EP0058780A1 - Antigen/Antikörper-Bestimmungsmethode - Google Patents

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EP0058780A1
EP0058780A1 EP81110764A EP81110764A EP0058780A1 EP 0058780 A1 EP0058780 A1 EP 0058780A1 EP 81110764 A EP81110764 A EP 81110764A EP 81110764 A EP81110764 A EP 81110764A EP 0058780 A1 EP0058780 A1 EP 0058780A1
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liquid
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F Hoffmann La Roche AG
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
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    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
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Definitions

  • an immunoglobulin-binding component is bound directly to the plastic material of the cuvette and can thus be used in the adherence test to find X-Anti-A which are bound to the cells. In this way, washing steps are eliminated and the sensitivity of the test is increased.
  • the present invention accordingly relates to a method for determining antigens or antibodies in a liquid by incubating particles which have antigens on the surface and antibodies, either the antigens or the antibodies being of known specificity, which is characterized in that introduces the antigen / antibody complex into a container with a conical or wedge-shaped bottom recess, at least the recess of the container being coated with an immunoglobulin-binding component which is directed against the antibodies, and after centrifugation the amount of sediment is determined, whereby the antigen / antibody complex is freed of unbound immunoglobulins before and / or after introduction into the container.
  • Anti-immunoglobulins or protein A isolated from Staphylococcus aureus can be considered as immunoglobulin-binding components, although it should be noted that protein A only binds the immunoglobulins G, as is known.
  • the method according to the present invention is particularly suitable for determining viral, cellular or erythrocyte antigens or antiviral, anticellular or antierythrocytic antibodies.
  • Antigens from hepatitis B, influenza, Rabies, Rubella and the like come into consideration as viral antigens to be determined.
  • Cellular antigens to be determined are, in particular, HLA series antigens and tumor antigens.
  • HLA series antigens and tumor antigens.
  • erythrocytic antigens blood group antigens, rhesus antigens, Kell antigens, MNS antigens, Lewis antigens and Duffy antigens come into consideration.
  • Antibodies to be determined are those which are formed in the body as a response to the above-mentioned antigens.
  • the liquid in which the antigens or antibodies are detected can be a biological liquid, such as blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, lymphatic fluid or saliva.
  • the liquid in which the antigens or antibodies are detected can also be a buffered saline solution, e.g. B. be phosphate buffered saline.
  • a liquid with a low ionic strength can also be considered, for example an aqueous solution containing 0.24 M / 1 glycine, 0.003 M / 1 Na 2 HPO 4 .12 H 2 0, 0.003 M / 1 NaH 2 P0 4. 2 H 2 O, 0.03 M / 1 NaCl and O, 1 g / 1 NaN 3 .
  • a cuvette or the well of a microtiter plate can be considered as a container with a conical or wedge-shaped bottom well, in which the determination of antigens or antibodies is carried out.
  • anti-immunoglobulins are used as the immunoglobulin-binding component, they do not necessarily have to be used in a purified form, but it is advantageous to use them in a purified form. Affinity chromatography is particularly suitable as a purification method.
  • the conical or wedge-shaped recesses in the bottom of the container need not be coated with the immunoglobulin-binding component immediately before the test; rather, it is possible to coat these conical or wedge-shaped depressions of the containers with the immunoglobulin-binding component, wash them out with water and dry them in air, whereupon the containers coated in this way can be stored in the refrigerator at 4 ° C.
  • protein A which binds to immunoglobulin G, or anti-immunoglobulins can be used as immunoglobulin-binding components.
  • Anti-immunoglobulins which can be used are those which are directed against the immunoglobulin subclasses of the antibodies. However, it is also possible to use, as anti-immunoglobulins, those which are directed against the light chains of the antibodies and thus offer a broader use since they are directed against all classes of immunoglobulins.
  • the conical or wedge-shaped recesses in the bottom of the containers are coated with the anti-immunoglobulins in a conventional manner.
  • the antigen / antibody complex is freed of unbound immunoglobulins before or after being introduced into the container. If this step is carried out before being introduced into the container, it is carried out in a conventional manner, ie by adding a buffer such as phosphate-buffered saline, centrifuging and decanting, this process being repeated several times. if this step is only carried out after it has been introduced into the container, it is carried out by centrifuging the liquid containing the antigen / antibody complex through a cushion consisting of a further liquid, the density of the liquid of the cushion being greater than the density the other liquid.
