EA045583B1 - METHOD FOR SYNTHESIS OF HYALURONIC ACID AND PACLITAXEL CONJUGATE - Google Patents
METHOD FOR SYNTHESIS OF HYALURONIC ACID AND PACLITAXEL CONJUGATE Download PDFInfo
- Publication number
- EA045583B1 EA045583B1 EA202291872 EA045583B1 EA 045583 B1 EA045583 B1 EA 045583B1 EA 202291872 EA202291872 EA 202291872 EA 045583 B1 EA045583 B1 EA 045583B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- paclitaxel
- conjugate
- hyaluronic acid
- linker
- spacer
- Prior art date
Links
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 title claims description 48
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 title claims description 36
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims description 25
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims description 25
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 15
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical group CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical class [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical group Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 claims description 8
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 4-bromobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCBr GRHQDJDRGZFIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical group CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 13
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- -1 HA polysaccharide Chemical class 0.000 description 4
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical group [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N taxol® Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(CC(C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3(C21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 2-bromobutyric acid Chemical compound CCC(Br)C(O)=O YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001116500 Taxus Species 0.000 description 1
- 241001116498 Taxus baccata Species 0.000 description 1
- 235000009065 Taxus cuspidata Nutrition 0.000 description 1
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012829 chemotherapy agent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 229920001038 ethylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000009101 premedication Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013269 sustained drug release Methods 0.000 description 1
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical group C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Задача изобретенияObjective of the invention
В настоящем изобретении описан способ промышленного синтеза конъюгата гиалуроновой кислоты и паклитаксела, полученного согласно способу синтеза между молекулами гиалуроновой кислоты (ГК) и паклитаксела путем введения спейсера/линкера 4-броммасляной кислоты между гиалуроновой кислотой и указанным выше химиотерапевтическим веществом согласно оригинальному способу синтеза и очистки, который обеспечивает чистоту конъюгата в его конечной форме.The present invention describes a method for the industrial synthesis of a hyaluronic acid-paclitaxel conjugate obtained according to a synthesis method between hyaluronic acid (HA) and paclitaxel molecules by introducing a 4-bromobutyric acid spacer/linker between hyaluronic acid and the above chemotherapeutic substance according to the original synthesis and purification method, which ensures the purity of the conjugate in its final form.
Область техникиTechnical field
Паклитаксел (Taxol®) представляет собой противораковое средство, осуществляющее свою антипролиферативную активность путем воздействия на организацию микротрубочек клеточной цитоскелетной системы: ингибируя деполяризацию вышеуказанных микротрубочек, он предотвращает их нормальную динамическую реорганизацию, которая происходит во время митотического клеточного деления (Manfredi J.J. et al., J. Cell Biol., 1982, 94:688-696).Paclitaxel (Taxol®) is an anticancer agent that exerts its antiproliferative activity by affecting the organization of microtubules of the cellular cytoskeletal system: by inhibiting the depolarization of the above microtubules, it prevents their normal dynamic reorganization that occurs during mitotic cell division (Manfredi J.J. et al., J Cell Biol, 1982, 94:688-696).
Основными терапевтическими показаниями для паклитаксела являются его применение в терапии распространенного рака молочной железы, в терапии рака легких, в лечении рака яичников, рака мочевого пузыря, предстательной железы и эндометрия.The main therapeutic indications for paclitaxel are its use in the treatment of advanced breast cancer, in the treatment of lung cancer, in the treatment of ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer and endometrial cancer.
Паклитаксел представляет собой нерастворимое в воде соединение, и, следовательно, фармацевтическая композиция, в которой он используется в настоящее время, включает его смешивание с Cremophor EL - этиловым спиртом, (Pfeifer R.W. et al., Am. J. Hosp. Pharm., 1993, 50:2520-2521) в соотношении 1:1, и именно в этой форме его обычно вводят путем непрерывной внутривенной инфузии. Присутствие Cremophor EL является основной причиной негативных реакций, которые обычно возникают при введении паклитаксела, т.е. простых приступов крапивницы, одышки и бронхоспазма, вплоть до анафилактического шока. По этой причине все пациенты, получающие лечение фармацевтической композицией паклитаксел-Cremophor EL, должны перед началом лечения пройти процедуру согласно протоколу премедикации, которая состоит из введения дексаметазона, возможно в сочетании с антигистаминным средством.Paclitaxel is a water-insoluble compound and therefore the pharmaceutical composition in which it is currently used involves mixing it with Cremophor EL - ethyl alcohol (Pfeifer R.W. et al., Am. J. Hosp. Pharm., 1993 , 50:2520-2521) in a 1:1 ratio, and it is in this form that it is usually administered by continuous intravenous infusion. The presence of Cremophor EL is the main cause of the adverse reactions that usually occur with the administration of paclitaxel, i.e. simple attacks of urticaria, shortness of breath and bronchospasm, up to anaphylactic shock. For this reason, all patients receiving treatment with the pharmaceutical composition paclitaxel-Cremophor EL must undergo a premedication protocol, which consists of the administration of dexamethasone, possibly in combination with an antihistamine, before starting treatment.
Таким образом, авторы настоящего изобретения могут с уверенностью заявить, что препарат Taxol®, который в настоящее время используется в клинической практике (а также способ его введения), представляет собой ограничение его терапевтической эффективности. По этой причине исследования в настоящее время ориентированы как на синтез пролекарств/водорастворимых конъюгатов паклитаксела, так и на новые препараты вышеупомянутого противоракового лекарственного средства.Thus, the inventors of the present invention can confidently state that the drug Taxol®, which is currently used in clinical practice (as well as the method of its administration), represents a limitation to its therapeutic effectiveness. For this reason, research is currently focused on both the synthesis of prodrugs/water-soluble conjugates of paclitaxel and new formulations of the aforementioned anticancer drug.
Паклитаксел представляет собой алкалоид, который в настоящее время получают полусинтетическим путем из одного из его предшественников, полученных из иголок тиса ягодного (Taxus Baccata). Химически он состоит из таксанового кольца с 15 атомами углерода, связанного с оксиэтановым кольцом в положениях С4 и С5, тогда как в положении С13 присутствует сложноэфирная связь, которая считается необходимой для его противораковой активности.Paclitaxel is an alkaloid that is currently obtained semi-synthetically from one of its precursors, obtained from the needles of the yew (Taxus baccata). Chemically, it consists of a taxane ring with 15 carbon atoms linked to an oxyethane ring at the C4 and C5 positions, while an ester linkage is present at the C13 position, which is considered essential for its anticancer activity.
