EP0077796A1 - New medicine comprised of an aprotinine-plasmine complex and method for the preparation of such new complex - Google Patents

New medicine comprised of an aprotinine-plasmine complex and method for the preparation of such new complex

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EP0077796A1
EP0077796A1 EP19820901356 EP82901356A EP0077796A1 EP 0077796 A1 EP0077796 A1 EP 0077796A1 EP 19820901356 EP19820901356 EP 19820901356 EP 82901356 A EP82901356 A EP 82901356A EP 0077796 A1 EP0077796 A1 EP 0077796A1
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plasmin
aprotinin
complex
plasminogen
activator
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EP19820901356
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Abstract

Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine, dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont presentes dans un rapport qui peut varier de 1/1 a 2/1 environ. Procede de preparation de ce complexe, qui consiste a mettre en contact de la plasmine ou son precurseur, a savoir le plasminogene associe a un activateur, avec de l'aprotinine, en quantites appropriees, dans un solvant approprie, et a purifier le complexe aprotinine-plasmine obtenu par passage sur une colonne Sepharose-lysine. Application en tant que medicament pour les traitements fibrinolytiques.New drug constituted by an aprotinin-plasmin complex, in which aprotinin and plasmin are present in a ratio which can vary from 1/1 to 2/1 approximately. Process for the preparation of this complex, which consists in bringing plasmin or its precursor, namely the plasminogen associated with an activator, into contact with aprotinin, in appropriate quantities, in an appropriate solvent, and in purifying the aprotinin complex -plasmin obtained by passage through a Sepharose-lysine column. Application as a medicament for fibrinolytic treatments.

Description

MEDICAMENT NOUVEAU CONSTITUE PAR UN COMPLEXE APROTININE- PLASMINE ET PROCEDE DE PREPARATION DE CE NOUVEAU COMPLEXE La présente invention est relative à un produit nouveau constitué par un complexe aprotinine-plasmine et plus particulièrement aprotinine-lys plasmine humaine et à l'utilisation de ce complexe nouveau en tant que médicament, notamment en tant que thrombolytique. The present invention relates to a new product constituted by an aprotinin-plasmin complex and more particularly to aprotinin-lys human plasmin and to the use of this new complex. as a medicament, especially as a thrombolytic.
L'aprotinine est un inhibiteur naturel compétitif d'un certain nombre d'endopeptidases, extrait d'organes de bovins tels que poumons, pancréas, parotides, dans lesquels il est présent dans les microsomes cellulaires. Son activité d'inhibition, en particulier vis-à-vis de la trypsine, de la kallikréine et de la plasmine, a permis son utilisation en thérapeutique, notamment dans les fibrinolyses cataclysmiques en raison de son activité antiplasmine. L'Inventeur (cf. VAIREL E.G., ANTOINE G., Ann. Anesth. Franc., 1963, IV, n° spécial, 23) a pu démontrer que tout syndrome fibrinolytique est déclenché par une coagulation intravasculaire ; or, comme on le sait, une telle fibrinolyse est sous la dépendance de la plasmine, enzyme protéolytique formée à partir d'un précurseur plasmatique, le plasminogène, laquelle dégrade la fibrine qui constitue le caillot, en petits fragments solubles. Ainsi, la plasmine présente dans le sang circulant provoque la fibrinolyse du caillot. Or, l'aprotinine est un antifibrinolytique qui exerce une action d'inhibition de la fibrinolyse, en sorte que l'on aurait pu s'attendre à ce que son administration bien connue en thérapeutique, entraîne des phénomènes de coagulation intravasculaire. Or, ce n'est pas le cas : l'aprotinine est très largement utilisée dans le traitement des pancrëatites, sans provoquer le développement de syndromes de coagulation intravasculaire, bien que l'on observe dans tous les cas une hypercoagulation accompagnée d'une hyperfibrinolyse. De même, l'Inventeur a montré [VAIREL E.G., HUREAU J., Ann. Pharm. Franc., 1973, 31 (6), 409] que l'accélération de la coagulation par injection, chez le chien, de kaolin ou de trypsine, n'est pas modifiée par l'administration d'aprotinine et que l'on n'observe généralement pas de phénomène de coagulation intravasculaire. Par contre, l'administration d'acide epsilon-amino-caproïque, qui est un inhibiteur synthétique de la fibrinolyse, à la place de l'aprotinine, provoque la mort rapide des animaux d'expérience, par infarcissement cardiovasculaire massif, ce qui tendrait à démontrer que cet inhibiteur synthétique s'opposerait à la fibrinolyse aussi bien qu'à la fibrinogénolyse, alors que l'aprotinine ne serait, in vivo, inhibiteur que de la fibrinogénolyse (le fibrinogène étant, comme on le sait, le précurseur de la fibrine, et étant transformé en cette dernière sous l'action de la thrombine), son action antifibrinolytique s'expliquant par son action d'inhibition de la plasmine avec laquelle elle forme in situ un complexe enzyme-inhibiteur, considéré dans la Littérature comme étant dénué d'activité aussi bien vis-à-vis du fibrinogène que de la fibrine.Aprotinin is a competitive natural inhibitor of a number of endopeptidases, extracted from cattle organs such as lungs, pancreas, parotids, in which it is present in cellular microsomes. Its inhibitory activity, in particular with respect to trypsin, kallikrein and plasmin, has enabled its use in therapy, in particular in cataclysmic fibrinolyses due to its antiplasmin activity. The Inventor (cf. VAIREL EG, ANTOINE G., Ann. Anesth. Franc., 1963, IV, special n °, 23) has been able to demonstrate that any fibrinolytic syndrome is triggered by intravascular coagulation; however, as is known, such fibrinolysis is dependent on plasmin, a proteolytic enzyme formed from a plasma precursor, plasminogen, which degrades the fibrin which constitutes the clot, into small soluble fragments. Thus, the plasmin present in the circulating blood causes fibrinolysis of the clot. However, aprotinin is an antifibrinolytic which exerts an action of inhibition of fibrinolysis, so that one could have expected that its administration well known in therapy, involves phenomena of intravascular coagulation. Gold, this is not the case: aprotinin is very widely used in the treatment of pancreatitis, without causing the development of intravascular coagulation syndromes, although in all cases hypercoagulation is observed accompanied by hyperfibrinolysis. Likewise, the inventor has shown [VAIREL EG, HUREAU J., Ann. Pharm. Franc., 1973, 31 (6), 409] that the acceleration of coagulation by injection, in dogs, of kaolin or trypsin, is not modified by the administration of aprotinin and that n generally observe no intravascular coagulation phenomenon. On the other hand, the administration of epsilon-amino-caproic acid, which is a synthetic fibrinolysis inhibitor, in place of aprotinin, causes the rapid death of experimental animals, by massive cardiovascular infarction, which would tend to demonstrate that this synthetic inhibitor would oppose fibrinolysis as well as fibrinogenolysis, whereas aprotinin would be, in vivo, only an inhibitor of fibrinogenolysis (fibrinogen being, as we know, the precursor of fibrin, and being transformed into the latter under the action of thrombin), its antifibrinolytic action explained by its action of inhibiting plasmin with which it forms in situ an enzyme-inhibitor complex, considered in the literature to be devoid of activity with respect to both fibrinogen and fibrin.
