EA046941B1

EA046941B1 - Антитела, содержащие модифицированные константные области тяжелой цепи

Info

Publication number: EA046941B1
Application number: EA201992797
Authority: EA
Inventors: Аарон П. Яминюк; Алан Дж. Корман; Марк Дж. Селби; Брайан С. Барнхарт; Нильс Лонберг; Мохан Сринивасан; Карла А. Хеннинг; Мишель Минхуа Хан; Мин Лей; Лиан Швейцер; Сандра В. Хатчер; Арвинд РАДЖПАЛ
Original assignee: Бристол-Маерс Сквибб Компани
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2024-05-15

Description

Терапия антителами является одной из наиболее быстро развивающихся областей лечения заболеваний, таких как рак и иммунные нарушения. Тем не менее эффективное нацеливание антигена терапевтическими антителами остается серьезной проблемой в здравоохранении. Поэтому разработка антител стала основным направлением в фармацевтическом мире. В результате этого внимания появилось множество новых сконструированных антител, таких как фрагменты антител, конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC), антитела с модифицированными эффекторными областями и биспецифические антитела.

Антитела реализуют свои терапевтические свойства посредством множества различных механизмов. Антитела могут напрямую ингибировать или активировать целевой антиген, регулируя таким образом передачу сигналов клетками. Антитела могут ингибировать связывание лиганда с рецептором. Антитела могут также индуцировать или ингибировать иммунный ответ, например, путем усиления иммунной системы субъекта для борьбы с инфекцией или раком (например, в качестве костимуляторов при активации Т-клеток).

Кроме того, основным механизмом действия терапевтических антител считается опосредованная антителами интернализация рецептора клеточной поверхности/антигена. В этом случае антитело удаляет мишень с клеточной поверхности и выполняет свою функцию путем индуцирования интернализации в клетку. Действительно, одним из пионерных терапевтических средств на основе антител является трастузумаб для лечения рака молочной железы. Трастузумаб нацеливается на рецептор ErbB2 и индуцирует интернализацию рецептор/антитело, таким образом ингибируя передачу сигналов EGFR. Однако антитела не всегда проявляют эффективные свойства интернализации, поэтому существует постоянная потребность в антителах с улучшенными функциями интернализации. Соответственно, весьма желательными являются способы улучшения интернализации известных терапевтических антител.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к константным областям тяжелой цепи (называемым модифицированные константные области тяжелой цепи) или их функционально эквивалентным фрагментам, которые усиливают или модифицируют биологические свойства антител по отношению к тем же антителам в неизмененной форме. Например, антитела, содержащие модифицированные константные области, проявляют повышенную интернализационную и/или агонистическую или антагонистическую активность. Соответственно, антитела по изобретению являются оптимизированными версиями исходного немодифицированного антитела. В определенных вариантах выполнения изобретения тяжелая цепь содержит модифицированную константную область, содержащую одну или несколько мутаций или модификаций относительно константной области тяжелой цепи дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи включает шарнир IgG2 и три константных домена (т.е. домены CH1, CH2 и CH3), где один или несколько доменов константной области не относятся к изотипу IgG2 человека (например, IgGl, IgG3 или IgG4), или их функционально эквивалентные фрагменты. Модифицированная константная область может включать соответствующую аминокислотную последовательность дикого типа или ее вариант, например, одну или несколько (например, от 1 до 10 или более) аминокислотных замен или делеций в шарнире или доменах CH1, CH2, CH3 относительно аминокислотной последовательности дикого типа. Соответственно, аминокислотная последовательность шарнира и/или каждого константного домена составляет по меньшей мере около 80, 85, 90, 95% или более (т.е. 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа.

В одном варианте выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи включает шарнир человеческого IgG2 дикого типа или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности шарнира человеческого IgG2 дикого типа. Шарнир может дополнительно содержать дополнительные модификации, например, для уменьшения образования дисульфидной связи. В одном варианте выполнения изобретения шарнир включает аминокислотную замену C219S относительно шарнира человеческого IgG2 дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 и 134-147, или одну из этих последовательностей, которая содержит 1-3 аминокислоты, вставленные между CVE и СРР.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи включает домен CH1 IgG2, например домен CH1 человеческого IgG2 дикого типа, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности домена C_H1 человеческого IgG2 дикого типа (SEQ ID NO: 7).

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяже

- 1 046941 лой цепи включает домен CH2 IgG1, например домен CH2 человеческого IgG1 дикого типа, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности домена CH2 человеческого IgG1 дикого типа. Домен CH2 может содержать дополнительные модификации (например, для уменьшения или устранения эффекторных функций). В некоторых вариантах выполнения изобретения домен CH2 включает аминокислотные замены A330S и P331S относительно полноразмерного C_H2 человеческого IgG1 дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения домен CH2 содержит SEQ ID NO: 24.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи включает домен CH3 IgG1, например домен CH3 человеческого IgG1 дикого типа, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности домена CH3 человеческого IgG1 дикого типа. Домен CH3 может также содержать дополнительные модификации для придания конкретного аллотипа. В одном варианте выполнения изобретения домен CH3 содержит аминокислотный остаток Е в положении 356 и аминокислоту М в положении 358 (аллотип f) относительно полноразмерного человеческого IgG1 дикого типа другого аллотипа (например, аллотипа fa, имеющего D и L в этих положениях соответственно). В некоторых вариантах выполнения изобретения домен C_H3 содержит SEQ ID NO: 5.

В конкретном варианте выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, в которой (а) домен C_H1 представляет собой домен C_H1 человеческого IgG2 дикого типа или домен CH1 IgG1 дикого типа с дополнительной модификацией или без нее; (b) шарнир представляет собой IgG2 дикого типа с заменой C219S или без нее; (с) домен C_H2 представляет собой домен CH2 человеческого IgG1 дикого типа или домен CH2 IgG2 дикого типа с дополнительными модификациями или без них и (d) домен CH3 представляет собой домен CH3 человеческого IgG1 дикого типа или домен CH3 человеческого IgG2 дикого типа с аминокислотой Е в положении 356 и аминокислотой М в положении 358 (например, аллотип f или fa) или без них. В конкретном варианте выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, например, изложенную в любой из SEQ ID NO: 26-37 и 78-93.

Антитела по изобретению (т.е. антитела, имеющие модифицированную константную область) могут быть полностью человеческими антителами или гуманизированными антителами и, кроме того, проявлять одну или несколько усиленных или измененных характеристик по сравнению с теми же антителами без модифицированной константной области тяжелой цепи. Эти признаки могут включать повышенную или измененную интернализацию клеткой, агонистическую активность, образование крупных сшитых комплексов, ADCC, опосредованную рецептором передачу сигналов, антагонистическую активность, иммуномодулирующую активность и противоопухолевую активность или введение нового свойства, например агонистической активности.

Также предлагаются биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты, содержащие модифицированные константные области по изобретению, а также композиции, которые содержат антитела, биспецифические молекулы или иммуноконъюгаты и приемлемый фармацевтический носитель. Такие композиции также могут включать один или несколько дополнительных терапевтических агентов, например, агент, который стимулирует иммунную систему, такой как ингибитор контрольных точек, костимулирующая молекула, антитело против CD39 или антитело против A2AR.

Также предложены способы получения антитела, содержащего модифицированную константную область тяжелой цепи. Определенные способы, представленные в настоящем документе, включают способы повышения интернализации антитела клеткой и способы повышения агонистической активности антитела по сравнению с тем же антителом, содержащим шарнир, не относящийся к изотипу IgG2. Такие способы включают стадии предоставления антитела, имеющего шарнир, который не является шарниром IgG2, и замены шарнира на шарнир IgG2 (такого как шарнир, который является шарниром человеческого IgG2 дикого типа, шарниром, имеющим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности шарнира человеческого IgG2 дикого типа или шарнира, который модифицирован для уменьшения образования дисульфидной связи, например, шарнира, который содержит аминокислотную замену C219S). В одном варианте выполнения изобретения интернализация антитела усиливается или увеличивается по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более, что приводит к снижению Т_1/2 по меньшей мере на 10, 30, 50, 75, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более. В определенных вариантах выполнения изобретения активность агониста увеличивается или усиливается по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более, что определяется повышенным высвобождением цитокинов или повышенной пролиферацией в эффекторных Т-клетках; снижением активности регуляторных Т-клеток, если связывание с T_reg снижает функцию T_reg; или увеличенной деплецией T_reg.

В определенных вариантах выполнения изобретения способ дополнительно включает этап замены по меньшей мере одного из доменов CH1, CH2 или CH3 доменом CH1, CH2 или CH3 другого изотипа. Такие замены включают, например, (а) замену домена CH1 доменом CH1 IgG1 или доменом CH1 IgG2; (b) замену домена CH2 доменом CH2 IgG1 или доменом CH2 IgG2 и/или (c) замену домена CH3 доменом CH3 IgG1 или доменом C_H3 IgG2, где домен замены имеет последовательность дикого типа или по меньшей мере

- 2 046941

95% идентичность с последовательностью дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения домен CH1 содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 7. В определенных вариантах выполнения изобретения домен CH2 модифицируют для уменьшения или устранения эффекторных функций, например домен CH2 содержит аминокислотные замены A330S и P331S (SEQ ID NO: 24). В определенных вариантах выполнения изобретения домен CH3 содержит аминокислотный остаток Е в положении 356 и аминокислоту М в положении 358 (SEQ ID NO: 5, аллотип Г), а в определенных вариантах выполнения изобретения домен CH3 содержит аллотип fa.

Способы, раскрытые в настоящем документе, включают способы лечения субъекта путем введения антитела, биспецифической молекулы или иммуноконъюгата, содержащего модифицированную константную область тяжелой цепи. Также могут вводиться совместно один или несколько дополнительных терапевтических агентов, например терапевтический агент, который стимулирует иммунную систему, такой как ингибитор контрольных точек, костимулирующая молекула.

В настоящем документе представлены антитела, содержащие модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3 в порядке от N- до С-конца, где (а) домен CH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, которая отличается от них не более чем на 5 аминокислот или которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 7, и где по меньшей мере один из С131, R133, Е137, S138 или R217 не заменены и не удалены; (b) шарнир, содержащий любую одну из SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 или 134-147 или последовательность, которая содержит 1-3 аминокислоты, вставленные между CVE и СРР или которая отличается от них не более чем на 5 аминокислот, где шарнир не содержит замены или делеции как в С219, так и в С220; (с) антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством или новым введенным свойством относительно того же антитела, которое содержит шарнир IgG1 и домен CH1; и (d) модифицированная константная область тяжелой цепи не является константной областью IgG2 дикого типа или константной областью IgG2, содержащей C219S и/или C220S. Шарнир может содержать аминокислотную последовательность ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 129) или ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 130), где X представляет собой любую аминокислоту, кроме цистеина. Например, шарнир может содержать аминокислотную последовательность ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 131) или ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 132). В некоторых вариантах выполнения изобретения по меньшей мере один или все аминокислотные остатки Р233, V234, А235 и G237 удалены или заменены другим аминокислотным остатком, например соответствующей аминокислотой в шарнире IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения ни один из аминокислотных остатков R133, Е137, S138 и R217 или ни один из С131, R133, Е137, S138 и R217 не заменен или не удален. В определенных вариантах выполнения изобретения N192 и/или F193 заменены другой аминокислотой. Антитело может содержать домен CH2, который по меньшей мере на 95% идентичен домену IgG1 дикого типа. Антитело может содержать домен CH3, который по меньшей мере на 95% идентичен домену IgG1 дикого типа. В некоторых вариантах выполнения изобретения домен CH2 и/или CH3 не является доменом CH2 и/или CH3 IgG1 дикого типа, и антитело обладает эффекторной функцией, которая является более эффективной, чем функция IgG1 дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения домен C_H2 и/или C_H3 не является доменом C_H2 и/или C_H3 IgG1 дикого типа, и антитело обладает эффекторной функцией, которая менее эффективна, чем такая у IgG1 дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит домен C_H2 и/или домен C_H1, который по меньшей мере на 95% идентичен домену IgG1 или IgG4 дикого типа. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством, выбранным из агонистической активности, опосредованной антителами интернализации рецептора, ADCC, опосредованной рецептором сигнализации, антагонистической активности, иммуномодулирующей активности или противоопухолевой активности; или новым введенным свойством, которое представляет собой агонистическую активность.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, где (а) домен C_H1 представляет собой домен C_H1 человеческого IgG2 дикого типа; (b) шарнир содержит любую одну из SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 или 134-147 или последовательность, которая содержит 1-3 аминокислоты, вставленные между CVE и СРР; (с) домен C_H2 представляет собой человеческий домен IgG1 дикого типа или модифицированный домен C_H2, придающий антителу усиленную или пониженную эффекторную функцию; и (d) домен C_H3 представляет собой домен CH3 человеческого IgG1 дикого типа или модифицированный домен CH3, придающий антителу усиленную или пониженную эффекторную функцию. Модифицированный константный домен тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична одной или нескольким из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262. Для тяжелых цепей, которые содержат Fc, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична любой из этих последовательностей, предпочтительно, чтобы специфические аминокислотные мутации, сделанные для модуляции биологической активности в этих последовательностях, не варьировались.

- 3 046941

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит домен CH1 и шарнир, содержащий последовательность

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSS AFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCP APPE4G (SEQ Ш NO: 133) или аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 133 не более чем в 10 аминокислот или по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 133, где (i) по меньшей мере один из С131, R133, Е137, S138 и R217 не заменен другой аминокислотой или не удален; (ii) C219 и С220 могут быть заменены другой аминокислотой или удалены, но С219 и С220 не могут быть оба заменены или удалены; (iii) 1-3 аминокислоты могут быть вставлены между CVE и СРР в шарнир; (iv) шарнир необязательно содержит дополнительную аминокислоту на С-конце, например G; (v) одна или несколько аминокислот Р233, V234, А235 и G237 могут быть заменены другой аминокислотой (например, соответствующей аминокислотой из IgG1) или удалены; (vi) домены CH2 и CH3 могут быть доменами CH2 и CH3 дикого типа или модифицированными IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; (vii) модифицированная константная область тяжелой цепи не является константной областью тяжелой цепи дикого типа IgG2 или тяжелой константной областью IgG2 дикого типа с C219S или C220S и (viii) антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством или новым введенным свойством относительно того же антитела, которое содержит шарнир IgG1 и домен CH1. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством, выбранным из агонистической активности, опосредованной антителами интернализацией рецептора, ADCC, опосредованной рецептором сигнализации, антагонистической активности, иммуномодулирующей активности или противоопухолевой активности; или новым введенным свойством, которое представляет собой агонистическую активность. В определенных вариантах выполнения изобретения ни одна из аминокислот С131; R133; Е137; S138; R217 не заменена другой аминокислотой или не удалена. В определенных вариантах выполнения изобретения N192 и/или F193 не являются замененными или представляют собой N192S и/или F193L соответственно. В определенных вариантах выполнения изобретения С219 представляет собой C219S, С220 представляет собой C220S, P233-G237 заменены или удалены; V234-G237 заменены или удалены; A235-G237 заменены или удалены; G237 заменен или удален; Р233 заменен или удален; P233-V234 заменены или удалены; или Р233-А235 заменены или удалены. Антитело может иметь эффекторную функцию или быть лишено эффекторной функции. Антитело может содержать домен C_H2 дикого типа, или модифицированный домен C_H2 IgG1, или модифицированный домен C_H3 IgG1 дикого типа.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит домен CH1, содержаASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ щий последовательность SSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE (SEQ ID NO: 7), или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности SEQ ID NO: 7 не более чем в 10 аминокислот или по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 7, где (i) по меньшей мере один из С131, R133, Е137, S138 и R217 не заменен или не удален; (ii) модифицированная константная область тяжелой цепи не является константной областью тяжелой цепи IgG2 дикого типа или тяжелой константной областью IgG2 дикого типа с C219S или C220S и (iii) антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством или новым введенным свойством относительно того же антитела, которое содержит шарнир IgG1 и домен C_H1. Антитело может обладать по меньшей мере одним усиленным свойством, выбранным из агонистической активности, опосредованной антителами интернализации рецепторов, ADCC, опосредованной рецептором передачи сигналов, антагонистической активности, иммуномодулирующей активности или противоопухолевой активности; или новым введенным свойством, которое представляет собой агонистическую активность. В некоторых вариантах выполнения изобретения ни одна из аминокислот С131; R133; E137 и S138 не заменена другой аминокислотой или не удалена. В некоторых вариантах выполнения изобретения N192 и/или F193 не являются замененными или представляют собой N192S и/или F193L соответственно. Антитело может иметь эффекторную функцию или быть лишенным эффекторной функции. Антитело может содержать домен CH2 IgG1 дикого типа или модифицированного и/или домен C_H3 IgG1 дикого типа или модифицированного.

Антитело может содержать модифицированную константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит шарнир, содержащий последовательность ERKCCVECPPCPAPPE4G (SEQ ш NO: 8) или аминокислотную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 8 не более чем в 5 аминокислотах, где (i) C219 и С220 могут быть заменены другой аминокислотой или удалены, но С219 и С220 оба не могут быть заменены или удалены, (ii) одна или несколько аминокислот Р233, V234, А235 и G237 могут быть заменены или удалены; (iii) 1-3 аминокислоты могут быть вставлены между CVE и СРР в шарнир; (iv) шарнир необязательно содержит дополнительную аминокислоту на С-конце, например G; (v) домены C_H2 и C_H3 могут быть доменами C_H2 и C_H3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 дикого типа или модифицированного; (vi) модифицированная константная область тяжелой цепи не является константной областью тяжелой цепи IgG2 дикого типа или тяжелой констант

- 4 046941 ной областью IgG2 дикого типа с C219S или C220S и (vii) антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством или новым введенным свойством относительно того же антитела, которое содержит шарнир IgG1 и домен CH1. Антитело может обладать по меньшей мере одним усиленным свойством, выбранным из агонистической активности, опосредованной антителами интернализации рецепторов, ADCC, опосредованной рецептором передачи сигналов, антагонистической активности, иммуномодулирующей активности или противоопухолевой активности; или новым введенным свойством, которое представляет собой агонистическую активность. В определенных вариантах выполнения изобретения С219 представляет собой C219S, С220 представляет собой C220S, P233-G237 заменены или удалены; V234-G237 заменены или удалены; A235-G237 заменены или удалены; G237 заменен или удален; Р233 заменен или удален; P233-V234 заменены или удалены или Р233-А235 заменены или удалены. Антитело может иметь эффекторную функцию или быть лишенным эффекторной функции. Антитело может содержать домен CH2 IgG1 дикого типа или модифицированного и/или домен CH3 IgG1 дикого типа или модифицированного.

Также изобретение относится к антителам, содержащим модифицированную константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит шарнир IgG1 или IgG2, и где шарнир не содержит 1-7 аминокислот, и где антитело обладает по меньшей мере одним усиленным свойством или новым введенным свойством относительно того же антитела, которое включает шарнир IgG1 и домен C_H1. Антитело может обладать по меньшей мере одним усиленным свойством, выбранным из агонистической активности, опосредованной антителами интернализации рецепторов, ADCC, опосредованной рецептором передачи сигналов, антагонистической активности, иммуномодулирующей активности или противоопухолевой активности; или новым введенным свойством, которое представляет собой агонистическую активность. Шарнир может быть шарниром IgG2, в котором отсутствуют 1-4 аминокислоты, например аминокислоты С219, С220, V222 и Е224. Шарнир представляет собой шарнир IgG1, в котором отсутствуют аминокислоты S219, С220, D221, K222, Т223, Н224 и Т225. Антитело может содержать домен CH1 IgG2 дикого типа или модифицированного; домен CH1 IgG1 дикого типа или модифицированного, домен C_H2 IgG1, IgG2 или IgG4 и домен C_H3 IgG1, IgG2 или IgG4.

Антитела с модифицированными константными областями тяжелой цепи могут быть человеческими или гуманизированными антителами или их антигенсвязывающими частями. В некоторых вариантах выполнения изобретения антитело специфически связывается с антигеном, который участвует в иммунной регуляции. Антитело может быть агонистом костимулирующего рецептора или антагонистом ингибирующего рецептора. Например, антитело может связываться с костимулирующим рецептором, например, выбранным из группы В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ, GITR, OX40, ICOS, CD70, CD27, CD40, DR3 или CD28H, или антитело может связываться с ингибирующим рецептором, например, выбранным из группы CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectin 9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 и TIM-4. Антиген может быть антигеном, который требуется для интернализации, например, CD73. Антиген может быть CD39.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с костимулирующим рецептором, например GITR, OX40, 4-1ВВ, CD28, ICOS, CD40, CD27 или любым другим членом суперсемейства TNFR, и содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 152-232, 234-245 и 247-262. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело проявляет усиленную или измененную агонистическую активность относительно антитела, имеющего такие же вариабельные области и легкую цепь, но содержащего константную область тяжелой цепи IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с молекулой клеточной поверхности, например CD73, и запускает опосредованную антителами интернализацию молекулы клеточной поверхности, и содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 и 152-232. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело обладает усиленными или измененными свойствами интернализации по отношению к антителу, имеющему такие же вариабельные области и легкую цепь, но содержащему константную область тяжелой цепи IgG1. Антитела к CD73 также могут быть связаны с Fc, имеющим любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 234-245 и 247-262.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с ингибирующим рецептором, например CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectin 9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 и TIM-4, и содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262. В некоторых вариантах выполнения изобретения антитело проявляет более сильную или измененную антагонистическую активность или вводит новую активность относительно того же антитела, имеющего константную область тяжелой цепи IgG1. В некоторых вариантах выполнения изобретения Fc содержит одну или несколько мутаций для модуляции, например снижения эффекторной функции.

- 5 046941

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с молекулой клеточной поверхности и запускает внутриклеточную передачу сигналов, где антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262. В определенных вариантах выполнения изобретения внутриклеточная передача сигналов опосредует агонистическую активность, антагонистическую активность, интернализацию молекулы клеточной поверхности или ADCC. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело запускает более мощную внутриклеточную передачу сигналов по сравнению с антителом, имеющим такие же вариабельные области и легкую цепь, но содержащим константную область тяжелой цепи IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с молекулой клеточной поверхности и запускает образование комплексов высокомолекулярное антитело - молекула клеточной поверхности, где антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело запускает образование комплексов с более высокой молекулярной массой относительно антитела, имеющего такие же вариабельные области и легкую цепь, но содержащего константную область тяжелой цепи IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, специфически связывается с молекулой клеточной поверхности и запускает кластеризацию или олигомеризацию молекулы клеточной поверхности, где антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело запускает больше кластеризации или олигомеризации молекулы клеточной поверхности относительно антитела, имеющего такие же вариабельные области и легкую цепь, но содержащего константную область тяжелой цепи IgG1.

Изобретение также относится к биспецифическим молекулам, содержащим антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, связанную с молекулой, имеющей вторую специфичность связывания. Изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, связанную со вторым агентом. Изобретение также относится к композиции, содержащей антитело, биспецифический или иммуноконъюгат, описанные в настоящем документе, и носитель. Композиции могут содержать один или несколько дополнительных терапевтических агентов, например терапевтический агент стимулирует иммунную систему и является, например, антагонистом ингибитора контрольных точек или костимулирующего рецептора.

Изобретение также относится к способам получения антитела, содержащего модифицированную константную область тяжелой цепи, где антитело содержит домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3 в порядке от N- до С-конца, включающим стадии (а) предоставления антитела, содержащего шарнир и/или домен CH1, который не является шарниром IgG2 и/или доменом CH1 IgG2; и (b) замены шарнира и/или домена C_H1 шарниром IgG2 и/или доменом C_H1 IgG2 соответственно. Кроме того, в настоящем документе представлены способы повышения интернализации антитела клеткой, включающие (а) предоставление антитела, содержащего шарнир и/или домен C_H1, который не является шарниром IgG2 и/или доменом C_H1 IgG2; и (b) замену шарнира и/или домена C_H1 шарниром IgG2 и/или доменом C_H1 IgG2 соответственно. Интернализация антитела может быть увеличена по сравнению с интернализацией того же антитела, содержащего шарнир, не относящийся к изотипу IgG2, например антитела, содержащего константную область IgG1. Изобретение также относится к способам повышения агонистической активности антитела, включающим (а) предоставление антитела, содержащего шарнир и/или домен CH1, который не является шарниром IgG2 и/или доменом CH1 IgG2; и (b) замену шарнира и/или домена CH1 шарниром IgG2 и/или доменом CH1 IgG2 соответственно. Агонистическая активность может быть увеличена по сравнению с агонистической активностью того же антитела, содержащего шарнир, не относящийся к изотипу IgG2, например антитела, содержащего константную область IgG1. Шарнир IgG2 может представлять собой шарнир человеческого IgG2 дикого типа или может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности шарнира человеческого IgG2 дикого типа, и может включать, например, последовательность, приведенную в табл. 4. Способ может включать этап замены по меньшей мере одного из доменов CH1, CH2 или CH3 доменом CH1, CH2 или CH3 другого изотипа соответственно. Способ может включать стадии (а) замены домена CH1 на домен IgG2 CH1; (b) замены домена CH2 на домен CH2 IgG1 и/или (b) замены домена CH3 на домен CH3 IgG1. Способ может включать стадии (а) замены домена CH1 доменом CH1 человеческого IgG2 дикого типа или доменом, идентичным ему по меньшей мере на 95%; (b) замены домена CH2 доменом CH2 человеческого IgG2 дикого типа или доменом, идентичным ему по меньшей мере на 95%; и/или (c) замены домена CH3 доменом CH3 человеческого IgG1 дикого типа или идентичным ему по меньшей мере на 95% доменом. Способ может включать стадию замены константной области тяжелой цепи модифицированной константной областью тяжелой цепи, содержащей любую из SEQ ID NO: 26-37, 54-56,

- 6 046941

78-125, 152-232, 234-245 и 247-262, или областью, по меньшей мере на 95% идентичной SEQ ID NO: 2637, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262 (или введением в Fc аминокислотных мутаций этих последовательностей). Шарнир может быть модифицирован для уменьшения или изменения образования дисульфидной связи. Шарнир может содержать аминокислотную замену C219S. Шарнир может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 или 134-147, или последовательность, которая содержит 1-3 аминокислоты, вставленные между CVE и СРР. Домен CH1 может содержать аминокислотную последовательность

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 7).

Домен C_H2 может быть модифицирован для уменьшения или устранения эффекторных функций. Домен CH2 может содержать аминокислотные замены A330S и P331S. Домен CH2 может содержать аминокислотную последовательность

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ Ш NO: 4).

Домен CH2 может содержать аминокислотные замены A330S и P331S.

Домен CH3 может содержать аминокислотную последовательность

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш

NO: 5).

Изобретение также относится к модифицированным константным областям тяжелой цепи с уменьшенным или необнаруживаемым связыванием с одним или несколькими FcyR (например, CD16, CD32, CD64). Такие модифицированные константные области тяжелой цепи могут иметь 1-5, 1-3, 1-2 или одну мутацию (например, замену) относительно константной области тяжелой цепи дикого типа.

Изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающей части, полученным способами, описанными в настоящем документе, например, изложенными выше, например человеческим или гуманизированным антителам. Способы лечения субъекта, например субъекта, страдающего раком, любым из антител, описанных в настоящем документе, также включены в настоящий документ. Способы могут включать введение одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов, например терапевтических агентов, которые стимулируют иммунную систему. Например, терапевтический агент может быть нацелен на ингибитор контрольных точек или костимулирующую молекулу. Способы могут включать введение композиции, биспецифической молекулы или иммуноконъюгата, описанных в настоящем документе.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 в клетках Н2228 (клеточная линия немелкоклеточной карциномы легкого) следующими антителами: 11F11, 4С3, 6D11, CD73.3-IgG1.1f с легкой цепью 4C3Vk1 (3-Vh-hHC-IgG1.1f/4C3Vk1), CD73.4-IgG2CS с легкой цепью 11F11-Vk2 (4-Vh-hHC-IgG2-C219S/11F11-Vk2), CD73.10-IgG2CS (CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S), CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f (CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S-IgG1.1f') и CD73.10-IgG1.1f(CD73.10-VhhHC-IgG1.1f) антителами в клетках Н2228. Антитела 11F11 (которое имеет изотип IgG2), CD73.4IgG2CS, CD73.10-IgG2CS и CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f интернализуются быстрее и в большей степени, чем другие протестированные антитела, которые имеют изотип IgG1.

На фиг. 1В показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 тех же антител, что и на фиг. 1А, в клетках НСС15 (клеточная линия немелкоклеточной карциномы легкого), демонстрируя результаты, аналогичные полученным в клетках Н2228.

На фиг. 1С показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 тех же антител, что и на фиг. 1А и 1В, а также CD73.11-IgG2CS (11-Vh-hVC-IgG2-C219S) в клетках Calu6, демонстрируя результаты, аналогичные полученным в клетках Н2228 и НСС15.

На фиг. 1D показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 тех же антител, что показаны на фиг. 1С в клетках NCI-2030 (линия клеток немелкоклеточной карциномы легкого), демонстрируя результаты, аналогичные полученным в клетках Н2228, НСС15 и Calu6.

На фиг. 1E показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 указанных антител в клетках Calu6, измеренная методом проточной цитометрии.

На фиг. 1F показана кинетика опосредованной антителами интернализации CD73 указанных антител в клетках NCI-H292 (клеточная линия мукоэпидермоидной карциномы легкого), измеренная с помощью проточной цитометрии, но где антитела не вымывались после первой инкубации клеток с антителами.

На фиг. 1G показан процент CD73, интернализированного в клетках Calu6, обработанных указанными антителами, демонстрирующий опосредованную антителами интернализацию CD73 указанных антител в клетках Calu6 с течением времени.

На фиг. 1H показан процент CD73, интернализированного в клетках NCI-H292, обработанных указанными антителами с течением времени, демонстрирующий опосредованную антителами интернализа

- 7 046941 цию CD73 указанных антител в клетках NCI-H292 с течением времени.

На фиг. 1I показан процент CD73, интернализированного в клетках SNU-C1 (клеточная линия карциномы толстой кишки), обработанных указанными антителами с течением времени, демонстрирующий опосредованную антителами интернализацию CD73 указанных антител в клетках SNU-C1 с течением времени.

На фиг. 1J показан процент CD73, интернализированного в клетках NCI-H1437 (клеточная линия немелкоклеточной карциномы легкого), обработанных указанными антителами с течением времени, демонстрирующий опосредованную антителами интернализацию CD73 указанных антител в клетках NCI-H1437 с течением времени.

На фиг. 2 показана кинетика связывания указанных антител к GITR человека с антителами против CD3 (планшет покрыт) и CD28-активированными CD4 Т-клетками человека и их соответствующие значения ЕС5₀, полученные из графика.

На фиг. 3А-3С показана секреция IFN-γ и IL-2 донорными CD4 Т-клетками, стимулированными растворимыми антителами к GITR человека с различными константными участками тяжелой цепи.

На фиг. 3А показана секреция IFN-γ донорными CD4 Т-клетками, стимулированными экспрессирующими OKT3 клетками CHO и различными концентрациями антител к GITR человека с константной областью IgG2-IgG1.

На фиг. 3В показана секреция IL-2 донорными CD4 Т-клетками, стимулированными экспрессирующими OKT3 клетками CHO и различными концентрациями константного домена тяжелой цепи IgG1 или гибридного константного домена тяжелой цепи IgG2-IgG1.

На фиг. 3С показана секреция IL-2 донорными CD4 Т-клетками, стимулированными экспрессирующими OKT3 клетками CHO и различными концентрациями безэффекторных версий (IgG1.1) антител на фиг. 3А и 3В.

На фиг. 4 показана секреция IL-2 из клеток 3A9-hGITR, культивированных на планшетах, покрытых моноклональными антителами против CD3, в присутствии возрастающих количеств указанных антител к GITR человека: гибридомы к GITR (IgG2) и рекомбинантных производных, таких как IgG1f, IgG1.1 (безэффекторные) или таких как химера с шарниром IgG2.

На фиг. 5A-5D показано влияние шарнира IgG2 на размер комплексов антитело/антиген.

На фиг. 5А-5С показаны данные хроматограмм SEC, данные DLS и данные MALS для комплексов hCD73-his с антителом CD73.4, содержащим разные константные области.

На фиг. 5D показана схематическая модель комплексов hCD73-his/mAb, полученных из масс, определенных MALS на фиг. 5С.

На фиг. 6 показаны данные SEC-MALS для комплексов CD73/mAb.

На фиг. 7 показаны данные DLS для комплексов CD73/mAb.

На фиг. 8А показан процент CD73, интернализированного в клетках Calu6, обработанных указанными антителами с течением времени, демонстрирующий опосредованную антителами интернализацию CD73 указанных антител в клетках Calu6 в течении времени.

На фиг. 8В показан процент CD73, интернализированного в клетках NCI-H292, обработанных указанными антителами с течением времени, демонстрирующий опосредованную антителами интернализацию CD73 указанных антител в клетках Calu6 с течением времени.

На фиг. 8С показан уровень CD73 на поверхности клеток Calu6, обработанных 5 мкг/мл указанных антител в течение 0, 5, 15 или 30 мин.

На фиг. 9 показан уровень IL-2, секретируемого CD4' Т-клетками, сокультивируемыми с клетками CHO-OKT3 в присутствии антитела к GITR, имеющего указанные константные области.

На фиг. 10 показан процент опосредованной антителами интернализации CD73 через 1, 4 или 21 ч после добавления каждого из показанных антител. Столбцы для каждого антитела показаны в порядке 21 ч (слева), 4 ч (в середине) и 1 ч (справа).

На фиг. 11А показано наложение данных хроматограммы SEC для 1:1 молярных комплексов hCD73-his с 16 различными антителами к CD73.4, содержащими разные последовательности константной области.

На фиг. 11В показано расширение данных хроматограммы за 11-19,5 мин хроматограммы на фиг. 10А с указанием 4 различных видов элюирования.

На фиг. 11С показан процент площади сигнала UV-хроматограммы для пика 2 на фиг. 11В, нанесенный на график для 16 различных комплексов антитело/CD73-his. Данные сортируются слева направо в порядке повышения площади пика.

На фиг. 12 показано связывание антитела с белками FcYR-his, захватившими анти-his Fab. Ответы на связывание наносят на график в процентах от теоретического Rmax, предполагая стехиометрию связывания 1:1 mAb:FcYR. Столбцы для каждого антитела показаны в порядке, представленном цветными легендами в нижней части слайда.

На фиг. 13 показано связывание антитела с белками FcgR-his, захватившими анти-his Fab. Ответы на связывание представлены в виде процента от теоретического Rmax, предполагая стехиометрию свя

- 8 046941 зывания 1:1 mAb:FcYR. Столбцы для каждого антитела показаны в порядке, представленном цветными легендами в нижней части слайда.

На фиг. 14А показано связывание антитела с белками FcYR-his, захватившими анти-his Fab. Ответы на связывание представлены в виде процента от теоретического Rmax, предполагая стехиометрию связывания 1:1 mAb:FcYR. Столбцы для каждого антитела показаны в порядке, представленном цветными легендами в нижней части слайда.

На фиг. 14В показано связывание антитела с белками FcYR-his, захватившими анти-his Fab. Ответы на связывание представлены в виде процента от теоретического Rmax, предполагая стехиометрию связывания 1:1 mAb:FcYR. Столбцы для каждого антитела показаны в порядке, представленном цветными легендами в нижней части слайда.

На фиг. 15 показан анализ динамики интернализации антител к GITR.

На фиг. 16А показан анализ совместной локализации GITR и раннего эндосомного маркера ЕЕА2 в нулевой момент времени.

На фиг. 16В показан анализ совместной локализации GEA и раннего эндосомного маркера ЕЕА2 через 30 и 120 мин.

На фиг. 16С показаны результаты количественного определения эндосомальной совместной локализации, показанной на фиг. 16А и 16В, нанесенные на график как отношение интенсивности совместно локализованного пикселя к общему окрашиванию.

На фиг. 17А показана активация передачи сигнала NFkB в CD8+ Т-клетках, обработанных указанными антителами к GITR.

На фиг. 17В показана активация передачи сигналов NFkB в CD4+ Т-клетках, обработанных указанными антителами к GITR.

На фиг. 18 показана активация Р38 в CD4+ Т-клетках, обработанных указанными антителами к GITR.

На фиг. 19 показана конфигурация дисульфидных связей в антителах IgG2, имеющих конформацию А, В или А/В.

На фиг. 20А показан уровень IL-2, секретируемого CD4+ Т-клетками, совместно культивируемыми с клетками CHO-OKT3 в присутствии различных концентраций антитела к GITR, имеющего указанные константные области.

На фиг. 20В показан уровень IL-2, секретируемого CD4+ Т-клетками, совместно культивируемыми с клетками CHO-OKT3 в присутствии 5 мкг/мл антитела к GITR, имеющего указанные константные области (тот же эксперимент, что и на фиг. 20А).

На фиг. 20С показан уровень IL-2, секретируемого CD4+ Т-клетками, совместно культивируемыми с клетками CHO-OKT3 в присутствии 1,25 мкг/мл антитела к GITR, имеющего указанные константные области (тот же эксперимент, что и на фиг. 20А).

На фиг. 20D показан уровень IL-2, секретируемого CD4+ Т-клетками, совместно культивируемыми с клетками CHO-OKT3 в присутствии 0,313 мкг/мл антитела к GITR, имеющего указанные константные области (тот же эксперимент, что и на фиг. 20А).

На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность части hIgGlf, где подчеркнутые последовательности воспроизведены ниже и показывают расположение мутаций в аминокислотных последовательностях hIgG1, hIgG1.1f, hIgG1.3f и hIgG1-Р238K относительно IgG1 дикого типа.

На фиг. 22A-22L показано сравнение скоростей диссоциации антитела Y1238 в контексте различных областей Fc из указанных рецепторов Fc на основе данных сенсограммы.

На фиг. 23A-23F показаны профили заряда для молекул dAb-Fc, которые характеризуются icIEF.

Подробное описание изобретения

В определенных вариантах выполнения изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что следующие свойства антител усиливаются или изменяются, когда антитела содержат шарнир IgG2, относительно тех же антител, которые содержат шарнир, не относящийся к IgG2 (или относительно тех же антител, которые содержат константную область IgG1): (i) интернализация; (ii) агонистическая функция; (iii) опосредованная рецептором внутриклеточная передача сигналов; (iv) ADCC и (v) масса комплексов антитело/антиген. Кроме того, эти усиленные или измененные свойства антител дополнительно усиливаются или изменяются, когда антитела содержат, помимо шарнира IgG2, домен C_H1 IgG2. Было также отмечено, что антитела, имеющие домен C_H1 IgG2, но не шарнир IgG2, обладают усиленной или измененной активностью по сравнению с теми же антителами, имеющими домен CH1 IgG1. He желая ограничиваться конкретным механизмом действия, было обнаружено, что усиливающие эффекты шарнира IgG2 коррелируют с увеличением размера комплексов антитело/антиген. Увеличенный размер комплексов антитело/антиген, когда антитело имеет шарнир IgG2, может быть результатом более высокой жесткости шарниров IgG2 по сравнению с жесткостью других изотипов. Кроме того, было показано, что определенные области или аминокислотные остатки шарнира IgG2 и домена CH1 могут быть модифицированы, тогда как другие предпочтительно не модифицированы, для того чтобы сохранить усиленные или измененные активности.

- 9 046941

Как дополнительно описано в настоящем документе, эти модифицированные константные области тяжелой цепи, придающие антителам (или их антигенсвязывающим областям) усиленные или модифицированные активности, могут иметь эффекторную функцию. Таким образом, было показано, что могут быть созданы антитела, которые имеют полезные свойства, присущие шарниру IgG2 и/или домену CH1, а также имеют эффекторную функцию.

Изобретение также основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что делеция определенных частей шарнира в антителе IgG1 или IgG2 приводит к тому, что антитело обладает усиленными или измененными свойствами по сравнению с антителом с константной областью IgG1.

Также в настоящем документе описаны модифицированные области тяжелой цепи, которые имеют мутации, которые снижают эффекторную функцию ADCC и/или CDC, например мутацию Р238, например Р238К, и в некоторых вариантах выполнения изобретения такая одна или более мутация комбинируется с мутацией, которая усиливает (i) интернализацию; (ii) агонистическую функцию; (iii) опосредованную рецептором внутриклеточную передачу сигналов; (iv) ADCC и/или (v) массу комплексов антитело/антиген.

Соответственно, в настоящем документе представлены (i) антитела, имеющие модифицированные константные области тяжелой цепи, придающие антигенсвязывающим областям антител усиленные или измененные свойства, и способы их применения, и (ii) способы усиления или изменения определенных биологических свойств антител, которые включают шарнир, не относящийся к IgG2, и/или домен C_H1, таких как интернализация, агонизм и антагонизм, где способ включает замену шарнира, не относящегося к IgG2, и/или домена C_H1 антитела на шарнир IgG2 и/или домен C_H1 IgG2 или его часть.

Изобретение относится к модифицированным константным областям тяжелой цепи, которые усиливают определенные биологические свойства антител, например антител, которые имеют шарнир, не относящийся к IgG2, и/или домен CH1, не относящийся к IgG2, по сравнению с теми же антителами, имеющими разные константные области. Типичные модифицированные константные области тяжелой цепи включают шарнир IgG2, домен CH1, домен CH2 и домен CH3, где по меньшей мере один из этих константных доменов не относится к изотипу IgG2 и может быть, например, IgG1, IgG3 или IgG4. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир IgG2 и домены C_H2 и C_H3 IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит домен C_H1 IgG2 и шарнир IgG2. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит домен CH1 IgG2, шарнир IgG2, домен CH2 IgG1 и домен CH3 IgG1. Модифицированная константная область тяжелой цепи может иметь эффекторную функцию, сходную с таковой у IgG1 дикого типа, или может быть сконструирована так, чтобы иметь пониженную или усиленную эффекторную функцию по сравнению с таковой у IgG дикого типа. Модифицированная константная область тяжелой цепи может содержать домен CH1 дикого типа, шарнир, домен CH2 и/или CH3 или их вариант, например, CH1, шарнир, CH2 и/или домен CH3, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений относительно соответствующего домена дикого типа, и/или имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% или более идентична соответствующей последовательности дикого типа.

