EA046236B1 - METHOD FOR DIRECT SULPHATION OF POLYSACCHARIDES IN AN ENVIRONMENTALLY ACCEPTABLE SOLVENT - Google Patents
METHOD FOR DIRECT SULPHATION OF POLYSACCHARIDES IN AN ENVIRONMENTALLY ACCEPTABLE SOLVENT Download PDFInfo
- Publication number
- EA046236B1 EA046236B1 EA202292496 EA046236B1 EA 046236 B1 EA046236 B1 EA 046236B1 EA 202292496 EA202292496 EA 202292496 EA 046236 B1 EA046236 B1 EA 046236B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sulfate
- chondroitin sulfate
- molecular weight
- polysaccharide
- salt
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title description 44
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title description 44
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title description 44
- 239000002904 solvent Substances 0.000 title description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 45
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 45
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 20
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 19
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 claims description 13
- KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-5,5-dimethylimidazolidine-2,4-dione Chemical group CC1(C)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonic acid Substances OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 9
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims description 3
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 3
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 13
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 9
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 3
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 3
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N tetraethylammonium Chemical group CC[N+](CC)(CC)CC CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O pyridinium Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical compound C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- WBTNIBPKHFFZTK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dibutyldecan-5-ylazanium hydroxide Chemical group [OH-].C(CCC)C(C([NH3+])(CCCC)CCCC)CCCC WBTNIBPKHFFZTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000205842 Escherichia coli O5 Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003109 Karl Fischer titration Methods 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L disodium;3-aminonaphthalene-1,5-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000002743 phosphorus functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- -1 polysaccharide (unsulfated chondroitin Chemical class 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000005621 tetraalkylammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940073455 tetraethylammonium hydroxide Drugs 0.000 description 1
- LRGJRHZIDJQFCL-UHFFFAOYSA-M tetraethylazanium;hydroxide Chemical compound [OH-].CC[N+](CC)(CC)CC LRGJRHZIDJQFCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003698 tetramethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical group [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- FAKFSJNVVCGEEI-UHFFFAOYSA-J tin(4+);disulfate Chemical compound [Sn+4].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O FAKFSJNVVCGEEI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к новому способу сульфатирования, в частности сульфатирования сахаров, с использованием экологически приемлемых растворителей; способ также применим к полисахаридам и позволяет получать сульфатированные гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфат. Реакции этого типа обычно проводят в токсичных растворителях с высоким воздействием на окружающую среду, таких как диметилформамид, диметилацетамид и т.п. Ранее неизвестное открытие заключается в том, что реакцию сульфатирования можно проводить в уксусной кислоте - экологически приемлемом растворителе, что приводит к хорошим выходам конверсии, хорошему контролю степени сульфатирования и хорошей хемоселективности. Кроме того, способ не требует стадий введения защиты/снятия защиты гидроксильной группы, а может быть применен непосредственно к незащищенным сахарам. Он также применим к полисахаридам в широком диапазоне молекулярных масс. В частности, он может применяться к гликозаминогликанам и может быть полезен при приготовлении гепарина, кератансульфата, дерматансульфата и хондроитинсульфата.The invention relates to a new method of sulfation, in particular the sulfation of sugars, using environmentally acceptable solvents; the method is also applicable to polysaccharides and allows the production of sulfated glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate. This type of reaction is usually carried out in toxic solvents with high environmental impact, such as dimethylformamide, dimethylacetamide, etc. A previously unknown discovery is that the sulfation reaction can be carried out in acetic acid, an environmentally acceptable solvent, resulting in good conversion yields, good control of the degree of sulfation, and good chemoselectivity. In addition, the method does not require hydroxyl group protection/deprotection steps and can be applied directly to unprotected sugars. It is also applicable to polysaccharides over a wide range of molecular weights. In particular, it can be applied to glycosaminoglycans and can be useful in the preparation of heparin, keratan sulfate, dermatan sulfate and chondroitin sulfate.
Уровень техникиState of the art
Гликозаминогликаны (ГАГ, или мукополисахариды) представляют собой семейство полисахаридов, образованных прямой цепью дисахаридов, в которой чередуются простой сахар с аминосахаром; в дисахариде могут присутствовать одна или более сульфатных групп в различных положениях. Они присутствуют во многих тканях животных и особенно распространены в соединительной ткани, такой как кожа, хрящи и мягкие ткани в целом. К ГАГ относятся гепарин и гепарансульфат, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат и гиалуроновая кислота; последняя является единственным соединением без сульфатных групп. Гликозаминогликаны могут иметь разные профили сульфатирования и разную молекулярную массу, в зависимости от вида животных и органа или ткани происхождения.Glycosaminoglycans (GAGs, or mucopolysaccharides) are a family of polysaccharides formed by a straight chain of disaccharides alternating a simple sugar with an amino sugar; one or more sulfate groups may be present in a disaccharide in various positions. They are present in many animal tissues and are especially common in connective tissue such as skin, cartilage and soft tissue in general. GAGs include heparin and heparan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate and hyaluronic acid; the latter is the only compound without sulfate groups. Glycosaminoglycans can have different sulfation profiles and different molecular weights, depending on the animal species and organ or tissue of origin.
Хондроитинсульфат (ХС) представляет собой гликозаминогликан, состоящий из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты, присутствующий в сульфатных группах в различных положениях в дисахариде, и обычно присутствует в различных тканях животных; он является самым распространенным ГАГ у людей, где он содержится, в частности, в хрящах. В настоящее время его используют как в качестве инъекционного препарата, так и в качестве нутрицевтического продукта, при лечении остеоартрита и других воспалительных заболеваний суставов, в частности колена и кисти руки, как для человека, так и для ветеринарного использования.Chondroitin sulfate (CS) is a glycosaminoglycan composed of N-acetylglucosamine and glucuronic acid, present in sulfate groups at various positions in the disaccharide, and is commonly present in various animal tissues; it is the most abundant GAG in humans, where it is found particularly in cartilage. It is currently used both as an injectable drug and as a nutraceutical product in the treatment of osteoarthritis and other inflammatory diseases of the joints, particularly the knee and hand, for both human and veterinary use.
ХС обычно получают в качестве побочного продукта пищевой промышленности, в частности при разведении животных, таких как крупный рогатый скот и свиньи, или в рыбной промышленности, в частности от акул. В зависимости от ткани и вида происхождения хондроитинсульфат имеет разные характеристики, в частности с разным профилем сульфатирования и разной молекулярной массой; на последнюю также может влиять используемый способ приготовления. ХС можно классифицировать на основании последовательности дисахаридов, из которых он состоит; сульфатная группа может присутствовать в разных положениях в дисахаридах и в обоих сахарах (в основном в положениях 2, 4 и 6); хондроитины А и С имеют только одну сульфатную группу, тогда как В, Е и D имеют две сульфатные группы. Также могут присутствовать несульфатированные и трисульфатированные хондроитины.CS is usually obtained as a by-product of the food industry, particularly from animal husbandry such as cattle and pigs, or from the fishing industry, particularly from sharks. Depending on the tissue and type of origin, chondroitin sulfate has different characteristics, in particular with different sulfation profiles and different molecular weights; the latter may also be influenced by the cooking method used. CS can be classified based on the sequence of disaccharides of which it is composed; the sulfate group can be present in different positions in disaccharides and in both sugars (mostly in positions 2, 4 and 6); chondroitins A and C have only one sulfate group, while B, E and D have two sulfate groups. Unsulfated and trisulfated chondroitins may also be present.
