Beschreibung description
ImmobilisierungssubstanzImmobilizing substance
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Immobilisie¬ rungssubstanz zur Bindung von biologischem Material an Trägern zu schaffen.The object of the invention is to provide an immobilizing substance for binding biological material to carriers.
Diese Immobilisierungεsubstanz ist' dadurch gekennzeichnet, daß adhäεive Proteine, die aus extrazellulären Strukturen, inεbesonTlere Fimbrien, Pili, äußeren Membranen oder Kapsel von Gram-negativen Bakterien, insbesondere Colibakterien, isoliert sind, verwendet werden.This immobilization substance is characterized in that adhesive proteins which are isolated from extracellular structures, in particular fimbriae, pili, outer membranes or capsules of Gram-negative bacteria, in particular coli bacteria, are used.
Diese adhäsiven Proteine (Adhäεine) besitzen typiεcherweis ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 12 000 bis 30 000 Dalton und können Kohlehydratkomponenten von Glyco- lipoiden und Glycoproteinen höherer Zellen erkennen. Diese adhäsiven Proteine vermitteln die Adhärenε der Bakterien an höhere Zellen (z. B. Erythrozyten, ymphozyten) und an Gewebe (z. B. Epithel). Diese adhäεiven Proteine werden im allgemeinen von Säugetier-Proteoεen nicht geεpalten.These adhesive proteins (adhesins) typically have a molecular weight of the order of 12,000 to 30,000 daltons and can recognize carbohydrate components of glycolipoids and glycoproteins of higher cells. These adhesive proteins mediate the adherence of the bacteria to higher cells (e.g. erythrocytes, ymphocytes) and to tissues (e.g. epithelium). These adhesive proteins are generally not cleaved by mammalian proteoses.
Dieεe iεolierten adhäεiven Proteine (Glycoproteine) bzw. di entsprechenden Bindungsstellen dieser Proteine oder der Proteinfragmente oder der gegebenenfalls daraus z. B. durch Hydrolyse gewonnenen Polypeptide werden erfindungsgemäß zur Immobilisierung von Zellen, insbeεondere Säugerzellen, Gewe ben, von pharmazeutischen Wirkstoffen, Antikörpern oderThe isolated adhesive proteins (glycoproteins) or the corresponding binding sites of these proteins or the protein fragments or the z. B. polypeptides obtained by hydrolysis are according to the invention for the immobilization of cells, in particular mammalian cells, tissue, pharmaceutical active ingredients, antibodies or
Wachstumεkörpern an Trägern verwendet. Inεbesondere für die Oberflächenaufbereitung von Implantaten lassen sich diese adhäsiven Proteine als Anheftfaktoren für Säugetierzellen bzw. Gewebe verwenden. Die Zellen bzw. Gewebe lassen sich über die adhäεiven Proteine an der Oberfläche eines Implan-
tatgrundkörperε quaεi irreversibel binden. Als Wachεtumε- faktoren kommen Blutserum oder Beεtandteile davon εowie Fibronektin in Frage. Auch eine Kombination auε Stoff- Wechselprodukten von Zellen und auf biochemischem Weg modi- fizierten Naturprodukten sind als Wachstumεfaktoren geeig¬ net. Weitere Wachεtumsfaktoren können zur Zelldifferenzie¬ rung führende Proteine und Knochenεubstanz induzierende Pro teine sein. Bei den Implantaten kann es sich um extra- korporale oder implantierbare künstliche Organe, Gefäße, Prothesen, Hautersatz, Zahnersatz, künstliche Augenlinsen, Kontaktlinsen und dgl. handeln. Durch kovalente Bindung können die Adhäsine an den Implantatoberflächen gebunden sein.Growth bodies used on carriers. In particular for the surface preparation of implants, these adhesive proteins can be used as attachment factors for mammalian cells or tissues. The cells or tissues can be found on the surface of an implant using the adhesive proteins. tie the basic body of the body irreversibly. Blood serum or parts thereof as well as fibronectin come into consideration as growth factors. A combination of metabolic products of cells and biochemically modified natural products are also suitable as growth factors. Further growth factors can be proteins which lead to cell differentiation and proteins which induce bone substance. The implants can be extra-corporal or implantable artificial organs, vessels, prostheses, skin replacements, dentures, artificial eye lenses, contact lenses and the like. The adhesins can be bound to the implant surfaces by covalent binding.
Auch bei der Formulierung von Arzneimitteln lasεen εich die adhäsiven Proteine zur Bindung der pharmazeutischen Wirk¬ sto fe, insbesondere von Blutgerinnungsmitteln, an den Trä¬ gerkörpern, inεbeεondere pulverförmigen Trägerkörpern, ver¬ wenden.The adhesive proteins can also be used in the formulation of pharmaceuticals to bind the pharmaceutical active substances, in particular blood coagulants, to the carrier bodies, in particular powdered carrier bodies.
Alε Trägerkörper kommen auch Kohlehydratkomponenten von Glycolipoiden und Glycoproteinen enthaltenden höheren Zelle in Frage, da dieεe von den adhäεiven Proteinen spezifisch erkannt werden.Carbohydrate components of glycolipoids and higher cell containing glycoproteins are also suitable as carrier bodies, since these are specifically recognized by the adhesive proteins.