  • the pillow liquid must not be toxic and must have a suitable pH (eg in the range of 6-8). Furthermore, this pillow liquid must not change the layer sequence.
  • pillow liquids examples include bovine serum albumin, fetal calf serum and polyvinylpyrrolidone.
  • the amount of sediment is determined after centrifugation, this preferably being done by measuring the sediment area proportional to it.
  • Erythrocytes are particularly suitable as particles that have antigens on the surface.
  • the antigen / antibody determination method according to the invention can be done both manually and by apparatus, e.g. with the device described in German Offenlegungsschrift No. 29 07 823.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Bestimmen von Antigenen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit beschrieben. Hierzu werden Partikel, die Antigene an der Oberfläche aufweisen, und Antikörper in dieser Flüssigkeit inkubiert. Entweder die Antigene oder die Antikörper sind von bekannter Spezifität. Charakteristisch für das neue Verfahren ist, daß der Antigen/Antikörper-Komplex in einen Behälter mit kegel- oder keilförmiger Bodenvertiefung eingebracht wird, wobei mindestens die Vertiefung des Behälters mit einer Immunglobulin-bindenden Komponente beschichtet ist, welche gegen die Antikörper gerichtet ist. Nach der Zentrifugation wird die Menge des Sedimentes bestimmt, die Auskunft über die An- oder Abwesenheit des zu suchenden Antigens oder Antikörpers liefert. Vor und/oder nach Einbringen des Antigen/Antikörper-Komplexes in den Behälter wird dieser gewaschen. Als zu bestimmende Antigene kommen insbesondere Blutgruppenantigene in Betracht. Als Immunglobulin-bindende Komponenten kommen Antiimmunglobuline sowie Protein A in Betracht.

Description

  • Das Binden von Antikörpern an Zielantigene, die an Zellen gebunden sind, ist eine grundlegende Reaktion auf allen Gebieten der Serologie und insbesondere der klinischen Diagnostik. Das Bestimmen einer solchen Bindung kann nach einer Vielzahl von Methoden erreicht werden. Diese Methoden umfassen die Beobachtung der Zellagglutination durch die Antikörper, den Zytotoxizitätstest sowie eine Vielfalt von Methoden, bei denen markierte Antikörper verwendet werden, deren Vorhandensein auf der Zelloberfläche durch weitere Methoden aufgedeckt wird, zum Beispiel durch Radioaktivitätsmessung, durch Bestimmung der Enzymsubstratreaktion sowie durch Fluoreszenzmessung. In der Deutschen Offenlegungsschrift No. 29 07 198 wird eine empfindliche Methode zum Auffinden der Bindung von Antikörpern an Erythrozyten (RBC) beschrieben, welche auf der Adhärenz der Antikörper-beladenen RBC an einer Plastikoberfläche beruht. Bei dieser Methode reagiert das Zielantigen (A), das von den RBC getragen wird, mit einem spezifischen Antikörper von Serum oder Zellen einer Tierspezies X (X-Anti-A). Nach einem Waschvorgang, bei dem überschüssiges X-Anti-A entfernt wird, wird ein weiteres Antiserum (B) zugegeben, das eine Spezifität gegen die Determinanten der Immunglobuline von X-Anti-A aufweist. Nach einem weiteren Wasch-Schritt werden die Zellen in einer Küvette zentrifugiert, deren V-förmiger Boden mit Immunglobulin (Ig) der Tiespezies X (IgX) beladen ist. Die zellgebundenen Antikörper (B) haben freie Bindungsstellen, welche mit dem IgX binden, woraus eine Adhärenz der Zellen an das Plastikmaterial resultiert. Im Fall einer negativen Reaktion, wo kein Anti-A an die Zelloberfläche gebunden ist, bindet Anti-Serum B ebenfalls nicht und es entsteht während der Zentrifugation keine Adhärenz der Zellen. Die in der oben erwähnten DOS beschriebene Methode zeigt zwei Nachteile, nämlich
    • a) das Erfordernis der mehrmaligen Zellwasch-Schritte, die zeitaufwendig sind, und
    • b) die Abhängigkeit von einer bestimmten, kritischen Konzentration an X-Anti-A auf der Zelloberfläche, in dem Mass, dass nach wie vor Anti-X Bindungsstellen des zellgebundenen Antiserums (B) vorhanden sind für die Bindung von IgX an die Plastikoberfläche.
