EA045880B1 - OPTIMIZATION OF C-8-ISOMERIZATION OF STEROLS - Google Patents
OPTIMIZATION OF C-8-ISOMERIZATION OF STEROLS Download PDFInfo
- Publication number
- EA045880B1 EA045880B1 EA202092804 EA045880B1 EA 045880 B1 EA045880 B1 EA 045880B1 EA 202092804 EA202092804 EA 202092804 EA 045880 B1 EA045880 B1 EA 045880B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dhc
- cholesterol
- yeast cell
- enzyme
- sterols
- Prior art date
Links
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 title claims description 67
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 title claims description 67
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 title claims description 66
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 title description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 claims description 117
- UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N Dehydrocholesterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 92
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 80
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 66
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 66
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 49
- 101001077418 Homo sapiens Potassium voltage-gated channel subfamily H member 6 Proteins 0.000 claims description 42
- 102100025135 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 6 Human genes 0.000 claims description 41
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 claims description 28
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 claims description 28
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 claims description 27
- UJELMAYUQSGICC-UHFFFAOYSA-N Zymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(C)C=CCC(C)C)CCC21 UJELMAYUQSGICC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- CGSJXLIKVBJVRY-XTGBIJOFSA-N zymosterol Chemical compound C([C@@]12C)C[C@H](O)C[C@@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@H]21 CGSJXLIKVBJVRY-XTGBIJOFSA-N 0.000 claims description 23
- 244000301083 Ustilago maydis Species 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 235000015919 Ustilago maydis Nutrition 0.000 claims description 15
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 13
- 101150098080 ERG5 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150050623 erg-6 gene Proteins 0.000 claims description 10
- JKKKWUFGIITSRU-WUHSCZTQSA-N C(C(C)=CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CCC4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)O Chemical compound C(C(C)=CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CCC4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)O JKKKWUFGIITSRU-WUHSCZTQSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108010068899 delta 24-sterol reductase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 30
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- IZVFFXVYBHFIHY-SKCNUYALSA-N 5alpha-cholest-7-en-3beta-ol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC[C@H]21 IZVFFXVYBHFIHY-SKCNUYALSA-N 0.000 description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 15
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- IZVFFXVYBHFIHY-UHFFFAOYSA-N (3alpha, 5alpha)-Cholest-7-en-3-ol, 9CI Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCCC(C)C)CCC33)C)C3=CCC21 IZVFFXVYBHFIHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 12
- CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N lanosterol Chemical compound C([C@]12C)C[C@@H](O)C(C)(C)[C@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@]21C CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N 0.000 description 12
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 11
- BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N (10S)-3c-Acetoxy-4.4.10r.13c.14t-pentamethyl-17c-((R)-1.5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-(5tH)-Delta8-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren Natural products CC12CCC(OC(C)=O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N (3beta,5alpha)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21 CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 14alpha-methylzymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 3beta-Hydroxy-lanostan Natural products C1CC2C(C)(C)C(O)CCC2(C)C2C1C1(C)CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N Gluanol Natural products CC(C)CC=CC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(O)C(C)(C)C4CC3 BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N Lanosterol Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N Nerifoliol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N dihydrolanosterol Natural products CC(C)CCCC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940058690 lanosterol Drugs 0.000 description 10
- 101001077420 Homo sapiens Potassium voltage-gated channel subfamily H member 7 Proteins 0.000 description 9
- 102100025133 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 7 Human genes 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 101000955959 Homo sapiens Vacuolar protein sorting-associated protein 52 homolog Proteins 0.000 description 8
- 102100038937 Vacuolar protein sorting-associated protein 52 homolog Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 6
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 6
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 25-Hydroxycholecalciferol Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 5
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 5
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 5
- 241000318910 Metarhizium acridum Species 0.000 description 5
- 101100065588 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) erg4A gene Proteins 0.000 description 5
- 240000000064 Penicillium roqueforti Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108010048070 delta(8)-delta(7)-sterol isomerase Proteins 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 4
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 4
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 4
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 102100037199 Lathosterol oxidase Human genes 0.000 description 4
- 241000223201 Metarhizium Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 108010046606 sterol delta-5 desaturase Proteins 0.000 description 4
- -1 without limitation Chemical compound 0.000 description 4
- JWUBBDSIWDLEOM-DCHLRESJSA-N 25-Hydroxyvitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-DCHLRESJSA-N 0.000 description 3
- JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 25-hydroxy-3 epi cholecalciferol Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 235000021318 Calcifediol Nutrition 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- JWUBBDSIWDLEOM-DTOXIADCSA-N calcidiol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-DTOXIADCSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960004361 calcifediol Drugs 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- UCTLRSWJYQTBFZ-DDPQNLDTSA-N cholesta-5,7-dien-3beta-ol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 UCTLRSWJYQTBFZ-DDPQNLDTSA-N 0.000 description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003872 25-hydroxy-cholecalciferol Substances 0.000 description 1
- UTXLOPQCWLMVMN-UHFFFAOYSA-N 3alpha,16beta-Dihydroxy-5alpha-androstan-7-on Natural products CC1(CCC2C(=CCC3C(C)(CO)C(O)CCC23C)C1)C(O)COC4OC(CO)C(O)C(O)C4O UTXLOPQCWLMVMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069620 ARE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100031674 Arabidopsis thaliana NPF8.3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- NKVLDPWGKCPGEP-FFTFKNOJSA-N C(C(C)=CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)O Chemical compound C(C(C)=CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)O NKVLDPWGKCPGEP-FFTFKNOJSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101150031251 ERG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001109620 Homo sapiens Nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000587438 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101150050258 Hsp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100389668 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) erg-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022726 Nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 101100235787 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pim1 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 101150114015 ptr-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Description
Изобретение касается усовершенствованного способа получения 7-дегидрохолестерина (7-DHC), важного промежуточного продукта при биотехнологическом получении витамина D3 или его производных/метаболитов. В изобретении представлены модифицированные штаммы клеток хозяина, экспрессирующих ферменты с улучшенной активностью С-8-стеролизомеразы, и их применение в способе получения витамина D3 или его производных и/или метаболитов.The invention relates to an improved method for the production of 7-dehydrocholesterol (7-DHC), an important intermediate in the biotechnological production of vitamin D3 or its derivatives/metabolites. The invention presents modified strains of host cells expressing enzymes with improved C-8-sterolysomerase activity, and their use in a method for producing vitamin D3 or its derivatives and/or metabolites.
Витамин D3 (также известный как холекальциферол или кальциол) может синтезироваться в коже млекопитающих из провитамина D3 (также известного как 7-дегидрохолестерин или 7-DHC), который является продуктом биосинтеза холестерина, под воздействием УФ-света, при этом 7-DHC фотохимически превращается в провитамин D3, который изомеризуется при температуре тела до биологически активной формы витамина D3. В печени витамин D3 превращается в биологически неактивный 25гидроксивитамин D3 (также известный как кальцидиол, кальцифедиол, 25-гидроксихолекальциферол, 25-OH-D3 или HyD), который является основной циркулирующей формой витамина D3. Дальнейшее гидроксилирование происходит в почках.Vitamin D3 (also known as cholecalciferol or calciol) can be synthesized in mammalian skin from provitamin D3 (also known as 7-dehydrocholesterol or 7-DHC), which is a product of cholesterol biosynthesis, upon exposure to UV light, whereby 7-DHC is photochemically converted into provitamin D3, which isomerizes at body temperature to the biologically active form of vitamin D3. In the liver, vitamin D3 is converted to biologically inactive 25hydroxyvitamin D3 (also known as calcidiol, calcifediol, 25-hydroxycholecalciferol, 25-OH-D3, or HyD), which is the main circulating form of vitamin D3. Further hydroxylation occurs in the kidneys.
Для промышленного производства витамина D3 доступен (в принципе) как химический, так и биотехнологический синтез. Химический синтез начинается с холестерина, выделенного, например, из шёрстного жира, который дегидрогенизируется до 7-DHC, важного промежуточного продукта как при химическом, так и биотехнологическом синтезе. Под воздействием УФ-излучения и дополнительных стадий очистки/экстракции 7-DHC превращается в витамин D3. Для биосинтеза 7-DHC можно использовать модифицированные штаммы дрожжей, в которых ацетил-СоА в многоступенчатом ферментативном процессе превращается в 7-DHC. Данная энзиматическая конверсия происходит в эндоплазматическом ретикулуме дрожжей. Избыточные количества стеролов, включая 7-DHC и его предшественники, которые не нужны в клеточных мембранах, токсичны для дрожжей, поэтому они накапливаются в виде стериловых эфиров во внутриклеточных органеллах (так называемых липидных тельцах), из которых они также могут быть выделены. Равновесие между свободными стеролами и стеролами, хранящимися в липидных телах (в основном в форме стериловых эфиров), запускается под действием нескольких белков (ферментов), включая действие стерол-ацилтрансфераз.For the industrial production of vitamin D3, both chemical and biotechnological synthesis are available (in principle). Chemical synthesis begins with cholesterol isolated, for example, from wool fat, which is dehydrogenated to 7-DHC, an important intermediate in both chemical and biotechnological synthesis. When exposed to UV light and additional purification/extraction steps, 7-DHC is converted to vitamin D3. For the biosynthesis of 7-DHC, modified yeast strains can be used, in which acetyl-CoA is converted into 7-DHC in a multi-step enzymatic process. This enzymatic conversion occurs in the endoplasmic reticulum of yeast. Excessive amounts of sterols, including 7-DHC and its precursors, which are not required in cell membranes, are toxic to yeast, so they accumulate as steryl esters in intracellular organelles (called lipid bodies), from which they can also be isolated. The equilibrium between free sterols and sterols stored in lipid bodies (mainly in the form of steryl esters) is triggered by the action of several proteins (enzymes), including the action of sterol acyltransferases.
Вследствие неспецифического действия данных ферментов - стерол-ацилтрансфераз пул стериловых эфиров, который хранится в липидных тельцах, относительно разнообразен, включая, без ограничения, например, сложные эфиры эргостерола, зимостерола, ланостерола, латостерола, холеста-5,7,24(25)триенола или 7-DHC. Только 7-DHC может затем превращаться в витамин D3.Due to the nonspecific action of these sterol acyltransferase enzymes, the pool of steryl esters that is stored in lipid bodies is relatively diverse, including, but not limited to, esters of ergosterol, zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,7,24(25)trienol or 7-DHC. Only 7-DHC can then be converted into vitamin D3.
