung. Allerdings zeigt sich in der praktischen Anwendung, das dass in der Patentschrift beschriebene Verfahren eine Reihe von Nachteilen mit sich bringt. Die Verwendung von partikulären Systemen für die Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ist prinzipiell sehr umständlich zu handhaben. Darüber hinaus zeigt sich, dass die Nutzung von Puffern auf der Basis der Verwendung chaotroper Salze in Bezug auf eine notwendige hochsensitive Virusdetektion oftmals nicht ausreicht.There are a number of extraction methods that allow the isolation of viral nucleic acids. The patent US 5,234,809 A describes a process for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase. The then binding solid phase consists of silicate mineral particles, which are> 50 nm. The chaotropic buffers realize both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase. The method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and finds its practical application especially in the field of isolation of viral nucleic acids. However, in practice, the method described in the patent has a number of disadvantages. The use of particulate systems for the attachment of the nucleic acids to be isolated is in principle very cumbersome to handle. In addition, it has been shown that the use of buffers based on the use of chaotropic salts is often insufficient with respect to the need for highly sensitive virus detection.

Eine Verbesserung des Verfahrens offenbart die Patentschrift WO 95/01359 A1 . Das Verfahren beschreibt die chromatographische Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen aus einer Lösung, die eine hohe Salzkonzentration und eine hohe Alkoholkonzentration aufweist.An improvement of the method disclosed in the patent WO 95/01359 A1 , The method describes the chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures from a solution having a high salt concentration and a high alcohol concentration.

Die Lösung wird wiederum mit einem Trägermaterial zur Anbindung der Nukleinsäuren in Kontakt gebracht, nachfolgend wird das Trägermaterial mit an sich bekannten alkoholischen Waschpuffern gewaschen und die gebundene Nukleinsäure final mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer wieder vom Trägermaterial abgelöst.The solution is in turn brought into contact with a carrier material for binding the nucleic acids, subsequently the carrier material is washed with alcoholic wash buffers known per se and the bound nucleic acid is finally removed again from the carrier material by means of water or a low salt buffer.

Das Verfahren realisiert eine effiziente Isolierung und ggf. auch Trennung von Nukleinsäuren/Nukleinsäuregemischen und ist einfach und schnell in der Durchführung. Die Verbesserung gegenüber der oben zitierten Patentschrift wird durch die Zugabe eines Alkohols zum initialen Lysepuffer erreicht. Dieser Schritt ermöglicht eine Effizienzsteigerung des Extraktionsprozesses, welche es gestattet, auch sensitiv Nukleinsäure-Targets aus einer klinischen Probe zu isolieren. Ein weiteres Verfahren der Trennung und Isolierung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren wird in der Patentschrift EP 1146049 A2 offenbart.The method realizes an efficient isolation and possibly also separation of nucleic acids / nucleic acid mixtures and is simple and fast to carry out. The improvement over the patent cited above is achieved by the addition of an alcohol to the initial lysis buffer. This step allows an increase in the efficiency of the extraction process, which also allows to sensitively isolate nucleic acid targets from a clinical sample. Another method of separating and isolating single-stranded and double-stranded nucleic acids is disclosed in the patent EP 1146049 A2 disclosed.

Das Verfahren basiert auf der Behandlung einer Nukleinsäuren enthaltenden Quelle mit mindestens einem mineralischen Trägermaterial in der Form das:

1. die einzelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass nachfolgend vorrangig die einzelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die doppelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
2. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein Gemisch von Erdalkali-Ionen komplexierenden Substanzen ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
3. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch die Anwesenheit eines Sarkosinats aber ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart, dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
4. die doppelsträngige oder einzelsträngige Nukleinsäuren isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass beide Nukleinsäurefraktionen an einen mineralischen Träger adsorbieren. Die Trennung der Nukleinsäuren erfolgt durch eine selektive Elution. Dabei wird die doppelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung verminderter Ionenstärke und niederen aliphatischen Alkoholen vom Trägermaterial abgelöst. Die verbleibende einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.

The method is based on the treatment of a source containing nucleic acids with at least one mineral carrier material in the form:

1. the single-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by an aqueous mixture of chaotropic salts and lower aliphatic alcohols, such that subsequently predominantly the single-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the double-stranded nucleic acid, however, not adsorbed. The bound single-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
2. the double-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by a mixture of alkaline earth ion complexing substances without lower aliphatic alcohols, such that below primarily the double-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the single-stranded nucleic acid, however, does not adsorb. The bound double-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
3. the double-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by the presence of a sarcosinate but without lower aliphatic alcohols, such that subsequently predominantly the double-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the single-stranded nucleic acid, however, does not adsorb. The bound double-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
4. the double-stranded or single-stranded nucleic acids is isolated by adjusting the treatment conditions by an aqueous mixture of chaotropic salts and lower aliphatic alcohols, such that both nucleic acid fractions adsorb to a mineral carrier. The separation of the nucleic acids takes place by a selective elution. In this case, the double-stranded nucleic acid is detached from the carrier material by means of a solution of reduced ionic strength and lower aliphatic alcohols. The remaining single-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally detached from the carrier material by means of a low-salt buffer.

