EA040301B1

EA040301B1 - SYSTEMS AND METHODS FOR FAILURE TYPE DETECTION IN INDUSTRIAL CHROMATOGRAPHY

Info

Publication number: EA040301B1
Application number: EA202091717
Authority: EA
Inventors: Нэтен Л. Мао; Скотт Карвер; Бернхард Шиллинг; Эрик Ширли
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2018-02-15
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2022-05-18

Description

Родственные заявкиRelated Applications

Для настоящей заявки испрашивается приоритет по заявке на патент США с серийным номеромThis application claims priority over U.S. patent application serial number

62/631167, поданной 15 февраля 2018 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.62/631167, filed February 15, 2018, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится, в целом, к способам очистки биологических продуктов, включая обнаружение ошибок в процессе хроматографии в реальном времени.The present invention relates generally to methods for purifying biological products, including the detection of errors in a real time chromatography process.

Уровень техникиState of the art

Успешное и своевременное определение типа сбоя в процессе хроматографии белков может быть проблематичным, и это обусловлено не только специфичностью типа сбоя для каждой отдельной операции, связанной с программой, но и отсутствием доступного для использования способа автоматического обнаружения. Это особенно верно для крупномасштабного производства. Таким образом, давно существует неудовлетворенная потребность в системе и способе масштабируемого обнаружения типа сбоя без остановки производства. В настоящем изобретении предложены новая система и способ, направленные на удовлетворение и решение указанной потребности.Successful and timely determination of the type of failure in a protein chromatography process can be problematic, and this is due not only to the specificity of the type of failure for each individual operation associated with the program, but also the lack of an automatic detection method available for use. This is especially true for large scale production. Thus, there has long been an unmet need for a system and method for scalable failure type detection without shutting down production. The present invention proposes a new system and method aimed at satisfying and solving this need.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

В настоящем изобретении предложены системы и способы для мониторинга промышленных хроматограмм в автоматическом или полуавтоматическом режиме. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению сравнивают измеренную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема с максимальной интенсивностью поглощения, полученной на основании по меньшей мере одной эталонной хроматограммы, и указанную измеренную интенсивность поглощения используют для определения нестабильности хроматографической матрицы, и благодаря прогнозированию и/или идентификации приближающегося сбоя предложенный способ обеспечивает улучшение производственных показателей в любом масштабе. Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы и устройства, подходящие для обнаружения типа сбоя в процессе хроматографии.The present invention provides systems and methods for monitoring industrial chromatograms in automatic or semi-automatic mode. In some embodiments of the methods of the present invention, the measured absorbance in the cumulative volume range is compared with the maximum absorbance obtained from at least one reference chromatogram, and the measured absorbance is used to determine the instability of the chromatographic matrix, and due to the prediction and / or identification approaching failure, the proposed method provides an improvement in production performance at any scale. Accordingly, the present invention provides methods and apparatus suitable for detecting a type of failure in a chromatography process.

В настоящем изобретении предложен способ прогнозирования или обнаружения сбоя в процессе хроматографии, включающий: (а) получение эталонной хроматограммы с помощью хроматографической колонки, (b) получение промышленной хроматограммы с помощью указанной хроматографической колонки и (с) обнаружение атипичного профиля на промышленной хроматограмме, причем атипичный профиль означает возможный или реальный сбой в процессе хроматографии.The present invention provides a method for predicting or detecting a failure in a chromatography process, comprising: (a) obtaining a reference chromatogram using a chromatographic column, (b) obtaining an industrial chromatogram using said chromatographic column, and (c) detecting an atypical profile on a commercial chromatogram, and an atypical profile means a possible or real failure in the chromatography process.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предложенный способ дополнительно включает (d) генерирование предупредительного сигнала.In some embodiments of the methods of the present invention, the proposed method further comprises (d) generating an alert signal.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предложенный способ дополнительно включает (е) переупаковку хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the proposed method further comprises (e) repackaging the chromatographic column.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в ионообменной хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatographic column is suitable for use in ion exchange chromatography.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в аффинной хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatographic column is suitable for use in affinity chromatography.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка подходит для применения в хроматографии гидрофобного взаимодействия.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatographic column is suitable for use in hydrophobic interaction chromatography.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению возможный или реальный сбой процесса хроматографии обусловлен износом колонки.In some embodiments of the methods according to the present invention, a possible or actual failure of the chromatography process is due to column wear.

В некоторых вариантах реализации износ колонки включает разрушение слоя в колонке.In some embodiments, the wear of the column includes the destruction of the layer in the column.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации дополнительный пик появляется во время стадии промывания в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации стадия промывания предшествует стадии элюирования в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации дополнительный пик появляется во время стадии промывания и предшествует стадии элюирования в процессе хроматографии.In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram. In some embodiments, an additional peak appears during the washing step of the chromatography process. In some embodiments, the washing step precedes the elution step in the chromatography process. In some embodiments, an additional peak appears during the washing step and precedes the elution step in the chromatography process.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмма, интенсивность дополнительного пика означает степень серьезности потенциального или реального сбоя в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации увеличение интенсивности дополнительного пика означает увеличение степени серьезности потенциального или реального сбоя в процессе хроматографии. В некоторых вариантах реализации сбой в процессе хроматографии вызывает снижение разделительной способности хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram, the intensity of the additional peak indicates the severity of a potential or actual failure in the chromatography process. In some implementations, an increase in the intensity of an additional peak means an increase in the severity of a potential or actual failure in the chromatography process. In some embodiments, a failure in the chromatography process causes a reduction in the separation capacity of the chromatographic column.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме, атипичный профиль включает по меньшей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющееIn some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram, the atypical profile includes at least one peak or at least one dimple in the production chromatogram having

