EA045858B1 - STABILIZED SOLUBLE RSV F-PROTEINS BEFORE FUSION - Google Patents
STABILIZED SOLUBLE RSV F-PROTEINS BEFORE FUSION Download PDFInfo
- Publication number
- EA045858B1 EA045858B1 EA202191622 EA045858B1 EA 045858 B1 EA045858 B1 EA 045858B1 EA 202191622 EA202191622 EA 202191622 EA 045858 B1 EA045858 B1 EA 045858B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- protein
- seq
- prefusion
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 19
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 142
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 110
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 17
- 102200142660 rs7565275 Human genes 0.000 description 17
- 102220082314 rs863224177 Human genes 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 102220069695 rs794727722 Human genes 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 102220320732 rs1554306350 Human genes 0.000 description 7
- 102200083206 rs80338798 Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 238000000959 Cochran–Mantel–Haenszel (CMH) test Methods 0.000 description 1
- 102100028712 Cytosolic purine 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000201835 Froelichia floridana Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000879777 Lynx rufus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- -1 for example Chemical class 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области медицины. Изобретение относится, в частности, к рекомбинантным F-белкам RSV до слияния и путям их применения, например в вакцинах.The invention relates to the field of medicine. The invention relates in particular to recombinant prefusion RSV F proteins and methods for their use, for example in vaccines.
Предпосылки к созданию изобретенияPrerequisites for creating an invention
Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является высококонтагиозным патогеном, вызывающим инфекции дыхательных путей у детей, который, как полагают, является причиной ~200000 летальных исходов среди детей ежегодно. У детей младше 2 лет на инфекции, вызванные RSV, приходится примерно 50% случаев госпитализации вследствие инфекций дыхательных путей, причем наибольшее количество случаев госпитализации имеет место в возрасте 2-4 месяца. Сообщалось, что почти все дети перенесут инфекцию, вызванную RSV, к возрасту двух лет, при этом повторное инфицирование на протяжении жизни связывают с пониженным врожденным иммунитетом. У пожилых людей тяжесть заболевания, вызванного RSV, является схожей с тяжестью заболеваний в результате инфекций, вызванных вирусом непандемического гриппа А.Respiratory syncytial virus (RSV) is a highly contagious pathogen that causes respiratory tract infections in children and is believed to be responsible for ~200,000 deaths among children annually. In children <2 years of age, RSV infections account for approximately 50% of hospitalizations due to respiratory tract infections, with the highest number of hospitalizations occurring between 2 and 4 months of age. It has been reported that almost all children will experience RSV infection by the age of two years, and re-infection throughout life has been associated with decreased innate immunity. In older adults, the severity of disease caused by RSV is similar to that resulting from infections caused by non-pandemic influenza A virus.
Для инфицирования клетки-хозяина RSV, подобно другим оболочечным вирусам, таким как вирус гриппа и HIV, требуется слияние вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Что касается RSV, то консервативный белок слияния (F-белок RSV) сливает вирусную мембрану и клеточную мембрану клетки-хозяина. В современных моделях на основе исследований парамиксовирусов F-белок RSV изначально уложен в конформацию до слияния. Метастабильная структура была выяснена лишь недавно в комплексе со стабилизирующим Fab-фрагментом нейтрализующего антитела (McLellan et al., Science 340 (6136): 1113-7, 2013). Во время входа в клетку, конформация до слияния претерпевает рефолдинг и конформационные изменения по сравнению с ее конформацией после слияния (McLellan, J. Virol 85(15):7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108 (23) :9619-24, 2011). Таким образом, F-белок RSV представляет собой метастабильный белок, который управляет слиянием мембран путем сочетания необратимого рефолдинга белка с соприкосновением мембран с помощью исходного фолдинга в метастабильную форму (конформация до слияния), которая в дальнейшем претерпевает дискретные/стадийные конформационные изменения до конформации с более низкой энергией (конформация после слияния). Эти наблюдения позволяют предположить, что F-белок RSV до слияния и после слияния отличается в антигенном отношении (Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)). Очевидно, исходя из электронной микроскопии RSV-F, что существуют значительные структурные различия между тримером F до слияния и после слияния, которые недавно были подтверждены с помощью кристаллографии (McLellan J.S. et al. Science 340 (6136):1113-7 (2013) и McLellan J.S. et al. Science 342(6158): 592-8 (2013)), и было показано, что большинство нейтрализующих антител в сыворотке крови RSV-положительных индивидуумов связывают с F до слияния (Ngwuta et. al., Science Translational Medicine, 7(309): 309ra162, 1-9).To infect a host cell, RSV, like other enveloped viruses such as influenza and HIV, requires fusion of the viral membrane with the host cell membrane. For RSV, a conserved fusion protein (RSV F protein) fuses the viral membrane and the host cell membrane. In current models based on studies of paramyxoviruses, the RSV F protein is initially folded into a prefusion conformation. The metastable structure was only recently elucidated in complex with a stabilizing Fab fragment of a neutralizing antibody (McLellan et al., Science 340 (6136): 1113-7, 2013). During cell entry, the prefusion conformation undergoes refolding and conformational changes compared to its postfusion conformation (McLellan, J. Virol 85(15):7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108(23):9619-24, 2011). Thus, the RSV F protein is a metastable protein that drives membrane fusion by coupling irreversible protein refolding with membrane apposition via initial folding into a metastable form (prefusion conformation), which subsequently undergoes discrete/stepwise conformational changes to a conformation with more low energy (post-fusion conformation). These observations suggest that the prefusion and postfusion RSV F protein is antigenically different (Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)). It is apparent from electron microscopy of RSV-F that there are significant structural differences between the prefusion and postfusion F trimer, which have recently been confirmed by crystallography (McLellan J.S. et al. Science 340 (6136):1113-7 (2013) and McLellan J.S. et al. Science 342(6158): 592-8 (2013)), and the majority of neutralizing antibodies in the serum of RSV-positive individuals have been shown to bind to prefusion F (Ngwuta et. al., Science Translational Medicine, 7(309): 309ra162, 1-9).
Вакцины против инфекции, вызванной RSV, в настоящее время не существует, хотя она и является очень востребованной. Кандидаты вакцин на основе F-белка RSV оказались неэффективными вследствие проблем, например, связанных со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью и эффективностью. Как указывалось выше, кристаллические структуры выявили значительное конформационное изменение между состояниями до слияния и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния, будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиловидного отростка до слияния на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредоточивались на разработке вакцин, которые содержат формы F-белка RSV до слияния (см., например, WO 20101149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). Однако, эти усилия не дали стабильных F-белков RSV до слияния, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для тестирования у людей.There is currently no vaccine against RSV infection, although it is in high demand. RSV F protein vaccine candidates have failed due to issues such as stability, purity, reproducibility, and efficacy. As stated above, the crystal structures revealed a significant conformational change between the prefusion and postfusion states. The magnitude of the rearrangement suggested that only a subset of antibodies directed to the postfusion conformation of RSV-F would be capable of cross-reacting with the native prefusion styloid conformation on the viral surface. Accordingly, efforts to obtain a vaccine against RSV have focused on developing vaccines that contain prefusion forms of the RSV F protein (see, for example, WO 20101149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). However, these efforts did not produce stable prefusion RSV F proteins that could be used as candidates for testing in humans.
Следовательно, сохраняется потребность в эффективных вакцинах и способах вакцинации против RSV, в частности предусматривающих F-белки RSV в конформации до слияния. Целями настоящего изобретения являются получение таких вакцин и способы вакцинации против RSV безопасным и эффективным способом.Therefore, there remains a need for effective RSV vaccines and vaccination methods, particularly those containing RSV F proteins in a prefusion conformation. The objects of the present invention are to provide such vaccines and methods of vaccination against RSV in a safe and effective manner.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение предусматривает стабильные рекомбинантные белки слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, т. е. рекомбинантные F-белки RSV в растворимой форме (т. е. не связанные с мембраной), которые являются стабилизированными в конформации до слияния, где F-белок RSV содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 или их фрагментов.The present invention provides stable recombinant prefusion respiratory syncytial virus (RSV) fusion (F) proteins, i.e., recombinant RSV F proteins in soluble form (i.e., not membrane bound) that are stabilized in a prefusion conformation, wherein the RSV F protein contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 or fragments thereof.
В некоторых вариантах осуществления F-белки RSV или их фрагменты содержат по меньшей мере один эпитоп, который является специфическим для F-белка в конформации до слияния, где по меньшей мере один эпитоп распознается моноклональным антителом, специфичным в отношении конформации до слияния, содержащим CDR1-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5, CDR3-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6 и CDR1-область легкой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-область легкой цепи с SEQ ID NO: 8 и CDR3-область легкой цепи с SEQ ID NO: 9, и/или моноклональным антителом, специфичным в отношении конформации до слияния, содержащим CDR1-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11, CDR3-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12 и CDRl-область легкой цепи с SEQ ID NO: 13, CDR2-область легкой цепи с SEQIn some embodiments, the RSV F proteins or fragments thereof contain at least one epitope that is specific for the F protein in the prefusion conformation, wherein the at least one epitope is recognized by a monoclonal antibody specific for the prefusion conformation containing CDR1- heavy chain region with SEQ ID NO: 4, CDR2 heavy chain region with SEQ ID NO: 5, CDR3 heavy chain region with SEQ ID NO: 6 and CDR1 light chain region with SEQ ID NO: 7, CDR2 light chain region chains with SEQ ID NO: 8 and a light chain CDR3 region with SEQ ID NO: 9, and/or a monoclonal antibody specific for prefusion conformation containing a heavy chain CDR1 region with SEQ ID NO: 10, a heavy chain CDR2 region chains with SEQ ID NO: 11, heavy chain CDR3 region with SEQ ID NO: 12 and light chain CDRl region with SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 region with SEQ
- 1 045858- 1 045858
ID NO: 14 и CDR3-область легкой цепи с SEQ ID NO: 15.ID NO: 14 and light chain CDR3 region of SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах осуществления F-белки RSV являются тримерными.In some embodiments, the RSV F proteins are trimeric.
Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие Fбелки RSV до слияния или их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding prefusion RSV F proteins or fragments thereof in accordance with the present invention and vectors containing such nucleic acid molecules.
Настоящее изобретение также относится к композициям, предпочтительно иммуногенным композициям, содержащим указанный F-белок RSV до слияния (или его фрагменты), молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный F-белок RSV до слияния, а также к их применению в индуцировании иммунного ответа к F-белку RSV, в частности их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа против респираторного синцитиального вируса (RSV), предусматривающим введение субъекту эффективного количества Fбелка RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный F-белок RSV, и/или вектор, содержащий молекулу указанной нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки нейтрализующих антител к F-белку респираторного синцитиального вируса (RSV), предусматривающему введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-белок RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный F-белок RSV, и/или вектор, содержащий молекулу указанной нуклеиновой кислоты.The present invention also relates to compositions, preferably immunogenic compositions, containing said pre-fusion RSV F protein (or fragments thereof), a nucleic acid molecule encoding said pre-fusion RSV F protein, and their use in inducing an immune response to F-protein. protein of RSV, in particular their use as a vaccine. The present invention also provides methods for inducing an immune response against respiratory syncytial virus (RSV) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of a prefusion RSV F protein, a nucleic acid molecule encoding said RSV F protein, and/or a vector containing said nucleic acid molecule . Preferably, the induced immune response is characterized by the production of neutralizing antibodies to RSV and/or protective immunity against RSV. In specific aspects, the present invention relates to a method of inducing in a subject the production of neutralizing antibodies to the F protein of respiratory syncytial virus (RSV), comprising administering to the subject an effective amount of an immunogenic composition comprising a prefusion RSV F protein, a nucleic acid molecule encoding said F protein RSV, and/or a vector containing a molecule of said nucleic acid.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1. Схематическое представление вариантов F-белка RSV. SCDM - одноцепочечный двойной мутант, SCTM - одноцепочечный тройной мутант, PRQM - преобразованный четверной мутант, и PRPM - преобразованный пента-мутант. Секретируемые белки представлены без сигнального пептида и фрагмента р27. Показаны домены F1 и F2, а также пептид слияния (FP), домен тримеризации фибритина (фолдон) и линкер в одноцепочечных белках между F2 и F1 (GSGSG). Три стабилизирующих мутации (N67I, S215P и D386N) (черные ромбы). Две мутации для улучшения антигенного соответствия циркулирующим штаммам (К66Е и I76V) (серые ромбы). Положение остатка пронумеровано, как и полноразмерный белок дикого типа, в том числе сигнальный пептид.Fig. 1. Schematic representation of RSV F protein variants. SCDM is a single-stranded double mutant, SCTM is a single-stranded triple mutant, PRQM is a converted quadruple mutant, and PRPM is a converted penta-transformed mutant. Secreted proteins are presented without the signal peptide and the p27 fragment. The F1 and F2 domains are shown, as well as the fusion peptide (FP), the fibritin trimerization domain (foldon), and the linker in single-chain proteins between F2 and F1 (GSGSG). Three stabilizing mutations (N67I, S215P and D386N) (black diamonds). Two mutations to improve antigenic match to circulating strains (K66E and I76V) (gray diamonds). The position of the residue is numbered as is the full-length wild-type protein, including the signal peptide.
Фиг. 2. Уровни экспрессии белка и стабильность до слияния преобразованных вариантов PR-A2 Fбелка RSV со множественными аминокислотными заменами. Уровни экспрессии белка в супернатантах клеточной культуры тестировали через 72 часа после трансфекции с помощью способа количественного октета (Q-Octet) с использованием CR9501 и CR9503 (полосы слева) и фракцией F-белка RSV, связывающегося со специфическим антителом CR9501 до слияния, в день сбора и после хранения при 4°С в течение указанного периода времени (полосы справа). Полосы представляют среднее значение от 2-4 измерений, линии представляют диапазон значений.Fig. 2. Protein expression levels and prefusion stability of transformed RSV PR-A2 F protein variants with multiple amino acid substitutions. Protein expression levels in cell culture supernatants were tested 72 hours after transfection using the quantitative octet (Q-Octet) method using CR9501 and CR9503 (lanes on the left) and the fraction of RSV F protein binding to the specific antibody CR9501 before fusion on the day of collection and after storage at 4°C for the indicated period of time (bars on the right). The bars represent the average of 2-4 measurements, the lines represent the range of values.
Фиг. 3. Значения температуры плавления (Tm) очищенных F-белков RSV. Каждое измерение представлено точкой.Fig. 3. Melting temperature (Tm) values of purified RSV F proteins. Each dimension is represented by a point.
Фиг. 4. Замены аминокислот К66Е и I76V не оказывали эффекта в отношении уровней экспрессии F-белка и стабильности до слияния. Уровни экспрессии белка в супернатантах клеточной культуры тестировали через 96 часов после трансфекции с помощью способа Q-Octet с использованием CR9501 и CR9503 (полосы слева) и фракцией F-белка RSV, связывающегося со специфическим антителом CR9501 до слияния, в день сбора и после хранения при 4°С в течение указанного периода времени (полосы справа). Полосы представляют среднее значение от 2 измерений, линии представляют диапазон значений.Fig. 4. Amino acid substitutions K66E and I76V had no effect on F protein expression levels and prefusion stability. Protein expression levels in cell culture supernatants were tested 96 hours after transfection using the Q-Octet method using CR9501 and CR9503 (left bars) and the fraction of RSV F protein binding to the specific antibody CR9501 before confluence, on the day of collection, and after storage at 4°C for the indicated period of time (bars on the right). The bars represent the average of 2 measurements, the lines represent the range of values.
Фиг. 5. Стабильность до слияния вариантов F-белка в супернатанте клеточной культуры СНО. Уровни экспрессии белков в супернатантах клеточной культуры тестировали через 96 часов после трансфекции с помощью способа Q-Octet с использованием CR9501 и CR9503 и фракцией F-белка RSV, связывающегося со специфическим антителом CR9501 до слияния, в день сбора и после хранения при 4°С в течение указанного периода времени. Полосы представляют среднее значение от 2 измерений, линии представляют диапазон значений. PRQM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е и I76V; PRPM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е, I76V и D486N.Fig. 5. Pre-fusion stability of F protein variants in CHO cell culture supernatant. Protein expression levels in cell culture supernatants were tested 96 hours after transfection using the Q-Octet method using CR9501 and CR9503 and a fraction of the RSV F protein binding to the specific antibody CR9501 before confluence, on the day of collection and after storage at 4°C at during the specified period of time. The bars represent the average of 2 measurements, the lines represent the range of values. PRQM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E and I76V; PRPM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E, I76V and D486N.
Фиг. 6. F-белки RSV по настоящему изобретению остаются инактными в супернатанте клеточной культуры СНО при рН 5. Значение рН супернатантов клеточной культуры, содержащих варианты Fбелка, доводили до рН 5 и образцы инкубировали в течение 7 дней с ингибиторами протеазы или без них. Образцы анализировали на SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. Первая полоса каждого геля представляет собой стандартный маркер молекулярной массы; указан размер стандартных белков. Образцы: 1 - образец в 0-й день; 2 - образец на 7-й день, инкубированный при 4°С; 3 - образец на 7-й день, инкубированный при 4°С с ингибиторами протеазы; 4 - образец на 0-й день; 5 - образец на 7-й день, инкубированный при комнатной температуре; 6 - образец на 7-й день, инкубированный при комнатной температуре с ингибиторами протеазы; 7 - образец на 0-й день; 8 - образец на 7-й день, инкубированный при 37°С; 9 - образец на 7-й день, инкубированный при 37°С с ингибиторами протеазы. В обработанных образцах белка нижняя полоса представляет домен F1, а верхняя полоса представляет частично обрабоFig. 6. The RSV F proteins of the present invention remain inactive in CHO cell culture supernatant at pH 5. The pH of cell culture supernatants containing F protein variants was adjusted to pH 5 and samples were incubated for 7 days with or without protease inhibitors. Samples were analyzed on SDS-PAGE under reducing conditions. The first band of each gel represents a standard molecular weight marker; The size of standard proteins is indicated. Samples: 1 - sample on day 0; 2 - sample on day 7, incubated at 4°C; 3 - sample on day 7, incubated at 4°C with protease inhibitors; 4 - sample on day 0; 5 - sample on day 7, incubated at room temperature; 6 - sample on day 7, incubated at room temperature with protease inhibitors; 7 - sample on day 0; 8 - sample on day 7, incubated at 37°C; 9 - sample on day 7, incubated at 37°C with protease inhibitors. In processed protein samples, the lower band represents the F1 domain and the upper band represents partially processed
- 2 045858 танный белок (F1+p27) или необработанный белок (F1+F2). В образце одноцепочечного белка полоса представляет домены F1+F2. PRQM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е и I76V; PRPM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е, I76V и D486N. LNR: K683-065.- 2 045858 tanned protein (F1+p27) or raw protein (F1+F2). In a single chain protein sample, the band represents the F1+F2 domains. PRQM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E and I76V; PRPM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E, I76V and D486N. LNR: K683-065.
