EA045443B1 - TCR AND PEPTIDES - Google Patents
TCR AND PEPTIDES Download PDFInfo
- Publication number
- EA045443B1 EA045443B1 EA201992536 EA045443B1 EA 045443 B1 EA045443 B1 EA 045443B1 EA 201992536 EA201992536 EA 201992536 EA 045443 B1 EA045443 B1 EA 045443B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- tcr
- acid sequence
- variant
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 308
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 849
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 406
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 361
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 claims description 338
- 101710127857 Wilms tumor protein Proteins 0.000 claims description 327
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 313
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 222
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 130
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 116
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 87
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 82
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 82
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 82
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 76
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 54
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 46
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 claims description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 33
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 28
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 19
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 16
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 16
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 14
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 230000002688 persistence Effects 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 10
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 6
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 4
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 365
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 355
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 354
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 354
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 352
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 352
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 138
- 208000026448 Wilms tumor 1 Diseases 0.000 description 137
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 42
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 42
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 description 41
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 description 40
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 description 40
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 description 40
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 39
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 38
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 38
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 37
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 102100021454 Histone deacetylase 4 Human genes 0.000 description 29
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 22
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 22
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 22
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 22
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 22
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 22
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 21
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 21
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 description 21
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 20
- 102100021453 Histone deacetylase 5 Human genes 0.000 description 18
- 102100039388 Polyamine deacetylase HDAC10 Human genes 0.000 description 18
- 101710107444 Polyamine deacetylase HDAC10 Proteins 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 17
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 102100022537 Histone deacetylase 6 Human genes 0.000 description 12
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 10
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Chemical group 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 8
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 8
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 8
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 8
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 8
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 8
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 8
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 7
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 6
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 6
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 4
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 4
- 108010081208 RMFPNAPYL Proteins 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 3
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 3
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 3
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000003515 double negative t cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000714175 Abelson murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 208000010006 Fraser Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000714475 Fujinami sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102210024302 HLA-B*0702 Human genes 0.000 description 2
- 108010078301 HLA-B*07:02 antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710095395 Histidine decarboxylase proenzyme Proteins 0.000 description 2
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 101001067830 Mus musculus Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A Proteins 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 TGFbR Proteins 0.000 description 2
- 101150053558 TRBC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150117561 TRBC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 208000006038 Urogenital Abnormalities Diseases 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100365087 Arabidopsis thaliana SCRA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000945470 Arcturus Species 0.000 description 1
- 241000713840 Avian erythroblastosis virus Species 0.000 description 1
- 241000713834 Avian myelocytomatosis virus 29 Species 0.000 description 1
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100035167 Coiled-coil domain-containing protein 54 Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713859 FBR murine osteosarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102210024054 HLA-C*03:04 Human genes 0.000 description 1
- 102210009886 HLA-C*04:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210042928 HLA-C*05:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210009879 HLA-C*06:02 Human genes 0.000 description 1
- 102210009882 HLA-C*07:02 Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000737052 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 54 Proteins 0.000 description 1
- 101100333868 Homo sapiens EVA1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100395311 Homo sapiens HLA-B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000824971 Homo sapiens Sperm surface protein Sp17 Proteins 0.000 description 1
- 101000939859 Homo sapiens T cell receptor beta variable 12-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000939742 Homo sapiens T cell receptor beta variable 20-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000606206 Homo sapiens T cell receptor beta variable 4-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000621309 Homo sapiens Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710119577 Molybdopterin molybdenumtransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 101100096028 Mus musculus Smok1 gene Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031798 Protein eva-1 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100029696 T cell receptor beta variable 12-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100029659 T cell receptor beta variable 20-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039757 T cell receptor beta variable 4-3 Human genes 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 101100310674 Tenebrio molitor SP23 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100438139 Vulpes vulpes CABYR gene Proteins 0.000 description 1
- 201000007960 WAGR syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000008303 aniridia Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000156 high-resolution energy loss spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004318 naive thymus-derived CD4-positive, alpha-beta T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 101150113941 trt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к Т-клеточным рецепторам (TCR), которые связываются с пептидами, полученными из белка опухоли Вильмса 1 (WT1), когда они презентированы главным комплексом гистосовместимости. В этом отношении данное изобретение относится определяющим комплементарность областям (CDR-областям), которые специфично распознают пептиды WT1. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным пептидам, полученным из WT1.The present invention relates to T cell receptors (TCRs) that bind to peptides derived from Wilms tumor protein 1 (WT1) when presented by the major histocompatibility complex. In this regard, the present invention relates to complementarity determining regions (CDR regions) that specifically recognize WT1 peptides. The present invention also relates to immunogenic peptides derived from WT1.
Уровень техникиState of the art
Генотерапия с применением Т-клеточных рецепторов (TCR) основана на генетическом переносе генов высокоавидных опухолеспецифичных TCR в Т-лимфоциты, что позволяет направленно связывать требуемые опухолеассоциированные антигены и приводит к менее токсичной и более специфичной и эффективной терапии. Этот подход показал многообещающие результаты в клинических исследованиях. Одним из основных препятствий, ограничивающих применение TCR генотерапии для клинического лечения рака, является отсутствие опухолеспецифичных Т-клеток и соответствующих TCR. Таким образом, низкая доступность опухолеспецифичных TCR все еще остается открытой проблемой, ограничивающей широкое применение иммунотерапевтических подходов на основе TCR.Gene therapy using T-cell receptors (TCRs) is based on the genetic transfer of genes for high-avidity tumor-specific TCRs into T lymphocytes, which allows targeted binding of the desired tumor-associated antigens and leads to less toxic and more specific and effective therapy. This approach has shown promising results in clinical studies. One of the main obstacles limiting the use of TCR gene therapy for the clinical treatment of cancer is the lack of tumor-specific T cells and corresponding TCRs. Thus, the low availability of tumor-specific TCRs is still an open problem limiting the widespread application of TCR-based immunotherapeutic approaches.
Большинство опухолеассоциированных антигенов (ОАА) являются аутоантигенами, поэтому Тклетки, специфичные в отношении таких молекул, либо разрушаются, либо подвергаются анергизации в результате центральной и периферической толерантности. Несмотря на это, природные опухолеспецифичные Т-клетки наблюдали у здоровых доноров и пациентов, особенно у пациентов, пораженных гемобластозами, после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), где частота опухолеспецифических лимфоцитов коррелировала с регрессией заболевания (Kapp, М. et al. Bone Marrow Transplantation 43,399-410 (2009); и Tyler, E.M. et al. Blood 121,308-317 (2013)).Most tumor-associated antigens (TAAs) are self-antigens, and T cells specific for such molecules are either destroyed or anergized as a result of central and peripheral tolerance. Despite this, natural tumor-specific T cells have been observed in healthy donors and patients, especially in patients affected by hematological malignancies after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), where the frequency of tumor-specific lymphocytes correlated with disease regression (Kapp, M. et al Bone Marrow Transplantation 43,399-410 (2009); and Tyler, E. M. et al. Blood 121,308-317 (2013).
Выбор опухолевого антигена, который будет являться мишенью иммунотерапевтических методов, все еще остается предметом обсуждений. В идеальном случае ОАА экспрессируются в опухолевых клетках на высоком уровне при минимальной экспрессии в здоровых тканях.The choice of tumor antigen that will be the target of immunotherapeutic methods is still a matter of debate. Ideally, TAAs are expressed at high levels in tumor cells with minimal expression in healthy tissues.
Белок опухоли Вильмса 1 (WT1) - внутриклеточный белок, кодирующий фактор транскрипции с доменами цинковых пальцев, который играет важную роль в росте и дифференцировке клеток (Yang, L. et al. Leukemia 21, 868-876 (2007)). WT1 широко экспрессируется на различных гемобластных и солидных опухолях, демонстрируя при этом ограниченную экспрессию в различных здоровых тканях (например, гонадах, матке, почке, мезотелии, клетках-предшественниках в различных тканях). Последние данные свидетельствуют о роли WT1 в лейкемогенезе и онкогенезе.Wilms tumor protein 1 (WT1) is an intracellular protein encoding a zinc finger domain transcription factor that plays an important role in cell growth and differentiation (Yang, L. et al. Leukemia 21, 868-876 (2007)). WT1 is widely expressed on a variety of hematological and solid tumors, while showing limited expression in various healthy tissues (eg, gonads, uterus, kidney, mesothelium, progenitor cells in various tissues). Recent evidence suggests a role for WT1 in leukemogenesis and tumorigenesis.
Некоторые продолжающиеся клинические исследования основаны на получении ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) при вакцинации пептидами WT1. Однако, несмотря на признание того, что WT1 можно применять в иммунотерапии, малое количество эпитопов WT1, которые ограничены небольшим числом аллелей HLA, используются в настоящее время в целях вакцинации (Di Stasi, A. et al. Front. Immunol. (2015)). Одним из таких эпитопов является эпитоп WT1 126-134 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255), который презентируется МНС, кодируемым аллелем HLA-A*0201 (то есть эпитоп является HLA-A*020 1 -рестриктированным).Several ongoing clinical studies are based on obtaining cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses upon vaccination with WT1 peptides. However, despite the recognition that WT1 can be used in immunotherapy, few WT1 epitopes, which are limited to a small number of HLA alleles, are currently used for vaccination purposes (Di Stasi, A. et al. Front. Immunol. (2015)) . One such epitope is the WT1 epitope 126-134 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255), which is presented by the MHC encoded by the HLA-A*0201 allele (ie, the epitope is HLA-A*020 1 -restricted).
HLA-А*0201-рестриктированные эпитопы и соответствующие TCR представляют интерес, поскольку главный комплекс гистосовместимости (МНС), имеющий гаплотип HLA-A*0201, экспрессируется у подавляющего большинства (60%) представителей европеоидной расы. Таким образом, TCR рецепторы, которые взаимодействуют с HLA-А*0201-рестриктированными эпитопами WT1, особенно предпочтительны, поскольку иммунотерапия с использованием таких TCR, может широко применяться.HLA-A*0201-restricted epitopes and corresponding TCRs are of interest because the major histocompatibility complex (MHC), having the HLA-A*0201 haplotype, is expressed in the vast majority (60%) of Caucasians. Thus, TCR receptors that interact with HLA-A*0201-restricted WT1 epitopes are particularly preferred since immunotherapy using such TCRs can be widely used.
Эпитоп WT1 126-134 широко изучали в нескольких исследованиях, отдельно или в комбинации с дополнительными опухолевыми антигенами. Тем не менее, недавние сообщения выдвинули на первый план серьезную озабоченность в отношении процессинга этого конкретного эпитопа, что может осложнить его применение в целях иммунотерапии. Примечательно то, что эпитоп WT1 126-134 более эффективно процессируется иммунопротеасомой по сравнению со стандартными протеасомами (Jaigirdar, A. et al. J Immunother. 39(3): 105-16 (2016)), что приводит к плохому распознаванию многих HLA-A*0201 опухолевых клеточных линий или первичных лейкозных клеток, которые эндогенно экспрессируют WT1.The WT1 126-134 epitope has been extensively studied in several studies, alone or in combination with additional tumor antigens. However, recent reports have highlighted serious concerns regarding the processing of this particular epitope, which may complicate its use for immunotherapy purposes. Notably, the WT1 126-134 epitope is more efficiently processed by the immunoproteasome compared to standard proteasomes (Jaigirdar, A. et al. J Immunother. 39(3): 105-16 (2016)), resulting in poor recognition of many HLA- A*0201 tumor cell lines or primary leukemia cells that endogenously express WT1.
Таким образом, остается потребность в новых эпитопах WT1, особенно в эпитопах WT1, презентируемых МНС с распространенными HLA гаплотипами (например, HLA-A*0201).Thus, there remains a need for new WT1 epitopes, especially WT1 epitopes presented by MHC with common HLA haplotypes (eg, HLA-A*0201).
Одним природно процессируемым HLA-А*0201-рестриктированным эпитопом, который был идентифицирован, является WT1 37-45, который имеет аминокислотную последовательность VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, см., например, Smithgall et al 2001; Blood 98 (11 Part 1): 121a). Однако было описано малое число аминокислотных последовательностей TCR, особенно CDR-последовательностей, специфичных в отношении этой пептидной последовательности (Schmitt, T.M. et al. (2017) Nat Biotechnol 35: 1188-1195).One naturally processed HLA-A*0201-restricted epitope that has been identified is WT1 37-45, which has the amino acid sequence VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, see, for example, Smithgall et al 2001; Blood 98 (11 Part 1 ): 121a). However, few TCR amino acid sequences have been described, especially CDR sequences specific to this peptide sequence (Schmitt, T.M. et al. (2017) Nat Biotechnol 35: 1188-1195).
Таким образом, остается потребность в новых эпитопах WT1, особенно таких, которые рестриктированы распространенными аллелями HLA, и потребность в новых TCR, способных связываться с эпитопами WT1.Thus, there remains a need for new WT1 epitopes, especially those restricted by common HLA alleles, and a need for new TCRs capable of binding to WT1 epitopes.
- 1 045443- 1 045443
Сущность изобретенияThe essence of the invention
В настоящем изобретении идентифицировали новые TCR, которые связываются с пептидами WT1, презентированными МНС. Кроме того, были определены аминокислотные последовательности TCR, включающие аминокислотные последовательности их CDR-областей, которые ответственны за специфичность связывания с WT1. Кроме того, было продемонстрировано, что Т-клетки, экспрессирующие TCR-рецепторы согласно настоящему изобретению, специфично взаимодействуют и убивают клетки, которые повышенно экспрессируют белок WT1. Кроме того, было показано, что TCR-рецепторы согласно настоящему изобретению рестриктированы МНС, кодируемым аллелями HLA класса 1 и 2, распространенными среди европеоидной расы, такими как HLA-A*0201 и HLA-B*3501 или HLA-B*3502.The present invention has identified novel TCRs that bind to MHC-presented WT1 peptides. In addition, the amino acid sequences of the TCRs, including the amino acid sequences of their CDR regions, that are responsible for the specificity of binding to WT1 were determined. In addition, it has been demonstrated that T cells expressing the TCR receptors of the present invention specifically interact with and kill cells that overexpress WT1 protein. In addition, the TCR receptors of the present invention have been shown to be restricted by MHC encoded by HLA class 1 and 2 alleles common in the Caucasian race, such as HLA-A*0201 and HLA-B*3501 or HLA-B*3502.
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен Т-клеточный рецептор (TCR), который связывается с пептидом белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR:Thus, in a first aspect of the present invention there is provided a T cell receptor (TCR) that binds to a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR:
(i) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(i) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(ii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(iii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(iii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(iv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(iv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(v) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(v) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(vi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(vi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(vii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(vii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;.CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;.
(viii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(viii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ix) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(ix) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
- 2 045443- 2 045443
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(х) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(x) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASRAAGLDTEAFF (ID NO:57 SEQ) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASRAAGLDTEAFF (ID NO:57 SEQ) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xiii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xiii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xiv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xiv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xvi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xvi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xvii) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xvii) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xviii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xviii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xix) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xix) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
- 3 045443- 3 045443
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(хх) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xx) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxii) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xxii) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxiii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxiii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxiv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxiv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxvi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxvi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxvii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxvii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxviii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxviii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxix) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxix) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
- 4 045443- 4 045443
CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ххх) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxx) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxi) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxi) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxiii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxiii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxiv) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xxxiv) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxv) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxv) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxvi) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xxxvi) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxvii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxvii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxviii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxviii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxix) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xxxix) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
- 5 045443- 5 045443
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(хххх) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательность(xxxx) includes CDR3a containing the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxxi) включает CDR3 α, включающую аминокислотную последовательность(xxxxi) includes CDR3 α comprising the amino acid sequence
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций; или (xxxxii) включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions; or (xxxxii) includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, иCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and
CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCDR3e, including the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, включающий следующие CDR-последовательности:In one embodiment of the present invention, a TCR of the present invention is provided comprising the following CDR sequences:
(i) CDR1a - KALYS (SEQ ID NO: 1),(i) CDR1a - KALYS (SEQ ID NO: 1),
CDR2a - LLKGGEQ (SEQ ID NO: 2),CDR2a - LLKGGEQ (SEQ ID NO: 2),
CDR3a - CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3),CDR3a - CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3),
CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 6),CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 6),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 7), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 7), and
CDR3e - CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ii) CDR1a - NSASQS (SEQ ID NO: 34),(ii) CDR1a - NSASQS (SEQ ID NO: 34),
CDR2a - VYSSGN (SEQ ID NO: 35),CDR2a - VYSSGN (SEQ ID NO: 35),
CDR3a - CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36),CDR3a - CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36),
CDR1e - LGHNA (SEQ ID NO: 39),CDR1e - LGHNA (SEQ ID NO: 39),
CDR2e - YSLEER (SEQ ID NO: 40), иCDR2e - YSLEER (SEQ ID NO: 40), and
CDR3e - CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(iii) CDR1a - SSVPPY (SEQ ID NO: 12),(iii) CDR1a - SSVPPY (SEQ ID NO: 12),
CDR2a - YTSAATLV (SEQ ID NO: 13),CDR2a - YTSAATLV (SEQ ID NO: 13),
CDR3a - CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14),CDR3a - CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14),
CDR1e - SGHAT (SEQ ID NO: 22),CDR1e - SGHAT (SEQ ID NO: 22),
CDR2e - FQNNGV (SEQ ID NO: 23), иCDR2e - FQNNGV (SEQ ID NO: 23), and
CDR3e - CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(iv) CDR1a - SSVPPY (SEQ ID NO: 12),(iv) CDR1a - SSVPPY (SEQ ID NO: 12),
CDR2a - YTSAATLV (SEQ ID NO: 13),CDR2a - YTSAATLV (SEQ ID NO: 13),
CDR3a - CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14),CDR3a - CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14),
CDR1e - SGHTA (SEQ ID NO: 28),CDR1e - SGHTA (SEQ ID NO: 28),
CDR2e - FQGNSA (SEQ ID NO: 29), иCDR2e - FQGNSA (SEQ ID NO: 29), and
CDR3e - CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(v) CDR1a - TSESDYY (SEQ ID NO: 17),(v) CDR1a - TSESDYY (SEQ ID NO: 17),
CDR2a - QEAYKQQN (SEQ ID NO: 18),CDR2a - QEAYKQQN (SEQ ID NO: 18),
CDR3a - CAYRSLKYGNKLVF (ID NO: 19 SEQ),CDR3a - CAYRSLKYGNKLVF (ID NO: 19 SEQ),
CDR1e - SGHAT (SEQ ID NO: 22),CDR1e - SGHAT (SEQ ID NO: 22),
CDR2e - FQNNGV (SEQ ID NO: 23), иCDR2e - FQNNGV (SEQ ID NO: 23), and
CDR3e - CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24), или их варианты, каждый из которых содержит доCDR3e - CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24), or variants thereof, each containing up to
- 6 045443 трех аминокислотных замен, вставок или делеций;- 6 045443 three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(vi) CDR1a - TSESDYY (SEQ ID NO: 17),(vi) CDR1a - TSESDYY (SEQ ID NO: 17),
CDR2a - QEAYKQQN (SEQ ID NO: 18),CDR2a - QEAYKQQN (SEQ ID NO: 18),
CDR3a - CAYRSLKYGNKLVF (ID NO: 19 SEQ),CDR3a - CAYRSLKYGNKLVF (ID NO: 19 SEQ),
CDR1e - SGHTA (SEQ ID NO: 28),CDR1e - SGHTA (SEQ ID NO: 28),
CDR2e - FQGNSA (SEQ ID NO: 29), иCDR2e - FQGNSA (SEQ ID NO: 29), and
CDR3e - CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(vii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),(vii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),
CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),
CDR1e - MNHNS (SEQ ID NO: 55),CDR1e - MNHNS (SEQ ID NO: 55),
CDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 56), иCDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 56), and
CDR3e - CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(viii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),(viii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),
CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),
CDR1e - MNHNY (SEQ ID NO: 61),CDR1e - MNHNY (SEQ ID NO: 61),
CDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 62), иCDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 62), and
CDR3e - CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ix) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),(ix) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 45),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 46),
CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),CDR3a - CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47),
CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 67),CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 67),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 68), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 68), and
CDR3e - CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(х) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),(x) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),
CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),
CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),
CDR1e - MNHNS (SEQ ID NO: 55),CDR1e - MNHNS (SEQ ID NO: 55),
CDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 56), иCDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 56), and
CDR3e - CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xi) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),(xi) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),
CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),
CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),
CDR1e - MNHNY (SEQ ID NO: 61),CDR1e - MNHNY (SEQ ID NO: 61),
CDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 62), иCDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 62), and
CDR3e - CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xii) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),(xii) CDR1a - DSAIYN (SEQ ID NO: 50),
CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),CDR2a - IQSSQRE (SEQ ID NO: 51),
CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),CDR3a - CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52),
CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 67),CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 67),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 68), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 68), and
CDR3e - CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xiii) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 73),(xiii) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 73),
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 74),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 74),
CDR3a - CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75),CDR3a - CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75),
CDR1e - ENHRY (SEQ ID NO: 78),CDR1e - ENHRY (SEQ ID NO: 78),
CDR2e - SYGVKD (SEQ ID NO: 79), иCDR2e - SYGVKD (SEQ ID NO: 79), and
CDR3e - CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xiv) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 73),(xiv) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 73),
- 7 045443- 7 045443
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 74),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 74),
CDR3a - CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75),CDR3a - CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75),
CDRie - SGDLS (SEQ ID NO: 84),CDRie - SGDLS (SEQ ID NO: 84),
CDR2e - YYNGEE (SEQ ID NO: 85), иCDR2e - YYNGEE (SEQ ID NO: 85), and
CDR3e - CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xv) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 90),(xv) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 90),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 91),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 91),
CDR3a - CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92),CDR3a - CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92),
CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 95),CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 95),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 96), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 96), and
CDR3e - CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xvi) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),(xvi) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),
CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),
CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), and
CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xvii) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),(xvii) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),
CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),
CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),
CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),
CDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), иCDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), and
CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xviii) CDR1a - DSVNN (ID NO: 106 SEQ),(xviii) CDR1a - DSVNN (ID NO: 106 SEQ),
CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),
CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), and
CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xix) CDR1a - DSVNN (ID NO: 106 SEQ),(xix) CDR1a - DSVNN (ID NO: 106 SEQ),
CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),
CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),
CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),
CDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), иCDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), and
CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(хх) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),(xx) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),
CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), and
CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxi) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),(xxi) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),
CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),
CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),
CDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), иCDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), and
CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxii) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 173),(xxii) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 173),
CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 174),CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 174),
CDR3a - CAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175),CDR3a - CAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175),
- 8 045443- 8 045443
CDRie - MNHNS (SEQ ID NO: 178),CDRie - MNHNS (SEQ ID NO: 178),
CDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 179), иCDR2e - SASEGT (SEQ ID NO: 179), and
CDR3e - CASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxiii) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),(xxiii) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),
CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),
CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),
CDR1e - SGHTS (SEQ ID NO: 194),CDR1e - SGHTS (SEQ ID NO: 194),
CDR2e - YDEGEE (SEQ ID NO: 195), иCDR2e - YDEGEE (SEQ ID NO: 195), and
CDR3e - CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxiv) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),(xxiv) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),
CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),
CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),
CDR1e - KGHSH (SEQ ID NO: 200),CDR1e - KGHSH (SEQ ID NO: 200),
CDR2e - LQKENI (SEQ ID NO: 201), иCDR2e - LQKENI (SEQ ID NO: 201), and
CDR3e - CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxv) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),(xxv) CDR1a - VGISA (SEQ ID NO: 184),
CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),CDR2a - LSSGK (SEQ ID NO: 185),
CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),CDR3a - CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186),
CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 206),CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 206),
CDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 207), иCDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 207), and
CDR3e - CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxvi) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),(xxvi) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),
CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),
CDR1e - SGHTS (SEQ ID NO: 194),CDR1e - SGHTS (SEQ ID NO: 194),
CDR2e - YDEGEE (SEQ ID NO: 195), иCDR2e - YDEGEE (SEQ ID NO: 195), and
CDR3e - CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxvii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),(xxvii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),
CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),
CDR1e - KGHSH (SEQ ID NO: 200),CDR1e - KGHSH (SEQ ID NO: 200),
CDR2e - LQKENI (SEQ ID NO: 201), иCDR2e - LQKENI (SEQ ID NO: 201), and
CDR3e - CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxviii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),(xxviii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 189),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 190),
CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),CDR3a - CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191),
CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 206),CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 206),
CDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 207), иCDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 207), and
CDR3e - CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxix) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 212),(xxix) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 212),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 213),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 213),
CDR3a - CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214),CDR3a - CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214),
CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 217),CDR1e - MNHEY (SEQ ID NO: 217),
CDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 218), иCDR2e - SVGAGI (SEQ ID NO: 218), and
CDR3e - CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(ххх) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 90),(xxx) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 90),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 91),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 91),
CDR3a - CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92),CDR3a - CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92),
CDR1e - SGHRS (SEQ ID NO: 269),CDR1e - SGHRS (SEQ ID NO: 269),
CDR2e - YFSETQ (SEQ ID NO: 270), иCDR2e - YFSETQ (SEQ ID NO: 270), and
- 9 045443- 9 045443
CDR3e - CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxi) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 264),(xxxi) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 264),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 265),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 265),
CDR3a - CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266),CDR3a - CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266),
CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 95),CDR1e - SGHNS (SEQ ID NO: 95),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 96), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 96), and
CDR3e - CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 264),(xxxii) CDR1a - NSMFDY (SEQ ID NO: 264),
CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 265),CDR2a - ISSIKDK (SEQ ID NO: 265),
CDR3a - CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266),CDR3a - CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266),
CDR1e - SGHRS (SEQ ID NO: 269),CDR1e - SGHRS (SEQ ID NO: 269),
CDR2e - YFSETQ (SEQ ID NO: 270), иCDR2e - YFSETQ (SEQ ID NO: 270), and
CDR3e - CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxiii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),(xxxiii) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),
CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 161),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 162), and
CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxiv) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),(xxxiv) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),
CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),
CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),CDR1e - SQVTM (SEQ ID NO: 167),
CDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), иCDR2e - ANQGSEA (SEQ ID NO: 168), and
CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxv) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),(xxxv) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),
CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), and
CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxvi) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),(xxxvi) CDR1a - TSINN (SEQ ID NO: 275),
CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),CDR2a - IRSNERE (SEQ ID NO: 276),
CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),CDR3a - CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277),
CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), and
CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxvii) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),(xxxvii) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),
CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),
CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),
CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), and
CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxviii) CDR1a - DSVNN (SEQ ID NO: 106),(xxxviii) CDR1a - DSVNN (SEQ ID NO: 106),
CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),
CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),
CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), and
CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
- 10 045443 (xxxix) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),- 10 045443 (xxxix) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),
CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),
CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),CDR1e - SGHDY (SEQ ID NO: 286),
CDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), иCDR2e - FNNNVP (SEQ ID NO: 287), and
CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(хххх) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),(xxxx) CDR1a - DSSSTY (SEQ ID NO: 101),
CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),CDR2a - IFSNMDM (SEQ ID NO: 102),
CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),CDR3a - CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), and
CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
(xxxxi) CDR1a - DSVNN (SEQ ID NO: 106),(xxxxi) CDR1a - DSVNN (SEQ ID NO: 106),
CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),CDR2a - IPSGT (SEQ ID NO: 107),
CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),CDR3a - CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), and
CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций; или (xxxxii) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions; or (xxxxii) CDR1a - DSASNY (SEQ ID NO: 111),
CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),CDR2a - IRSNVGE (SEQ ID NO: 112),
CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),CDR3a - CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113),
CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),CDR1e - DFQATT (SEQ ID NO: 280),
CDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), иCDR2e - SNEGSKA (SEQ ID NO: 281), and
CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), или их варианты, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.CDR3e - CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282), or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, включающий:In one embodiment of the present invention, a TCR of the present invention is provided, comprising:
(i) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(i) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(ii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(ii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(iii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(iii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(iv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей(iv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least
- 11 045443 мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;- 11 045443 at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(v) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(v) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(vi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(vi) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(vii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(vii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(viii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(viii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(ix) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(ix) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(х) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(x) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53(xi) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53
- 12 045443 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;- 12 045443 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xiii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xiii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xiv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87 или вариант этого по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xiv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87 or a variant thereof of at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xvi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xvi) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xvii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентично(xvii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% identical
- 13 045443 стью последовательности с ней;- 13 045443 there is a sequence with it;
(xviii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xviii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xix) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xix) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(хх) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xx) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxi) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 181 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 181 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxiii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxiii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxiv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 203 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей(xxiv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 203 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least
- 14 045443 мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;- 14 045443 at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% identical sequences with her;
(xxv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 209 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxvi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxvi) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxvii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 203 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxvii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 203 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxviii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; или (xxix) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 220 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxviii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 209 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; or (xxix) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 220 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(ххх) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 272 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxx) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 272 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 267 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последова-(xxxi) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 267 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity
- 15 045443 тельности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность- 15 045443 relationship with her; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence
SEQ ID NO: 98 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;SEQ ID NO: 98 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97 %, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it;
(xxxii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 267 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 272 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 267 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 272 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxiii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxiii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 278 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxiv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxiv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 278 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxv) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxv) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 278 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 283 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxvi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 289 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxvi) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 278 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 289 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxvii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 289 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxvii) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 289 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxviii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере(xxxviii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least
- 16 045443- 16 045443
85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 289 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 289 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxix) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 289 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxxix) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 289 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(ххх х) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней;(xxx x) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 283 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto;
(xxxxi) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; или (xxxxii) вариабельный домен α-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и вариабельный домен β-цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней.(xxxxi) an α chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 283 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; or (xxxxii) an α-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β-chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 283 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, включающий:In one embodiment of the present invention, a TCR of the present invention is provided, comprising:
(i) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и вариантов SEQ ID NO: 10 и 11, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(i) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and variants of SEQ ID NO: 10 and 11, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(ii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 и вариантов SEQ ID NO: 43 и 44, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%,(ii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, and variants of SEQ ID NO: 43 and 44, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%,
- 17 045443 по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;- 17 045443 at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(iii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и вариантов SEQ ID NO: 26 и 27, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(iii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and variants of SEQ ID NO: 26 and 27, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(iv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и вариантов SEQ ID NO: 32 и 33, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(iv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and variants of SEQ ID NO: 32 and 33, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(v) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и вариантов SEQ ID NO: 26 и 27, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(v) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and variants of SEQ ID NO: 26 and 27, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(vi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и вариантов SEQ ID NO: 32 и 33, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(vi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and variants of SEQ ID NO: 32 and 33, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(vii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и вариантов SEQ ID NO: 59 и 60, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(vii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, and variants of SEQ ID NO: 59 and 60, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(viii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 и вариантов SEQ ID NO: 65 и 66, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(viii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, and variants of SEQ ID NO: 65 and 66, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(ix) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID(ix) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID
- 18 045443- 18 045443
NO: 71, SEQ ID NO: 72 и вариантов SEQ ID NO: 71 и 72, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;NO: 71, SEQ ID NO: 72 and variants of SEQ ID NO: 71 and 72 having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity therewith;
(х) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и вариантов SEQ ID NO: 59 и 60, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(x) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, and variants of SEQ ID NO: 59 and 60, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 и вариантов SEQ ID NO: 65 и 66, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, and variants of SEQ ID NO: 65 and 66, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и вариантов SEQ ID NO: 71 и 72, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and variants of SEQ ID NO: 71 and 72, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xiii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 и вариантов SEQ ID NO: 82 и 83, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xiii) an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, and variants of SEQ ID NO: 82 and 83, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xiv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 и вариантов SEQ ID NO: 88 и 89, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xiv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, and variants of SEQ ID NO: 88 and 89 having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 и вариантов SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 and variants of SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 having at least 75% of at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75 % sequence identity with them;
(xvi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по(xvi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or according
- 19 045443 меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166 и вариантов SEQ ID NO: 165 и 166, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;- 19 045443 at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, and variants of SEQ ID NO: 165 and 166, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xvii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 и вариантов SEQ ID NO: 171 и 172, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xvii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, and variants of SEQ ID NO: 171 and 172, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xviii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166 и вариантов SEQ ID NO: 165 и 166, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xviii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, and variants of SEQ ID NO: 165 and 166, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xix) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 и вариантов SEQ ID NO: 171 и 172, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xix) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, and variants of SEQ ID NO: 171 and 172, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(хх) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166 и вариантов SEQ ID NO: 165 и 166, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xx) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, and variants of SEQ ID NO: 165 and 166, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 и вариантов SEQ ID NO: 171 и 172, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, and variants of SEQ ID NO: 171 and 172, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 177 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 и вариантов SEQ ID NO: 182 и 183, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 177 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, and variants of SEQ ID NO: 182 and 183, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxiii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188 или ее вариант,(xxiii) an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 188 or a variant thereof,
- 20 045443 обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 и вариантов SEQ ID NO: 198 и 199, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;- 20 045443 having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98 % or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, and variants of SEQ ID NO: 198 and 199, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxiv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 и вариантов SEQ ID NO: 204 и 205, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxiv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 188 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, and variants of SEQ ID NO: 204 and 205, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 и вариантов SEQ ID NO: 210 и 211, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 188 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, and variants of SEQ ID NO: 210 and 211, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxvi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 и вариантов SEQ ID NO: 198 и 199, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxvi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 193 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, and variants of SEQ ID NO: 198 and 199, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxvii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 и вариантов SEQ ID NO: 204 и 205, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxvii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 193 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, and variants of SEQ ID NO: 204 and 205, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxviii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 и вариантов SEQ ID NO: 210 и 211, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxviii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 193 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, and variants of SEQ ID NO: 210 and 211, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxix) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 216 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222 и вариантов SEQ ID NO: 221 и 222, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по(xxix) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 216 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, and variants of SEQ ID NO: 221 and 222, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably
- 21 045443 меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;- 21 045443 at least 75% sequence identity with them;
(ххх) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274 и вариантов SEQ ID NO: 273 и 274, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxx) an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, and variants of SEQ ID NO: 273 and 274, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 268 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 и вариантов SEQ ID NO: 99 и 100, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 268 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, and variants of SEQ ID NO: 99 and 100, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 268 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274 и вариантов SEQ ID NO: 273 и 274, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 268 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, and variants of SEQ ID NO: 273 and 274, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxiii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166 и вариантов SEQ ID NO: 165 и 166, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxiii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 279 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, and variants of SEQ ID NO: 165 and 166, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxiv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 и вариантов SEQ ID NO: 171 и 172, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxiv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 279 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, and variants of SEQ ID NO: 171 and 172, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxv) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 и вариантов SEQ ID NO: 284 и 285, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxv) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 279 or a variant thereof, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, and variants of SEQ ID NO: 284 and 285, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxvi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 и вариантов SEQ ID NO: 290 и 291 наличие по меньшей мере 75%, по меньшей(xxxvi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 279 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 and variants of SEQ ID NO: 290 and 291 presence of at least 75%, at least
- 22 045443 мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;- 22 045443 at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxvii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 и вариантов SEQ ID NO: 290 и 291 наличие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxvii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 and variants of SEQ ID NO: 290 and 291 presence of at least 75%, at least 80%, at least at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto ;
(xxxviii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 и вариантов SEQ ID NO: 290 и 291 наличие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxviii) an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 and variants of SEQ ID NO: 290 and 291 presence of at least 75%, at least 80%, at least at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto ;
(xxxix) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 и вариантов SEQ ID NO: 290 и 291 наличие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxxix) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 and variants of SEQ ID NO: 290 and 291 presence of at least 75%, at least 80%, at least at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto ;
(ххх х) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 и вариантов SEQ ID NO: 284 и 285, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними;(xxx x) an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% , at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, and variants of SEQ ID NO: 284 and 285, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them;
(xxxxi) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 и вариантов SEQ ID NO: 284 и 285, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними; или (xxxxii) α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 и вариантов SEQ ID NO: 284 и 285, обладающих по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними.(xxxxi) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, and variants of SEQ ID NO: 284 and 285, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them; or (xxxxii) an α-chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% , at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, and variants of SEQ ID NO: 284 and 285, having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with them.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, включающий α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 257 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%In one embodiment of the present invention, there is provided a TCR of the present invention comprising an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 257 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%
- 23 045443 или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 259 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней.- 23 045443 or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity with it; and a β chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 259 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, включающий α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 261 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней; и β-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 263 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней.In one embodiment of the present invention, there is provided a TCR of the present invention comprising an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 261 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto; and a β chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 263 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, preferably at least 75% sequence identity thereto.