Изобретение также относится к антителам и слитым белкам, содержащим константную область тяжелой цепи IgG1.3. Антитело, содержащее константную область тяжелой цепи IgG1.3, может быть антагонистическим или агонистическим антителом, таким как антагонистическое антитело к ингибитору контрольных точек или агонистическое антитело к стимулятору контрольных точек.

Определения

Для того чтобы настоящее описание было более понятным, сначала даются определения для конкретных терминов. Дополнительные определения излагаются по тексту подробного описания изобретения.

Используемый в настоящем документе термин антитело может включать целые антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты (например, антигенсвязывающий фрагмент, который включает шарнир, антигенсвязывающий фрагмент, который включает шарнир и домен C_H1, антигенсвязывающий фрагмент, который включает шарнир и домен C_H2 или антигенсвязывающий фрагмент, который включает шарнир, домен CH2 и часть домена CH3) или их отдельные цепи. В одном варианте выполнения изобретения антитело относится к белку, например гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или к его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе как VH) и константной области тяжелой цепи. В определенных встречающихся в природе антителах IgG, IgD и IgA константная область тяжелой цепи состоит из шарнира, домена CH1, домена CH2 и домена CH3. В определенных встречающихся в природе антителах каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L. Области VH и V_L могут быть далее подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые

- 10 046941 являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL составлена из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино- к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Иммуноглобулин может быть любым из широко известных изотипов, включая, но не ограничиваясь этим, IgA, секреторный IgA, IgG и IgM. Изотип IgG подразделяется на подклассы определенных видов: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 у человека и IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 у мышей. В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, описанные в настоящем документе, относятся к человеческому подтипу IgG1 или IgG2. Иммуноглобулины, например человеческий IgG1, существуют в нескольких аллотипах, которые отличаются друг от друга не более чем несколькими аминокислотами. Антитело может включать в качестве примера как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе антитела; моноклональные и поликлональные антитела; химерные и гуманизированные антитела; человеческие и нечеловеческие антитела; полностью синтетические антитела; и одноцепочечные антитела.

В определенных вариантах выполнения изобретения тяжелая цепь антитела содержит С-концевой лизин; С-концевой глицин (потерявшая С-концевой лизин), или не содержит GK, или не содержит K. При ссылке на антитела, содержащие модифицированную константную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе, антитело может содержать раскрытую последовательность, имеющую С-концевой GK или K или, альтернативно, лишенную GK или K.

Аминокислотная нумерация в соответствии с индексом EU, как у Kabat, Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, и в соответствии с фиг. 3c-3f публ. патентной. заявки США № 2008/0248028.

Используемый в настоящем документе термин антигенсвязывающая часть антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Антигенсвязывающая часть антитела может представлять собой шарнир, содержащий антигенсвязывающую часть. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающая часть антитела, описанного в настоящем документе, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989), Nature, 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR) или (vii) комбинацию двух или более изолированных CDR, которые могут быть необязательно соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, могут быть кодированы отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов, с помощью синтетического линкера, который позволяет им быть выполненными в виде одной белковой цепи, в которой пара V_L и V областей образует одновалентные молекулы (известные как одноцепочечное Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988), Science, 242:423-426; и Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть антитела. Эти и другие потенциальные конструкции описаны в Chan & Carter (2010), Nat. Rev. Immunol. 10:301. Эти фрагменты антител получают с использованием общепринятых методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты проверяют на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены с помощью методик рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов.

CDR вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки в гипервариабельной области, идентифицируемые в соответствии с определениями Kabat, Chothia, комбинацией Kabat и Chothia, AbM, контактными и/или конформационным определениями или любым методом определения CDR, хорошо известны в данной области. CDR антител могут быть идентифицированы как гипервариабельные области, первоначально определенные Kabat et al. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Положения CDR также могут быть идентифицированы как структурные петлевые структуры, первоначально описанные Chothia и др. См., например, Chothia et al., 1989, Nature, 342:877-883. Другие подходы к идентификации CDR включают определение AbM, являющееся компромиссом между Kabat и Chothia и полученное с использованием программного обеспечения для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (в настоящее время Accelrys®), или определение контактов CDR на основе наблюдаемых контактов антигена, изложенные в MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. В другом подходе, упоминаемом в настоящем документе как конформационное определение CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые вносят энтальпийный вклад в связывание антигена. См., например, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Тем не менее другие определения границ CDR могут не строго следовать одному из вышеприведенных подходов, но, тем не менее, будут пе

- 11 046941 рекрываться по меньшей мере с частью CDR Kabat, хотя они могут быть сокращены или удлинены в свете прогноза или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки, или группы остатков, или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. Как используется в настоящем документе, CDR может относиться к CDR, определенным любым подходом, известным в данной области техники, включая комбинации подходов. Используемые в настоящем документе способы могут использовать CDR, определенные в соответствии с любым из этих подходов. Для любого данного варианта выполнения, содержащего более одного CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из определений Kabat, Chothia, удлинений, AbM, контактного и/или конформационного определения.

Используемый в настоящем документе термин изотип относится к классу антител (например, антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE), которые кодируются генами константного домена тяжелой цепи. Полноразмерная аминокислотная последовательность каждой константной области человеческого IgG дикого типа (включая все домены, т.е. домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3) каталогизируется в базе данных UniProt, доступной в режиме онлайн, например, как Р01857 (IgG1), P01859 (IgG2), P01860 (IgG3) и Р01861 (IgG4) или их различные аллотипы (SEQ ID NO: 1, 6, 11 и 16 соответственно). В настоящем описании домен константной области тяжелой цепи, например шарнир, имеет изотип IgG1, изотип IgG2, изотип IgG3 или изотип IgG4, если домен содержит аминокислотную последовательность соответствующего домена соответствующего изотипа или его варианта (который имеет более высокую гомологию с соответствующим доменом соответствующего изотипа, чем с доменом других изотипов).

Аллотип относится к встречающимся в природе вариантам в пределах определенной группы изотипов, которые отличаются несколькими аминокислотами (см., например, Jefferies et al. (2009), mAbs 1:1). Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть любого аллотипа.

Белок дикого типа или его часть является разновидностью белка в том виде, в каком он встречается в природе. Аминокислотная последовательность белка дикого типа, например константная область тяжелой цепи, представляет собой аминокислотную последовательность белка в том виде, в каком она встречается в природе. Из-за аллотипических различий может быть более одной аминокислотной последовательности для белка дикого типа. Например, существует несколько аллотипов природных константных областей тяжелой цепи человеческого IgG1 (см., например, Jeffries et al. (2009), mAbs 1:1).

Область Fc (область кристаллизуемого фрагмента), или домен Fc, или Fc относится к С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая опосредует связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая связывание с рецепторами Fc, расположенными на различных клетках иммунной системы (например, эффекторных клетках), или с первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Таким образом, область Fc антитела изотипа IgG содержит константную область тяжелой цепи антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина (CH1). В изотипах антител IgG, IgA и IgD область Fc содержит константные домены CH2 и CH3 в каждой из двух тяжелых цепей антитела; области Fc IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (домены C_H2-4) в каждой полипептидной цепи. Для IgG область Fc содержит домены иммуноглобулина, состоящие из шарнира, CH2 и CH3. Для целей настоящего изобретения область Fc определяется как начинающаяся с аминокислоты 216 и заканчивающаяся аминокислотой 447, где нумерация соответствует индексу EU, как в Kabat. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, и в соответствии с фиг. 3c-3f публ. патентной заявки США № 2008/0248028. Fc может представлять собой нативный (или встречающийся в природе или дикого типа) Fc, включая любой аллотипический вариант, или вариант Fc (например, не встречающийся в природе Fc), содержащий, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-5, 1-10 или 5-10 или более аминокислотных мутаций, например замены, добавления или делеции. Например, вариант Fc может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична Fc дикого типа. Модифицированные или мутированные Fc могут иметь усиленную или уменьшенную эффекторную функцию и/или период полужизни. Области C_H2 и C_H3 являются первичным сайтом эффекторных функций и связывания FcRn. Fc может относиться к этой области изолированно или в контексте Fc-содержащего белкового полипептида, такого как связывающий белок, содержащий область Fc, также упоминаемого как Fc-белок слияния (например, антитело или иммуноадгезин).

Эффекторная функция относится к взаимодействию области Fc антитела с рецептором Fc или лигандом или к биохимическому событию, которое возникает в результате этого. Типичные эффекторные функции включают связывание C1q, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание с рецептором Fc, FcYR-опосредованные эффекторные функции, такие как ADCC и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), и подавление рецептора на клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR). Для таких эффекторных функций обычно требуется, чтобы область Fc была объединена с доменом связывания (например, вариабельным доменом антитела).

Рецептор Fc или FcR представляет собой рецептор, который связывается с областью Fc иммуноглобулина. FcR, которые связываются с антителом IgG, содержат рецепторы семейства FcyR, включая

- 12 046941 аллельные варианты и, альтернативно, сплайсированные формы этих рецепторов. Семейство FcyR состоит из трех активирующих (FcyRI, FcyRIII и FcyRIV у мышей; FcyRIA, FcyRIIA и FcyRIIIA у людей) и одного ингибирующего (FcyRIIB) рецепторов. Различные свойства FcyR человека приведены в табл. 1. Большинство типов врожденных эффекторных клеток коэкспрессируют один или несколько активирующих FcyR и ингибирующий FcyRIIB, тогда как клетки естественных киллеров (NK) избирательно экспрессируют один активирующий рецептор Fc (FcyRIII у мышей и FcyRIIIA у людей), но не экспрессируют ингибирующий FcyRIIB у мышей и людей. Человеческий IgG1 связывается с большинством человеческих рецепторов Fc и считается эквивалентным мышиному IgG2a в отношении типов активирующих рецепторов Fc, с которыми он связывается.

Таблица 1

Свойства человеческих FcyR

Fey	Аллельные варианты	Аффинность в отношении человеческо го IgG	Предпочтение к изотипу	Распространение в клетках
FcyRI (CD64)	He описаны	Высокая (Kd ~10 нМ)	IgGl=3>4»2	Моноциты, макрофаги, активированные нейтрофилы, дендритные клетки?
FcyRIIA (CD32a)	H131	От низкой до Средней	IgGl>3>2>4	Нейтрофилы, моноциты, макрофаги, эозинофилы, дендритные клетки, тромбоциты
R131	Низкая	IgGl>3>4>2
FcyRIIIA CD 16a)	V158	Средняя	IgGl=3»4>2	NK-клетки, моноциты, макрофаги, тучные клетки, эозинофилы, дендритные клетки?
F158	Низкая	IgGl=3»4>2
FcyRIIB (CD32b)	1232	Низкая	IgGl=3=4>2	В-клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки
T232	Низкая	IgGl=3=4>2

Шарнир, шарнирный домен, или шарнирная область, или шарнирная область антитела относится к домену константной области тяжелой цепи, которая соединяет домен CH1 с доменом CH2 и включает в себя верхнюю, среднюю и нижнюю части шарнира (Roux et al. J. Immunol. 1998, 161:4083). Шарнир обеспечивает различные уровни гибкости между связывающей и эффекторной областями антитела, а также обеспечивает сайты межмолекулярного дисульфидного связывания между двумя константными областями тяжелой цепи. Как используется в настоящем документе, шарнир начинается у Glu216 и заканчивается у Gly237 для всех изотипов IgG (Roux et al., 1998, J. Immunol. 161:4083). Последовательности шарниров IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 дикого типа показаны в табл. 2.

- 13 046941

Таблица 2

Аминокислоты шарнирной области

Тип 1g	С-концевой ChI*	Верхний Шарнир	Средний Шарнир	Нижний Шарнир
IgGl	VDKRV (SEQ ID NO: 57)	EPKSCDKTHT (SEQIDNO:59)	CPPCP (SEQ ID NO :64)	APELLGG (SEQ ID NO :70)
IgG2	VDKTV (SEQ ID NO:58)	ERK (SEQ ID NO:60)	CCVECPPCP (SEQIDNO:65)	APPVAG (SEQ ID NO:71)
IgG3 (17-1515-15)	VDKRV	ELKTPLGDTTHT (SEQIDNO:61)	CPRCP (SEQ ID NO:66) (EPKSCDTPPPCPRCP)₃(SEQ ID NO :67)	APELLGG
IgG3 (17-1515)	VDKRV	ELKTPLGDTTHT	CPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)₂	APELLGG
IgG3 (17-15)	VDKRV	ELKTPLGDTTHT	CPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)i	APELLGG
IgG3 (15-1515)	VDKRV	EPKS (SEQ ID NO:62)	CDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:68) (EPKSCDTPPPCPRCP)₂	APELLGG
IgG3 (15)	VDKRV	EPKS	CDTPPPCPRCP	APELLGG
IgG4	VDKRV	ESKYGPP (SEQIDNO:63)	CPSCP(SEQ ID NO:69)	APEFLGG

* С-концевые аминокислотные последовательности доменов CH1.

Термин шарнир включает шарниры дикого типа (такие как указанные в табл. 3), а также их варианты (например, не встречающиеся в природе шарниры или модифицированные шарниры). Например, термин шарнир IgG2 включает шарнир IgG2 дикого типа, показанный в табл. 3, и варианты, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 и/или не более 5, 4, 3, 2 или 1 мутации, например замены, делеции или добавления. Типичные варианты шарниров IgG2 включают шарниры IgG2, в которых 1, 2, 3 или все 4 цистеина (С219, С220, С226 и С229) заменены другой аминокислотой. В конкретном варианте выполнения изобретения шарнир IgG2 содержит замену С219Х или С220Х, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме цистеина. Шарнир IgG2 может содержать замену, которая сама по себе или вместе с одной или несколькими заменами в других областях тяжелой или легкой цепи приведет к тому, что антитело, содержащее шарнир, примет форму А или В (см., например, Allen et al. (2009), Biochemistry, 48:3755). В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир представляет собой гибридный шарнир, который содержит последовательности по меньшей мере из двух изотипов. Например, шарнир может содержать верхний, средний или нижний шарнир от одного изотипа и остаток шарнира от одного или нескольких других изотипов. Например, шарнир может быть шарниром IgG2/IgG1 и может включать, например, верхний и средний шарниры IgG2 и нижний шарнир IgG1. Шарнир может иметь эффекторную функцию или быть лишен эффекторной функции. Например, нижний шарнир IgG1 дикого типа обеспечивает эффекторную функцию.

Шарнир не относящийся к IgG2 относится к шарниру, который не относится к изотипу IgG2.

Термин домен CH1 относится к константной области тяжелой цепи, связывающей вариабельный домен с шарниром в константной области тяжелой цепи. Как используется в настоящем документе, домен CH1 начинается в А118 и заканчивается в V215. Термин домен CH1 включает в себя домены CH1 дикого типа (такие как имеющие SEQ ID NO: 2 для IgG1 и SEQ ID NO: 7 для IgG2; табл. 3), а также их варианты (например, не встречающиеся в природе домены CH1 или модифицированные домены CH1). Например, термин домен CH1 включает домены CH1 дикого типа и их варианты, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 и/или не более 5, 4, 3, 2 или 1 мутации, например замены, делеции или добавления. Типичные домены CH1 включают домены CH1 с мутациями, которые модифицируют биологическую актив- 14 046941 ность антитела, такую как ADCC, CDC или период полужизни. В настоящем документе представлены модификации домена CH1, которые влияют на биологическую активность антитела.

Термин домен CH2 относится к константной области тяжелой цепи, связывающей шарнир с доменом CH3 в константном домене тяжелой цепи. Как используется в настоящем документе, домен CH2 начинается в Р238 и заканчивается в K340. Термин домен CH2 включает в себя домены CH2 дикого типа (например, имеющие SEQ ID NO: 4 для IgG1; табл. 3), а также их варианты (например, не встречающиеся в природе домены CH2 или модифицированные домены CH2). Например, термин домен CH2 включает в себя домены CH2 дикого типа и их варианты, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 и/или не более 5, 4, 3, 2 или 1 мутации, например замены, делеции или добавления. Типичные домены C_H2 включают домены C_H2 с мутациями, которые модифицируют биологическую активность антитела, такую как ADCC, CDC или период полужизни. В определенных вариантах выполнения изобретения домен C_H2 содержит замены A330S/P331S, которые снижают эффекторную функцию. В настоящем документе представлены другие модификации домена C_H2, которые влияют на биологическую активность антитела.

Термин домен CH3 относится к константной области тяжелой цепи, которая является С-концевой по отношению к домену C_H2 в константном домене тяжелой цепи. Как используется в настоящем документе, домен CH3 начинается в G341 и заканчивается в K447. Термин домен CH3 включает домены CH3 дикого типа (такие как имеющие SEQ ID NO: 5 для IgG1; табл. 3), а также их варианты (например, не встречающиеся в природе домены CH3 или модифицированные домены CH3). Например, термин домен C_H3 включает домены C_H3 дикого типа и их варианты, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 и/или не более 5, 4, 3, 2 или 1 мутации, например замены, делеции или добавления. Типичные домены C_H3 включают домены C_H3 с мутациями, которые модифицируют биологическую активность антитела, такую как ADCC, CDC или период полужизни. В настоящем документе представлены модификации домена C_H3, которые влияют на биологическую активность антитела.

Таблица 3

Домен	Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO:
IgGl СН1	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV	2
Шарнир IgGl	EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG	3
IgGl СН2	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK	4

- 15 046941

IgGl СНЗ	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	5
IgG2 СН1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS SNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTV	7
Шарнир IgG2	ERKCCVECPPCPAPPVAG	8
IgG2 СН2	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK	9
IgG2 СНЗ	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	10
IgG3 CHI	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YTCNVNHKPSNTKVDKRV	12
Шарнир IgG3	ELKTPLGDTTHTCPRCPE	13
IgG3 CH2	PKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPR CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK	14
IgG3 CH3	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK	15
IgG4 CHI	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRV	17
Шарнир IgG4	ESKYGPPCPSCPAPEFLGG	18
IgG4 CH2	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
IgG4 CH3	GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	20

Используемый в настоящем документе термин моноклональное антитело относится к антителу, которое проявляет единственную специфичность связывания и аффинность для конкретного эпитопа, или композиции антител, в которой все антитела проявляют единственную специфичность связывания и аффинность для конкретного эпитопа. Обычно такие моноклональные антитела будут получены из одной клетки или нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, и будут передаваться без преднамеренного внесения каких-либо изменений в последовательность. Соответственно, термин человеческое моноклональное антитело относится к моноклональному антителу, которое имеет вариабельные и необязательные константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте выполнения изобретения моноклональные антитела человека продуцируются гибридомой, например, полученной путем слияния В-клетки, полученной от трансгенного или трансхромосомного животного, не являющегося человеком, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, в иммортализованную клетку.

Термин рекомбинантное человеческое антитело в контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для генов иммуноглобулина человека или полученных из них гибридом; (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например из

- 16 046941 трансфектомы; (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека; и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные и константные области, в которых используются конкретные последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, которые кодируются генами зародышевой линии, но включают последующие перестройки и мутации, которые возникают, например, во время созревания антитела. Как известно в данной области (см., например, Lonberg (2005), Nature Biotech. 23(9):1117-1125), вариабельная область содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые перестраиваются с образованием антитела, специфичного для чужеродного антигена. В дополнение к перегруппировке вариабельная область может быть дополнительно модифицирована путем множественных изменений одной аминокислоты (называемых соматической мутацией или гипермутацией) для повышения сродства антитела к чужеродному антигену. Константная область изменится в дальнейшем ответе на антиген (т.е. переключение изотипа). Следовательно, перестроенные и соматически мутированные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды иммуноглобулинов легкой и тяжелой цепей в ответ на антиген, могут не быть идентичны исходным последовательностям зародышевой линии, но вместо этого будут по существу идентичными или подобными (т.е. иметь по меньшей мере 80% идентичности).

Человеческое антитело (HuMAb) относится к антителу, имеющему вариабельные области, в которых как каркасы, так и области CDR получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также получена из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Описанные в настоящем документе антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайтспецифическим мутагенезом in vitro или путем соматической мутации in vivo). Тем не менее, термин антитело человека, используемый в настоящем документе, не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека. Термины человеческие антитела и полностью человеческие антитела используются как синонимы.

Гуманизированное антитело относится к антителу, в котором некоторые, большинство или все аминокислоты вне доменов CDR антитела, не принадлежащего человеку, заменены соответствующими аминокислотами, полученными из иммуноглобулинов человека. В одном варианте выполнения изобретения в гуманизированной форме антитела некоторые, большинство или все аминокислоты вне доменов CDR были заменены аминокислотами из иммуноглобулинов человека, тогда как некоторые, большинство или все аминокислоты в одной или нескольких областях CDR являются неизмененными. Небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот допустимы, если они не отменяют способность антитела связываться с конкретным антигеном. Гуманизированное антитело сохраняет антигенную специфичность, сходную со специфичностью исходного антитела.

Химерное антитело относится к антителу, в котором вариабельные области получены из одного вида, а константные области получены из другого вида, такому как антитело, в котором вариабельные области получены из мышиного антитела, а константные области получены из человеческого антитела.

Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелых/легких цепей, дающее в результате два антигенсвязывающих сайта со специфичностью к различным антигенам. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или связывание фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 15471553 (1992).

Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используются в настоящем документе взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.

Выделенное антитело, как используется в настоящем документе, предназначено для обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с антигеном х, по существу, не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от антигена х). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом антигена х, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами х белков разных видов.

Используемый в настоящем описании термин агонистическое антитело относится к антителу, которое является агонистом костимуляторного рецептора, например, антителу, которое способно стимулировать иммунную систему (или иммунный ответ) субъекта путем стимуляции активности белка, который, в свою очередь, стимулирует иммунную клетку, например Т-клетку, такому как белок В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, или CD27, DR3, или CD28H. В определенных вариантах выполнения изобретения агонистическое антитело представляет собой анти

- 17 046941 тело, которое усиливает активность ингибирующего рецептора, например CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 или LAG-3, TIM-3, Galectin 9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 или TIM-4 и тем самым ингибирует иммунный ответ.

Используемый в настоящем документе термин антагонистическое антитело относится к антителу, которое является антагонистом ингибирующего сигнала на иммунной клетке, например Т-клетке, например антителу, которое способно ингибировать или блокировать белок, который ингибирует активацию Т-клетки (например, ингибиторам контрольных точек иммунного ответа), таким как CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 или LAG-3, TIM-3, Galectin 9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 или TIM-4 и, таким образом, стимулирует иммунный ответ. В определенных вариантах выполнения изобретения антагонистическое антитело представляет собой антитело, которое ингибирует активность стимулирующего рецептора, например, В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, или CD27, DR3, или CD28H и тем самым ингибирует иммунный ответ.

Как агонистические, так и антагонистические антитела приводят к усилению антигенспецифических Т-клеточных ответов или к ингибированию антигенспецифических Т-клеточных ответов (регуляторы контрольных точек иммунного ответа).

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на антигене (например, GITR), с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы внутри белковых антигенов могут образовываться как из смежных аминокислот (обычно линейный эпитоп), так и из несмежных аминокислот, расположенных рядом с третичным сворачиванием белка (обычно конформационный эпитоп). Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, но не всегда, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичной структурой, как правило, теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, какие эпитопы связаны данным антителом (т.е. картирование эпитопов), хорошо известны в данной области и включают, например, анализы иммуноблоттинга и иммунопреципитации, в которых перекрывающиеся или смежные пептиды тестируют на реактивность с данным антителом. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методики, известные в данной области и описанные в настоящем документе, например рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)).

Термин встречающийся в природе используется в настоящем документе применительно к объекту, относящемуся к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является в встречающейся в природе.

Полипептид относится к цепи, содержащей по меньшей мере два последовательно связанных аминокислотных остатка без верхнего предела длины цепи. Один или несколько аминокислотных остатков в белке могут содержать модификацию, такую как, но не ограничиваясь этим, гликозилирование, фосфорилирование или дисульфидная связь.

Белок может содержать один или несколько полипептидов.

Используемый в настоящем документе термин молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять собой кДНК.

Также изобретение относится к консервативным модификациям последовательностей, раскрытых в настоящем документе, включая, например, консервативные замены нуклеотидов и аминокислот, а также добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Например, модификации могут быть введены в SEQ ID NO: 1-74 стандартными методиками, известными в данной области, такими как сайтнаправленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные модификации последовательностей включают консервативные аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

В одном варианте выполнения изобретения модификации аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи или ее домена не модифицируют или не аннулируют определенные свойства константной области тяжелой цепи. Эти свойства включают, например, жесткость или прочность шарнира, а также агонистическую или антагонистическую активность антитела. В определенных

- 18 046941 вариантах выполнения изобретения модификации аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи или ее домена действительно изменяют или аннулируют определенные свойства константной области тяжелой цепи.

Способы идентификации аминокислотных консервативных замен, которые аннулируют и не аннулируют свойства антител и/или константных областей, хорошо известны в данной области, например, как описано в настоящем документе в разделе Примеры.

Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология указывает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности, когда они оптимально выровнены и сравнены, идентичны с соответствующими вставками или делециями нуклеотидов по меньшей мере около в 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере около от 90 до 95% и более предпочтительно по меньшей мере около от 98 до 99,5% нуклеотидов. В качестве альтернативы существенная гомологичность существует, когда сегменты будут гибридизоваться в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи.

Для полипептидов термин существенная гомология указывает, что два полипептида или их обозначенные последовательности, когда они оптимально выровнены и сравнены, идентичны с соответствующими аминокислотными вставками или делециями по меньшей мере около в 80% аминокислот, обычно по меньшей мере от около 90 до 95% и более предпочтительно по меньшей мере от около 98 до 99,5% аминокислот.

Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций, совместно используемых последовательностями, когда последовательности оптимально выровнены (т.е. % гомологии = # идентичных позиций/общее # положений х 100), при этом оптимальное выравнивание определяется с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями могут быть выполнены с использованием математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.

Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с помощью программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступной по адресу http://www.gcg.com) с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может быть также определен с использованием алгоритма Е. Meyers и W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), который внедрен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы веса остатка РАМ120, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за гэп 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), который был внедрен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступном по адресу http://www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, и штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белка, описанные в настоящем документе, могут далее использоваться в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации связанных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с помощью программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов BLAST могут быть выполнены с помощью программы NBLAST, вес = 100, длина слова = 12, с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным в настоящем документе. Поиски белка BLAST могут быть выполнены с помощью программы XBLAST, вес = 50, длина слова = 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка, описанным в настоящем документе. Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения может быть использован Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. www.ncbi.nlm.nih.gov.

Используемый в настоящем документе термин антиген относится к любому природному или синтетическому иммуногенному веществу, такому как белок, пептид или гаптен. Антиген может представлять собой полноразмерный или зрелый белок или его фрагмент.

Иммунный ответ относится к биологическому ответу у позвоночного на чужеродные агенты, который защищает организм от этих агентов и вызванных ими заболеваний. Иммунный ответ опосредуется действием клетки иммунной системы (например, Т-лимфоцита, В-лимфоцита, естественной клеткикиллера (NK), макрофага, эозинофила, тучной клетки, дендритнойх клетки или нейтрофила) и растворимых макромолекул, продуцируемых любыми из этих клеток или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), приводящему к селективному нацеливанию, связыванию, повреждению, разрушению и/или удалению из тела позвоночных патогенных микроорганизмов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых или других аномальных клеток или, в случае аутоиммунного или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека. Иммунная реакция включает, например, активацию или ингибирование Т-клетки, например эффекторной Т-клетки или Th-клетки, такой как CD4' или CD8'

- 19 046941

Т -клетки, или ингибирование Т_гед-клетки.

Иммуномодулятор или иммунорегулятор относится к агенту, например компоненту сигнального пути, который может участвовать в модуляции, регуляции или модификации иммунного ответа. Модулирующий, регулирующий или модифицирующий иммунный ответ относится к любому изменению в клетке иммунной системы или в активности такой клетки (например, эффекторной Т-клетки). Такая модуляция включает в себя стимуляцию или подавление иммунной системы, что может проявляться увеличением или уменьшением числа клеток различных типов, увеличением или уменьшением активности этих клеток или любыми другими изменениями, которые могут происходить в иммунной системе. Были идентифицированы как ингибирующие, так и стимулирующие иммуномодуляторы, некоторые из которых могут иметь усиленную функцию в микроокружении опухоли. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения иммуномодулятор расположен на поверхности Т-клетки. Иммуномодулирующая мишень или иммунорегуляторная мишень представляет собой иммуномодулятор, который нацелен на связывание и активность которого изменяется в результате связывания вещества, агента, фрагмента, соединения или молекулы. Иммуномодулирующие мишени включают, например, рецепторы на клеточной поверхности (иммуномодулирующие рецепторы) и рецепторные лиганды (иммуномодулирующие лиганды).

Иммунотерапия относится к лечению субъекта, пораженного или подвергающегося риску заражения или рецидива заболевания, способом, включающим индукцию, усиление, подавление или иное изменение иммунного ответа.

Иммуностимулирующая терапия или иммуностимуляторная терапия относится к терапии, которая приводит к увеличению (индукции или усилению) иммунного ответа у субъекта, например, для лечения рака.

Потенцирование эндогенного иммунного ответа означает повышение эффективности или потенции существующего иммунного ответа у субъекта. Это увеличение эффективности и потенции может быть достигнуто, например, путем преодоления механизмов, которые подавляют эндогенный иммунный ответ хозяина, или путем стимулирования механизмов, которые усиливают эндогенный иммунный ответ хозяина.

Т-эффекторные (T_eff) клетки относятся к Т-клеткам (например, CD4+ и CD8+ Т-клеткам) с цитолитической активностью, а также к Т-хелперным (Th) клеткам, которые секретируют цитокины и активируют и направляют другие иммунные клетки, но не включают регуляторные Т-клетки (Treg-клетки).

Используемый в настоящем документе термин связанный относится к ассоциации двух или более молекул. Связь может быть ковалентной или нековалентной. Связь также может быть генетической (т.е. рекомбинантно слитой). Такие связи могут быть достигнуты с использованием широкого разнообразия известных в данной области методик, таких как химическое конъюгирование и продуцирование рекомбинантного белка.

Как используется в настоящем документе, введение относится к физическому введению композиции, содержащей терапевтический агент, субъекту с применением любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в данной области. Предпочтительные пути введения антител, описанные в настоящем документе, включают внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например путем инъекции или инфузии. Используемая в настоящем документе фраза парентеральное введение означает способы введения, отличные от энтерального и топического введения, обычно путем инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интралимфатическую, внутричерепную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию, а также электропорацию in vivo. Альтернативно, антитело, описанное в настоящем документе, можно вводить непарентеральным путем, таким как топический, эпидермальный или слизистый путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или топически. Введение также может выполняться, например, один раз, несколько раз и/или в течение одного или нескольких длительных периодов.

Используемый в настоящем документе термин опосредованный Т-клетками ответ относится к ответу, опосредованному Т-клетками, включая эффекторные Т-клетки (например, клетки CD8') и хелперные Т-клетки (например, клетки CD4+). Ответы, опосредованные Т-клетками, включают, например, цитотоксичность и пролиферацию Т-клеток.

Используемый в настоящем документе термин ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) относится к иммунному ответу, индуцированному цитотоксическими Т-клетками. Ответы CTL опосредуются, прежде всего, CD8+ Т-клетками.

Используемые в настоящем документе термины ингибирует или блокирует (например, относящиеся к ингибированию/блокированию лиганда к его рецептору или к последующему внутриклеточному ответу) используются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. В некоторых вариантах выполнения изобретения антитело ингибирует связывание по

- 20 046941 меньшей мере на около 50%, например, по меньшей мере на около 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100%, что определяется, например, как описано в настоящем описании далее.

Используемый в настоящем документе термин рак относится к широкой группе заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аномальных клеток в организме. Нерегулируемое клеточное деление может привести к образованию злокачественных опухолей или клеток, которые проникают в соседние ткани и могут метастазировать в отдаленные части тела через лимфатическую систему или кровоток.

Термины лечить, лечение и вылечивание, как они используются в настоящем документе, относятся к любому типу вмешательства или процессу, выполняемому над субъектом или вводимому активному агенту субъекту с целью обращения, облегчения, улучшения, ингибирования, или замедления, или предотвращения прогрессирования, развития, тяжести или рецидива симптома, осложнения, состояния или биохимических признаков, связанных с заболеванием. Профилактика относится к введению субъекту, у которого нет заболевания, с целью предотвратить возникновение заболевания или минимизировать его последствия, если оно имеет место.

Гематологическое злокачественное образование включает лимфому, лейкоз, миелому или лимфоидное злокачественное образование, а также рак селезенки и лимфатических узлов. Типичные лимфомы включают как В-клеточные лимфомы, так и Т-клеточные лимфомы. В-клеточные лимфомы включают как лимфомы Ходжкина, так и большинство неходжкинских лимфом. Неограничивающие примеры В-клеточных лимфом включают диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лимфому лимфатической ткани, ассоциированную со слизистой оболочкой, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (перекрываются с хроническим лимфолейкозом), мантийноклеточную лимфому (MCL), лимфому Беркитта, медиастинальную В-крупноклеточную лимфому Беркитта, макроглобулинемию Вальденстрема, узловую В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, лимфому селезенки из клеток краевой зоны, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфоматоидный гранулематоз. Неограничивающие примеры Т-клеточных лимфом включают экстранодальную Т-клеточную лимфому, кожную Т-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому и ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому. Гематологические злокачественные новообразования также включают лейкоз, такой как, но не ограничиваясь этим, вторичный лейкоз, хронический лимфолейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и острый лимфобластный лейкоз. Гематологические злокачественные новообразования дополнительно включают миеломы, такие как, но не ограничиваясь этим, множественная миелома и вялотекущая множественная миелома. Другие гематологические и/или В-клеточные или Т-клеточные раковые заболевания охватываются термином гематологические злокачественные новообразования.

Термин эффективная доза или эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения желаемого эффекта. Терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная дозировка лекарственного средства или терапевтического агента представляет собой любое количество лекарственного средства, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом способствует регрессии заболевания, о чем свидетельствует уменьшение выраженности симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания, или профилактике нарушений или инвалидности вследствие заболевания. Профилактически эффективное количество или профилактически эффективная дозировка лекарственного средства представляет собой количество лекарственного средства, которое при введении отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом субъекту, подверженному риску развития заболевания или страдающему рецидивом заболевания, тормозит развитие или рецидив заболевания. Способность терапевтического или профилактического агента стимулировать регрессию заболевания или ингибировать развитие или рецидив заболевания можно оценить с использованием различных способов, известных квалифицированному практику, таких как у людей во время клинических испытаний, в системах на животных моделях, прогнозирующих эффективность на людях, или путем анализа активности агента в анализах in vitro.

Например, противораковое средство представляет собой лекарственное средство, которое замедляет прогрессирование рака или способствует регрессии рака у субъекта. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения терапевтически эффективное количество лекарственного средства способствует регрессии рака до момента его устранения. Содействие регрессии рака означает, что введение эффективного количества лекарственного средства, отдельно или в сочетании с противоопухолевым средством, приводит к уменьшению роста или размера опухоли, некрозу опухоли, уменьшению тяжести по меньшей мере одного симптома заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания, предотвращению нарушения или нетрудоспособности из-за заболевания, или иному улучшению симптомов заболевания у пациента. Фармакологическая эффективность относится к способности лекарственного средства ускорять регрессию рака у пациента. Физиологическая безопасность относится к приемлемо низкому уровню токсичности или другим неблагоприятным физиологическим эффектам на клеточном уровне, уровне органов и/или организмов (неблагоприятным эффектам), возникающим в результате введения лекарственного средства.

- 21 046941

В качестве примера для лечения опухолей терапевтически эффективное количество или дозировка лекарственного средства предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли по меньшей мере на около 20%, более предпочтительно по меньшей мере на около 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на около 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере на около 80% по сравнению с нелеченными субъектами. В наиболее предпочтительных вариантах выполнения изобретения терапевтически эффективное количество или дозировка лекарственного средства полностью ингибирует рост клеток или рост опухоли, т.е. предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли на 100%. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена с использованием анализов, описанных ниже. Альтернативно, это свойство композиции может быть оценено путем изучения способности соединения ингибировать рост клеток, где такое ингибирование может быть измерено in vitro с помощью анализов, известных специалисту в данной области. В других предпочтительных вариантах выполнения изобретения, описанных в настоящем документе, регрессия опухоли может наблюдаться и может продолжаться в течение периода по меньшей мере около 20 дней, более предпочтительно по меньшей мере около 40 дней или даже более предпочтительно по меньшей мере около 60 дней.

Термины пациент и субъект относятся к любому человеку или животному, не являющемуся человеком, которое получает либо профилактическое, либо терапевтическое лечение. Например, способы и композиции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения субъекта, страдающего раком. Термин не являющееся человеком животное включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не-млекопитающих, таких как приматы, не являющиеся человеком, овца, собака, корова, куры, амфибии, рептилии и т.д.

Различные аспекты, описанные в настоящем документе, описаны более подробно в следующих подразделах.

I. Модифицированные константные области тяжелой цепи.

В настоящем документе описаны модифицированные константные области тяжелой цепи, которые, когда присутствуют в антителах, усиливают или изменяют определенные биологические свойства или свойства антител по сравнению с теми же антителами, которые не имеют модифицированной константной области тяжелой цепи, такими как антитела, которые содержат шарнир, не относящийся к IgG2, например антитела IgG1. Усиленные или измененные биологические свойства антител включают:

(a) повышенную или измененную интернализацию клеткой;

(b) повышенную или измененную агонистическую активность;

(c) повышенную или измененную антагонистическую или блокирующую активность;

(d) усиленную ADCC;

(d) создание нового свойства;

(e) повышенную или измененную передачу сигнала;

(f) образование более крупных сшитых комплексов антитело/антиген;

(g) усиление кластеризации или олигомеризации поверхностной молекулы клетки-мишени;

(h) усиление стимуляции или усиление иммунного ответа и/или (i) усиление ингибирования иммунного ответа.

В настоящем документе также представлены антитела, содержащие тяжелые цепи, содержащие одну или несколько аминокислотных мутаций, которые модулируют эффекторную функцию, например снижают эффекторную функцию.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обеспечивает более эффективную интернализацию антителозависимого рецептора (или лиганда, или поверхностной молекулы), например антитело интернализирует молекулу-мишень или поверхностную молекулу (например, рецептор или лиганд) и/или интернализируется само с более высокой скоростью и/или степенью интернализации в клетку после того, как антитело связывается со своей мишенью на клеточной мембране по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Скорость и степень интернализации антитела могут быть определены, например, как показано в примерах. Скорость интернализации, измеряемая, например, с помощью Т_1/2 интернализации, например, как показано в разделе Примеры, может быть усилена или увеличена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более, что приводит к снижению Т_1/2 по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более. Например, вместо того, чтобы иметь T_1/2 10 мин, модифицированная константная область тяжелой цепи может увеличить скорость интернализации и, таким образом, уменьшить Т_1/2 до 5 мин (т.е. двукратное увеличение скорости интернализации или двукратное снижение Т_1/2). Т1/2 определяется как время, за которое достигается половина максимальной интернализации, измеренное с момента добавления антитела в клетки. В определенных вариантах выполнения изобретения Т_1/2 уменьшается по меньшей мере на 10 мин, 30 мин или 1 ч. Максимальным уровнем интернализации может быть уровень интернализации на плато графика, представляющего нанесенную на график интернализацию в зависимости от концентрации антитела или времени. Модифицированная константная область тяжелой цепи может увеличить максимальный уровень интернализации антитела по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более. Другим способом сравнения эффективности ин

- 22 046941 тернализации различных антител, таких как антитело с модифицированной константной областью тяжелой цепи и то же самое антитело без нее, является сравнение их уровня интернализации при данной концентрации антитела (например, 100 нМ) и/или при данном времени (например, 2, 5, 10 или 30 мин). Сравнение уровней интернализации также может быть сделано путем сравнения уровней EC₅₀ интернализации. Уровень интернализации одного антитела может быть определен относительно уровня интернализации данного (эталонного) антитела, например антитела, описанного в настоящем документе, например 11F11 или CD73.4-IgG2CS-IgG1, и может быть указан в процентах от значения, полученного с данным (эталонным) антителом. Степень интернализации может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз или более раз по сравнению с любым из этих способов.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает более сильной агонистической активностью по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения усиленная активность агониста усиливает стимулирующую активность молекулы-мишени, например, GITR, или других молекул, которые стимулируют или совместно стимулируют иммунный ответ, например, активность Т-клеток. В определенных вариантах выполнения изобретения усиленная активность агониста усиливает ингибирующую активность молекулы-мишени, которая ингибирует иммунный ответ, например активность Т-клеток (например, ингибитор контрольных точек). Усиленную агонистическую активность антитела, которое модулирует активность Т-клеток, можно определить, например, как показано в разделе Примеры, например, путем измерения уровня секреции IFN-γ или IL-2 из Т-клеток, которые контактируют с антителом. Агонистическая активность антитела, которое связывается со стимулирующей мишенью, может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более, как это определено по увеличению высвобождения цитокинов или увеличению пролиферации эффекторных Т-клеток; снижению активности регуляторных Т-клеток, если участие в T_reg снижает функцию T_reg; или увеличенному истощению T_reg. Например, количество IFN-γ или IL-2, секретируемого из Т-клеток, стимулированных антителом, которое связывается со стимулирующей мишенью, содержащей модифицированную константную область тяжелой цепи, может составлять по меньшей мере 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более выше, чем у Т-клеток, имитированных тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи. Агонистическая активность антитела, которое связывается с ингибирующей мишенью, может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более, что определяется уменьшенным высвобождением цитокинов или уменьшенной пролиферацией эффекторных Т-клеток; повышенной активностью регуляторных Т-клеток или уменьшенным истощением T_reg. Например, количество IFN-γ или IL-2, секретируемого из Т-клеток, стимулированных антителом, которое связывается с ингибирующей мишенью, содержащей модифицированную константную область тяжелой цепи, может составлять по меньшей мере 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз или ниже, чем у Т-клеток, имитируемых тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает более сильным антагонистическим или блокирующим действием по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Усиленную антагонистическую активность антитела можно определить, например, путем измерения высвобождения и/или пролиферации цитокинов в условиях, которые включают условия активации Т-клеток. Антагонистическая активность может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 и более раз.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает усиленной активностью ADCC по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Усиленная ADCC может быть определена в соответствии со способами, известными в данной области техники. ADCC может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50%, в 2 раза, в 5 раз или более.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает способностью образовывать более крупные сшитые комплексы антитело/антиген по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Способность образовывать комплексы можно определить, как описано, например, в разделе Примеры. Комплексы антитело/антиген, образованные с антителом, которое содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, могут быть по меньшей мере на 50%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз или 10 раз больше, чем комплексы, образованные с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи. В определенных вариантах выполнения изобретения комплексы по меньшей мере 2000; 3000; 5000; 10000, 50000 или 100000 кДа образуются с антителами, имеющими модифицированную константную область тяжелой цепи.