- 1 040301 сниженную остроту или сниженную интенсивность по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом положении на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность, возникает на стадии промывания. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один пик или по меньшей мере одно углубление на промышленной хроматограмме, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность, возникает после стадии элюирования.- 1 040301 reduced sharpness or reduced intensity compared to a peak or depression at a comparable position on the reference chromatogram. In some embodiments, at least one peak or at least one dip in a commercial chromatogram having reduced sharpness or reduced intensity occurs during the washing step. In some embodiments, at least one peak or at least one recess in a commercial chromatogram having reduced sharpness or reduced intensity occurs after the elution step.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению, включая те, в которых атипичный профиль включает дополнительный пик на промышленной хроматограмме по сравнению с сопоставимым положением на эталонной хроматограмме, атипичный профиль включает первый пик или первое углубление, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность на промышленной хроматограмме по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом первом положении на эталонной хроматограмме, и второй пик или второе углубление, имеющее сниженную остроту или сниженную интенсивность на промышленной хроматограмме по сравнению с пиком или углублением в сопоставимом втором положении на эталонной хроматограмме. В некоторых вариантах реализации первый пик или первое углубление возникает после стадии элюирования. В некоторых вариантах реализации первый пик или первое углубление соответствует углублению, возникающему в начале стадии сбора. В некоторых вариантах реализации второй пик или второе углубление возникает после стадии сбора. В некоторых вариантах реализации второй пик или второе углубление включает пик десорбции.In some embodiments of the methods of the present invention, including those in which the atypical profile includes an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position in the reference chromatogram, the atypical profile includes a first peak or a first dimple having reduced sharpness or reduced intensity in the production chromatogram according to compared to a peak or recess at a comparable first position in the reference chromatogram, and a second peak or second recess having reduced sharpness or reduced intensity in the commercial chromatogram compared to a peak or recess at a comparable second position in the reference chromatogram. In some embodiments, the first peak or first dimple occurs after the elution step. In some embodiments, the first peak or first dimple corresponds to the dimple that occurs at the start of the collection step. In some embodiments, the second peak or second dimple occurs after the collection step. In some embodiments, the second peak or second recess includes a desorption peak.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению промышленная хроматограмма имеет измеренную интенсивность поглощения, максимальную интенсивность поглощения и диапазон интегрального объема. В некоторых вариантах реализации атипичный профиль включает измеренную интенсивность поглощения, которая превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения измеряют при длине волны, соответствующей ультрафиолетовому (УФ) свету. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны от 260 до 280 нм, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 260 нм с получением значения A₂₆₀. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 280 нм с получением значения A₂₈₀. В некоторых вариантах реализации атипичный профиль имеет измеренную интенсивность поглощения, которая превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема, и при этом максимальная интенсивность поглощения имеет значение A₂₆₀ или значение А₂₈₀ по меньшей мере 0,05. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению атипичный профиль имеет измеренную интенсивность поглощения, которая не превышает максимальную интенсивность поглощения в диапазоне интегрального объема, и при этом максимальная интенсивность поглощения имеет значение A₂₆₀ или значение A₂₈₀ по меньшей мере 0,05 или менее.In some embodiments of the methods of the present invention, a commercial chromatogram has a measured absorbance, a maximum absorbance, and an cumulative volume range. In some embodiments, the atypical profile includes a measured uptake intensity that is greater than the maximum uptake intensity in the cumulative volume range. In some embodiments, the measured absorption intensity is measured at a wavelength corresponding to ultraviolet (UV) light. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 260 to 280 nm, including endpoints. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 260 nm to give an A ₂₆₀ value. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 280 nm to give an A ₂₈₀ value. In some embodiments, the atypical profile has a measured uptake intensity that is greater than the maximum uptake intensity in the cumulative volume range, and the maximum uptake intensity has an A ₂₆₀ value or an A ₂₈₀ value of at least 0.05. In some embodiments of the methods of the present invention, the atypical profile has a measured uptake intensity that does not exceed the maximum uptake intensity in the cumulative volume range, and the maximum uptake intensity has an A ₂₆₀ value or an A ₂₈₀ value of at least 0.05 or less.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля измеряют во время стадии элюирования предыдущего колоночного процесса. В некоторых вариантах реализации значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля определяют при длине волны, соответствующей ультрафиолетовому (УФ) свету. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны от 260 до 280 нм, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 260 нм с получением значения A₂₆₀. В некоторых вариантах реализации измеренную интенсивность поглощения определяют при длине волны 280 нм с получением значения A₂₈₀. В некоторых вариантах реализации после получения значения, означающего атипичный профиль, направляют сигнал, который указывает на износ колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the absorbance value of the atypical profile and/or typical profile is measured during the elution step of a previous column process. In some embodiments, the absorption intensity value of the atypical profile and/or typical profile is determined at a wavelength corresponding to ultraviolet (UV) light. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 260 to 280 nm, including endpoints. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 260 nm to give an A ₂₆₀ value. In some embodiments, the measured absorbance intensity is determined at a wavelength of 280 nm to give an A ₂₈₀ value. In some embodiments, upon receiving a value indicating an atypical profile, a signal is sent that indicates column wear.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля измеряют во время стадии элюирования предыдущего колоночного процесса. В некоторых вариантах реализации значение интенсивности поглощения атипичного профиля и/или типичного профиля определяют посредством оценки уровня рН элюата на стадии элюирования. В некоторых вариантах реализации рН означает атипичный профиль, поскольку данное значение рН выше значения, ожидаемого на основании типичного профиля. В некоторых вариантах реализации рН означает атипичный профиль, поскольку данное значение рН ниже значения, ожидаемого на основании типичного профиля. В некоторых вариантах реализации после получения значения, означающего атипичный профиль, направляют сигнал, который указывает на износ колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the absorbance value of the atypical profile and/or typical profile is measured during the elution step of a previous column process. In some embodiments, the absorbance value of the atypical profile and/or typical profile is determined by assessing the pH of the eluate during the elution step. In some embodiments, pH means an atypical profile because the pH is higher than expected based on a typical profile. In some embodiments, pH means an atypical profile because the pH is lower than expected based on a typical profile. In some embodiments, upon receiving a value indicating an atypical profile, a signal is sent that indicates column wear.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1 до 5000 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1000 до 3000 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает от 1000 до 2500 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации диапазон интегрального объема возникает от 1250 до 2250 л, включая конеч- 2 040301 ные точки. В некоторых вариантах реализации диапазон интегрального объема возникает от 1600 доIn some embodiments of the methods according to the present invention, the range of integral volume occurs from 1 to 5000 liters, including endpoints. In some embodiments of the methods according to the present invention, the range of integral volume occurs from 1000 to 3000 liters, including endpoints. In some embodiments of the methods of the present invention, an integral volume range occurs from 1000 to 2500 L, including endpoints. In some embodiments, the integral volume range occurs from 1250 to 2250 liters, including endpoints. In some embodiments, the integral volume range occurs from 1600 to

1800 л, включая конечные точки. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению диапазон интегрального объема возникает в объеме 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000,1800 l including end points. In some embodiments of the methods according to the present invention, the integral volume range occurs in the volume of 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000,

