EA045557B1 - SYSTEMS AND METHODS FOR DETECTING A TYPE OF FAILURE IN INDUSTRIAL CHROMATOGRAPHY - Google Patents
SYSTEMS AND METHODS FOR DETECTING A TYPE OF FAILURE IN INDUSTRIAL CHROMATOGRAPHY Download PDFInfo
- Publication number
- EA045557B1 EA045557B1 EA202290812 EA045557B1 EA 045557 B1 EA045557 B1 EA 045557B1 EA 202290812 EA202290812 EA 202290812 EA 045557 B1 EA045557 B1 EA 045557B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- composition
- chromatogram
- chromatography
- column
- peak
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 109
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 132
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 55
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 30
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 26
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 claims description 25
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 235000019633 pungent taste Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 claims 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 claims 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Substances OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012857 repacking Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Description
Родственные заявкиRelated applications
Для настоящей заявки испрашивается приоритет по заявке на патент США с серийным номеромThis application claims priority to U.S. patent application serial no.
62/631167, поданной 15 февраля 2018 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.62/631167, filed February 15, 2018, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
Область техникиField of technology
Настоящее изобретение относится в целом к способам очистки биологических продуктов, включая обнаружение ошибок в процессе хроматографии в реальном времени.The present invention relates generally to methods for the purification of biological products, including detection of errors in the chromatography process in real time.
Уровень техникиState of the art
Успешное и своевременное определение типа сбоя в процессе хроматографии белков может быть проблематичным, и это обусловлено не только специфичностью типа сбоя для каждой отдельной операции, связанной с программой, но и отсутствием доступного для использования способа автоматического обнаружения. Это особенно верно для крупномасштабного производства. Таким образом, давно существует неудовлетворенная потребность в системе и способе масштабируемого обнаружения типа сбоя без остановки производства. В настоящем изобретении предложены новая система и способ, направленные на удовлетворение и решение указанной потребности.Successfully and timely identification of the type of failure in a protein chromatography process can be challenging, due not only to the specificity of the type of failure to each individual operation associated with the program, but also to the lack of an automatic detection method available for use. This is especially true for large-scale production. Thus, there has been a long-standing unmet need for a system and method for scalable failure type detection without stopping production. The present invention provides a new system and method aimed at meeting and solving this need.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
В настоящем изобретении предложены системы и способы для мониторинга промышленных хроматограмм в автоматическом или полуавтоматическом режиме. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению сравнивают измеренную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема с максимальной интенсивностью поглощения, полученной на основании по меньшей мере одной эталонной хроматограммы, и указанную измеренную интенсивность поглощения используют для определения нестабильности хроматографической матрицы, и благодаря прогнозированию и/или идентификации приближающегося сбоя, предложенный способ обеспечивает улучшение производственных показателей в любом масштабе. Соответственно в настоящем изобретении предложены способы и устройства, подходящие для обнаружения типа сбоя в процессе хроматографии.The present invention provides systems and methods for monitoring industrial chromatograms in an automatic or semi-automatic mode. In some embodiments of the methods of the present invention, the measured absorbance intensity over a range of integrated volumes is compared with the maximum absorbance intensity obtained from at least one reference chromatogram, and the measured absorbance intensity is used to determine the instability of the chromatographic matrix, and through prediction and/or identification approaching failure, the proposed method provides improved production performance at any scale. Accordingly, the present invention provides methods and apparatuses suitable for detecting a type of failure in a chromatography process.
В настоящем изобретении предложен способ прогнозирования или обнаружения сбоя в процессе хроматографии, включающий (а) получение эталонной хроматограммы с помощью хроматографической колонки;The present invention provides a method for predicting or detecting failure in a chromatography process, comprising (a) obtaining a reference chromatogram using a chromatography column;
(b) получение промышленной хроматограммы с помощью указанной хроматографической колонки; и (с) обнаружение атипичного профиля на промышленной хроматограмме, причем атипичный профиль означает возможный или реальный сбой в процессе хроматографии.(b) obtaining an industrial chromatogram using said chromatography column; and (c) detection of an atypical profile in the industrial chromatogram, the atypical profile indicating a possible or actual failure in the chromatography process.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предложенный способ дополнительно включает (d) генерирование предупредительного сигнала.In some embodiments of the methods of the present invention, the proposed method further includes (d) generating an alert signal.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предложенный способ дополнительно включает (е) переупаковку хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the proposed method further comprises (f) repacking the chromatography column.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в ионообменной хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography column is suitable for use in ion exchange chromatography.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в аффинной хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography column is suitable for use in affinity chromatography.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в хроматографии гидрофобного взаимодействия.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography column is suitable for use in hydrophobic interaction chromatography.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению возможный или реальный сбой процесса хроматографии обусловлен износом колонки. В некоторых вариантах реализации износ колонки включает разрушение слоя в колонке.In some embodiments of the methods of the present invention, potential or actual failure of the chromatography process is due to column wear. In some embodiments, column wear includes failure of a layer in the column.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации дополнительный пик появляется во время стадии промывания в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации стадия промывания предшествует стадии элюирования в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации дополнительный пик появляется во время стадии промывания и предшествует стадии элюирования в процессе хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram. In some embodiments, an additional peak appears during the washing step of the chromatography process. In some embodiments, the washing step precedes the elution step in the chromatography process. In some embodiments, an additional peak appears during the washing step and precedes the elution step of the chromatography process.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмма, интенсивность дополнительного пика означает степень серьезности потенциального или реального сбоя в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации увеличение интенсивности дополнительного пика означает увеличение степени серьезности потенциального или реального сбоя в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации сбой в процессе хроматографии вызывает снижение разделительной способности хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram, the intensity of the additional peak indicates the severity of a potential or actual failure in the chromatography process. In some embodiments, an increase in the intensity of an additional peak indicates an increase in the severity of a potential or actual failure in the chromatography process. In some embodiments, a failure in the chromatography process causes a decrease in the separation ability of the chromatography column.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме, атипичный профиль включает по мень- 1 045557 шей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом положении на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность, возникает на стадии промывания. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность, возникает после стадии элюирования.In some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak on the production chromatogram compared to a comparable position on the reference chromatogram, the atypical profile includes at least one peak or at least one depression on industrial chromatogram, having reduced sharpness or reduced intensity compared to a peak or depression at a comparable position in the reference chromatogram. In some embodiments, at least one peak or at least one depression in the production chromatogram having reduced pungency or reduced intensity occurs during the washing step. In some embodiments, at least one peak or at least one depression in the production chromatogram having reduced severity or reduced intensity occurs after the elution step.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме, атипичный профиль включает первый пик или первое углубление, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность на промышленной хроматограмме по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом первом положении на эталонной хроматограмме, и второй пик или второе углубление, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность на промышленной хроматограмме по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом втором положении на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации первый пик или первое углубление возникает после стадии элюирования. В некоторых вариантах реализации первый пик или первое углубление соответствует углублению, возникающему в начале стадии сбора. В некоторых вариантах реализации второй пик или второе углубление возникает после стадии сбора. В некоторых вариантах реализации второй пик или второе углубление включает пик десорбции.In some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak on the production chromatogram compared to a comparable position on the reference chromatogram, the atypical profile includes a first peak or first depression having a reduced pungency or reduced intensity on the production chromatogram according to compared to a peak or depression at a comparable first position on the reference chromatogram, and a second peak or depression having reduced sharpness or reduced intensity on the commercial chromatogram compared to a peak or depression at a comparable second position on the reference chromatogram. In some embodiments, the first peak or first valley occurs after the elution step. In some embodiments, the first peak or first valley corresponds to a depression that occurs at the beginning of the collection stage. In some embodiments, a second peak or second valley occurs after the collection step. In some embodiments, the second peak or second valley includes a desorption peak.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению промышленная хроматограмма имеет измеренную интенсивность поглощения, максимальную интенсивность поглощения и диапазон интегрального объема. В некоторых вариантах реализации атипичный профиль включает измеренную интенсивность поглощения, которая превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения измеряют при длине волны, соответствующей ультрафиолетовому (УФ) свету. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны от 260 до 280 нанометров (нм), включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 260 нм с получением значения А260. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 280 нм с получением значения А280. В некоторых вариантах реализации атипичный профиль имеет измеренную интенсивность поглощения, которая превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема, и при этом максимальная интенсивность поглощения имеет значение А260 или значение А280 по меньшей мере 0,05. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению атипичный профиль имеет измеренную интенсивность поглощения, которая не превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема, и при этом максимальная интенсивность поглощения имеет значение А260 или значение А280 по меньшей мере 0,05 или менее.In some embodiments of the methods of the present invention, the industrial chromatogram has a measured absorbance intensity, a maximum absorbance intensity, and an integral volume range. In some embodiments, the atypical profile includes a measured absorption intensity that exceeds the maximum absorption intensity in the integral volume range. In some embodiments, the measured absorption intensity is measured at a wavelength corresponding to ultraviolet (UV) light. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 260 to 280 nanometers (nm), including endpoints. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 260 nm to obtain an A 260 value. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 280 nm to obtain an A 280 value. In some embodiments, the atypical profile has a measured absorption intensity that exceeds the maximum absorption intensity in the integral volume range, and wherein the maximum absorption intensity has an A 260 value or an A 280 value of at least 0.05. In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile has a measured absorption intensity that does not exceed the maximum absorption intensity in the integral volume range, and wherein the maximum absorption intensity has an A 260 value or an A 280 value of at least 0.05 or less.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля измеряют во время стадии элюирования предыдущего колоночного процесса. В некоторых вариантах реализации значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля определяют при длине волны, соответствующей ультрафиолетовому (УФ) свету. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны от 260 до 280 нм, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 260 нм с получением значения А260. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 280 нм с получением значения А280. В некоторых вариантах реализации после получения значения, означающего атипичный профиль, направляют сигнал, который указывает на износ колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile and/or typical profile absorbance value is measured during the elution step of the previous column process. In some embodiments, the atypical profile and/or typical profile absorption intensity value is determined at a wavelength corresponding to ultraviolet (UV) light. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 260 to 280 nm, including the end points. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 260 nm to obtain an A 260 value. In some embodiments, the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 280 nm to obtain an A 280 value. In some embodiments, upon receiving a value indicating an atypical profile, a signal is sent that indicates column wear.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля измеряют во время стадии элюирования предыдущего колоночного процесса. В некоторых вариантах реализации значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля определяют посредством оценки уровня рН элюата на стадии элюирования. В некоторых вариантах реализации рН означает атипичный профиль, поскольку данное значение рН выше значения, ожидаемого на основании типичного профиля. В некоторых вариантах реализации рН означает атипичный профиль, поскольку данное значение рН ниже значения, ожидаемого на основании типичного профиля. В некоторых вариантах реализации после получения значения, означающего атипичный профиль, направляют сигнал, который указывает на износ колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile and/or typical profile absorbance value is measured during the elution step of the previous column process. In some embodiments, the atypical profile and/or typical profile absorbance intensity value is determined by assessing the pH of the eluate during the elution step. In some embodiments, pH indicates an atypical profile because the given pH value is higher than the value expected based on the typical profile. In some embodiments, pH indicates an atypical profile because the pH value is lower than the value expected based on the typical profile. In some embodiments, upon receiving a value indicating an atypical profile, a signal is sent that indicates column wear.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1 до 5000 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1000 до 3000 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1000 до 2500 л, включая конечные точки. В некоторыхIn some embodiments of the methods of the present invention, the range of integral volume occurs from 1 to 5000 L, including end points. In some embodiments of the methods of the present invention, the integral volume range occurs from 1000 to 3000 L, including end points. In some embodiments of the methods of the present invention, the integral volume range occurs from 1000 to 2500 L, including end points. In some
- 2 045557 вариантах реализации диапазон интегрального объема возникает от 1250 до 2250 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации диапазон интегрального объема возникает от 1600 л до 1800 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает в объеме 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000,- 2 045557 embodiments, the range of integral volume occurs from 1250 to 2250 l, including end points. In some embodiments, the integral volume range occurs from 1600 L to 1800 L, including end points. In some embodiments of the methods of the present invention, the integral volume range occurs at a volume of 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000,
