EA045921B1 - METHODS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES TO LEPTINA - Google Patents
METHODS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES TO LEPTINA Download PDFInfo
- Publication number
- EA045921B1 EA045921B1 EA201990720 EA045921B1 EA 045921 B1 EA045921 B1 EA 045921B1 EA 201990720 EA201990720 EA 201990720 EA 045921 B1 EA045921 B1 EA 045921B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- leptin
- labeled
- antibody
- sample
- signal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims description 56
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 204
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 203
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 201
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 201
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 74
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 claims description 61
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 claims description 61
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 24
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 17
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 12
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims description 5
- 201000006641 Acquired generalized lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010053547 Congenital generalised lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006705 Congenital generalized lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 201000000736 Amenorrhea Diseases 0.000 claims description 3
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 claims description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 231100000540 amenorrhea Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010053857 partial lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 108700008455 metreleptin Proteins 0.000 description 41
- 229960000668 metreleptin Drugs 0.000 description 37
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- BZSVVCFHMVMYCR-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-ylpyridine;ruthenium Chemical compound [Ru].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 BZSVVCFHMVMYCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- -1 metreleptin Chemical compound 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Description
Ссылка на связанные заявкиLink to related applications
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет перед предварительной заявкой с серийным номером 62/393632, поданной 12 марта 2016 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.This application claims priority to provisional application Serial No. 62/393632 filed March 12, 2016, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates
Настоящее раскрытие относится к способам детекции нейтрализующих антител к лептину и наборам, которые могут быть использованы для осуществления таких способов. Такие способы и наборы могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к лептину в образце или для выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови.The present disclosure relates to methods for detecting neutralizing antibodies to leptin and kits that can be used to carry out such methods. Such methods and kits can be used to detect leptin neutralizing antibodies in a sample or to identify subjects having leptin neutralizing antibodies in blood, serum or plasma.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Метрелептин представляет собой аналог лептина, показанный в качестве вспомогательного средства к диете или в качестве заместительной терапии для лечения осложнений вследствие лептиновой недостаточности у субъектов с врожденной или приобретенной генерализованной липодистрофией. Врожденная генерализованная липодистрофия представляет собой редкое патологическое состояние, характеризующееся почти полным отсутствием жировой ткани в организме и очень мускулистым внешним видом. Жировая ткань присутствует во многих частях тела, в том числе под кожей, и окружает внутренние органы. Она запасает жир в качестве источника энергии и также выполняет функцию амортизации и изоляции тела. Недостаток жировой ткани приводит к запасу жира в других частях тела, таких как печень и мышцы, что приводит к серьезным проблемам со здоровьем. Приобретенная генерализованная липодистрофия представляет собой редкой патологическое состояние, которое возникает в детстве или юности, характеризующееся потерей жировой ткани, затрагивающей значительную площадь тела, в частности, лица, верхних конечностей и нижних конечностей.Metreleptin is a leptin analogue indicated as a dietary adjunct or replacement therapy for the treatment of complications due to leptin deficiency in subjects with congenital or acquired generalized lipodystrophy. Congenital generalized lipodystrophy is a rare pathological condition characterized by an almost complete absence of adipose tissue in the body and a very muscular appearance. Fatty tissue is present in many parts of the body, including under the skin, and surrounds internal organs. It stores fat as a source of energy and also functions as shock absorption and insulation for the body. Lack of adipose tissue leads to fat storage in other parts of the body such as the liver and muscles, leading to serious health problems. Acquired generalized lipodystrophy is a rare condition that occurs during childhood or adolescence, characterized by loss of adipose tissue affecting a large area of the body, particularly the face, upper extremities, and lower extremities.
Помимо этого, метрелептин изучают в качестве лекарственного средства для лечения других показаний, в том числе частичной липодистрофии, гипоталамической аменореи, неалкогольного стеатогепатоза и других различных гиполептинемических дисметаболических расстройств.In addition, metreleptin is being studied as a drug for the treatment of other indications, including partial lipodystrophy, hypothalamic amenorrhea, non-alcoholic steatohepatosis and various other hypoleptinemic dysmetabolic disorders.
Метрелептин, как правило, вводят с помощью ежедневной подкожной инъекции. В связи с таким повторным введением существует риск того, что у субъектов будут образовываться антитела к метрелептину. Эти антитела могут нейтрализовать метрелептин, делая лечение неэффективным. Более того, они могут нейтрализовать эндогенный лептин, усугубляя заболевание субъектов, которые уже страдают от лептиновой недостаточности. По этой причине в данной области техники существует потребность в способе надежной детекции нейтрализующих антител у субъектов.Metreleptin is typically administered by daily subcutaneous injection. Due to this repeated administration, there is a risk that subjects will develop antibodies to metreleptin. These antibodies may neutralize metreleptin, rendering treatment ineffective. Moreover, they may neutralize endogenous leptin, exacerbating the disease in subjects who already suffer from leptin deficiency. For this reason, there is a need in the art for a method for reliably detecting neutralizing antibodies in subjects.
Краткое описание настоящего изобретенияBrief Description of the Present Invention
Настоящее изобретении относится к детекции нейтрализующих антител к лептину.The present invention relates to the detection of neutralizing antibodies to leptin.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции нейтрализующих антител к лептину в образце, предусматривающему: (а) инактивацию лептина в образце; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; и (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином.In one aspect, the present invention provides a method for detecting neutralizing antibodies to leptin in a sample, comprising: (a) inactivating leptin in the sample; (b) adding a known amount of labeled leptin to the sample; (c) contacting the sample containing the labeled leptin from (b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; and (e) measuring the labeling signal produced by substrate-bound labeled leptin.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выявления субъекта, имеющего нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающему (а) инактивацию лептина, присутствующего в образце крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт меченого лептина из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (f) измерение положительного контрольного сигнала, при этом положительный контрольный сигнал образуется в результате завершения этапов (а) - (е), и дополнительно предусматривающему добавление известного количества антитела к лептину на этапе (b); и (g) сравнение сигнала из (е) с сигналом из (f), при этом в случае, если уровень сигнала, измеряемый на этапе (е) равен или меньше, чем уровень сигнала, измеряемого на этапе (f), то субъект считается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину.In one aspect, the present invention provides a method for identifying a subject having neutralizing antibodies to leptin in blood, serum, or plasma from the subject, comprising (a) inactivating leptin present in a blood sample, serum, or plasma of the subject; (b) adding a known amount of labeled leptin to the sample; (c) contacting the labeled leptin from (b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (f) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (f) measuring a positive control signal, wherein the positive control signal is generated by completing steps (a) to (e), and further comprising adding a known amount of leptin antibody in step (b); and (g) comparing the signal from (e) with the signal from (f), wherein if the signal level measured in step (e) is equal to or less than the signal level measured in step (f), then the subject is considered positive for neutralizing antibodies to leptin.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта, предусматривающему: (а) инактивацию лептина, присутствующего в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта; (b) добавление известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведение в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать мечены лептин; (d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (f) измерение отрицательного контрольного сигнала, при этом указанный отрицательный контрольный сигнал образуется в результате завершение этапов (а) - (е), при этом образец крови, сыворотки крови или плазмы крови не содержит нейтрализующие антитела к лептину; и (g) сравнение процентной разницы сигнала из (е) и сигнала из (f) с границей разделения, при этом в случае, если процентная разница сигнала из (е) и сигнала из (f) больше, чем граница разделения, то субъект счиIn another aspect, the present invention provides a method for identifying subjects having neutralizing antibodies to leptin in the blood, serum, or plasma of the subject, comprising: (a) inactivating leptin present in the blood, serum, or plasma of the subject; (b) adding a known amount of labeled leptin to the sample; (c) contacting the sample containing the labeled leptin from (b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (f) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (f) measuring a negative control signal, wherein said negative control signal is generated by completing steps (a) to (e), wherein the blood, serum or plasma sample does not contain leptin neutralizing antibodies; and (g) comparing the percentage difference of the signal from (e) and the signal from (f) with the separation limit, wherein if the percentage difference of the signal from (e) and the signal from (f) is greater than the separation boundary, then the subject considers
