EA045282B1

EA045282B1 - MODIFIED STEROL ACYLTRANSFERASES

Info

Publication number: EA045282B1
Application number: EA202092799
Authority: EA
Inventors: Кристофер Марк Фаррел; Лиза Энн Лапраде; Отто Мартин Леман; Джошуа Трухарт
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2023-11-10

Description

Изобретение касается модифицированных ферментов - стерол-ацилтрансфераз с улучшенной активностью и/или специфичностью в отношении ацилирования предшественника витамина D3, 7дегидрохолестерина (7-DHC), для применения при биотехнологическом производстве витамина D3.The invention concerns modified sterol acyltransferase enzymes with improved activity and/or specificity for acylation of the vitamin D3 precursor, 7-dehydrocholesterol (7-DHC), for use in the biotechnological production of vitamin D3.

Кроме того, изобретение касается дрожжевых штаммов, экспрессирующих данные модифицированные ферменты, и их применения в способе получения витамина D3 или его производных и/или метаболитов.In addition, the invention relates to yeast strains expressing these modified enzymes and their use in a method for producing vitamin D3 or its derivatives and/or metabolites.

Витамин D3 (также известный как холекальциферол или кальциол) может синтезироваться в коже млекопитающих из провитамина D3 (также известного как 7-дегидрохолестерин или 7-DHC), который является продуктом биосинтеза холестерина, под воздействием УФ-света, при этом 7-DHC фотохимически превращается в провитамин D3, который изомеризуется при температуре тела до биологически активной формы витамина D3. В печени витамин D3 превращается в биологически неактивный 25гидроксивитамин D3 (также известный как кальцидиол, кальцифедиол, 25-гидроксихолекальциферол, 25-OH-D3 или HyD), который является основной циркулирующей формой витамина D3. Дальнейшее гидроксилирование происходит в почках.Vitamin D3 (also known as cholecalciferol or calciol) can be synthesized in mammalian skin from provitamin D3 (also known as 7-dehydrocholesterol or 7-DHC), which is a product of cholesterol biosynthesis, upon exposure to UV light, whereby 7-DHC is photochemically converted into provitamin D3, which isomerizes at body temperature to the biologically active form of vitamin D3. In the liver, vitamin D3 is converted to biologically inactive 25hydroxyvitamin D3 (also known as calcidiol, calcifediol, 25-hydroxycholecalciferol, 25-OH-D3, or HyD), which is the main circulating form of vitamin D3. Further hydroxylation occurs in the kidneys.

Для промышленного производства витамина D3 доступен (в принципе) как химический, так и биотехнологический синтез. Химический синтез начинается с холестерина, выделенного, например, из шёрстного жира, который дегидрогенизируется до 7-DHC, важного промежуточного продукта как при химическом, так и биотехнологическом синтезе. Под воздействием УФ-излучения и дополнительных стадий очистки/экстракции 7-DHC превращается в витамин D3. Для биосинтеза 7-DHC можно использовать модифицированные штаммы дрожжей, в которых ацетил-СоА в многоступенчатом ферментативном процессе превращается в 7-DHC. Данная энзиматическая конверсия происходит в эндоплазматическом ретикулуме дрожжей. Избыточные количества стеролов, включая 7-DHC и его предшественники, которые не нужны в клеточных мембранах, токсичны для дрожжей, поэтому они накапливаются в виде стериловых эфиров во внутриклеточных органеллах (так называемых липидных тельцах), из которых они также могут быть выделены. Равновесие между свободными стеролами и стеролами, хранящимися в липидных телах (в основном в форме стериловых эфиров), запускается под действием нескольких белков (ферментов), включая действие стерол-ацилтрансфераз. У дрожжей, особенно у Saccharomyces cerevisiae, образование сложных эфиров стеролов в основном осуществляется двумя стерол-ацилтрансферазами: Are1p и Are2p.For the industrial production of vitamin D3, both chemical and biotechnological synthesis are available (in principle). Chemical synthesis begins with cholesterol isolated, for example, from wool fat, which is dehydrogenated to 7-DHC, an important intermediate in both chemical and biotechnological synthesis. When exposed to UV light and additional purification/extraction steps, 7-DHC is converted to vitamin D3. For the biosynthesis of 7-DHC, modified yeast strains can be used, in which acetyl-CoA is converted into 7-DHC in a multi-step enzymatic process. This enzymatic conversion occurs in the endoplasmic reticulum of yeast. Excessive amounts of sterols, including 7-DHC and its precursors, which are not required in cell membranes, are toxic to yeast, so they accumulate as steryl esters in intracellular organelles (called lipid bodies), from which they can also be isolated. The equilibrium between free sterols and sterols stored in lipid bodies (mainly in the form of steryl esters) is triggered by the action of several proteins (enzymes), including the action of sterol acyltransferases. In yeast, especially Saccharomyces cerevisiae, the formation of sterol esters is mainly carried out by two sterol acyltransferases: Are1p and Are2p.

Вследствие неспецифического действия данных ферментов - стерол-ацилтрансфераз пул стериловых эфиров, который хранится в липидных тельцах, относительно разнообразен, включая, без ограничения, например, сложные эфиры эргостерола, зимостерола, ланостерола, латостерола, холеста-5,7,24(25)триенола или 7-DHC. Поскольку для синтеза витамина D3 может использоваться только холеста5,7,24(25)-триенол, предшественник 7-DHC, а не зимостерол, то существует необходимость либо в избирательном хранении определенных сложных эфиров, таких, например, как сложные эфиры 7-DHC, в липидных тельцах, и/или в повышении оборота промежуточных продуктов 7-DHC, вырабатываемых такими штаммами дрожжей, которые далее превращаются в витамин D3 и/или его производные или метаболиты. Конкретным метаболитом, на котором и сосредоточено настоящее изобретение, является 25гидроксивитамин D3.Due to the nonspecific action of these sterol acyltransferase enzymes, the pool of steryl esters that is stored in lipid bodies is relatively diverse, including, but not limited to, esters of ergosterol, zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,7,24(25)trienol or 7-DHC. Since only cholesta 5,7,24(25)-trienol, the precursor of 7-DHC, and not zymosterol, can be used for the synthesis of vitamin D3, there is a need for either selective storage of certain esters, such as 7-DHC esters, in lipid bodies, and/or in increasing the turnover of 7-DHC intermediates produced by such yeast strains, which are further converted into vitamin D3 and/or its derivatives or metabolites. The specific metabolite that the present invention focuses on is 25hydroxyvitamin D3.

Таким образом, текущей задачей является создание клеток хозяина типа дрожжей, способных вырабатывать стеролы с высокой продуктивностью/специфичностью для 7-DHC и/или с меньшим накоплением побочных/промежуточных продуктов, включая зимостерол, ланостерол и латостерол, в частности, сложных эфиров таких промежуточных продуктов, которые хранятся в липидных тельцах.Thus, the current goal is to engineer yeast host cells capable of producing sterols with high productivity/specificity for 7-DHC and/or with less accumulation of by-products/intermediates, including zymosterol, lanosterol and lathosterol, in particular esters of such intermediates , which are stored in lipid bodies.

Неожиданно оказалось, что специфичность активности стерол-ацилтрансфераз в клетках хозяина можно сместить в сторону 7-DHC посредством введения определенных аминокислотных замен в последовательность ARE2 и/или ARE1, что приведет к повышению продуктивности и/или соотношения продуктов в клетках хозяина в сторону 7-DHC как важного промежуточного продукта при производстве витамина D3.Unexpectedly, it turned out that the specificity of sterol acyltransferase activity in host cells can be shifted towards 7-DHC by introducing certain amino acid substitutions into the sequence of ARE2 and/or ARE1, which will lead to increased productivity and/or the ratio of products in host cells towards 7-DHC as an important intermediate in the production of vitamin D3.

Так, настоящее изобретение направлено на модифицированные ферменты со стеролацилтрансферазной активностью, т.е. модифицированные стерол-ацилтрансферазы, в частности, на изоформы стерол-ацилтрансферазы Are1p и/или Are2p, содержащие одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих остаткам, выбранным из 592 и/или 595 в полипептиде по SEQ ID NO: 1, причем данные модифицированные ферменты обладают большей специфичностью к 7-DHC, чем к побочным/промежуточным продуктам, включая зимостерол.Thus, the present invention is directed to modified enzymes with sterol acyltransferase activity, i.e. modified sterol acyltransferases, in particular the sterol acyltransferase isoforms Are1p and/or Are2p, containing one or more amino acid substitutions at positions corresponding to residues selected from 592 and/or 595 in the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and these modified the enzymes have greater specificity for 7-DHC than for by-products/intermediates, including zymosterol.