- 23 046941

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, запускает большую кластеризацию или олигомеризацию молекулымишени на клеточной поверхности по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Степень кластеризации олигомеризации можно определить, например, путем измерения размера комплексов антитело/антиген.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, трансдуцирует передачу сигналов или сигнальную трансдукцию более высокого уровня или другого типа по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Сигнальная трансдукция может контролироваться путем определения уровня активации одного или нескольких белков в путях сигнальной трансдукции. В определенных вариантах выполнения изобретения сигнальная трансдукция определяется путем измерения активности (или фосфорилирования) белка сигнальной трансдукции, например NF-kB или р38, как описано, например, в разделе Примеры. Сигнальная трансдукция, запускаемая антителом, которое содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, может быть выше или ниже по меньшей мере на 10, 20, 50%, в 2 раза, 5 раз или более, чем сигнальная трансдукция с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи. Например, сигнальная трансдукция, запускаемая антителом, которое связывается со стимулирующей молекулой (например, GITR) и содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, может быть усилена по меньшей мере на 10% по сравнению с трансдукцией, полученной с тем же антителом, имеющим тяжелую цепь IgG1. Например, EC₅₀ активности NF-kB или р38 (например, фосфорилирования) может быть уменьшено по меньшей мере на 50%, в 2 раза, в 5 раз или более.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает повышенной способностью стимулировать или усиливать иммунный ответ или иммунную систему по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Повышенная способность стимулировать иммунный ответ или иммунную систему может быть результатом усиленной агонистической активности Т-клеточных костимуляторных рецепторов и/или усиленной антагонистической активности ингибирующих рецепторов. Повышенная способность стимулировать иммунный ответ или иммунную систему может отражаться в кратном увеличении EC₅₀ или максимального уровня активности в анализе, в котором измеряется иммунный ответ, например, анализе, в котором измеряются изменения в высвобождении цитокинов или хемокинов, цитолитической активности (определяется непосредственно на клетках-мишенях или опосредованно через обнаружение CD107а или гранзимов) и пролиферации. Способность стимулировать иммунный ответ или активность иммунной системы может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или более.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает повышенной антипролиферативной или противоопухолевой активностью по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Усиленная противоопухолевая активность антитела может быть определена, например, по росту опухоли у животного, которое было обработано антителом. Противоопухолевая активность может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз и более. Противоопухолевая активность может быть измерена, например, как уменьшение бремени опухоли, например, выраженное в уменьшенной кинетике роста опухоли и полной регрессии опухоли.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, обладает повышенной способностью ингибировать или подавлять иммунный ответ или иммунную систему по сравнению с тем же антителом, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и содержит, например, тяжелую цепь IgG1. Повышенная способность ингибировать или подавлять иммунный ответ или иммунную систему может быть результатом усиленной антагонистической активности Т-клеточных костимуляторных рецепторов и/или усиленной агонистической активности ингибирующих рецепторов. Повышенная способность стимулировать иммунный ответ или иммунную систему может отражаться в кратном увеличении EC₅₀ или максимальном уровне активности в анализе, в котором измеряется иммунный ответ, например, анализе, в котором измеряются изменения в высвобождении цитокинов или хемокинов, цитолитической активности (определяется непосредственно на клетках-мишенях или опосредованно через обнаружение CD107а или гранзимов) и пролиферации. Способность ингибировать или подавлять иммунный ответ или активность иммунной системы может быть усилена по меньшей мере на 10, 30, 50, 75%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз и более.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи или ее часть, напр. шарнир, является более жесткой по сравнению с другими константными областями тяжелой цепи, например, константными областями тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4.

- 24 046941

Например, модифицированная константная область тяжелой цепи представляет собой не встречающуюся в природе константную область тяжелой цепи, которая является более жесткой или имеет часть, например, шарнир, которая является более жесткой, чем природная константная область тяжелой цепи или ее шарнир. Жесткость константной области тяжелой цепи или ее части, такой как шарнир, может быть определена, например, с помощью компьютерного моделирования, электронной микроскопии, спектроскопии, такой как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рентгеновской кристаллографии (В-факторы) или аналитическим ультрацентрифугированием со скоростной седиментацией (AUC) для измерения или сравнения радиуса вращения антител, содержащих шарнир. Альтернативно, жесткость константной области тяжелой цепи или ее части может быть определена путем измерения размеров комплексов антитело/антиген, например, как далее описано в настоящем документе.

Понятно, что антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи и обладающее усиленным функциональным свойством, которое определяется в соответствии с методиками, известными в данной области техники, и описанное в настоящем документе, относится к статистически значимому различию в конкретной активности относительно активности, наблюдаемой в том же антителе, но с другой константной областью тяжелой цепи.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир изотипа IgG2 (шарнир IgG2) и домен CH1, CH2 и CH3. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир IgG2 и домен CH1, CH2 и CH3, где по меньшей мере один из доменов CH1, CH2 и CH3 не относится к изотипу IgG2. В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир IgG2 и домен CH1, CH2 и CH3, где константный домен тяжелой цепи не является константной областью IgG2 дикого типа или не является константной областью IgG2 с мутацией в аминокислоте 219 или 220. Шарнир IgG2 может представлять собой шарнир IgG2 дикого типа, например шарнир человеческого IgG2 дикого типа (например, имеющий SEQ ID NO: 8) или его вариант при условии, что шарнир IgG2 сохраняет способность придавать антителу усиленную активность по сравнению с тем же антителом, которое содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или содержит тяжелую цепь IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнирный вариант IgG2 сохраняет жесткость или прочность, аналогичные таковым для шарнира IgG2 дикого типа. Жесткость шарнира может быть определена, например, с помощью компьютерного моделирования, электронной микроскопии, спектроскопии, такой как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рентгеновской кристаллографии (В-факторы) или аналитическим ультрацентрифугированием со скоростной седиментацией (AUC) для измерения или сравнения радиуса вращения антител, составляющих шарнир. Шарнир имеет такую же или более высокую жесткость относительно жесткости другого шарнира, если антитело, содержащее шарнир, имеет значение, полученное в результате одного из испытаний, описанных в предыдущем предложении, которое отличается от значения того же антитела с другим шарниром, например шарниром IgG1, менее чем на 5, 10, 25, 50, 75 или 100%. Специалист в данной области сможет определить по результатам испытаний, имеет ли шарнир по меньшей мере жесткость, аналогичную жесткости другого шарнира, путем интерпретации результатов этих испытаний.

Примером варианта шарнира человеческого IgG2 является шарнир IgG2, который содержит замену одного или нескольких из четырех остатков цистеина (т.е. С219, С220, С226 и С229) другой аминокислотой. Цистеин может быть заменен серином. Типичным шарниром IgG2 является шарнир человеческого IgG2, содержащий мутацию С219Х или мутацию С220Х, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме цистеина. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир IgG2 не содержит замены как С219Х, так и С220Х. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир IgG2 содержит C219S или C220S, но не одновременно C219S и C22S. Другие варианты шарнира IgG2, которые можно использовать, включают шарниры человеческого IgG2, содержащие замену С220, С226 и/или С229, например, мутацию C220S, C226S или C229S (которая может сочетаться с мутацией C219S). Шарнир IgG2 также может представлять собой шарнир IgG2, в котором часть шарнира является частью другого изотипа (т.е. представлять собой химерный или гибридный шарнир), при условии, что жесткость химерного шарнира по меньшей мере аналогична жесткости шарнира IgG2 дикого типа. Например, шарнир IgG2 может быть шарниром IgG2, в котором нижний шарнир (как определено в Таблице 2) имеет изотип IgG1 и, например, является нижним шарниром IgG1 дикого типа.

Гибридный или химерный шарнир относится к специфическому изотипу, если более половины последовательных аминокислот шарнира происходят из этого изотипа. Например, шарнир, имеющий верхний и средний шарнир IgG2 и нижний шарнир IgG1, считается гибридным шарниром IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, которая содержит шарнир IgG2, содержащий последовательность, приведенную в табл. 4, например одну из следующих аминокислотных последовательностей: 8, 21, 22, 23, 126-129 и 134-147. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 или 135, где 1, 2, 3 или все 4 аминокислоты Р233, V234, А235 и G237 (соответствующие С-концевым 4 аминокислотам PVAG (SEQ ID NO: 148) удаляются или заменяются другой аминокислотой, например аминокислотами С-конца шарнира IgG1 (ELLG (SEQ ID NO: 149) или ELLGG

- 25 046941 (SEQ ID NO: 150). В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 или 135, где V234, А235 и G237 удалены или заменены другой аминокислотой. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 или 135, где А235 и G237 удалены или заменены другой аминокислотой. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 или 135, где G237 удален или заменен другой аминокислотой. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 или 135, где V234 и А235 удалены или заменены другой аминокислотой. Замена PVAG (SEQ ID NO: 143) в IgG2 соответствующими аминокислотами шарнира IgG1, т.е. (ELLG (SEQ ID NO: 144) или ELLGG (SEQ ID NO: 145)), для получения гибридного шарнира, имеющего SEQ ID NO: 22 или 138, или его вариантов (см., например, табл. 4), обеспечивает шарнир, имеющий преимущества шарнира IgG2 и эффекторную функцию шарниров IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир, который состоит из или состоит по существу из одной из последовательностей в табл. 4, например SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 127-132 и 134-141, и в определенных вариантах выполнения изобретения не содержит дополнительных шарнирных аминокислотных остатков.

Таблица 4

Типичные шарниры IgG2

Описание шарнира IgG2	Аминокислотная последовательность	SEQ Ш NO:
IgG2 Дикого типа	ERKCCVECPPCPAPPVAG	8
IgG2cC219S	ERKSCVECPPCPAPPVAG	21
IgG2 с C220S	ERKC S VECPPCP АРР VAG	126
IgG2cC219X	ERKXCVECPPCPAPPVAG	134
IgG2 с С220Х	ERKCXVECPPCP APPVAG	135
IgG2 Дикого типа с С-концевым X	ERKCCVECPPCPAPPVAGX	143
IgG2 с C219S с С-концевым X	ERKSCVECPPCPAPPVAGX	144
IgG2 с C220S с С-концевым X	ERKC S VECPPCP АРР VAGX	145
IgG2 с С219Х с С-концевым X	ERKXCVECPPCPAPPVAGX	146
IgG2 с С220Х с С-концевым X	ERKCXVECPPCP APPVAGX	147
IgG2/IgGl гибрид	ERKCCVECPPCP APELLGG	22
IgG2/IgGl гибрид с C219S	ERKSCVECPPCP APELLGG	23
IgG2/IgGl гибрид с C220S	ERKC S VECPPCP APELLGG	127
IgG2/IgGl гибрид с С219Х	ERKXCVECPPCP APELLGG	136
IgG2/IgGl гибрид с С220Х	ERKCXVECPPCP APELLGG	137
IgG2/IgGl гибрид deltaG	ERKCCVECPPCP APELLG	138
IgG2/IgGl гибрид с C219S deltaG	ERKSCVECPPCP APELLG	139
IgG2/IgGl гибрид с C220S deltaG	ERKC S VECPPCP APELLG	140
IgG2/IgGl гибрид с С219Х deltaG	ERKXCVECPPCP APELLG	141
IgG2/IgGl гибрид с С220Х deltaG	ERKCXVECPPCP APELLG	142
Усеченный IgG2 дикого типа	ERKCCVECPPCP AP	128
Усеченный IgG2 дикого типа с C219S	ERKSCVECPPCPAP	129
Усеченный IgG2 дикого типа с C220S	ERKC S VECPPCP AP	130
Усеченный IgG2 дикого типа с С219Х	ERKXCVECPPCP AP	131
Усеченный IgG2 дикого типа с С220Х	ERKCXVECPPCP AP	132

X представляет собой любую аминокислоту, кроме цистеина.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит шарнир IgG2, представленный в табл. 4, в которой 1-5, 1-3, 1-2 или 1 аминокислота вставлена между аминокислотными остатками CVE и СРР. В определенных вариантах выполнения изо

- 26 046941 бретения вставлены ТНТ или GGG. В определенных вариантах выполнения изобретения между шарниром и доменом CH2 могут быть вставлены 1, 1-2 или 1-3 аминокислоты. Например, дополнительный глицин может быть вставлен между шарниром и доменом CH2.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи представляет собой константную область IgG1 или IgG2, где шарнир содержит делецию из 1-10 аминокислот. Как показано в примерах, антитело IgG1, лишенное аминокислотных остатков SCDKTHT (S219, С220, D221, K222, Т223, Н224 и Т225; SEQ ID NO: 151), обеспечивало опосредованную антителом интернализацию CD73 более эффективно, чем то же антитело, имеющее константную область IgG1 дикого типа. Аналогично в контексте антитела IgG2, антитело IgG2, лишенное аминокислотных остатков CCVE (С219, С220, V222 и Е224; SEQ ID NO: 152), обеспечивало интернализацию CD73, опосредованную антителами, более эффективно, чем то же антитело, имеющее константную область IgG1 дикого типа. Соответственно, в настоящем документе представлены модифицированные константные области тяжелой цепи, в которых шарнир содержит делецию из 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков, выбранных из остатков S219, С220, D221, K222, Т223, Н224 и Т225 для антитела IgG1 и остатков С219, С220, V222 и Е224 для антитела IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи включает домен CH1, который представляет собой домен CH1 дикого типа изотипа IgG1 или IgG2 (домен C_H1 IgG1 или домен C_H1 IgG2 соответственно). Также можно использовать домены CH1 изотипов IgG3 и IgG4 (домен C_H1 IgG3 и домен C_H1 IgG2 соответственно). Домен CH1 также может представлять собой вариант домена C_H1 дикого типа, например, вариант домена C_H1 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 дикого типа. Типичные варианты доменов CH1 включают А114С, d31S и/или Т173С. Домен CH1, например, домен C_H1 IgG2, может содержать замену d31S, которая связана с антителом IgG2 или антителом, имеющим CH1 IgG2, и шарнир формы В (или конформации).

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит домен C_H1, который имеет изотип IgG2. В некоторых вариантах выполнения изобретения домен C_H1 представляет собой домен C_H1 IgG2 дикого типа, например, имеющий аминокислотную последовательность:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSA^GTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ Ш NO: 7).

В определенных вариантах выполнения изобретения домен C_H1 представляет собой вариант SEQ ID NO: 7 и содержит 1-10, 1-5, 1-2 или 1 аминокислотные замены или делеции относительно SEQ ID NO: 7. Как дополнительно описано в примерах, в настоящем документе было показано, что домен CH1 IgG2 или его варианты придают усиленные свойства антителам относительно антител IgG1 и даже более усиленные свойства, когда антитела также содержат шарнир IgG2. В определенных вариантах выполнения изобретения варианты C_H1 IgG2 не содержат аминокислотную замену или делецию в одном или нескольких из следующих аминокислотных остатков: С131, R133, Е137 и S138, причем эти аминокислотные остатки показаны жирным шрифтом и подчеркнуты в SEQ ID NO: 7, показанной выше. Например, модифицированная константная область тяжелой цепи может содержать домен CH1 IgG2, в котором ни один из R133, Е137 и S138 не заменен другой аминокислотой или удален, или в котором ни один из С131, R133, Е137 и S138 не заменен другой аминокислотой или удален. В определенных вариантах выполнения изобретения С131 заменен другой аминокислотой, например, C131S, замена которой запускает антитело для принятия конформации В. Было показано, что как антитела конформации А, так и антитела конформации В, имеющие модифицированные константные области тяжелой цепи, обладают усиленной активностью относительно того же антитела с константной областью IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения N192 и/или F193 (показанные как выделенные курсивом и подчеркнутые остатки в SEQ ID NO: 7, показанной выше) заменены другой аминокислотой, например, соответствующими аминокислотами в IgG1, т.е. N192S и/или F193L.

В определенных вариантах выполнения изобретения один или несколько аминокислотных остатков домена CH1 IgG2 заменены соответствующими аминокислотными остатками в IgG4. Например, N192 может быть N192S; F193 может быть F193L; С131 может быть d31K; и/или Т214 может быть T214R.

Антитело может содержать модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую домен C_H1 IgG2 или его вариант и шарнир IgG2 или его вариант. Шарнир и домен CH1 могут представлять собой комбинацию любого шарнира IgG2 и домена CH1 IgG2, описанных в настоящем документе. В определенных вариантах выполнения изобретения CH1 IgG2 и шарнир включают следующую аминокислотную последовательность:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSAFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ГО NO: 133) или аминокислотную последовательность, которая отличается от нее не более чем в 1-10 аминокислот. Варианты аминокислот являются такими, как описано для шарнира и доменов CH1 выше.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела содержат по меньшей мере шарнир

- 27 046941

IgG2 и, необязательно, также домен CH1 IgG2, или фрагмент или производное шарнира и/или домена CH1, и антитело принимает форму (конформацию) А (см., например, Allen et al. (2009), Biochemistry, 48:3755). В определенных вариантах выполнения изобретения антитела содержат по меньшей мере шарнир IgG2 и, необязательно, также домен или фрагмент C_H1 IgG2 или производное шарнира и/или домена CH1, и антитело принимает форму В (см., например, Allen et al. (2009), Biochemistry, 48:3755).

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит домен C_H2, который представляет собой домен C_H2 дикого типа изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (домен CH2 IgG1, домен CH2 IgG2, домен CH2 IgG3 или домен CH2 IgG4 соответственно. Домен CH2 также может представлять собой вариант домена CH2 дикого типа, например, вариант домена CH2 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 дикого типа. Типичные варианты доменов CH2 включают варианты, которые модулируют биологическую активность области Fc антитела, такую как ADCC или CDC, или модулируют период полужизни антитела или его стабильность. В одном варианте выполнения изобретения домен CH2 представляет собой домен CH2 человеческого IgG1 с мутацией A330S и/или P331S, где домен CH2 обладает пониженной эффекторной функцией относительно той же самой мутации CH2 без мутаций. Домен C_H2 может иметь усиленную эффекторную функцию. Домены C_H2 могут содержать одну или несколько из следующих мутаций: SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF, GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) и/или одну или несколько мутации в следующих аминокислотах: Е233, L235, G237, Р238, Н268, Р271, L328, А330 и K322. Обращается внимание на то, что некоторые из этих мутаций на самом деле являются частью шарнира, а не домена C_H2, как определено в настоящем документе. Другие мутации дополнительно изложены в настоящем документе в другом месте.

В определенных вариантах выполнения изобретения модифицированная константная область тяжелой цепи содержит домен CH3, который представляет собой домен CH3 дикого типа изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (домен CH3 IgG1, домен CH3 IgG2, домен CH3 IgG3 или домен CH3 IgG4 соответственно). Домен CH3 также может представлять собой вариант домена CH3 дикого типа, например вариант домена C_H3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 дикого типа. Типичные варианты доменов C_H3 включают варианты, которые модулируют биологическую активность области Fc антитела, такую как ADCC или CDC, или модулируют период полужизни антитела или его стабильность.

Как правило, варианты CH1, шарнира, доменов CH2 или CH3 могут включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более мутаций и/или не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мутации или 1-10, или 1-5 мутаций или содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична таковой для соответствующего домена дикого типа (CH1, шарнир, домен CH2 или CH3 соответственно) при условии, что константная область тяжелой цепи, содержащая конкретный вариант, сохраняет необходимую биологическую активность.

В табл. 5 приведены типичные константные области тяжелой цепи человека, содержащие CH1, шарнир, домены CH2 и/или CH3 человека, где каждый домен представляет собой либо домен дикого типа, либо его вариант, который обеспечивает требуемую биологическую активность константной области тяжелой цепи. Незаполненная клетка в табл. 5 указывает, что домен присутствует или нет и, если он присутствует, может иметь любой изотип, например IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

Например, антитело, содержащее константную область 1 тяжелой цепи в табл. 5, представляет собой антитело, которое содержит константную область тяжелой цепи, содержащую по меньшей мере шарнир IgG2, и которое также может содержать домен CH1, CH2 и/или CH3, и, если присутствует, то домен CH1, CH2 и/или CH3 имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В качестве другого примера для понимания табл. 5 антитело, содержащее константную область 8 тяжелой цепи, представляет собой антитело, содержащее константную область тяжелой цепи, содержащую домен CH1 IgG1 и шарнир IgG2, домен CH2 IgG1, и которое может также содержать или не содержать домен CH3, который присутствует и может иметь изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

- 28 046941

Таблица 5

MHCCR*	СН1	Шарнир	CH2	CH3
1		IgG2
2	IgGl	IgG2
3	IgG2	IgG2
4		IgG2	IgGl
5		IgG2	IgG2
6		IgG2		IgGl
7		IgG2		IgG2
8	IgGl	IgG2	IgGl
9	IgGl	IgG2	IgG2
10	IgG2	IgG2	IgGl
И	IgG2	IgG2	IgG2
12	IgGl	IgG2		IgGl
13	IgGl	IgG2		IgG2
14	IgG2	IgG2		IgGl
15	IgG2	IgG2		IgG2
16		IgG2	IgGl	IgGl
17		IgG2	IgGl	IgG2
18		IgG2	IgG2	IgGl
19		IgG2	IgG2	IgG2
20	IgGl	IgG2	IgGl	IgGl
21	IgGl	IgG2	IgGl	IgG2
22	IgGl	IgG2	IgG2	IgGl
23	IgGl	IgG2	IgG2	IgG2
24	IgG2	IgG2	IgGl	IgGl
25	IgG2	IgG2	IgGl	IgG2
26	IgG2	IgG2	IgG2	IgGl
27	IgG2	IgG2	IgG2	IgG2

* Модифицированная константная область тяжелой цепи.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее константную область тяжелой цепи, показанную в табл. 5, обладает усиленной биологической активностью по сравнению с тем же антителом, содержащим константную область тяжелой цепи, которое не содержит эту специфическую константную область тяжелой цепи, или относительно того же антитела, которое содержит константную область IgG1.

В определенных вариантах выполнения изобретения способ улучшения биологической активности антитела, которое содержит шарнир, не относящийся к IgG2, и/или домен CH1, не относящийся к IgG2, включает предоставление антитела, которое содержит шарнир, не относящийся к IgG2, и/или домен C_H1, не относящийся к IgG2, и замену шарнира, не относящегося к IgG2, и домена CH1, не относящегося к IgG2, шарниром IgG2 и доменом CH1 IgG2 соответственно. Способ улучшения биологической активности антитела, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, может включать предоставление антитела, которое не содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, и замену его константной области тяжелой цепи модифицированной константной областью тяжелой цепи.

Типичные модифицированные константные области тяжелой цепи представлены в табл. 6, в которой указывается идентичность каждого из доменов.

Таблица 6

Модифицированная константная область тяжелой цепи

СН1

Шарнир

СН2

СНЗ

SEQ ID NO целой MHCCR

- 29 046941

IgGl-IgG2-IgGl	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2/IgGl SEQ ID NO:22	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:26
IgGl-IgG2-IgG12	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:8	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:27
IgGl-IgG2CS-IgGl	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2C219S/IgGl SEQ ID NO:23	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:32
IgGl-IgG2CS-IgG12	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2 C219S SEQ ID NO 2 I	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:33
IgG2-IgGl	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2/IgGl SEQ ID NO:22	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:28
IgG2-IgG12	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:8	IgGl дикого типа SEQ ID NO:4	IgGl дикого типа SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:29

- 30 046941


IgG2CS-IgGl	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2C219S/IgGl SEQ ID NO:23	IgGl дикого типа SEQ Ш NO:4	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:34
IgG2CS-IgG12	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2 C219S SEQIDNO:21	IgGl дикого типа SEQ Ш NO:4	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:35
IgGlCHl- IgG2LUapHnp- IgGlCH2 (A330S, P331S)-IgGlCH3 или IgGl-IgG2-IgGl. 1	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2 дикого типа SEQIDNO:8	IgGl A330S/P331S SEQ ID NO:24	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:30
IgGl CHI-IgG2 Шарнир(С2198)IgGlCH2(A330S, P331S)-IgGlCH3 или IgGl-IgG2CS-IgGl.l	IgGl дикого типа SEQ ID NO:2	IgG2 C219S SEQIDNO:21	IgGl A330S/P331S SEQ ID NO:24	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:36
IgG2-IgGl.l	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2 дикого типа SEQIDNO:8	IgGl A330S/P331S SEQ ID NO:24	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:31
IgG2CS-IgGl.l	IgG2 дикого типа SEQ ID NO:7	IgG2 C219S SEQIDNO:21	IgGl A330S/P331S SEQ ID NO:24	IgGl дикого типа SEQ ГО NO:5	SEQ ID NO:37

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую шарнир IgG2, содержащий любую одну из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137 или ее вариант, такой как шарнир IgG2, содержащий аминокислотную последовательность, которая (i) отличается от любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137 заменами, добавлениями или делециями 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот; (ii) отличается от любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137 не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 или 3-5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 или 137, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может быть консервативной аминокислотной заменой или неконсервативной аминокислотной заменой; и где модифицированная константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например, константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

- 31 046941

В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир содержит последовательность, которая является вариантом любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137, где R217 (вторая аминокислота в шарнире IgG2 дикого типа (SEQ ID NO: 8) не удалена или не заменена другой аминокислотой. В определенных вариантах выполнения изобретения, в которых шарнир представляет собой вариант любой из SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 и 137, шарнир имеет жесткость, аналогичную жесткости IgG2 дикого типа.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую домен CH1 IgG1, содержащий SEQ ID NO: 2, или домен CH1 IgG2, содержащий SEQ ID NO: 7, или вариант SEQ ID NO: 2 или 7, причем этот вариант (i) отличается от SEQ ID NO: 2 или 7 заменами, добавлениями или делециями 1,2, 3,4 или 5 аминокислот; (ii) отличается от SEQ ID NO: 2 или 7 не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от SEQ ID NO: 2 или 7 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 или 3-5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 2 или 7, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую домен CH2 IgG1, содержащий SEQ ID NO: 4 или 24, или вариант SEQ ID NO: 4 или 24, причем этот вариант (i) отличается от SEQ ID NO: 4 или 24 заменами, добавлениями или делециями 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот; (ii) отличается от SEQ ID NO: 4 или 24 не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от SEQ ID NO: 4 или 24 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 или 3-5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 4 или 24, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например, константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую домен CH3 IgG1, содержащий SEQ ID NO: 5, или вариант SEQ ID NO: 5, причем этот вариант (i) отличается от SEQ ID NO: 5 заменами, добавлениями или делециями 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот; (ii) отличается от SEQ ID NO: 5 не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от SEQ ID NO: 5 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 или 3-5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98% или 99%, идентичной SEQ ID NO: 5, где в любом из (i)-(iv), аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

Модифицированные константные области тяжелой цепи также могут содержать комбинацию доменов CH1, шарнира, CH2 и CH3, описанных выше.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе, или вариант модифицированной константной области тяжелой цепи, описанный в настоящем документе, причем этот вариант (i) отличается от модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (ii) отличается от модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 или 5-10 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная

- 32 046941 константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например, константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую любую одну из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262 или вариант любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262, причем этот вариант (i) отличается от любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262 заменами, добавлениями или делециями 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот; (ii) отличается от любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262 не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 или 5-10 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой из SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 и 247-262, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная константная область тяжелой цепи обладает усиленной биологической активностью (и/или пониженной эффекторной функцией) относительно активности другой константной области тяжелой цепи, например константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или относительно той же модифицированной константной области тяжелой цепи, которая содержит шарнир, не относящийся к IgG2.

Модифицированные константные области тяжелой цепи могут иметь (i) сходную, пониженную или повышенную эффекторную функцию (например, связывание с FcyR) относительно константной области тяжелой цепи дикого типа и (или) (ii) сходный, уменьшенный или увеличенный период полужизни (или связывание с рецептором FcRn) относительно константной области тяжелой цепи дикого типа.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит модифицированную константную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 198, или ее часть, содержащую Р238К, или вариант любой из SEQ ID NO: 198 или ее части, где вариант (i) отличается от SEQ ID NO: 198 или ее части, содержащей Р238К, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (ii) отличается от SEQ ID NO: 198 или ее части, содержащей Р238К, не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от SEQ ID NO: 198 или ее части, содержащей Р238К, 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 или 5-10 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 198 или ее части, содержащей Р23 8К, где аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену; и где модифицированная константная область тяжелой цепи имеет пониженную эффекторную функцию, например, необнаружимое связывание с FcyR (например, CD32a, CD32b и CD16а) с низкой аффинностью и необязательно необнаружимое связывание с FcyR (CD64) с высокой аффинностью, определяемое в анализе, описанном в настоящем документе.

В определенных вариантах выполнения изобретения Fc IgG1, содержащий мутацию Р238К (например, содержащий SEQ ID NO: 198 или ее часть), не содержит никаких других мутаций относящихся к Fc IgG1 дикого типа, например, описанных в настоящем документе. В определенных вариантах выполнения изобретения Fc IgG1, содержащий мутацию Р238К (например, содержащий SEQ ID NO: 198 или ее часть), содержит 1-5 аминокислотных замен в дополнение к Р238К относительно человеческого Fc IgG1 дикого типа, например, он включает SEQ ID NO: 198 или ее часть и 1-5 аминокислотных замен относительно SEQ ID NO: 198 или ее части при условии, что Fc IgG1 обладает пониженной эффекторной функцией.

В определенных вариантах выполнения изобретения Fc IgG1, содержащий мутацию Р238К, не содержит никакой другой мутации, которая снижает эффекторную функцию. В определенных вариантах выполнения изобретения Fc IgG1, содержащий мутацию Р238К, содержит 1-5 мутаций, которые снижают эффекторную функцию.

В определенных вариантах выполнения изобретения Fc IgG, содержащий мутацию Р238К, также содержит мутацию L235E и/или мутацию К322А и может в определенных вариантах выполнения изобретения не содержать никакой дополнительной мутации Fc, которая модулирует эффекторную функцию Fc, например он не включает мутацию в Р330, Р331 или мутацию в нижнем шарнире, например, у аминокислот 234 и 236-237. IgG может представлять собой IgG1 или IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую константный домен IgG2 или по меньшей мере его шарнир, где константный домен IgG2 или его шарнир содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из Р238А, Р238К, L235A, К322А, и, необязательно, мутацию в С219 и/или С220, например C219S и/или C220S.

- 33 046941

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую константный домен IgG1, содержащий один или несколько из L234A, L235E и G237A. Используемый в настоящем документе термин IgG1.3 относится к тяжелой цепи IgG1, содержащей L234A, L235E и G237A (см., например, SEQ ID NO: 248). Константные области IgG1, содержащие эти три мутации, также могут содержать дополнительные мутации такие, как описанные в настоящем документе. Типичные последовательности, содержащие мутации L234A, L235E и G237A и дополнительные мутации, представлены в настоящем документе в Таблице Последовательностей. Fc IgG1.3 обеспечивает антитело со значительно пониженной эффекторной функцией, такой как ADCC и CDC. В определенных вариантах выполнения изобретения Fc содержит мутации IgG1.3 и дополнительные мутации, например Р238К.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1.3, константная область которой не содержит ничего, кроме мутации, которая модулирует эффекторную функцию, в дополнение к L234A, L235E и G237A. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1.3, константная область которой не содержит ничего, кроме мутации, в дополнение к L234A, L235E и G237A.

Константные области тяжелой цепи представлены в таблице последовательностей. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит одну из константных областей тяжелой цепи, указанных в таблице, где константная область не содержит никакой мутации в дополнение к мутации в последовательности, указанной в таблице. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело содержит одну из константных областей тяжелой цепи, указанных в таблице, где константная область (i) отличается от последовательности из таблицы последовательностей 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (ii) отличается от последовательности из таблицы последовательностей не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями; (iii) отличается от последовательности из таблицы последовательностей 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 или 3-5 аминокислотными заменами, добавлениями или делециями и/или (iv) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности из таблицы последовательностей, где в любом из (i)-(iv) аминокислотная замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную заменуи где биологическая активность константной области существенно не изменяется этими мутациями.

Константные области тяжелой цепи могут содержать комбинацию мутаций, которые придают антителу, содержащему область тяжелой цепи, комбинацию биологических активностей, присущих каждой отдельной мутации. Например, одну или несколько мутаций, которые усиливают образование агонистической активности крупных комплексов на клеточной поверхности или которые усиливают интернализацию антитела, можно комбинировать с одной или несколькими мутациями, которые модулируют эффекторную функцию. Типичные последовательности константных цепей, содержащих комбинацию мутаций, обеспечивающих различные биологические функции, приведены в таблице последовательностей.

II. Антитела с модифицированными константными областями тяжелой цепи и их антигены-мишени.

Модифицированные константные области тяжелой цепи можно использовать в широком спектре антител, таких как антитела, которые требуют интернализацию (например, конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC), и антитела к CD73), агонистическую активность (например, антитела, которые эффективны в модулировании иммунных ответов, например, при стимулировании активации Т-клеток, такие как агонистические антитела к GITR), антагонистическую активность (например, антитела, которые ингибируют или блокируют белок, который ингибирует иммунный ответ, например, активацию Т-клеток, такие как антитело-антагонист PD-1), эффекторную функцию, например ADCC и CDC, или пониженную эффекторную функцию, сигнальную трансдукцию или противоопухолевую активность. Например, интернализация рецептора, ингибирующего клеточную поверхность, может ограничивать его способность взаимодействовать с его рецептором(ами) и снижать функцию(и) клетки.

В одном варианте выполнения изобретения антитела, содержащие модифицированный константный домен тяжелой цепи, представляют собой антитела, которые требуют их интернализацию для активности (например, антитела, которые специфичны для рецепторов клеточной поверхности), например, индуцируя опосредованный рецептором эндоцитоз, когда они связываются с поверхностью клетки. Такие антитела могут быть использованы в качестве носителей для направленной доставки лекарственных средств, токсинов, ферментов или ДНК для терапевтических применений. Поэтому желательно повышение свойств интернализации этих антител. Типичными антителами, которые могут выиграть от эффективной интернализации, являются конъюгаты антител с лекарственными средствами. Различные анализы для измерения свойств интернализации антитела известны в данной области и описаны в настоящем документе. В этих анализах используется, например, широкий спектр красителей для пометки антител, которые можно использовать в анализах с отмывкой или анализах на основе гашения для мониторинга интернализации. Интернализацию антител также можно отслеживать в анализах без промывки, которые основаны на флуоресцентных метках.

В одном варианте выполнения изобретения антитела, содержащие модифицированный константный домен тяжелой цепи, представляют собой антитела, которые требуют интернализацию антигена, с

- 34 046941 которым они связаны, например молекулы клеточной поверхности, такой как рецептор или лиганд, для активности. Таким образом, в антителах к белкам клеточной поверхности, которые требуют пониженной регуляции для биологической (например, терапевтической) активности, может использоваться модифицированная константная область тяжелой цепи, описанная в настоящем документе.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, содержащие модифицированный константный домен тяжелой цепи, связываются с молекулами клеточной поверхности и агонизируют или антагонизируют биологическую активность молекулы клеточной поверхности, например молекулы клеточной поверхности на иммунной клетке, например Т-клетке, Teff-клетке, Th1-клетке, Th2-клетке, CD4+ Т-клетке, CD8+ Т-клетке, Treg-клетке, дендритной клетке, макрофаге, моноците, клетке Лангерганса, NK-клетке, клетке-супрессоре миелоидного происхождения, В-клетке или любой другой иммунной клетке. Молекула клеточной поверхности может быть стимулирующей, например костимулирующей молекулой (например, GITR, OX40, CD137, CD40, ICOS и другими членами семейства TNFR), и антитело может дополнительно стимулировать активность (агонистическое антитело) или антитело может ингибировать активность (антагонистическое антитело). Молекула клеточной поверхности может быть ингибирующей молекулой (например, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3), и антитело может дополнительно стимулировать активность (агонистическое антитело), или антитело может ингибировать активность (антагонистическое антитело).

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, содержащие модифицированный константный домен тяжелой цепи, представляют собой агонистические антитела стимулирующих (или костимулирующих) молекул, которые, например, стимулируют иммунную систему субъекта, например, путем индукции секреции IL-2 и/или IFN-γ из Т-клеток (например, антитела к GITR). Было показано, что другие агонистические антитела активируют АРС, стимулируют противоопухолевые Т-клеточные ответы и/или стимулируют цитотоксические миелоидные клетки с потенциалом для борьбы с раком в отсутствии Т-клеточного иммунитета. Агонистические антитела стимулирующих молекул отличаются от антагонистических антител ингибирующих молекул, которые блокируют отрицательные иммунные контрольные точки, такие как к CTLA-4 или к PD-1. Активность агониста, такая как пролиферация Т-клеток, может быть измерена с использованием различных способов, известных в данной области.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, содержащие модифицированный константный домен тяжелой цепи, являются антагонистическими антителами ингибиторов контрольных точек, усиливают иммунный ответ субъекта путем блокирования или ингибирования отрицательных контрольных точек иммунного ответа, такими как антитела против CTLA-4 или против PD-1, например, путем нацеливания ингибирующего рецептора, экспрессированного на активированных Т-клетках. Антагонистическая активность, такая как ингибирование пролиферации Т-клеток, может быть измерена с использованием различных способов, известных в данной области.

В одном варианте выполнения изобретения антитело является (i) агонистом костимулирующего рецептора или (ii) антагонистом ингибирующего сигнала, например, на Т-клетках, которые оба могут приводить к усилению иммунных ответов, например антигенспецифических Т-клеточных ответов (регуляторы контрольных точек иммунного ответа). В определенных вариантах выполнения изобретения антитело является (i) антагонистом костимулирующего рецептора или (ii) агонистом ингибирующего сигнала, например, на Т-клетках. Костимулирующие и коингибирующие молекулы могут быть членами суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF), и антитела, имеющие модифицированные константные области тяжелой цепи, могут связываться с любым из них. Одним из важных семейств мембраносвязанных лигандов, которые связываются с костимулирующими или коингибирующими рецепторами, является семейство В7, которое включает В7-1, В7-2, В7-Н1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), В7-Н2 (ICOS-L), B7-H3, В7-Н4, В7-Н5 (VISTA) и В7-Н6, и антитела, имеющие модифицированные константные области тяжелой цепи, могут связываться с любым из них. Другим семейством мембраносвязанных лигандов, которые связываются с костимулирующими или совместно ингибирующими рецепторами, является семейство молекул TNF, которые связываются с членами семейства рецепторов TNF (TNFR), которые включают CD40 и CD40L, ОХ-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Lymphotoxin α/TNFe, TNFR2, TNFa, LTa, LTe, LTeR, Lymphotoxin α1 β2, FAS, FASL (CD178), DR3 (TNFRSF25), RELT, DR6, TROY, NGFR (см., например, Tansey (2009), Drug Discovery Today, 00:1). Таким образом, антитела, описанные в настоящем документе, могут связываться с любой из этих поверхностных молекул, и они могут быть, например, (i) агонистами или антагонистами (или ингибиторами или блокирующими агентами) белков семейства IgSF, или семейства В7, или семейства TNFR, которые ингибируют активацию Т-клеток, или антагонистами цитокинов, которые ингибируют активацию Т-клеток (например, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF; иммуносупрессивные цитокины), и/или (ii) агонистами или антагонистами стимулирующих рецепторов семейства IgSF, семейства В7, или семейства TNF, или цитокинов, которые стимулируют активацию Т-клеток, для модуляции, например стимуляции, иммунного ответа, например, для лечения пролиферативных заболеваний,

- 35 046941 таких как рак.

Соответственно, антитело с модифицированным константным доменом тяжелой цепи может быть использовано в качестве одного из следующих агентов:

(1) агонист белка, который стимулирует, например, активацию Т-клеток, такого как В7-1, В7-2, CD28, 4-1ВВ (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 или CD28H; или (2) антагонист (ингибитор или блокирующий агент) белка, который ингибирует активацию Т-клеток (например, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа), такого как CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 и LAG-3, как описано выше, и любого из следующих белков: TIM-3, Galectin 9, СЕАСАМ-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1, TIM-4, CD39.

Другие антитела включают антагонисты ингибирующих рецепторов на NK-клетках и агонисты активирующих рецепторов на NK-клетках, например KIR, TIGIT, NKG2A.