Фиг. 7. Термостабильность F-белков RSV в супернатанте клеточной культуры СНО. Образцы супернатантов подвергали термообработке в течение 30 мин при значениях температуры 45-65°С. Количество белка до слияния в образце измеряли в ELISA с использованием антител CR9501. Значения нормализовали по необработанному образцу (20°С). Кривые показаны для каждого белка отдельно, а также наложение всех кривых (в правом нижнем углу). Каждая точка представляет воспроизводимое измерение. Два анализа проводили в 2 технических повторах для каждого. Кривые подбирали с использованием уравнения нелинейной регрессии с переменным наклоном (GraphPad Prism); при этом значения температуры плавления (Tm) рассчитывали как значения IC50. PRQM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е и I76V; PRPM - PR-A2 с N67I, S215P, К66Е, I76V и D486N.Fig. 7. Thermal stability of RSV F proteins in the supernatant of CHO cell culture. Supernatant samples were subjected to heat treatment for 30 min at temperatures of 45-65°C. The amount of prefusion protein in the sample was measured in an ELISA using CR9501 antibody. Values were normalized to the untreated sample (20°C). Curves are shown for each protein separately, as well as an overlay of all curves (lower right corner). Each dot represents a reproducible measurement. Two analyzes were performed in 2 technical replicates each. Curves were fitted using a variable slope nonlinear regression equation (GraphPad Prism); melting temperature (Tm) values were calculated as IC50 values. PRQM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E and I76V; PRPM - PR-A2 with N67I, S215P, K66E, I76V and D486N.
Фиг. 8. Титры RSV в легких и носу через 5 дней после контрольного заражения с помощью А2 RSV. Титры RSV в легких (верхняя секция) и носу (нижняя секция) через 5 дней после контрольного заражения с помощью А2 RSV. Нижний уровень обнаружения (LOD) обозначен пунктирной линией. Средние титры (log10 БОЕ на грамм ткани) обозначены горизонтальными полосами. Адъювантные и неадъювантные группы PRPM сравнивали по дозе с помощью теста Кохрана-Мантеля-Хензеля, и статистические различия указаны на фигуре, i.m.: внутримышечный; i.n.: интраназальный.Fig. 8. RSV titers in the lungs and nose 5 days after challenge with A2 RSV. RSV titers in the lungs (top section) and nose (bottom section) 5 days after challenge with A2 RSV. The lower level of detection (LOD) is indicated by the dotted line. Mean titers (log10 PFU per gram of tissue) are indicated by horizontal bars. Adjuvant and non-adjuvant PRPM groups were compared by dose using the Cochran-Mantel-Haenszel test, and statistical differences are indicated in the figure, i.m.: intramuscular; i.n.: intranasal.
Фиг. 9. RSV-нейтрализующие титры против A Long RSV в сыворотке крови хлопковых крыс на 49й день после примирования. RSV-нейтрализующие титры (IC50 (log2)) против A Long RSV с использованием считывания на основе ELISA определяли в сыворотке крови хлопковых крыс на 49-й день после примирования. Среднее значение для каждой группы обозначено горизонтальной полосой. Предел обнаружения (LOD) установлен на 3.0 (log2 и обозначен пунктирной линией). Титры VNA, индуцированные адъювантным и неадъювантным PRPM, сравнивали по дозе с помощью ANOVA, и результаты показаны на фигуре. i.m.: внутримышечный; i.n.: интраназальный.Fig. 9. RSV-neutralizing titers against A Long RSV in the blood serum of cotton rats on the 49th day after priming. RSV neutralizing titers (IC50 (log 2 )) against A Long RSV using an ELISA-based readout were determined in the serum of cotton rats on day 49 postpriming. The mean for each group is indicated by a horizontal bar. The limit of detection (LOD) is set to 3.0 (log2 and is indicated by the dotted line). VNA titers induced by adjuvant and non-adjuvant PRPM were compared by dose using ANOVA, and the results are shown in the figure. im: intramuscular; in: intranasal.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) вовлечен в слияние вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. mRNA F-белка RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначенный F0, который содержит последовательность сигнального пептида из 26 аминокислот на N-конце, которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 расщепляется по двум сайтам (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) с помощью клеточных фурин-подобных протеаз в транс-Гольджи с удалением короткой гликозилированной вставочной последовательности (также обозначенной как область р27, содержащая аминокислотные остатки 110-136) и образованием двух доменов или субъединиц, обозначенных F1 и F2. Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, и С-конец содержит трансмембранную (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматическую области (аминокислотные остатки 551-574). Домен F2 (аминокислотные остатки 27109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.The fusion protein (F) of respiratory syncytial virus (RSV) is involved in the fusion of the viral membrane with the host cell membrane, which is required for infection. RSV F protein mRNA is translated into a 574 amino acid precursor protein designated F0, which contains a 26 amino acid signal peptide sequence at the N terminus that is removed by signal peptidase in the endoplasmic reticulum. F0 is cleaved at two sites (between amino acid residues 109/110 and 136/137) by cellular furin-like proteases in the trans-Golgi, removing a short glycosylated insertion sequence (also designated the p27 region containing amino acid residues 110-136) and producing two domains or subunits designated F1 and F2. The F1 domain (amino acid residues 137-574) contains a hydrophobic fusion peptide at its N-terminus, and the C-terminus contains the transmembrane (TM) (amino acid residues 530-550) and cytoplasmic regions (amino acid residues 551-574). The F2 domain (amino acid residues 27109) is covalently linked to F1 by two disulfide bridges. Heterodimers F1-F2 undergo assembly in the virion as homotrimers.
Вакцины против инфекции, вызванной RSV, в настоящее время не существует, хотя она и является очень востребованной. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является субъединичная вакцина на основе очищенного F-белка RSV. Однако для данного подхода требуется, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, которая подобна конформации F-белка RSV в состоянии до слияния и которая стабильна в течение продолжительного периода и может быть получена в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе субъединицы необходимо осуществить усечение Fбелка RSV путем делеции трансмембранной (ТМ) и цитоплазматической областей с получением растворимого секретируемого F-белка (sF). Поскольку область ТМ отвечает за заякоривание в мембране и тримеризацию, то незаякоренный растворимый F-белок является в значительной степени более лабильным, чем белок полной длины, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации до слияния, который демонстрирует высокие уровни экспрессии и высокую стабильность, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию до слияния.There is currently no vaccine against RSV infection, although it is in high demand. One potential vaccine approach is a subunit vaccine based on purified RSV F protein. However, this approach requires that the purified RSV F protein be in a conformation that is similar to the prefusion state of the RSV F protein and that is stable over an extended period and can be produced in sufficient quantities. In addition, a subunit vaccine requires truncation of the RSV F protein by deletion of the transmembrane (TM) and cytoplasmic regions to produce a soluble secreted F protein (sF). Because the TM region is responsible for membrane anchoring and trimerization, the unanchored soluble F protein is substantially more labile than the full-length protein and will readily refold to its final state after fusion. To obtain a soluble F protein in a stable prefusion conformation that exhibits high levels of expression and high stability, it is therefore necessary to stabilize the prefusion conformation.
Несколько мутаций, стабилизирующих F-белок RSV в конформации до слияния, ранее были описаны в WO 2014/174018 и WO 2014/202570. F-белки RSV в соответствии с настоящим изобретением содержат уникальное и специфическое подмножество мутаций, описанных ранее в комбинации с двумя другими мутациями. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что данная уникальная комбинация мутаций по настоящему изобретению приводит в результате к повышению уровней экспрессии F-белка RSV и стабильности конформации до слияния.Several mutations stabilizing the RSV F protein in a prefusion conformation were previously described in WO 2014/174018 and WO 2014/202570. The RSV F proteins of the present invention contain a unique and specific subset of mutations previously described in combination with two other mutations. In accordance with the present invention, it has been shown that this unique combination of mutations of the present invention results in increased levels of RSV F protein expression and prefusion conformation stability.
Настоящее изобретение, таким образом, предусматривает новые стабильные растворимые F-белки RSV до слияния, т. е. растворимые F-белки RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния, или их фрагменты. F-белки RSV в соответствии с настоящим изобретением содержат аминоThe present invention thus provides novel stable soluble prefusion RSV F proteins, ie, soluble RSV F proteins that are stabilized in a prefusion conformation, or fragments thereof. The RSV F proteins of the present invention contain amino
- 3 045858 кислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.- 3 045858 acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, была введена уникальная комбинация мутаций вместе с гетерологичным доменом тримеризации для получения указанных стабильных растворимых F-белков RSV до слияния. Стабильные F-белки RSV до слияния по настоящему изобретению находятся в конформации до слияния, т. е. они содержат (имеют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфическим для F-белка в конформации до слияния. Эпитоп, который является специфическим для F-белка в конформации до слияния, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не желая ограничиваться конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV до слияния может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на природных вирионах RSV, и таким образом может предоставлять преимущества для вызывания выработки защитных нейтрализующих антител.In the study that led to the present invention, a unique combination of mutations was introduced along with a heterologous trimerization domain to produce these stable, soluble prefusion RSV F proteins. The stable prefusion RSV F proteins of the present invention are in the prefusion conformation, i.e., they contain (have) at least one epitope that is specific for the F protein in the prefusion conformation. An epitope that is specific for the F protein in the prefusion conformation is an epitope that is not present in the postfusion conformation. Without wishing to be limited by theory, it is believed that the prefusion conformation of the RSV F protein may contain epitopes that are the same as those on the RSV F protein expressed on natural RSV virions and thus may provide advantages for inducing the production of protective neutralizing proteins. antibodies.