- 1 045921 тается положительным в отношении нейтрализующих антител к лептину. В некоторых вариантах осуществления граница разделения находится между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или между приблизительно 5% и 15%.- 1 045921 is positive for neutralizing antibodies to leptin. In some embodiments, the cutoff is between about 5% and about 40%, or between about 5% and about 30%, or between about 5% and 15%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу, который включает определение у субъекта изменения в присутствии нейтрализующих антител к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта с течением времени. В некоторых вариантах осуществления этот способ может быть использован у субъекта, получающего лечение лептином, в котором присутствие нейтрализующих антител в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта может быть определено перед лечением лептином (предварительное лечение) и затем во время или после лечения лептином. Данный способ предусматривает: (1а) инактивацию лептина, присутствующего в первом образце крови, сыворотки крови или плазмы субъекта; (1b) добавление известного количества меченого лептина к первому образцу; (1с) приведение в контакт первого образца, содержащего меченый лептин из (1b) с субстратом, способным связываться с меченым лептином; (Id) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (1е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (2а) инактивацию лептина, присутствующего во втором образце крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта; (2b) добавление известного количества меченого лептина ко второму образцу; (2с) приведение в контакт второго образца, содержащего меченый лептин из (2b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (2d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (2е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (3) сравнение сигнала метки из (2е) с сигналом метки из (1е). В некоторых вариантах осуществления в результате сравнения может определяться процентная разницу между сигналом метки из (2е) и сигналом метки из (1е). В определенных вариантах осуществления процентную разницу можно сравнивать с границей разделения. Граница разделения может находиться между приблизительно 55% и приблизительно 95%, или между приблизительно 60% и приблизительно 90%, например, составлять приблизительно 65%, или приблизительно 85%, или приблизительно 80%.In another aspect, the present invention provides a method that includes determining in a subject a change in the presence of neutralizing antibodies to leptin in blood, serum, or plasma from the subject over time. In some embodiments, this method may be used in a subject receiving leptin treatment, in which the presence of neutralizing antibodies in the subject's blood, serum, or plasma may be determined before leptin treatment (pretreatment) and then during or after leptin treatment. The method comprises: (1a) inactivating leptin present in a first sample of blood, serum or plasma of the subject; (1b) adding a known amount of labeled leptin to the first sample; (1c) contacting the first sample containing the labeled leptin of (1b) with a substrate capable of binding to the labeled leptin; (Id) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (1e) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (2a) inactivating leptin present in a second sample of blood, serum or plasma of the subject; (2b) adding a known amount of labeled leptin to the second sample; (2c) contacting a second sample containing the labeled leptin from (2b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (2d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (2e) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (3) comparison of the tag signal from (2e) with the tag signal from (1e). In some embodiments, the comparison may determine the percentage difference between the mark signal from (2e) and the mark signal from (1e). In certain embodiments, the percentage difference may be compared to a split margin. The separation limit may be between about 55% and about 95%, or between about 60% and about 90%, such as about 65%, or about 85%, or about 80%.
В определенных вариантах осуществления лептин можно метить пероксидазой хрена или рутения трис-бипиридином.In certain embodiments, leptin can be labeled with horseradish peroxidase or ruthenium tris-bipyridine.
В некоторых вариантах осуществления инактивация лептина может осуществляться в результате нагревания образца.In some embodiments, leptin inactivation may be accomplished by heating the sample.
В определенных вариантах осуществления субстрат, способный связывать меченый лептин, может содержать (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей из (i). Покрытая матрица может представлять собой покрытую стрептавидином матрицу. Лептиновый рецептор можно метить биотином.In certain embodiments, a substrate capable of binding labeled leptin may comprise (i) a coated matrix and (ii) a labeled leptin receptor coupled to the matrix of (i). The coated matrix may be a streptavidin-coated matrix. The leptin receptor can be labeled with biotin.
В некоторых вариантах осуществления субстрат, способный связывать меченый лептин, может представлять собой (i) покрытую матрицу, (ii) антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить меткой, подходящей для аффинной очистки; например, лептиновый рецептор можно метить с помощью гексагистидиновой метки. Антитело может иметь подходящую аффинность к метке лептинового рецептора; например, антитело может представлять собой антитело к гексагистидину. Помимо этого антитело можно метить меткой, подходящей для того, чтобы связываться с покрытой матрицей, такой как биотин.In some embodiments, the substrate capable of binding labeled leptin may be (i) a coated matrix, (ii) an antibody coupled to the matrix of (i), and (iii) a labeled leptin receptor coupled to the antibody of (ii). The coated matrix may be a streptavidin-coated matrix. The leptin receptor can be labeled with a label suitable for affinity purification; for example, the leptin receptor can be labeled with a hexahistidine tag. The antibody may have a suitable affinity for the leptin receptor tag; for example, the antibody may be an anti-hexahistidine antibody. In addition, the antibody can be labeled with a label suitable for binding to a coated matrix, such as biotin.
Способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать этап снижения значения рН инактивированного образца (а) в результате добавления кислого раствора, и при этом меченый лептин, добавленный в (b), дополнительно содержит основной раствор, достаточный для нейтрализации значения рН образца после добавления. Кислый раствор может представлять собой раствор уксусной кислоты, такой как 0,8% раствор уксусной кислоты. Основной раствор может представлять собой буфер, такой как 0,125 М Tham-буфер.The methods of the present invention may further include the step of lowering the pH value of the inactivated sample (a) by adding an acidic solution, and wherein the labeled leptin added to (b) further comprises a basic solution sufficient to neutralize the pH value of the sample after addition. The acidic solution may be an acetic acid solution, such as 0.8% acetic acid solution. The stock solution may be a buffer such as 0.125 M Tham buffer.
В некоторых вариантах осуществления меченый лептин, добавленный на этапе (b), может представлять собой рекомбинантный человеческий лептин. В определенных вариантах осуществления меченый лептин, добавленный на этапе (b), может представлять собой метрелептин.In some embodiments, the labeled leptin added in step (b) may be recombinant human leptin. In certain embodiments, the labeled leptin added in step (b) may be metreleptin.
В некоторых вариантах осуществления детектируемый сигнал образуется на этапе (е) в случае, если концентрация меченого лептина, такого как метрелептин, в образце на этапе (b) составляет от приблизительно 90 нг/мл до приблизительно 120 нг/мл, или от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 110 нг/мл, например, приблизительно 101 нг/мл или приблизительно 109 нг/мл.In some embodiments, a detectable signal is generated in step (e) if the concentration of labeled leptin, such as metreleptin, in the sample in step (b) is from about 90 ng/ml to about 120 ng/ml, or from about 100 ng /ml to about 110 ng/ml, for example, about 101 ng/ml or about 109 ng/ml.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу определения восприимчивости субъекта, имеющего связанное с лептином нарушение, к лечению лептином, предусматривающему определение количества нейтрализующих антител к лептину у субъекта, при этом количество антител указывает на невосприимчивость субъекта к терапии лептином. Способы могут предусматривать этап, перечисленный выше. Связанное с лептином нарушение может представлять собой врожденную генерализованную липодистрофию, приобретенную генерализованную липодистрофию, частичную липодистрофию, гипоталамическую аменорею, неалкогольный стеатогепатоз и гиполептинемическое дисметаболическое расстройство.In one aspect, the present invention provides a method for determining the responsiveness of a subject having a leptin-related disorder to leptin treatment, comprising determining the amount of neutralizing antibodies to leptin in the subject, wherein the amount of antibodies indicates the subject's refractoriness to leptin therapy. The methods may include the step listed above. The leptin-related disorder may be congenital generalized lipodystrophy, acquired generalized lipodystrophy, partial lipodystrophy, hypothalamic amenorrhea, nonalcoholic steatohepatosis, and hypoleptinaemic dysmetabolic disorder.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, который может быть использован дляIn another aspect, the present invention relates to a kit that can be used to
- 2 045921 детекции нейтрализующих антител к лептину в образце. Набор может содержать (а) меченый лептин и (b) субстрат, способный связывать меченый лептин.- 2 045921 detection of neutralizing antibodies to leptin in the sample. The kit may contain (a) labeled leptin and (b) a substrate capable of binding labeled leptin.
В определенных вариантах осуществления лептин в наборе можно метить пероксидазой хрена или рутения трис-бипиридином.In certain embodiments, the leptin in the kit can be labeled with horseradish peroxidase or ruthenium peroxidase with tris-bipyridine.