4000, 5000 л или в любом количестве литров между указанными значениями.4000, 5000 liters or any number of liters in between.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка содержит Q-сефарозную анионообменную смолу.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography column contains a Q-Sepharose anion exchange resin.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадия (а) получения эталонной хроматограммы включает (1) приведение в контакт исходной композиции, содержащей множество заранее определенных аналитов, и разделительной композиции, содержащей матрицу, в условиях, достаточных для обратимого связывания с матрицей по меньшей мере одного аналита из исходной композиции, причем хроматографическая колонка содержит разделительную композицию, с получением колонки, связанной с аналитом, и первой отработанной композиции;In some embodiments of the methods of the present invention, step (a) of obtaining a reference chromatogram includes (1) contacting a source composition containing a plurality of predetermined analytes and a separation composition containing a matrix under conditions sufficient to reversibly bind to the matrix of at least one analyte from the feed composition, the chromatography column containing a separation composition to provide an analyte-coupled column and a first spent composition;
(2) приведение в контакт колонки, связанной с аналитом, со стадии (1) и промывочной композиции, причем связанным с матрицей остается лишь по меньшей мере один аналит из исходной композиции, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и второй отработанной композиции;(2) contacting the analyte-coupled column of step (1) and the wash composition, with only at least one analyte from the original composition remaining bound to the matrix, to produce a purified analyte-coupled column and a second spent composition;
(3) приведение в контакт очищенной колонки, связанной с аналитом, со стадии (2) и элюирующей композиции, причем указанный по меньшей мере один аналит из исходной композиции высвобождается из матрицы в элюирующую композицию, с получением композиции элюированного аналита;(3) contacting the purified analyte column from step (2) and an eluting composition, wherein said at least one analyte from the original composition is released from the matrix into the eluting composition, to obtain an eluted analyte composition;
(4) сбор композиции элюированного аналита;(4) collecting the eluted analyte composition;
(5) одновременно с каждой из стадий (1)-(4), приведение в контакт каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита с ультрафиолетовым (УФ) светом;(5) simultaneously with each of steps (1)-(4), contacting each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition with ultraviolet (UV) light;
(6) измерение поглощения УФ света каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита; и (7) получение хроматограммы посредством нанесения на график значения поглощения каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита в зависимости от объема жидкости, проходящей через хроматографическую колонку.(6) measuring the UV light absorption of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition; and (7) obtaining a chromatogram by plotting the absorbance value of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition as a function of the volume of liquid passing through the chromatography column.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадия (b) получения промышленной хроматограммы включает (1) приведение в контакт исходной композиции, содержащей множество тестируемых аналитов, и разделительной композиции, содержащей матрицу, в условиях, достаточных для обратимого связывания с матрицей по меньшей мере одного аналита из исходной композиции, причем хроматографическая колонка содержит разделительную композицию, с получением колонки, связанной с аналитом, и первой отработанной композиции;In some embodiments of the methods of the present invention, step (b) of obtaining a commercial chromatogram includes (1) contacting a source composition containing a plurality of test analytes and a separating composition containing a matrix under conditions sufficient to reversibly bind at least one an analyte from a feed composition, the chromatography column containing a separation composition to provide an analyte-coupled column and a first spent composition;
(2) приведение в контакт колонки, связанной с аналитом, со стадии (1) и промывочной композиции, причем связанным с матрицей остается лишь по меньшей мере один аналит из исходной композиции, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и второй отработанной композиции;(2) contacting the analyte-coupled column of step (1) and the wash composition, with only at least one analyte from the original composition remaining bound to the matrix, to produce a purified analyte-coupled column and a second spent composition;
(3) приведение в контакт очищенной колонки, связанной с аналитом, со стадии (2), и элюирующей композиции, причем указанный по меньшей мере один аналит из исходной композиции высвобождается из матрицы в элюирующую композицию, с получением композиции элюированного аналита;(3) contacting the purified analyte column from step (2) and an eluting composition, wherein said at least one analyte from the original composition is released from the matrix into the eluting composition, to obtain an eluted analyte composition;
(4) сбор композиции элюированного аналита;(4) collecting the eluted analyte composition;
(5) одновременно с каждой из стадий (1)-(4), приведение в контакт каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита с ультрафиолетовым (УФ) светом;(5) simultaneously with each of steps (1)-(4), contacting each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition with ultraviolet (UV) light;
(6) измерение поглощения УФ света каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита; и (7) получение хроматограммы посредством нанесения на график значения поглощения каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита в зависимости от объема жидкости, проходящей через хроматографическую колонку.(6) measuring the UV light absorption of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition; and (7) obtaining a chromatogram by plotting the absorbance value of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition as a function of the volume of liquid passing through the chromatography column.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадии (а) или (b) получения хроматограммы включают(ет) стадию (5) приведения в контакт и стадию (6) измерения, и, кроме того, указанная стадия (5) приведения в контакт и стадия (6) измерения являются непрерывными. В некоторых вариантах реализации стадия (5) приведения в контакт и стадия (6) измерения являются одновременными, последовательными или чередующимися и непрерывными.In some embodiments of the methods according to the present invention, steps (a) or (b) of obtaining a chromatogram include a contacting step (5) and a measuring step (6), and, in addition, said contacting step (5) and stage (6) measurements are continuous. In some embodiments, the contacting step (5) and the measuring step (6) are simultaneous, sequential, or alternating and continuous.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка содержит матрицу, и указанная матрица содержит смолу.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography column contains a matrix, and said matrix contains a resin.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению и, в частности, в отношении стадий (а) или (b) получения хроматограммы, тестируемый аналит представляет собой биологическую композицию. В некоторых вариантах реализации биологическая композиция представляет собой терапевтическую композицию для применения в способе лечения человека. В некоторых вариан- 3 045557 тах реализации биологическая композиция содержит терапевтический белок.In some embodiments of the methods of the present invention, and in particular with respect to steps (a) or (b) of obtaining a chromatogram, the test analyte is a biological composition. In some embodiments, the biological composition is a therapeutic composition for use in a method of treating a human. In some embodiments, the biological composition contains a therapeutic protein.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предупредительный сигнал передают в электронном виде в процессор, а процессор функционально связан с хроматографической колонкой. В некоторых вариантах реализации процессор принимает предупредительный сигнал и прерывает процесс хроматографии или не допускает начало следующего хроматографического процесса до устранения возможного или реального сбоя хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the alert signal is electronically transmitted to a processor, and the processor is operably coupled to the chromatography column. In some embodiments, the processor receives the warning signal and aborts the chromatography process or prevents the next chromatography process from starting until the potential or actual failure of the chromatography column is resolved.