TCR настоящего изобретения может связываться с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изThe TCR of the present invention can bind to a WT1 peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен Т-клеточный рецептор (TCR), который связывается с пептидом белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где пептид WT1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изIn another aspect of the present invention, there is provided a T cell receptor (TCR) that binds to a major histocompatibility complex (MHC) Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the WT1 peptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения связывается с пептидным комплексом МНС I и/или МНС П.In one embodiment, the TCR of the present invention binds to the MHC I and/or MHC II peptide complex.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован аллелем человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован аллелем HLA-A или HLA-B. В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован аллелем HLA-A, выбранным из группы, состоящей из HLA-A*0201, HLA-A*0101, HLA-A*2402 и HLA-A*0301, или аллелем HLA-B, выбранным из группы, состоящей из HLA-B*0702, HLA-B*35O1 и HLA-B*35O2.In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by a human leukocyte antigen (HLA) allele. In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by an HLA-A or HLA-B allele. In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by an HLA-A allele selected from the group consisting of HLA-A*0201, HLA-A*0101, HLA-A*2402 and HLA-A*0301, or an HLA-B allele selected from the group consisting of HLA-B*0702, HLA-B*35O1 and HLA-B*35O2.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован HLA-A*0201.In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by HLA-A*0201.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован HLA-B*3502.In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by HLA-B*3502.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован HLA-B*3501.In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by HLA-B*3501.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован аллелем HLA-C. В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения рестриктирован аллелем HLA-C, выбранным из группы, состоящей из HLA-C*O7:O1, HLA-C*03:04, HLA-C*04:01, HLA-C*05:01, HLA-C*06:02 и HLA-C*07:02.In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by an HLA-C allele. In one embodiment, the TCR of the present invention is restricted by an HLA-C allele selected from the group consisting of HLA-C*O7:O1, HLA-C*03:04, HLA-C*04:01, HLA-C*05:01 , HLA-C*06:02 and HLA-C*07:02.
- 24 045443- 24 045443
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения включает одну или более мутаций в области соединения α-цепи/β-цепи, такие, что, когда α-цепь и β-цепь экспрессируются в Т-клетке, частота ошибочного спаривания между указанными цепями и α и β-цепями эндогенного TCR снижена.In one embodiment, the TCR of the present invention includes one or more mutations in the α-chain/β-chain junction region such that when the α-chain and β-chain are expressed in a T cell, the frequency of mismatches between these chains and the α and β chains is β-chains of endogenous TCR are reduced.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения включает одну или более мутаций в области соединения α-цепи/β-цепи, такие, что, когда α-цепь и β-цепь экспрессируются в Т-клетке, уровень экспрессии α и β цепи TCR повышен.In one embodiment, the TCR of the present invention includes one or more mutations in the α chain/β chain junction region such that when the α chain and β chain are expressed in a T cell, the level of expression of the TCR α and β chains is increased.
В одном варианте осуществления одна или более мутаций вводят остаток цистеина в домен константной области каждой α-цепи и β-цепи, где остатки цистеина способны образовывать дисульфидную связь между α-цепью и β-цепью.In one embodiment, one or more mutations introduce a cysteine residue into the constant region domain of each α chain and β chain, where the cysteine residues are capable of forming a disulfide bond between the α chain and the β chain.
TCR настоящего изобретения может включать муринизированную константную область.The TCR of the present invention may include a murinized constant region.
В одном варианте осуществления TCR изобретения является растворимым TCR.In one embodiment, the TCR of the invention is a soluble TCR.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий αцепь Т-клеточного рецептора (TCR) настоящего изобретения и/или β-цепь TCR настоящего изобретения.In another aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide encoding the T cell receptor (TCR) α chain of the present invention and/or the TCR β chain of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 256 и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 258, или их варианты, обладающие по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними.In another aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 256 and/or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 258, or variants thereof, having at least 40%, at least 50%, at least 60% , at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, according to at least 98% or at least 99% sequence identity with them.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 260 и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 262, или их варианты, обладающие по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними.In another aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 260 and/or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 262, or variants thereof, having at least 40%, at least 50%, at least 60% , at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, according to at least 98% or at least 99% sequence identity with them.
В одном варианте осуществления выделенный полинуклеотид кодирует α-цепь, связанную с βцепью. В одном варианте осуществления выделенный полинуклеотид кодирует одну или более последовательностей коротких интеферирующих РНК (миРНК) и/или одно или более других средств, способных снижать или блокировать экспрессию одного или более эндогенных генов TCR.In one embodiment, the isolated polynucleotide encodes an α chain linked to a β chain. In one embodiment, the isolated polynucleotide encodes one or more short interfering RNA (siRNA) sequences and/or one or more other agents capable of reducing or blocking the expression of one or more endogenous TCR genes.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, включающий полинуклеотид настоящего изобретения. В одном варианте осуществления вектор включает полинуклеотид, который кодирует одну или более цепей CD3, CD8, суицидальный ген и/или селективный маркер.In another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising a polynucleotide of the present invention. In one embodiment, the vector includes a polynucleotide that encodes one or more CD3, CD8, suicide gene, and/or selectable marker chains.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, включающая TCR настоящего изобретения, полинуклеотид настоящего изобретения или вектор настоящего изобретения.In another aspect of the present invention, a cell is provided including a TCR of the present invention, a polynucleotide of the present invention, or a vector of the present invention.
В одном варианте осуществления клетка дополнительно включает вектор, который кодирует одну или более цепей CD3, CD8, суицидальный ген и/или селективный маркер.In one embodiment, the cell further includes a vector that encodes one or more CD3, CD8, suicide gene, and/or selectable marker chains.
В одном варианте осуществления клетка является Т-клеткой, лимфоцитом или стволовой клеткой, такой как гемопоэтические стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС). Т-клетка, лимфоцит или стволовая клетка могут быть выбраны из группы, состоящей из CD4 клеток, CD8 клеток, Th0 клеток, Тс0 клеток, Th1 клеток, Tc1 клеток, Th2 клеток, Тс2 клеток, Th17 клеток, Th22 клеток, гамма/дельта Т-клеток, естественных киллерных клеток (NK), естественных киллерных Тклеток (NKT), двойных отрицательных Т-клеток, наивных Т-клеток, стволовых Т-клеток памяти, Тклеток центральной памяти, эффекторных Т-клеток памяти, эффекторный Т-клеток, гемопоэтических стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток.In one embodiment, the cell is a T cell, lymphocyte, or stem cell, such as hematopoietic stem cells or induced pluripotent stem cells (iPS). The T cell, lymphocyte or stem cell may be selected from the group consisting of CD4 cells, CD8 cells, Th0 cells, Tc0 cells, Th1 cells, Tc1 cells, Th2 cells, Tc2 cells, Th17 cells, Th22 cells, gamma/delta T -cells, natural killer (NK) cells, natural killer T cells (NKT), double negative T cells, naive T cells, memory stem T cells, central memory T cells, effector memory T cells, effector T cells, hematopoietic stem cells and pluripotent stem cells.
В одном варианте осуществления клетка является Т-клеткой, которая была выделена у субъекта.In one embodiment, the cell is a T cell that has been isolated from a subject.
В одном варианте осуществления эндогенный ген, кодирующий α-цепь TCR, и/или эндогенный ген, кодирующий β-цепь TCR, в клетке прерван, предпочтительно таким образом, что эндогенный ген, кодирующий α-цепь TCR, и/или эндогенный ген, кодирующий β-цепь TCR, не экспрессируется. В одном варианте осуществления эндогенный ген, кодирующий α-цепь TCR и/или эндогенный ген, кодирующий βцепь TCR, прерван в результате вставки кассеты экспрессии, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR настоящего изобретения. В одном варианте осуществления один или более эндогенных генов, кодирующих МНС, в клетке прерваны, где клетка предпочтительно является неаллореактивной универсальной Т-клеткой. В одном варианте осуществления эндогенный ген, участвующий в персистировании, размножении, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функциях Т-клеток в клетке, прерван, где эндогенный ген, участвующий в персистировании, размножении, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функциях Т-клеток, предпочтительно выбран из группы, состоящей из PD1, TIM3, LAG3, 2В4, KLRG1, TGFbR, CD160 и CTLA4. В одном варианте осуществления эндогенный ген, участвующий в персистировании, размножении, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функциях Т-клеток, прерван в результате интеграции кассеты экспрессии, где кассета экспрессии вклю- 25 045443 чает полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR настоящего изобретения.In one embodiment, the endogenous gene encoding the TCR α chain and/or the endogenous gene encoding the TCR β chain is interrupted in the cell, preferably such that the endogenous gene encoding the TCR α chain and/or the endogenous gene encoding TCR β chain is not expressed. In one embodiment, the endogenous gene encoding the TCR α chain and/or the endogenous gene encoding the TCR β chain is interrupted by insertion of an expression cassette comprising a polynucleotide sequence encoding the TCR of the present invention. In one embodiment, one or more endogenous MHC-encoding genes in the cell are interrupted, where the cell is preferably a non-alloreactive generalist T cell. In one embodiment, an endogenous gene involved in persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/senescence/inhibition signals, homing ability, or other T cell functions in the cell is interrupted, wherein the endogenous gene involved in persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/senescence/inhibition signals, homing ability or other T cell functions, preferably selected from the group consisting of PD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160 and CTLA4. In one embodiment, an endogenous gene involved in persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/aging/inhibition signals, homing ability, or other T cell functions is interrupted by integration of an expression cassette, wherein the expression cassette includes a polynucleotide the TCR coding sequence of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения клетки, который включает этап введения вектора изобретения в клетку in vitro, ex vivo или in vivo, например, путем трансфекции или трансдукции.In another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a cell, which includes the step of introducing a vector of the invention into a cell in vitro, ex vivo or in vivo, for example, by transfection or transduction.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения клетки, который включает этап трансдукции клетки in vitro, ex vivo или in vivo одним или более векторами настоящего изобретения.In another aspect of the present invention, there is provided a method of producing a cell, which includes the step of transducing the cell in vitro, ex vivo or in vivo with one or more vectors of the present invention.
В одном варианте осуществления клетка, которая подлежит трансдукции одним или более векторами, выбрана из группы, состоящей из Т-клеток, лимфоцитов или стволовых клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС), необязательно Т-клетка, лимфоцит или стволовая клетка могут быть выбраны из группы, состоящей из CD4 клеток, CD8 клеток, Th0 клеток, Тс0 клеток, Th1 клеток, Tc1 клеток, Th2 клеток, Тс2 клеток, Th17 клеток, Th22 клеток, гамма/дельта Т-клеток, естественных киллерных клеток (NK), естественных киллерных Т-клеток (NKT), двойных отрицательных Т-клеток, наивных Т-клеток, стволовых Т-клеток памяти, Т-клеток центральной памяти, эффекторных Т-клеток памяти, эффекторных Т-клеток, гемопоэтических стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток.In one embodiment, the cell that is to be transduced with one or more vectors is selected from the group consisting of T cells, lymphocytes or stem cells, such as hematopoietic stem cells or induced pluripotent stem cells (iPS), optionally a T cell, lymphocyte or the stem cell may be selected from the group consisting of CD4 cells, CD8 cells, Th0 cells, Tc0 cells, Th1 cells, Tc1 cells, Th2 cells, Tc2 cells, Th17 cells, Th22 cells, gamma/delta T cells, natural killer cells (NK), natural killer T cells (NKT), double negative T cells, naïve T cells, memory stem T cells, central memory T cells, effector memory T cells, effector T cells, hematopoietic stem cells and pluripotent stem cells.
В одном варианте осуществления способ включает этап редактирования Т-клеток, который включает прерывание эндогенного гена, например, эндогенного гена, кодирующего α-цепь TCR, и/или эндогенного гена, кодирующего β-цепь TCR, с помощью искусственной нуклеазы, где искусственная нуклеаза предпочтительно выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN), подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN) и системы CRISPR/Cas.In one embodiment, the method includes a T cell editing step that includes interrupting an endogenous gene, for example, an endogenous gene encoding a TCR α chain and/or an endogenous gene encoding a TCR β chain, using an artificial nuclease, where the artificial nuclease is preferably selected from the group consisting of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the CRISPR/Cas system.
В одном варианте осуществления способ включает этап редактирования Т-клеток, который включает прерывание эндогенного гена, кодирующего α-цепь TCR, и/или эндогенного гена, кодирующего βцепь TCR, с помощью искусственной нуклеазы, где искусственная нуклеаза предпочтительно выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN), подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN) и системы CRISPR/Cas.In one embodiment, the method includes a T cell editing step that includes interrupting an endogenous gene encoding a TCR α chain and/or an endogenous gene encoding a TCR β chain using an artificial nuclease, wherein the artificial nuclease is preferably selected from the group consisting of zinc -finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and the CRISPR/Cas system.
В одном варианте осуществления способ включает этап направленной интеграции кассеты экспрессии в эндогенный ген, кодирующий ген α-цепи TCR, и/или эндогенный ген, кодирующий β-цепь TCR, прерванный с помощью искусственной нуклеазы, где кассета экспрессии включает полинуклеотид, кодирующий TCR настоящего изобретения или полинуклеотидную последовательность настоящего изобретения.In one embodiment, the method includes the step of targeting integration of an expression cassette into an endogenous gene encoding a TCR α chain gene and/or an endogenous gene encoding a TCR β chain interrupted by an artificial nuclease, wherein the expression cassette includes a polynucleotide encoding a TCR of the present invention or a polynucleotide sequence of the present invention.
В одном варианте осуществления способ включает этап прерывания одного или более эндогенных генов, кодирующих МНС, где клетка, полученная с применением данного способа, предпочтительно является неаллореактивной универсальной Т-клеткой.In one embodiment, the method includes the step of interrupting one or more endogenous MHC-encoding genes, wherein the cell obtained using the method is preferably a non-alloreactive universal T cell.
В одном варианте осуществления способ включает этап прерывания одного или более эндогенных генов МНС, где клетка, полученная с применением данного способа, предпочтительно является неаллореактивной универсальной Т-клеткой.In one embodiment, the method includes the step of interrupting one or more endogenous MHC genes, wherein the cell obtained using the method is preferably a non-alloreactive universal T cell.
В одном варианте осуществления способ включает этап прерывания одного или более эндогенных генов с целью модификации персистирования, размножения, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функций Т-клеток, где способ предпочтительно включает этап направленной интеграции кассеты экспрессии в эндогенный ген, участвующий в персистировании, размножении, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функциях Т-клеток, прерванный с помощью искусственной нуклеазы, где кассета экспрессии включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR настоящего изобретения, где эндогенный ген предпочтительно выбран из группы, состоящей из PD1, TIM3, LAG3, 2В4, KLRG1, TGFbR, CD160 и CTLA4.In one embodiment, the method includes the step of interrupting one or more endogenous genes to modify persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/senescence/inhibition signals, homing ability or other functions of T cells, where the method preferably includes the step of targeted integration of an expression cassette to an endogenous gene involved in persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/senescence/inhibition signals, homing ability or other functions of T cells, interrupted by an artificial nuclease, wherein the expression cassette includes a polynucleotide sequence encoding the TCR of the present invention, wherein the endogenous gene is preferably selected from the group consisting of PD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160 and CTLA4.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка настоящего изобретения или клетка, полученная способом настоящего изобретения, для применения в адоптивном переносе клетки, предпочтительно адоптивном переносе Т-клетки, при этом, необязательно, адоптивный перенос Т-клетки может быть адоптивным переносом аллогенной Т-клетки, переносом универсальной неаллореактивной Тклетки или адоптивным переносом аутологичной Т-клетки.In another aspect of the present invention, a cell of the present invention or a cell obtained by the method of the present invention is provided for use in adoptive cell transfer, preferably T cell adoptive transfer, wherein, optionally, the adoptive T cell transfer may be an allogeneic T cell adoptive transfer, transfer of a universal non-alloreactive T cell or adoptive transfer of an autologous T cell.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, выделенный полинуклеотид настоящего изобретения, вектор настоящего изобретения, клетка настоящего изобретения, клетка, полученная способом настоящего изобретения, или химерная молекула настоящего изобретения для применения в терапии.In another aspect of the present invention, there is provided a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell produced by a method of the present invention, or a chimeric molecule of the present invention for use in therapy.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR настоящего изобретения, выделенный полинуклеотид настоящего изобретения, вектор настоящего изобретения, клетка настоящего изобретения, клетка, полученная способом настоящего изобретения, для применения в лечении и/или предотвращении заболевания, связанного с экспрессией WT1.In another aspect, the present invention provides a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell produced by the method of the present invention, for use in treating and/or preventing a disease associated with WT1 expression.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена Т-клетка, генетически модифицированная (генетически отредактированная) с целью модификации персистирования, размножения, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функ- 26 045443 ций Т-клеток, где Т-клетка экспрессирует α-цепь TCR настоящего изобретения и/или β-цепь TCR настоящего изобретения.Another aspect of the present invention provides a T cell that has been genetically modified (genetically edited) to modify T cell persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/aging/inhibition signals, homing ability, or other functions, wherein T The α-cell expresses the TCR α-chain of the present invention and/or the TCR β-chain of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена Т-клетка, генетически модифицированная (генетически отредактированная) с помощью методики, которая включает этап направленной интеграции кассеты экспрессии в эндогенный ген, участвующий в персистировании, размножении, активности, устойчивости к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способности или других функциях Т-клеток, прерванный с помощью искусственной нуклеазы, где кассета экспрессии включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую α-цепь TCR настоящего изобретения и/или β-цепь TCR настоящего изобретения.In another aspect of the present invention, a T cell is provided that is genetically modified (genetically edited) using a technique that includes the step of targeted integration of an expression cassette into an endogenous gene involved in persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/aging/inhibition signals, homing abilities or other functions of T cells, interrupted by an artificial nuclease, wherein the expression cassette includes a polynucleotide sequence encoding a TCR α chain of the present invention and/or a TCR β chain of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, который включает этап введения TCR настоящего изобретения, выделенного полинуклеотида настоящего изобретения, вектора настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения, клетки, полученной с применением данного способа настоящего изобретения, или химерной молекулы настоящего изобретения нуждающемуся в этом субъекту.In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating and/or preventing a disease associated with the expression of WT1, which includes the step of administering a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell obtained using this method of the present invention, or a chimeric molecule of the present invention to a subject in need thereof.
Заболевание, связанное с экспрессией WT1, может быть пролиферативным нарушением. Предпочтительно пролиферативное нарушение может быть выбрано из группы, состоящей из гемобластозов, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), лимфообластный лейкоз, миелодиспластические синдромы, множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Ходжкина. Пролиферативное нарушение может быть выбрано из группы солидных опухолей, таких как рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка, рак толстой кишки, холангиокарцинома, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак головы и шеи, синовиальная саркома, ангиосаркома, остеогенная саркома, рак щитовидной железы, рак эндометрия, нейробластома, рабдомиосаркома, рак печени, меланома, рак предстательной железы, рак почки, саркома мягких тканей, уротелиальный рак, рак желчных протоков, глиобластома, мезотелиома, рак шейки матки и рак толстой и прямой кишки.The disease associated with WT1 expression may be a proliferative disorder. Preferably, the proliferative disorder may be selected from the group consisting of hematological malignancies such as acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), lymphoblastic leukemia, myelodysplastic syndromes, multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma. The proliferative disorder may be selected from the group of solid tumors such as lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, synovial sarcoma, angiosarcoma, osteogenic sarcoma , thyroid cancer, endometrial cancer, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, liver cancer, melanoma, prostate cancer, kidney cancer, soft tissue sarcoma, urothelial cancer, bile duct cancer, glioblastoma, mesothelioma, cervical cancer and colorectal cancer.
В предпочтительном варианте осуществления заболевание, связанное с экспрессией WT1, является острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).In a preferred embodiment, the disease associated with WT1 expression is acute myeloid leukemia (AML).
В другом предпочтительном варианте осуществления заболевание, связанное с экспрессией WT1, является хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ).In another preferred embodiment, the disease associated with WT1 expression is chronic myeloid leukemia (CML).
В другом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный иммуногенный пептид WT1, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изIn another aspect of the present invention, there is provided an isolated immunogenic WT1 peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Описание чертежейDescription of drawings
Фиг. 1. Графики, на которых показаны результаты in vitro размножения функциональных WT-1специфичных Т-клеток из периферической крови десяти здоровых доноров.Fig. 1. Graphs showing the results of in vitro expansion of functional WT-1-specific T cells from the peripheral blood of ten healthy donors.
Мононуклеарные клетки периферической крови десяти здоровых доноров (HD) стимулировали пулами перекрывающихся 15-мерных пептидов WT1 в течение 26-30 ч, обогащали CD137+ клетками и размножали в течение 9-19 дней. Размноженные Т-клетки повторно стимулировали в течение 6 часов с аутологичными антигенпрезентирующими клетками (АПК), нагруженными пулом нерелевантных пептидов или пулом пептидов WT1. Кроме того, отрицательный (нестимулированные Т-клетки) и положительный (Т-клетки, культивируемые в присутствии ФМА и иономицина) контроли были включены в условия эксперимента (не показаны). На точечных диаграммах показаны результаты внутриклеточного окрашивания на продукцию IFNy и экспонирование CD107а на поверхности клеток. После нескольких повторных стимуляций аутологичными АПК, нагруженными пулами пептидов WT1, специфичность Тклеток исследовали с помощью внутриклеточного окрашивания, как описано ранее. Результаты показали обогащение WT1-специфичных Т-клеток в категории CD8 Т-клеток на HD1 (а), HD3 (с), HD4 (d), HD5 (е), HD6 (f), HD7 (g) и HD10 (j) и в категории CD4 Т-клеток на HD2 (b), HD8 (h) и HD9 (i). WT1, белок опухоли Вильмса 1; ФМА, форбол-12-миристат 13-ацетат; IFNy, интерферон-у; S, стимуляция.Peripheral blood mononuclear cells from ten healthy donors (HD) were stimulated with pools of overlapping WT1 15-mer peptides for 26–30 h, enriched for CD137+ cells, and expanded for 9–19 days. Expanded T cells were restimulated for 6 hours with autologous antigen presenting cells (APCs) loaded with a pool of irrelevant peptides or a pool of WT1 peptides. In addition, negative (unstimulated T cells) and positive (T cells cultured in the presence of PMA and ionomycin) controls were included in the experimental conditions (not shown). Dot plots show the results of intracellular staining for IFNy production and cell surface exposure of CD107a. After several repeated stimulations with autologous APCs loaded with WT1 peptide pools, T cell specificity was examined by intracellular staining as previously described. Results showed enrichment of WT1-specific T cells in the CD8 T cell category at HD1 (a), HD3 (c), HD4 (d), HD5 (e), HD6 (f), HD7 (g) and HD10 (j) and in the CD4 T cell category at HD2 (b), HD8 (h) and HD9 (i). WT1, Wilms tumor protein 1; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; IFNy, interferon-γ; S, stimulation.
Фиг. 2. Таблица и диаграммы, на которых показана идентификация WT1-иммуногенных пептидов с применением стратегии сетки картирования.Fig. 2. Table and diagrams showing the identification of WT1 immunogenic peptides using the grid mapping strategy.
- 27 045443- 27 045443
Эпитопы, распознаваемые Т-клетками, стимулированными in vitro при повторной стимуляции пулом перекрывающихся пептидов WT1, идентифицировали с помощью внутриклеточного окрашивания. В частности, оценивали процент специфичных Т-клеток, отвечающих на сетку картирования субпулов пентадекапептидов WT1, нагруженных на АПК. Кроме того, отрицательный (нестимулированные Т-клетки и Т-клеткии, совместно культивируемые с АПК, нагруженными пулом нерелевантных пептидов) и положительный (Т-клетки, культивируемые в присутствии ФМА и иономицина) контроли включали в условия эксперимента (нестимулированные Т-клетки и условия ФМА/ионо не показаны).Epitopes recognized by T cells stimulated in vitro with repeated stimulation with a pool of overlapping WT1 peptides were identified by intracellular staining. Specifically, the percentage of specific T cells responding to a mapping grid of WT1 pentadecapeptide subpools loaded on APCs was assessed. In addition, negative (unstimulated T cells and T cells co-cultured with APCs loaded with a pool of irrelevant peptides) and positive (T cells cultured in the presence of PMA and ionomycin) controls were included in the experimental conditions (unstimulated T cells and conditions FMA/iono not shown).
(а) Сетка деконволюции указывает процент Т-клеток, экспрессирующих IFNy и CD107а после сокультивирования с АПК, нагруженными различными субпулами (обозначенные SP1-24). Значения IFNy и CD107a, выделенные жирным шрифтом, обозначают субпулы, которые содержат эпитоп WT1, распознаваемый Т-клетками. Представлены репрезентативные точечные диаграммы для сокультуры Т-клеток с АПК, нагруженными положительными субпулами, и показывающие экспрессию IFNy и CD107а. Доминантные ответы наблюдали для: субпулов 4, 5, 16 у HD1 (b), HD3 (d), HD6 (g), HD7 (h), HD10 (k); субпулов 6, 16, 17, 20, 23 у HD2 (с); субпулов 4, 5, 6, 14, 18, 21 у HD4 (е); субпулов 5, 11, 12, 21, 22 у HD5 (f); субпулов 12, 14 у HD8 (i); субпулов 5, 13, 21 у HD9 (j). Для HD7 также наблюдали повышенную секрецию IFNy и экспрессию CD107а в ответ на субпулы 7, 8, 20, хотя и с более низкими процентами по сравнению с ответом, наблюдаемым с субпулами 4, 5, 16. SP, субпулы; WT1, белок опухоли Вильмса 1; АПК, антигенпрезентирующие клетки; ФМА, форбол-12-миристат-13-ацетат; IFNy, интерферон-y.(a) Deconvolution grid indicates the percentage of T cells expressing IFNγ and CD107a after coculture with APCs loaded with different subpools (labeled SP1-24). IFNγ and CD107a values in bold indicate subpools that contain the WT1 epitope recognized by T cells. Representative dot plots are presented for coculture of T cells with APCs loaded with positive subpools and showing the expression of IFNγ and CD107a. Dominant responses were observed for: subpools 4, 5, 16 in HD1 (b), HD3 (d), HD6 (g), HD7 (h), HD10 (k); subpools 6, 16, 17, 20, 23 in HD2 (c); subpools 4, 5, 6, 14, 18, 21 in HD4 (e); subpools 5, 11, 12, 21, 22 in HD5 (f); subpools 12, 14 for HD8 (i); subpools 5, 13, 21 in HD9 (j). For HD7, increased IFNy secretion and CD107a expression were also observed in response to subpools 7, 8, 20, although at lower percentages compared to the response observed with subpools 4, 5, 16. SP, subpools; WT1, Wilms tumor protein 1; APCs, antigen presenting cells; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; IFNy, interferon-y.
Фиг. 3. Эпитопная специфичность WT1-специфичных Т-клеток, полученных при сенсибилизации пулами пептидов.Fig. 3. Epitope specificity of WT1-specific T cells obtained by sensitization with peptide pools.
Для проверки WT1 иммуногенных пептидов Т-клетки, размноженные от каждого HD, совместно культивировали в течение 6 часов в присутствии АПК, нагруженных пептидами, идентифицированными после деконволюции сетки картирования, и по меньшей мере одним нерелевантным пептидом в качестве отрицательного контроля. Кроме того, отрицательный (нестимулированные Т-клетки) и положительный (Т-клетки, культивируемые в присутствии ФМА и иономицина) контроли включали в условия эксперимента (не показаны). На точечных диаграммах для каждого HD показаны результаты внутриклеточного окрашивания на IFNy и/или поверхностный CD107а. Обогащение CD107а и/или IFNy-положительными клетками, соответственно, наблюдали для Т-клеток, совместно культивированных с пептидами 40 и 41, у HD1 (а), но не с пептидами 42 и 43 (нерелевантные пептиды); пептидами 54, 77, 90 у HD2 (b), но не с пептидами 42 и 138 (нерелевантные пептиды); пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, который является нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 117 (обозначен как 11-мер на фиг. 3с)) у HD3 (с) и низкий ответ с пептидами PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL, который является другим нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 117), и LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 159, LDF, который является нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 116, ранее описанного как иммуногенный пептид (Doubrovina, E. et al. (2012) Blood 120: 1633-1646)); пептидами 17, 18, 99, 100 у HD4 (d, e), а не для нерелевантных пептидов (15, 16, 63-66, 101, 102 и 132); пептид 101 для HD5 (f), но не с нерелевантными пептидами (63, 107, 108, 113, 119 и 120); пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, который является нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 117 (обозначанного как 11-мер на фиг. 3с)) у HD6 (g) и пептидом PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL, который является другим неамером пептида, представленного SEQ ID NO: 117), но не с пептидом LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 159, LDF, который является нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 116, ранее описанного как иммуногенный пептид (Doubrovina, E. et al. (2012) Blood 120: 1633-1646)); пептидами 101, 125, 137 у HD9 (h); пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, который является нонамером пептида, представленного SEQ ID NO: 117 (обозначенного как 11-мер на фиг. 3с)) у HD10 (i), но не с нерелевантным пептидом. У HD7 и HD8 из-за недостаточного соответствия Т-клеток было невозможно выполнить функциональные тесты для проверки пептида, предсказанного при деконволюции сетки картирования, т.е. пептидов 40, 41, 91, 92 у HD7 и пептида 24 у HD8.To screen for WT1 immunogenic peptides, T cells expanded from each HD were cocultured for 6 h in the presence of APCs loaded with peptides identified after deconvolution of the mapping grid and at least one irrelevant peptide as a negative control. In addition, negative (unstimulated T cells) and positive (T cells cultured in the presence of PMA and ionomycin) controls were included in the experimental conditions (not shown). Dot plots for each HD show the results of intracellular staining for IFNy and/or surface CD107a. Enrichment of CD107a and/or IFNy-positive cells, respectively, was observed for T cells cocultured with peptides 40 and 41 in HD1(a), but not with peptides 42 and 43 (irrelevant peptides); with peptides 54, 77, 90 in HD2 (b), but not with peptides 42 and 138 (irrelevant peptides); peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, which is a nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 117 (designated as 11-mer in Fig. 3c)) in HD3 (c) and a low response with peptides PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL, which is another nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 117), and LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 159, LDF, which is a nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 116, previously described as an immunogenic peptide (Doubrovina, E et al (2012) Blood 120: 1633-1646)); by peptides 17, 18, 99, 100 in HD4 (d, e), and not for irrelevant peptides (15, 16, 63-66, 101, 102 and 132); peptide 101 for HD5 (f), but not with irrelevant peptides (63, 107, 108, 113, 119 and 120); the peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, which is the nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 117 (referred to as the 11-mer in Fig. 3c)) in HD6 (g) and the peptide PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL , which is another nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 117), but not with the peptide LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 159, LDF, which is a nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 116, previously described as an immunogenic peptide (Doubrovina, E et al (2012) Blood 120: 1633-1646)); peptides 101, 125, 137 in HD9 (h); peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, VLD, which is a nonamer of the peptide represented by SEQ ID NO: 117 (designated as 11-mer in Fig. 3c)) in HD10 (i), but not with an irrelevant peptide. In HD7 and HD8, due to insufficient T cell matching, it was not possible to perform functional tests to validate the peptide predicted by deconvolution of the mapping grid, i.e. peptides 40, 41, 91, 92 in HD7 and peptide 24 in HD8.