В некоторых вариантах осуществления F-белки RSV до слияния (или их фрагменты) по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается моноклональным антителом, специфичным в отношении конформации до слияния, содержащим CDR1-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5, CDR3-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6 и CDR1-область легкой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-область легкой цепи с SEQ ID NO: 8 и CDR3область легкой цепи с SEQ ID NO: 9 (далее в данном документе называемым CR9501), и/или моноклональным антителом, специфичным в отношении конформации до слияния, содержащим CDR1-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11, CDR3-область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12 и CDR1-область легкой цепи с SEQ ID NO: 13, CDR2-область легкой цепи с SEQ ID NO: 14 и CDR3-область легкой цепи с SEQ ID NO: 15 (называемым CR9502). CR9501 и CR9502 содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей и, таким образом, специфичности связывания антител 58С5 и 30D8 соответственно, которые, как было показано ранее, специфично связываются с Fбелком RSV в его конформации до слияния, а не в конформации после слияния (как раскрыто в WO 2012/006596).In some embodiments, the prefusion RSV F proteins (or fragments thereof) of the present invention contain at least one epitope that is recognized by a prefusion conformation-specific monoclonal antibody containing the heavy chain CDR1 region of SEQ ID NO: 4. CDR2 heavy chain region with SEQ ID NO: 5, CDR3 heavy chain region with SEQ ID NO: 6 and CDR1 light chain region with SEQ ID NO: 7, CDR2 light chain region with SEQ ID NO: 8 and CDR3 light chain region chain of SEQ ID NO: 9 (hereinafter referred to as CR9501), and/or a prefusion conformation-specific monoclonal antibody comprising a heavy chain CDR1 region of SEQ ID NO: 10, a heavy chain CDR2 region of SEQ ID NO: 11, heavy chain CDR3 region with SEQ ID NO: 12 and light chain CDR1 region with SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 region with SEQ ID NO: 14 and light chain CDR3 region with SEQ ID NO: 15 (called CR9502). CR9501 and CR9502 contain variable regions of the heavy and light chains and thus the binding specificities of antibodies 58C5 and 30D8, respectively, which have previously been shown to specifically bind to the RSV F protein in its prefusion conformation rather than its postfusion conformation (as disclosed in WO 2012/006596).
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные F-белки RSV до слияния являются тримерными.In some embodiments, the recombinant RSV F proteins are trimeric prior to fusion.
Как используется по всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5'- к 3'-концу, и аминокислотные последовательности представлены от N-конца к С-концу, как принято в данной области.As used throughout this application, nucleotide sequences are presented in a 5' to 3' direction, and amino acid sequences are presented from an N-terminus to a C-terminus, as is customary in the art.
Как указано выше, настоящим изобретением также охватываются фрагменты F-белка RSV до слияния. Фрагмент может представлять собой результат какой-либо одной или обеих из амино-терминальной (например, путем отщепления сигнальной последовательности) и карбокси-терминальной делеций. Может быть выбран такой фрагмент, который включает иммунологически активный фрагмент F-белка, т. е. часть, которая будет приводить к иммунному ответу у субъекта. Его можно легко определить с применением способов in silico, in vitro и/или in vivo, все из которых хорошо известны специалисту.As stated above, prefusion fragments of the RSV F protein are also covered by the present invention. The fragment may be the result of either or both of an amino-terminal (eg, by signal sequence cleavage) and carboxy-terminal deletion. The fragment may be selected to include an immunologically active portion of the F protein, ie, a portion that will lead to an immune response in the subject. It can be easily determined using in silico, in vitro and/or in vivo methods, all of which are well known to those skilled in the art.
В некоторых вариантах осуществления кодируемые белки в соответствии с настоящим изобретением содержат сигнальную последовательность, также называемую лидерной последовательностью или сигнальным пептидом, соответствующую аминокислотам 1-26 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Сигнальные последовательности обычно являются короткими (например, 5-30 аминокислот в длину) аминокислотными последовательностями, присутствующими на N-конце большинства вновь синтезированных белков, которые предназначены для секреторного пути и обычно отщепляются сигнальной пептидазой с образованием свободного сигнального пептида и зрелого белка.In some embodiments, the encoded proteins of the present invention comprise a signal sequence, also referred to as a leader sequence or signal peptide, corresponding to amino acids 1-26 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3. The signal sequences typically are short (eg, 5-30 amino acids in length) amino acid sequences present at the N-terminus of most newly synthesized proteins that are destined for the secretory pathway and are typically cleaved by signal peptidase to produce the free signal peptide and mature protein.
В некоторых вариантах осуществления белки в соответствии с настоящим изобретением не содержат сигнальную последовательность.In some embodiments, the proteins of the present invention do not contain a signal sequence.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие F-белки RSV до слияния или их фрагменты, в соответствии с настоящим изобретением.The present invention further provides nucleic acid molecules encoding prefusion RSV F proteins or fragments thereof, in accordance with the present invention.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие Fбелки RSV в соответствии с настоящим изобретением, являются кодон-оптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации кодонов известны и были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается кодоноптимизированной, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется в организме с меньшей частотой, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется в организме более часто, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, как, например, на сайте http://www.kazusa.or.jp/codon.In preferred embodiments, the nucleic acid molecules encoding the RSV F proteins of the present invention are codon optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells. Methods for codon optimization are known and have been described previously (eg WO 96/09378). A sequence is considered codon-optimized if at least one non-preferred codon is replaced by a codon that is more preferred than the wild-type sequence. As used herein, a non-preferred codon is a codon that is used less frequently in the body than another codon encoding the same amino acid, and a codon that is preferred is a codon that is used more frequently in the body than the codon , which is not preferred. The frequency of codon usage for a particular organism can be found in codon frequency tables, such as at http://www.kazusa.or.jp/codon.
Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являPreferably more than one non-preferred codon, preferably most or all of the non-preferred codons are replaced by codons that are
- 4 045858 ются более предпочтительными. Предпочтительно, в кодон-оптимизированной последовательности используют кодоны, наиболее часто используемые в организме. Как правило, замещение предпочтительными кодонами приводит к более высокой экспрессии.- 4 045858 are more preferable. Preferably, the codon-optimized sequence uses the codons most commonly used in the body. Generally, substitution with preferred codons results in higher expression.
Специалисту в данной области будет понятно, что несколько различных полинуклеотидов и молекул нуклеиновой кислоты могут кодировать один и тот же белок в результате вырожденности генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной области с помощью традиционных методик могут осуществлять нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность белка, кодируемую молекулами нуклеиновой кислоты, для отражения частоты использования кодонов в любом конкретном организме-хозяине, в котором белки будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, то выражение нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать в себя или могут не включать в себя интроны.One skilled in the art will appreciate that several different polynucleotides and nucleic acid molecules can encode the same protein as a result of the degeneracy of the genetic code. It is also understood that those skilled in the art, using conventional techniques, can make nucleotide substitutions that do not affect the protein sequence encoded by the nucleic acid molecules to reflect the frequency of codon usage in any particular host organism in which the proteins will be expressed. Therefore, unless specifically stated otherwise, the expression nucleotide sequence encoding an amino acid sequence includes all nucleotide sequences that are degenerate versions of each other and that encode the same amino acid sequence. Nucleotide sequences that encode proteins and RNA may or may not include introns.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo с помощью синтеза ДНК, который можно осуществлять с использованием стандартных процедур с участием компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).Nucleic acid sequences can be cloned using standard molecular biology techniques or obtained de novo through DNA synthesis, which can be performed using standard procedures involving companies providing DNA synthesis and/or molecular cloning services (e.g., GeneArt, GenScripts, Invitrogen , Eurofins).
В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты содержат нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 21, 22 или 23.In some embodiments, the nucleic acid molecules comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, 22, or 23.