Ferner können die adhäsiven Proteine als Immobilisierungε- substanz für Antikörper produzierende Zellen, inεbeεondere Säugerzellen, von Gewebe und dgl. verwendet werden. Ferner besteht eine Anwendungsmöglichkeit der Adhäεine in der Endo theliumbildung bei Gefäßverpflanzungen.Furthermore, the adhesive proteins can be used as immobilizing substance for antibody-producing cells, in particular mammalian cells, of tissue and the like. There is also an application of the adhesives in the formation of endothelium in vascular grafts.
Eine weitere wichtige Anwendung besteht darin, daß die Ad¬ häεine in der Chirurgie als Gewebekleber zum Einsatz kommen Da die Adhäsine wasεerlöεlich sind, können sie als Einkompo
nentenkleber zur Anwendung kommen. Die Anwendungεgebiete sind insbesondere die Unfallchirurgie, die Weichteilchirur gie und auch die Leberchirurgie, da in diesen Fällen Nähte häufig nicht zum gewünschten Erfolg führen. Gegenüber den bislang verwendeten Fimbrienklebern, bei denen es εich um einen Z"weikomponentenkleber handelt, der während der Opera tion angemischt und schnell verarbeitet werden muß, und in der Handhabung daher schwierig und nicht ohne Risiko für d Blutgerinnung ist, treten bei dem Adhäsine-Gewebekleber di se Nachteile nicht auf. Da Adhäsine wasserlöslich sind, kö nen siegln Form eines Einkomponentenklebers verwendet wer¬ den.Another important application is that the adhesives are used in surgery as tissue adhesives. Since the adhesins are water-soluble, they can be used as a single component can be used. The areas of application are in particular trauma surgery, soft tissue surgery and also liver surgery, since in these cases sutures often do not lead to the desired success. Compared to the Fimbrienklebern hitherto used, which are εich is a Z "weikomponentenkleber, which must be mixed tion during the Opera and quickly processed, and to use therefore difficult and not without risk for d clotting, contact tissue adhesive adhesins wherein di se disadvantages do not occur. Because adhesions are water soluble, you can take it nen g ln the form of a single-component used wer¬ to.
Bevorzugt kommen Nicht-Fi brien-assoziierte Adhäεine zum Einsatz, da diese εich mit größerer Ausbeute von der Zell¬ oberfläche der Bakterien isolieren laεsen. Diese Nicht- Fimbrien-assoziierten Adhäsine, welche bevorzugt aus Escherichia Coli-Bakterien gewonnen werden, binden selekti an Humanzellmembranen. Das Molekulargewicht liegt in der Größenordnung von 12 000 bis 30 000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 20 000 Dalton. Die Nicht-Fimbrien-aεsoziierten Adhäεine können Aggregate bilden. Dieses dann apparenteNon-Fi brien-associated adhesives are preferably used, since they can be isolated from the cell surface of the bacteria with greater yield. These non-fimbria-associated adhesins, which are preferably obtained from Escherichia coli bacteria, bind selectively to human cell membranes. The molecular weight is on the order of 12,000 to 30,000 daltons, preferably in the range of 20,000 daltons. The non-fimbria-associated adhesins can form aggregates. This then apparent
Molekulargewicht nach der Aggregatbildung beträgt etwaMolecular weight after aggregate formation is approximately
6 7 10 bis 10 Dalton. Ferner sind dieεe Adhäsine wasserlösli6 7 10 to 10 daltons. Furthermore, these adhesins are water-soluble
Für die Gewinnung der Adhäsine läßt εich folgendes Verfahr durchführen. Auf Agar lassen sich in beispielsweise Petri- schalen die entsprechenden E. Coli-Bakterien kultivieren. Trennung der Adhäsine von den Zellmembranen der Bakterien werden dieεe zunächst ultrabeschallt und dann durch Ultraz trifugieren getrennt urid nachfolgende chromatographische A reinigung gereinigt. Man erhält bei der Kultivierung in 10 Petrischalten mit 14 cm Durchmeεεer etwa 40 bis 50 mg grob gereinigte Adhäsine bzw. etwa 30 mg hoch gereinigte Adhäεi
Die gewonnenen Nicht-Fimbrien-assoziierten Adhäsine können je nach E. Coli-Stamm folgende Spezifizitäten aufweisen:The following procedure can be carried out for obtaining the adhesins. The corresponding E. coli bacteria can be cultivated on agar in, for example, petri dishes. Separation of the adhesins from the cell membranes of the bacteria are first sonicated and then separated by ultracentrifugation and then purified by subsequent chromatographic purification. In the cultivation in 10 petri dishes with a diameter of 14 cm, about 40 to 50 mg of coarsely purified adhesins or about 30 mg of highly purified adhesions are obtained The non-fimbria-associated adhesins obtained can have the following specificities depending on the E. coli strain:
Spezifitäten bei den Nicht-Fimbrien-assoziierten Adhäsinen (NFA)Specificities in non-fimbria associated adhesins (NFA)
NFA-1: Rezeptor ist das Glycophorin A (Vorkommen ist vor allem auf Erythrozyten, Bindung aber auch an Nierenzellen)NFA-1: the receptor is glycophorin A (occurs mainly on erythrocytes, but also binds to kidney cells)
NFA-2: Rezeptor ist daε Glycophorin ANFA-2: The receptor is glycophorin A.
NFA-3: Rezeptor iεt daε Blutgruppenantigen NNFA-3: receptor is the blood group antigen N
NFA-4: Rezeptor iεt daε Blutgruppenantigen MNFA-4: receptor is the blood group antigen M
NFA-5: Rezeptor ist das Blutgruppenantigen M.
NFA-5: The receptor is the blood group antigen M.