Des complexes plasmine-aprotinine ont été préparés dans l'Art antérieur [cf. "The Journal of Biological Chemistry, vol. 250, n° 10, 25 Mai 1975, p. 3988-3995, L. SUMMARIA, L. ARZADON, P. BERNABE et K.C. ROBBINS :Plasmin-aprotinin complexes have been prepared in the prior art [cf. "The Journal of Biological Chemistry, vol. 250, n ° 10, May 25, 1975, p. 3988-3995, L. SUMMARIA, L. ARZADON, P. BERNABE and K.C. ROBBINS:
"The activation of Plasminogen to Plasmine by ϋrokinase in the présence of the Plasmin inhibitor trasylol" et "Thrombosis Research, 17, p. 143-152, B. WIMAN : "on the reaction of plasmin or plasmin-streptokinase complex with aprotinin or α2-a-ntiplasmine"] ; toutefois, ces complexes ont essentiellement été préparés dans le but, pour l'équipe de SUMMARIA et Alia, ce démontrer qu'il ne se produit pas de clivages importants de s liaisons peptidiques dans la fraction qui comporte un -NH2 terminal, des Gluplasminogènes humains ou de lapin et dans le Asp-plasminogène de chat ou dans le X-plasminogène de chien, pendant l'activation par des quantités catalytiques d'urokinase dans 25 % de glycérol, en présence de "Trasylol" (dénomination commerciale de l'aprotinine Bayer). Le but recherché par B. WIMAN a été, par exemple, d'étudier la cinétique de la réaction d'inactivation de la plasmine par l'aprotinine par la formation d'un complexe présent au cours d'une première étape de la réaction, sous une forme réversible et, au cours d'une deuxième étape, sous une forme modifiée, également réversible, à partir d'un mélange de plasmine avec un excès (60 %) d'aprotinine par rapport à la plasmine. SUMMARIA et Alia ont confirmé, dans leur étude précitée, que les complexes plasmineaprotinine sont inactifs en tant qu'enzymes. Aucune de ces publications n'a envisagé la possibilité d'une utilisation de ces complexes en thérapeutique, le but clairement visé de leurs Auteurs étant de tenter d'expliciter des mécanismes biochimiques en utilisant la propriété de l'aprotinine d'inhiber la plasmine in situ, à l'aide de modèles formés in vitro."The activation of Plasminogen to Plasmine by ϋrokinase in the presence of the Plasmin inhibitor trasylol" and "Thrombosis Research, 17, p. 143-152, B. WIMAN:" on the reaction of plasmin or plasmin-streptokinase complex with aprotinin or α 2 -a-ntiplasmine "]; however, these complexes were essentially prepared with the aim, for the team of SUMMARIA and Alia, of demonstrating that it does not occur no significant cleavages of peptide bonds in the fraction which contains a terminal -NH 2 , human or rabbit Gluplasminogens and in cat Asp-plasminogen or in dog X-plasminogen, during activation by catalytic amounts urokinase in 25% glycerol, in the presence of "Trasylol" (trade name of aprotinin Bayer). The aim sought by B. WIMAN was, for example, to study the kinetics of the plasmin inactivation reaction with aprotinin by the formation of a complex present during a first stage of the reaction, in a reversible form and, during a second step, in a modified form, also reversible, from a mixture of plasmin with an excess (60%) of aprotinin relative to plasmin. SUMMARIA and Alia confirmed, in their aforementioned study, that the plasmineaprotinin complexes are inactive as enzymes. None of these publications has considered the possibility of using these complexes in therapy, the clearly aimed aim of their Authors being to try to explain biochemical mechanisms by using the property of aprotinin to inhibit plasmin in situ, using in vitro trained models.
L'Inventeur a à présent mis en évidence que le complexe aprotinine-plasmine n'est pas inerte vis-à-vis de la fibrine, dans certaines conditions, et que, de ce fait, il peut être utilisé en tant que nouveau médicament fibrinolytique.The inventor has now demonstrated that the aprotinin-plasmin complex is not inert towards fibrin, under certain conditions, and that, therefore, it can be used as a new fibrinolytic drug. .
En effet, contrairement à ce que l'on croyait être le comportement du complexe qui se formerait in situ entre l'aprotinine et la plasmine et que l'on considérait comme tout à fait inerte tant vis-à-vis de la fibrine que du fibrinogène, l'Inventeur a pu établir que le produit nouveau conforme à l'invention n'est inerte que vis-à-vis du fibrinogène et ne l'est pas vis-à-vis de la fibrine. De plus, il est connu que les α2antiplasmines contenues dans le plasma sont capables d'inhiber les deux tiers environ de la plasmine pouvant être générée dans le plasma , à l ' égard de laquelle ils j ouent le rôle d ' inhibiteurs naturels présents dans le sang circulant ; de ce fait , il faut , pour que la fibrinolyse puisse se produire , que l ' on ait abaissé le taux d' α2antiplasmines jusqu ' à un certain point , afin de permettre à la plasmine de jouer son rôle vis-à-vis de la fibrine , ce qui a pour effet une consommation très importante du plasminogène circulant , ce qui nécessite dé pourvoir à un apport externe de plasmine ou de plasminogène . Or , alors que la plasmine présente dans le sang circulant est inhibée par les α-antiplasmines , l ' Inventeur a pu établir que lorsque la plasmine est complexée avec l ' aprotinine conformément à l ' invention, elle est inerte vis-à-vis des α2 antiplasmines , ce qui fait que l ' apport de plasmine nécessaire à la fibrinolyse est considérablement réduit et que cette dernière est susceptible d' exercer immédiatement son action . La présente invention a donc pour objet un médicament nouveau constitué par un complexe aprotinine-plasmine.In fact, contrary to what we believed to be the behavior of the complex which would form in situ between aprotinin and plasmin and which we considered to be completely inert both towards fibrin and fibrinogen, the inventor was able to establish that the new product in accordance with the invention is only inert with respect to fibrinogen and is not with respect to fibrin. In addition, it is known that the α2antiplasmins contained in the plasma are capable of inhibiting both approximately one third of the plasmin that can be generated in plasma, in respect of which they play the role of natural inhibitors present in circulating blood; therefore, for fibrinolysis to occur, the level of α 2 antiplasmin has to be lowered to a certain point, in order to allow plasmin to play its role vis-à-vis fibrin, which results in a very high consumption of circulating plasminogen, which necessitates providing an external supply of plasmin or plasminogen. However, while the plasmin present in the circulating blood is inhibited by the α-antiplasmin, the inventor has been able to establish that when the plasmin is complexed with aprotinin in accordance with the invention, it is inert with respect to α 2 antiplasmin, which means that the supply of plasmin necessary for fibrinolysis is considerably reduced and the latter is likely to exert its action immediately. The present invention therefore relates to a new medicament constituted by an aprotinin-plasmin complex.
Selon un itode de réalisation avantageux de l'invention, le médicament nouveau est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine.According to an advantageous embodiment of the invention, the new drug consists of an aprotinin-human plasmin lys complex.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe en quantités équimoléculaires, ce rapport 1/1 étant exprimé dans ce qui va suivre par l'abréviation AP.According to an advantageous embodiment of the invention, aprotinin and plasmin are present in the complex in equimolecular quantities, this 1/1 ratio being expressed in what follows by the abbreviation AP.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe dans un rapport aprotinine/plasmine de 2/1,ce rapport 2/1 étant exprimé dans ce qui va suivre par l'abréviation APA.According to another advantageous embodiment of the invention, aprotinin and plasmin are present in the complex in an aprotinin / plasmin ratio of 2/1, this 2/1 ratio being expressed in the following by the abbreviation APA.
La présente invention a également pour objet un nouveau procédé de préparation du complexe aprotinineplasmine , lequel consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur , avec de l ' aprotinine , en quantités appropriées , dans un solvant convenable , le complexe aprotinine-plasmin. formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'activateur si celui-ci a été précédemment ajouté et le complexe étant ensuite élué par l'acide epsilon-amino-caproïque à une concentration molaire d'au moins 0,05 M.The subject of the present invention is also a new process for preparing the aprotininplasmin complex, which consists in bringing plasmin or its precursor, the plasminogen associated with an activator, into contact with aprotinin, in appropriate quantities, in a suitable solvent. , the aprotinin-plasmin complex. formed being purified by passage over a Sepharose-lysine column, so as to eliminate the possible excess of aprotinin and, where appropriate, the activator if the latter has been previously added and the complex then being eluted with epsilon acid -amino-caproic at a molar concentration of at least 0.05 M.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, dans le cas où l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celui-ci est un plasminogène partiellement pré-activé tel que celui qui a été décrit dans le Brevet CHOAY n° 73 45289 déposé le 18 Décembre 1973 et publié sous le n° 2 254 316.According to an advantageous embodiment of the process which is the subject of the present invention, in the case where the plasmin precursor, namely plasminogen, is used, it is a partially pre-activated plasminogen such than that which has been described in the CHOAY patent n ° 73 45289 filed on December 18, 1973 and published under n ° 2 254 316.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, l'activateur associé au plasminogène est l'urokinase.According to yet another advantageous embodiment of the process which is the subject of the present invention, the activator associated with plasminogen is urokinase.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 1400 à 2000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine dans le cas où l'on cherche à obtenir un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes en quantités équimoléculaires.According to another advantageous embodiment of the process which is the subject of the present invention, the mixture of aprotinin and plasmin comprises at least 1400 to 2000 IUU of aprotinin per 1 microkatal of plasmin in the case where it is sought to obtain a complex in which aprotinin and plasmin must be present in equimolecular amounts.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 3500 à 5000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3600 à 4000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'on cherche à obtenir un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes dans un rapport 2/1.According to yet another advantageous embodiment of the process which is the subject of the present invention, the mixture of aprotinin and plasmin comprises at least 3500 to 5000 IUU of aprotinin per 1 microkatal of plasmin, and advantageously 3600 to 4000 IUU of aprotinin for 1 microkatal of plasmin, in the case where it is sought to obtain a complex in which aprotinin and plasmin must be present in a 2/1 ratio.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la complexation de l'aprotinine et de la plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 40°C. Selon une disposition particulière de ce mode de réalisation, dans le cas où l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ -, pour provoquer la transformation du plasminogène en plasmine et la complexation de cette dernière avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmine.According to another advantageous embodiment of the method which is the subject of the present invention, the complexation of aprotinin and plasmin is carried out by incubation of a mixture of aprotinin and plasmin, or of plasminogen associated with a activator, at a temperature between ambient and 40 ° C. According to a particular provision of this embodiment, in the case where the plasminogen associated with an activator is used, the duration of the incubation is sufficient - of the order of approximately one hour - to cause the transformation of the plasminogen plasmin and complexation of the latter with aprotinin, this time can be reduced to a few minutes in the case where plasmin is used.