2500, 3000, 4000, 5000 л или в любом количестве литров между указанными значениями.2500, 3000, 4000, 5000 liters or any number of liters in between.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка содержит Q-сефарозную анионообменную смолу.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatographic column contains a Q-sepharose anion exchange resin.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадия (а) получения эталонной хроматограммы включает (1) приведение в контакт исходной композиции, содержащей множество заранее определенных аналитов, и разделительной композиции, содержащей матрицу, в условиях, достаточных для обратимого связывания с матрицей по меньшей мере одного аналита из исходной композиции, причем хроматографическая колонка содержит разделительную композицию с получением колонки, связанной с аналитом, и первой отработанной композиции; (2) приведение в контакт колонки, связанной с аналитом, со стадии (1) и промывочной композиции, причем связанным с матрицей остается лишь по меньшей мере один аналит из исходной композиции, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и второй отработанной композиции; (3) приведение в контакт очищенной колонки, связанной с аналитом, со стадии (2) и элюирующей композиции, причем указанный по меньшей мере один аналит из исходной композиции высвобождается из матрицы в элюирующую композицию, с получением композиции элюированного аналита; (4) сбор композиции элюированного аналита; (5) одновременно с каждой из стадий (1)-(4), приведение в контакт каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита с ультрафиолетовым (УФ) светом, (6) измерение поглощения УФ-света каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита; и (7) получение хроматограммы посредством нанесения на график значения поглощения каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита в зависимости от объема жидкости, проходящей через хроматографическую колонку.In some embodiments of the methods of the present invention, step (a) of obtaining a reference chromatogram comprises (1) bringing into contact an initial composition containing a plurality of predetermined analytes and a release composition containing a matrix under conditions sufficient to reversibly bind to a matrix of at least one analyte from the original composition, and the chromatographic column contains a separating composition to obtain a column associated with the analyte, and the first spent composition; (2) contacting the analyte-bound column from step (1) and the wash composition, with only at least one analyte from the original composition remaining bound to the matrix, to obtain a purified analyte-bound column and a second spent composition; (3) contacting the purified analyte-bound column from step (2) and the eluting composition, wherein said at least one analyte from the original composition is released from the matrix into the eluting composition to form an eluted analyte composition; (4) collecting the composition of the eluted analyte; (5) concurrently with each of steps (1)-(4), contacting each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition with ultraviolet (UV) light, (6) measuring the UV light absorption of each of the first a spent composition, a second spent composition, and an eluted analyte composition; and (7) obtaining a chromatogram by plotting the absorbance value of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition as a function of the volume of liquid passing through the chromatographic column.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадия (b) получения промышленной хроматограммы включает (1) приведение в контакт исходной композиции, содержащей множество тестируемых аналитов, и разделительной композиции, содержащей матрицу, в условиях, достаточных для обратимого связывания с матрицей по меньшей мере одного аналита из исходной композиции, причем хроматографическая колонка содержит разделительную композицию с получением колонки, связанной с аналитом, и первой отработанной композиции; (2) приведение в контакт колонки, связанной с аналитом, со стадии (1) и промывочной композиции, причем связанным с матрицей остается лишь по меньшей мере один аналит из исходной композиции, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и второй отработанной композиции; (3) приведение в контакт очищенной колонки, связанной с аналитом, со стадии (2) и элюирующей композиции, причем указанный по меньшей мере один аналит из исходной композиции высвобождается из матрицы в элюирующую композицию, с получением композиции элюированного аналита; (4) сбор композиции элюированного аналита; (5) одновременно с каждой из стадий (1)-(4) приведение в контакт каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита с ультрафиолетовым (УФ) светом, (6) измерение поглощения УФ-света каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита; и (7) получение хроматограммы посредством нанесения на график значения поглощения каждой из первой отработанной композиции, второй отработанной композиции и композиции элюированного аналита в зависимости от объема жидкости, проходящей через хроматографическую колонку.In some embodiments of the methods of the present invention, step (b) of obtaining a commercial chromatogram comprises (1) bringing into contact an initial composition containing a plurality of analytes under test and a release composition containing a matrix under conditions sufficient to reversibly bind to the matrix at least one analyte from the original composition, and the chromatographic column contains a separating composition to obtain a column associated with the analyte, and the first spent composition; (2) contacting the analyte-bound column from step (1) and the wash composition, with only at least one analyte from the original composition remaining bound to the matrix, to obtain a purified analyte-bound column and a second spent composition; (3) contacting the purified analyte-bound column from step (2) and the eluting composition, wherein said at least one analyte from the original composition is released from the matrix into the eluting composition to form an eluted analyte composition; (4) collecting the composition of the eluted analyte; (5) concurrently with each of steps (1)-(4) contacting each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition with ultraviolet (UV) light, (6) measuring the UV light absorption of each of the first spent compositions, the second spent composition and the composition of the eluted analyte; and (7) obtaining a chromatogram by plotting the absorbance value of each of the first spent composition, the second spent composition, and the eluted analyte composition as a function of the volume of liquid passing through the chromatographic column.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению стадии (а) или (b) получения хроматограммы включают(ет) стадию (5) приведения в контакт и стадию (6) измерения, и, кроме того, указанная стадия (5) приведения в контакт и стадия (6) измерения являются непрерывными. В некоторых вариантах реализации стадия (5) приведения в контакт и стадия (6) измерения являются одновременными, последовательными или чередующимися и непрерывными.In some embodiments of the methods according to the present invention, steps (a) or (b) of obtaining a chromatogram include(s) a contacting step (5) and a measurement step (6), and, in addition, said contacting step (5) and step (6) measurements are continuous. In some embodiments, the contacting step (5) and the measurement step (6) are simultaneous, sequential or alternating and continuous.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматографическая колонка содержит матрицу, и указанная матрица содержит смолу.In some embodiments of the methods according to the present invention, the chromatographic column contains a matrix, and the specified matrix contains a resin.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению и, в частности, в отношении стадий (а) или (b) получения хроматограммы, тестируемый аналит представляет собой биологическую композицию. В некоторых вариантах реализации биологическая композиция представляет собой терапевтическую композицию для применения в способе лечения человека. В некоторых вариантах реализации биологическая композиция содержит терапевтический белок.In some embodiments of the methods of the present invention, and in particular with respect to steps (a) or (b) of obtaining a chromatogram, the analyte to be tested is a biological composition. In some embodiments, the biological composition is a therapeutic composition for use in a method of treating a human. In some embodiments, the biological composition contains a therapeutic protein.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению предупредительный сигнал передают в электронном виде в процессор, а процессор функционально связан с хроматографической колонкой. В некоторых вариантах реализации процессор принимает предупредительный сигнал и прерывает процесс хроматографии или не допускает начало следующего хроматографического процесса до устранения возможного или реального сбоя хроматографической колонки.In some embodiments of the methods of the present invention, the alert signal is transmitted electronically to the processor, and the processor is operatively coupled to the chromatography column. In some embodiments, the processor receives an alert and aborts the chromatography process or prevents the next chromatography process from starting until a potential or actual chromatographic column failure has been resolved.

Дополнительные аспекты и варианты реализации настоящего изобретения станут понятны из сле- 3 040301 дующего подробного описания.Additional aspects and embodiments of the present invention will become apparent from the following detailed description.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 представлены эталонные хроматограммы, известные по литературным данным.In FIG. 1 shows the reference chromatograms known from the literature.

На фиг. 2 представлена еще одна эталонная хроматограмма.In FIG. 2 shows another reference chromatogram.

На фиг. 3 представлена хроматограмма, отображающая не отвечающий нормам пик 2 промывания.In FIG. 3 is a chromatogram showing the abnormal wash peak 2.

На фиг. 4 представлена хроматограмма, отображающая не отвечающий нормам пик 2 промывания, не отвечающие нормам пики элюирования и снижение остроты пика десорбции.In FIG. 4 is a chromatogram showing the abnormal wash peak 2, the abnormal elution peaks and desorption peak sharpening.

На фиг. 5 представлена некорректная хроматограмма. Присутствует пик 2 промывания.In FIG. 5 shows an incorrect chromatogram. Peak 2 washes present.

На фиг. 6 представлено сравнение типичной и атипичной хроматограмм VEGF-Trap Q. Большинство атипичных УФ-следов имеют поглощение >0,05 единиц оптической плотности (AU) при 635 л при 2 промывании.In FIG. 6 shows a comparison of typical and atypical VEGF-Trap Q chromatograms. Most of the atypical UV traces have an absorbance of >0.05 optical density units (AU) at 635 L with 2 washes.