Состав ХС животного происхождения, присутствующего на рынке, различается в зависимости от видов и тканей происхождения; молекулярная масса также различается, как правило, она выше в продуктах морского происхождения и ниже в продуктах, полученных от земных животных. Более того, ХС животного происхождения представляет собой очень гетерогенную смесь с точки зрения молекулярной массы полимеров, так как состоит из смеси короткоцепочечных (несколько кДа), среднецепочечных и длинноцепочечных (>100 кДа) полисахаридов. Для описания характеристик ХС также указывают его полидисперсность (дисперсия значений MW вокруг среднего) в дополнение к среднему значению MW. Описание композиции по происхождению продукта можно найти в WO 2012/159655, с. 2-3, табл. 1.The composition of animal cholesterol present on the market varies depending on the species and tissue of origin; molecular weight also varies, typically being higher in foods of marine origin and lower in foods derived from terrestrial animals. Moreover, animal-derived cholesterol is a very heterogeneous mixture in terms of the molecular weight of the polymers, as it consists of a mixture of short-chain (several kDa), medium-chain and long-chain (>100 kDa) polysaccharides. To describe the characteristics of a cholesterol, its polydispersity (dispersion of MW values around the average) is also indicated in addition to the average MW value. A description of the composition according to the origin of the product can be found in WO 2012/159655, p. 2-3, table. 1.
Средняя исходная молекулярная масса ХС (или других гликозаминогликанов) также может быть уменьшена, по желанию, путем контролируемой фрагментации полисахарида; в ХС животного происхождения с низкой средней молекулярной массой (ХС-НММ, LMW-CS) значение полидисперсности, как правило, еще выше, так как полисахаридные цепи фрагментируются статистическим образом как при кислотном, так и при радикальном гидролизе.The average initial molecular weight of cholesterol (or other glycosaminoglycans) can also be reduced, if desired, by controlled fragmentation of the polysaccharide; in CS of animal origin with a low average molecular weight (CS-LMM, LMW-CS), the value of polydispersity is usually even higher, since polysaccharide chains fragment statistically during both acidic and radical hydrolysis.
В дополнение к плохой стандартизации продукта, тот факт, что ХС имеет животное происхождение, очевидно, также сопряжен с другими рисками, такими как связанные с заболеваниями, передаваемыми от исходного животного к людям или домашним животным.In addition to poor product standardization, the fact that CS is of animal origin obviously also carries other risks, such as those associated with diseases transmitted from the source animal to humans or pets.
Для преодоления недостатков, вытекающих из животного происхождения, недавно было разработано производство хондроитинсульфата, получаемого полусинтетическим методом; несульфатированный предшественник, называемый K4, производят путем ферментации и затем превращают в хондроитинсульфат. K4 представляет собой полисахарид, который имеет ту же линейную структуру, что и хондроитин, но также содержит остатки фруктозы и не имеет сульфатных групп; он может быть произведен путем ферментации, например, из Е. coli О5:К4:Н4, как описано в WO 2001/02597 A1. K4 может быть легко дефруктозилирован химическим гидролизом, приводящим к получению линейного полимера под названием K4d, соответствующего структуре несульфатированного хондроитина, и из негоTo overcome the disadvantages arising from animal origin, the production of chondroitin sulfate, obtained by a semi-synthetic method, has recently been developed; a non-sulfated precursor called K4 is produced by fermentation and then converted to chondroitin sulfate. K4 is a polysaccharide that has the same linear structure as chondroitin, but also contains fructose residues and no sulfate groups; it can be produced by fermentation, for example, from E. coli O5:K4:H4, as described in WO 2001/02597 A1. K4 can be easily defructosylated by chemical hydrolysis resulting in and from a linear polymer called K4d, corresponding to the structure of unsulfated chondroitin
- 1 046236 получают ХС.- 1,046,236 receive cholesterol.
Альтернативно, полисахарид K4d также может быть произведен непосредственно путем ферментации с использованием подходящего рекомбинантного микробного штамма, как описано в WO 2012/004063.Alternatively, the K4d polysaccharide can also be produced directly by fermentation using a suitable recombinant microbial strain, as described in WO 2012/004063.
Последующее сульфатирование полисахарида K4d может происходить в контролируемых условиях для изменения степени сульфатирования (числа сульфатных групп на единицу дисахарида) с точки зрения положения введения сульфатной группы, как правило, в положении 4 или 6. Молекулярную массу также можно изменять, например подвергая высокомолекулярный полимер кислотному или радикальному гидролизу; это может быть сделано либо до, либо после сульфатирования, т.е. как с полисахаридом K4d, так и с хондроитинсульфатом. Этот процесс, с его вариантами, приводит к образованию хондроитинсульфата, имеющего желаемый профиль сульфатирования, с превосходной надежностью и без недостатков, характерных для продукта животного происхождения (US 2019/231810).Subsequent sulfation of the K4d polysaccharide can occur under controlled conditions to change the degree of sulfation (the number of sulfate groups per unit of disaccharide) in terms of the position of introduction of the sulfate group, typically at position 4 or 6. The molecular weight can also be changed, for example by exposing the high molecular weight polymer to acidic or radical hydrolysis; this can be done either before or after sulfation, i.e. with both K4d polysaccharide and chondroitin sulfate. This process, with its variations, results in chondroitin sulfate having the desired sulfation profile, with excellent reliability and without the disadvantages of an animal product (US 2019/231810).
Реакцию сульфатирования полимера K4d до сих пор проводили с применением различных сульфатирующих агентов, но всегда с использованием безводного органического растворителя, в частности диметилформамида (ДМФ); она не является процессом с низким экотоксикологическим воздействием.The sulfation reaction of the K4d polymer has so far been carried out using various sulfating agents, but always using an anhydrous organic solvent, in particular dimethylformamide (DMF); it is not a process with low ecotoxicological impact.
ДМФ является растворителем, который требует особых мер предосторожности, поскольку он не только легко воспламеняется, но также опасен для человека и окружающей среды; он токсичен для кожи и глаз, дыхательной системы и репродуктивной системы. Это также особенно опасно, поскольку вредно, если он вступает в контакт с кожей или его вдыхают. С учетом его токсических свойств экологические издержки, очевидно, также высоки; рекуперация и удаление сточных вод, содержащих ДМФ, являются дорогостоящими. В качестве альтернативы ДМФ в реакциях сульфатирования могут быть использованы диметилацетамид или N-метилпирролидон, однако они создают аналогичные экотоксикологические проблемы.DMF is a solvent that requires special precautions because it is not only highly flammable, but also hazardous to humans and the environment; it is toxic to the skin and eyes, respiratory system and reproductive system. It is also particularly dangerous as it is harmful if it comes into contact with skin or is inhaled. Given its toxic properties, the environmental costs are obviously also high; Recovery and disposal of wastewater containing DMF is expensive. Dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone can be used as alternatives to DMF in sulfation reactions, but they pose similar ecotoxicological problems.