Настоящее изобретение также предусматривает векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая описана выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. С такими векторами можно легко производить манипуляции с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и их, например, можно разрабатывать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, для трансформации эукариотических клеток можно использовать многие векторы, и при этом они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в своем геноме требуемую нуклеиновую кислоту. Используемым вектором может быть любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно применять для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Специалист в данной области способен выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению функциональным образом.The present invention also provides vectors containing a nucleic acid molecule as described above. Thus, in some embodiments, the nucleic acid molecule of the present invention is part of a vector. Such vectors can be easily manipulated using methods well known to one skilled in the art and, for example, can be designed to be capable of replication in prokaryotic and/or eukaryotic cells. In addition, many vectors can be used to transform eukaryotic cells and will integrate, in whole or in part, into the genome of such cells, resulting in stable host cells containing the desired nucleic acid in their genome. The vector used can be any vector that is suitable for DNA cloning and that can be used to transcribe the nucleic acid of interest. One skilled in the art will be able to select suitable expression vectors and insert the nucleic acid sequences of the present invention in a functional manner.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-белки RSV до слияния, также образуют часть настоящего изобретения. F-белки RSV до слияния можно получать с помощью технологии рекомбинантной ДНК, включающей экспрессию молекул в клетках-хозяевах, например клетках яичников китайского хомячка (СНО), линиях опухолевых клеток, клетках BHK, клеточных линиях человека, таких как клетки HEK293, клетки PER.C6, или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т. п. или трансгенных животных или растений. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в некоторых вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки человека. В целом, получение рекомбинантных белков, таких как F-белки RSV до слияния по настоящему изобретению, в клетке-хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты и обеспечение экспрессии белка в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии, и для нее обычно требуются последовательности, способствующие экспрессии нуклеиновой кислоты, такие как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т. п. Специалист в данной области осведомлен о том, что для достижения экспрессии гена в клетках-хозяевах можно использовать различные промоторы. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или разрабатывать искусственным путем.Host cells containing nucleic acid molecules encoding the RSV F proteins prior to fusion also form part of the present invention. Prefusion RSV F proteins can be produced using recombinant DNA technology involving expression of the molecules in host cells, eg Chinese hamster ovary (CHO) cells, tumor cell lines, BHK cells, human cell lines such as HEK293 cells, PER cells. C6, or cells of yeast, fungi, insects, etc. or transgenic animals or plants. In some embodiments, the cells are derived from a multicellular organism, in some embodiments they are derived from a vertebrate or an invertebrate. In some embodiments, the cells are mammalian cells. In some embodiments, the cells are human cells. In general, production of recombinant proteins, such as the prefusion RSV F proteins of the present invention, in a host cell involves introducing a heterologous nucleic acid molecule encoding the protein in an expressible format into the host cell, culturing the cells under conditions that promote expression of the nucleic acid molecule acid and ensuring protein expression in the specified cell. The nucleic acid molecule encoding the protein in an expressible format may be in the form of an expression cassette and typically requires sequences that promote expression of the nucleic acid, such as an enhancer(s), a promoter, a polyadenylation signal, etc. One skilled in the art will be aware that different promoters can be used to achieve gene expression in host cells. Promoters can be constitutive or regulated and can be obtained from a variety of sources, including viruses, prokaryotic or eukaryotic sources, or developed artificially.
Среды для выращивания клеточных культур доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно в рабочем порядке выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-белков RSV до слияния. Подходящая среда может содержать или может не содержать сыворотку.Cell culture media are available from a variety of suppliers, and suitable media can be routinely selected for the host cell to express the protein of interest, in this case the RSV F proteins prior to fusion. A suitable medium may or may not contain serum.
Гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты (также называемая в данном документе трансгеном) представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клеткехозяине. Ее вводят, например в вектор, с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно осуществить, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), подA heterologous nucleic acid molecule (also referred to herein as a transgene) is a nucleic acid molecule that is not naturally present in a host cell. It is introduced, for example, into a vector, using standard molecular biology techniques. The transgene is usually operably linked to expression control sequences. This can be accomplished, for example, by placing the nucleic acid encoding the transgene(s) under
- 5 045858 контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Для экспрессии трансгена(ов) можно использовать многие промоторы, и они известны специалисту, например, такие промоторы могут включать промоторы вирусов, млекопитающих, синтетические промоторы и т. п. Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор гена CMV (US 5385839), например промотор предраннего гена CMV, например содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например сигнал полиА гена бычьего гормона роста (US 5122458), может располагаться позади трансгена(ов). В качестве альтернативы, в данной области техники доступны несколько широко используемых векторов экспрессии, и их получают из коммерческих источников, например серия векторов pcDNA и pEF от Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т. д., которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, полиАпоследовательностей и т. п.- 5 045858 promoter control. Additional regulatory sequences can be added. Many promoters can be used to express the transgene(s) and are known to one skilled in the art, for example, such promoters may include viral promoters, mammalian promoters, synthetic promoters, etc. A non-limiting example of a suitable promoter for obtaining expression in eukaryotic cells is the CMV gene promoter (US 5,385,839), for example a CMV immediate early gene promoter, for example containing nucleotides -735 to +95 from the CMV immediate early gene enhancer/promoter. A polyadenylation signal, for example the polyA signal of the bovine growth hormone gene (US 5122458), may be located behind the transgene(s). Alternatively, several commonly used expression vectors are available in the art and are obtained from commercial sources, such as the pcDNA and pEF vector series from Invitrogen, pMSCV and pTK-Hyg from BD Sciences, pCMV-Script from Stratagene, etc. , which can be used for recombinant expression of a protein of interest, or for the production of suitable promoters and/or transcription terminator sequences, polyA sequences, etc.
Клеточная культура может представлять собой любой тип клеточной культуры, в том числе адгезивную клеточную культуру, например клетки, прикрепленные к поверхности культурального флакона или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Манипуляции с суспензионными культурами в наиболее крупном масштабе проводят в периодическом процессе или процессе с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и масштабирования. В настоящее время непрерывные процессы на основе принципов перфузии становятся более распространенными, и они также являются подходящими. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно осуществлять, например, в чашках, роллер-флаконах или в биореакторах, с использованием периодических, подпитываемых, непрерывных систем и т. п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).The cell culture can be any type of cell culture, including adherent cell culture, such as cells attached to the surface of a culture flask or to microcarriers, as well as suspension culture. Suspension culture manipulations on the largest scale are carried out in batch or fed-batch processes because they are the easiest to manage and scale up. Nowadays, continuous processes based on perfusion principles are becoming more common and are also suitable. Suitable culture media are well known to one of ordinary skill in the art and can typically be obtained from commercial sources in large quantities or produced to order according to standard protocols. Culture can be carried out, for example, in dishes, roller bottles or bioreactors, using batch, fed, continuous systems, etc. Suitable conditions for culturing cells are known (see, for example, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson , editors (1973) and R. I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, которые описаны выше. Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, имеющий эпитоп, который присутствует в конформации F-белка RSV до слияния, однако отсутствует в конформации после слияния, или его фрагмент. Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-белок RSV до слияния или его фрагмент. Композиции предпочтительно представляют собой иммуногенные композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, которые описаны выше. Настоящее изобретение также предусматривает применение стабилизированного F-белка RSV до слияния или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный F-белок RSV в соответствии с настоящим изобретением, для индуцирования у субъекта иммунного ответа на F-белок RSV. Дополнительно предусмотрены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа на F-белок RSV, предусматривающие введение субъекту F-белка RSV до слияния, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, и/или вектора в соответствии с настоящим изобретением. Также предусмотрены F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта на F-белок RSV. Также предусмотрено применение F-белков RSV до слияния, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа на F-белок RSV.The present invention also provides compositions containing a prefusion RSV F protein and/or a nucleic acid molecule and/or a vector as described above. The present invention also provides compositions comprising a prefusion RSV F protein having an epitope that is present in the prefusion conformation of the RSV F protein but absent in the postfusion conformation, or a fragment thereof. The present invention also provides compositions containing a nucleic acid molecule and/or vector encoding such a prefusion RSV F protein or a fragment thereof. The compositions are preferably immunogenic compositions containing a prefusion RSV F protein and/or a nucleic acid molecule and/or a vector as described above. The present invention also provides the use of a stabilized prefusion RSV F protein or a nucleic acid molecule encoding said RSV F protein in accordance with the present invention to induce an immune response to the RSV F protein in a subject. Additionally provided are methods of inducing an immune response to RSV F protein in a subject, comprising administering to the subject a prefusion RSV F protein and/or a nucleic acid molecule and/or a vector in accordance with the present invention. Also provided are prefusion RSV F proteins, nucleic acid molecules, and/or vectors in accordance with the present invention for inducing an immune response in a subject to the RSV F protein. Also contemplated is the use of prefusion RSV F proteins and/or nucleic acid molecules and/or vectors in accordance with the present invention for the manufacture of a medicament for use in inducing an immune response to the RSV F protein in a subject.
F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения (профилактики) и/или лечения инфекций, вызванных RSV. В некоторых вариантах осуществления предупреждение и/или лечение может быть направлено на группы пациентов, которые восприимчивы к инфекции, вызываемой RSV. Такие группы пациентов включают без ограничения, например, пожилых (например, в возрасте >50 лет, в возрасте >60 лет и предпочтительно в возрасте >65 лет), молодых (например, в возрасте <5 лет, в возрасте <1 года), госпитализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусным соединением, однако продемонстрировали неудовлетворительный противовирусный ответ.The prefusion RSV F proteins, nucleic acid molecules or vectors of the present invention can be used to prevent and/or treat infections caused by RSV. In some embodiments, prevention and/or treatment may be directed to groups of patients who are susceptible to RSV infection. Such patient populations include, but are not limited to, the elderly (eg, aged >50 years, aged >60 years, and preferably aged >65 years), young (eg, aged <5 years, aged <1 year), hospitalized patients and patients who were treated with an antiviral compound but demonstrated an unsatisfactory antiviral response.