Таким образом, насущной задачей является создание клеток хозяина типа дрожжей, способных вырабатывать стеролы с высокой продуктивностью/специфичностью для 7-DHC и/или с меньшим накоплением побочных/промежуточных продуктов, включая зимостерол, ланостерол и латостерол, в частности, сложных эфиров таких промежуточных продуктов, которые хранятся в липидных тельцах.Thus, an urgent need is to engineer yeast host cells capable of producing sterols with high productivity/specificity for 7-DHC and/or with less accumulation of by-products/intermediates, including zymosterol, lanosterol and lathosterol, in particular esters of such intermediates , which are stored in lipid bodies.
Неожиданно мы обнаружили, что продуктивность по 7-DHC в клетках хозяина, в частности, соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу, можно сместить в сторону 7-DHC посредством модификации активности С-8-стеролизомеразы в клетках хозяина, т.е. экспрессии гетерологичных ферментов, обладающих активностью С-8-стеролизомеразы, что приведет к повышению продуктивности клеток хозяина в сторону 7-DHC как важного промежуточного продукта при получении витамина D3.Surprisingly, we discovered that 7-DHC productivity in host cells, in particular the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol, can be shifted towards 7-DHC by modifying C-8 sterolysomerase activity in host cells, i.e. . expression of heterologous enzymes with C-8-sterolysomerase activity, which will lead to an increase in the productivity of host cells towards 7-DHC as an important intermediate in the production of vitamin D3.
Итак, настоящее изобретение направлено на применение ферментов, обладающих активностью С-8стеролизомеразы, в способе получения 7-DHC, причем такие полипептиды по меньшей мере на 41%, както, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичны SEQ ID NO: 6, и экспрессируются (гетерологически) в подходящих клетках хозяина для получения 7-DHC, причем соотношение 7-DHC к побочным продуктам, включая холеста-8-енол, повышается по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированными клетками хозяина.Thus, the present invention is directed to the use of enzymes having C-8 sterolysomerase activity in a process for producing 7-DHC, such polypeptides being at least 41%, such as, for example, at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 and up to 100% identical to SEQ ID NO: 6, and are expressed (heterologously) in suitable host cells to produce 7-DHC, the ratio of 7-DHC to by-products , including cholesta-8-enol, increases at least 2-fold compared to unmodified host cells.
Полипептид по SEQ ID NO: 6, проявляющий активность С-8-стеролизомеразы, который может кодироваться полинуклеотидом по SEQ ID NO: 2, был выделен из Ustilago maydis.The polypeptide of SEQ ID NO: 6 exhibiting C-8 sterolysomerase activity, which can be encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 2, was isolated from Ustilago maydis.
Термины С-8-стеролизомераза, дельта-8,7-изомераза, фермент, обладающий активностью С-8стеролизомеразы, изомераза или гомолог ERG2 применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к ферментам, которые способны катализировать превращение холеста-8-енола в холеста-7-енол и/или зимостерола в холеста-7,24-диенол. Определенные здесь ферменты являются гомологами ERG2 Saccharomyces cerevisiae (полипептидная последовательность происходит из UniProtKB - Р32352) по SEQ ID NO: 5, которая может кодироваться полинуклеотидом по SEQ ID NO: 1.The terms C-8 sterol isomerase, delta 8,7 isomerase, enzyme having C 8 sterol isomerase activity, isomerase, or ERG2 homologue are used interchangeably herein and refer to enzymes that are capable of catalyzing the conversion of cholesta-8-enol to cholesta-7-enol and/or zymosterol to cholesta-7,24-dienol. The enzymes defined herein are homologs of Saccharomyces cerevisiae ERG2 (polypeptide sequence derived from UniProtKB P32352) of SEQ ID NO: 5, which may be encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.
Термины превращение, ферментативное превращение или изомеризация в связи с ферментативным катализом, например, холеста-8-енола в холеста-7-енол (латостерол) и/или зимостерола в холеста-7,24-диенол применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к действию С-8-стеролизомеразы, как определено здесь и известно в данной области.The terms conversion, enzymatic conversion or isomerization in connection with enzymatic catalysis of, for example, cholesta-8-enol to cholesta-7-enol (latosterol) and/or zymosterol to cholesta-7,24-dienol are used interchangeably herein and refer to the action of C- 8-sterolysomerases, as defined here and known in the art.
Изомераза может применяться в выделенном виде (например, в бесклеточной системе) или может быть введенной и экспрессироваться в виде гетерологичного фермента или дополнительных копий эндогенных ферментов в подходящих клетках хозяина. Таким образом, подходящие клетки хозяина экспрессируют одну, две или несколько копий ферментов изомеразы, как определено здесь, что ведет к повышению выхода 7-DHC и/или улучшению доли 7-DHC по сравнению с холеста-8-енолом, причем такие клетThe isomerase can be used in isolated form (eg, in a cell-free system) or can be introduced and expressed as a heterologous enzyme or additional copies of endogenous enzymes in suitable host cells. Thus, suitable host cells express one, two, or more copies of the isomerase enzymes as defined herein, leading to increased 7-DHC yield and/or improved 7-DHC fraction relative to cholesta-8-enol, such cells
- 1 045880 ки хозяина именуются здесь генетически модифицированными клетками хозяина. Генетически немодифицированными или немодифицированными клетками хозяина именуются здесь соответствующие клетки хозяина, несущие только эндогенную активность С-8-стеролизомеразы, экспрессируемой эндогенным геном ERG2.- 1045880 host cells are referred to herein as genetically modified host cells. Genetically unmodified or unmodified host cells are referred to herein as corresponding host cells bearing only the endogenous C-8 sterolysomerase activity expressed by the endogenous ERG2 gene.
В настоящем изобретении термины зимостерол, ланостерол, латостерол, холеста-5,8,24(25)триенол, холеста-5,7,24(25)-триенол или 7-DHC, определяющие промежуточные соединения витамина D3, включают как свободные формы, так и формы сложных эфиров данных соединений. При этом смесь стеролов содержит 7-DHC и побочные или промежуточные продукты, включая, без ограничения, зимостерол, ланостерол, латостерол, холеста-5,8,24(25)-триенол или холеста-5,7,24(25)-триенол.In the present invention, the terms zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,8,24(25)trienol, cholesta-5,7,24(25)-trienol, or 7-DHC, defining vitamin D3 intermediates, are included as free forms, and ester forms of these compounds. In this case, the mixture of sterols contains 7-DHC and by-products or intermediate products, including, without limitation, zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,8,24(25)-trienol or cholesta-5,7,24(25)-trienol .
В настоящем изобретении дрожжи, вырабатывающие холестерин, больше не могут вырабатывать эргостерол, а вырабатывают продукты холестерина, включая, без ограничения, холеста-5,7,24(25)триенол, холеста-5,8,24(25)триенол, холеста-7,24(25)-диенол, 7-DHC или зимостерол. В частности, этого можно добиться за счет введения двойного нокаута erg5erg6.In the present invention, the cholesterol-producing yeast can no longer produce ergosterol, but produces cholesterol products, including, but not limited to, cholesta-5,7,24(25)trienol, cholesta-5,8,24(25)trienol, cholesta- 7,24(25)-dienol, 7-DHC or zymosterol. In particular, this can be achieved by introducing a double knockout of erg5erg6.
Подходящие изомеразы, как определено здесь, могут быть получены из разных источников, таких, например, как растения, животные, включая людей, водоросли, грибы, включая дрожжи, или бактерии, предпочтительно из грибов, в особенности выбранных из группы, состоящей из Saccharomyces, Yarrowia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Candida, Penicillium, Aspergillus, Cryptococcus, Magneporte, Metarhizium и Ustilago, более предпочтительно из S. cerevisiae, Y. lipolytica, K. lactis, Schizosaccharomyces pombe, P. pastoris, C. albicans, P. roqueforti, A. nidulans, C. neoformans, Magneporte oryzae, Metarhizium acridum или U. maydis, наиболее предпочтительно из U. maydis.Suitable isomerases, as defined herein, can be obtained from various sources, such as, for example, plants, animals, including humans, algae, fungi, including yeast, or bacteria, preferably from fungi, especially selected from the group consisting of Saccharomyces, Yarrowia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Candida, Penicillium, Aspergillus, Cryptococcus, Magneporte, Metarhizium and Ustilago, more preferably from S. cerevisiae, Y. lipolytica, K. lactis, Schizosaccharomyces pombe, P. pastoris, C. albicans, P. roqueforti, A. nidulans, C. neoformans, Magneporte oryzae, Metarhizium acridum or U. maydis, most preferably U. maydis.
В предпочтительном воплощении фермент, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы, получают из Ustilago, в частности Ustilago maydis, например, типа белка, кодируемого полинуклеотидом по SEQ ID NO: 2, более предпочтительно таким белком является полипептид по SEQ ID NO: 6 (полипептидная последовательность из UniProtKB-P32360).In a preferred embodiment, the enzyme having C-8 sterolysomerase activity is obtained from Ustilago, in particular Ustilago maydis, for example, the type of protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 2, more preferably such protein is the polypeptide of SEQ ID NO: 6 (polypeptide sequence from UniProtKB-P32360).
В другом воплощении фермент, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы, получают из Candida, в частности Candida albicans, например, типа белка, кодируемого полинуклеотидом по SEQ ID NO: 3, более предпочтительно таким белком является полипептид по SEQ ID NO: 7 (полипептидная последовательность из UniProtKB -C4YFH6).In another embodiment, the enzyme having C-8 sterolysomerase activity is obtained from Candida, in particular Candida albicans, for example, the type of protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 3, more preferably such protein is the polypeptide of SEQ ID NO: 7 (polypeptide sequence from UniProtKB -C4YFH6).
В следующем воплощении фермент, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы, получают из Schizosaccharomyces, в частности Schizosaccharomyces pombe, например, типа белка, кодируемого полинуклеотидом по SEQ ID NO: 4, более предпочтительно таким белком является полипептид по SEQ ID NO: 8 (полипептидная последовательность из UniProtKB - P87113).In a further embodiment, the enzyme having C-8 sterolysomerase activity is obtained from Schizosaccharomyces, in particular Schizosaccharomyces pombe, for example, the type of protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 4, more preferably such protein is the polypeptide of SEQ ID NO: 8 (polypeptide sequence from UniProtKB - P87113).
В другом воплощении фермент, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы, получают из Saccharomyces, в частности Saccharomyces cerevisiae, например, типа белка, кодируемого полинуклеотидом по SEQ ID NO: 1, более предпочтительно таким белком является полипептид по SEQ ID NO: 5 (полипептидная последовательность из UniProtKB - Р32352), причем такой фермент экспрессируется дополнительно и/или в качестве замены эндогенной ERG2 при использовании S. cerevisiae в качестве хозяина.In another embodiment, the enzyme having C-8 sterolysomerase activity is obtained from Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae, for example, the type of protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, more preferably such protein is the polypeptide of SEQ ID NO: 5 (polypeptide sequence from UniProtKB - P32352), and such an enzyme is expressed additionally and/or as a replacement for endogenous ERG2 when using S. cerevisiae as a host.