Alternativ dazu kann die einzelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung, welche Erdalkali-Ionen komplexierende Substanzen und/oder Sarkosinate enthält, selektiv vom Trägermaterial eluiert werden. Die nunmehr verbleibende doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend wiederum gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.Alternatively, the single-stranded nucleic acid can be selectively eluted from the support material by means of a solution containing alkaline earth ion complexing substances and / or sarcosinates. The now remaining double-stranded nucleic acid is subsequently washed again and finally detached from the carrier material by means of a low-salt buffer.

Das Verfahren ist wiederum einfach in der Durchführung und kann DNA oder RNA aus biologischen Proben isolieren. Auch wenn sich das Patent auf die Trennung von Nukleinsäuregemischen bezieht, wird dem Fachmann beim Lesen des Unteranspruches 4 klar, das wiederum, wie schon in der Patentschrift WO 95/01359 A1 beschrieben, durch die Kombination einer Salzlösung mit einem Alkohol, die Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Material realisiert wird. Entscheidend für den Schritt der Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Materialien ist dabei wiederum die Existenz eines Alkohols in den für den Extraktionsprozess eingesetzten Puffer. Damit weist der Stand der Technik darauf hin, das eine Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben unter Verwendung von chaotropen Salzen allein funktioniert, das Verfahren aber erst durch die Zugabe eines Alkohols (d. h. eine Kombination aus einer salzhaltigen Lösung mit einem aliphatischen Alkohol) wirklich effizient wird.Again, the process is simple to carry out and can isolate DNA or RNA from biological samples. Even if the patent refers to the separation of nucleic acid mixtures, the skilled person will read the dependent claim 4, which in turn, as in the patent WO 95/01359 A1 described, the combination of a saline solution with an alcohol, the attachment of nucleic acids to a mineral material is realized. Crucial for the step of attaching nucleic acids to mineral materials is again the existence of an alcohol in the buffer used for the extraction process. Thus, the prior art indicates that isolation of nucleic acids from biological samples using chaotropic salts alone works, but the process becomes truly efficient only by the addition of an alcohol (ie, a combination of a saline solution with an aliphatic alcohol) ,

Der Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile, die im Stand der Technik genannt wurden, zu beseitigen.The invention was based on the object to eliminate the disadvantages mentioned in the prior art.

Die erfindungsgemäße Aufgabe konnte in überraschender Weise einfach gelöst werden. Das Verfahren ist durch den Patentanspruch 1 mit seinen Verfahrensalternativen charakterisiert. Die Unteransprüche 2 bis 6 betreffen spezifische Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The object of the invention could be solved in a surprising manner. The method is characterized by claim 1 with its alternative methods. The dependent claims 2 to 6 relate to specific embodiments of the method according to the invention.

Erfindungsgemäß wurde ein alternatives Verfahren bereitgestellt, welches es erlaubt, schnell, einfach und preiswert virale Nukleinsäuren aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe zu isolieren, ohne dass die für die selektive Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Lösungen einen Alkohol enthalten. Dabei gestattet das Verfahren, gleichzeitig und damit keine Trennung von Nukleinsäuregemischen bewirkend, DNA (doppelsträngige Nukleinsäure) und RNA (einzelsträngige Nukleinsäure) aus einer Ausgangsprobe zu isolieren. Insbesondere ist das Verfahren in der Lage, hochsensitiv virale Nukleinsäuren aus diagnostisch relevanten biologischen Proben zu isolieren.According to the invention, an alternative method has been provided which allows rapid, simple and inexpensive viral nucleic acids to be isolated from a nucleic acid-containing sample without the solutions necessary for the selective attachment of the nucleic acids containing an alcohol. At the same time, the method makes it possible to isolate DNA (double-stranded nucleic acid) and RNA (single-stranded nucleic acid) from a starting sample at the same time and thus does not cause separation of nucleic acid mixtures. In particular, the method is able to isolate highly sensitive viral nucleic acids from diagnostically relevant biological samples.