Для преодоления указанных выше проблем, связанных с типом состава, были предприняты попытки, например, инкапсулировать указанное противораковое вещество в липосомы, нанокапсулы и микросферы, образованные полимерной оболочкой, образованной биоразлагаемыми сополимерами, такими как полимолочная кислота, или небиоразлагаемыми сополимерами, такими как сополимер этилена с винилацетатом, или микросферы, образованные полифосфоэфиром, нагруженным паклитакселом, для создания системы пролонгированного высвобождения лекарственного средства в месте лечения (Nuijen В. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).To overcome the above problems associated with the type of formulation, attempts have been made, for example, to encapsulate the said anticancer agent in liposomes, nanocapsules and microspheres formed by a polymer shell formed by biodegradable copolymers such as polylactic acid or non-biodegradable copolymers such as ethylene copolymer vinyl acetate, or microspheres formed by paclitaxel-loaded polyphosphoester to create a sustained drug release system at the site of treatment (Nuijen B et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).
Однако было показано, что эти новые системы для инкапсуляции паклитаксела имеют проблемы со стабильностью, производством и воспроизводимостью.However, these new systems for paclitaxel encapsulation have been shown to have problems with stability, manufacturing, and reproducibility.
Более того, были предприняты различные попытки солюбилизировать вышеупомянутое лекарственное средство циклодекстринами, но новые препараты не давали желаемых результатов (Nuijen В. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).Moreover, various attempts have been made to solubilize the above-mentioned drug with cyclodextrins, but the new drugs have not given the desired results (Nuijen B. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).
Химические исследования новых препаратов паклитаксела, которые сделают это лекарственное средство более водорастворимым, сохраняя при этом его эффективность в качестве противоракового средства неизменной, привели в результате к синтезу новых аналогов, модифицированных в положениях С2' и С7, и, кроме того, к получению новых конъюгатов, также определяемых как пролекарства.Chemical studies of new formulations of paclitaxel that would make the drug more water soluble while maintaining its effectiveness as an anticancer agent have resulted in the synthesis of new analogues modified at the C2' and C7 positions and, in addition, to the preparation of new conjugates , also defined as prodrugs.
Имея это в виду, было предпринято несколько попыток синтезировать новые пролекарства, которые привели, например, к получению таких лекарственных средств, как ацетилпаклитаксел (Mellado W. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 124(2):329-336), или к синтезу новых сложных эфиров вышеуказанного лекарственного средства с сукцинатом, глутаратом и сульфоновой кислотой на атоме углерода в положении С2', сложных эфиров, которые, однако, оказались нестабильными в водной среде.With this in mind, several attempts have been made to synthesize new prodrugs, leading, for example, to drugs such as acetylpaclitaxel (Mellado W. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 124(2): 329-336), or to the synthesis of new esters of the above drug with succinate, glutarate and sulfonic acid on the carbon atom in position C2', esters, which, however, turned out to be unstable in an aqueous environment.
Кроме того, также известно применение ПЭГ (полиэтиленгликоля) для дериватизации вышеуказанного химиотерапевтического вещества путем этерификации паклитаксела в положении С2'. Такая новая молекула оказалась хорошо растворимой в воде, но также имела ограниченную стабильность.In addition, it is also known to use PEG (polyethylene glycol) to derivatize the above chemotherapeutic agent by esterifying paclitaxel at the C2' position. This new molecule turned out to be highly soluble in water, but also had limited stability.
Наконец, была также разработана новая система доставки вышеуказанного лекарственного средства, которую получают путем конъюгации паклитаксела с белком сывороточного альбумина (ЧСА):Finally, a new delivery system for the above drug has also been developed, which is obtained by conjugating paclitaxel with serum albumin protein (HSA):
- 1 045583 конъюгат паклитаксел-ЧСА оказался хорошо растворимым в воде, но нет достоверных данных об эффективности относительно паклитаксела per se (Nuijen В. et al., Investigational. New Drugs, 2001, 19:143-153).- 1 045583 paclitaxel-HSA conjugate was found to be highly soluble in water, but there is no reliable data on the effectiveness of paclitaxel per se (Nuijen B. et al., Investigational. New Drugs, 2001, 19:143-153).
Недавно была синтезирована новая система высвобождения паклитаксела, этерифицированного предварительно модифицированной гиалуроновой кислотой (ГК), т.е. дериватизированного молекулами гидразида, связанными с карбоксильной группой ГК амидной связью (Luo Y. et al., Biomacromolecules, 2000, 1(2):208-218) (US 5,874,417). Таким образом, была получена новая система доставки паклитаксела, которая позволяет лекарственному средству напрямую достигать поверхности мембраны опухолевой клетки-мишени, которая характеризуется сверхэкспрессией рецептора ГК CD44.Recently, a new release system for paclitaxel esterified with premodified hyaluronic acid (HA), i.e., was synthesized. derivatized by hydrazide molecules linked to the carboxyl group of HA by an amide bond (Luo Y. et al., Biomacromolecules, 2000, 1(2):208-218) (US 5,874,417). Thus, a new delivery system for paclitaxel was obtained, which allows the drug to directly reach the surface of the membrane of the target tumor cell, which is characterized by overexpression of the GC receptor CD44.
В попытке развить все возможности ассоциации паклитаксела с ГК, в результате был изучен и синтезирован новый конъюгат ГК с химиотерапевтическим веществом, причем ГК и химиотерапевтическое вещество ковалентно связаны в нем друг с другом опосредованно с помощью спейсера/линкера, такого как, например, броммасляная кислота, которая делает конечный продукт более водорастворимым и, следовательно, легким для введения (ЕР 2045270).In an attempt to develop the full potential of the association of paclitaxel with HA, a new HA-chemotherapeutic conjugate was studied and synthesized, wherein HA and the chemotherapeutic agent are covalently linked to each other indirectly through a spacer/linker, such as, for example, bromobutyric acid, which makes the final product more water soluble and therefore easier to administer (EP 2045270).