Полипептид по SEQ ID NO: 1, проявляющий активность ARE1, включая полинуклеотиды, кодирующие такой полипептид по SEQ ID NO: 1, был выделен из Saccharomyces cerevisiae. Полипептид по SEQ ID NO: 3, проявляющий активность ARE2, включая полинуклеотиды, кодирующие такой полинуклеотид по SEQ ID NO: 3, был выделен из Saccharomyces cerevisiae.The polypeptide of SEQ ID NO: 1 exhibiting ARE1 activity, including polynucleotides encoding such polypeptide of SEQ ID NO: 1, was isolated from Saccharomyces cerevisiae. The polypeptide of SEQ ID NO: 3 exhibiting ARE2 activity, including polynucleotides encoding such polynucleotide of SEQ ID NO: 3, was isolated from Saccharomyces cerevisiae.

Термины стерол-ацилтрансфераза, ацилтрансфераза, ARE, фермент, обладающий ацилтрансферазной активностью или просто фермент применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к ферментам ЕС 2.3.1.26, то есть к ацилтрансферазам, переносящим жирноацильные группы из одной молекулы к другой. Такой перенос или ферментативную активность можно измерить известными специалистам способами. Стерол-ацилтрансферазы были выделены из различных источников, в том числе изThe terms sterol acyltransferase, acyltransferase, ARE, enzyme having acyltransferase activity or simply enzyme are used interchangeably herein and refer to EU 2.3.1.26 enzymes, that is, acyltransferases that transfer fatty acyl groups from one molecule to another. Such transfer or enzymatic activity can be measured by methods known to those skilled in the art. Sterol acyltransferases have been isolated from various sources, including

- 1 045282 млекопитающих, дрожжей или растений. ARE1 и ARE2 способны ацилировать такие стеролы, например, как зимостерол и/или 7-DHC, в соответствующие сложные эфиры. В настоящем изобретении модифицированный фермент, то есть модифицированная ацилтрансфераза, обладает предпочтительной активностью и/или специфичностью в отношении этерификации 7-DHC по сравнению с этерификацией, например, зимостерола, и/или лучшим образованием сложных эфиров стеролов вообще, включая, например, 7-DHC или зимостерол. Предпочтительными изоформами ацилтрансферазы являются Are1p или Are2p. ''^модифицированная стерол-ацилтрансфераза, в частности ARE1 и ARE2, в настоящем изобретении означает соответствующий эндогенный фермент, не несущий одну или несколько аминокислотных замен, как определено здесь.- 1 045282 mammals, yeasts or plants. ARE1 and ARE2 are capable of acylating sterols such as zymosterol and/or 7-DHC into the corresponding esters. In the present invention, the modified enzyme, i.e. the modified acyltransferase, has preferential activity and/or specificity for the esterification of 7-DHC compared to the esterification of, for example, zymosterol, and/or better formation of sterol esters in general, including, for example, 7-DHC or zymosterol. The preferred acyltransferase isoforms are Are1p or Are2p. ''modified sterol acyltransferase, particularly ARE1 and ARE2, as used herein means the corresponding endogenous enzyme not bearing one or more amino acid substitutions as defined herein.

В настоящем изобретении клетки хозяина, несущие модифицированную стерол-ацилтрансферазную активность, как определено здесь, в частности, ARE2 и/или ARE1, содержащую одну или несколько аминокислотных замен, как определено здесь, именуются модифицированными клетками хозяина. Соответствующие клетки хозяина, несущие немодифицированную стерол-ацилтрансферазную активность, т.е. кодирующую гены ARE1 и/или ARE2 дикого типа, именуются немодифицированными клетками хозяина.In the present invention, host cells bearing a modified sterol acyltransferase activity as defined herein, in particular ARE2 and/or ARE1, containing one or more amino acid substitutions as defined herein are referred to as modified host cells. The corresponding host cells carrying unmodified sterol acyltransferase activity, i.e. encoding wild-type ARE1 and/or ARE2 genes are called unmodified host cells.

В настоящем изобретении термины зимостерол, ланостерол, латостерол, холеста-5,8,24(25)триенол, холеста-5,7,24(25)-триенол или 7-DHC, определяющие промежуточные соединения витамина D3, включают как свободные формы, так и формы сложных эфиров данных соединений. При этом смесь стеролов содержит 7-DHC и побочные или промежуточные продукты, включая, без ограничения, зимостерол, ланостерол, латостерол, холеста-5,8,24(25)-триенол или холеста-5,7,24(25)-триенол.In the present invention, the terms zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,8,24(25)trienol, cholesta-5,7,24(25)-trienol, or 7-DHC, defining vitamin D3 intermediates, are included as free forms, and ester forms of these compounds. In this case, the mixture of sterols contains 7-DHC and by-products or intermediate products, including, without limitation, zymosterol, lanosterol, lathosterol, cholesta-5,8,24(25)-trienol or cholesta-5,7,24(25)-trienol .

В настоящем изобретении дрожжи, вырабатывающие холестерин, больше не могут вырабатывать эргостерол, а вырабатывают продукты холестерина, включая, без ограничения, холеста-5,7,24(25)триенол, холеста-5,8,24(25)триенол, холеста-7,24(25)-диенол, 7-DHC или зимостерол. В частности, этого можно добиться за счет введения двойного нокаута erg5erg6.In the present invention, the cholesterol-producing yeast can no longer produce ergosterol, but produces cholesterol products, including, but not limited to, cholesta-5,7,24(25)trienol, cholesta-5,8,24(25)trienol, cholesta- 7,24(25)-dienol, 7-DHC or zymosterol. In particular, this can be achieved by introducing a double knockout of erg5erg6.

В одном воплощении модифицированный фермент, как определено здесь, в частности, модифицированный фермент ARE1, содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку 592 в полипептиде по SEQ ID NO: 1, предпочтительно замену фенилаланина на лейцин (F592L). Предпочтительно фермент с модифицированной активностью ARE1 происходит из Saccharomyces типа S. cerevisiae. Используя данный модифицированный фермент ARE1, можно повысить соотношение 7-DHC к зимостеролу в смеси стеролов по меньшей мере на 15% по сравнению со штаммом, экспрессирующим немодифицированный эндогенный ARE1.In one embodiment, the modified enzyme as defined herein, particularly the modified ARE1 enzyme, contains an amino acid substitution at the position corresponding to residue 592 in the polypeptide of SEQ ID NO: 1, preferably a phenylalanine to leucine substitution (F592L). Preferably, the enzyme with modified ARE1 activity is derived from Saccharomyces type S. cerevisiae. Using this modified ARE1 enzyme, it is possible to increase the ratio of 7-DHC to zymosterol in a sterol mixture by at least 15% compared to a strain expressing unmodified endogenous ARE1.

В другом воплощении модифицированный фермент, как определено здесь, в частности, модифицированный фермент ARE1, содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку 595 в полипептиде по SEQ ID NO: 1, предпочтительно замену глицина на аспарагиновую кислоту (G595D). Предпочтительно фермент с модифицированной активностью ARE1 происходит из Saccharomyces типа S. cerevisiae. Используя данный модифицированный фермент ARE1, можно повысить соотношение 7DHC к зимостеролу в смеси стеролов более чем вдвое, т.е. повысить по меньшей мере на 55% по сравнению со штаммом, экспрессирующим немодифицированный эндогенный ARE1.In another embodiment, the modified enzyme as defined herein, particularly the modified ARE1 enzyme, contains an amino acid substitution at the position corresponding to residue 595 in the polypeptide of SEQ ID NO: 1, preferably a glycine to aspartic acid substitution (G595D). Preferably, the enzyme with modified ARE1 activity is derived from Saccharomyces type S. cerevisiae. Using this modified ARE1 enzyme, the ratio of 7DHC to zymosterol in a sterol mixture can be more than doubled, i.e. increase by at least 55% compared to a strain expressing unmodified endogenous ARE1.

В одном воплощении модифицированный фермент, как определено здесь, в частности, модифицированный фермент ARE2, содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку 624 в полипептиде по SEQ ID NO: 3, предпочтительно замену фенилаланина на лейцин (F624L). Предпочтительно фермент с модифицированной активностью ARE2 происходит из Saccharomyces типа S. cerevisiae. Используя данный модифицированный фермент ARE2, можно повысить соотношение 7-DHC к зимостеролу в смеси стеролов по меньшей мере на 15% по сравнению со штаммом, экспрессирующим немодифицированный эндогенный ARE2.In one embodiment, the modified enzyme as defined herein, particularly the modified ARE2 enzyme, contains an amino acid substitution at the position corresponding to residue 624 in the polypeptide of SEQ ID NO: 3, preferably a phenylalanine to leucine substitution (F624L). Preferably, the enzyme with modified ARE2 activity is derived from Saccharomyces type S. cerevisiae. Using this modified ARE2 enzyme, it is possible to increase the ratio of 7-DHC to zymosterol in a sterol mixture by at least 15% compared to a strain expressing unmodified endogenous ARE2.