Как правило, антитела, которые могут извлечь выгоду из модифицированной константной области тяжелой цепи, включают, например, агонистические антитела, которые лигируют положительные костимуляторные рецепторы, блокирующие антитела, которые ослабляют передачу сигналов через ингибирующие рецепторы, антагонистические антитела и антитела, которые системно увеличивают частоту противоопухолевых Т-клеток, антитела, которые преодолевают различные иммуносупрессивные пути в микроокружении опухоли (например, блокируют ингибирующее взаимодействие с рецептором (например, взаимодействия PD-L1/PD-1), истощают или ингибируют T_reg (например, моноклональное антитело против CD25), ингибируют метаболические ферменты, такие как IDO, или обращают/предотвращают анергию или истощение Т-клеток) и антитела, которые запускают активацию врожденного иммунитета и/или воспаление в местах опухоли. Повышенная интернализация ингибирующих рецепторов может привести к снижению уровня потенциального ингибитора.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, представляет собой антитело, которое конъюгировано с терапевтическим агентом с образованием иммуноконъюгата, такого как конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), где иммуноконъюгат требует интернализации для своей активности. В ADC антитело функционирует в качестве нацеливающего агента для направления ADC в клетку-мишень, экспрессирующую его антиген, такой как антиген в раковой клетке. В этом случае антиген может быть антигеном, ассоциированным с опухолью, т.е. антигеном, который уникально экспрессируется или сверхэкспрессируется раковой клеткой. Оказавшись там, лекарственное средство высвобождается либо внутри клетки-мишени, либо в ее окрестностях, чтобы действовать в качестве терапевтического агента. Для обзора механизма действия и использования ADC в терапии рака, см. Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.

Для лечения рака терапевтический агент или лекарственное средство ADC предпочтительно представляют собой цитотоксическое лекарственное средство, которое вызывает гибель целевой раковой клетки. Цитотоксические лекарственные средства, которые можно использовать в ADC, включают следующие типы соединений и их аналогов и производных:

(a) енедиины, такие как калихеамицин (см., например, Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 и 3466) и унциаламицин (см., например, Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007) и Chowdari et al., US 8709431 B2 (2012);

(b) тубулизины (см., например, Domling et al., US 7778814 B2 (2010); Cheng et al., US 8394922 B2 (2013) и Cong et al., US 2014/0227295 A1;

(c) CC-1065 и дуокармицин (см., например, Boger, US 6545530 B1 (2003); Sufi et al., US 8461117 B2 (2013) и Zhang et al., US 2012/0301490 Al (2012));

(d) эпотилоны (см., например, Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007) и US RE42930 E (2011));

(e) ауристатины (см., например, Senter et al., US 6844869 B2 (2005) и Doronina et al., US 7498298 B2 (2009));

(f) димеры пирролобезодиазепина (PBD) (см., например, Howard et al., US 2013/0059800 A1 (2013); US 2013/0028919 A1 (2013) и WO 2013/041606 A1 (2013));

(g) мейтансиноиды, такие как DM1 и DM4 (см., например, Chari et al., US 5208020 (1993) и Amphlett et al., US 7374762 B2 (2008)).

В ADC антитело и терапевтический агент могут быть конъюгированы через линкер, например, расщепляемый линкер, такой как пептидильный, дисульфидный или гидразоновый линкер. Например, линкер может представлять собой пептидильный линкер, такой как Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser или Glu. ADC могут быть получены, как описано в патентах США №. 7087600; 6989452 и 7129261; публикациях РСТ WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312 и WO 08/103693; патентных публикациях США 20060024317; 20060004081 и 20060247295; описания которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Типичные мишени для ADC, которые могут быть усилены с помощью модифицированной константной области тяжелой цепи, включают В7Н4 (Korman et al., US 2009/0074660 A1); CD19 (Rao-Naik et

- 36 046941 al., 8097703 B2); CD22 (King et al., US 2010/0143368 A1); CD30 (Keler et al., US 7387776 B2 (2008); CD70 (Terrett et al., US 8124738 B2); CTLA-4 (Korman et al., US 6984720 B1 (2006)); PD-1 (Korman et al., US 8008449 B2 (2011); PSMA (Huang et al., US 2009/0297438 A1 и Cardarelli et al., US 8875278 B2); PTK7 (Terrett et al., US 2010/0034826 A1); глипикан-3 (Terrett et al., US 2010/0209432 (A1)), RG1 (Harkins et al., US 7335748 B2 (2008)), мезотелин (Terrett et al., US 8268970 B2 (2012)) и CD44 (Xu et al., US 2010/0092484 A1).

Модифицированные константные домены тяжелой цепи также могут быть частью антител для применений вне онкологии, например при иммунологических заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, волчанка и т.д.

Модифицированные константные домены тяжелой цепи также могут быть слиты с молекулами, не являющимися антителами (или вариантами антител) или их фрагментами, и могут быть слиты с любым полипептидом, который нуждается в присутствии Fc. Модифицированный константный домен тяжелой цепи может быть слит с антигенсвязывающим фрагментом антитела, как дополнительно определено в настоящем документе (например, в разделе Определения).

В определенных вариантах выполнения изобретения константный домен тяжелой цепи или его часть, содержащая мутацию Р238К, которая лишена определенной эффекторной функции, слит с полипептидом, например, частью тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента антитела. Как дополнительно описано в настоящем документе, Fc IgG, например IgG1, содержащий мутацию Р238К и содержащий, например, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 198, может быть слит с вариабельным доменом тяжелой цепи антитела, где антитело связывается с любой мишенью, например, целевым белком, описанным в настоящем документе (например, CD40 или CD40L). Fc IgG1 с мутацией Р238К (например, IgG1 fa P238K, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198 или в контексте IgG1, имеющего аллотип f), можно использовать в любом антителе или с любым его антигенсвязывающим фрагментом, для которого эффекторная функция, в частности, связывание с FcyRs CD32a, CD32b и CD16a, нежелательна. В дополнение к Р238К константная область тяжелой цепи может содержать дополнительные 1 или 2 мутации, например замены, которые уменьшают связывание с FcyR CD64, или Р238К может использоваться в контексте шарнира IgG2, например шарнира IgG2, содержащего C219S, как дополнительно описано в настоящем документе.

III. Способы модификации биологической активности антител.

В настоящем документе представлены способы усиления биологической активности определенных антител, таких как одна или несколько из следующих биологических активностей:

(a) повышенная или измененная интернализация клеткой;

(b) повышенная или измененная агонистическая активность;

(c) повышенная или измененная антагонистическая или блокирующая активность;

(d) усиленная или пониженная ADCC;

(d) создание нового свойства;

(e) повышенная или измененная трансдукция сигнала;

(g) усиление кластеризации или олигомеризации молекулы-мишени клеточной поверхности;

Способ усиления биологической активности антитела может включать замену константной области тяжелой цепи или ее части, например шарнира и/или домена CH1, модифицированной константной областью тяжелой цепи или ее частью, например шарниром IgG2 и/или доменом C_H1 IgG2.

В определенных вариантах выполнения изобретения способ улучшения биологической активности антитела включает (i) предоставление антитела, которое не содержит модифицированной константной области тяжелой цепи, как описано в настоящем документе; и (ii) замену константной области тяжелой цепи антитела модифицированной константной областью тяжелой цепи или ее частью, которая усиливает биологическую активность антитела. В определенных вариантах выполнения изобретения способ улучшения биологической активности антитела включает (i) предоставление антитела, которое содержит шарнир, не относящийся к IgG2 (например, шарнир IgG1, шарнир IgG3 или шарнир IgG4); и (ii) замену шарнира, не относящегося к IgG2, антитела на шарнир IgG2. В определенных вариантах выполнения изобретения способ улучшения биологической активности антитела включает (i) предоставление антитела, которое содержит неусиливающий шарнир IgG2; и (ii) замену неусиливающего шарнира IgG2 антитела на шарнир IgG2. Неусиливающий шарнир IgG2 представляет собой вариант шарнира IgG2, который отличается от шарнира IgG2 тем, что он больше не обладает необходимой характеристикой для усиления биологической активности антитела, например, вариант шарнира, который больше не имеет жесткости шарнира IgG2 дикого типа.

Типичные способы усиления биологической активности антитела включают (i) предоставление антитела, которое содержит шарнир, не относящийся к IgG2, или неусиливающий шарнир IgG2, и (ii) замену шарнира шарниром, содержащим SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 или 137 или их варианты,

- 37 046941 например варианты, описанные в настоящем документе. Способы усиления биологической активности антитела могут также включать (i) предоставление антитела, которое содержит константную область тяжелой цепи, которая не является модифицированной константной областью тяжелой цепи, и (ii) замену константной области тяжелой цепи модифицированной константой областью тяжелой цепи. Замена константной области тяжелой цепи может включать замену домена CH1, шарнира, CH2 и/или CH3. Например, константная область тяжелой цепи может быть модифицирована путем замены шарнира на шарнир IgG2 или его вариант и/или путем замены домена CH1 на домен CH1 IgG1 или IgG2 или его вариант. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир заменяется шарниром IgG2, а домен CH2 заменяется доменом CH2 IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир заменяется шарниром IgG2, а домен CH3 заменяется доменом IgG1 CH3. В определенных вариантах выполнения изобретения шарнир заменяется шарниром IgG2, CH1 заменяется шарниром IgG2, домен CH2 заменяется доменом CH2 IgG1, a домен CH3 заменяется доменом CH3 IgG1. В определенных вариантах выполнения изобретения константная область тяжелой цепи заменяется модифицированными областями 1-27 тяжелой цепи, указанными в приведенной выше табл. 5, или константными областями тяжелой цепи, представленными в табл. 6 или описанными в настоящем документе.

В настоящем документе также представлены способы усиления биологической активности антитела IgG1 или IgG2, включающие удаление 1-10 аминокислот в шарнире IgG1 или IgG2 антитела соответственно. Например, одна или несколько аминокислот S219, С22, D221, К222, Т223, Н224 и Т225 могут быть удалены. В одном варианте выполнения изобретения все аминокислоты S219, С22, D221, K222, Т223, Н224 и Т225 удалены.

Кроме того, изобретение относится к способам получения и предоставления безэффекторных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, например, путем мутации Р238, например в Р238К, для устранения или снижения эффекторной функции антитела.

В определенных вариантах выполнения изобретения замена константной области тяжелой цепи антитела, например, для модификации его биологической активности, не сопровождается снижением или значительным снижением его активности связывания с антигеном-мишенью. Как описано в примерах, замена константной области тяжелой цепи антител к GITR и против CD73 существенно не изменяла их аффинность к человеческим антигенам GITR и CD73 соответственно.

Понятно, что при ссылке на замену домена определенного изотипа тем же доменом другого изотипа или доменом, включающим мутацию, например мутацию Р238, нет необходимости буквально заменять домен, а, скорее, это может быть необходимо только для изменения аминокислот, которые различаются между двумя изотипами.

Стандартные анализы для оценки способности антител связываться с антигеном различных видов известны в данной области и дополнительно описаны в настоящем документе и включают, например, ELISA, Вестерн-блоты и RIA. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Кинетика связывания (например, аффинность связывания) антител также может быть оценена с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как анализ BIACORE® SPR. Анализы для оценки свойств антител, имеющих модифицированные константные области (например, связывание лиганда, пролиферация Т-клеток, продуцирование цитокинов), более подробно описаны ниже и в примерах.

Типичные антитела, которые могут быть модифицированы, как описано в настоящем документе, включают, например, антитела для лечения рака, такие как Yervoy™ (ипилимумаб) или Тремелимумаб (к CTLA-4), галиксимаб (к В7.1), BMS-936558 (к PD-1)), СТ-011 (к PD-1), MK-3475 (к PD-1), AMP224 (к B7DC), BMS-936559 (к В7-Н1), MPDL3280A (к В7-Н1), MEDI-570 (к ICOS), AMG557 (к В7Н2), MGA271 (к В7Н3), IMP321 (к LAG-3), BMS-663513 (к CD137), PF-05082566 (к CD137), CDX-1127 (к CD27), к ОХ40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (к OX40L), Атацицепт (к TACI), CP-870893 (к CD40), Люкатумумаб (к CD40), Дацетузумаб (к CD40), Муромонаб-CD3 (к CD3), Ипилумумаб (к CTLA-4).

Другие антитела, которые можно модифицировать, как описано в настоящем документе, включают антагонистические антитела к PD-1 и PD-L1. Типичным антителом против PD-1, которое можно модифицировать, как описано в настоящем документе, является ниволумаб (BMS-936558); антитело, которое содержит CDR или вариабельные области одного из антител 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 7D3, 5F4 и 4А11, описанных в WO 2006/121168; MK-3475 (Ламбролизумаб), описанный в WO 2012/145493; АМР-514, описанный в WO 2012/145493; СТ-011 (Пидилизумаб; ранее CT-AcTibody или ВАТ; см., например, Rosenblatt et al. (2011), J. Immunotherapy 34:409); раскрытые в WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, WO 2013/173223, патентах США № 7635757 и 8217149 и патентной публикации США № 2009/0317368.

Другие антитела, которые могут быть модифицированы, включают антитела против PD-L1, например BMS-936559 (обозначается как 12А4 в WO 2007/005874 и патенте США № 7943743); антитело, которое содержит CDR или вариабельные области 3G10, 12А4, 10А5, 5F8, 10Н10, 1В12, 7Н1, 11Е6, 12В7 и 13G4, которое описано в публикации РСТ WO 2007/005874 и патенте США № 7943743; MEDI4736 (также известное как ЛпЦ-В7-Н1); MPDL3280A (также известное как RG7446); любое из антител против

- 38 046941

PD-L1, раскрытое в WO 2013/173223, WO 2011/066389, WO 2012/145493, патентах США № 7635757 и 8217149 и публикации США № 2009/145493.

Другие антитела, которые могут быть модифицированы, включают антитела против CTLA-4, например Yervoy™ (ипилимумаб или антитело 10D1, описанное в публикации РСТ WO 01/14424); тремелимумаб (ранее тицилимумаб, СР-675,206); моноклональное или антитело против CTLA-4, описанное в любой из следующих публикаций: WO 98/42752; WO 00/37504; патент США № 6207156; Hurwitz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004), J. Clin. Oncology, 22(145):Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); и Mokyr et al. (1998), Cancer Res. 58:5301-5304; и любое из антител к CTLA-4, раскрытых в WO 2013/173223.

Другие антитела, которые могут быть модифицированы, включают антитела против LAG-3, например BMS-986016; IMP731, описанные в US 2011/007023; и IMP-321.

Другие антитела, которые могут быть модифицированы, включают антитела-агонисты к GITR, например антитело 6С8 к GITR или его гуманизированные варианты, описанные в WO 2006/105021; антитело, описанное в WO 2011/028683; и антитело, описанное в JP2008278814.

Антитела, которые нацелены на другие антигены, в том числе описанные в другом месте настоящего документа, также могут быть модифицированы. Например, антитела против Her2, которые требуют интернализации, например трастузумаб (Herceptin), могут быть модифицированы, как описано в настоящем документе.

IV. Дополнительные модификации константного домена тяжелой цепи.

В дополнение к описанным в настоящем документе модификациям антител для усиления их биологической активности или снижения эффекторной функции могут быть внесены дополнительные мутации, например, в CH1, шарнир, домен CH2 или CH3, например, для дополнительного снижения эффекторной функции, связывания с FcyR и/или стабильности антител. Например, любая из описанных в настоящем документе модификаций, например ниже, может быть объединена с мутацией Р238, например Р238К, такой как в IgG1 или гибриде IgG1-IgG2 Fc или их части.

Fc и модифицированные Fc.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать Fc, включающий одну или несколько модификаций, обычно для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность. Например, можно вносить модификации в область Fc, чтобы генерировать вариант Fc с (а) повышенной или пониженной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC), (b) повышенной или пониженной опосредованной комплементом цитотоксичностью (CDC), (с) повышенной или пониженной аффинностью к C1q и/или (d) повышенной или пониженной аффинностью к рецептору Fc относительно исходного Fc. Такие варианты области Fc будут обычно содержать по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в области Fc. Считается, что объединение модификаций аминокислот является особенно желательным. Например, вариант области Fc может включать две, три, четыре, пять и т.д. замены, например, определенных положений области Fc, определенных в настоящем документе. Типичные варианты последовательности Fc раскрыты в настоящем документе и также представлены в патентах США № 5624821; 6277375; 6737056; 6194551; 7317091; 8101720; патентных публикациях РСТ WO 00/42072; WO 01/58957; WO 2004/016750; WO 2004/029207; WO 2004/035752; WO 2004/074455; WO 2004/099249; WO 2004/063351; WO 2005/070963; WO 2005/040217, WO 2005/092925 и WO 2006/020114.

Снижение эффекторной функции.

Активность ADCC может быть уменьшена путем модификации области Fc. В определенных вариантах выполнения изобретения сайты, которые влияют на связывание с рецепторами Fc, могут быть удалены (например, путем мутации), предпочтительно, сайты, отличные от сайтов связывания с рецептором реутилизации. В других вариантах выполнения изобретения область Fc может быть модифицирована для удаления сайта ADCC. Сайты ADCC известны в данной области; см., например, Sarmay et al. (1992), Molec. Immunol. 29(5):633-9 в отношении сайтов ADCC в IgG1. В одном варианте выполнения изобретения вариант G236R и L328R человеческого IgG1 эффективно устраняет связывание с FcyR. Horton et al. (2011), J. Immunol. 186:4223 и Chu et al. (2008), Mol. Immunol. 45:3926. В других вариантах выполнения изобретения Fc, имеющий пониженное связывание с FcyR, содержит аминокислотные замены L234A, L235E и G237A. Gross et al. (2001), Immunity, 15:289.

Активность CDC также может быть снижена путем модификации области Fc. Мутации в положениях D270, K322, Р329 и Р331 IgG1, в частности мутации аланина D270A, К322А, Р329А и Р331А, значительно снижают способность соответствующего антитела связывать C1q и активировать комплемент. Idusogie et al. (2000), J. Immunol. 164:4178; WO 99/51642. Было показано, что модификация положения 331 IgG1 (например, P331S) снижает связывание с комплементом. Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661 и Canfield & Morrison (1991), J. Exp. Med. 173:1483. В другом примере один или несколько аминокислотных остатков в аминокислотных положениях с 231 по 239 изменены, чтобы тем самым уменьшить способность антитела фиксировать комплемент. WO 94/29351.

- 39 046941

В некоторых вариантах выполнения изобретения Fc с уменьшенной фиксацией комплемента имеет аминокислотные замены A330S и P331S. Gross et al. (2001), Immunity, 15:289.

Для применений, в которых следует избегать эффекторной функции, например, когда только связывание антигена достаточно для получения желаемого терапевтического эффекта, а эффекторная функция лишь приводит (или увеличивает риск) к нежелательным побочным эффектам, могут использоваться антитела IgG4 или могут быть созданы антитела или фрагменты, в которых отсутствует область Fc или ее существенная часть, или Fc может быть мутирован для полного устранения гликозилирования (например, N297A). Альтернативно, была создана гибридная конструкция человеческого IgG2 (домен CH1 и шарнирная область) и человеческого IgG4 (домены CH2 и CH3), которая лишена эффекторной функции, лишена способности связываться с FcyR (подобно IgG2) и неспособна активировать комплемент (подобно IgG4). Rother et al. (2007), Nat. Biotechnol. 25:1256. См. также Mueller et al. (1997), Mol. Immunol. 34:441; Labrijn et al. (2008), Curr. Op. Immunol. 20:479 (обсуждение модификаций Fc для снижения эффекторной функции в целом).

В других вариантах выполнения изобретения область Fc изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, чтобы уменьшить всю эффекторную функцию(ии) антитела. Например, одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно заменить другим аминокислотным остатком так, что антитело имеет пониженную аффинность к эффекторному лиганду, но сохраняет антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, к которому изменяется аффинность, может представлять собой, например, рецептор Fc (остатки 234, 235, 236, 237, 297) или компонент С1 комплемента (остатки 297, 318, 320, 322), патенты США № 5624821 и 5648260, оба авторства Winter et al.

В WO 88/007089 предложены модификации IgG в области Fc для уменьшения связывания с FcyRI, для уменьшения ADCC (234A; 235Е; 236А; G237A) или блокирования связывания с компонентом G1q комплемента для устранения CDC (Е318А или V/K320A и K322A/Q). См. также Duncan & Winter (1988), Nature, 332:563; Chappel et al. (1991), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 88:9036; и Sondermann et al. (2000), Nature, 406:267 (обсуждается влияние этих мутаций на связывание с FcyRIII).

Модификации Fc, снижающие эффекторную функцию, также включают замены, вставки и делеции в положениях 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 и 328, такие как 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L и 328R. Вариант Fc может содержать 236R/328R. Другие модификации для уменьшения взаимодействий FcyR и комплемента включают замены 297А, 234А, 235А, 237А, 318А, 228Р, 236Е, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233Р и 234V. Эти и другие модификации рассмотрены в Strohl (2009), Current Opinion in Biotechnology, 20:685-691. Эффекторные функции (как ADCC, так и активация комплемента) могут быть снижены при поддержании связывания с неонатальным FcR (поддержание периода полужизни) путем мутации остатков IgG в одном или нескольких положениях 233-236 и 327-331, таких как Е233Р, L234V, L235A необязательно G236A, A327G, A330S и P331S в IgG1; E233P, F234V, L235A, необязательно G236A в IgG4; и A330S и P331S в IgG2. См. Armour et al. (1999), Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572. Другие мутации, которые снижают эффекторную функцию, включают L234A и L235A в IgG1 (Alegre et al. (1994), Transplantation, 57:1537); V234A и G237A в IgG2 (Cole et al. (1997), J. Immunol. 159:3613; см. также патент США № 5834597); и S228P и L235E для IgG4 (Reddy et al. (2000), J. Immunol. 164:1925). Другая комбинация мутаций для снижения эффекторной функции человеческого IgG1 включает L234F, L235E и P331S. Oganesyan et al. (2008), Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700. См., в целом, Labrijn et al. (2008), Curr. Op. Immunol. 20:479. Обнаружено, что дополнительными мутациями, снижающими эффекторную функцию в контексте слитого белка Fc (IgG1) (абатацепт), являются C226S, C229S и P238S (нумерация остатков по EU). Davis et al. (2007), J. Immunol. 34:2204.

Другие варианты Fc, имеющие пониженную ADCC и/или CDC, описаны у в Glaesner et al. (2010), Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287 (F234A и L235A для уменьшения ADCC и ADCP в IgG4); Hutchins et al. (1995), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 92:11980 (F234A, G237A и Е318А в IgG4); An et al. (2009), MAbs, 1:572 и публикации патентной заявки США 2007/0148167 (H268Q, V309L, A330S и P331S в IgG2); McEarchern et al. (2007), Blood, 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235A в IgGl); Vafa et al. (2014), Methods, 65:114 (V234V, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S в IgG2).

В определенных вариантах выполнения изобретения выбран Fc, который по существу не имеет эффекторной функции, т.е. он имеет пониженное связывание с FcyR и пониженную фиксацию комплемента. Типичный Fc, например, Fc IgG1, который не содержит эффекторов, содержит следующие пять мутаций: L234A, L235E, G237A, A330S и P331S. Gross et al. (2001), Immunity, 15:289. Эти пять замен могут быть объединены с N297A, чтобы также устранить гликозилирование.

Усиление эффекторной функции.

Альтернативно, активность ADCC может быть увеличена путем модификации области Fc. Что касается активности ADCC, человеческий IgG1>IgG3>>IgG4>IgG2, так что константная область IgG1, а не IgG2 или IgG4, может быть выбрана для применения в лекарственном средстве, где требуется ADCC. Альтернативно, область Fc может быть модифицирована для повышения антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или для повышения сродства к рецептору Fcy путем модификации одной или

- 40 046941 нескольких аминокислот в следующих положениях: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245,247,

248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285,286,

289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325,326,

327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416,419,

430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 или 439. См. WO 2012/142515; см. также WO 00/42072. Типичные замены включают 236А, 239D, 239Е, 268D, 267Е, 268Е, 268F, 324Т, 332D и 332Е. Типичные варианты включают 239D/332E, 236А/332Е, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267Е/324Т и 267E/268F/324T. Например, было показано, что человеческие IgG1Fc, содержащие вариант G236A, который может необязательно комбинироваться с I332E, увеличивают отношение аффинности связывания FcyIIA/FcyIIB приблизительно в 15 раз. Richards et al. (2008), Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010), mAbs 2:181. Другие модификации для усиления взаимодействия FcyR и комплемента включают, но не ограничиваются ими, замены 298А, 333А, 334А, 326А, 247I, 339D, 339Q, 280Н, 290S, 298D, 298V, 243L, 292Р, 300L, 396L, 305I и 396L. Эти и другие модификации рассмотрены в Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. В частности, и ADCC, и CDC могут быть усилены путем изменений в положении Е333 IgG1, например, Е333А. Shields et al. (2001), J. Biol. Chem. 276:6591. Использование мутаций Р2471 и A339D/Q для усиления эффекторной функции в IgG1 раскрыто в WO 2006/020114, a D280H, K290S ± S298D/V раскрыто в WO 2004/074455. Было показано, что варианты K326A/W и E333A/S усиливают эффекторную функцию в человеческом IgG1 и E333S в IgG2. Idusogie et al. (2001), J. Immunol. 166:2571.

В частности, были картированы сайты связывания на человеческом IgG1 для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn, и были описаны варианты с улучшенным связыванием. Shields et al. (2001), J. Biol. Chem. 276:6591-6604. Было показано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcyRIII, включая комбинационные мутанты T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A (имеющие усиленные связывание с FcYRIIIa и активность ADCC). Были идентифицированы другие варианты IgG1 с сильно усиленным связыванием с FcYRIIIa, включая варианты с мутациями S239D/I332E и S239D/I332E/A330L, которые показали наибольшее увеличение сродства к FcYRIIIa, снижение связывания FcYRIIb и сильную цитотоксическую активность у яванских макаков. Lazar et al. (2006), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 103:4005; Awan et al. (2010), Blood, 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011), Exp. Cell Res. 317:1278. Введение тройных мутаций в антитела, такие как алемтузумаб (CD52-специфическое), трастузумаб (HER2/neu-специфическое), ритуксимаб (CD20специфическое) и цетуксимаб (EGFR-специфическое), транслировалось в значительно усиленную активность ADCC in vitro, и вариант S239D/I332E показал усиленную способность истощать В-клетки у обезьян. Lazar et al. (2006), Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 103:4005. Кроме того, были идентифицированы мутанты IgG1, содержащие мутации L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L, которые проявляли усиленное связывание с FcYRIIIa и одновременно усиленную активность ADCC у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий FcYRIIIa, в моделях злокачественных опухолей В-клеток и рака молочной железы. Stavenhagen et al. (2007), Cancer Res. 67:8882; патент США № 8,652,466; Nordstrom et al. (2011), Breast Cancer Res. 13:R123.

Различные изотипы IgG также проявляют дифференциальную активность CDC (IgG3>IgG1>>IgG2»IgG4). Dangl et al. (1988), EMBO J. 7:1989. Для применений, в которых требуется усиленная CDC, также возможно введение мутаций, которые увеличивают связывание с C1q. Способность рекрутировать комплемент (CDC) может быть усилена мутациями в K326 и/или Е333 в IgG2, такими как K326W (которая снижает активность ADCC) и E333S, для повышения связывания с Clq, первым компонентом каскада комплемента. Idusogie et al. (2001), J. Immunol. 166:2571. Введение S267E / H268F / S324T (отдельно или в любой комбинации) в человеческий IgG1 усиливает связывание с C1q. Moore et al. (2010), mAbs 2:181. Область Fc гибридного IgG1/IgG3 изотипического антитела 113F согласно Natsume et al. (2008), Cancer Res. 68:3863 (фиг. 1) также обеспечивает усиленную CDC. См. также Michaelsen et al. (2009), Scand. J. Immunol. 70:553 и Redpath et al. (1998), Immunology, 93:595.

Дополнительные мутации, которые могут увеличивать или уменьшать эффекторную функцию, описаны в Dall'Acqua et al. (2006), J. Immunol. 177:1129. См. также Carter (2006), Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008), Curr. Op. Immunol. 20:460.

Варианты Fc, которые усиливают аффинность к ингибирующему рецептору FcYRIIb, также можно использовать, например, для усиления индуцирующей апоптоз или адъювантной активности. Li & Ravetch (2011), Science 333:1030; Li & Ravetch (2012), Proc. Nat'l. Acad. Sci (USA), 109:10966; публикация патентной заявки США 2014/0010812. Такие варианты могут обеспечивать антитело с иммуномодулирующими активностями, связанными с клетками FcYRllb⁺, включая, например, В-клетки и моноциты. В одном варианте выполнения изобретения варианты Fc обеспечивают селективно усиленную аффинность к FcYRIIb относительно одного или нескольких активирующих рецепторов. Модификации для изменения связывания с FcYRIIb включают одну или несколько модификаций в положении, выбранном из группы, состоящей из 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 и 332 в соответствии с индексом EU. Типичные замены для усиления аффинности FcYRIIb включают, но не ограничиваются ими, 234D, 234Е, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239Е, 266М, 267D, 267Е,

- 41 046941

268D, 268Е, 327D, 327Е, 328F, 328W, 328Y и 332Е. Типичные замены включают 235Y, 236D, 239D, 266М, 267Е, 268D, 268Е, 328F, 328W и 328Y. Другие варианты Fc для усиления связывания с FcYRIIb включают 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267Е/268Е и 267E/328F. В частности, варианты S267E, G236D, S239D, L328F и I332E, включая двойной вариант S267E + L328F, человеческого IgG1 имеют особое значение для специфического усиления сродства к ингибирующему рецептору FcYRIIb. Chu et al. (2008), Mol. Immunol. 45:3926; публикация патентной заявки США 2006/024298; WO 2012/087928. Усиленная специфичность для FcYRIIb (в отличие от FcYRIIaR131) может быть получена путем добавления замены P238D. Mimoto et al. (2013), Protein. Eng. Des. & Selection, 26:589; WO 2012/115241.

Г ликозилирование.

Г ликозилирование антитела модифицируется для увеличения или уменьшения эффекторной функции. Например, может быть получено агликозилированное антитело, которому не хватает всей эффекторной функции, путем мутации консервативного остатка аспарагина в положении 297 (например, N297A), тем самым устраняя связывание комплемента и FcyRI. Bolt et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23:403. См. также Тао & Morrison (1989), J. Immunol. 143:2595 (применение N297Q в IgG1 для устранения гликозилирования в положении 297).

Хотя у агликозилированных антител обычно отсутствует эффекторная функция, могут быть введены мутации для восстановления этой функции. Агликозилированные антитела, например антитела, полученные в результате мутаций N297A/C/D/ или Н или продуцируемые в системах (например, E.coli), которые не гликозилируют белки, могут быть дополнительно мутированы для восстановления связывания FcyR, например S298G и/или T299A/G, или Н (WO 2009/079242), или E382V и M428I (Jung et al. (2010), Proc. Nat'l. Acad. Sci (USA), 107:604).

Кроме того, антитело с усиленной ADCC может быть получено путем изменения гликозилирования. Например, было показано, что удаление фукозы из Asn297-связанных олигосахаридов с тяжелой цепью усиливает ADCC, основываясь на улучшенном связывании с FcYRIIIa. Shields et al. (2002), JBC, 277:26733; Niwa et al. (2005), J. Immunol. Methods 306:151; Cardarelli et al. (2009), Clin. Cancer Res. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010), Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342). Такие антитела с низким содержанием фукозы могут продуцироваться, например, в нокаутированных клетках яичника Китайского хомяка (CHO), лишенных фукозилтрансферазы (FUT8) (Yamane-Ohnuki et al. (2004), Biotechnol. Bioeng. 87:614) или в других клетках, которые генерируют афукозилированные антитела. См., например, Zhang et al. (2011), mAbs, 3:289 и Li et al. (2006), Nat. Biotechnol. 24:210 (оба описывают продуцирование антител в гликосконструированных Pichia pastoris); Mossner et al. (2010), Blood, 15:4393; Shields et al. (2002), J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003), J. Biol. Chem. 278:3466; ЕР 1176195В1. ADCC также может быть усилено, как описано в публикации РСТ WO 03/035835, где раскрыто использование варианта клеточной линии CHO, Lec13, с пониженной способностью присоединять фукозу к связанным с Asn(297) углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также Shields, R.L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277:2673326740). Альтернативно, аналоги фукозы могут быть добавлены в культуральную среду во время продуцирования антитела для того, чтобы ингибировать включение фукозы в углевод в антителе. WO 2009/135181.

Увеличение бисектирования структур GlcNac в связанных с антителами олигосахаридах также усиливает ADCC. В публикации РСТ WO 99/54342 Umana et al. описываются клеточные линии, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-Ыацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)) так, что антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, проявляют повышенное бисектирование структур GlcNac, что приводит к увеличению активности ADCC антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

Были разработаны дополнительные варианты гликозилирования, которые не содержат остатков галактозы, сиаловой кислоты, фукозы и ксилозы (так называемые гликоформы GNGN), которые демонстрируют усиленые ADCC и ADCP, но сниженную CDC, а также другие, которые не содержат сиаловой кислоты, фукозы и ксилозы (так называемые гликоформы G1/G2), которые демонстрируют усиленные ADCC, ADCP и CDC. публикация патентной заявки США № 2013/0149300. Антитела, имеющие эти паттерны гликозилирования, необязательно продуцируются в генетически модифицированных растениях N. benthamiana, у которых эндогенные ксилозильные и фукозилтрансферазные гены были нокаутированы.

Гликоконструирование также может быть использовано для модификации противовоспалительных свойств конструкции IgG путем изменения содержания а2,6-сиалила в углеводных цепях, присоединенных в Asn297 областей Fc, где увеличение доли а2,6-сиалированных форм приводит к усилению противовоспалительных эффектов. См. Nimmerjahn et al. (2008), Ann. Rev. Immunol. 26:513. И наоборот, снижение доли антител, имеющих а2,6-сиалированные углеводы, может быть полезным в тех случаях, когда противовоспалительные свойства не нужны. Способы модификации содержания а2,6-сиалированных антител, например, путем селективной очистки 2,6-сиалированных форм или путем ферментативной мо

- 42 046941 дификации раскрыты в публикации патентной заявки США № 2008/0206246. В других вариантах выполнения изобретения аминокислотная последовательность области Fc может быть модифицирована так, чтобы имитировать эффект а2,6-сиалирования, например, путем включения модификации F241A. WO 2013/095966.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Такие сайты гликозилирования могут приводить к повышенной иммуногенности антитела или изменению pK антитела вследствие измененного связывания антигена (Marshall et al. (1972), Annu Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004), J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al. (1988), J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002), Glycobiology, 12:43R56R; Parekh et al. (1985), Nature, 316:452-7; Mimura et al. (2000), Mol. Immunol. 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T.

Биологический период полужизни.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело модифицировано для повышения его биологического периода полужизни. Возможны разные подходы, например, это может быть сделано путем повышения аффинности связывания области Fc для FcRn. В одном варианте выполнения изобретения антитело изменяют в пределах области CH1 или CL так, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора реутилизации, взятый из двух петель домена C_H2 области Fc IgG, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022 Presta et al. Другие типичные варианты Fc, которые увеличивают связывание с FcRn и/или улучшают фармакокинетические свойства, включают замены в положениях 259, 308 и 434, включая, например, 259I, 308F, 428L, 428М, 434S, 434Н, 434F, 434Y и 434М. Другие варианты, которые увеличивают связывание Fc с FcRn, включают 250Е, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216, Hinton et al. 2006, Journal of Immunology, 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 311A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Del' Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall' Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry, 281:23514-23524). См. патент США № 8367805.

В качестве способа повышения сродства к FcRn была предложена модификация некоторых консервативных остатков в Fc IgG (I253/H310/Q311/H433/N434), таких как вариант N434A (Yeung et al. (2009), J. Immunol. 182:7663), тем самым увеличивая период полужизни антитела в кровотоке. WO 98/023289. Было показано, что комбинированный вариант Fc, включающий M428L и N434S, увеличивает связывание FcRn и увеличивает период полужизни в сыворотке вплоть до пяти раз. Zalevsky et al. (2010), Nat. Biotechnol. 28:157. Комбинированный вариант Fc, содержащий модификации Т307А, Е380А и N434A, также увеличивает период полужизни антител IgG1. Petkova et al. (2006), Int. Immunol. 18:1759. Кроме того, было показано, что комбинированные варианты Fc, содержащие варианты M252Y/M428L, M428L/N434H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M и M428L/N434S, увеличивают период полужизни, WO 2009/086320.

Кроме того, вариант Fc комбинации, включающей M252Y, S254T и Т256Е, увеличивает период полужизни почти в 4 раза. Dall' Acqua et al. (2006), J. Biol. Chem. 281:23514. Связанная модификация IgG1, обеспечивающая повышенное аффинность к FcRn, но сниженную зависимость от рН (M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F), была использована для создания конструкции IgG1 (MST-HN Abdeg) для применения в качестве конкурента для предотвращения связывания других антител с FcRn, что приводит к увеличению клиренса этого другого антитела, либо эндогенного IgG (например, в аутоиммунной среде), либо другого экзогенного (терапевтического) mAb. Vaccaro et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:1283; WO 2006/130834.

Другие модификации для повышения связывания с FcRn описаны в Yeung et al. (2010), J. Immunol. 182:7663-7671; патентах США № 6277375; 6821505; WO 97/34631; WO 2002/060919.

В определенных вариантах выполнения изобретения гибридные изотипы IgG могут быть использованы для повышения связывания с FcRn и потенциально для повышения периода полужизни. Например, гибридный вариант IgG1/IgG3 может быть сконструирован путем замены положений IgG1 в области CH2 и/или C_H3 аминокислотами из IgG3 в положениях, где два изотипа различаются. Таким образом, может быть сконструировано гибридное вариантное антитело IgG, которое содержит одну или несколько замен, например, 274Q, 276K, 300F, 339Т, 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М, 422I, 435R и 436F. В других вариантах выполнения изобретения, описанных в настоящем документе, гибридный вариант IgG1/IgG2 может быть сконструирован путем замены положений IgG2 в области C_H2 и/или C_H3 аминокислотами из IgG1 в положениях, где два изотипа различаются. Таким образом, может быть сконструировано гибридное вариантное антитело IgG, которое включает одну или несколько замен, например, одну или несколько следующих аминокислотных замен: 233Е, 234L, 235L, -236G (что относится к вставке глицина в положении 236), и 327А. См. Пат. США № 8,629,113. Был создан гибрид последовательностей IgG1/IgG2/IgG4, который предположительно увеличивает период полужизни в сыворотке и улучшает экспрессию, патент США № 7867491 (в нем порядковый номер 18).

Период полужизни в сыворотке антител по настоящему изобретению также может быть увеличен путем пэгилирования. Антитело может быть пэгилировано, например, для повышения биологического

- 43 046941 (например, сывороточного) периода полужизни антитела. Для пэгилирования антитела антитело или его фрагмент обычно подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолевым (ПЭГ) реагентом, таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или несколько групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пэгилирование проводят посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Используемый в настоящем документе термин полиэтиленгликоль предназначен для охвата любой из форм ПЭГ, которые были использованы для дериватизации других белков, таких как моно (C1-C10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, подлежащее пэгилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы пэгилирования белков известны в данной области и могут применяться к антителам, описанным в настоящем документе. См., например, ЕР 0154316 Nishimura et al. и ЕР 0401384 Ishikawa et al.

Альтернативно, при некоторых обстоятельствах может быть желательно уменьшить период полужизни антитела по настоящему изобретению, а не увеличить его. Модификации, такие как I253A (Hornick et al. (2000), J. Nucl. Med. 41:355) и H435A/R I253A или Н310А (Kim et al. (2000), Em. J. Immunol. 29:2819) в Fc человеческого IgG1 могут уменьшать связывание с FcRn, таким образом уменьшая период полужизни (увеличивая клиренс) для использования в ситуациях, когда предпочтительным является быстрый клиренс, например, при медицинской визуализации. См. также Kenanova et al. (2005), Cancer Res. 65:622. Другие способы усиления клиренса включают форматирование антигенсвязывающих доменов по настоящему изобретению в виде фрагментов антител, не обладающих способностью связываться с FcRn, таких как фрагменты Fab. Такая модификация может сократить период полужизни в кровотоке антитела от пары недель до нескольких часов. Селективное пэгилирование фрагментов антител можно затем использовать для точной настройки (повышения) периода полужизни фрагментов антител, если это необходимо. Chapman et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17:780. Фрагменты антител также могут быть слиты с человеческим сывороточным альбумином, например, в конструкции слитого белка для увеличения периода полужизни. Yeh et al. (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904. Альтернативно, биспецифическое антитело может быть сконструировано с первым антигенсвязывающим доменом по настоящему изобретению и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывается с человеческим сывороточным альбумином (HSA), см. международную патентную заявку WO 2009/127691 и цитируемые там ссылки на патенты. Альтернативно, специализированные полипептидные последовательности могут быть добавлены к фрагментам антител для повышения периода полужизни, например, полипептидные последовательности XTEN. Schellenberger et al. (2009), Nat. Biotechnol. 27:1186; международная публикация патентной заявки WO 2010/091122.

Стабильность.

Потенциальный сайт расщепления протеазой в шарнире конструкций IgG1 может быть устранен модификациями D221G и K222S, увеличивая стабильность антитела, WO 2014/043344.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, описанные в настоящем документе, не содержат сайтов изомерии аспарагина. Деамидирование аспарагина может происходить в последовательностях N-G или D-G и может приводить к образованию остатка изоаспарагиновой кислоты, который может ввести излом в полипептидную цепь и может снизить ее стабильность (эффект изоаспарагиновой кислоты).