Дополнительные аспекты и варианты реализации настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания.Additional aspects and embodiments of the present invention will become apparent from the following detailed description.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На фиг. 1 представлены эталонные хроматограммы, известные по литературным данным.In fig. Figure 1 shows standard chromatograms known from the literature.
На фиг. 2 представлена еще одна эталонная хроматограмма.In fig. Figure 2 shows another reference chromatogram.
На фиг. 3 представлена хроматограмма, отображающая не отвечающий нормам пик 2 промывания.In fig. Figure 3 shows a chromatogram showing the non-standard wash peak 2.
На фиг. 4 представлена хроматограмма, отображающая не отвечающий нормам пик 2 промывания, не отвечающие нормам пики элюирования и снижение остроты пика десорбции.In fig. Figure 4 shows a chromatogram showing non-standard wash peak 2, non-standard elution peaks and a decrease in the severity of the desorption peak.
На фиг. 5 представлена некорректная хроматограмма. Присутствует пик 2 промывания.In fig. Figure 5 shows an incorrect chromatogram. Wash peak 2 is present.
На фиг. 6 представлено сравнение типичной и атипичной хроматограмм VEGF-Trap Q. Большинство атипичных УФ следов имеют поглощение >0,05 ед. оптической плотности (AU) при 635 л при 2 промывании.In fig. Figure 6 shows a comparison of typical and atypical VEGF-Trap Q chromatograms. Most of the atypical UV traces have an absorbance of >0.05 units. optical density (AU) at 635 l with 2 washes.
На фиг. 7 представлены дополнительные атипичные хроматограммы VEGF-Trap Q, т.е. примеры пика 2 промывания.In fig. 7 shows additional atypical VEGF-Trap Q chromatograms, i.e. examples of peak 2 wash.
На фиг. 8 представлены дополнительные типичные хроматограммы VEGF-Trap Q. УФ следы не превышают поглощение 0,05 при 635 л при 2 промывании.In fig. Figure 8 shows additional typical chromatograms of VEGF-Trap Q. UV traces do not exceed 0.05 absorbance at 635 L with 2 washes.
Подробное описаниеDetailed description
Успешное и своевременное определение типа сбоя в процессе хроматографии белков, особенно при крупномасштабном производстве, может быть проблематичным, и это обусловлено не только специфичностью типа сбоя для каждой отдельной операции, связанной с программой, но и отсутствием доступного для использования способа автоматического обнаружения, который обеспечивают композиции и способы согласно настоящему изобретению.Successfully and timely identification of the type of failure in a protein chromatography process, especially in large-scale production, can be problematic, and this is due not only to the specificity of the type of failure for each individual operation associated with the program, but also to the lack of readily available automatic detection method that compositions provide and methods according to the present invention.
В настоящем изобретении предложена новая система Watch и способ обнаружения типа сбоя. Новая система Watch и способ мониторинга с помощью хроматографической колонки предназначены для оповещения оператора о том, что колонка не выполняет заданную функцию. Системы Watch и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают автоматический мониторинг сигналов системы в течение всего времени для определения оптимальной работы колонки. Если система не соответствует критериям приемлемости, то оператор получает сообщение с указанием о необходимости добавления данного события в систему контроля качества и обеспечения возможности дальнейшего изучения и возможного исправления. Контролируемые сигналы, значимая интенсивность сигнала и диапазоны времени интегрирования определяют эмпирически для эксплуатации каждой отдельной хроматографической установки, подлежащей мониторингу.The present invention provides a new Watch system and a method for detecting the type of failure. The new Watch system and chromatography column monitoring method are designed to alert the operator when the column is not performing as intended. Watch systems and methods of the present invention automatically monitor system signals at all times to determine optimal column performance. If the system does not meet the acceptance criteria, the operator receives a message indicating that the event should be added to the quality control system and allow further investigation and possible correction. Monitored signals, significant signal intensities and integration time ranges are determined empirically for the operation of each individual chromatography installation to be monitored.
Хроматография.Chromatography.
Системы и способы согласно настоящему изобретению можно использовать для препаративной или аналитической хроматографии. В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению используют для очистки белков, которые можно использовать в композиции для лечения какого-либо заболевания. Эффективность процесса очистки особенно важна для тех способов, которые включают препаративную хроматографию для крупномасштабной очистки или очистки терапевтических белков в большом объеме. Системы и способы согласно настоящему изобретению можно использовать в любом масштабе. Однако они особенно применимы, когда в процессе используется большое количество препаратов, а также в том случае, если сбой системы (такой как проскок ценного аналита через разделительную композицию в хроматографической колонке, где он должен улавливаться) приводит к потере ценного продукта и ценного производственного времени. Системы и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают прогнозирование и обнаружение сбоя в процессе хроматографии в реальном времени и, благодаря идентификации неисправного процесса, обеспечивают возможность восстановления функции и возврата к эффективной и надежной очистке до выполнения последующих работ с неисправным процессом.The systems and methods of the present invention can be used for preparative or analytical chromatography. In some embodiments, the methods of the present invention are used to purify proteins that can be used in a composition to treat a disease. The efficiency of the purification process is especially important for those methods that involve preparative chromatography for large-scale or high-volume purification of therapeutic proteins. The systems and methods of the present invention can be used at any scale. However, they are particularly useful when a process involves a large number of drugs or when a system failure (such as a valuable analyte leaking through the separation composition in the chromatography column where it should be captured) results in the loss of valuable product and valuable production time. The systems and methods of the present invention provide real-time prediction and detection of failure in a chromatography process and, by identifying the faulty process, provide the ability to restore function and return to efficient and reliable purification before further work is performed on the faulty process.