В другом воплощении модифицированный фермент, как определено здесь, в частности, модифицированный фермент ARE2, содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку 627 в полипептиде по SEQ ID NO: 3, предпочтительно замену глицина на аспарагиновую кислоту (G627D). Предпочтительно фермент с модифицированной активностью ARE2 происходит из Saccharomyces типа S. cerevisiae. Используя данный модифицированный фермент ARE2, можно повысить соотношение 7DHC к зимостеролу в смеси стеролов по меньшей мере на 15% по сравнению со штаммом, экспрессирующим немодифицированный эндогенный ARE2.In another embodiment, the modified enzyme as defined herein, particularly the modified ARE2 enzyme, contains an amino acid substitution at the position corresponding to residue 627 in the polypeptide of SEQ ID NO: 3, preferably a glycine to aspartic acid substitution (G627D). Preferably, the enzyme with modified ARE2 activity is derived from Saccharomyces type S. cerevisiae. Using this modified ARE2 enzyme, it is possible to increase the ratio of 7DHC to zymosterol in a sterol mixture by at least 15% compared to a strain expressing unmodified endogenous ARE2.

Описанные аминокислотные замены в положениях, соответствующих остаткам F592L и/или G595D в SEQ ID NO: 1, можно комбинировать с другими заменами, как определено здесь, т.е. заменами в одном или нескольких положениях, соответствующих аминокислотным остаткам 624 и/или 627 в полипептиде по SEQ ID NO: 3, как описано здесь. Предпочтительно можно комбинировать аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку F592L в SEQ ID NO: 1, с другими заменами типа аминокислотных замен в положениях, соответствующих G595D в SEQ ID NO: 1 и/или F624L в SEQ ID NO: 3 и/или G627D в SEQ ID NO: 3. Предпочтительным модифицированным ферментом является фермент, обладающий активностью ARE1 и содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену в положении, соответствующем G595D в SEQ ID NO: 1, проявляющий повышение титра 7-DHC по меньшей мере на 30, 35, 40, 45% и снижение зимостерола по меньшей мере на 15, 20, 25, 30% в смеси стеролов, причем содержаниеThe described amino acid substitutions at positions corresponding to residues F592L and/or G595D in SEQ ID NO: 1 can be combined with other substitutions as defined herein, i.e. substitutions at one or more positions corresponding to amino acid residues 624 and/or 627 in the polypeptide of SEQ ID NO: 3, as described herein. Preferably, you can combine an amino acid substitution at the position corresponding to residue F592L in SEQ ID NO: 1 with other substitutions such as amino acid substitutions at positions corresponding to G595D in SEQ ID NO: 1 and/or F624L in SEQ ID NO: 3 and/or G627D in SEQ ID NO: 3. A preferred modified enzyme is an enzyme having ARE1 activity and containing at least one amino acid substitution at a position corresponding to G595D in SEQ ID NO: 1, exhibiting an increase in 7-DHC titer of at least 30, 35, 40 , 45% and a decrease in zymosterol by at least 15, 20, 25, 30% in a mixture of sterols, and the content

- 2 045282- 2 045282

7-DHC в смеси стеролов составляет 70-76%.7-DHC in the sterol mixture is 70-76%.

В настоящем изобретении активность ARE1 и/или ARE2 подвергается модификации. Это осуществляется, например, путем введения мутаций в эндогенный ген, кодирующий ARE1 и/или ARE2, то есть аминокислотных замен в одном или нескольких положениях, как описано здесь. Специалистам известно, как проводятся генетические манипуляции дрожжевых клеток, приводящие к модификации активности ARE1 и/или ARE2. Эти генетические манипуляции включают, без ограничения, например, замену генов, амплификацию генов, разрушение генов, трансфекцию, трансформацию с помощью плазмид, вирусов или других векторов.In the present invention, the activity of ARE1 and/or ARE2 is modified. This is accomplished, for example, by introducing mutations into the endogenous gene encoding ARE1 and/or ARE2, that is, amino acid substitutions at one or more positions, as described here. Those skilled in the art are aware of how yeast cells are genetically manipulated to modify the activity of ARE1 and/or ARE2. These genetic manipulations include, but are not limited to, gene replacement, gene amplification, gene disruption, transfection, transformation with plasmids, viruses or other vectors.

Введение мутаций в нуклеиновые кислоты или аминокислоты, то есть мутагенез, может осуществляться различными способами, такими, к примеру, как случайный или направленный мутагенез, физическое повреждение, вызванное такими агентами, к примеру, как радиация, химическая обработка или вставка генетического элемента. Специалистам известно, как вводятся мутации.The introduction of mutations into nucleic acids or amino acids, that is, mutagenesis, can be carried out in various ways, such as random or targeted mutagenesis, physical damage caused by agents such as radiation, chemical treatment or insertion of a genetic element. Experts know how mutations are introduced.

Настоящее изобретение, в частности, направлено на применение таких модифицированных ферментов ARE1 и/или ARE2, как определено здесь, в способе получения 7-DHC, промежуточного соединения для витамина D3. Предпочтительно модифицированные ферменты по настоящему изобретению вводятся и/или экспрессируются в подходящих клетках хозяина типа дрожжевых, предпочтительно вырабатывающих стеролы дрожжей, в частности, в дрожжевых клетках, вырабатывающих холестерин, как-то выбранных из Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. или Yarrowia lipolytica, предпочтительно S. cerevisiae. Модифицированные клетки используются для получения 7-DHC, который в дальнейшем может быть преобразован в витамин D3 и/или 25гидроксивитамин D3.The present invention is particularly directed to the use of such modified ARE1 and/or ARE2 enzymes as defined herein in a process for producing 7-DHC, a vitamin D3 intermediate. Preferably, the modified enzymes of the present invention are introduced and/or expressed in suitable host cells of the yeast type, preferably sterol-producing yeasts, in particular cholesterol-producing yeast cells, such as those selected from Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. or Yarrowia lipolytica, preferably S. cerevisiae. The modified cells are used to produce 7-DHC, which can be further converted into vitamin D3 and/or 25hydroxyvitamin D3.

Подходящие клетки хозяина могут подвергаться дополнительным модификациям для дальнейшего повышения продукции 7-DHC, важного промежуточного продукта для биосинтеза витамина D3, и/или для снижения накопления побочных продуктов.Suitable host cells can undergo additional modifications to further increase the production of 7-DHC, an important intermediate for vitamin D3 biosynthesis, and/or to reduce the accumulation of byproducts.

Так, в одном воплощении изобретение направлено на штамм дрожжей с модифицированной активностью ARE1 и/или ARE2, при этом также инактивированы ERG5 и ERG6. Дрожжевые клетки могут подвергаться дополнительной модификации посредством экспрессии гетерологичного фермента, обладающего активностью С24-редуктазы, в особенности из числа ЕС 1.3.1.72, типа гетерологичной С24редуктазы, действующей на холеста-7,24-диенол, зимостерол или триенол (например, холеста-5,7,25триенол), предпочтительно растительной или стерол-А24-редуктазы позвоночных, более предпочтительно из позвоночных, еще более предпочтительно из человека, свиньи, собаки, мыши, крысы, лошади, Danio rerio или же любого известного источника, если только она может экспрессироваться в данных дрожжевых клетках. Наиболее предпочтительно стерол-А24-редуктаза выбрана из Danio rerio, крысы или человека. Последовательности, экспрессирующие данные ферменты стерол-А24-редуктазы, являются общедоступными, включая, без ограничения, ссылки Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 или Р93472 из UniProtKB/Swiss-Prot (например, см. WO 2003/064650). При использовании такого штамма дрожжей содержание 7-DHC в смеси стеролов будет составлять от 70% и более, предпочтительно типа 75, 80, 88, 90, 95, 98% от общего количества стеролов.Thus, in one embodiment, the invention is directed to a yeast strain with modified ARE1 and/or ARE2 activity, wherein ERG5 and ERG6 are also inactivated. Yeast cells can be further modified by the expression of a heterologous enzyme having C24 reductase activity, especially EC 1.3.1.72, a type of heterologous C24 reductase acting on cholesta-7,24-dienol, zymosterol or trienol (e.g. cholesta-5, 7,25trienol), preferably a plant or vertebrate sterol A24 reductase, more preferably from a vertebrate, even more preferably from a human, pig, dog, mouse, rat, horse, Danio rerio or any known source, as long as it can be expressed in these yeast cells. Most preferably, the sterol A24 reductase is selected from Danio rerio, rat or human. Expression sequences for these sterol A24 reductase enzymes are publicly available, including, without limitation, references Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085, or P93472 from UniProtKB/Swiss-Prot (eg, see WO 2003/064650). When using such a yeast strain, the 7-DHC content of the sterol mixture will be 70% or more, preferably 75, 80, 88, 90, 95, 98% of the total sterols.