Для определения HLA-рестрикции эпитопов WT1, идентифицированных для HD4, HD5 и HD10 Тклеток, ДНК доноров секвенировали для определения HLA-типирования. После этого WT1специфичные Т-клетки совместно культивировали с различными антигенпрезентирующими клеточными линиями EBV-BLCL, каждая из которых несет специфический HLA аллель, представляющий интерес, который идентифицировали путем секвенирования ДНК HD4, HD5 или HD10. Клетки EBV-BLCL сенсибилизировали пептидом 17 для HD4, пептидом 101 для HD5 и пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) или нерелевантным контрольным пептидом. После совместного культивирования в течение 6 часов наблюдали значимый ответ на WT1 WT1-специфичных Т-клеток, которые совместно культивировали с клетками EBV-BLCL, экспрессирующими аллель HLA-B*3502 и сенсибилизированными пептидом 17 для HD4 (j), клетками EBV-BLCL, экспрессирующими аллель HLA-B*3501 и сенсибилизированными пептидом 101 для HD5 (k), и клетками EBV-BLCL, экспрессирующими аллель HLA-A*0201 и сенсибилизированными пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) для HD10 (l). (m) Таблица, в которой показаны пептиды, распознаваемые размноженными Т-клетками от HD1-HD10. Для HD3, HD6 и HD10 показаны специфические нонамерные перекрывающиеся пептиды 40 и 41, вызывающие иммунный ответ. WT1,To determine the HLA restriction of WT1 epitopes identified for HD4, HD5 and HD10 T cells, donor DNA was sequenced to determine HLA typing. WT1-specific T cells were then co-cultured with different antigen-presenting EBV-BLCL cell lines, each carrying a specific HLA allele of interest, which was identified by DNA sequencing of HD4, HD5 or HD10. EBV-BLCL cells were sensitized with HD4 peptide 17, HD5 peptide 101, and VLDFAPPGA peptide (SEQ ID NO: 157) or an irrelevant control peptide. After co-culture for 6 hours, a significant response to WT1 was observed in WT1-specific T cells that were co-cultured with EBV-BLCL cells expressing the HLA-B*3502 allele and sensitized with HD4 peptide 17 (j), EBV-BLCL cells, expressing the HLA-B*3501 allele and sensitized with peptide 101 for HD5 (k), and EBV-BLCL cells expressing the HLA-A*0201 allele and sensitized with the VLDFAPPGA peptide (SEQ ID NO: 157) for HD10 (l). (m) Table showing peptides recognized by expanded T cells from HD1-HD10. For HD3, HD6 and HD10, specific nonamer overlapping peptides 40 and 41 are shown to induce an immune response. WT1,
- 28 045443 белок опухоли Вильмса 1; АПК, антигенпрезентирующие клетки; ФМА, 2, форбол-12-миристат-13ацетат; IFNy, интерферон-γ; S, стимуляция.- 28 045443 Wilms tumor protein 1; APCs, antigen presenting cells; PMA, 2, phorbol-12-myristate-13acetate; IFNy, interferon-γ; S, stimulation.
Фиг. 4. Графики и диаграммы, на которых показано, что размноженные Т-клетки HD1, HD3 и HD4 распознают природно процессированный эпитоп WT1 (a) График, на котором показана экспрессия CD107 CD8+ Т-клетками, размноженными от HD1 после совместного культивирования с клетками Т2, сенсибилизированными пулом WT1, клетками K562, генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 и оверэкспрессии белка WT1, или клетками Т2, сенсибилизированными неспецифичным контрольным пулом MelanA/MART1 в качестве отрицательного контроля.Fig. 4. Graphs and diagrams showing that expanded HD1, HD3 and HD4 T cells recognize the naturally processed WT1 epitope (a) Graph showing CD107 expression by CD8+ T cells expanded from HD1 after co-culture with T2 cells, sensitized with the WT1 pool, K562 cells genetically modified to express the HLA-A*0201 allele and overexpress WT1 protein, or T2 cells sensitized with a nonspecific MelanA/MART1 control pool as a negative control.
(b) График, на котором показаны результаты экспериментов по определению способности HD3 размножившихся Т-клеток направленно взаимодействовать с WT1-экспрессирующими клетками. Результаты представлены как индекс элиминации, который вычисляли как общее количество клеток-мишеней, оставшихся в культуре после совместно культивирования с WT1-специфичными Т-клетками, деленное на общее количество клеток-мишеней в отдельности. Т-клетки HD3 совместно культивировали с клетками Т2, сенсибилизированными субпулом 16 (SP16), содержащим иммуногенный пептид, вызывающий иммунный ответ; клетками Т2, сенсибилизированными пулом MelanA/MART1 (Melan А) в качестве отрицательного контроля; клетками K562 дикого типа (K562) или генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 и оверэкспрессии белка WT1 (K562 A2+WT1+).(b) Graph showing the results of experiments to determine the ability of HD3 expanded T cells to target WT1-expressing cells. Results are presented as the elimination index, which was calculated as the total number of target cells remaining in culture after coculture with WT1-specific T cells divided by the total number of target cells individually. HD3 T cells were cocultured with T2 cells sensitized with subpool 16 (SP16), which contains an immunogenic peptide that induces an immune response; T2 cells sensitized with the MelanA/MART1 pool (Melan A) as a negative control; wild-type K562 cells (K562) or genetically modified to express the HLA-A*0201 allele and overexpress the WT1 protein (K562 A2+WT1+).
(с) Диаграммы, на которых представлены результаты экспериментов по определению способности WT1-специфичных Т-клеток от HD4 элиминировать клетки-мишени. Т-клетки HD4 совместно культивировали с первичными CD33+ бластами, полученными от HLA-B*3502 пациента в соотношении 10:1, или, в качестве контроля, с лейкозными клетками пациента, не несущего аллель HLA-B*3502. После 3 дней сокультивирования результаты показывают почти полное устранение CD33+ HLA-B*35O2 бластов при посеве с WT1-специфичными Т-клетками (CD3+ клетками). Е, эффектор; Т, мишень.(c) Diagrams showing the results of experiments to determine the ability of WT1-specific T cells from HD4 to eliminate target cells. HD4 T cells were cocultured with primary CD33+ blasts derived from the patient's HLA-B*3502 at a ratio of 10:1 or, as a control, with leukemia cells from a patient not carrying the HLA-B*3502 allele. After 3 days of coculture, results show almost complete elimination of CD33+ HLA-B*35O2 blasts when plated with WT1-specific T cells (CD3+ cells). E, effector; T, target.
Фиг. 5. График, на котором показаны результаты Ve профилирования WT1-специфичных Т-клеток WT1-специфичные Т-клетки, полученные от разных HD после нескольких стимуляций пулом WT1, окрашивали с помощью набора для Ve иммунопрофилирования, для определения клональности популяции. В частности, экспрессию генов вариабельных доменов (V) β-цепи определяли с помощью FACS анализа. Результаты указывают на экспрессию высокодоминантного гена Ve у HD1 (TRBV12-3; 12-4), HD2 (TRBV11-2), HD3 (TRBV4-3), HD5 (TRBV20-1), тогда как у HD4, HD6, HD10 четкого обогащения определенными Ve не было обнаружено. SP14 HD4 указывает на Т-клетки, стимулированные субпулом 14, который содержит пептиды 17-18, вызывающие наиболее сильный иммунный ответ; SP18+21 HD4 указывает на Т-клетки, стимулированные субпулами 18 и 21, которые содержат пептиды 63-64-65-66 и 99-100-101-102, соответственно, вызывающие минимальный иммунный ответ, как показано на фиг. 3. Для HD7, HD8 и HD9 не удалось выполнить анализ Ve иммунопрофилирования из-за недостаточного качества клеток.Fig. 5. Graph showing the results of Ve profiling of WT1-specific T cells. WT1-specific T cells obtained from different HDs after multiple stimulations with the WT1 pool were stained using a Ve immunoprofiling kit to determine the clonality of the population. In particular, the expression of β-chain variable domain (V) genes was determined using FACS analysis. The results indicate the expression of highly dominant Ve gene in HD1 (TRBV12-3; 12-4), HD2 (TRBV11-2), HD3 (TRBV4-3), HD5 (TRBV20-1), while in HD4, HD6, HD10 there is clear enrichment no specific Ve was detected. SP14 HD4 indicates T cells stimulated by subpool 14, which contains peptides 17-18 that elicit the most potent immune response; SP18+21 HD4 indicates T cells stimulated by subpools 18 and 21, which contain peptides 63-64-65-66 and 99-100-101-102, respectively, eliciting a minimal immune response, as shown in FIG. 3. Ve immunoprofiling could not be performed for HD7, HD8 and HD9 due to insufficient cell quality.
Фиг. 6. Графики, на которых показаны результаты секвенирования TCR обогащенных WT1специфичных Т-клеток в зависимости от времени Т-клетки, полученные от каждого здорового донора, включенного в условия эксперимента, исследовали путем секвенирования αβ TCR после нескольких стимуляций пулом WT1. Результаты секвенирования показали присутствие преобладающих клонотипов для HD1 (a), HD2 (b) и HD3 (с), HD4 (d), HD5 (е), HD6 (f), HD7 (g), HD8 (h), HD9 (i), HD10 (j). На гистограммах показаны десять преобладающих аминокислотных последовательностей CDR3, идентифицированных в каждой точке времени (например, S9 соответствует результатам секвенирования, полученным после 9-го раунда стимуляции). Для каждого столбца, от оси X, нижний сегмент представляет наиболее преобладающую CDR-последовательность. Следующие девять наиболее преобладающих последовательностей расположены над нижним сегментом и упорядочены по уменьшению частоты снизу вверх. Остальные последовательности сгруппированы в верхнем сегменте. WT1, белок опухоли Вильмса 1; CDR3, определяющая комплементарность область 3; S, стимуляция.Fig. 6. Graphs showing TCR sequencing results of enriched WT1-specific T cells over time. T cells obtained from each healthy donor included in the experimental conditions were examined by sequencing the αβ TCR after several stimulations with the WT1 pool. Sequencing results showed the presence of predominant clonotypes for HD1 (a), HD2 (b) and HD3 (c), HD4 (d), HD5 (e), HD6 (f), HD7 (g), HD8 (h), HD9 (i ), HD10 (j). The histograms show the ten predominant CDR3 amino acid sequences identified at each time point (e.g., S9 corresponds to sequencing results obtained after the 9th round of stimulation). For each bar, from the x-axis, the bottom segment represents the most dominant CDR sequence. The next nine most dominant sequences are located above the bottom segment and are ordered by decreasing frequency from bottom to top. The remaining sequences are grouped in the upper segment. WT1, Wilms tumor protein 1; CDR3, complementarity determining region 3; S, stimulation.
Фиг. 7. Функциональная активность генетически модифицированных Т-лимфоцитов.Fig. 7. Functional activity of genetically modified T-lymphocytes.
Т-клетки, выделенные из МКПК здоровых лиц, трансдуцировали двунаправленным лентивирусным вектором, кодирующим α и β-цепь TCR-рецепторов, выделенных у HD1 и HD3. В качестве контроля трансдуцировали Т-клетки с ранее опубликованным TCR, распознающим пептид 126-134 WT1 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255), презентированный аллелем HLA-A*0201. Т-лимфоциты для переноса (TR) совместно культивировали в течение 3 дней с (а) клетками Т2, сенсибилизированными или не сенсибилизированными пептидом WT1 126-134 или пептидом VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) (соотношение эффектор:мишень=1:1); (b) клетками K562 дикого типа (K562) или генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 (соотношение эффектор:мишень=1:1); (с) 3 различными первичными ОМЛ бластами, отобранными по экспрессии аллеля HLA-A*0201 и антигена WT1 (соотношение эффектор:мишень=5:1). В качестве контроля для совместного культивирования с линиями клеток Т2 и K562 включали нетрансдуцированные Т-клетки. Результаты продемонстрировали способность каждого TCR распознавать пептид-мишень, презентированный аллелем HLA-A*0201 (фиг. 7а) и более высокийT cells isolated from PBMCs from healthy individuals were transduced with a bidirectional lentiviral vector encoding the α and β chain of TCR receptors isolated from HD1 and HD3. As a control, T cells were transduced with a previously published TCR recognizing WT1 peptide 126-134 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255) presented by the HLA-A*0201 allele. Transfer T lymphocytes (TR) were co-cultured for 3 days with (a) T2 cells sensitized or not with WT1 126-134 peptide or VLDFAPPGA peptide (SEQ ID NO: 157) (effector:target ratio=1:1) ; (b) wild-type K562 cells (K562) or genetically modified to express the HLA-A*0201 allele (effector:target ratio=1:1); (c) 3 different primary AML blasts selected for expression of the HLA-A*0201 allele and WT1 antigen (effector:target ratio=5:1). Untransduced T cells were included as controls for coculture with T2 and K562 cell lines. The results demonstrated the ability of each TCR to recognize the target peptide presented by the HLA-A*0201 allele (Fig. 7a) and higher
- 29 045443 потенциал HD1 TCR-трансдуцированных Т-клеток в опосредовании специфичной и почти полной элиминации клеток K562, несущих аллель HLA*A0201 по сравнению с HD3-TR Т-клетками. Следует отметить, что не наблюдали никакого значимого киллинга клеток-мишеней при совместном культивировании клеток K562 HLA*A0201 с WT1 126-134 TR Т-клетками (фиг. 7b). Эти результаты также подтверждались данными, полученными в эксперименте по совместному культивированию, который проводили при использовании в качестве клеток-мишеней первичных ОМЛ бластов, полученных от 3 различных пациентов с ОМЛ (бласты pAML1: WT1-/HLA-A*0201+; бласты pAML2 и pAML3: WT1+/HLA-A*0201+). В этом эксперименте каждую отдельную популяцию Т-клеток сортировали с определенными декстрамерами перед совместным культивированием с мишенями с целью обогащения чистоты эффекторных клеток. Наблюдали более сильную элиминацию обоих pAML бластов, несущих аллель HLA-A*0201, при совместном культивировании с HD1 TR T-клетками, тогда как HD3 Т и WT1 126-134 Т-клетки распознавали только бласты pAML3. UT, нетрансдуцированный, pAML, первичный острый миелоидный лейкоз; TR, перенос; Dx, декстрамер.- 29 045443 the potential of HD1 TCR-transduced T cells to mediate the specific and almost complete elimination of K562 cells carrying the HLA*A0201 allele compared to HD3-TR T cells. It should be noted that no significant killing of target cells was observed when K562 HLA*A0201 cells were co-cultured with WT1 126-134 TR T cells (Fig. 7b). These results were also confirmed by data obtained in a co-culture experiment using primary AML blasts obtained from 3 different AML patients as target cells (pAML1 blasts: WT1-/HLA-A*0201+; pAML2 blasts and pAML3: WT1+/HLA-A*0201+). In this experiment, each individual T cell population was sorted with specific dextramers before coculture with targets to enrich the purity of effector cells. A stronger elimination of both pAML blasts carrying the HLA-A*0201 allele was observed when co-cultured with HD1 TR T cells, whereas HD3 T and WT1 126-134 T cells recognized only pAML3 blasts. UT, untransduced, pAML, primary acute myeloid leukemia; TR, transfer; Dx, dextramer.
Подробное описаниеDetailed description
Термины включающий, включает и включает в себя при использовании в настоящем документе синонимичны терминам содержащий или содержит и являются включительными или открытым и не исключают дополнительные, неуказанные элементы или этапы. Термины включающий, включает и включает в себя также включают термин состоящий из.The terms including, includes, and includes, as used herein, are synonymous with the terms containing or contains and are inclusive or open-ended and do not exclude additional, unspecified elements or steps. The terms including, includes and includes also include the term consisting of.
Т-клеточный рецептор.T cell receptor.
В ходе процессинга антигенов антигены расщепляются в клетках и затем переносятся на поверхность клеток молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Т-клетки способны распознавать такой комплекс петида:МНС на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Существует два разных класса молекул МНС: МНС I и МНС II, каждый класс доставляет пептиды из различных клеточных компартментов на поверхность клеток.During antigen processing, antigens are broken down in cells and then transferred to the cell surface by major histocompatibility complex (MHC) molecules. T cells are able to recognize such a peptide:MHC complex on the surface of an antigen-presenting cell. There are two different classes of MHC molecules: MHC I and MHC II, each class delivers peptides from different cellular compartments to the cell surface.
Т-клеточный рецептор (TCR) представляет собой молекулу, которая может быть обнаружена на поверхности Т-клеток и отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами МНС. Природный гетеродимер TCR состоит из альфа (α) и бета (β) цепи приблизительно у 95% Т-клеток, тогда как приблизительно 5% Т-клеток имеют TCR-рецепторы, состоящие из гамма (γ) и дельта (δ) цепи.The T cell receptor (TCR) is a molecule that can be found on the surface of T cells and is responsible for recognizing antigens bound to MHC molecules. The natural TCR heterodimer consists of an alpha (α) and beta (β) chain in approximately 95% of T cells, whereas approximately 5% of T cells have TCR receptors consisting of a gamma (γ) and delta (δ) chain.
Связывание TCR с антигеном и МНС приводит к активации Т-лимфоцита, на котором экспрессирован TCR, посредством последовательности биохимических событий, опосредуемых соответствующими ферментами, корецепторами и специализированными вспомогательными молекулами.Binding of the TCR to antigen and MHC results in activation of the T lymphocyte on which the TCR is expressed through a sequence of biochemical events mediated by appropriate enzymes, coreceptors, and specialized accessory molecules.
Каждая цепь природного TCR является членом супер семейства иммуноглобулинов и обладает одним N-концевым иммуноглобулиновым (Ig)-варибельным (V) доменом, одним Ig-константным (С) доменом, трансмембранной/проходящей через клеточную мембрану областью и коротким цитоплазматическим хвостом на С-конце.Each natural TCR chain is a member of the immunoglobulin superfamily and possesses one N-terminal immunoglobulin (Ig) variable (V) domain, one Ig constant (C) domain, a transmembrane/cell membrane spanning region, and a short cytoplasmic tail at the C terminus. .
Варибельный домен и α-цепи и β-цепи TCR содержит три гиперварибельных или определяющих комплементарность области (CDRs). α-Цепь или β-цепь TCR, например, включает CDR1, CDR2 и CDR3 в порядке от N-конца к С-концу. Как правило, CDR3 является главной CDR, которая отвечает за распознавание процессированного антигена, хотя CDR1 альфа-цепи, как было также показано, взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, тогда как CDR1 бета-цепи взаимодействует с С-концевой частью пептида. Предполагают, что CDR2 распознает молекулу МНС.The variable domain of both the α and β chains of the TCR contains three hypervariable or complementarity determining regions (CDRs). The TCR α-chain or β-chain, for example, includes CDR1, CDR2 and CDR3 in order from N-terminus to C-terminus. Typically, CDR3 is the major CDR that is responsible for recognition of processed antigen, although the alpha chain CDR1 has also been shown to interact with the N-terminal portion of the antigenic peptide, whereas the beta chain CDR1 interacts with the C-terminal portion of the peptide. It is assumed that CDR2 recognizes the MHC molecule.
Константный домен TCR может состоять из коротких соединительных последовательностей, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, соединяя две цепи.The TCR constant domain may consist of short connecting sequences in which a cysteine residue forms a disulfide bond, connecting the two chains.
α-Цепь TCR настоящего изобретения может иметь константный домен, кодируемый геном TRAC. Примерная аминокислотная последовательность константного домена α-цепи, кодируемая геном TRAC, показана ниже:The TCR α-chain of the present invention may have a constant domain encoded by the TRAC gene. An approximate amino acid sequence of the α chain constant domain encoded by the TRAC gene is shown below:
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLS VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO: 128)IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLS VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO: 128)
TCR настоящего изобретения может включать α-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ней, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ней.The TCR of the present invention may include an α chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 or a variant thereof having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% sequence identity with it, preferably at least 75% sequence identity with it.
β-Цепь TCR настоящего изобретения может иметь константный домен, кодируемый геном TRBC1 или TRBC2. Примерная аминокислотная последовательность константного домена β-цепи, кодируемая геном TRBC1, показана ниже:The TCR β-chain of the present invention may have a constant domain encoded by the TRBC1 or TRBC2 gene. An approximate amino acid sequence of the β chain constant domain encoded by the TRBC1 gene is shown below:
DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSG VSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDR AKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSG VSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDR AKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAM
- 30 045443- 30 045443
VKRKDF (SEQ ID NO: 129)VKRKDF (SEQ ID NO: 129)
Примерная аминокислотная последовательность константного домена β-цепи, кодируемая геном TRBC2, показана ниже:An approximate amino acid sequence of the β chain constant domain encoded by the TRBC2 gene is shown below:
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSG
VSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDR AKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAM VKRKDSRG (SEQ ID NO: 130)VSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDR AKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAM VKRKDSRG (SEQ ID NO: 130)
TCR настоящего изобретения может включать β-цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 или варианты SEQ ID NO: 129 и 130, обладающие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними, предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ними.The TCR of the present invention may include a β chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, or variants of SEQ ID NO: 129 and 130, having at least 75%, at least 80%, at least 85 %, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% sequence identity with them, preferably at least 75% sequence identity with them with them.
TCR настоящего изобретения может иметь один или более дополнительных остатков цистеина в каждой из α и β-цепей, в результате чего TCR может включать две или более дисульфидных связи в константных доменах.The TCR of the present invention may have one or more additional cysteine residues in each of the α and β chains, whereby the TCR may include two or more disulfide bonds in the constant domains.
Структура позволяет TCR связываться с другими молекулами, такими как CD3, которые обладают тремя разными цепями (γ, δ и ε) у млекопитающих и ζ-цепью. Эти вспомогательные молекулы имеют отрицательно заряженные трансмембранные области и жизненно важны для передачи сигнала от TCR в клетку. CD3- и ζ-цепи вместе с TCR, образуют комплекс, известный как комплекс Т-клеточного рецептора.The structure allows the TCR to bind to other molecules such as CD3, which have three different chains (γ, δ and ε) in mammals and a ζ chain. These accessory molecules have negatively charged transmembrane regions and are vital for transmitting the signal from the TCR into the cell. The CD3 and ζ chains, together with the TCR, form a complex known as the T-cell receptor complex.
Сигнал от Т-клеточного комплекса усиливается при одновременном связывании молекул МНС специфичным корецептором. У Т-хелперов этим корецептором является CD4 (специфический для МНС класса II); тогда как у цитотоксических Т-клеток этим корецептором является CD8 (специфический для МНС класса I). Корецептор обеспечивает более длительное связывание между антигенпрезентирующей клеткой и Т-клеткой и рекрутирует необходимые молекулы (например, LCK) в клетке, участвующие в передаче сигналов активированного Т-лимфоцита.The signal from the T-cell complex is enhanced by the simultaneous binding of MHC molecules by a specific coreceptor. In T helper cells, this coreceptor is CD4 (MHC class II specific); whereas in cytotoxic T cells this coreceptor is CD8 (MHC class I specific). The coreceptor mediates longer-lasting binding between the antigen-presenting cell and the T cell and recruits essential molecules (eg, LCK) to the cell involved in activated T cell signaling.
Таким образом, при использовании в настоящем документе термин Т-клеточный рецептор (TCR) относится к молекуле, способной к распознаванию пептида, презентированного молекулой МНС. Молекула может быть гетеродимером из двух α и β-цепей (или, необязательно, γ и δ), или она может быть одноцепочечной TCR конструкцией. TCR настоящего изобретения может быть растворимым TCR, например, не содержащим или содержащим измененные один или более константных доменов. TCR настоящего изобретения может включать константный домен.Thus, as used herein, the term T cell receptor (TCR) refers to a molecule capable of recognizing a peptide presented by an MHC molecule. The molecule may be a heterodimer of two α and β chains (or optionally γ and δ), or it may be a single chain TCR construct. The TCR of the present invention may be a soluble TCR, for example, one that does not contain or contains altered one or more constant domains. The TCR of the present invention may include a constant domain.
В настоящем изобретении также предложена α-цепь или β-цепь из такого Т-клеточного рецептора.The present invention also provides an α chain or a β chain from such a T cell receptor.
TCR настоящего изобретения может быть гибридным TCR, включающим последовательности, полученные больше чем из одного биологического вида. Например, было неожиданно обнаружено, что мышиные TCR-рецепторы более эффективно экспрессируются в человеческих Т-клетках, чем человеческие TCR-рецепторы. Таким образом, TCR может включать человеческую вариабельную область и мышиные последовательности в константной области.The TCR of the present invention may be a hybrid TCR including sequences derived from more than one species. For example, it was unexpectedly found that mouse TCR receptors are more efficiently expressed in human T cells than human TCR receptors. Thus, the TCR may include a human variable region and murine constant region sequences.
Недостаток этого подхода заключается в том, что мышиные константные последовательности могут вызывать иммунный ответ, который приводит к отторжению Т-клеток после их переноса. Однако схемы кондиционирования, используемые для подготовки пациентов к адоптивной Т-клеточной терапии, могут приводить к достаточной иммуносупрессии, что дает возможность приживления Т-клеток, экспрессирующих мышиные последовательности.A disadvantage of this approach is that murine constant sequences can cause an immune response that leads to T cell rejection after transfer. However, conditioning regimens used to prepare patients for adoptive T-cell therapy may result in sufficient immunosuppression to allow engraftment of T cells expressing murine sequences.
Определяющие комплементарность (CDR) области.Complementarity determining regions (CDRs).
Фрагмент TCR, который формирует большую часть контактов с антигенным пептидом, связанным с главным комплексом гистосовместимости (МНС), является определяющей комплементарность областью 3 (CDR3), которая уникальна для каждого Т-клеточного клона. Область CDR3 образуется в ходе событий соматической перестройки, происходящих в тимусе, в которых участвуют несмежные гены, принадлежащие к вариабельным (V), формирующим разнообразие (D, для β и δ цепей) и соединительным (J) генам. Кроме того, случайные нуклеотиды, вставленные/удаленные в перестраиваемых локусах гена каждой цепи TCR, значительно увеличивают разнообразие высоковариабельной последовательности CDR3. Таким образом, частота специфической последовательности CDR3 в биологическом образце указывает на представленность определенной популяции Т-клеток. Большое разнообразие репертуара TCR у здоровых людей обеспечивает защиту широкого спектра против различных чужеродных антигенов, презентируемых молекулами МНС на поверхности антигенпрезентирующих клеток. В этом отношении следует отметить, что теоретически в тимусе может образовываться до 1015 различных TCR-рецепторов.The fragment of the TCR that makes the majority of contacts with the major histocompatibility complex (MHC)-bound antigenic peptide is complementarity determining region 3 (CDR3), which is unique to each T cell lineage. The CDR3 region is generated by somatic remodeling events occurring in the thymus that involve noncontiguous genes belonging to the variable (V), diversity-forming (D, for β and δ chains), and junction (J) genes. In addition, random nucleotides inserted/deleted at the rearranged gene loci of each TCR chain significantly increase the diversity of the highly variable CDR3 sequence. Thus, the frequency of a specific CDR3 sequence in a biological sample indicates the representation of a specific T cell population. The wide diversity of the TCR repertoire in healthy individuals provides broad-spectrum protection against a variety of foreign antigens presented by MHC molecules on the surface of antigen-presenting cells. In this regard, it should be noted that theoretically, up to 10 15 different TCR receptors can be formed in the thymus.
Разнообразие Т-клеточных рецепторов основано на CDR3, и эта область главным образом ответственна за распознавание антигена.A variety of T cell receptors are based on CDR3, and this region is primarily responsible for antigen recognition.
Последовательности CDR3 областей TCR настоящего изобретения могут быть выбраны из последо- 31 045443 вательностей, приведенных в табл. 1 ниже. TCR может включать CDR-области, которые включают или состоят из пары CDR3a и CDR3e, описанной ниже.The CDR3 sequences of the TCR regions of the present invention may be selected from the sequences shown in Table 1. 1 below. The TCR may include CDR regions that include or consist of the pair CDR3a and CDR3e, described below.
CDR-области могут, например, включать одну, две или три замены, вставки или делеции в данной последовательности, при условии, что TCR сохраняет возможность связывать пептид WT1, презентированный молекулой МНС.CDR regions may, for example, include one, two or three substitutions, insertions or deletions in a given sequence, provided that the TCR retains the ability to bind the WT1 peptide presented by the MHC molecule.
При использовании в настоящем документе термин белок включает одноцепочечные полипептидные молекулы, а также комплексы из множества полипептидов, где отдельные полипептиды, входящие в их состав, связаны ковалентными или нековалентными способами. При использовании в настоящем документе термин полипептид относится к полимеру, в котором мономерами являются аминокислоты, соединенные дисульфидными или пептидными связями.As used herein, the term protein includes single-chain polypeptide molecules as well as complexes of multiple polypeptides where the individual polypeptides comprising them are linked by covalent or non-covalent means. As used herein, the term polypeptide refers to a polymer in which the monomers are amino acids linked by disulfide or peptide bonds.
Варианты, производные, аналоги, гомологи и фрагменты.Variants, derivatives, analogs, homologues and fragments.
В дополнение к конкретным белкам и полинуклеотидам, указанным в настоящем документе, настоящее изобретение также охватывает применение их вариантов, производных, аналогов, гомологов и фрагментов.In addition to the specific proteins and polynucleotides specified herein, the present invention also covers the use of variants, derivatives, analogues, homologues and fragments thereof.
В рамках настоящего изобретения вариант любой последовательности является последовательностью, в которой определенная последовательность остатков (аминокислотных остатков или остатков нуклеиновых кислот) была изменена таким образом, что рассматриваемый полипептид или полинуклеотид по существу сохраняет по меньшей мере одну из своих эндогенных функций. Вариантная последовательность может быть получена в результате вставки, делеции, замены, модификации и/или изменения по меньшей мере одного остатка, присутствующего в природном белке.For purposes of the present invention, any sequence variant is a sequence in which a particular sequence of residues (amino acid residues or nucleic acid residues) has been altered such that the polypeptide or polynucleotide in question substantially retains at least one of its endogenous functions. The variant sequence can be obtained by insertion, deletion, substitution, modification and/or change of at least one residue present in the naturally occurring protein.
Вариантная аминокислотная последовательность настоящего изобретения, указанная как имеющая до трех аминокислотных замен, вставок или делеции, может иметь, например, одну, две или три аминокислотных замены, вставки или делеции.A variant amino acid sequence of the present invention specified as having up to three amino acid substitutions, insertions or deletions may have, for example, one, two or three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Термин производное при использовании в настоящем документе в отношении белков или полипептидов настоящего изобретения включает любую замену, изменение, модификацию, делецию и/или добавление одного (или более) аминокислотного остатка в или из последовательности при условии, что получаемый в результате белок или полипептид по существу сохраняет по меньшей мере одну из своих эндогенных функций.The term derivative as used herein in relation to proteins or polypeptides of the present invention includes any substitution, alteration, modification, deletion and/or addition of one (or more) amino acid residue to or from a sequence, provided that the resulting protein or polypeptide is substantially retains at least one of its endogenous functions.
Термин аналог при использовании в настоящем документе в отношении полипептидов или полинуклеотидов включает любой миметик, то есть химическое соединение, которое обладает по меньшей мере одной из эндогенных функций полипептидов или полинуклеотидов, аналогом которых он является.The term analogue as used herein in relation to polypeptides or polynucleotides includes any mimetic, that is, a chemical compound that possesses at least one of the endogenous functions of the polypeptides or polynucleotides of which it is an analogue.
Белки, используемые в настоящем изобретении, также могут иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащее изменение и приводят к функционально эквивалентному белку. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе подобия полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков при условии сохранения эндогенной функции. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющими подобные значения гидрофильности, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.Proteins used in the present invention may also have deletions, insertions or substitutions of amino acid residues that cause a silent change and result in a functionally equivalent protein. Deliberate amino acid substitutions can be made based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues while preserving endogenous function. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar terminal groups having similar hydrophilicity values include asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine.