Объем настоящего изобретения заключается в определении нового способа получения и очистки, который является особенно эффективным и преодолевает отмеченные выше недостатки предшествующего уровня техники.The scope of the present invention is to identify a new production and purification process that is particularly effective and overcomes the above-mentioned disadvantages of the prior art.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Таким образом, объектом настоящего изобретения является оригинальный способ получения и очистки конъюгата гиалуроновой кислоты и паклитаксела (ГК-паклитаксела), который включает или состоит из следующих стадий:Thus, the object of the present invention is an original method for the preparation and purification of a hyaluronic acid-paclitaxel conjugate (HA-paclitaxel), which includes or consists of the following stages:
а) активация в растворе паклитаксела в органическом растворителе, предпочтительно дихлорметане, содержащем спейсер/линкер 4-броммасляной кислоты, карбоксильной группы вышеуказанного спейсера/линкера 4-броммасляной кислоты с помощью активирующего агента, предпочтительно карбодиимида, более предпочтительно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC, CAS номер 25952-53-8), в присутствии катализатора, предпочтительно DMAP (4-диметиламинопиридина), с получением интермедиата конъюгата ГК и паклитаксела (Br-С4-паклитаксела);a) activating, in a solution of paclitaxel in an organic solvent, preferably dichloromethane containing a 4-bromobutyric acid spacer/linker, the carboxyl group of said 4-bromobutyric acid spacer/linker with an activating agent, preferably a carbodiimide, more preferably 1-ethyl-3-(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC, CAS number 25952-53-8), in the presence of a catalyst, preferably DMAP (4-dimethylaminopyridine), to obtain the HA-paclitaxel conjugate intermediate (Br-C4-paclitaxel);
b) кристаллизация интермедиата, полученного на предыдущей стадии (а), в органическом растворителе, предпочтительно N-гептане, затем его фильтрация и сушка;b) crystallizing the intermediate obtained in the previous step (a) in an organic solvent, preferably N-heptane, then filtering and drying it;
c) добавление интермедиата, полученного на предыдущей стадии (b), к ТВА (тетрабутиламмониевой) соли ГК в ДМСО;c) adding the intermediate obtained in the previous step (b) to the TBA (tetrabutylammonium) salt of HA in DMSO;
d) очистка полученного таким образом конъюгата ГК-паклитаксела, который имеет сложноэфирную связь между карбоксилом полисахарида ГК и спейсером/линкером, где указанный спейсер/линкер, в свою очередь, связан сложноэфирной связью через свой карбоксил с гидроксильной группой у атома углерода в положении С2' паклитаксела, путем осаждения с помощью раствора этанол/вода, содержащего соль NaBr, по меньшей мере одной последующей промывки в этаноле/воде и дополнительной промывки в этаноле, предварительная сушка при температуре 40°C и пропускание в насыщенной водяным паром камере при температуре 40°C и атмосферном давлении, наконец, сушка при температуре 40°C под вакуумом.d) purifying the HA-paclitaxel conjugate thus obtained, which has an ester bond between the carboxyl of the HA polysaccharide and a spacer/linker, wherein said spacer/linker is in turn linked by an ester bond through its carboxyl to a hydroxyl group at the carbon atom at position C2' paclitaxel, by precipitation with an ethanol/water solution containing NaBr salt, at least one subsequent ethanol/water wash and an additional ethanol wash, pre-drying at 40°C and passing through a steam chamber at 40°C and atmospheric pressure, finally drying at 40°C under vacuum.
Еще одним объектом изобретения является конъюгат ГК-паклитаксела, имеющий степень дериватизации или этерификации в диапазоне от 15 до 21% (мас./мас.), предпочтительно в диапазоне от 16 до 20% (мас./мас.), где исходная гиалуроновая кислота имеет ферментативное происхождение и среднемассовую молекулярную массу от 140000 до 250000 Да, причем указанный конъюгат имеет форму мелкодисперсного и однородного порошка со степенью чистоты более 98% (мас.) в пересчете на сухой продукт и содержит количество ди-Br-паклитаксела менее 1% (мас.).Another aspect of the invention is a HA-paclitaxel conjugate having a degree of derivatization or esterification in the range of 15 to 21% (w/w), preferably in the range of 16 to 20% (w/w), wherein the parent hyaluronic acid has an enzymatic origin and a weight-average molecular weight from 140,000 to 250,000 Yes, and the specified conjugate is in the form of a fine and homogeneous powder with a purity of more than 98% (wt.) in terms of dry product and contains an amount of di-Br-paclitaxel less than 1% (wt.) .).
Еще одним объектом изобретения также является конъюгат ГК-паклитаксела в форме мелкодисперсного и однородного порошка, содержащего менее 1% (мас.) ди-Br-паклитаксела, полученный и очищенный, как описано, и, следовательно, чрезвычайно чистый по отношению к такому же конъюгату, полученному способом согласно ЕР 2045270.Another object of the invention is a HA-paclitaxel conjugate in the form of a fine and uniform powder containing less than 1% (wt.) di-Br-paclitaxel, prepared and purified as described, and therefore extremely pure relative to the same conjugate , obtained by the method according to EP 2045270.
Еще одним объектом изобретения также является фармацевтическая композиция, по существу состоящая из конъюгата, полученного и очищенного с помощью описанного выше способа, в сочетании с фармакологически приемлемыми разбавителями/эксципиентами, предпочтительно фармацевтическая композиция, приготовленная в стерильной изотонической воде, содержащей 5% (мас./об.) глюкозы, для применения в лечении распространенного рака молочной железы, рака легких, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы и эндометрия и мезотелиомы.Another object of the invention is also a pharmaceutical composition consisting essentially of a conjugate obtained and purified using the method described above, in combination with pharmacologically acceptable diluents/excipients, preferably a pharmaceutical composition prepared in sterile isotonic water containing 5% (wt./ vol.) glucose, for use in the treatment of advanced breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate and endometrial cancer and mesothelioma.
Композицию по настоящему изобретению применяют при лечении всех форм рака, при которых обычно применимы паклитаксел, все известные вышеперечисленные производные такого лекарственного средства и таксаны в целом.The composition of the present invention is used in the treatment of all forms of cancer for which paclitaxel, all of the above-known derivatives of such a drug and taxanes in general are commonly used.