На фиг. 7 представлены дополнительные атипичные хроматограммы VEGF-Trap Q, т.е. примеры пика 2 промывания.In FIG. 7 shows additional atypical VEGF-Trap Q chromatograms, i. examples of peak 2 washes.

На фиг. 8 представлены дополнительные типичные хроматограммы VEGF-Trap Q. УФ-следы не превышают поглощение 0,05 при 635 л при 2 промывании.In FIG. 8 shows additional typical VEGF-Trap Q chromatograms. UV traces do not exceed an absorbance of 0.05 at 635 L for 2 washes.

Подробное описаниеDetailed description

Успешное и своевременное определение типа сбоя в процессе хроматографии белков, особенно при крупномасштабном производстве, может быть проблематичным, и это обусловлено не только специфичностью типа сбоя для каждой отдельной операции, связанной с программой, но и отсутствием доступного для использования способа автоматического обнаружения, который обеспечивают композиции и способы согласно настоящему изобретению.Successful and timely determination of the type of failure in a protein chromatography process, especially in large-scale production, can be problematic, and this is due not only to the specificity of the type of failure for each individual operation associated with the program, but also to the lack of an available method of automatic detection that is provided by the compositions. and methods according to the present invention.

В настоящем изобретении предложена новая система Watch и способ обнаружения типа сбоя. Новая система Watch и способ мониторинга с помощью хроматографической колонки предназначены для оповещения оператора о том, что колонка не выполняет заданную функцию. Системы Watch и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают автоматический мониторинг сигналов системы в течение всего времени для определения оптимальной работы колонки. Если система не соответствует критериям приемлемости, то оператор получает сообщение с указанием о необходимости добавления данного события в систему контроля качества и обеспечения возможности дальнейшего изучения и возможного исправления. Контролируемые сигналы, значимая интенсивность сигнала и диапазоны времени интегрирования определяют эмпирически для эксплуатации каждой отдельной хроматографической установки, подлежащей мониторингу.The present invention proposes a new Watch system and a method for detecting the type of failure. The new Watch system and chromatography column monitoring method is designed to alert the operator when the column is not performing its intended function. The Watch systems and methods of the present invention provide for automatic monitoring of system signals at all times to determine optimal column performance. If the system does not meet the acceptance criteria, then the operator receives a message indicating that the event should be added to the quality system and allowed for further investigation and possible correction. Monitored signals, significant signal intensity and integration time ranges are determined empirically for the operation of each individual chromatographic unit to be monitored.

Хроматография.Chromatography.

Системы и способы согласно настоящему изобретению можно использовать для препаративной или аналитической хроматографии. В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению используют для очистки белков, которые можно использовать в композиции для лечения какого-либо заболевания. Эффективность процесса очистки особенно важна для тех способов, которые включают препаративную хроматографию для крупномасштабной очистки или очистки терапевтических белков в большом объеме. Системы и способы согласно настоящему изобретению можно использовать в любом масштабе. Однако они особенно применимы, когда в процессе используется большое количество препаратов, а также в том случае, если сбой системы (такой как проскок ценного аналита через разделительную композицию в хроматографической колонке, где он должен улавливаться) приводит к потере ценного продукта и ценного производственного времени. Системы и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают прогнозирование и обнаружение сбоя в процессе хроматографии в реальном времени и благодаря идентификации неисправного процесса обеспечивают возможность восстановления функции и возврата к эффективной и надежной очистке до выполнения последующих работ с неисправным процессом.Systems and methods according to the present invention can be used for preparative or analytical chromatography. In some embodiments, the methods of the present invention are used to purify proteins that can be used in a composition to treat a disease. The efficiency of the purification process is particularly important for those methods that involve preparative chromatography for large scale purification or high volume purification of therapeutic proteins. The systems and methods of the present invention can be used at any scale. However, they are especially applicable when a large number of drugs are used in the process, and also if a system failure (such as a valuable analyte slipping through the separating composition in the chromatographic column where it should be trapped) results in the loss of valuable product and valuable production time. The systems and methods of the present invention provide real-time chromatography process failure prediction and detection, and by identifying the failed process, allow recovery of function and return to efficient and reliable purification prior to subsequent work on the failed process.

Настоящее изобретение предусматривает любую форму хроматографии. Как метод хроматография представляет собой способ выделения компонентов из смеси. Выделение осуществляют посредством разделения с помощью подвижной фазы и неподвижной фазы. Как описано в настоящем документе, исходные композиции, содержащие тестируемый аналит, необязательно также для получения, принадлежат к подвижной фазе. Как описано в настоящем документе, разделительные композиции, содержащие матрицу, принадлежат к неподвижной фазе. Иллюстративные матрицы согласно настоящему изобретению могут содержать любой материал, обладающий способностью разделять элементы подвижной фазы по химическим свойствам (заряду) и/или по физическим свойствам (размеру).The present invention provides for any form of chromatography. As a method, chromatography is a method for isolating components from a mixture. The selection is carried out by separation using the mobile phase and the stationary phase. As described herein, the original compositions containing the analyte to be tested, optionally also to obtain, belong to the mobile phase. As described herein, release compositions containing a matrix belong to the stationary phase. Exemplary matrices of the present invention may comprise any material capable of separating mobile phase elements by chemical properties (charge) and/or physical properties (size).

В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, включая способы получения терапевтических белков, процессы хроматографии могут включать, но не ограничиваются ими, колоночную и плоскостную хроматографию. В некоторых предпочтительных вариантах реализации процессы хроматографии могут включать, но не ограничиваются ими, колоночную хроматографию.In accordance with some variants of implementation of the present invention, including methods for obtaining therapeutic proteins, chromatography processes may include, but are not limited to, column and planar chromatography. In some preferred embodiments, the chromatographic processes may include, but are not limited to, column chromatography.

Колоночная хроматография.Column chromatography.

Настоящее изобретение предусматривает любую форму колоночной хроматографии, включая влажный и сухой способы. В сухом способе разделительная композиция содержит сухую матрицу, которую затем приводят в контакт с жидкой исходной композицией, оптимально смачивая всю матрицу и неThe present invention contemplates any form of column chromatography, including both wet and dry methods. In the dry process, the release composition contains a dry matrix, which is then brought into contact with the liquid starting composition, optimally wetting the entire matrix and not

- 4 040301 допуская высыхания матрицы до окончания всего процесса. Во влажном способе разделительная композиция содержит суспензию или взвесь матрицы и элюента, которую вводят в колонку и затем приводят в контакт с жидкой исходной композицией.- 4 040301 allowing the matrix to dry before the end of the whole process. In the wet method, the release composition contains a suspension or slurry of matrix and eluent, which is injected into the column and then brought into contact with the liquid starting composition.