Überraschender Weise kann eine hocheffiziente Isolierung von virale Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe auch auf einem ganz anderen Weg, als im Stand der Technik beschrieben, erreicht werden, wobei gänzlich auf die dafür bisher notwendige essentielle Komponente Alkohol verzichtet wird.Surprisingly, a highly efficient isolation of viral nucleic acids from a biological sample can also be achieved in a completely different way than described in the prior art, omitting entirely the essential component alcohol previously required for this purpose.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Lyse einer biologischen Probe mit Lysepuffern wie im Anspruch 1 beschrieben. Diese Puffersysteme erlauben in ihrer bekannten Funktion den Aufschluss und eine Denaturierung einer biologischen Probe und bewirken auch eine Inaktivierung endogener RNasen. Dies ist insbesondere in Hinblick auf die Isolierung von RNA wesentlich. Es können auch Lysepuffer verwendet werden, welche eine Kombination von chaotropen Salzen und anderen Salzen wie beansprucht darstellen und welche zur Unterstützung des Lyseprozesses ggf. noch Detergenzien und ggf. weitere Zusätze enthalten, wobei bei den chaotropen Salzen keine an sich bekannten hohen Ionenstärken verwendet werden. Eine solche Kombination erlaubt dann eine effiziente Einbeziehung proteolytischer Enzyme (z. B. Proteinase K) für einen wirksamen Aufschluss des Ausgangsmaterials.The inventive method is based on the lysis of a biological sample with lysis buffers as described in claim 1. These buffer systems allow in their known function the digestion and denaturation of a biological sample and also cause inactivation of endogenous RNases. This is especially important with regard to the isolation of RNA. It is also possible to use lysis buffers which represent a combination of chaotropic salts and other salts as claimed and which optionally also contain detergents and optionally further additives for supporting the lysis process, wherein no high ionic strengths known per se are used in the chaotropic salts. Such a combination then allows efficient incorporation of proteolytic enzymes (eg proteinase K) for efficient digestion of the starting material.

Nach Lyse des Ausgangsmaterials werden dann die Bindungsbedingungen zur Anbindung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial eingestellt.After lysis of the starting material, the binding conditions for binding the nucleic acids contained in the sample to a mineral carrier material are then set.

Dies erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren nicht durch die Zugabe eines Alkohols, sondern überraschender Weise durch die Zugabe eines nichtionischen Detergenzes, wie z. B. Tween-20, Tween-80 oder Triton X-100 in einer hohen Konzentration. Die Zugabe des Detergenzes ist dabei der essentielle Schritt. Das Detergenz ersetzt erfindungsgemäß komplett die Funktion der Zugabe einer bisher dazu notwendigen alkoholischen Komponente. Der Lyseansatz, welcher mit dem Detergenz gemischt wird, wird nachfolgend mit einem Träger, vorzugsweise ein mineralischer Träger oder oberflächenfunktionalisierte Magnetpartikel oder Eisenoxydpartikel, in Kontakt gebracht, wodurch die zu isolierenden Nukleinsäuren an den mineralischen Träger adsorbieren. Der mineralische Träger wird nachfolgend mit an sich bekannten Waschpuffern gewaschen und final wiederum mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material abgelöst. Die für die Anbindung der Nukleinsäuren benötigte Detergenz-Komponente kann darüber hinaus auch als ein Gemisch von Detergenz mit weiteren Salzen und ggf. weiteren Zusätzen vorliegen. Damit können immer jeweils optimale Bindungsbedingungen in der Kombination von Salz/Detergenz erreicht werden, ohne das dies auf die initiale Nutzung eines effizienten Lyepuffers einen Einfluss hat. So kann z. B. ein Lysepuffer zum initialen Probenaufschluss eingesetzt werden, welcher nur eine geringe Salzkonzentration aufweist (welche nicht ausreichend wäre, um in der Kombination mit einem Detergenz eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren zu vermitteln). Nach Probenaufschluss wird dem Reaktionsansatz dann ein Bindungspuffer zugegeben, welcher ein nichtionisches Detergenz hoher Konzentration sowie zusätzlich eine hohe Salzkonzentration aufweist. Damit werden dann die Bindungsbedingungen eingestellt, die eine quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren effizient vermitteln. Entscheidend ist immer, dass über den Bindungspuffer auf der Basis einer hohen Konzentration nichtionischer Detergenzien auch die weiteren Komponenten bereitgestellt werden, welche eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ermöglichen. This is done in the process according to the invention not by the addition of an alcohol, but surprisingly by the addition of a nonionic detergent such. Tween-20, Tween-80 or Triton X-100 in a high concentration. The addition of the detergent is the essential step. According to the invention, the detergent completely replaces the function of adding a previously necessary alcoholic component. The lysis mixture, which is mixed with the detergent, is subsequently brought into contact with a carrier, preferably a mineral carrier or surface-functionalized magnetic particles or iron oxide particles, whereby the nucleic acids to be isolated are adsorbed to the mineral carrier. The mineral carrier is subsequently washed with known washing buffers and final, in turn, detached from the mineral material by means of water or a low salt buffer. In addition, the detergent component required for the binding of the nucleic acids can also be present as a mixture of detergent with further salts and optionally further additives. Thus, optimal binding conditions in the combination of salt / detergent can always be achieved without this having an effect on the initial use of an efficient lyophil buffer. So z. B. a lysis buffer for initial sample digestion are used, which has only a low salt concentration (which would not be sufficient to provide in combination with a detergent efficient binding of the nucleic acids to be isolated). After sample digestion, a binding buffer is then added to the reaction mixture which has a nonionic detergent of high concentration and, in addition, a high salt concentration. This then sets the binding conditions that efficiently mediate quantitative isolation of the viral nucleic acids. It is always crucial that the binding buffer based on a high concentration of nonionic detergents also provides the further components which enable an efficient binding of the nucleic acids to be isolated.