Таким образом, в настоящем изобретении описано и заявлено получение и очистка конъюгата ГК-паклитаксела согласно оригинальному способу синтеза, состоящему во введении спейсера/линкера между гиалуроновой кислотой и вышеуказанным химиотерапевтическим веществом посредством образования сложноэфирной связи между карбоксилом вышеуказанного полисахарида и спейсером/линкером, причем указанный спейсер/линкер, в свою очередь, связан (всегда сложноэфирной свя- 2 045583 зью) через свой карбоксил с гидроксильной группой у атома углерода С2' паклитаксела, при этом спейсер/линкер, используемый для синтеза вышеуказанного конъюгата, представляет собой 4-броммасляную кислоту.Thus, the present invention describes and claims the preparation and purification of a HA-paclitaxel conjugate according to an original synthesis method consisting of introducing a spacer/linker between hyaluronic acid and the above chemotherapeutic agent by forming an ester bond between the carboxyl of the above polysaccharide and the spacer/linker, said spacer /linker, in turn, is linked (always by an ester linkage) through its carboxyl to the hydroxyl group at the C2' carbon atom of paclitaxel, the spacer/linker used for the synthesis of the above conjugate being 4-bromobutyric acid.
Такой новый способ синтеза конъюгата ГК-паклитаксела отличается от ЕР 2045270, поскольку он обеспечивает:This new method for the synthesis of the HA-paclitaxel conjugate differs from EP 2045270 because it provides:
образование конъюгата с большей степенью чистоты;formation of a conjugate with a higher degree of purity;
исключение заключительного диализа;exclusion of terminal dialysis;
сокращение использования растворителей;reducing the use of solvents;
получение исходного материала (конъюгата ГК-паклитаксела) в виде мелкодисперсного и однородного порошка, легко поддающегося стерилизации путем фильтрации после приготовления в водном растворителе;obtaining the starting material (HA-paclitaxel conjugate) in the form of a fine and homogeneous powder, easily sterilized by filtration after preparation in an aqueous solvent;
сокращение времени синтеза.reduction of synthesis time.
Полученный и очищенный таким образом конъюгат ГК-паклитаксела имел степень дериватизации в диапазоне от 15 до 21% (мас./мас.), предпочтительно в диапазоне от 16 до 20% (мас./мас.).The HA-paclitaxel conjugate thus obtained and purified had a degree of derivatization in the range of 15 to 21% (w/w), preferably in the range of 16 to 20% (w/w).
Степень дериватизации или этерификации вышеуказанного конъюгата определяют ниже как массовую процентную долю паклитаксела к массе ГК-паклитаксела, таким образом, 100 мг конъюгата со степенью дериватизации, составляющей от 15 до 21% (мас./мас.), будут содержать 15, 16, 17, 18, 19, или 20, или 21 мг химиотерапевтического вещества паклитаксел в зависимости от указанной степени дериватизации (чтобы дополнительно проиллюстрировать это, при степени дериватизации 20% (мас./мас.) в 100 мг конъюгата содержится 20 мг паклитаксела); однако специалисту в данной области техники очевидно, что в конце таких промышленных способов синтеза может происходить небольшое варьирование в соотношении массы между молекулами,поэтому здесь и далее заявитель, описывая и заявляя диапазон дериватизации вышеуказанного конъюгата, составляющий от 15 до 21% (мас./мас.), намерен заявлять все заявленные процентные значения, включающие ±1%: например, степень 20% (мас./мас.) соответственно полагают равной 20±1%.The degree of derivatization or esterification of the above conjugate is defined below as the percentage by weight of paclitaxel to the weight of HA-paclitaxel, thus 100 mg of a conjugate with a degree of derivatization ranging from 15 to 21% (w/w) will contain 15, 16, 17 , 18, 19, or 20, or 21 mg of the chemotherapy agent paclitaxel depending on the degree of derivatization indicated (to further illustrate this, at a degree of derivatization of 20% (w/w) 100 mg of conjugate contains 20 mg of paclitaxel); However, it will be apparent to one skilled in the art that at the end of such industrial synthetic processes there may be slight variation in the mass ratio between the molecules, so hereinafter the Applicant describes and claims a derivatization range of the above conjugate of 15 to 21% (w/w) .), intends to declare all stated percentages including ±1%: for example, a power of 20% (w/w) is accordingly assumed to be 20±1%.
ГК, используемая для синтеза такого конъюгата ГК-паклитаксела, может быть получена из любого источника, например, путем экстракции из петушиных гребней (например, согласно ЕР 0138572 или WO 2018/020458), или биотехнологическим путем (например, согласно ЕР 2614088 или ЕР 2614087), или предпочтительно ферментативным путем (например, согласно ЕР0716688) и иметь среднемассовую молекулярную массу (MW) в диапазоне от 400 до 3x106 Да, предпочтительно от 400 до 1x106 Да, еще более предпочтительно от 140000 до 250000 Да (среднемассовая молекулярная масса означает массу, вычисленную с помощью способа характеристической вязкости (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363377)). ГК-паклитаксел, описанный и заявленный заявителем, имеет степень дериватизации в пределах от 15 до 21% (мас./мас.), предпочтительно в пределах от 16 до 20% (мас./мас.), предпочтительно получен из ГК ферментативного происхождения со среднемассовой молекулярной массой в диапазоне от 140000 до 250000 Да.The HA used for the synthesis of such a HA-paclitaxel conjugate can be obtained from any source, for example by extraction from cockscombs (for example, according to EP 0138572 or WO 2018/020458), or biotechnologically (for example, according to EP 2614088 or EP 2614087 ), or preferably enzymatically (for example, according to EP0716688) and have a weight average molecular weight (MW) in the range from 400 to 3x106 Da, preferably from 400 to 1x106 Da, even more preferably from 140,000 to 250,000 Da (weight average molecular weight means the weight calculated using the intrinsic viscosity method (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363377)). HA-paclitaxel as described and claimed by the Applicant has a degree of derivatization ranging from 15 to 21% (w/w), preferably in the range from 16 to 20% (w/w), preferably derived from HA of enzymatic origin with weight average molecular weight in the range from 140,000 to 250,000 Da.