Ионообменная хроматография.Ion exchange chromatography.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы по заряду. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая обратимо связывает заряженный белковый аналит из исходной композиции. Таким образом, разделительная матрица может быть пригодна для анионо- или катионообменной хроматографии и может содержать матрицу, имеющую суммарный отрицательный или положительный заряд соответственно. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция содержит матрицу, содержащую сефарозу или Q-сефарозу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения хроматографическая колонка представляет собой Q-колонку.In some embodiments of the present invention, the separating composition may contain any material capable of separating mobile phase elements by charge. For example, the release composition may contain a matrix that reversibly binds the charged protein analyte from the original composition. Thus, the separation matrix may be suitable for anion or cation exchange chromatography and may contain a matrix having a net negative or positive charge, respectively. In some embodiments of the present invention, the separating composition contains a matrix containing sepharose or Q-sepharose. In some embodiments of the present invention, the chromatographic column is a Q-column.

Аффинная хроматография.Affinity chromatography.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании специфических взаимодействий между партнерами по связыванию, включая, но не ограничиваясь ими, партнеры по связыванию антиген/антитело, партнеры по связыванию фермент/субстрат, партнеры по связыванию рецептор/лиганд, партнеры по связыванию белок/белок, партнеры по связыванию белок/нуклеиновая кислота и партнеры по связыванию нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая обратимо связывается с одним партнером из партнеров по связыванию (например, с аналитом из исходной композиции), поскольку содержит другой партнер из партнеров по связыванию. Например, разделительная композиция может содержать матрицу, которая содержит антиген, с которым специфически связывается аналит из исходной композиции, что обеспечивает селективную очистку антитела-аналита из исходного материала. В качестве дополнительной иллюстрации разделительная композиция может содержать матрицу, которая содержит эпитоп белка VEGF, с которым селективно связывается VEGF-Trap, что обеспечивает селективную очистку аналита VEGF-Trap из исходного материала.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material capable of separating mobile phase elements based on specific interactions between binding partners, including, but not limited to, antigen/antibody binding partners, enzyme/substrate binding partners, receptor/ligand binding, protein/protein binding partners, protein/nucleic acid binding partners, and nucleic acid/nucleic acid binding partners. For example, a release composition may contain a matrix that reversibly binds to one of the binding partners (eg, the analyte from the parent composition) because it contains the other of the binding partners. For example, a release composition may comprise a matrix that contains an antigen to which the analyte from the parent composition specifically binds, allowing selective purification of the analyte antibody from the parent material. As a further illustration, the release composition may comprise a matrix that contains an epitope of the VEGF protein to which VEGF-Trap selectively binds, allowing selective purification of the VEGF-Trap analyte from the starting material.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC).Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их относительной гидрофобности. HIC можно использовать для селективной очистки белкового аналита с сохранением его биологической активности благодаря применению условий и матриц, которые работают в менее денатурирующих условиях. В некоторых вариантах реализации аналиты согласно настоящему изобретению, содержащие гидрофобные и гидрофильные области, приводят в контакт с колонкой HIC в буфере с высоким содержанием соли. Соль в буфере снижает сольватацию растворенного вещества аналита в исходном материале. В результате снижения сольватации гидрофобные области, которые становятся обнаженными, адсорбируются средой. Чем более гидрофобной является молекула в исходном материале, тем меньше соли нужно для промотирования связывания. Можно использовать убывающий градиент соли для элюирования образцов из колонки в порядке повышения гидрофобности. Элюирующие буферы согласно настоящему изобретению также могут содержать слабый органический модификатор или мягкий детергент.In some embodiments of the present invention, the separating composition may comprise any material capable of separating mobile phase elements based on their relative hydrophobicity. HIC can be used to selectively purify a protein analyte while maintaining its biological activity through the use of conditions and matrices that operate under less denaturing conditions. In some embodiments, analytes of the present invention containing hydrophobic and hydrophilic regions are contacted with a HIC column in a high salt buffer. The salt in the buffer reduces the solvation of the analyte solute in the starting material. As a result of the decrease in solvation, the hydrophobic regions that become exposed are adsorbed by the medium. The more hydrophobic the molecule in the starting material, the less salt is needed to promote binding. A decreasing salt gradient can be used to elute samples from the column in order of increasing hydrophobicity. The elution buffers of the present invention may also contain a weak organic modifier or a mild detergent.

Эксклюзионная хроматография (SEC).Size Exclusion Chromatography (SEC).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их относительного размера или, в некоторых случаях, относительной молекулярной массы. SEC можно использовать для селективной очистки крупных молекул или макромолекулярных комплексов, таких как белки и полимеры. В некоторых вариантах реализации, например, в тех вариантах реализации, в которых используют водный раствор для переноса подвижной фазы через колонку, указанная технология известна как гельфильтрационная хроматография. В некоторых вариантах реализации, например, в тех вариантах реализации, в которых в качестве подвижной фазы, пропускаемой через колонку, используют органический растворитель, указанная технология известна как гельпроникающая хроматография. В некоторых вариантах реализации хроматографическая колонка упакована мелкими пористыми гранулами, состоящими, например, из декстрановых полимеров (Sephadex), агарозы (Sepharose) или полиакриламида (Sephacryl или BioGel P). Размер пор указанных гранул используют для оценки размеров макромолекул. Гельфильтрационную хроматографию можно использовать для фракционирования белковых аналитов и других водорастворимых полимеров, а гельпроникающую хроматографию можно использовать для фракционирования растворимых в органических растворителях полимеров по молекулярномассовому распределению.In some embodiments of the present invention, the separating composition may comprise any material capable of separating mobile phase elements based on their relative size or, in some cases, relative molecular weight. SEC can be used to selectively purify large molecules or macromolecular complexes such as proteins and polymers. In some embodiments, for example, those implementations that use an aqueous solution to transfer the mobile phase through the column, this technology is known as gel filtration chromatography. In some embodiments, for example, in those embodiments in which an organic solvent is used as the mobile phase passed through the column, this technique is known as Gel Permeation Chromatography. In some embodiments, the chromatographic column is packed with small porous beads consisting of, for example, dextran polymers (Sephadex), agarose (Sepharose), or polyacrylamide (Sephacryl or BioGel P). The pore size of these granules is used to estimate the size of the macromolecules. Gel filtration chromatography can be used to fractionate protein analytes and other water-soluble polymers, and gel permeation chromatography can be used to fractionate organic solvent-soluble polymers by molecular weight distribution.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).High performance liquid chromatography (HPLC).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы по их вза- 5 040301 имодействию с материалом адсорбента разделительной композиции, которое обусловливает различную скорость движения различных компонентов и приводит к разделению компонентов по мере их вытекания из колонки. Аналиты в подвижной фазе можно разделять, например, на основании гидрофобного, ионного или диполь-дипольного взаимодействия. В основе ВЭЖХ лежит действие насоса, обеспечивающего прохождение под давлением жидкого растворителя, содержащего подвижную фазу, через колонку, наполненную твердым материалом адсорбента. В некоторых вариантах реализации активный компонент колонки, адсорбент, содержит гранулированный материал из твердых частиц (например, диоксида кремния или полимеров). Иллюстративный размер частиц включает 2-50 мкм, и столь малый размер может обеспечивать превосходную эффективность разделения ВЭЖХ хроматографии. В некоторых вариантах реализации подвижная фаза под давлением представляет собой смесь растворителей, таких как вода, ацетонитрил и/или метанол. В некоторых вариантах реализации ВЭЖХ насос обеспечивает смешение нескольких растворителей друг с другом в соотношениях, изменяющихся в зависимости от времени, что обеспечивает градиентный состав подвижной фазы. В некоторых вариантах реализации водный компонент подвижной фазы содержит кислоты (такие как муравьиная, фосфорная или трифторуксусная кислота) или соли для облегчения разделения компонентов образца. В некоторых вариантах реализации ВЭЖХ включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.In some embodiments of the present invention, the release composition may contain any material capable of separating the elements of the mobile phase by their interaction with the adsorbent material of the release composition, which causes different speeds of movement of various components and leads to separation of the components as they flow from the column. . The analytes in the mobile phase can be separated, for example, based on hydrophobic, ionic, or dipole-dipole interaction. HPLC is based on the action of a pump to force a pressurized liquid solvent containing a mobile phase through a column filled with solid adsorbent material. In some embodiments, the active component of the column, the adsorbent, contains granular particulate material (eg, silica or polymers). Exemplary particle size includes 2-50 µm, and such a small size can provide excellent separation efficiency HPLC chromatography. In some embodiments, the pressurized mobile phase is a mixture of solvents such as water, acetonitrile, and/or methanol. In some embodiments of the HPLC, the pump allows multiple solvents to be mixed with each other in time-varying ratios to provide a gradient composition of the mobile phase. In some embodiments, the aqueous component of the mobile phase contains acids (such as formic, phosphoric, or trifluoroacetic acid) or salts to facilitate separation of the sample components. In some embodiments, HPLC includes partition chromatography, normal phase chromatography, exclusion chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or aqueous normal phase chromatography.