Conformément à l'invention, le pH du mélange est de l'ordre de 7,4 ± 0,4.According to the invention, the pH of the mixture is of the order of 7.4 ± 0.4.
Les différents paramètres ci-dessus indiqués, c'est-à-dire concentration des produits en présence, température, pH, durée d'incubation, sont ajustés les uns aux autres en vue d'obtenir le complexe désiré. Comme il est bien connu dans ce type de réaction, ces différents paramètres sont généralement en relation directe les uns avec les autres et il est clair que la modification de l'un de ces facteurs conduit à l'ajustement des autres en conséquence. Egalement conformément à l'invention, le complexe formé conformément à l'invention, est lyophilisé.The various parameters indicated above, that is to say concentration of the products present, temperature, pH, incubation time, are adjusted to each other in order to obtain the desired complex. As is well known in this type of reaction, these various parameters are generally in direct relation to each other and it is clear that the modification of one of these factors leads to the adjustment of the others accordingly. Also according to the invention, the complex formed according to the invention is lyophilized.
La Demanderesse a pu mettre en évidence que le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention se fixe sur la fibrine, une certaine quantité d'aprotinine se trouve alors libérée et entraînée dans le plasma.The Applicant has been able to demonstrate that the aprotinin-plasmin complex according to the invention binds to fibrin, a certain amount of aprotinin is then released and entrained in the plasma.
Le complexe ainsi modifié par la fibrine possède alors des propriétés fibrinolytiques qui s'exercent directement sur le support fibrine en l'hydrolysant. Cette modification a été démontrée, conformément à l'invention, par le dosage de l'activité inhibitrice de l'aprotinine sur la trypsine, selon la méthode de la Pharmacopée française, d'une part directement et, d'autre part, dans le surnageant trichloracétique 5 % dont la plasmine précipitée est éliminée. on constate :The complex thus modified by fibrin then has fibrinolytic properties which are exerted directly on the fibrin support by hydrolyzing it. This modification has been demonstrated, in accordance with the invention, by assaying the inhibitory activity of aprotinin on trypsin, according to the method of the French Pharmacopoeia, on the one hand directly and, on the other hand, in the 5% trichloroacetic supernatant from which the precipitated plasmin is eliminated. we aknowledge :
1°) l'absence d'une activité inhibitrice directe du complexe sur la trypsine ; la totalité de l'inhibiteur engagé dans le complexe peut être retrouvée dans le surnageant trichloracétique de la solution du complexe ; 2°) en présence de fibrine, le complexe acquiert une activite inhibitrice directe sur la trypsine, ce qui montre une libération partielle d'aprotinine. De plus, le surnageant du précipité trichloracétique de l'ensemble (fibrine, fibrinopeptides, complexe et aprotinine libre), permet de retrouver dans le surnageant la totalité de l'aprotinine engagée dans le complexe.1) the absence of a direct inhibitory activity of the complex on trypsin; all of the inhibitor engaged in the complex can be found in the trichloroacetic supernatant of the solution of the complex; 2) in the presence of fibrin, the complex acquires a direct inhibitory activity on trypsin, which shows a partial release of aprotinin. In addition, the supernatant of the trichloroacetic precipitate of the whole (fibrin, fibrinopeptides, complex and free aprotinin) makes it possible to find in the supernatant all of the aprotinin involved in the complex.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.
L'invention vise plus particulièrement le médicament nouveau conforme à l'invention, ainsi que le procédé et les moyens mis en oeuvre pour sa préparation et son utilisation.The invention relates more particularly to the new medicament according to the invention, as well as the process and the means used for its preparation and its use.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du complexe conforme à l'invention, de dosage de l'aprotinine libérée du complexe, ainsi qu'à un compte-rendu d'expérimentations relatives à l'activité pharmacologique du nouveau complexe conforme à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exempies de préparation et de dosage et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - OBTENTION D'UN COMPLEXE APA On mélange :The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of preparation of the complex according to the invention, assay of aprotinin released from the complex, as well as to an account -Rendering of experiments relating to the pharmacological activity of the new complex in accordance with the invention. It should be understood, however, that these examples of preparation and dosage and this report on experiments are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation. EXAMPLE 1 - OBTAINING AN APA COMPLEX We mix:
- Lys plasminogène 30 microkatals- Plasminogen lily 30 microkatals
- Aprotinine 300 000 UIP- Aprotinin 300,000 IPU
- Urokinase 6 000 UCTA dans 2 ml de solution tampon phosphaté 0,15 M, pH 7,4. Le plasminogène activé par la streptokinase ou l'urokinase est dosé par son activité estérolytique sur l'ester mêthylique de la N-α-acétyl glycyl-L-lysine (AGLME) : l'unité 1 microkatal out l'activité enzymatique qui hydrolyse une mole de substrat par seconde à 30ºC - pH 8,10.- Urokinase 6,000 UCTA in 2 ml of 0.15 M phosphate buffer solution, pH 7.4. Plasminogen activated by streptokinase or urokinase is measured by its esterolytic activity on the methyl ester of N-α-acetyl glycyl-L-lysine (AGLME): 1 microkatal unit out the enzymatic activity which hydrolyzes one mole of substrate per second at 30ºC - pH 8.10.
On incube pendant une heure.We incubate for an hour.
Sur une colonne de lysine-Sépharose (Pharmacia) de 9 mm de diamètre et 14 cm de long, équilibrée avec le tampon phosphate, on effectue une chromatographie d'affinité du mélange incubé.Affinity chromatography of the incubated mixture is carried out on a lysine-Sepharose column (Pharmacia) 9 mm in diameter and 14 cm long, equilibrated with phosphate buffer.
L'excès d'aprotinine et l'urokinase, non retenus sur le support, sont présents dans un premier pic (1) représenté à la figure 1 des dessins annexés, qui apparaît dès l'écoulement d'un volume égal à celui de la colonne.The excess aprotinin and urokinase, not retained on the support, are present in a first peak (1) represented in FIG. 1 of the appended drawings, which appears from the flow of a volume equal to that of the column.
Le complexe APA est élué par le tampon phosphate additionné de 0,05 M d'acade ε-araino-caproïque (cf. flèche 3). Il apparaît dans un pic étroit (2), représentant dans cet essai, 6 ml d'éluat.The APA complex is eluted by the phosphate buffer supplemented with 0.05 M of ε-araino-caproic acade (cf. arrow 3). It appears in a narrow peak (2), representing in this test, 6 ml of eluate.
Cet éluat est débarrassé de l'acide ε-aminocaproïque par dialyse. Le dialysat est lyophilisé. EXEMPLE 2 - OBTENTION D'UN COMPLEXE APA a) Formation ducomplexe On mélange :This eluate is freed from ε-aminocaproic acid by dialysis. The dialysate is lyophilized. EXAMPLE 2 - OBTAINING AN APA COMPLEX a) Formation of the complex We mix:
- Lys-plasmine 800 mg- Lys-plasmin 800 mg
- Aprotinine 64 mg dans 5 ml d'eau distillée.- Aprotinin 64 mg in 5 ml of distilled water.
On fait incuber 5 mn à température ambiante. On lyophilise et on obtient environ 850 mg du complexe aprotinine-plasmine, soit un rendement pratiquement quantitatif. b) Purification du complexeThey are incubated for 5 min at room temperature. Lyophilized and approximately 850 mg of the aprotinin-plasmin complex is obtained, ie a practically quantitative yield. b) Purification of the complex
On procède comme indiqué à l'Exemple 1, mais avec une colonne de taille adaptée.The procedure is as indicated in Example 1, but with a column of suitable size.
EXEMPLE 3 - OBTENTION D'UN COMPLEXE AP On mélange :EXAMPLE 3 - OBTAINING AN AP COMPLEX We mix:
- Lys-plasmine (titrant 2 μKatals/mg) 100 g- Lys-plasmin (grading 2 μKatals / mg) 100 g
- Aprotinine (titrant 50 000 UlP/mg) 8,0 g On incube dans les mêmes conditions qu'à l'Exemple 2 et on lyophilise ; on obtient environ 100 g du complexe. CARACTERISATION DU PRODUIT- Aprotinin (grading 50,000 IUU / mg) 8.0 g Incubate under the same conditions as in Example 2 and lyophilize; about 100 g of the complex are obtained. CHARACTERIZATION OF THE PRODUCT
- Le nouveau complexe conforme à I'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes: . son poids moléculaire après filtration sur "ULTROGEL" est de l'ordre de 90 000 pour le complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans un rapport 2/1, et il est de l'ordre de 84 000 pour le complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont présentes en quantités équimoléculaires ; . la constante d'association du complexe AP calculée par- The new complex according to the invention has the following physicochemical characteristics:. its molecular weight after filtration on "ULTROGEL" is around 90,000 for the complex in which aprotinin and plasmin are present in a 2/1 ratio, and it is around 84,000 for the complex wherein aprotinin and plasmin are present in equimolecular amounts; . the association constant of the AP complex calculated by
FRITZ H., SCHULT H., MEISTER R., WERLE E. - Z. Physiol.FRITZ H., SCHULT H., MEISTER R., WERLE E. - Z. Physiol.