Конъюгат ГК-паклитаксела, описанный выше, получают и очищают в соответствии с вышеуказанным оригинальным способом синтеза, модифицированным по сравнению с предшествующим уровнем техники и, таким образом, подробно описанным ниже:The HA-paclitaxel conjugate described above is prepared and purified according to the above original synthesis method, modified from the prior art and thus described in detail below:
в растворе паклитаксела в органическом растворителе, предпочтительно дихлорметане, содержится спейсер/линкер 4-броммасляной кислоты, карбоксильную группу 4-броммасляной кислоты активируют активирующим агентом, таким как карбодиимид, предпочтительно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (EDC), в присутствии катализатора, предпочтительно DMAP (4-диметиламинопиридина), таким образом получают образование сложного эфира между гидроксильной функциональной группой при атоме углерода С2' паклитаксела и карбоксильной группой спейсера/линкера для образования интермедиата конъюгата ГК-паклитаксела, в котором связь между указанным спейсером/линкером и паклитакселом представляет собой сложноэфирную связь;a solution of paclitaxel in an organic solvent, preferably dichloromethane, contains a 4-bromobutyric acid spacer/linker, the carboxyl group of 4-bromobutyric acid is activated with an activating agent such as carbodiimide, preferably 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) , in the presence of a catalyst, preferably DMAP (4-dimethylaminopyridine), thus obtaining the formation of an ester between the hydroxyl functional group at the C2' carbon atom of paclitaxel and the carboxyl group of the spacer/linker to form a HA-paclitaxel conjugate intermediate, in which the bond between said spacer/ the linker and paclitaxel is an ester linkage;
полученный интермедиат кристаллизуют путем добавления органического растворителя, предпочтительно N-гептана, к вышеуказанному раствору, затем выделяют путем фильтрации и сушат; таким образом получают высушенный интермедиат, который затем анализируют для оценки степени чистоты с помощью метода ВЭЖХ на наличие ди-Br-паkлитаксела, количество которого благодаря вышеуказанной стадии кристаллизации резко снижается, оказываясь менее 1% (мас.), следовательно, чистота продукта такого синтеза оказывается более 98% (мас./мас.);the resulting intermediate is crystallized by adding an organic solvent, preferably N-heptane, to the above solution, then isolated by filtration and dried; the dried intermediate is thus obtained, which is then analyzed to assess the degree of purity using the HPLC method for the presence of di-Br-paclitaxel, the amount of which, due to the above crystallization step, is sharply reduced, being less than 1% (wt.), therefore, the purity of the product of this synthesis is more than 98% (w/w);
затем путем прямого контакта указанного интермедиата с ТВА (тетрабутиламмониевой) солью ГК в диметисульфоксиде (ДМСО) (ДМСО позволяет растворять такой интермедиат и оптимизирует реакцию указанного синтеза по сравнению с N-метил-2-пирролидоном (NMP) и диметилформамидом (DMF)) получают нуклеофильное замещение СОО- ГК на углероде, связанном с бромом спейсера/линкера. Таким образом, образуется сложноэфирная связь между ГК и спейсером/линкером, ранее связанным и паклитаксела;then by direct contact of this intermediate with the TBA (tetrabutylammonium) salt of HA in dimethyl sulfoxide (DMSO) (DMSO allows the dissolution of such an intermediate and optimizes the reaction of this synthesis compared to N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and dimethylformamide (DMF)) the nucleophilic substitution of COO-HA on the carbon bonded to the bromine of the spacer/linker. Thus, an ester bond is formed between the HA and the spacer/linker previously associated with paclitaxel;
полученный конъюгат таким образом очищают путем осаждения из раствора этанол/вода, содержащего NaBr (при температуре 40°C), затем промывают один или более раз в этаноле/воде и потом про- 3 045583 мывают в этаноле, затем предварительно сушат при температуре 40°C, оставляют при температуре 40°C в насыщенной водяным паром камере при атмосферном давлении и, наконец, сушат при температуреthe resulting conjugate is thus purified by precipitation from an ethanol/water solution containing NaBr (at 40°C), then washed one or more times in ethanol/water and then washed in ethanol, then pre-dried at 40°C C, left at 40°C in a steam-saturated chamber at atmospheric pressure and finally dried at
40°C под вакуумом.40°C under vacuum.
Заявитель неожиданно обнаружил, что NaBr облегчает осаждение конъюгата и, следовательно, его очистку, в то же время NaBr, в свою очередь, легко удаляется путем последующих промывок конъюгата указанными выше водно-спиртовыми растворами.The Applicant has surprisingly discovered that NaBr facilitates the precipitation of the conjugate and, therefore, its purification, while NaBr, in turn, is easily removed by subsequent washings of the conjugate with the above-mentioned aqueous-alcoholic solutions.
Стадии предварительной сушки и пропускание в насыщенной водяным паром камере при атмосферном давлении проводят при температуре 40°C в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 8 ч, а стадию сушки проводят при температуре 40°C, под вакуумом, в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 16 ч.The pre-drying and steam-boosting steps at atmospheric pressure are carried out at a temperature of 40°C for a period of at least 8 hours, and the drying step is carried out at a temperature of 40°C, under vacuum, for a period of time of at least 16 hours
Такая стадия очистки конъюгата исключает процесс диализа.This conjugate purification step eliminates the dialysis process.
Полученный конечный продукт представляет собой мелкодисперсный и однородный порошок, его анализируют методом ВЭЖХ для оценки степени дериватизации или этерификации карбоксила, и его способности фильтроваться.The resulting final product is a fine and homogeneous powder and is analyzed by HPLC to assess the degree of carboxyl derivatization or esterification and its filterability.
Таким образом, показано, что конъюгат ГК-паклитаксела, полученный и очищенный, как указано выше, свободен от загрязняющих веществ, в основном представленных следующими:Thus, the HA-paclitaxel conjugate prepared and purified as above is shown to be free of contaminants mainly represented by the following:
ди-Br-паклитаксел: полностью нежелательный побочный продукт реакции вследствие реакции этерификации двух молекул 4-броммасляной кислоты с молекулой паклитаксела по двух разным гидроксилам. Снижение содержания этого вторичного продукта является значительным улучшением процесса синтеза и очистки конъюгата, поскольку ди-Br-паклитαксел взаимодействует с двумя карбоксильными функциональными группами одной или двух молекул ГК-ТВА и, следовательно, определяет образование сшитой фармацевтической композиции, содержащей конъюгат согласно настоящем изобретению, которая полностью теряет терапевтическую эффективность и ставит под сомнение возможность стерилизации путем фильтрации с помощью 0,2 мкм фильтров;di-Br-paclitaxel: A completely undesirable reaction by-product due to the esterification reaction of two 4-bromobutyric acid molecules with a paclitaxel molecule at two different hydroxyls. Reducing the content of this secondary product is a significant improvement in the synthesis and purification of the conjugate, since di-Br-paclitαxel reacts with the two carboxyl functional groups of one or two HA-TBA molecules and, therefore, determines the formation of a cross-linked pharmaceutical composition containing the conjugate of the present invention, which completely loses therapeutic effectiveness and casts doubt on the possibility of sterilization by filtration using 0.2 micron filters;
остатки NaBr, растворителей и активирующих агентов, которые удаляются благодаря стадии кристаллизации интермедиата в N-гептане, благодаря стадии осаждения в этаноле и последующим промывкам конечного продукта ГК-паклитаксела в водно-спиртовом растворе. На практике, можно проводить процесс кристаллизации в N-гептане, и, следовательно, он включает только интермедиат, что, таким образом, приводит к чистому продукту, который легко отделить от остатков различного вида, присутствующих в реакционной среде.residues of NaBr, solvents and activating agents, which are removed due to the crystallization step of the intermediate in N-heptane, due to the precipitation step in ethanol and subsequent washings of the final product HA-paclitaxel in an aqueous-alcoholic solution. In practice, the crystallization process can be carried out in N-heptane and therefore involves only the intermediate, thus resulting in a pure product that can be easily separated from the various kinds of residues present in the reaction medium.