В некоторых вариантах осуществления субстрат в наборе может содержать (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей из (i). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить биотином. Покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор могут находиться совместно в виде одного компонента в наборе или могут представлять собой отдельные компоненты.In some embodiments, the substrate in the kit may comprise (i) a coated matrix and (ii) a labeled leptin receptor coupled to the matrix of (i). The coated matrix may be a streptavidin-coated matrix. The leptin receptor can be labeled with biotin. The coated matrix and the labeled leptin receptor may be present together as one component in the kit or may be separate components.
В некоторых вариантах осуществления субстрат в наборе может представлять собой (i) покрытую матрицу, (ii) антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii). Покрытая матрица может представлять собой матрицу, покрытую стрептавидином. Лептиновый рецептор можно метить с помощью метки, подходящей для аффинной очистки; например, лептиновый рецептор можно метить с помощью гексагистидиновой метки. Антитело может иметь подходящую аффинность к метке лептинового рецептора; например, антитело может представлять собой антитело к гексагистидину. Помимо этого антитело можно метить меткой, подходящей для того, чтобы связываться с покрытой матрицей, такой как биотин. Покрытая матрица, антитело и меченый лептиновый рецептор могут находиться совместно в виде одного компонента в наборе или в виде отдельных компонентов.In some embodiments, the substrate in the kit may be (i) a coated matrix, (ii) an antibody coupled to the matrix from (i), and (iii) a labeled leptin receptor coupled to the antibody from (ii). The coated matrix may be a streptavidin-coated matrix. The leptin receptor can be labeled with a tag suitable for affinity purification; for example, the leptin receptor can be labeled with a hexahistidine tag. The antibody may have a suitable affinity for the leptin receptor tag; for example, the antibody may be an anti-hexahistidine antibody. In addition, the antibody can be labeled with a label suitable for binding to a coated matrix, such as biotin. The coated matrix, antibody, and labeled leptin receptor may be present together as a single component in the kit or as separate components.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно может содержать положительный контроль и/или отрицательный контроль.In certain embodiments, the kit may further comprise a positive control and/or a negative control.
В некоторых вариантах осуществления набор может дополнительно содержать подкисляющий реагент; например, уксусную кислоту.In some embodiments, the kit may further comprise an acidifying reagent; for example, acetic acid.
В определенных вариантах осуществления набор может дополнительно содержать основной раствор; например, буфер, такой как Tham-буфер.In certain embodiments, the kit may further comprise a base solution; for example, a buffer such as a Tham buffer.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Настоящее раскрытие будет дополнительно объяснено с отсылкой на прилагаемые чертежи. Представленные чертежи не обязательно требуют масштабирования, при этом основная идея, как правило, акцентируется на иллюстрации принципов настоящего раскрытия, а некоторые характеристики могут быть преувеличены для того, чтобы продемонстрировать детали определенных компонентов. Помимо этого, любые измерения, описания и т.п., представленные в чертежах или описанные ниже, предполагают иллюстративный, а не ограничивающий характер. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, раскрываемые в настоящем документе, не должны восприниматься как ограничивающие, а просто иметь иллюстративную основу для объяснения специалисту в данной области техники как использовать способы и наборы, описываемые в настоящем документе.The present disclosure will be further explained with reference to the accompanying drawings. The drawings provided are not necessarily to scale, with the main idea generally being emphasized to illustrate the principles of the present disclosure and certain features may be exaggerated to show detail of certain components. In addition, any measurements, descriptions, etc. shown in the drawings or described below are intended to be illustrative and not limiting. Thus, the specific structural and functional details disclosed herein are not to be taken as limiting, but merely as an illustrative basis for explaining to one skilled in the art how to use the methods and kits described herein.
На фиг. 1А-1В представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае лептина и метрелептина, который включает в себя субстрат, способный связывать меченый лептин, содержащий (i) покрытую матрицу и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей (i), в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. На фиг. 1А представлены различные компоненты, используемые в анализе, и на фиг. 1В представлено применение анализа.In fig. 1A-1B depict an exemplary receptor binding assay for leptin and metreleptin, which includes a substrate capable of binding labeled leptin comprising (i) a coated matrix and (ii) a labeled leptin receptor bound to matrix (i), in accordance with embodiments of the present invention. In fig. 1A illustrates the various components used in the analysis and FIG. Figure 1B shows the application of the analysis.
На фиг. 2 представлен иллюстративный лист данных для представления результатов анализа связывания с рецептором в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.In fig. 2 is an exemplary data sheet for presenting the results of a receptor binding assay in accordance with embodiments of the present invention.
На фиг. 3А-3В представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае лептина и метрелептина, который включает в себя субстрат, способный связывать меченый лептин, содержащий (i) покрытую матрицу, (ii) меченое антитело, связанное с матрицей из (i), и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом из (ii), в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. На фиг. 3А представлены различные компоненты, используемые в анализе, и на фиг. 3В представлено применение анализа.In fig. 3A-3B show an exemplary receptor binding assay for leptin and metreleptin, which includes a substrate capable of binding labeled leptin comprising (i) a coated matrix, (ii) a labeled antibody coupled to the matrix of (i), and (iii). ) a labeled leptin receptor coupled to the antibody of (ii), in accordance with embodiments of the present invention. In fig. 3A illustrates the various components used in the analysis and FIG. 3B shows the application of the analysis.
На фиг. 4 представлен иллюстративный анализ связывания с рецептором в случае метрелептина, который включает положительные и отрицательные контроли, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.In fig. 4 depicts an exemplary receptor binding assay for metreleptin, which includes positive and negative controls, in accordance with embodiments of the present invention.
На фиг. 5 представлен этап кислотной диссоциации для применения в иллюстративном анализе связывания с рецептором в случае метрелептина, в соответствии с настоящим изобретением.In fig. 5 depicts an acid dissociation step for use in an exemplary receptor binding assay for metreleptin in accordance with the present invention.
На фиг. 6 представлена таблица, которая представляет сигнал, % ингибирования, а а также категорийные данные, собранные в результате анализа образцов от 17 субъектов, некоторые из которых были здоровыми и некоторых из которых были больными и ранее получали лечение лептином.In fig. 6 is a table that presents the signal, % inhibition, and categorical data collected from the analysis of samples from 17 subjects, some of whom were healthy and some of whom were diseased and previously treated with leptin.
Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention
Способы детекции нейтрализующих антител к лептину.Methods for detecting neutralizing antibodies to leptin.
В настоящем документе описаны способы детекции нейтрализующих антител к лептину в образце. Иллюстративные способы предусматривают этапы (а) инактивации лептина в образце; (b) добавления известного количества меченого лептина к образцу; (с) приведения в контакт образца, содержащего меченый лептин из (b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (d) промывания субстрата сMethods for detecting neutralizing antibodies to leptin in a sample are described herein. Exemplary methods include the steps of (a) inactivating leptin in a sample; (b) adding a known amount of labeled leptin to the sample; (c) contacting the sample containing the labeled leptin from (b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (d) washing the substrate with
- 3 045921 удалением несвязанного меченого лептина; и (е) измерения сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином.- 3 045921 by removing unbound labeled leptin; and (e) measuring the labeling signal produced by substrate-bound labeled leptin.
Термин способ и анализ используются в настоящем документе взаимозаменяемо.The terms method and assay are used interchangeably herein.