Замена может включать замену аминокислоты подобной аминокислотой (консервативную замену). Подобная аминокислота является аминокислотой, которая имеет боковую цепь со сходными свойствами, которые можно объединить в группы, например, как показано ниже:The substitution may involve replacing an amino acid with a similar amino acid (conservative substitution). A similar amino acid is an amino acid that has a side chain with similar properties that can be grouped together, for example as shown below:
(i) основные боковые цепи: лизин (K), аргинин (R), гистидин (Н);(i) main side chains: lysine (K), arginine (R), histidine (H);
(ii) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е);(ii) acidic side chains: aspartic acid (D) and glutamic acid (E);
(iii) незаряженные полярные боковые цепи: аспарагин (N), глутамин (Q), серии (S), треонин (Т) и тирозин (Y); или (iv) неполярные боковые цепи: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F), метионин (М), триптофан (W) и цистеин (С).(iii) uncharged polar side chains: asparagine (N), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), and tyrosine (Y); or (iv) non-polar side chains: glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), phenylalanine (F), methionine (M), tryptophan ( W) and cysteine (C).
Любые изменения аминокислот должны сохранять возможность TCR связывать пептид WT1, презентированный молекулами МНС.Any amino acid changes must preserve the ability of the TCR to bind the WT1 peptide presented by MHC molecules.
Вариантные последовательности могут включать аминокислотные замены, дополнения, делеции и/или вставки. Вариация может быть сконцентрирована в одной или более областях, таких как константные области, линкер или каркасные области α или β-цепей, или они могут быть распределены по всей молекуле TCR.Variant sequences may include amino acid substitutions, additions, deletions and/or insertions. The variation may be concentrated in one or more regions, such as constant regions, linker or framework regions of the α or β chains, or they may be distributed throughout the TCR molecule.
Консервативные замены, дополнения или делеции могут быть сделаны, например, согласно приведенной ниже таблице. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной строке третьего столбца можно заменить друг другом:Conservative substitutions, additions or deletions can be made, for example, according to the table below. Amino acids in the same block in the second column and preferably in the same row in the third column can be replaced with each other:
- 32 045443- 32 045443
Настоящее изобретение также охватывает гомологичную замену (замена и замещение используются в настоящем документе для обозначения обмена существующего аминокислотного остатка на альтернативный остаток), например, равноценную замену, такую как основная на основную, кислотная на кислотную, полярная на полярную и т.д. Негомологичная замена также может присутствовать, например, остатка из одного класса другим или, альтернативно, включающая введение неприродных аминокислот, таких как орнитин.The present invention also covers homologous substitution (substitution and substitution are used herein to mean the exchange of an existing amino acid residue for an alternative residue), for example, equivalent substitution such as basic for basic, acid for acid, polar for polar, etc. Non-homologous substitution may also be present, for example from a residue from one class to another or, alternatively, involving the introduction of unnatural amino acids such as ornithine.
Термин вариантный при использовании в настоящем документе может означать единицу, обладающую некоторой гомологией с аминокислотной последовательностью дикого типа или нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин гомология может быть приравнен к идентичности.The term variant as used herein can mean a unit having some homology to a wild-type amino acid sequence or a wild-type nucleotide sequence. The term homology can be equated to identity.
Вариантная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% идентичной рассматриваемой последовательности. Как правило, варианты будут включать такие же активные сайты и т.д., как и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения подобия (т.е. аминокислотные остатки, обладающие подобными химическими свойствами/функциями), в рамках настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.The variant sequence may include an amino acid sequence that may be at least 50%, 55%, 65%, 75%, 85%, or 90% identical, preferably at least 95%, at least 97%, or at least at least 99% identical to the sequence in question. Typically, variants will include the same active sites, etc., as the amino acid sequence in question. Although homology can also be considered in terms of similarity (ie, amino acid residues having similar chemical properties/functions), within the scope of the present invention it is preferable to express homology in terms of sequence identity.
Вариантная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или на 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% идентичной рассматриваемой последовательности. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения подобия, в рамках настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.The variant sequence may include a nucleotide sequence that may be at least 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 75%, 85% or 90% identical, preferably at least 95%, at least at least 97% or at least 99% identical to the sequence in question. Although homology can also be considered in terms of similarity, within the scope of the present invention it is preferable to express homology in terms of sequence identity.
Предпочтительно, ссылка на последовательность, которая обладает некоторым процентном идентичности с любой из SEQ ID NO, подробно описанных в настоящем документе, относится к последовательности, которая обладает указанным процентом идентичности по всей протяженности указанной SEQ ID NO.Preferably, reference to a sequence that has a certain percentage identity with any of the SEQ ID NOs detailed herein refers to a sequence that has a specified percentage identity throughout the entire length of the specified SEQ ID NO.
Сравнения идентичности можно проводить визуально или, как обычно практикуют, при помощи доступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять процент гомологии или идентичности между двумя или более последовательностями.Identity comparisons can be made visually or, as is commonly practiced, using available sequence comparison programs. Such commercially available computer programs can calculate the percentage of homology or identity between two or more sequences.
Процент гомологии может быть вычислен для непрерывных последовательностей, т.е. одну последовательность выравнивают с другой последовательностью и каждую аминокислоту в одной последовательности непосредственно сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток в каждый отдельно взятый момент. Это называют несодержащим пропуски выравниванием. Как правило, такие выравнивания без пропусков выполняют только для относительно небольшого количества остатков.Percentage homology can be calculated for contiguous sequences, e.g. one sequence is aligned with another sequence and each amino acid in one sequence is directly compared with the corresponding amino acid in another sequence, one residue at a time. This is called gap-free alignment. Typically, such gapless alignments are performed only for a relatively small number of residues.
Хотя это очень простой и надежный метод, он не учитывает, например, что в другой идентичной паре последовательностей одна вставка или делеция в нуклеотидной последовательности может привести к тому, что следующие кодоны выпадут из выравнивания, что потенциально может привести к значительному снижению процента гомологии при глобальном выравнивании. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей предназначены для получения оптимальных выравниваний, учитывающих возможные вставки и делеции, без введения необоснованных штрафов в общий показатель гомологии. Это достигается путем вставки пропусков в выравнивание последовательностей для получения максимально высокой локальной гомологии.Although this is a very simple and reliable method, it does not take into account, for example, that in another identical sequence pair, a single insertion or deletion in the nucleotide sequence could cause subsequent codons to fall out of alignment, potentially leading to a significant reduction in the percentage of homology when globally alignment. Consequently, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that account for possible insertions and deletions, without introducing unreasonable penalties to the overall homology score. This is achieved by inserting gaps into the sequence alignment to obtain the highest possible local homology.
Однако эти более сложные методы назначают штрафы за пропуски для каждого пропуска, возникающего при выравнивании, в результате чего при одинаковом количестве идентичных аминокислот выравнивание последовательностей с как можно меньшим количеством пропусков, отражающее более высокое родство между двумя сравниваемыми последовательностями, будет получать более высокую оценку, чем выравнивание, в котором много пропусков. Обычно используются суммируемые штрафы за пропуск, которые накладывают относительно высокий штраф за присутствие пропуска и меньший штраф за каждый последующий остаток в пропуске. Это наиболее часто используемая система оценки пропусков. Высокие штрафы за пропуски, конечно, приведут к оптимизированным выравниваниям сHowever, these more complex methods assign gap penalties to each gap that occurs in the alignment, with the result that, given the same number of identical amino acids, a sequence alignment with as few gaps as possible, reflecting the higher relatedness between the two sequences being compared, will receive a higher score than an alignment that has a lot of gaps. Typically, cumulative omission penalties are used, which impose a relatively high penalty for the presence of the omission and a smaller penalty for each subsequent remainder in the omission. This is the most commonly used pass scoring system. High omission penalties will of course result in optimized alignments with
- 33 045443 меньшим количеством пропусков. Большинство программ выравнивания позволяют изменять штрафы за пропуски. Однако предпочтительно использовать значения по умолчанию при использовании таких программ для сравнения последовательностей. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit штраф за пропуск по умолчанию для аминокислотных последовательностей составляет -12 за пропуск и 4 за каждое продолжение пропуска.- 33 045443 with fewer passes. Most leveling programs allow you to change the penalties for omissions. However, it is preferable to use the default values when using such sequence comparison programs. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default omission penalty for amino acid sequences is -12 per omission and 4 per continuation omission.
Поэтому расчет максимального процента гомологии, во-первых, требует получения оптимального выравнивания с учетом штрафов за пропуски. Подходящей компьютерной программой для проведения такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры других программ, которые могут выполнять сравнение последовательностей, включают, без ограничения перечисленным, пакет BLAST (см. Ausubel et al. (1999), там же - Гл. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) и пакет инструментов сравнения GENEWORKS. BLAST и FASTA доступны для поиска в режиме офлайн и онлайн (см. Ausubel et al. (1999), там же, страницы с 7-58 по 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительно использовать программу GCG Bestfit. Другое средство, называемое BLAST 2 Sequence, также доступно для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).Therefore, calculating the maximum homology percentage firstly requires obtaining an optimal alignment, taking into account gap penalties. A suitable computer program for performing this alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Examples of other programs that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al. (1999), ibid. - Chapter 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) and the GENEWORKS comparison tools package. BLAST and FASTA are searchable offline and online (see Ausubel et al. (1999), ibid., pages 7-58 to 7-60). However, for some applications it is preferable to use the GCG Bestfit program. Another tool called BLAST 2 Sequence is also available for comparing protein and nucleotide sequences (see FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).
Хотя конечный процент гомологии может быть измерен в выражении идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основан на сравнении пар по принципу все или ничего. Вместо этого обычно используется масштабированная оценочная матрица подобия, которая присваивает баллы каждому парному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой широко используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для пакета программ BLAST. В программах GCG Wisconsin обычно используются либо общедоступные значения по умолчанию, либо специализированная таблица сравнения символов, если таковая имеется (см. руководство пользователя для получения дополнительной информации). Для некоторых приложений предпочтительно использовать общедоступные значения по умолчанию для пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.Although the final percentage of homology can be measured in terms of identity, the alignment process itself is not usually based on an all-or-nothing comparison of pairs. Instead, a scaled similarity scoring matrix is typically used, which assigns scores to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. An example of such a widely used matrix is the BLOSUM62 matrix, the default matrix for the BLAST software package. GCG Wisconsin programs typically use either public defaults or a custom character comparison table, if available (see the user manual for more information). For some applications it is preferable to use the public defaults for the GCG package or, in the case of other software, a default matrix such as BLOSUM62.
После получения программой оптимального выравнивания может быть вычислен процент гомологии, предпочтительно процент идентичности последовательности. Программа обычно выполняет это как часть сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.Once the optimal alignment is obtained by the program, the percentage of homology, preferably the percentage of sequence identity, can be calculated. The program typically does this as part of a sequence comparison and generates a numeric result.
Фрагменты также являются вариантами, при этом данный термин, как правило, относится к выбранной области полипептида или полинуклеотида, которая представляет интерес функционально или, например, в анализе. Фрагмент, таким образом, относится к аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, которая является частью полноразмерного полипептида или полинуклеотида.Fragments are also variants, the term generally referring to a selected region of a polypeptide or polynucleotide that is of functional or eg analytical interest. A fragment thus refers to an amino acid sequence or nucleic acid sequence that is part of a full-length polypeptide or polynucleotide.
Такие варианты могут быть получены при использовании стандартных технологий рекомбинантных ДНК, таких как сайт-направленный мутагенез. В случае, когда требуется сделать вставки, может быть получена синтетическая ДНК, кодирующая вставку вместе с 5' и 3' фланкирующими областями, соответствующими природной последовательности с любой стороны от участка вставки. Фланкирующие области содержат удобные сайты рестрикции, соответствующие сайтам в природной последовательности, чтобы последовательность можно было разрезать подходящим ферментом(ами) и лигировать синтетическую ДНК в разрез. Затем ДНК экспрессируется в соответствии с изобретением, с получением кодируемого белка. Эти способы являются лишь иллюстративными примерами многочисленных стандартных методик, известных в области манипуляции последовательностями ДНК, и также могут использоваться другие известные методики.Such variants can be generated using standard recombinant DNA technologies such as site-directed mutagenesis. In cases where insertions are required, synthetic DNA encoding the insertion together with 5' and 3' flanking regions corresponding to the natural sequence on either side of the insertion site can be produced. The flanking regions contain convenient restriction sites corresponding to those in the natural sequence so that the sequence can be cut with suitable enzyme(s) and synthetic DNA ligated into the cut. The DNA is then expressed in accordance with the invention to produce the encoded protein. These methods are merely illustrative examples of numerous standard techniques known in the art of DNA sequence manipulation, and other known techniques may also be used.
Молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС).Molecules of the major histocompatibility complex (MHC).
Как правило, TCR-рецепторы связываются с пептидами в качестве части комплекса пептида:МНС.Typically, TCR receptors bind to peptides as part of a peptide:MHC complex.
Молекула МНС может быть молекулой МНС класса I или II. Комплекс может находиться на поверхности антигенпрезентирующей клетки, такой как дендритная клетка или В-клетка или любая другая клетка, включая раковые клетки, или он может быть иммобилизирован, например, путем покрытия сферы или планшета.The MHC molecule may be an MHC class I or II molecule. The complex may be on the surface of an antigen presenting cell, such as a dendritic cell or B cell or any other cell, including cancer cells, or it may be immobilized, for example by coating a sphere or plate.
Система лейкоцитарных антигенов человека (HLA) является названием комплекса генов, который кодирует главный комплекс гистосовместимости (МНС) у людей и включает антигены HLA I класса (А, В и С) и антигены HLA II класса (DP, DQ и DR).The human leukocyte antigen (HLA) system is the name of the complex of genes that encodes the major histocompatibility complex (MHC) in humans and includes HLA class I antigens (A, B and C) and HLA class II antigens (DP, DQ and DR).
Аллели HLA А, В и С представляют собой пептиды, получаемые, главным образом, из внутриклеточных белков, например, белков, экспрессируемых в клетке. Это имеет особое значение, так как WT1 является внутриклеточным белком.HLA A, B, and C alleles are peptides derived primarily from intracellular proteins, such as those expressed within the cell. This is of particular importance since WT1 is an intracellular protein.
В ходе развития Т-клеток in vivo, Т-клетки проходят этап положительного отбора, гарантирующего распознавание своих МНС, с последующим этапом отрицательного отбора для удаления Т-клеток, которые слишком сильно связываются с МНС, которые представляют аутоантигены. В результате некоторые Т-клетки и TCR-рецепторы, которые они экспрессируют, распознают только пептиды, представленные некоторыми типами молекул МНС, т.е. пептиды, кодируемые определенными аллелями HLA. Это известно как HLA рестрикция.During T cell development in vivo, T cells undergo a step of positive selection to ensure recognition of their MHCs, followed by a step of negative selection to remove T cells that bind too strongly to MHCs that present self-antigens. As a result, some T cells and the TCR receptors they express recognize only peptides presented by certain types of MHC molecules, i.e. peptides encoded by specific HLA alleles. This is known as HLA restriction.
- 34 045443- 34 045443
Одним из представляющих интерес аллелей HLA является HLA-A*0201, который экспрессируется у подавляющего большинства (>50%) представителей европеоидной расы. Соответственно, TCRрецепторы, которые связывают пептиды WT1, презентированные МНС, кодируемыми HLA-A*0201 (т.е.One HLA allele of interest is HLA-A*0201, which is expressed in the vast majority (>50%) of Caucasians. Accordingly, TCR receptors that bind WT1 peptides presented by MHC encoded by HLA-A*0201 (i.e.
HLA-A*0201 рестриктированными), предпочтительны, так как иммунотерапия с применением такихHLA-A*0201 restricted), are preferred, since immunotherapy using such
TCR-рецепторов, будет подходить для лечения значительной доли представителей европеоидной расы.TCR receptors will be suitable for treatment of a significant proportion of Caucasians.
Другими представляющими интерес аллелями HLA-A являются HLA-A*0101, HLA-A*2402, и HLA-A*0301.Other HLA-A alleles of interest are HLA-A*0101, HLA-A*2402, and HLA-A*0301.
Широко экспресирующимися аллелями HLA-B, представляющими интерес, являются HLA-B*3501, HLA-B*0702 и HLA-B*3502.Widely expressed HLA-B alleles of interest are HLA-B*3501, HLA-B*0702 and HLA-B*3502.
TCR настоящего изобретения может быть HLA-А*0201-рестриктированным.The TCR of the present invention may be HLA-A*0201-restricted.
В одном аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*020 1 -рестриктированным.CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*020 1 -restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266)CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266)
- 35 045443 или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательность- 35 045443 or a variant thereof, containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e, including the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR являетсяCASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, TCR is
HLA-A*020 1 -рестриктированным.HLA-A*020 1 -restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В другом аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*0201 -рестриктированным.CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*0201-restricted.
В одном варианте осуществления TCR настоящего изобретения, который является HLA-A*0201рестриктированным, связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR of the present invention that is HLA-A*0201 restricted binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В одном аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
- 36 045443- 36 045443
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-A*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-A*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266)CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266)
- 37 045443 или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательность- 37 045443 or a variant thereof, containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e, including the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-А*0201-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-A*0201-restricted and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Другим широко экспрессируемым аллелем HLA, представляющим интерес, является HLA-B*3501. TCR настоящего изобретения может быть HLA-B*3501-рестриктированным.Another widely expressed HLA allele of interest is HLA-B*3501. The TCR of the present invention may be HLA-B*3501-restricted.
В одном аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-В*3501-рестриктированным.CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-B*3501-restricted.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-В*3501-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, where the TCR is HLA-B*3501-restricted, and where the WT1 peptide includes the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
- 38 045443- 38 045443
В одном аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-В*3501-рестриктированным.CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-B*3501-restricted.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in another aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-В*3501-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, where the TCR is HLA-B*3501-restricted, and where the WT1 peptide includes the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Другим широко экспрессируемым аллелем HLA, представляющим интерес, является HLA-B*3502. TCR настоящего изобретения может быть HLA-B*3502-рестриктированным.Another widely expressed HLA allele of interest is HLA-B*3502. The TCR of the present invention may be HLA-B*3502 restricted.
В одном аспекте, где TCR настоящего изобретения включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one aspect, wherein the TCR of the present invention includes a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-В*3502-рестриктированным.CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-B*3502-restricted.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложен TCR, который связывает пептид белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где TCR включает CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one aspect of the present invention, there is provided a TCR that binds a major histocompatibility complex (MHC)-presented Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the TCR includes CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, где TCR является HLA-В*3502-рестриктированным, и где пептид WT1 включает аминокислотную последовательностьCASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, wherein the TCR is HLA-B*3502-restricted, and wherein the WT1 peptide includes the amino acid sequence
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Было продемонстрировано, что Т-клетки, экспрессирующие TCR-рецепторы настоящего изобретения, которые связываются с пептидами WT1, включающими аминокислотную последовательностьIt has been demonstrated that T cells expressing the TCR receptors of the present invention that bind to WT1 peptides comprising the amino acid sequence
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123), способны селективно элиминировать опухолевые (ОМЛ) клетки, экспрессирующие аллель HLAВ*3502, см. Пример 4 и фиг. 4с.EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) are capable of selectively eliminating tumor (AML) cells expressing the HLAB*3502 allele, see Example 4 and FIG. 4s.
В одном аспекте, где TCR настоящего изобретения связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьIn one aspect, wherein the TCR of the present invention binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-В*3502-рестриктированным.EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-B*3502-restricted.
В одном варианте осуществления, где TCR настоящего изобретения связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьIn one embodiment, wherein the TCR of the present invention binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-A*020 1 -рестриктированным.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-A*020 1 -restricted.
В одном варианте осуществления, где TCR настоящего изобретения связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьIn one embodiment, wherein the TCR of the present invention binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, TCR является HLA-В*3501-рестриктированным.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, the TCR is HLA-B*3501-restricted.
Белок опухоли Вильмса 1 (WT1).Wilms tumor protein 1 (WT1).
- 39 045443- 39 045443
Белок опухоли Вильмса 1 (WT1) - внутриклеточный белок, кодирующий фактор транскрипции с цинк-пальцевым доменом, который играет важную роль в росте и дифференцировке клеток (Yang, L. et al. Leukemia 21, 868-876 (2007)). Он широко экспрессируется на различных гемобластных и солидных опухолях, но при этом демонстрирует ограниченную экспрессию на других тканях (гонады, матка, почка, мезотелий, клетки-предшественники в различных тканях). Последние данные свидетельствуют, что WT1 играет роль в лейкемогенезе и онкогенезе.Wilms tumor protein 1 (WT1) is an intracellular protein encoding a zinc finger domain transcription factor that plays an important role in cell growth and differentiation (Yang, L. et al. Leukemia 21, 868-876 (2007)). It is widely expressed on various hematoblastic and solid tumors, but shows limited expression on other tissues (gonads, uterus, kidney, mesothelium, progenitor cells in various tissues). Recent evidence suggests that WT1 plays a role in leukemogenesis and tumorigenesis.
WT1 имеет несколько изоформ, некоторые из которых образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК транскриптов, кодирующих WT1. Полная аминокислотная последовательность изоформы WT1 была опубликована ранее (Gessler, М. et al. Nature; 343(6260):774-778; (1990)). Эта конкретная изоформа состоит из 575 аминокислот и включает первые 126 аминокислот на N-конце, которые отсутствуют в экзон 5+ и KTS+ изоформах WT1.WT1 has several isoforms, some of which are generated by alternative splicing of the mRNA transcripts encoding WT1. The complete amino acid sequence of the WT1 isoform has been published previously (Gessler, M. et al. Nature; 343(6260):774-778; (1990)). This particular isoform is 575 amino acids long and includes the first 126 amino acids at the N-terminus, which are absent in the exon 5+ and KTS+ isoforms of WT1.
Примерный белок WT1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в UniProt J3KNN9.The exemplary WT1 protein has the amino acid sequence shown in UniProt J3KNN9.
Другой примерный белок WT1 имеет аминокислотную последовательность, представленную ниже:Another exemplary WT1 protein has the amino acid sequence shown below:
SRQRPHPGAI.RNPTACI’LPHFPPSEPPTHSPTHPPRAGTAAQAPGPRRLI.AAII.DFSRQRPHPGAI.RNPTACI’LPHFPPSEPPTHSPTHPPRAGTAAQAPGPRRLI.AAII.DF
LLLQDPASTCVPEPASQ1 1TLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRR SRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASA YGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSHKQEPSWGGAEPHEEQCLS AH VH FSGQF I GTAGACR YGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAlRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSIinA AQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTFYSSDNLY QMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNIITTPILCGA QYR1HTHGVFRG1QDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMH SRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRH TGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLK TH TRT1 1TGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRU1 IN Ml IQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 131)LLLQDPASTCVPEPASQ1 1TLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRR SRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASA YGSLGGPAPPPAPPPPPPPHSHKQEPSWGGAEPHEEQCLS AH VH FSGQF I GTAGACR YGPFGPPPPSQASSGQARMFPNA PYLPSCLESQPAlRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSIinA AQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTFYSSDNLY QMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNIITTPILCGA QYR1HTHGVFRG1QDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGC NKRYFKLSHLQMH SRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRH TGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLK TH TRT1 1TGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRU1 IN Ml IQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 131)
Пептиды WT1.WT1 peptides.
При использовании в настоящем документе термин пептид относится к множеству аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Как определено в настоящем документе, пептид может состоять из меньше чем приблизительно 30, меньше чем приблизительно 25, меньше чем приблизительно 20, меньше чем 19, меньше чем 18, меньше чем 17, меньше чем 16, меньше чем 15, меньше чем 14, меньше чем 13, меньше чем 12, меньше чем 11, меньше чем 10, меньше чем 9, меньше чем 8, меньше чем 7, меньше чем 6 или меньше чем 5 аминокислотных остатков. Предпочтительно пептид имеет длину приблизительно 5-20 аминокислот, более предпочтительно пептид имеет длину приблизительно 8-15 аминокислотных остатков.As used herein, the term peptide refers to a plurality of amino acid residues linked by peptide bonds. As defined herein, a peptide may consist of less than about 30, less than about 25, less than about 20, less than 19, less than 18, less than 17, less than 16, less than 15, less than 14, less less than 13, less than 12, less than 11, less than 10, less than 9, less than 8, less than 7, less than 6 or less than 5 amino acid residues. Preferably the peptide is approximately 5-20 amino acids in length, more preferably the peptide is approximately 8-15 amino acid residues in length.
TCR-рецепторы настоящего изобретения связываются с пептидом WT1, когда пептид WT1 презентирован МНС. При использовании в настоящем документе, термин пептид WT1 следует понимать как пептид, включающий аминокислотную последовательность, полученную из белка WT1.The TCR receptors of the present invention bind to the WT1 peptide when the WT1 peptide is presented to the MHC. As used herein, the term WT1 peptide should be understood as a peptide comprising an amino acid sequence derived from the WT1 protein.
Например, пептид WT1 может включать по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 25 непрерывных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности белка WT1.For example, a WT1 peptide may include at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13 , at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, or at least 25 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of the WT1 protein.
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательностиThe WT1 peptide may include or consist of the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций. Примерами пептидов WT1, включающих аминокислотную последовательность, являютсяAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions. Examples of WT1 peptides including amino acid sequence are
AAQWAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 115) иAAQWAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 115) and
APVLDFAPPGASAYG (SEQ ID NO: 116).APVLDFAPPGASAYG (SEQ ID NO: 116).
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей изThe WT1 peptide may comprise or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) и вариантов SEQ ID NO: 118-120, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) and variants SEQ ID NO: 118-120, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей изThe WT1 peptide may comprise or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126)YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126)
- 40 045443 и вариантов SEQ ID NO: 123 и 126, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций. Примерные пептиды WT1 могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из- 40 045443 and variants SEQ ID NO: 123 and 126, each of which contains up to three amino acid substitutions, insertions or deletions. Exemplary WT1 peptides may have an amino acid sequence selected from the group consisting of
TCVPEPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 121),TCVPEPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 121),
EPASQHTLRSGPGCL (SEQ ID NO: 122),EPASQHTLRSGPGCL (SEQ ID NO: 122),
HSTGYESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 124) иHSTGYESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 124) and
YESDNHTTPILCGAQ (SEQ ID NO: 125).YESDNHTTPILCGAQ (SEQ ID NO: 125).
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательности NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.The WT1 peptide may include or consist of the amino acid sequence NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательностиThe WT1 peptide may include or consist of the amino acid sequence
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций. Примерные пептиды WT1 могут иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions. Exemplary WT1 peptides may have an amino acid sequence selected from the group consisting of
CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 248) иCMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 248) and
NQMNLGATLKGVAAG (SEQ ID NO: 249).NQMNLGATLKGVAAG (SEQ ID NO: 249).
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательностиThe WT1 peptide may include or consist of the amino acid sequence
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Пептид WT1 может включать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей изThe WT1 peptide may comprise or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и вариантов SEQ ID NO: 252, 253 и 254, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants SEQ ID NO: 252, 253 and 254, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
В некоторых вариантах осуществления, для пептидов WT1, которые связываются с молекулами МНС, кодируемыми аллелем HLA-A*0201, может быть предпочтительно, что аминокислоты в положении 2 пептида (т.е. вторая аминокислота от N-конца) являются лейцином или метионином, хотя также могут быть предпочтительными изолейцин, валин, аланин и треонин. Также может быть предпочтительно, что аминокислотой в положении 9 или 10 является валин, лейцин или изолейцин, хотя также могут быть предпочтительными аланин, метионин и треонин. Предпочтительные МНС-связывающие мотивы других аллелей HLA раскрыты в Celis et al. (Molecular Immunology, Vol. 31,8, December 1994, стр. 1423-1430).In some embodiments, for WT1 peptides that bind to MHC molecules encoded by the HLA-A*0201 allele, it may be preferable that the amino acids at position 2 of the peptide (i.e., the second amino acid from the N-terminus) be leucine or methionine, although isoleucine, valine, alanine and threonine may also be preferred. It may also be preferred that the amino acid at position 9 or 10 is valine, leucine or isoleucine, although alanine, methionine and threonine may also be preferred. The preferred MHC binding motifs of other HLA alleles are disclosed in Celis et al. (Molecular Immunology, Vol. 31.8, December 1994, pp. 1423-1430).
В настоящем изобретении предусмотрены различные применения пептидов WT1, описанных в настоящем документе. Например, пептиды WT1, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту, например, человеку, участвующему в исследовании. Введение пептидов WT1 настоящего изобретения может вызывать иммунный ответ против клеток, экспрессирующих или повышенно экспрессирующих белок WT1, т.е. пептиды WT1 являются иммуногенными пептидами WT1.The present invention provides for various uses of the WT1 peptides described herein. For example, the WT1 peptides described herein can be administered to a subject, such as a human, participating in a study. Administration of the WT1 peptides of the present invention can induce an immune response against cells expressing or overexpressing WT1 protein, i.e. WT1 peptides are immunogenic WT1 peptides.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный иммуногенный пептид WT1, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изThus, in another aspect of the present invention, there is provided an isolated immunogenic WT1 peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Пептиды WT1, описанные в настоящем документе, например, пептиды WT1, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изWT1 peptides described herein, for example, WT1 peptides comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) иEPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) and
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
- 41 045443- 41 045443
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, могут применяться для скрининга на и/или идентификации новых последовательностей TCR, которые связываются с клетками WT1. Например, клетки Т2 можно сенсибилизировать пептидом WT1, указанным в настоящем изобретении, и инкубировать с популяцией Т-клеток, выделенных у донора. В данном подходе экспрессия цитокинов, например, CD107а и IFNy, может указывать на Т-клетки, которые распознают пептиды WT1.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, can be used to screen for and/or identify novel TCR sequences that bind to WT1 cells. For example, T2 cells can be sensitized with the WT1 peptide of the present invention and incubated with a population of T cells isolated from a donor. In this approach, expression of cytokines such as CD107a and IFNy may indicate T cells that recognize WT1 peptides.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложен Т-клеточный рецептор (TCR), который связывается с пептидом белка опухоли Вильмса 1 (WT1), презентированный главным комплексом гистосовместимости (МНС), где пептид WT1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изThus, in one aspect of the present invention, there is provided a T cell receptor (TCR) that binds to a major histocompatibility complex (MHC) Wilms tumor 1 (WT1) protein peptide, wherein the WT1 peptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123),
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127),
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119),
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120),
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117),
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250),
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251),DPGGIWAKLGAAAEAS (SEQ ID NO: 251),
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252),
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253),
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) и их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) and variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Последовательности TCR.TCR sequences.
Были определены аминокислотные последовательности TCR-рецепторов, которые связываются с пептидами WT1, описанными в настоящем документе. В частности были определены аминокислотные последовательности CDR-областей TCR, которые важны для распознавания и связывания пептида WT1.The amino acid sequences of the TCR receptors that bind to the WT1 peptides described herein have been determined. In particular, the amino acid sequences of the TCR CDR regions that are important for recognition and binding of the WT1 peptide were determined.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCVVNLLSNQGGKLIF (SEQ ID NO: 36) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSQDYLVSNEKLFF (SEQ ID NO: 41) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
- 42 045443- 42 045443
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептидAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, when the peptide
WT1 презентирован МНС.WT1 is presented by MHC.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSVGGSGSYNEQFF (SEQ ID NO: 169) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment of the present invention, there is provided a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASGGRDDKIIF (SEQ ID NO: 214) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSYSRTESTDTQYF (SEQ ID NO: 219) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В настоящем изобретении также предложен TCR, включающий:The present invention also provides a TCR comprising:
CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьCDR3a, including the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьCDR3a, including the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьCDR3a, including the amino acid sequence
- 43 045443- 43 045443
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций; илиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions; or
CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьCDR3a, including the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций;CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions;
где TCR связывается с презентированным МНС пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей изwherein the TCR binds to an MHC-presented WT1 peptide comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118),
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) иEDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) and
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) или их вариантов, каждый из которых содержит до трех аминокислотных замен, вставок или делеций.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) or variants thereof, each containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions.