Chem., 1969, 350, 1531, est égale à 3 × 108.Chem., 1969, 350, 1531, is equal to 3 × 10 8 .
- Le complexe peut être en partie dissocié en présence de fibrine, ainsi qu'il est décrit plus loin et acquiert, notamment en ce qui concerne le complexe APA, du fait de sa dissociation partielle, des propriétés fibrinolytiques.- The complex can be partly dissociated in the presence of fibrin, as described below and acquires, in particular with regard to the APA complex, due to its partial dissociation, fibrinolytic properties.
- Les caractéristiques biologiques du complexe conforme à l'invention, sont les suivantes : . il est inactif vis-à-vis du fibrinogène, en milieu plasmatique, . il est inactif vis-à-vis d'un excédent de plasmine. Dosage de l'aprotinine libérée du complexe APA- The biological characteristics of the complex according to the invention are as follows:. it is inactive with respect to fibrinogen, in a plasma medium,. it is inactive vis-à-vis an excess of plasmin. Determination of aprotinin released from the APA complex
On dose lî aprotinine libérée du complexe, en procédant comme décrit ci-après, dans le but de déterminer la quantité d'aprotinine fixée par microkatal de plasmine, dans le complexe conforme à l'invention. a) On forme le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention à partir : . de 25 microkatals de Lys-plasminogène humain dont l'activité a été préalablement mesurée, . d'urokinase,The aprotinin released from the complex is assayed, by proceeding as described below, in order to determine the amount of aprotinin fixed by microkatal of plasmin, in the complex according to the invention. a) The aprotinin-plasmin complex according to the invention is formed from: 25 microkatals of human Lys-plasminogen whose activity has been previously measured,. urokinase,
. et d'un excès d'aprotinine (cf. Exemple 1 ci-dessus) ; On incube pendant une heure à 37°C. On filtre sur une colonne de lysine-Sépharose qui retient le complexe, tandis que l'excès d' aprotinine et l'urokinase, qui ne sont pas retenus sur le support, s'écoulent de la colonne.. and an excess of aprotinin (cf. Example 1 above); Incubate for one hour at 37 ° C. It is filtered through a lysine-Sepharose column which retains the complex, while the excess of aprotinin and urokinase, which are not retained on the support, flow from the column.
Le complexe aprotinine-lys plasmine humaine obtenu, est élué par de l'acide ε-amino-caprolque, puis dialyse pour éliminer ce dernier. b) On dissout le complexe obtenu dans du sérum physiologique. c) On ajoute à cette solution, de l'acide trichloracétique concentré en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale d'acide trichloracétique de 5 % dans la solution de complexe. Il se forme un précipité contenant la plasmine décomplexée, leσuel est éliminé par centrifugation.The aprotinin-lys human plasmin complex obtained is eluted with ε-amino-caprolic acid, then dialyzed to eliminate the latter. b) The complex obtained is dissolved in physiological saline. c) To this solution is added concentrated trichloroacetic acid in sufficient quantity to obtain a final concentration of 5% trichloroacetic acid in the complex solution. A precipitate containing the uninhibited plasmin is formed, the oil is eliminated by centrifugation.
On recueille le surnageant, qui contient l'aprotinine ; on ajuste le pH à 8, puis on dose l'aprotinine présente dans le surnageant, par inhibition de l'action de la trypsine sur BAEE, à 253 nm, suivant la méthode de la Pharmacopée Française.The supernatant, which contains aprotinin, is collected; the pH is adjusted to 8, then the aprotinin present in the supernatant is assayed, by inhibition of the action of trypsin on BAEE, at 253 nm, according to the method of the French Pharmacopoeia.
Le dosage montre que 100 000 UIP d'aprotinine ont été libérées du complexe, soit environ 4 000 UIP par microkatal de plasmine¬The assay shows that 100,000 PIUs of aprotinin have been released from the complex, ie approximately 4,000 PIUs per microkatal of plasmin
Le dosage d'aprotinine dans le complexe AP peut être réalisé de la même manière. Identification et differenciction ducomplexedans leguel l'aprotinine et la plasmine sonu présentes dans un rapport 2/1 (APA) et du comglexe dans leg uel elles sont présentes dans un rappory 1/ 1 (AP)The assay of aprotinin in the AP complex can be carried out in the same way. Identification and differentiation of the complex in legacy aprotinin and plasmin appeared in a 2/1 ratio (APA) and of the complex in leg uel they are present in a 1/1 ratio (AP)
1. On met en suspension de la plasmine dans un tampon voisin de la neutralité ; on ajoute à cette solution un large excès d'aprotinine ; après incubation à la température du laboratoire (environ 20°C) pendant 30 minutes, la solution est passée au travers d'une colonne de lysine-Sépharose.1. Plasmin is suspended in a buffer close to neutral; a large excess of aprotinin is added to this solution; after incubation at laboratory temperature (approximately 20 ° C) for 30 minutes, the solution is passed through a column of lysine-Sepharose.
Il se forme le complexe 2/1 qui est retenu sur la colonne,tandis que l'excès d' aprotinine se trouve dans l'effluent. On évalue la quantité d'aprotinine présente dans cet effluent et, connaissant la quantité mise en oeuvre, on calcule la quantité d'aprotinine fixée sur 1 mg de la plasmine utilisée.The 2/1 complex is formed which is retained on the column, while the excess aprotinin is in the effluent. We assess the amount of aprotinin present in this effluent and, knowing the amount used, the amount of aprotinin fixed on 1 mg of the plasmin used is calculated.
2. Pour une quantité connue de cette plasmine, on ajoute alors dans les mêmes conditions que précédemment, la moitié de la quantité d'aprotinine calculée de manière à ce que le mélange soit équimoléculaire.2. For a known quantity of this plasmin, half of the quantity of aprotinin calculated in such a way that the mixture is equimolecular is then added under the same conditions as above.
Pour vérifier la composition du complexe et établir qu'il s'agit bien d'un complexe équimoléculaire, la solution obtenue a été soumise à une filtration moléculaire sur colonne d' "Ultrogel AcA 44" et l'activité de l'effluent a été étudiée du début à la fin de la sortie des protéines. L'activité spécifique de tous ces échantillons a été identique, et la sortie s'est établie en un seul pic. Le poids moléculaire est donc homogène et l'activité spécifique identique. Etant donné la nature du mélange, ces résultats montrent que le complexe formé est homogène et par conséquent équimoléculaire. Ceci montre également que les constantes d'association des deux molécules d'aprotinine sur une molécule de plasmine sont suffisamment différentes pour que les techniques d'analyse ne puissent pas déceler deux formes de complexe. COMPTE-RENDU D'EXPERIMENTATIONS DEMONTRANT L'ACTIVITETo verify the composition of the complex and establish that it is indeed an equimolecular complex, the solution obtained was subjected to molecular filtration on a column of "Ultrogel AcA 44" and the activity of the effluent was studied from the beginning to the end of the release of proteins. The specific activity of all these samples was identical, and the output was established in a single peak. The molecular weight is therefore homogeneous and the specific activity identical. Given the nature of the mixture, these results show that the complex formed is homogeneous and therefore equimolecular. This also shows that the association constants of the two aprotinin molecules on a plasmin molecule are sufficiently different that the analysis techniques cannot detect two forms of complex. REPORT ON EXPERIMENTATIONS DEMONSTRATING THE ACTIVITY
PHARMACOLOGIQUE DU COMPLEXE CONFORME A L'INVENTION 1°) Comportement du complexe aprotinine-plasmine APA au contast de la fibrinePHARMACOLOGICAL OF THE COMPLEX CONFORMING TO THE INVENTION 1 °) Behavior of the aprotinin-plasmin APA complex to the fibrin contast
500 mg de fibrinogène humain (Kabivitrum) sont dissous dans 80 ml de tampon Tris- ClH, pH 7,4, 0,05 M contenant 0,01 % de mercurothiolate de sodium ; 20 ml de plasma humain citrate sont ajoutés à cette solution (apport de facteur XIII).500 mg of human fibrinogen (Kabivitrum) are dissolved in 80 ml of Tris-ClH buffer, pH 7.4, 0.05 M containing 0.01% sodium mercurothiolate; 20 ml of human citrate plasma are added to this solution (addition of factor XIII).