Каждое антитело будет иметь уникальную изоэлектрическую точку (pI), которая обычно находится в диапазоне рН от 6 до 9,5. Значение pI для антитела IgG1 обычно находится в диапазоне рН 7-9,5, а значение pI для антитела IgG4 обычно находится в диапазоне рН 6-8. Существует предположение, что антитела с pI вне нормального диапазона могут иметь некоторое разворачивание и нестабильность в условиях in vivo. Таким образом, предпочтительно иметь антитело, которое содержит значение pI, которое находится в нормальном диапазоне. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител с pI в нормальном диапазоне, либо путем мутации заряженных поверхностных остатков.

Каждое антитело будет иметь характерную температуру плавления, причем более высокая температура плавления указывает на большую общую стабильность in vivo (Krishnamurthy R. and Manning M.C. (2002), Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Как правило, предпочтительно, чтобы T_M1 (температура начального разворачивания) была выше чем 60°С, предпочтительно выше чем 65°С, еще более предпочтительно выше чем 70°С.

Температуру плавления антитела можно измерить, используя дифференциальную сканирующую калориметрию (Chen et al. (2003), Pharm. Res. 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999), Immunol. Lett. 68:47-52) или циркулярный дихроизм (Murray et al. (2002), J. Chromatogr. Sci. 40:343-9).

В предпочтительном варианте выполнения изобретения выбираются антитела, которые не деградируют быстро. Деградация антитела может быть измерена с использованием капиллярного электрофореза (СЕ) и MALDI-MS (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995), Anal. Chem. 67:3626-32).

При использовании константного домена IgG4 обычно предпочтительно включать замену S228P, которая имитирует последовательность шарнира в IgG1 и тем самым стабилизирует молекулы IgG4, на

- 44 046941 пример, снижает обмен плечом Fab между терапевтическим антителом и эндогенным IgG4 у пациента, которого лечат. Labrijn et al. (2009), Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000), J. Immunol. 164:1925. Аналогичным образом, в шарнире IgG2, содержащем антитела, мутация C219S и/или C220S стабилизирует антитело, содержащее шарнир IgG2.

Агрегация.

В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения выбирают антитела, которые имеют минимальные агрегационные эффекты, которые могут приводить к запуску нежелательного иммунного ответа и/или измененных или неблагоприятных фармакокинетических свойств. Обычно антитела являются приемлемыми с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, еще более предпочтительно 15% или менее, еще более предпочтительно 10% или менее и еще более предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена несколькими методиками, включая колоночную гельхроматографию (SEC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и рассеяние света.

V. Белки, не принадлежащие к антителам, и производные антител.

Описанное в настоящем документе изобретение также может быть применено к молекулам, которые не являются полноразмерными антителами, при условии, что они содержат шарнир. Например, могут быть получены слитые белки IgG с повышенной биологической активностью или отсутствием эффекторной функции. Соответственно, в настоящем документе представлены слитые белки, содержащие активный фрагмент, связанный, например ковалентно связанный, с константной областью IgG, например областью Fc, содержащей шарнир IgG2 и, необязательно, домены CH2 и CH3 или их части, или связанный с IgG (например, IgG1) или его частью с пониженной эффекторной функцией, например, содержащей мутацию в Р238, например Р238К. Fc может представлять собой любой Fc модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, такой как участки Fc модифицированной константной области тяжелой цепи, указанные в табл. 5, 6 или в таблице последовательностей.

Антитела, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для образования биспецифических молекул или молекул для терапии CAR-T. Антитело или его антигенсвязывающие части могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора) так, чтобы генерировать биспецифическую молекулу, которая связывается по меньшей мере с двумя различными связывающими сайтами или молекулами-мишенями. Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть дериватизированы или связаны более чем с одной другой функциональной молекулой для генерации мультиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями; предполагается, что такие мультиспецифические молекулы также охватываются термином биспецифическая молекула, как используется в настоящем документе. Для того чтобы создать биспецифическую молекулу, антитело, описанное в настоящем документе, может быть функционально связано (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или миметик связывания так, что получается биспецифическая молекула.

VI. Композиции.

Кроме того, изобретение относится к композициям, например, фармацевтическим композициям, содержащим одно или комбинацию антител, или их антигенсвязывающую часть (части), описанные в настоящем документе, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию (например, двух или более разных) антител или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул, описанных в настоящем документе. Например, фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов, или биспецифических агентов), которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени или которые обладают комплементарной активностью.

В определенных вариантах выполнения изобретения композиция содержит антитело, описанное в настоящем документе, в концентрации по меньшей мере 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 1-300 или 100-300 мг/мл.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, также можно вводить в составе комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать антитело, описанное в настоящем документе, в сочетании по меньшей мере с одним другим противораковым и/или стимулирующим Т-клетки (например, активирующим) агентом. Примеры терапевтических агентов, которые могут быть использованы в комбинированной терапии, более подробно описаны ниже в разделе, относящемся к применению антител, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах выполнения изобретения терапевтические композиции, раскрытые в настоящем документе, могут включать другие соединения, лекарственные средства и/или агенты, применяемые для лечения рака. Такие соединения, лекарственные средства и/или агенты могут включать, например, химиотерапевтические лекарственные средства, низкомолекулярные лекарственные средства или антитела, которые стимулируют иммунный ответ на данный рак. В некоторых случаях терапевтические композиции могут включать, например, одно или несколько из антитела к CTLA-4, антитела к PD-1,

- 45 046941 антитела к PDL-1, антитела к ОХ40 (также известного как CD134, TNFRSF4, АСТ35 и/или TXGP1L) или антитела к LAG-3.

Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула, может быть покрыто материалом для того, чтобы защитить соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

Фармацевтические соединения, описанные в настоящем документе, могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет требуемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает нежелательного токсического действия (см., например, Berge, S.M., et al. (1977), J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислот и соли присоединения оснований. Кислотноаддитивные соли включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлороводородная, азотная, фосфорная, серная, бромоводородная, йодоводородная, фосфористая и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамененные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфокислоты и т.п. Основно-аддитивные соли включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N.N'-дибензилэтилендиамин. N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.е; и (3) хелатирующие металл агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в описанных в настоящем документе фармацевтических композициях, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Требуемая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрывающих материалов, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

Эти композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как процедурами стерилизации, supra, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и тому подобных. Кроме того, может быть желательно включать в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть осуществлена путем включения в композицию агентов, которые задерживают абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением тех случаев, когда обычные среды или агент несовместимы с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях возможно. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составить в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящими их смесями. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть осуществлена пу

- 46 046941 тем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например моностеаратных солей и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей фильтрующей микростерилизацией. Обычно дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из предварительно стерильно отфильтрованного раствора.

Количество активного ингредиента, который может быть объединен с материалом-носителем для получения разовой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, который может быть объединен с материалом-носителем для получения разовой лекарственной формы, как правило, будет количеством композиции, которое дает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов это количество будет составлять от около 0,01 до около 99% активного ингредиента, предпочтительно от около 0,1 до около 70%, наиболее предпочтительно от около 1 до около 30 % активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Режимы дозирования регулируют так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить единственный болюс, можно вводить несколько разделенных доз в течение времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с остротой терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно составлять парентеральные композиции в дозированной единичной форме для простоты введения и однородности дозы. Единичная дозированная форма, как используется в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унифицированных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для единичных дозированных форм, описанных в настоящем документе, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который нужно достичь, и (b) ограничений, присущих в данной области техники для компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.

Для введения антитела дозировка составляет от около 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Типичный режим лечения включает введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца или один раз каждые 3-6 месяцев. Предпочтительные схемы дозирования антитела, описанного в настоящем документе, включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела при внутривенном введении, причем антитело вводят с использованием одного из следующих режимов дозирования: (i) каждые четыре недели для шести дозировок, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела один раз, затем 1 мг/кг массы тела каждые три недели.

В некоторых способах два или более моноклональных антител с различной специфичностью связывания вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого вводимого антитела попадает в указанные диапазоны. Антитело обычно вводят несколько раз. Интервалы между однократными дозами могут составлять, например, еженедельно, ежемесячно, каждые три месяца или ежегодно. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровня антител в крови к целевому антигену у пациента. В некоторых способах дозировку регулируют до достижения концентрации антител в плазме около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - около 25-300 мкг/мл.

Антитело можно вводить в виде препарата с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни антитела у пациента. В целом, человеческие антитела показывают самый длинный период полужизни, за которыми следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических целях относительно низкие дозы вводятся с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца своей жизни. В терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая доза с относительно короткими интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не уменьшится или не прекратится и предпочтительно пока пациент не покажет частичное или полное улучшение симптомов заболевания. После этого пациенту может быть назначен профилактический режим.

Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях, описанных в настоящем документе, можно варьировать так, чтобы получить количество активного ингредиента,

- 47 046941 которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность используемых конкретных композиций по настоящему изобретению, или их сложного эфира, соли или амида, способ введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, подлежащего лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Терапевтически эффективная дозировка антитела, описанного в настоящем документе, предпочтительно приводит к уменьшению выраженности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов отсутствия симптомов заболевания или предотвращению нарушения или нетрудоспособности из-за заболевания. В контексте рака терапевтически эффективная доза предпочтительно предотвращает дальнейшее ухудшение физических симптомов, связанных с раком. Симптомы рака хорошо известны в данной области и включают, например, необычные признаки родинки, изменение внешнего вида родинки, включая асимметрию, границу, цвет и/или диаметр, новую пигментированную область кожи, аномальную родинку, затемненную область под ногтем, уплотнения молочной железы, изменения сосков, кисты молочной железы, боль в груди, смерть, потерю массы, слабость, чрезмерную усталость, трудности с питанием, потерю аппетита, хронический кашель, прогрессирование одышки, кашель с кровью, кровь в моче, кровь при дефекации, тошноту, рвоту, метастазы в печени, метастазы в легких, метастазы в костях, ощущение переполнения желудка, вздутие живота, жидкость в брюшной полости, вагинальное кровотечение, запор, вздутие живота, перфорацию толстой кишки, острый перитонит (инфекция, лихорадка, боль), боль, рвоту кровью, сильное потоотделение, лихорадку, высокое кровяное давление, анемию, диарею, желтуху, головокружение, озноб, мышечные спазмы, метастазы в толстой кишке, метастазы в легких, метастазы в мочевом пузыре, метастазы в печени, метастазы в кости, метастазы в почках и метастазы в поджелудочной железе, трудности с глотанием и т.п.

Терапевтически эффективная доза может предотвратить или отсрочить возникновение рака, что может быть желательным, если присутствуют ранние или предварительные признаки заболевания. Лабораторные тесты, используемые в диагностике рака, включают химию, гематологию, серологию и радиологию. Соответственно, любой клинический или биохимический анализ, который мониторит любое из вышеперечисленного, может использоваться для определения того, является ли конкретное лечение терапевтически эффективной дозой для лечения рака. Специалист в данной области сможет определить такие количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения.

Композицию, описанную в настоящем документе, можно вводить посредством одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких из множества способов, известных в данной области техники. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут изменяться в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительные пути введения антител, описанные в настоящем документе, включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. Используемая в настоящем документе фраза парентеральное введение означает способы введения, отличные от энтерального и топического введения, обычно путем инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Альтернативно, антитело, описанное в настоящем документе, можно вводить посредством непарентерального пути, такого как местный, эпидермальный или слизистый путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или топически.

Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, такие как составы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте выполнения изобретения терапевтическую композицию, описанную в настоящем документе, можно вводить с помощью устройства для безыгольной подкожной инъекции, такого как устройства, раскрытого в патентах США № 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей

- 48 046941 для применения с антителами, описанными в настоящем документе, включают патент США № 4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США № 4486194, в котором раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; патент США № 4447233, в котором раскрыт инфузионный насос для доставки лекарственного средства с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором раскрыто имплантируемое инфузионное устройство с переменным потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарств, имеющая многокамерные отделения; и патент США № 4475196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственных средств. Эти патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули известны специалистам в данной области.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитела, описанные в настоящем документе, могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для того чтобы гарантировать, что терапевтические соединения, описанные в настоящем документе, пересекают ВВВ (если требуется), их можно составлять, например, в липосомах. Способы производства липосом, см., например, в патентах США № 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или более остатков, которые селективно транспортируются в специфические клетки или органы, таким образом повышая целевую доставку лекарственного средства (см., например, Ranade (1989), J. Clin. Pharmacol. 29:685). Типичные нацеливающие фрагменты включают фолат или биотин (см., например, патент США № 5416016 Low et al.); маннозиды (Umezawa et al., (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (P.G. Bloeman et al. (1995), FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995), Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); поверхностно-активный рецептор протеина А (Briscoe et al. (1995), Am. J. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994), J. Biol. Chem. 269:9090); см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994), FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994), Immunomethods, 4:273.

VII. Применения и способы.

Антитела, композиции антител и способы, описанные в настоящем документе, имеют множество применений in vitro и in vivo, включая, например, лечение различных расстройств, например, рака. Например, антитела, описанные в настоящем документе, можно вводить в клетки в культуру, in vitro или ex vivo, или людям, например, in vivo. Соответственно, изобретение относится к способам лечения субъекта, включающим введение субъекту антитела, содержащего модифицированную константную область тяжелой цепи, так что наступает лечение. Изобретение относится также к способам модификации иммунного ответа у субъекта, включающим введение субъекту антитела таким образом, что иммунный ответ у субъекта модифицируется. Предпочтительно ответ усиливается, стимулируется или активируется. Однако в других вариантах выполнения изобретения иммунный ответ ингибируется.

Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей, у которых было бы желательно усиление иммунного ответа. Способы особенно подходят для лечения пациентов-людей, имеющих расстройство, которое можно лечить путем усиления иммунного ответа (например, опосредованного Т-клетками иммунного ответа). В конкретном варианте выполнения изобретения способы особенно подходят для лечения рака in vivo. В одном варианте выполнения изобретения субъект является субъектом, несущим опухоль, и иммунный ответ против опухоли стимулируется. Опухоль может быть солидной опухолью или опухолью жидких тканей, например, гематологическим злокачественным новообразованием. В определенных вариантах выполнения изобретения опухоль представляет собой иммуногенную опухоль. В определенных вариантах выполнения изобретения опухоль не является иммуногенной. В определенных вариантах выполнения изобретения опухоль является PD-L1-положительной. В определенных вариантах выполнения изобретения опухоль является PD-L1-отрицательной. Субъект также может быть носителем вируса, и иммунный ответ против вируса стимулируется.

Кроме того, предложены способы ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, включающие введение субъекту антитела, описанного в настоящем документе, таким образом, что рост опухоли ингибируется у субъекта. Изобретение также относится к способам лечения вирусной инфекции у субъекта, включающим введение субъекту антитела, описанного в настоящем документе, таким образом, что вирусная инфекция у субъекта лечится.

В настоящем документе также охватываются способы истощения Treg-клеток из микроокружения опухоли субъекта, имеющего опухоль, например раковую опухоль, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, описанного в настоящем документе, которое содержит Fc, который стимулирует истощение Treg-клеток в микроокружении опухоли. Fc может, например, представлять собой Fc с эффекторной функцией или усиленной эффекторной функцией, такой как связывание или усиленное связывание с одним или несколькими активирующими рецепторами Fc.

В определенных вариантах выполнения изобретения антитело, содержащее модифицированную константную область тяжелой цепи, связывается со стимулирующей молекулой и ингибирует ее активность, т.е. является антагонистом стимулирующей молекулы, или антитело связывается с ингибирующей молекулой и стимулирует ее активность, т.е. является агонистом ингибирующей молекулы. Такие анти

- 49 046941 тела можно применять для лечения заболеваний, при которых иммунная система или иммунный ответ должны быть подавлены например, аутоиммунных заболеваний, или для предотвращения отторжений трансплантата.

Рак.

В настоящем документе представлены способы лечения субъекта, имеющего рак, включающие введение субъекту антитела, описанного в настоящем документе, таким образом, что субъект подвергается лечению, например, таким образом, что рост раковых опухолей ингибируется или уменьшается и/или что опухоли регрессируют. Например, активация GITR антителами к GITR может усиливать иммунный ответ на раковые клетки у пациента. Антитело можно применять отдельно для ингибирования роста раковых опухолей. Альтернативно, антитело можно использовать в сочетании с другим агентом, например, другими иммуногенными агентами, стандартными схемами лечения рака или другими антителами, как описано ниже.

Злокачественные новообразования, рост которых можно ингибировать с применением антител, описанных в настоящем документе, включают злокачественные опухоли, обычно реагирующие на иммунотерапию. Неограничивающие примеры рака для лечения включают плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), не-NSCLC, глиому, рак желудочно-кишечного тракта, почечный рак (например, светлоклеточный рак), рак яичников, рак печени, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки (например, карцинома клеток почки (RCC)), рак предстательной железы (например, гормонорезистентная аденокарцинома предстательной железы), рак щитовидной железы, нейробластому, рак поджелудочной железы, глиобластому (мультиформную глиобластому), рак шейки матки, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, карциному толстой кишки и рак головы и шеи (или карцинома), рак желудка, герминогенный рак, саркому детского возраста, синоназальный естественный киллер, меланому (например, метастатическую злокачественную меланому, такую как кожная или внутриглазная злокачественная меланома), рак кости, рак кожи, рак матки, рак анальной области, рак яичка, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному вагины, карциному вульвы, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак полового члена, солидные опухоли детского возраста, рак мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (CNS), первичную лимфому CNS, опухолевый ангиогенез, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточную лимфому, рак, вызванный окружающей средой, включая рак, вызванный асбестом, рак, связанный с вирусом (например, опухоль, связанная с вирусом папилломы человека (HPV)), и гематологические злокачественные новообразования из любой из двух основных линий клеток крови, то есть, линии миелоидных клеток (которая продуцирует гранулоциты, эритроциты, тромбоциты, макрофаги и тучные клетки) или линии лимфоидных клеток (которая продуцирует В, Т, NK и плазматические клетки), такие как все типы лейкозов, лимфом и миелом, например острые, хронические, лимфоцитарные и/или миелогенные лейкозы, такие как острый лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфолейкоз (CLL) и хронический миелогенный лейкоз (CML), недифференцированный AML (М0), миелобластный лейкоз (M1), миелобластный лейкоз (М2; с созреванием клеток), промиелоцитарный лейкоз (М3 или вариант М3 [M3V]), миеломоноцитарный лейкоз (М4 или вариант М4 с эозинофилией [М4Е]), моноцитарный лейкоз (М5), эритролейкоз (М6), мегакариобластный лейкоз (М7), изолированная гранулоцитарная саркома и хлорома; лимфомы, такие как лимфома Ходжкина (HL), неходжкинская лимфома (NHL), B-клеточные лимфомы, Т-клеточные лимфомы, лимфоплазмоцитоидная лимфома, моноцитоидная В-клеточная лимфома, лимфома слизисто-ассоциированной лимфоидной ткани (MALT), анапластическая (например, Ki 1+) крупноклеточная лимфома, Т-клеточная лимф ома/лейкоз взрослых, мантийноклеточная лимфома, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, ангиоцентрическая лимфома, кишечная Т-клеточная лимфома, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома, предшественник Т-лимфобластной лимфомы, Т-лимфобластная; и лимфома/лейкоз (Т-Lbly/T-ALL), периферическая Т-клеточная лимфома, лимфобластная лимфома, посттрансплантационная лимфопролиферативная патология, истинная гистиоцитарная лимфома, первичная лимфома центральной нервной системы, первичная эффузионная лимфома, лимфобластная лимфома (LBL), гематопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, острый лимфобластный лейкоз, диффузная В-крупноклеточная лимфома, лимфома Беркитта, фолликулярная лимфома, диффузная гистиоцитарная лимфома (DHL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, предшественник В-лимфобластной лимфомы, кожная Т-клеточная лимфома (CTLC) (также называемая фунгоидным микозом или синдромом Сезари) и лимфоплазмоцитоидная лимфома (LPL) с макроглобулинемией Вальденстрема; миеломы, такие как миелома IgG, миелома легких цепей, несекреторная миелома, вялотекущая миелома (также называемая индолентной миеломой), солитарная плазмоцитома и множественные миеломы, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лимфома волосатых клеток; гематопоэтические опухоли миелоидного происхождения, опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиоскаркому; семиному, тератокарциному, опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитома, шванномы; опухоли мезенхимального

- 50 046941 происхождения, включая фибросаркому, рабдомиоскарому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному, гемопоэтические опухоли лимфоидной линии, например опухоли Т-клеток и В-клеток, включая, но не ограничиваясь этим, нарушения Т-клеток, такие как пролимфоцитарный лейкоз Т-клеток (T-PLL), в том числе мелкоклеточного и церебриформного типа; крупногранулярный лимфоцитарных лейкоз (LGL) предпочтительно Т-клеток; а/д T-NHL гепатоспленальную лимфому; периферическую/посттимусную Т-клеточную лимфому (плеоморфный и иммунобластный подтипы); ангиоцентрическую (назальную) Т-клеточную лимфому; рак головы или шеи, рак почки, рак прямой кишки, рак щитовидной железы; острую миелоидную лимфому, а также любые комбинации указанных видов рака. Способы, описанные в настоящем документе, могут также применяться для лечения метастатических видов рака, рефрактерных видов рака (например, видов рака, резистентных к предшествующей иммунотерапии, например, блокирующим антителом к CTLA-4 или PD-1), и рецидивирующих видов рака.

Комбинированные терапии.

В дополнение к терапиям, раскрытым выше, антитела, описанные в настоящем документе, также могут применяться в комбинации с другой терапией. Например, для лечения рака антитело, описанное в настоящем документе, может быть введено субъекту, который также получает другое лечение рака, такое как химиотерапия, радиационная терапия, хирургическое вмешательство или генная терапия.

Способы лечения могут включать совместное введение антитела, описанного в настоящем документе (например, антагонистического антитела, агонистического антитела и ADC, имеющего модифицированную константную область тяжелой цепи), с другой молекулой, например антителом (например, антагонистическим антителом, агонистическим антителом и ADC). Описанное в настоящем документе антитело, которое стимулирует иммунную систему, может вводиться с другой молекулой, которая стимулирует иммунную систему, например с молекулой, которая является агонистом костимулирующей молекулы или ингибитором ингибирующей молекулы.

Антитело, как описано в настоящем документе, отдельно или с одним или несколькими дополнительными иммуностимулирующими антителами (например, блокадой CTLA-4, и/или PD-1, и/или PD-L1, и/или LAG-3) можно комбинировать со стандартным лечением рака. Например, антитело, описанное в настоящем документе, отдельно или с одним или несколькими дополнительными антителами, можно эффективно комбинировать с химиотерапевтическими режимами. В этих случаях может быть возможно уменьшить дозу другого химиотерапевтического реагента, вводимого с помощью комбинации по настоящему изобретению (Mokyr et al. (1998), Cancer Research, 58:5301-5304). Примером такой комбинации является комбинация антитела, описанного в настоящем документе, с дополнительным антителом или без него, дополнительно в комбинации с декарбазином или IL-2 для лечения меланомы.

Описанное в настоящем документе антитело может быть объединено с антинеопластическим антителом, таким как Rituxan® (ритуксимаб), Herceptin® (трастузумаб), Bexxar® (тоситумомаб), Zevalin® (ибритумомаб), Campath® (алемтузумаб), Lymphocide® (эпртузумаб), Avastin® (бевацизумаб) и Tarceva® (эрлотиниб) и т.п. Антитела, описанные в настоящем документе, также могут быть объединены с одним или несколькими из следующих химиотерапевтических агентов: камптотецин (СРТ-11), 5-фторурацил (5-FU), цисплатин, доксорубицин, иринотекан, паклитаксел, гемцитабин, цисплатин, паклитаксел, карбоплатин-паклитаксел (Taxol), доксорубицин, 5-fu или камптотецин + apo21/TRAIL (комбинация 6Х)); ингибитор протеасомы (например, бортезомиб или MG132); ингибитор Bcl-2 (например, BH3I-2' (ингибитор bcl-xl), ингибитор индоламиндиоксигеназы-1 (IDO1) (например, INCB24360), АТ-101 (производное R-(-)-госсиπола), АВТ-263 (малая молекула), GX-15-070 (обатоклакс) или MCL-1 (антагонисты белка-1 клеточной дифференциации миелоидной лейкемии), антагонисты iAP (ингибитора белка апоптоза) (например, smac7, smac4, малая молекула миметика smac, синтетические пептиды smac (см. Fulda et al., Nat. Med. 2002; 8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) или AEG-35156 (GEM-640)), ингибиторы HDAC (гистондеацетилазы), антитела к CD20 (например, ритуксимаб), ингибиторы ангиогенеза (например, бевацизумаб), антиангиогенные агенты, нацеленные на VEGF и VEGFR (например, Avastin), синтетические тритерпеноиды (см. Hyer et al., Cancer Research, 2005; 65:4799-808), модуляторы c-FLIP (клеточного FLICE-ингибирующего белка) (например, природные и синтетические лиганды PPARy (рецептора у, активируемого пероксисомным пролифератором), 5809354 или 5569100), ингибиторы киназы (например, Сорафениб), Трастузумаб, Цетуксимаб, Темсиролимус, ингибиторы mTOR, такие как рапамицин и темсиролимус, Бортезомиб, ингибиторы JAK2, ингибиторы HSP90, ингибиторы PI3K-AKT, Леналилдомид, ингибиторы GSK3P, ингибиторы IAP и/или генотоксичные лекарственные средства.

Описанные в настоящем документе способы лечения антителами и комбинациями антител могут дополнительно применяться в сочетании с одним или несколькими антипролиферативными цитотоксическими агентами. Классы соединений, которые могут быть использованы в качестве антипролиферативных цитотоксических агентов, включают, но не ограничиваются ими, следующее:

Алкилирующие агенты (включая, без ограничения, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены): Урациловый иприт, Хлорметин, Циклофосфамид (CYTOXAN™) фосфамид, Мелфалан, Хлорамбуцил, Пипоброман, Триэтиленмеламин, Триэтилентио

- 51 046941 фосфорамин, Бусульфан, Кармустин, Ломустин, Стрептозоцин, Дакарбазин и Темозоломид.

Антиметаболиты (включая, без ограничения, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндеаминазы): Метотрексат, 5-Фторурацил, Флоксуридин, Цитарабин, 6-Меркаптопурин, 6-Тиогуанин, Флударабина фосфат, Пентостатин и Гемцитабин.

Подходящие антипролиферативные агенты для комбинирования с антителами, описанными в настоящем документе, без ограничения, таксаны, паклитаксел (паклитаксел коммерчески доступен как TAXOL™), доцетаксел, дискодермолид (DDM), диктиостатин (DCT), Пелорузид А, эпотилоны, эпотилон А, эпотилон В, эпотилон С, эпотилон D, эпотилон Е, эпотилон F, фураноэпотилон D, дезоксиэпотилон В1, [17]-дегидродезоксиэпотилон В, [18]-дегидродезоксиэпотилоны В, С12,13-циклопропил-эпотилон А, С6-С8 мостиковый эпотилон А, транс-9,10-дегидроэпотилон D, цис-9,10-дегидроэпотилон D, 16-десметилэпотилон В, эпотилон В10, дискодеромолид, патупилон (ЕРО-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (Дискодермолид), TZT-1027 (соблидотин), ILX-651 (гидрохлорид тасидотина), Галихондрин В, мезилат Эрибулина (Е-7389), гемиастерлин (HTI-286), Е-7974, Циртофицины, LY-355703, иммуноконъюгаты Майтанзиноида (DM-1), MKC-1, АВТ-751, Т1-38067, Т-900607, SB-715992 (испинесиб), SB-743921, MK-0731, STA-5312, элеутеробин, 17-бета-ацетокси-2-этокси-6-оксоВ-гомоэстра-1,3,5(10)-триен-3-ол, циклострептин, изолаулималид, лаулималид, 4-эпи-7-дегидрокси14,16-дидеметил-(+)-дискодермолиды и криптотилон 1 в дополнение к другим стабилизирующим микротрубочки агентам, известным в данной области техники.

Комбинированные схемы введения можно вводить одновременно или последовательно. В определенных примерах комбинации представляют собой комбинации с фиксированной дозой.

В случаях, когда желательно сделать аберрантно пролиферативные клетки находящимися в покое в сочетании с лечением или до лечения антителами, описанными в настоящем документе, пациенту могут быть также введены гормоны и стероиды (включая синтетические аналоги), такие как 17а-Этинилэстрадиол, Диэтилстилбестрол, Тестостерон, Преднизон, Флуоксиместерон, Дромостанолонпропионат, Тестолактон, Мегестролацетат, Метилпреднизолон, Метил-тестостерон, Преднизолон, Триамцинолон, Хлортрианизен, Гидроксипрогестерон, Аминоглутетимид, Эстрамустин, Медроксипрогестеронацетат, Лейпролид, Флутамид, Торемифен, ZOLADEX™. При использовании способов или композиций, описанных в настоящем документе, также могут вводиться по желанию другие агенты, применяемые для модуляции роста опухоли или метастазирования в клинических условиях, такие как антимиметики.

Способы безопасного и эффективного введения химиотерапевтических агентов известны специалистам в данной области. Кроме того, их введение описано в обычной литературе. Например, введение многих химиотерапевтических агентов описано в справочнике врача Physicians' Desk Reference (PDR), например, 1996 г. издания (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки на него.

Химиотерапевтический агент(ы) и/или радиотерапию можно вводить в соответствии с терапевтическими протоколами, хорошо известными в данной области. Специалистам в данной области будет очевидно, что введение химиотерапевтического агента(ов) и/или радиотерапии может варьироваться в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, и известного влияния химиотерапевтического агента(ов) и/или радиотерапии на это заболевание. Кроме того, в соответствии со знаниями квалифицированного клинициста, терапевтические протоколы (например, количества доз и количество раз введения) могут варьироваться с учетом наблюдаемого воздействия вводимых терапевтических агентов на пациента и с учетом наблюдаемых реакций заболевания для назначаемых терапевтических агентов.

Настоящее раскрытие дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как дополнительное ограничение. Содержание всех фигур и всех ссылок, последовательностей Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в настоящей заявке, специально включено в настоящий документ посредством ссылки. В частности, описания заявок WO 2009/045957, WO 2009/073533, WO 2009/073546, WO 2009/054863, PCT/US2013/072918, PCT/US15/61632 и патентная публикации США № 2011/0150892 специально включены в настоящий документ посредством ссылки.

Примеры

Пример 1. Усиленная интернализация антител против CD73 с шарниром IgG2 относительно тех же антител с шарниром, не относящимся к IgG2.

Было отмечено, что полученное из гибридомы антитело 11F11 против CD73, которое имеет константную область IgG2, является более эффективным в клеточных анализах ингибирования CD73, чем антитело 11F11, в качестве IgG1 или IgG1.1 (IgG1 без эффектора), и более эффективно, чем другие антитела к CD73, имеющие константные области IgG1. На основании по меньшей мере этого наблюдения было высказано предположение, что повышенная ингибирующая активность антител против CD73, имеющих шарниры IgG2 относительно тех, которые имеют шарниры, не относящиеся к IgG2, такие как шарниры IgG1, обусловлена повышенной интернализацией антител. Для того чтобы проверить эту гипотезу, антитела к CD73, имеющие константные области IgG1 или IgG2 или их части, тестировали в анали

- 52 046941 зах интернализации.

Использованные антитела перечислены в табл. 7, в которой приведены идентификаторы каждого из доменов константных областей (все человеческие) каждого антитела, включая специфические мутации, если они присутствуют.

Таблица 7

Название антитела	VH	СН1	Шарнир	СН2	снз	НС SEQ ID NO¹	LC SEQ ID NO²
11F11	11F11	IgG2	IgG2	IgG2	IgG2	44	72

4C3	4C3	IgGl	IgGl	IgGl	IgGl	45	73
6D11	6D11	IgGl	IgGl	IgGl	IgGl	46	74
CD73.10- IgG2-C219S	CD73.1 0	IgG2	IgG2 (C219S)	IgG2	IgG2	47	72
CD73.10- IgG2- C219S- IgGl.l	CD73.1 0	IgG2	IgG2 (C219S)	IgGl.l (A330S/P331 S)	IgG2	48	72
CD73.10- IgGl.l	CD73.1 0	IgGl. 1	IgGl.l (L234A/L23 5E/G237A)	IgGl.l (A330S/P331 S)	IgGl .1	49	72
CD73.4- IgG2-C219S	CD73.1 0	IgG2	IgG2 (C219S)	IgG2	IgG2	50	72
CD73.3- IgGl.l	CD73.3	IgGl. 1	IgGl.l (L234A/L23 5E/G237A)	IgGl.l (A330S/P331 S)	IgGl .1	51	73

¹ SEQ ID NO полноразмерной тяжелой цепи.

² SEQ ID NO полноразмерной легкой цепи.

Антитела были получены путем экспрессии тяжелых и легких цепей в клетках HEK293-6E, а культуральную среду собирали через 5 дней после трансфекции.

Измеряли связывание конструкций с FcyR. Данные по связыванию hCD64 и hCD32a-H131 для молекул IgG1.1 и IgG2 соответствовали ожидаемым значениям для различных Fc. IgG1.1f является наиболее инертным Fc. IgG2 и IgG2-C219S показали типичное связывание FcR для IgG2. Как и ожидалось, данные для IgG2-C219S-G1.1f предполагают значительно более слабое связывание, чем для IgG1 или IgG2 дикого типа, но повышенное связывание по сравнению с IgG1.1f.

Аффинность антител к человеческому CD73 измеряли, чтобы определить, влияет ли на них изменение константной области. аффинности определяли поверхностным плазмонным резонансом (SPR) следующим образом. Кинетику связывания CD73 и аффинность изучали поверхностным плазмонным резонансом (SPR) с использованием прибора Biacore T100 (GE Healthcare) при 25°С. В этом эксперименте проверялось связывание N-концевого домена hCD73 (состоящего из остатков 26-336 человеческого CD73; называемого N-hCD73) с антителами, которые были захвачены на поверхностях иммобилизованного белка А. Для этих экспериментов белок A (Pierce) иммобилизовали до плотности 3000-4000 RU на проточных ячейках 1-4 сенсорного чипа СМ5 (GE Healthcare) с использованием стандартной химии этил(диметиламинопропил)карбодиимид (EDCyN-гидроксисукцинимид (NHS) с блокированием этаноламином в рабочем буфере 0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. tween 20. Кинетические эксперименты проводили путем первого захвата антител (5-10 мкг/мл) на поверхностях белка А с использованием времени контакта 30 с при 10 мкл/мин со связыванием 600, 200, 66,7, 22,2, 7,4 и 2,5 нМ N-hCD73-his, используя время ассоциации 180 с и время диссоциации 360 с при скорости потока 30 мкл/мин. Рабочий буфер для кинетических экспериментов представляет собой 10 мМ фосфат натрия, 130 мМ хлорид натрия, 0,05% tween 20, рН 7,1. Поверхности регенерировали после каждого цикла с использованием двух импульсов в 30 сек 10 мМ глицина, рН 1,5 при скорости потока 30 мкл/мин. Данные сенсограммы были дважды стандартизованы и затем адаптированы к модели Ленгмюра 1:1 с использованием оценочного программного обеспечения Biacore T100 v2.0.4 для определения константы скорости ассоциации (k_a), константы скорости диссоциации (kd) и константы равновесной диссоциации (Kd).

Результаты приведены в табл. 8. В таблице собраны данные из разных экспериментов. Для антител, для которых показаны два набора чисел, каждый набор соответствует данным, полученным в отдельном эксперименте.

- 53 046941

Таблица 8

тЛЬ	Fc	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD(hM)
11F11	IgG2	2.6E+05	4.2E-04	1.6
		2.9 E+05	1.6E-04	0.56
4СЗ	IgGl	2.2E+04	2.4E-03	110
		2.4 E+04	2.2 E-03	92
6Е11	IgGl	5.7E+04	1.4E-03	25
CD73.10	IgGl.l	2.7 E+05	1.3 E-03	4.7
CD73.10	IgG2-C219S	2.2 E+05	1.4 E-03	6.2
		2.2 E+05	1.8 E-03	8.3
CD73.10	IgG2-C219S-IgGl.l	2.4 E+05	1.4 E-03	5.7
		2.3 E+05	1.60E-03	6.8
CD73.4	IgG2-C219S	2.9 E+05	1.6E-04	0.55
		2.8 E+05	3.3E-04	1.2
		2.9 E+05	3.7E-04	1.3
CD73.3	IgGl.l	1.6 E+04	3.6 E-03	220

Результаты показывают, что присутствие различных константных областей в антителе, например,

CD73.10, не изменяет аффинность антитела к человеческому CD73.

Интернализацию антител против CD73 измеряли в двух разных анализах.

А. Анализ интернализации с высоким содержанием (анализ с фиксированным временем 2 ч).

Антитела к CD73 использовали для тестирования зависимой от антитела к CD73 интернализации CD73 в клетках Calu6 путем оценки клеточной экспрессии после 2 ч инкубации антител. Клетки (2000 клеток/лунка) в 20 мкл полной среды (Gibco RPMI Media 1640 с 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сывороткой) высевали на 384-луночный планшет Falcon и выращивали в течение ночи при 37°С, 5% CO₂ и 95% влажности. Антитела к CD73 серийно разводили буфером PBS, содержащим 0,2% BSA, и добавляли в количестве 5 мкл/лунка в клеточный планшет. Клетки инкубировали с антителами в течение 2 ч при 37°С, 5% CO₂ и 95% влажности, после чего один раз промывали буфером PBS. Формальдегид (конечный 4% в PBS) затем добавляли в клеточный планшет в количестве 20 мкл/лунка и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого всю жидкость аспирировали и клетки промывали один раз 30 мкл PBS. Детектируемое антитело (2,5 мкл/лунка анти-CD73 Ab CD73.10. IgG2C219S) IgG2C219S) добавляли в количестве 15 мкг/лунка в фиксированный клеточный планшет. Клетки инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет дважды промывали буфером PBS с последующим добавлением вторичного антитела, содержащего А1еха-488 козы против человека и DAPI, окрашенного в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех промывок в буфером PBS планшет визуализировали на Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). Измеряли IC₅₀ и Y_max. Y_max определяли, сравнивая с 100 нМ дозой 11F11 в качестве внутреннего максимума. Все расчеты были определены как процент интернализации по сравнению с этим контролем, который был установлен на 100%.

Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9

mAb	Константная область	Эпитопная группа	EC50 (нМ)	Ymax
11F11	IgG2	1	0.58	98
4D4	IgG2	1	0.38	104
10D2	IgGl	1	ND	29
24H2	IgGl	1	8.2	51
7A11	IgGl	1	2.59	50
CD73.4	IgG2-C219S-IgGl.l	1	1.2	97
CD73.10	IgGl.l	1	6.18	64
CD73.10	IgG2-C219S	1	0.67	99
CD73.10	IgG2-C219S-IgGl.l	1	0.87	99

ND = He обнаружено.

NA = He применимо.

Результаты показывают, что антитела к CD73, имеющие шарнир IgG2, имеют более низкий ЕС₅₀ и более высокий Y_max.

- 54 046941

Для оценки скорости интернализации были проведены кинетические исследования интернализации. Было протестировано несколько клеточных линий: клетки Н2228, клетки НСС15, клетки Calu6 и NCI-H2030. Клетки (2000 клеток/лунка) в 20 мкл полной среды (Gibco RPMI Media 1640 с 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сывороткой) высевали на 384-луночный планшет Falcon и выращивали в течение ночи при 37°С, 5% CO2 и 95% влажности. Антитела к CD73 разводили до 10 мкг/мл буфером PBS, содержащим 0,2% BSA, и добавляли в количестве 5 мкл/лунка в клеточный планшет. Клетки инкубировали с антителами в течение 0-2 ч при 37°С с последующей промывкой один раз буфером PBS. Затем клетки фиксировали формальдегидом (конечный 4% в PBS) при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем один раз промывали 30 мкл PBS. Детектируемое антитело (2,5 мкл/лунка, антиCD73 Abs CD73.10.IgG2C219S) разбавляли буфером PBS, содержащим 0,2% BSA, и добавляли в количестве 15 мкл/лунка в фиксированный клеточный планшет. Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день после 3 промывок в буфере PBS, добавляли Вторичное антитело А1еха488 козы против человека с DAPI. Клетки окрашивали в течение 60 мин при комнатной температуре, после 3 промывок изображения получали с использованием Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA).

Результаты представлены на фиг. 1A-1J и в табл. 10 и 11. Значения в табл. 10 получены из данных, показанных на фиг. 1A-1J.

Таблица 10

Линия клеток	HFll(IgG2) Т1/2 (мин)	6Ell(IgGl) Tl/2 (мин)	CD73.10.IgGl.lf T1/2 (мин)
Calu6	3.9	60.9	14.4
НСС44	3.3	27.9	23.5
Н2030	3.3	40.3	18.3
Н647	45.7	N/A	N/A
Н2228	10.9	36.5	35.7
НСС15	2.2	84.4	37.9
SKLU1	6.8	18.0	17.2
SKMES1	2.2	62.8	32.3
SW900	10.3	94.9	43.4

Таблица 11

Т1/2 и % интернализация антител к CD73 в четырех клеточных линиях человека

	клетки H228	клетки HCC15	клетки Calu6	клетки Н2030
	Tl/2 мин	% интернализации	Tl/2 мин	% интернализации	Tl/2 МИН	% интернализации	Т1/2 МИН	% интернализации
CD73.11- IgG2CS	-	-	-	-	4.1	89	4.6	85
CD73.10- IgG2CS	9.7	93	2.6	91	3.0	91	3.3	85
CD73.10- IgG2CSIgGl.lf	9.4	92	3.0	91	3.1	91	4.3	87
CD73.4- IgG2CS	13.8	94	3.1	94	6.5	88	3.7	89
CD73.10- IgGl.lf	35.7	33	37.9	71	14.4	63	18.3	67
CD73.3- IgGl.lf	16.5	-47	>240	38	111.4	79	>120	27
11F11	10.9	96	2.2	94	3.9	87	3.3	90
4C3	7.6	-48	141.5	28	0.6	-6	>120	-34
6E11	36.5	13	84.4	64	107.4	68	40.32	51

Результаты показывают, что 11F11 (антитело IgG2) интернализируется в течение нескольких минут, достигая плато за 30 мин, тогда как 6Е11 (антитело IgG1) интернализируется медленнее, достигая плато

- 55 046941 через около 1 ч (фиг. 1A-1J). Аналогично, 11F11 с константной областью IgG1 интернализируется медленнее, чем 11F11 с константной областью IgG2. Эта тенденция наблюдалась в нескольких клеточных линиях (табл. 10 и 11 и фиг. 1A-1J).