Дальнейшие воплощения включают способ получения 7-DHC в подходящих клетках хозяина, например, в дрожжевых клетках, в особенности вырабатывающих холестерин дрожжевых клетках, причем гомолог ERG2 из Y. lipolytica (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - Q6CEA6 или Q6C3U4), K. lactis (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - Q6CL22), P. pastoris (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - F2QZY6 или C4R749), Р. roqueforti (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - W6PX20), А. nidulans (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - C8VT80), С. neoformans (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - J9VMS8), Magnaporthe oryzae (например, полипептидная последовательность из UniProtKB -Р33281) или Metarhizium acridum (например, полипептидная последовательность из UniProtKB - E9EHP6) экспрессируется в подходящих вырабатывающих холестерин дрожжевых клетках в подходящих условиях, как описано здесь.Further embodiments include a method of producing 7-DHC in suitable host cells, for example, yeast cells, especially cholesterol-producing yeast cells, wherein the ERG2 homologue from Y. lipolytica (for example, the polypeptide sequence from UniProtKB - Q6CEA6 or Q6C3U4), K. lactis ( for example, polypeptide sequence from UniProtKB - Q6CL22), P. pastoris (for example, polypeptide sequence from UniProtKB - F2QZY6 or C4R749), P. roqueforti (for example, polypeptide sequence from UniProtKB - W6PX20), A. nidulans (for example, polypeptide sequence from UniProtKB - C8VT80), C. neoformans (e.g. polypeptide sequence from UniProtKB - J9VMS8), Magnaporthe oryzae (e.g. polypeptide sequence from UniProtKB - P33281) or Metarhizium acridum (e.g. polypeptide sequence from UniProtKB - E9EHP6) is expressed in suitable cholesterol-producing yeast cells under suitable conditions as described here.
Исходя из приведенных здесь последовательностей и из улучшения накопления 7-DHC и/или снижения холеста-8-енола в смеси стеролов, т.е. получения по меньшей мере 80%, как-то 85, 90, 95, 98 или даже 100% 7-DHC в смеси стеролов, можно легко вывести дополнительные подходящие гены, кодирующие полипептиды, обладающие активностью С-8-стеролизомеразы, как определено здесь, которые могут применяться для С-8-изомеризации стеролов, как определено здесь, в частности, зимостерола и холеста8-енола. Так, настоящее изобретение направлено на способ идентификации новых изомераз, в котором в качестве зонда в процессе скрининга новых С-8-стеролизомераз используется полипептид, который по меньшей мере на 43%, как-то, например, по меньшей мере на 47, 50, 56, 60, 70, 75, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен ERG2 Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 5), с предпочтением на продукцию 7-DHC перед холеста-8-енолом, получая по меньшей мере 80% 7-DHC в смеси стеролов, вырабатываемых подходящим штаммом хозяина. Для получения 7-DHC может использоваться любой полипептид, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы и описанный здесь, если только изомеризация дает по меньшей мере 80% 7-DHC в смеси стеролов, исходя из общего количества вырабатываемых стеролов, и/или повышение соотношения 7-DHC к холеста-8-енолу.Based on the sequences given here and from the improvement in 7-DHC accumulation and/or reduction in cholesta-8-enol in the sterol mixture, i.e. by obtaining at least 80%, such as 85, 90, 95, 98 or even 100% 7-DHC in a mixture of sterols, additional suitable genes encoding polypeptides having C-8 sterolysomerase activity as defined herein can be easily derived. which can be used for the C-8 isomerization of sterols as defined herein, in particular zymosterol and cholesta8-enol. Thus, the present invention is directed to a method for identifying new isomerases, in which a polypeptide that is at least 43%, such as, for example, at least 47, 50, is used as a probe in the process of screening for new C-8 sterol isomerases. 56, 60, 70, 75, 80, 90, 92, 95, 98 and up to 100% identical to ERG2 of Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 5), with a preference for the production of 7-DHC over cholesta-8-enol, obtaining at least 80% 7-DHC in a mixture of sterols produced by a suitable host strain. Any polypeptide having C-8 sterol isomerase activity described herein can be used to produce 7-DHC, as long as the isomerization produces at least 80% 7-DHC in the sterol mixture, based on the total amount of sterols produced, and/or increasing the ratio 7 -DHC to cholesta-8-enol.
- 2 045880- 2 045880
Настоящее изобретение, в частности, направлено на применение таких новых ферментов-изомераз, в особенности гетерологичных ферментов, в способе получения 7-DHC, причем под действием таких изомераз, как определено здесь, содержание побочных продуктов в смеси стеролов, включая холеста-8енол, зимостерол, латостерол и ланостерол, снижается до 20% и менее, как-то до 15, 10, 5, 3% и менее в пересчете на общее количество стеролов, при этом предпочтительно снижается содержание холеста-8енола относительно содержания 7-DHC. Способ может выполняться с подходящими вырабатывающими холестерин дрожжевыми клетками, экспрессирующими такие гетерологичные изомеразы, при этом предпочтительно гены, кодирующие данные ферменты, экспрессируются гетерологически, т.е. вводятся в данные клетки хозяина. Далее 7-DHC может превращаться в витамин D3 под действием (известных) подходящих химических или биотехнологических механизмов.The present invention is particularly directed to the use of such novel isomerase enzymes, especially heterologous enzymes, in a process for the production of 7-DHC, whereby such isomerases, as defined herein, contribute to the by-product content of a mixture of sterols, including cholesta-8enol, zymosterol , lathosterol and lanosterol, is reduced to 20% or less, such as 15, 10, 5, 3% or less, based on total sterols, preferably reducing the content of cholesta-8enol relative to the content of 7-DHC. The method can be performed with suitable cholesterol-producing yeast cells expressing such heterologous isomerases, preferably the genes encoding these enzymes are expressed heterologously, i.e. are introduced into these host cells. 7-DHC can then be converted to vitamin D3 by (known) suitable chemical or biotechnological mechanisms.
Термины идентичность последовательностей, % идентичности применяются здесь взаимозаменяемо. В целях настоящего изобретения устанавливается, что для определения степени идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот эти последовательности совмещают с целью оптимального сравнения. Для оптимального совмещения двух последовательностей можно вводить пробелы в любые из двух сравниваемых последовательностей. Такое совмещение может проводиться по всей длине сравниваемых последовательностей. С другой стороны, совмещение может проводиться и по меньшей длине, к примеру, по 20, по 50, по 100 и более оснований/нуклеотидов или аминокислот. Идентичность последовательностей составляет процент идентичных совпадений между двумя последовательностями по приведенному совмещенному участку. Степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить по алгоритму Needleman-Wunsch для совмещения двух последовательностей (Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). По этому алгоритму можно совмещать и аминокислотные последовательности, и нуклеотидные последовательности. Алгоритм Needleman-Wunsch встроен в компьютерную программу NEEDLE. В настоящем изобретении использовалась программа NEEDLE из пакета EMBOSS (версия 2.8.0 или выше, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16(6), pp. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Для белковых последовательностей в качестве матрицы замен используется EBLOSUM62. Для нуклеотидных последовательностей используется EDNAFULL. Оптимальные параметры - пеня за открытый пробел = 10 и пеня за расширение пробела = 0,5. Квалифицированным специалистам должно быть понятно, что все эти различные параметры будут давать несколько разные результаты, но общая степень идентичности двух последовательностей существенно не изменится при использовании разных алгоритмов.The terms sequence identity, % identity are used interchangeably here. For the purposes of the present invention, it is stated that in order to determine the degree of identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, these sequences are combined for the purpose of optimal comparison. To optimally match two sequences, you can introduce spaces in any of the two sequences being compared. Such a combination can be carried out along the entire length of the sequences being compared. On the other hand, the combination can be carried out over a shorter length, for example, 20, 50, 100 or more bases/nucleotides or amino acids. Sequence identity is the percentage of identical matches between two sequences over a given matched region. The degree of sequence identity between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences can be determined by the Needleman-Wunsch algorithm for aligning two sequences (Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Using this algorithm, both amino acid sequences and nucleotide sequences can be combined. The Needleman-Wunsch algorithm is built into the NEEDLE computer program. The present invention used the NEEDLE program from the EMBOSS package (version 2.8.0 or higher, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16(6), pp. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). For protein sequences, EBLOSUM62 is used as the substitution matrix. For nucleotide sequences, EDNAFULL is used. The optimal parameters are penalty for open space = 10 and penalty for expanding space = 0.5. It will be appreciated by those skilled in the art that each of these different parameters will produce slightly different results, but the overall degree of identity between the two sequences will not change significantly when different algorithms are used.
После совмещения при помощи программы NEEDLE, как описано выше, рассчитывается степень идентичности между запрашиваемой последовательностью и последовательностью по изобретению следующим образом: количество соответствующих положений при совмещении, проявляющих идентичные аминокислоты либо идентичные нуклеотиды в обеих последовательностях, делится на общую длину совмещения за вычетом общего количества пробелов в совмещении. Идентичность, как определено здесь, можно получить из NEEDLE при помощи опции NOBRIEF, она отмечена на выходе программы как идентичность по наибольшей длине. Если обе сравниваемые аминокислотные последовательности не отличаются ни по одной аминокислоте, то они одинаковы или идентичны на 100%. Что касается ферментов, происходящих из растений, как определено здесь, то специалистам должно быть известно, что ферменты растительного происхождения могут содержать наводящий сигнал хлоропластов, который отщепляется определенными ферментами, такими, например, как ферменты процессинга хлоропластов (СРЕ).After alignment using the NEEDLE program as described above, the degree of identity between the query sequence and the sequence of the invention is calculated as follows: the number of matching positions in the alignment exhibiting identical amino acids or identical nucleotides in both sequences is divided by the total length of the alignment minus the total number of gaps in combination. The identity as defined here can be obtained from NEEDLE using the NOBRIEF option and is marked in the program output as the longest identity. If both amino acid sequences being compared do not differ in any amino acid, then they are the same or 100% identical. With respect to plant-derived enzymes as defined herein, those skilled in the art will be aware that plant-derived enzymes may contain a chloroplast guidance signal that is cleaved off by certain enzymes, such as chloroplast processing enzymes (CPEs).