Sous agitation, sont ajoutés 100 NIH de thrombine (Roche) dissous dans 10 ml de solution de Cl2Ca M/20. Après 20 minutes d'incubation à 37°C, la fibrine est recueillie par centrifugation, puis mise en suspension dansWith stirring, 100 NIH of thrombin (Roche) dissolved in 10 ml of Cl 2 Ca M / 20 solution are added. After 20 minutes of incubation at 37 ° C, the fibrin is collected by centrifugation, then suspended in
500 ml du tampon Tris par dispersion mécanique (Ultraturax ) . Après agitation de 15 minutes, la fibrine est recueillie par centrifugation à + 10ºC et remise en suspension dans500 ml of Tris buffer by mechanical dispersion (Ultraturax). After stirring for 15 minutes, the fibrin is collected by centrifugation at + 10ºC and resuspended in
500 ml de tampon et agitée de la même manière que précédemment. Ce lavage est éventuellement répété afin d'obtenir une fibrine insensible à l'urokinase Choay ou à la streptokinase Behring (à 1 ml de suspension de fibrine, 0,1 ml de solution de SK à 1000 Ul/ml ou 0,1 ml d'UK à 1000 UCTA/ml est ajouté ; aucune dissolution ne doit être observée après incubation d'une heure à 37°C).500 ml of buffer and stirred in the same manner as above. This washing is optionally repeated in order to obtain a fibrin insensitive to urokinase Choay or to streptokinase Behring (to 1 ml of fibrin suspension, 0.1 ml of SK solution at 1000 IU / ml or 0.1 ml of 'UK at 1000 UCTA / ml is added; no dissolution should be observed after incubation for one hour at 37 ° C).
La totalité de la fibrine est alors dispersée mécaniquement dans 50 ml de tampon. Cette suspension sert à constituer une colonne de 15 cm de long et de 0,9 cm de diamètre. Cette colonne est alimentée en continu par une pompe, l'effluent est analysé par un lecteur U.V. avant d'être distribué par un collecteur de fractions (matériel LKB). L'équilibre de la colonne est obtenu par passage de la solution tampon Tris sous un débit de 10 ml/heure pendant 2 heures.The entire fibrin is then mechanically dispersed in 50 ml of buffer. This suspension is used to form a column 15 cm long and 0.9 cm in diameter. This column is continuously supplied by a pump, the effluent is analyzed by a UV reader before being distributed by a fraction collector (LKB material). The balance of the column is obtained by passing the Tris buffer solution at a flow rate of 10 ml / hour for 2 hours.
2° ) Comportement du complexe aprotinine-lys plasmine humaine APA vis-à-vis de la fibrine en milieu tampon 2 ml de la solution du complexe inactif correspondant à 8 microkatals de plasmine et additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, sont déposés au sommet de la colonne de fibrine, puis un débit de 10 ml/heure de tampon est appliqué. Résultats2) Behavior of the aprotinin-human plasmin APA lys complex with respect to fibrin in a buffer medium 2 ml of the solution of the inactive complex corresponding to 8 microkatals of plasmin and added with 50,000 uIP of aprotinin in excess, are deposited at the top of the fibrin column, then a flow rate of 10 ml / hour of buffer is applied. Results
Un pic apparaît entre le 10ème et le 16ème ml d'effluent ; il contient imiquement l'aprotinine ajoutée en excès en même temps que la dissolution du sommet de la colonne est observée, dissolution qui est complète après 90 minutes.A peak appears between the 10th and 16th ml of effluent; it imically contains the aprotinin added in excess at the same time as the dissolution of the top of the column is observed, dissolution which is complete after 90 minutes.
Ceci prouve que l'aprotinine n'est pas adsorbée sur la fibrine et qu'à partir du moment où seul le complexe se trouve en présence de fibrine, la dissolution de cette dernière est observée.This proves that aprotinin is not adsorbed on fibrin and that from the moment when only the complex is in the presence of fibrin, the dissolution of the latter is observed.
Si au début de l'observation de la lyse, le tampon est additionné de 0,05 M d'acide ε-amino-caproïque, la dissolution de la fibrine ne se poursuit pas et le complexe, comme débit plus loin, est lué de la fibrine ; il apparaît dans un pic assez large.If at the start of the observation of lysis, the buffer is added with 0.05 M of ε-amino-caproic acid, the dissolution of fibrin does not continue and the complex, as further flow, is read from fibrin; it appears in a fairly broad peak.
En remplaçant la fibrine comme support par le Sépharose-lysine défini par DEUTSCH D. et MERTZ E.T. - Science 1970, 170, 1095 pour la purification du plasminogène, on observe que le complexe aprotinine-plasmine est retenu sur la colonne de Sépharose-lysine, alors que l'aprotinine en excès est éliminée ; ] 'excès d'aprotinine est présent dans l'éluat frontal et le complexe est élué par l'acide ε-amino-caproïque. Cette observation a été utilisée pour le développement du procédé de préparation du complexe conforme à l'invention tel que décrit à l'Exemple 1 ci-dessus.By replacing fibrin as a support with Sepharose-lysine defined by DEUTSCH D. and MERTZ ET - Science 1970, 170, 1095 for the purification of plasminogen, it is observed that the aprotinin-plasmin complex is retained on the Sepharose-lysine column, while excess aprotinin is eliminated; ] 'excess aprotinin is present in the frontal eluate and the complex is eluted by ε-amino-caproic acid. This observation was used for the development of the process for the preparation of the complex according to the invention as described in Example 1 above.
ConclusionsConclusions
Le complexe APA, dont la constante d'association est très forte, est partiellement dissocié en présence de fibrine. Tout se passe comme si le complexe aprotinineplasmine transformé comme décrit plus loin, formait un complexe transitoire avec la fibrine. 3°) Comportement du complexe aprotininr-plasmine APA en milieu plasmatique humainThe APA complex, whose association constant is very strong, is partially dissociated in the presence of fibrin. It is as if the aprotininplasmin complex transformed as described below, forms a transient complex with fibrin. 3 °) Behavior of the aprotininr-plasmin APA complex in human plasma medium
A/ Mise en évidence de l'action lytique sur la fibrineA / Demonstration of the lytic action on fibrin
La colonne de fibrine étant réalisée comme précédemment, 20 ml de plasma humain citrate dilués au 1/2 avec le tampon Tris ont servi à équilibrer la colonne sous un débit de 12,5 ml/heure.The fibrin column being produced as above, 20 ml of human citrate plasma diluted 1/2 with Tris buffer were used to balance the column at a flow rate of 12.5 ml / hour.
2 ml de la solution du complexe inactif correspondant à 8 microkatals de plasmine, sont additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, puis mélangés à 100 ml de plasma humain citrate dilué au 1/2 avec la solution tampon. Ce mélange a été passé sur la colonne de fibrine avec un débit de 12,5 ml/heure, puis 300 ml de plasma flilué au 1/2 ont été passés.2 ml of the solution of the inactive complex corresponding to 8 microkatals of plasmin are added with 50,000 uIP of excess aprotinin, then mixed with 100 ml of human plasma citrate diluted 1/2 with the buffer solution. This mixture was passed through the fibrin column with a flow rate of 12.5 ml / hour, then 300 ml of 1/2 fluted plasma were passed.
Résultats a) L'inhibiteur se libère beaucoup plus lentement que dans le premier cas considéré et il faut attendre le passage de 50 ml de plasma d'élurion pour qu'il soit complètement élué. b) la fibrinolyse débute après que 100 ml de plas- ma d'élution soient passés au travers de la colonne. Cette lyse se poursuit, mais se limite à la moitié de la colonne. Ceci peut être du à l'intervention des α2 antipiasmines présentes en large excès dans le plasma. Il peut être également supposé qu'après 48 heures, la plasmine soit dégradée. ConclusionsResults a) The inhibitor is released much more slowly than in the first case considered and it is necessary to wait for the passage of 50 ml of elurion plasma so that it is completely eluted. b) fibrinolysis begins after 100 ml of elution plasma has passed through the column. This lysis continues, but is limited to half the column. This may be due to the intervention of the α 2 antipiasmins present in large excess in the plasma. It can also be assumed that after 48 hours the plasmin is degraded. Conclusions
L'expérience réalisée en milieu plasmatique démontre que le complexe aprotinine-lys-plasmine humaine est également dissocié en milieu plasmatique humain et qu'il exerce son action fibrinolytique, ce qui permet d'envisager son utilisation comme thérapeutique spécifique de choix des coagulations intravasculaires. B/ Mise en évidence de la libération d' aorotinine en milieu plasmatigue a) On fait transiter le complexe APA conforme à l' invention comprenant 10 m i c r o k a t a l s de plasmine et 40 000 uIP d'aprotinine (1 microkatal pourExperience in plasma shows that the aprotinin-lys-human plasmin complex is also dissociated in human plasma and that it exerts its fibrinolytic action, which makes it possible to consider its use as a specific therapy for the choice of intravascular coagulations. B / Demonstration of the release of aorotinin in a plasma medium a) The APA complex according to the invention is made to pass comprising 10 m i c r o k a t a l s of plasmin and 40,000 uIP of aprotinin (1 microkatal for
4 000 uIP), en solution dans 50 ml de plasma dilué au4,000 uIP), dissolved in 50 ml of plasma diluted with
1/2, à travers une colonne remplie de fibrine. Le complexe se fixe sur le caillot de fibrine. b) On fait alors transiter à travers la colonne du plasma humain citrate, dilué au 1/2 et ne contenant pas de complexe.1/2, through a column filled with fibrin. The complex attaches to the fibrin clot. b) It is then made to pass through the column of citrated human plasma, diluted to 1/2 and containing no complex.