В другом воплощении клетки хозяина по настоящему изобретению могут подвергаться дальнейшей модификации посредством введения гомологов эндогенных ферментов, участвующих в биосинтезе 7DHC, таких, например, как С5-стерол-десатураза (ERG3) и/или С8-стерол-изомераза (ERG2), что ведет к повышению специфичности и/или продуктивности по 7-DHC со снижением накопления побочных продуктов или промежуточных соединений витамина D3, в том числе, без ограничения, зимостерола, ланостерола и/или латостерола. Предпочтительно модифицированные клетки хозяина, как определено здесь, содержат гетерологичную ERG2 и/или ERG3, причем ERG2 предпочтительно выбрана из Ustilago maydis (последовательность происходит из UniProtKB P32360), а/или ERG3 предпочтительно выбрана из Pichia pastoris (последовательность происходит из UniProtKB C4QY87) или Schizosaccharomyces pombe (последовательность происходит из UniProtKB O94457). Штаммы, содержащие гомологи ERG2 и ERG3 вместе с модифицированными ARE1 и/или ARE2, как определено здесь, вырабатывают смесь стеролов с содержанием 7-DHC более 80% и повышением соотношения 7-DHC к холеста-8-енолу и/или латостеролу по меньшей мере на 15-20%. Еще более предпочтительным является модифицированный штамм, как определено здесь, дополнительно содержащий две или несколько копий гомологов ERG2 и/или ERG3, как описано выше.In another embodiment, the host cells of the present invention can be further modified by introducing homologs of endogenous enzymes involved in 7DHC biosynthesis, such as C5 sterol desaturase (ERG3) and/or C8 sterol isomerase (ERG2), which leads to to increased 7-DHC specificity and/or productivity with decreased accumulation of vitamin D3 by-products or intermediates, including, but not limited to, zymosterol, lanosterol and/or lathosterol. Preferably, the modified host cells as defined herein contain heterologous ERG2 and/or ERG3, wherein ERG2 is preferably selected from Ustilago maydis (sequence derived from UniProtKB P32360) and/or ERG3 is preferably selected from Pichia pastoris (sequence derived from UniProtKB C4QY87) or Schizosaccharomyces pombe (sequence comes from UniProtKB O94457). Strains containing homologues of ERG2 and ERG3 together with modified ARE1 and/or ARE2, as defined here, produce a mixture of sterols with a 7-DHC content of more than 80% and an increase in the ratio of 7-DHC to cholesta-8-enol and/or lathosterol by at least by 15-20%. Even more preferred is a modified strain, as defined herein, additionally containing two or more copies of ERG2 and/or ERG3 homologs, as described above.

В конкретном воплощении изобретение касется способа улучшения клеток хозяина в отношении продукции 7-DHC, причем клетки хозяина модифицированы, как определено здесь, т.е. модифицированы путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в стерол-ацилтрансферазы ARE1 и/или ARE2, как определено здесь, в частности, дрожжевые клетки, вырабатывающие холестерин, предпочтительно это дрожжевые клетки, в которых инактивированы ERG5 и ERG6 и в которых необязательно экспрессируется гетерологичный фермент, обладающий активностью С-24-редуктазы, как определено здесь, и/или необязательно экспрессируются гомологи эндогенных ERG2 и/или ERG3, причем клетки хозяина улучшаются таким образом, что содержание 7-DHC в общем количестве стеролов, вырабатываемых дан- 3 045282 ными клетками хозяина, повышается по меньшей мере до 70, 75, 80%, предпочтительно 88, 90, 95, 98%, в частности, при этом соотношение 7-DHC к побочным продуктам, включая зимостерол и холеста-8-енол, повышается по меньшей мере на 5, 10, 15, 18, 20, 25% по сравнению с дрожжевым штаммом, экспрессирующим немодифицированный фермент, т.е. ARE1 и/или ARE2 дикого типа.In a specific embodiment, the invention relates to a method for improving host cells to produce 7-DHC, wherein the host cells are modified as defined herein, i.e. modified by introducing one or more amino acid substitutions into the sterol acyltransferases ARE1 and/or ARE2 as defined herein, in particular cholesterol-producing yeast cells, preferably yeast cells in which ERG5 and ERG6 are inactivated and in which the heterologous enzyme is optionally expressed, having C-24 reductase activity as defined herein, and/or optionally expressing homologues of endogenous ERG2 and/or ERG3, wherein the host cells are improved such that the 7-DHC content of the total sterols produced by the host cells , is increased to at least 70, 75, 80%, preferably 88, 90, 95, 98%, in particular, the ratio of 7-DHC to by-products, including zymosterol and cholesta-8-enol, is increased by at least 5, 10, 15, 18, 20, 25% compared to a yeast strain expressing an unmodified enzyme, i.e. ARE1 and/or ARE2 wild type.

В одном аспекте настоящего изобретения клетки хозяина, содержащие модифицированный фермент ARE1 и/или ARE2, как определено здесь, применяются в способе получения 7-DHC, предшественника витамина D3. Модифицированные клетки хозяина можно культивировать в водной среде с добавлением соответствующих питательных веществ, в аэробных или анаэробных условиях, известных специалистам, для соответствующих клеток хозяина, вырабатывающих холестерин. Необязательно такое культивирование проводится в присутствии белков и/или кофакторов, участвующих в переносе электронов, которые известны в данной области. Культивирование/выращивание клеток хозяина может проводиться в периодическом режиме, с подпиткой, в полунепрерывном или непрерывном режиме. В зависимости от клеток хозяина, предпочтительно, получение витамина D3 и его предшественников типа 7-DHC может варьироваться, как это известно специалистам. Культивирование и выделение 7-DHC и других промежуточных продуктов при получении витамина D3 описано, например, в WO 2011/067144 или WO 2017/108799. 7-DHC можно выделить и/или необязательно дополнительно очистить из смеси стеролов, а также преобразовать в витамин D3 и/или 25-гидроксивитамин D3 известными в данной области способами.In one aspect of the present invention, host cells containing a modified ARE1 and/or ARE2 enzyme, as defined herein, are used in a method for producing 7-DHC, a vitamin D3 precursor. The modified host cells can be cultured in an aqueous environment supplemented with appropriate nutrients, under aerobic or anaerobic conditions known to those skilled in the art for the appropriate cholesterol-producing host cells. Optionally, such cultivation is carried out in the presence of proteins and/or cofactors involved in electron transfer, which are known in the art. The culture/growth of host cells can be carried out in batch, fed-batch, semi-continuous or continuous mode. Depending on the host cells, the preferred production of vitamin D3 and its 7-DHC type precursors may vary, as is known in the art. The cultivation and isolation of 7-DHC and other intermediates in the production of vitamin D3 is described, for example, in WO 2011/067144 or WO 2017/108799. 7-DHC can be isolated and/or optionally further purified from a mixture of sterols and also converted to vitamin D3 and/or 25-hydroxyvitamin D3 by methods known in the art.

При использовании клеток хозяина, как описано здесь, можно смещать субстратную специфичность фермента стерол-ацилтрансферазы в сторону 7-DHC, получая содержание 7-DHC в общем объеме стеролов, вырабатываемых данными клетками хозяина, по меньшей мере 70%, с титрами 7-DHC вплоть до 10 г/л и более после ферментации около 100 ч в подходящих условиях культивирования.By using host cells as described herein, it is possible to shift the substrate specificity of the sterol acyltransferase enzyme toward 7-DHC, resulting in a 7-DHC content of the total sterols produced by a given host cell of at least 70%, with titers of 7-DHC up to up to 10 g/l or more after fermentation for about 100 hours under suitable cultivation conditions.

Термины ARE1 и Are1p, ARE2 и Are2p, ERG5 и Erg5p, ERG6 и Erg6p применяются здесь взаимозаменяемо и обозначают полипептиды, кодируемые соответствующими генами are1, are2, erg5 и erg6. В целях настоящего изобретения дрожжевые клетки, вырабатывающие холестерин, модифицируют так, что они действительно проявляют модифицированную активность ARE1 и/или ARE2, например, несут модификации в эндогенном ARE1 либо в ARE2, либо в обоих, что ведет к модификации специфичности ARE1 и/или ARE2, причем данные модификации осуществляются путем введения одной или нескольких аминокислотных замен, как определено здесь.The terms ARE1 and Are1p, ARE2 and Are2p, ERG5 and Erg5p, ERG6 and Erg6p are used interchangeably herein and refer to the polypeptides encoded by the corresponding genes are1, are2, erg5 and erg6. For purposes of the present invention, cholesterol-producing yeast cells are modified such that they actually exhibit modified ARE1 and/or ARE2 activity, for example, carrying modifications in endogenous ARE1 or ARE2 or both, leading to modification of ARE1 and/or ARE2 specificity , wherein these modifications are accomplished by introducing one or more amino acid substitutions as defined herein.