Ферменты/гомологи ERG2, как определено здесь, также охватывают ферменты, несущие аминокислотные замены, которые не изменяют активность фермента, т.е. проявляют такие же свойства, как и ферменты дикого типа и катализируют С-8-изомеризацию стеролов, давая содержание 7-DHC не менее 80% (со снижением холеста-8-енола относительно 7-DHC) в смеси стеролов. Такие мутации также называют молчащими мутациями, так как они не изменяют (ферментативную) активность ферментов, как описано здесь.ERG2 enzymes/homologs, as defined here, also encompass enzymes bearing amino acid substitutions that do not alter enzyme activity, i.e. exhibit the same properties as wild-type enzymes and catalyze the C-8 isomerization of sterols, giving a 7-DHC content of at least 80% (with a decrease in cholesta-8-enol relative to 7-DHC) in the sterol mixture. Such mutations are also called silent mutations since they do not change the (enzymatic) activity of the enzymes as described here.
В зависимости от клеток хозяина полинуклеотиды, как определено здесь, участвующие в С-8изомеризации стеролов, могут подвергаться оптимизации для экспрессии в соответствующих клетках хозяина. Специалистам известно, как получить такие модифицированные полинуклеотиды. Подразумевается, что полинуклеотиды, как определено здесь, охватывают и такие оптимизированные для хозяина молекулы нуклеиновых кислот, если только они экспрессируют полипептиды с соответствующей активностью, как определено здесь. Примеры таких оптимизированных для хозяина гомологов ERG2 представлены, например, в SEQ ID NO: 9, 10 и 11.Depending on the host cells, polynucleotides, as defined herein, involved in C-8 isomerization of sterols may be optimized for expression in the appropriate host cells. Those skilled in the art know how to prepare such modified polynucleotides. Polynucleotides as defined herein are intended to include such host-optimized nucleic acid molecules as long as they express polypeptides with the appropriate activity as defined herein. Examples of such host-optimized ERG2 homologs are provided, for example, in SEQ ID NOs: 9, 10 and 11.
Так, в одном воплощении настоящее изобретение направлено на клетки хозяина, содержащие полинуклеотиды, кодирующие (гетерологичные) гомологи ERG2, как определено здесь, которые оптимизированы для экспрессии в данных клетках хозяина, не оказывая влияния на рост или профиль экспрессии клеток хозяина или ферментов. В частности, дрожжи, например, дрожжевые клетки, вырабатывающие холестерин, выбирают из Saccharomyces, как-то, например, Saccharomyces cerevisiae, причем одну, две или несколько копий полинуклеотидов, кодирующих ферменты ERG2, как определено здесь, выбираютThus, in one embodiment, the present invention is directed to host cells containing polynucleotides encoding (heterologous) homologs of ERG2, as defined herein, that are optimized for expression in the host cells without affecting the growth or expression profile of the host cells or enzymes. In particular, the yeast, such as cholesterol producing yeast cells, is selected from Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, wherein one, two or more copies of polynucleotides encoding ERG2 enzymes, as defined herein, are selected
- 3 045880 из полинуклеотидов, по меньшей мере на 52%, как-то, например, на 54, 60, 70, 80, 85, 90, 92, 97 и вплоть до 100% идентичных SEQ ID NO: 9, включая полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8.- 3 045 880 of polynucleotides, at least 52%, such as 54, 60, 70, 80, 85, 90, 92, 97 and up to 100% identical to SEQ ID NO: 9, including polynucleotides, encoding polypeptides according to SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, предусмотренной настоящим изобретением, такой, например, как последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10 или 11, к примеру, фрагмент, который можно использовать в качестве зонда или праймера либо фрагмент, кодирующий часть гомолога ERG2, как определено здесь. Зонд/праймер обычно содержит практически очищенные олигонуклеотиды, которые обычно содержат участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется, предпочтительно в очень строгих условиях, по меньшей мере примерно с 12 или 15, предпочтительно примерно с 18 или 20, более предпочтительно примерно с 22 или 25, еще более предпочтительно примерно с 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 и более последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности по SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10 или 11 либо их фрагментов или производных.The nucleic acid molecules of the invention may contain only a portion or fragment of a nucleic acid sequence provided by the present invention, such as the sequences set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10 or 11, for example, a fragment , which can be used as a probe or primer, or a fragment encoding part of the ERG2 homolog as defined here. The probe/primer typically contains substantially purified oligonucleotides, which typically contain a region of nucleotide sequence that hybridizes, preferably under very stringent conditions, to at least about 12 or 15, preferably about 18 or 20, more preferably about 22 or 25, more more preferably, about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, or 75 or more contiguous nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, or 11, or fragments or derivatives thereof .
Предпочтительным неограничительным примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6-кратном хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при 45°С с последующей одной или несколькими промывками в 1-кратном SSC с 0,1% SDS при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С.A preferred non-limiting example of such hybridization conditions is hybridization in 6x sodium chloride/sodium citrate (SSC) at 45°C followed by one or more washes in 1x SSC with 0.1% SDS at 50°C, preferably at 55°C C, more preferably at 60°C and even more preferably at 65°C.
Очень строгие условия включают, к примеру, инкубацию от 2 ч до 4 дней при 42°С с использованием ДНК-зонда, меченного дигоксигенином (DIG) (полученного с использованием системы мечения DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Германия), в растворе типа DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) со 100 мкг/мл ДНК спермы лосося или без неё, либо в растворе, содержащем 50% формамида, 5xSSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 0,02% додецилсульфата натрия, 0,1% Nлауроилсаркозина и 2% блокирующего реагента (Roche Diagnostics GmbH), с последующей промывкой фильтров дважды от 5 до 15 мин в 2xSSC и 0,1% SDS при комнатной температуре, а затем промывкой дважды от 15 до 30 мин в 0,5xSSC и 0,1% SDS или 0,1xSSC и 0,1% SDS при 65-68°С.Very stringent conditions include, for example, incubation for 2 hours to 4 days at 42°C using a digoxigenin (DIG)-labeled DNA probe (prepared using the DIG labeling system; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Germany) in solution type DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) with or without 100 µg/ml salmon sperm DNA, or in a solution containing 50% formamide, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 0.02% sodium dodecyl sulfate, 0.1% Nlauroylsarcosine and 2% blocking reagent (Roche Diagnostics GmbH), followed by washing the filters twice for 5 to 15 min in 2xSSC and 0.1% SDS at room temperature, and then washing twice for 15 to 30 min in 0.5xSSC and 0. 1% SDS or 0.1xSSC and 0.1% SDS at 65-68°C.
Настоящее изобретение, в частности, направлено на применение гетерологичных ферментов, обладающих активностью С-8-стеролизомеразы, как определено здесь, в способе получения 7-DHC, промежуточного соединения для витамина D3. Предпочтительно модифицированные ферменты по настоящему изобретению вводятся и/или экспрессируются в подходящих клетках хозяина типа дрожжевых, в частности, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, как-то выбранных из Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. или Yarrowia lipolytica, предпочтительно S. cerevisiae. Модифицированный хозяин используется для получения 7-DHC, который далее может быть преобразован в витамин D3 и/или 25-гидроксивитамин D3.The present invention is particularly directed to the use of heterologous enzymes having C-8 sterolysomerase activity as defined herein in a process for the production of 7-DHC, a vitamin D3 intermediate. Preferably, the modified enzymes of the present invention are introduced and/or expressed in suitable yeast host cells, in particular cholesterol producing yeast cells, such as those selected from Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. . or Yarrowia lipolytica, preferably S. cerevisiae. The modified host is used to produce 7-DHC, which can then be converted to vitamin D3 and/or 25-hydroxyvitamin D3.
Подходящие клетки хозяина могут подвергаться дополнительной модификации для дальнейшего повышения продукции 7-DHC, важного промежуточного продукта при биосинтезе витамина D3, и/или для снижения накопления побочных продуктов.Suitable host cells can be further modified to further increase the production of 7-DHC, an important intermediate in vitamin D3 biosynthesis, and/or to reduce the accumulation of byproducts.
Так, в одном воплощении изобретение направлено на штаммы дрожжей с модифицированной активностью С-8, в которых также инактивированы ERG5 и ERG6. Дрожжевые клетки могут подвергаться дополнительной модификации посредством экспрессии гетерологичного фермента, обладающего активностью С24-редуктазы, в особенности из числа ЕС 1.3.1.72, типа гетерологичной С24-редуктазы, действующей на холеста-7,24-диенол, зимостерол или триенол (например, холеста-5,7,25-триенол), предпочтительно растительной или стерол^24-редуктазы позвоночных, более предпочтительно из позвоночных, еще более предпочтительно из человека, свиньи, собаки, мыши, крысы, лошади, Danio rerio или же любого известного источника, если только она может экспрессироваться в данных дрожжевых клетках. Наиболее предпочтительно стерол^24-редуктаза выбрана из Danio rerio, крысы или человека. Последовательности, экспрессирующие данные ферменты стерол^24-редуктазы, являются общедоступными, включая, без ограничения, ссылки Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 или Р93472 из UniProtKB/Swiss-Prot (например, см. WO 2003/064650).Thus, in one embodiment, the invention is directed to yeast strains with modified C-8 activity in which ERG5 and ERG6 are also inactivated. Yeast cells can be further modified by the expression of a heterologous enzyme having C24 reductase activity, especially EC 1.3.1.72, a type of heterologous C24 reductase acting on cholesta-7,24-dienol, zymosterol or trienol (e.g. cholesta-7,24-dienol, zymosterol or trienol) 5,7,25-trienol), preferably plant or vertebrate sterol^24-reductase, more preferably from vertebrates, even more preferably from human, pig, dog, mouse, rat, horse, Danio rerio or any known source, unless it can be expressed in these yeast cells. Most preferably, the sterol^24 reductase is selected from Danio rerio, rat or human. Expression sequences for these sterol 24 reductase enzymes are publicly available, including, without limitation, references Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085, or P93472 from UniProtKB/Swiss-Prot (eg, see WO 2003/064650).
В другом воплощении клетки хозяина по настоящему изобретению могут подвергаться дальнейшей модификации посредством введения гомологов эндогенных ферментов, участвующих в биосинтезе 7DHC, таких, например, как С5-стеролдесатураза (ERG3), что ведет к повышению специфичности и/или продуктивности по 7-DHC со снижением накопления побочных продуктов или промежуточных соединений витамина D3, в том числе, без ограничения, зимостерола, ланостерола и/или латостерола. Предпочтительно модифицированные клетки хозяина, как определено здесь, содержат гетерологичную ERG3, причем ERG3 предпочтительно выбрана из Pichia pastoris (последовательность из UniProtKB - C4QY87) или Schizosaccharomyces pombe (последовательность из UniProtKB - 094457).In another embodiment, host cells of the present invention may be further modified by introducing homologues of endogenous enzymes involved in 7DHC biosynthesis, such as C5-sterol desaturase (ERG3), leading to increased 7-DHC specificity and/or productivity with decreased accumulation of vitamin D3 by-products or intermediates, including, without limitation, zymosterol, lanosterol and/or lathosterol. Preferably, the modified host cells as defined herein contain heterologous ERG3, with ERG3 preferably selected from Pichia pastoris (sequence from UniProtKB - C4QY87) or Schizosaccharomyces pombe (sequence from UniProtKB - 094457).