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung wird eine Immunglobulin-bindende Komponente direkt an das Plastikmaterial der Küvette gebunden und kann so im Adhärenztest zur Auffindung von X-Anti-A verwendet werden, die an die Zellen gebunden sind. Auf diese Weise werden Wasch-Schritte eliminiert und die Empfindlichkeit des Tests wird erhöht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zum Bestimmen von Antigenen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit durch Inkubieren von Partikeln, die Antigene an der Oberfläche aufweisen, und Antikörpern, wobei entweder die Antigene oder die Antikörper von bekannter Spezifität sind, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Antigen/Antikörper-Komplex in einen Behälter mit kegel- oder keilförmiger Bodenvertiefung einbringt, wobei mindestens die Vertiefung des Behälters mit einer Immunglobulin-bindenden Komponente beschichtet ist, welche gegen die Antikörper gerichtet sind, und dass man nach Zentrifugation die Menge des Sedimentes bestimmt, wobei man den Antigen/Antikörper-Komplex vor und/oder nach dem Einbringen in den Behälter von ungebundenen Immunglobulinen befreit.
  • Als Immunglobulin-bindende Komponenten kommen Antiimmunglobuline oder Protein A (isoliert aus Staphylococcus aureus) in Betracht, wobei jedoch zu beachten ist, dass Protein A bekanntlich nur die Immunglobuline G bindet.
  • Das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung ist insbesondere zur Bestimmung viraler, zellulärer oder erythrozytärer Antigene bzw. antiviraler, antizellulärer oder antierythrozytärer Antikörper geeignet.
  • Als zu bestimmende virale Antigene kommen Antigene von Hepatitis B, Influenza, Rabies, Rubella und dergleichen in Betracht. Zu bestimmende zelluläre Antigene sind insbesondere Antigene der HLA-Serie sowie Tumor-Antigene. Bei den erythrozytären Antigenen kommen Blutgruppen-Antigene, Rhesus-Antigene, Kell-Antigene, MNS-Antigene, Lewis-Antigene sowie Duffy-Antigene in Betracht.
  • Als zu bestimmende Antikörper kommen solche in Betracht, die als Antowort auf die oben erwähnten Antigene im Körper gebildet werden.
  • Die Flüssigkeit, in der die Antigene bzw. Antikörper nachgewiesen werden, kann eine biologische Flüssigkeit, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Liquor-cerebrospinalis, Lymphflüssigkeit oder Speichel sein. Andererseits kann die Flüssigkeit, in der die Antigene bzw. Antikörper nachgewiesen werden, auch eine gepufferte Salzlösung, z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein. Im weiteren kommt auch eine Flüssigkeit mit geringer Ionenstärke in Betracht, z.B. eine wässrige Lösung enthaltend 0,24 M/1 Glycin, 0,003 M/1 Na2HPO4· 12 H20, 0,003 M/1 NaH2P04·2 H2O, 0,03 M/1 NaCl und O,1 g/1 NaN3. Als Behälter mit einer kegel- oder keilförmigen Bodenvertiefung, in dem die Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern durchgeführt wird, kommt eine Küvette oder die Vertiefung einer Mikrotiterplatte in Betracht.
  • Sofern als Immunglobulin-bindende Komponente Anti-Immunglobuline verwendet werden, müssen diese nicht unbedingt in gereinigter Form eingesetzt werden, doch ist es von Vorteil, diese in gereinigter Form einzusetzen. Als Reinigungsmethode eignet sich hierzu insbesondere die Affinitätschromatographie.
  • Nach einem besonderen Aspekt der Erfindung müssen die kegel- oder keilförmigen Bodenvertiefungen der Behälter nicht unmittelbar vor dem Test mit der Immunglobulin-bindenden Komponente beschichtet werden; vielmehr ist es möglich, diese kegel- oder keilförmigen Vertiefungen der Behälter mit der Immunglobulin-bindenden Komponente zu beschichten, mit Wasser auszuwaschen und luftzutrocknen, worauf die so beschichteten Behälter im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt werden können.
  • Als Immunglobulin-bindende Komponenten können - wie erwähnt - Protein A, welches an Immunglobulin G bindet, oder Anti-Immunglobuline verwendet werden.