Благодаря всем вышеперечисленным стадиям получают чрезвычайно чистый мелкодисперсный порошкообразный конъюгат без необходимости проведения заключительного диализа, что также определяет значительную экономию растворителей.Thanks to all the above steps, an extremely pure fine powder conjugate is obtained without the need for final dialysis, which also results in significant savings in solvents.
Таким образом, способ синтеза и очистки конъюгата ГК-паклитаксела, являющийся объектом изобретения, отличается от ЕР 2045270, поскольку он обеспечивает:Thus, the method for the synthesis and purification of the HA-paclitaxel conjugate, which is the object of the invention, differs from EP 2045270, since it provides:
образование конъюгата с большей степенью чистоты;formation of a conjugate with a higher degree of purity;
исключение заключительного диализа;exclusion of terminal dialysis;
сокращение использования растворителей;reducing the use of solvents;
получение исходного материала в виде мелкодисперсного и однородного порошка, легко поддающегося стерилизации путем фильтрации после приготовления в водном растворителе;obtaining the starting material in the form of a fine and homogeneous powder, easily sterilized by filtration after preparation in an aqueous solvent;
общее сокращение времени синтеза.overall reduction in synthesis time.
Чтобы лучше проиллюстрировать объем и преимущества настоящего изобретения, приведен пример получения и очистки конъюгата ГК-паклитаксела, который, однако, никоим образом не ограничивает объем формулы изобретения.To better illustrate the scope and advantages of the present invention, an example of the preparation and purification of a HA-paclitaxel conjugate is provided, which, however, does not in any way limit the scope of the claims.
Пример 1. Получение и очистка конъюгата ГК-паклитаксела со степенью дериватизации 18% (мас./мас.).Example 1. Preparation and purification of HA-paclitaxel conjugate with a degree of derivatization of 18% (w/w).
Получение сложноэфирного производного ГК (ГК, используемая для такого синтеза, имеет среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 160000 до 230000 Да) и паклитаксела, имеющего степень дериватизации, т.е. этерификации карбоксила, 18% (мас./мас.).Preparation of the ester derivative of HA (HA used for such synthesis has a weight average molecular weight in the range from 160,000 to 230,000 Da) and paclitaxel, which has a degree of derivatization, i.e. carboxyl esterification, 18% (w/w).
110,1 мг 4-броммасляной кислоты, 151,9 мг EDC и 19,5 мг DMAP добавляли в 308,7 мг паклитаксела, растворенного в 15 мл дихлорметана, при перемешивании при температуре 10°C в течение по меньшей мере 40 мин. Затем к полученному таким образом раствору добавляли воду; после перемешивания в течение нескольких минут органической фазе давали отделиться. Органическую фазу собирали, а водную фазу (содержащую соли и остаток бромида) удаляли. К полученной таким образом органической фазе добавляли 25 мл N-гептана при температуре 10°C, получая кристаллизацию интермедиата, затем выделяли путем фильтрации и таким образом сушили. Таким образом, было получено 301 мг высушенного продукта-интермедиата.110.1 mg of 4-bromobutyric acid, 151.9 mg of EDC and 19.5 mg of DMAP were added to 308.7 mg of paclitaxel dissolved in 15 ml of dichloromethane with stirring at 10°C for at least 40 minutes. Water was then added to the solution thus obtained; after stirring for several minutes, the organic phase was allowed to separate. The organic phase was collected and the aqueous phase (containing the salts and bromide residue) was removed. To the organic phase thus obtained, 25 ml of N-heptane was added at a temperature of 10°C, obtaining crystallization of the intermediate, then isolated by filtration and thus dried. Thus, 301 mg of dried intermediate product was obtained.
300 мг такого интермедиата было добавлено в раствор 1000 мг ГК-ТВА (соли ГК с тетрабутиламмонием), растворенной в 44 мл ДМСО. Через 1 день реакции при температуре 40°C в раствор добавляли 50 мл ДМСО. Через 1 ч медленно по каплям добавляли раствор этанол/вода в соотношении 96/4, содержащий NaBr с концентрацией 2% (мас./мас.), получая таким образом осадок полученного конъюгата, который многократно промывали в этаноле/воде (8,5/1,5), окончательно повторно промывали 100% эта- 4 045583 нолом и затем предварительно сушили при температуре 40°C в течение 8 ч. Предварительно высушенный продукт затем оставляли при 40°C в насыщенной водяным паром камере при атмосферном давлении еще на 8 ч и, наконец, сушили при 40°C в вакууме не менее 16 ч, но до полного высыхания.300 mg of this intermediate was added to a solution of 1000 mg of HA-TBA (tetrabutylammonium salt of HA) dissolved in 44 ml of DMSO. After 1 day of reaction at 40°C, 50 ml of DMSO was added to the solution. After 1 hour, a 96/4 ethanol/water solution containing NaBr at a concentration of 2% (w/w) was slowly added dropwise, thereby obtaining a precipitate of the resulting conjugate, which was washed repeatedly in ethanol/water (8.5/wt). 1.5), was finally washed again with 100% ethanol and then pre-dried at 40°C for 8 hours. The pre-dried product was then left at 40°C in a steam-saturated chamber at atmospheric pressure for another 8 hours and finally, dried at 40°C in a vacuum for at least 16 hours, but until completely dry.