Настоящее изобретение предусматривает любую форму хроматографии. Как метод, хроматография представляет собой способ выделения компонентов из смеси. Выделение осуществляют посредством разделения с помощью подвижной фазы и неподвижной фазы.The present invention contemplates any form of chromatography. As a technique, chromatography is a method of isolating components from a mixture. Isolation is carried out by separation using a mobile phase and a stationary phase.
Как описано в настоящем документе, исходные композиции, содержащие тестируемый аналит, необязательно также для получения, принадлежат к подвижной фазе. Как описано в настоящем документе, разделительные композиции, содержащие матрицу, принадлежат к неподвижной фазе. Иллюстративные матрицы согласно настоящему изобретению могут содержать любой материал, обладающий способностью разделять элементы подвижной фазы по химическим свойствам (заряду) и/или по физическим свойствам (размеру).As described herein, the source compositions containing the test analyte, optionally also for preparation, belong to the mobile phase. As described herein, release compositions containing a matrix belong to the stationary phase. Exemplary matrices of the present invention may contain any material having the ability to separate mobile phase elements by chemical properties (charge) and/or physical properties (size).
- 4 045557- 4 045557
В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, включая способы получения терапевтических белков, процессы хроматографии могут включать, но не ограничиваются ими, колоночную и плоскостную хроматографию. В некоторых предпочтительных вариантах реализации процессы хроматографии могут включать, но не ограничиваются ими, колоночную хроматографию.In accordance with some embodiments of the present invention, including methods for producing therapeutic proteins, chromatography processes may include, but are not limited to, column chromatography and plane chromatography. In some preferred embodiments, chromatography processes may include, but are not limited to, column chromatography.
Колоночная хроматография.Column chromatography.
Настоящее изобретение предусматривает любую форму колоночной хроматографии, включая влажный и сухой способы. В сухом способе разделительная композиция содержит сухую матрицу, которую затем приводят в контакт с жидкой исходной композицией, оптимально смачивая всю матрицу и не допуская высыхания матрицы до окончания всего процесса. Во влажном способе разделительная композиция содержит суспензию или взвесь матрицы и элюента, которую вводят в колонку и затем приводят в контакт с жидкой исходной композицией.The present invention contemplates any form of column chromatography, including wet and dry methods. In the dry method, the release composition contains a dry matrix, which is then brought into contact with the liquid starting composition, optimally wetting the entire matrix and preventing the matrix from drying out until the end of the entire process. In the wet method, the release composition contains a suspension or slurry of matrix and eluent, which is introduced into the column and then brought into contact with the liquid starting composition.
Ионообменная хроматография.Ion exchange chromatography.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы по заряду. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая обратимо связывает заряженный белковый аналит из исходной композиции. Таким образом, разделительная матрица может быть пригодна для анионо- или катионообменной хроматографии и может содержать матрицу, имеющую суммарный отрицательный или положительный заряд, соответственно. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция содержит матрицу, содержащую сефарозу или Q-сефарозу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения хроматографическая колонка представляет собой Q-колонку.In some embodiments of the present invention, the release composition may contain any material having the ability to separate elements of the mobile phase by charge. For example, the release composition may contain a matrix that reversibly binds a charged protein analyte from the original composition. Thus, the separation matrix may be suitable for anion or cation exchange chromatography and may contain a matrix having a net negative or positive charge, respectively. In some embodiments of the present invention, the release composition contains a matrix containing Sepharose or Q-Sepharose. In some embodiments of the present invention, the chromatography column is a Q column.
Аффинная хроматография.Affinity chromatography.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании специфических взаимодействий между партнерами по связыванию, включая, но не ограничиваясь ими, партнеры по связыванию антиген/антитело, партнеры по связыванию фермент/субстрат, партнеры по связыванию рецептор/лиганд, партнеры по связыванию белок/белок, партнеры по связыванию белок/нуклеиновая кислота и партнеры по связыванию нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая обратимо связывается с одним партнером из партнеров по связыванию (например, с аналитом из исходной композиции), поскольку содержит другой партнер из партнеров по связыванию. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая содержит антиген, с которым специфически связывается аналит из исходной композиции, что обеспечивает селективную очистку антитела-аналита из исходного материала. В качестве дополнительной иллюстрации, разделительная композиция может содержать матрицу, которая содержит эпитоп белка VEGF, с которым селективно связывается VEGF-Trap, что обеспечивает селективную очистку аналита VEGF-Trap из исходного материала.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material having the ability to separate mobile phase elements based on specific interactions between binding partners, including, but not limited to, antigen/antibody binding partners, enzyme/substrate binding partners, receptor/ligand binding partners, protein/protein binding partners, protein/nucleic acid binding partners, and nucleic acid/nucleic acid binding partners. For example, the release composition may contain a matrix that reversibly binds to one of the binding partners (eg, an analyte from the original composition) because it contains another of the binding partners. For example, the release composition may contain a matrix that contains an antigen to which an analyte from the starting composition specifically binds, allowing for selective purification of the antibody analyte from the starting material. As a further illustration, the release composition may contain a matrix that contains a VEGF protein epitope to which VEGF-Trap selectively binds, allowing selective purification of the VEGF-Trap analyte from the starting material.
Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC).Hydrophobic interaction chromatography (HIC).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их относительной гидрофобности. HIC можно использовать для селективной очистки белкового аналита с сохранением его биологической активности благодаря применению условий и матриц, которые работают в менее денатурирующих условиях. В некоторых вариантах реализации аналиты согласно настоящему изобретению, содержащие гидрофобные и гидрофильные области, приводят в контакт с колонкой HIC в буфере с высоким содержанием соли. Соль в буфере снижает сольватацию растворенного вещества аналита в исходном материале. В результате снижения сольватации гидрофобные области, которые становятся обнаженными, адсорбируются средой. Чем более гидрофобной является молекула в исходном материале, тем меньше соли нужно для промотирования связывания. Можно использовать убывающий градиент соли для элюирования образцов из колонки в порядке повышения гидрофобности. Элюирующие буферы согласно настоящему изобретению также могут содержать слабый органический модификатор или мягкий детергент.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material having the ability to separate mobile phase elements based on their relative hydrophobicity. HIC can be used to selectively purify a protein analyte while maintaining its biological activity by using conditions and matrices that operate under less denaturing conditions. In some embodiments, analytes of the present invention containing hydrophobic and hydrophilic regions are contacted with an HIC column in a high salt buffer. Salt in the buffer reduces solvation of the analyte solute in the starting material. As a result of reduced solvation, hydrophobic regions that become exposed are adsorbed by the medium. The more hydrophobic the molecule in the starting material, the less salt is needed to promote binding. A decreasing salt gradient can be used to elute samples from the column in order of increasing hydrophobicity. The elution buffers of the present invention may also contain a weak organic modifier or mild detergent.