Гены, кодирующие ERG5, ERG6, ARE1, ARE2, ERG2, ERG3 или стерол-А24-редуктазу (ERG4), культивирование и генная инженерия дрожжевых клеток, которые используются здесь, известны и описаны, например, в US 7608421.The genes encoding ERG5, ERG6, ARE1, ARE2, ERG2, ERG3 or sterol A24 reductase (ERG4), culture and genetic engineering of yeast cells, which are used here, are known and are described, for example, in US 7608421.

В настоящем изобретении термины С-24-редуктаза или А24-редуктаза применяются здесь взаимозаменяемо. У дрожжей этот фермент кодируется erg4 и действует на метильную группу у атома углерода в положении 24. Триенол, который не содержит такой метильной группы в данном положении, поэтому не является приемлемым субстратом для дрожжевой ERG4.In the present invention, the terms C-24 reductase or A24 reductase are used interchangeably herein. In yeast, this enzyme is encoded by erg4 and acts on a methyl group at carbon atom at position 24. Trienol, which does not contain such a methyl group at this position, is therefore not an acceptable substrate for yeast ERG4.

Термины С-8-стеролизомераза, дельта-8,7-изомераза или фермент, обладающий активностью С-8-стеролизомеразы применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к ферментам, которые способны катализировать превращение холеста-8-енола в холеста-7-енол и/или зимостерола в холеста-7,24-диенол. У дрожжей этот фермент кодируется erg2. Предпочтительным гомологом ERG2 для применения в модифицированных клетках хозяина по настоящему изобретению является полипептид, который по меньшей мере на 41%, как-то, например, по меньшей мере на 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 или вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 5 и проявляет активность С-8-стеролизомеразы, а полинуклеотиды, кодирующие такой полипептид, получены из Ustilago maydis. Предпочтительно в модифицированных клетках хозяина экспрессируется 1 или несколько копий типа по меньшей мере 1, 2, 3, 5 данного гомолога ERG2, как определено здесь.The terms C-8-sterolysomerase, delta-8,7-isomerase, or enzyme having C-8-sterolysomerase activity are used interchangeably herein and refer to enzymes that are capable of catalyzing the conversion of cholesta-8-enol to cholesta-7-enol and/or zymosterol to cholesta-7,24-dienol. In yeast, this enzyme is encoded by erg2. A preferred ERG2 homolog for use in the modified host cells of the present invention is a polypeptide that is at least 41%, such as at least 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80 , 90, 92, 95, 98 or up to 100% identical to SEQ ID NO: 5 and exhibits C-8 sterolysomerase activity, and the polynucleotides encoding such polypeptide are derived from Ustilago maydis. Preferably, 1 or more copies of at least type 1, 2, 3, 5 of a given ERG2 homolog as defined herein are expressed in the modified host cells.

Термины С-5-стеролдесатураза, фермент, обладающий активностью С-5-стеролдесатуразы применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к ферментам, которые способны катализировать превращение холеста-8-енола в холеста-7,24-диенол и/или холеста-7-енола в холеста-5,7,24-триенол и/или 7DHC. У дрожжей этот фермент кодируется erg3. Предпочтительным гомологом ERG3 для применения в модифицированных клетках хозяина по настоящему изобретению является полипептид, который по меньшей мере на 45%, как-то, например, по меньшей мере на 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 или вплоть до 100% идентичен SEQ ID NO: 7 и проявляет активность С-5-стеролдесатуразы, а полинуклеотиды, кодирующие такой полипептид, получены из Pichia pastoris или Schizosaccharomyces pombe. Предпочтительно в модифицированных клетках хозяина экспрессируется 1 или несколько копий типа по меньшей мере 1, 2, 3, 5 данного гомолога ERG3, как определено здесь.The terms C-5-sterol desaturase, enzyme having C-5-sterol desaturase activity are used interchangeably herein and refer to enzymes that are capable of catalyzing the conversion of cholesta-8-enol to cholesta-7,24-dienol and/or cholesta-7-enol to cholesta-5,7,24-trienol and/or 7DHC. In yeast, this enzyme is encoded by erg3. A preferred ERG3 homolog for use in modified host cells of the present invention is a polypeptide that is at least 45%, such as at least 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 or up to 100% identical to SEQ ID NO: 7 and exhibits C-5-sterol desaturase activity, and the polynucleotides encoding such polypeptide are derived from Pichia pastoris or Schizosaccharomyces pombe. Preferably, 1 or more copies of at least type 1, 2, 3, 5 of a given ERG3 homologue as defined herein are expressed in the modified host cells.

Термины идентичность последовательностей, % идентичности применяются здесь взаимозаменяемо. В целях настоящего изобретения устанавливается, что для определения степени идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот эти последовательности совмещают с целью оптимального сравнения. Для оптимального совмещения двух последовательностей можно вводить пробелы в любые из двух сравниваемых последовательностей. ТакоеThe terms sequence identity, % identity are used interchangeably here. For the purposes of the present invention, it is stated that in order to determine the degree of identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, these sequences are combined for the purpose of optimal comparison. To optimally match two sequences, you can introduce spaces in any of the two sequences being compared. This

- 4 045282 совмещение может проводиться по всей длине сравниваемых последовательностей. С другой стороны, совмещение может проводиться и по меньшей длине, к примеру, по 20, по 50, по 100 и более оснований/нуклеотидов или аминокислот. Идентичность последовательностей составляет процент идентичных совпадений между двумя последовательностями по приведенному совмещенному участку. Степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить по алгоритму Needleman-Wunsch для совмещения двух последовательностей (Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). По этому алгоритму можно совмещать и аминокислотные последовательности, и нуклеотидные последовательности. Алгоритм Needleman-Wunsch встроен в компьютерную программу NEEDLE. В настоящем изобретении использовалась программа NEEDLE из пакета EMBOSS (версия 2.8.0 или выше, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16(6), pp. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Для белковых последовательностей в качестве матрицы замен используется EBLOSUM62. Для нуклеотидных последовательностей используется EDNAFULL. Оптимальные параметры - пеня за открытый пробел = 10 и пеня за расширение пробела = 0,5. Квалифицированным специалистам должно быть понятно, что все эти различные параметры будут давать несколько разные результаты, но общая степень идентичности двух последовательностей существенно не изменится при использовании разных алгоритмов.- 4 045282 alignment can be carried out along the entire length of the compared sequences. On the other hand, the combination can be carried out over a shorter length, for example, 20, 50, 100 or more bases/nucleotides or amino acids. Sequence identity is the percentage of identical matches between two sequences over a given matched region. The degree of sequence identity between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences can be determined by the Needleman-Wunsch algorithm for aligning two sequences (Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Using this algorithm, both amino acid sequences and nucleotide sequences can be combined. The Needleman-Wunsch algorithm is built into the NEEDLE computer program. The present invention used the NEEDLE program from the EMBOSS package (version 2.8.0 or higher, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16(6), pp. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). For protein sequences, EBLOSUM62 is used as the substitution matrix. For nucleotide sequences, EDNAFULL is used. The optimal parameters are penalty for open space = 10 and penalty for expanding space = 0.5. It will be appreciated by those skilled in the art that each of these different parameters will produce slightly different results, but the overall degree of identity between the two sequences will not change significantly when different algorithms are used.

После совмещения при помощи программы NEEDLE, как описано выше, рассчитывается степень идентичности между запрашиваемой последовательностью и последовательностью по изобретению следующим образом: количество соответствующих положений при совмещении, проявляющих идентичные аминокислоты либо идентичные нуклеотиды в обеих последовательностях, делится на общую длину совмещения за вычетом общего количества пробелов в совмещении. Идентичность, как определено здесь, можно получить из NEEDLE при помощи опции NOBRIEF, она отмечена на выходе программы как идентичность по наибольшей длине. Если обе сравниваемые аминокислотные последовательности не отличаются ни по одной аминокислоте, то они одинаковы или идентичны на 100%. Что касается ферментов, происходящих из растений, как определено здесь, то специалистам должно быть известно, что ферменты растительного происхождения могут содержать наводящий сигнал хлоропластов, который отщепляется определенными ферментами, такими, например, как ферменты процессинга хлоропластов (СРЕ).After alignment using the NEEDLE program as described above, the degree of identity between the query sequence and the sequence of the invention is calculated as follows: the number of matching positions in the alignment exhibiting identical amino acids or identical nucleotides in both sequences is divided by the total length of the alignment minus the total number of gaps in combination. The identity as defined here can be obtained from NEEDLE using the NOBRIEF option and is marked in the program output as the longest identity. If both amino acid sequences being compared do not differ in any amino acid, then they are the same or 100% identical. With respect to plant-derived enzymes as defined herein, those skilled in the art will be aware that plant-derived enzymes may contain a chloroplast guidance signal that is cleaved off by certain enzymes, such as chloroplast processing enzymes (CPEs).