В следующем воплощении клетки хозяина по настоящему изобретению могут подвергаться дополнительной модификации по активности стерол-ацилтрансферазы, в частности, по активности изоформы стерол-ацилтрансферазы Are1p и/или Are2p, в особенности Are1p, содержащей одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих остаткам, выбранным из 592 и/или 595 в полипептиде по SEQ ID NO: 12.In a further embodiment, the host cells of the present invention may be further modified in sterol acyltransferase activity, in particular the activity of the sterol acyltransferase isoform Are1p and/or Are2p, in particular Are1p, containing one or more amino acid substitutions at positions corresponding to residues selected of 592 and/or 595 in the polypeptide of SEQ ID NO: 12.
- 4 045880- 4 045880
В одном конкретном воплощении изобретение касается способа улучшения клеток хозяина в отношении продукции 7-DHC, причем клетки хозяина модифицированы, как определено здесь, т.е. экспрессируется гомолог ERG2, как определено здесь, например, путем введения одной, двух или нескольких копий ферментов изомеразы, как определено здесь, в частности, в дрожжевые клетки, вырабатывающие холестерин, предпочтительно в такие дрожжевые клетки, у которых инактивированы ERG5 и ERG6, и при этом необязательно экспрессируется гетерологичный фермент, обладающий активностью С-24редуктазы, как определено здесь, и/или модифицированы ARE1 и/или ARE1, как описано здесь, и/или необязательно экспрессируются гомологи ERG3, причем клетки хозяина улучшаются таким образом, что доля 7-DHC в общем количестве стеролов, вырабатываемых данными клетками хозяина, повышается по меньшей мере до 80%, в частности, при этом соотношение 7-DHC к побочным продуктам, включая холеста-8-енол, повышается по меньшей мере в 1,1 раза по сравнению с немодифицированным штаммом дрожжей, как определено здесь, т.е. экспрессирующим только фермент ERG2 дикого типа (эндогенный).In one specific embodiment, the invention relates to a method for improving host cells to produce 7-DHC, wherein the host cells are modified as defined herein, i.e. expresses a homolog of ERG2 as defined herein, for example, by introducing one, two or more copies of the isomerase enzymes as defined herein, in particular, into cholesterol producing yeast cells, preferably into those yeast cells in which ERG5 and ERG6 are inactivated, and when this optionally expresses a heterologous enzyme having C-24 reductase activity as defined herein, and/or is modified by ARE1 and/or ARE1 as described herein, and/or optionally expresses ERG3 homologues, wherein the host cells are improved such that the proportion of 7-DHC in the total amount of sterols produced by these host cells increases to at least 80%, in particular, the ratio of 7-DHC to byproducts, including cholesta-8-enol, increases by at least 1.1 times compared with an unmodified yeast strain as defined here, i.e. expressing only the wild-type (endogenous) ERG2 enzyme.
В одном конкретном воплощении изобретение касается способа улучшения дрожжевых клеток в отношении продукции 7-DHC, в частности, дрожжевых клеток, вырабатывающих холестерин, типа дрожжевых клеток, у которых инактивированы ERG5 и ERG6 и необязательно экспрессируется гетерологичный фермент, обладающий активностью С-24-редуктазы, как определено здесь, причем данные дрожжевые клетки экспрессируют гомолог ERG2, как определено здесь, например, посредством введения одной, двух или нескольких копий фермента десатуразы, как определено здесь, причем дрожжевые клетки улучшаются таким образом, что доля 7-DHC в общем количестве стеролов, вырабатываемых данными клетками, повышается по меньшей мере до 80%, как-то, например, до 85, 90, 92, 95, 97 и даже 100%, а содержание побочных продуктов в смеси стеролов, включая холеста-7-енол, латостерол и/или холеста-8-енол и/или зимостерол, снижается до 20% и менее от общего количества стеролов, т.е. уменьшение холеста-7-енола, латостерола и/или холеста-8-енола и/или зимостерола составляет по меньшей мере 20% от общего количества стеролов по сравнению с немодифицированным штаммом дрожжей, экспрессирующим только фермент ERG2 дикого типа (эндогенный).In one specific embodiment, the invention relates to a method for improving the production of 7-DHC in yeast cells, in particular cholesterol producing yeast cells, a type of yeast cell in which ERG5 and ERG6 are inactivated and optionally expresses a heterologous enzyme having C-24 reductase activity, as defined herein, wherein the yeast cells express an ERG2 homolog as defined herein, for example, by introducing one, two or more copies of the desaturase enzyme as defined herein, wherein the yeast cells are improved such that the proportion of 7-DHC to total sterols, produced by these cells increases to at least 80%, such as 85, 90, 92, 95, 97 and even 100%, and the content of by-products in a mixture of sterols, including cholesta-7-enol, lathosterol and /or cholesta-8-enol and/or zymosterol, is reduced to 20% or less of the total amount of sterols, i.e. the reduction of cholesta-7-enol, lathosterol and/or cholesta-8-enol and/or zymosterol is at least 20% of the total sterols compared to an unmodified yeast strain expressing only the wild-type (endogenous) ERG2 enzyme.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC и холеста-8-енол, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, причем соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу в смеси стеролов повышается по меньшей мере в 2,4 раза, как-то, например, в 2,5, 2,8, 4, 4,5, 5 раз, а данные вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки экспрессируют гетерологичную изомеразу, как определено здесь, т.е. полипептид, который по меньшей мере на 41%, как-то, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 2, который более предпочтительно экспрессируется соответствующими оптимизированными по кодонам полинуклеотидами, как определено здесь, а предпочтительно происходит из Ustilago maydis, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe или Saccharomyces cerevisiae, более предпочтительно из Ustilago maydis или Saccharomyces cerevisiae.In one aspect, the present invention is directed to a method of producing a sterol mixture containing 7-DHC and cholesta-8-enol in cholesterol-producing yeast cells, wherein the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol in the sterol mixture is increased by at least 2 ,4 times, such as 2.5, 2.8, 4, 4.5, 5 times, and these cholesterol-producing yeast cells express a heterologous isomerase as defined here, i.e. a polypeptide that is at least 41%, such as at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98, and up to 100% identical to SEQ ID NO: 2, which is more preferably expressed by the corresponding codon optimized polynucleotides as defined herein, and preferably is derived from Ustilago maydis, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe or Saccharomyces cerevisiae, more preferably from Ustilago maydis or Saccharomyces cerevisiae.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC и смесь холеста-7-енола (латостерола) и/или ланостерола, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, причем соотношение 7-DHC к лано/ латостеролу в смеси стеролов повышается по меньшей мере в 1,1 раза, как-то по меньшей мере в 1,3 раза, а данные вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки экспрессируют (гетерологичную) изомеразу, как определено здесь, т.е. полипептид, который по меньшей мере на 41%, как-то, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 6, который более предпочтительно экспрессируется соответствующими оптимизированными по кодонам полинуклеотидами, как определено здесь, а предпочтительно происходит из Ustilago maydis или Schizosaccharomyces pombe, предпочтительно из Ustilago maydis.In one aspect, the present invention is directed to a method for producing a sterol mixture containing 7-DHC and a mixture of cholesta-7-enol (latosterol) and/or lanosterol in cholesterol-producing yeast cells, wherein the ratio of 7-DHC to lano/latosterol in the sterol mixture is is increased by at least 1.1-fold, such as at least 1.3-fold, and the cholesterol-producing yeast cells express a (heterologous) isomerase as defined herein, i.e. a polypeptide that is at least 41%, such as at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98, and up to 100% identical to SEQ ID NO: 6, which is more preferably expressed by the corresponding codon optimized polynucleotides as defined herein, and preferably is derived from Ustilago maydis or Schizosaccharomyces pombe, preferably from Ustilago maydis.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC и зимостерол, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, причем соотношение 7-DHC к зимостеролу в смеси стеролов повышается по меньшей мере в 1,2 раза, а данные вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки экспрессируют (гетерологичную) изомеразу, как определено здесь, т.е. полипептид, который по меньшей мере на 41%, как-то, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 6, который более предпочтительно экспрессируется соответствующими оптимизированными по кодонам полинуклеотидами, как определено здесь, а предпочтительно происходит из Ustilago maydis.In another aspect, the present invention is directed to a method of producing a sterol mixture containing 7-DHC and zymosterol in cholesterol-producing yeast cells, wherein the ratio of 7-DHC to zymosterol in the sterol mixture is increased by at least 1.2-fold, and these cholesterol-producing yeast cells express a (heterologous) isomerase as defined here, i.e. a polypeptide that is at least 41%, such as at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98, and up to 100% identical to SEQ ID NO: 6, which is more preferably expressed by the corresponding codon optimized polynucleotides as defined herein, and is preferably derived from Ustilago maydis.
В одном конкретном воплощении настоящее изобретение направлено на способ получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC, зимостерол, холеста-8-енол, лано- или латостерин, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, причем содержание 7-DHC повышается по меньшей мере на 5, 8, 10, 20, 30% от общего количества стеролов по сравнению с зимостеролом, холеста-8-енолом и лано- или латостеролом, а данные вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки экспрессируют гетерологичную изомеразу, как определено здесь, т.е. полипептид, который по меньшей мере на 41%, как-то, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 6, который более предпочтительно экспрессируется соответствующими оптимизированными по кодонам полинуклеотидами, как определено здесь, а предпочтительно происходит из Ustilago maydis.In one specific embodiment, the present invention is directed to a method of producing a sterol mixture containing 7-DHC, zymosterol, cholesta-8-enol, lano- or lathosterol, in cholesterol-producing yeast cells, wherein the 7-DHC content is increased by at least 5. 8, 10, 20, 30% of the total sterols compared to zymosterol, cholesta-8-enol and lano- or lathosterol, and these cholesterol-producing yeast cells express a heterologous isomerase as defined here, i.e. a polypeptide that is at least 41%, such as at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98, and up to 100% identical to SEQ ID NO: 6, which is more preferably expressed by the corresponding codon optimized polynucleotides as defined herein, and is preferably derived from Ustilago maydis.