Жидкостная экспресс-хроматография белков (FPLC).Rapid Protein Liquid Chromatography (FPLC).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разделительная композиция может содержать любой материал, обладающий способностью разделения элементов подвижной фазы на основании их различного сродства к разделительной композиции. Жидкостная экспресс-хроматография белков (FPLC) представляет собой форму жидкостной хроматографии, которую используют для разделения смесей белковых аналитов. В некоторых вариантах реализации разделение возможно, поскольку различные компоненты подвижной фазы обладают разной аффинностью к подвижной фазе и неподвижной фазе (разделительной композиции). В некоторых вариантах реализации подвижная фаза представляет собой водный раствор или буфер. Скорость потока буфера можно регулировать с помощью насоса вытесняющего действия. В некоторых вариантах реализации скорость потока буфера является постоянной, а состав буфера варьируется. В некоторых вариантах реализации неподвижная фаза представляет собой смолу, состоящую из гранул, например из гранул агарозы. Специалисты в данной области техники могут изменять размеры гранул и поверхность лигандов неподвижной фазы в зависимости от подвижной фазы и аналитов в конкретном случае применения.In some embodiments of the present invention, the release composition may comprise any material capable of separating mobile phase elements based on their different affinity for the release composition. Rapid protein liquid chromatography (FPLC) is a form of liquid chromatography that is used to separate mixtures of protein analytes. In some embodiments, separation is possible because the different components of the mobile phase have different affinities for the mobile phase and the stationary phase (the separation composition). In some embodiments, the mobile phase is an aqueous solution or buffer. The buffer flow rate can be adjusted using a positive displacement pump. In some embodiments, the buffer flow rate is constant and the buffer composition varies. In some embodiments, the stationary phase is a resin composed of granules, such as agarose granules. Those skilled in the art can vary the bead size and surface of the stationary phase ligands depending on the mobile phase and analytes in the particular application.

В некоторых вариантах реализации FPLC включает ионообменную хроматографию. Например, смола неподвижной фазы связывается с белковым аналитом благодаря взаимодействию зарядов в первом буфере (подвижном буфере), но диссоциирует во втором буфере (элюирующем буфере). Смесь, содержащую один или более белковых аналитов, растворяют в первом буфере и закачивают в колонку под давлением. Требуемые белки связываются со смолой, а другие компоненты выходят вместе с первым буфером. Общую скорость потока буфера поддерживают постоянной. С течением времени процент элюирующего буфера постепенно повышают от 0 до 100% в соответствии с запрограммированным изменением концентрации с получением градиента. В определенный момент градиентного изменения каждый из связанных белковых аналитов диссоциирует и появляется в элюате. Затем элюат пропускают через детекторы. Иллюстративные детекторы могут обеспечивать измерение концентрации соли в элюате (по проводимости) и концентрации белка в элюате (по поглощению ультрафиолетового света).In some embodiments, FPLC includes ion exchange chromatography. For example, the resin of the stationary phase binds to the protein analyte due to the interaction of charges in the first buffer (moving buffer), but dissociates in the second buffer (elution buffer). A mixture containing one or more protein analytes is dissolved in the first buffer and pumped into the column under pressure. The required proteins bind to the resin and the other components come out with the first buffer. The total buffer flow rate is kept constant. Over time, the percentage of elution buffer is gradually increased from 0 to 100% in accordance with the programmed change in concentration to obtain a gradient. At a certain point in the gradient change, each of the bound protein analytes dissociates and appears in the eluate. The eluate is then passed through detectors. Exemplary detectors may provide measurement of salt concentration in the eluate (by conductivity) and protein concentration in the eluate (by absorption of ultraviolet light).

Повышение давления.Increasing pressure.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению поток подвижной фазы через неподвижную фазу регулируется силой тяжести. В некоторых вариантах реализации гравитационную хроматографию используют для одностадийной очистки, такой как обессоливание и аффинное связывание. Типичная гравитационная колонка содержит верхний элемент, буферный резервуар, функционально связанный с хроматографической колонкой, имеющей выходное отверстие в нижней части. Поток регулируют с помощью запорного крана или зажима на трубке между буферным резервуаром и колонкой. Можно использовать адаптеры потока для минимизации вариабельности при загрузке образца. В некоторых вариантах реализации гравитационная хроматография включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.In some embodiments of the methods of the present invention, the flow of the mobile phase through the stationary phase is controlled by gravity. In some embodiments, gravity chromatography is used for one-step purification, such as desalting and affinity binding. A typical gravity column contains an upper element, a buffer tank, operatively associated with a chromatographic column having an outlet at the bottom. The flow is controlled by a stopcock or a clamp on the tubing between the buffer tank and the column. You can use flow adapters to minimize sample loading variability. In some embodiments, gravity chromatography includes partition chromatography, normal phase chromatography, exclusion chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or aqueous normal phase chromatography.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию низкого давления. В некоторых вариантах реализации хроматографическая система низкого давления представляет собой систему, которая работает при давлении менее 50 фунт/кв.дюйм (~3 бар (0,3 МПа)). Хроматографию низкого давления можно использовать для разделения белков, не требующих высокого разделения.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography includes low pressure chromatography. In some embodiments, the low pressure chromatographic system is a system that operates at less than 50 psi (~3 bar (0.3 MPa)). Low pressure chromatography can be used to separate proteins that do not require a high separation.