Ce plasma dilué au 1/2, ayant transité au travers de la colonne, additionné de 25 u de streptokinase par ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est de l'ordre de 5 mn.This plasma diluted to 1/2, having passed through the column, added with 25 u of streptokinase per ml and coagulated with thrombin, gives a clot whose lysis time is of the order of 5 min.
Ce même plasma ayant transité au travers de la colonne de fibrine chargée de complexe, additionné de la même manière de 25 u de streptokinase/ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est supérieur à 35 mn. Ceci montre que le plasma, en transitant au travers de la colonne s'est chargé d'inhibiteur, augmentant. ainsi le temps de lyse.This same plasma, which has passed through the fibrin column loaded with complex, added in the same way to 25 u of streptokinase / ml and coagulated with thrombin, gives a clot whose lysis time is greater than 35 min. This shows that the plasma, while passing through the column, became responsible for the inhibitor, increasing. thus the lysis time.
Cette expérimentation illustre clairement que le complexe aprotinine-plasmine ne devient actif en tant que fibrinolytique qu'en présence de fibrine et après libération d'une partie de l'aprotinine initialement complexée dans le milieu plasmatique, ce qui met en évidence les deux formes sous lesquelles le complexe se présente, à savoir : - une forme stable inactive dans laquelle l'aprotinine est présente dans une proportion de 2/1 par rapport à la plasmine et une forme active, dans laquelle le rapport aprotinine-plasmine s'est abaissé, une partie de l'aprotinine ayant été libérée dans le plasma, en présence de fibrine.This experiment clearly illustrates that the aprotinin-plasmin complex becomes active as fibrinolytic only in the presence of fibrin and after release of part of the aprotinin initially complexed in the plasma medium, which highlights the two forms under which the complex occurs, namely: - a stable inactive form in which aprotinin is present in a proportion of 2/1 relative to plasmin and an active form, in which the aprotinin-plasmin ratio has decreased, part of the aprotinin having been released into the plasma, in the presence of fibrin.
4°) Etude de la durée de la présence du complexe aprotinine-paasmine APA dans le sang circulant après injection intraveineuse au lapin4 °) Study of the duration of the presence of the aprotinin-paasmine APA complex in the circulating blood after intravenous injection in rabbits
A. Le potentiel fibrinolytique du sang est étudié en utilisant une des méthodes d'étude des fibrinolytiques; celle-ci est décrite page 274 et suivantes par E.G. VAIREL dans "Progress in Chemical fibrinolysis and thrombolysis", vol. 1, édité par J.F. Davidson, M.M. Samama et P.C.A. The fibrinolytic potential of the blood is studied using one of the fibrinolytic study methods; this is described on page 274 et seq. by E.G. VAIREL in "Progress in Chemical fibrinolysis and thrombolysis", vol. 1, edited by J.F. Davidson, M.M. Samama and P.C.
Desnoyers - Raven Press - New York. Le sang citraté (1/20 de citrate de sodium à 9%) est centrifugé pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes Le plasma citrate est recalcifié et on introduit aussitôt 0,5 ml dans le tube central à fond poreux, alors qu'en même temps, on obtient le même niveau dans le tube externe, avec une solution tampon pH 7,4, 0,15 mg. Les tubes sont maintenus à 37°C. Après coagulation ferme, le lavage est obtenu par addition de tampon à 37°C dans le tube externe ; la différence de niveau obtenue fait que le tampon pénètre au travers du caillot de bas en haut, et réalise son lavage. Le liquide de lavage après avoir traversé le caillot, est éliminé par siphonnage. Ce lavage peut être arrêté après 3 heures. Les tubes sont maintenus à 37°C.Desnoyers - Raven Press - New York. The citrated blood (1/20 of sodium citrate at 9%) is centrifuged to obtain a plasma poor in platelets The citrate plasma is recalcified and 0.5 ml is immediately introduced into the central tube with a porous bottom, while at the same time time, the same level is obtained in the external tube, with a buffer solution pH 7.4, 0.15 mg. The tubes are maintained at 37 ° C. After firm coagulation, washing is obtained by adding buffer at 37 ° C. to the external tube; the difference in level obtained means that the tampon penetrates through the clot from bottom to top, and performs its washing. The washing liquid after passing through the clot is removed by siphoning. This washing can be stopped after 3 hours. The tubes are maintained at 37 ° C.
Après 24 heures, un caillot constitué à partir de sang normal n'a subi aucune modification ; un caillot constitué à partir de sang contenant du complexe aprotinine- plasmine conforme à l'invention a subi une dissolution partielle ou totale.After 24 hours, a clot formed from normal blood has not undergone any modification; a clot formed from blood containing the aprotinin-plasmin complex according to the invention has undergone partial or total dissolution.
L'observation de la lyse du caillot plasmatique d'un animal ayant reçu préalablement une injection de complexe aprotinine-plasmine APA signifie que du complexe aprotinine-plasmine APA est encore présent dans le sang au moment du prélèvement. Ceci montre que le complexe est susceptible de poursuivre son action pendant une durée prolongée, ce qui n'est pas observé avec les fibrinolytiques actuellement utilisés en clinique (streptokinase, urokinase ou plasmine).Observation of the plasma clot lysis of an animal which has previously received an injection of the aprotinin-plasmin APA complex means that the aprotinin-plasmin APA complex is still present in the blood at the time of collection. This shows that the complex is capable of continuing its action for a prolonged period, which is not observed with the fibrinolytics currently used in clinical practice (streptokinase, urokinase or plasmin).
L'Inventeur a pratiqué cet essai en prélevant le sang dans l'artère centrale de l'oreille avant l'administration du complexe aprotinine-plasmine APA, puis 1 mn après, 30 minutes après, 2 heures, 4 heures et 5 heures 30 après l'injection dans la veine marginale de l'oreille. Les résultats observés après injection de 25 microkatals de lys-plasmine inhibée par 2mg d'aprotinine pure, sont consignés dans le Tableau ci-après. Le signe "+" indique que le caillot a lysé. Le signe "O" qu'il n'y a pas eu de lyse. On constate que, chez 5 animaux sur 6, le complexe est encore présent à la 2ème heure et que chez 3 animaux sur 4, il est encore présent au cours de la 5ème heure. The inventor practiced this test by drawing blood from the central artery of the ear before the administration of the aprotinin-plasmin APA complex, then 1 min after, 30 minutes after, 2 hours, 4 hours and 5 hours 30 minutes after. injection into the marginal ear vein. The results observed after injection of 25 microkatals of lys-plasmin inhibited by 2 mg of pure aprotinin, are recorded in the table below. The "+" sign indicates that the clot has lysed. The sign "O" that there has been no lysis. It is noted that, in 5 animals out of 6, the complex is still present at the 2nd hour and that in 3 animals out of 4, it is still present during the 5th hour.
5°) Etude de l'activité fibrinolvtique du complexe aprotinine-plasmine APA in vivo Cette étude a été effectuée sur le lapin. 18 animaux ont été utilisés. On dégage une fémorale de lapin, on fait une ligature d'amont amovible, et, après avoir chassé le sang de la partie fémorale dégagée, on fait une ligature d'aval, également amovible.5 °) Study of the fibrinolvtic activity of the aprotinin-plasmin APA complex in vivo This study was carried out on rabbits. 18 animals were used. A rabbit femoral is released, a removable upstream ligature is made, and, after having removed the blood from the released femoral part, a downstream ligature, also removable, is made.
A l'aide d'une petite aiguille de 4/10è on injecte dans la partie ainsi isolée, du sang prélevé dans l'artère centrale de l'oreille du lapin ( soit environ 0,05 à 0,10 ml).With the help of a small 4/10 needle, blood drawn from the central artery of the rabbit's ear is injected into the isolated part (about 0.05 to 0.10 ml).
L'aiguille étant maintenue en place, on injecteWith the needle held in place, we inject
0,01 ml de solution de thrombine concentrée. Il se forme presque immédiatement un caillot à l'intérieur de la partie isolée. On déplace alors la ligature d'aval en direction de la ligature d'amont, de manière que la ligature d'aval se trouve en amont du trou de piqûre, puis on lève très légèrement la ligature d'amont pour faire pénétrer un peu de sang dans le sac formé par les deux ligatures.0.01 ml of concentrated thrombin solution. A clot forms almost immediately inside the isolated part. The downstream ligature is then moved in the direction of the upstream ligature, so that the downstream ligature is upstream of the puncture hole, then the upstream ligature is lifted very slightly to allow a little penetration blood in the bag formed by the two ligatures.
Le sang introduit se coagule sous l'effet de la thrombine précédemment introduite dans le sac.The blood introduced coagulates under the effect of the thrombin previously introduced into the bag.
On laisse les deux ligatures en place pendant 1/4 d'heure au bout duquel on retire totalement la ligature d'amont. La thrombine contenue dans le caillot diffuse alors et s'étend dans des zones non dénudées.The two ligatures are left in place for 1/4 hour after which the upstream ligature is completely removed. The thrombin contained in the clot then diffuses and spreads in non-bare areas.