Предполагается, что способы, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к лептину любого вида, в том числе встречающимся в природе человеческим, мышиным, крысиным лептинам и лептинам других гетерологичных видов, а рекомбинантно продуцируемого зрелого лептина. Например, лептин представляет собой полипептидный продукт, например, гена ob, описанного в международной публикации № WO 96/05309 и патенте США № 6309853, каждое из которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Способы настоящего изобретения могут также быть использованы для детекции нейтрализующих антител к биологически активным фрагментам, агонистам, аналогам агонистов, вариантам, слитым белкам лептина, химерному лептину и другим их производным, таким как таковые, раскрытые в патенте США № 5521283, патенте США № 5532336, патенте США № 5552522, патенте США № 5552523, патенте США № 5552524, патенте США № 5554727, патенте США № 5559208, патенте США № 5580954, патенте США № 5594101, патенте США № 5691309, патенте США № 5756461, патенте США № 5851995, патенте США № 5935810, патенте США № 6001968, патенте США № 6309853, патенте США № 6309853, патенте США № 6350730, патенте США № 6420339, патенте США № 6429290, патенте США № 6541033, патенте США № 6936439, патенте США № 7112659, патенте США № 7183254, патенте США № 7208577, патенте США № 8080254, патенте США № 8394765, публикации США № 2016/0083446, публикации согласно РСТ № WO 00/09165, публикации согласно РСТ № WO 00/20872, публикации согласно РСТ № WO 00/21574, публикации согласно РСТ № WO 00/47741, публикации согласно РСТ № WO 04/39832, публикации согласно РСТ № WO 09/64298, публикации согласно РСТ № WO 96/05309, публикации согласно РСТ № WO 96/22308, публикации согласно РСТ № WO 96/23517, публикации согласно РСТ № WO 96/40912, публикации согласно РСТ № WO 97/02004, публикации согласно РСТ № WO 97/06816, публикации согласно РСТ № WO 97/18833, публикации согласно РСТ № WO 97/38014, публикации согласно РСТ № WO 98/08512, публикации согласно РСТ № WO 98/12224, публикации согласно РСТ № WO 98/28427, публикации согласно РСТ № WO 98/46257, публикации согласно РСТ № WO 98/55139, публикации согласно РСТ № WO 2012/050925, публикации согласно РСТ № WO 2012/050930 и публикации согласно РСТ № WO 2013/009539; все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей. В определенных вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть использованы для детекции нейтрализующих антител к метрелептину.It is contemplated that the methods provided herein can be used to detect neutralizing antibodies to leptin of any kind, including naturally occurring human, murine, rat leptins and leptins of other heterologous species, and recombinantly produced mature leptin. For example, leptin is the polypeptide product of, for example, the ob gene described in International Publication No. WO 96/05309 and US Patent No. 6,309,853, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The methods of the present invention can also be used to detect neutralizing antibodies to biologically active fragments, agonists, agonist analogues, variants, leptin fusion proteins, chimeric leptin and other derivatives thereof, such as those disclosed in US Pat. No. 5,521,283, US Pat. No. 5,532,336. US Patent No. 5552522, US Patent No. 5552523, US Patent No. 5552524, US Patent No. 5554727, US Patent No. 5559208, US Patent No. 5580954, US Patent No. 5594101, US Patent No. 5691309, US Patent No. 5756461, US Patent No. 58 51995, US Patent No. 5935810, US Patent No. 6001968, US Patent No. 6309853, US Patent No. 6309853, US Patent No. 6350730, US Patent No. 6420339, US Patent No. 6429290, US Patent No. 6541033, US Patent No. 6936439, US Patent No. 71 12659, US Patent No. 7183254, US Patent No. 7208577, US Patent No. 8080254, US Patent No. 8394765, US Publication No. 2016/0083446, PCT Publication No. WO 00/09165, PCT Publication No. WO 00/20872, PCT Publication No. WO 00/21574, publications according to PCT No. WO 00/47741, publications according to PCT No. WO 04/39832, publications according to PCT No. WO 09/64298, publications according to PCT No. WO 96/05309, publications according to PCT No. WO 96/22308, publications according to PCT No. WO 96/23517, publications according to PCT No. WO 96/40912, publications according to PCT No. WO 97/02004, publications according to PCT No. WO 97/06816, publications according to PCT No. WO 97/18833, publications according to PCT No. WO 97 /38014, publications according to PCT No. WO 98/08512, publications according to PCT No. WO 98/12224, publications according to PCT No. WO 98/28427, publications according to PCT No. WO 98/46257, publications according to PCT No. WO 98/55139, publications according to PCT No. WO 2012/050925, publications according to PCT No. WO 2012/050930 and publications according to PCT No. WO 2013/009539; all of which are incorporated herein by reference in their entirety and for all purposes. In certain embodiments, the methods of the present invention can be used to detect neutralizing antibodies to metreleptin.
Предполагаемые способы инактивации лептина включают в себя инактивацию нагреванием, а также обработку химическими ингибиторами лептина, в том числе химическими ядами лептина, при условии, что ингибиторы или яды могут быть инактивированы перед добавлением меченого лептина.Suggested methods for inactivating leptin include heat inactivation as well as treatment with chemical leptin inhibitors, including chemical leptin poisons, provided that the inhibitors or poisons can be inactivated before adding labeled leptin.
Предполагается, что меченый лептин может представлять собой любую форму лептина, аналог лептина, химеру лептина или слитый белок или его производное, в том числе таковые соединения, перечисленные выше. Предполагается, что меченый лептин можно метить любой меткой, способной приводить к образованию удобным образом количественно определяемого сигнала. Метки могут представлять собой флуоресцентные метки, в том числе флуоресцентные метки с временным разрешением. Примеры могут включать в себя пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и рутения трис-бипиридин, среди других меток, известных в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет понятно, что способ детекции сигнала метки, образуемого связанным с субстратом меченым лептином, будет зависеть от природы метки.It is contemplated that the labeled leptin may be any form of leptin, leptin analog, leptin chimera or fusion protein or derivative thereof, including those listed above. It is contemplated that labeled leptin can be labeled with any label capable of producing a conveniently quantifiable signal. The tags may be fluorescent tags, including time-resolved fluorescent tags. Examples may include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and ruthenium tris-bipyridine, among other labels known in the art. One skilled in the art will appreciate that the method of detecting the label signal produced by substrate-bound labeled leptin will depend on the nature of the label.
Предполагается, что субстрат, используемый для приведения в контакт с содержащим образец меченым лептином, может содержать (i) покрытую матрицу; и (ii) меченый лептиновый рецептор, связанный с матрицей. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу. В определенных вариантах осуществления лептиновый рецептор метят биотином. Например, лептиновый рецептор может быть связан с матрицей с помощью биотина. Подразумевается, что покрытая матрица может быть связана с более чем одним меченым лептиновым рецептором. В определенных вариантах осуществления аналог лептинового рецептора может быть связан с матрицей.It is contemplated that the substrate used to contact the sample-containing labeled leptin may comprise (i) a coated matrix; and (ii) tagged matrix-bound leptin receptor. In some embodiments, the coated matrix is a streptavidin-coated matrix. In certain embodiments, the leptin receptor is labeled with biotin. For example, the leptin receptor can be coupled to the matrix via biotin. It is understood that the coated matrix may be associated with more than one labeled leptin receptor. In certain embodiments, the leptin receptor analog may be associated with the matrix.
В альтернативном случае предполагается, что субстрат может содержать: (i) покрытую матрицу; (ii) антитело, связанное с матрицей; и (iii) меченый лептиновый рецептор, связанный с антителом. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица представляет собой покрытую стрептавидином матрицу. В определенных вариантах осуществления лептиновый рецептор можно метить любой меткой, подходящей для аффинной очистки. Например, метка может представлять собой гексагистидиновую метку. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое может называться иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору, представляет собой любое антитело с подходящей аффинностью к метке лептинового рецептора. Например, иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору может представлять собой антитело к гексагистидину, в случае, если лептиновый рецептор имеет гексагистидиновую метку. Иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору можно также метить меткой, подходящей для связывания с матрицей, например, биотином. В определенных вариантах осуществления аналог лептинового рецептора может быть связан с матрицей.Alternatively, it is contemplated that the substrate may comprise: (i) a coated matrix; (ii) matrix-bound antibody; and (iii) labeled leptin receptor coupled to antibody. In some embodiments, the coated matrix is a streptavidin-coated matrix. In certain embodiments, the leptin receptor can be labeled with any label suitable for affinity purification. For example, the label may be a hexahistidine label. In some embodiments, the antibody, which may be referred to as a leptin receptor capture antibody, is any antibody with suitable affinity for the leptin receptor tag. For example, the immobilized leptin receptor antibody may be an anti-hexahistidine antibody, where the leptin receptor has a hexahistidine tag. The immobilized leptin receptor antibody can also be labeled with a label suitable for binding to the matrix, such as biotin. In certain embodiments, the leptin receptor analog may be associated with the matrix.