- 6 040301- 6 040301

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию среднего давления. В некоторых вариантах реализации хроматографическая система среднего давления представляет собой систему, которая работает при давлении до 3500 фунт/кв.дюйм (~24 МПа). Хроматографическая система среднего давления обеспечивает достаточное давление для размещения композиций неподвижной фазы с высокой разделительной способностью, например, с гранулами размером 5-15 мкм. В некоторых вариантах реализации хроматография среднего давления включает распределительную хроматографию, нормально-фазовую хроматографию, вытеснительную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или водную нормально-фазовую хроматографию.In some embodiments of the methods of the present invention, the chromatography includes medium pressure chromatography. In some embodiments, the medium pressure chromatographic system is a system that operates at pressures up to 3500 psi (~24 MPa). The medium pressure chromatography system provides sufficient pressure to accommodate high resolution stationary phase formulations, such as 5-15 µm bead sizes. In some embodiments, medium pressure chromatography includes partition chromatography, normal phase chromatography, exclusion chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or aqueous normal phase chromatography.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению хроматография включает хроматографию высокого давления, например ВЭЖХ.In some embodiments of the methods of the present invention, chromatography includes high pressure chromatography, such as HPLC.

Подвижная фаза.mobile phase.

Настоящее изобретение предусматривает любую форму подвижной фазы, включая, но не ограничиваясь ими, элюент, растворитель, стерильный растворитель и фармацевтически приемлемый носитель. Элюирующие композиции согласно настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель.The present invention provides for any form of mobile phase, including, but not limited to, an eluent, a diluent, a sterile diluent, and a pharmaceutically acceptable carrier. Eluting compositions according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.

Неподвижная фаза.stationary phase.

Настоящее изобретение предусматривает любую форму неподвижной фазы, включая, но не ограничиваясь ими, диоксид кремния, оксид алюминия (Al₂O₃), целлюлозу, сефарозу и Q-сефарозу. Иллюстративные разделительные композиции согласно настоящему изобретению могут содержать матрицу, полимер, смолу, белок или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации разделительная композиция содержит сефарозу или Q-сефарозу.The present invention contemplates any form of stationary phase including, but not limited to, silica, alumina (Al ₂ O ₃ ), cellulose, sepharose, and Q-sepharose. Illustrative release compositions according to the present invention may contain a matrix, polymer, resin, protein, or a combination thereof. In some embodiments, the release composition contains sepharose or Q-sepharose.

Хроматограммы.Chromatograms.

В данном контексте хроматограмма представляет собой визуальный выходной сигнал хроматографа. Как правило, время удерживания и/или объем выходящего потока элюата представляют на оси х хроматограммы, а сигнал наносят на оси у. Иллюстративные сигналы включают, но не ограничиваются ими, электрическую проводимость, поглощение света и масс-спектрометрию и соответствуют реакции детектора на аналиты, выходящие из хроматографа. В некоторых вариантах реализации указанный сигнал пропорционален концентрации конкретного аналита, выделяемого с помощью хроматографа.In this context, a chromatogram is the visual output of a chromatograph. Generally, the retention time and/or the volume of the eluate effluent is presented on the x-axis of the chromatogram and the signal is plotted on the y-axis. Illustrative signals include, but are not limited to, electrical conductivity, light absorption, and mass spectrometry, and correspond to the detector's response to analytes exiting the chromatograph. In some embodiments, said signal is proportional to the concentration of a particular analyte isolated from the chromatograph.

В одном иллюстративном варианте реализации концентрацию белка, измеренную по поглощению света, наносят на ось у хроматограммы. Многие белки в растворе поглощают свет, например ультрафиолетовый свет с длиной волны 280 нм, что можно использовать для расчета концентрации белка в образце. В зависимости от белка, предусмотрены дополнительные длины волн света. Например, белки, содержащие группы гемма или флуорофоры, обнаруживают при другой длине волны света. Специалисты в данной области техники могут выбрать подходящую систему обнаружения для конкретного аналита.In one exemplary embodiment, the protein concentration, as measured by light absorption, is plotted on the y-axis of the chromatogram. Many proteins in solution absorb light, such as ultraviolet light at 280 nm, which can be used to calculate the protein concentration in a sample. Depending on the protein, additional wavelengths of light are provided. For example, proteins containing gemma groups or fluorophores are detected at a different wavelength of light. Those skilled in the art can select the appropriate detection system for a particular analyte.

Биологические образцы.biological samples.

В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению аналит содержит белок, пептид, нуклеиновую кислоту или вирус. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). В некоторых вариантах реализации вирус представляет собой аденовирус, аденоассоциированный вирус или лентивирус.In some embodiments of the methods of the present invention, the analyte comprises a protein, peptide, nucleic acid, or virus. In some embodiments, the nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). In some embodiments, the virus is an adenovirus, an adeno-associated virus, or a lentivirus.

ПримерыExamples

Пример 1. Очистка VEGF Trap.Example 1 Purification of the VEGF Trap.

На фиг. 1-8 представлены иллюстративные эталонные хроматограммы (фиг. 1 и 2), а также иллюстративные промышленные хроматограммы, имеющие атипичный профиль (фиг. 3-5), с использованием VEGF-Trap в качестве иллюстративного аналита для очистки.In FIG. 1-8 are illustrative reference chromatograms (FIGS. 1 and 2) as well as illustrative industrial chromatograms having an atypical profile (FIGS. 3-5) using VEGF-Trap as an illustrative purification analyte.

Кратко, хроматограммы на фиг. 1-8 получали посредством приведения в контакт исходной композиции, содержащей множество аналитов (аналиты VEGF-Trap, а также множество примесей (например, белков клетки-хозяина, ДНК и слабо сиалилированных белков)), и разделительной композиции, содержащей матрицу (в данном примере Q-сефарозу), в условиях, достаточных для обратимого связывания по меньшей мере одного белка VEGF-Trap исходной композиции с матрицей, причем хроматографическая колонка содержала разделительную композицию, с получением колонки, связанной с аналитом, и первой отработанной композиции. Затем приводили в контакт колонку, связанную с аналитом, и первую промывочную композицию, причем белок VEGF-Trap исходной композиции оставался связанным с матрицей, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и второй отработанной композиции. Приводили в контакт колонку, связанную с аналитом, и вторую промывочную композицию, причем на эталонной хроматограмме, отображающей типичный профиль, белок VEGF-Trap исходной композиции оставался связанным с матрицей, с получением очищенной колонки, связанной с аналитом, и третьей отработанной композиции. Для получения промышленной хроматограммы, отображающей атипичный профиль, приводили в контакт колонку, связанную с аналитом, и вторую промывочную композицию, при этом на промышленной хроматограмме, отображающей атипичный профиль, связанный с матрицей, оставалсяBriefly, the chromatograms in Fig. 1-8 were prepared by bringing into contact an initial composition containing a plurality of analytes (VEGF-Trap analytes, as well as a plurality of impurities (for example, host cell proteins, DNA and weakly sialylated proteins)) and a release composition containing a matrix (in this example Q-Sepharose), under conditions sufficient to reversibly bind at least one VEGF-Trap protein of the original composition to the matrix, wherein the chromatographic column contained a separating composition, to obtain an analyte-bound column and a first spent composition. The analyte-bound column and the first wash composition were then brought into contact, with the VEGF-Trap protein of the original composition remaining bound to the matrix, to obtain a purified analyte-bound column and a second wasted composition. The analyte-bound column and the second wash composition were brought into contact, with the reference chromatogram displaying a typical profile, the VEGF-Trap protein of the original composition remaining bound to the matrix, to obtain a purified analyte-bound column and a third spent composition. To obtain a commercial chromatogram showing an atypical profile, the analyte bound column and a second wash composition were brought into contact, while the commercial chromatogram showing the atypical profile associated with the matrix remained