Une heure après le début de l'expérience, on lève la ligature d'aval.One hour after the start of the experiment, the downstream ligature is lifted.
Résultats Animaux témoins : Des observations effectuées 24 heures et 48 heures plus tard, montrent que l'artère est complètement bouchée et que le caillot reste en place. Animaux traitésResults Control animals: Observations made 24 hours and 48 hours later show that the artery is completely blocked and that the clot remains in place. Treated animals
12 lapins sont traités immédiatement après l'enlèvement de la ligature d'aval, par une injection massive de complexe comprenant 50 microkatals de plasmine et 200 000 UIP d'aprotinine dans la veine marginale de l'oreille.12 rabbits are treated immediately after removal of the downstream ligature, by a massive injection of complex comprising 50 microkatals of plasmin and 200,000 IUPs of aprotinin in the marginal vein of the ear.
On observe chez 50 % des animaux la libération totale de l'artère dans les 24 heures qui suivent l'injection. Cette étude montre que, dans les conditions expérimentales, le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est capable de lyser un caillot in vivo chez le lapin.In 50% of the animals, complete liberation of the artery is observed within 24 hours of the injection. This study shows that, under experimental conditions, the aprotinin-plasmin complex according to the invention is capable of lyzing a clot in vivo in rabbits.
6°) Etude in vitro des propriétés du complexe équimoléculaire aprotinine-plasmine - Compataison avec la plasmine et avec le complexe 2 aprotinines/1 plasmine, saturé A - Etudede l'activité directe surcaillots standards de fibrinogène humain Toutes les solutions sont faites dans un tampon phosphate-CINa isotonique pH 7,2.6 °) In vitro study of the properties of the equimolecular aprotinin-plasmin complex - Comparison with plasmin and with the 2 aprotinins / 1 plasmin complex, saturated A - Study of direct activity on standard human fibrinogen clots All solutions are made in a buffer isotonic phosphate-CINa pH 7.2.
Dans des tubes à hémolyse placés dans un bain-marie à 37°C, on introduit 0,1 ml de solution de plasmine ou de complexe à différentes concentrations, puis 0,1 ml de solution de thrombine à 25 NIH/ml.Into hemolysis tubes placed in a water bath at 37 ° C., 0.1 ml of plasmin solution or complex is introduced at different concentrations, then 0.1 ml of thrombin solution at 25 NIH / ml.
On injecte à l'aide d'une seringue rhéomètre 1 ml de solution de fibrinogène humain â 1 % de protéines coagulables. Le temps compris entre l'injection du fibrinogène et la lyse complète du caillot est mesuré. Résultats : Le même temps de lyse (8 minutes) a été obtenu avec 0,0075 μKat. de plasmine complexée et avec 0,002 μKat. de plasmine seule. Dans ce test, 27 % de l'activité de la plasmine subsiste après complexation avec l'aprotinine mole à mole. B - Etude de l ' activité directe sur caillots de plasmas humains (pool)1 ml of a human fibrinogen solution containing 1% of coagulable proteins is injected with a rheometer syringe. The time between the injection of fibrinogen and the complete lysis of the clot is measured. Results: The same lysis time (8 minutes) was obtained with 0.0075 μKat. of plasmin complexed and with 0.002 μKat. plasmin alone. In this test, 27% of the plasmin activity remains after complexation with mole-to-mole aprotinin. B - Study of direct activity on human plasma clots (pool)
Cet essai est calqué sur le précédent sauf que la solution de fibrinogène est remplacé par le plasma . La coagulation est obtenue par 50 microlitres de thrombine à 250 NIH/ml ( 10 fois plus concentrée) .This test is modeled on the previous one except that the fibrinogen solution is replaced by the plasma. Coagulation is obtained with 50 microliters of thrombin at 250 NIH / ml (10 times more concentrated).
L ' ordre d ' addition des réactifs est le même que pour l ' essai précédent . Résultats : (AP = complexe 1/1 - APA = complexe 2/1) .The order of addition of the reagents is the same as for the previous test. Results: (AP = complex 1/1 - APA = complex 2/1).
Dans cet essai, on trouve également que le complexe 1/1 a conservé environ 30 % de l'activité directe de la plasmine engagée.In this test, it is also found that the 1/1 complex retained approximately 30% of the direct activity of the plasmin engaged.
Nota : Cette activité est beaucoup plus progressive pour le complexe AP que pour la plasmine ; ceci est dû à l'inhibition de la seule plasmine par les antiplasmines plasmatiques. C - Comparaison de l'activité dans le temps de la plasmine et des complexes 1/1 et 2/1 sur le caillot de plasma humain Dans les boites de Petri à fond bien plat, de 9 cm de diamètre, on introduit 9 ml de plasma humain citraté, puis 0,5 ml de solution de thrombine à 50 NIH/ml. On agite légèrement par rotation de la boîte. On laisse coaguler sur un plan horizontal.Note: This activity is much more progressive for the AP complex than for plasmin; this is due to the inhibition of the only plasmin by plasma antiplasmin. C - Comparison of the activity over time of plasmin and the 1/1 and 2/1 complexes on the human plasma clot In the Petri dishes with a very flat bottom, 9 cm in diameter, 9 ml of citrated human plasma, then 0.5 ml of thrombin solution at 50 NIH / ml. Shake slightly by rotating the box. Let coagulate on a horizontal plane.
Une heure après, les solutions de plasmine, complexe 1/1 ou complexe 2/1 sont déposées sur ces plaques sous un volume de 30 microlitres. Les aires de lyse sont mesurées toutes les 24 heures.An hour later, the solutions of plasmin, complex 1/1 or complex 2/1 are deposited on these plates in a volume of 30 microliters. The lysis areas are measured every 24 hours.
Les graphiques reportés aux figures 2 à 4 annexées, montrent l'évolution des surfaces de lyse dans le temps et, en particulier : - la figure 2 donne l'évolution de la surface de lyse en mm2 en fonction du temps, exprimé en jours, après dépôt sur les plaques précitées de 30 microlitres d'une solution à 7,5 μkatals de plasmine/ml respectivement sous la forme de plasmine seule, du complexe 1/1 et du complexe 2/1,The graphs shown in Figures 2 to 4 appended show the evolution of the lysis surface over time and, in particular: - Figure 2 gives the evolution of the lysis surface in mm 2 as a function of time, expressed in days , after depositing on the aforementioned plates 30 microliters of a solution containing 7.5 μkatins of plasmin / ml respectively in the form of plasmin alone, of the 1/1 complex and of the 2/1 complex,
- la figure 3 montre la courbe d'évolution de ladite surface de lyse dans le cas où la plasmine est déposée sous les trois formes respectives ci-dessus, en solutions à 15 μkatals/ml, et - la figure 4 montre la courbe d'évolution de la surface de lyse dans le cas où la plasmine est déposée sous les trois formes respectives ci-dessus en solutions à 30 μkatals/ml.- Figure 3 shows the evolution curve of said lysis surface in the case where plasmin is deposited in the three respective forms above, in solutions at 15 μkatals / ml, and - Figure 4 shows the curve evolution of the lysis surface in the case where plasmin is deposited in the three respective forms above in solutions at 30 μkatals / ml.
Dans ces trois figures : - les courbes IV, VII et X se réfèrent aux solutions de plasmine seule ;In these three figures: - curves IV, VII and X refer to solutions of plasmin alone;
- les courbes V, VIII et XI aux solutions de complexe AP (1/1), et- curves V, VIII and XI to solutions of AP complex (1/1), and
- les courbes VI, IX et XII aux solutions de complexe APA (2/1).- curves VI, IX and XII to solutions of APA complex (2/1).
Ces courbes montrent que dès la 12ème heure, les aires de lyse sous l'action de la plasmine n'évoluent plus : ceci est dû à l'inactivation par les inhibiteurs plasmatiques car, sur plaques de fibrine pure, les aires de lyse s'accentuent pendant plus de 48 heures. Cette stabilisation au bout de 12 heures n'est donc pas due à une dégradation de l'enzyme. Au bout de 24 heures, les aires de lyse dues au complexe 1/1 sont presque équivalentes à celles de la plasmine engagée, alors qu'il faut attendre plus de 48 heures pour observer le même résultat avec le complexe 2/1.These curves show that from the 12th hour, the lysis areas under the action of plasmin no longer change: this is due to inactivation by the plasma inhibitors because, on plates of pure fibrin, the lysis areas accentuate for more than 48 hours. This stabilization after 12 hours is therefore not due to a degradation of the enzyme. After 24 hours, the lysis areas due to the 1/1 complex are almost equivalent to those of the plasmin engaged, whereas it is necessary to wait more than 48 hours to observe the same result with the 2/1 complex.