- 4 045921- 4 045921
Матрица, используемая в настоящем документе, может представлять собой твердую подложку, с которым связан меченый лептиновый рецептор или антитело. Матрица может быть подходящей для измерения сигнала, образуемого меченым лептином. Примеры матрицы включают в себя без ограничения лунки планшета, такого как микротитровальный планшет, и гранулы. В определенных вариантах осуществления матрица может представлять собой многолуночный планшет Meso Scale Discovery (MSD).The matrix used herein may be a solid support to which a labeled leptin receptor or antibody is bound. The array may be suitable for measuring the signal produced by labeled leptin. Examples of the matrix include, but are not limited to, wells of a plate such as a microtiter plate, and beads. In certain embodiments, the array may be a Meso Scale Discovery (MSD) multiwell plate.
В определенных вариантах осуществления образец, используемый в способах настоящего изобретения для детекции нейтрализующих антител к лептину, может быть выбран из крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта. Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек.In certain embodiments, the sample used in the methods of the present invention for the detection of neutralizing antibodies to leptin may be selected from the blood, serum, or plasma of the subject. The subject may be a mammal such as a human.
В одном аспекте настоящего изобретения способы, предполагаемые в настоящем документе, могут быть использованы для выявления субъектов, имеющих нейтрализующие антитела, например, в крови, сыворотке крови или плазме крови. Предполагается, что индивидуумы, имеющие нейтрализующие антитела к лептину или аналогу лептина, могут быть выявлены. Индивидуумы, которые являются положительными в отношении нейтрализующих антител, могут быть выявлены в результате сравнения сигнала, образуемого меченым лептином, с положительными и/или отрицательными контрольными данными. В случае, если контроль представляет собой положительный контроль, предполагается, что в случае, если сигнал меньше или равен положительному контрольному сигналу, то образец может рассматриваться в качестве положительного в отношении нейтрализующих антител. В случае, если контроль представляет собой отрицательный контроль, то будет рассчитана процентная разница между сигналом образца и контрольным сигналом, процентную разницу будут сравнивать с границей разделения и в случае, если она больше, чем граница разделения, то субъекту ставят диагноз наличия нейтрализующих антител к исследуемому лептину.In one aspect of the present invention, the methods provided herein can be used to detect subjects having neutralizing antibodies, for example, in blood, serum or plasma. It is believed that individuals who have neutralizing antibodies to leptin or a leptin analogue may be identified. Individuals who are positive for neutralizing antibodies can be identified by comparing the signal generated by labeled leptin with positive and/or negative controls. In case the control is a positive control, it is assumed that if the signal is less than or equal to the positive control signal, then the sample can be considered positive for neutralizing antibodies. In case the control is a negative control, the percentage difference between the sample signal and the control signal will be calculated, the percentage difference will be compared to the cut-off limit and, if greater than the cut-off limit, the subject will be diagnosed with neutralizing antibodies to the test subject. leptin.
Варианты осуществления способа, включающего отрицательный контроль, показаны на фиг. 1А-1В и 3А-3В. На этих фигурах показано, как может возникать связывание между меченым лептином/метрелептином и лептиновым рецепторами, и/или между нейтрализующими антителами к лептину/к метрелептину и лептиновыми рецепторами, с образованием процентной разницы сигнала, которая меньше, чем граница разделения, или равна или больше, чем граница разделения.Embodiments of the method including a negative control are shown in FIG. 1A-1B and 3A-3B. These figures illustrate how binding can occur between labeled leptin/metreleptin and leptin receptors, and/or between neutralizing leptin/metreleptin antibodies and leptin receptors, producing a percentage signal difference that is less than, equal to, or greater than the cutoff. than the separation boundary.
Граница разделения может находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 10% и приблизительно 30%, или составлять приблизительно 20%. Например, граница разделения может составлять приблизительно 5%, или приблизительно 6%, или приблизительно 7%, или приблизительно 8%, или приблизительно 9%, или приблизительно 10%, или приблизительно 11%, или приблизительно 12%, или приблизительно 13%, или приблизительно 14%, или приблизительно 15%, или приблизительно 16%, или приблизительно 17%, или приблизительно 18%, или приблизительно 19%, или приблизительно 20%, или приблизительно 21%, или приблизительно 22%, или приблизительно 23%, или приблизительно 24%, или приблизительно 25%, или приблизительно 26%, или приблизительно 27%, или приблизительно 28%, или приблизительно 29%, или приблизительно 30%, или приблизительно 31%, или приблизительно 32%, или приблизительно 33%, или приблизительно 34%, или приблизительно 35%, или приблизительно 36%, или приблизительно 37%, или приблизительно 38%, или приблизительно 39% или приблизительно 40%.The cutoff may be between about 5% and about 40%, or between about 10% and about 30%, or about 20%. For example, the cutoff may be about 5%, or about 6%, or about 7%, or about 8%, or about 9%, or about 10%, or about 11%, or about 12%, or about 13%, or about 14%, or about 15%, or about 16%, or about 17%, or about 18%, or about 19%, or about 20%, or about 21%, or about 22%, or about 23%, or about 24%, or about 25%, or about 26%, or about 27%, or about 28%, or about 29%, or about 30%, or about 31%, or about 32%, or about 33%, or about 34%, or about 35%, or about 36%, or about 37%, or about 38%, or about 39%, or about 40%.
В определенных вариантах осуществления граница разделения может отличаться в случае, если субъект имеет нормальный уровень лептина, или в случае, если субъект имеет лептиновую недостаточность. В определенных вариантах осуществления субъект имеет лептиновую недостаточность, в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке, которая составляет приблизительно 16 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 7 нг/мл или ниже для мужчины; концентрацию в сыворотке, которая составляет приблизительно 8 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 5 нг/мл или ниже для мужчины; или приблизительно 5 нг/мл или ниже для женщины и приблизительно 3 нг/мл или ниже для мужчины. В противном случае субъект имеет лептиновую недостаточность в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке в пределах 15-го процентиля, или 10-го процентиля, или 8-го процентиля, или второго процентиля, или первого процентиля в соответствии с NHANES III. В альтернативном случае субъект имеет лептиновую недостаточность в случае, если он/она имеет концентрацию в сыворотке, которая находится в пределах определенного процентиля, скорректированного на BMI, пол и/или другие факторы, такие как концентрация в сыворотке в пределах 10-го процентиля, или 5-го процентиля, или 3-го процентиля, или 2-го процентиля в соответствии с NHANES III, скорректированного на BMI.In certain embodiments, the cutoff may be different if the subject has normal leptin levels or if the subject has leptin deficiency. In certain embodiments, a subject has leptin deficiency if he/she has a serum concentration that is about 16 ng/mL or lower for a woman and about 7 ng/mL or lower for a man; a serum concentration that is approximately 8 ng/mL or lower for a woman and approximately 5 ng/mL or lower for a man; or about 5 ng/ml or lower for a woman and about 3 ng/ml or lower for a man. Otherwise, a subject has leptin deficiency if he/she has a serum concentration within the 15th percentile, or the 10th percentile, or the 8th percentile, or the second percentile, or the first percentile according to NHANES III. Alternatively, a subject has leptin deficiency if he/she has a serum concentration that is within a certain percentile adjusted for BMI, sex, and/or other factors, such as a serum concentration within the 10th percentile, or 5th percentile, or 3rd percentile, or 2nd percentile according to NHANES III, adjusted for BMI.