ДМФ также является хорошим растворителем для сульфатирующих агентов; например, в Chopin et al., BioMed Research International, 2015, Article ID508656, гликозаминогликан сульфатируют с использованием ионных жидкостей в качестве реакционного растворителя, но ДМФ по-прежнему используют для растворения доноров сульфатной группы (комплексы SO3 с различными органическими основаниями). Кроме того, ДМФ образует комплекс с SO3, который представляет собой возможный сульфатирующий агент.DMF is also a good solvent for sulfating agents; for example, in Chopin et al., BioMed Research International, 2015, Article ID508656, glycosaminoglycan is sulfated using ionic liquids as the reaction solvent, but DMF is still used to dissolve sulfate group donors (SO 3 complexes with various organic bases). In addition, DMF forms a complex with SO 3 , which is a possible sulfating agent.
В качестве альтернативы ДМФ в качестве растворителя в реакциях, проводимых с микроволновым излучением, может быть использован ацетонитрил; см., например, de Paz Carrera et al., WO 2012/035188. Общее описание реакций сульфатирования органических молекул, включая полисахариды, можно найти в обзоре Desai et al., Tetrahedron, 66, 2907-18 (2010).As an alternative to DMF, acetonitrile can be used as a solvent in microwave-assisted reactions; see, for example, de Paz Carrera et al., WO 2012/035188. A general description of sulfation reactions of organic molecules, including polysaccharides, can be found in the review by Desai et al., Tetrahedron, 66, 2907-18 (2010).
ОпределенияDefinitions
K4: фруктозилированный, несульфатированный гликозаминогликановый полисахарид, имеющий следующую структурную формулу:K4: fructosylated, non-sulfated glycosaminoglycan polysaccharide having the following structural formula:
K4d: несульфатированный гликозаминогликановый полисахарид, свободный от остатков фруктозы, имеющий следующую структурную формулу:K4d: non-sulfated glycosaminoglycan polysaccharide, free of fructose residues, having the following structural formula:
Хондроитинсульфат: сульфатированный гликозаминогликановый полисахарид, имеющий следующую структурную формулу:Chondroitin sulfate: a sulfated glycosaminoglycan polysaccharide having the following structural formula:
R+,Re=H unnSOjNaR + ,Re=H unnSOjNa
Описание изобретенияDescription of the invention
Способ сульфатирования согласно изобретению позволяет использовать уксусную кислоту - экологически приемлемый растворитель, сохраняя при этом хороший контроль над реакцией как с точки зрения ее прохождения, т.е. степени сульфатирования, так и положения введения сульфатной группы, аThe sulfation method according to the invention allows the use of acetic acid, an environmentally acceptable solvent, while maintaining good control over the reaction both in terms of its progress, i.e. the degree of sulfation and the position of introduction of the sulfate group, and
- 2 046236 именно ее селективности. Кроме того, способ не требует стадий введения защиты и снятия защиты, что приводит к экономии сырья и снижению количества сточных вод. Способ включает увеличение молекулярной массы (MW), которое связано исключительно с введением новых сульфатных групп, но не влияет на длину полимера или влияет на него только контролируемым образом и, в частности, не вызывает фрагментацию; если требуется получить ХС-НММ (LMW-CS), MW конечного продукта может быть соответственно изменена по желанию путем объединения процессов синтеза (контролируемая фрагментация полисахарида K4d до или после сульфатирования на хондроитинсульфате) и процессов выделения (выделение осаждением или ультрафильтрацией). Таким образом, новый процесс обеспечивает получение ХС с желаемым профилем сульфатирования, молекулярной массой и полидисперсностью, который подходит для использования в пищевой и фармацевтической областях.- 2 046236 precisely its selectivity. In addition, the method does not require the stages of introducing protection and removing protection, which leads to savings in raw materials and a reduction in the amount of wastewater. The method includes an increase in molecular weight (MW), which is associated solely with the introduction of new sulfate groups, but does not affect the length of the polymer or affects it only in a controlled manner and, in particular, does not cause fragmentation; if it is desired to obtain LMW-CS, the MW of the final product can be suitably modified as desired by combining synthesis processes (controlled fragmentation of the K4d polysaccharide before or after sulfation on chondroitin sulfate) and isolation processes (isolation by precipitation or ultrafiltration). Thus, the new process provides CS with the desired sulfation profile, molecular weight and polydispersity, which is suitable for use in the food and pharmaceutical fields.
Способ согласно изобретению оказывает меньшее экологическое воздействие благодаря использованию экологически чистых растворителей и снижению объема производства сточных вод. В предпочтительном воплощении способа полученный продукт представляет собой натриевую соль низкомолекулярного хондроитинсульфата.The method according to the invention has a lower environmental impact due to the use of environmentally friendly solvents and reduced wastewater production. In a preferred embodiment of the method, the resulting product is the sodium salt of low molecular weight chondroitin sulfate.
В одном возможном воплощении сульфатируют полимерную соль K4d, предпочтительно тетраалкиламмониевую соль, более предпочтительно пиридиниевую соль либо тетраметил-, тетраэтил- или тетрабутиламмониевую соль. В альтернативном воплощении используют полисахарид K4d в кислой форме.In one possible embodiment, the polymer salt of K4d is sulfated, preferably a tetraalkylammonium salt, more preferably a pyridinium salt or a tetramethyl, tetraethyl or tetrabutylammonium salt. In an alternative embodiment, the K4d polysaccharide is used in acidic form.
В одном воплощении в качестве сульфатирующего агента используют комплекс SO3 с органическим основанием, такой как SO3Py или SO3NEt3, ДМФ и т.д. В альтернативном воплощении в качестве сульфатирующего агента используют хлорсульфоновую кислоту.In one embodiment, a complex of SO3 with an organic base such as SO 3 Py or SO 3 NEt 3 , DMF, etc. is used as the sulfating agent. In an alternative embodiment, chlorosulfonic acid is used as the sulfating agent.
В одном воплощении реакцию сульфатирования проводят с использованием уксусной кислоты в качестве растворителя.In one embodiment, the sulfation reaction is carried out using acetic acid as a solvent.
Способ согласно изобретению включает:The method according to the invention includes:
a) растворение или суспендирование полисахарида, такого как гликозаминогликан или его соль, в уксусной кислоте;a) dissolving or suspending a polysaccharide, such as a glycosaminoglycan or a salt thereof, in acetic acid;
b) добавление сульфатирующего агента;b) adding a sulfating agent;
c) проведение реакции в контролируемых температурных условиях, например, путем поддержания реакционной смеси между температурой замерзания уксусной кислоты или ее смесей с полисахаридами, подлежащими сульфатированию, и 70°С, более предпочтительно между 10 и 50°С и еще более предпочтительно между 10 и 20°С;c) carrying out the reaction under controlled temperature conditions, for example by maintaining the reaction mixture between the freezing point of acetic acid or mixtures thereof with the polysaccharides to be sulfated and 70°C, more preferably between 10 and 50°C and even more preferably between 10 and 20 °C;
d) отделение продукта от реакционного растворителя, например, путем прямой фильтрации, осаждения в органическом растворителе или хроматографии;d) separating the product from the reaction solvent, for example, by direct filtration, precipitation in an organic solvent or chromatography;
e) возможно, удаление органических или неорганических солей и других примесей из раствора гликозаминогликансульфата, например, путем диализа;e) optionally removing organic or inorganic salts and other impurities from the glycosaminoglycan sulfate solution, for example by dialysis;
f) возможно, извлечение реакционного растворителя, получаемого после отделения желаемого продукта, и повторное использование его в реакции, описанной в пункте а).f) optionally recovering the reaction solvent obtained after separation of the desired product and reusing it in the reaction described in point a).