Das Verfahren ist damit komplett alternativ zu den beschriebenen Verfahren, welche für eine effiziente Anbindung von viraler Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien einen Alkohol benötigen. Es erlaubt darüber hinaus die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngige viraler Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, ohne die doppelsträngige und einzelsträngige Nukleinsäuren zu trennen. Die Einstellung der Bindungsbedingungen für Nukleinsäuren für deren Adsorption an ein mineralisches Trägermaterial erfolgt immer nach der Lyse des Ausgangsmaterials durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Bindungspuffers, enthaltend eine hohe Konzentration eines nichtionischen Detergenzes und ggf. enthaltend weitere Zusätzen.The method is thus completely alternative to the described methods, which require an alcohol for efficient attachment of viral nucleic acids to mineral support materials. It also allows the parallel isolation of double-stranded and single-stranded viral nucleic acids from a biological sample without separating the double-stranded and single-stranded nucleic acids. The adjustment of the binding conditions for nucleic acids for their adsorption to a mineral carrier material is always carried out after the lysis of the starting material by the addition of the binding buffer according to the invention, containing a high concentration of a nonionic detergent and optionally containing further additives.

Die Erfindung ermöglicht erstmals die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngiger viraler Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen Probe, wobei die nukleinsäureenthaltende Probe mit einem Puffer, der aus chaotropen Salzen geringer Ionenstärke (kleiner 100 mM) und anderen nichtchaotropen Salzen besteht, sowie ggf. weiteren Zusätzen wie Detergenzien (SDS, Sarkosinat, LDS), proteolytischen Enzymen, komplexierenden Verbindungen (EDTA, EGTA), inkubiert wird, unter diesen Bedingungen ein Aufschluss der biologischen Probe erfolgt, so dass die Nukleinsäuren in den Puffer freigesetzt werden.For the first time, the invention enables the parallel isolation of double-stranded and single-stranded viral nucleic acids from a nucleic acid-containing sample, wherein the nucleic acid-containing sample with a buffer consisting of chaotropic salts of low ionic strength (less than 100 mM) and other non-chaotropic salts, and optionally other additives such as detergents ( SDS, sarcosinate, LDS), proteolytic enzymes, complexing compounds (EDTA, EGTA), incubated, under these conditions, a digestion of the biological sample takes place, so that the nucleic acids are released into the buffer.

Erfindungsgemäß werden durch die Zugabe eines Bindungspuffers bestehend aus:

a) einem nichtionischen Detergenz oder
b) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit Wasser oder
c) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit einer Salzlösung

und ggf. weiteren Zusätzen, aber ohne Alkohol, Bedingungen eingestellt, die es ermöglichen, sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige Nukleinsäuren an ein mineralisches Material (Träger) zu adsorbieren. Die Konzentration an Detergenz zur Anbindung der Nukleinsäuren beträgt 5–50%; vorzugsweise 10–30% im finalen Gemisch von Lysepuffer/Bindungspuffer.According to the invention, by adding a binding buffer consisting of:

a) a nonionic detergent or
b) a mixture of a nonionic detergent with water or
c) a mixture of a nonionic detergent with a saline solution

and optionally further additives, but without alcohol, set conditions that make it possible to adsorb both double-stranded and single-stranded nucleic acids to a mineral material (carrier). The concentration of detergent for binding the nucleic acids is 5-50%; preferably 10-30% in the final mixture of lysis buffer / binding buffer.