В определенных вариантах осуществления, в случае, если субъект не имеет лептиновой недостаточности, граница разделения будет находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или в некоторых вариантах осуществления между приблизительно 5% и приблизительно 15%, например, составлять приблизительно 10,2% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к лептину (например, если субъект получал лечение лептином), или составлять приблизительно 7,89% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к метрелептину (например, если субъект получал лечение метрелептином). В определенных вариантах осуществления, в случае, если субъект имеет лептиновую недостаточность, граница разделения будет находиться между приблизительно 5% и приблизительно 40%, или между приблизительно 5% и приблизительно 30%, или в некоторых вариантах осуществления между приблизительно 5% и приблизительно 15%, наIn certain embodiments, if the subject does not have leptin deficiency, the cutoff will be between about 5% and about 40%, or between about 5% and about 30%, or in some embodiments, between about 5% and about 15 %, for example, be approximately 10.2% if neutralizing antibodies to leptin are detected (eg, if the subject was treated with leptin), or be approximately 7.89% if neutralizing antibodies to metreleptin are detected (eg, if the subject received treatment with metreleptin). In certain embodiments, if the subject has leptin deficiency, the cutoff will be between about 5% and about 40%, or between about 5% and about 30%, or in some embodiments, between about 5% and about 15% , on
- 5 045921 пример, составлять приблизительно 10,2% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к лептину (например, если субъект получал лечение лептином), или составлять приблизительно 9,66% в случае, если выявляются нейтрализующие антитела к метрелептину (например, если субъект получал лечение метрелептином).- 5 045921 example, to be approximately 10.2% if neutralizing antibodies to leptin are detected (for example, if the subject was treated with leptin), or to be approximately 9.66% if neutralizing antibodies to metreleptin are detected (for example, if subject was treated with metreleptin).
На фиг. 2 представлен иллюстративный лист данных для применения в соответствии со способами настоящего изобретения.In fig. 2 is an illustrative data sheet for use in accordance with the methods of the present invention.
В одном аспекте способы, предполагаемые в настоящем документе, могут быть использованы для определения у субъекта изменения в присутствии нейтрализующих антител к лептину в крови, сыворотке крови или плазме крови от субъекта с течением времени. Например, способы могут быть использованы у субъекта, получающего лечение лептином, в целях определения изменения в наличии нейтрализующих антител в крови, сыворотке крови или плазме крови субъекта, перед лечением лептином и затем во время или после лечения лептином. Примеры видов лечения лептином известны в данной области техники. Способ может предусматривать: (1а) инактивацию лептина, присутствующего в первом образце крови, сыворотки крови или плазмы субъекта; (1b) добавление известного количества меченого лептина к первому образцу; (1с) приведение в контакт первого образца, содержащего меченый лептин из (1b) с субстратом, способным связываться с меченым лептином; (1d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (1е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (2а) инактивацию лептина, присутствующего во втором образце крови, сыворотки крови или плазмы крови субъекта; (2b) добавление известного количества меченого лептина ко второму образцу; (2с) приведение в контакт второго образца, содержащего меченый лептин из (2b) с субстратом, способным связывать меченый лептин; (2d) промывание субстрата с удалением несвязанного меченого лептина; (2е) измерение сигнала метки, образуемого связанным меченым лептином; (3) сравнение сигнала метки из (2е) с сигналом метки из (1е). В некоторых вариантах осуществления в результате сравнения может определяться процентная разницу между сигналом метки из (2е) и сигналом метки из (1е). В определенных вариантах осуществления процентную разницу можно сравнивать с границей разделения. Граница разделения может находиться между приблизительно 55% и приблизительно 95%, или между приблизительно 60% и приблизительно 90%. Примеры могут включать в себя приблизительно 60%, или приблизительно 61%, или приблизительно 62%, или приблизительно 63%, или приблизительно 64%, или приблизительно 65%, или приблизительно 66%, или приблизительно 67%, или приблизительно 68%, или приблизительно 69%, или приблизительно 70%, или приблизительно 71%, или приблизительно 72%, или приблизительно 73%, или приблизительно 74%, или приблизительно 75%, или приблизительно 76%, или приблизительно 77%, или приблизительно 78%, или приблизительно 79%, или приблизительно 80%, или приблизительно 81%, или приблизительно 82%, или приблизительно 83%, или приблизительно 84%, или приблизительно 85%, или приблизительно 86%, или приблизительно 87%, или приблизительно 88%, или приблизительно 89% или приблизительно 90%. В определенных вариантах осуществления граница разделения может быть использована для определения того, необходимо ли субъекту продолжать лечение или будет ли субъект восприимчив к лечению. Например, в случае, если процентная разница равна или меньше границы разделения, то можно определить, что субъект должен прекратить лечение или что субъект будет невосприимчив к лечению.In one aspect, the methods provided herein can be used to determine in a subject changes in the presence of neutralizing antibodies to leptin in blood, serum, or plasma from the subject over time. For example, the methods may be used in a subject receiving leptin treatment to determine a change in the presence of neutralizing antibodies in the subject's blood, serum, or plasma, before leptin treatment and then during or after leptin treatment. Examples of leptin treatments are known in the art. The method may include: (1a) inactivating leptin present in the first sample of blood, serum or plasma of the subject; (1b) adding a known amount of labeled leptin to the first sample; (1c) contacting the first sample containing the labeled leptin of (1b) with a substrate capable of binding to the labeled leptin; (1d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (1e) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (2a) inactivating leptin present in a second sample of blood, serum or plasma of the subject; (2b) adding a known amount of labeled leptin to the second sample; (2c) contacting a second sample containing the labeled leptin from (2b) with a substrate capable of binding the labeled leptin; (2d) washing the substrate to remove unbound labeled leptin; (2e) measuring the labeling signal produced by bound labeled leptin; (3) comparison of the tag signal from (2e) with the tag signal from (1e). In some embodiments, the comparison may determine the percentage difference between the mark signal from (2e) and the mark signal from (1e). In certain embodiments, the percentage difference may be compared to a split margin. The separation limit may be between about 55% and about 95%, or between about 60% and about 90%. Examples may include about 60%, or about 61%, or about 62%, or about 63%, or about 64%, or about 65%, or about 66%, or about 67%, or about 68%, or about 69%, or about 70%, or about 71%, or about 72%, or about 73%, or about 74%, or about 75%, or about 76%, or about 77%, or about 78%, or about 79%, or about 80%, or about 81%, or about 82%, or about 83%, or about 84%, or about 85%, or about 86%, or about 87%, or about 88%, or approximately 89% or approximately 90%. In certain embodiments, the separation boundary may be used to determine whether a subject needs to continue treatment or whether the subject will be receptive to treatment. For example, if the percentage difference is equal to or less than the cutoff limit, it may be determined that the subject should discontinue treatment or that the subject will be refractory to treatment.
Предполагаемые способы могут дополнительно предусматривать этап диссоциации, в целях диссоциации любых нейтрализующих антител в образце из любого лептина, который может присутствовать в образце. Указанный этап диссоциации может осуществляться в результате снижения значения рН образца после нейтрализации лептина. Подходящие реагенты для подкисления образца будут полностью очевидны специалисту в данной области техники, например, может быть использована уксусная кислота, например, раствор с содержанием от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% уксусной кислоты, или приблизительно 0,8% раствор уксусной кислоты. Другие подходящие реагенты, которые могут быть использованы для подкисления образца, известны специалисту в данной области техники. После подкисления образца, который диссоциирует любые нейтрализующие антитела из лептинов, которые могут присутствовать в образце, меченый лептин может быть добавлен совместно с основным раствором, достаточным для нейтрализации значения рН образца. Предполагается, что раствор, содержащий меченый лептин, может представлять собой буфер, такой, чтобы при добавлении его к образцу, значение рН образца повышалось до примерно 7, например, 7,4, обеспечивая связывание любых нейтрализующих антител, присутствующих в образце, с меченым лептином. Подходящие буферы включают в себя Thamбуфер от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,15 М, или от приблизительно 0,12 М до приблизительно 0,14 М, или приблизительно 0,124 М или 0,125 М. Другие подходящие буферы, которые могут возвращать значение рН образца к состоянию около нейтральности, известны специалисту в данной области техники.The contemplated methods may further include a dissociation step to dissociate any neutralizing antibodies in the sample from any leptin that may be present in the sample. This dissociation step can occur as a result of a decrease in the pH value of the sample after neutralization of leptin. Suitable reagents for acidifying the sample will be readily apparent to one skilled in the art, for example, acetic acid, such as a solution containing from about 0.5% to about 1% acetic acid, or about a 0.8% acetic acid solution, can be used. Other suitable reagents that can be used to acidify the sample are known to one skilled in the art. After acidification of the sample, which dissociates any neutralizing antibodies from leptins that may be present in the sample, labeled leptin can be added along with a stock solution sufficient to neutralize the pH value of the sample. It is contemplated that the solution containing labeled leptin may be a buffer such that when added to a sample, the pH of the sample is raised to about 7, for example 7.4, allowing any neutralizing antibodies present in the sample to bind to the labeled leptin . Suitable buffers include Thambuffer from about 0.1 M to about 0.15 M, or from about 0.12 M to about 0.14 M, or about 0.124 M or 0.125 M. Other suitable buffers that can return a pH value sample to a state near neutrality are known to one skilled in the art.