  • Als Anti-Immunglobuline können solche verwendet werden, die gegen die Immunglobulinsubklassen der Antikörper gerichtet sind. Es ist aber auch möglich, als Anti-Immunglobuline solche zu verwenden, die gegen die leichten Ketten der Antikörper gerichtet sind und somit eine breitere Anwendungsmöglichkeit bieten, da sie gegen alle Immunglobulinklassen gerichtet sind. Die Beschichtung der kegel- oder keilförmigen Bodenvertiefungen der Behälter mit den Anti-Immunglobulinen erfolgt in herkömmlicher Weise.
  • Wie bereits erwähnt,wird der Antigen/Antikörper-Komplex vor oder nach'dem Einbringen in den Behälter von ungebundenen Immunglobulinen befreit. Falls dieser Schritt vor dem Einbringen in den Behälter vorgenommen wird,erfolgt er in herkömmlicher Weise, d.h. durch Versetzen mit einem Puffer wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Zentrifugieren und Abdekantieren, wobei dieser Vorgang mehrfach wiederholt wird. wird dieser Schritt erst nach dem Einbringen in den Behälter vorgenommen, so erfolgt er dadurch, dass die den Antigen/Antikörper-Komplex enthaltende Flüssigkeit durch ein Kissen bestehend aus einer weiteren Flüssigkeit zcntrifugiert wird, wobei die Dichte der Flüssigkeit des Kissens grösser ist als die Dichte der anderen Flüssigkeit. Selbstverständlich darf die Kissen-Flüssigkeit nicht toxisch sein und muss einen geeigneten pH (z.B. im Bereich von 6-8) aufweisen. Im weiteren darf diese Kissen-Flüssigkeit keine Aenderung hinsichtlich der Schichtenfolge bewirken.
  • Beispiele solcher Kissen-Flüssigkeiten sind Rinderserumalbumin, foetales Kälberserum sowie Polyvinylpyrrolidon.
  • Im Falle der Bestimmung von Seren mit niedrigen Titern empfiehlt es sich, einen vorgängigen Wasch-Schritt sowie die Kissen-Reinigungsmethode anzuwenden.
  • Wie bereits früher erwähnt, wird nach der Zentrifugation die Menge des Sedimentes bestimmt, wobei dies vorzugweise durch Messung der ihr proportionalen Sedimentfläche erfolgt.
  • Als Partikel, die Antigene an der Oberfläche aufweisen, kommen insbesondere Erythrozyten in Betracht.
  • Die erfindungsgemässe Antigen/Antikörper-Bestimmungsmethode kann sowohl manuell wie auch apparativ, z.B. mit dem in der Deutschen Offenlegungsschrift Nr. 29 07 823 beschriebenen Gerät durchgeführt werden.
  • Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung.
    • Beispiel Rhesusbestimmung:
    • 1. Herstellung von Kaninchen-Anti-Human IgG (R-Anti-HIgG)
      • a) Kaninchen werden durch eine erste subkutane Injektion von 0,5 mg humanem IgG in Freund's vollständigem Adjuvans,gefolgt von einer zweiten, vier Wochen späteren Injektion von 0,5 mg IgG in Freund's inkompletten Adjuvans immunisiert. 10 Tage nach der zweiten Injektion werden die Seren mit Hilfe des Ouchterlony Immundiffusionstestes nach Antikörpern gegen humanes IgG untersucht. Kaninchen mit hohen Titern an Antikörpern wird Blut entnommen, und die Seren werden abgetrennt und durch Erhitzen auf 56°C während 30 Minuten inaktiviert.
      • b) Die spezifischen Antikörper gegen humanes IgG werden an einer human-IgG-Sepharose Kolonne affinitätschromatographisch gereinigt. Das Antiserum wird auf die Kolonne gebracht, welche dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH 7,2 gespült wird. Die spezifischen Antikörper werden dann mit Glycin-Natriumchloridpuffer vom pH 2,8 aus der Säule eluiert. Das Eluat (R-Anti-HIgG) wird dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert.
    • 2. Beschichtung mit R-Anti-HIgG oder mit Protein A
      • a) Die R-Anti-HIgG bzw. das Protein A (Pharmacia) werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 10 µg/ml verdünnt. 50 µl werden zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit V-förmigem Boden (Dynatech Laboratories Cat. No. 1-330-25, Virginia, USA) gegeben. Die Platten werden während einer Stunde bei 37°C inkubiert.