Таким образом, в одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьThus, in one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
- 44 045443- 44 045443
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим изCASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRLSGSARQLTF (SEQ ID NO: 14) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLLGDEQYF (SEQ ID NO: 24) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30)CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30)
- 45 045443 или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательности- 45 045443 or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептидQCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, when the peptide
WT1 презентирован МНС.WT1 is presented by MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
В одном варианте осуществления предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn one embodiment, a TCR is provided comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAYRSLKYGNKLVF (SEQ ID NO: 19) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSLVALQGAGEQYF (SEQ ID NO: 30) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDAYSGNTPLVF (SEQ ID NO: 47) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASRAAGLDTEAFF (SEQ ID NO: 57) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASTQTPYEQYF (SEQ ID NO: 63) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRAEIYNQGGKLIF (SEQ ID NO: 52) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим или состоящим из аминокислотной последовательностиCASSTVGGEDYGYTF (SEQ ID NO: 69) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising or consisting of the amino acid sequence
YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126) или ее варианта, содержащего до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую амино- 46 045443 кислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising an amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCAISVGQGALYEQYF (SEQ ID NO: 80) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASMAGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 75) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSVARDRRNYGYTF (SEQ ID NO: 86) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVTVGNKLVF (SEQ ID NO: 175) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASRGWREQFF (SEQ ID NO: 180) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAARSYNTDKLIF (SEQ ID NO: 186) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSWGYQETQYF (SEQ ID NO: 196) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions that binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSPTGGEYYGYTF (SEQ ID NO: 202) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASYNNARLMF (SEQ ID NO: 191) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связы- 47 045443 вается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF (SEQ ID NO: 208) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептидPSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, when the peptide
WT1 презентирован МНС.WT1 is presented by MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAANNARLMF (SEQ ID NO: 92) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSDTRAREQFF (SEQ ID NO: 97) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAASATGNQFYF (SEQ ID NO: 266) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSPGQHGELFF (SEQ ID NO: 271) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован МНС.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented by the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
- 48 045443- 48 045443
CAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVEATDSWGKLQF (SEQ ID NO: 108) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAVRTSYDKVIF (SEQ ID NO: 113) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCASSLGLSISQETQYF (SEQ ID NO: 288) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCAERLNTDKLIF (SEQ ID NO: 103) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDSVSGNTIYF (SEQ ID NO: 163) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR, включающий CDR3a, включающую аминокислотную последовательностьIn addition, the present invention provides a TCR comprising a CDR3a comprising the amino acid sequence
CATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, и CDR3e, включающую аминокислотную последовательностьCATDGDSSYKLIF (SEQ ID NO: 277) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, and CDR3e comprising the amino acid sequence
CSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, который связывается с пептидом WT1, включающим аминокислотную последовательностьCSARDVLTGDYGYTF (SEQ ID NO: 282) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions, which binds to a WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) или ее вариант, содержащий до трех аминокислотных замен, вставок или делеций, когда пептид WT1 презентирован MHC.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) or a variant thereof containing up to three amino acid substitutions, insertions or deletions when the WT1 peptide is presented to the MHC.
Примеры аминокислотных последовательностей TCR настоящего изобретения приведены в табл. 1.Examples of TCR amino acid sequences of the present invention are shown in table. 1.
- 49 045443- 49 045443
Таблица 1Table 1
Донор: HD2Donor: HD2
- 50 045443- 50 045443
- 51 045443- 51 045443
- 52 045443- 52 045443
Донор: HD3Donor: HD3
- 53 045443- 53 045443
Донор: HD4Donor: HD4
- 54 045443- 54 045443
- 55 045443- 55 045443
- 56 045443- 56 045443
Донор: HD5Donor: HD5
- 57 045443- 57 045443
- 58 045443- 58 045443
Донор: HD6Donor: HD6
- 59 045443- 59 045443
- 60 045443- 60 045443
Донор: HD7Donor: HD7
- 61 045443- 61 045443
- 62 045443- 62 045443
- 63 045443- 63 045443
- 64 045443- 64 045443
- 65 045443- 65 045443
- 66 045443- 66 045443
Донор: HD8Donor: HD8
Донор: HD9Donor: HD9
- 67 045443- 67 045443
- 68 045443- 68 045443
- 69 045443- 69 045443
- 70 045443- 70 045443
Донор: HD10Donor: HD10
- 71 045443- 71 045443
Таким образом, в настоящем изобретении предложены выделенные полипептиды, включающие одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1114 и 160-222, их фрагменты, варианты и гомологи.Thus, the present invention provides isolated polypeptides comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1114 and 160-222, fragments, variants and homologues thereof.
В одном аспекте изобретения предложен TCR, включающий последовательность альфа-цепи TCR, выбранные из группы, состоящей из последовательностей альфа-цепи HD1-HD10 в табл. 1, и последовательность бета-цепи TCR, независимо выбранную из группы, состоящей из последовательностей бетацепи HD1-HD10 в табл. 1.In one aspect of the invention, a TCR is provided comprising a TCR alpha chain sequence selected from the group consisting of the HD1-HD10 alpha chain sequences in Table 1. 1, and a TCR beta chain sequence independently selected from the group consisting of HD1-HD10 beta chain sequences in table. 1.
Уменьшение ошибочного спаривания и повышение экспрессии TCR.Reduced mismatching and increased TCR expression.
TCR согласно изобретению может экспрессироваться в Т-клетке с изменением антигенной специфичности Т-клетки. TCR-трансдуцированные Т-клетки могут экспрессировать по меньшей мере две альфа-цепи TCR и две бета-цепи TCR. Хотя эндогенные альфа/бета-цепи TCR формируют рецептор, который является аутотолерантным, введенные альфы/бета-цепи TCR формируют рецептор с определенной специфичностью в отношении данного антигена-мишени.The TCR of the invention can be expressed in a T cell to change the antigen specificity of the T cell. TCR-transduced T cells can express at least two TCR alpha chains and two TCR beta chains. Although endogenous TCR alpha/beta chains form a receptor that is autotolerant, introduced TCR alpha/beta chains form a receptor with a certain specificity for a given target antigen.
Однако TCR-генотерапия требует достаточной экспрессии перенесенных TCR-рецепторов. Перенесенный TCR может быть разбавлен присутствием эндогенного TCR, что приводит к недостаточной экспрессии опухолеспецифичного TCR. Кроме того, может происходить ошибочное спаривание между эндогенными и введенными цепями с образованием новых рецепторов, которые могут проявлять неожиданную специфичность в отношении аутоантигенов и вызывать аутоиммунное повреждение при переносе пациентам.However, TCR gene therapy requires sufficient expression of the transferred TCR receptors. The transferred TCR may be diluted by the presence of endogenous TCR, resulting in insufficient expression of the tumor-specific TCR. In addition, mispairing between endogenous and introduced chains can occur to form new receptors that may exhibit unexpected specificity for autoantigens and cause autoimmune damage when transferred to patients.
Следовательно, исследовали несколько стратегий для снижения риска ошибочного спаривания между эндогенными и введенными цепями TCR. Мутации в альфа/бета-интерфейсе TCR являются одной из стратегий, используемых в настоящее время для уменьшения нежелательного ошибочного спаривания. Например, введение цистеина в константные домены альфа и бета-цепи позволяет образовывать дисульфидную связь и улучшает спаривание введенных цепей, уменьшая при этом ошибочное спаривание с цепями дикого типа.Consequently, several strategies have been explored to reduce the risk of mismatching between endogenous and introduced TCR chains. Mutations in the TCR alpha/beta interface are one of the strategies currently used to reduce unwanted mismatching. For example, introducing a cysteine into the alpha and beta chain constant domains allows disulfide bond formation and improves pairing of the introduced chains while reducing mispairing with wild-type chains.
Таким образом, TCR-рецепторы настоящего изобретения могут включать одну или более мутаций в области соединения α-цепи/β-цепи, такие, что при экспрессии α-цепи и β-цепи в Т-клетке частота ошибочного спаривания между указанными цепями и эндогенными α и β-цепями TCR снижается. В одном варианте осуществления одна или более мутаций вводят остаток цистеина в домен константной области каждой α-цепи и β-цепи, где остатки цистеина способны образовывать дисульфидную связь между αцепью и β-цепью.Thus, the TCR receptors of the present invention may include one or more mutations in the α-chain/β-chain junction region such that when the α-chain and β-chain are expressed in a T cell, the frequency of mispairing between these chains and endogenous α and TCR β-chains are reduced. In one embodiment, one or more mutations introduce a cysteine residue into the constant region domain of each α chain and β chain, where the cysteine residues are capable of forming a disulfide bond between the α chain and the β chain.
Другая стратегия уменьшения ошибочного спаривания основана на введении полинуклеотидных последовательностей, кодирующих миРНК, добавляемых к генам, кодирующим опухолеспецифичные α и или β-цепи TCR, и созданных с возможностью ограничивать экспрессию эндогенных генов TCR (Okamoto S. Cancer research 69, 9003-9011,2009).Another strategy to reduce mismatching is based on the introduction of polynucleotide sequences encoding miRNAs added to genes encoding tumor-specific TCR α and or β chains and designed to restrict the expression of endogenous TCR genes (Okamoto S. Cancer research 69, 9003-9011, 2009 ).
- 72 045443- 72 045443
Таким образом, вектор или полинуклеотид, кодирующий TCR-рецепторы настоящего изобретения, может включать один или более миРНК или других средств, направленных на ограничение или устранение экспрессии эндогенных генов TCR.Thus, a vector or polynucleotide encoding the TCR receptors of the present invention may include one or more siRNAs or other agents aimed at limiting or eliminating the expression of endogenous TCR genes.
Также можно комбинировать искусственные нуклеазы, такие как цинк-пальцевые нуклеазы (ZFN), подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN) или CRISPR/Cas системы, предназначенные для адресного воздействия на константные области эндогенных генов, например генов TCR (TRAC и/или TRBC), с получением постоянного прерывания эндогенных генов альфа и/или бета-цепи TCR, обеспечивая в результате полную экспрессию опухолеспецифичного TCR и, таким образом, уменьшая или устраняя риск ошибочного спаривания TCR. Этот процесс, известный как редактирование гена TCR, превзошел перенос гена TCR in vitro и in vivo (Provasi E., Genovese P., Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).It is also possible to combine artificial nucleases, such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR/Cas systems designed to target constant regions of endogenous genes, such as TCR genes (TRAC and/or TRBC) , resulting in permanent interruption of endogenous TCR alpha and/or beta chain genes, resulting in full expression of the tumor-specific TCR and thus reducing or eliminating the risk of TCR mismatching. This process, known as TCR gene editing, has surpassed TCR gene transfer in vitro and in vivo (Provasi E, Genovese P, Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).
Таким образом, TCR-рецепторы настоящего изобретения могут применяться для редактирования специфичности Т-клеток путем прерывания TCR и генетического введения опухолеспецифичного TCR.Thus, the TCR receptors of the present invention can be used to edit T cell specificity by interrupting the TCR and genetically introducing a tumor-specific TCR.
Кроме того, технология редактирования генома обеспечивает возможность направленной интеграции кассеты экспрессии, содержащей полинуклеотид, кодирующий TCR настоящего изобретения, и, необязательно, одну или более промоторных областей и/или другие последовательности контроля экспрессии, в эндогенный ген, прерванный с помощью искусственных нуклеаз (Lombardo A., Nature biotechnology 25, 1298-1306; 2007).In addition, genome editing technology allows for the targeted integration of an expression cassette containing a polynucleotide encoding the TCR of the present invention, and optionally one or more promoter regions and/or other expression control sequences, into an endogenous gene interrupted by artificial nucleases (Lombardo A ., Nature biotechnology 25, 1298-1306; 2007).
Таким образом, TCR-рецепторы настоящего изобретения могут применяться для редактирования специфичности Т-клеток путем направленной интеграции полинуклеотида, кодирующего TCR настоящего изобретения, в геномную область. Интеграция может направляться искусственной нуклеазой.Thus, the TCR receptors of the present invention can be used to edit the specificity of T cells by targeted integration of a polynucleotide encoding the TCR of the present invention into a genomic region. Integration can be directed by an artificial nuclease.
Другая стратегия, разработанная для повышения экспрессии перенесенного TCR и уменьшения ошибочного спаривания TCR, заключается в муринизации, при которой заменяют человеческие TCR α и TCR β константные области (например, области TRAC, TRBC1 и TRBC2) их мышиными аналогами. Муринизация константных областей TCR описана, например, в публикации Sommermeyer and Uckert, J Immunol; 2010 (184:6223-6231). Таким образом, TCR-рецепторы настоящего изобретения могут быть муринизированными.Another strategy developed to increase expression of the transferred TCR and reduce TCR mismatching is murinization, which replaces the human TCR α and TCR β constant regions (eg, TRAC, TRBC1, and TRBC2 regions) with their murine counterparts. Murinization of TCR constant regions is described, for example, in Sommermeyer and Uckert, J Immunol; 2010 (184:6223-6231). Thus, the TCR receptors of the present invention may be murinized.
Выделенный полинуклеотид.Isolated polynucleotide.
Настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему TCR рецептор изобретения или его часть, такую как α-цепь и/или β-цепь, вариабельный домен или его часть.The present invention relates to an isolated polynucleotide encoding the TCR receptor of the invention or a part thereof, such as an α chain and/or a β chain, a variable domain or a part thereof.
Выделенный полинуклеотид может быть двухцепочечным или одноцепочечным и может быть РНК или ДНК.The isolated polynucleotide may be double-stranded or single-stranded and may be RNA or DNA.
Специалисту будет очевидно, что множество различных полинуклеотидов могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Кроме того, следует понимать, что специалист при использовании стандартных методов сумеет сделать замены, вставки или делеции нуклеотидов, которые не повлияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами согласно изобретению, отражая использование кодонов какого-либо конкретного организма-хозяина, в котором требуется экспрессировать полипептиды согласно изобретению.It will be apparent to one skilled in the art that many different polynucleotides can encode the same polypeptide as a result of the degeneracy of the genetic code. In addition, it should be understood that one skilled in the art, using standard techniques, will be able to make nucleotide substitutions, insertions or deletions that will not affect the polypeptide sequence encoded by the polynucleotides of the invention, reflecting the codon usage of any particular host organism in which the polypeptides are desired to be expressed. invention.
Полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут быть модифицированы с помощью любого способа, доступного в уровне техники. Такие модификации могут быть выполнены с целью повышения активности in vivo или продолжительность действия полинуклеотидов изобретения.The polynucleotides described herein may be modified by any method available in the art. Such modifications may be made to increase the in vivo activity or duration of action of the polynucleotides of the invention.
Полинуклеотиды, такие как ДНК полинуклеотиды, могут быть получены рекомбинантно, искусственно или любыми способами, доступными специалистам в данной области. Они могут быть также клонированы стандартными методами.Polynucleotides, such as DNA polynucleotides, can be produced recombinantly, artificially, or by any methods available to those skilled in the art. They can also be cloned using standard methods.
Более протяженные полинуклеотиды обычно получают с применением рекомбинантных способов, например, при использовании технологий клонирования методом полимеразной цепной реакции (PCR). Это включает получение пары праймеров (например, длиной приблизительно 15-30 нуклеотидов), фланкирующих целевую последовательность, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК полученной из клетки животного или клетки человека, проведение полимеразной цепной реакции при условиях, которые вызывают амплификацию нужной области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси из агарозного геля) и получение амплифицированной ДНК. Могут быть созданы праймеры, содержащие подходящие сайты рестрикции, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий вектор.Longer polynucleotides are usually produced using recombinant methods, for example, using polymerase chain reaction (PCR) cloning technologies. This involves obtaining a pair of primers (e.g., approximately 15-30 nucleotides in length) flanking the target sequence to be cloned, contacting the primers with mRNA or cDNA derived from an animal or human cell, performing a polymerase chain reaction under conditions that cause amplification the desired region, isolating the amplified fragment (for example, by purifying the reaction mixture from an agarose gel) and obtaining the amplified DNA. Primers can be designed containing suitable restriction sites so that the amplified DNA can be cloned into a suitable vector.
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих TCR-рецепторы согласно настоящему изобретению, приведены в табл. 2.Examples of nucleotide sequences encoding TCR receptors according to the present invention are given in table. 2.
- 73 045443- 73 045443
Таблица 2table 2
- 74 045443- 74 045443
- 75 045443- 75 045443
- 76 045443- 76 045443
- 77 045443- 77 045443
- 78 045443- 78 045443
- 79 045443- 79 045443
- 80 045443- 80 045443
- 81 045443- 81 045443
- 82 045443- 82 045443
- 83 045443- 83 045443
- 84 045443- 84 045443
- 85 045443- 85 045443
- 86 045443- 86 045443
- 87 045443- 87 045443
- 88 045443- 88 045443
- 89 045443- 89 045443
- 90 045443- 90 045443
- 91 045443- 91 045443
- 92 045443- 92 045443
- 93 045443- 93 045443
- 94 045443- 94 045443
- 95 045443- 95 045443
- 96 045443- 96 045443
- 97 045443- 97 045443
- 98 045443- 98 045443
- 99 045443- 99 045443
- 100 045443- 100 045443
Таким образом, в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, включающий одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 132-156, 223-247 и 292-299 или их вариантов, обладающих по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними.Thus, the present invention provides an isolated polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 132-156, 223-247 and 292-299 or variants thereof, having at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
В настоящем изобретении также предложен TCR, включающий α-цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 132, 135, 138, 141, 144, 147, 152, 223, 226, 227, 228, 233, 236, 237, 238, 245, 292, 295 и их вариантов, обладающих по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними.The present invention also provides a TCR comprising an α chain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 132, 135, 138, 141, 144, 147, 152, 223, 226, 227, 228, 233, 236, 237, 238, 245, 292, 295 and variants thereof, having at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80 %, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity with them.
В настоящем изобретении также предложен TCR, включающий β-цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 156, 224, 225, 229, 230, 231, 232, 234, 235, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 293, 294, 296-299 и их вариантов, обладающих по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с ними.The present invention also provides a TCR comprising a β-strand encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 156, 224, 225, 229, 230, 231, 232, 234, 235, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 293, 294, 2 96- 299 and variants thereof, having at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity with them.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены выделенные полинуклеотидные последовательности, полученные из последовательностей, представленных в табл. 2. Например, в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий вариабельную область TCR согласно настоящему изобретению, где выделенный полинуклеотид включает фрагмент нуклеотидов любой из последовательностей SEQ ID NO: 132-156, 223-247 и 292-299.In addition, the present invention provides isolated polynucleotide sequences derived from the sequences presented in table. 2. For example, the present invention provides an isolated polynucleotide encoding a TCR variable region of the present invention, wherein the isolated polynucleotide includes a portion of the nucleotides of any of the sequences of SEQ ID NOs: 132-156, 223-247 and 292-299.
Вариантные последовательности могут иметь вставки, делеции или замены одного или более осно- 101 045443 ваний. Если вариация включает вставку(и) или делецию(и), она может происходить по тройкам или может быть сбалансирована (т.е. вставкой на каждую делецию), чтобы вариация не вызывала сдвиг рамки считывания при трансляции остальной части последовательности.Variant sequences may have insertions, deletions, or substitutions of one or more bases. If the variation involves insertion(s) or deletion(s), it may occur in triplets or may be balanced (i.e., an insertion at each deletion) so that the variation does not cause a frameshift when the rest of the sequence is translated.
Некоторые или все вариации могут быть молчащими в том смысле, что они не оказывают влияния на последовательность кодируемого белка вследствие вырожденности генетического кода.Some or all of the variations may be silent in the sense that they do not affect the sequence of the encoded protein due to the degeneracy of the genetic code.
Некоторые или все вариации могут давать консервативные аминокислотные замены, вставки или делеции, как объяснено выше. Вариация может быть сконцентрирована в одной или более областях, таких как области, кодирующие константные области, линкер или каркасные области α или β-цепей, или они могут быть распределены по всей протяженности молекулы.Some or all of the variations may result in conservative amino acid substitutions, insertions, or deletions, as explained above. The variation may be concentrated in one or more regions, such as regions encoding constant regions, linker or framework regions of the α or β chains, or they may be distributed throughout the entire length of the molecule.
Вариантная последовательность должна сохранять возможность кодировать всю или часть аминокислотной последовательности TCR, которая связывается с пептидом WT1.The variant sequence must retain the ability to encode all or part of the TCR amino acid sequence that binds to the WT1 peptide.
Оптимизация кодонов.Codon optimization.
Полинуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть кодон-оптимизированными. Оптимизация кодона была ранее описана в WO 1999/41397 и WO 2001/79518. Различные клетки отличаются по своему использованию конкретных кодонов. Такое предпочтение кодонов соответствует различиям в относительной представленности конкретных тРНК в клетке определенного типа. Путем изменения кодонов в последовательности таким образом, чтобы они соответствовали относительной представленности соответствующих тРНК, можно повысить экспрессию. Подобным способом можно снизить экспрессию, специально подбирая такие кодоны, которым, как известно, соответствуют редкие в конкретном типе клетки тРНК. Таким образом, доступна дополнительная степень трансляционного контроля.The polynucleotides used in the present invention may be codon optimized. Codon optimization has been previously described in WO 1999/41397 and WO 2001/79518. Different cells differ in their use of specific codons. This codon preference corresponds to differences in the relative abundance of specific tRNAs in a given cell type. By changing the codons in the sequence to match the relative abundance of the corresponding tRNAs, expression can be increased. In a similar way, it is possible to reduce expression by specifically selecting codons that are known to correspond to tRNAs that are rare in a particular cell type. Thus, an additional degree of translational control is available.
Многие вирусы, включая ВИЧ и другие лентивирусы, используют большое количество редких кодонов, и, путем их изменения в соответствии с обычно используемыми у млекопитающих кодонами, может быть достигнута повышенная экспрессия пакующих компонентов в клетках-продуцентах млекопитающих. В уровне теники известны таблицы использования кодонов в клетках млекопитающих, а также во множестве других организмов.Many viruses, including HIV and other lentiviruses, use a large number of rare codons, and by altering them to match those commonly used in mammals, increased expression of packaging components can be achieved in mammalian producing cells. At the technical level, tables of codon usage are known in mammalian cells, as well as in many other organisms.
Оптимизация кодонов также может включать удаление мотивов нестабильности мРНК и скрытых сайтов сплайсинга.Codon optimization may also include removal of mRNA instability motifs and cryptic splice sites.
Вектор.Vector.
В настоящем изобретении предложен вектор, включающий полинуклеотид, описанный в настоящем документе.The present invention provides a vector comprising a polynucleotide described herein.
Вектор представляет собой инструмент, который обеспечивает или облегчает перенос единицы из одного окружения в другое. В соответствии с настоящим изобретением, и в качестве примера, некоторые векторы, используемые в технологиях рекомбинантных нуклеиновых кислот, позволяют осуществлять перенос таких единиц, как сегмент нуклеиновой кислоты (например, сегмент гетерологичной ДНК, такой как сегмент гетерологичной кДНК), в клетку-мишень. Вектор может служить для поддержания гетерологичной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в клетке, облегчения репликации вектора, включающего сегмент нуклеиновой кислоты, или облегчения экспрессии белка, кодируемого сегментом нуклеиновой кислоты. Векторы могут быть невирусными или вирусными. Примеры векторов, используемых в технологиях рекомбинантных нуклеиновых кислот, включают, без ограничения перечисленными, плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы и вирусы. Вектор может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Он может быть линейным, и, необязательно, вектор включает одно или более плеч гомологии. Вектор также может быть, например, голой нуклеиновой кислотой (например, ДНК). В своей простейшей форме сам вектор может быть представляющим интерес нуклеотидом.A vector is a tool that enables or facilitates the transfer of a unit from one environment to another. In accordance with the present invention, and by way of example, some vectors used in recombinant nucleic acid technologies allow the transfer of units such as a nucleic acid segment (eg, a heterologous DNA segment, such as a heterologous cDNA segment) into a target cell. A vector may serve to maintain a heterologous nucleic acid (DNA or RNA) in a cell, facilitate replication of a vector comprising a nucleic acid segment, or facilitate expression of a protein encoded by the nucleic acid segment. Vectors can be non-viral or viral. Examples of vectors used in recombinant nucleic acid technologies include, but are not limited to, plasmids, chromosomes, artificial chromosomes, and viruses. The vector can be single-stranded or double-stranded. It may be linear, and optionally the vector includes one or more homology arms. The vector may also be, for example, a naked nucleic acid (eg DNA). In its simplest form, the vector itself may be the nucleotide of interest.
Векторы, используемые в изобретении, могут быть, например, плазмидными или вирусными векторами и могут включать промотор для экспрессии полинуклеотида и, необязательно, регулятор промотора.Vectors used in the invention may be, for example, plasmid or viral vectors and may include a promoter for expression of the polynucleotide and, optionally, a promoter regulator.
Векторы, включающие полинуклеотиды, используемые в изобретении, могут быть введены в клетки при использовании различных способов, известных в уровне техники, таких как трансформация, трансфекция и трансдукция. Несколько методов известны в уровне техники, например, трансдукция рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, на основе аденоассоциированного вируса, бакуловирусные и векторы на основе вируса простого герпеса, векторы с транспозоном Спящая красавица; прямая инъекция нуклеиновых кислот и биолистическая трансформация.Vectors comprising the polynucleotides used in the invention can be introduced into cells using various methods known in the art, such as transformation, transfection and transduction. Several methods are known in the art, for example, transduction with recombinant viral vectors such as retroviral, lentiviral, adenoviral, adeno-associated virus, baculovirus and herpes simplex virus vectors, Sleeping Beauty transposon vectors; direct injection of nucleic acids and biolistic transformation.
Невирусные системы доставки включают, без ограничения перечисленными, способы трансфекции ДНК. В настоящем документе, трансфекция включает процесс с использованием невирусного вектора для доставки гена в клетку-мишень. Типичные методы трансфекции включают электропорацию, ДНК биолистику, липид-опосредованную трансфекцию, трансфекция уплотненной ДНК, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, трансфекцию с использованием катионных соединений, катионные поверхностные амфифилы (CFA) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) и их комбинации.Non-viral delivery systems include, but are not limited to, DNA transfection methods. As used herein, transfection involves the process of using a non-viral vector to deliver a gene to a target cell. Typical transfection methods include electroporation, DNA biolistics, lipid-mediated transfection, compacted DNA transfection, liposomes, immunoliposomes, lipofectin, cationic transfection, cationic surface amphiphiles (CFAs) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) and combinations thereof.
Следует понимать, что термин трансфекция охватывает доставку полинуклеотидов в клетки путем вирусной и невирусной доставки.It should be understood that the term transfection covers the delivery of polynucleotides into cells by viral and non-viral delivery.
Кроме того, в изобретении могут использоваться методики таргетинга генов, например, доставка ДНК-модифицирующих средств.In addition, the invention may use gene targeting techniques, for example, the delivery of DNA-modifying agents.
- 102 045443- 102 045443
Термин вектор включает вектор экспрессии, т.е. конструкцию, способную к экспрессии in vivo или in vitro/ex vivo. Экспрессию может регулировать векторная последовательность, или, например, в случае вставки в целевой сайт, экспрессию может регулировать последовательность-мишень. Вектор может быть интегрирован в ДНК клетки или связан с ней.The term vector includes an expression vector, i.e. a construct capable of expression in vivo or in vitro/ex vivo. Expression may be regulated by a vector sequence, or, for example, in the case of insertion at a target site, expression may be regulated by a target sequence. The vector may be integrated into or associated with the cell's DNA.
Вирусные системы доставки включают, без ограничения перечисленными, аденовирусный вектор, вектор на основе адено-ассоциированного вируса (AAV), вектор на основе вируса герпеса, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор и бакуловирусный вектор.Viral delivery systems include, but are not limited to, adenoviral vector, adeno-associated virus (AAV) vector, herpes virus vector, retroviral vector, lentiviral vector, and baculoviral vector.
Ретровирусы представляют собой РНК-вирусы, жизненный цикл которых отличается от жизненного цикла литических вирусов. В этом отношении ретровирус является инфекционной еденицей, которая реплицируется через промежуточную ДНК. Когда ретровирус заражает клетку, его геном превращается в ДНК-форму под действием фермента обратной транскриптазы. ДНК-копия служит матрицей для синтеза новых РНК-геномов и кодируемых вирусом белков, необходимых для сборки инфекционных вирусных частиц.Retroviruses are RNA viruses whose life cycle differs from that of lytic viruses. In this regard, a retrovirus is an infectious unit that replicates through a DNA intermediate. When a retrovirus infects a cell, its genome is converted into DNA form by the enzyme reverse transcriptase. The DNA copy serves as a template for the synthesis of new RNA genomes and virus-encoded proteins necessary for the assembly of infectious viral particles.
Существует множество ретровирусов, например, вирус лейкоза мышей (MLV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV), вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV), вирус саркомы Рауса (RSV), вирус саркомы Фудзинами (FuSV), вирус лейкоза мышей Молони (Mo-MLV), вирус остеосаркомы FBR мышей (FBR MSV), вирус саркомы мышей Молони (MoMSV), вирус лейкоза мышей Абельсона (A-MLV), вирус миелоцитоматоза птиц 29 (МС29) и вирус эритробластоза птиц (AEV), а также другие ретровирусы, включая лентивирусы.There are many retroviruses, such as murine leukemia virus (MLV), human immunodeficiency virus (HIV), equine infectious anemia virus (EIAV), murine mammary tumor virus (MMTV), Rous sarcoma virus (RSV), Fujinami sarcoma virus (FuSV) , Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV), FBR murine osteosarcoma virus (FBR MSV), Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Abelson murine leukemia virus (A-MLV), avian myelocytomatosis virus 29 (MC29) and avian erythroblastosis virus ( AEV), as well as other retroviruses, including lentiviruses.
Подробный список ретровирусов можно найти в публикации Coffin et al. (Retroviruses 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).A detailed list of retroviruses can be found in Coffin et al. (Retroviruses 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).
Лентивирусы также принадлежат к семейству ретровирусов, но они могут инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки (Lewis et al (1992) EMBO J. 3053-3058).Lentiviruses also belong to the retrovirus family, but they can infect dividing and non-dividing cells (Lewis et al (1992) EMBO J. 3053-3058).
Вектор может быть способен к переносу нуклеотидной последовательности, кодирующей WT1специфичный TCR, описанный в настоящем документе, в клетку, такую как Т-клетка, в результате чего клетка экспрессирует WT1-специфичный TCR. Предпочтительно вектор будет способен к длительной высокой экспрессии в Т-клетках, при этом введенный TCR может успешно конкурировать с эндогенным TCR за ограниченный пул молекул CD3.The vector may be capable of transferring a nucleotide sequence encoding a WT1-specific TCR described herein into a cell, such as a T cell, causing the cell to express the WT1-specific TCR. Preferably, the vector will be capable of long-term high expression in T cells, and the introduced TCR can successfully compete with the endogenous TCR for a limited pool of CD3 molecules.
Увеличение доступности молекул CD3 может повышать экспрессию TCR, например, в клетке, которая была модифицирована для экспрессии TCR настоящего изобретения. Таким образом, вектор согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать один или более генов, кодирующих CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон и/или CD3-дзета. В одном варианте осуществления вектор согласно настоящему изобретению содержит ген, кодирующий CD3-дзета. Вектор может содержать ген, кодирующий CD8. Вектор может кодировать селективный маркер или суицидальный ген для повышения профиля безопасности генетически модифицированной клетки, например, клетки согласно настоящему изобретению или клетки, которая была модифицирована для экспрессии TCR настоящего изобретения (Bonini, Science 1997, Ciceri, Bonini Lancet Oncol. 2009, Oliveira et al., STM 2015). Гены, содержащиеся в векторе согласно настоящему изобретению, могут быть соединены с помощью саморасщепляющихся последовательностей, таких как саморасщепляющаяся последовательность 2А.Increasing the availability of CD3 molecules can increase TCR expression, for example, in a cell that has been modified to express the TCR of the present invention. Thus, the vector of the present invention may further contain one or more genes encoding CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon and/or CD3 zeta. In one embodiment, the vector of the present invention contains a gene encoding CD3-zeta. The vector may contain a gene encoding CD8. The vector may encode a selectable marker or suicide gene to enhance the safety profile of a genetically modified cell, for example a cell of the present invention or a cell that has been modified to express the TCR of the present invention (Bonini, Science 1997, Ciceri, Bonini Lancet Oncol. 2009, Oliveira et al ., STM 2015). The genes contained in the vector of the present invention may be linked by self-cleaving sequences such as the 2A self-cleaving sequence.
В альтернативе один или более отдельных векторов, кодирующих ген CD3, могут быть предоставлены для совместного переноса в клетку одновременно, последовательно или раздельно с одним или более векторами согласно настоящему изобретению, например, одним или более векторами, кодирующими TCR-рецепторы настоящего изобретения.Alternatively, one or more separate vectors encoding the CD3 gene may be provided for co-transfer into a cell simultaneously, sequentially or separately with one or more vectors of the present invention, for example, one or more vectors encoding the TCR receptors of the present invention.
Клетка.Cell.
Настоящее изобретение относится к клетке, включающей полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению.The present invention relates to a cell comprising a polynucleotide or vector according to the present invention.
Клетка может быть Т-клеткой, лимфоцитом или стволовой клеткой. Т-клетка, лимфоцит или стволовая клетка могут быть выбраны из группы, состоящей из CD4 клеток, CD8 клеток, наивных Т-клеток, стволовых Т-клеток памяти, Т-клеток центральной памяти, двойных отрицательных Т-клеток, эффекторных Т-клеток памяти, эффекторных Т-клеток, клеток Th0, клеток Тс0, клеток Th1, клеток Tc1, клеток Th2, клеток Тс2, клеток Th17, клеток Th22, гамма/дельта Т-клеток, естественных киллерных клеток (NK), естественных киллерных Т-клеток (NKT), гемопоэтических стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток.The cell may be a T cell, a lymphocyte, or a stem cell. The T cell, lymphocyte or stem cell may be selected from the group consisting of CD4 cells, CD8 cells, naïve T cells, stem memory T cells, central memory T cells, double negative T cells, effector memory T cells , effector T cells, Th0 cells, Tc0 cells, Th1 cells, Tc1 cells, Th2 cells, Tc2 cells, Th17 cells, Th22 cells, gamma/delta T cells, natural killer (NK) cells, natural killer T cells ( NKT), hematopoietic stem cells and pluripotent stem cells.
Тип клетки может быть выбран с возможностью обеспечивать требуемое и предпочтительное персистирование in vivo и обеспечивать требуемые и предпочтительные функции и свойства клеток настоящего изобретения.The cell type may be selected to provide the desired and preferred persistence in vivo and provide the desired and preferred functions and properties of the cells of the present invention.