В. Интернализация, измеренная с помощью проточной цитометрии.

Опосредованная антителом против CD73 интернализация CD73 также тестировалась с помощью проточной цитометрии. Указанные клетки инкубировали с 10 мкг/мл указанного антитела в течение 30 мин на льду, несколько раз промывали и переносили в 37°С на указанное время. Клетки собирали в одно и то же время после указанного времени инкубации. Клетки снова окрашивали первичным антителом (тем же антителом, которое использовалось для начальной инкубации), а затем вторичным антителом против человека. Затем клетки анализировали на экспрессию CD73 с помощью проточной цитометрии.

Результаты, которые показаны на фиг. 1E и в табл. 11, согласуются с результатами, полученными в анализах интернализации, описанных выше, и показывают, что все антитела с шарниром IgG2 и CH1 индуцировали быструю и полную интернализацию. Уровни CD73 оставались низкими после 22 ч после вымывания, что указывает на длительную интернализацию.

Аналогичные результаты, показанные на фиг. 1F и в табл. 11, были получены для клеточной линии NCI-H292, в которой антитело поддерживалось в культуре в течение времени инкубации (без вымывания). Опять же, эти данные указывают на быструю и значительную интернализацию и поддержание подавления эндогенного CD73.

Анализ интернализации также проводили с человеческими клетками SNU-C1 (клеточная линия рака толстой кишки) и NCI-H1437 (клеточная линия немелкоклеточного рака легкого). Результаты, которые показаны на фиг. 1I и 1J, также указывают на быструю интернализацию с максимальным уровнем, достигнутым в течение 5 ч, и максимальным уровнем интернализации около 50% для CD73.4.IgG2-C219SIgG1.1f в SNU-C1 и 60% для клеток NCI-H1437. Фиг. 1G и Н показывают сходную кинетику интернализации CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f в клетках Calu6 и NCI-H292. Для графиков, которые показывают % интернализированного CD73, это число было получено следующим образом:

(MFI_t=x - MFL·^ \ % интернализированного CD73 = 100 - ——----——— X 100 ) \MFI_t=0 — MFI$_Oii / где для каждого антитела MFIt=x представляет собой MFI в данный момент времени, a MFIt=₀ представляет собой максимальную флуоресценцию при t=0, a MF^_oh представляет собой MFI только вторичного Ab.

Таблица 12

EC₅₀ опосредуемой антителами интернализации CD73 в нескольких клеточных линиях (данные с фиг. 1G-1I)

	Calu6	NCI-H292	SNU-C1	SNU-C1 (без отмывки)	NCI-H1437	NCI-H1437 (без отмывки)
	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)	Ym ax (%)	Tl/2 (ч)
шАЬCD73. 4IgG2IgGl. If	76.8	0.56 61	77.6 4	0.26 33	48.9 6	0.49 54	38.3 9	1.0 25	63.1 2	0.31 64	62.7 8	0.34 18
mAbCD73. 4- IgG2	75.5 9	0.60 03	78.4 2	0.27 66
mAbCD73. 4-	44.9 9	1.73 7	51.4 9	0.20 87	30.5 8	0.99 15	33.1 6	2.3 3	49.7 6	0.49 15	49.9 5	0.53 84
IgGl. If

- 56 046941

Таким образом, антитела к CD73 с шарниром IgG2 усваиваются быстрее и в большей степени по сравнению с антителами против CD73 с шарниром IgG1.

Пример 2. Усиленная агонистическая активность антител к GITR с шарниром IgG2 относительно тех же антител с шарниром IgG1.

Этот пример демонстрирует, что антитела к GITR, содержащие шарнир IgG2, обладают повышенной способностью индуцировать секрецию IL-2 и IFN-γ Т-клетками по сравнению с теми же антителами, которые имеют шарнир IgG1.

В анализах CHO-OKT3 и 3А9, описанных выше, наблюдалось, что антитела, полученные из гибридомы, имеющие константную область IgG2, более эффективны в стимуляции секреции цитокинов, чем те же антитела, в которых константная область тяжелой цепи была переключена на область IgG1 или IgG1 без эффектора (IgG1.1). Следовательно, влияние константной области или шарнира IgG2 дополнительно тестировали на антителах к GITR в этих анализах.

Вариабельная область тяжелой цепи антитела к GITR человека (SEQ ID NO: 75) была связана с константными областями тяжелой цепи, показанными в табл. 13. Легкая цепь антител к GITR содержала SEQ ID NO: 77. В табл. 13 показана идентичность каждого домена константных областей:

Таблица 13

Константные области тяжелой цепи антител, использованных в этом примере

Название антитела	CHI	Шарнир	CH2	CH3	SEQ ID NO*
анти-GITR	IgG2 SEQ ID NO:7	IgG2 SEQIDNO:8	IgG2 SEQ ID NO:9	IgG2 SEQ ID NO:10	SEQ ID NO :52
анти-GITR - IgG2	IgG2 SEQ ID NO:7	IgG2 SEQIDNO:8	IgG2 SEQ ID NO:9	IgG2 SEQ ID NO:10	SEQ ID NO :52
анти-GITR - IgGl	IgGl SEQ ID NO:2	IgGl SEQ ID NO:3	IgGl SEQ ID NO:4	IgGl SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:53
анти-GITR - IgGl.l	IgGl.l SEQ ID NO:2	IgGl.l (L234A/L235E/G237A) SEQ ID NO:25	IgGl.l (A330S/P331S) SEQ ID NO:24	IgGl.l SEQ ID NO:5	SEQ ID NO :54
анти-GITR IgG2-IgGl или антиGITR.g2.gl	IgG2 SEQ ID NO:7	гибрид IgG2/IgGl SEQ ID NO:22	IgGl SEQ ID NO:4	IgGl SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:55
анти-GITR - IgG2-IgGl.l или анти- GITR.g2.gl.l	IgG2 SEQ ID NO:7	IgG2 SEQIDNO:8	IgGl.l (A330S/P331S) SEQ ID NO:24	IgGl SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:56

* SEQ ID NO полноразмерной константной области тяжелой цепи.

Во-первых, аффинность связывания этих антител к GITR сравнивали с аффинностями связывания антител к GITR, имеющих шарнир IgG1. Аффинности связывания антител к GITR с растворимым GITR определялась с помощью Biacore следующим образом. Антитела к GITR были захвачены на покрытых чипах каппа-цепи человека (~5KRU; Southernbiotech cat # 2060-01), и рекомбинантный человеческий GITR (rHGITR/Fc: R&D systems, cat # 689-GR) был пропущен через чип в концентрациях 500, 250, 125, 62 и 31 нМ. Концентрация захвата mAb/объем составляла 2-40 мкг/мл (5 мкл при 10 мкл/мин). Время ассоциации антигена составляло 5 мин при 15 мкл/мин, время диссоциации антигена составляло 6 мин, и регенерацию проводили с помощью 50 мМ HCl/50 мМ NaOH (12 мкл каждый при 100 мкл/мин).

Результаты, показанные на фиг. 2, указывают, что все три антитела к GITR, имеющие шарнир IgG2, имеют сходные аффинности к активированным Т-клеткам, поскольку антитела к GITR имеют константную область IgG1 или IgG1.1.

- 57 046941

Затем тестировали способность антител к GITR, имеющих константную область IgG1 или шарнир IgG2/goMeH Fc IgG1, индуцировать секрецию IL-2 и IFN-γ из донорных Т-клеток человека, стимулированных анти-CD3scFv (OKT3)-экспрессирующими клетками CHO. Клетки CHO экспрессировали низкие уровни OKT3 так, чтобы промотировать субоптимальную стимуляцию, чтобы иметь возможность наблюдать агонизм антителами к GITR. CD4+ Т-клетки от донора стимулировали экспрессирующими OKT3 клетками CHO и антителом к GITR и измеряли секрецию IL-2 и IFN-γ. Эксперименты проводили следующим образом. Для экспериментов с CD4+ Т-клетками получали CD4+ Т-клетки из РВМС человека с коктейлем, обогащенным CD4+ Т-клетками человека RosetteSep (StemCell Technology#15062) в соответствии с протоколом производителя. Клетки CHO, экспрессирующие анти-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3), дважды промывали средой RPMI и подвергали облучению с дозой 50K рад. Клетки собирали и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 55 нМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ пирувата натрия и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина) при концентрации 2,5х105/мл. Высевали 2,5х10⁴ клеток CHO-OKT3 и 1х 10⁵ Т-клеток на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном класса ТС (Costar). Клетки инкубировали с 8-точечным, 4-кратным титрованием антител к GITR, начиная с 40 мкг/мл. Нерелевантный hIgG1 добавляли с концентрацией 40 мкг/мл в качестве контроля изотипа. Образец только с клетками был включен для того, чтобы показать исходную активность без какой-либо обработки. Супернатант из каждого образца собирали в день 2 для измерения IL-2 (только для анализов с CD4' Т-клетками) (набор BD opt EIA Human IL-2 ELISA; BD Bioscience # 555190) и в день 3 для измерения IFN-γ (Набор BD optEIA human IFN-g ELISA; BD Bioscience # 555142).

Как показано на фиг. 3А и В, антитело с шарниром IgG2/доменом Fc IgG1 (анти-GITR.g2.g1) индуцирует секрецию как IL-2, так и IFN-γ Т-клетками в большей степени, чем антитело с константной областью IgG1 (анти-GITR.g1). Аналогичные результаты были получены с безэффекторными версиями этих константных доменов (фиг. 3C).

Для дальнейшего подтверждения повышенной активации Т-клеток антителами к GITR, содержащими шарнир IgG2, тестировали секрецию IL-2 в другом экспериментальном формате. В этом эксперименте способность антител к GITR индуцировать секрецию IL-2 из клеток 3A9-hGITR (клеточная линия гибридомы 3А9 Т-клеток мыши, эктопически экспрессирующая человеческий GITR) была протестирована следующим образом. Клеточную линию гибридомы 3А9 Т-клеток мыши, которая эктопически экспрессирует человеческий GITR (3A9-hGITR), культивировали на планшетах, покрытых моноклональными антителами против CD3, в присутствии увеличивающихся количеств указанных антител. 5х 10⁴ клеток 3A9-hGITR культивировали на планшетах, покрытых 1 мкг/мл антитела к CD3 (Клон 145-2С11; BD Biosciences), и обрабатывали указанными концентрациями антител в течение 7 ч.

Как показано на фиг. 4, все антитела, имеющие шарнир IgG2 (анти-GITR.g2, анти-GITR.g2.g1f и анти-GITR.g2.g1.f), индуцировали секрецию IL-2 из клеток 3A9-hGITR до более высокой степени, чем их аналоги (анти-GITR.g1f и анти-GITR.g1.1f), содержащие константные области IgG1.

Эти результаты в целом предполагают, что антитела к GITR, имеющие шарнир IgG2 и константные области g1 или g1.1, являются более сильнодействующими, чем те же антитела, имеющие шарнир IgG1.

Пример 3: Влияние различных комбинаций шарнир/Fc на размер комплексов антитело/антиген

Как показано в приведенных выше примерах, антитела к CD73 с шарниром IgG2 являются лучшими ингибиторами клеточной активности CD73 и лучше интернализуются, чем те же антитела с шарниром IgG1, а антитела к GITR с шарниром IgG2 являются более сильными агонистами, чем те же антитела с шарниром IgG1. На основании этого наблюдения и того факта, что шарнир IgG2 является более жестким, чем шарнир IgG1, было выдвинуто предположение, что между антигеном и антителами, имеющими шарнир IgG2, образуются более крупные комплексы по сравнению с антителами, имеющими шарнир IgG1. Для анализа этой гипотезы был проведен следующий эксперимент.

Структуру и олигомерное состояние комплексов CD73/антитело в растворе исследовали с помощью SEC-MALS и DLS. Для этих исследований антитела, содержащие либо константную область IgG1, либо IgG2, смешивали при различных молярных отношениях с рекомбинантными белками, содержащими либо полноразмерный внеклеточный домен человеческого CD73, содержащий С-концевую полигистидиновую метку (аминокислотные остатки 26-546 человеческого CD73, обозначен hCD73-his), либо фрагмент, соответствующий N-концевому домену человеческого CD73 (аминокислотные остатки 26-336, обозначен N-hCD73-his).

Олигомерное состояние комплексов CD73/антитело исследовали с помощью эксклюзионной хроматографии, соединенной со встроенным многоугловым детектором рассеяния света (SEC-MALS). Изократические разделения проводили на колонке Shodex PROTEIN KW-803, подключенной к Prominence Shimadzu UFLC в буфере, содержащем 200 мМ K2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 6,8, содержащем 0,02% азида Na (отфильтрованный через 0,1 мкм), со скоростью 0,5 мл/мин. Образцы вводили в колонку с использованием автосамплера SIL-20AC Prominence Shimadzu, и данные получали с трех онлайн-детекторов, подключенных последовательно: UV-спектрофотометр с диодной матрицей UV/vis Prominence SPD-20AD, затем Многоугловой Детектор Светорассеяния Wyatt miniDAWN™ TREOS, затем Детектор Показателя

- 58 046941

Преломления Wyatt Optilab T-rEX. Данные собирали и анализировали с использованием программного обеспечения Astra (Wyatt) и Labsolutions (Shimadzu).

Исследования динамического рассеяния света (DLS) проводили на планшетном ридере Wyatt DynaPro в 384-луночных планшетах при 25°С. Экспериментальными параметрами были 20 сборов по 5 с на каждое измерение, и измерения были записаны по четырем экземплярам, при этом сообщалось среднее и стандартное отклонение. Автокорреляционные функции интенсивности подбирались с использованием алгоритма Регуляризация в программном обеспечении Dynamics (Wyatt Technologies).

Краткое описание SEC-MALS и DLS представлено на фиг. 6 и 7. Анализ отдельных антител показывает время удерживания (около 16-17 мин), массы (140-150 кДа) и гидродинамические радиусы (5,05,4 нм) для каждого антитела, которые типичны для мономерного моноклонального антитела. Данные для белка hCD73-his соответствуют белку, принимающему ожидаемую димерную структуру в растворе; в частности, масса, определенная по данным SEC-MALS (120 кДа), согласуется с ожидаемой для димера CD73-his (117 кДа) и не согласуется с тем, что можно ожидать для мономера hCD73-his (58,5 кДа). Данные для N-hCD73 согласуются с тем, что рекомбинантный белок N-домена является мономерным в растворе (измеренная масса SEC-MALS = 38 кДа по сравнению с ожидаемой массой мономера = 35,0 кДа), что ожидается из-за того, что область полноразмерного внеклеточного домена CD73, который отвечает за димеризацию белка, содержащегося в С-концевом домене без вклада остатков N-домена.

Обнаружено, что эквимолярные смеси данного антитела с N-hCD73-his элюируются в SEC как единственный вид с более коротким временем удержания, чем антитело или только N-hCD73-his, а также с большими гидродинамическими радиусами (Rh) no DLS, что согласуется с образованием комплексов. Данные MALS указывают массы для этих комплексов приблизительно 210 кДа. Это согласуется с тем, что одна молекула N-hCD73-his связана с каждым из двух доменов Fab данного антитела с образованием комплекса 1:2 антитело:N-hCD73-his.

Данные SEC-MALS для смесей антител против CD73 с димером hCD73-his показывают, что смесь элюируется раньше, чем hCD73-his или одно антитело, что позволяет предположить, что комплексы образуются. Сравнение данных для mAb, которые содержат одну и ту же вариабельную область, но разные константные домены, показывает, что времена элюирования для комплексов hCD73-his с mAb, содержащими константные домены IgG2 (IgG2-C219S, IgG2-C219S-IgG1.1f), являются более ранними, чем для комплексов hCD73-his с mAb, содержащими константный домен IgG1.1f. Кроме того, определенные по MALS массы для комплексов hCD73-his с mAb, содержащих константный домен IgG2, больше, чем для комплексов hCD73-his с mAb, содержащих константный домен IgG1. Данные DLS также показывают, что гидродинамический радиус комплексов hCD73-his с mAb, содержащих константный домен IgG2, больше, чем у комплексов hCD73-his с mAbs, содержащих константный домен IgG1. Например, данные SEC-MALS и DLS для CD73.4 с тремя разными константными областями (IgG2-C219S, IgG2-C219SIgG1.1f или IgG1.1f) показаны на фиг. 5. На ней можно увидеть, что комплекс hCD73-his с CD73.4, содержащий константный домен IgG2, имеет более короткое время удерживания (фиг. 5А), большие гидродинамические радиусы (фиг. 5В) и большие массы, определенные по MALS (фиг. 5С), по сравнению с комплексами hCD73-his с CD73.4-IgG1.1f. На основе масс по MALS схематическая модель структуры и стехиометрии комплексов между hCD73-his и антителами показана на фиг. 5D, где комплексы, содержащие CD73.4-IgG1.1f, преимущественно образуют меньшие 2:2 (пик 1 = ~550 кДа) или 4:4 димерные комплексы mAb/CD73 (пик 2 = ~1300 кДа), тогда как CD73.4-IgG2-C219S или CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f образуют гораздо более крупные комплексы (>3000 кДа) с hCD73-his, для которого точная структура и стехиометрия не могут быть уверенно смоделированы.

В совокупности, данные SEC-MALS и DLS демонстрируют, что более крупные комплексы образуются между hCD73-his и mAb, содержащими шарнирную область IgG2 (IgG2-C219S или IgG2-C219SIgG1.1f), по сравнению с теми, которые содержат шарнирную область IgG1 (IgG1.1f).

Пример 4. CH1 изотипа IgG2 дополнительно улучшает опосредованную антителами интернализацию CD73.

Дополнительные анализы интернализации были проведены в клетках Calu6 и Н292 для дальнейшего определения роли изотипа в интернализации. Анализы интернализации проводили, как описано в примерах 1А и 1В (протокол проточной цитометрии без стадии вымывания антител), а антитела различных гибридных изотипов, показанные в табл. 14, выдерживали в культуре при 10 мкг/мл в течение времени инкубации. Для экспериментов с проточной цитометрией способ из примера 1В был адаптирован для анализа с высокой пропускной способностью в 96-луночных планшетах (в отличие от 48-луночных планшетов) и с 50000 клеток на лунку.

- 59 046941

Таблица 14

Константные области, протестированные с вариабельными областями CD73.4

Конструкции	SEO ID NO	Описание
константной области
IgGlf	78	IgGlf дикого типа
IgGl.lf	83	стандартный инертный IgGl.lf
IgG2.3	79	IgG2 A-форма (C219S)
IgG2.5	82	IgG2 В-форма (C131S)
IgG2.3Gl-KH	81	СШ, верхний шарнир и нижний шарнир/верхний СН2 из IgG2.3, все другие IgGlf
IgG2.5Gl-KH	90	СН1, верхний шарнир и нижний шарнир/верхний СН2 из IgG2.5, все другие IgGlf
IgG2.3Gl-AY	80	СН1 и верхний шарнир IgG2.3, все другие IgGlf
IgG2.5Gl-AY	89	СН1 и верхний шарнир IgG2.5, все другие IgGlf
IgGl-G2.3Gl-KH	93	СН1 из IgGl, верхний шарнир и нижний шарнир/верхний СН2 из IgG2.3, все другие IgGlf
IgGl-G2.3Gl-AY	92	СН1 из IgGl, верхний шарнир IgG2.3, все другие IgGlf
IgG2.3Gl.lf-KH	84	СН1, верхний шарнир и нижний шарнир/верхний СН2 из IgG2.3, все другие IgGl.lf
IgG2.5Gl.lf-KH	88	СН1, верхний шарнир и нижний шарнир/верхний СН2 из IgG2.5, все другие IgGl.lf
IgGl-deltaTHT	85	IgGl с последовательностью ТНТ, удаленной из шарнира
IgG2.3-plusTHT	86	IgG2.3 с последовательностью ТНТ (из IgGl), добавленной в шарнир
IgG2.5-plusTHT	91	IgG2.5 с последовательностью ТНТ (из IgGl), добавленной в шарнир
IgG2.3-plusGGG	87	IgG2.3 с гибкой последовательностью GGG, добавленной в шарнир

Было показано, что связывание FcyR является ожидаемым для каждой конструкции, т.е. связывание FcyR обусловлено нижним шарниром/областью CH2.

Результаты показаны на фиг. 8А-8С, а также в табл. 15 и 16. Данные, показанные в табл. 15, были получены с использованием того же протокола, описанного в примере 1В (без вымывания антител). Данные, показанные в табл. 16, были получены с использованием того же протокола, который описан в примере 1А.

- 60 046941

Таблица 15

Ymax и Т_1/2 опосредованной антителами интернализации CD73 в клетках Calu6 и NCI-292

	Calu6	NCI-H292
	Ymax (%)	Ti/2 (ч)	Ymax (%)	Tl/2 (ч)
mAb-CD73.4- IgGlf/LC-llFll-Vk2	55.72	0.8452	73.05	0.5014
mAb-CD73.4- IgG2.3Gl-AY-pTT5-SP	85.07	0.3326	90.25	0.272
mAb-CD73.4- IgG2.3Gl-KH	81.62	0.3962	91.61	0.2801
mAb-CD73.4-Gl-G2.3- Gl-AY	72.7	0.4229	84.51	0.3083
mAb-CD73.4-IgGldeltaTHT	69.27	0.5652	83.63	0.3441
mAb-CD73.4-Gl-G2.3- Gl-KH	65.67	0.5674	83.29	0.343
mAb-CD73.4-IgG2.3plusTHT	81.19	0.3551	91.41	0.2935
mAb-CD73.4-IgG2.3plusGGG	81.72	0.3355	91.6	0.2712
mAb-CD73.4-IgG2.5	78.98	0.3485	89.56	0.3057
mAb-CD73.4- IgG2.5Gl.lf-KH	79.63	0.3527	90.86	0.2993
mAb-CD73.4- IgG2.5Gl-AY	81.91	0.2901	91.3	0.2452
mAb-CD73.4- IgG2.5Gl-KH	76	0.2837	90.75	0.256
mAb-CD73.4- IgG2.5plusTHI7LC	80.15	0.2869	89.6	0.2565
mAb-CD73.4-IgG2- C219S/LC	82.35	0.3725	88.91	0.2866
mAb-CD73.4-IgG2- C219S/LC	82.54	0.3639	87.66	0.2845
mAb-CD73.4- IgGl.lf+K/LC	57.07	1.519	70.4	0.4969
mAb-CD73.4-IgG2CS- IgGl.lf	80.98	0.3508	90.35	0.2764

- 61 046941

Таблица 16

Характеристики интернализации CD73.4 с различными константными областями в клетках Calu6

	Интернализация
CD73 mAb Clones	Max	Скорость
CD73.4-IgGlf/LC-l 1F11-Vk2	+	+
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.3Gl-AYpTT5-SP5	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.3Gl-KH	++++	+++
CD73.4-Vh-hHC-Gl-G2.3-Gl-AY	++	++
CD73.4-Vh-hHC-Gl-G2.3-Gl-KH	++	++
CD73.4-Vh-hHC-IgGl-deltaTHT	++	+++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.3-plusTHT	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.3-plusGGG	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.5	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.5Gl. If-KH	++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.5Gl-AY	+++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2.5Gl-KH	+++	++++
CD73 4-Vh-hHC-IgG2.5plusTHT/LC	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2-C219S/LC	++++	++++
CD73.4-Vh-hHC-IgG2-C219S/LC	++++	++++
CD73 4-Vh-hHC-IgGl. 1 f+K/LC	+	+
CD73.4-Vh-hCh-IgG2-C219S- IgGl.lf	++++	++++

На фиг. 8А-8С и в табл. 15 и 16 показано, что антитела, имеющие шарнир и домен CH1 изотипа IgG2, наиболее эффективны для стимулирования интернализации CD73, тогда как антитела, имеющие шарнир IgG1 и домен IgG1, соответствуют нижним кривым на фигуре, т.е. более низкой степени интернализации. Кроме того, антитела только с шарниром из IgG2 имеют повышенную интернализацию по сравнению с шарниром человеческого IgG1. Таким образом, антитела, имеющие шарнир и домен C_H1 изотипа IgG2, имеют превосходные характеристики интернализации по сравнению с антителами с изотипом IgG1.

Таким образом, антитело против CD73 mAb-CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (имеющее шарнир IgG2 с заменой C219S и домен CH1 IgG2) вызывало быструю интернализацию в зависимости от тестируемой клеточной линии. Т_1/2 для интернализации варьировался от минут до 1 ч. Большинство протестированных клеточных линий имели Т_1/2 менее 10 мин. Для некоторых клеточных линий была индуцирована почти полная интернализация, и у большинства протестированных наблюдалось снижение экспрессии CD73 на поверхности по меньшей мере на 50%, которое обычно достигало максимальных уровней к 5 часам, в некоторых случаях значительно короче.

Пример 5. CH1 IgG2 усиливает индуцированную GITR Ab секрецию IL-2 CD4+ Т-клетками.

В этом примере показано, что домен CH1 изотипа IgG2 усиливает индуцированную антителом к GITR активность Т-клеток по сравнению с антителом с доменом C_H1 изотипа IgG1.

Те же самые модифицированные константные области тяжелой цепи, которые использовались в примере 4, были связаны с вариабельными областями антитела к GITR (примера 2). Донорные CD4+ Т-клетки инкубировали с клетками CHO, экспрессирующими OKT3-scFv, и различными антителами к GITR и измеряли уровень секретируемого IL-2. Это было проведено, как описано в примере 2.

Результаты, показанные на фиг. 9, указывают на то, что все антитела к GITR, имеющие домен CH1 изотипа IgG2, в дополнение к шарниру изотипа IgG2, более эффективны в стимуляции секреции IL-2 из CD4+ Т-клеток, чем антитела, имеющие шарнир IgG1 и CH1.

Таким образом, этот пример показывает, что присутствие шарнира IgG2 и домена CH1 IgG2 в агонистическом антителе к GITR дополнительно усиливает агонистическую активность антитела по отношению к тому же антителу, которое не имеет шарнира и/или домена CH1 изотипа IgG2. Антитело, имеющее как шарнир, так и домен C_H1 изотипа IgG2, обладает более сильным агонистическим эффектом по сравнению с антителом, имеющим шарнир, но не C_H1, изотипа IgG2. Кроме того, антитело с доменом C_H1 из IgG2 обладает более сильной агонистической активностью, чем антитело с доменом C_H1 из изотипа IgG1. Антитело с шарниром из IgG2 и доменом C_H1 из IgG1 обладает более сильной агонистической активностью, чем антитело с C_H1 и шарниром из изотипа IgG1.

Пример 6. Роль определенных аминокислотных остатков в C_H1 IgG2 и шарнир в улучшении опо

- 62 046941 средованной антителами интернализации CD73.

Антитела к CD73 (CD73.4) с константными областями тяжелой цепи, показанными в табл. 17, получали и тестировали, как описано выше в анализах интернализации CD73, опосредованных антителами.

Таблица 17

Константные области тяжелой цепи, которые были слиты с вариабельными областями анти-CD73

Описание	Конструкции	SEQ ID NO константной области
Домен СН1 из IgG2 со всеми другими IgGl. Также мутант Cys>Ser для снижения потенциальной дисульфидной гетерогенности:	G2-G1-G1-G1	94
G2.5-G1-G1-G1	95
Домен СН1 из IgGl со всеми другими IgG2.3:	G1-G2.3-G2-G2	96
Замена областей СШ в IgGl на такие же из IgG2 либо по-отдельности, либо вместе:	G1-KRGEGSSNLF	97
G1-KRGEGS	98
G1-SNLF	99
IgGl-ITNDRTPR	100
G1-SNLFPR	101
	G2-RKEGSGNSFL	102
Замена областей СШ в IgG2 на такие же из IgGl либо по-отдельности, либо вместе:	G2-RKEGSG	103
G2-NSFL	103
lgG2-TIDNTRRP	105
G2-NSFLRP	106
IgGl с остатками домена СН2 из IgG2:	G1-G1-G2-G1-AY	107
G1-G1-G2-G1-KH	108
IgG2 с остатками домена CH2H3lgGl:	G2-G2.3-G1-G2-KH	109
G2.5-G2.3-G1-G2-KH	110
G2-G2.3-G1-G2-AY	111
G2.5-G2.3-G1-G2-AY	112
Замена областей шарнира между IgGl и IgG2:	G1-G2.3-G1-G1-KH	113
G2-G1-G2-G2-AY	114
G2.5-G1-G2-G2-AY	115
G1-G2-G1-G1-AY	116
G2-G1-G2-G2-KH	117
G2.5-G1-G2-G2-KH	118
Усечения шарнира	IgGl-deltaHinge	119
lgG2-deltaHinge	120
lgG2.5-deltaHinge	121
lgGl-deltaG237	122
lgG2-plusG237	123
Другое	lgG2.4	124
lgG2.3/4	125

Результаты, показанные на фиг. 10, предоставляют следующую информацию в контексте интернализации CD73:

домен CH2 не оказывает влияния, как показано с помощью:

а) наблюдалась очень небольшая разница в способности к интернализации между антителами, содержащими модифицированную константную область тяжелой цепи с форматом AY (имеющими шарнир IgG2 ERKCCVECPPCPAPPVAG seq id NO: 8), по сравнению с антителами с форматом KH (ERKCCVECPPCPAPELLGG SEQ ID NO: 22) (Наборы 5, 6 и 7);

b) замены CH2 сопоставимы с дикими типами G1 или G2 (Наборы 5 и 6) и

с) остаток 237 не оказывает влияния на интернализацию: ни добавление остатка G к шарниру

- 63 046941

IgG2, ни удаление С-концевого G в шарнире IgG1 не влияют на интернализацию (Набор 9);.

это говорит о том, что домен CH2 не влияет на интернализацию (т.е. домен CH2 может быть из IgG1 или IgG2);

замена областей CH1, указанных в Наборе 3 (KRGEGSSNLF; KRGEGS; SNLF; ITNDRTPR и SNLFPR) в IgG1, на те же IgG2 обеспечивает небольшое преимущество, т.е. интернализация остается сходной с интернализацией IgG1; см. Набор 3);

замена областей CH1, указанных в Наборе 4 (RKEGSGNSFL; RKEGSG; NSFL; TIDNTRRP и NSFLRP) в IgG2, на те же IgG1 имеет переменное влияние: изменение NSFL не оказывает влияния, в то время как другие 2 области (RKEGSG & RP) участвуют (см. Набор 4). Исходя из результатов Наборов 3 и 4, представляется, что существует взаимодействие между областью CH1 и шарниром, причем области RKEGSG и RP более важны, чем область NSFL;

шарнирная область влияет на интернализацию, т.е. шарнир IgG2 обеспечивает лучшую интернализацию по сравнению с шарниром IgG1 (см. Наборы 7 и 8). Кроме того, IgG1 с делецией (С1-дельташарнир) улучшает интернализацию по сравнению с IgG1. IgG2 с делецией (С2-дельта-шарнир) обеспечивает аналогичный уровень интернализации по сравнению с таковым у шарнира IgG2. Это говорит о том, что шарнирная область влияет на интернализацию, эффект которой усиливается с помощью CH1 IgG2 (G2-G1-G2-G2-AY сравним с G1-G2-G1-G1-AY);

IgG2.4 (C220S) имеет сходную или пониженную интернализацию по сравнению с IgG2.3 (C219S). IgG2.3/4 (C219S/C220S) имеет значительно сниженную интернализацию по сравнению с одним IgG2.3 или IgG2.4 (см. Набор 10). Это говорит о том, что интернализация антитела с шарниром IgG2 и C219S примерно такая же, как и у шарнира IgG2 с C220S, оба из которых намного лучше, чем у шарнира IgG2 с C219Sи C220S;

IgG2.5 (мутация C131S) имеет меньшую интернализацию по сравнению с конструкциями с С131 (см. Наборы 1, 6 и 7).

Таким образом, эти результаты показывают, что домен CH1 и шарнир оба имеют отношение к интернализации CD73, опосредованной антителом, и что антитело, имеющее последовательности IgG2 из этих доменов, интернализируется с большей эффективностью по сравнению с антителом, имеющим эти области из IgG1.

Пример 7. Антитела, имеющие шарнир IgG2 и/или домен CH1, образуют комплексы с высокой молекулярной массой

Антитела к CD73.4, имеющие константные области тяжелой цепи, указанные в табл. 14, также тестировали на образование комплексов с высокой молекулярной массой в экспериментах SEC-MALS и DLS, как описано в примере 3.

Три из 16 антител в этом исследовании были протестированы ранее: CD73.4-IgG1.1f, CD73.4-IgG2C219S CD73.4-IgG1.1f, CD73.4-IgG2-C219S (также называемое CD73.4-IgG2.3) и CD73.4-IgG2-C219SIgG1.1f (также называемое CD73.4-IgG2.3G1.1f-KH). Данные SEC-MALS и DLS только для антител показали времена удерживания, массы и гидродинамические радиусы для каждого антитела, которые типичны для мономерного моноклонального антитела. Эквимолярные комплексы каждого антитела (5,5 мкМ) с hCD73-his (5,5 мкМ) показали более медленные времена удерживания для всех комплексов по сравнению с антителом или только hCD73-his, что указывает на образование комплексов. Наложение данных хроматограммы SEC для каждого из 16 комплексов показано на фиг. 11А. Данные хроматограммы можно разделить на четыре отдельных пика, которые показаны на фиг. 11В. Пик 1 содержит самые крупные виды, причем определенные с помощью MALS массы указывают на комплексы с эквивалентной массой более 4:4 hCD73-his:mAb комплексы. Пик 2 содержит виды с определенными с помощью MALS массами, что предполагает наличие комплексов около 2:2 hCD73-his:mAb комплексов. Пик 3 является второстепенным видом с низким сигналом и определенными с помощью MALS массами, предполагающими комплексы около 1:1 hCD73-his:mAb. Пик 4 соответствует элюированию только mAbs с определенными с помощью MALS массами, соответствующими свободному антителу. Для количественного определения относительных количеств каждого вида 4 пика каждой хроматограммы интегрировали в виде пика 1 (<12,9 мин), пика 2 (12,9-15,1 мин), пика 3 (15,1-16,7 мин), пика 4 (16,7-19,3 мин). Интеграция также включала дополнительный интегрированный диапазон, называемый пиком 5 (>19,3 мин), для учета любых низкомолекулярных частиц, которые оказались незначительными (<3,5% для всех комплексов). Процент каждого вида из этой интеграции представлен в табл. 18. Все комплексы содержали одинаковый небольшой процент пика 3 (около 6-9%), но различные количества других пиков. Наиболее примечательно то, что все комплексы между hCD73-his и антителами, содержащими домен CH1 из hIgG1, имели значительно больший процент более мелких комплексов (пик 2), тогда как те, которые содержали домен CH1 из hIgG2, имели больший процент более крупных комплексов (пик 1) (табл. 18 и фиг. 11С). Это говорит о важной роли не только шарнирной области, но и домена CH1 в формировании комплекса более высокого порядка.

- 64 046941

Таблица 18

Времена удерживания антител к CD73.4 с модифицированными константными областями тяжелой цепи

	% uv
Ππκΐ	Пик2	ПикЗ	Пик4	Пик5
Комплексы	<12.9 мин	12.9-15.1 мин	15.1-16.7 мин	16.7-19.3 мин	>19.3 мин
CD73.4-IgG2.3 + hCD73-his	37.0	23.8	7.7	28.6	2.9
CD73.4-IgG2.3Gl.lf-KH + hCD73-his	36.0	23.8	7.9	29.3	3.0
CD73,4-IgGl. 1 f + hCD73 -his	28.4	36.2	7.4	25.6	2.3
CD73.4-IgGlf + hCD73-his	26.0	36.5	7.5	27.8	2.2
CD73.4-IgG2.3Gl-AY + hCD73-his	30.2	24.3	8.1	34.4	3.0
CD73.4-IgG2.3Gl-KH + hCD73-his	34.9	23.4	7.9	30.7	3.0
CD73.4-IgGl-G2.3Gl-AY + hCD73-his	14.6	29.2	6.4	48.3	1.6
CD73.4-IgGl-G2.3Gl-KH + hCD73-his	23.8	32.6	7.0	34.5	2.1
CD73.4-IgGl-deltaTHT + hCD73-his	28.3	35.4	7.0	26.9	2.4
CD73.4-IgG2.3-plusTHT + hCD73-his	30.6	24.3	8.3	33.7	3.2
CD73.4-IgG2.3-plusGGG + hCD73-his	30.0	23.9	8.2	34.9	2.9
CD73.4-IgG2.5 + hCD73-his	31.7	24.4	8.4	32.5	3.1
CD73.4-IgG2.5Gl.lf-KH + hCD73-his	30.7	24.3	8.9	32.7	3.4
CD73.4-IgG2.5Gl-AY + hCD73-his	26.3	24.8	8.1	38.3	2.6
CD73.4-IgG2.5Gl-KH + hCD73-his	21.4	24.1	7.0	45.6	1.9
CD73.4-IgG2.5-plusTHT + hCD73-his	32.6	23.5	8.3	32.6	3.0

Пример 8. Связывание с рецептором Fc для антител со сконструированными константными доменами.

Этот пример демонстрирует, что антитела, имеющие модифицированные константные области тяжелой цепи, включающие CH1 и шарнир IgG2, связываются с FcyR, когда они содержат домены CH2 и Ch3 IgG1.

Помимо связывания антигена вариабельными доменами, антитела могут взаимодействовать с рецепторами Fc-гамма (FcgR) посредством взаимодействия с константными доменами. Эти взаимодействия опосредуют эффекторные функции, такие как антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Активность функции эффектора высокая для изотипа IgG1, но очень низкая или отсутствует для IgG2 и IgG4 из-за того, что эти изотипы имеют более низкую аффинность к FcgR. Кроме того, эффекторная функция IgG1 может быть модифицирована путем мутации аминокислотных остатков в пределах константных областей для изменения аффинности и селективности FcgR.

Связывание антител с рецепторами Fc-гамма (FcyR или FcgR) изучали с использованием биосенсорных технологий, включая поверхностный плазмонный резонанс Biacore (SPR) и биослойную интерферометрию Fortebio (BLI). Исследования SPR проводились на приборе Biacore T100 (GE Healthcare) при 25°С. Фрагмент Fab из мышиного антитела против анти-6xHis иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 с использованием EDC/NHS до плотности ~3000 RU. Различные FcgR с меткой his (7 мкг/мл) захватывали через С-концевую метку his, используя время контакта 30 с при 10 мкл/мин, и связывание антитела с концентрацией 1,0 мкМ оценивали в рабочем буфере 10 мМ NaPO4, 130 мМ NaCl, 0,05% р20 (PBS-T), рН 7,1. FcgR, использованные для этих экспериментов, включали CD64 (FcgRI), CD32a-H131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NAl (FcgRIIIb-NA1) и CD16B-NA2 (FcgRIIIb-NA2). Эксперименты BLI проводили на приборе Fortebio Octet RED (Pall, Fortebio) при 25°С в 10 мМ NaPO4, 130 мМ NaCl, 0,05% p20 (PBS-T) pH 7,1. Антитела захватывали из неразбавленных супернатантов экспрессии на сенсорах, покрытых белком А, с последующим связыванием аналитов 1 мкМ hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 или 0,1 мкМ hCD64.

Сначала были получены антитела, связывающиеся с различными мишенями, которые содержат модифицированные домены Fc IgG1, включая замены S267E (SE) и S267E/L328F (SELF), а также различные комбинации мутаций P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, упоминаемые как V4, V7, V8, V9 и V12. Связывание этих антител изучали с помощью Biacore SPR в сравнении с антителами IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) и IgG4.1 (IgG4-S228P), а также с антителом IgG1.1f, которое было разработано для уменьшения связывания со всеми FcgR. Результаты, которые показаны на фиг. 12, демонстрируют ожидаемые свойства связывания FcgR для IgG1f, IgG2.3 и IgG4.1 и мутированных антител IgG1, включая повышен

- 65 046941 ное связывание с CD32a-H131, CD32a-R131 и CD32b для SE и SELF, а также повышенную селективность мутантов V4, V7, V8, V9 и V12 в отношении CD32b по сравнению с CD32a-H131 и CD32a-R131, фиг. 12.

Следующий набор конструкций был использован для конструирования эффекторной функции в отрицательный изотип IgG2 эффекторной функции. Для этого исследования описанные выше мутации были введены в контексте константной области IgG2.3 или гибрида IgG2.3/IgG1f, названного IgG2.3G1-AY, табл. 19. Антитела в небольшом масштабе экспрессировали в виде супернатантов и тестировали на связывание с FcgR с использованием технологии Интерферометрического биосенсора Fortebio Octet BioLayer. Поскольку антитела присутствовали в супернатантах с низкой концентрацией, эксперимент проводили путем захвата антител из супернатантов с использованием сенсоров, покрытых белком А, с последующим связыванием аналитов FcgR в растворе. Очищенный и супернатантный контрольный IgGlf, включающий антитела IgG1, SE, P238D, V4 и V12 дикого типа, также были включены для сравнения, и каждое из этих контрольных антител продемонстрировало ожидаемые свойства связывания с FcgR, фиг. 13. Антитело IgG2.3 также продемонстрировало ожидаемый профиль связывания с заметным связыванием только с CD32a-H131. Однако все мутации для введения мутаций S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D или E233D в IgG2.3 не смогли воспроизвести аффинность FcgR соответствующих сконструированных mAb IgG1, фиг. 13. Напротив, конструкция IgG2.3G1-AY была способна полностью сохранять FcgR-связывающие свойства IgG1 дикого типа, в то же время сохраняя CH1 и шарнирные области IgG2.3. Кроме того, все мутанты IgG2.3G1-AY, содержащие S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D и E233D, продемонстрировали свойства связывания с FcgR, сравнимые с mAb версии IgG1, содержащими те же мутации, фиг. 13. Это демонстрирует успешное конструирование антител с CH1 и шарнирными участками IgG2 в сочетании с эффекторной функцией дикого типа или мутантного IgG1.