Полученный конъюгат ГК-паклитаксела анализировали методом ВЭЖХ (Rosato A., Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2006, 24:207-215), чтобы проверить, что эффективная степень дериватизации составила 18% (мас./мас.); методом ВЭЖХ высушенного интермедиата (Theodoridis G. et al., Application Note, August 1999:40-44) определили количество ди-Br-паклитаксела, которое составило менее 1% (мас.) (как продемонстрировано ниже), степень чистоты конъюгата составила более 98% (мас.) в пересчете на сухой продукт.The resulting HA-paclitaxel conjugate was analyzed by HPLC (Rosato A., Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2006, 24:207-215) to verify that the effective degree of derivatization was 18% (w/w); HPLC analysis of the dried intermediate (Theodoridis G. et al., Application Note, August 1999:40-44) determined the amount of di-Br-paclitaxel to be less than 1% (wt.) (as demonstrated below), the purity of the conjugate was more than 98% (wt.) in terms of dry product.
Конъюгат ГК-паклитаксела, полученный как описано выше, представляет собой бело-желтоватый порошок, однородный и гигроскопичный, легко стерилизуемый путем фильтрации с помощью 0,2 мкм фильтров при восстановлении в водной среде в виде фармацевтической композиции.The HA-paclitaxel conjugate prepared as described above is a white-yellowish powder, homogeneous and hygroscopic, easily sterilized by filtration using 0.2 μm filters when reconstituted in an aqueous medium as a pharmaceutical composition.
Пример 2 сравнительный. Получение и очистка конъюгата ГК-паклитаксела согласно WO 2004/035629 (ЕР 2045270).Example 2 is comparative. Preparation and purification of the HA-paclitaxel conjugate according to WO 2004/035629 (EP 2045270).
Получение сложноэфирного производного ГК и паклитаксела со степенью этерификации карбоксила 18% (мас./мас.).Preparation of an ester derivative of HA and paclitaxel with a degree of carboxyl esterification of 18% (w/w).
Чтобы продемонстрировать, что способ, являющийся объектом изобретения, превосходит предшествующий уровень техники, представленный способом, описанным в WO 2004/035629, заявитель приготовил конъюгат ГК-паклитаксела в соответствии с примером 6 из WO 2004/035629, изменив массовую концентрацию различных компонентов, для получения конъюгата ГК-паклитаксела со степенью этерификации карбоксила 18% (мас./мас.), чтобы сравнить такое производное в отношении чистоты и способности фильтроваться с конъюгатом ГК-паклитаксела из примера 1 данного документа.To demonstrate that the method subject to the invention is superior to the prior art represented by the method described in WO 2004/035629, the Applicant prepared a HA-paclitaxel conjugate in accordance with Example 6 of WO 2004/035629, varying the mass concentration of the various components to obtain HA-paclitaxel conjugate with a degree of carboxyl esterification of 18% (w/w) to compare such derivative in terms of purity and filterability with the HA-paclitaxel conjugate of Example 1 herein.
Используемая ГК имеет среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 160000 до 230000 Да, как в примере 1.The HA used has a weight average molecular weight in the range from 160,000 to 230,000 Da, as in example 1.
Вкратце, к 308,7 мг паклитаксела, растворенного в 15 мл дихлорметана, добавляли 117,2 мг 4-броммасляной кислоты и 614,1 мг EDC. Затем в раствор добавляли воду для удаления всего бромида и карбодиимида. В полученный таким образом органический раствор добавляли сульфат натрия для обезвоживания, а растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. В итоге, было получено 363 мг высушенного интермедиата.Briefly, 117.2 mg of 4-bromobutyric acid and 614.1 mg of EDC were added to 308.7 mg of paclitaxel dissolved in 15 ml of dichloromethane. Water was then added to the solution to remove all bromide and carbodiimide. Sodium sulfate was added to the organic solution thus obtained for dehydration, and the solvent was removed using a rotary evaporator. As a result, 363 mg of dried intermediate was obtained.
315 мг полученного таким образом интермедиата добавляли к ГК-ТВА, растворенного в безводном NMP, раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 7 дней, после чего добавляли 20 мл бидистиллированной воды и 4 мл насыщенного раствора NaCl. Его перемешивали в течение 1 ч, чтобы обеспечить обмен натрия с ионом ТВА. Затем по каплям добавляли этанол и полученный таким образом волокнистый продукт растворяли в воде, подвергали диализу и, наконец, лиофилизировали.315 mg of the intermediate thus obtained was added to HA-TBA dissolved in anhydrous NMP, the solution was stirred at room temperature for 7 days, after which 20 ml of double-distilled water and 4 ml of saturated NaCl solution were added. It was stirred for 1 hour to allow exchange of sodium with the TBA ion. Ethanol was then added dropwise and the fibrous product thus obtained was dissolved in water, dialyzed and finally lyophilized.
Конъюгат ГК-паклитаксела, полученный в соответствии с примером 2, анализировали методом ВЭЖХ, чтобы проверить, что полученная эффективная степень дериватизации составила 18% (мас./мас.).The HA-paclitaxel conjugate prepared according to Example 2 was analyzed by HPLC to verify that the effective degree of derivatization obtained was 18% (w/w).
Таким образом, два конъюгата из примеров 1 и 2 сравнивали для проверки их чистоты в отношении количества ди-Br-паклитаксела (сшитого побочного продукта реакции), присутствующего и определяемого в высушенном интермедиате из примеров 1 и 2 (методом ВЭЖХ в отношении высушенного интермедиата, Theodoridis G. et al., Application Note, August 1999:40-44), и способности фильтроваться через фильтры из ацетата целлюлозы (Minisart®, 0,2 мкм), которые гарантируют квалифицированному специалисту стерильность продукта, измеренную при давление 2 атм.Thus, the two conjugates of Examples 1 and 2 were compared to check their purity with respect to the amount of di-Br-paclitaxel (a cross-linked reaction by-product) present and detectable in the dried intermediate of Examples 1 and 2 (by HPLC on the dried intermediate, Theodoridis G. et al., Application Note, August 1999:40-44), and the ability to be filtered through cellulose acetate filters (Minisart®, 0.2 microns), which guarantee to the qualified specialist the sterility of the product, measured at a pressure of 2 atm.
Испытание на способность фильтроваться.Filterability test.