Сигналы, образуемые метками, могут быть измерены с помощью способов, известных в данной области техники. Например, подходящие устройства, которые могут измерять сигналы, известны специалисту в данной области техники.The signals generated by the marks can be measured using methods known in the art. For example, suitable devices that can measure signals are known to one skilled in the art.
Предполагается, что определение того, имеет или не имеет субъект нейтрализующие антитела к лептину, может быть использовано для прогноза того, будет ли субъект восприимчив к лечению лептиIt is proposed that determining whether a subject has or does not have neutralizing antibodies to leptin can be used to predict whether the subject will be responsive to treatment for leptin
- 6 045921 ном, например, предполагается, что субъект с высокими уровнями нейтрализующих антител будет невосприимчив к лечению лептином.- 6 045921 nom, for example, it is expected that a subject with high levels of neutralizing antibodies will be refractory to leptin treatment.
Наборы.Sets.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор, содержащий компоненты для осуществления способов настоящего изобретения. Такой набор может содержать меченый лептин и субстрат, способный связывать меченый лептин, как описано выше, для применения в способах настоящего изобретения. Например, в некоторых вариантах осуществления лептин можно метить пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или рутения трис-бипиридином. В определенных вариантах осуществления лептин представляет собой метрелептин.In another aspect of the present invention, there is provided a kit containing components for carrying out the methods of the present invention. Such a kit may contain labeled leptin and a substrate capable of binding labeled leptin, as described above, for use in the methods of the present invention. For example, in some embodiments, leptin can be labeled with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, or ruthenium tris-bipyridine. In certain embodiments, the leptin is metreleptin.
В определенных вариантах осуществления субстрат может представлять собой покрытую матрицу, как описано выше, такую как покрытую стрептавидином матрицу, и меченый лептиновый рецептор. Лептиновый рецептор можно метить биотином. В некоторых вариантах осуществления покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор могут храниться в наборе по отдельности. В других вариантах осуществления меченый лептиновый рецептор может быть связан с матрицей.In certain embodiments, the substrate may be a coated matrix as described above, such as a streptavidin-coated matrix, and a labeled leptin receptor. The leptin receptor can be labeled with biotin. In some embodiments, the coated matrix and the labeled leptin receptor may be stored separately in the kit. In other embodiments, the labeled leptin receptor may be associated with the matrix.
В некоторых вариантах осуществления субстрат может представлять собой покрытую матрицу, такую как покрытую стрептавидином матрицу; антитело; и меченый лептиновый рецептор. Лептиновый рецептор можно метить любой меткой, подходящей для аффинной очистки, такой как гексагистидиновой меткой. В некоторых вариантах осуществления антитело, т.е., иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору, представляет собой любое антитело с подходящей аффинностью к метке лептинового рецептора. Например, иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору может представлять собой антитело к гексагистидину, в случае, если лептиновый рецептор имеет гексагистидиновую метку. Иммобилизованное антитело к лептиновому рецептору можно также метить меткой, подходящей для связывания с матрицей, такой как, биотином. В некоторых вариантах осуществления антитело может быть связано с матрицей, и/или меченый лептиновый рецептор может быть связан с антителом. В других вариантах осуществления покрытая матрица и меченый лептиновый рецептор находятся в наборе по отдельности.In some embodiments, the substrate may be a coated matrix, such as a streptavidin-coated matrix; antibody; and tagged leptin receptor. The leptin receptor can be labeled with any tag suitable for affinity purification, such as a hexahistidine tag. In some embodiments, the antibody, i.e., the immobilized leptin receptor antibody, is any antibody with suitable affinity for the leptin receptor tag. For example, the immobilized leptin receptor antibody may be an anti-hexahistidine antibody, where the leptin receptor has a hexahistidine tag. The immobilized leptin receptor antibody can also be labeled with a label suitable for binding to a matrix, such as biotin. In some embodiments, the antibody may be associated with a matrix, and/or the labeled leptin receptor may be associated with the antibody. In other embodiments, the coated matrix and the labeled leptin receptor are separately included in the kit.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит положительный контроль, такой как антитело к лептину или антитело к метрелептину.In certain embodiments, the kit further comprises a positive control, such as an anti-leptin antibody or an anti-metreleptin antibody.
В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит отрицательный контроль.In certain embodiments, the kit further comprises a negative control.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или несколько подкисляющих реагентов. Например, подкисляющий реагент может представлять собой уксусную кислоту, такую как раствор от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% уксусной кислоты, или приблизительно 8% раствор уксусной кислоты.In some embodiments, the kit further contains one or more acidifying reagents. For example, the acidifying agent may be acetic acid, such as a solution of about 0.5% to about 1% acetic acid, or about 8% acetic acid.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит основной раствор, такой как буфер. Соответствующие буферы включают в себя Tham-буфер от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,15 М, или от приблизительно 0,12 М до приблизительно 0,14 М, или приблизительно 0,124 М или 0,125 М.In some embodiments, the kit further contains a stock solution, such as a buffer. Suitable buffers include Tham buffer from about 0.1 M to about 0.15 M, or from about 0.12 M to about 0.14 M, or about 0.124 M or 0.125 M.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции для работы с компонентами набора.In some embodiments, the kit further includes instructions for operating the components of the kit.
ПримерыExamples
Следующие примеры никоим образом не предусматривают ограничение объема настоящего изобретения, а представлены для иллюстрации аспектов раскрываемых способов. Многие другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники.The following examples are not intended to limit the scope of the present invention in any way, but are presented to illustrate aspects of the disclosed methods. Many other embodiments of the present invention will be apparent to one skilled in the art.
Пример 1.Example 1.
Рассматриваемые образцы можно исследовать следующим образом в целях определения уровня нейтрализующих антител, которые они содержат (см. также фиг. 4).The samples in question can be examined as follows to determine the level of neutralizing antibodies they contain (see also FIG. 4).
1. Покрытые стрептавидином планшеты блокировали с помощью Superblock в течение 1 часа.1. Streptavidin-coated plates were blocked with Superblock for 1 hour.
2. Рассматриваемые образцы инактивировали нагреванием.2. The samples in question were inactivated by heat.
3. Лептин или метрелептин, меченые рутения (Ru) сульфометкой, добавляли к каждому образцу. Образцы положительного контроля готовили путем добавления лептина или метрелептина, меченого Ru сульфометкой, и положительного контрольного антитела к лептину muLEP13-11.03. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.3. Leptin or metreleptin, labeled with ruthenium (Ru) sulfomethane, was added to each sample. Positive control samples were prepared by adding leptin or Ru sulfonated metreleptin and the positive control anti-leptin antibody muLEP13-11.03. Samples were incubated at room temperature for 2 hours.
4. Планшеты со стрептавидином промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Меченое биотином антитело к гексагистидину, разбавленное в PBS, добавляли к планшетам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.4. Streptavidin plates were washed with phosphate buffered saline (PBS). Biotin-labeled anti-hexahistidine antibody diluted in PBS was added to the plates and incubated at room temperature for 1 hour.
5. Планшеты промывали PBS и разведенный меченый гептагистидином белок лептинового рецептора добавляли к планшетам и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа.5. The plates were washed with PBS and diluted heptahistidine-tagged leptin receptor protein was added to the plates and the plates were incubated at room temperature for one hour.
6. Планшеты промывали PBS, исследуемые и контрольные образцы (из этапа 2, приведенного выше) добавляли к планшетам и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.6. The plates were washed with PBS, test and control samples (from step 2 above) were added to the plates and the plates were incubated at room temperature for 1 hour.
7. Планшеты промывали PBS и считывали на ридере MSD ESL.7. The plates were washed with PBS and read on an MSD ESL reader.