L'accroissement des surfaces de lyse pendant une semaine est observé avec les deux complexes et fait apparaître leur insensibilité aux inhibiteurs plasmatiques et leur stabilité. L'avantage du complexe 1/1 sur le complexe 2/1 réside en son activité directe immédiate importante (25 à 35 % de celle de la plasmine), tandis que la stabilité du complexe 2/1 est supérieure à celle du complexe 1/1. 7°) Tests de toxicitéThe increase in lysis surfaces for one week is observed with the two complexes and shows their insensitivity to plasma inhibitors and their stability. The advantage of the 1/1 complex over the 2/1 complex lies in its significant immediate direct activity (25 to 35% of that of plasmin), while the stability of the 2/1 complex is greater than that of the 1 / complex. 1. 7 °) Toxicity tests
On a injecté à la souris une quantité de complexe comprenant 2 microkatals de plasmine et 8 000 uIP d'aprotinine dans 0,5 ml de sérum physiologique, par voie intraveineuse. On a utilisé pour réaliser ces tests de toxicité, dix animaux : aucune anomalie n'a été constatée : les dix animaux étaient vivants au bout de 21 jours. 8°) Indications et posologieAn amount of complex comprising 2 microkatins of plasmin and 8,000 pIU of aprotinin in 0.5 ml of saline was injected intravenously. Ten animals were used to carry out these toxicity tests: no anomaly was noted: the ten animals were alive after 21 days. 8 °) Indications and dosage
Le nouveau complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est particulièrement indiqué pour tous traitements fibrinolytiques et notamment pour le traitement des embolies, des thromboses, des microcaillots des capillaires, des coagulations intravasculaires disséminées (CIVD) fréquentes en néphrologie, etc... La stabilité du complexe conforme à l'invention pourrait avantageusement être utilisée pour obtenir une fibrinolyse thérapeutique locale, notamment dans les thromboses artérielles, du fait que son activité se prolonge pendant plusieurs heures, au lieu de ne durer que quelques minutes comme c'est le cas pour les fibrinolytiques actuellement connus. Le complexe est avanrageusement. à administrer de 50 à 300 microkatals de placτr:i::G: complexée avec l'aprotinine par 24 heures.The new aprotinin-plasmin complex in accordance with the invention is particularly indicated for all fibrinolytic treatments and in particular for the treatment of embolism, thrombosis, capillary micro clots, disseminated intravascular coagulation (DIC) frequent in nephrology, etc. stability of the complex according to the invention could advantageously be used to obtain local therapeutic fibrinolysis, in particular in arterial thrombosis, because its activity is prolonged for several hours, instead of only lasting a few minutes as is the case for currently known fibrinolytics. The complex is advantageously. to be administered from 50 to 300 microkatals of placτr: i :: G: complexed with aprotinin per 24 hours.
Le complexe conforme à l'invention est avantageusèment administré en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable, tel que le soluté chloruré isotonique, par exemple, par voie parentérale, de préférence intraveineuse.The complex according to the invention is advantageously administered in combination with an acceptable pharmaceutical vehicle, such as the isotonic chlorinated solution, for example, parenterally, preferably intravenously.
Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre et de réalisation adoptés, l'on obtient un médicament doué d'une activité fibrinolytique efficace et rapide, à des doses relativement réduites, étant donné son action prolongée.It follows from the foregoing that, whatever the mode of implementation and realization adopted, one gets a medicament with an effective and fast fibrinolyti q ue activity at relatively low doses, given its prolonged action.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre et de réalisation qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation and embodiments which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS 1º- Médicament nouveau, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-plasmine.CLAIMS 1º- New drug, characterized in that it consists of an aprotinin-plasmin complex.
2°- Médicament nouveau selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine.2 ° - New medicament according to Claim 1, characterized in that it consists of an aprotinin-lys human plasmin complex.
3°- Complexe selon la Revendication 1 ou la Revendication 2, caractérisé en ce que la plasmine est présente sous la forme de son précurseur, le plasminogène associé à un activateur.3 ° - Complex according to Claim 1 or Claim 2, characterized in that plasmin is present in the form of its precursor, plasminogen associated with an activator.
4°- Complexe selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe en quantités équimoléculaires. 5°- Complexe selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe, dans un rapport aprotinine/plasmine de l'ordre de 2/1.4 ° - Complex according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that aprotinin and plasmin are present in the complex in equimolecular quantities. 5 ° - Complex according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that aprotinin and plasmin are present in the complex, in an aprotinin / plasmin ratio of the order of 2/1.
6°- Procédé de préparation du nouveau médicament selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur, avec de l'aprotinine, en quantités appropriées, dans un solvant convenable, le complexe aprotinine-plasmine formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'activateur, si celui-ci a été précédemment ajouté, le complexe étant ensuite élué par l'acide ε-amino-caproïque à une concentration molaire d'au moins 0,05 M.6 ° - Process for preparing the new drug according to any one of Claims 1 to 5, characterized in that it consists in bringing plasmin or its precursor, plasminogen associated with an activator, into contact with aprotinin , in appropriate quantities, in a suitable solvent, the aprotinin-plasmin complex formed being purified by passage over a column of Sepharose-lysine, so as to eliminate the possible excess of aprotinin and, where appropriate, the activator, if the latter Ci was previously added, the complex then being eluted by ε-amino-caproic acid at a molar concentration of at least 0.05 M.
7°- Procédé selon la Revendication 6, caractérisé en ce que dans le cas où l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celuici est de préférence du lys-plasminogène et notamment du lys-plasminogène humain.7 ° - Process according to Claim 6, characterized in that in the case where the plasmin precursor, namely plasminogen, is used, this is preferably lys-plasminogen and in particular human lys-plasminogen.
8°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'activateur associé au plasminogène, est l'urokinase.8 ° - Method according to any one of Claims 6 or 7, characterized in that the activator associated with plasminogen, is urokinase.
9°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 1400 à 2000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'obtention d'un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes en quantités équimoléculaires est recherchée.9 ° - A method according to any one of Claims 6 to 8, characterized in that the mixture of aprotinin and plasmin comprises at least 1400 to 2000 UIP of aprotinin for 1 microkatal of plasmin, in the case where obtaining of a complex in which aprotinin and plasmin must be present in equimolecular amounts is sought.
10°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le mélange d' aprotinine et de plasmine comprend au moins 3500 à 5000 UIP d' aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3600 à 4000 UIP d' aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'obtention d'un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes dans un rapport 2/1, est recherchée.10 ° - Method according to any one of Claims 6 to 8, characterized in that the mixture of aprotinin and plasmin comprises at least 3500 to 5000 UIP of aprotinin for 1 microkatal of plasmin, and advantageously 3600 to 4000 UIP d 'aprotinin for 1 microkatal of plasmin, in the case where obtaining a complex in which aprotinin and plasmin must be present in a 2/1 ratio, is sought.
11º- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 10, caractérisé en ce que la complexation de l'aprotinine et de la plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 40°C.11º- Process according to any one of Claims 6 to 10, characterized in that the complexation of aprotinin and plasmin is carried out by incubation of a mixture of aprotinin and plasmin, or of plasminogen associated with an activator , at a temperature between ambient and 40 ° C.
12°- Procédé selon la Revendication 11, caractérisé en ce que dans le cas où l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ - pour provoquer la transformation du plasminogène en plasmine et la complexation de cette dernière avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmine.12 ° - Process according to Claim 11, characterized in that in the case where the plasminogen associated with an activator is used, the duration of the incubation is sufficient - of the order of approximately one hour - to cause the transformation of plasminogen into plasmin and complexation of the latter with aprotinin, this time can be reduced to a few minutes in the case where plasmin is used.
13°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le pH du mélange est de l'ordre de 7,4 ±0,4.13 ° - Process according to any one of Claims 6 to 12, characterized in that the pH of the mixture is of the order of 7.4 ± 0.4.
14°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 13, caractérisé en ce que le complexe formé est lyophilisé. 14 ° - Process according to any one of Claims 6 to 13, characterized in that the complex formed is lyophilized.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3119157A1 (en) * 1981-05-14 1982-12-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg METHOD FOR PRODUCING PLASMINOGEN AND THEREFORE PRODUCED
JPH0768274B2 (en) * 1987-03-27 1995-07-26 株式会社ミドリ十字 Method for producing plasminogen
GB8721951D0 (en) * 1987-09-18 1987-10-28 Thrombosis Research Trust Organic compounds
JP2764264B2 (en) * 1987-10-01 1998-06-11 株式会社ミドリ十字 Fibrinolytic activity enhancer
DE19903693A1 (en) * 1998-04-24 1999-10-28 Centeon Pharma Gmbh Protease for activation of coagulation factor VII
DE10023923A1 (en) 1999-06-10 2000-12-14 Aventis Behring Gmbh Method for determining the activity of the factor VII-activating protease from protein solutions
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
CN117568445B (en) * 2024-01-18 2024-04-09 西南交通大学 Preparation method and application of TAT (TAT) and PIC (PIC) composite quality control product

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7602846A (en) * 1976-03-18 1977-09-20 Leuven Res & Dev Vzw ANTIPLASMIN AND AN ANTI-SERUM AGAINST.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO8203772A1 *

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FR2504921A1 (en) 1982-11-05

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