Эксклюзионная хроматография (SEC).Size exclusion chromatography (SEC).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их относительного размера или, в некоторых случаях, относительной молекулярной массы. SEC можно использовать для селективной очистки крупных молекул или макромолекулярных комплексов, таких как белки и полимеры. В некоторых вариантах реализации, например, в тех вариантах реализации, в которых используют водный раствор для переноса подвижной фазы через колонку, указанная технология известна как гельфильтрационная хроматография. В некоторых вариантах реализации, например, в тех вариантах реализации, в которых в качестве подвижной фазы, пропускаемой через колонку, используют органический растворитель, указанная технология известна как гельпроникающая хроматография. В некоторых вариантах реализации хроматографическая колонка упакована мелкими пористыми гранулами, состоящими, например, из декстрановых полимеров (Sephadex), агарозы (Sepharose) или полиакри- 5 045557 ламида (Sephacryl или BioGel P). Размер пор указанных гранул используют для оценки размеров макромолекул. Гельфильтрационную хроматографию можно использовать для фракционирования белковых аналитов и других водорастворимых полимеров, а гельпроникающую хроматографию можно использовать для фракционирования растворимых в органических растворителях полимеров по молекулярномассовому распределению.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material having the ability to separate elements of the mobile phase based on their relative size or, in some cases, relative molecular weight. SEC can be used for the selective purification of large molecules or macromolecular complexes such as proteins and polymers. In some embodiments, such as those that use an aqueous solution to transport the mobile phase through a column, the technology is known as gel filtration chromatography. In some embodiments, for example, in those embodiments in which an organic solvent is used as the mobile phase passed through the column, the technology is known as gel permeation chromatography. In some embodiments, the chromatography column is packed with fine porous beads consisting of, for example, dextran polymers (Sephadex), agarose (Sepharose), or polyacrylamide (Sephacryl or BioGel P). The pore size of these granules is used to estimate the size of macromolecules. Gel filtration chromatography can be used to fractionate protein analytes and other water-soluble polymers, and gel permeation chromatography can be used to fractionate organic solvent-soluble polymers by molecular weight distribution.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).High performance liquid chromatography (HPLC).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы по их взаимодействию с материалом адсорбента разделительной композиции, которое обусловливает различную скорость движения различных компонентов и приводит к разделению компонентов по мере их вытекания из колонки. Аналиты в подвижной фазе можно разделять, например, на основании гидрофобного, ионного или диполь-дипольного взаимодействия. В основе ВЭЖХ лежит действие насоса, обеспечивающего прохождение под давлением жидкого растворителя, содержащего подвижную фазу, через колонку, наполненную твердым материалом адсорбента. В некоторых вариантах реализации активный компонент колонки, адсорбент, содержит гранулированный материал из твердых частиц (например, диоксида кремния или полимеров). Иллюстративный размер частиц включает 2-50 мкм, и столь малый размер может обеспечивать превосходную эффективность разделения ВЭЖХ хроматографии. В некоторых вариантах реализации подвижная фаза под давлением представляет собой смесь растворителей, таких как вода, ацетонитрил и/или метанол. В некоторых вариантах реализации ВЭЖХ насос обеспечивает смешение нескольких растворителей друг с другом в соотношениях, изменяющихся в зависимости от времени, что обеспечивает градиентный состав подвижной фазы. В некоторых вариантах реализации водный компонент подвижной фазы содержит кислоты (такие как муравьиная, фосфорная или трифторуксусная кислота) или соли для облегчения разделения компонентов образца. В некоторых вариантах реализации ВЭЖХ включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.In some embodiments of the present invention, the separating composition may contain any material that has the ability to separate elements of the mobile phase by their interaction with the adsorbent material of the separating composition, which causes different rates of movement of the various components and leads to the separation of the components as they flow from the column. Analytes in the mobile phase can be separated, for example, based on hydrophobic, ionic or dipole-dipole interactions. HPLC relies on the action of a pump to force a pressurized liquid solvent containing a mobile phase through a column filled with solid adsorbent material. In some embodiments, the active component of the column, the adsorbent, contains particulate granular material (eg, silica or polymers). Exemplary particle sizes include 2-50 μm, and such a small size can provide excellent HPLC chromatography separation efficiency. In some embodiments, the pressurized mobile phase is a mixture of solvents such as water, acetonitrile, and/or methanol. In some embodiments, the HPLC pump mixes multiple solvents with each other in ratios that vary over time, providing a gradient composition of the mobile phase. In some embodiments, the aqueous component of the mobile phase contains acids (such as formic, phosphoric, or trifluoroacetic acid) or salts to facilitate separation of sample components. In some embodiments, HPLC includes partition chromatography, normal phase chromatography, size exclusion chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or aqueous normal phase chromatography.