Ферменты/гомологи ARE2 и ARE1, как определено здесь, также охватывают ферменты, несущие аминокислотные замены, которые не изменяют активность фермента, т.е. проявляют такие же свойства, как и ферменты дикого типа и катализируют ацилирование стеролов, как определено здесь. Такие мутации также называют молчащими мутациями, так как они не изменяют (ферментативную) активность ферментов, как описано здесь.ARE2 and ARE1 enzymes/homologs, as defined here, also encompass enzymes bearing amino acid substitutions that do not alter enzyme activity, i.e. exhibit the same properties as the wild-type enzymes and catalyze the acylation of sterols as defined here. Such mutations are also called silent mutations since they do not change the (enzymatic) activity of the enzymes as described here.

В настоящем изобретении термин удельная активность или активность в отношении ферментов означает их каталитическую активность, то есть способность катализировать образование продукта из данного субстрата. Удельная активность определяется количеством потребленного субстрата и/или образовавшегося продукта за определенный период времени на определенное количество белка при определенной температуре. Как правило, удельная активность выражается в мкмолях израсходованного субстрата или образовавшегося продукта за 1 минуту на мг белка. Обычно мкмоль/мин обозначается сокращенно как U (= единица). Поэтому определения единицы удельной активности в мкмоль/мин/мг белка или U/мг белка применяются здесь взаимозаменяемым образом. Фермент активен, если он проявляет свою каталитическую активность in vivo, то есть внутри клеток хозяина, как определено здесь, или в подходящей (бесклеточной) системе в присутствии подходящего субстрата. Специалистам известно, как измеряется активность ферментов, типа, например, методом HPLC.In the present invention, the term specific activity or activity for enzymes means their catalytic activity, that is, the ability to catalyze the formation of a product from a given substrate. Specific activity is determined by the amount of substrate consumed and/or product formed over a certain period of time for a certain amount of protein at a certain temperature. Typically, specific activity is expressed in µmol of substrate consumed or product formed in 1 minute per mg of protein. Typically, µmol/min is abbreviated as U (= unit). Therefore, the specific activity unit definitions of μmol/min/mg protein or U/mg protein are used interchangeably here. An enzyme is active if it exhibits its catalytic activity in vivo, that is, inside host cells as defined herein, or in a suitable (cell-free) system in the presence of a suitable substrate. Those skilled in the art know how enzyme activity is measured, such as, for example, by HPLC.

В настоящем изобретении подразумевается, что организмы, как-то, например, микроорганизмы, грибы, водоросли или растения также включают синонимы или базонимы таких видов, обладающие такими же физиологическими свойствами, как определено Международным кодексом номенклатуры прокариот или Международным кодексом номенклатуры водорослей, грибов и растений (Мельбурнский кодекс).In the present invention, it is intended that organisms such as microorganisms, fungi, algae or plants also include synonyms or bazoonyms for such species having the same physiological properties as defined by the International Code of Nomenclature of Prokaryotes or the International Code of Nomenclature of Algae, Fungi and Plants (Melbourne Code).

В частности, в настоящем изобретении представлены следующие воплощения.In particular, the present invention provides the following embodiments.

1. Модифицированный фермент, обладающий стерол-ацилтрансферазной активностью, содержащий одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих остаткам, выбранным из 592 и/или 595 в полипептиде по SEQ ID NO: 1, предпочтительно замен, соответствующих F592L и/или G595D.1. A modified enzyme having sterol acyltransferase activity, containing one or more amino acid substitutions at positions corresponding to residues selected from residues 592 and/or 595 in the polypeptide of SEQ ID NO: 1, preferably substitutions corresponding to F592L and/or G595D.

2. Модифицированный фермент, как определено здесь и по п.1, катализирующий эстерификацию стеролов, содержащих 7-дегидрохолестерин (7-DHC) и зимостерол, причем соотношение 7-DHC к зимостеролу в сложных эфирах стеролов повышается по меньшей мере на 15% по сравнению с соотношением 7-DHC к зимостеролу при катализе с использованием соответствующего немодифицированного фермента.2. A modified enzyme as defined herein and in claim 1, catalyzing the esterification of sterols containing 7-dehydrocholesterol (7-DHC) and zymosterol, wherein the ratio of 7-DHC to zymosterol in the sterol esters is increased by at least 15% over with the ratio of 7-DHC to zymosterol catalyzed using the appropriate unmodified enzyme.

3. Модифицированный фермент, как определено здесь и по п.1 или 2, при этом аминокислотная замена выбрана из G595D.3. A modified enzyme as defined herein and in claim 1 or 2, wherein the amino acid substitution is selected from G595D.

4. Клетки хозяина, предпочтительно дрожжевые, более предпочтительно вырабатывающих стеролы4. Host cells, preferably yeast, more preferably producing sterols

- 5 045282 дрожжей, еще более предпочтительно дрожжей, вырабатывающих холестерин, содержащие модифицированный фермент, как определено здесь и по п.1, 2 или 3.- 5 045282 yeast, even more preferably cholesterol producing yeast, containing a modified enzyme as defined herein and according to claim 1, 2 or 3.

5. Клетки хозяина, как определено здесь и по п.4, которые применяются для получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC и зимостерол, причем соотношение 7-DHC к зимостеролу повышается по меньшей мере на 15% по сравнению с клетками хозяина, экспрессирующими немодифицированный фермент.5. Host cells, as defined herein and in claim 4, which are used to produce a sterol mixture containing 7-DHC and zymosterol, wherein the ratio of 7-DHC to zymosterol is increased by at least 15% compared to host cells expressing unmodified enzyme.

6. Клетки хозяина, как определено здесь и по п.4 или 5, в которых инактивированы ERG5 и ERG6.6. Host cells, as defined herein and in claim 4 or 5, in which ERG5 and ERG6 are inactivated.

7. Клетки хозяина, как определено здесь и по п.4, 5 или 6, при этом клетки экспрессируют гетерологичный фермент, выбранный из ЕС 1.3.1.72, обладающий активностью стерол-Δ24-редуктазы, причем предпочтительно гетерологичный фермент происходит из растений или позвоночных, более предпочтительно из человека, свиньи, собаки, мыши, крысы, лошади или Danio rerio.7. Host cells as defined herein and in claim 4, 5 or 6, wherein the cells express a heterologous enzyme selected from EC 1.3.1.72 having sterol Δ24 reductase activity, wherein preferably the heterologous enzyme is derived from plants or vertebrates, more preferably human, pig, dog, mouse, rat, horse or Danio rerio.

8. Клетки хозяина, как определено здесь и по п.4, 5, 6 или 7, при этом клетки хозяина выбраны из группы, состоящей из Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula и Yarrowia, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp. или Yarrowia lipolytica.8. Host cells as defined herein and in claim 4, 5, 6 or 7, wherein the host cells are selected from the group consisting of Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula and Yarrowia, preferably Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp. , Pichia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp. or Yarrowia lipolytica.

9. Способ снижения содержания зимостерола в смеси стеролов, содержащей зимостерол и 7-DHC, включающий культивирование клеток хозяина, как определено здесь и по п.4, 5, 6, 7 или 8, в соответствующих условиях и необязательно выделение и/или очистку 7-DHC из смеси стеролов.9. A method of reducing the zymosterol content of a sterol mixture containing zymosterol and 7-DHC, comprising culturing host cells as defined herein and in claim 4, 5, 6, 7 or 8, under appropriate conditions and optionally isolating and/or purifying 7 -DHC from a mixture of sterols.

10. Способ повышения содержания 7-DHC в смеси стеролов, содержащей 7-DHC и зимостерол, включающий культивирование клеток хозяина, как определено здесь и по п.4, 5, 6, 7 или 8, в соответствующих условиях и необязательно выделение и/или очистку 7-DHC из смеси стеролов.10. A method of increasing the 7-DHC content of a sterol mixture containing 7-DHC and zymosterol, comprising culturing host cells as defined herein and in claim 4, 5, 6, 7 or 8, under appropriate conditions and optionally isolating and/or purification of 7-DHC from a mixture of sterols.

11. Способ получения 7-DHC, включающий ферментативное превращение ацетил-СоА в смесь стеролов, содержащую зимостерол и 7-DHC, используя клетки хозяина, как определено здесь и по п.4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, причем содержание 7-DHC в смеси стеролов составляет по меньшей мере 70%.11. A method for producing 7-DHC, comprising enzymatic conversion of acetyl-CoA into a sterol mixture containing zymosterol and 7-DHC, using host cells as defined herein and in claim 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, wherein the 7-DHC content of the sterol mixture is at least 70%.

12. Способ, как определено здесь и по п.11, при этом 7-DHC дополнительно превращается в витамин D3.12. The method as defined herein and in claim 11, wherein the 7-DHC is further converted to vitamin D3.

13. Способ, как определено здесь и по п.11 или 12, при этом 7-DHC дополнительно превращается в 25-гидроксивитамин D3.13. The method as defined herein and in claim 11 or 12, wherein the 7-DHC is further converted to 25-hydroxyvitamin D3.