F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновых кислот и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы, например, в самостоятельных лечении и/или профилактике заболевания или состояния, вызываемого RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующие или будущие) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.Prefusion RSV F proteins, nucleic acid molecules and/or vectors in accordance with the present invention can be used, for example, in the treatment and/or prevention of a disease or condition caused by RSV alone, or in combination with other prophylactic and/or therapeutic agents treatments such as (existing or future) vaccines, antivirals and/or monoclonal antibodies.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной RSV, с использованием F-белков RSV до слияния, молекул нуклеиновых кислот и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществлеThe present invention further provides methods for preventing and/or treating RSV infection in a subject using prefusion RSV F proteins, nucleic acid molecules and/or vectors in accordance with the present invention. In a specific embodiment,
- 6 045858 ния способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной RSV, предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-белка RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, которые описаны выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству белка, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, облегчения и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает ингибирование или уменьшение распространения RSV или ингибирование или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызванной RSV. Облегчение, как используется в данном документе, может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или других поддающихся измерению проявлений инфекции гриппа.- 6 045858 A method of preventing and/or treating an RSV infection in a subject involves administering to the subject in need thereof an effective amount of a prefusion RSV F protein, a nucleic acid molecule and/or a vector as described above. A therapeutically effective amount refers to an amount of protein, nucleic acid molecule, or vector that is effective to prevent, alleviate, and/or treat a disease or condition resulting from RSV infection. Prevention covers inhibition or reduction of the spread of RSV or inhibition or reduction of the occurrence, development or progression of one or more symptoms associated with RSV infection. Relief, as used herein, may refer to a reduction in visible or tangible symptoms of disease, viremia, or other measurable manifestations of influenza infection.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут применяться фармацевтические композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В настоящем контексте термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель или вспомогательное вещество в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или неблагоприятных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). F-белки RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают с помощью стерилизующей фильтрации или с помощью других способов, известных per se из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или заполняют ними контейнеры, предназначенные для лекарственных форм. Значение рН раствора обычно находится в диапазоне рН от 3,0 до 9,5, например рН от 5,0 до 7,5. F-белки RSV обычно находятся в растворе, содержащем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция также может содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В некоторых вариантах осуществления добавляют детергент. В некоторых вариантах осуществления F-белки RSV могут быть составлены в виде инъекционного препарата.For administration to subjects such as humans, the present invention may employ pharmaceutical compositions comprising the prefusion RSV F protein, a nucleic acid molecule and/or vector as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. As used herein, the term pharmaceutically acceptable means that the carrier or excipient, at the dosages and concentrations used, will not cause any undesirable or adverse effects in subjects to whom it is administered. Such pharmaceutically acceptable carriers and excipients are well known in the art (see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard , Eds., Taylor & Francis [2000] and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). RSV F proteins or nucleic acid molecules are preferably formulated and administered as a sterile solution, although the use of lyophilized preparations is also possible. Sterile solutions are prepared by sterile filtration or other methods known per se in the art. The solutions are then lyophilized or filled into containers intended for dosage forms. The pH value of the solution is usually in the range of pH 3.0 to 9.5, for example pH 5.0 to 7.5. The RSV F proteins are typically present in a solution containing a suitable pharmaceutically acceptable buffer, and the composition may also contain a salt. Optionally, a stabilizing agent such as albumin may be present. In some embodiments, a detergent is added. In some embodiments, the RSV F proteins may be formulated as an injectable formulation.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Как известно из уровня техники, адъюванты дополнительно повышают иммунный ответ на применяемую антигенную детерминанту. Термины адъювант и иммуностимулятор используются в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на F-белки RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе сквален-водных эмульсий, таких как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфориллипид A (MPL), 3-O-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT E. coli, холерный токсин СТ и т. п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CD1a, CD3, CD7, CD80) и лиганды к рецепторам (например, CD40L, GMCSF, GCSF и др.), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с реципиентными клетками. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации, в концентрациях, составляющих 0,05-5 мг, например 0,075-1,0 мг алюминия на дозу.In some embodiments, the composition in accordance with the present invention further contains one or more adjuvants. As is known in the art, adjuvants further enhance the immune response to the applied antigenic determinant. The terms adjuvant and immunostimulant are used interchangeably herein and are defined as one or more substances that cause stimulation of the immune system. In this context, an adjuvant is used to enhance the immune response to the RSV F proteins of the present invention. Examples of suitable adjuvants include aluminum salts such as aluminum hydroxide and/or aluminum phosphate; compositions based on oil emulsions (or oil-in-water compositions), including squalene-water emulsions such as MF59 (see, for example, WO 90/14837); compositions with saponins, such as, for example, QS21 and immunostimulating complexes (ISCOMS) (see, for example, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivatives of bacteria or microorganisms, examples of which are monophosphoryl lipid A (MPL), 3-O-deacylated MPL (3dMPL), oligonucleotides containing a CpG motif, ADP-ribosylating bacterial toxins or mutant forms thereof, such as E. coli heat labile enterotoxin LT, cholera ST toxin, etc.; eukaryotic proteins (for example, antibodies or their fragments (for example, directed against the antigen itself or CD1a, CD3, CD7, CD80) and ligands to receptors (for example, CD40L, GMCSF, GCSF, etc.), which stimulate the immune response when interacting with recipient In some embodiments, the compositions of the present invention contain aluminum as an adjuvant, for example in the form of aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum potassium phosphate or a combination thereof, in concentrations of 0.05-5 mg, for example 0.075-1.0 mg aluminum per dose.
F-белки RSV перед слиянием можно также вводить в комбинацию или конъюгировать с наночастицами, такими как, например, полимеры, липосомы, виросомы, вирус-подобные частицы или самоорганизующиеся белковые частицы. F-белки до слияния могут быть комбинированы с наночастицами, инкапсулированы в наночастицах или конъюгированы с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в документе US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в документах US 4372945 или US 4474757.RSV F proteins can also be combined or conjugated with nanoparticles before fusion, such as, for example, polymers, liposomes, virosomes, virus-like particles or self-assembled protein particles. Prefusion F proteins can be combined with nanoparticles, encapsulated in nanoparticles, or conjugated to nanoparticles with or without adjuvant. Liposome encapsulation is described, for example, in US 4,235,877. Conjugation with macromolecules is disclosed, for example, in US 4,372,945 or US 4,474,757.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.In other embodiments, the compositions do not contain adjuvants.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), предусматривающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию. Термин вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, эффективный для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенномуIn some embodiments, the present invention provides methods for preparing a vaccine against respiratory syncytial virus (RSV), comprising providing a composition in accordance with the present invention and placing it in a pharmaceutically acceptable composition. The term vaccine refers to a product or composition containing an active ingredient effective to induce in a subject a certain degree of immunity to a specified
- 7 045858 патогенному или болезнетворному микроорганизму, которая приведет по меньшей мере к снижению (включительно до полного отсутствия) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, связанных с инфицированием патогенным или болезнетворным микроорганизмом. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-белка RSV до слияния, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-белок RSV до слияния, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, что вызывает формирование иммунного ответа в отношении F-белка RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту возникновения осложнений, таких как пневмония и бронхиолит, у субъекта вследствие инфицирования и репликации RSV. В соответствии с настоящим изобретением, термин вакцина подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию и, таким образом, обычно включает фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель или вспомогательное вещество. Она может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты. В некоторых вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, индуцирующие иммунный ответ, например против других белков RSV и/или против других инфекционных агентов. Введение дополнительных активных компонентов может быть осуществлено, например, путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.- 7 045858 pathogenic or pathogenic microorganism, which will result in at least a reduction (including complete absence) in the severity, duration or other manifestation of symptoms associated with infection by the pathogenic or pathogenic microorganism. In the present invention, the vaccine contains an effective amount of the prefusion RSV F protein, and/or a nucleic acid molecule encoding the prefusion RSV F protein, and/or a vector containing the said nucleic acid molecule, which causes the formation of an immune response against the F protein RSV. This provides a method of preventing severe lower respiratory tract disease leading to hospitalization and reduces the incidence of complications such as pneumonia and bronchiolitis in a subject due to RSV infection and replication. In accordance with the present invention, the term vaccine implies that it is a pharmaceutical composition and, thus, generally includes a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient. It may or may not contain additional active ingredients. In some embodiments, it may be a combination vaccine that additionally contains other components that induce an immune response, for example against other RSV proteins and/or against other infectious agents. Administration of additional active components can be accomplished, for example, by separate administration or by administration of a combination of the vaccine products of the present invention and additional active components.
Композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Суммарная доза F-белков RSV в композиции для однократного введения может составлять, например, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг, например 1 мкг - 1 мг, например 10 мкг - 100 мкг. Определение рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.The compositions can be administered to a subject, for example a human subject. The total dose of RSV F proteins in a single administration composition may be, for example, from about 0.01 μg to about 10 mg, eg 1 μg - 1 mg, eg 10 μg - 100 μg. Determination of the recommended dose will be carried out during the experiment and is standard for specialists in this field.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например интраназальное, пероральное и т. п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например вакцины для индуцирования иммунного ответа к антигену(ам), присутствующему(им) в вакцине.Administration of compositions in accordance with the present invention can be accomplished using standard routes of administration. Non-limiting embodiments include parenteral administration, such as intradermal, intramuscular, subcutaneous, transdermal or mucosal administration, such as intranasal, oral, etc. In one embodiment, the composition is administered by intramuscular injection. One skilled in the art knows various possibilities for administering a composition, for example a vaccine, to induce an immune response to the antigen(s) present in the vaccine.
Как используется в данном документе, субъект предпочтительно представляет собой млекопитающее, например грызуна, например мышь, хлопкового хомяка, или примата, отличного от человека, или человека. Предпочтительно субъектом является субъект-человек.As used herein, the subject is preferably a mammal, such as a rodent such as a mouse, a bobcat, or a non-human primate or human. Preferably, the subject is a human subject.
Белки, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или композиции также можно вводить в виде примирования или в виде усиления в гомологичном или гетерологичном режиме примирования/усиления. При осуществлении бустерной вакцинации, как правило, такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком времени от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев, после введения композиции субъекту в первый раз (что в данном случае называется примирующей вакцинацией). В некоторых вариантах осуществления введение предусматривает примирование и по меньшей мере одно бустерное введение.Proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or compositions can also be administered as priming or amplification in a homologous or heterologous priming/amplification mode. When performing a booster vaccination, typically the booster vaccine will be administered to the same subject over a period of one week to one year, preferably two weeks to four months, after the composition is administered to the subject for the first time (which is herein referred to as priming). vaccination). In some embodiments, administration comprises a priming and at least one boost administration.