Das mineralische Material nachfolgend mit Waschpuffer wäscht und die Nukleinsäuren mittels Wasser oder Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material wieder ablöst.Subsequently, wash the mineral material with wash buffer and detach the nucleic acids from the mineral material using water or low salt buffer.

Beispiel (nicht erfindungsgemäß)Example (not according to the invention)

Beispiel: Isolierung viraler Nukleinsäuren aus BlutplasmaExample: Isolation of viral nucleic acids from blood plasma

Zwei Blutplasma-Proben wurden mit HIV Viren und HBV Viren gespiked und für die Isolierung der viralen Nukleinsäure eingesetzt. 150 μl der Probe wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Probe wurde nachfolgend mit 450 μl eines Lysepuffers (4 M Guanidinthiocyanat, 80 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) versetzt und 10 s gevortext. Anschließend wurde die Probe bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Nach der Lyse und Denaturierung der Ausgangsprobe wurden 600 μl eines Bindungspuffers (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) zugegeben und die Probe vollständig durchmischt. Der Ansatz wurde nachfolgend über eine Filtersäule, welche ein kommerziell verfügbares Glasfaser-Filterpapier (Fa. Whatmann) enthielt, zentrifugiert. Die Filtersäule wurde nachfolgend mit alkoholischen Waschpuffern gewaschen. Danach kurz zentrifugiert, um das Filtermaterial zu trocknen. Die Elution der gebundenen viralen Nukleinsäure erfolgte mittels der Zugabe von 50 μl RNAse freiem Wasser.Two blood plasma samples were spiked with HIV virus and HBV virus and used for the isolation of the viral nucleic acid. 150 μl of the sample was transferred to a 1.5 ml reaction vessel. The sample was subsequently added with 450 μl of a lysis buffer (4 M guanidine thiocyanate, 80 mM trisodium citrate dihydrate) and vortexed for 10 s. Subsequently, the sample was incubated at room temperature for 10 min. After lysis and denaturation of the starting sample, 600 μl of a binding buffer (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM trisodium citrate dihydrate) was added and the sample completely mixed. The batch was subsequently centrifuged over a filter column which contained a commercially available glass fiber filter paper (Whatman). The filter column was subsequently washed with alcoholic wash buffers. Centrifuged briefly to dry the filter material. The elution of the bound viral nucleic acid was carried out by the addition of 50 μl RNAse free water.

Die isolierte Nukleinsäure wurde dann zum spezifischen Virusnachweis von HIV bzw. HBV mittels Real-Time PCR analysiert. Der Nachweis der viralen Nukleinsäuren war erfolgreich. Ergebnisse: Plasma Probe Virusnachweis CT-Wert Probe 1 HIV 1000 IU/ml 34,33 Probe 1 HBV 500 IU/ml 30,52 Probe 2 HIV 1000 IU/ml 34,86 Probe 2 HBV 500 IU/ml 30,78 The isolated nucleic acid was then analyzed for specific virus detection of HIV or HBV by means of real-time PCR. The detection of viral nucleic acids was successful. Results: Plasma sample virus detection CT value Sample 1 HIV 1000 IU / ml 34.33 Sample 1 HBV 500 IU / ml 30.52 Sample 2 HIV 1000 IU / ml 34.86 Sample 2 HBV 500 IU / ml 30.78

Claims

A method for parallel isolation of viral double and single stranded nucleic acids from samples containing these substances without separating the double and single stranded viral nucleic acids, wherein the nucleic acid containing samples with a lysis buffer consisting of a salt solution of chaotropic salts with an ionic strength, the smaller is added as 100 mM and other non-chaotropic salts, characterized by the following steps: a) the nucleic acid-containing samples (before lysis) or the already lysed or homogenized samples are adjusted in the absence of alcohol with a binding buffer containing at least one nonionic detergent in a concentration of 10-50%, so that the detergent concentration Binding of nucleic acids 10-50%; in the final mixture of lysis buffer / binding buffer and thus the total nucleic acid is adsorbed to a solid support b) removing the carrier with the adsorbed total nucleic acid c) washing and eluting the adsorbed total nucleic acid according to known methods.

A method according to claim 1, characterized in that in known lysis buffers low ionic strength (less than 100 mM), the nonionic detergent additionally contains a salt solution of high concentration (greater than 1 M).

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the detergent used is Tween-20, Tween-80 or Triton X-100.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the binding buffer additionally contains a) SDS, sarcosinate, LDS and / or b) complexing compounds, in particular EDTA or EGTA.

A method according to claim 1, characterized in that as a solid carrier, a mineral carrier or magnetic iron oxide particles, preferably with modified surfaces, are used.

Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the solid support is part of a mini-centrifugation column.