Жидкостная экспресс-хроматография белков (FPLC).Express liquid chromatography of proteins (FPLC).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их различного сродства к разделительной композиции. Жидкостная экспресс-хроматография белков (FPLC) представляет собой форму жидкостной хроматографии, которую используют для разделения смесей белковых аналитов. В некоторых вариантах реализации разделение возможно, поскольку различные компоненты подвижной фазы обладают разной аффинностью к подвижной фазе и неподвижной фазе (разделительной композиции). В некоторых вариантах реализации подвижная фаза представляет собой водный раствор или буфер. Скорость потока буфера можно регулировать с помощью насоса вытесняющего действия. В некоторых вариантах реализации скорость потока буфера является постоянной, а состав буфера варьируется. В некоторых вариантах реализации неподвижная фаза представляет собой смолу, состоящую из гранул, например, из гранул агарозы. Специалисты в данной области техники могут изменять размеры гранул и поверхность лигандов неподвижной фазы в зависимости от подвижной фазы и аналитов в конкретном случае применения.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material having the ability to separate elements of the mobile phase based on their different affinities for the release composition. Flash protein liquid chromatography (FPLC) is a form of liquid chromatography used to separate mixtures of protein analytes. In some embodiments, separation is possible because the various components of the mobile phase have different affinities for the mobile phase and the stationary phase (separation composition). In some embodiments, the mobile phase is an aqueous solution or buffer. The buffer flow rate can be controlled using a displacement pump. In some implementations, the buffer flow rate is constant, but the composition of the buffer varies. In some embodiments, the stationary phase is a resin composed of beads, such as agarose beads. Those skilled in the art can vary the bead sizes and surface area of the stationary phase ligands depending on the mobile phase and analytes in a particular application.
В некоторых вариантах реализации FPLC включает ионообменную хроматографию. Например, смола неподвижной фазы связывается с белковым аналитом благодаря взаимодействию зарядов в первом буфере (подвижном буфере), но диссоциирует во втором буфере (элюирующем буфере). Смесь, содержащую один или более белковых аналитов, растворяют в первом буфере и закачивают в колонку под давлением. Требуемые белки связываются со смолой, а другие компоненты выходят вместе с первым буфером. Общую скорость потока буфера поддерживают постоянной. С течением времени процент элюирующего буфера постепенно повышают от 0 до 100% в соответствии с запрограммированным изменением концентрации с получением градиента. В определенный момент градиентного изменения каждый из связанных белковых аналитов диссоциирует и появляется в элюате. Затем элюат пропускают через детекторы. Иллюстративные детекторы могут обеспечивать измерение концентрации соли в элюате (по проводимости) и концентрации белка в элюате (по поглощению ультрафиолетового света).In some embodiments, FPLC includes ion exchange chromatography. For example, a stationary phase resin binds to a protein analyte due to charge interactions in the first buffer (the running buffer), but dissociates in the second buffer (the elution buffer). A mixture containing one or more protein analytes is dissolved in a first buffer and pumped into the column under pressure. The required proteins are bound to the resin, and other components are released along with the first buffer. The overall buffer flow rate is kept constant. Over time, the percentage of elution buffer is gradually increased from 0 to 100% in accordance with the programmed change in concentration to produce a gradient. At a certain point along the gradient, each of the bound protein analytes dissociates and appears in the eluate. The eluate is then passed through detectors. Exemplary detectors may provide measurements of salt concentration in the eluate (by conductivity) and protein concentration in the eluate (by ultraviolet light absorption).
Повышение давления.Increased pressure.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению поток подвижной фазы через неподвижную фазу регулируется силой тяжести. В некоторых вариантах реализации гравитационную хроматографию используют для одностадийной очистки, такой как обессоливание и аффинное связывание. Типичная гравитационная колонка содержит верхний элемент, буферный резервуар, функционально связанный с хроматографической колонкой, имеющей выходное отверстие в нижней части. Поток регулируют с помощью запорного крана или зажима на трубке между буферным резервуаром и колонкой. Можно использовать адаптеры потока для минимизации вариабельности при загрузке образца. В некоторых вариантах реализации гравитационная хроматография включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовуюIn some embodiments of the methods of the present invention, the flow of the mobile phase through the stationary phase is controlled by gravity. In some embodiments, gravity chromatography is used for one-step purification, such as desalting and affinity binding. A typical gravity column contains a top member, a buffer reservoir, operably coupled to a chromatography column having an outlet at the bottom. Flow is controlled by a stopcock or clamp on the tubing between the buffer reservoir and the column. Flow adapters can be used to minimize variability in sample loading. In some embodiments, gravity chromatography includes partition chromatography, normal phase chromatography, size exclusion chromatography, reversed phase
- 6 045557 хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.- 6 045557 chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography or aqueous normal phase chromatography.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию низкого давления. В некоторых вариантах реализации хроматографическая система низкого давления представляет собой систему, которая работает при давлении менее 50 фунт/кв. дюйм (~3 бар (0,3 МПа)).In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography includes low pressure chromatography. In some embodiments, the low pressure chromatography system is a system that operates at a pressure of less than 50 psig. inch (~3 bar (0.3 MPa)).
Хроматографию низкого давления можно использовать для разделения белков, не требующего высокого разделения.Low pressure chromatography can be used to separate proteins that do not require high separation.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию среднего давления. В некоторых вариантах реализации хроматографическая система среднего давления представляет собой систему, которая работает при давлении до 3500 фунт/кв.дюйм (~24 МПа). Хроматографическая система среднего давления обеспечивает достаточное давление для размещения композиций неподвижной фазы с высокой разделительной способностью, например, с гранулами размером 5-15 мкм. В некоторых вариантах реализации хроматография среднего давления включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography includes medium pressure chromatography. In some embodiments, the medium pressure chromatography system is a system that operates at pressures up to 3500 psi (~24 MPa). The medium pressure chromatography system provides sufficient pressure to accommodate stationary phase compositions with high separation power, such as 5-15 µm beads. In some embodiments, medium pressure chromatography includes partition chromatography, normal phase chromatography, size exclusion chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or aqueous normal phase chromatography.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию высокого давления, например, ВЭЖХ.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography includes high pressure chromatography, such as HPLC.
Подвижная фаза.Mobile phase.
Настоящее изобретение предусматривает любую форму подвижной фазы, включая, но не ограничиваясь ими, элюент, растворитель, стерильный растворитель и фармацевтически приемлемый носитель. Элюирующие композиции согласно настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель.The present invention provides for any form of mobile phase, including, but not limited to, eluent, solvent, sterile solvent and pharmaceutically acceptable carrier. The elution compositions of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
Неподвижная фаза.Stationary phase.