--

Claims

only the VEGF-Trap protein of the original composition, resulting in a purified column bound to the analyte, and a third spent composition, however, the third spent composition contained an impurity or VEGF-Trap protein. In both the reference and production chromatograms, the purified column bound to the analyte and the eluting composition were brought into contact, whereby at least one analyte from the original composition was released from the matrix into the eluting composition to form the eluted analyte composition. Both the reference and production chromatograms collected the composition of the eluted analyte. Simultaneously with each of the steps above, each of the first spent composition, the second spent composition, the third spent composition, and the eluted analyte composition were contacted with ultraviolet (UV) light. The UV light absorbance of each of the first spent composition, the second spent composition, the third spent composition, and the eluted analyte composition was measured simultaneously or sequentially to obtain an absorbance value for each of the first spent composition, the second spent composition, the third spent composition, and the eluted analyte composition. The absorbance values for each of the first spent composition, the second spent composition, the third spent composition, and the eluted analyte composition were plotted against the volume of liquid passed through the chromatographic column to obtain a chromatogram. A chromatogram was obtained in real time of the chromatography process and the occurrence of an atypical profile was determined as soon as an additional peak appeared on the chromatogram. The occurrence of an atypical profile triggers an alert from the detector and/or processor to the processor operatively associated with the chromatography column, which in turn prevents further chromatography from proceeding until the column failure is corrected.

CLAIM

1. A method for detecting a failure in the operation of a chromatographic column in a chromatography process, including:

(a) contacting a reference sample containing a plurality of analytes and a biological composition with a chromatographic column containing a separation composition containing a matrix under conditions sufficient to reversibly bind at least one analyte to the matrix and elute it from the matrix, to obtain those the most reference chromatogram based on a given chromatographic column;

(b) contacting an industrial sample containing a plurality of analytes and a biological composition with said chromatographic column under conditions sufficient to reversibly bind at least one analyte to the matrix and elute it from the matrix, thereby obtaining an industrial chromatogram based on this chromatographic columns;

(c) comparing the production chromatogram with a reference chromatogram with detection by means of this atypical profile in the production chromatogram, where the atypical profile contains one or more features that indicate a malfunction, selected from the group including an additional peak in the production chromatogram compared to a comparable position on the reference chromatogram;

at least one peak or at least one recess in the industrial chromatogram having reduced sharpness or reduced intensity compared to a peak or recess at a comparable position in the reference chromatogram; and the measured absorption intensity, which exceeds the maximum absorption intensity in the range of the integral volume;

(d) generating an alarm; and (e) stopping the chromatography process until the failure of the chromatographic column is corrected.

2. The method according to claim 1, characterized in that the chromatography process includes ion exchange chromatography.

3. The method according to claim 1, characterized in that the chromatography process includes affinity chromatography.

4. The method of claim 1, wherein the chromatography process comprises hydrophobic interaction chromatography.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the failure of the chromatographic column is due to wear of the chromatographic column.

6. The method according to claim 5, characterized in that the wear of the chromatographic column includes the destruction of the layer in the chromatographic column.

7. Method according to claim 1, characterized in that the additional peak occurs during the washing step of the chromatography process.

8. The method according to claim 7, characterized in that the washing step precedes the elution step in

- 8 040301 chromatography process.

9. The method according to claim 1, characterized in that the intensity of the additional peak indicates the degree of criticality of the failure of the chromatographic column.

10. The method according to claim 9, characterized in that an increase in the intensity of the additional peak indicates an increase in the degree of criticality of the failure of the chromatographic column.

11. The method according to claim 1, characterized in that the malfunction of the chromatographic column causes a decrease in the separation capacity of the chromatographic column.

12. The method according to claim 1, characterized in that at least one peak or at least one recess in the industrial chromatogram having reduced sharpness or reduced intensity occurs during the washing step.

13. The method according to claim 1, characterized in that at least one peak or at least one recess in the industrial chromatogram having reduced sharpness or reduced intensity follows the elution step.

14. The method of claim 1, wherein the atypical profile comprises a first peak or first dimple having reduced sharpness or reduced intensity in the production chromatogram compared to a peak or dimple at a comparable first position in the reference chromatogram and a second peak or second dimple , which has reduced sharpness or reduced intensity in a production chromatogram compared to a peak or recess at a comparable second position in a reference chromatogram.

15. The method according to claim 14, characterized in that the first peak or first recess follows the elution step.

16. The method according to claim 15, characterized in that the first peak or first depression corresponds to the depression occurring at the beginning of the collection step.

17. The method according to any one of claims 14 to 16, characterized in that the second peak or second depression follows the collection step.

18. The method of claim 22, wherein the second peak or second recess includes a desorption peak.

19. The method according to claim 1, characterized in that the measured absorption intensity is determined at a wavelength corresponding to ultraviolet (UV) light.

20. The method according to claim 19, characterized in that the measured absorption intensity is determined at a wavelength from 260 to 280 nm, including the end points.

21. The method according to claim 19, characterized in that the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 260 nm to obtain the value of A ₂₆₀ .

22. The method according to claim 19, characterized in that the measured absorption intensity is determined at a wavelength of 280 nm to obtain the value of A ₂₈₀ .

23. The method according to claim 21 or 22, characterized in that the maximum absorption intensity has an A ₂₆₀ value or an A ₂₈₀ value of at least 0.05.

24. The method according to claim 1, characterized in that the reference chromatogram has a measured absorption intensity that does not exceed the maximum absorption intensity in the range of the integral volume, and while the maximum absorption intensity has an A ₂₆₀ value or an A ₂₈₀ value of at least 0.05 or less.

25. The method according to claim 1, characterized in that the range of the integrated volume of the chromatographic column is from 1000 to 2500 liters, including the end points.

26. The method according to claim 25, characterized in that the range of the integral volume of the chromatographic column is from 1250 to 2250 liters, including the end points.

27. The method according to claim 25, characterized in that the range of the integral volume of the chromatographic column is from 1600 to 1800 liters, including the end points.

28. The method according to claim 1, characterized in that the chromatographic column contains an anion exchange resin.

29. The method according to claim 1, characterized in that step (a) of obtaining a reference chromatogram and step (b) of obtaining an industrial chromatogram comprise:

(1) binding at least one analyte to a matrix to obtain a chromatographic column associated with the analyte and a first spent composition;

(2) contacting the analyte-bound chromatographic column from step (1) and the wash composition, with at least one analyte from the original composition remaining bound to the matrix, to obtain a purified analyte-bound chromatographic column and a second spent composition ;

(3) contacting the purified analyte-bound chromatographic column from step (2) and the eluent composition, wherein at least one analyte is released from the matrix into the eluent composition to obtain an eluted analyte composition;

(4) collecting the composition of the eluted analyte;

(5) simultaneously with each of the stages (1)-(4) bringing into contact each of the first worked out

-