Таким образом, раствор желаемого продукта получают в достаточно чистом виде для использования в области питания; если желательно получить продукт в твердой форме, раствор может быть подвергнут сублимационной сушке, распылительной сушке или высушен другим подходящим способом.In this way, a solution of the desired product is obtained in sufficiently pure form for use in the nutritional field; if it is desired to obtain the product in solid form, the solution may be freeze-dried, spray-dried, or dried by other suitable means.
Если необходимо получить продукт реакции с качеством, пригодным для использования в инъекциях, рекомендуется удалить из вышеуказанного раствора любые пирогены, например, путем депирогенизации с помощью углерода с последующей стерилизующей фильтрацией перед сушкой.If it is necessary to obtain a reaction product of injectable quality, it is recommended that any pyrogens be removed from the above solution, for example by depyrogenation with carbon followed by sterilizing filtration before drying.
Полный процесс начинается с производства капсульного полисахарида K4, полученного путем ферментации штамма Escherichia coli дикого типа О5:К4:Н4, как описано в WO 2001/02597 A1. После разделения биомассы надосадочную жидкость подвергают гидролизу в контролируемых условиях для удаления остатков фруктозы; получают водный раствор полисахарида K4d, который соответствует несульфатированному хондроитину. Указанный продукт можно дополнительно очистить для получения водного раствора дефруктозилированного высокомолекулярного полисахарида в виде натриевой соли. Затем этот продукт подвергают контролируемой фрагментации в кислых условиях, аналогично процессу, описанному Cho et al. в Biol. Pham. Bull. 27, (1), 47-51. Альтернативно, может быть использован процесс радикальной фрагментации с использованием перекиси водорода и сульфата железа, как раскрыто в IT 1224260, или с использованием гипохлорита натрия, как раскрыто в US 4977250. Реакцию обычно контролируют с помощью эксклюзионной ВЭЖХ (HLPC-SEC) для контроля молекулярной массы продукта; при достижении желаемой средней MW, например, между 5 и 30 кДа, реакцию останавливают путем добавления гидроксида натрия, карбоната натрия или другого основания до достижения нейтрального рН и охлаждения смеси до комнатной температуры.The complete process begins with the production of K4 capsular polysaccharide obtained by fermentation of the wild type Escherichia coli strain O5:K4:H4, as described in WO 2001/02597 A1. After separation of the biomass, the supernatant is hydrolyzed under controlled conditions to remove residual fructose; an aqueous solution of the K4d polysaccharide is obtained, which corresponds to unsulfated chondroitin. This product can be further purified to obtain an aqueous solution of the defructosylated high molecular weight polysaccharide in the form of a sodium salt. This product is then subjected to controlled fragmentation under acidic conditions, similar to the process described by Cho et al. in Biol. Pham. Bull. 27, (1), 47-51. Alternatively, a radical fragmentation process can be used using hydrogen peroxide and ferrous sulfate, as disclosed in IT 1224260, or using sodium hypochlorite, as disclosed in US 4977250. The reaction is usually monitored using size exclusion HPLC (HLPC-SEC) to control the molecular weight product; When the desired average MW is reached, for example between 5 and 30 kDa, the reaction is stopped by adding sodium hydroxide, sodium carbonate or other base until a neutral pH is reached and the mixture is cooled to room temperature.
Водный раствор низкомолекулярного полимера K4d подвергают ультрафильтрации полисульфоновыми мембранами с отсечкой от 500 до 5000 Да; в пермеате удаляют неорганические соли (в основном хлорид натрия и сульфат натрия) и сахара с очень низкой молекулярной массой. Таким образом, молекулярную массу полимера выбирают в узком диапазоне; можно также комбинировать две ультрафильтрации, одну с более высокой отсечкой и другую с более низкой отсечкой, чтобы еще больше сузить молеAn aqueous solution of low molecular weight polymer K4d is subjected to ultrafiltration with polysulfone membranes with a cutoff of 500 to 5000 Da; in the permeate, inorganic salts (mainly sodium chloride and sodium sulfate) and very low molecular weight sugars are removed. Thus, the molecular weight of the polymer is selected within a narrow range; it is also possible to combine two ultrafiltration units, one with a higher cutoff and one with a lower cutoff, to further narrow the mole
- 3 046236 кулярно-массовое распределение (низкая полидисперсность).- 3 046236 cular mass distribution (low polydispersity).
Фракция высокомолекулярного полимера, задержанная мембраной, может быть переработана в следующей партии.The high molecular weight polymer fraction retained by the membrane can be processed in the next batch.
Для получения полисахарида K4d в виде натриевой соли раствор можно концентрировать путем ультрафильтрации или тонкопленочного выпаривания, а затем высушить распылением; альтернативно, продукт может быть выделен путем сублимационной сушки. Получают по существу чистый полисахарид K4d (несульфатированный хондроитин), имеющий желаемую молекулярную массу; остаточное содержание воды составляет менее 5% и обычно менее 2% (титрование по Карлу Фишеру).To obtain the K4d polysaccharide as the sodium salt, the solution can be concentrated by ultrafiltration or thin film evaporation and then spray dried; alternatively, the product can be isolated by freeze-drying. An essentially pure K4d polysaccharide (unsulfated chondroitin) having the desired molecular weight is obtained; the residual water content is less than 5% and usually less than 2% (Karl Fischer titration).
Используя процедуру, очень похожую на описанную выше, можно получить калиевую, аммониевую или другую соль, используя соответствующие растворы для диализа или элюирования из смол (например, используя раствор KCl вместо NaCl).Using a procedure very similar to that described above, potassium, ammonium, or other salts can be prepared using appropriate dialysis or resin elution solutions (eg, using a KCl solution instead of NaCl).
Для получения полимера K4d в кислой форме или в виде четвертичной аммониевой соли можно действовать так, как описано выше, но для снижения затрат предпочтительно использовать катионообменную смолу, предпочтительно сильнокислотную смолу и предпочтительно сульфоновую кислотную смолу. Смола может быть основана на природном полимере, таком как агароза, или на синтетическом полимере, таком как полиакрилат или полистирол; она может быть как жесткой, так и в форме геля; она должна быть функционализирована сильнокислотной группой, такой как сульфоновая или фосфорная группа. Процесс можно проводить в колоночном или периодическом режиме, и количество используемой смолы зависит от степени ее функционализации (количество функциональных групп на 1 л смолы).To obtain the K4d polymer in acid form or as a quaternary ammonium salt, one can proceed as described above, but to reduce costs it is preferable to use a cation exchange resin, preferably a strong acid resin and preferably a sulfonic acid resin. The resin may be based on a natural polymer such as agarose or a synthetic polymer such as polyacrylate or polystyrene; it can be either hard or in gel form; it must be functionalized with a strong acidic group, such as a sulfonic or phosphorus group. The process can be carried out in column or batch mode, and the amount of resin used depends on the degree of its functionalization (number of functional groups per 1 liter of resin).
Водный раствор полимера K4d обрабатывают в реакторе, снабженном механической мешалкой, путем добавления смолы (в кислой форме) последовательными порциями до тех пор, пока рН раствора не составит менее 2; затем смолу отделяют фильтрацией. Получают раствор полисахарида K4d в виде недиссоциированной кислоты, при этом фрагментации полимера не наблюдают; продукт также может быть получен в твердом виде путем сублимационной сушки или распылительной сушки раствора.An aqueous solution of K4d polymer is treated in a reactor equipped with a mechanical stirrer by adding resin (in acidic form) in successive portions until the pH of the solution is less than 2; the resin is then separated by filtration. A solution of the K4d polysaccharide is obtained in the form of an undissociated acid, and no fragmentation of the polymer is observed; the product can also be obtained in solid form by freeze drying or solution spray drying.
Если продукт должен быть получен в виде четвертичной аммониевой соли, к описанному выше раствору кислоты добавляют подходящее основание (пиридин, гидроксид тетрабутиламмония и т.д.) в количестве, необходимом для достижения нейтрального рН; твердый продукт получают путем распылительной сушки, как описано выше, или путем сублимационной сушки.If the product is to be obtained as a quaternary ammonium salt, a suitable base (pyridine, tetrabutylammonium hydroxide, etc.) is added to the acid solution described above in the amount necessary to achieve a neutral pH; the solid product is obtained by spray drying as described above or by freeze drying.
Таким путем могут быть получены пиридиниевые, тетраметиламмониевые, тетраэтиламмониевые и тетрабутиламмониевые соли, все в виде белого или бледно-желтого твердого вещества, с остаточной влажностью менее 5% и по существу свободные от натрия (менее 0,1%).In this manner, pyridinium, tetramethylammonium, tetraethylammonium and tetrabutylammonium salts can be obtained, all as a white or pale yellow solid, with a residual moisture of less than 5% and substantially free of sodium (less than 0.1%).
Полимер K4d в кислотной или солеобразной форме затем используют для реакции сульфатирования, описанной ниже, для получения хондроитинсульфата; после диализа и концентрирования раствор ХС сушат распылением для получения натриевой соли ХС. Хороший контроль реакции позволяет изменять региоселективность и степень сульфатирования полимера. Таким образом, можно приготовить продукт, имеющий характеристики, сходные с характеристиками хондроитинсульфата животного происхождения, например, с профилем сульфатирования, сходным с ХС, полученным из акул или других видов животных.The K4d polymer in acid or salt form is then used in the sulfation reaction described below to produce chondroitin sulfate; After dialysis and concentration, the CS solution is spray dried to obtain the sodium salt of CS. Good control of the reaction makes it possible to change the regioselectivity and degree of sulfation of the polymer. Thus, it is possible to prepare a product having characteristics similar to those of animal-derived chondroitin sulfate, for example, with a sulfation profile similar to cholesterol obtained from sharks or other animal species.
Также можно выбрать среднюю молекулярную массу конечного продукта и его распределение вокруг среднего значения либо путем фрагментации полимера K4d перед сульфатированием, как описано выше, либо путем фрагментации хондроитинсульфата, полученного после сульфатирования; в обоих случаях фрагментация может быть осуществлена с помощью кислотного или радикального механизма, как описано в цитируемой литературе.It is also possible to select the average molecular weight of the final product and its distribution around the average value either by fragmenting the K4d polymer before sulfation, as described above, or by fragmenting the chondroitin sulfate obtained after sulfation; in both cases, fragmentation can be accomplished by an acidic or radical mechanism, as described in the cited literature.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение более подробно.The following examples illustrate the invention in more detail.
Пример 1. Общий метод получения натриевой соли полимера K4d.Example 1. General method for preparing the sodium salt of polymer K4d.
Полисахарид K4d получают путем приготовления капсульного полисахарида K4 посредством ферментации Escherichia coli, как описано в Manzoni et al., Biotechnol. Lett. 18, 383-6 (1996); после разделения биомассы надосадочную жидкость подвергают гидролизу в контролируемых условиях для удаления остатков фруктозы; полученный водный раствор полисахарида K4d дополнительно очищают с помощью хроматографии, как описано в Rodriguez et al., Eur. J. Biochem. 177, 117-124 (1988), для получения водного раствора дефруктозилированного высокомолекулярного полисахарида.K4d polysaccharide is prepared by preparing K4 capsular polysaccharide through Escherichia coli fermentation as described in Manzoni et al., Biotechnol. Lett. 18, 383-6 (1996); after separation of the biomass, the supernatant is hydrolyzed under controlled conditions to remove residual fructose; the resulting aqueous solution of K4d polysaccharide is further purified by chromatography as described in Rodriguez et al., Eur. J. Biochem. 177, 117-124 (1988), to obtain an aqueous solution of defructosylated high molecular weight polysaccharide.
Затем проводят кислотную деполимеризацию в контролируемых условиях, регулируя раствор до достижения рН в диапазоне от 1 до 4 путем добавления HCl и нагрева до 60-80°С. Реакцию контролируют с помощью эксклюзионной ВЭЖХ (HPLC-SEC) для проверки молекулярной массы продукта; при достижении желаемой средней молекулярной массы от 5 до 30 кДа реакцию останавливают добавлением гидроксида натрия до достижения рН 7 и охлаждают до 20-25°С.Acid depolymerization is then carried out under controlled conditions, adjusting the solution to achieve a pH in the range of 1 to 4 by adding HCl and heating to 60-80°C. The reaction is monitored using HPLC-SEC to check the molecular weight of the product; when the desired average molecular weight is reached from 5 to 30 kDa, the reaction is stopped by adding sodium hydroxide until pH 7 is reached and cooled to 20-25°C.
Водный раствор низкомолекулярного полимера K4d подвергают ультрафильтрации полисульфоновыми мембранами, имеющими отсечку 2,5 кДа, диализируют водой и концентрируют. В промышленных масштабах продукт выделяют распылительной сушкой, в то время как в лабораторных масштабах его получают сублимационной сушкой. Натриевую соль полисахарида K4d (несульфатированный хондроитин) получают в виде мелкодисперсного беловатого порошка; остаточное содержание воды менее 2%An aqueous solution of low molecular weight polymer K4d is ultrafiltrated with polysulfone membranes having a cutoff of 2.5 kDa, dialyzed with water and concentrated. On an industrial scale, the product is isolated by spray drying, while on a laboratory scale it is obtained by freeze drying. The sodium salt of the K4d polysaccharide (non-sulfated chondroitin) is obtained in the form of a fine whitish powder; residual water content less than 2%
- 4 046236 (титрование по Карлу Фишеру).- 4 046236 (titration according to Karl Fischer).
Пример 2. Общий метод получения четвертичной аммониевой соли полимера K4d.Example 2: General method for preparing the quaternary ammonium salt of polymer K4d.
Полисахарид K4d получают, действуя так, как описано в примере 1, до получения водного раствора чистой натриевой соли с желаемой молекулярной массой без необходимости выделения продукта в твердой форме.Polysaccharide K4d is prepared by proceeding as described in Example 1 to obtain an aqueous solution of pure sodium salt with the desired molecular weight without the need to isolate the product in solid form.
Указанный раствор помещают в реактор, снабженный механической мешалкой, и затем добавляют смолу Amberlite IRA1200H (кислотная форма) последовательными порциями до тех пор, пока не будет достигнут рН ниже 2; затем смолу отделяют фильтрацией. Получают раствор полисахарида K4d в недиссоциированной кислотной форме, фрагментации полимера не наблюдают; продукт также может быть получен в твердом виде путем сублимационной сушки или распылительной сушки раствора.This solution is placed in a reactor equipped with a mechanical stirrer and then Amberlite IRA1200H resin (acid form) is added in successive portions until a pH below 2 is achieved; the resin is then separated by filtration. A solution of the K4d polysaccharide is obtained in an undissociated acidic form; no fragmentation of the polymer is observed; the product can also be obtained in solid form by freeze drying or solution spray drying.
Вместо Amberlite IRA1200H может быть использована аналогичная смола, например сильнокатионная смола с полиакриловой или поливинильной структурой, и будут получены аналогичные результаты.A similar resin, such as a highly cationic resin with a polyacrylic or polyvinyl structure, can be used in place of Amberlite IRA1200H and similar results will be obtained.
К указанному раствору кислоты добавляют основание (пиридин или гидроксид тетрабутил-, тетраметил- или тетраэтиламмония) в количестве, необходимом для достижения значения рН более 7. Твердый продукт получают методом распылительной сушки или сублимационной сушки.A base (pyridine or tetrabutyl-, tetramethyl- or tetraethylammonium hydroxide) is added to the specified acid solution in the amount necessary to achieve a pH value greater than 7. The solid product is obtained by spray drying or freeze drying.
Таким образом получают пиридиниевые, тетраметиламмониевые, тетраэтиламмониевые или тетрабутиламмониевые соли, все в виде белого или бледно-желтого твердого вещества, с остаточной влажностью менее 5% и по существу свободные от натрия (менее 0,1%).The pyridinium, tetramethylammonium, tetraethylammonium or tetrabutylammonium salts are thus obtained, all as a white or pale yellow solid, with a residual moisture of less than 5% and substantially free of sodium (less than 0.1%).
Пример 3. Альтернативная методика получения полимера K4d.Example 3. Alternative method for producing polymer K4d.
В качестве альтернативы способу, описанному в примере 1, полисахарид K4d может быть получен непосредственно путем ферментации с использованием штамма DSM23644, который производит дефруктозилированный полисахарид. Продукт очищают, как описано в WO2012/004063, и выполняют кислотную или радикальную деполимеризацию, как описано Cho et al., для получения желаемой молекулярной массы.As an alternative to the method described in Example 1, the K4d polysaccharide can be produced directly by fermentation using strain DSM23644, which produces a defructosylated polysaccharide. The product is purified as described in WO2012/004063 and acid or radical depolymerization is performed as described by Cho et al. to obtain the desired molecular weight.
Полученный продукт идентичен полученному согласно примеру 1; четвертичную аммониевую соль можно получить, действуя так, как описано в примере 2.The resulting product is identical to that obtained according to example 1; The quaternary ammonium salt can be prepared by proceeding as described in example 2.
Пример 4 (сравнительный). Получение хондроитинсульфата в растворителе ДМФ.Example 4 (comparative). Preparation of chondroitin sulfate in DMF solvent.
Реакцию проводят так, как описано в WO 2012/159655, пример 4, с той разницей, что используемый полисахарид K4d имеет более низкую молекулярную массу, <10 кДа.The reaction is carried out as described in WO 2012/159655, example 4, with the difference that the K4d polysaccharide used has a lower molecular weight, <10 kDa.
В реактор загружают 72 мл безводного диметилформамида и 1,20 г тетрабутиламмониевой (ТБА) соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2. Добавляют 3 экв. комплекса SO3 ДМФ и температуру поддерживают на уровне примерно 10°С. После завершения реакции реакцию останавливают бикарбонатом натрия и осуществляют диализ, с выделением продукта путем сублимационной сушки; получают хондроитинсульфат натрия с молекулярной массой <10 кДа и профилем сульфатирования, представленным в WO 2012/159655, с.. 16, табл. 2.The reactor was charged with 72 ml of anhydrous dimethylformamide and 1.20 g of tetrabutylammonium (TBA) salt of the K4d polysaccharide, obtained as described in example 2. Add 3 eq. complex SO 3 DMF and the temperature is maintained at approximately 10°C. After completion of the reaction, the reaction is stopped with sodium bicarbonate and dialysis is carried out to isolate the product by freeze drying; sodium chondroitin sulfate is obtained with a molecular weight of <10 kDa and a sulfation profile presented in WO 2012/159655, p. 16, table. 2.
Пример 5. Получение сулъфатирующей смеси в уксусной кислоте.Example 5. Preparation of a sulfating mixture in acetic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 134 мл безводного ДМФ и охлаждают до 5±5°С; добавляют по каплям 67 г хлорсульфоновой кислоты, поддерживая температуру <30°С. Во время добавления образуется белый осадок; смесь выдерживают при перемешивании еще 20 мин, регулируя температуру до 5±5°С. Твердое вещество фильтруют через воронку Бюхнера из спеченного стекла в атмосфере азота, удаляя ДМФ. Твердый реагент растворяют в уксусной кислоте (73,46 г) при перемешивании магнитной мешалкой. Полученный сульфатирующий раствор выдерживают в атмосфере азота при 4°С, защищенный от влажности, до момента использования.134 ml of anhydrous DMF are loaded into a glass reactor in a nitrogen stream and cooled to 5±5°C; add 67 g of chlorosulfonic acid dropwise, maintaining the temperature <30°C. A white precipitate forms during addition; the mixture is kept with stirring for another 20 minutes, adjusting the temperature to 5±5°C. The solid is filtered through a sintered glass Buchner funnel under a nitrogen atmosphere to remove DMF. The solid reagent is dissolved in acetic acid (73.46 g) with magnetic stirring. The resulting sulfating solution is kept in a nitrogen atmosphere at 4°C, protected from humidity, until use.
Пример 6. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте.Example 6. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 200 мл безводной уксусной кислоты и 20 г тетрабутиламмониевой соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2. Полученную суспензию охлаждают при перемешивании примерно до 13°С, обрабатывают сульфатирующим раствором, приготовленным согласно примеру 5 (40,22 г), и выдерживают при перемешивании при той же температуре в течение 24 ч. Реакцию останавливают 30% NaOH (382 мл) и льдом, поддерживая температуру <30°С; суспензию доводят до рН 7,9 с помощью HCl и фильтруют через воронку Бюхнера и твердое вещество (ацетат натрия) отбрасывают. Маточный раствор подвергают ультрафильтрации через ультрафильтрационную мембрану (отсечка 2,5 кДа), осуществляя диализ с водой. Ретентат концентрируют вакуумным выпариванием, обесцвечивают обесцвечивающим древесным углем и высушивают сублимационной сушкой с получением 10,5 г хондроитинсульфата.200 ml of anhydrous acetic acid and 20 g of tetrabutylammonium salt of polysaccharide K4d, obtained as described in example 2, are loaded into a glass reactor in a nitrogen stream. The resulting suspension is cooled with stirring to approximately 13°C, treated with a sulfating solution prepared according to example 5 (40, 22 g), and kept with stirring at the same temperature for 24 hours. The reaction is stopped with 30% NaOH (382 ml) and ice, maintaining the temperature <30°C; the suspension is adjusted to pH 7.9 with HCl and filtered through a Buchner funnel and the solid (sodium acetate) is discarded. The mother liquor is ultrafiltrated through an ultrafiltration membrane (2.5 kDa cutoff) by dialyzing with water. The retentate was concentrated by vacuum evaporation, decolorized with decolorizing charcoal and freeze-dried to obtain 10.5 g of chondroitin sulfate.
Пример 7. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте.Example 7. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 200 мл безводной уксусной кислоты и 20 г тетрабутиламмониевой соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2; суспензию охлаждают примерно до 13°С и добавляют сульфатирующий раствор, описанный в примере 5 (40,0 г). Через 24 ч реакцию останавливают водой и льдом, поддерживая температуру <30°С; после этого следует ультрафильтрация и диализ с водой с регулированием рН ретентата между 5,5 и 7,5. Ретентат концентрируют, обесцвечивают древесным углем и высушивают сублимационной сушкой с получением 11,5 г хондроиA glass reactor is charged under a nitrogen stream with 200 ml of anhydrous acetic acid and 20 g of tetrabutylammonium salt of polysaccharide K4d, obtained as described in example 2; the suspension is cooled to approximately 13°C and the sulfating solution described in example 5 (40.0 g) is added. After 24 hours, the reaction is stopped with water and ice, maintaining the temperature <30°C; this is followed by ultrafiltration and dialysis with water, adjusting the pH of the retentate between 5.5 and 7.5. The retentate is concentrated, decolorized with charcoal and freeze-dried to obtain 11.5 g of chondro
- 5 046236 тинсульфата.- 5 046236 tin sulfate.
Пример 8. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте.Example 8. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 800 мл безводной уксусной кислоты и 80 г тетрабутиламмониевой соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2. Полученную суспензию нагревают примерно до 50°С при перемешивании, обрабатывают сульфатирующим раствором, приготовленным согласно примеру 5 (161,32 г), и выдерживают при перемешивании при той же температуре в течение 1 ч. Часть суспензии (~200 мл) подвергают остановке реакции путем выливания в воду и лед (2,5 кг), поддерживая температуру <30°С; полученный раствор подвергают ультрафильтрации через ультрафильтрационную мембрану (отсечка 2,5 кДа), осуществляя диализ с водой до достижения проводимости в пермеате <500 мкСм и регулируют рН ретентата в пределах от 5,5 до 7,5. Ретентат концентрируют путем выпаривания, обработки льдом и сублимационной сушки с получением 8,6 г хондроитинсульфата.800 ml of anhydrous acetic acid and 80 g of tetrabutylammonium salt of polysaccharide K4d, obtained as described in example 2, are loaded into a glass reactor in a nitrogen stream. The resulting suspension is heated to approximately 50°C with stirring, treated with a sulfating solution prepared according to example 5 (161, 32 g), and kept with stirring at the same temperature for 1 hour. Part of the suspension (~200 ml) is subjected to stopping the reaction by pouring into water and ice (2.5 kg), maintaining the temperature <30°C; the resulting solution is subjected to ultrafiltration through an ultrafiltration membrane (cutoff 2.5 kDa), dialyzing with water until the conductivity in the permeate is <500 μS, and the pH of the retentate is adjusted in the range from 5.5 to 7.5. The retentate is concentrated by evaporation, ice treatment and freeze drying to obtain 8.6 g of chondroitin sulfate.
Пример 9. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте с хлорсульфоновой кислотой.Example 9. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid with chlorosulfonic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 200 мл безводной уксусной кислоты и 20 г тетрабутиламмониевой соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2; суспензию охлаждают примерно до 13 °С и добавляют хлорсульфоновую кислоту (8,95 г), поддерживая температуру в течение 24 ч. Затем суспензию выливают в воду и лед, подвергают ультрафильтрации и диализу, как описано в примере 7. Путем сублимационной сушки получают 12,7 г хондроитинсульфата.A glass reactor is charged under a nitrogen stream with 200 ml of anhydrous acetic acid and 20 g of tetrabutylammonium salt of polysaccharide K4d, obtained as described in example 2; the suspension is cooled to approximately 13 °C and chlorosulfonic acid (8.95 g) is added, maintaining the temperature for 24 hours. The suspension is then poured into water and ice, ultrafiltrated and dialyzed as described in example 7. By freeze-drying, 12 is obtained. 7 g chondroitin sulfate.
Пример 10. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте с хлорсульфоновой кислотой.Example 10. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid with chlorosulfonic acid.
В стеклянный реактор, снабженный механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, загружают в потоке азота 600 мл безводной уксусной кислоты и 60 г тетрабутиламмониевой соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2. Полученную суспензию нагревают примерно до 50°С при перемешивании и обрабатывают хлорсульфоновой кислотой (28,8 г) и выдерживают при перемешивании при той же температуре в течение 10 мин. Часть суспензии (~200 мл) подвергают остановке реакции путем выливания в воду и лед (2,5 кг), поддерживая температуру <30°С; полученный раствор подвергают ультрафильтрации через ультрафильтрационную мембрану, осуществляя диализ с водой до проводимости в пермеате <500 мкСм и регулируя рН ретентата между 5,5 и 7,5. Ретентат концентрируют путем выпаривания, обработки льдом и сублимационной сушки с получением 8,64 г хондроитинсульфата.In a glass reactor equipped with a mechanical stirrer, a thermometer and a dropping funnel, 600 ml of anhydrous acetic acid and 60 g of tetrabutylammonium salt of polysaccharide K4d, obtained as described in example 2, are charged under a stream of nitrogen. The resulting suspension is heated to approximately 50° C. with stirring and processed chlorosulfonic acid (28.8 g) and kept with stirring at the same temperature for 10 minutes. Part of the suspension (~200 ml) is subjected to stopping the reaction by pouring into water and ice (2.5 kg), maintaining the temperature <30°C; the resulting solution is ultrafiltrated through an ultrafiltration membrane, dialyzing with water until the permeate conductivity is <500 μS and adjusting the pH of the retentate between 5.5 and 7.5. The retentate was concentrated by evaporation, ice treatment and freeze drying to obtain 8.64 g of chondroitin sulfate.
Пример 11. Получение низкомолекулярного хондроитинсульфата в растворителе - уксусной кислоте с хлорсулъфоновой кислотой.Example 11. Preparation of low molecular weight chondroitin sulfate in a solvent - acetic acid with chlorosulfonic acid.
Процесс проводят, как и в предыдущих примерах, с использованием 200 мл безводной уксусной кислоты, 20 г ТБА соли полисахарида K4d и 10,54 г хлорсульфоновой кислоты, проводя реакцию при 1015°С в течение 24 ч. После завершения реакции суспензию фильтруют через воронку Бюхнера и осадок промывают уксусной кислотой и растворяют в воде при рН 7,3 с Na2CO3 в достаточном количестве (q.s.). Полученный раствор подвергают ультрафильтрации и диализу, как описано выше, и ретентат подвергают сублимационной сушке с получением 8,58 г хондроитинсульфата.The process is carried out as in the previous examples, using 200 ml of anhydrous acetic acid, 20 g of TBA salt of the K4d polysaccharide and 10.54 g of chlorosulfonic acid, reacting at 1015 ° C for 24 hours. After completion of the reaction, the suspension is filtered through a Buchner funnel and the precipitate is washed with acetic acid and dissolved in water at pH 7.3 with Na 2 CO 3 in sufficient quantity (qs). The resulting solution was subjected to ultrafiltration and dialysis as described above, and the retentate was freeze-dried to obtain 8.58 g of chondroitin sulfate.