Клетка может быть выделена у субъекта.The cell may be isolated from the subject.
Клетка согласно настоящему изобретению может быть предложена для применения в адоптивном переносе клеток. При использовании в настоящем документе термин адоптивный перенос клеток относится к введению популяции клеток пациенту. Как правило, такие клетки являются Т-клетками, которые выделяют у субъекта, а затем генетически модифицируют и культивируют in vitro с целью экспрессии TCR настоящего изобретения, после чего вводят пациенту.The cell according to the present invention can be proposed for use in adoptive cell transfer. As used herein, the term adoptive cell transfer refers to the administration of a population of cells to a patient. Typically, such cells are T cells that are isolated from a subject and then genetically modified and cultured in vitro to express the TCR of the present invention and then administered to the patient.
- 103 045443- 103 045443
Адоптивный перенос клеток может быть аллогенным или аутологичным.Adoptive cell transfer can be allogeneic or autologous.
Под аутологичным переносом клеток следует понимать, что исходную популяцию клеток (которые затем трансдуцируют согласно способу изобретения или трансдуцируют вектором согласно настоящему изобретению) получают у того же субъекта, которому затем вводят популяцию трансдуцированных Т-клеток. Аутологичный перенос обладает преимуществами, поскольку он лишен недостатков, связанных с иммунологической несовместимостью, и доступен субъекта независимо от доступности генетически совместимого донора.By autologous cell transfer it is meant that the starting population of cells (which are then transduced according to the method of the invention or transduced with a vector according to the present invention) is obtained from the same subject to whom the transduced T cell population is then administered. Autologous transfer is advantageous because it does not have the disadvantages of immunological incompatibility and is available to the subject regardless of the availability of a genetically compatible donor.
Под аллогенным переносом клеток следует понимать, что исходную популяцию клеток (которые затем трансдуцируют согласно способу изобретения или трансдуцируют вектором согласно настоящему изобретению) получают у субъекта, отличного от субъекта, которому затем вводят популяцию трансдуцированных клеток. Предпочтительно донор будет генетически совместим с субъектом, которому вводят клетки, чтобы свести к минимуму риск иммунологической несовместимости. В альтернативе донор может быть несовместимым и не являться родственником пациента.By allogeneic cell transfer it is meant that the initial population of cells (which are then transduced according to the method of the invention or transduced with a vector according to the present invention) is obtained from a subject different from the subject to which the population of transduced cells is then administered. Preferably, the donor will be genetically compatible with the subject to whom the cells are administered to minimize the risk of immunological incompatibility. Alternatively, the donor may be incompatible and unrelated to the patient.
Подходящие дозы популяций трансдуцированных клеток являются такими, которые являются терапевтически и/или профилактически эффективными. Вводимая доза может зависеть от субъекта и состояния, подвергаемого лечению, и может быть с легкостью определена специалистом.Suitable dosages of transduced cell populations are those that are therapeutically and/or prophylactically effective. The dose administered may depend on the subject and condition being treated and can be readily determined by one skilled in the art.
Клетка может быть получена из Т-клетки, выделенной у субъекта. Т-клетка может быть частью смешанной популяции клеток, выделенной у субъекта, такой как популяция лимфоцитов периферической крови (ЛПК). Т-клетки в популяции ЛПК могут быть активированы с помощью способов, известных в уровне техники, например, при использовании антител против CD3 и/или против CD28, или совпадающих по размеру с клетками сфер, конъюгированных с антителами против CD3 и/или против CD28.The cell may be derived from a T cell isolated from a subject. The T cell may be part of a mixed population of cells isolated from a subject, such as a population of peripheral blood lymphocytes (PBL). T cells in the PBL population can be activated using methods known in the art, for example, using anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies, or cell-matched beads conjugated to anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies.
Т-клетка может быть CD4+ Т-хелпером или CD8+ цитотоксической Т-клеткой. Клетка может присутствовать в смешанной популяции CD4+ Т-хелперов/CD8+ цитотоксических Т-клеток. Поликлональная активация, например, с применением антител против CD3, необязательно в комбинации с антителами против CD28, будет вызывать пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток.The T cell may be a CD4+ T helper cell or a CD8+ cytotoxic T cell. The cell may be present in a mixed population of CD4+ T helper cells/CD8 + cytotoxic T cells. Polyclonal activation, for example using anti-CD3 antibodies, optionally in combination with anti-CD28 antibodies, will induce proliferation of CD4+ and CD8+ T cells.
Клетка может быть выделена у субъекта, которому затем адоптивно переносят генетически модифицированную клетку. В этом отношении клетка может быть получена путем выделения Т-клетки у субъекта, необязательной активации Т-клетки, переноса гена TCR в клетку ex vivo. Последующую иммунотерапию субъекта можно затем осуществлять путем адоптивного переноса TCR-трансдуцированных клеток. При использовании в настоящем документе этот процесс относится к аутологичному переносу Тклеток, то есть TCR-трансдуцированные клетки вводят тому же субъекту, у которого Т-клетки были первоначально получены.The cell may be isolated from a subject to whom the genetically modified cell is then adoptively transferred. In this regard, the cell can be obtained by isolating a T cell from a subject, optionally activating the T cell, transferring the TCR gene into the cell ex vivo. Subsequent immunotherapy of the subject can then be achieved by adoptive transfer of TCR-transduced cells. As used herein, this process refers to autologous T cell transfer, that is, the TCR-transduced cells are administered to the same subject from which the T cells were originally obtained.
В альтернативе Т-клетка может быть выделена у другого субъекта, таким образом, она является аллогенной. Т-клетка может быть выделена у субъекта-донора. Например, если субъект подвергается аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) или трансплантации паренхиматозных органов, или трансплантации клеток, или терапии стволовыми клетками, клетка может быть получена от донора, от которого получены органы, ткани или клетки. Донор и субъект, подвергающиеся лечению, могут быть прямыми родственниками.Alternatively, the T cell may be isolated from another subject and thus is allogeneic. The T cell may be isolated from a donor subject. For example, if a subject undergoes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) or solid organ transplantation or cell transplantation or stem cell therapy, the cell may be obtained from the donor from whom the organs, tissues, or cells are obtained. The donor and the subject being treated may be direct relatives.
В альтернативе клетка может быть, или может быть получена из стволовой клетки, такой как гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК). Перенос генов в ГСК не приводит к экспрессии TCR на поверхности клеток, поскольку стволовые клетки не экспрессируют молекулы CD3. Однако когда стволовые клетки дифференцируются в лимфоидные клетки-предшественники, которые мигрируют в тимус, инициация экспрессии CD3 приводит к поверхностной экспрессии введенного TCR в тимоцитах.Alternatively, the cell may be, or may be, derived from a stem cell, such as a hematopoietic stem cell (HSC). Gene transfer into stem cells does not result in TCR expression on the cell surface because stem cells do not express CD3 molecules. However, when stem cells differentiate into lymphoid progenitor cells that migrate to the thymus, initiation of CD3 expression results in surface expression of the introduced TCR in thymocytes.
Преимущество данного подхода состоит в том, что после своего формирования зрелые Т-клетки экспрессируют только введенный TCR и либо малые уровни эндогенных цепей TCR, либо не экспрессируют их, потому что экспрессия введенных цепей TCR подавляет перестройку эндогенных сегментов генов TCR с образованием функциональных альфа и бета-генов TCR. Дополнительное преимущество состоит в том, что генетически модифицированные стволовые клетки являются непрерывным источником зрелых Т-клеток с требуемой антигенной специфичностью. Таким образом, клетка может быть генетически модифицированной стволовой клеткой, предпочтительно генетически модифицированной гемопоэтической стволовой клеткой, которая после дифференцировки образует Т-клетку, экспрессирующую TCR согласно изобретению.The advantage of this approach is that once established, mature T cells express only the introduced TCR and either little or no levels of endogenous TCR chains because expression of the introduced TCR chains suppresses the rearrangement of endogenous TCR gene segments to produce functional alpha and beta -TCR genes. An additional advantage is that genetically modified stem cells provide a continuous source of mature T cells with the desired antigen specificity. Thus, the cell may be a genetically modified stem cell, preferably a genetically modified hematopoietic stem cell, which upon differentiation forms a T cell expressing the TCR of the invention.
Другие методы, известные в уровне техники, могут использоваться для уменьшения, ограничения, предотвращения, сайленсинга или блокирования экспрессии эндогенных генов в клетках согласно настоящему изобретению или в клетках, полученных способами настоящего изобретения.Other methods known in the art can be used to reduce, limit, prevent, silence or block the expression of endogenous genes in cells of the present invention or in cells produced by the methods of the present invention.
При использовании в настоящем документе термин прерывание относится к снижению, ограничению, предотвращению, сайленсингу или блокированию экспрессии гена. Специалист в данной области способен применить любой способ, известный в уровне техники, для прерывания эндогенного гена, например, любой подходящий способ редактирования генома, сайленсинга гена, нокдауна гена или нокаута гена.As used herein, the term interruption refers to reducing, limiting, preventing, silencing or blocking gene expression. One skilled in the art will be able to use any method known in the art to interrupt an endogenous gene, for example, any suitable method of genome editing, gene silencing, gene knockdown, or gene knockout.
Например, эндогенный ген может быть прерван искусственной нуклеазой. Искусственная нуклеаза, например, искусственная рестриктаза, сконструированная для направленного селективного воздействияFor example, an endogenous gene can be interrupted by an artificial nuclease. Artificial nuclease, e.g. artificial restriction enzyme, designed for targeted selective action
- 104 045443 на определенную полинуклеотидную последовательность (например, кодирующую целевой ген) и создающая двухцепочечный разрыв в указанной полинуклеотидной последовательности. Как правило, двухцепочечный разрыв (DSB) восстанавливается в процессе допускающего ошибки негомологичного соединения концов (NHEJ), в результате чего образуется нефункциональная полинуклеотидная последовательность, которая может быть неспособна экспрессировать эндогенный ген.- 104 045443 on a specific polynucleotide sequence (for example, encoding a target gene) and creating a double-strand break in the specified polynucleotide sequence. Typically, a double-strand break (DSB) is repaired by an error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) process, resulting in a nonfunctional polynucleotide sequence that may be unable to express the endogenous gene.
В некоторых вариантах осуществления искусственная нуклеаза выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN), подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN) и CRISPR/Cas (например, CRISPR/Cas9).In some embodiments, the artificial nuclease is selected from the group consisting of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas (eg, CRISPR/Cas9).
Способы получения клетки (например, Т-клетки) согласно настоящему изобретению могут включать этап направленной интеграции кассеты экспрессии в эндогенный ген (например, эндогенный ген αцепи TCR и/или эндогенный ген β-цепи TCR). При использовании в настоящем документе термин кассета экспрессии относится к полинуклеотидной последовательности (например, ДНК полинуклеотидной последовательности), включающей одну или более полинуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более генов, представляющих интерес, таким образом, указанные представляющие интерес гены способны экспрессироваться. Эндогенные последовательности могут способствовать экспрессии кассеты экспрессии, и/или транскрипция контрольных последовательностей в кассете экспрессии может способствовать экспрессии. Например, кассета экспрессии может содержать полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению или полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR согласно настоящему изобретению, функционально связанную с последовательностью регуляции экспрессии, например, промоторной или энхансерной последовательностью. Один или более генов, представляющих интерес, могут быть расположены между одним или более наборами сайтов рестрикции. Предпочтительно сайты рестрикции могут облегчать интеграцию кассеты экспрессии, например, в вектор, плазмиду или геномную ДНК (например, геномную ДНК клетки-хозяина).Methods for producing a cell (eg, T cell) according to the present invention may include the step of targeting integration of an expression cassette into an endogenous gene (eg, an endogenous TCR α chain gene and/or an endogenous TCR β chain gene). As used herein, the term expression cassette refers to a polynucleotide sequence (eg, a DNA polynucleotide sequence) comprising one or more polynucleotide sequences encoding one or more genes of interest, such that the genes of interest are capable of being expressed. Endogenous sequences may promote expression of the expression cassette, and/or transcription of control sequences within the expression cassette may promote expression. For example, an expression cassette may comprise a polynucleotide sequence of the present invention or a polynucleotide sequence encoding a TCR of the present invention operably linked to an expression regulatory sequence, such as a promoter or enhancer sequence. One or more genes of interest may be located between one or more sets of restriction sites. Preferably, restriction sites may facilitate integration of the expression cassette, for example, into a vector, plasmid or genomic DNA (eg, host cell genomic DNA).
Например, кассета экспрессии настоящего изобретения может быть перенесена из первой полинуклеотидной последовательности, например, в векторе, в другую путем 'разреза', например вырезания, кассеты экспрессии с использованием одной или нескольких подходящих рестриктаз и 'вставки', например интеграции, кассеты экспрессии во вторую полинуклеотидную последовательность.For example, an expression cassette of the present invention may be transferred from a first polynucleotide sequence, for example in a vector, to another by 'cutting', for example excision, the expression cassette using one or more suitable restriction enzymes and 'inserting', for example integrating, the expression cassette into the second polynucleotide sequence.
Кассета экспрессии может включать полинуклеотид настоящего изобретения. Кассета экспрессии может включать полинуклеотид, кодирующий один или более TCR-рецепторов настоящего изобретения. Кассета экспрессии может дополнительно включать ген устойчивости к антибиотикам или другой селективный маркерный ген, который позволяет идентифицировать клетки, которые успешно интегрировали кассету экспрессии в свою ДНК. Полинуклеотидные последовательности, содержащиеся в кассете экспрессии, могут быть функционально связаны с последовательностями регуляции экспрессии, например, подходящей промоторной или энхансерной последовательностью. Специалист в данной области сумеет выбрать подходящие последовательности регуляции экспрессии.The expression cassette may include a polynucleotide of the present invention. The expression cassette may include a polynucleotide encoding one or more TCR receptors of the present invention. The expression cassette may further include an antibiotic resistance gene or other selectable marker gene that allows the identification of cells that have successfully integrated the expression cassette into their DNA. The polynucleotide sequences contained in the expression cassette may be operably linked to expression control sequences, for example, a suitable promoter or enhancer sequence. One skilled in the art will be able to select appropriate expression control sequences.
В настоящем изобретении также предусмотрена клетка, экспрессирующая TCR настоящего изобретения, которая была генетически модифицирована с целью прерывания одного или более эндогенных генов МНС. Прерывание эндогенного гена МНС может снижать или предотвращать экспрессию МНС на поверхности генетически модифицированных клеток. Таким образом, такая генетически модифицированная клетка со сниженной или отсутствующей экспрессией МНС будеть обладать ограниченной или не будет обладать способностью презентировать антигены на своей клеточной поверхности. Такая клетка особенно предпочтительна для адоптивного переноса клеток, поскольку такая клетка не будет аллореактивной, например, клетка не будет презентировать антигены, которые могут распознаваться иммунной системой субъекта, получающего адоптивно переносимую клетку. В результате перенесенная клетка не будет распознаваться как 'чужая', и можно будет избежать нежелательного иммунного ответа против клетки. Такую клетку называют 'универсальной клеткой', так как она подходит для адоптивного переноса во множество различных хозяев независимо от типа HLA.The present invention also provides a cell expressing the TCR of the present invention that has been genetically modified to interrupt one or more endogenous MHC genes. Interruption of the endogenous MHC gene can reduce or prevent MHC expression on the surface of genetically modified cells. Thus, such a genetically modified cell with reduced or absent MHC expression will have limited or no ability to present antigens on its cell surface. Such a cell is particularly preferred for adoptive cell transfer because the cell will not be alloreactive, eg, the cell will not present antigens that can be recognized by the immune system of the subject receiving the adoptively transferred cell. As a result, the transferred cell will not be recognized as 'foreign', and an unwanted immune response against the cell can be avoided. Such a cell is called a 'universal cell' because it is suitable for adoptive transfer into many different hosts regardless of HLA type.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ получения неаллореактивной универсальной Т-клетки, которая экспрессирует TCR настоящего изобретения. Кроме того, в настоящем изобретении предложена неаллореактивная универсальная Т-клетка, которая экспрессирует TCR настоящего изобретения.Thus, the present invention provides a method for producing a non-alloreactive universal T cell that expresses the TCR of the present invention. In addition, the present invention provides a non-alloreactive generic T cell that expresses the TCR of the present invention.
В настоящем изобретении также предусмотрены клетки, которые были генетически модифицированы с целью прерывания еще одного из эндогенных генов для модификации клетки с целью улучшения выгодных свойств, характеристик или функций клетки и/или уменьшения нежелательных свойств, характеристик или функций. Например, путем прерывания эндогенного гена клетки можно изменять персистирование, размножение, активность, устойчивость к сигналам истощения/старения/ингибирования, хоуминг-способность или другие функции клетки. При использовании в данном контексте термин 'модифицировать' относится к изменению одной или более характеристик по сравнению с эквивалентной немодифицированной клеткой, например, клеткой, в которой не был прерван эндогенный ген. Например, изменение может быть увеличением, улучшением или введением характеристики или функции клетки по сравнению с эквивалентной немодифицированной клеткой. В альтернативе изменение может бытьThe present invention also provides cells that have been genetically modified to interrupt yet another of the endogenous genes to modify the cell to improve beneficial properties, characteristics or functions of the cell and/or reduce undesirable properties, characteristics or functions. For example, by interrupting an endogenous gene of a cell, persistence, proliferation, activity, resistance to exhaustion/senescence/inhibition signals, homing ability, or other functions of the cell can be altered. When used in this context, the term 'modify' refers to a change in one or more characteristics compared to an equivalent unmodified cell, for example, a cell in which the endogenous gene has not been interrupted. For example, the change may be an increase, improvement, or introduction of a characteristic or function of the cell compared to an equivalent unmodified cell. Alternatively, the change could be
- 105 045443 уменьшением, супрессией или устранением характеристики или функции клетки по сравнению с эквивалентной немодифицированной клеткой.- 105 045443 reduction, suppression or elimination of a characteristic or function of a cell compared to an equivalent unmodified cell.
Полинуклеотиды и векторы настоящего изобретения можно переносить в определенные субпопуляции Т-клеток, включающие CD4 и/или CD8, наивные, стволовые Т-клетки памяти, центральной памяти, эффекторные клетки памяти или эффекторные клетки, или в другие клеточные субпопуляции, например, с получением другой продолжительности персистирования in vivo и функции в клетках настоящего изобретения.The polynucleotides and vectors of the present invention can be transferred into certain subsets of T cells, including CD4 and/or CD8, naïve, stem memory T cells, central memory T cells, effector memory cells or effector cells, or into other cell subsets, e.g. duration of persistence in vivo and function in the cells of the present invention.
Полинуклеотиды и векторы настоящего изобретения также можно переносить в субпопуляции Тклеток, такие как наивные, стволовые Т-клетки памяти, клетки центральной памяти, эффекторные клетки памяти, эффекторы.The polynucleotides and vectors of the present invention can also be transferred into subpopulations of T cells, such as naive, stem memory T cells, central memory cells, effector memory cells, effectors.
Полинуклеотиды и векторы настоящего изобретения также можно переносить в субпопуляции Т-клеток с разной поляризацией, такие как Th0/Tc0, Th1/Tc1, Th2/Tc2, Th17, Th22 или другие, в зависимости от цитокинового фона, наиболее подходящего для направленного воздействия на опухоль конкретного типа.The polynucleotides and vectors of the present invention can also be transferred into subpopulations of T cells with different polarizations, such as Th0/Tc0, Th1/Tc1, Th2/Tc2, Th17, Th22 or others, depending on the cytokine background most suitable for targeting the tumor specific type.
Кроме того, полинуклеотиды и векторы настоящего изобретения, кодирующие антигенспецифичные области TCR-рецепторов настоящего изобретения, можно переносить в другие клеточные субпопуляции, в том числе гамма/дельта Т-клетки, NK-клетки, NKT-клетки, гемопоэтические стволовые клетки или другие клетки с целью получения терапевтического эффекта.In addition, the polynucleotides and vectors of the present invention encoding the antigen-specific regions of the TCR receptors of the present invention can be transferred into other cell subpopulations, including gamma/delta T cells, NK cells, NKT cells, hematopoietic stem cells, or other cells with in order to obtain a therapeutic effect.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения клетки, который включает этап трансдукции клетки in vitro или ex vivo вектором настоящего изобретения. Различные способы трансдукции клетки вектором известны в уровне техники (см., например, Sambrook et al.).In addition, the present invention provides a method for producing a cell, which includes the step of transducing the cell in vitro or ex vivo with a vector of the present invention. Various methods for transducing a cell with a vector are known in the art (see, for example, Sambrook et al.).
В настоящем изобретении также предложен способ получения Т-клетки, экспрессирующей TCR согласно изобретению, посредством индукции дифференцировки стволовой клетки, которая включает полинуклеотид или вектор настоящего изобретения.The present invention also provides a method for producing a T cell expressing a TCR of the invention by inducing differentiation of a stem cell that includes a polynucleotide or vector of the present invention.
Популяция клеток может быть селективно очищена с обогащением клетками, которые демонстрируют определенный фенотип или характеристику, и очищена от других клеток, которые не демонстрируют такой фенотип или характеристику, или демонстрируют его в меньшей степени. Например, популяция клеток, которая экспрессирует специфический маркер (например, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 или CCR4), может быть очищена из исходной популяции клеток. Альтернативно или дополнительно популяция клеток, которая не экспрессирует другой маркер, может быть очищена.A population of cells can be selectively purified to be enriched for cells that exhibit a particular phenotype or characteristic, and purified from other cells that do not exhibit that phenotype or characteristic, or exhibit it to a lesser extent. For example, a population of cells that expresses a specific marker (eg, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3, or CCR4) can be purified from the original cell population. Alternatively or additionally, a population of cells that does not express the other marker may be purified.
Под обогащением популяции клеток клетками определенного типа следует понимать, что концентрация клеток такого типа в популяции увеличивается. Концентрация других типов клеток может одновременно с этим уменьшаться.By enriching a cell population with cells of a certain type, it should be understood that the concentration of cells of this type in the population increases. The concentration of other cell types may decrease at the same time.
Очистка или обогащение могут привести к получению популяции клеток, по существу не содержащей других типов клеток.Purification or enrichment may result in a population of cells substantially free of other cell types.
Очистка или обогащение популяции клеток, экспрессирующих специфический маркер (например, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 или CCR4), может быть выполнена при использовании средства, которое связывается с таким маркером, предпочтительно по существу специфично связывается с таким маркером. Средство, которое связывается с клеточным маркером, может быть антителом, например, антителом, которое связывается с CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 или CCR4.Purification or enrichment of a population of cells expressing a specific marker (eg, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 or CCR4) can be accomplished by using an agent that binds to such marker, preferably binds substantially specifically to such marker . The agent that binds to the cell marker may be an antibody, for example an antibody that binds to CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 or CCR4.
Термин антитело относится к полным антителам или фрагментам антител, способным связываться с выбранной мишенью и включающим Fv, ScFv, F(ab') и F(ab')2, моноклональные и поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, включая химерные, CDR-перивитые и гуманизированные антитела, а также искусственно отобранные антитела, полученные с применением фагового дисплея или альтернативных методов.The term antibody refers to complete antibodies or antibody fragments capable of binding to a selected target and includes Fv, ScFv, F(ab') and F(ab') 2 , monoclonal and polyclonal antibodies, recombinant antibodies, including chimeric, CDR-peri-vital and humanized antibodies, as well as artificially selected antibodies obtained using phage display or alternative methods.
Кроме того, в изобретении также могут применяться альтернативы природным антителам, например авитела, авимеры, антикалины, нанотела и дарпины.In addition, alternatives to natural antibodies, such as avitels, avimers, anticalins, nanobodies and darpins, can also be used in the invention.
Средства, которые связываются со специфическими маркерами, могут быть помечены с возможностью идентификации с использованием любого из различных способов, известных в уровне техники. Средство может изначально содержать метку или может быть модифицировано путем конъюгирования метки с ним. Под конъюгированием следует понимать, что средство и метка функционально связаны. Это означает, что средство и метка соединены таким способом, который позволяет им выполнять свою функцию (например, связывание с маркером, обеспечение возможности флуоресцентной идентификации или разделения при помещении в магнитное поле) по существу беспрепятственно. Подходящие способы конъюгирования известны в данной области и могут быть с легкостью определены специалистом.Agents that bind to specific markers can be identifiably labeled using any of various methods known in the art. The agent may initially contain a label or may be modified by conjugating a label to it. By conjugation it is meant that the agent and the label are operably linked. This means that the agent and the tag are connected in a manner that allows them to perform their function (eg, binding to a marker, enabling fluorescent identification, or separation when placed in a magnetic field) substantially unimpeded. Suitable conjugation methods are known in the art and can be readily determined by one skilled in the art.
Метка может позволять детектировать и/или очищать из своего окружения, например, меченое средство и любую клетку, с которой оно связано (например, средство может быть помечено магнитной сферой или аффинной меткой, такой как авидин). Детектируемые маркеры, подходящие для применения в качестве метки, включают флуорофоры (например, зеленый, mCherry, голубой и оранжевый флуоресцентные белки) и пептидные метки (например, His-метки, Мус-метки, FLAG-метки и НА-метки).The label may allow detection and/or purification from its environment, for example, of the labeled agent and any cell to which it is associated (for example, the agent may be labeled with a magnetic sphere or an affinity label such as avidin). Detectable markers suitable for use as a label include fluorophores (eg, green, mCherry, cyan and orange fluorescent proteins) and peptide tags (eg, His tags, Myc tags, FLAG tags and HA tags).
В уровне техники известен ряд методик для разделения популяции клеток, экспрессирующих специфический маркер. К ним относятся технологии разделения на основе магнитных сфер (например, раз- 106 045443 деление на основе магнитных сфер с замкнутым циклом), проточная цитометрия, сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS), очистка с использованием аффинной метки (например, с использованием аффинных колонок или сфер, таких как биотиновые колонки, для разделения меченных авидином средств) и способы на основе микроскопии.A number of techniques are known in the art for separating a population of cells expressing a specific marker. These include magnetic bead separation technologies (e.g., closed loop magnetic bead separation), flow cytometry, fluorescence activated cell sorting (FACS), affinity tag purification (e.g., affinity columns). or spheres, such as biotin columns, for separation of avidin-labeled agents) and microscopy-based methods.
Также можно проводить разделение при использовании комбинации различных методов, таких как этап разделения на основе магнитных сфер с последующей сортировкой полученной популяции клеток на один или более дополнительных (положительных или отрицательных) маркеров с помощью проточной цитометрии.Separation can also be achieved using a combination of different methods, such as a magnetic bead-based separation step followed by sorting the resulting cell population for one or more additional (positive or negative) markers using flow cytometry.
Разделение для клинического применения может быть выполнено, например, при использовании системы CliniMACS® (Miltenyi). Она является примером технологии разделения на основе магнитных сфер с замкнутым циклом.Separations for clinical use can be performed, for example, using the CliniMACS® system (Miltenyi). It is an example of closed-loop magnetic sphere separation technology.
Также предусмотрено, что свойства вытеснения красителя (например, боковая популяция или мечение родамином) или ферментативная активность (например, активность ALDH) могут использоваться для обогащения ГСК.It is also contemplated that dye displacement properties (eg, side population or rhodamine labeling) or enzymatic activity (eg, ALDH activity) can be used to enrich HSCs.
Химерные молекулыChimeric molecules
В другом аспекте настоящего изобретения предложена химерная молекула, включающая TCR настоящего изобретения, TCR, кодируемый полинуклеотидом настоящего изобретения или его частью, конъюгированная с неклеточным субстратом. Конъюгирование может быть ковалентным или нековалентным.In another aspect of the present invention, a chimeric molecule is provided comprising a TCR of the present invention, a TCR encoded by a polynucleotide of the present invention or a portion thereof, conjugated to a non-cellular substrate. Conjugation can be covalent or non-covalent.
Неклеточный субстрат может быть наночастицей, экзосомой или любым неклеточным субстратом, известным в уровне техники.The non-cellular substrate can be a nanoparticle, an exosome, or any non-cellular substrate known in the art.
Химерная молекула настоящего изобретения может быть растворимой.The chimeric molecule of the present invention may be soluble.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена химерная молекула, включающая TCR настоящего изобретения, TCR, кодируемый полинуклеотидом настоящего изобретения или его частью, конъюгированная с токсином или антителом.In another aspect of the present invention, a chimeric molecule is provided comprising a TCR of the present invention, a TCR encoded by a polynucleotide of the present invention or a portion thereof, conjugated to a toxin or antibody.
Токсин или антитело могут быть цитотоксическими. Токсин может быть цитотоксической молекулой или соединением, например, радиоактивной молекулой или соединением. Компонент TCR химерной молекулы может придавать способность распознавать клетки, экспрессирующие белок или пептиды WT1. Таким образом, химерная молекула может специфично распознавать и/или связываться с WT1экспрессирующими опухолевыми клетками. Таким образом, химерные молекулы настоящего изобретения могут обеспечивать WT1-направленную доставку цитотоксических токсинов, антител и/или соединений.The toxin or antibody may be cytotoxic. The toxin may be a cytotoxic molecule or compound, such as a radioactive molecule or compound. The TCR component of the chimeric molecule may confer the ability to recognize cells expressing WT1 protein or peptides. Thus, the chimeric molecule can specifically recognize and/or bind to WT1-expressing tumor cells. Thus, the chimeric molecules of the present invention can provide WT1-directed delivery of cytotoxic toxins, antibodies and/or compounds.
WT1-ассоциированные заболевания.WT1-associated diseases.
WT1 широко экспрессируется на различных гемобластных и солидных опухолях и при этом демонстрирует ограниченную экспрессию на различных здоровых тканях (например, гонадах, матке, почке, мезотелии, клетках-предшественниках в различных тканях). Авторы настоящего изобретения идентифицировали и определили аминокислотные последовательности TCR-рецепторов, которые распознают пептиды WT1. Кроме того, продемонстрировали, что Т-клетки, экспрессирующие TCR-рецепторы согласно настоящему изобретению, направленно воздействуют и убивают клетки, которые презентируют пептид WT1 или экспрессируют белок WT1 на повышенных уровнях.WT1 is widely expressed on a variety of hematological and solid tumors, while showing limited expression on various healthy tissues (eg, gonads, uterus, kidney, mesothelium, progenitor cells in various tissues). The present inventors have identified and determined the amino acid sequences of TCR receptors that recognize WT1 peptides. In addition, it has been demonstrated that T cells expressing the TCR receptors of the present invention target and kill cells that present WT1 peptide or express WT1 protein at elevated levels.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, который включает этап введения TCR, выделенного полинуклеотида, вектора или клетки согласно настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В настоящем изобретении также предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, который включает этап введения клетки, полученной с применением способа настоящего изобретения, нуждающемуся в этом субъекту.Thus, the present invention provides a method of treating and/or preventing a disease associated with the expression of WT1, which includes the step of administering a TCR, isolated polynucleotide, vector or cell according to the present invention to a subject in need thereof. The present invention also provides a method of treating and/or preventing a disease associated with the expression of WT1, which includes the step of administering a cell obtained using the method of the present invention to a subject in need thereof.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен TCR настоящего изобретения, выделенный полинуклеотид настоящего изобретения, вектор настоящего изобретения, клетка согласно настоящему изобретению или клетка, полученная с применением способа настоящего изобретения, для применения в лечении и/или предотвращении заболевания, связанного с экспрессией WT1.The present invention further provides a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, or a cell obtained using the method of the present invention, for use in treating and/or preventing a disease associated with WT1 expression.
Термин 'предотвращение' служит для обозначения предупреждения, задержки, воспрепятствования или торможения развития заболевания. Лечение, например, может предотвратить или уменьшить вероятность развития или возникновения заболевания, связанного с экспрессией WT1.The term 'prevention' is used to mean preventing, delaying, preventing or inhibiting the development of a disease. Treatment, for example, can prevent or reduce the likelihood of developing or causing a disease associated with WT1 expression.
'Лечение' при использовании в настоящем документе относится к уходу за больным субъектом с целью уменьшения тяжести, устранения или уменьшения симптомов заболевания, или для снижения, остановки или задержки развития заболевания.'Treatment' as used herein refers to the care of a diseased subject to reduce the severity, eliminate or reduce the symptoms of a disease, or to reduce, stop or delay the progression of a disease.
Субъектом может быть человек, участвующий в исследовании. Участвующий в исследовании человек может быть ребенком. Например, возраст ребенка может составлять меньше 10 лет, меньше 9 лет, меньше 8 лет, меньше 7 лет, меньше 6 лет, меньше 5 лет, меньше 4 лет, меньше 3 лет или меньше 2 лет. Участвующий в исследовании человек может быть грудным ребенком.A subject may be a person participating in a study. The person participating in the study may be a child. For example, the child's age may be less than 10 years, less than 9 years, less than 8 years, less than 7 years, less than 6 years, less than 5 years, less than 4 years, less than 3 years, or less than 2 years. The person participating in the study may be an infant.