Таблица 19

Сконструированные конструкции IgG2

Набор	ID	Конструкция	Seq ID#
1	IgG2.3	hHC-IgG2-C219S
IgG2.3-V13	hHC-IgG2-C219S -P238D
IgG2.3-V14	hHC-IgG2-C219S - P238D,P271G
IgG2.3-V15	hHC-IgG2-C219S - P238D,H268D,P271G
IgG2.3-V16	hHC-IgG2-C219S - P238D,P271G,A330R
IgG2.3-V17	hHC-IgG2-C219S - P238D,H268D,P271G, A330R
IgG2.3-V18	hHC-IgG2-C219S - S267E
IgG2.3-V19	hHC-IgG2-C219S - S267E,L328F
2	IgG2.3Gl	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGl f
IgG2.3Gl-AY-V20	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf- P238D
	IgG2.3Gl-AY-V21	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - P238D,P271G
IgG2.3Gl-AY-V22	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - P238D,H268D,P271G
IgG2.3Gl-AY-V23	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - P238D,P271G,A330R
IgG2.3Gl-AY-V24	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - P23 8D,H268D,P271G, A3 3 OR
IgG2.3Gl-AY-V25	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - G237D,P238D,H268D,P271G,A330R
IgG2.3Gl-AY-V26	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - E23 3D, G23 7D,P23 8D,H268D,P271G, A3 3 OR
IgG2.3Gl-AY-V27	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf- S267E
IgG2.3Gl-AY-V28	hHC-IgG2-C219S/hHC-IgGlf - S267E,L328F

Эта инжиниринговая стратегия была дополнительно изучена путем получения других антител, отформатированных с помощью IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), а также вариантов формы IgG2-B (IgG2.5G1-AY и IgG2.5G1-AY-V27) и других гибридных антител, содержащих различные комбинации константных доменов IgG1 и IgG2, и тестирования связывания этих антител с антиhis Fab, захватывающими меченные his FcgR с использованием технологии Biacore SPR. В соответствии с данными супернатанта Octet данные SPR показали, что антитела IgG2.3G1-AY и IgG2.3G1-AY-V27

- 66 046941 обладали сопоставимыми свойствами связывания FcgR с IgGlf и IgG1f-S267E соответственно, несмотря на то что они содержали области CH1 и шарнирные области антитела А-формы IgG2 (IgG2.3) (фиг. 14А и В и табл. 20). Аналогичные данные были также получены с использованием антител IgG2.5G1-AY и IgG2.5G1-AY-V27, демонстрирующих успешное конструирование антител В-формы IgG2 (содержащих мутацию d31S, называемые IgG2.5), имеющих IgG1f или модифицированные подобные IgG1f эффекторные функции. Данные для нескольких других антител с константными областями IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY или IgG2.5G1-AY-V27, но с различными вариабельными областями, показывают, что эта инженерная стратегия широко применима к другим антителам, независимым от вариабельных доменов (фиг. 14А и 14В и табл. 20). Другими конструкциями, которые демонстрируют свойства связывания FcgR, подобного IgG1f, являются IgG1-G2.3G1-AY и IgG1deltaTHT, тогда как некоторые из модифицированных конструкций константной области были неспособны сохранять свойства связывания подобного IgG1f FcgR, включая конструкции IgG2.3G1-KH, IgG2.5G1-KH, IgG2.3plusTHT, IgG2.5plusTHT и IgG2.3plusGGG (фиг. 14А и 14В и табл. 20).

Таблица 20

Значения %Rmax для 1 мкМ антител, связывающихся с захваченными анти-his Fab белками FcgR-his

mAb	hCD64	hCD32a- H131	hCD32a- R131	hCD32b	hCD16a- V158	hCD16B- NA2
mAb8-IgGlf	80%	82%	51%	27%	51%	21%
mAb9-IgGlf	70%	33%	19%	4%	28%	10%
CD73.4-IgGlf	65%	46%	26%	6%	43%	17%
GITR.6-IgGlf	66%	35%	25%	8%	41%	19%

CD73.4-IgGl.lf	2%	0%	2%	1%	0%	0%
GITR.6-IgGl.lf	2%	0%	3%	1%	0%	0%

mAbll-IgG2.3	2%	44%	17%	5%	1%	0%
CD73.4-IgG2.3	3%	48%	11%	1%	1%	0%
mAb6-IgG2.3	3%	66%	14%	3%	1%	0%
GITR.6-IgG2.3	4%	40%	10%	1%	2%	0%
mAb4-IgG2.3	1%	39%	6%	1%	1%	0%
mAb5-IgG2.3	6%	100%	30%	4%	3%	0%
mAbl2-IgG2.3	2%	39%	7%	1%	1%	0%
mAbl3-IgG2.3	2%	40%	7%	1%	1%	0%

mAbll-IgG2.5	0%	40%	13%	3%	0%	-1%
mAb7-IgG2.5	4%	72%	19%	2%	2%	0%
mAb8-IgG2.5	3%	59%	14%	3%	2%	0%
mAblO-IgG2.5	1%	29%	5%	1%	1%	0%
CD73.4-IgG2.5	3%	40%	7%	1%	1%	0%
mAb6-IgG2.5	3%	75%	17%	4%	2%	0%
GITR.6-IgG2.5	4%	43%	13%	2%	2%	1%

- 67 046941

mAb4-IgG2.5	2%	46%	8%	1%	1%	0%
mAb5-IgG2.5	6%	89%	26%	5%	4%	1%
mAbl2-IgG2.5	1%	36%	6%	1%	1%	0%
mAbl3-IgG2.5	-2%	39%	4%	-2%	0%	-2%

mAb8-IgG2.3Gl-AY	77%	61%	38%	10%	38%	13%
mAblO-IgG2.3Gl- AY	67%	23%	14%	4%	24%	8%
CD73.4-IgG2.3Gl- AY	65%	38%	20%	5%	38%	14%
GITR.6-IgG2.3Gl- AY	66%	43%	33%	16%	42%	21%

mAb7-IgG2.5Gl-AY	80%	73%	45%	12%	47%	19%
mAb8-IgG2.5Gl-AY	77%	70%	45%	17%	48%	22%
CD73.4-IgG2.5Gl- AY	65%	43%	24%	7%	40%	16%
GITR.6-IgG2.5Gl- AY	65%	38%	27%	10%	41%	19%

CD73.4-IgG2.3Gl- KH	2%	15%	2%	0%	2%	0%
GITR.6-IgG2.3Gl- KH	3%	13%	3%	0%	3%	1%

CD73.4-IgG2.5Gl- KH	2%	17%	2%	0%	3%	0%
GITR.6-IgG2.5Gl- KH	2%	15%	3%	0%	3%	1%

CD73.4-IgG2.3Gl.lf- KH	1%	10%	1%	0%	1%	0%
GITR.6-IgG2.3Gl.lf- KH	2%	9%	2%	0%	1%	0%

- 68 046941


CD73.4-IgG2.5Gl .1 fкн	1%	6%	1%	0%	1%	0%
GITR.6-IgG2.5Gl.lf- КН	3%	15%	4%	0%	2%	0%

mAb7-IgG2.3Gl-AY- V27	84%	68%	92%	76%	26%	7%
mAb8-IgG2.3Gl-AY- V27	78%	67%	80%	67%	24%	7%
mAblO-IgG2.3Gl- AY-V27	69%	24%	57%	40%	12%	3%

mAb7-IgG2.5Gl-AY- V27	81%	74%	89%	84%	32%	9%
mAb8-IgG2.5Gl-AY- V27	77%	76%	79%	77%	33%	10%

CD73.4-IgGl- G2.3G1-AY	66%	50%	31%	10%	48%	23%
GITR.6-IgGl- G2.3G1-AY	66%	36%	25%	7%	42%	19%

CD73.4-IgGl- G2.3G1-KH	2%	18%	2%	0%	4%	1%
GITR.6-IgGl- G2.3G1-KH	2%	21%	2%	0%	5%	1%

CD73.4- IgGldeltaTHT	65%	43%	23%	6%	42%	17%
GITR. 6- IgGldeltaTHT	66%	57%	42%	17%	48%	27%

CD73.4- IgG2.3plusTHT	3%	42%	8%	1%	1%	0%
GITR. 6- IgG2.3plusTHT	6%	45%	17%	2%	3%	1%

CD73.4- IgG2.5plusTHT	2%	34%	7%	1%	1%	0%
GITR. 6- IgG2.5plusTHT	5%	44%	15%	2%	3%	1%

CD73.4- IgG2.3plusGGG	3%	43%	8%	1%	1%	0%
GITR. 6- IgG2.3plusGGG	6%	45%	17%	2%	3%	1%

Взятые вместе, эти данные показывают, что последовательность, непосредственно С-концевая с консервативным мотивом СРРСРАР в шарнирной области, придает опосредованную FcgR эффекторную функцию, тогда как CH1 и верхние части шарнира антитела могут быть заменены IgG2 или модифицированными последовательностями IgG2 для потенциального комбинирования эффекторных функций IgG1 и модифицированного IgG1 с превосходными интернализующими или сигнальными свойствами антител, содержащих CH1 и/или шарнирные области IgG2.

- 69 046941

Пример 9. Интернализация агонистических Ab к GITR усиливается в антителах, имеющих шарнир IgG2 и домен CH1.

Для индукции экспрессии GITR клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°С с 20 нг/мл анти-CD3 ⁺ 1000 нг/мл CD28. В качестве альтернативного способа активации Т-клеток большие партии активированных CD4⁺ Т-клеток готовили по трехстадийному протоколу культивирования. Вкратце, CD4⁺Т-клетки стимулировали связанным с планшетом CD3 (1,5 мкг/мл), дополненным 1 мкг/мл растворимого CD28 в течение 72 ч при 37°С, размножали в культуре в течение 14 дней в присутствии 20 ед/мл IL2 и, наконец, подвергали воздействию другого цикла активации путем добавления 10 мкг/мл РН А, 2 мкг/мл IL2 и 1 мкг/мл CD28 в течение 72 ч при 37°С. Стимулированные Т-клетки высевали в 384-луночные планшеты для визуализации PDL в течение 2 ч для прикрепления клеток, охлаждали в течение 15 мин при 4°С, а затем отдельно добавляли меченные Alexa 488 антитела к GITR в течение 1 ч. Наконец, планшеты визуализировали с помощью HCS, и данные были представлены как общая интенсивность на клетку.

Три различных антитела к GITR были оценены с использованием вышеупомянутых способов активации Т-клеток. Они представляют собой антитело к GITR.6 в качестве изотипа G1 и инертного (IgG1.1) изотипа, неспособного связываться с рецепторами Fc, а также химеры с шарниром IgG2 вместо шарнира IgG1.

Индуцированную антителами к GITR интернализацию оценивали в стимулированных CD3 CD4⁺Т-клетках с использованием формата анализа гашения Alexa. Свежеполученные положительные по CD4 Т-клетки инкубировали в соответствии с описанным выше для того, чтобы вызвать экспрессию GITR. После стимуляции клетки ресуспендировали в свежую среду и высевали для анализа на интернализацию следующим образом. Клетки инкубировали с антителом, как описано выше, промывали теплой средой и инкубировали при 37°С в течение указанного времени перед фиксацией и гашением. Интернализованное антитело измеряли как повышенную флуоресценцию выше небольшого негасимого сигнала, наблюдаемого в нулевой момент времени, а затем нормализовали по отношению к общей флуоресценции негасимого контроля, первоначально связанного с клетками. Как показано на фиг. 15, лигирование GITR приводило к быстрой интернализации с пиками между 30-60 мин для каждого тестируемого антитела, тогда как было обнаружено, что контрольные антитела поддерживают локализацию на плазматической мембране. Результаты показывают, что шарнирная область IgG2 усиливает интернализацию, индуцированную лигированием GITR.

Для дальнейшего изучения детальных механизмов интернализации и связанных динамик был проанализирован эндоцитоз и доставка антител в ранние компартменты эндосом. В этом эксперименте клетки подвергали пульс-чейз анализу с немечеными антителами. После фиксации клетки пермеабилизировали и окрашивали ранним эндосомным маркером ЕЕА1 (технология передачи сигналов клеток), промывали и затем детектировали с помощью вторичного анти-кроличьего антитела, конъюгированного с Alexa fluor-488 (EEA1), и анти-человеческого антитела, конъюгированного с Alexa fluor-647 (GITR). Пластины визуализировали на конфокальной системе Opera с 60-кратным водноиммерсионным объективом. Результаты показали четкую сегрегацию между окрашиванием мембраносвязанных антител к GITR и внутриклеточным сигналом ЕЕА1. При нагревании культур была обнаружена кластеризация для некоторых антител, которые, по-видимому, совместно локализуются с эндосомальными белками. Количественную оценку эндосомальной совместной локализации проводили с использованием Программного обеспечения HCS Studio, и результаты наносили на график как отношение интенсивности солокализованного пикселя к общему окрашиванию (фиг. 16). Солокализация антитела к GITR и ранней эндосомы наиболее выражена через 30 мин. В этот тестируемый момент времени GITR.6.G2.G1f показало более высокую солокализованную фракцию, чем антитело GITR.6.G1f. Результаты солокализации коррелируют с наблюдениями, сделанными с использованием описанного выше способа гашения Alexa, и подтверждают модель, предполагающую, что шарнир G2 обладает потенциальным преимуществом по сравнению с G1 для индуцирования интернализации GITR.

Пример 10. Передача сигналов агонистических Ab к GITR в CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетках, активированных Т-клеточным рецептором, усиливается в антителах, имеющих шарнир IgG2 и домен C_H1.

Для того чтобы дополнительно исследовать механизмы для агонистических антител к GITR, контролировали несколько сигнальных путей, вовлеченных в активацию Т-клеток, таких как сигнальные пути NFkB и Р38.

CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки от здорового донора (М6576) активировали планшетом, покрытым 0,4 мкг/мл анти-CD3 и 0,4 мкг/мл анти-CD28. Через 3 дня клетки собирали и высевали на 384-луночные планшеты для изображения для активации сигнализирования. После того как клетки оседали в планшете в течение 2 ч, их обрабатывали антителами к GITR в течение 15 мин, и события передачи сигналов прекращали, добавляя формальдегид в аналитический планшет до конечных 10%. Затем клетки пермеабилизировали и окрашивали антителом фосфор-р65 NFKB для обнаружения сигналов. Как показано на фиг. 17 антитела GITR.6.G2 и GITR.6.G2.G1f имели более высокие сигнальные ответы по сравнению с GITR.6.G1f как в CD4⁺, так и в CD8⁺ Т-клетках. Хотя прямых доказательств связывающей интернализации и активации сигнального пути нет, интересно отметить, что изотип G2, по-видимому, улучшает оба

- 70 046941 аспекта функциональной активности антител по сравнению с IgGl для GITR.6.

Для количественной оценки сигнальных активностей для каждого антитела были рассчитаны как ЕС50, так и Emax для каждого антитела, поскольку оба параметра являются критическими для захвата полной степени сигнального события. Уровень ответа GITR.6.G2.G1f выбран в качестве 100%-ного контроля, и все другие антитела были нормализованы против него. Как показано в табл. 21 для обеих популяций CD4+ и CD8+ Т-клеток, активированных антителами к CD3 и CD28, существует целый ряд активностей для антител к GITR с точки зрения как потенции (ЕС5₀), так и эффективности (Ema_x(%)). Хотя GITR.6.G2, GITR.6.G2.Glf и GITR.6.Glf продемонстрировали сходные потенции (ЕС5₀) в диапазоне 10 нМ, эффективность (Emax) была довольно разной для разных изотипов, предполагая, что антитело к G1 не передает сигнал так же эффективно, как G2 или химерные изотипы.

Таблица 21

Краткая информация о сигнальных активностях GITR HuMab NFkB в активированных TCR CD4+ и CD8+ Т-клетках

Антитело	CD4+ Т-клетки	CD8+ Т-клетки
ЕС50 (нМ)	Ешах (%)	ЕС50 (нМ)	Ешах (%)
GITR.6.G2	12.8	69	9.00	85
GITR.6.G2.Gif	9.00	100	3.77	92
GITR.6.Glf	7.3	10.8	20.05	27
Изотипический Контроль hlgGl	Неактивно	4	Неактивно	6

Для дальнейшего подтверждения, ограничивается ли различие сигнализации GITR.6.G2 и GITR.6.G2.G1f по сравнению с GITR.6.G1f только передачей сигналов NFkB или это верно и для других событий сигнализации, было исследовано считывание сигналов Р38 МАРК. Как показано на фиг. 18, антитела GITR.6.G2 и GITR.6.G2.G1f имели более высокие сигнальные ответы по сравнению с антителом GITR.6.G1f в анализе активации р38 МАРК клеток CD4+. Следовательно, лучшая сигнальная активность для изотипа GITR.6 G2 по сравнению с изотипом G1 не ограничивается только передачей сигналов NFkB.

В дополнение к повышенной агонистической активности и интернализации было также показано, что модифицированные константные области тяжелой цепи могут придавать усиленную ADCC (например, агонисту стимулирующего рецептора), а также придавать новую активность антителу. Например, было обнаружено, что изменение константного домена тяжелой цепи антитела, которое связывается с ингибирующей молекулой клеточной поверхности и предотвращает ингибирующую активность молекулы клеточной поверхности (антагониста) в отношении модифицированной константной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе, приводило к тому, что антитело теряет способность быть антагонистом и вместо этого наделяет его агонистической активностью (ингибирующей активностью).

Пример 11. Подтверждение дисульфидных связей конструкций IgG2.3 и IgG2.5.

Структуры дисульфидной связи в антителе, содержащем константный домен IgG2.3 (форма А), IgG2.3G1 (форма А) и IgG2.5 (форма В), были подтверждены как правильные при сравнении невосстановленного и восстановленного гидролизата Lys-C.

Образцы антител переваривали с помощью Lys-C, который специфически расщепляет пептидные связи на карбоксильной концевой стороне остатков Лизина (К, Lys). Пептиды в гидролизате разделяли с использованием колонки Waters ACQUITY ВЕН С18, 1,7 мкм, 2,1x150 мм, обращенно-фазовой колонки HPLC и детектировали с помощью ультрафиолетового (УФ) детектора при 214 нм и масс-спектрометра Thermo LTQ.

Ферментативное переваривание с помощью Lys-C и восстановление дисульфидных связей: В пробирку, содержащую 100 мкг образца антитела, добавляли 120 мкл денатурирующего буфера, в результате чего получали 3,7 М раствор GuHCl, 0,2 М Tris pH 7,0. Смесь инкубировали при 55°С в течение 30 мин. Алкилирование белка осуществляли добавлением 1 мкл 50 мМ йодацетамида в вышеупомянутый раствор, затем инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Алкилированный образец разбавляли 80 мкл dH₂O и добавляли Waco Lys-C при соотношении фермента к субстрату 1:10. Антитела переваривали в течение ночи в темноте при комнатной температуре. После расщепления из переваренного с помощью Lys-C образца удаляли аликвоту 100 мкл и добавляли 10 мкл 0,5 М DTT. Этот образец инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч для уменьшения дисульфидных связей.

Полученные результаты следующие.

Дисульфидная структура антител IgG2.3 и IgG2.3G1 (форма А): В пределах области Fab тяжелой цепи Cys22 (H) связан с Cys98 (H), a Cys 151 (Н) связан с Cys 207(H). В области Fc тяжелой цепи Cys265 (H) связан с Cys325 (H), a Cys371 (H) связан с Cys429 (Н). В области Fab легкой цепи Cys23 (L) связан с Cys88 (L), a Cys134 (L) связан с Cys194 (L). С-конец легкой цепи Cys214 (L) связан с тяжелой цепью в Cys138 (H). Шарнирная область тяжелой цепи содержит три остатка цистеина Cys227 (H), Cys230 (H) и

- 71 046941

Cys233 (Н), которые обеспечивают три межцепные дисульфидные связи. Наиболее вероятная связь представляет собой Cys227 (H) с Cys227 (H), Cys230 (H) с Cys230 (H) и Cys233 (H) с Cys233 (H), что является правильным теоретическим дисульфидным расположением IgG2 формы А.

Дисульфидная структура антитела IgG2.5 (форма В): В области Fab тяжелой цепи Cys22 (H) связан с Cys98 (H), a Cys151 (Н) связан с Cys 207 (Н). В области Fc тяжелой цепи Cys264 (H) связан с Cys324 (H), a Cys370 (H) связан с Cys428 (H). В области Fab легкой цепи Cys23 (L) связан с Cys88 (L), a Cys134 (L) связан с Cys194 (L). Шарнирная область тяжелой цепи содержит четыре цистеиновых остатка Cys226 (H), Cys227 (H), Cys230 (Н) и Cys233 (Н). С-конец легкой цепи Cys214 (L) связан с остатком цистеина тяжелой цепи в шарнирной области, а остальные три остатка цистеина обеспечивают три межцепные дисульфидные связи. Наиболее вероятной является связь Cys214 (L) с Cys226 (H), затем Cys227 (H) с Cys227 (H), Cys230 (Н) с Cys230 (H) и Cys233 (H) с Cys233 (Н), что является правильным теоретическим дисульфидным расположением IgG2 формы В. Кроме того, дисульфидные связи в шарнирной области были подтверждены с помощью тандемной масс-спектрометрии, инициируемой диссоциацией с переносом электронов (ETD), с использованием масс-спектрометра с ионной ловушкой.

Пример 12. Релевантность определенных аминокислотных остатков в C_H1 IgG2 и шарнире в улучшении агонизма GITR на Т-клетках.

Антитела к GITR (GITR.6) с константными областями тяжелой цепи, показанными в табл. 17, получали и тестировали в анализах продукции IL-2, как описано в примере 2, но в которых супернатанты собирали не через 48 ч, а через 40 ч.

Результаты, которые показаны на фиг. 20A-D, в основном, согласуются с результатами интернализации CD73 (см. фиг. 10), полученными с антителами к CD73, имеющими те же константные области тяжелой цепи, что и используемые в этом примере.

Пример 13. Устранение эффекторных функций с помощью мутации Р238К.

Вариабельные области антитела были слиты с Fc IgG1, который отличается от Fc IgG1 дикого типа одним аминокислотным остатком: Р238К (SEQ ID NO: 198). При этой единственной мутации антитело продемонстрировало отсутствие эффекторной функции, по существу не обнаруживая детектируемого сигнала связывания с низкоаффинными FclR hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 или hCD16b-NA2 (см. данные в примере 14). Кроме того, антитело с IgG1 P238K показало значительное понижение аффинности связывания с высокоаффинным FcVR CD64 (см. данные в примере 14). Связывание антитела с CD64 продемонстрировало более высокую скорость смещения (константу диссоциации) по сравнению с антителами с константным доменом IgG1 дикого типа.

Отсутствие эффекторной функции Fc IgG1, имеющего мутацию Р238К (SEQ ID NO: 198), также было продемонстрировано с вариантом антитела.

Таким образом, Fc человеческого IgG1 с единственной мутацией (Р238К), например, где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198, можно использовать в любых антителах, в которых эффекторные функции нежелательны.

Пример 14. Устранение эффекторных функций с помощью Р238К и дополнительных мутаций.

Дополнительные антитела были получены с Fc, имеющими мутацию(и), для дальнейшего понижения эффекторной функции, предпочтительно как ADCC, так и CDC. Мутанты были созданы для дальнейшего понижения связывания FcR, как показано в табл. 22. В частности, как показано выше, Р238К устраняет обнаруживаемое связывание с cFcR, за исключением CD64, поэтому целью было объединить Р238К с дополнительными мутациями для уменьшения связывания с CD64. Мутации были протестированы в контексте форматов изотипа IgG1, изотипа IgG2.3 и IgG2.5 и изотипа IgG2.3G1. Fc, используемые в этих антителах, содержат одну из аминокислотных последовательностей, имеющих SEQ ID NO: 234245 и 247-262.

Расположение мутаций показано на фиг. 21.

Связывание FcyR человека с антителами изучали методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы Biacore 8K (GE Healthcare). Для этих исследований белок А был иммобилизован на проточных ячейках 1-4 сенсорного чипа СМ5 с использованием стандартного реактива этил(диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/N-гидроксисукцинимид (NHS) с блокированием этаноламином в рабочем буфере 10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% сурфактанта р20, до плотности ~3000 RU. Очищенные антитела (10 мкг/мл) или экспрессионные супернатанты (разбавленные до ~10 мкг/мл) были захвачены на поверхности белка А до плотности ~1000-1200 RU, и связывание аналитов FcyR было протестировано в рабочем буфере, состоящем из 10 мМ NaPO4, 130 мМ NaCl, 0,05% р20, буфера (PBS-T), рН 7,1 при 25°С, с использованием времени ассоциации 120 с и времени диссоциации 120 с при скорости потока 20 мкл/мин. Данные анализировали с использованием оценочного программного обеспечения Biacore 8K, определяя измеренный отклик связывания как процент от теоретического максимального отклика связывания для каждого антитела (%Rmax), основываясь на уровне захваченного антитела, предполагая 100% фракционную активность и принимая во внимание только белковую массу без гликозилирования, как указано далее. Для сравнения связывания с FcyR различных молекул данные связывания SPR анализировали путем расчета максимального отклика связывания в процен

- 72 046941 тах от теоретического максимального отклика связывания (%Rmax), как в общем показано в Уравн. 1:

%Rmax = (Наблюдаемый Отклик Связывания Аналита) (Теоретический Максимальный Отклик Связывания Аналита) ур_авн ।

В частности, %Rmax был рассчитан с использованием уравнения: л (Отклик Связывания Аналита) %Rmax = >_MwAHaJWT)-----------------------------------(Mw Лиганд} ^х(О^тклик^^иганД^а)^х(^{стехиомет}Р^ия аналит:лиганд)

Уравн. 2 где Аналит представляет собой антитело, а Лиганд представляет собой захваченный белок FcyR. Этот анализ не учитывает массу гликозилирования антитела или FcyR и предполагает 100% фракционную активность для захваченного лиганда.

Анализ %Rmax особенно полезен для оценки связывания FcyR с низкими аффинностями, например hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16a-F158, hCD16b-NAl и hCD16b-NA2, которые имеют относительно высокие скорости ассоциации и диссоциации и аффинности вблизи или ниже тестируемой концентрации аналита (1 микромолярной (мкМ)), поэтому насыщение поверхности обычно не достигается в этих условиях. Напротив, высокоаффинный FcyR hCD64 связывается с более высокой аффинностью и более медленной кинетикой диссоциации, чем другие FcgR, особенно с IgG1 и IgG4, и, таким образом, эти изотипы обычно насыщают поверхность hCD64 при концентрациях микромолярного аналита и труднее дифференцировать аффинности, используя %Rmax. Для этих взаимодействий различия между антителами можно легко наблюдать путем сравнения скоростей диссоциации в данных сенсограммы.

Результаты показаны в табл. 22, а типичные данные сенсограммы представлены на фиг. 21A-21L.

Таблица 22

Связывание антител с Fc дикого типа или с мутированным Fc с FcyR показано в процентах от Rmax

Антитело	Образец	1 мкМ hCD64	10 мкМ hCD32a- Н131	10 мкМ hCD32a- R131	10 мкМ hCD32b	10 мкМ hCD16a- V158	10 мкМ hCD16a- F158	0.1 мкМ hCD64	1 мкМ hCD32aН131	1 мкМ hCD32aR131	1 мкМ hCD32b	1 мкМ hCD16a- V158	1 мкМ hCD16a- F158
Abl-hlgGlf	Очищен	126%	98%	93%	61%	116%	45%	126%	54%	43%	13%	81%	10%
Ab2-hIgGlf	Очищен	123%	98%	96%	73%	116%	65%	124%	65%	56%	20%	94%	17%
Abi-NF	Очищен	125%	97%	98%	76%	124%	130%	125%	55%	59%	22%	123%	104%
Ab33-IgG2.3	Очищен	16%	100%	69%	29%	27%	4%	2%	60%	21%	7%	6%	2%
Ab4-hzl-P238K	Очищен	116%	0%	1%	1%	-1%	-1%	88%	0%	0%	0%	0%	0%

Ab2-IgG1.3f-P238K	супернатант	1%	1%	3%	2%	0%	0%	0%	1%	1%	1%	0%	0%
Ab2-IgGlf-P238K	супернатант	109%	-3%	-2%	-2%	-4%	-4%	89%	1%	1%	1%	0%	0%
Ab2-IgGlf-L235E-P238K	супернатант	11%	1%	3%	3%	0%	-1%	2%	0%	1%	1%	0%	0%
Ab2-IgGlf-L235E-P238K- K322A	супернатант	11%	2%	5%	3%	0%	0%	2%	1%	1%	1%	1%	0%
Ab2-IgG2.3G1.3f-P238K	супернатант	2%	1%	3%	1%	0%	0%	0%	0%	1%	1%	0%	0%
Ab2-IgG2.3Gl-L235E-P238K	супернатант	16%	1%	4%	3%	1%	0%	2%	1%	1%	1%	1%	1%
Ab2-IgG2.3Gl-L235E-P238K- K322A	супернатант	16%	2%	5%	3%	0%	0%	2%	1%	1%	1%	1%	0%
Ab2-TgG2.5G1.3f-P238K	супернатант	2%	1%	3%	2%	0%	0%	0%	1%	1%	1%	1%	1%
Ab2-IgG2.5Gl-L235E-P238K- K322A	супернатант	15%	2%	5%	3%	0%	0%	2%	1%	1%	1%	1%	1%

Ab4-IgGlfa	супернатант	124%	99%	95%	71%	116%	59%	125%	63%	53%	19%	91%	15%
Ab4-IgG1.3fa	супернатант	7%	2%	29%	17%	4%	1%	1%	0%	4%	2%	1%	0%
Ab4-IgGlfa-P238K	супернатант	116%	1%	1%	1%	0%	0%	87%	1%	1%	1%	0%	0%
Ab4-IgGl fa-L23 5 A-P23 8K	супернатант	51%	0%	1%	0%	-1%	-1%	10%	0%	0%	0%	0%	0%
Ab4-IgGlfa-L235E-P238K	супернатант	9%	0%	3%	2%	0%	0%	1%	0%	1%	1%	0%	0%
Ab4-IgG1.3fa-P238K	супернатант	1%	0%	2%	1%	0%	-1%	0%	0%	1%	0%	0%	0%
Ab4-IgGlfa-L235E-P238K- K322A	супернатант	11%	1%	4%	1%	-1%	-1%	2%	0%	1%	0%	0%	0%
Ab4-IgG2.3	супернатант	16%	98%	73%	31%	34%	4%	2%	66%	23%	6%	7%	2%
Ab4-IgG2.3-P238K	супернатант	1%	1%	2%	1%	0%	0%	0%	2%	2%	2%	1%	1%
Ab4-IgG2.3Gl	супернатант	123%	95%	93%	72%	113%	62%	123%	62%	55%	21%	90%	16%
Ab4-IgG2.3Gl-P238K	супернатант	116%	0%	1%	1%	-1%	-2%	91%	0%	0%	0%	0%	-1%
Ab4-IgG2.5Gl-P238K	супернатант	118%	1%	2%	2%	0%	0%	94%	1%	1%	1%	1%	1%
Ab4-IgG2.3Gl-L235E-P238K	супернатант	13%	0%	3%	3%	0%	0%	2%	0%	1%	1%	0%	0%

Как показано в табл. 22 и на фиг. 22, комбинационные мутанты продемонстрировали очень слабое связывание с FcR. Добавление мутаций L235 к изотипу Р238К снижало связывание с CD64 до уровней, аналогичных IgG1.3f. L235E превосходил мутацию L235A в уменьшении связывания с CD64. Добавление мутации Р238К к IgG2 (IgG2.3-P238K) привело к полностью инертному изотипу, демонстрирующему отсутствие детектируемого связывания с каким-либо из белков FcR. Мутации также показали сходные тенденции в контексте форматов IgG1 и IgG2.xG1. Мутация К322А, которая снижает связывание с C1q (активность CDC) и была добавлена в некоторые конструкции, оказала минимальное влияние на связы- 73 046941 вание с FcR, поэтому не наблюдалось значительного эффекта К322А.

Пример 14. Устранение эффекторных функций с помощью Fc IgG1.3.

Этот пример описан в примерах 2 и 3 параллельно поданной заявки РСТ того же заявителя, озаглавленной MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH.

Этот пример показывает, что антитело или полипептид с Fc IgG1.3 по существу лишены: связывания с CD16, CD32a, CD32b и CD64. Это также наблюдалось, когда IgG1.3 Fc был связан с вариабельным доменом антител к TIM3 (см. WO 2018/013818). IgG1.3 был получен из Fc IgG1.1 (IgG1.1 представляет собой IgG1 с заменами L234A, L235E, G237A, A330S и P331S) путем удаления A330S и P331S, таким образом сохраняя 3 из 5 мутаций, т.е. L234A, L235E, G237A. Неожиданно было обнаружено, что отсутствие A330S и Р331S в Fc IgG1.1 не оказывает значительного влияния на инертность этого Fc. Ниже приведены типичные измерения связывания с FcyR для IgG1.1 и IgG1.3 (и других Fc для сравнительных целей), содержащих антитела и слитые белки, сравнивая инертность IgG1.1 и IgG1.3 в отношении антитела, а также в контексте белка без антител.

Материалы: и способы, использованные в этом примере, включают следующее.

Связывание с FcgR no SPR: Связывание с FcgR может быть измерено in vitro с использованием очищенных FcyR с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore™. В настоящем документе использовалось два способа.

В одном способе проверяется связывание очищенных антител или белков dAb-Fc с белками FcgR, меченными His (FcgR-His (FcgR используется взаимозаменяемо с FcyR), которые захватываются на иммобилизованном фрагменте Fab антитела анти-His. Эти эксперименты проводят на приборе Biacore™ T100 или Biacore™ T200 (GE Healthcare) при 25°С. Фрагмент Fab из мышиного антитела анти-6xHis (полученного своими силами) иммобилизуют на сенсорном чипе СМ5 с использованием стандартного реактива этил(диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/N-гидроксисукцинимид (NHS) с блокированием этаноламином до плотности ~3000 резонансных единиц RU в рабочем буфере из 10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностно-активного вещества р20 (HBS-EP+). Все остальные исследования выполняются с использованием рабочего буфера 10 мМ NaPO₄, 130 мМ NaCl, 0,05% р20 (PBS-T) при рН 7,1.

Различные белки FcgR, содержащие С-концевую 6-кратную полигистидиновую метку (полученные своими силами), были захвачены на этой поверхности (обычно с использованием концентрации белка FcgR-His ~7 мкг/мл) при времени контакта 30 секунд (с) при 10 мкл/мин. Различные концентрации очищенных антител или белков dAb-Fc тестируют на связывание, например используя время ассоциации 120 с при 30 мкл/мин и время диссоциации 120 с при 30 мкл/мин. Белки FcgR, протестированные в этих исследованиях, включают высокоаффинный FcgR hCD64 (hFcgRI), a также низкоаффинные FcgR hCD32a-H131 (FcgRIIa-H131), hCD32a-R131 (FcgRIIa-R131), hCD32b (FcgRIIb), hCD16a-V158 (FcgRIIIaV158), hCD16a-F158 (FcgRIIIa-F158), hCD16b-NAl (FcgRIIIb-NA1) и hCD16b-NA2 (FcgRIIIb-NA2).

Для того чтобы количественно проанализировать реакции связывания и сравнить связывание с FcgR различных молекул, данные связывания SPR могут быть проанализированы путем расчета максимального ответа связывания в процентах от теоретического максимального ответа связывания (%Rmax), как в общем показано в Уравн. 1:

1_п, _ (Наблюдаемый Отклик Связывания Ан алита) %Rmax = ----¹----------------------------(Теоретический Максимальный Отклик Связывания Аналита) „ , „

Уравн. 1

В частности, %Rmax был рассчитан с использованием уравнения:

%Rmax — (Отклик Связывания Аналита) (Mw Лиганд) ^х(^^тклик'^^иганД^а)^х(^{стехиомет}Р^ия аналит:лиганд)

Уравн. 2 где Аналит представляет собой антитело или dAb-Fc, а Лиганд представляет собой захваченный белок FcgR. Этот анализ не учитывает массу гликозилирования антител, dAb-Fc или FcgR, и предполагает 100%-ную фракционную активность для захваченного лиганда.

Анализ %Rmax особенно полезен для оценки связывания FcgR с низкой аффинностью, например, hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16a-F158, hCD16b-NAl и hCD16b-NA2, которые имеют относительно высокие скорости ассоциации и диссоциации и аффинности вблизи или ниже тестируемой концентрации аналита (1 мкМ), поэтому насыщение поверхности обычно не достигается в этих условиях. В противоположность этому, высокоаффинное FcgR hCD64 связывается с более высокой аффинностью и более медленной кинетикой диссоциации, чем другие FcgR, в частности IgG1 и IgG4, и, таким образом, эти изотипы, как правило, насыщают поверхность hCD64 ниже микромолярных концентраций аналита, и является более трудным дифференцировать аффинности с использованием %Rmax. Для этих взаимодействий различия между антителами можно легко наблюдать путем сравнения скоростей диссоциации по данным сенсограммы.

Второй анализ SPR для тестирования взаимодействия между антителами или белками dAb-Fc с бел

- 74 046941 ками FcgR представляет собой способ захвата белка А. Эти эксперименты также проводят на приборе Biacore™ T100 или Biacore™ T200 (GE Healthcare) при 25°С. Для этих исследований белок А иммобилизуют на проточных ячейках 1-4 сенсорного чипа СМ5 с использованием стандартного реагента этил(диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/N-гидроксисукцинимид (NHS) с блокированием этаноламином в рабочем буфере из 10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностноактивного вещества р20, до плотности ~ 3000 RU. Антитела или белки dAb-Fc (обычно ~3-10 мкг/мл) захватываются на поверхности белка А, и связывание аналитов FcgR тестируют в рабочем буфере, состоящем из 10 мМ NaPO₄, 130 мМ NaCl, 0,05% р20, буфера (PBS-T) при рН 7,1 и при 25°С, используя, например, время ассоциации 120 с и время диссоциации 180 с при скорости потока 30 мкл/мин.

Анализ захвата белка А также можно использовать для анализа неочищенных супернатантов, содержащих молекулы антител или dAb-Fc. Для этого анализа антитела или белки dAb-Fc могут быть захвачены либо из неразбавленных супернатантов, либо из супернатантов, разведенных рабочим буфером. Для того чтобы количественно проанализировать реакции связывания и сравнить связывание с FcgR различных молекул, данные связывания SPR можно проанализировать, рассчитав %Rmax, используя Уравн. 1, где Аналит представляет собой очищенный белок FcgR, а Лиганд представляет собой захваченное антитело или белок dAb-Fc.

В дополнение к анализу %Rmax количественный анализ кинетики и аффинности связывания может быть выполнен путем тестирования титрования аналита FcgR для связывания с захваченными белком А антителами или белками dAb-Fc. Например, FcgR в серийном разведении 3:1 можно титровать от 10 мкМ до или 0,15 нМ (hCD64), или 1,5 нМ (все другие FcgR). Эти кинетические данные могут быть адаптированы либо к модели Ленгмюра 1:1, либо к модели стационарного связывания с использованием оценочного программного обеспечения Biacore™ T200 для получения значений кинетики и аффинности.

dAb-Fc: dAb-Fc, исследованные в этом примере, показаны в табл. 23. В этих последовательностях остатки одного вариабельного домена 3x56-269 представляют собой аминокислоты 1-118 (подчеркнуты). Линкер AST подчеркнут дважды.

Таблица 23

Seq #	ID Образца	Последовательность
263	3h56-269-IgG4.1 OR BMS-986090	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSA INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAV
YYCAKLP

- 75 046941

		FRFSDRGQGTLVTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP
PKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK
264	3h56-269-CT	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSA INPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YYCAKLP FRFSDRGQGTLVTVSSASTEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVF
LFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
265	3h56-269-IgGl.lf	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS
LRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
266	3h56-269-IgG1.3f	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS

		LRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
267	3h56-269-IgGl-D265A	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNS
LRAEDT AVYYCAKLPFRF SDRGQGTLVTVS S ASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

- 76 046941

Последовательности IgGl.lf и IgG1.3f, каждая из которых начинается с EPK (т.е. последовательности в SEQ ID NO: 77 и 78), которые показаны в табл. 23, идентичны последовательностям, начинающимся с EPK в SEQ ID NO 83 и 248 соответственно.

Контрольное mAb: Контрольное моноклональное антитело (1F4) также форматировали с аналогичными мутациями домена Fc. Последовательности отдельных цепей показаны в табл. 24, включая последовательность (SEQ ID NO: 268) части тяжелой цепи 1F4, включая вариабельную область и область CH1. Эта последовательность подчеркнута в последовательностях тяжелых цепей (SEQ ID NO: 269-275). Пара последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи для каждого варианта lF4 mAb показана в табл. 25.