Настоящее изобретение предусматривает любую форму неподвижной фазы, включая, но не ограничиваясь ими, диоксид кремния, оксид алюминия (Al2O3), целлюлозу, сефарозу и Q-сефарозу. Иллюстративные разделительные композиции согласно настоящему изобретению могут содержать матрицу, полимер, смолу, белок или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации разделительная композиция содержит сефарозу или Q-сефарозу.The present invention provides for any form of stationary phase, including, but not limited to, silica, alumina (Al 2 O 3 ), cellulose, Sepharose and Q-Sepharose. Exemplary release compositions of the present invention may contain a matrix, polymer, resin, protein, or a combination thereof. In some embodiments, the release composition comprises Sepharose or Q-Sepharose.
Хроматограммы.Chromatograms.
В данном контексте хроматограмма представляет собой визуальный выходной сигнал хроматографа. Как правило, время удерживания и/или объем выходящего потока элюата представляют на оси х хроматограммы, а сигнал наносят на оси у. Иллюстративные сигналы включают, но не ограничиваются ими, электрическую проводимость, поглощение света и масс-спектрометрию и соответствуют реакции детектора на аналиты, выходящие из хроматографа. В некоторых вариантах реализации указанный сигнал пропорционален концентрации конкретного аналита, выделяемого с помощью хроматографа.In this context, a chromatogram is the visual output of a chromatograph. Typically, the retention time and/or volume of eluate effluent is plotted on the x-axis of the chromatogram, and the signal is plotted on the y-axis. Exemplary signals include, but are not limited to, electrical conductivity, light absorption, and mass spectrometry and correspond to the response of the detector to analytes leaving the chromatograph. In some embodiments, the signal is proportional to the concentration of a particular analyte isolated by the chromatograph.
В одном иллюстративном варианте реализации концентрацию белка, измеренную по поглощению света, наносят на ось у хроматограммы. Многие белки в растворе поглощают свет, например, ультрафиолетовый свет с длиной волны 280 нм, что можно использовать для расчета концентрации белка в образце. В зависимости от белка, предусмотрены дополнительные длины волн света. Например, белки, содержащие группы гемма или флуорофоры, обнаруживают при другой длине волны света. Специалисты в данной области техники могут выбрать подходящую систему обнаружения для конкретного аналита.In one exemplary embodiment, protein concentration, measured by light absorption, is plotted on the y-axis of the chromatogram. Many proteins in solution absorb light, such as ultraviolet light at 280 nm, which can be used to calculate the protein concentration in a sample. Depending on the protein, additional wavelengths of light are provided. For example, proteins containing heme groups or fluorophores are detected at a different wavelength of light. Those skilled in the art can select an appropriate detection system for a particular analyte.
Биологические образцы.Biological samples.
В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению аналит содержит белок, пептид, нуклеиновую кислоту или вирус. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). В некоторых вариантах реализации вирус представляет собой аденовирус, аденоассоциированный вирус или лентивирус.In some embodiments of the methods of the present invention, the analyte contains a protein, peptide, nucleic acid, or virus. In some embodiments, the nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). In some embodiments, the virus is an adenovirus, adeno-associated virus, or lentivirus.
ПримерыExamples
Пример. Очистка VEGF Trap.Example. Cleaning VEGF Trap.
На фиг. 1-8 представлены иллюстративные эталонные хроматограммы (фиг. 1 и 2), а также иллюстративные промышленные хроматограммы, имеющие атипичный профиль (фиг. 3-5), с использованием VEGF-Trap в качестве иллюстративного аналита для очистки.In fig. 1-8 show exemplary reference chromatograms (FIGS. 1 and 2), as well as exemplary industrial chromatograms having an atypical profile (FIGS. 3-5), using VEGF-Trap as an exemplary purification analyte.
Кратко хроматограммы на фиг. 1-8 получали посредством приведения в контакт исходной композиции, содержащей множество аналитов (аналиты VEGF-Trap, а также множество примесей (например, белков клетки-хозяина, ДНК и слабо сиалилированных белков)), и разделительной композиции, содержащей матрицу (в данном примере Q-сефарозу), в условиях, достаточных для обратимого связывания по меньшей мере одного белка VEGF-Trap исходной композиции с матрицей, причем хроматографическая колонка содержала разделительную композицию, с получением колонки, связанной с аналитом, и первойBrief chromatograms in Fig. 1-8 were prepared by contacting a source composition containing a plurality of analytes (VEGF-Trap analytes, as well as a variety of impurities (e.g., host cell proteins, DNA, and weakly sialylated proteins)) and a release composition containing a matrix (in this example Q-Sepharose), under conditions sufficient to reversibly bind at least one VEGF-Trap protein of the original composition to the matrix, wherein the chromatography column contained a separating composition, to produce an analyte-bound column and a first
--
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/631,167 | 2018-02-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045557B1 true EA045557B1 (en) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5148484B2 (en) | Chromatographic matrix regeneration | |
| CA2632519A1 (en) | Polishing steps used in multi-step protein purification processes | |
| JP2024023764A (en) | System and method for detecting failure mode in processing chromatography | |
| US20130213884A1 (en) | Chromatography system with guard columns | |
| EA045557B1 (en) | SYSTEMS AND METHODS FOR DETECTING A TYPE OF FAILURE IN INDUSTRIAL CHROMATOGRAPHY | |
| US12025599B2 (en) | Systems and methods for failure mode detection in process chromatography | |
| EA040301B1 (en) | SYSTEMS AND METHODS FOR FAILURE TYPE DETECTION IN INDUSTRIAL CHROMATOGRAPHY | |
| JPH0225147B2 (en) | ||
| WO2023052358A1 (en) | Methods for monitoring chromatography resins during continuous chromatography operation | |
| King Jr | Co-adsorption of Albumin and Immunoglobulin G from Human Serum onto cation exchanger mixed mode adsorbent. | |
| US20080160629A1 (en) | Methods and systems for off-line multidimensional concentration and separation of biomolecules | |
| Nölting et al. | Liquid chromatography of biomolecules | |
| Shukla et al. | Screening of chromatographic stationary phases | |
| Sedzik et al. | Gels Mimicking Antibodies in Their Selective Recognition of Proteins and Its Potential Use for Protein Crystallization | |
| Smith et al. | Enrichment of Human Urinary Proteins Using Solid‐Phase Extraction Column Chromatography |