Для проведения испытания использовали небольшой стальной бак (Sartorius Stedim объемом 0,22 л) с входным отверстием для сжатого воздуха (регулируемым манометром) в верхней части и выходным отверстием в нижней части. В бак загружали 15 мл раствора ГК-паклитаксела, растворенного до концентрации 12 мг/мл в глюкозе концентрацией 5% (мас./мас.). Под баком, на выходном отверстии, установлен фильтр 0,2 мкм (Minisart, СЕ, Sterile). Поток сжатого воздуха регулировали для получения давления около 1,5 бар внутри стального бака с целью проталкивания раствора через стерильный фильтр. В момент начала фильтрации включали хронометр и, поместив градуированный цилиндр под выходное отверстие фильтра, измеряли отфильтрованный объем с течением времени.The test was carried out using a small steel tank (Sartorius Stedim 0.22 L) with a compressed air inlet (adjustable pressure gauge) at the top and an outlet at the bottom. The tank was loaded with 15 ml of HA-paclitaxel solution, dissolved to a concentration of 12 mg/ml in glucose with a concentration of 5% (w/w). Under the tank, at the outlet, there is a 0.2 micron filter (Minisart, CE, Sterile). The compressed air flow was adjusted to obtain a pressure of approximately 1.5 bar inside the steel tank to force the solution through the sterile filter. At the start of filtration, the chronometer was turned on and, by placing a graduated cylinder under the outlet of the filter, the filtered volume was measured over time.
Результаты.Results.
Конъюгат ГК-паклитаксела, полученный согласно примеру 1:HA-paclitaxel conjugate prepared according to example 1:
ди-Br-паклитаксел (мас./мас.) (процентная массовая доля относительно массы интермедиата): 0,8%;di-Br-paclitaxel (wt./wt.) (percentage mass fraction relative to the mass of the intermediate): 0.8%;
способность фильтроваться (раствор 12 мг/мл конъюгата в растворе глюкозы концентрацией 5% (мас./мас.)): 4,5 мл/мин.filterability (12 mg/ml solution of conjugate in 5% (w/w) glucose solution): 4.5 ml/min.
Конъюгат ГК-паклитаксела, полученный согласно примеру 2:HA-paclitaxel conjugate prepared according to example 2:
ди-Br-паклитаксел (мас./мас): 5,2%;di-Br-paclitaxel (w/w): 5.2%;
способность фильтроваться: 0,04 мл/мин.filterability: 0.04 ml/min.
В заключение, полученные результаты показывают, что конъюгированный ГК-паклитаксел, полученный согласно способу изобретения, отличается:In conclusion, the results obtained show that the conjugated HA-paclitaxel obtained according to the method of the invention is different:
очень высокой степенью чистоты при совершенно незначительном количестве ди-Br-паклитаксела;very high degree of purity with a very small amount of di-Br-paclitaxel;
- 5 045583 высокой способностью отфильтровываться через 0,2 мкм фильтры, которые, как известно специалисту в данной области, обеспечивают стерильность фильтрата (фильтрующая способность 0,04 мл/мин является признаком мало/плохо фильтруемого продукта, поэтому не поддается стерилизации через фильтры 0,2 мкм, что делает необходимым выбор альтернативного метода стерилизации, такого как термическая или радиационная стерилизация, причем оба метода, однако, определяют, как широко известно, частичное разрушение продуктов, подвергнутых таким процессам, особенно производных сложных эфиров).- 5 045583 high ability to be filtered through 0.2 micron filters, which, as is known to a person skilled in the art, ensure the sterility of the filtrate (filtration capacity of 0.04 ml/min is a sign of a poorly/poorly filtered product, and therefore cannot be sterilized through filters 0. 2 µm, necessitating the choice of an alternative sterilization method such as heat or radiation sterilization, both methods, however, are widely known to cause partial destruction of products subjected to such processes, especially ester derivatives).
Наконец, способ по изобретению приводит к значительному снижению количества используемого растворителя, поскольку в таком способе не проводится очистка путем диализа конъюгата, запланированная, однако, в известном специалисту способе, что приводит к значительному сокращению времени приготовления конъюгата по примеру 1-2 в сравнении.Finally, the method according to the invention leads to a significant reduction in the amount of solvent used, since in this method there is no purification by dialysis of the conjugate, planned, however, in a method known to the person skilled in the art, which leads to a significant reduction in the preparation time of the conjugate according to example 1-2 in comparison.
Таким образом, полученный конъюгат имел оптимальные характеристики по сравнению с конъюгатом, полученным в предшествующем уровне техники (WO 2004/035629), и, кроме того, обеспечивалась значительная экономия издержек и времени.Thus, the resulting conjugate had optimal characteristics compared to the conjugate obtained in the prior art (WO 2004/035629), and, in addition, significant cost and time savings were achieved.
Claims (11)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102020000008209 | 2020-04-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045583B1 true EA045583B1 (en) | 2023-12-07 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2384593C2 (en) | Taxanes covalently bonded with hyaluronic acid or hyaluronic acid derivatives | |
| KR101614157B1 (en) | Antitumoral bioconjugates of hyaluronic acid or its derivatives obtained by indirect chemical conjugation | |
| EP2219616A2 (en) | Lyophilized pharmaceutical composition with improved stability containing taxane derivatives, and method of manufacturing the same | |
| Nichols et al. | Selective oxidation of 2-hydroxypropyl ethers of cellulose and dextran: Simple and efficient introduction of versatile ketone groups to polysaccharides | |
| CN115379862A (en) | Method for synthesizing conjugates of hyaluronic acid and paclitaxel | |
| EA045583B1 (en) | METHOD FOR SYNTHESIS OF HYALURONIC ACID AND PACLITAXEL CONJUGATE | |
| Guo et al. | Drug content on anticancer efficacy of self-assembling ketal-linked dextran-paclitaxel conjugates | |
| JP2021176932A (en) | Carboxylated degradable polyrotaxane and method for producing the same | |
| JP5514718B2 (en) | Hyperbranched polymers based on cyclodextrins and poly (amidoamines) for controlled release of insoluble drugs | |
| Jelonek et al. | Correlation between the composition of PLA-based folate targeted micelles and release of phosphonate derivative of betulin | |
| Petrova et al. | Threading the needle: Achieving simplicity and performance in cellulose alkanoate ω-carboxyalkanoates for amorphous solid dispersion |