Таблица 24

Seq ID No.	Идентичность последователь ности	Последовательность
268	1F4 Вариабельная область	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG

	тяжелой цепи и СН1	CLVKD YFPEP VT VS WNSGALT SGVHTFP A VLQ S SGL YSLS S VVTVP S S SL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
269	1F4 Вариабельная область легкой цепи и CL	EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASOSISSSYLAWYOOKPGOAPRLLIYG
ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOOYGSSPYTFGO
GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLS SP VTKSFNRGEC
270	lF4-IgGlf тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVS WNSGALT SGVHTFP A VLO S SGL YSLS S VVTVP S S SL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALP APIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
271	lF4-IgG4.1 тяжелая цепь	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALG
CLVKD YFPEP VT VS WNSGALT SGVHTFP A VLO S SGL YSLS S VVTVP S S SL
GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLG
272	lF4-IgGl.lf тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKD YFPEP VT VS WNSGALT SGVHTFP A VLO S SGL YSLS S VVTVP S S SL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

- 77 046941

		PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG
273	lF4-IgG1.3f тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTOTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
274	1F4-D265A тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAGKGLEWVS
AISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCAK
VDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEP VT VSWNSGALTSGVHTFP AVLOS SGLYSLS S VVTVPS S SL
GTOTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
275	1F4-CT тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCA
KVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTOTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
		NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK

Таблица 25

название mAb	НС	LC
lF4-IgGlf	SEQ #: 270	SEQ #: 269
lF4-IgG4.1	SEQ#: 271	SEQ #: 269
lF4-IgGl.lf	SEQ #: 272	SEQ #: 269
lF4-IgG1.3f	SEQ #: 273	SEQ #: 269
1F4-D265A	SEQ #: 274	SEQ #: 269
1F4-CT	SEQ #: 275	SEQ #: 269

Результаты: молекулы dAb-Fc были получены с мутациями в домене Fc для понижения связывания с FcgR. Конкретно, антитело 3h56-269 к домену CD40 было отформатировано со следующими вариантами домена Fc: IgG1.1f, IgG1.3f и IgG1-D265A. В каждом из 3h-56-269-IgG1.1f (SEQ ID NO: 77), 3h-56-269-IgG1.3f (SEQ ID NO: 78) и 3h-56-269-IgG1-D265A (SEQ ID NO: 79) аминокислоты 1-116 представляют собой 3h-56-269 dAb, аминокислоты 117-119 представляют собой линкер, а аминокислоты 120351 представляют собой домен Fc.

Было подтверждено, что каждый из этих слитых белков dAb-Fc, а также каждый из 3h56-269-IgG4.1 и 3h56-269-CT связывается с высокой аффинностью с очищенным мономером человеческого CD40 (мономером hCD40, полученным своими силами), что измеряется с помощью SPR Biacore™ Как показано в

- 78 046941 табл. 26, значения KD находятся в диапазоне от 7,3 до 11,5 нМ для различных вариантов Fc. Каждая из молекул dAb-Fc также связывала CD40 человека с высокой авидностью, что измеряли с помощью SPR с использованием hCD40-Fc на поверхности сенсорного чипа и молекул dAb-Fc в качестве растворимых аналитов в растворе, где данные для 250 и 25 нМ инъекций аналита dAb-Fc соответствовали модели Ленгмюра 1:1 с оценкой кажущихся значений KD, зависимых от авидности (^очевидная) для всех dAb-Fc как <1 нМ (см. табл. 26).

Таблица 26

Данные SPR для связывания молекул dAb-Fc с CD40 человека

Лиганд	связывание ЬСН40мономер с молекулами dAb-Fc, захваченными на иммобилизованной белком А поверхности (Аффинность)	связывание dAb-Fc с иммобилизованной поверхностью
		hCD40-Fc (Авидность)
ка (1/Мс)	kd (1/с)	КН(нМ)	КВочевидная (нМ)
3h56-269-IgG4.1	8.5Е+03	9.7Е-05	И.5	<1
3h56-269-CT	1.6Е+04	1 .ЗЕ-04	8.0	<1
1.6Е+04	1.2Е-04	7.3	<1
3h56-269-CT (UCOE-CHO)*	1.6Е+04	ЕЗЕ-04	7.7	<1
1.9Е+04	1.4Е-04	7.0	<1
3h56-269-IgGl.lf	9.6Е+03	1.0Е-04	10.8	<1
3h56-269-IgG1.3f	9.9Е+03	9.1Е-05	9.2	<1
1.1Е+04	1.1Е-04	9.8	<1
3h56-269-IgGl-D265A	1.1Е+04	9.9Е-05	9.0	<1

*3h-56-269-CT, экспрессированный и очищенный из клеток UCOE-CHO.

Свойства связывания с FcgR молекул dAb-Fc и различных контрольных моноклональных антител 1F4 были охарактеризованы с помощью SPR. Первый анализ включал связывание 1 или 10 мкМ dAb-Fc или контрольного человеческого антитела IgG1f (1F4-IgG1f) с поверхностями FcgR-His с захваченным анти-His Fab. Эти данные приведены в табл. 27.

Таблица 27

Данные %Rmax для 1 мкМ или 10 мкМ dAb-Fc или lF4-IgG1f контрольного антитела, связывающегося с белками hFcgR-His с захваченным анти-His Fab

Образец	Конц (мкМ)	FcgR с захваченным Анти-His Fab
FcgR c Высокой Аффинностью	FcgR с Низкой Аффинностью
hCD64	hCD32a- H131	hCD32a- R131	hCD32b	hCD16a- V158	hCD16b- NA2
lF4-IgGlf	1	65%	31%	19%	5%	31%	13%
3h56-269- IgG4.1	1	68%	27%	30%	20%	6%	1%
3h56-269-IgGl- D265A	1	68%	7%	2%	0%	1%	0%
3h56-269IgGl.lf	1	11%	1%	10%	3%	0%	0%

- 79 046941

3h56-269- IgG1.3f	1	12%	1%	8%	3%	1%	0%
3h56-269-CT	1	72%	0%	1%	0%	1%	0%
lF4-IgGlf	10	65%	62%	51%	24%	52%	36%
3h56-269- IgG4.1	10	69%	65%	66%	57%	27%	9%
3h56-269-IgGl- D265A	10	69%	33%	17%	2%	2%	-1%
3h56-269- IgGl.lf	10	39%	6%	43%	21%	3%	2%
3h56-269- IgG1.3f	10	39%	6%	37%	19%	5%	4%
3h56-269-CT	10	70%	2%	10%	3%	6%	-1%

В другом анализе аналиты FcgR (в концентрации 1 или 10 мкМ) тестировали на связывание с поверхностями dAb-Fc с захваченным белком А (данные показаны в табл. 28) и на связывание с поверхностями антител (данные показаны в табл. 29).

Таблица 28

Данные %Rmax для 1 мкМ или 10 мкМ FcgR, связывающихся с белками dAb-Fc с захваченным белком А

Образец	Конц (мкМ)	Белок dAb-Fc с захваченным Белком A
3h56- 269- IgG4.1	3h56269IgGlD265A	3h56- 269IgGl.lf	3h56- 269IgG1.3f	3h56- 269-CT
hCD64	1	99%	41%	1%	2%	80%
hCD32a-H131	1	29%	3%	0%	1%	1%
hCD32a-R131	1	31%	1%	4%	5%	1%
hCD32b	1	19%	0%	1%	2%	1%
hCD16a-V158	1	12%	0%	0%	1%	1%
hCD16B-NA2	1	2%	0%	0%	0%	0%
hCD64	10	119%	85%	3%	7%	114%
hCD32a-H131	10	70%	18%	4%	6%	7%
hCD32a-R131	10	71%	4%	18%	26%	7%
hCD32b	10	59%	1%	9%	12%	4%
hCD16a-V158	10	47%	2%	2%	6%	7%
hCD16B-NA2	10	13%	0%	1%	3%	1%

- 80 046941

Таблица 29

Данные %Rmax для 1 мкМ или 10 мкМ FcgR, связывающихся с антителами с захваченным белком А

Образец	Конц (мкМ)	Антитела с захваченным белком A
1F4- IgGlf	1F4- IgG4J	1F4- D265A	1F4- IgGLlf	1F4- IgG1.3f	1F4CT
hCD64	1	138%	126%	96%	8%	5%	120%
hCD32a-H131	1	62%	29%	7%	2%	1%	2%
hCD32a-R131	1	48%	33%	3%	5%	3%	2%
hCD32b	1	11%	17%	1%	1%	1%	1%
hCD16a-V158	1	97%	15%	1%	3%	2%	2%
hCD16B-NA2	1	33%	4%	1%	4%	3%	0%
hCD64	10	155%	139%	131%	17%	14%	131%
hCD32a-H131	10	99%	79%	38%	7%	6%	11%
hCD32a-R131	10	101%	87%	17%	28%	24%	13%
hCD32b	10	55%	68%	4%	11%	12%	8%
hCD16a-V158	10	125%	59%	2%	5%	7%	11%
hCD16B-NA2	10	81%	16%	-2%	4%	6%	1%

На основании ответов связывания или их отсутствия в этих экспериментах была выбрана подгруппа взаимодействий dAb-Fc/FcgR или Ab/FcgR с более высокой аффинностью с наиболее сильными ответами связывания для характеристики кинетики/аффинности с использованием титрования аналитов (аналиты FcgR связываются с антителами или dAb-Fc с захваченным белком А). Эти данные представлены в табл. 30.

Таблица 30

Значения KD (в нМ) для очищенных аналитов FcgR, связывающихся с антителами или dAb-Fc с захваченным белком А

Образец
	hCD64	hCD32a- H131	hCD32a- R131	hCD32b	hCD16a- V158	hCD16B- NA2
lF4-IgGlf	0.2	920	1400	>5000	430	4800
lF4-IgG4.1	0.58	3700	2400	3100	>5000	>5000
3h56-269-IgG4.1	2.8	>5000	2200	>5000	>5000	>5000
3h56-269-IgGl- D265A	62
3h56-269-IgGl.lf	>5000
3h56-269-IgG1.3f	>5000	>5000	>5000	>5000	>5000	>5000
3h56-269-CT	4.6	>5000	>5000	>5000	>5000	>5000

В совокупности эти данные SPR связывания FcgR показывают, что молекулы изотипа IgG1f и IgG4.1 имеют значительно более высокую аффинность FcgR среди всех FcgR по сравнению с модифицированным вариантом Fc IgG1-D265A, IgG1.1f, IgG1.3f или молекулами СТ. Из модифицированных вариантов Fc аффинность связывания hCD64 была самой сильной для 3h56-269-CT (K_D=4,6 нМ), более слабой для 3h56-269-IgG1-D265A (Kd=62 нМ) и самой слабой для 3h56-269-IgG1.1f и 3h56-269-IgG1.3f, для которых аффинность была слишком слабой для количественного определения в тестируемых условиях (K_D > 5 мкМ, что составляет половину самой высокой протестированной концентрации аналита). Все другие взаимодействия FcgR (hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16b-NA2) для вариантов IgG1-D265A, IgG1.1f, IgG1.3f и СТ также были слишком слабыми, чтобы получить достоверные значения KD (K_D>5 мкМ). Однако в данных %Rmax могут наблюдаться различия в относительных реакциях связывания. Например, вариант IgG1-D265A имеет более сильный ответ связывания для hCD32a-H131 по сравнению с вариантами IgG1.1f, IgG1.3f или СТ (табл. 28). Напротив, варианты IgG1.1f и IgG1.3f имеют более сильные ответы связывания для hCD32a-R131 по сравнению с вариантами IgG1-D265A и СТ (табл. 28).

IgG1.3, содержащие слитый белок или антитело, оценивали с помощью DSC, icIEF и массспектрометрии. Материалы и способы описаны ниже.

Дифференциальная сканирующая калориметрия: Эксперименты с DSC проводили на приборе MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern Instruments, Malvern, UK) в 10 мМ NaPO₄, 130 мМ NaCl pH 7,1. Об

- 81 046941 разцы 1 мг/мл dAb-Fc или антитела были протестированы с использованием диапазона сканирования 10-110°С и скорости сканирования 90°С/ч. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения MicroCal-Origin 7.0.

Визуализированная капиллярная изоэлектрическая фокусировка: Эксперименты icIEF проводились на ProteinSimple iCE3™ System (ProteinSimple, San Jose, CA). Для этих исследований образцы dAb-Fc или антитела, обычно в концентрации 2 мг/мл, смешивали с носителем из смеси амфолитов, состоящей из 2 М мочевины, 0,35% метилцеллюлозы, 1% Фармалита 5-8, 3% Фармалита 8-10,5 и маркеров pI 5,85 и 10,10 до конечной концентрации белка 0,20 мг/мл и анализировали с использованием времени предварительной фокусировки 1 мин при 1,5 кВ и времени фокусировки 10 мин при 3 кВ.

Масс-спектрометрия: Для масс-спектрометрического (масс-спек) анализа образцы восстанавливали с использованием 100 мМ DTT, и N-дегликозилирование проводили с пептидом: N-гликозидазой (FPNGaseF). Используемые приборы для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS) представляли собой Waters Synapt® G2 (Waters Corporation, Milford, MA) с Waters Acquity® UPLC (ультраэффективная жидкостная хроматография). Колонка UPLC представляла собой Waters Acquity® ВЕН (гибридная частица с этиленовым мостиком) С4 (2,1x150 мм, 300 А, 1,7 мкм). Градиент составлял от 10 до 38% (Подвижная фаза В) в течение 10 мин при скорости потока 200 мкл/мин. Подвижная фаза А содержала 0,1% муравьиной кислоты в воде. Подвижная фаза В содержала 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Температура колонки составляла 60°С. Анализ данных проводился вручную с помощью программного обеспечения Waters MassLynx™; спектральная деконволюция была выполнена с помощью алгоритма MaxEntl.

Ускоренные исследования стабильности: Ускоренные исследования стабильности проводились путем первого экстенсивного диализа молекул dAb-Fc в целевых рецептурных буферах при 4°С. Образцы отбирали и концентрировали, используя ультрацентробежные фильтрующие установки Amicon® (Merck KgaA, Germany), и готовили при различных целевых концентрациях в диализном буфере. Эти образцы инкубировали при различных температурах, обычно 4, 25, 32 и/или 40°С, в течение нескольких недель, отбирая аликвоты и анализируя с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Аналитическую эксклюзионную хроматографию проводили на Agilent 1260 HPLC, используя колонку Shodex™ K403-4F (Showa Denko America, Inc., New York, NY) в подвижной фазе из 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,3 скорость потока 0,3 мл/мин.

Результаты - Дифференциальная сканирующая калориметрия: DSC может использоваться для измерения термостабильности белка. Наилучшие значения Tm приведены в табл. 31.

Таблица 31

Значения термической температуры плавления (Tm) для молекул dAb-Fc, определенные с помощью DSC

	Tm dAb и доменов CH2	Tm домена CH3 (°C)
Образец	Tml (°C)	Tml (°C)
3h56-269-IgG4.1	62.8		69.6
3h56-269-CT	55.4	60.4	83.2
3h56-269-IgGl.lf	59.0	61.6	82.3
3h56-269-IgG1.3f	57.0	62.8	81.9
3h56-269-IgGl-D265A	56.4	61.4	82.4

На основании характерных профилей термической денатурации для доменов Fc IgG переходу домена Fc C_H3 для 3h56-269-IgG4.1 было присвоено значение перехода со средней точкой (Tm) 69,6°С; и домену Fc CH3 различных молекул IgG1 был присвоен переход с Tm вблизи ~82-83°С. Денатурация домена dAb и домена C_H2 для dAb-Fc были отнесены к переходу(ам) ниже 65°С, которые отличаются между различными конструкциями, как по началу термической денатурации (T_onset), так и по форме разворачивающегося перехода, и лучше всего подходят значения Tm. Например, термический переход для доменов dAb и C_H2 3h56-269-IgG4.1 проявляется как одиночный перекрывающийся или кооперативный переход со значением Tm 62,8°С. Все профили денатурации для доменов dAb и CH2 3h56-269-IgG1D265A, 3h56-269-IgG1.1f и 3h56-269-IgG1.3f соответствуют более асимметричному переходу, который лучше всего описан двумя переходами, имеющими значения Tm между ~56-63°С. 3h56-269-CT имел самую низкую T_onset, начинающую разворачиваться около 40°С, с широким термическим переходом и самыми низкими установленными значениями Tm Tm1=55,4°C и Tm2=60,4°C.

Результаты - Визуализированная капиллярная изоэлектрическая фокусировка (icIEF): Визуализированная капиллярная изоэлектрическая фокусировка (icIEF) может использоваться для характеристики однородности или неоднородности образца. Способность генерировать однородный продукт является еще одним важным критерием развития. Следовательно, во время открытия и оптимизации нового белкового терапевтического средства различные аналитические способы используются для характеристики и количественного определения неоднородностей образца, а также для выбора наиболее гомогенных

- 82 046941 молекул.

Профили заряда для молекул dAb-Fc были охарактеризованы с помощью icIEF. Данные показаны на фиг. 23. Профили icIEF для 3h56-269-IgG4.1 (фиг. 23A), 3h56-269-IgG1.1f (фиг. 23Е) и 3h56-269IgG1.3f (фиг. 23F) все относительно просты, причем каждый состоит из отчетливого основного пика с площадью 69-86% и между двумя и четырьмя вариантами заряда в более низкой представленности. Этот профиль icIEF аналогичен типичному профилю, полученному для антитела. Основным пиком для 3h56-269-IgG1-D265A (фиг. 23D) является несколько более низкая представленность (49%) с соответствующим более высоким уровнем кислых вариантов по меньшей мере с шестью обнаруживаемыми видами. Напротив, профиль для 3h56-269-CT (фиг. 23В) является высокогетерогенным, состоящим по меньшей мере из 16 различных видов и без четкого основного пика. Профиль icIEF для 3h56-269-CT, экспрессируемый в другой клеточной линии (UCOE-CHO), был одинаково гетерогенным (фиг. 23С), хотя распределение вариантов заряда значительно отличалось от материала, экспрессированного HEK293.

Результаты - Масс-спектрометрия: Типичное гликозилирование в домене Fc IgG или содержащих Fc белках представляет собой смесь G0F, G1F и некоторых видов G2F. Другие гликоформы, такие как сталированные или нефукозилированные формы, как правило, обнаруживаются в значительно меньшей численности или на неопределяемых уровнях.

Для того чтобы охарактеризовать профили гликозилирования белков dAb-Fc и сравнить белки dAbFc с контрольными антителами с аналогичными мутациями Fc, были проведены массспектрометрические эксперименты. Данные приведены в табл. 32.

Таблица 32

Обнаруживаемые гликоформы в молекулах dAb-Fc и антител, определенные способом масс-спектрометрии

Образец	GOF	GIF	G2F	G2FS1	G2FS2
3h56-269-IgG4.1	67%	29%	4%
3h56-269-IgGl.lf	32%	58%	9%
3h56-269-IgG1.3f	42%	55%	3%
3h56-269-IgGl-D265A	4%	37%	43%	13%	2%
lF4-IgGlf	68%	32%
lF4-IgG1.3f	26%	64%	10%
1F4-D265A	27%	40%	27%	4%	2%

Данные масс-спектрометрии для контрольных антител lF4-IgG1f и lF4-IgG1.3f, а также для антител dAb-Fc 3h56-269-IgG4.1, 3h56-269-IgG1.1f, 3h56-269-IgG1.3f, показали, что эти белки состоят из типичной смеси гликоформ G0F, G1F с более низким содержанием видов G2F.

Таким образом, IgG1 .3 (константная область тяжелой цепи и Fc) по существу лишен связывания с CD16, CD32a, CD32b и CD64 и обладает хорошими биофизическими свойствами. Это также наблюдалось, когда Fc IgG1.3 был связан с вариабельным доменом антител к TIM3 (см. WO2018/013818). Было показано, что антитело к TIM3, содержащее IgG1.3, обладает хорошей термической стабильностью (Tm1=68,1°C, Tm2=80,3°C, Tm3=82,6°C) и термической обратимостью (95,6% при 74°С, 25,5% при 80°С), что говорит о том, что молекула сохраняет свою структурную целостность при термическом стресс и обладает устойчивыми свойствами рефолдинга при снятии стресса.

Таблица 33

Последовательности

SEQ ID NO	Описание	Последовательность
1	Полноразмерный IgGl дикого типа	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

- 83 046941

		DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2	CHI IgGl дикого типа	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS S VVT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKV
3	Шарнир IgGl дикого типа	EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
4	СН2 IgGl дикого типа	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC I<VSNI<ALPAPIEI<TISI<AI<
5	СНЗ IgGl дикого типа	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6	Полноразмерный IgG2 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7	CHI IgG2 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTV
8	Шарнир IgG2 дикого типа	ERKCCVECPPCPAPPVAG
9	СН2 IgG2 дикого типа	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPAPIEKTISKTK
10	СНЗ IgG2 дикого типа	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 84 046941

и	Полноразмерный IgG3 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS S VVT VP S S SLGTQT YTCNVN HKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
12	CHI IgG3 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YTCNVN HKPSNTKVDKRV
13	Шарнир IgG3 дикого типа	ELKTPLGDTTHTCPRCPE
14	СН2 IgG3 дикого типа	PKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFK WYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGI< EYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK
15	СНЗ IgG3 дикого типа	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES SGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCS VMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
16	Полноразмерный IgG4 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
17	CHI IgG4 дикого типа	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRV
18	Шарнир IgG4 дикого типа	ESKYGPPCPSCPAPEFLGG

- 85 046941

19	CH2 IgG4 дикого типа	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAK
20	СНЗ IgG4 дикого типа	GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
21	Модифицированный IgG2 Шарнир (C219S)	ERKSCVECPPCPAPPVAG
22	IgG2/IgGl гибридный шарнир	ERKCCVECPPCPAPELLGG
23	IgG2 C219S/IgGl гибридный шарнир	ERKSCVECPPCPAPELLGG
24	Модифицированный СН2 IgGl (A330S/P331S)	PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC I<VSNI<ALPSSIEI<TISI<AI<
25	IgGl.l Шарнир (L234A/L235E/G237A)	EPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGA
26	IgGl-IgG2-IgGl (IgGl- IgG2/IgGl(SEQ#22)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
27	IgGl-IgG2-IgG12 (IgGl-IgG2(SEQ#8)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

- 86 046941

28	IgG2-IgGl (IgG2- IgG2/IgGl(SEQ#22)- IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S SNFGTQT YTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
29	IgG2-IgG12 (IgG2-IgG2(SEQ#8)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
30	IgGl-IgG2-IgGl.l (IgGl-IgG2(SEQ#8)IgGl(A330S/P331S)IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
31	IgG2-IgGl.l (IgG2-IgG2(SEQ#8)IgGl(A330S/P331S)IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
32	IgGl-IgG2CS-IgGl (IgGl-IgG2(C219S)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 87 046941

		EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
33	IgGl-IgG2CS-IgG12 (IgGl-IgG2(C219S)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
34	IgG2CS-IgGl (IgG2-IgG2(C219S)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
35	IgG2CS-IgG12 (IgG2-IgG2(C219S)IgGl-IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
36	IgGl-IgG2CS-IgGl.l (IgGl-IgG2(C219S)IgGl(A330S/P331S)- IgGl)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

- 88 046941

37	IgG2CS-IgGl.l (IgG2-IgG2(C219S)- IgGl(A330S/P331S)IgGl)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
38	Ab 11F11 VH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPG KGLEWVAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDT AV YYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S
39	Ab 4C3 VH	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDT AL YYC VKGYYVILTGLD YWGQGTL VT VS S
40	Ab CD73.10 VH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S
41	Ab CD73.3 VH (4C3 / V94A)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDT VL YYC VKGYYVILTGLD YWGQGTL VT VS S
42	Ab 6E11 VH	EVQLVESGGALVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGITWNSGGIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDT AL YYC AKDRYYS S WLLFDNWGQGIL VT VS S
43	Ab CD73.4 VH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S
44	Ab 11F11 полноразмерный НС	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPG KGLEWVAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDT AV YYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S ASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT KVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

- 89 046941

		GQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
45	Ab 4C3 полноразмерный НС	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTALYYCVKGYYVILTGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
46	Ab 6Е11 полноразмерный НС	EVQLVESGGALVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGITWNSGGIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTALYYC AKDRYYS SWLLFDNWGQGILVT VS S ASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YICNVNHKP SNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
47	Ab CD73.10-IgG2-C219S полноразмерный НС	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S ASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSN TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG

- 90 046941

48	Ab CD73.10-IgG2- C219S-IgGl.l полноразмерный НС	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S ASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSN TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
49	Ab CD73.10-IgGl.l полноразмерный НС (IgGl.l - IgGl. 1 (L234A/L23 5E/G2 37A)- IgGl.l(A330S/P331S)IgGl.l)	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S ASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
50	Ab CD73.4-IgG2-C219S полноразмерный НС	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDT A VYYC ARGGS S W YPD SFDIWGQGTMVT VS S ASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSN TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG
51	Ab CD73.3-IgGl.l полноразмерный НС	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTVLYYCVKGYYVILTGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPS

- 91 046941

	(IgGl.l - IgGl. 1 (L234A/L23 5E/G2 37A)- IgGl.l(A330S/P331S)- IgGl.l)	VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
52	Полноразмерная константная область тяжелой цепи IgG2IgG2-IgG2-IgG2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
53	Полноразмерная константная область тяжелой цепи IgGl- IgGl -IgGl -IgGl	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
54	Полноразмерная константная область тяжелой цепи IgGlIgGl. 1 (L234A/L23 5E/G2 37A)-IgGl.l (A330S/P331S)-IgGl	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
55	Полноразмерная константная область тяжелой цепи IgG2-	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 92 046941

	IgG2/IgGl hybrid-IgGl- IgGl	EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
56	Полноразмерная константная область тяжелой цепи IgG2IgG2- IgGL 1(АЗЗО/РЗЗ 1S)IgGl	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
57	Table 2 - шарнирный домен	VDKRV
58	Table 2 - шарнирный домен	VDKTV
59	Table 2 - шарнирный домен	EPKSCDKTHT
60	Table 2 - шарнирный домен	ERK
61	Table 2 - шарнирный домен	ELKTPLGDTTHT
62	Table 2 - шарнирный домен	EPKS
63	Table 2 - шарнирный домен	ESKYGPP
64	Table 2 - шарнирный домен	СРРСР
65	Table 2 - шарнирный домен	CCVECPPCP
66	Table 2 - шарнирный домен	CPRCP
67	Table 2 - шарнирный домен	EPKSCDTPPPCPRCP
68	Table 2 - шарнирный домен	CDTPPPCPRCP

- 93 046941

69	Table 2 - шарнирный домен	CPSCP
70	Table 2 - шарнирный домен	APELLGG
71	Table 2 - шарнирный домен	APPVAG
72	Легкая цепь 11F11	DIQMTQ SP S SLS AS VGDRVTITCRASQGIS S WL AW YQQKPEK A PKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
73	Легкая цепь 4СЗ	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QYGSSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL S STLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
74	Легкая цепь 6D11	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QHYGSSFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL S STLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
75	Анти-GITR AbVH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVIWYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARGGSMVRGDYYYGMDVWGQGTTVTVS S
76	Анти-GITR Ab VL	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAP KLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QFNSYPYTFGQGTKLEIK
77	Анти-GITR Ab LC	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAP KLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QFNSYPYTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTEODSKDSTYSL
S STLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

78	IgGlf	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

- 94 046941

		DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
79	IgG2.3	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
80	IgG2.3Gl-AY	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
81	IgG2.3Gl-KH	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
82	IgG2.5	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

- 95 046941

		EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
83	IgGl. If	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
84	IgG2.3Gl.lf-KH	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
85	IgGl-deltaTHT	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
86	IgG2.3-plusTHT	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVETHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 96 046941

87	IgG2.3-plusGGG	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVEGGGCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
88	IgG2.5Gl.lf-KH	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
89	IgG2.5Gl-AY	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
90	IgG2.5Gl-KH	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
91	IgG2.5-plusTHT	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVETHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD

- 97 046941

		TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
92	IgGl-G2.3Gl-AY	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
93	IgGl-G2.3Gl-KH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
94	G2-G1-G1-G1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
95	G2.5-G1-G1-G1	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV

- 98 046941

		HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
96	G1-G2.3-G2-G2	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
97	Gl-KRGEGSSNLF	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW

- 99 046941

		QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
98	Gl-KRGEGS	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
99	Gl-SNLF	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNS GALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
100	IgGl-ITNDRTPR	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK

- 100 046941

		EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
101	Gl-SNLFPR	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVER KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
102	G2-RKEGSGNSFL	ASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
103	G2-RKEGSG	ASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER

- 101 046941

		KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
104	G2-NSFL	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
105	IgG2-TIDNTRRP	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 102 046941


106	G2-NSFLRP	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
107	G1-G1-G2-G1-AY	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
108	G1-G1-G2-G1-KH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK

- 103 046941

		EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
109	G2-G2.3-G1-G2-KH	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
110	G2.5-G2.3-G1-G2-KH	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
111	G2-G2.3-G1-G2-AY	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER

- 104 046941

		KSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
112	G2.5-G2.3-G1-G2-AY	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ИЗ	G1-G2.3-G1-G1-KH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

-105046941

		LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
117	G2-G1-G2-G2-KH	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
118	G2.5-G1-G2-G2-KH	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
119	IgG 1 -deltalllapHHp	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVS HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK

- 106 046941

		EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
120	IgG2-deltalHapHnp	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
121	IgG2.5-del talllap h ир	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
122	IgGl-deltaG237	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGV HTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKV DKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVS

- 107 046941

		HEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
123	IgG2-plusG237	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGV HTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S SNFGTQT YTCNVDHKP SNTK VDKTVER KSCVECPPCPAPPVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVV HQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
124	IgG2.4	ASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCSVEC PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
125	IgG2.3/4	ASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF

- 108 046941

		GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKSSVEC PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
126	Шарнир IgG2 C220S	ERKCSVECPPCPAPPVAG
127	IgG2/IgGl гибридный шарнир C220S	ERKCSVECPPCPAPELLGG
128	Часть шарнира IgG2 дикого типа	ERKCCVECPPCPAP
129	IgG2 шарнирная часть C219S	ERKSCVECPPCPAP
130	IgG2 шарнирная часть C220S	ERKCSVECPPCPAP
131	IgG2 шарнирная часть С219Х	ERKXCVECPPCPAP
132	IgG2 шарнирная часть С220Х	ERKCXVECPPCPAP
133	IgG2 CHl+IgG2 шарнир (дикого типа)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG
134	IgG2 с С219Х	ERKXCVECPPCPAPPVAG
135	IgG2 с С220Х	ERKCXVECPPCPAPPVAG
136	IgG2/IgGl гибрид с С219Х	ERKXCVECPPCPAPELLGG
137	IgG2/IgGl гибрид с С220Х	ERKCVECPPCPAPELLGG
138	IgG2/IgGl гибрид deltaG	ERKCCVECPPCPAPELLG
139	IgG2/IgGl гибрид с C219S deltaG	ERKSCVECPPCPAPELLG

- 109 046941

140	IgG2/IgGl гибрид с C220S deltaG	ERKCSVECPPCPAPELLG
141	IgG2/IgGl гибрид с С219Х deltaG	ERKXCVECPPCPAPELLG
142	IgG2/IgGl hybrid with C220X deltaG	ERKCXVECPPCPAPELLG
143	IgG2 дикого типа с Cконцевым X	ERKCCVECPPCPAPPVAGX
144	IgG2 c C219S с Сконцевым X	ERKSCVECPPCPAPPVAGX
145	IgG2 с C220S с Сконцевым X	ERKCSVECPPCPAPPVAGX
146	IgG2 с С219Х с Сконцевым X	ERKXCVECPPCPAPPVAGX
147	IgG2 с С220Х с Сконцевым X	ERKCXVECPPCPAPPVAGX
148	IgG2 шарнирная часть	PVAG
149	IgGl шарнирная часть	SCDKTHT
150	IgGl шарнирная часть 1	ELLG
151	IgGl шарнирная часть 2	ELLGG
152	IgG2.3-V13	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
153	IgG2.3-V14	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 110 046941

154	IgG2.3-V15	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
155	IgG2.3-V16	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPRPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
156	IgG2.3-V17	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPRPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
157	IgG2.3-V18	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
158	IgG2.3-V19	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 111 046941

		EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
159	IgG2.3Gl	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
160	IgG2.3Gl-V20	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
161	IgG2.3Gl-V21	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
162	IgG2.3Gl-V22	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 112 046941

163	IgG2.3Gl-V23	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
164	IgG2.3Gl-V24	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
165	IgG2.3Gl-V25	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
166	IgG2.3Gl-V26	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPDLLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
167	IgG2.3Gl-V27	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PRE

- 113 046941

		EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
168	IgG2.3Gl-V28	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
169	IgG2.3Gl-AY-V9-D270E	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEEGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
170	IgG2.3Gl-AY-Vll	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
171	IgG2.5Gl-AY-V9-D270E	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEEGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 114 046941

172	IgG2.5Gl-AY-Vll	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
173	IgGlf-GASDALIE	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPE EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
174	IgGlf-G236A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
175	IgG2.3Gl-AY-G236A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
176	IgG2.3Gl-AY- GASDALIE	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 115 046941

		EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
177	IgG2.5Gl-AY-G236A	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
178	IgG2.5Gl-AY- GASDALIE	STKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHK PSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
179	IgG2.3Gl.lf-AY	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
180	IgG2.3Gl.3f-AY	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 116 046941

181	IgG2.3Gl-AY-D265A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S SNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
182	IgG2.3Gl-AY-N297A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
183	IgG2.5Gl.lf-AY	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
184	IgG2.5Gl.3f-AY	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
185	IgG2.5Gl-AY-D265A	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL M1SRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 117 046941

		EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISK AKGQPREPQ VYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVK GF YP SDIA V EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
186	IgG2.5Gl-AY-N297A	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
187	СТ	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
188	CTf	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
189	IgG2.3-CT	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVESPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 118 046941

190	IgG2.5-CT	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S SNFGTQT YTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVESPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
191	IgGlfa-C226S	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CT<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
192	IgGlfa-C229S	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CT<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
193	IgGlfa-C226S,C229S	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CT<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
194	IgGlfa-P238S	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPK DTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

- 119 046941

		PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
195	IgGlfa-C226A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTAPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYKCI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
196	IgGlfa-C229A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPAPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYKCI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
197	IgGlfa-C226A,C229A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYKCI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
198	IgGlfa-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP API EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 120 046941

199	IgG2.3-R133K	ASTKGPSVFPLAPCSKSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
200	IgG2.3-E137G	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
201	IgG2.3-S138G	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
202	IgG2.3-E137G-S138G	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
203	IgG2.3-T214R	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKRVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 121 046941

		EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQ VYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVKGF YP SDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
204	IgG2.3-R217P	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KP SNTKVDKT VEPKS C VECPPCP APP VAGP S VFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
205	IgG2.3-R217S	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVESKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206	IgG2.3-V224A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCAECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
207	IgG2.3-E225A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVACPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 122 046941

208	IgG2.3-R133A	ASTKGPSVFPLAPCSASTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
209	IgG2.3-E137D	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSDSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
210	IgG2.3-E137Q	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSQSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
211	IgG2.3-S138T	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSETTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
212	IgG2.3-S138E	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSEETAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 123 046941

		EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
213	IgG2.3-E137A-S138I	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSAITAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
214	IgG2.3-E137I-S138A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSIATAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
215	IgG2.3-R217G	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVEGKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
216	IgG2.3-R217A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVEAKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 124 046941

217	lgG2.3-R2171	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVEIKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPP SREEMTKNQ VSLTCL VKGF YP SDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
218	IgG2.3-R217E	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVEEKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219	IgG2.3-R217K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVEKKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
220	IgG2.3-V224I	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCIECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
221	IgG2.3-E225D	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVDCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 125 046941

		EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
222	IgG2-G4.1-G4-G4	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
223	IgG4-G2.3-G2-G2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVESKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
224	IgG2-G4.1-G2-G2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
225	IgG4-G2.3-G4-G4	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVESKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

- 126 046941

226	IgG2-G2.3-G4-G4	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
227	IgG4-G4.1-G2-G2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
228	IgG4-G4.1-Gl-Gl	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
229	IgG4.1	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KP SNTKVDKRVESK YGPPCPPCP APEFLGGP S VFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
230	IgG4.1-R214T	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKTVESK YGPPCPPCP APEFLGGP S VFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 127 046941

		EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
231	IgG4.1-S217R	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVERKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
232	IgG4.1-S217P	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALT SGVHTFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDH KPSNTKVDKRVEPKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
233	IgGlfa	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
234	IgG1.3fa	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 128 046941

235	IgGlfa-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
236	IgG1.3fa-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
237	IgGlfa-L235E-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
238	IgGlfa-L235A-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGGKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
239	IgGlfa-L235E-P238K- K322A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

- 129 046941

		KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
240	IgG2.3	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
241	IgG2.3-P238K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
242	IgG2.3Gl	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
243	IgG2.3Gl-P238K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 130 046941

244	lgG2.3 G1-L23 5E-P23 8K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQ VYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVKGF YP SDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
245	IgG2.5Gl-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
246	hlgGlf	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
247	hIgGlf-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
248	hIgG1.3f	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

- 131 046941

		PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
249	hIgG1.3f-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT S GVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
250	hIgGlf-L235E-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT S GVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
251	h!gGlf-L235E-P238K- K322A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALT S GVHTFP AVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
252	IgG2.3G1.3f	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 132 046941

253	IgG2.3G1.3f-P238K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
244	IgG2.3Gl-L235E-P238K	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
254	IgG2.3Gl-L235E-P238K- K322A	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
255	IgG2.5	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
256	IgG2.5-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGKSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

- 133 046941

		EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
257	IgG2.5Gl	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
258	IgG2.5Gl-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
259	IgG2.5G1.3f	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
260	IgG2.5G1.3f-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 134 046941

261	IgG2.5Gl-L235E-P238K	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
262	IgG2.5Gl-L235E-P238K- K322A	ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
263	3h56-269-IgG4.1 ИЛИ BMS-986090	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSA INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAV
YYCAKLP FRFSDRGOGTLVTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK
264	3h56-269-CT	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSA INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAV
YYCAKLP FRFSDRGOGTLVTVSSASTEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVF LFPPK

- 135 046941

		PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
265	3h56-269-IgGl.lf	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNS
LRAEDT AVYYCAKLPFRF SDRGQGTLVTVS S ASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
266	3h56-269-IgG1.3f	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNS
LRAEDT AVYYCAKLPFRF SDRGQGTLVTVS S ASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
267	3h56-269-IgGl-D265A	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPG
KGLERVSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS
LRAEDT AVYYCAKLPFRF SDRGQGTLVTVS S ASTEPKSCDKTH
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

- 136 046941

268	1F4 Вариабельная область тяжелой цепи и СН1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFP AVLQ S SGL YSLS S VVT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVD KRV
269	1F4 Вариабельная область легкой цепи и CL	EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASOSISSSYLAWYOOKPGOA
PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC OOYGSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
270	lF4-IgGlf тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFP AVLQ S SGL YSLS SWT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVD
KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
271	lF4-IgG4.1 тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV
DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
272	lF4-IgGl.lf тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSV

- 137 046941

		FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVD
KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG
273	lF4-IgGE3f тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFD YWGQGTL VTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVD
KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG
274	1F4-D265A тяжелая цепь	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFD YWGQGTL VTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVD
KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
275	1F4-CT тяжелая цепь	EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGK
GLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSL
RAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFD YWGQGTL VTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD
KRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTP

EVTCVVVDVSHEDPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNS

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов выполнения, описанных в настоящем документе. Такие эквиваленты предназначены для охвата следующей формулой изобретения.

Claims

1. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с антигеном, участвующим в иммунной регуляции, где антитело содержит модифицированный константный домен тяжелой цепи, содержащий константный домен тяжелой цепи человеческого IgG, при этом модифицированный константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентична SEQ ID NO: 198, и где:

(a) аминокислота в положении 238 представляет собой лизин (K);

(b) модифицированный константный домен тяжелой цепи обладает пониженной эффекторной функцией относительно того же константного домена тяжелой цепи IgG, где аминокислотой в положении 238 является пролин (Р); и

- 138 046941 (c) константный домен тяжелой цепи IgG представляет собой константный домен тяжелой цепи IgG1 человека; и при этом:

(i) связывание антитела с hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD16a-V158 и/или hCD16b-NA2 снижено по сравнению с антителом с таким же константным доменом тяжелой цепи IgG, где аминокислота в положении 238 представляет собой Р; и (ii ) связывание антитела с CD64 имеет более высокую скорость диссоциации относительно антитела с константной областью IgG1 дикого типа.

2. Способ по п.1, в котором константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 234, 236, 237, 238, 239, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 259 или 260, включая С-концевой лизин или нет.

3. Способ по п.1 или 2, в котором связывание антитела с hCD32a-H131 или hCD32a-R131 является пониженным относительно антитела с таким же константным доменом тяжелой цепи IgG, где аминокислота в положении 238 представляет собой Р.

4. Способ по любому из пп.1-3, где у субъекта имеется рак легких, рак желудочно-кишечного тракта, рак яичников, рак печени, колоректальный рак, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак поджелудочной железы, рак мозга, рак желудка, рак молочной железы, рак толстой кишки, а также рак головы и шеи, рак костей или рак кожи.

5. Способ по любому из пп.1-3, где антитело ингибирует иммунный ответ у субъекта.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором антитело представляет собой полноразмерное антитело.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором антитело связывается с CD64 FcgR (hFcgRI) с высокой аффинностью с более высокой скоростью диссоциации (скоростью диссоциации) относительно антитела с константной областью IgG1 дикого типа.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором антитело не имеет детектируемого связывания при концентрации антитела 10 мкМ с FcyRs hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 или hCD16b-NA2 с низкой аффинностью и имеет более высокую скорость диссоциации относительно антитела с константной областью дикого типа.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором антитело обладает превосходящей термостабильностью относительно антитела с константной областью IgG1 дикого типа.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором антитело обладает пониженной гетерогенностью относительно антитела с константной областью IgG1 дикого типа.