Ранее могли определить, что субъект нуждается в TCR, выделенном полинуклеотиде, векторе или клетке согласно настоящему изобретению или клетке, полученной способом согласно настоящему изо- 107 045443 бретению на основе экспрессии WT1. Например, субъект может иметь популяцию клеток, которая демонстрирует повышенную экспрессию WT1 по сравнению с популяцией здоровых контрольных клеток. Различные методы, известные в уровне техники, могут использоваться для определения экспрессии WT1, например, количественная ОТ-ПЦР может применяться для определения количества РНК-транскрипта WT1, которое указывает на экспрессию белка WT1. Специалисту в данной области также будет очевидно, что экспрессия белка WT1 может быть определена путем проведения вестерн-блоттинга с использованием доступных в продаже антител, специфичных к WT1.Previously, a subject may have been determined to require a TCR, isolated polynucleotide, vector or cell of the present invention, or a cell produced by the method of the present invention based on WT1 expression. For example, a subject may have a population of cells that exhibit increased expression of WT1 compared to a population of healthy control cells. Various methods known in the art can be used to determine WT1 expression, for example, quantitative RT-PCR can be used to determine the amount of WT1 RNA transcript, which is indicative of WT1 protein expression. It will also be apparent to one skilled in the art that WT1 protein expression can be determined by performing Western blotting using commercially available WT1-specific antibodies.
У субъекта также может быть ранее выявлено наличие изменения (например, мутации или делеции) в гене WT1. Такое изменение может быть наследственным. Таким образом, заболевание, связанное с экспрессией WT1, может быть наследственным заболеванием. Примеры наследственных заболеваний, связанных с экспрессией WT1, включают, без ограничения перечисленными, синдром WAGR (опухоль Вильмса, аниридия, аномалии мочеполовой системы, задержка умственного развития), синдром ДенисаДраша (DDS), синдром Фрейзера (FS), синдром аномалий мочеполовой системы (аномалии репродуктивной функции и мочевыделительной системы).The subject may also have previously been identified as having a change (eg, mutation or deletion) in the WT1 gene. This change may be hereditary. Thus, the disease associated with WT1 expression may be an inherited disease. Examples of inherited diseases associated with WT1 expression include, but are not limited to, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary abnormalities, mental retardation), Denis Drush syndrome (DDS), Fraser syndrome (FS), genitourinary abnormalities syndrome (anomalies reproductive function and urinary system).
Субъекты с наследственными заболеваниями, связанными с экспрессией WT1, могут подвергаться более высокому риску развития пролиферативного нарушения (например, рака).Subjects with inherited diseases associated with WT1 expression may be at higher risk of developing a proliferative disorder (eg, cancer).
Заболевание, связанное с экспрессией WT1, может быть пролиферативным нарушением.The disease associated with WT1 expression may be a proliferative disorder.
Пролиферативное нарушение может быть гемобластозом или солидной опухолью. Гемобластоз может быть выбран из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), лимфообластного лейкоза, миелодиспластических синдромов, лимфомы, множественной миеломы, неходжкинской лимфомы и лимфомы Ходжкина.The proliferative disorder may be a hematologic malignancy or a solid tumor. The hemoblastosis may be selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), lymphoblastic leukemia, myelodysplastic syndromes, lymphoma, multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma and Hodgkin's lymphoma.
Солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака легкого, рака молочной железы, рака пищевода, рака желудка, рака толстой кишки, холангиокарциномы, рака поджелудочной железы, рака яичника, злокачественных опухолей головы и шеи, синовиальной саркомы, ангиосаркомы, остеогенной саркомы, рака щитовидной железы, рака эндометрия, нейробластомы, рабдомиосаркомы, рака печени, меланомы, рака предстательной железы, рака почки, саркомы мягких тканей, уротелиального рака, рака желчных протоков, глиобластомы, мезотелиомы, рака шейки матки и рака толстой и прямой кишки.The solid tumor may be selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, head and neck malignancies, synovial sarcoma, angiosarcoma, osteogenic sarcoma, thyroid cancer, endometrial cancer, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, liver cancer, melanoma, prostate cancer, kidney cancer, soft tissue sarcoma, urothelial cancer, bile duct cancer, glioblastoma, mesothelioma, cervical cancer and colorectal cancer.
Заболевание, связанное с экспрессией WT1, может быть выбрано из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), лимф областного лейкоза, миелодиспластических синдромов, лимфомы, множественной миеломы, неходжкинской лимфомы и лимфомы Ходжкина, рака легкого, рака молочной железы, рака пищевода, рака желудка, рака толстой кишки, холангиокарциномы, рака поджелудочной железы, рака яичника, злокачественных опухолей головы и шеи, синовиальной саркомы, ангиосаркомы, остеогенной саркомы, рака щитовидной железы, рака эндометрия, нейробластомы, рабдомиосаркомы, рака печени, меланомы, рака предстательной железы, рака почки, саркомы мягких тканей, уротелиального рака, рака желчных протоков, глиобластомы, мезотелиомы, рака шейки матки и рака толстой и прямой кишки.The disease associated with WT1 expression may be selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), lymphatic leukemia, myelodysplastic syndromes, lymphoma, multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma and Hodgkin's lymphoma, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, malignant tumors of the head and neck, synovial sarcoma, angiosarcoma, osteogenic sarcoma, thyroid cancer, endometrial cancer, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, liver cancer , melanoma, prostate cancer, kidney cancer, soft tissue sarcoma, urothelial cancer, bile duct cancer, glioblastoma, mesothelioma, cervical cancer and colorectal cancer.
Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.
TCR-рецепторы настоящего изобретения, полинуклеотиды настоящего изобретения, векторы настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения, клетки, полученные способами настоящего изобретения, химерные молекулы настоящего изобретения и смешанная популяция клеток настоящего изобретения могут быть включены в лекарственную форму для введения субъектам с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. Подходящие носители и разбавители включают изотонические физиологические растворы, например фосфатно-солевой буферный раствор, и могут содержать человеческий сывороточный альбумин.The TCR receptors of the present invention, polynucleotides of the present invention, vectors of the present invention, cells of the present invention, cells produced by methods of the present invention, chimeric molecules of the present invention, and a mixed population of cells of the present invention can be formulated for administration to subjects with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or an excipient. Suitable carriers and diluents include isotonic saline solutions, such as phosphate-buffered saline, and may contain human serum albumin.
Обращение с продуктами для клеточной терапии предпочтительно осуществляют в соответствии с Международными стандартами FACT-JACIE для клеточной терапии.Cell therapy products are preferably handled in accordance with the FACT-JACIE International Standards for Cell Therapy.
Способ лечения.Method of treatment.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, который включает этап введения TCR настоящего изобретения, выделенного полинуклеотида настоящего изобретения, вектора настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения, клетки, полученной с применением способа настоящего изобретения, химерной молекулы настоящего изобретения или смешанной популяции клеток настоящего изобретения нуждающемуся в этом субъекту.In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating and/or preventing a disease associated with the expression of WT1, which includes the step of administering a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell obtained using the method of the present invention, a chimeric molecules of the present invention or a mixed population of cells of the present invention to a subject in need thereof.
Субъект может быть человеком, участвующим в исследовании. Субъект может быть не относящимся к человеку подопытным животным.The subject may be a person participating in a study. The subject may be a non-human experimental animal.
Субъект может иметь заболевание, связанное с экспрессией WT1. Субъект может подвергаться риску развития заболеваний, связанных с экспрессией WT1. Ранее могло быть определено, что субъект подвергается риску развития заболевания, связанного с экспрессией WT1. Субъект может иметь повышенный риск развития заболевания, связанного с WT1.The subject may have a disease associated with WT1 expression. The subject may be at risk of developing diseases associated with WT1 expression. The subject may have previously been determined to be at risk of developing a disease associated with WT1 expression. The subject may be at increased risk of developing WT1-associated disease.
Повышенный риск может быть определен с помощью генетического исследования и/или изучения семейного анамнеза субъекта. У субъекта могут экспрессироваться генетические маркеры, указывающиеIncreased risk may be determined through genetic testing and/or examination of the subject's family history. The subject may express genetic markers indicating
- 108 045443 на повышенный риск развития заболевания, связанного с экспрессией WT1.- 108 045443 for an increased risk of developing disease associated with WT1 expression.
Таким образом, специалист в данной области будет осведомлен о генетических факторах риска (например, генетических маркерах), связанных с повышенным риском развития заболевания, связанного с WT1. Специалист сумеет применить любой подходящий способ или методику, известные в уровне техники, для определения, подвергается ли субъект повышенному риску развития заболевания, связанного с экспрессией WT1.Thus, one skilled in the art will be aware of genetic risk factors (eg, genetic markers) associated with an increased risk of developing WT1-associated disease. One skilled in the art will be able to employ any suitable method or technique known in the art to determine whether a subject is at increased risk of developing a disease associated with WT1 expression.
Субъект мог ранее проходить лечение от заболевания, связанного с экспрессией WT1. Субъект может находиться в состоянии ремиссии. Субъект может быть резистентным к химиотерапии. Субъект может быть резистентным к терапии антителами против WT1.The subject may have previously been treated for a disease associated with WT1 expression. The subject may be in remission. The subject may be resistant to chemotherapy. The subject may be resistant to anti-WT1 antibody therapy.
В одном варианте осуществления способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, включает этап введения субъекту химиотерапевтического средства. Химиотерапевтическое средство могут вводить субъекту одновременно, последовательно или отдельно с TCR настоящего изобретения, выделенным полинуклеотидом настоящего изобретения, вектором настоящего изобретения, клеткой согласно настоящему изобретению, клеткой, полученной способом настоящего изобретения, или химерной молекулой настоящего изобретения.In one embodiment, a method of treating and/or preventing a disease associated with WT1 expression includes the step of administering a chemotherapeutic agent to a subject. The chemotherapeutic agent may be administered to a subject simultaneously, sequentially or separately with a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell produced by a method of the present invention, or a chimeric molecule of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания, связанного с экспрессией WT1, который включает этап введения смешанной популяции клеток, где смешанная популяция клеток включает множество популяций клеток, каждая из которых экспрессирует разные TCR согласно настоящему изобретению.In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating and/or preventing a disease associated with the expression of WT1, which includes the step of administering a mixed population of cells, where the mixed population of cells includes multiple populations of cells, each of which expresses a different TCR according to the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена смешанная популяция клеток, включающая множество популяций клеток, каждая из которых экспрессирует разные TCR согласно настоящему изобретению.In another aspect of the present invention, a mixed population of cells is provided, including multiple populations of cells, each of which expresses a different TCR according to the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения смешанной популяции клеток, включающей множество популяций клеток, каждая из которых экспрессирует разные TCR согласно настоящему изобретению, где способ включает этап трансдукции клетки in vitro или ex vivo вектором настоящего изобретения.In another aspect of the present invention, there is provided a method of producing a mixed population of cells, including multiple populations of cells, each of which expresses a different TCR according to the present invention, where the method includes the step of transducing the cell in vitro or ex vivo with a vector of the present invention.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена смешанная популяция клеток для применения в лечении и/или предотвращении заболевания, связанного с экспрессией WT1, где смешанная популяция клеток включает множество популяций клеток, каждая из которых экспрессирует разные TCR согласно настоящему изобретению.In another aspect of the present invention, a mixed cell population is provided for use in the treatment and/or prevention of a disease associated with WT1 expression, wherein the mixed cell population comprises a plurality of cell populations each expressing a different TCR of the present invention.
Например, смешанная популяция клеток может включать первую популяцию клеток, экспрессирующую первый TCR настоящего изобретения, и вторую популяцию клеток, экспрессирующую второй TCR настоящего изобретения. Например, смешанная популяция клеток может включать первую популяцию клеток, экспрессирующую первый TCR настоящего изобретения, вторую популяцию клеток, экспрессирующую второй TCR настоящего изобретения, и третью популяцию клеток, экспрессирующую третий TCR настоящего изобретения, и так далее.For example, the mixed population of cells may include a first population of cells expressing a first TCR of the present invention and a second population of cells expressing a second TCR of the present invention. For example, the mixed population of cells may include a first population of cells expressing a first TCR of the present invention, a second population of cells expressing a second TCR of the present invention, and a third population of cells expressing a third TCR of the present invention, and so on.
Каждая популяция клеток смешанной популяции клеток может, например, экспрессировать только один TCR настоящего изобретения. Эндогенные гены TCR популяций клеток в смешанной популяции клеток могут быть прерваны или делетированы. Экспрессия эндогенных генов TCR клеток в смешанной популяции клеток может быть прервана, например, с помощью редактирования генов искусственной нуклеазой.Each cell population of a mixed cell population may, for example, express only one TCR of the present invention. Endogenous TCR genes of cell populations in a mixed population of cells may be interrupted or deleted. Expression of endogenous TCR cell genes in a mixed population of cells can be interrupted, for example, by gene editing with an artificial nuclease.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение TCR настоящего изобретения, выделенного полинуклеотида настоящего изобретения, вектора настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения, клетки, полученной с применением способа настоящего изобретения, химерной молекулы настоящего изобретения или смешанной популяции клетки настоящего изобретения для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с экспрессией WT1.Another aspect of the present invention provides the use of a TCR of the present invention, an isolated polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention, a cell of the present invention, a cell produced using a method of the present invention, a chimeric molecule of the present invention, or a mixed population of a cell of the present invention for the production of a drug for the treatment of a disease. associated with WT1 expression.
Лечение человека, как и ветеринарное лечение, входят в объем настоящего изобретения.Human treatment as well as veterinary treatment are within the scope of the present invention.
Если не указано иное, при практическом осуществлении настоящего изобретения будут использоваться стандартные методики клеточной биологии, молекулярной биологии, гистологии, иммунологии, онкологии, которые находятся в рамках квалификации специалиста в данной области. Такие методики описаны в литературе.Unless otherwise indicated, the practice of the present invention will use standard techniques of cell biology, molecular biology, histology, immunology, oncology, which are within the skill of one skilled in the art. Such techniques are described in the literature.
См., например, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, В., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984)See, for example, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley &Sons; Roe, W., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984)
Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; и Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен в настоящий документ посредством отсылки.Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Each of these general texts is incorporated herein by reference.
Различные предпочтительные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны далее посредством неограничивающих примеров.Various preferred features and embodiments of the present invention will be described below by way of non-limiting examples.
- 109 045443- 109 045443
ПримерыExamples
Пример 1. Получение функциональных WTl-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от здоровых доноров (HD).Example 1. Obtaining functional WTl-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) from healthy donors (HD).
Для идентификации новых TCR-рецепторов, специфичных к эпитопам WT1, рестриктированным различными аллелями HLA, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) десяти разных ЗД стимулировали пулом пентадекапептидов (15-меров) с перекрывающимся участком из 11 аминокислот, охватывающих полную последовательность белка WT1 (см. материалы и методы). Такой дизайн пептидов обеспечивает оптимальную стимуляцию как CD4+, так и CD8+ Т-клеток.To identify new TCR receptors specific for WT1 epitopes restricted by different HLA alleles, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from ten different CDs were stimulated with a pool of pentadecapeptides (15-mers) with an overlapping region of 11 amino acids covering the complete sequence of the WT1 protein (see Fig. Materials and methods). This peptide design provides optimal stimulation of both CD4+ and CD8+ T cells.
После 26-30 ч стимуляции обогащали Т-клетки, экспрессирующие CD137. CD137 является молекулой, апрегулируемой при связывании Т-клеточного рецептора, и ранее было показано, что она является надежным маркером для быстрой идентификации, выделения и размножения in vitro антигенспецифичных CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти и наивных Т-клеток. Затем из CD137-отрицательной фракции удаляли фракцию CD3, затем облуча при 30 Гр и использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток (АПК) для фракции CD137+. Сортированные CD137+ клетки размножали in vitro в течение ~9 дней и повторно стимулировали аутологичными АПК, представленными CD3-элиминированными клетками, или иммортализованными аутологичными В-клетками, нагруженными пулом пептидов, каждые 7-14 дней. Эта процедура привела к обогащению WT1-специфических Т-лимфоцитов, как показывают результаты цитофлуориметрического анализа, представленные на фиг. 1 (a-j). Функциональное исследование Т-клеток проводили в различные моменты времени. Более конкретно, Т-клетки совместно культивировали с аутологичными АПК, нагруженными пулом пептидов, и после 6 часов совместного культивирования экспрессию CD107а и IFNy в популяции Т-клеток определяли путем внутриклеточного окрашивания. Экспрессия CD107а после контакта с антигеном указывает на антиген-индуцированную дегрануляцию и литический потенциал.After 26–30 h of stimulation, T cells expressing CD137 were enriched. CD137 is a T cell receptor binding upregulated molecule and has previously been shown to be a reliable marker for the rapid identification, isolation and in vitro expansion of antigen-specific CD4+ and CD8+ memory and naïve T cells. The CD137-negative fraction was then depleted of the CD3 fraction, then irradiated at 30 Gy, and used as antigen-presenting cells (APCs) for the CD137+ fraction. Sorted CD137+ cells were expanded in vitro for ~9 days and restimulated with autologous APCs presented by CD3-depleted cells or immortalized autologous B cells loaded with a peptide pool every 7-14 days. This procedure resulted in an enrichment of WT1-specific T lymphocytes, as shown by the cytofluorometric analysis results presented in FIG. 1 (a-j). T cell functional studies were performed at various time points. More specifically, T cells were co-cultured with autologous APCs loaded with a pool of peptides, and after 6 hours of co-culture, the expression of CD107a and IFNy in the T cell population was determined by intracellular staining. CD107a expression following antigen exposure indicates antigen-induced degranulation and lytic potential.
В качестве отрицательного контроля клетки стимулировали пулом нерелевантных пептидов. Контрольная стимуляция приводила к минимальной секреции IFNy и CD107а Т-клетками, полученными от каждого здорового донора.As a negative control, cells were stimulated with a pool of irrelevant peptides. Control stimulation resulted in minimal secretion of IFNy and CD107a by T cells obtained from each healthy donor.
Пример 2. Картирование эпитопов WT1, вызывающих Т-клеточный ответ.Example 2: Mapping of WT1 epitopes that induce T cell responses.
Для идентификации эпитопа WT1, распознаваемого Т-клетками, секрецию IFNy определяли количественно после 6 часов совместного культивирования in vitro WT1-стимулированных/обогащенных Тклеток с аутологичными АПК, нагруженными субпулами пептидов, каждый из которых содержал до 12 пептидов согласно сетке картирования. Сетка картирования состоит из 24 субпулов, причем каждый пептид содержится исключительно в двух пересекающихся субпулах (Doubrovina, E. et al. Blood 120, 16331646 (2012)). Результаты приведены на фиг. 2а.To identify the WT1 epitope recognized by T cells, IFNy secretion was quantified after 6 hours of in vitro coculture of WT1-stimulated/enriched T cells with autologous APCs loaded with peptide subpools, each containing up to 12 peptides according to the mapping grid. The mapping grid consists of 24 subpools, with each peptide contained exclusively in two overlapping subpools (Doubrovina, E. et al. Blood 120, 16331646 (2012)). The results are shown in Fig. 2a.
FACS анализ показал значимую экспрессию IFNy и CD107а Т-клетками, полученными от HD1, HD3, HD6, HD7, HD10, после стимуляции субпулами 4, 5 и 16 (Фиг. 2b, d, g, h, k). Значимую экспрессию IFNy наблюдали в случае Т-клеток, полученных от HD2, стимулированных субпулами 6, 16, 17 и 20 (фиг. 2с), тогда как субпулы 4, 5, 6, 14, 18, 21 стимулировали экспрессию IFNy и CD107a в Т-клетках, полученных от HD4 (фиг. 2е), и субпулы 5, 11, 12, 21, 22 стимулировали экспрессию IFNy в HD5 (фиг. 2f). Что касается HD7, дополнительно наблюдали повышенную экспрессию IFNy и CD107а, хотя и на более низком уровне по сравнению с уровнем, наблюдаемым для субпулов 4, 5 и 16, после стимуляции субпулами 7, 8, 20 (фиг. 2h). Кроме того, наблюдали повышенную экспрессию IFNy и CD107а после стимуляции Тклеток, полученных от HD8, субпулами 12 и 14 (Фиг. 2i), и Т-клеток, полученных от HD9, субпулами 5, 13, 21 (фиг. 2j).FACS analysis showed significant expression of IFNy and CD107a by T cells derived from HD1, HD3, HD6, HD7, HD10 after stimulation with subpools 4, 5 and 16 (Fig. 2b, d, g, h, k). Significant IFNy expression was observed in HD2-derived T cells stimulated with subpools 6, 16, 17 and 20 (Fig. 2c), while subpools 4, 5, 6, 14, 18, 21 stimulated IFNy and CD107a expression in T -cells derived from HD4 (Fig. 2e) and subpools 5, 11, 12, 21, 22 stimulated IFNy expression in HD5 (Fig. 2f). For HD7, increased expression of IFNy and CD107a was additionally observed, although at a lower level compared to that observed for subpools 4, 5 and 16, after stimulation with subpools 7, 8, 20 (Fig. 2h). In addition, increased expression of IFNy and CD107a was observed after stimulation of HD8-derived T cells with subpools 12 and 14 (Fig. 2i) and HD9-derived T cells with subpools 5, 13, 21 (Fig. 2j).
После этого полученные от HD Т-клетки стимулировали в течение 6 часов АПК, сенсибилизированными одиночными пентадекапептидами, общими для субпулов, вызывающих самый сильный иммунный ответ, и по меньшей мере одним нерелевантным 15-мером. FACS анализ показал повышенную экспрессию CD107a и/или IFNy для пептидов 40 и 41 в Т-клетках HD1 (Фиг. 3а), пептидов 54, 77, 90 для Тклеток HD2 (фиг. 3b), пептида VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; который является нонамером пептида, представленного в SEQ ID NO: 117) для Т-клеток HD3 (Фиг. 3с), пептидов 17, 18, 99, 100 для HD4 (фиг. 3d, е), пептида 101 для HD5 (фиг. 3f), пептида VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; который является нонамером пептида, представленного в SEQ ID NO: 117) для Т-клеток HD6 (фиг. 3g), пептидов 101, 125 и 137 для Т-клеток HD9 (фиг. 3h), пептида VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; который является нонамером пептида, представленного в SEQ ID NO: 117) для Т-клеток HD10 (фиг. 3i). Таким образом, идентифицировали доминантные иммуногенные последовательности. Никаких релевантных иммунных ответов (т.е. повышенной экспрессии CD107а и/или IFNy) после совместного культивирования с нерелевантными контрольными пептидами не наблюдали. Для HD7 и HD8 из-за сниженного качества клеток было невозможно провести эксперименты по культивированию для идентификации иммуногенных пептидов. Тем не менее, можно было бы предсказать распознаваемый пептид путем деконволюции сетки картирования. Идентифицировали перекрывающуюся последовательность пептидов 41 и 42 (полученных из SP4, 5, 16) и перекрывающуюся последовательность пептидов 91 и 92 (полученных из SP7, 8, 20) для HD7 и пептида 24 для HD8.HD-derived T cells were then stimulated for 6 hours with APCs sensitized with single pentadecapeptides common to the subpools that elicit the strongest immune response and at least one irrelevant 15-mer. FACS analysis showed increased expression of CD107a and/or IFNy for peptides 40 and 41 in HD1 T cells (Fig. 3a), peptides 54, 77, 90 in HD2 T cells (Fig. 3b), peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; which is a nonamer of the peptide presented in SEQ ID NO: 117) for HD3 T cells (Fig. 3c), peptides 17, 18, 99, 100 for HD4 (Fig. 3d, e), peptide 101 for HD5 (Fig. 3f ), peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; which is a nonamer of the peptide presented in SEQ ID NO: 117) for HD6 T cells (Fig. 3g), peptides 101, 125 and 137 for HD9 T cells (Fig. 3h ), peptide VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; which is a nonamer of the peptide presented in SEQ ID NO: 117) for HD10 T cells (Fig. 3i). Thus, dominant immunogenic sequences were identified. No relevant immune responses (i.e. increased expression of CD107a and/or IFNy) were observed after co-culture with irrelevant control peptides. For HD7 and HD8, due to reduced cell quality, it was not possible to perform culture experiments to identify immunogenic peptides. However, it would be possible to predict the recognition peptide by deconvolution of the mapping grid. The overlapping sequence of peptides 41 and 42 (derived from SP4, 5, 16) and the overlapping sequence of peptides 91 and 92 (derived from SP7, 8, 20) for HD7 and peptide 24 for HD8 were identified.
- 110 045443- 110 045443
Для определения HLA-рестрикции иммуногенного пептида WT1, распознаваемого Т-клетками, размноженными от HD4, HD5 и HD10, Т-клетки из них совместно культивировали в течение 6 часов с панелью различных клеток-мишеней EBV-BLCL, каждая из которых экспрессировала разный аллельTo determine the HLA restriction of the WT1 immunogenic peptide recognized by T cells expanded from HD4, HD5, and HD10, T cells from them were cocultured for 6 hours with a panel of different EBV-BLCL target cells, each expressing a different allele
HLA-A или HLA-B, которые сенсибилизировали соответствующим пептидом (пептидом 17 для HD4;HLA-A or HLA-B, which were sensitized with the corresponding peptide (peptide 17 for HD4;
пептидом 101 для HD5; пептидомpeptide 101 for HD5; peptide
VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) для HD10) или нерелевантным контрольным пептидом. Результаты этого эксперимента показали, что пептид 17 презентирован аллелем HLA-B*3502 и распознается Т-клетками, полученными от HD4 (фиг. 3j), пептид 101 презентирован HLA-B*3501 и распознается Т-клетками, полученными от HD5 (фиг. 3 k); пептидVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) for HD10) or an irrelevant control peptide. The results of this experiment showed that peptide 17 is presented by the HLA-B*3502 allele and is recognized by T cells derived from HD4 (Fig. 3j), peptide 101 is presented by HLA-B*3501 and is recognized by T cells derived from HD5 (Fig. 3k); peptide
VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) презентирован HLA-A*0201 и распознается Т-клетками, полученными от HD10 (фиг. 3l).VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) is presented by HLA-A*0201 and is recognized by HD10-derived T cells (Fig. 3l).
Последовательности пептидов WT1, распознаваемых WT1-специфичными Т-клетками, размноженными от HD1-HD10, показаны в табл. 3 ниже.The sequences of WT1 peptides recognized by WT1-specific T cells expanded from HD1-HD10 are shown in Table. 3 below.
Таблица 3Table 3
Пример 3. WT1-специфичные Т-клетки селективно элиминируют клетки, экспрессирующие WT1Example 3: WT1-Specific T Cells Selectively Eliminate WT1-Expressing Cells
Для определения HLA рестрикции WT1-специфичных Т-клеток и их способности элиминировать WT1-экспрессирующие клетки, Т-клетки совместно культивировали с различными клетками-мишенями.To determine HLA restriction of WT1-specific T cells and their ability to eliminate WT1-expressing cells, T cells were cocultured with various target cells.
- 111 045443- 111 045443
T-клетки, полученные от HD1.HD1-derived T cells.
Зная, что HD1 несет аллель HLA-A*0201, обогащенные WTl-специфичные Т-клетки культивировали совместно с различными клетками-мишенями: клетками Т2, сенсибилизированными пулом перекрывающихся пептидов, содержащим пептиды 40 и 41 (см. табл. 3); клетками Т2, сенсибилизированными пулом MelanA/MART1 в качестве отрицательного контроля (пулом Т2 MelanA/MART1); или клетками K562, генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 и оверэкспрессией белка WT1 (K562 HLA-A*0201 WT1).Knowing that HD1 carries the HLA-A*0201 allele, enriched WTl-specific T cells were co-cultured with various target cells: T2 cells sensitized with an overlapping peptide pool containing peptides 40 and 41 (see Table 3); T2 cells sensitized with the MelanA/MART1 pool as a negative control (T2 MelanA/MART1 pool); or K562 cells genetically modified to express the HLA-A*0201 allele and overexpress the WT1 protein (K562 HLA-A*0201 WT1).
После 6 часов совместного культивирования экспрессию CD107а определяли с помощью FACS. Результаты для HD1 указывают на экспрессию CD107а в >60% CD8+ T-клеток после совместного культивирования с клетками Т2, сенсибилизированными пулом WT1 (фиг. 4а). Аналогичным образом, совместное культивирование WT1-специфичных Т-клеток с генетически модифицированными клетками K562 (экспрессиующими аллель HLA-A*0201 и белок WT1) привело к экспрессии CD107a >60% CD8+ Тклетками (фиг. 4а).After 6 h of co-culture, CD107a expression was determined by FACS. Results for HD1 indicate expression of CD107a in >60% of CD8+ T cells after co-culture with T2 cells sensitized with the WT1 pool (Fig. 4a). Similarly, co-culture of WT1-specific T cells with genetically modified K562 cells (expressing the HLA-A*0201 allele and WT1 protein) resulted in >60% CD8+ T cells expressing CD107a (Fig. 4a).
С другой стороны, экспрессия CD107a CD8+ Т-клетками, совместно культивируемыми с клетками Т2, сенсибилизированными пулом отрицательного контроля MelanA/MARTl, была минимальной (фиг. 4а).On the other hand, expression of CD107a by CD8+ T cells co-cultured with T2 cells sensitized with the MelanA/MARTl negative control pool was minimal (Fig. 4a).
Эти результаты демонстрируют, что выделенные Т-клетки, полученные от HD1, специфично распознают пептид WT1, включающий последовательностьThese results demonstrate that isolated HD1-derived T cells specifically recognize the WT1 peptide comprising the sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117), когда он презентирован молекулами МНС, кодируемыми аллелем HLA-A*0201. Кроме того, результаты показывают, что полученные от HD1 Т-клетки способны специфично взаимодействовать с клетками-мишенями, повышенно экспрессирующими белок WT1. Таким образом, эти экспериментальные данные демонстрируют, что TCR-рецепторы, экспрессируемые полученными от HD1 Т-клетками, специфично связываются с пептидами, включающими аминокислотную последовательностьAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) when presented by MHC molecules encoded by the HLA-A*0201 allele. In addition, the results indicate that HD1-derived T cells are able to specifically interact with target cells overexpressing the WT1 protein. Thus, these experimental data demonstrate that TCR receptors expressed by HD1-derived T cells specifically bind to peptides comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117), и что такие TCR-рецепторы HLA-А*0201-рестриктированы.APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117), and that such TCR receptors are HLA-A*0201-restricted.
T-клетки, полученные от HD3.HD3-derived T cells.
Зная, что HD3 несет аллель HLA-A*0201, обогащенные WT1-специфичные Т-клетки культивировали совместно с различными клетками-мишенями: клетками Т2, сенсибилизированными субпулом 16, который, как было ранее определено, содержал иммуногенный пептид, вызывающий иммунный ответ (T2-SP16); клетками Т2, сенсибилизированными пулом MelanA/MART1 в качестве отрицательного контроля (Т2-Melan А); клетками K562 дикого типа (K562) в качестве отрицательного контроля; или клетками K562, генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 и оверэкспрессии белка WT1 (K562 A2+WT1 +).Knowing that HD3 carries the HLA-A*0201 allele, enriched WT1-specific T cells were co-cultured with different target cells: T2 cells sensitized with subpool 16, which was previously determined to contain an immunogenic peptide that induces an immune response (T2 -SP16); T2 cells sensitized with the MelanA/MART1 pool as a negative control (T2-Melan A); wild-type K562 cells (K562) as a negative control; or K562 cells genetically modified to express the HLA-A*0201 allele and overexpress the WT1 protein (K562 A2+WT1 +).
После 4 дней совместного культивирования способность полученных от HD3 Т-клеток убивать клетки-мишени выражали в виде индекса элиминации, вычисленного как общее количество клетокмишеней, оставшихся после совместного культивирования с WT1-специфичными Т-клетками, деленное на общее количество отдельных клеток-мишеней.After 4 days of coculture, the ability of HD3-derived T cells to kill target cells was expressed as the elimination index, calculated as the total number of target cells remaining after coculture with WT1-specific T cells divided by the total number of individual target cells.
Результаты демонстрируют способность WT1-специфичных Т-лимфоцитов элиминировать клеткимишени, экспрессирующие идентифицированный WT1-специфичный эпитоп (Фиг. 4b). В частности, Тклетки, полученные от HD3, элиминировали приблизительно 95% клеток Т2, сенсибилизированных пептидами WT1, включающими аминокислотную последовательностьThe results demonstrate the ability of WT1-specific T lymphocytes to eliminate target cells expressing the identified WT1-specific epitope (Fig. 4b). Specifically, HD3-derived T cells eliminated approximately 95% of T2 cells sensitized with WT1 peptides comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) (субпул 16; SP16). Кроме того, полученные от HD3 Т-клетки элиминировали приблизительно 78% клеток K562, экспрессирующих молекулы МНС, кодируемые аллелем HLA-A*0201, и повышенно экспрессирующих белок WT1. С другой стороны, ни одна из сенсибилизированных пулом отрицательного контроля MelanA/MART1 клеток Т2 не была элиминирована полученными от HD3 Т-клетками. Аналогичным образом, было отмечена минимальная элиминация контрольных клеток дикого типа K562 (фиг. 4b).APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) (subpool 16; SP16). In addition, HD3-derived T cells eliminated approximately 78% of K562 cells expressing MHC molecules encoded by the HLA-A*0201 allele and overexpressing WT1 protein. On the other hand, none of the T2 cells sensitized with the MelanA/MART1 negative control pool were eliminated by HD3-derived T cells. Similarly, minimal elimination of control wild-type K562 cells was noted (Fig. 4b).
Эти результаты демонстрируют, что выделенные Т-клетки, полученные от HD3, специфично распознают пептид WT1, включающий аминокислотную последовательностьThese results demonstrate that isolated HD3-derived T cells specifically recognize the WT1 peptide comprising the amino acid sequence
APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117).APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117).
Кроме того, результаты показывают, что полученные от HD3 Т-клетки способны специфично взаимодействовать и убивать клетки, повышенно экспрессирующие белок WT1 посредством презентации пептида кодируемым HLA-A*0201 МНС. Таким образом, эти экспериментальные данные демонстрируют специфичность к пептиду WT1 TCR-рецепторов, экспрессируемых полученными от HD3 Т-клетками, и что полученные от HD3 TCR-рецепторы являются HLA-A*0201-рестриктированными.In addition, the results indicate that HD3-derived T cells are able to specifically interact with and kill cells overexpressing WT1 protein through presentation of the peptide by the HLA-A*0201-encoded MHC. Thus, these experimental data demonstrate the WT1 peptide specificity of TCRs expressed by HD3-derived T cells and that HD3-derived TCRs are HLA-A*0201-restricted.
T-клетки, полученные от HD4.HD4-derived T cells.
Способность полученных от HD4 Т-клеток элиминировать клетки-мишени оценивали при совместном культивировании Т-клеток с первичными лейкозными бластами (CD33+ клетками), выделенными у пациента с острым миелодным лейкозом (ОМЛ), который был отобран по высокой экспрессии антигена WT1 и HLA-типированию (HLA-B*3502). В качестве отрицательного контроля Т-клетки, полученные от HD4, совместно культивировали с лейкозными бластами пациента с ОМЛ, у которого не экспрессировался аллель HLA-B*3502.The ability of HD4-derived T cells to eliminate target cells was assessed by co-cultivating T cells with primary leukemic blasts (CD33+ cells) isolated from a patient with acute myeloid leukemia (AML) who was selected for high WT1 antigen expression and HLA typing (HLA-B*3502). As a negative control, HD4-derived T cells were cocultured with leukemia blasts from an AML patient who did not express the HLA-B*3502 allele.
- 112 045443- 112 045443
После трех дней совместного культивирования при соотношении эффектора:мишени 10 к 1, FACS анализ показал почти полный клиренс лейкозных бластов (CD33+), полученных у пациента с ОМЛ, экспрессирующего аллель HLA-B*3502, после совместно культивирования с WT1-специфичными Тклетками HD4 (CD3+ клетками) (фиг. 4с, верхняя панель). Фактически только 0,54% оставшейся полной популяции клеток были положительными на экспрессию CD33.After three days of co-culture at an effector:target ratio of 10 to 1, FACS analysis showed almost complete clearance of leukemic blasts (CD33+) obtained from an AML patient expressing the HLA-B*3502 allele after co-culture with WT1-specific HD4 T cells ( CD3+ cells) (Fig. 4c, top panel). In fact, only 0.54% of the remaining total cell population was positive for CD33 expression.
С другой стороны, не наблюдали клиренса CD33+ клеток после совместного культивирования WT1специфичных Т-клеток с нерелевантными контрольными ОМЛ бластами (Фиг. 4с, нижняя панель). Фактически в контрольном образце 7,9% полной популяции клеток были положительными на экспрессию CD33 после совместного культивирования с полученными от HD4 WT1-специфичными Т-клетками.On the other hand, no clearance of CD33+ cells was observed after co-culture of WT1-specific T cells with irrelevant control AML blasts (Fig. 4c, bottom panel). In fact, in the control sample, 7.9% of the total cell population was positive for CD33 expression after coculture with HD4-derived WT1-specific T cells.
Важно отметить, что эти результаты демонстрируют способность WT1-специфичных Т-клеток, полученных от HD4, специфично воздействовать и убивать лейкозные бласты (раковые клетки ОМЛ) с оверэкспрессией WT1 и кодируемый HLA-B*35O2 МНС. Таким образом, TCR-рецепторы, полученные от HD4, способны специфично воздействовать и HLA-В*3502-рестриктированно убивать раковые клетки.Importantly, these results demonstrate the ability of WT1-specific HD4-derived T cells to specifically target and kill leukemic blasts (AML cancer cells) overexpressing WT1 and HLA-B*35O2-encoded MHC. Thus, TCR receptors derived from HD4 are able to specifically target and kill cancer cells in an HLA-B*3502-restricted manner.
Пример 4. Иммунопрофилирование последовательностей Ve для WT1-специфичных Т-клеток.Example 4 Immunoprofiling of Ve sequences for WT1-specific T cells.
Для лучшей идентификации TCR-рецепторов, участвующих в антигенном распознавании WT1специфичными Т-клетками от HD1-6 и 10 (для HD7, HD8 и HD9 анализ Ve иммунопрофилирования было невозможно выполнить из-за сниженного качества клеток) сначала проводили мультипараметрический FACS анализ с целью количественного определения репертуар TCR Ve. Таким образом, с целью определения клональности размножившихся WT1-специфичных Т-клеток использовали набор 10 Test Beta Mark TCR V beta для определения V-бета репертуара согласно рекомендациям производителя. Этот набор позволяет обнаруживать экспрессию 24 различных V-бета генов в восьми отдельных пробирках. В частности, данный метод гарантирует охват 75% полного репертуара V-бета. Результаты FACS окрашивания показали преобладание специфических Ve для HD1, HD2, HD3, HD5, см. фиг. 5. Для HD4, HD6 и HD10 полное определение преобладающих Ve было невозможным, вероятно из-за внутреннего ограничения набора, который включает антитела, охватывающие 75% существующих белков Ve.To better identify the TCR receptors involved in antigen recognition by WT1-specific T cells from HD1-6 and 10 (for HD7, HD8 and HD9 Ve immunoprofiling analysis could not be performed due to reduced cell quality), a multiparametric FACS analysis was first performed to quantify repertoire TCR Ve. Thus, in order to determine the clonality of expanded WT1-specific T cells, the 10 Test Beta Mark TCR V beta kit was used to determine the V-beta repertoire according to the manufacturer's recommendations. This kit allows detection of the expression of 24 different V-beta genes in eight separate tubes. In particular, this method guarantees coverage of 75% of the total V-beta repertoire. FACS staining results showed a predominance of specific Ve for HD1, HD2, HD3, HD5, see Fig. 5. For HD4, HD6, and HD10, complete determination of the predominant Ves was not possible, likely due to an inherent limitation of the kit, which includes antibodies covering 75% of the existing Ve proteins.
Пример 5. Высокопроизводительное секвенирование TCR α- и β-цепей, выделенных из WT1специфичных Т-клеток.Example 5: High-throughput sequencing of TCR α- and β-chains isolated from WT1-specific T cells.
WT1-специфичные Т-клетки собирали в различные моменты времени в течение периода совместного культивирования и выделяли их РНК при использовании набора Arcturus Pico Pure для выделения РНК. Последовательности CDR3 WT1-специфичных Т-клеток амплифицировали при использовании модифицированного метода RACE, в который включали магнитный захват после синтеза кДНК для повышения специфичности реакции и удаления нежелательных матриц (Ruggiero et al. Nat. Commun. 6, 8081 (2015)). Образцы секвенировали при помощи секвенатора Illumina MiSeq и определяли клонотипы CDR3 при использовании программы MiXTCR (Bolotin, DA et al. Nature Methods 12, 380-381 (2015)). Кроме того, также определяли CDR1, CDR2 и CDR3 при использовании средства IMGT V-quest (Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008). PMID: 18503082; Giudicelli, V., Brochet, X., Lefranc, M.-P., Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1; 2011(6). pii: pdb.prot5633. doi: 10.1101/pdb.prot5633. PMID: 21632778. Также см. реферат в буклете IMGT с подробным представлением из протокола Cold Spring Harbor (CSH)).WT1-specific T cells were collected at various time points during the coculture period and their RNA was isolated using the Arcturus Pico Pure RNA Isolation Kit. CDR3 sequences of WT1-specific T cells were amplified using a modified RACE method that included magnetic capture after cDNA synthesis to increase reaction specificity and remove unwanted templates (Ruggiero et al. Nat. Commun. 6, 8081 (2015)). Samples were sequenced using an Illumina MiSeq sequencer and CDR3 clonotypes were determined using the MiXTCR program (Bolotin, DA et al. Nature Methods 12, 380-381 (2015)). In addition, CDR1, CDR2 and CDR3 were also determined using the IMGT V-quest tool (Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008). PMID: 18503082; Giudicelli, V., Brochet , X., Lefranc, M.-P., Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1; 2011(6). pii: pdb.prot5633. doi: 10.1101/pdb.prot5633. PMID: 21632778. Also see abstract in booklet IMGT with detailed representation from the Cold Spring Harbor (CSH) protocol).
Результаты секвенирования продемонстрировали растущее в динамике преобладание специфического CDR3 клонотипа в популяции WT1-специфичных Т-клеток для обеих цепей TCR у HD1-10. Преобладающие генотипы α и β-цепей и последовательности CDR3 представлены на фиг. 6.Sequencing results demonstrated a dynamically increasing predominance of a specific CDR3 clonotype in the population of WT1-specific T cells for both TCR chains in HD1-10. The predominant α and β chain genotypes and CDR3 sequences are shown in FIG. 6.
Кроме того, определяли полноразмерные аминокислотные последовательности α и β-цепи TCRрецепторов, полученных от HD1-10, см. табл. 1. Также определяли соответствующие нуклеотидные последовательности, см. табл. 2.In addition, the full-length amino acid sequences of the α and β chains of TCR receptors obtained from HD1-10 were determined, see table. 1. The corresponding nucleotide sequences were also determined, see table. 2.
Пример 6. Функциональная проверка недавно идентифицированных TCR-рецепторов.Example 6: Functional Validation of Newly Identified TCR Receptors.
α и β последовательности TCR-рецепторов, выделенных у HD1 и HD3 и распознающих пептид WT1α and β sequences of TCR receptors isolated from HD1 and HD3 and recognizing the WT1 peptide
VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157), презентированный аллелем HLA-A*0201, клонировали в лентивирусный вектор под контролем двунаправленного промотора для получения стабильной и скоординированной экспрессии обеих цепей TCR в трансдуцированных лимфоцитах. Т-клетки здорового донора трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим TCR HD1 или TCR HD3. В качестве контроля клетки также трансдуцировали WT1 126-134 TCR. Трансдуцированные Т-клетки функционально проверяли при совместном культивировании с различными клетками-мишенями, представленными клетками Т2, сенсибилизированными одним из 2 распознаваемых пептидов (VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) для TCR HD1 и HD3;VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157), presented by the HLA-A*0201 allele, was cloned into a lentiviral vector under the control of a bidirectional promoter to obtain stable and coordinated expression of both TCR chains in transduced lymphocytes. T cells from a healthy donor were transduced with a viral vector encoding TCR HD1 or TCR HD3. As a control, cells were also transduced with WT1 126-134 TCR. Transduced T cells were functionally tested by co-culture with various target cells, represented by T2 cells sensitized with one of 2 recognition peptides (VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) for TCR HD1 and HD3;
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) для WT1 126-134 TCR) (фиг. 7а), клетками K562 дикого типа или генетически модифицированными для экспрессии аллеля HLA-A*0201 (фиг. 7b), первичными бластами ОМЛ, полученными у 3 пациентов с ОМЛ и отобранными по экспрессии аллеля HLA-A*0201 и экспрессии WT1 (фиг. 7с). После 3 дней со- 113 045443 вместного культивирования наблюдали способность каждой популяции трансдуцированных Т-клеток специфично распознавать пептид-мишень, презентированный аллелем HLA-A*0201 (фиг. 7а), и более высокий потенциал Т-клеток HD1 при опосредовании почти полной элиминации генетически модифицированных клеток K562. Более высокая способность TCR HD1 распознавать антиген-мишень также подтверждали результатами совместно культивирования с Paml бластами. В данном случае наблюдали более полную элиминацию обоих бластов pAML, несущих аллель HLA-A*0201, при совместном культивированием с Т-клетками TR HD1 по сравнению с условиями, при которых HD3 TR и WT1 126-134 TR Тлимфоциты использовали в качестве эффекторных клеток.RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) for WT1 126-134 TCR) (Fig. 7a), wild-type K562 cells or genetically modified to express the HLA-A*0201 allele (Fig. 7b), primary AML blasts obtained from 3 patients with AML and selected for HLA-A*0201 allele expression and WT1 expression (Fig. 7c). After 3 days of co-culture, the ability of each transduced T cell population to specifically recognize the target peptide presented by the HLA-A*0201 allele was observed (Fig. 7a), and the higher potential of HD1 T cells to mediate almost complete genetic elimination modified K562 cells. The higher ability of TCR HD1 to recognize target antigen was also confirmed by co-culture results with Paml blasts. In this case, more complete elimination of both pAML blasts carrying the HLA-A*0201 allele was observed when co-cultured with TR HD1 T cells compared to conditions in which HD3 TR and WT1 126-134 TR T lymphocytes were used as effector cells.
Материалы и методыMaterials and methods
Последовательность белка WT1, ранее опубликованную Гесслером с соавт. (Gessler, M. et al. (1990) Nature 343: 774-778), использовали для получения пептидов, используемых для стимуляции и выделения WT1-специфичных Т-клеток. Эта последовательность содержит 575 аминокислот и включает на N-конце первые 126 аминокислот, отсутствующие в изоформе WT1 (экзон 5+, KTS+). Создавали 141 пентадекапептид, охватывающий полную последовательность белка WT1, каждый из которых перекрывается с 11 аминокислотами следующего петида.The WT1 protein sequence previously published by Gessler et al. (Gessler, M. et al. (1990) Nature 343: 774-778) was used to prepare peptides used to stimulate and isolate WT1-specific T cells. This sequence contains 575 amino acids and includes at the N-terminus the first 126 amino acids that are absent in the WT1 isoform (exon 5+, KTS+). We created 141 pentadecapeptides spanning the entire WT1 protein sequence, each of which overlaps 11 amino acids of the next peptide.
Пептиды синтезировали с помощью PRIMM согласно спецификациям подтвержденной последовательности, с 70% чистотой, стерильностью и отсутствием эндотоксина. Эти пептиды смешивали в равных количествах в пул WT1 при концентрации 1 мкг/мл каждого пептида. Кроме того, получали 24 субпула, каждый из которых содержал до 12 пептидов (4,17 мкг/мл каждого пептида) согласно определенной матрице картирования, чтобы каждый пептид был включен только в два перекрывающихся субпула, как показано в табл. 4 (см. стратегию с использованием сетки картирования в публикации Doubrovina, E. et al. Blood 120, 1633-1646 (2012)).Peptides were synthesized using PRIMM according to sequence verified specifications, with 70% purity, sterility, and endotoxin-free. These peptides were mixed in equal amounts into the WT1 pool at a concentration of 1 μg/ml of each peptide. In addition, 24 subpools were obtained, each containing up to 12 peptides (4.17 μg/ml of each peptide) according to a defined mapping matrix, so that each peptide was included in only two overlapping subpools, as shown in Table. 4 (see grid mapping strategy in Doubrovina, E. et al. Blood 120, 1633-1646 (2012)).
Таблица 4Table 4
SPl SP2 SP3 SP4 SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12SPl SP2 SP3 SP4 SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови.Isolation of peripheral blood mononuclear cells.
Периферическую кровь забирали у десяти здоровых доноров в клинике Сан-Раффаэле при получении информированного согласия. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гипака.Peripheral blood was collected from ten healthy donors at the San Raffaele Clinic after obtaining informed consent. Peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation.
Иммортализованные В клетки.Immortalized B cells.
Аутологичные В-клетки выделяли из МКПК здоровых доноров при использовании микросфер CD19 (Miltenyi Biotech). Клетки трансдуцировали лентивирусным вектором, несущим трансген BCL6/BCL-XL (Kwakkenbos, M. J. et al. Nat. Med.16, 123 (2009)) и псевдотип H/F (Levy, C. et al. Molecular Therapy20 9, 1699-1712, (2012)), и культивировали в IMDM с добавкой 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), пенициллин-стрептомицина и 10 нг/мл IL21 (Miltenyi Biotech). В-клетки повторно стимулировали каждые 5 дней при совместном культивировании с облученными (50 Гр) мышиными Lфибробластами, экспрессирующими CD40L (3T3-CD40L), при соотношении В-клетки:3Т3-CD40L 10:1.Autologous B cells were isolated from PBMCs from healthy donors using CD19 microspheres (Miltenyi Biotech). Cells were transduced with a lentiviral vector carrying the BCL6/BCL-XL transgene (Kwakkenbos, M. J. et al. Nat. Med. 16, 123 (2009)) and the H/F pseudotype (Levy, C. et al. Molecular Therapy 20 9, 1699-1712 , (2012)), and cultured in IMDM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin and 10 ng/ml IL21 (Miltenyi Biotech). B cells were restimulated every 5 days in coculture with irradiated (50 Gy) murine CD40L-expressing L fibroblasts (3T3-CD40L) at a B cell:3T3-CD40L ratio of 10:1.
Клеточные линии.Cell lines.
Клеточные линии Т2 и K562 культивировали в 1640 RPMI (GIB CO-БАРРЕЛЬ) с добавкой пенициллина, стрептомицина, глутамина и 10% FBS (BioWhittaker).T2 and K562 cell lines were cultured in 1640 RPMI (GIB CO-BARREL) supplemented with penicillin, streptomycin, glutamine and 10% FBS (BioWhittaker).
Лейкозные клетки.Leukemia cells.
Первичные клетки ОМЛ были получены из биобанка лейкоза клиники Сан-Раффаэле (OSR) и отобраны по экспрессии WT1 с помощью количественной PCR и HLA типированию. Все EBV-BLCL и первичные лейкозные клетки типировали по аллелям HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR и HLA-DQ в высоком разрешении в HLA лаборатории OSR.Primary AML cells were obtained from the Leukemia Biobank of the San Raffaele Clinic (OSR) and selected for WT1 expression using quantitative PCR and HLA typing. All EBV-BLCL and primary leukemia cells were typed for HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR and HLA-DQ alleles at high resolution in the OSR HLA laboratory.
Проточная цитометрия.Flow cytometry.
Использовали конъюгированные с ФИТЦ, ФЭ, PerCP, АФЦ, ФЭ-CyChrome 7, АФЦ-CyChrome 7Pacific Blue и Brillant Violet антитела к CD3, CD4, CD8, CD107a, IFNy, TNFa, CD33, CD117, CD34, CD14, Ve21.3, Ve8, Ve7.2 и HLA-A2 человека. Флуоресцентно меченный АФЦ WT1We used antibodies conjugated to FITC, PE, PerCP, AFC, PE-CyChrome 7, AFC-CyChrome 7Pacific Blue and Brillant Violet to CD3, CD4, CD8, CD107a, IFNy, TNFa, CD33, CD117, CD34, CD14, Ve21.3, Ve8, Ve7.2 and human HLA-A2. Fluorescently labeled AFC WT1
VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) и флуоресцентно меченный ФЭ WT1VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) and fluorescently labeled PE WT1
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) декстрамеры использовали согласно инструкциям производителя. Клетки инкубировали с антите- 114 045443 лами в течение 15 минут при 4°С и промывали фосфатно-солевым буферным раствором, содержащимRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) dextramers were used according to the manufacturer's instructions. Cells were incubated with antibodies for 15 minutes at 4°C and washed with phosphate-buffered saline containing
1% FBS. Образцы вводили в проточный цитофлуориметр для сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) Canto II (BD Biosciences) и анализировали полученные данные с помощью программы Flow Jo (Tree star Inc). Для внутриклеточной оценки секреции цитокинов и экспрессии маркеров дегрануляции использовали набор Fix/Perm buffer set (Biolegend) согласно инструкциям производителя.1% FBS. Samples were injected into a Canto II fluorescence-activated cell sorting (FACS) flow cytometer (BD Biosciences) and the resulting data were analyzed using Flow Jo software (Tree star Inc). For intracellular assessment of cytokine secretion and expression of degranulation markers, a Fix/Perm buffer set (Biolegend) was used according to the manufacturer's instructions.
Стимуляция, выделение и размножение WT1-специфичных Т клетокStimulation, isolation and expansion of WT1-specific T cells
Свежие выделенные МКПК ресуспендировали в X-VIVO с добавкой 5% АВ человеческой сыворотки, 2 мМ глутамина и 1 мкг/мл моноклонального антитела к CD28, сеяли при плотности 107 клеток/мл и стимулировали пулом перекрывающихся пептидов WT1, каждый пептид присутствовал в концентрации 1 мкг/мл.Freshly isolated PBMCs were resuspended in X-VIVO supplemented with 5% human serum AB, 2 mM glutamine and 1 μg/ml anti-CD28 monoclonal antibody, seeded at a density of 10 7 cells/ml and stimulated with a pool of overlapping WT1 peptides, each peptide present at a concentration of 1 µg/ml.
Антигенспецифичные Т-клетки выделяли через 26-30 ч по экспрессии CD137. В частности, клетки окрашивали ФЭ-конъюгированным антителом к CD137 и сортировали с использованим микросфер против ФЭ (Miltenyi Biotech). Из фракции CD137- клеток CD3 клетки элиминировали при использовании CD3-микросфер (Miltenyi Biotech), облучали при 30 Гр и использовали в качестве нагруженных пептидами АПК при сокультуре с CD137+ фракцией в соотношении 100:1 по возможности, или по меньшей мере 20:1, и конечной плотности 5x10 клеток/мл. В качестве среды использовали X-VIVO с добавкой 5% АВ человеческой сыворотки, 5 нг/мл IL7, 5 нг/мл IL15 и 10 нг/мл IL21. Среды, содержащие цитокины, меняли каждые 2-3 дня.Antigen-specific T cells were isolated after 26–30 h based on CD137 expression. Specifically, cells were stained with PE-conjugated anti-CD137 antibody and sorted using anti-PE microspheres (Miltenyi Biotech). From the CD137 - cell fraction, CD3 cells were eliminated using CD3 microspheres (Miltenyi Biotech), irradiated at 30 Gy and used as peptide-loaded APCs in coculture with the CD137 + fraction in a ratio of 100:1 if possible, or at least 20:1. and a final density of 5x10 cells/ml. The medium used was X-VIVO supplemented with 5% AB human serum, 5 ng/ml IL7, 5 ng/ml IL15 and 10 ng/ml IL21. Media containing cytokines were changed every 2-3 days.
Повторная стимуляция размноженных антигенспецифичных T-клеток.Re-stimulation of expanded antigen-specific T cells.
Клетки повторно стимулировали каждые 7-14 дней WT1-сенсибилизированными аутологичными АПК (МКПК без CD3-клеток; иммортализованные В-клетки). При первых рестимуляциях клетки промывали, и через 2 дня сеяли в среду без цитокинов. АПК облучали при 30 Гр, сенсибилизировали пулом пептидов в течение ночи и совместно культивировали с эффекторными клетками в Х-VIVO с добавкой 5% АВ человеческой сывороткой, 1 мкг/мл моноклонального антитела к CD28 и IL7 (5 нг/мл), IL15 (5 нг/мл), IL21 (10 нг/мл).Cells were restimulated every 7–14 days with WT1-sensitized autologous APCs (CD3 cell-free PBMCs; immortalized B cells). During the first restimulations, the cells were washed and 2 days later they were plated in a medium without cytokines. APCs were irradiated at 30 Gy, sensitized with a pool of peptides overnight and co-cultured with effector cells in X-VIVO supplemented with 5% AB human serum, 1 μg/ml monoclonal antibody to CD28 and IL7 (5 ng/ml), IL15 (5 ng/ml), IL21 (10 ng/ml).
Оценка T-клеточного ответа.Assessment of T-cell response.
Процент Т-клеток, отвечающих на пул пептидов WT1, измеряли путем 6-часового совместного культивирования эффекторных клеток с аутологичными АПК (при соотношении по меньшей мере 1:1), сенсибилизироваными нужным антигеном (пул пептидов WT1, субпулы WT1, отдельные пептиды WT1, нерелевантный пул пептидов в качестве контроля). Сокультуры сеяли в X-VIVO с добавкой 5% АВ человеческой сыворотки и моноклонального антитела к CD28 (1 мкг/мл), Golgi Stop (BD) и ФИТЦ-антитела к CD107а для оценки дегрануляции. Затем клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали внутриклеточно для определения процента CD3+CD8+или CD3+CD4+ клеток, экспрессирующих IFNy и CD 107а.The percentage of T cells responding to the WT1 peptide pool was measured by co-cultivating effector cells for 6 hours with autologous APCs (at least 1:1 ratio) sensitized with the desired antigen (WT1 peptide pool, WT1 subpools, individual WT1 peptides, irrelevant pool of peptides as control). Cocultures were inoculated in X-VIVO supplemented with 5% AB human serum and monoclonal antibody to CD28 (1 μg/ml), Golgi Stop (BD) and FITC antibody to CD107a to assess degranulation. Cells were then fixed, permeabilized, and stained intracellularly to determine the percentage of CD3 + CD8 + or CD3 + CD4 + cells expressing IFNγ and CD 107a.
Картирование иммуногенных пептидов.Mapping of immunogenic peptides.
Т-клетки, стимулированные пулом WT1, сеяли в разные лунки и совместно культивировали с аутологичными АПК, нагруженными одним из каждого субпула WT1 в соотношении по меньшей мере 1:1. Тклеточные ответы против каждого субпула измеряли, как описано ранее, с помощью FACS анализа. Деконволюция сетки картирования была крайне важна для определения, какие из общих пептидов вызывали Т-клеточный ответ. После определения иммуногенных пептидов, Т-клетки дополнительно стимулировали АПК, нагруженными отдельными пептидами, чтобы подтвердить их иммуногенность.T cells stimulated with the WT1 pool were seeded into different wells and cocultured with autologous APCs loaded with one of each WT1 subpool in a ratio of at least 1:1. Tcellular responses against each subpool were measured as previously described using FACS analysis. Deconvolution of the mapping grid was critical to determining which of the common peptides elicited a T cell response. After identifying immunogenic peptides, T cells were further stimulated with APCs loaded with individual peptides to confirm their immunogenicity.
Оценка способности Т-клеток распознавать WT1-экспрессирующие клетки.Assessing the ability of T cells to recognize WT1-expressing cells.
WT1-специфичность и HLA-рестриктированную способность Т-клеток распознавать клеткимишени измеряли с помощью различных экспериментальных процедур. Для Т-клеток, полученных от HD1, секрецию CD107а определяли с помощью FACS анализа после 6 часов совместного культивирования с клетками-мишенями; для Т-клеток, полученных от HD3, вычисляли индекс элиминации как общее количество клеток-мишеней, оставшихся после 4 дней совместного культивирования с WT1специфичными Т-клетками, деленное на общее количество отдельных клеток-мишеней; для Т-клеток, полученных от HD4, процент CD33+ клеток-мишеней (первичные клетки ОМЛ, несущие представляющие интерес аллели HLA, и, в качестве контроля, первичные клетки ОМЛ, не несущие специфический аллель HLA), оставшихся после 3 дней совместного культивирования с CD3+ WT1-специфичными Тклетками, оценивали с помощью цитофлуориметрического анализа.WT1 specificity and HLA-restricted ability of T cells to recognize target cells were measured using various experimental procedures. For HD1-derived T cells, CD107a secretion was determined by FACS analysis after 6 hours of co-culture with target cells; for HD3-derived T cells, the elimination index was calculated as the total number of target cells remaining after 4 days of coculture with WT1-specific T cells divided by the total number of individual target cells; for HD4-derived T cells, the percentage of CD33+ target cells (primary AML cells carrying the HLA allele of interest and, as a control, primary AML cells not carrying the specific HLA allele) remaining after 3 days of coculture with CD3+ WT1-specific T cells were assessed using cytofluorometric analysis.
Оценка клональности Т-клеток.Assessment of T cell clonality.
Для определения клональности размноженных WT1-специфичных Т-клеток использовали набор IO Test Beta Mark TCR V beta repertoire согласно рекомендациям производителя.To determine the clonality of expanded WT1-specific T cells, the IO Test Beta Mark TCR V beta repertoire kit was used according to the manufacturer's recommendations.
Секвенирование репертуара TCR.Sequencing of the TCR repertoire.
WT1-специфичные Т-клетки собирали в различные точки времени в течение периода совместного культивирования и выделяли РНК с помощью набора для выделения РНК Arcturus PicoPure. Последовательности определяющей комплементарность области (CDR) 3 WT1-специфичных Т-клеток амплифицировали с помощью модифицированного метода RACE (Ruggiero, E. et al. Nat. Commun. 6,8081 (2015)). Образцы секвенировали при использовании секвенатора IlluminaMiSeq и определяли клонотипы CDR3 при использовании программы MiXCR (Bolotin, DA et al. Nature Methods 12, 380-381 (2015)).WT1-specific T cells were collected at various time points during the coculture period and RNA was isolated using the Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit. Complementarity determining region (CDR) 3 sequences of WT1-specific T cells were amplified using a modified RACE method (Ruggiero, E. et al. Nat. Commun. 6.8081 (2015)). Samples were sequenced using an IlluminaMiSeq sequencer and CDR3 clonotypes were determined using the MiXCR program (Bolotin, DA et al. Nature Methods 12, 380-381 (2015)).
- 115 045443- 115 045443
Лентивирусные векторы.Lentiviral vectors.
Гены α- и β-цепи TCR, выделенные от HD1 и HD3, оптимизировали по кодонам, модифицировали остатками цистеина и клонировали в лентивирусный вектор (LV) под контролем двунаправленного промотора. Аминокислотные (ак) и нуклеотидные (нт) последовательности являлись следующими:TCR α- and β-chain genes isolated from HD1 and HD3 were codon optimized, modified with cysteine residues, and cloned into a lentiviral vector (LV) under the control of a bidirectional promoter. The amino acid (aa) and nucleotide (nt) sequences were as follows:
- 116 045443- 116 045443
- 117 045443- 117 045443
LV векторы упаковывали при использовании интеграза-компетентной конструкции третьего поколения и псевдотипировали с помощью оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV). В качестве контроля включали LV, кодирующий WT1 126-134 TCR, распознающий пептидLV vectors were packaged using a third-generation integrase-competent construct and pseudotyped with vesicular stomatitis virus (VSV) envelope. LV encoding WT1 126-134 TCR recognition peptide was included as a control
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255).RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255).
Векторные трансдукции.Vector transductions.
Для трансдукции WT1-TCR лентивирусным вектором Т-клетки, выделенные у здорового лица, активировали и сортировали с использованием магнитных сфер, конъюгированных с антителами к CD3 и CD28 (ClinExVivo CD3/CD28; Invitrogen), согласно инструкциям производителя и культивировали в среде Дульбекко в модификации Искова (IMDM) (GIBCO-BRL) с добавкой пенициллина, стрептомицина, 10% FBS и по 5 нг/мл IL-7 и IL-15 (PeproTech). Для трансдукции Т-клетки сеяли при плотности 2,5х106 клеток/мл и заражали LV в течение 24 ч. Затем Т-клетки культивировали при плотности 106 клеток/мл и размножали. Эффективность трансдукции определяли путем измерения процента CD3 Т-клеток, экспрессирующих определенные декстрамеры. Клетки сортировали при использовании флуоресцентно меченного АФЦ или ФЭ HLA-A*0201 декстрамера, специфичного к пептидуFor transduction of WT1-TCR with a lentiviral vector, T cells isolated from a healthy individual were activated and sorted using anti-CD3 and anti-CD28 antibody-conjugated magnetic beads (ClinExVivo CD3/CD28; Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and cultured in Dulbecco's modified medium Iskova (IMDM) (GIBCO-BRL) with the addition of penicillin, streptomycin, 10% FBS and 5 ng/ml IL-7 and IL-15 (PeproTech). For transduction, T cells were seeded at a density of 2.5 x 10 6 cells/ml and infected with LV for 24 hours. T cells were then cultured at a density of 10 6 cells/ml and expanded. Transduction efficiency was determined by measuring the percentage of CD3 T cells expressing specific dextramers. Cells were sorted using fluorescently labeled APC or PE HLA-A*0201 peptide-specific dextramer
VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) илиVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) or
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) (Immudex) при использовании микросфер против АФЦ или против ФЭ (Miltenyi Biotec) согласно инструкциям производителя.RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) (Immudex) when using anti-AFC or anti-PE microspheres (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions.
- 118 -- 118 -
Claims (36)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/489,226 | 2017-04-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045443B1 true EA045443B1 (en) | 2023-11-27 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11597755B2 (en) | TCR and peptides | |
| JP7451858B2 (en) | Claudin 6-specific immune receptors and T cell epitopes | |
| KR102457504B1 (en) | Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers | |
| CN109476726B (en) | Fusion proteins for use in the treatment of HvG disease | |
| US11713346B2 (en) | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and T cell epitopes | |
| US10538572B2 (en) | T cell immunotherapy specific for WT-1 | |
| US20230041030A1 (en) | Antigen-binding proteins targeting shared neoantigens | |
| WO2008059252A9 (en) | Methods and composition fro t cell receptors which recognize 5t4 antigen | |
| AU2017205637A1 (en) | Compositions and libraries comprising recombinant T-cell receptors and methods of using recombinant T-cell receptors | |
| US20220289849A1 (en) | Car for use in the treatment of hvg disease | |
| Davari et al. | Development of a CD8 co-receptor independent T-cell receptor specific for tumor-associated antigen MAGE-A4 for next generation T-cell-based immunotherapy | |
| US20220119477A1 (en) | Tcr and peptides | |
| TWI835730B (en) | Tcr and peptides | |
| EA045443B1 (en) | TCR AND PEPTIDES |