14. Применение модифицированного фермента, как определено здесь и по п.1, 2 или 3, либо клеток хозяина, как определено здесь и по п.4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, в способе получения 7-DHC, причем 7-DHC выделяют из смеси стеролов, содержащей зимостерол и 7-DHC, а соотношение 7-DHC к зимостеролу повышается по меньшей мере на 15% по сравнению со способом с использованием соответствующего немодифицированного фермента и немодифицированных клеток хозяина, соответственно.14. Use of a modified enzyme as defined herein and claim 1, 2 or 3, or host cells as defined herein and claim 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, in a process for producing 7-DHC wherein 7-DHC is isolated from a sterol mixture containing zymosterol and 7-DHC, and the ratio of 7-DHC to zymosterol is increased by at least 15% compared to the method using the corresponding unmodified enzyme and unmodified host cells, respectively.

Следующие примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения никоим образом.The following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

ПримерыExamples

Пример 1. Основные методы, штаммы и плазмиды.Example 1. Basic methods, strains and plasmids.

Все основные процедуры молекулярной биологии и манипуляции с ДНК, описанные здесь, обычно проводили в соответствии с Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; или Ausubel et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York. Генотипы используемых штаммов S. cerevisiae и плазмиды перечислены в табл. 1 и 2. Вырабатывающий 7-DHC штамм Y2140 Saccharomyces cerevisiae конструировали, исходя из фонового штамма CEN.PK дикого типа. Этот штамм дикого трансформировали кассетой с поврежденным erg5, которая содержала оптимизированный по кодонам ген стерол-24-редуктазы из рыбки данио, фланкированный промотором PGK1 и терминатором CYC1, в сочетании с TRP1. После этого трансформировали кассетой с поврежденным erg6, которая содержала ген стерол-24-редуктазы из крыс, фланкированный промотором TDH3 и терминатором PGK1, в сочетании с LEU2. Все упомянутые штаммы являются МАТа и содержат гиперэкспрессируемую копию усеченного конститутивно активного гена HMG-CoA-редуктазы (tHMG1).All basic molecular biology procedures and DNA manipulations described here were routinely performed according to Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; or Ausubel et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York. The genotypes of the S. cerevisiae strains and plasmids used are listed in Table. 1 and 2. The 7-DHC-producing Saccharomyces cerevisiae strain Y2140 was constructed from the wild-type background strain CEN.PK. This wild strain was transformed with an erg5 disruption cassette that contained a codon optimized zebrafish sterol 24 reductase gene flanked by a PGK1 promoter and a CYC1 terminator in combination with TRP1. This was then transformed with an erg6 lesion cassette that contained the rat sterol 24 reductase gene, flanked by the TDH3 promoter and PGK1 terminator, in combination with LEU2. All mentioned strains are MATa and contain an overexpressed copy of a truncated constitutively active HMG-CoA reductase gene (tHMG1).

Таблица 1Table 1

Штаммы Saccharomyces cerevisiaeStrains of Saccharomyces cerevisiae

Y2159 Y2159 erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A::TDH3p-S24Rl-PGKlt-URA3 erg4A:: Hyg^R TDH3p-tHMGlerg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A::TDH3p-S24Rl-PGKlt-URA3 erg4A:: Hyg ^R TDH3p-tHMGl Классические и стандартные молекулярно-генетические методы Classical and standard molecular genetic methods Y2017 Y2017 erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3pS24R1-PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-AREl CYClt-LEU2 TDH3p-tHMGl erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3pS24R1-PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-AREl CYClt-LEU2 TDH3p-tHMGl Целенаправленная замена с помощью кассеты с LEU2 Targeted replacement using cassette with LEU2 Y2157 Y2157 erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3p-S24Rl -PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-arel F592L-CYC1 t-LEU2 TDH3p-tHMGl erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3p-S24Rl -PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-arel F592L-CYC1 t-LEU2 TDH3p-tHMGl Целенаправленная замена с помощью кассеты с LEU2 Targeted replacement using cassette with LEU2 Y2159 Y2159 erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3pS24R1-PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-arel G595D-CYClt-LEU2 TDH3p-tHMGl erg5A: :PGK1p-S24R2-CYCl t-TRPl erg6A:: TDH3pS24R1-PGK11- URA 3 erg4A: :PGK1p-Scer-arel G595D-CYClt-LEU2 TDH3p-tHMGl Целенаправленная замена с помощью кассеты с LEU2 Targeted replacement using cassette with LEU2

- 6 045282- 6 045282

Таблица 2table 2

Плазмиды, используемые для конструирования мутаций ARE. Scer означает Saccharomyces cerevisiaePlasmids used to construct ARE mutations. Scer stands for Saccharomyces cerevisiae

Плазмида Plasmid Основа The basis Вставка Insert Олиго или источник Oligo or source SEQ ID NO: SEQ ID NO: pHyD459 pHyD459 pHyD445 pHyD445 Scer-AREl Scer-AREl вставка LEU2 insert LEU2 рМВ7584 рМВ7584 pHyD459 pHyD459 Scer-arel F592L Scer-arel F592L МО10013 и МО10014, М010016иМ010017 MO10013 and MO10014, M010016 and M010017 16 и 17 19 и 20 16 and 17 19 and 20 рМВ7585 рМВ7585 pHyD459 pHyD459 Scer-arel G595D Scer-arel G595D МО10013 &МО10015 MO10013 &MO10015 16 и 18 16 and 18

Пример 2. Конструирование плазмиды pHyD459 с ARE1-WT.Example 2: Construction of plasmid pHyD459 with ARE1-WT.

ARE1 дикого типа (WT) S. cerevisiae синтезировали с помощью DNA2.0, включая сайт XbaI на 5’конце (TCTAGAACAAAatg...) и сайт PstI на З'-конце. Её клонировали в плазмиду с делецией erg4Δ::Hyg^Rпо уникальным сайтам XbaI и PstI. После этого использовали LEU2 для замены фрагмента HygR путем клонирования по KpnI-AgeI.Wild-type (WT) S. cerevisiae ARE1 was synthesized using DNA2.0, including an XbaI site at the 5' end (TCTAGAACAAAatg...) and a PstI site at the 3' end. It was cloned into a plasmid with a deletion of erg4Δ::Hyg ^R at the unique XbaI and PstI sites. LEU2 was then used to replace the HygR fragment by cloning at KpnI-AgeI.

Пример 3. Клонирование мутантных генов ARE1.Example 3. Cloning of mutant ARE1 genes.

Мутантный вариант рМВ7584 (F592L) ARE1 S. cerevisiae путем лигирования расщепленного BsrGIBsaI продукта ПЦР, полученного из ARE1 (праймеры по SEQ ID NO: 16 и 17), с двухцепочечным олигонуклеотидом, полученным при гибридизации SEQ ID NO: 19 и 20 с расщепленной BsrGI-PstI плазмидой pHyD459. Аналогичным образом получали мутантный вариант рМВ7585 (G595D) ARE1 S. cerevisiae путем лигирования расщепленного BsrGI-BsaI продукта ПЦР, полученного из ARE1 (праймеры по SEQ ID NO: 16 и 18), с двухцепочечным олигонуклеотидом, полученным при гибридизации SEQ ID NO: 21 и 22 с расщепленной BsrGI-PstI плазмидой pHyD459. Праймеры, а также другие используемые здесь последовательности приведены в перечне последовательностей.Mutant variant pMB7584 (F592L) of S. cerevisiae ARE1 by ligation of the BsrGIBsaI-digested PCR product obtained from ARE1 (primers according to SEQ ID NO: 16 and 17) with a double-stranded oligonucleotide obtained by hybridization of SEQ ID NO: 19 and 20 with the digested BsrGI- PstI plasmid pHyD459. In a similar manner, the S. cerevisiae ARE1 mutant pMB7585 (G595D) was prepared by ligating the BsrGI-BsaI digested PCR product obtained from ARE1 (primers SEQ ID NO: 16 and 18) with a double-stranded oligonucleotide obtained by hybridization of SEQ ID NO: 21 and 22 with BsrGI-PstI-digested plasmid pHyD459. Primers, as well as other sequences used herein, are given in the sequence listing.

Пример 4. Введение ARE1 WT и мутантных генов в Saccharomyces cerevisiae. Для проверки влияния мутантных генов ARE1 на продукцию 7-DHC в сравнении с геном WT, трансформировали штамм Y2140 тремя различными конструкциями:Example 4: Introduction of ARE1 WT and mutant genes into Saccharomyces cerevisiae. To test the effect of mutant ARE1 genes on 7-DHC production in comparison with the WT gene, strain Y2140 was transformed with three different constructs:

1) Sail-фрагмент плазмиды pHyD459, который представляет собой конструкцию с поврежденным erg4, несущую ген ARE1 WT под контролем промотора PGK1, а также LEU2;1) Sail fragment of plasmid pHyD459, which is a construct with damaged erg4, carrying the ARE1 WT gene under the control of the PGK1 promoter, as well as LEU2;

2) Sail-фрагмент плазмиды рМВ7584, который представляет собой конструкцию с поврежденным erg4, несущую ген ARE1 F592L под контролем промотора PGK1, а также LEU2;2) Sail fragment of plasmid pMB7584, which is a construct with damaged erg4, carrying the ARE1 F592L gene under the control of the PGK1 promoter, as well as LEU2;

3) Sail-фрагмент плазмиды рМВ7585, который представляет собой конструкцию с поврежденным erg4, несущую ген ARE1 G595D под контролем промотора PGK1, а также LEU2.3) Sail fragment of plasmid рМВ7585, which is a construct with damaged erg4, carrying the ARE1 G595D gene under the control of the PGK1 promoter, as well as LEU2.