Кроме того, белки по настоящему изобретению могут применяться в качестве диагностического средства, например, для тестирования иммунного статуса индивидуума путем установления способности антител в сыворотке крови такого индивидуума к связыванию с белком по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу выявления у пациента наличия инфекции, вызванной RSV, при этом указанный способ включает стадии а) приведения биологического образца, полученного от указанного пациента, в контакт с белком в соответствии с настоящим изобретением и b) выявления присутствия комплексов антитело-белок.In addition, the proteins of the present invention can be used as a diagnostic tool, for example, to test the immune status of an individual by determining the ability of antibodies in the blood serum of such an individual to bind to the protein of the present invention. Thus, the present invention also relates to an in vitro diagnostic method for detecting the presence of an RSV infection in a patient, said method comprising the steps of a) contacting a biological sample obtained from said patient with a protein in accordance with the present invention and b) detecting the presence of antibody-protein complexes.
ПримерыExamples
Пример 1. Получение стабильных F-белков RSV до слиянияExample 1: Generation of stable RSV F proteins prior to fusion
Были получены несколько вариантов F-белка RSV до слияния, которые схематически представлены на фиг. 1. Все кандидаты включали домен тримеризации фибритина (фолдон) (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL; SEQ ID NO: 20), связанный с аминокислотным остатком 495 домена F1 А2 RSV.Several prefusion variants of the RSV F protein have been generated and are schematically represented in FIG. 1. All candidates included a fibritin trimerization domain (foldon) (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL; SEQ ID NO: 20) associated with amino acid residue 495 of the RSV F1 A2 domain.
В преобразованных версиях F RSV (т. е. в версиях, которые расщеплены с удалением области р27) замена N67I оказала наиболее сильный эффект как в отношении уровня экспрессии, так и в отношении стабильности, однако полностью стабильный F-белок до слияния был получен лишь тогда, когда замены 67 и 215 были объединены, что привело к 20-кратному увеличению уровня экспрессии (Фиг. 2). Добавление третьей замены аминокислоты не улучшало уровень экспрессии или стабильность, как измерено посредством стабильности при хранении при 4°С. Однако, в случае когда F-белки RSV были очищены и дополнительно охарактеризованы, оказалось, что дополнительная третья замена значительно стабилизировала F-белок до слияния, как измерено с помощью более жесткого теста на термостабильность (методом дифференциальной сканирующей флуориметрии - DSF) (Фиг. 3).In transformed versions of RSV F (i.e., versions that are cleaved to remove the p27 region), the N67I substitution had the most dramatic effect on both expression level and stability, but only then was a fully stable prefusion F protein obtained , when substitutions 67 and 215 were combined, resulting in a 20-fold increase in expression level (Figure 2). The addition of a third amino acid substitution did not improve expression levels or stability as measured by storage stability at 4°C. However, when RSV F proteins were purified and further characterized, the additional third substitution was found to significantly stabilize the prefusion F protein, as measured by a more stringent thermostability test (differential scanning fluorimetry - DSF) (Fig. 3 ).
Поскольку штамм А2, который использовался в качестве родительской последовательности дляSince strain A2, which was used as the parent sequence for
- 8 045858 описанных ранее вариантов F-белка RSV (WO2014/174018 и WO2014/202570), представлял собой лабораторный штамм, адаптированный на уровне клеточной линии, который накопил две уникальные и редкие мутации в верхушке K66 и I76), было решено подвергнуть мутации эти два остатка в соответствии с природными клиническими изолятами (К66Е, I76V). Мутации К66Е и I76V были включены в новую преобразованную конструкцию белка, чтобы сделать последовательность ближе к природным изолятам вируса. Замены K66E+I76V тестировали в выбранных стабилизированных вариантах, чтобы продемонстрировать то, что аминокислотные замены не оказывали отрицательного влияния на экспрессию или стабильность белка. Было показано, что белки были стабильны в супернатантах клеточной культуры более 2 недель. Какого-либо отрицательного влияния на уровень экспрессии F-белков не было, напротив, Fбелок RSV с мутациями N67I, S215P, К66Е и I76V экспрессировался на более высоком уровне, чем белок только с N67I и S215P (Фиг. 4).- 8 045858 previously described variants of the RSV F protein (WO2014/174018 and WO2014/202570), was a laboratory strain adapted at the cell line level that had accumulated two unique and rare mutations in the tip of K66 and I76, it was decided to mutate these two residues consistent with natural clinical isolates (K66E, I76V). The K66E and I76V mutations were included in the new reconstituted protein construct to bring the sequence closer to natural virus isolates. The K66E+I76V substitutions were tested in selected stabilized variants to demonstrate that the amino acid substitutions did not adversely affect protein expression or stability. The proteins were shown to be stable in cell culture supernatants for more than 2 weeks. There was no negative effect on the expression level of F proteins; on the contrary, RSV F protein with mutations N67I, S215P, K66E and I76V was expressed at a higher level than protein with only N67I and S215P (Fig. 4).
Преобразованные F-белки RSV с N67I, S215P, К66Е и I76V (названные PRQM для преобразованного четверного мутанта) и с N67I, S215P, К66Е, I76V и D486N (называемые PRPM для преобразованного пента-мутанта) были очищены и дополнительно охарактеризованы.Transformed RSV F proteins with N67I, S215P, K66E, and I76V (termed PRQM for the transformed quadruple mutant) and with N67I, S215P, K66E, I76V, and D486N (termed PRPM for the transformed penta mutant) were purified and further characterized.
Скрининг стабилизирующих мутаций для F-белка RSV осуществляли в суспензионных клетках HEK (Freestyle 293F). Эти клетки удобно использовать в исследовательской лаборатории, поскольку они адаптированы к протоколу простой трансфекции и экспрессируют белки на высоком уровне. Для крупномасштабного производства и продуцирования белка GMP клетки СНО часто являются предпочтительной клеточной линией. Следовательно, экспрессию и стабильность нескольких предпочтительных конструкций F-белка тестировали в суспензионных клетках СНО (Freestyle CHO-S). Клетки CHO-S трудно трансфицировать, а следовательно ожидается, что общие уровни экспрессии будут ниже, чем в клетках HEK. Следовательно, во время анализа авторы данного изобретения сосредоточились на относительной экспрессии белков и их стабильности.Screening for stabilizing mutations for the RSV F protein was performed in HEK suspension cells (Freestyle 293F). These cells are convenient for use in the research laboratory because they are adapted to a simple transfection protocol and express proteins at high levels. For large scale production and production of GMP protein, CHO cells are often the cell line of choice. Therefore, the expression and stability of several preferred F protein constructs were tested in CHO suspension cells (Freestyle CHO-S). CHO-S cells are difficult to transfect and therefore overall expression levels are expected to be lower than in HEK cells. Therefore, during the analysis, the present inventors focused on the relative expression of proteins and their stability.
Для теста были выбраны пять преобразованных белков. Все 5 вариантов содержали замены К66Е, I76V, N67I и S215P. Как описано выше, последние 2 необходимы для стабилизации белка в конформации до слияния; первые две были включены, чтобы приблизить последовательность к изолятам, встречающимся в природе (как описано в предыдущем разделе). Белки отличались дополнительными мутациями Е161Р, D486N и E487Q. Они были выбраны из-за высокого уровня экспрессии, стабильности при хранении и низкого влияния на антигенность. Все белки были экспрессированы в клетках СНО и характеризовались сопоставимой стабильностью при хранении. F-белки RSV были стабильны в конформации до слияния при хранении в супернатантах клеточных культур в течение 2 недель при 4°С (Фиг. 5). Также была протестирована стабильность F-белков RSV в супернатанте клеточной культуры СНО при рН 5. Как показано на фиг. 6, не было обнаружено какой-либо деградации после инкубации образцов белка в течение 7 дней при разных значениях температуры.Five transformed proteins were selected for the test. All 5 variants contained substitutions K66E, I76V, N67I and S215P. As described above, the latter 2 are required to stabilize the protein in the prefusion conformation; the first two were included to bring the sequence closer to naturally occurring isolates (as described in the previous section). The proteins differed by additional mutations E161P, D486N and E487Q. They were selected for their high expression levels, storage stability and low impact on antigenicity. All proteins were expressed in CHO cells and had comparable storage stability. RSV F proteins were stable in the prefusion conformation when stored in cell culture supernatants for 2 weeks at 4°C (Fig. 5). The stability of RSV F proteins in CHO cell culture supernatant at pH 5 was also tested. As shown in FIG. 6, no degradation was detected after incubating protein samples for 7 days at different temperatures.
В заключение, F-белки RSV по настоящему изобретению экспрессировались в клетках СНО и были стабильны в супернатантах клеточных культур. Также тестировали термостабильность белка. Супернатанты клеточных культур подвергали термообработке и количество белка до слияния в образцах измеряли в ELISA с помощью антитела CR9501 (Фиг. 7).In conclusion, the RSV F proteins of the present invention were expressed in CHO cells and were stable in cell culture supernatants. The thermostability of the protein was also tested. Cell culture supernatants were heat treated and the amount of preconfluent protein in the samples was measured by ELISA using antibody CR9501 (Fig. 7).