Измеряли максимальный сигнал для лунок отрицательного контроля, содержащих лептин и метрелептин, но не нейтрализующее антитело. Процентное ингибирование рассчитывали путем вычитанияThe maximum signal was measured for negative control wells containing leptin and metreleptin, but not neutralizing antibody. Percent inhibition was calculated by subtracting
- 7 045921 разницы между максимальным сигналом и измеряемым сигналом для каждого образца и деления этого числа на максимальный сигнал. Процентное ингибирование затем сравнивали с границей разделения, как описано в примере 3.- 7 045921 the difference between the maximum signal and the measured signal for each sample and dividing this number by the maximum signal. Percent inhibition was then compared to the cutoff as described in Example 3.
Пример 2.Example 2.
Необязательный этап кислотной диссоциации можно осуществлять в результате модификации процедуры, описанной в примере 1, следующим образом (см. также фиг. 5).The optional acid dissociation step can be carried out by modifying the procedure described in Example 1 as follows (see also FIG. 5).
1. После инактивации нагреванием образцы инкубировали в 0,8% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре в течение одного часа с диссоциацией любых связанных антител в образце.1. After heat inactivation, samples were incubated in 0.8% acetic acid at room temperature for one hour to dissociate any bound antibodies in the sample.
2. Лептин или метрелептин, меченые сульфометкой, разводили в 0,124 М растворе Tham-буфера, который нейтрализует уксусный образец при добавлении, способствуя связыванию антител.2. Sulfometlabeled leptin or metreleptin was diluted in 0.124 M Tham buffer, which neutralizes the acetic sample upon addition, promoting antibody binding.
Было определено, что чувствительность анализа связывания с рецептором, описанного выше, составляла 109 нг/мл в случае антител к метрелептину и 101 нг/мл в случае антител к лептину. Предел детекции в случае сопоставимого клеточного анализа с нейтрализующими антителами составлял 251 нг/мл.The sensitivity of the receptor binding assay described above was determined to be 109 ng/ml for metreleptin antibodies and 101 ng/ml for leptin antibodies. The limit of detection for a comparable cell-based assay with neutralizing antibodies was 251 ng/mL.
Пример 3.Example 3.
Границы разделения рассчитывали на основе процентного ингибирования сигнала от лептина и метрелептина у больных субъектов, которые имели предшествующее лечение метрелептином, и здоровых субъектов, не получавших лечения. Граница разделения в случае ингибирования связывания с лептином у здоровых и ранее получавших лечение больных субъектов составляла 10,18% ингибирования. Граница разделения в случае ингибирования связывания с метрелептином у больных субъектов, которые ранее получали лечение, составляла 9,66% ингибирования, а у нормальных субъектов она составляла 7,89% ингибирования. Все границы разделения устанавливали таким образом, чтобы они давали 1% доли ложных распознаваний сигнала. Данные о границах разделения представлены на фиг. 6.Cutoff limits were calculated based on the percentage inhibition of leptin and metreleptin signal in diseased subjects who had prior treatment with metreleptin and healthy subjects who had not received treatment. The cutoff for inhibition of leptin binding in healthy and previously treated diseased subjects was 10.18% inhibition. The cutoff for inhibition of metreleptin binding in previously treated diseased subjects was 9.66% inhibition and in normal subjects it was 7.89% inhibition. All cutoff limits were set to yield a 1% false signal recognition rate. Data on the separation boundaries are presented in Fig. 6.
Таблица 1 Обобщение границ разделения в случае лептина и метрелептина как для нормальных, так и для больных субъектовTable 1 Summary of cutoffs for leptin and metreleptin for both normal and diseased subjects
Пример 4.Example 4.
Образцы от 17 пациентов исследовали в отношении ингибирования сигнала от лептина и метрелептина в соответствии со способами, описанными выше. Данные представлены на фиг. 6 и в табл. 2-4.Samples from 17 patients were tested for leptin and metreleptin signal inhibition according to the methods described above. The data is presented in Fig. 6 and in table. 2-4.
Два контрольных моноклональных нейтрализующих антитела к лептину использовали в концентрациях как 156 нг/мл (положительный контроль (низкая)) или 5000 нг/мл (положительный контроль (высокая)). Контрольные данные представлены на фиг. 6 и в табл. 3. Ингибирование обоими антителами было в значительной степени однородным, что указывало на надежность анализа.Two control monoclonal leptin neutralizing antibodies were used at concentrations of either 156 ng/ml (positive control (low)) or 5000 ng/ml (positive control (high)). Control data is presented in Fig. 6 and in table. 3. Inhibition by both antibodies was largely uniform, indicating the reliability of the assay.
Образцы с ингибированием более, чем граница разделения, относили к положительной категории, в то время как таковые с ингибированием ниже границы разделения относили к отрицательной категории. См. фиг. 6 и табл. 4.Samples with inhibition greater than the cutoff were assigned to the positive category, while those with inhibition below the cutoff were assigned to the negative category. See fig. 6 and table. 4.
- 8 045921- 8 045921
Таблица 2table 2
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином, полученный из образцов от 17 пациентовSignal data and percentage inhibition of leptin and metreleptin binding obtained from samples from 17 patients
- 9 045921- 9 045921
Таблица 3Table 3
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином высокими и низкими дозами моноклональных нейтрализующих антител к лептину положительного контроляSignal data and percentage inhibition of leptin and metreleptin binding by high and low dose positive control monoclonal neutralizing antibodies to leptin
- 10 045921- 10 045921
Таблица 4Table 4
Данные о сигналах и процент ингибирования связывания с лептином и метрелептином, а также диагностированная категория (положительная или отрицательная в случае нейтрализующих антител к лептину) для образцов от 17 пациентовSignal data and percentage inhibition of leptin and metreleptin binding, and diagnosed category (positive or negative for leptin neutralizing antibodies) for samples from 17 patients
Включение в описание изобретения сведений путем ссылки.Incorporation of information into the description of the invention by reference.
Во всем настоящем раскрытии были сделаны ссылки и цитаты на другие документы, такие как патенты, патентные заявки, патентные публикации, журналы, книги, периодические издания, исследования, веб-контенты. Все такие документы включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.Throughout this disclosure, references and quotations have been made to other documents, such as patents, patent applications, patent publications, journals, books, periodicals, studies, web content. All such documents are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.
--
Claims (17)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/393,632 | 2016-09-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045921B1 true EA045921B1 (en) | 2024-01-18 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200378988A1 (en) | Methods of detecting anti-leptin neutralizing antibodies | |
| JP5555846B2 (en) | Prognosis determination method for acute central nervous system disorder | |
| Sisson et al. | Increased survivin expression contributes to apoptosis-resistance in IPF fibroblasts | |
| US9068988B2 (en) | Compositions and methods of detecting TIABs | |
| JP5737673B2 (en) | Method for detecting epitope of allergen or candidate thereof and use thereof | |
| KR20100128281A (en) | Classification of individuals suffering from cardiovascular diseases according to survival prognoses as found by measuring the levels of biomarker ykl-40 | |
| JP5222138B2 (en) | Method for measuring the concentration of adipocyte type (A-FABP, FABP4, P2) of fatty acid binding protein | |
| TW201033616A (en) | Urine and serum biomarkers associated with diabetic nephropathy | |
| JP2019529904A5 (en) | ||
| CN110488025A (en) | A kind of chemiluminescence quantitative detection excrement calprotectin and its detection method and its intestinal health detection purposes | |
| JP6733889B2 (en) | Cell differentiation potential determination method | |
| TW201027075A (en) | Methods for the classification and diagnosis of scoliosis | |
| EA045921B1 (en) | METHODS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES TO LEPTINA | |
| KR20100127210A (en) | Ykl-40 as a general marker for non-specific disease | |
| CN104105967B (en) | Tenascin C and its purposes in rheumatoid arthritis | |
| US20120178112A1 (en) | Method of detecting skeletal muscle damage | |
| EP3298028B1 (en) | Method for detecting and measuring endogenous complexes as a new tumour marker | |
| JP2009128178A (en) | Detection method and detection kit of body activity level | |
| JP2022021363A (en) | Biomarker for determining sleep disorder | |
| EP2526423A1 (en) | Methods&devices for diagnosing cardiac disorders | |
| Bartl et al. | Laboratory Investigations in Osteoporosis: Are They Needed? | |
| Potts Jr | Clinical applications of parathyroid hormone assays | |
| DE102015108523A1 (en) | Peptide biomarker for cancer | |
| CN106459166A (en) | Method and biomarker for detecting metastasis of sarcoma |