Пример 12. Очистка низкомолекулярного хондроитинсульфата в уксусной кислоте путем осаждения в этаноле и воде.Example 12. Purification of low molecular weight chondroitin sulfate in acetic acid by precipitation in ethanol and water.
Синтез проводят, как описано в примере 6, и ацетат натрия удаляют фильтрацией в конце реакции. Раствор добавляют по каплям в абсолютный этанол при энергичном перемешивании; в результате получают суспензию, которую фильтруют через воронку Бюхнера для получения 27,1 г сырого хондроитинсульфата в виде стеклообразного твердого вещества. Аликвоту полученного твердого вещества (2,5 г) растворяют в 0,2 М NaCl (7,5 мл) и раствор затем добавляют по каплям в EtOH (50 мл) при энергичном перемешивании; чистый хондроитинсульфат выпадает в осадок в виде аморфного твердого вещества (2,16 г).The synthesis is carried out as described in example 6, and sodium acetate is removed by filtration at the end of the reaction. The solution is added dropwise to absolute ethanol with vigorous stirring; the resulting suspension was filtered through a Buchner funnel to obtain 27.1 g of crude chondroitin sulfate as a glassy solid. An aliquot of the resulting solid (2.5 g) was dissolved in 0.2 M NaCl (7.5 ml) and the solution was then added dropwise to EtOH (50 ml) with vigorous stirring; pure chondroitin sulfate precipitates as an amorphous solid (2.16 g).
Пример 13. Синтез и очистка высокомолекулярного хондроитинсульфата в уксусной кислоте.Example 13. Synthesis and purification of high molecular weight chondroitin sulfate in acetic acid.
Реакцию проводят, как описано в примере 1, с получением высокомолекулярного (дефруктозилированного) полисахарида K4d в водном растворе; однако деполимеризацию не проводят. Соответствующую тетрабутиламмониевую соль получают с ионообменной смолой, как описано в примере 2.The reaction is carried out as described in example 1, obtaining high molecular weight (defructosylated) polysaccharide K4d in aqueous solution; however, depolymerization is not carried out. The corresponding tetrabutylammonium salt is prepared with an ion exchange resin as described in example 2.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 91 мл безводной уксусной кислоты и 9,1 г ТБА соли высокомолекулярного полисахарида K4d. Полученную суспензию охлаждают при перемешивании до 10-15°С и обрабатывают хлорсульфоновой кислотой (5,3 г), затем выдерживают при перемешивании при той же температуре в течение 2,5 ч. Суспензию фильтруют через воронку Бюхнера и полученный осадок растворяют в 10% вод. NaHCO3; полученный раствор подвергают ультрафильтрации и диализу через ультрафильтрационную мембрану. Путем сублимационной сушки получают 5,21 г хондроитинсульфата.91 ml of anhydrous acetic acid and 9.1 g of TBA salt of high molecular weight polysaccharide K4d are charged into a glass reactor under a nitrogen stream. The resulting suspension is cooled with stirring to 10-15°C and treated with chlorosulfonic acid (5.3 g), then kept with stirring at the same temperature for 2.5 hours. The suspension is filtered through a Buchner funnel and the resulting precipitate is dissolved in 10% water . NaHCO3 ; the resulting solution is subjected to ultrafiltration and dialysis through an ultrafiltration membrane. By freeze-drying, 5.21 g of chondroitin sulfate is obtained.
Пример 14. Синтез и очистка низкомолекулярного хондроитинсульфата (с порошком ДМФ-SO;,) в уксусной кислоте.Example 14. Synthesis and purification of low molecular weight chondroitin sulfate (with DMF-SO powder;,) in acetic acid.
В стеклянный реактор загружают в потоке азота 200 мл безводной уксусной кислоты и 20 г ТБА соли полисахарида K4d, полученной, как описано в примере 2. Полученную суспензию нагревают примерA glass reactor is charged under a nitrogen stream with 200 ml of anhydrous acetic acid and 20 g of TBA salt of the K4d polysaccharide, obtained as described in example 2. The resulting suspension is heated.
- 6 046236 но до 50°С при перемешивании, обрабатывают комплексом ДМФ^О3 (Олдрич, 10,95 г) и выдерживают при перемешивании при той же температуре в течение 1 ч; затем реакцию останавливают во льду с последующей ультрафильтрацией и диализом, поддерживая рН ретентата на уровне от 5,5 до 7,5. Продукт обесцвечивают обесцвечивающим древесным углем и подвергают сублимационной сушке с получением 8,73 г хондроитинсульфата.- 6 046236 but up to 50°C with stirring, treated with DMF^O 3 complex (Aldrich, 10.95 g) and kept with stirring at the same temperature for 1 hour; the reaction is then stopped on ice, followed by ultrafiltration and dialysis, maintaining the pH of the retentate between 5.5 and 7.5. The product was decolorized with bleaching charcoal and freeze-dried to obtain 8.73 g of chondroitin sulfate.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102020000004564 | 2020-03-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046236B1 true EA046236B1 (en) | 2024-02-20 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK168297B1 (en) | Process for producing low molecular weight heparin from normal heparin | |
| JPS59133201A (en) | Polysaccharide depolymerization and sulfatation | |
| US4948881A (en) | Process for the depolymerization and sulfation of polysaccharides | |
| US10870711B2 (en) | Process for the preparation of polysaccharides | |
| WO2012114349A1 (en) | An improved process for the preparation of pentosan polysulfate sodium | |
| US8513407B2 (en) | Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained | |
| CN115210266B (en) | Method for direct sulfation of polysaccharides in ecologically acceptable solvents | |
| DK2707396T3 (en) | Biotechnological sulfated chondroitin sulfate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain and process for its preparation | |
| US8664196B2 (en) | Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof | |
| KR101788536B1 (en) | Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof | |
| CA2489862C (en) | Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation | |
| EA046236B1 (en) | METHOD FOR DIRECT SULPHATION OF POLYSACCHARIDES IN AN ENVIRONMENTALLY ACCEPTABLE SOLVENT | |
| JP4958368B2 (en) | Cross-linked hyaluronic acid | |
| IE833063L (en) | Process for the depolymerisation and sulfation of¹polysaccharides | |
| Saravanan et al. | Partial sequencing, structural characterization, and anticoagulant activity of heparan sulfate and sulfated chitosan from selected Indian marine mollusks | |
| Carvalho et al. | Extraction and Purification of Biopolymers from Marine Origin Sources Envisaging Their Use for Biotechnological Applications | |
| WO2021229538A1 (en) | Method for obtaining chitosan-based bioactive hemostatic agent and chitosan-based bioactive hemostatic agent | |
| dos Santos Queda | Studies towards modified chitooligosaccharides: a new approach to NAG-NAM moiety | |
| KR20220091513A (en) | Method for purification of sodium hyaluronate salt carried out in an organic solvent |