      • b) Die Flüssigkeit mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und ungebundenem R-Anti-HIgG oder Protein A wird entfernt und die Mikrotiterplatten werden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und dann kurz mit destilliertem Wasser gewaschen.
      • c) Das destillierte Wasser wird sofort entfernt, und die Mikrotiterplatten werden in einem kühlen Luftstrom luftgetrocknet. Die getrockneten Platten können dann bei 4°C bis zur Verwendung gelagert werden.
    • 3. Bestimmung von RBC-Antigenen unter Verwendung von mit R-Anti-HIgG oder mit Protein A beschichteten Platten
      • a) 100 µl Citrat-antikoaguliertes Spenderblut werden durch Zugabe von 5 ml eines Puffers mit geringer Ionenstärke verdünnt. Als Puffer mit geringer Ionenstärke wird 4%ige Glukose in Wasser mit 5 mM HEPES (N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure) Puffer verwendet.
      • b) 50 µl des verdünnten Blutes werden mit 10 µl Rhesusblutgruppen-Antiserum (Merz und Dade, Düdingen, Schweiz) während 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
      • c) In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, die mit R-Anti-HIgG oder mit Protein A beschichtet ist, werden 150 µl 20%iges Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gegeben.
      • d) 25 µl des Inkubationsgcmisches gemäss 3b) werden auf die Oberfläche der phosphatgepufferten Kochsalzlösung überschichtet.
      • e) Die Platten werden während 5 Minuten bei 3000 rpm in einer Zentrifuge mit einem Rotationsradius von 11 cm zentrifugiert (dies entspricht ungefähr 1100 x g).
      • f) Das Ausmass des Erythrozytensedimentes wird visuell abgeschätzt. Im Fall, wo weniger als 10% der Erythrozyten im Sediment enthalten sind, wird die Reaktion als positiv (+) beurteilt, was bedeutet, dass die Erythrozyten das Antigen tragen, welches von dem verwendeten Antiserum erkannt wird. Im Falle, wo mindestens 70% der Erythrozyten im Sediment vorhanden sind, wird der Test als negativ betrachtet (-). Bei Verwendung rhesustypischer Antiseren wurden keine Zwischenresultate beobachtet.
    • 4. Ergebnis
      • a) Die Rhesusbestimmung gemäss der erfindungscemässen Festphasenmethode (SPA) wird mit der herkömmlichen Coombs Antiglobulinmethode (CT) verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
        Figure imgb0001

Claims (14)

1. Verfahren zum Bestimmen von Antigenen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit durch Inkubieren von Partikeln, die Antigene an der Oberfläche aufweisen', und Antikörpern, wobei entweder die Antigene oder die Antikörper von bekannter Spezifität sind, dadurch gekennzeichnet, dass man den Antigen/Antikörper-Komplex in einen Behälter mit kegel-oder keilförmiger Bodenvertiefung einbrinqt, wobei mindestens die Vertiefung des Behälters mit einer Immunglobulin-bindenden Komponente beschichtet ist, welche gegen die Antikörper gerichtet sind, und dass man nach Zentrifugation die Menge des Sedimentes bestimmt, wobei man den Antigen/Antikörper-Komplex vor und/oder nach dem Einbringen in den Behälter von ungebundenen Immunglobulinen befreit.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulin-bindende Komponente ein Anti-Immunglobulin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulin-bindende Komponente Protein A ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmenden Antigene virale, zelluläre oder erythrozytäre Antigene sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmenden Antikörper antivirale, antizelluläre oder antierythrozytäre Antikörper sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit eine biologische Flüssigkeit ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit gepufferte Salzlösung ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ein Puffer mit geringer Ionenstärke ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter mit kegel- oder keilförmiger Bodenvertiefung eine Küvette oder die Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulin-bindende Komponente in gereinigter Form eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 2 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Anti-Immunglobuline durch Affinitätschromatographie gereinigt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die kegel- oder keilförmigen Bodenvertiefungen der Behälter mit der Immunglobulin-bindenden Komponente beschichtet, mit Wasser auswäscht und lufttrocknet.
13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anti-Immunglobuline gegen Immunglobulinsubklassen der Antikörper gerichtet sind.
14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anti-Immunglobuline gegen die leichten Ketten der Antikörper gerichtet sind.
EP81110764A 1981-02-19 1981-12-24 Antigen/Antikörper-Bestimmungsmethode Expired EP0058780B1 (de)

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