- 5 045880- 5 045880
В настоящем изобретении повышение содержания 7-DHC в смеси стеролов определяется как количество 7-DHC, вырабатываемое клетками хозяина, экспрессирующими гетерологичный полипептид, обладающий изомеразной активностью, как определено здесь, по сравнению с клетками хозяина, экспрессирующими только эндогенную С-8-стеролизомеразу, такую, например, как ERG2. При использовании таких клеток хозяина, например, дрожжевых, в частности, дрожжевых клеток, вырабатывающих холестерин, в способе получения стеролов содержание 7-DHC может повышаться до 80% и более, как-то до 85, 90, 92, 95, 97 и вплоть до 100% от общего количества стеролов, и вплоть до 4,5 раз по сравнению с содержанием холеста-8-енола в общем количестве стеролов, вырабатываемых данными клетками хозяина. В настоящем изобретении экспрессия гомолога ERG2 включает экспрессию дополнительных копий эндогенных полипептидов ERG2, то есть экспрессию двух или нескольких копий ERG2.In the present invention, the increase in 7-DHC content in a sterol mixture is defined as the amount of 7-DHC produced by host cells expressing a heterologous polypeptide having isomerase activity as defined herein, compared to host cells expressing only endogenous C-8 sterol isomerase, such , for example, as ERG2. When using such host cells, for example yeast, in particular cholesterol-producing yeast cells, in the method for producing sterols, the 7-DHC content can increase to 80% or more, such as 85, 90, 92, 95, 97 and up up to 100% of the total amount of sterols, and up to 4.5 times compared to the content of cholesta-8-enol in the total amount of sterols produced by these host cells. In the present invention, expression of an ERG2 homologue includes expression of additional copies of endogenous ERG2 polypeptides, that is, expression of two or more copies of ERG2.
В одном конкретном воплощении настоящее изобретение направлено на способ получения смеси стеролов, в котором применяются дрожжевые клетки, как описано ранее, причем содержание холеста-8енола и/или зимостерола и/или ланостерола и/или латостерола в данной смеси стеролов снижается, т.е. составляет 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20% и менее от общего количества стеролов, что ведет к повышению доли 7DHC в смеси стеролов.In one specific embodiment, the present invention is directed to a method for producing a sterol mixture using yeast cells as previously described, wherein the content of cholesta-8enol and/or zymosterol and/or lanosterol and/or lathosterol in the given sterol mixture is reduced, i.e. is 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20% or less of the total amount of sterols, which leads to an increase in the proportion of 7DHC in the mixture of sterols.
Модифицированные клетки хозяина, которые способны экспрессировать гомологи ERG2, как определено здесь, а также гены, необходимые для биосинтеза предшественников и/или промежуточных соединений витамина D3, применяются в способе получения 7-DHC, предшественника витамина D3. Модифицированные клетки хозяина можно культивировать в водной среде с добавлением соответствующих питательных веществ, в аэробных или анаэробных условиях, известных специалистам, для соответствующих клеток хозяина, вырабатывающих холестерин. Необязательно такое культивирование проводится в присутствии белков и/или кофакторов, участвующих в переносе электронов, которые известны в данной области. Культивирование/выращивание клеток хозяина может проводиться в периодическом режиме, с подпиткой, в полунепрерывном или непрерывном режиме. В зависимости от клеток хозяина, предпочтительно, получение витамина D3 и его предшественников типа 7-DHC может варьироваться, как это известно специалистам. Культивирование и выделение 7-DHC и других промежуточных продуктов при получении витамина D3 описано, например, в WO 2011/067144 или WO 2017/108799.Modified host cells that are capable of expressing ERG2 homologues as defined herein, as well as genes required for the biosynthesis of vitamin D3 precursors and/or intermediates, are used in a method for producing 7-DHC, a vitamin D3 precursor. The modified host cells can be cultured in an aqueous environment supplemented with appropriate nutrients, under aerobic or anaerobic conditions known to those skilled in the art for the appropriate cholesterol-producing host cells. Optionally, such cultivation is carried out in the presence of proteins and/or cofactors involved in electron transfer, which are known in the art. The culture/growth of host cells can be carried out in batch, fed-batch, semi-continuous or continuous mode. Depending on the host cells, the preferred production of vitamin D3 and its 7-DHC type precursors may vary, as is known in the art. The cultivation and isolation of 7-DHC and other intermediates in the production of vitamin D3 is described, for example, in WO 2011/067144 or WO 2017/108799.
При использовании клеток хозяина, как описано здесь, можно смещать продуктивность/специфичность активности С-8-стеролизомеразы в сторону 7-DHC, получая содержание 7-DHC в общем объеме стеролов, вырабатываемых данными клетками хозяина, по меньшей мере 80%, с титрами 7-DHC вплоть до 12-15 г/л после ферментации около 100 ч в подходящих условиях культивирования.By using host cells as described herein, it is possible to shift the productivity/specificity of C-8 sterolysomerase activity towards 7-DHC, resulting in a 7-DHC content of the total sterols produced by these host cells of at least 80%, with titers of 7 -DHC up to 12-15 g/l after fermentation for about 100 hours under suitable cultivation conditions.
Термины ERG5 и Erg5p или ERG6 и Erg6p применяются здесь взаимозаменяемо и обозначают полипептиды, кодируемые соответствующими генами erg3, erg5 и erg6.The terms ERG5 and Erg5p or ERG6 and Erg6p are used interchangeably herein and refer to the polypeptides encoded by the corresponding erg3, erg5 and erg6 genes.
Гены, кодирующие ERG5, ERG6, ERG2, ERG3, ARE1, ARE2 или стерол-А24-редуктазу (ERG4), культивирование и генная инженерия дрожжевых клеток, которые используются здесь, известны и описаны, например, в US 7608421.The genes encoding ERG5, ERG6, ERG2, ERG3, ARE1, ARE2 or sterol A24 reductase (ERG4), culture and genetic engineering of yeast cells, which are used here, are known and are described, for example, in US 7608421.
В настоящем изобретении термины С-24-редуктаза или А24-редуктаза применяются здесь взаимозаменяемо. У дрожжей этот фермент кодируется erg4 и действует на метильную группу у атома углерода в положении 24. Поэтому триенолы, которые не содержат такой метильной группы в данном положении, не являются приемлемым субстратом для дрожжевой ERG4.In the present invention, the terms C-24 reductase or A24 reductase are used interchangeably herein. In yeast, this enzyme is encoded by erg4 and acts on a methyl group at carbon atom at position 24. Therefore, trienols, which do not contain such a methyl group at this position, are not acceptable substrates for yeast ERG4.
Термины С-5-стеролдесатураза, фермент, обладающий активностью С-5-стеролдесатуразы применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к ферментам, которые способны катализировать превращение холеста-8-енола в холеста-7,24-диенол и/или холеста-7-енола в холеста-5,7,24-триенол и/или 7DHC. У дрожжей этот фермент кодируется erg3. Предпочтительным гомологом ERG3 для применения в модифицированных клетках хозяина по настоящему изобретению является полипептид, который по меньшей мере на 45%, как-то, например, по меньшей мере на 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 14 и проявляет активность С-5-стеролдесатуразы, которая может кодироваться полинуклеотидом по SEQ ID NO: 15, полученным из Pichia pastoris или Schizosaccharomyces pombe. Предпочтительно в модифицированных клетках хозяина экспрессируется 1 или несколько копий типа по меньшей мере 1, 2, 3, 5 данного гомолога ERG3, как определено здесь.The terms C-5-sterol desaturase, enzyme having C-5-sterol desaturase activity are used interchangeably herein and refer to enzymes that are capable of catalyzing the conversion of cholesta-8-enol to cholesta-7,24-dienol and/or cholesta-7-enol to cholesta-5,7,24-trienol and/or 7DHC. In yeast, this enzyme is encoded by erg3. A preferred ERG3 homolog for use in modified host cells of the present invention is a polypeptide that is at least 45%, such as at least 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 and is up to 100% identical to SEQ ID NO: 14 and exhibits C-5-sterol desaturase activity, which may be encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 15 derived from Pichia pastoris or Schizosaccharomyces pombe. Preferably, 1 or more copies of at least type 1, 2, 3, 5 of a given ERG3 homologue as defined herein are expressed in the modified host cells.
В настоящем изобретении термин удельная активность или активность в отношении ферментов означает их каталитическую активность, то есть способность катализировать образование продукта из данного субстрата. Удельная активность определяется количеством потребленного субстрата и/или образовавшегося продукта за определенный период времени на определенное количество белка при определенной температуре. Как правило, удельная активность выражается в мкмолях израсходованного субстрата или образовавшегося продукта за 1 минуту на мг белка. Обычно мкмоль/мин обозначается сокращенно как U (= единица). Поэтому определения единицы удельной активности в мкмоль/мин/мг белка или U/мг белка применяются здесь взаимозаменяемым образом. Фермент активен, если он проявляет свою каталитическую активность in vivo, то есть внутри клеток хозяина, как определено здесь, или в подходящей (бесклеточной) системе в присутствии подходящего субстрата. Специалистам известно, как измеряется активность ферментов, как-то, например, методом HPLC.In the present invention, the term specific activity or activity for enzymes means their catalytic activity, that is, the ability to catalyze the formation of a product from a given substrate. Specific activity is determined by the amount of substrate consumed and/or product formed over a certain period of time for a certain amount of protein at a certain temperature. Typically, specific activity is expressed in µmol of substrate consumed or product formed in 1 minute per mg of protein. Typically, µmol/min is abbreviated as U (= unit). Therefore, the specific activity unit definitions of μmol/min/mg protein or U/mg protein are used interchangeably here. An enzyme is active if it exhibits its catalytic activity in vivo, that is, inside host cells as defined herein, or in a suitable (cell-free) system in the presence of a suitable substrate. Those skilled in the art know how enzyme activity is measured, such as by HPLC.
- 6 045880- 6 045880
В настоящем изобретении подразумевается, что организмы, как-то, например, микроорганизмы, грибы, водоросли или растения также включают синонимы или базонимы таких видов, обладающие такими же физиологическими свойствами, как определено Международным кодексом номенклатуры прокариот или Международным кодексом номенклатуры водорослей, грибов и растений (Мельбурнский кодекс).In the present invention, it is intended that organisms such as microorganisms, fungi, algae or plants also include synonyms or bazoonyms for such species having the same physiological properties as defined by the International Code of Nomenclature of Prokaryotes or the International Code of Nomenclature of Algae, Fungi and Plants (Melbourne Code).
В частности, в настоящем изобретении представлены следующие воплощения.In particular, the present invention provides the following embodiments.
1. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь, содержащие фермент, обладающий активностью С8-стеролизомеразы, причем данные дрожжевые клетки вырабатывают смесь стеролов, содержащую по меньшей мере 80% 7-дегидрохолестерина (7-DHC), предпочтительно содержащую по меньшей мере 82, 85, 88, 90, 92, 95, 97, 98 и вплоть до 100% 7-DHC от общего количества стеролов.1. Cholesterol-producing yeast cells, as defined herein, containing an enzyme having C8-sterolysomerase activity, wherein the yeast cells produce a mixture of sterols containing at least 80% 7-dehydrocholesterol (7-DHC), preferably containing at least 82, 85, 88, 90, 92, 95, 97, 98 and up to 100% 7-DHC of total sterols.
2. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, при этом соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу составляет около 20.2. Cholesterol-producing yeast cells, as defined herein and in claim 1, wherein the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol is about 20.
3. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, при этом соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу повышается по меньшей мере в 2 раза.3. Cholesterol-producing yeast cells as defined herein and in claim 1, wherein the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol is increased by at least 2-fold.
4. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, 2 или 3, экспрессирующие гетерологичный фермент, обладающий активностью С8-стеролизомеразы, который по меньшей мере на 42%, как-то, например, по меньшей мере на 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 75, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен полипептиду по SEQ ID NO: 6.4. Cholesterol-producing yeast cells, as defined herein and according to claim 1, 2 or 3, expressing a heterologous enzyme having C8 sterolysomerase activity that is at least 42%, such as at least 43%, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 75, 80, 90, 92, 95, 98 and up to 100% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 6.
5. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.4, экспрессирующие гетерологичный фермент, обладающий активностью С8-стеролизомеразы, причем данный фермент выбран из группы, состоящей из Saccharomyces типа Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia типа Y. lipolytica, Klyveromyces типа K. lactis, Schizosaccharomyces типа Schizosaccharomyces pombe, Pichia типа Р. pastoris, Candida типа С. albicans, Penicillium типа P. roqueforti, Aspergillus типа A. nidulans, Cryptococcus типа С. neoformans, Magneporte типа Magneporte oryzae, Metarhizium типа Metarhizium acridum и Ustilago типа Ustilago maydis.5. Cholesterol-producing yeast cells as defined herein and in claim 4, expressing a heterologous enzyme having C8 sterolysomerase activity, wherein the enzyme is selected from the group consisting of Saccharomyces type Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia type Y. lipolytica, Klyveromyces type K. lactis, Schizosaccharomyces type Schizosaccharomyces pombe, Pichia type P. pastoris, Candida type C. albicans, Penicillium type P. roqueforti, Aspergillus type A. nidulans, Cryptococcus type C. neoformans, Magneporte type Magneporte oryzae, Metarhizium type Metarhizium acridum and Ustilago type Ustilago maydis.
6. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, 2, 3, 4 или 5, в которых инактивированы ERG5 и ERG6.6. Cholesterol-producing yeast cells, as defined herein and in claim 1, 2, 3, 4 or 5, in which ERG5 and ERG6 are inactivated.
7. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, 2, 3, 4, 5 или 6, при этом дрожжевые клетки экспрессируют гетерологичный фермент из числа ЕС 1.3.1.72, обладающий активностью Δ24-стеролредуктазы, причем предпочтительно гетерологичный фермент происходит из растения или позвоночного, более предпочтительно из человека, свиньи, собаки, мыши, крысы, лошади или Danio rerio.7. Cholesterol-producing yeast cells as defined herein and according to claim 1, 2, 3, 4, 5 or 6, wherein the yeast cells express a heterologous enzyme from EC 1.3.1.72 having Δ24-sterol reductase activity, preferably the heterologous enzyme comes from a plant or vertebrate, more preferably human, pig, dog, mouse, rat, horse or Danio rerio.
8. Вырабатывающие холестерин дрожжевые клетки, как определено здесь и по п.1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, при этом дрожжевые клетки экспрессируют гетерологичный фермент, обладающий активностью С5десатуразы, причем предпочтительно гетерологичный фермент происходит из Pichia pastoris, более предпочтительно из полипептида, который по меньшей мере на 45%, как-то, например, по меньшей мере на 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 и вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 14.8. Cholesterol-producing yeast cells as defined herein and in claim 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, wherein the yeast cells express a heterologous enzyme having C5 desaturase activity, wherein preferably the heterologous enzyme is derived from Pichia pastoris, more preferably from a polypeptide that is at least 45%, such as at least 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 and up to 100% identical to SEQ ID NO: 14 .
9. Применение вырабатывающих холестерин дрожжевых клеток, как определено здесь и по п.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, для получения стеролов, предпочтительно для получения предшественников витамина D3, более предпочтительно для получения 7-DHC.9. Use of cholesterol-producing yeast cells as defined herein and in claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 for the production of sterols, preferably for the production of vitamin D3 precursors, more preferably for the production of 7-DHC.
10. Применение вырабатывающих холестерин дрожжевых клеток, как определено здесь и по п.9, при этом 7-DHC дополнительно превращается в витамин D3.10. Use of cholesterol-producing yeast cells as defined herein and in claim 9, wherein 7-DHC is further converted to vitamin D3.
11. Применение, как определено здесь и по п.9 или 10, при этом 7-DHC дополнительно превращается в 25-гидроксивитамин D3.11. Use as defined herein and in claim 9 or 10, wherein 7-DHC is further converted to 25-hydroxyvitamin D3.
12. Способ снижения количества холеста-8-енола в смеси стеролов, вырабатываемых дрожжевыми клетками, который включает экспрессирование гетерологичного фермента, обладающего активностью С8-стеролизомеразы, причем данный фермент выбран из группы, состоящей из Saccharomyces типа Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia типа Y. lipolytica, Klyveromyces типа K. lactis, Schizosaccharomyces типа Schizosaccharomyces pombe, Pichia типа P. pastoris, Candida типа С. albicans, Penicillium типа P. roqueforti, Aspergillus типа A. nidulans, Cryptococcus типа С. neoformans, Magneporte типа Magneporte oryzae, Metarhizium типа Metarhizium acridum и Ustilago типа Ustilago maydis, предпочтительно из Ustilago maydis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans или Saccharomyces cerevisiae.12. A method for reducing the amount of cholesta-8-enol in a mixture of sterols produced by yeast cells, which includes expressing a heterologous enzyme having C8-sterolysomerase activity, this enzyme being selected from the group consisting of Saccharomyces type Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia type Y. lipolytica, Klyveromyces type K. lactis, Schizosaccharomyces type Schizosaccharomyces pombe, Pichia type P. pastoris, Candida type C. albicans, Penicillium type P. roqueforti, Aspergillus type A. nidulans, Cryptococcus type C. neoformans, Magneporte type Magneporte oryzae, Metarhizium type Metarhizium acridum and Ustilago type Ustilago maydis, preferably from Ustilago maydis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans or Saccharomyces cerevisiae.
13. Способ получения смеси стеролов, предпочтительно предшественников витамина D3, более предпочтительно смеси стеролов, содержащей по меньшей мере 80% 7-DHC, в дрожжевых клетках, включающий:13. A method of producing a mixture of sterols, preferably vitamin D3 precursors, more preferably a mixture of sterols containing at least 80% 7-DHC, in yeast cells, comprising:
(a) инактивацию ERG5 и ERG6, (b) экспрессирование гетерологичного фермента из числа ЕС 1.3.1.72, обладающего активностью стерол-А24-редуктазы в отношении холеста-7,24-диенола, зимостерола или триенола, предпочтительно растительной или стерол-А24-редуктазы позвоночных, более предпочтительно стерол-А24-редуктазы позвоночных,(a) inactivation of ERG5 and ERG6, (b) expression of a heterologous enzyme from EC 1.3.1.72 having sterol A24 reductase activity towards cholesta-7,24-dienol, zymosterol or trienol, preferably plant or sterol A24 reductase vertebrates, more preferably vertebrate sterol A24 reductase,
- 7 045880 (c) экспрессирование гетерологичного фермента, обладающего активностью С8-стеролизомеразы, причем данный фермент выбран из группы, состоящей из Saccharomyces типа Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia типа Y. lipolytica, Klyveromyces типа К. lactis, Schizosaccharomyces типа Schizosaccharomyces pombe, Pichia типа Р. pastoris, Candida типа С. albicans, Penicillium типа Р. roqueforti, Aspergillus типа A. nidulans, Cryptococcus типа С. neoformans, Magneporte типа Magneporte oryzae, Metarhizium типа Metarhizium acridum и Ustilago типа Ustilago maydis, предпочтительно из Ustilago maydis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans или Saccharomyces cerevisiae, (d) культивирование данных дрожжевых клеток в условиях, подходящих для получения стеролов, причем соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу в смеси стеролов составляет более 8,7.- 7 045880 (c) expression of a heterologous enzyme having C8 sterolysomerase activity, wherein the enzyme is selected from the group consisting of Saccharomyces type Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia type Y. lipolytica, Klyveromyces type K. lactis, Schizosaccharomyces type Schizosaccharomyces pombe, Pichia type P pastoris, Candida type C. albicans, Penicillium type P. roqueforti, Aspergillus type A. nidulans, Cryptococcus type C. neoformans, Magneporte type Magneporte oryzae, Metarhizium type Metarhizium acridum and Ustilago type Ustilago maydis, preferably from Ustilago maydis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans or Saccharomyces cerevisiae, (d) culturing these yeast cells under conditions suitable for the production of sterols, the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol in the sterol mixture being greater than 8.7.
Следующие примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения никоим образом.The following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
ПримерыExamples
Пример 1. Основные методы, штаммы и плазмидыExample 1. Basic methods, strains and plasmids
Все основные процедуры молекулярной биологии и манипуляции с ДНК, описанные здесь, обычно проводили в соответствии с Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; или Ausubel et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York. Генотипы используемых штаммов S. cerevisiae и плазмиды приведены в табл. 1 и 2. Вырабатывающий 7-DHC штамм Y2159 Saccharomyces cerevisiae конструировали, как описано в примере 4. Все перечисленные штаммы являются штаммами МАТа.All basic molecular biology procedures and DNA manipulations described here were routinely performed according to Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; or Ausubel et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York. The genotypes of the S. cerevisiae strains and plasmids used are given in Table. 1 and 2. The 7-DHC producing Saccharomyces cerevisiae strain Y2159 was constructed as described in Example 4. All of the listed strains are MAT strains.
Таблица 1Table 1
Штаммы Saccharomyces cerevisiaeStrains of Saccharomyces cerevisiae
Таблица 2table 2
Плазмиды, используемые для клонирования гомологов ERG2Plasmids used for cloning ERG2 homologues
Пример 2. Клонирование различных гомологов ERG2 в S. cerevisiae Y2159Example 2: Cloning of various ERG2 homologues in S. cerevisiae Y2159
Все кассеты ERG2 конструировали следующим образом. Открытые рамки считывания оптимизировали по кодонам на основе выведенной аминокислотной последовательности и синтезировали с 5'-сайтом XbaI (TCTAGAACAAAatg ...) и 3'-сайтом PstI. Их клонировали путем вставки фрагментов ERG2, расщепленных XbaI-PstI, в расщепленную XbaI-PstI плазмиду рМВ7621, что позволяет встраиваться в межгенный локус INT59 на хромосоме XI между генами SRP40 и PTR2 (примерно в положении 615000).All ERG2 cassettes were constructed as follows. Open reading frames were codon optimized based on the deduced amino acid sequence and synthesized with a 5′ XbaI site (TCTAGAACAAAatg...) and a 3′ PstI site. They were cloned by inserting XbaI-PstI-digested ERG2 fragments into the XbaI-PstI-digested plasmid pMB7621, allowing insertion into the intergenic INT59 locus on chromosome XI between the SRP40 and PTR2 genes (at approximately position 615000).
Помимо ERG2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1; плазмида рМВ7677), синтезированные гены включают гомологи ERG2 (оптимизированные по кодонам) из Ustilago maydis (SEQ ID NO: 9; плазмида рМВ7732), Candida albicans (SEQ ID NO: 10; плазмида рМВ7683) и Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 11; плазмида рМВ7681), см. перечень последовательностей.In addition to S. cerevisiae ERG2 (SEQ ID NO: 1; plasmid pMB7677), synthesized genes include ERG2 homologues (codon optimized) from Ustilago maydis (SEQ ID NO: 9; plasmid pMB7732), Candida albicans (SEQ ID NO: 10; plasmid pMB7683) and Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 11; plasmid pMB7681), see sequence listing.
Для проверки влияния различных генов ERG2 на продукцию 7-DHC штамм Y2159 трансформировали четырьмя различными расщепленными SfiI фрагментами, представляющими один из четырех видов, описанных выше, в локусе INT59, используя устойчивость к нурсеотрицину (NatR) в качестве отборочного маркера и сильный конститутивный промотор HSP26 в качестве контролирующего элемента.To test the effect of different ERG2 genes on 7-DHC production, strain Y2159 was transformed with four different SfiI-digested fragments representing one of the four species described above at the INT59 locus, using nurseothricin resistance (NatR) as a selection marker and the strong constitutive HSP26 promoter at as a controlling element.
Отбирали трансформанты на YPD-агаре с 200 мг/л нурсеотрицина через 3 дня при 30°С. Штаммы,Transformants were selected on YPD agar with 200 mg/l nurseothricin after 3 days at 30°C. Strains,
- 8 045880 полученные из этих трансформантов, приведены выше в табл. 1. Эти штаммы впоследствии анализировали на продуктивность по 7-DHC и общую чистоту стерола 7-DHC, как описано ниже.- 8 045880 obtained from these transformants are given above in the table. 1. These strains were subsequently analyzed for 7-DHC productivity and total 7-DHC sterol purity as described below.
Пример 3. Анализ стеролов в трансформированных штаммах по HPLCExample 3 HPLC Analysis of Sterols in Transformed Strains
Штаммы культивировали следующим образом. Исследуемые штаммы сначала высеивали на агар с YPD и инкубировали 48 часов при 30°С. Из этих чашек инокулировали предварительные культуры в 2 мл YPD и инкубировали на круговой качалке в течение 24 часов при 30°С. Из предварительных культур вносили в 24-луночный планшет 0,8 мл YPD + 10 г/л этанола до конечного значения OD6oo = 0,5. Планшеты инкубировали при 30°С в увлажненной атмосфере со встряхиванием при 800 об/мин на качалке с размахом 3 мм. Через 24 и 48 часов после инокуляции в каждую лунку добавляли 16 мкл этанола в качестве подпитки. Через 72 часа после инокуляции отбирали образцы клеток на содержание стеролов.The strains were cultured as follows. The test strains were first plated on YPD agar and incubated for 48 hours at 30°C. From these plates, pre-cultures were inoculated in 2 ml YPD and incubated on a circular shaker for 24 hours at 30°C. From the preliminary cultures, 0.8 ml of YPD + 10 g/l of ethanol was added to a 24-well plate to a final value of OD6oo = 0.5. The plates were incubated at 30°C in a humidified atmosphere with shaking at 800 rpm on a shaker with a swing of 3 mm. At 24 and 48 hours after inoculation, 16 μL of ethanol was added to each well as feed. 72 hours after inoculation, cell samples were collected for sterol content.
Из культур экстрагировали стеролы и анализировали следующим образом. Вносили пипеткой 80 мкл цельного бульона в пробирки Precellys на 2 мл со стеклянными шариками. Добавляли 800 мкл омыляющего раствора (5% KOH в этаноле), помещали образцы в гомогенизатор Precellys 24 и перемешивали при 6500 об/мин за 3 цикла по 15 сек на цикл. Затем добавляли 60 мкл ледяной уксусной кислоты и центрифугировали пробирки в течение 1 мин при максимальной скорости. Супернатанты анализировали методом HPLC на содержание стеролов. Результаты представлены в табл. 3, 4 и 5.Sterols were extracted from the cultures and analyzed as follows. Pipette 80 μl of whole broth into 2 ml Precellys tubes with glass beads. Add 800 μl of saponification solution (5% KOH in ethanol), place the samples in a Precellys 24 homogenizer and mix at 6500 rpm for 3 cycles of 15 s per cycle. Then 60 μl of glacial acetic acid was added and the tubes were centrifuged for 1 min at maximum speed. Supernatants were analyzed by HPLC for sterol content. The results are presented in table. 3, 4 and 5.
Таблица 3Table 3
Соотношение 7-DHC к зимостеролу в контроле и в штаммах, несущих гомологи ERG2Ratio of 7-DHC to zymosterol in control and strains carrying ERG2 homologs
Таблица 4Table 4
Соотношение 7-DHC к холеста-8-енолу в контроле и в штаммах, несущих гомологи ERG2Ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol in control and in strains carrying ERG2 homologs
Таблица 5Table 5
Соотношение 7-DHC к смеси ланостерола и латостерола в контроле и в штаммах, несущих гомологи ERG2Ratio of 7-DHC to a mixture of lanosterol and lathosterol in the control and in strains carrying ERG2 homologs
Пример 4. Конструирование Y2159Example 4: Construction of Y2159
ARE1 дикого типа (WT) S. cerevisiae синтезировали с помощью DNA2.0, включая сайт XbaI на 5'конце (TCTAGAACAAAatg...) и сайт PstI на 3'-конце. Её клонировали в плазмиду с делецией erg4Δ::Hyg по уникальным сайтам XbaI и PstI. После этого использовали LEU2 для замены фрагмента HygR путем клонирования по KpnI-AgeI. В результате получили плазмиду pHyD459.Wild-type (WT) S. cerevisiae ARE1 was synthesized using DNA2.0, including an XbaI site at the 5' end (TCTAGAACAAAatg...) and a PstI site at the 3' end. It was cloned into a plasmid with a deletion of erg4Δ::Hyg at the unique XbaI and PstI sites. LEU2 was then used to replace the HygR fragment by cloning at KpnI-AgeI. As a result, plasmid pHyD459 was obtained.
Плазмиду рМВ7584 с мутантным вариантом (F592L) ARE1 S. cerevisiae получали путем лигирования расщепленного BsrGI-BsaI продукта ПЦР, полученного из ARE1 (праймеры по SEQ ID NO: 16 и 17), с двухцепочечным олигонуклеотидом, полученным при гибридизации SEQ ID NO: 19 и 20 с расщепленной BsrGI-PstI плазмидой pHyD459. Аналогичным образом получали рМВ7585 с мутантным вариантом (G595D) ARE1 S. cerevisiae путем лигирования расщепленного BsrGI-Bsal продукта ПЦР, полученного из ARE1 (праймеры по SEQ ID NO: 16 и 18), с двухцепочечным олигонуклеотидом, полученным при гибридизации SEQ ID NO: 21 и 22 с расщепленной BsrGI-PstI плазмидой pHyD459. Праймеры, а также другие используемые здесь последовательности приведены в табл. 6.Plasmid pMB7584 with a mutant variant (F592L) of S. cerevisiae ARE1 was obtained by ligating the BsrGI-BsaI digested PCR product obtained from ARE1 (primers according to SEQ ID NO: 16 and 17) with a double-stranded oligonucleotide obtained by hybridization of SEQ ID NO: 19 and 20 with BsrGI-PstI-digested plasmid pHyD459. pMB7585 with the mutant variant (G595D) of S. cerevisiae ARE1 was prepared in a similar manner by ligating the BsrGI-Bsal digested PCR product obtained from ARE1 (primers SEQ ID NO: 16 and 18) with the double-stranded oligonucleotide obtained by hybridization SEQ ID NO: 21 and 22 with BsrGI-PstI-digested plasmid pHyD459. Primers, as well as other sequences used here, are given in table. 6.
Таблица 6Table 6
Плазмиды, используемые для конструирования мутаций ARE. Scer означает Saccharomyces cerevisiaePlasmids used to construct ARE mutations. Scer stands for Saccharomyces cerevisiae
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00626/18 | 2018-05-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045880B1 true EA045880B1 (en) | 2024-01-12 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6494522B2 (en) | Production of ergothioneine by metabolic engineering | |
| US10358664B2 (en) | Mutant host cells for the production of 3-hydroxypropionic acid | |
| JP7443658B2 (en) | Optimization of C-8 sterol isomerization | |
| JP2022025108A (en) | Fungal production of fdca | |
| US9885066B2 (en) | Organic acid pathway | |
| CN101993861A (en) | Recombinant expression of carboxyl esterase | |
| Li et al. | Overexpression of Candida rugosa lipase Lip1 via combined strategies in Pichia pastoris | |
| Kubiak-Szymendera et al. | Hyperosmolarity adversely impacts recombinant protein synthesis by Yarrowia lipolytica—molecular background revealed by quantitative proteomics | |
| US12018309B2 (en) | Optimization of C-5 sterol desaturation | |
| JP7460540B2 (en) | Modified sterol acyltransferase | |
| US12049617B2 (en) | Optimization of C-8 sterol isomerization | |
| EA045880B1 (en) | OPTIMIZATION OF C-8-ISOMERIZATION OF STEROLS | |
| JP2008035732A (en) | Method for producing organic acid | |
| EA045256B1 (en) | OPTIMIZATION OF C-5-DESATURATION OF STEROLS | |
| EA045282B1 (en) | MODIFIED STEROL ACYLTRANSFERASES | |
| KR101243903B1 (en) | Ethanol―Tolerant Yeast Strains and Genes Thereof | |
| US10131897B2 (en) | Molecules associated with fatty acid biosynthetic pathways and uses thereof | |
| WO2019086583A1 (en) | Production of macrocyclic ketones in recombinant hosts | |
| WO2009144245A1 (en) | Method for increasing growth rate | |
| EA045290B1 (en) | MODIFIED STEROL ACYLTRANSFERASES | |
| WO2019224188A1 (en) | Modified sterol acyltransferases |