Отбирали трансформантов на минимальной среде при 30°C и проверяли их на чувствительность к гигромицину. Штаммы, полученные из этих трансформантов, приведены выше в табл. 1. Эти штаммы впоследствии анализировали на продуктивность по 7-DHC и общую чистоту стерола 7-DHC, как описано ниже в примере 5.Transformants were selected on minimal medium at 30°C and tested for sensitivity to hygromycin. The strains obtained from these transformants are given in Table 1 above. 1. These strains were subsequently analyzed for 7-DHC productivity and total 7-DHC sterol purity as described below in Example 5.

Пример 5. Анализ стеролов в мутантных штаммах ARE по HPLC.Example 5 HPLC analysis of sterols in ARE mutant strains.

Исследуемые штаммы сначала высеивали на агар с YPD и инкубировали в течение 48 часов при 30°C. Из этих чашек инокулировали предварительные культуры в 2 мл YPD и инкубировали на круговой качалке в течение 24 часов при 30°C. Из предварительных культур вносили в 24-луночный планшет 0,8 мл YPD + 10 г/л этанола до конечного значения OD₆₀₀ = 0,5. Планшеты инкубировали при 30°C в увлажненной атмосфере со встряхиванием при 800 об/мин на качалке с размахом 3 мм. Через 24 и 48 часов после инокуляции в каждую лунку добавляли 16 мкл этанола в качестве подпитки. Через 72 часа после инокуляции отбирали образцы клеток на содержание стеролов.The test strains were first plated on YPD agar and incubated for 48 hours at 30°C. From these plates, pre-cultures were inoculated in 2 ml YPD and incubated on a circular shaker for 24 hours at 30°C. From the preliminary cultures, 0.8 ml of YPD + 10 g/l of ethanol was added to a 24-well plate to a final value of OD ₆₀₀ = 0.5. The plates were incubated at 30°C in a humidified atmosphere with shaking at 800 rpm on a shaker with a swing of 3 mm. At 24 and 48 hours after inoculation, 16 μL of ethanol was added to each well as feed. 72 hours after inoculation, cell samples were collected for sterol content.

Для экстракции стеролов из культур вносили пипеткой 80 мкл цельного бульона в пробирки Precellys на 2 мл со стеклянными шариками. Добавляли 800 мкл омыляющего раствора (5% KOH в этаноле), помещали образцы в гомогенизатор Precellys 24 и перемешивали при 6500 об/мин за 3 цикла по 15 сек на цикл. Затем добавляли 60 мкл ледяной уксусной кислоты и центрифугировали пробирки в течение 1 мин при максимальной скорости. Супернатанты анализировали методом HPLC на содержание стеролов (см. табл. 3).To extract sterols from cultures, 80 μL of whole broth was pipetted into 2 mL Precellys tubes with glass beads. Add 800 µl of saponification solution (5% KOH in ethanol), place the samples in a Precellys 24 homogenizer and mix at 6500 rpm for 3 cycles of 15 sec per cycle. Then, 60 μl of glacial acetic acid was added and the tubes were centrifuged for 1 min at maximum speed. The supernatants were analyzed by HPLC for sterol content (see Table 3).

- 7 045282- 7 045282

Таблица 3Table 3

Соотношения между 7-DHC и выбранными промежуточными стеролами в контрольных и мутантных штаммах ARE1 и/или ARE2. Лано-/лато означает смесь ланостерола и латостерола, а зим означает зимостерол. П,ифры отражают содержание стеролов в мг/млRatios between 7-DHC and selected sterol intermediates in control and ARE1 and/or ARE2 mutant strains. Lano-/lato means a mixture of lanosterol and lathosterol, and zim means zymosterol. Numbers reflect the sterol content in mg/ml

Мутант Mutant 7-DHC 7-DHC Лано/ лато Lano/ lato Холеста8-енол Cholesta8-enol Зим Zim Соотношение 7-DHC к зим Ratio of 7-DHC to winter Соотношение 7-DHC к лано/лато Ratio of 7-DHC to lano/lato ARE1 wt ARE1 wt 1060 1060 70 70 99 99 92 92 12 12 15 15 Are2-F624L Are2-F624L 1090 1090 35 35 122 122 80 80 14 14 31 31 Are2-G627D Are2-G627D 1141 1141 50 50 140 140 82 82 14 14 23 23 Arel-F592L Arel-F592L 1240 1240 62 62 143 143 105 105 14 14 20 20 Arel-G595D Arel-G595D 1448 1448 104 104 152 152 77 77 19 19 14 14

В результате скрининга различных мутантов Arel S. cerevisiae авторы изобретения обнаружили ряд вариантов Arel, которые при экспрессии продуцируют 7-DHC с большей общей продуктивностью, меньшим накоплением стероловых побочных продуктов (зимостерола, латостерола, ланостерола, холеста-8-енола и т.п.) или тем и другим.As a result of screening various Arel mutants of S. cerevisiae, the inventors discovered a number of Arel variants that, when expressed, produce 7-DHC with greater overall productivity, less accumulation of sterol by-products (zymosterol, lathosterol, lanosterol, cholesta-8-enol, etc. ) or both.

Claims

1. A modified enzyme having sterol acyltransferase activity selected from EC 2.3.1.26, containing one or more amino acid substitutions at positions corresponding to amino acid residues selected from 592 and/or 595 in a polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, where the amino acid at position 592 in the polypeptide SEQ ID NO: 1 or at the corresponding position of mammalian, yeast or plant sterol acyltransferase 1 (ARE1) is leucine, and/or the amino acid at position 595 in the polypeptide SEQ ID NO: 1 or at the corresponding position sterol α-acyltransferase 1 (ARE1) from mammals, yeast or plants is aspartic acid.

2. The modified enzyme according to claim 1, in which the amino acid substitution is selected from F592L and/or G595D.

3. A sterol-producing yeast cell containing and expressing a modified enzyme according to any one of claims 1 or 2.

4. Yeast cell according to claim 3, producing cholesterol.

5. Use of a yeast cell according to claim 3 or 4 to produce a mixture of sterols containing 7-DHC and zymosterol, where the ratio of 7-DHC to zymosterol is increased by at least 15% compared to a cell expressing the unmodified enzyme.

6. Yeast cell according to claim 3 or 4, in which endogenous genes expressing sterol desaturase C-22 (ERG5) and delta-(24)-sterol-C-methyltransferase (ERG6) are inactivated.

7. A yeast cell according to any one of claims 3, 4 or 6, which expresses a heterologous enzyme selected from EC 1.3.1.72 having sterol A24 reductase activity, preferably the heterologous enzyme being derived from plants or vertebrates.

8. A yeast cell according to any one of claims 3, 4, 6 or 7, which is selected from the group consisting of Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula and Yarrowia.

9. A method for reducing the zymosterol content in a sterol mixture containing zymosterol and 7-DHC, comprising cultivating a yeast cell according to any one of claims 3, 4, 6, 7 or 8 under appropriate conditions.

10. A method for increasing the content of 7-DHC in a sterol mixture containing 7-DHC and zymosterol, comprising cultivating a yeast cell according to any one of claims 3, 4, 6, 7 or 8 under appropriate conditions.

11. The method according to claim 9 or 10, further comprising isolating and/or purifying 7-DHC from a mixture of sterols.

12. A method for producing 7-DHC, including the enzymatic conversion of acetyl-CoA into a mixture of sterols containing zymosterol and 7-DHC, using a yeast cell according to any one of claims 3, 4, 6, 7 or 8, where the content of 7-DHC in the mixture sterols is at least 70%.

13. The method according to claim 12, where 7-DHC is additionally converted into vitamin D3.

14. The method according to claim 12 or 13, wherein 7-DHC is further converted into 25-hydroxyvitamin D3.

15. Use of a modified enzyme according to claim 1 or 2 in a method for producing 7-DHC, wherein said modified enzyme is expressed in a sterol-producing yeast cell, where 7DHC is isolated from a mixture of sterols containing zymosterol and 7-DHC, and where the ratio of 7-DHC to zymosterol is increased by at least 15% compared to a method using the corresponding unmodified enzyme expressed in the corresponding unmodified yeast cell.