Вариант с D486N (белок PRPM) был наиболее устойчивым к температурному стрессу. Добавление мутации K498R, казалось, не имело каких-либо преимуществ по сравнению с белком с минимальным количеством модификации (PRQM). Варианты с мутацией Е161Р характеризовались наиболее высокими уровнями экспрессии (данные не показаны). Однако недостатком этой аминокислотной замены было то, что остаток 161 расположен на поверхности белка и на краю эпитопа для антитела CR9501.The variant with D486N (PRPM protein) was the most resistant to temperature stress. The addition of the K498R mutation did not seem to have any advantage over protein with minimal modification (PRQM). Variants with the E161P mutation were characterized by the highest levels of expression (data not shown). However, the disadvantage of this amino acid change was that residue 161 is located on the surface of the protein and at the edge of the epitope for the CR9501 antibody.
В соответствии с настоящим изобретением было показано, что PRPM (F-белок RSV с доменом фолдон тримеризации фибритина и с мутациями N67I, S215P, К66Е, I76V и D486N, SEQ ID NO: 1) и PRQM (F-белок RSV с доменом фолдон тримеризации фибритина и с N67I, S215P, К66Е и I76V, SEQ ID NO: 2) в качестве преобразованного белка до слияния с минимальными необходимыми модификациями последовательности, а также вариант PRQM +S46G или PRPM +S46G, все стабилизированы в конформации до слияния и демонстрируют высокое значение Tm (табл. 1). Последние варианты с заменой S46G характеризовались значительно более высоким уровнем экспрессии.In accordance with the present invention, it has been shown that PRPM (RSV F protein with fibritin trimerization foldon domain and mutations N67I, S215P, K66E, I76V and D486N, SEQ ID NO: 1) and PRQM (RSV F protein with fibritin trimerization foldon domain fibritin and with N67I, S215P, K66E and I76V, SEQ ID NO: 2) as a prefusion converted protein with minimal required sequence modifications, as well as the PRQM +S46G or PRPM +S46G variant, all stabilized in a prefusion conformation and exhibiting high value Tm (Table 1). The latter variants with the S46G substitution were characterized by a significantly higher level of expression.
Таблица 1Table 1
- 9 045858- 9 045858
Пример 2. Иммуногенность и защита, индуцированные PRPM с адъювантом и без негоExample 2: Immunogenicity and Protection Induced by PRPM with and without Adjuvant
Был проведен эксперимент по определению иммуногенной и профилактической эффективности рекомбинантного белка PRPM в присутствии или отсутствии адъюванта в гомологичной модели контрольного заражения А2 RSV хлопкового хомяка. Животных иммунизировали i.m. в 0-й и 28-й дни с помощью 2 доз PRPM (5 и 0,5 мкг), неадъювантного или адъювантного, со 100 мкг Adjuphos. Животных подвергали контрольному заражению на 49-й день с помощью 105 (БОЕ) А2 RSV. Животных умерщвляли через 5 дней после заражения, и титры измеряли в легких и носу.An experiment was conducted to determine the immunogenic and prophylactic efficacy of recombinant PRPM protein in the presence or absence of an adjuvant in a homologous cottontail A2 RSV challenge model. Animals were immunized i.m. on days 0 and 28 with 2 doses of PRPM (5 and 0.5 mcg), non-adjuvant or adjuvant, with 100 mcg Adjuphos. Animals were challenged on day 49 with 105 (PFU) A2 RSV. Animals were sacrificed 5 days postinfection, and titers were measured in the lungs and nose.
Результатыresults
Иммунизация адъювантным PRPM вызвала полную защиту в легких и носу, за исключением 1 животного, у которого выявили прорыв в носу. У большей части животных, получавших 5 и 0,5 мкг неадъювантного PRPM, выявляли прорыв в легких и носах, а также была значительная разница между группами, получавшими адъювантный и неадъювантный белки (Фиг. 8). Адъювантный белок индуцировал значительно более высокие титры VNA по сравнению с неадъювантным белком на 49-й день после иммунизации (Фиг. 9).Immunization with adjuvant PRPM induced complete protection in the lungs and nose, with the exception of 1 animal that showed a breakthrough in the nose. A greater proportion of animals receiving 5 and 0.5 μg of non-adjuvant PRPM showed lung and nasal breakthrough, and there was a significant difference between the adjuvant and non-adjuvant protein groups (Figure 8). The adjuvanted protein induced significantly higher VNA titers compared with the nonadjuvanted protein at day 49 postimmunization (Fig. 9).
Таблица 2table 2
Последовательности антителAntibody sequences
- 10 045858- 10 045858
ПоследовательностиSequences
SEQ ID NO: 1: PRPMSEQ ID NO: 1: PRPM
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 2 PRQMSEQ ID NO: 2 PRQM
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 3 PRPM+S46GSEQ ID NO: 3PRPM+S46G
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKOELDKYKNAVTELOLLMOSTPATNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSL GAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KS DE LL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
CR9501, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 16):CR9501 Heavy Chain (SEQ ID NO: 16):
- 11 045858- 11 045858
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNT YYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCQVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNT YYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501, легкая цепь (SEQ ID NO: 17):CR9501 light chain (SEQ ID NO: 17):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVP SRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVP SRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502 тяжелая цепь (SEQ ID NO:18):CR9502 heavy chain (SEQ ID NO:18):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTE YAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGTFFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTE YAQKIQGRVTMTMDTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502, легкая цепь (SEQ ID NO: 19):CR9502 light chain (SEQ ID NO: 19):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPD RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECSQSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPD RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQV THEGSTVEKTIAPTECS
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PRPM (SEQ ID NO: 20):Nucleotide sequence encoding PRPM (SEQ ID NO: 20):
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGA CAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCAT TGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCA AC G T G GAGAT С T T СAAC С С TAAG TAG GAG T G CAAGAT CAT GAC CAG CAAGAC C GAC G T G T С CAGATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGC AGGAACTGGA CAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCAT TGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGC GAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACC CCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCCTGTGCACCACCACA CCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCA AC G T G GAGAT C T T CAAC C C TAAG TAG GAG T G CAAGAT CAT GAC CAG CAAGAC C G AC G T G T WITH CAG
- 12 045858- 12 045858
CTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACG AGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCG GAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCC AGCAACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACG AGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCG GAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTG
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PRQM (SEQ ID NO: 21):Nucleotide sequence encoding PRQM (SEQ ID NO: 21):
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGA CAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCAT TGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCA AC G T G GAGAT С T T СAAC С С TAAG TAG GAG T G CAAGAT CAT GAC CAG CAAGAC C GAC G T G T С CAG CTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACG AGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCG GAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTGATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGC AGGAACTGGA CAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCAT TGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGC GAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACC CCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCCTGTGCACCACCACA CCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCA AC G T G GAGAT C T T CAAC C C TAAG TAG GAG T G CAAGAT CAT GAC CAG CAAGAC C G AC G T G T C CAG CTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCAACTTCTACGACC CCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACG AGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCG GAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTG
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PRPM+S46G (SEQ ID NO: 22):Nucleotide sequence encoding PRPM+S46G (SEQ ID NO: 22):
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTTGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTATCTGGGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAAGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAGTGAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGA CAAGTACAAGAATGCCGTGACCGAACTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGAAGAGAACTGCCCAGATTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTTCTGCTGGGAGTGGGAAGCGCCAT TGCTAGCGGAGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCTCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAACAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGTCCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATTATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCTCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACAGAGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTCTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAATCTGTGCA AC G T G GACAT С T T CAAC С С TAAG TAG GAC T G CAAGAT CAT GAC С T С CAAGAC C GAC G T G T С CAG CTCCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCTGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAAGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGTCCGATG AGCTGCTGAGCGCCATCGGCGGCTACATCCCTGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTGCG GAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTGATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTT CTGCTTTGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCC AAGGGCTATCTGGGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCA ACATCAAAGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAGTGAAGCTGATCAAGC AGGAACTGGA CAAGTACAAGAATGCCGTGACCGAACTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAAC CGGGCCAGAAGAGAACTGCCCAGATTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACG TGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTTCTGCTGGGAGTGGGAAGCGCCAT TGCTAGCGGAGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGC GAAGTGAACAAGATCAAGAGC GCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCTCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCA AGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAACAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTG CAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATC ACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACC CCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACA GCGAGCTGCTGTCCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAA CAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATTATCAAAGAAGAGGTGCTG GCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCA GCCCTTGTGCACCACCACA CCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACAGAGG CTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTCTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAATCTGTGCA AC G T G GACAT C T T CAAC C C TAAG TAG GAC T G CAAGAT CAT GAC C T C CAAGAC C G AC G T G T C CAG CTCCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGC AACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGG TGGACACCGTGTCTGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTA CGTGAAGGGCGAGCCCATCAACTTCTACGACC CCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGAC GCCAGCATCAGCCAAGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGTCCGATG AGCTGCTGAGCGCCATCGGCGGCTACATCCCTGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTGCG GAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTG
Claims (7)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16163810.1 | 2016-04-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045858B1 true EA045858B1 (en) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7362819B2 (en) | Stabilized soluble prefusion RSV F protein | |
| US20210101940A1 (en) | Stabilized Soluble Pre-Fusion RSV F Polypeptides | |
| AU2022204267A1 (en) | Vaccine compositions | |
| JP2018520159A (en) | Vaccine against RSV | |
| US20220017574A1 (en) | Stabilized pre-fusion rsv f proteins | |
| KR20190012193A (en) | The stabilized fusion-pre-RSV F protein | |
| EP4150061A1 (en) | Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins | |
| CN117202928A (en) | Protein-based nanoparticle vaccine for metapneumovirus | |
| EA045858B1 (en) | STABILIZED SOLUBLE RSV F-PROTEINS BEFORE FUSION | |
| OA18879A (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F proteins | |
| NZ785677A (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |