EA045394B1 - METHOD FOR CONSTRUCTION OF CHIMERIC PLASMID LIBRARY - Google Patents

METHOD FOR CONSTRUCTION OF CHIMERIC PLASMID LIBRARY Download PDF

Info

Publication number
EA045394B1
EA045394B1 EA202192652 EA045394B1 EA 045394 B1 EA045394 B1 EA 045394B1 EA 202192652 EA202192652 EA 202192652 EA 045394 B1 EA045394 B1 EA 045394B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dna
types
plasmids
dna fragment
plasmid
Prior art date
Application number
EA202192652
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Кендзи Цуге
Дзун Исии
Акихико Кондо
Original Assignee
Нэшнл Юниверсити Корпорейшн Кобе Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нэшнл Юниверсити Корпорейшн Кобе Юниверсити filed Critical Нэшнл Юниверсити Корпорейшн Кобе Юниверсити
Publication of EA045394B1 publication Critical patent/EA045394B1/en

Links

Description

В связи с прогрессом в синтетической биологии возрастает потребность в длинноцепочечной ДНК, в которой связаны множество генов. При конструировании последовательности для длинноцепочечной ДНК маловероятно, что представляющий интерес результат может быть достигнут посредством конструирования последовательности за один раз, поскольку обязательно необходимо изучить множество параметров экспрессии, таких как выбор используемого типа гена или выбор интенсивности экспрессии гена. Таким образом, во многих случаях конструирование последовательности проводят в условиях проведения цикла DBTL (цикл моделирования-конструирования-тестирования-изучения), в котором сначала моделируют длинноцепочечную ДНК, затем длинноцепочечную ДНК конструируют, затем длинноцепочечную ДНК тестируют, ее содержимое изучают, и конструируют новую ДНК на основе полученных данных. Для изучения множества параметров экспрессии одновременно в этом цикле DBTL является желательным с точки зрения эффективности способ комбинаторной библиотеки для отбора одного варианта выбора из множества вариантов выбора для каждого параметра экспрессии и связывания каждого из них для конструирования различных типов длинноцепочечных ДНК. Иными словами, проще установить направление моделирования ДНК для каждого параметра экспрессии в более коротком цикле путем одновременного конструирования и сравнения множества типов длинноцепочечных ДНК с варьированием каждого параметра экспрессии, чем сконструировать и протестировать только одну длинноцепочечную ДНК.With advances in synthetic biology, there is an increasing need for long-stranded DNA in which many genes are linked. When designing a sequence for long-stranded DNA, it is unlikely that the result of interest can be achieved by designing the sequence in one go, since it is necessary to examine many expression parameters, such as the choice of the type of gene used or the choice of the intensity of gene expression. Thus, in many cases, sequence design is carried out in a DBTL (design-build-test-learn) cycle, in which long-stranded DNA is first modeled, then long-stranded DNA is designed, then long-stranded DNA is tested, its contents are studied, and new DNA is constructed. based on the data obtained. To study multiple expression parameters simultaneously in this DBTL cycle, a combinatorial library method for selecting one choice from multiple choices for each expression parameter and linking each of them to construct different types of long-stranded DNA is desirable from an efficiency standpoint. In other words, it is easier to establish a DNA modeling direction for each expression parameter in a shorter cycle by simultaneously constructing and comparing multiple types of long-stranded DNA while varying each expression parameter than to design and test only one long-stranded DNA.

Однако синтез длинноцепочечной ДНК, как правило, вовлекает расходы и отнимает время, и часто является трудным конструирование множества длинноцепочечных ДНК. Для конструирования длинноцепочечной ДНК используют способ сборки множества фрагментов генов для получения множества коротких фрагментов ДНК с функциональным элементом гена и т.п. в качестве индексного и связывание (сборку) их для конструирования, например, поскольку длина ДНК, которая может быть обеспечена посредством химического синтеза, составляет только приблизительно 200 оснований. Для этого типа способа сборки фрагментов ДНК были разработаны различные способы, включая способ OGAB (патентные документы 1: выложенная публикация Японии № 2004-129654, непатентный документ 1: Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res.31, e133 (2003)), способ SLIC (непатентный документ 2: Li MZ, Elledge SJ (2007) Nature Methods 4:251-256), способ Golden Gate (непатентный документ 3: Engler, С. et al. PLoS ONE (2008)), способ Gibson Assembly (непатентный документ 4: Gibson, D. G., et al. Nat. Methods, 6, 343-345. (2009)), способ LCR (непатентный документ 5: de Kok, S. et al. ACS Synth. Biol. (2014)), способ сборки генов с использованием почкующихся дрожжей (непатентный документ 6: Gibson, D. G., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008) и т.п.However, the synthesis of long-stranded DNA generally involves expense and time, and it is often difficult to construct multiple long-stranded DNAs. To construct long-strand DNA, a method of assembling multiple gene fragments to produce multiple short DNA fragments with a functional element of a gene and the like is used. as an index and linking (assembling) them for construction, for example, since the length of DNA that can be provided through chemical synthesis is only about 200 bases. For this type of DNA fragment assembly method, various methods have been developed, including the OGAB method (Patent Documents 1: Japan Laid-Open Publication No. 2004-129654, Non-Patent Document 1: Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res.31, e133 (2003 )), SLIC method (non-patent document 2: Li MZ, Elledge SJ (2007) Nature Methods 4:251-256), Golden Gate method (non-patent document 3: Engler, S. et al. PLoS ONE (2008)), method Gibson Assembly (Non-Patent Document 4: Gibson, D. G., et al. Nat. Methods, 6, 343-345. (2009)), LCR Method (Non-Patent Document 5: de Kok, S. et al. ACS Synth. Biol. ( 2014)), a method for assembling genes using budding yeast (Non-Patent Document 6: Gibson, D. G., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008), etc.

Для легкого предоставления множества типов длинноцепочечной ДНК при низких расходах является возможным одновременное получение множества коротких фрагментов ДНК, каждый из которых имеет отличающийся параметр экспрессии, для применения в этой сборке генов и связывания их комбинационным образом с получением комбинаторной библиотеки. В описанном выше способе сборки генов разработан способ конструирования комбинаторной библиотеки.To easily provide multiple types of long-stranded DNA at low cost, it is possible to simultaneously produce multiple short DNA fragments, each having a different expression parameter, for use in a gene assembly and link them in a combinatorial manner to produce a combinatorial library. In the gene assembly method described above, a method for constructing a combinatorial library is developed.

Кроме того, является необходимым, чтобы генотип длинноцепочечной ДНК соответствовал ее фенотипу, при тестировании комбинаторной библиотеки длинноцепочечной ДНК, обеспечиваемой этими способами, и изучении направления конструирования параметров экспрессии. В общепринятом конструировании комбинаторной библиотеки, главным образом, существует два способа. Первым способом является конструирование одного типа длинноцепочечной ДНК в виде одной генной сборки. В этом случае генную сборку с использованием отличающегося материала проводят индивидуально столько раз, чтобы присутствовало соответствие комбинаторной библиотеке. Этот способ имеет преимущество, состоящее в том, что является возможным быстрое получение соответствующего фенотипа даже без отдельного подтверждения генотипа в тесте, поскольку заранее может быть установлено, какая генная сборка приводит к какому генотипу. Однако этот способ имеет недостаток, состоящий в том, что трудно увеличить масштаб. Вторым способом является смешение всех материалов, подлежащих применению в комбинаторной библиотеке, и конструирование библиотеки с одной генной сборкой. Этот способ имеет преимущество, состоящее в том, что может быть без труда получена крупномасштабная комбинаторная библиотека. Однако является необходимым индивидуальное подтверждение последовательности оснований посредством секвенирования, чтобы знать генотип клона, отобранного из этой библиотеки, и чем длиннее цепь ДНК, тем больше времени отнимает подтверждение последовательности оснований. Таким образом, этот способ имеет проблему, состоящую в том, что этот тест представляет собой скоростьопределяющую стадию.In addition, it is necessary that the genotype of the long-stranded DNA matches its phenotype when testing a combinatorial library of long-stranded DNA provided by these methods and studying the direction of designing expression parameters. In conventional combinatorial library construction, there are mainly two methods. The first method is to construct one type of long-stranded DNA as a single gene assembly. In this case, gene assembly using different material is carried out individually so many times that there is a match to the combinatorial library. This method has the advantage that it is possible to quickly obtain the corresponding phenotype even without separate confirmation of the genotype in the test, since it can be determined in advance which gene assembly leads to which genotype. However, this method has the disadvantage that it is difficult to scale up. The second method is to mix all the materials to be used in a combinatorial library and construct a library with a single gene assembly. This method has the advantage that a large-scale combinatorial library can be easily obtained. However, individual confirmation of the base sequence by sequencing is necessary to know the genotype of the clone selected from this library, and the longer the DNA strand, the more time-consuming it takes to confirm the base sequence. Therefore, this method has the problem that this test is a rate-determining step.

Список литературы.Bibliography.

Патентная литература.Patent literature.

[PL1] Выложенная публикация Японии № 2004-129654 (патент Японии № 4479199).[PL1] Japanese Publication Released No. 2004-129654 (Japanese Patent No. 4479199).

Непатентные документы.Non-patent documents.

[NPL 1] Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res.31, e133, 2003.[NPL 1] Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res.31, e133, 2003.

- 1 045394- 1 045394

[NPL 2] Li MZ, Elledge SJ, Nature Methods 4:251-256, 2007.[NPL 2] Li MZ, Elledge SJ, Nature Methods 4:251-256, 2007.

[NPL 3] Engler, C. et al. PLoS ONE, 2008.[NPL 3] Engler, C. et al. PLoS ONE, 2008.

[NPL 4] Gibson, D. G., et al. Nat. Methods, 6, 343-345., 2009.[NPL 4] Gibson, D. G., et al. Nat. Methods, 6, 343-345., 2009.

[NPL 5] de Kok, S. et al. ACS Synth. Biol., 2014.[NPL 5] de Kok, S. et al. ACS Synth. Biol., 2014.

[NPL 6] Gibson, D. G., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008.[NPL 6] Gibson, D. G., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Техническая проблема.Technical problem.

В этих обстоятельствах проблемой, решаемой посредством настоящего изобретения, является предоставление нового способа получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, посредством которого может быть эффективно сконструирована комбинаторная библиотека длинноцепочечной ДНК и посредством которого может быть быстро получена комбинаторная библиотека длинноцепочечной ДНК для следующего цикла DBTL даже без подтверждения последовательности оснований, которое является скорость-определяющей стадией.In these circumstances, the problem solved by the present invention is to provide a new method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells, by which a combinatorial long-chain DNA library can be efficiently constructed, and by which a combinatorial long-chain DNA library can be quickly obtained for the next round of DBTL even without confirmation base sequence, which is the rate-determining step.

Решение проблемы.Solution to the problem.

Является предпочтительным использование способа сборки множества фрагментов генов, как описано выше, для эффективного конструирования комбинаторной библиотеки длинноцепочечной ДНК. Однако, независимо от типа способа сборки генов, является важной сборка фрагментов генов в равном количестве, иными словами, важно, чтобы молярная концентрация всех фрагментов генов была равной. Однако трудно эффективно сконструировать комбинаторную библиотеку, состоящую из множества вариантов выбора, с использованием способа сборки генов, поскольку является трудным довести молярную концентрацию множества фрагментов генов, в частности, более 10, до равной молярной концентрации.It is preferable to use a method for assembling multiple gene fragments as described above to efficiently construct a combinatorial long-stranded DNA library. However, regardless of the type of gene assembly method, it is important that the gene fragments are assembled in equal numbers, in other words, it is important that the molar concentration of all gene fragments be equal. However, it is difficult to efficiently construct a combinatorial library consisting of multiple selections using a gene assembly method because it is difficult to bring the molar concentration of multiple gene fragments, particularly more than 10, to an equal molar concentration.

Фрагменты генов, которые являются материалами для проведения сборки генов, как правило, необходимо получать по одному для каждого фрагмента. Кроме того, при объединении этих фрагментов так, чтобы они присутствовали в равной молярной концентрации, концентрацию по массе ДНК измеряют и количество, подлежащее добавлению, определяют посредством вычисления на основе длины фрагмента ДНК. Однако является чрезвычайно трудным точно объединить фрагменты в эквимолярных концентрациях вследствие ошибки измерения концентрации ДНК, ошибки при отборе ДНК в пипетку и т.п. Между тем, когда сборку, которая находится в состоянии плазмиды после сборки, расщепляют ферментом рестрикции до исходного материала, полученный материал находится в идеальном эквимолярном состоянии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, если его фактически вновь использовать для сборки, эффективность сборки повышается в 100 раз или более по сравнению описанным выше случаем, где фрагменты ДНК вручную объединяют и собирают (Tsuge, NAR, 2003). Более того, в случае сборки, которая расщеплена на выбранные фрагменты путем расщепления ферментом рестрикции, даже когда последовательность оснований выбранных фрагментов не идентифицирована, присутствие фактической ДНК позволяет конструирование комбинаторной библиотеки путем смешения выбранных фрагментов с выбранным фрагментом, происходящим из другой сборки, полученной аналогичным образом. У авторов настоящего изобретения из этого результата возникла идея осуществления высокоэффективного способа конструирования комбинаторной библиотеки длинноцепочечной ДНК по настоящему изобретению.Gene fragments, which are the materials for carrying out gene assembly, usually need to be obtained one for each fragment. In addition, when these fragments are combined so that they are present in equal molar concentration, the concentration by weight of the DNA is measured and the amount to be added is determined by calculation based on the length of the DNA fragment. However, it is extremely difficult to accurately combine fragments at equimolar concentrations due to error in measuring DNA concentration, error in pipetting DNA, and the like. Meanwhile, when the assembly, which is in a plasmid state after assembly, is digested by a restriction enzyme into the starting material, the resulting material is in a perfect equimolar state. The inventors of the present invention have found that if it is actually reused for assembly, the assembly efficiency is increased by 100 times or more compared with the case described above where DNA fragments are manually combined and assembled (Tsuge, NAR, 2003). Moreover, in the case of an assembly that is cleaved into selected fragments by restriction enzyme digestion, even when the base sequence of the selected fragments is not identified, the presence of actual DNA allows the construction of a combinatorial library by mixing the selected fragments with a selected fragment derived from another assembly obtained in a similar manner. From this result, the present inventors came up with the idea of implementing a highly efficient method for constructing a combinatorial long-stranded DNA library according to the present invention.

В частности, в результате тщательного исследования для решения описанной выше проблемы, подлежащей решению, авторы настоящего изобретения использовали описанный выше способ так, чтобы все соотношения между молярными концентрациями фрагментов ДНК, которые используются для сборки комбинаторной библиотеки, были близки к 1 насколько это возможно, в способе сборки генов с использованием плазмидной системы трансформации Bacillus subtilis (способ OGAB). В частности, выбранные фрагменты генов, подлежащие включению в комбинаторную библиотеку, связывают в нить для конструирования затравочной плазмиды. Кроме того, конструируют другие затравочные плазмиды для других выбранных фрагментов генов для получения затравочных плазмид, количество типов которых является таким же, как и максимальное количество вариантов выбора. Расщепление каждой затравочной плазмиды ферментом рестрикции обеспечивает раствор, в котором фрагменты генов смешаны в эквимолярном состоянии. Эквимолярность этого раствора сохраняется, даже когда его смешивают с другой затравочной плазмидой. Затем различные фрагменты генов, содержащиеся в таком растворе, подвергают линейному связыванию с получением полимерной ДНК в состоянии псевдотандемных повторов, в котором периодически встречается часть плазмидного вектора, и эта ДНК используется для трансформации Bacillus subtilis. Комбинаторную библиотеку эффективно конструируют путем циркуляризации в организме Bacillus subtilis с использованием гомологии с частью плазмидного вектора.In particular, as a result of careful research to solve the above-described problem to be solved, the authors of the present invention used the above-described method so that all the ratios between the molar concentrations of DNA fragments that are used for assembling the combinatorial library were as close to 1 as possible, in method of gene assembly using the Bacillus subtilis plasmid transformation system (OGAB method). Specifically, selected gene fragments to be included in the combinatorial library are stranded to construct a seed plasmid. In addition, other seed plasmids are constructed for other selected gene fragments to obtain seed plasmids the number of types of which is the same as the maximum number of selections. Digestion of each seed plasmid by a restriction enzyme provides a solution in which the gene fragments are mixed in an equimolar state. The equimolarity of this solution is maintained even when it is mixed with another seed plasmid. The various gene fragments contained in this solution are then linearly linked to produce polymeric DNA in a pseudotandem repeat state in which part of the plasmid vector is periodically encountered, and this DNA is used to transform Bacillus subtilis. The combinatorial library is efficiently constructed by circularization in Bacillus subtilis using homology to a portion of the plasmid vector.

Этот способ имеет признак, состоящий в том, что фрагменты генов в равной молярной концентрации, необходимые для конструирования комбинаторной библиотеки, могут быть без труда и непременно получены, и масштаб конструирования библиотеки может быть увеличен в большей степени, чем когдалибо ранее. Кроме того, с использованием этого способа можно конструировать комбинаторную библиотеку длинноцепочечной ДНК следующего цикла даже без подтверждения генотипа полученной плазмиды. В частности, настоящее изобретение может быть обобщено следующим образом.This method has the feature that equal molar concentrations of gene fragments required for combinatorial library construction can be readily and readily obtained, and the scale of library construction can be increased to a greater extent than ever before. In addition, using this method, it is possible to construct a combinatorial library of long-stranded DNA of the next cycle, even without confirming the genotype of the resulting plasmid. In particular, the present invention can be summarized as follows.

1. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, причем фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин реп-1. A method for producing a DNA fragment for transformation of microbial cells, wherein the DNA fragment has at least one DNA insert element containing: DNA containing the origin of the rep-

- 2 045394 ликации, эффективный в микроорганизме-хозяине; и ДНК-вставку, в которой единичные ДНК связаны, отличающийся тем, что способ включает:- 2 045394 lication, effective in the host microorganism; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes:

(A) получение множества типов плазмид способом OGAB, где плазмиды содержат элемент ДНКвставки, в котором связано множество типов единичных ДНК, способных быть связанными в определенном порядке связывания;(A) producing multiple types of plasmids by the OGAB method, wherein the plasmids contain a DNA insert element in which multiple types of single DNAs capable of being linked in a specific binding order are linked;

(B) обработку множества типов плазмид, полученных на стадии (А), ферментом рестрикции, пригодным для расщепления каждой плазмиды на единичные ДНК и получения растворов со смесью множества типов единичных ДНК; и (C) повторную сборку единичных ДНК способом OGAB с использованием растворов со смесью множества типов единичных ДНК, полученных на стадии (В), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.(B) treating the plurality of types of plasmids obtained in step (A) with a restriction enzyme suitable for cleaving each plasmid into single DNAs and producing solutions with a mixture of the plurality of types of single DNAs; and (C) reassembling the single DNA units by the OGAB method using solutions with a mixture of multiple types of single DNA units obtained in step (B) to obtain a long-stranded DNA fragment.

2. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробной клетки согласно 1, отличающийся ткем, что все соотношения между молярными концентрациями для фрагментов ДНК в растворах со смесью единичных ДНК, полученных на стадии (В), составляют от 0,8 до 1,2.2. The method of obtaining a DNA fragment for the transformation of a microbial cell according to 1, characterized in that all the ratios between the molar concentrations for DNA fragments in solutions with a mixture of single DNA obtained in stage (B) range from 0.8 to 1.2.

3. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток согласно 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (А) количество типов единичных ДНК, содержащихся в одном типе элемента ДНК-вставки, составляет от 3 до 60.3. A method for obtaining a DNA fragment for the transformation of microbial cells according to 1 or 2, characterized in that at stage (A) the number of types of single DNA contained in one type of DNA insert element ranges from 3 to 60.

4. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток согласно любому из 1-3, где количество типов ферментов рестрикции, используемых на стадии (В), составляет три или менее.4. A method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells according to any one of 1 to 3, where the number of types of restriction enzymes used in step (B) is three or less.

5. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток согласно любому из 1-4, где фермент рестрикции представляет собой фермент рестрикции, который образует выступающий конец.5. A method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells according to any one of 1 to 4, wherein the restriction enzyme is a restriction enzyme that forms a protruding end.

6. Плазмида, содержащая фрагмент ДНК для трансформации микробных клеток, полученный способом получения согласно любому из 1-5.6. A plasmid containing a DNA fragment for the transformation of microbial cells, obtained by the production method according to any of 1-5.

7. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, причем фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине; и ДНК-вставку, в которой связаны единичные ДНК, отличающийся тем, что способ включает:7. A method for producing a DNA fragment for transformation of microbial cells, wherein the DNA fragment has at least one DNA insert element containing: DNA containing an origin of replication effective in the host microorganism; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes:

(В ') обработку множества типов плазмид согласно 6 ферментом рестрикции, пригодным для каждой плазмиды, для расщепления плазмид на единичные ДНК и получения множества типов растворов со смесью единичных ДНК; и (С ) повторную сборку единичных ДНК способом OGAB с использованием растворов со смесью единичных ДНК, полученных на стадии (В'), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.(B') treating multiple types of plasmids according to 6 with a restriction enzyme suitable for each plasmid to cleave the plasmids into single DNAs and obtain multiple types of solutions with a mixture of single DNAs; and (C) reassembling the single DNA units using the OGAB method using the solutions with the mixture of single DNA units obtained in step (B') to obtain a long-stranded DNA fragment.

8. Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток согласно 7, отличающийся выбором множества типов плазмид, содержащих полученный фрагмент длинноцепочечной ДНК, и повторное использование плазмид в качестве плазмид на стадии (В').8. The method of obtaining a DNA fragment for the transformation of microbial cells according to 7, characterized by selecting multiple types of plasmids containing the obtained long-chain DNA fragment, and reusing the plasmids as plasmids in step (B').

9. Способ конструирования химерной плазмидной библиотеки с использованием способа получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток согласно 1-5, 7 и 8.9. A method for constructing a chimeric plasmid library using a method for obtaining a DNA fragment for the transformation of microbial cells according to 1-5, 7 and 8.

Преимущественные эффекты изобретения.Advantageous effects of the invention.

В соответствии с настоящим изобретением, является возможным быстрое и эффективное конструирование комбинаторной библиотеки длинноцепочечных ДНК. Также является возможным повторное использование множества плазмид, которые выбраны из одной и той же библиотеки и последовательности оснований которых не подтверждены, для конструирования новой химерной библиотеки.In accordance with the present invention, it is possible to quickly and efficiently construct a combinatorial library of long-stranded DNA. It is also possible to reuse multiple plasmids that are selected from the same library and whose base sequences have not been confirmed to construct a new chimeric library.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Фиг. 1. На фиг. 1 представлена структура pGETS302-SfiI-pBR, который представляет собой плазмидный вектор для сборки.Fig. 1. In FIG. Figure 1 shows the structure of pGETS302-SfiI-pBR, which is a plasmid assembly vector.

Фиг. 2. На фиг. 2 представлена детальная структура единичной ДНК, составляющей элемент вставки.Fig. 2. In FIG. Figure 2 shows the detailed structure of a single DNA constituting an insertion element.

Фиг. 3. На фиг. 3 представлен искусственный метаболический путь почкующихся дрожжей, который предназначен для продуцирования изобутанола на высоком уровне.Fig. 3. In FIG. Figure 3 shows an artificial metabolic pathway in budding yeast that is designed to produce isobutanol at high levels.

Фиг. 4. На фиг. 4 схематически представлен способ конструирования химерной плазмидной библиотеки по настоящему изобретению.Fig. 4. In FIG. 4 is a schematic diagram of a method for constructing a chimeric plasmid library according to the present invention.

Фиг. 5. На фиг. 5 представлено направление единичного гена в каждой плазмиде в первой химерной плазмидной библиотеке, полученной способом по настоящему изобретению, и продуцирование изобутанола.Fig. 5. In FIG. 5 shows the direction of a single gene in each plasmid in the first chimeric plasmid library obtained by the method of the present invention and the production of isobutanol.

Фиг. 6. На фиг. 6 представлены стадии конструирования новой комбинаторной библиотеки с плазмидой, используемой для трансформации в качестве затравочной плазмиды.Fig. 6. In FIG. 6 shows the stages of construction of a new combinatorial library with a plasmid used for transformation as a seed plasmid.

Фиг. 7. На фиг. 7 представлено направление единого гена в каждой плазмиде во второй химерной плазмидной библиотеке, полученной способом по настоящему изобретению, и продуцирование изобутанола.Fig. 7. In FIG. 7 shows the direction of a single gene in each plasmid in the second chimeric plasmid library obtained by the method of the present invention and the production of isobutanol.

Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments

Настоящее изобретение подробно описано в настоящем описании далее. Как используют в рамках изобретения, молекулярно-биологический подход можно выполнять посредством способа, описанного в обычных экспериментальных руководствах, известных специалистам в данной области, или способа, эквивалентного ему, если конкретно и явно не указано иное. Кроме того, термины, используемые в настоящем описании, подразумеваются в значении, которое часто используется в данной области, еслиThe present invention is described in detail in the present specification below. As used within the scope of the invention, the molecular biology approach can be performed by a method described in conventional experimental guidelines known to those skilled in the art, or a method equivalent thereto, unless specifically and expressly indicated otherwise. Moreover, the terms used herein are intended to have the meaning commonly used in the art, unless

- 3 045394 конкретно не указано иное.- 3 045394 not specifically stated otherwise.

Способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток.Method for obtaining a DNA fragment for transformation of microbial cells.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, посредством которого комбинаторная библиотека длинноцепочечных ДНК может быть эффективно сконструирована, и посредством которого может быть без труда сконструирована новая комбинаторная библиотека даже без подтверждения генотипа полученного клона. В частности, указанный способ получения представляет собой способ получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, имеющего по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине; и ДНК-вставку, в которой связаны единичные ДНК, отличающийся тем, что способ включает:The present invention relates to a new method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells, by which a combinatorial library of long-stranded DNA can be efficiently constructed, and by which a new combinatorial library can be easily constructed even without confirming the genotype of the resulting clone. In particular, said production method is a method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells having at least one DNA insert element comprising: DNA containing an origin of replication effective in a host microorganism; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes:

(A) получение множества типов плазмид способом OGAB, где плазмиды содержат элемент ДНКвставки, в котором связано множество типов единичных ДНК, способных связываться в определенном порядке связывания;(A) producing multiple types of plasmids by the OGAB method, wherein the plasmids contain a DNA insert element in which multiple types of single DNAs capable of binding in a specific binding order are associated;

(B) обработку множества типов плазмид, полученных на стадии (А), ферментом рестрикции, пригодным для расщепления каждой плазмиды на единичные ДНК и получения множества типов растворов со смесью единичных ДНК; и (C) повторную сборку единичных ДНК способом OGAB с использованием множества типов растворов со смесью единичных ДНК, полученных на стадии (В), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.(B) treating the plurality of types of plasmids obtained in step (A) with a restriction enzyme suitable to cleave each plasmid into single DNAs and produce a plurality of types of solutions with a mixture of single DNAs; and (C) reassembling the single DNA units using the OGAB method using a variety of types of solutions with a mixture of single DNA units obtained in step (B) to obtain a long-stranded DNA fragment.

Настоящее изобретение относится к способу, где ДНК (плазмидный вектор), содержащую ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине, и элемент ДНК-вставки, содержащий ДНКвставку, получают в качестве множества единичных ДНК, имеющих структуру, в которой они могут быть поочередно связаны, причем единичные ДНК связаны с образованием фрагмента ДНК, который имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки и имеет по меньшей мере две единичных ДНК, которые являются идентичными, затем проводят сокультивирование фрагмента ДНК и компетентной клетки микроорганизма-хозяина, плазмидную ДНК собирают из микроорганизма с получением комбинаторной библиотеки, и плазмидная ДНК, отобранная из комбинаторной библиотеки, может быть использована в качестве затравочной плазмиды для новой библиотеки.The present invention relates to a method wherein a DNA (plasmid vector) containing an origin of replication effective in a host microorganism and a DNA insert element containing the DNA insert are produced as a plurality of single DNAs having a structure in which they can be alternately linked, wherein single DNAs are associated with the formation of a DNA fragment that has at least one DNA insert element and has at least two single DNAs that are identical, then co-cultivation of the DNA fragment and a competent cell of the host microorganism is carried out, plasmid DNA is collected from the microorganism with obtaining a combinatorial library, and the plasmid DNA selected from the combinatorial library can be used as a seed plasmid for the new library.

В рамках настоящего изобретения элемент ДНК-вставки относится к элементу, который содержит: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине; и ДНК-вставку. Фрагмент ДНК для трансформации микробных клеток содержит один или более элементов ДНК-вставки. Более того, элемент ДНК-вставки при необходимости может включать соответствующую последовательность оснований в дополнение к ДНК, содержащей ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине, и ДНК-вставку. Например, когда плазмиду для экспрессии гена, содержащегося в ДНКвставке, создают способом по настоящему изобретению, элемент ДНК-вставки может содержать последовательность оснований, которая контролирует транскрипцию и трансляцию, такую как промоторы, операторы, активаторы или терминаторы. В частности, промоторы, используемый в хозяине, включает промотор для первичного метаболита системы гликолиза и т.п.In the context of the present invention, a DNA insert element refers to an element that contains: DNA containing an origin of replication effective in a host microorganism; and DNA insert. The DNA fragment for transformation of microbial cells contains one or more DNA insert elements. Moreover, the DNA insert element may optionally include an appropriate base sequence in addition to DNA containing an origin of replication effective in the host microorganism and the DNA insert. For example, when a plasmid for expressing a gene contained in a DNA insert is created by the method of the present invention, the DNA insert element may contain base sequences that control transcription and translation, such as promoters, operators, activators or terminators. In particular, the promoters used in the host include a promoter for a primary metabolite of the glycolytic system and the like.

В рамках настоящего изобретения ДНК, содержащая ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине, может представлять собой любую ДНК при условии, что ДНК реплицируется в микроорганизме, который может быть трансформирован полученным фрагментом ДНК. В качестве микроорганизма по настоящему изобретению используют бактерии, которые принадлежат роду Bacillus. Примеры конкретного микроорганизма и ДНК, содержащей ориджин репликации, эффективный в микроорганизме, включают В. subtilis (Bacillus subtilis) и ДНК, имеющую механизм репликации Θ-типа, которая конкретно включает последовательность ориджина репликации и т.п., содержащуюся в плазмиде, такой как рТВ19 (Imanaka, Т., et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399-1408. (1984)) или pLS32 (Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998), pAMe1 (Swinfield, T. J., et al. Gene 87, 79-90. (1990)).For the purposes of the present invention, the DNA containing an origin of replication effective in a host microorganism may be any DNA as long as the DNA is replicated in a microorganism that can be transformed by the resulting DNA fragment. As the microorganism of the present invention, bacteria that belong to the genus Bacillus are used. Examples of a specific microorganism and DNA containing an origin of replication effective in the microorganism include B. subtilis (Bacillus subtilis) and DNA having a Θ-type replication mechanism, which specifically includes an origin of replication sequence and the like contained in a plasmid such as pTB19 (Imanaka, T., et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399-1408. (1984)) or pLS32 (Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998) pAMe1 (Swinfield, T. J., et al. Gene 87, 79-90. (1990)).

В рамках настоящего изобретения ДНК-вставка относится к ДНК, подлежащей клонированию, и ее тип и размер конкретно не ограничены. ДНК может представлять собой любой тип ДНК, который представляет собой не только встречающуюся в природе последовательность прокариотического организма, эукариотического организма, вируса и т.п., но также искусственно сконструированную последовательность. Тип ДНК конкретно не ограничен. Предпочтительно, ДНК включает группу генов, составляющую серию метаболических путей, группу генов антисмысловой РНК, предназначенной для инактивации экспрессии гена, присутствующего в организме-хозяине, смесь как группы генов метаболических путей, так и группы антисмысловых РНК, и т.п. ДНК-вставка по настоящему изобретению имеет структуру, в которой единичные ДНК связаны.In the context of the present invention, a DNA insert refers to DNA to be cloned, and its type and size are not particularly limited. The DNA may be any type of DNA that is not only a naturally occurring sequence from a prokaryotic organism, a eukaryotic organism, a virus, etc., but also an artificially engineered sequence. The type of DNA is not particularly limited. Preferably, the DNA includes a group of genes constituting a series of metabolic pathways, a group of antisense RNA genes designed to inactivate the expression of a gene present in the host, a mixture of both a group of metabolic pathway genes and a group of antisense RNAs, and the like. The DNA insert of the present invention has a structure in which single DNAs are linked.

В рамках настоящего изобретения единичные ДНК имеют структуру, в которой они могут быть повторяющимся образом связаны друг с другом при сохранении порядка. Единичные ДНК, которые связаны по порядку, составляют фрагмент ДНК, который представляет собой одну ДНК-вставку. Длина цепи ДНК в единичном фрагменте ДНК конкретно не ограничена. Связывание друг с другом при сохранении порядка означает, что единичные ДНК, имеющие последовательности, соседние друг с другом, на ДНКWithin the scope of the present invention, single DNAs have a structure in which they can be linked to each other in a repeating manner while maintaining order. Single DNAs that are linked in order make up a DNA fragment, which is a single DNA insert. The length of the DNA chain in a single DNA fragment is not particularly limited. Linking to each other while maintaining order means that single DNAs having sequences adjacent to each other on DNA

- 4 045394 вставке связаны при сохранении порядка и направления. Кроме того, связывание повторяющимся образом означает, что 5'-конец единичной ДНК, имеющей последовательность оснований 5'-конца ДНКвставки, и 3'-конец единичной ДНК, имеющей последовательность оснований 3'-концевой ДНК-вставки, связаны. Конкретные примеры таких единичных ДНК включают фрагменты ДНК, имеющие концы, которые могут быть повторяющимся образом связаны друг с другом при сохранении порядка с использованием комплементарности между последовательностями оснований на выступающих концах фрагментов. Структура этого выступающего конца, включая отличия в форме выступающего конца между 5'концевым выступающим концом и 3'-концевым выступающим концом, конкретно не ограничена при условии, что она не является палиндромной структурой (палиндром). В этом отношении, является предпочтительным, чтобы выступающий конец мог быть получен посредством расщепления ферментом рестрикции при получении единичной ДНК. Если в качестве фермента рестрикции используют фермент, способный распознавать конкретную последовательность и создавать выступающий конец любой последовательности вблизи распознаваемой последовательности, выступающие концы единичных фрагментов ДНК могут различаться на каждом участке связывания, так что порядок связывания сохраняется. Примеры такого фермента рестрикции включают TALEN и ZNF, которые являются искусственными ферментами рестрикции или связанными со способом CRISPR ферментами, способными создавать выступающий конец, такими как CRISPR-Cpf1 и т.п. в дополнение к основным ферментам рестрикции, используемых для молекулярной биологии. Является предпочтительным применение фермента рестрикции типа II, такого как AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI, SfaNI или SfiI.- 4 045394 inserts are connected while maintaining order and direction. In addition, binding in a repetitive manner means that the 5' end of a DNA unit having the base sequence of the 5' end of the DNA insert and the 3' end of the unit DNA having the base sequence of the 3' end of the DNA insert are linked. Specific examples of such DNA units include DNA fragments having ends that can be linked to each other in a repeating manner while maintaining order using complementarity between base sequences at the overhanging ends of the fragments. The structure of this overhang, including differences in the shape of the overhang between a 5' overhang and a 3' overhang, is not particularly limited as long as it is not a palindromic structure (palindrome). In this regard, it is preferable that the overhang can be obtained by restriction enzyme digestion to obtain a single DNA. If the restriction enzyme is an enzyme capable of recognizing a particular sequence and creating an overhang of any sequence in the vicinity of the sequence being recognized, the overhangs of the individual DNA fragments may be different at each binding site so that the order of binding is maintained. Examples of such a restriction enzyme include TALEN and ZNF, which are artificial restriction enzymes or CRISPR method-related enzymes capable of creating an overhang, such as CRISPR-Cpf1 and the like. in addition to the basic restriction enzymes used for molecular biology. It is preferred to use a type II restriction enzyme such as AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI, SfaNI or SfiI.

Что касается количества типов ферментов рестрикции, используемых для создания выступающего конца, расщепление посредством одного типа фермента рестрикции является предпочтительным для расщепления одной единичной ДНК. Не все единичные ДНК обязательно должны быть получены посредством расщепления одним и тем же типом фермента рестрикции. Однако лучше, чтобы общее количество типов используемых ферментов рестрикции было меньшим, где предпочтительными являются три или менее типов, более предпочтительными являются два или менее типов, и еще более предпочтительным является один тип.With regard to the number of types of restriction enzymes used to create the overhang, cleavage by one type of restriction enzyme is preferred for cleaving one single DNA unit. Not all single DNAs need to be produced by digestion with the same type of restriction enzyme. However, it is preferable that the total number of types of restriction enzymes used is smaller, where three or less types are preferred, two or fewer types are more preferred, and one type is even more preferred.

Одна или более единичных ДНК среди единичных ДНК, составляющих элемент ДНК-вставки, должны содержать ориджин репликации, эффективный в клетке-хозяине. Остальные единичные ДНК представляют собой элементы, составляющие непрерывную последовательность оснований, такую как кластер метаболического пути, часть или целую непрерывную геномную последовательность организма, искусственный ген или искусственный генный цикл, и отсутствует ограничение, что одна единичная ДНК должна соответствовать биологически функциональному элементу.One or more DNA units among the DNA units constituting the DNA insert element must contain an origin of replication that is effective in the host cell. The remaining DNA units are elements constituting a contiguous sequence of bases, such as a metabolic pathway cluster, part or all of an organism's contiguous genomic sequence, an artificial gene, or an artificial gene cycle, and there is no restriction that one DNA unit must correspond to a biologically functional element.

Способ получения единичной ДНК может представлять собой любой способ при условии, что он может создавать единичную ДНК по настоящему изобретению. Например, фрагмент ДНК, амплифицированный посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймера, в который добавлена последовательность распознавания ферментом рестрикции, который создает выступающий конец в последовательности оснований на матричной ДНК, или химически синтезированный фрагмент ДНК, включающий последовательность распознавания ферментом рестрикции для получения любой выступающей последовательности на конце заранее и т.п., клонируют в плазмидный вектор и используют после подтверждения последовательности оснований. Каждая единичная ДНК сконструирована так, чтобы связываться в определенном порядке, чтобы в конечном итоге получить желаемый фрагмент ДНК для трансформации микробных клеток. Количество (тип) единичных ДНК, которые связывают для получения представляющей интерес ДНК-вставки, составляет от 3 до 60 (типов), предпочтительно от 5 до 50 (типов), более предпочтительно от 8 до 25 (типов) и еще более предпочтительно от 10 до 20 (типов).The method for producing a single DNA may be any method as long as it can produce a single DNA according to the present invention. For example, a DNA fragment amplified by polymerase chain reaction (PCR) using a primer to which is added a restriction enzyme recognition sequence that creates an overhang in the sequence of bases on the template DNA, or a chemically synthesized DNA fragment including a restriction enzyme recognition sequence to produce any overhanging sequence at the end in advance, etc., is cloned into a plasmid vector and used after confirming the base sequence. Each DNA unit is designed to bind in a specific order to ultimately produce the desired DNA fragment for microbial cell transformation. The number (type) of DNA units that are linked to produce the DNA insert of interest is from 3 to 60 types, preferably from 5 to 50 types, more preferably from 8 to 25 types, and even more preferably from 10 up to 20 (types).

Каждая стадия способа получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток по настоящему изобретению далее подробно описана.Each step of the method for obtaining a DNA fragment for transforming microbial cells of the present invention is described in detail below.

Стадия (А).Stage (A).

На стадии (А) в способе получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток по настоящему изобретению получают так называемую затравочную плазмиду. Затравочная плазмида должна иметь структуру, где соответствующая последовательность распознавания ферментом рестрикции внесена на или вблизи границы между единичными ДНК, в соответствии с каждой конструкцией, так чтобы плазмида после конструирования сборки могла быть разделена на единичные фрагменты ДНК с учетом стадии (В) и стадии (С). Является предпочтительным использование фермента, способного создавать выступающий конец с любой последовательностью, такого как AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI, SfaNI или SfiI, в качестве фермента рестрикции. Множество выступающих последовательностей, полученных посредством процессинга этими ферментами рестрикции, должны представлять собой уникальную последовательность в одной затравочной плазмиде. Кроме того, группа затравочных плазмид должна иметь одну и ту же выступающую последовательность в одной и той же цепи и в одном и том же порядке в элементе рекомбинации комбинаторной библиотеки (хотя единичная ДНК часто соответствует указанному элементу, рекомбинационный элемент может состоять из множества единичных ДНК в некоторых затравочныхIn step (A), in the method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells of the present invention, a so-called seed plasmid is obtained. The seed plasmid must have a structure where the appropriate restriction enzyme recognition sequence is introduced at or near the boundary between the DNA units, corresponding to each construct, so that the plasmid, after constructing the assembly, can be divided into single DNA fragments taking into account step (B) and step (C) ). It is preferred to use an enzyme capable of creating an overhang with any sequence, such as AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI , SfaNI or SfiI, as a restriction enzyme. The plurality of overhang sequences obtained by processing with these restriction enzymes must represent a unique sequence in a single seed plasmid. In addition, a group of seed plasmids must have the same overhang sequence on the same strand and in the same order in the recombination element of the combinatorial library (although a single DNA often corresponds to a specified element, a recombination element can consist of multiple single DNAs in some basic

- 5 045394 плазмидах).- 5 045394 plasmids).

При конструировании затравочной плазмиды OGAB, в частности, также является возможным создание фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток путем связывания (лигирования) с использованием ДНК-лигазы и т.п. в растворах со смесями единичных ДНК, где все из описанных единичных ДНК доведены до практически эквимолярного состояния. В этом отношении исходный материал для сборки гена не ограничивается только каждой из описанных выше единичных ДНК. Можно использовать сборку, полученную любым способом сборки, при условии, что она в конечном итоге имеет структуру, которая может быть разделена на каждую единичную ДНК, как описано выше. В этом случае, практически эквимолярный означает, что все соотношения между молярными концентрациями для фрагментов ДНК в растворах со смесями единичных ДНК находятся в диапазоне от 0,8 до 1,2, предпочтительно в диапазоне от 0,9 до 1,1, более предпочтительно в диапазоне от 0,95 до 1,05, еще более предпочтительно 1,0. Все соотношения между молярными концентрациями для фрагментов ДНК в растворах со смесями единичных ДНК, находящимися в описанном выше числовом диапазоне величин, могут быть также перефразированы как величина, полученная путем деления наибольшей величины концентрации единичных ДНК, содержащихся в растворах со смесями единичных ДНК, на наиболее низкую величину, находящаяся в диапазоне от 1,0 до 1,5, находящуюся в диапазоне от 1,0 до 1,2, составляющую 1,0-1,1, или составляющую 1,0.When constructing the OGAB seed plasmid, in particular, it is also possible to create a DNA fragment for transformation of microbial cells by binding (ligation) using a DNA ligase or the like. in solutions with mixtures of single DNAs, where all of the described single DNAs are brought to an almost equimolar state. In this regard, the starting material for gene assembly is not limited to just each of the DNA units described above. An assembly produced by any assembly method can be used, provided that it ultimately has a structure that can be separated into each DNA unit as described above. In this case, substantially equimolar means that all ratios between molar concentrations for DNA fragments in solutions with mixtures of single DNAs are in the range of 0.8 to 1.2, preferably in the range of 0.9 to 1.1, more preferably in range from 0.95 to 1.05, even more preferably 1.0. All relationships between molar concentrations for DNA fragments in solutions containing single DNA mixtures within the numerical range described above can also be rephrased as the value obtained by dividing the highest concentration of single DNA contained in solutions containing single DNA mixtures by the lowest a value in the range from 1.0 to 1.5, in the range from 1.0 to 1.2, 1.0-1.1, or 1.0.

Единичная ДНК затравочной плазмиды, полученной на этой стадии, может представлять собой любую форму, такую как кластер генов, ген или фрагмент гена.The single DNA of the seed plasmid obtained at this stage can be in any form, such as a gene cluster, a gene or a gene fragment.

Хотя способ связывания единичных ДНК конкретно не ограничен, предпочтительно проводить связывание в присутствии полиэтиленгликоля и соли. В качестве соли является предпочтительной соль одновалентного щелочного металла. В частности, является более предпочтительным проведение связывания в растворе для реакции лигирования, содержащем 10% полиэтиленгликоль 6000 и 250 мМ хлорид натрия. Кроме того, хотя концентрация каждой единичной ДНК в реакционном растворе конкретно не ограничена, предпочтительно, чтобы каждая единичная ДНК имела концентрацию 1 фмоль/мкл или более и была эквимолярной. Хотя фермент, температура реакции и время лигирования конкретно не ограничены, предпочтительным является лигирование с ДНК-полимеразой Т4 при 37°С в течение 30 минут или более.Although the method of binding single DNAs is not particularly limited, it is preferable to carry out the binding in the presence of polyethylene glycol and salt. As the salt, a monovalent alkali metal salt is preferred. In particular, it is more preferred to carry out the coupling in a ligation reaction solution containing 10% polyethylene glycol 6000 and 250 mM sodium chloride. In addition, although the concentration of each DNA unit in the reaction solution is not particularly limited, it is preferable that each DNA unit has a concentration of 1 fmol/μL or more and is equimolar. Although the enzyme, reaction temperature and ligation time are not particularly limited, ligation with T4 DNA polymerase at 37° C. for 30 minutes or more is preferred.

Микроорганизм-хозяин для фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что он имеет естественную способность к трансформации. Такой микроорганизм включает микроорганизм, который имеет естественную способность к трансформации для процессинга ДНК в одноцепочечную ДНК для захвата ДНК и т.п. В частности, включены бактерии, которые принадлежат роду Bacillus, бактерии, которые принадлежат роду Streptococcus, бактерии, которые принадлежат роду Haemophilus, бактерии, которые принадлежат роду Neisseria, и т.п. Более того, бактерии, которые принадлежат роду Bacillus, включают В. subtilis (Bacillus subtilis), В. megaterium (Bacillus megaterium), B. stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) и т.п. Наиболее предпочтительный микроорганизм среди них включает Bacillus subtilis, имеющие превосходную природную способность к трансформации и способность к рекомбинации.The host microorganism for the microbial cell transformation DNA fragment of the present invention is not particularly limited as long as it has natural transformation ability. Such a microorganism includes a microorganism that has a natural ability to transform to process DNA into single-stranded DNA to capture DNA and the like. In particular, bacteria that belong to the genus Bacillus, bacteria that belong to the genus Streptococcus, bacteria that belong to the genus Haemophilus, bacteria that belong to the genus Neisseria, and the like are included. Moreover, bacteria that belong to the genus Bacillus include B. subtilis (Bacillus subtilis), B. megaterium (Bacillus megaterium), B. stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) and the like. The most preferred microorganism among them includes Bacillus subtilis, having excellent natural transformation ability and recombination ability.

В качестве способа преобразования микробной клетки в компетентную может быть выбран известный способ, пригодный для каждого микроорганизма. В частности, например, является предпочтительным использование способа, описанного в Anagnostopoulou, С. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746 (1961), для Bacillus subtilis. Кроме того, в качестве способа трансформации может использоваться любой способ, пригодный для каждого микроорганизма. Количество жидкости в продукте лигирования, вводимом в компетентную клетку, также конкретно не ограничено. Предпочтительно это количество составляет от 1/20 до равного количества, и более предпочтительно половинное количество относительно культуры компетентных клеток. В качестве способа очистки плазмиды от трансформации также может использоваться известный способ.As a method for converting a microbial cell into a competent one, a known method suitable for each microorganism can be selected. In particular, for example, it is preferred to use the method described in Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746 (1961), for Bacillus subtilis. In addition, any method suitable for each microorganism can be used as the transformation method. The amount of liquid in the ligation product introduced into the competent cell is also not particularly limited. Preferably, this amount is from 1/20 to an equal amount, and more preferably half the amount relative to the competent cell culture. A known method can also be used as a method for purifying a plasmid from transformation.

Может быть подтверждено, что плазмида, полученная описанным выше способом, имеет представляющую интерес ДНК-вставку, по паттерну размера фрагментов, полученных посредством расщепления ферментом рестрикции, способом ПНР или способом секвенирования. Кроме того, когда ДНК-вставка имеет функцию, такую как продуцирование вещества, подтверждение может быть осуществлено посредством обнаружения функции.The plasmid obtained by the above method can be confirmed to have a DNA insert of interest by the size pattern of the fragments obtained by restriction enzyme digestion, the NLR method, or the sequencing method. Moreover, when the DNA insert has a function such as producing a substance, confirmation can be accomplished by detecting the function.

Для коррекции затравочной плазмиды, используемой для конструирования комбинаторной библиотеки, может использоваться любой способ при условии, что он представляет собой обычный способ очистки кольцевой плазмиды. Является желательным способ со снижением риска контаминации посредством ДНК, отличной от плазмидной ДНК. В частности, предпочтительным является способ ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия-бромида этидия.Any method may be used to correct the seed plasmid used to construct a combinatorial library, as long as it is a conventional method for purifying a circular plasmid. A method that reduces the risk of contamination by DNA other than plasmid DNA is desirable. In particular, the cesium chloride-ethidium bromide density gradient ultracentrifugation method is preferred.

Стадия (В).Stage (B).

Эта стадия представляет собой обработку множества типов плазмид (затравочные плазмиды), полученных на стадии (А) ферментом рестрикции, пригодным для расщепления каждой плазмиды на единичные ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК. Множество типов плазмид (затравочных плазмид), полученных на стадии (А), очищают до высокой чистоты, а затем расщеп- 6 045394 ляют на единичные ДНК. Для расщепления на единичные ДНК, соответствующий фермент рестрикции может быть выбран в зависимости от конструкции на стадии (А).This step involves treating the multiple types of plasmids (primer plasmids) obtained in step (A) with a restriction enzyme suitable to cleave each plasmid into single DNAs and produce multiple types of solutions with mixtures of single DNAs. The multiple types of plasmids (primer plasmids) obtained in step (A) are purified to high purity and then cleaved into single DNAs. For cleavage into single DNAs, an appropriate restriction enzyme can be selected depending on the design in step (A).

Что касается количества типов ферментов рестрикции, используемых для создания выступающего конца, для расщепления одной единичной ДНК является предпочтительным расщепление одним типом фермента рестрикции. Не все единичные ДНК обязательно должны быть получены посредством расщепления тем же типом фермента рестрикции. Однако лучше, чтобы общее количество типов используемых ферментов рестрикции было меньшим, где предпочтительными являются три или менее типов, более предпочтительными являются два или менее типов, или еще более предпочтительным является один тип.Regarding the number of types of restriction enzymes used to create the overhang, it is preferable to cleave with one type of restriction enzyme to cleave one single DNA unit. Not all single DNAs need to be produced by digestion with the same type of restriction enzyme. However, it is preferable that the total number of types of restriction enzymes used is smaller, where three or less types are preferred, two or fewer types are more preferred, or one type is even more preferred.

Растворы со смесями единичных ДНК, полученные на этой стадии, являются свободными от фрагмента ДНК, отличного от плазмиды, поскольку затравочные плазмиды очищают до чрезвычайно высокой чистоты. Полученную длинноцепочечную ДНК расщепляют ферментом рестрикции и фермент рестрикции удаляют, посредством чего могут быть получены растворы с фрагментами ДНК (растворы со смесями единичных ДНК), в которых все соотношения между молярными концентрациями фрагментов ДНК максимально близки к 1.Single DNA mixture solutions obtained at this stage are free of non-plasmid DNA fragment because the seed plasmids are purified to extremely high purity. The resulting long-chain DNA is digested with a restriction enzyme and the restriction enzyme is removed, whereby solutions with DNA fragments (solutions with mixtures of single DNAs) can be obtained in which all ratios between the molar concentrations of DNA fragments are as close as possible to 1.

Стадия (С).Stage (C).

Эта стадия представляет собой повторную сборку единичных ДНК способом OGAB с использованием множества типов растворов со смесями единичных ДНК, полученных на стадии (В), для получения фрагмента длинноцепочечной ДНК. Является возможным более эффективное проведение сборки гена путем проведения способа сборки гена (способ OGAB) с использованием растворов фрагментов ДНК (растворы со смесями единичных ДНК), полученных на стадии (В), в которых все соотношения между молярными концентрациями для фрагментов ДНК максимально близки к 1, в качестве исходного материала. Пояснение для стадии (А) может быть применено к способу повторной сборки единичных ДНК посредством способа OGAB с использованием растворов со смесями единичных ДНК на этой стадии.This step is the reassembly of single DNA units using the OGAB method using multiple types of solutions with mixtures of single DNA units obtained in step (B) to produce a long-stranded DNA fragment. It is possible to carry out gene assembly more efficiently by carrying out the gene assembly method (OGAB method) using solutions of DNA fragments (solutions with mixtures of single DNAs) obtained in step (B), in which all ratios between molar concentrations for DNA fragments are as close as possible to 1 , as starting material. The explanation for step (A) can be applied to the method of reassembling single DNAs by the OGAB method using solutions with mixtures of single DNAs in this step.

Более того, настоящее изобретение также относится к способу получения фрагмента ДНК для трансформации микробных клеток, причем ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в микроорганизме-хозяине; и ДНКвставку, в которой связаны единичные ДНК, отличающийся тем, что способ включает:Moreover, the present invention also relates to a method for producing a DNA fragment for transforming microbial cells, the DNA having at least one DNA insert element comprising: DNA containing an origin of replication effective in a host microorganism; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes:

(В') обработку множества типов плазмид, полученных описанным выше способом по настоящему изобретению, ферментом рестрикции, пригодным для расщепления каждой плазмиды на единичные ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК; и (С) повторную сборку единичных ДНК способом OGAB с использованием растворов со смесями единичных ДНК, полученных на стадии (В'), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.(B') treating the plurality of types of plasmids obtained by the method of the present invention described above with a restriction enzyme suitable for cleaving each plasmid into single DNAs and producing a variety of types of solutions with mixtures of single DNAs; and (C) reassembling the single DNA units using the OGAB method using solutions with mixtures of single DNA units obtained in step (B') to obtain a long-stranded DNA fragment.

Множество типов плазмид, содержащих фрагмент длинноцепочечной ДНК, полученный описанным выше способом по настоящему изобретению, может быть выбрано и повторно использовано в качестве плазмид на стадии (В').Many types of plasmids containing the long-chain DNA fragment obtained by the above-described method of the present invention can be selected and reused as plasmids in step (B').

Настоящее изобретение также относится к плазмиде, содержащей фрагмент ДНК для трансформации микробных клеток, полученный описанным выше способом получения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу конструирования химерной плазмидной библиотеки с использованием способа получения по настоящему изобретению.The present invention also relates to a plasmid containing a DNA fragment for transformation of microbial cells obtained by the above-described production method of the present invention. The present invention also relates to a method for constructing a chimeric plasmid library using the production method of the present invention.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение конкретно описано в примерах ниже. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.The present invention is specifically described in the examples below. However, the present invention is not limited to these examples.

Обычный способ тестирования и т.п., например, реагенты, используемые в примерах, являются следующими.The usual method for testing etc., for example, the reagents used in the examples are as follows.

В качестве хозяина Bacillus subtilis использовали штамм RM125 (Uozumi, Т., et al. Moi. Gen. Genet., 152, 65-69 (1977)) и его производный штамм, штамм BUSY9797. В качестве плазмидного вектора, способного к репликации в Bacillus subtilis, использовали pGET118 (Kaneko, S., et al. Nucleic Acids Res. 31, e112 (2003)). Карбенициллин, который является антибиотиком, приобретали от Wako Pure Chemical Industries. Тетрациклин, который является антибиотиком, приобретали от Sigma. SfiI и BspQI, которые являются ферментами рестрикции, приобретали от NEB. ДНК-лигазу Т4 приобретали от Takara Bio. Для обычного лигирования для конструирования плазмиды для Escherichia coli использовали набор Takara Ligation Kit (Mighty) (Takara Bio). Для реакции ПЦР для получения единичной ДНК использовали полимеразу KOD plus от TOYOBO. Между тем, для ПЦР колоний для секвенирования ДНК, клонированной в плазмиду, использовали Ех-Taq HS, производимую Takara Bio. pMD-19 (простая) приобретали от Takara Bio. В качестве Plasmid Safe, который представляет собой фермент для очистки кольцевой плазмиды, использовали продукт, производимый EPICENTER. 2-гидроксиэтилагарозу, которая представляет агарозный гель с низкой температурой плавления для электрофореза ДНК, приобретали от Sigma. Агарозу UltraPure от Invitrogen использовали для других распространенных агарозных гелей для электрофореза. Использовали фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 25:24:1 и ТЕ-насыщенный фенол (содержащий 8хинолинол), произведенный Nacalai Tesque. Лизоцим приобретали от Wako Pure Chemical Industries. В качестве компонента среды использовали среду LB и агар, производимый Becton Dickinson. Использовали IPTG (изопропил s-D-тиогалактопиранозид), производимый Wako Pure Chemical Industries. Для всехThe Bacillus subtilis host used was strain RM125 (Uozumi, T., et al. Moi. Gen. Genet., 152, 65-69 (1977)) and its derivative strain, strain BUSY9797. pGET118 (Kaneko, S., et al. Nucleic Acids Res. 31, e112 (2003)) was used as a plasmid vector capable of replication in Bacillus subtilis. Carbenicillin, which is an antibiotic, was purchased from Wako Pure Chemical Industries. Tetracycline, which is an antibiotic, was purchased from Sigma. SfiI and BspQI, which are restriction enzymes, were purchased from NEB. T4 DNA ligase was purchased from Takara Bio. For conventional ligation, the Takara Ligation Kit (Mighty) (Takara Bio) was used to construct a plasmid for Escherichia coli. For the PCR reaction to obtain single DNA, KOD plus polymerase from TOYOBO was used. Meanwhile, for colony PCR, Ex-Taq HS produced by Takara Bio was used to sequence the DNA cloned into the plasmid. pMD-19 (plain) was purchased from Takara Bio. A product manufactured by EPICENTER was used as Plasmid Safe, which is a circular plasmid purification enzyme. 2-hydroxyethyl agarose, which is a low melting point agarose gel for DNA electrophoresis, was purchased from Sigma. Invitrogen's UltraPure Agarose has been used for other common agarose electrophoresis gels. Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 and TE-saturated phenol (containing 8-quinolinol) from Nacalai Tesque were used. Lysozyme was purchased from Wako Pure Chemical Industries. LB medium and agar produced by Becton Dickinson were used as media components. IPTG (isopropyl s-D-thiogalactopyranoside) manufactured by Wako Pure Chemical Industries was used. For all

- 7 045394 других компонентов сред и биохимических реагентов использовали продукты, производимые Wako Pure- 7 045394 other media components and biochemical reagents used products manufactured by Wako Pure

Chemical Industries.Chemical Industries.

Для конструирования плазмиды, которая конкретно не указана, использовали либо штамм DH5a Escherichia coli, либо штамм JM109, либо штамм ТОР10. Для очистки малого количества сконструированной плазмиды от Escherichia coli использовали набор QIAprep Spin Miniprep Kit от Qiagen, в то время как для очистки большого количества использовали набор QLAfilter Midi Kit от Qiagen. Для очистки ДНК от раствора фермента рестрикции использовали набор MinElute Reaction Cleanup Kit от Qiagen или набор QIAquick PCR purification Kit от Qiagen. Для очистки из геля блока, полученного после разделения на обычном агарозном гель-электрофорезе, использовали набор MinElute Gel Extraction Kit от Qiagen. В качестве ультраследового спектрофотометра использовали nano-drop 2000 от Thermo. Для секвенирования использовали генетический анализатор 3130x1, который представляет собой флуоресцентный автоматический секвенатор, производимый Applied Biosystems.To construct the plasmid, which is not specifically mentioned, either Escherichia coli strain DH5a, JM109 strain, or TOP10 strain was used. The QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen was used to purify small quantities of the engineered plasmid from Escherichia coli, while the QLAfilter Midi Kit from Qiagen was used to purify large quantities. To purify DNA from the restriction enzyme solution, we used the MinElute Reaction Cleanup Kit from Qiagen or the QIAquick PCR purification Kit from Qiagen. The MinElute Gel Extraction Kit from Qiagen was used to purify the block obtained from conventional agarose gel electrophoresis gel. A nano-drop 2000 from Thermo was used as an ultra-trace spectrophotometer. The 3130x1 Genetic Analyzer, which is a fluorescent automated sequencer manufactured by Applied Biosystems, was used for sequencing.

Другие общеизвестные манипуляции с ДНК проводили в соответствии со стандартным протоколом (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Трансформацию Bacillus subtilis и экстракцию плазмиды способом OGAB и т.п. проводили в соответствии с известным способом (Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res. 31, e133. (2003)).Other well-known DNA manipulations were performed according to standard protocols (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Transformation of Bacillus subtilis and plasmid extraction by OGAB method, etc. carried out in accordance with a known method (Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res. 31, e133. (2003)).

1. Получение элемента ДНК-вставки.1. Obtaining a DNA insert element.

(1) Конструирование плазмидного вектора для сборки pGETS302-SfiI-pBR.(1) Construction of plasmid vector for assembly of pGETS302-SfiI-pBR.

Плазмидный вектор для сборки представляет собой челночный плазмидный вектор Escherichia coliBacillus subtilis-дрожжей, который имеет ориджин репликации pBR322 Escherichia coli, repA, который представляет собой ориджин репликации, функциональный в Bacillus subtilis, и ARS4 и CEN6, способные к репликации в почкующихся дрожжах. Она представляет собой плазмиду, сконструированную посредством многостадийных процессов на основе pGETS109 (Tsuge, et. al., Nucleic Acids Res., 31, e133. (2003)). На фиг. 1 представлена его структура и под SEQ ID NO: 1 представлена его последовательность оснований. Участок клонирования для гена, подлежащего сборки, находится между двумя участками расщепления Sfil, и для сборки используется наибольший фрагмент SfiI размером 15 т.п.н. Для селекции в Escherichia coli использовали ампициллин. К 5 мкг этой плазмиды добавляли стерильную воду, так что общий объем составлял 40 мкл, с последующим добавлением 5 мкл 10х буфера NEB2.1, прилагаемого к ферменту рестрикции, и 5 мкл фермента рестрикции SfiI (NEB), и осуществлением реакции их смеси при 50°С в течение 2 часов. Полученную жидкость подвергали разделения посредством гель-электрофореза на агарозе с низкой температурой плавления, затем фрагмент остова вектора размером приблизительно 15 т.п.н. вырезали из геля, представляющий интерес фрагмент ДНК очищали, затем фрагмент ДНК растворяли в 20 мкл ТЕ, 1 мкл раствора собирали и концентрацию в нем определяли с использованием ультраследового спектрофотометра.The plasmid assembly vector is an Escherichia coliBacillus subtilis-yeast shuttle plasmid vector that has the Escherichia coli origin of replication pBR322, repA, which is an origin of replication functional in Bacillus subtilis, and ARS4 and CEN6 capable of replication in budding yeast. It is a plasmid constructed through multistep processes based on pGETS109 (Tsuge, et. al., Nucleic Acids Res., 31, e133. (2003)). In fig. 1 shows its structure and SEQ ID NO: 1 shows its base sequence. The cloning site for the gene to be assembled is between the two Sfil cleavage sites, and the largest SfiI fragment of 15 kb is used for assembly. Ampicillin was used for selection in Escherichia coli. Sterile water was added to 5 μg of this plasmid so that the total volume was 40 μl, followed by adding 5 μl of 10x NEB2.1 restriction enzyme buffer and 5 μl of SfiI restriction enzyme (NEB) and reacting the mixture at 50 °C for 2 hours. The resulting liquid was separated by low melting point agarose gel electrophoresis, then an approximately 15 kb fragment of the vector backbone. cut from the gel, the DNA fragment of interest was purified, then the DNA fragment was dissolved in 20 μl of TE, 1 μl of the solution was collected and its concentration was determined using an ultra-trace spectrophotometer.

(2) Способ конструирования выступающей последовательности единичной ДНК.(2) A method for constructing a single DNA overhang sequence.

В качестве единичных ДНК, составляющих один элемент-вставку, существует всего 14 фрагментов, включающих pGETS302, который представляет собой вектор для сборки, как показано на фиг. 2. Существует всего 12 генов, составляющих группу, вовлеченную в метаболический путь изобутанола в почкующихся дрожжах. Эти гены определяют как 1-12-я единичная ДНК по порядку. kanMX4, который выступает в качестве селективного маркера для трансформации в почкующихся дрожжах, определяют как 13-ю единичную ДНК, и вектор для сборки определяют как 14-ю единичную ДНК. 1-14-я единичные ДНК являются соседними в порядке в соответствии с номером, и они формируют структуру, в которой 14-я единичная ДНК и 1-я единичная ДНК связаны, тем самым образуя один элемент вставки. Конец каждого элемента ДНК имеет 3 уникальных 3'-концевых выступающих основания, которые указываются для каждого номера единичной ДНК как слева, так и справа от фрагмента. С использованием этой комплементарности обозначают партнера по связыванию. Конкретная конфигурация является следующей. (14-я единичная ДНК)-GTT-(1-я единичная ДНК)-TGA-(2-я единичная ДНК)-CGA-(3-я единичная ДНК)TGT-(4-я единичная ДНК)-GAT-(5-я единичная ДНК)-TTG-(6-я единичная ДНК)-GTC-(7-я единичная ДНК)-ATG-(8-я единичная ДНК)-TGG-(9-я единичная ДНК)-TAG-(10-я единичная ДНК)-АСТ-(11-я единичная ДНК)-GTA-(12-я единичная ДНК)-СТТ-(13-я единичная ДНК)-ТСТ-(14-я единичная ДНК).As single DNAs constituting one insert element, there are a total of 14 fragments comprising pGETS302, which is an assembly vector as shown in FIG. 2. There are a total of 12 genes that make up the group involved in the isobutanol metabolic pathway in budding yeast. These genes are defined as the 1st to 12th DNA units in order. kanMX4, which acts as a selectable marker for transformation in budding yeast, is defined as the 13th DNA unit, and the assembly vector is defined as the 14th DNA unit. The 1st to 14th DNA units are adjacent in order according to number, and they form a structure in which the 14th DNA unit and the 1st DNA unit are linked, thereby forming one insertion element. The end of each DNA element has 3 unique 3' terminal overhangs, which are indicated for each DNA unit number on both the left and right of the fragment. Using this complementarity, the binding partner is designated. The specific configuration is as follows. (14th DNA unit)-GTT-(1st DNA unit)-TGA-(2nd DNA unit)-CGA-(3rd DNA unit)TGT-(4th DNA unit)-GAT-( 5th DNA unit)-TTG-(6th DNA unit)-GTC-(7th DNA unit)-ATG-(8th DNA unit)-TGG-(9th DNA unit)-TAG-( 10th DNA unit)-AST-(11th DNA unit)-GTA-(12th DNA unit)-CTT-(13th DNA unit)-TST-(14th DNA unit).

2. Регуляция уровня экспрессии генов в почкующихся дрожжах из группы изобутанолпродуцирующих генов.2. Regulation of the level of gene expression in budding yeast from the group of isobutanol-producing genes.

(1) Почкующиеся дрожжи.(1) Budding yeast.

Почкующиеся дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) представляют собой эукариотический микроорганизм. Исследование почкующихся дрожжей было внедрено в качестве эукариотического модельного микроорганизма, его геномная последовательность была полностью установлена, и была собрана различная информация. Почкующиеся дрожжи осуществляют спиртовую ферментацию в качестве анаэробного дыхания. Почкующиеся дрожжи используются для ферментации пива, вина, японского сакэ и т.п. в течение длительного времени, и широко используются в качестве хозяев для продуцирования биоэтанола вследствие их высокой способности к продуцированию этанола. В настоящее время почкующиеся дрож- 8 045394 жи также широко используются для промышленных целей в качестве хозяев для производства полезных веществ, отличных от этанола, и также используются для продуцирования дополнительных полезных продуктов, таких как красители, отдушки или добавки, в дополнение к высшим спиртам, имеющим цепь из трех или более атомов углерода, или различным органическим кислотам. В отличие от бактерий, которые являются прокариотами, почкующиеся дрожжи, которые являются эукариотами, имеют органеллы, такие как митохондрии или ядро. Кроме того, поскольку почкующиеся дрожжи, как правило, имеют моноцистронный формат экспрессии вместо полицистронного формата экспрессии, для одного гена требуется один промотор. Например, для экспрессии 12 генов требуется 12 промоторов.Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) is a eukaryotic microorganism. The study of budding yeast has been established as a eukaryotic model microorganism, its genome sequence has been fully established, and various information has been collected. Budding yeast performs alcoholic fermentation as anaerobic respiration. Budding yeast is used to ferment beer, wine, Japanese sake, etc. for a long time, and are widely used as hosts for bioethanol production due to their high ethanol production capacity. Nowadays, budding yeast is also widely used for industrial purposes as hosts for the production of useful substances other than ethanol, and is also used to produce additional useful products such as dyes, flavors or additives, in addition to higher alcohols, having a chain of three or more carbon atoms, or various organic acids. Unlike bacteria, which are prokaryotes, budding yeast, which are eukaryotes, have organelles such as mitochondria or a nucleus. Additionally, since budding yeast typically has a monocistronic expression format instead of a polycistronic expression format, one promoter is required per gene. For example, 12 promoters are required to express 12 genes.

(2) Конструирование метаболического пути изобутанола.(2) Construction of the isobutanol metabolic pathway.

Основным применением изобутанола является применение в качестве растворителя для органического синтеза, растворителя для удаления краски и исходного материала для изобутилметакрилата. Кроме того, изобутанол может быть конвертирован в изобутилен посредством дегидратации, может использоваться в качестве исходного материала для агента топливной смеси или реактивного биотоплива, такого как этил-трет-бутиловый эфир (ЕТВЕ), и может далее использоваться в качестве исходного материала для различных полимеров посредством конвертирования изобутилена в изооктен (диизобутилен). Хотя почкующиеся дрожжи первоначально продуцируют этанол в качестве основного продукта, почкующиеся дрожжи немного продуцируют изобутанол в качестве сивушного спирта. На фиг. 3 представлен искусственный метаболический путь для почкующихся дрожжей, которые предназначены для продуцирования изобутанола на высоком уровне. Если два гена (например, kivd, происходящий из Lactococcus lactis, и ADH6, происходящий из почкующихся дрожжей), кодирующих декарбоксилазу кетокислот (KDC) и алкогольдегидрогеназу (ADH), добавить к 2-кетоизовалерату в метаболическом пути L-валина в почкующихся дрожжах, продуцирование изобутанола возрастает. Таким образом, эти гены добавляли к объекту сборки. Однако изобутанол не может эффективно продуцироваться по множеству причин, таких как то, что 2-кетоизовалерат является субстратом, который первоначально продуцируется в митохондриях, или NADPH, требуемый для редуктоизомеразы кетол-кислота (ILV5) и ADH6, является дефицитным. Таким образом, три гена, кодирующих ацетолактатсинтазу (ILV2), редуктоизомеразу кетол-кислота (ILV5) и дегидратазу дигидроксикислот (ILV3), составляющие путь от пировиноградной кислоты до 2кетоизовалерата (метаболический путь, указанный двойной линией на фиг. 3), который осуществляется в митохондрии, и яблочный фермент (МАЕ1) для коррекции уровня NADPH в митохондриях, т.е. всего четыре гена (гены, указанные двойной подчеркнутой линией на фиг. 3), добавляли в объекту сборки для повышения экспрессии этих генов. Более того, три гена: ilv2CEc, ilvDLl и alsLp, добавляли к объекту сборки так, чтобы метаболический путь описанных выше генов также конструировался на стороне цитоплазмы, и три гена фиксирующего угольную кислоту фермента (PYC2), яблочной дегидрогеназы (MDH2) и sMAE1, из которых удален сигнал митохондриальной локализации на N-конце яблочного фермента (МАЕ1), добавляли к объекту сборки для устранения дефицита NADPH в цитоплазме, иными словами, к объекту сборки добавляли всего шесть генов (гены, указанные однократным подчеркиванием на фиг. 3). Каждый из описанных выше 12 генов вносили с промотором и терминатором первичного метаболического каскада, способными к экспрессии в дрожжах на высоком уровне.The main uses of isobutanol are as a solvent for organic synthesis, a solvent for paint removal, and a starting material for isobutyl methacrylate. In addition, isobutanol can be converted to isobutylene by dehydration, can be used as a starting material for a fuel blending agent or jet biofuel such as ethyl tert-butyl ether (ETBE), and can be further used as a starting material for various polymers through converting isobutylene into isooctene (diisobutylene). Although budding yeast initially produces ethanol as its main product, budding yeast produces some isobutanol as fusel alcohol. In fig. Figure 3 shows an artificial metabolic pathway for budding yeast that is designed to produce isobutanol at high levels. If two genes (e.g., kivd, derived from Lactococcus lactis, and ADH6, derived from budding yeast) encoding ketoacid decarboxylase (KDC) and alcohol dehydrogenase (ADH) are added to 2-ketoisovalerate in the L-valine metabolic pathway in budding yeast, the production isobutanol increases. Thus, these genes were added to the assembly object. However, isobutanol cannot be produced efficiently for a variety of reasons, such as 2-ketoisovalerate being a substrate that is initially produced in the mitochondria, or NADPH required for ketol acid reductoisomerase (ILV5) and ADH6 being deficient. Thus, three genes encoding acetolactate synthase (ILV2), ketol acid reductoisomerase (ILV5) and dihydroxy acid dehydratase (ILV3) constitute the pathway from pyruvic acid to 2-ketoisovalerate (the metabolic pathway indicated by the double line in Fig. 3), which occurs in the mitochondria , and malic enzyme (MAE1) to correct NADPH levels in mitochondria, i.e. a total of four genes (genes indicated by the double underline in Fig. 3) were added to the assembly object to increase the expression of these genes. Moreover, three genes: ilv2CEc, ilvDLl and alsLp were added to the assembly object so that the metabolic pathway of the genes described above was also constructed on the cytoplasmic side, and three genes for carbonic acid fixing enzyme (PYC2), malic dehydrogenase (MDH2) and sMAE1, from which had the mitochondrial localization signal at the N-terminus of the malic enzyme (MAE1) removed, were added to the assembly object to correct the deficiency of NADPH in the cytoplasm, in other words, a total of six genes were added to the assembly object (genes indicated by a single underline in Fig. 3). Each of the 12 genes described above was introduced with a promoter and terminator of the primary metabolic cascade capable of high-level expression in yeast.

(3) Затравочная плазмида 1: конструирование набора из группы сверхэкспрессирующихся генов.(3) Seed plasmid 1: construction of a set of overexpressed genes.

Экспрессирующие кассеты с использованием 12 типов промоторов и терминаторов конструировали так, чтобы 12 генов могли экспрессироваться в почкующихся дрожжах. В частности, промоторы и терминаторы ADH1, FBA1, НХТ7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2 и ТРИ использовали для конструирования 12 типов экспрессирующих кассет (стрелки на ORF гена на фиг. 4 указывают на промоторную последовательность, в то время как указатели в виде булавок указывают на последовательность терминатора). Последовательность (...atgAGAAGAGCTCTTCAtaa...), в которой два участка BspQI размещены обратным образом, добавляли между промотором и терминатором каждой экспрессирующей кассеты, так чтобы часть от инициирующего кодона (ATG) до стоп-кодона (ТАА) гена, подлежащего встраиванию, могла быть субклонирована. Для промотора PDC1 и промотора TDH2, в качестве промотора промотора PDC1 и промотора TDH2 использовали последовательность, в которой G в положении -492 был заменен на С, и последовательность, в которой С в положении -462 был заменен на G, соответственно, для удаления участков BspQI, содержащихся в последовательности. Участок фермента рестрикции (участок SfiI), сконструированный так, чтобы уникальный 3'-концевой выступающий конец из 3 оснований, указанный для каждого номера единичной ДНК, появлялся после расщепления SfiI, был добавлен к левой и правой концевым последовательностям 12 типов экспрессирующих кассет, содержавших промотор и терминатор, и последовательность конструировали так, чтобы партнер по связыванию определялся посредством комплементарности. Эти экспрессирующие кассеты, содержащие 12 типов промоторов и терминаторов, были предназначены для клонирования в вектор рМА или рМК. Далее были выбраны ilvEc, ilvDL1, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc и sMAE1 в качестве 12 генов, составляющих группу, вовлеченную в метаболический путь изобутанола в почкующихся дрожжах, и последовательность модифицировали так, чтобы инициирующий кодон и стоп-кодон каждого гена были унифицированы как ATG и ТАА, соответственно. Эти гены также конструировали так, чтобы в них была добавлена последовательность (TAGGCTCTTCAatg...taaAGAAGAGCCTA), в которой участок BspQIExpression cassettes using 12 types of promoters and terminators were designed so that 12 genes could be expressed in budding yeast. In particular, the promoters and terminators of ADH1, FBA1, HXT7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2 and TRI were used to construct 12 types of expression cassettes (arrows on the gene ORF in Fig. 4 indicate the promoter sequence while the pin pointers indicate the terminator sequence). A sequence (...atgAGAAGAGCTCTTCAtaa...), in which the two BspQI regions are placed in a reverse manner, was added between the promoter and terminator of each expression cassette, so that the portion from the start codon (ATG) to the stop codon (TAA) of the gene to be inserted could have been subcloned. For the PDC1 promoter and the TDH2 promoter, a sequence in which the G at position -492 was replaced by a C and a sequence in which the C at position -462 was replaced by a G were used as the promoter of the PDC1 promoter and the TDH2 promoter, respectively, to remove the regions BspQI contained in the sequence. A restriction enzyme site (SfiI site), designed so that a unique 3-base 3'-terminal overhang specified for each DNA unit number appears after SfiI digestion, was added to the left and right terminal sequences of 12 types of expression cassettes containing a promoter both the terminator and the sequence were designed so that the binding partner was determined by complementarity. These expression cassettes, containing 12 types of promoters and terminators, were designed for cloning into the pMA or pMK vector. Next, ilvEc, ilvDL1, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc and sMAE1 were selected as 12 genes constituting a group involved in the isobutanol metabolic pathway in budding yeast, and the sequence was modified so that the initiator The codon and stop codon of each gene were unified as ATG and TAA, respectively. These genes were also designed to include a sequence (TAGGCTTCTTCAatg...taaAGAAGAGCCTA), in which the BspQI region

- 9 045394 помещен на обоих концах, так чтобы эти гены могли быть субклонированы в любую из 12 типов экспрессирующих кассет (фиг. 2). Эти гены, имеющие участок BspQI на обоих концах, конструировали так, чтобы клонировать их в вектор PCR-BluntII-TOPO. Наконец, конструировали всего 12 типов сверхэкспрессирующих кассет (ilvCEc-1st, ilvDL1-2nd, alsLp-3rd, kindEc-4th, ILV3-5th, ILV5-6th, ADH6-7th, PYC2-8th, ILV2-9th, MDH2-10th, maeBEc-11th и sMAEl-12th) (SEQ ID NO: 2-13), так чтобы ilvEc, ilvDL1, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc или sMAE1 были встроены в каждый из участков BspQI 12 типов экспрессирующих кассет, имеющих промоторы и терминаторы ADH1, FBA1, НХТ7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2 и TPI1, клонированные в рМА или pMK. Кроме того, фрагмент KanMX (kanMX4-13th) добавляли в качестве 13-го фрагмента (SEQ ID NO: 14) для обеспечения селекции с использованием агента в почкующихся дрожжах.- 9045394 is placed at both ends so that these genes can be subcloned into any of the 12 types of expression cassettes (Fig. 2). These genes, having a BspQI region at both ends, were designed to be cloned into the PCR-BluntII-TOPO vector. Finally, a total of 12 types of overexpression cassettes were constructed (ilvCEc-1st, ilvDL1-2nd, alsLp-3rd, kindEc-4th, ILV3-5th, ILV5-6th, ADH6-7th, PYC2-8th, ILV2-9th, MDH2-10th, maeBEc -11th and sMAEl-12th) (SEQ ID NO: 2-13), such that ilvEc, ilvDL1, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc or sMAE1 are inserted into each of the BspQI sites 12 types of expression cassettes having promoters and terminators ADH1, FBA1, HXT7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2 and TPI1, cloned into pMA or pMK. In addition, a KanMX fragment (kanMX4-13th) was added as the 13th fragment (SEQ ID NO: 14) to provide agent selection in budding yeast.

(4) Затравочная плазмида 2: конструирование набора из группы генов, подавляющих экспрессию.(4) Seed plasmid 2: construction of a set of genes that suppress expression.

Хотя использовали ту же последовательность промотора и терминатора, что и для конструирования (3) затравочной плазмиды 1: набора из группы сверхэкспрессирующихся генов, фрагмент ORF каждого гена, подлежащего встраиванию, конструировали так, чтобы он имел противоположное направлении относительно набора из группы сверхэкспрессирующихся генов. В частности, плазмиду, организованную так, чтобы она была способной к субклонированию части от инициирующего кодона (ATG) до стопкодона (ТАА) гена, подлежащего встраиванию между промотором и терминатором каждой экспрессирующей кассеты, который был сконструирован в (3), расщепляли BspQI и последовательность, в которой участки BspQI размещены в обратном направлении, вновь связывали с ней, тем самым получая плазмиду с измененной выступающей последовательностью (подчеркнутая последовательность ... atgttaAGAAGAGCTCTTCAcattaa....). Последовательности оснований подавляющих экспрессию кассет (ilvCEc-as-1st, ilvDL1-as-2nd, alsLp-as-3rd, kindEc-as-4th, ILV3-as-5th, ILV5-as-6th, ADH6-as-7th, PYC2-as-8th, ILV2-as9th, MDH2-as-10th, maeBEc-as-11th, и sMAE1-as-12th), полученных посредством этих процессов, представлены в SEQ ID NO: 15-26. Что касается единичной ДНК, единичные ДНК затравочной плазмиды 2, следовательно, являются более длинными, чем единичные ДНК затравочной плазмиды 1, на шесть оснований выступающей последовательности, которые были вновь внесены. Тот же маркер, что и у затравочной плазмиды 1, использовали для KanMX, который является маркером для селекции с агентом.Although the same promoter and terminator sequence was used as for the construction of (3) seed plasmid 1: the overexpressed gene set, the ORF fragment of each gene to be inserted was designed to be in the opposite direction to the overexpressed gene set. Specifically, a plasmid designed to be capable of subcloning the portion from the start codon (ATG) to the stop codon (TAA) of the gene to be inserted between the promoter and terminator of each expression cassette, which was constructed in (3), was digested with BspQI and the sequence , in which the BspQI regions are placed in the reverse direction, was relinked to it, thereby obtaining a plasmid with a modified overhang sequence (underlined sequence ... atgttaAGAAGAGCTCTTCAcattaa....). Base sequences of the expression suppressing cassettes (ilvCEc-as-1st, ilvDL1-as-2nd, alsLp-as-3rd, kindEc-as-4th, ILV3-as-5th, ILV5-as-6th, ADH6-as-7th, PYC2- as-8th, ILV2-as9th, MDH2-as-10th, maeBEc-as-11th, and sMAE1-as-12th) obtained through these processes are presented in SEQ ID NO: 15-26. As for the single DNA, the single DNAs of seed plasmid 2 are therefore longer than the single DNAs of seed plasmid 1 by the six bases of overhang that have been reintroduced. The same marker as seed plasmid 1 was used for KanMX, which is an agent selection marker.

(5) Конструирование затравочной плазмиды.(5) Construction of the seed plasmid.

Ген (область ORF) амплифицировали из почкующихся дрожжей (штамм YPH499) с использованием способа ПЦР. Сначала использовали праймеры, в которые был добавлен участок распознавания для фермента рестрикции, определенный выше, на 5'-конце праймеров для амплификации последовательности ДНК между комбинациями выступающих концов, определенных выше, в положении для вырезания желаемого выступающего конца, и в которых была дополнительно добавлена последовательность TAG на 5'-конец. Фрагмент ДНК сконструированной области амплифицировали из генома почкующихся дрожжей с использованием пары этих праймеров. Условия реакции ПЦР определялись добавлением для каждой реакции (50 мкл): 5 мкл 10х буфера KOD Plus Ver. 2, 3 мкл 25 мМ MgSO4, 5 мкл dNTP (по 2 мМ каждого), 1 мкл KOD Plus (1 единица/мкл), 48 пг ДНК фага лямбда (TOYOBO), 15 пмоль праймеров (Fпраймер и R-праймер, соответственно) и стерильной воды, и реакцию проводили с использованием системы GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой. После инкубации при 94°С в течение 2 минут проводили 30 циклов, каждый из которых включал 98°С в течение 10 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 68°С в течение 1 минуты, и конечную инкубацию проводили при 68 °С в течение 7 минут.The gene (ORF region) was amplified from budding yeast (strain YPH499) using the PCR method. Primers were first used to which the restriction enzyme recognition site defined above was added at the 5' end of the primers to amplify the DNA sequence between the combinations of overhangs defined above at the position for cutting the desired overhang, and to which the sequence was further added TAG at the 5' end. A DNA fragment of the designed region was amplified from the budding yeast genome using a pair of these primers. PCR reaction conditions were determined by adding for each reaction (50 µl): 5 µl of 10x buffer KOD Plus Ver. 2.3 µl 25 mM MgSO4 , 5 µl dNTPs (2 mM each), 1 µl KOD Plus (1 unit/µl), 48 pg lambda phage DNA (TOYOBO), 15 pmol primers (Fprimer and R-primer, respectively ) and sterile water, and the reaction was performed using a GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) according to the following program. After incubation at 94°C for 2 minutes, 30 cycles were performed, each consisting of 98°C for 10 seconds, 55°C for 30 seconds and 68°C for 1 minute, and a final incubation was carried out at 68°C within 7 minutes.

К амплифицированному фрагменту ДНК применяли напряжение 100 В (приблизительно 8 В/см) с использованием устройства для гель-электрофореза общего назначения (i-MyRun.N, система электрофореза нуклеиновых кислот, Cosmo Bio) и подвергали электрофорезу в течение 1 часа в присутствии 1х буфера ТАЕ (буфер Tris-ацетат-EDTA) в 0,7% агарозном геле с низкой температурой плавления (2гидроксиэтилагароза типа VII, Sigma), посредством чего плазмидный вектор и единичные ДНК разделяли. Этот гель для электрофореза окрашивали 100 мл 1х буфера ТАЕ, содержавшего 1 мкг/мл бромида этидия (Sigma), в течение 30 минут и освещали ультрафиолетовыми лучами с длинной длиной волны (366 нм) для визуализации, после чего продукт ПЦР, имевший представляющий интерес размер, вырезали с использованием лезвия и собирали в 1,5-мл пробирку. К собранному агарозному гелю с низкой температурой плавления (приблизительно 300 мг) добавляли 1х буфер ТАЕ, так чтобы общий объем составлял приблизительно 700 мкл, который затем поддерживали при постоянной температуре 65°С в течение 10 минут, тем самым растворяя гель. Затем добавляли равное количество ТЕ-насыщенного фенола (Nacalai Tesque) и хорошо перемешивали для деактивации фермента рестрикции. Смесь разделяли на фенольную фазу и водную фазу посредством центрифугирования (20000xg, 10 минут), и водную фазу (приблизительно 900 мкл) собирали в новую 1,5-мл пробирку. К ней добавляли 500 мкл 1-бутанола (Wako Pure Chemical Industries) и хорошо перемешивали, а затем проводили разделение посредством центрифугирования (20000xg, 1 минута) и удаления насыщенного водой 1-бутанола. Это действие повторяли до тех пор, пока объем водной фазы не составил 450 мкл или менее, тем самым уменьшая объем водной фазы. Добавляли 50 мкл 3 М буфера на основе ацетата калия-уксусной кислоты (рН 5,2) и 900A voltage of 100 V (approximately 8 V/cm) was applied to the amplified DNA fragment using a general purpose gel electrophoresis device (i-MyRun.N, Nucleic Acid Electrophoresis System, Cosmo Bio) and electrophoresed for 1 hour in the presence of 1x buffer TAE (Tris-acetate-EDTA buffer) in a 0.7% low melting point agarose gel (2hydroxyethyl agarose type VII, Sigma), whereby the plasmid vector and single DNAs were separated. This electrophoresis gel was stained with 100 ml of 1x TAE buffer containing 1 μg/ml ethidium bromide (Sigma) for 30 minutes and illuminated with long wavelength ultraviolet rays (366 nm) for visualization, after which the PCR product of the size of interest , cut using a blade and collected in a 1.5 ml tube. 1x TAE buffer was added to the collected low melting point agarose gel (approximately 300 mg) so that the total volume was approximately 700 μl, which was then maintained at a constant temperature of 65°C for 10 minutes, thereby dissolving the gel. An equal amount of TE-saturated phenol (Nacalai Tesque) was then added and mixed well to deactivate the restriction enzyme. The mixture was separated into a phenolic phase and an aqueous phase by centrifugation (20,000xg, 10 minutes), and the aqueous phase (approximately 900 μl) was collected in a new 1.5-ml tube. 500 μL of 1-butanol (Wako Pure Chemical Industries) was added to it and mixed well, and then separated by centrifugation (20000xg, 1 minute) and removing the water-saturated 1-butanol. This action was repeated until the volume of the aqueous phase was 450 μl or less, thereby reducing the volume of the aqueous phase. Add 50 μl of 3 M potassium acetate-acetic acid buffer (pH 5.2) and 900

- 10 045394 мкл этанола и проводили центрифугирование (20000xg, 10 минут) для преципитации ДНК, которую затем ополаскивали 70% этанолом и растворяли в 20 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0). Эту собранную ДНК хранили при -20°С до применения.- 10045394 μl ethanol and centrifugation was performed (20000xg, 10 minutes) to precipitate DNA, which was then rinsed with 70% ethanol and dissolved in 20 μl TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). This collected DNA was stored at -20°C until use.

Полученный фрагмент ДНК клонировали в плазмидный вектор Escherichia coli способом клонирования с ТА, представленным ниже. 1 мкл 10х буфера Ex-Taq, прилагаемого к Ex-Taq, который представляет собой фермент для реакции ПЦР от TAKARA, 0,5 мкл 100 мМ dATP, и 0,5 мкл Ex-Taq добавляли к 8 мкл фрагмента ДНК, и эту смесь поддерживали при постоянной температуре 65°С в течение 10 минут, чтобы тем самым добавить выступающий конец А к 3'-концу фрагмента ДНК. 1 мкл pMD19-Simple от TAKARA и 3 мкл стерильной воды смешивали с 1 мкл этого раствора фрагмента ДНК, затем к нему добавляли 5 мкл смеси TAKATA Ligation (Mighty) Mix, и смесь поддерживали при постоянной температуре 16°С в течение 30 минут. 5 мкл этого раствора для лигирования добавляли к 50 мкл химически компетентных клеток DH5a Escherichia coli, и смесь поддерживали при постоянной температуре на льду в течение 15 минут, затем ее подвергали тепловому шоку при 42° в течение 30 секунд, оставляли ее на льду в течение 2 минут, а затем к ней добавляли 200 мкл среды LB. Смесь поддерживали при постоянной температуре 37°С в течение 1 часа, затем распределяли на чашке с LB, содержавшей 1,5% агар и содержавшей карбенициллин в концентрации 100 мкг/мл, и культивировали в течение ночи при 37°С, посредством чего получали трансформант плазмиды.The resulting DNA fragment was cloned into an Escherichia coli plasmid vector using the TA cloning method presented below. 1 µl of 10x Ex-Taq buffer supplied with Ex-Taq, which is an enzyme for the PCR reaction from TAKARA, 0.5 µl of 100 mM dATP, and 0.5 µl of Ex-Taq was added to 8 µl of DNA fragment, and this mixture maintained at a constant temperature of 65°C for 10 minutes to thereby add overhang A to the 3' end of the DNA fragment. 1 μl of pMD19-Simple from TAKARA and 3 μl of sterile water were mixed with 1 μl of this DNA fragment solution, then 5 μl of TAKATA Ligation (Mighty) Mix was added to it, and the mixture was maintained at a constant temperature of 16°C for 30 minutes. 5 µl of this ligation solution was added to 50 µl of chemically competent DH5a Escherichia coli cells, and the mixture was kept at constant temperature on ice for 15 minutes, then heat shocked at 42° for 30 seconds, left on ice for 2 minutes, and then 200 μl of LB medium was added to it. The mixture was maintained at a constant temperature of 37°C for 1 hour, then spread on an LB plate containing 1.5% agar containing carbenicillin at a concentration of 100 μg/ml, and cultured overnight at 37°C, whereby a transformant was obtained plasmids.

Полученную колонию обрабатывали с использованием реагента для получения матричной ДНК для ПНР (реагент для получения ДНК Cica geneus®, Kanto Kagaku). В частности, получали 2,5 мкл раствора, в котором реагент а и реагент b из набора реагентов были смешаны в соотношении 1:10, и небольшую часть колонии на чашке, собранную с использованием зубочистки, суспендировали в растворе, а затем суспензию обрабатывали при 72°С в течение 6 минут, а затем ее обрабатывали при 94°С в течение 3 минут. К полученной жидкости добавляли 2,5 мкл 10х фермента для TAKARA Ex-Taq, 2 мкл 2,5 мМ раствора dNTP, 0,25 мкл праймера M13F в концентрации 10 пмоль/мкл, 0,25 мкл праймера M13R в концентрации 10 пмоль/мкл, 17 мкл стерильной воды, и 0,5 мкл Ех-TaqHS, и смесь инкубировали при 94°С в течение 5 минут с последующим проведением 30 циклов, каждый из которых состоял из 98°С в течение 20 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, для амплификации ДНК. Последовательность оснований этого продукта ПНР анализировали для исследования того, совпадает ли она полностью с желаемой последовательностью. В результате, правильная последовательность была получена для всех клонов.The resulting colony was treated with DNA template reagent for PNR (Cica geneus® DNA reagent, Kanto Kagaku). Specifically, 2.5 μl of a solution was prepared in which reagent a and reagent b from the reagent kit were mixed in a ratio of 1:10, and a small portion of the colony on the plate, collected using a toothpick, was suspended in the solution, and then the suspension was treated at 72 °C for 6 minutes and then it was treated at 94 °C for 3 minutes. To the resulting liquid was added 2.5 μl of 10x enzyme for TAKARA Ex-Taq, 2 μl of 2.5 mM dNTP solution, 0.25 μl of M13F primer at a concentration of 10 pmol/μl, 0.25 μl of M13R primer at a concentration of 10 pmol/μl , 17 µl sterile water, and 0.5 µl Ex-TaqHS, and the mixture was incubated at 94°C for 5 minutes, followed by 30 cycles, each of which consisted of 98°C for 20 seconds, 55°C for 30 seconds and 72°C for 1 minute to amplify DNA. The base sequence of this PNR product was analyzed to examine whether it exactly matches the desired sequence. As a result, the correct sequence was obtained for all clones.

Каждый из трансформантов Escherichia coli, имевших плазмиду, в которую был клонирован фрагмент ДНК, имевший желаемую последовательность, культивировали в 2 мл среды LB, содержавшей 100 мкг/мл карбенициллина при 37°С и 120 об/мин в течение ночи. Полученную микробную массу очищали с использованием набора QLAfilter Plasmid miniKit (Qiagen) в соответствии с руководством. Полученную плазмиду расщепляли BspQI и область ORF собирали путем фракционирования по размеру с использованием электрофореза.Each of the Escherichia coli transformants, which had a plasmid into which a DNA fragment having the desired sequence was cloned, was cultured in 2 ml of LB medium containing 100 μg/ml carbenicillin at 37°C and 120 rpm overnight. The resulting microbial mass was purified using the QLAfilter Plasmid miniKit (Qiagen) according to the manual. The resulting plasmid was digested with BspQI and the ORF region was collected by size fractionation using electrophoresis.

Thermo Fisher просили синтезировать ДНК (для сверхэкспрессии согласно фиг. 2), так чтобы фрагменты ДНК, в которых промотор и терминатор дрожжей связаны в участке BspQI, можно было вырезать в участке SfiI. Эти фрагменты ДНК доставляли в ходе клонирования в плазмидный вектор рАМ или рМК. Эту плазмиду расщепляли BspQI и фрагмент BspQI описанной выше ORF, связывали с ней с получением конструкции, которая имела форму плазмиды, имевшей единичные ДНК затравочной плазмиды 1. Последовательности этих единичных фрагментов ДНК являются такими, как показано в SEQ ID NO: 2-13. Для затравочной плазмиды 2 описанные выше фрагменты ДНК, клонированные в рМА или рМК, в которых промотор и терминатор связаны в участке BspQI, расщепляли посредством BspQI и вносили линкерную ДНК, тем самым получая новую конструкцию как и в конструкции для подавления экспрессии согласно фиг. 2. Эту плазмиду расщепляли посредством BspQI и фрагмент BspQI описанной выше ORF вносили для получения конструкции. Каждый из трансформантов Escherichia coli, имевших эти плазмиды, в которые был клонирован фрагмент ДНК, имевший желаемую последовательность, культивировали в 2 мл среды LB, содержавшей 100 мкг/мл карбенициллина, при 37°С и 120 об/мин в течение ночи. Полученную микробную массу очищали с использованием набора QIAfilter Plasmid miniKit (Qiagen) в соответствии с руководством. 10 мкл полученной плазмиды фракционировали, добавляли 30 мкл стерильной воды, 5 мкл 10х буфера #2 NEB, и 5 мкл фермента рестрикции SfiI (NEB), и смеси позволяли реагировать при 50°С в течение 2 часов, тем самым отделяя единичные фрагменты ДНК от плазмидного вектора. К полученному продукту применяли напряжение 50 В (приблизительно 4 В/см) с использованием устройства для гель-электрофореза общего назначения, и подвергали электрофорезу в течение 1 часа в присутствии 1х буфера ТАЕ в 0,7% агарозном геле с низкой температурой плавления, посредством чего плазмидный вектор и единичные ДНК разделяли. Этот гель для электрофореза окрашивали 100 мл 1х буфера ТАЕ, содержавшего 1 мкг/мл бромида этидия (Sigma), в течение 30 минут и освещали ультрафиолетовым лучом с длинной длиной волны (366 нм) для визуализации, после чего участок размером приблизительно 3 т.п.н. вырезали с использованием лезвия и собирали в 1,5-мл пробирку. Собранный агарозный гель с низкой температурой плавления (приблизительно 300 мг) очищали описаннымThermo Fisher was asked to synthesize DNA (for overexpression according to Fig. 2) so that DNA fragments in which the yeast promoter and terminator are bound at the BspQI site could be excised at the SfiI site. These DNA fragments were delivered during cloning into the plasmid vector pAM or pMK. This plasmid was digested with BspQI and the BspQI fragment of the ORF described above and linked thereto to obtain a construct which was in the form of a plasmid having single DNA fragments of seed plasmid 1. The sequences of these single DNA fragments are as shown in SEQ ID NO: 2-13. For seed plasmid 2, the above-described DNA fragments cloned into pMA or pMK, in which the promoter and terminator are linked at the BspQI site, were digested with BspQI and the linker DNA was introduced, thereby obtaining a new construct as in the expression suppression construct according to FIG. 2. This plasmid was digested with BspQI and the BspQI fragment of the ORF described above was introduced to obtain the construct. Each of the Escherichia coli transformants that had these plasmids into which a DNA fragment having the desired sequence had been cloned was cultured in 2 ml of LB medium containing 100 μg/ml carbenicillin at 37°C and 120 rpm overnight. The resulting microbial mass was purified using the QIAfilter Plasmid miniKit (Qiagen) according to the manual. 10 µl of the resulting plasmid was fractionated, 30 µl of sterile water, 5 µl of 10x buffer #2 NEB, and 5 µl of restriction enzyme SfiI (NEB) were added, and the mixture was allowed to react at 50°C for 2 hours, thereby separating single DNA fragments from plasmid vector. The resulting product was applied at 50 V (approximately 4 V/cm) using a general purpose gel electrophoresis apparatus, and electrophoresed for 1 hour in the presence of 1x TAE buffer on a 0.7% low melting point agarose gel, whereby the plasmid vector and single DNAs were separated. This electrophoresis gel was stained with 100 ml of 1x TAE buffer containing 1 μg/ml ethidium bromide (Sigma) for 30 minutes and illuminated with long wavelength ultraviolet light (366 nm) for visualization, after which an area measuring approximately 3 kb .n. cut using a blade and collected in a 1.5 ml tube. The collected low melting point agarose gel (approximately 300 mg) was purified as described.

- 11 045394 выше образом и растворяли в 20 мкл ТЕ. Единичную ДНК-плазмиду, полученную таким образом, количественно определяли с использованием флуоресцентного устройства считывания планшетов для SYBR- 11 045394 above and dissolved in 20 μl of TE. The single DNA plasmid thus obtained was quantified using a fluorescent plate reader for SYBR

GreenII, который представляет собой флуоресцентный краситель для нуклеиновой кислоты, с использованием калибровочной кривой, созданной на основе серии разведений коммерчески доступной ДНК генома фага-лямбда (TOYOBO).GreenII, which is a fluorescent nucleic acid dye, using a calibration curve generated from a dilution series of commercially available lambda phage genome DNA (TOYOBO).

(6) Сборка гена.(6) Gene assembly.

мкл 2х буфера для лигирования добавляли к 10 мкл раствора со смесью, содержавшего 0,1 фмоль или более единичных ДНК SEQ ID NO: 2-14 для сборки затравочной плазмиды 1 или единичных ДНК SEQ ID NO: 14-26 для сборки затравочной плазмиды 2 и pGETS302-SfiI (SEQ ID NO: 1), который представляет собой вектор для сборки гена, в эквимолярных количествах. Всю смесь поддерживали при постоянной температуре 37°С в течение 5 минут с последующим добавлением 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (Takara) и поддержанием смеси при постоянной температуре 37°С в течение 4 часов. Из нее отбирали 10 мкл и подвергали электрофорезу для подтверждения лигирования. Затем, из нее отбирали 10 мкл в новую пробирку, в нее добавляли 100 мкл компетентных клеток Bacillus subtilis, и смесь подвергали культивированию с вращением посредством ротора Duck при 37°С в течение 30 минут. Затем добавляли 300 мкл среды LB и смесь подвергали культивированию с вращением посредством ротора Duck при 37°С в течение 1 часа, а затем культуральный раствор распределяли на чашку LB, содержавшую 10 мкг/мл тетрациклина, и культивировали в течение ночи при 37°С. Из колоний было получено 100 трансформантов как для конструкции для сверхэкспрессии, так и для конструкции для подавления экспрессии генов. Плазмиду экстрагировали и паттерн расщепления ферментом рестрикции анализировали для селекции одного трансформанта, имевшего представляющую интерес структуру (затравочные плазмиды стадии (А) фиг. 4), для каждой из конструкций.µl of 2x ligation buffer was added to 10 µl of a mixture solution containing 0.1 fmol or more DNA units SEQ ID NO: 2-14 to assemble seed plasmid 1 or DNA units SEQ ID NO: 14-26 to assemble seed plasmid 2 and pGETS302-SfiI (SEQ ID NO: 1), which is a gene assembly vector, in equimolar amounts. The entire mixture was maintained at a constant temperature of 37°C for 5 minutes, followed by the addition of 1 μl of T4 DNA ligase (Takara) and maintaining the mixture at a constant temperature of 37°C for 4 hours. 10 μl was taken from it and subjected to electrophoresis to confirm ligation. Then, 10 μl of it was taken into a new tube, 100 μl of Bacillus subtilis competent cells were added to it, and the mixture was subjected to spinning culture using a Duck rotor at 37°C for 30 minutes. 300 μl of LB medium was then added and the mixture was spin cultured using a Duck rotor at 37°C for 1 hour, and then the culture solution was spread onto an LB plate containing 10 μg/ml tetracycline and cultured overnight at 37°C. From the colonies, 100 transformants were obtained for both the overexpression and gene silencing constructs. The plasmid was extracted and the restriction enzyme digestion pattern was analyzed to select one transformant having the structure of interest (stage (A) seed plasmids of Fig. 4) for each of the constructs.

(7) Очистка затравочной плазмиды до высокой степени чистоты.(7) Purification of the seed plasmid to a high degree of purity.

Плазмидную ДНК с высокой степенью очистки предоставляли посредством способа ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия-бромида этидия. В частности, получали 200 мл среды LB, дополненной антибиотиком (тетрациклин), каждые ее 100 мл помещали в 500-мл коническую колбу и культивировали в течение ночи при 37°С. После достаточной пролиферации в каждую колбу добавляли 100 мкл 1 М IPTG для увеличения количества копий плазмиды, и смесь далее культивировали в течение приблизительно 3-12 часов. После завершения культивирования 50 мл каждого из полученных продуктов распределяли в четыре 50-мл пробирки (Falcon 2070) и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант выбрасывали и бактериальный остаток полностью освобождали посредством встряхивания. Получали раствор 10 мг/мл Sol.I, содержавший лизоцим (композиция: 50 мМ глюкоза, 25 мМ Tris-Cl (рН 8,0) и 10 мМ EDTA), и 2,5 мл каждого раствора добавляли в четыре пробирки, содержавшие бактерии, и хорошо перемешивали. Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Центрифугирование проводили при 5000 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляли путем декантирования, в каждую из четырех пробирок снова добавляли 2,5 мл Sol.I, свободного от лизоциам, и осадок суспендировали до однородного состояния. Получали свежий Sol.II (композиция: 0,2 Н NaOH и 1% (масс/об.) додецилсульфат натрия), 5 мл каждого раствора добавляли в четыре пробирки и смесь медленно перемешивали до прозрачного состояния. В каждую пробирку добавляли 3,75 мл Sol.III (композиция: 60 мл 5 М ацетат калия, 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и 28,5 мл воды) и смешивали при умеренном усилии до определенной степени, так чтобы белое мутное вещество полностью диспергировалось. Центрифугирование проводили при 5000 об/мин в течение 10 минут и супернатант аспирировали пипеткой и переносили в четыре новых 50-мл пробирки (Falcon 2070) с навинчивающейся крышкой. В каждую пробирку добавляли 5 мл смеси фенол/хлороформ и энергично перемешивали. Центрифугирование проводили при 5000 об/мин в течение 10 минут, и супернатант аспирировали пипеткой и переносили в четыре новых 50-мл пробирки (Falcon 2070) с навинчивающейся крышкой. В каждую из пробирок добавляли 25 мл 100% этанола и перемешивали, а затем проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли. В каждую пробирку добавляли 2,5 мл каждого раствора (конечная концентрация 10 мкг/мл), в котором 10 мкл 10 мг/мл раствора РНК-азы А было добавлено к 10 мл ТЕ, и осадок растворяли. Жидкость из четырех пробирок собирали в одну пробирку и инкубировали в течение 30 минут с использованием инкубатора с газовой фазой при 37°С. После завершения инкубации добавляли 5 мл смеси фенол/хлороформ и хорошо перемешивали, а затем проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносили в новую 50-мл пробирку, в нее добавляли 1 мл Sol.ni, а затем к смеси добавляли 25 мл 100% этанола и перемешивали. Затем проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 10 минут для удаления супернатанта. К остатку добавляли 5,4 мл ТЕ и полностью растворяли. Затем добавляли точно отвешенные 6,40 г хлорида цезия и полностью растворяли. Более того, добавляли 2,6 мл раствора хлорида цезия в концентрации 1,3 г/мл (раствор, полученный путем смешения 1,3 г хлорида цезия и 1 мл воды, в котором не проводили волюметрическую коррекцию). Наконец, добавляли 600 мкл раствора бромида этидия 10 мг/мл и хорошо перемешивали. Подготавливали одну пробирку для ультрацентрифугирования (Beckman 362181) и описанную выше смесь переносили в пробирку для ультрацентрифугирования. Добавляли воду или раствор хлорида цезияHighly purified plasmid DNA was provided via a cesium chloride-ethidium bromide gradient ultracentrifugation method. Specifically, 200 ml of LB medium supplemented with antibiotic (tetracycline) was prepared, each 100 ml was placed in a 500 ml conical flask and cultured overnight at 37°C. After sufficient proliferation, 100 μl of 1 M IPTG was added to each flask to increase the copy number of the plasmid, and the mixture was further cultured for approximately 3-12 hours. After completion of culture, 50 ml of each of the resulting products was distributed into four 50 ml tubes (Falcon 2070) and centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant was discarded and the bacterial residue was completely released by shaking. A solution of 10 mg/ml Sol.I containing lysozyme (composition: 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) and 10 mM EDTA) was prepared, and 2.5 ml of each solution was added to four test tubes containing bacteria , and mixed well. The resulting mixture was incubated at 37°C for 30 minutes. Centrifugation was carried out at 5000 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed by decanting, 2.5 ml of lyso-free Sol.I was again added to each of the four tubes, and the pellet was suspended until homogeneous. Fresh Sol.II was prepared (composition: 0.2 N NaOH and 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate), 5 ml of each solution was added to four test tubes and the mixture was slowly stirred until clear. To each test tube, add 3.75 ml Sol.III (composition: 60 ml 5 M potassium acetate, 11.5 ml glacial acetic acid and 28.5 ml water) and mix with moderate force to a certain extent, so that the white cloudy substance is completely dispersed. Centrifugation was performed at 5000 rpm for 10 minutes and the supernatant was aspirated with a pipette and transferred into four new 50-ml screw cap tubes (Falcon 2070). 5 ml of phenol/chloroform mixture was added to each tube and mixed vigorously. Centrifugation was performed at 5000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was aspirated with a pipette and transferred into four new 50-ml screw cap tubes (Falcon 2070). 25 ml of 100% ethanol was added to each tube and mixed, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed. To each tube, 2.5 ml of each solution (final concentration 10 μg/ml) was added, in which 10 μl of 10 mg/ml RNase A solution was added to 10 ml of TE, and the precipitate was dissolved. The liquid from the four tubes was collected into one tube and incubated for 30 minutes using a gas phase incubator at 37°C. After completion of incubation, 5 ml of phenol/chloroform mixture was added and mixed well, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant was transferred to a new 50 ml tube, 1 ml Sol.ni was added to it, and then 25 ml 100% ethanol was added to the mixture and mixed. Then centrifugation was carried out at 5000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant. 5.4 ml of TE was added to the residue and completely dissolved. Then accurately weighed 6.40 g of cesium chloride was added and completely dissolved. Moreover, 2.6 ml of cesium chloride solution at a concentration of 1.3 g/ml was added (a solution prepared by mixing 1.3 g of cesium chloride and 1 ml of water, in which no volumetric correction was performed). Finally, 600 μL of 10 mg/mL ethidium bromide solution was added and mixed well. One ultracentrifuge tube (Beckman 362181) was prepared and the above mixture was transferred to the ultracentrifuge tube. Add water or cesium chloride solution

- 12 045394- 12 045394

1,3 г/мл (с удельной плотностью приблизительно 1,5 г/мл) для тонкой коррекции массы, так чтобы отличие массы от противовеса составляло 20 мг или менее. Центрифугирование проводили с использованием устройства для ультрацентрифугирования (Beckman Coulter) в следующих условиях. Центрифугирование проводили при температуре 18°С, скорости 50000 об/мин, максимальном ускорении и максимальном торможении, в течение 15 часов или более. После завершения центрифугирования подготавливали 1-мл шприц с иглой (21G х 5/8) и помещали в полосу плазмиды в ссс-форме для сбора раствора плазмиды и переноса его в 15-мл пробирку при наблюдении с использованием ультрафиолетового луча (365 нм). Добавляли 500 мкл Sol.III, а затем добавляли воду, так чтобы общий объем составлял 3 мл. Затем добавляли 9 мл 100% этанола. Центрифугирование проводили при 5000 об/мин в течение 10 минут для удаления супернатанта. К полученному преципитату добавляли 700 мкл ТЕ в 15-мл пробирке и ДНК растворяли. Полученный продукт переносили в 1,5-мл пробирку, добавляли 600 мкл 1-бутанола и перемешивали, смесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение приблизительно 10 секунд для разделения смеси на два слоя, и верхний слой бутанола выбрасывали. Снова добавляли 600 мкл 1-бутанола и перемешивали, смесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение приблизительно 10 секунд для разделения смеси на два слоя, и верхний слой бутанола выбрасывали. Это действие продолжали до тех пор, пока объем водного слоя не становился 450 мкл или менее. Добавляли 50 мкл Sol.III и далее добавляли 900 мкл 100% этанола. Центрифугирование проводили при 15000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант выбрасывали и осадок ополаскивали 70% этанолом. Осадок растворяли в 22 мкл ТЕ.1.3 g/ml (with a specific gravity of approximately 1.5 g/ml) to finely adjust the mass so that the mass difference from the counterweight is 20 mg or less. Centrifugation was performed using an ultracentrifugation device (Beckman Coulter) under the following conditions. Centrifugation was carried out at a temperature of 18°C, a speed of 50,000 rpm, maximum acceleration and maximum deceleration, for 15 hours or more. After centrifugation was completed, a 1-mL syringe with a needle (21G x 5/8) was prepared and placed into the plasmid strip in CC form to collect the plasmid solution and transfer it into a 15-mL tube under observation using ultraviolet light (365 nm). 500 µl Sol.III was added and then water was added so that the total volume was 3 ml. Then 9 ml of 100% ethanol was added. Centrifugation was performed at 5000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant. 700 μl of TE in a 15-ml tube was added to the resulting precipitate and the DNA was dissolved. The resulting product was transferred to a 1.5 mL tube, 600 μL of 1-butanol was added and mixed, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for approximately 10 seconds to separate the mixture into two layers, and the top butanol layer was discarded. 600 μl of 1-butanol was again added and mixed, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for approximately 10 seconds to separate the mixture into two layers, and the top layer of butanol was discarded. This action was continued until the volume of the aqueous layer became 450 μl or less. 50 µl Sol.III was added and then 900 µl 100% ethanol was added. Centrifugation was carried out at 15,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was discarded and the pellet was rinsed with 70% ethanol. The sediment was dissolved in 22 μl of TE.

(8) Получение единичной ДНК из затравочной плазмиды.(8) Obtaining single DNA from the seed plasmid.

Получение единичной ДНК на стадии (В), представленной на фиг. 4, проводили следующим образом. 300 нг затравочной плазмиды, очищенной до высокой степени чистоты способом ультрацентрифугирования, фракционировали и разбавляли до 40 мкл стерильной водой, затем добавляли 5 мкл 10х буфера #2 NEB и 5 мкл фермента рестрикции SfiI (NEB), и их смеси позволяли реагировать при 37°С в течение 2 часов. 1 мкл реакционного раствора подвергали электрофорезу для подтверждения расщепления. Затем реакционные растворы двух затравочных плазмид объединяли и к ним добавляли 450 мкл смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) (Nacalai Tesque) и перемешивали, а затем смесь разделяли на фенольную фазу и водную фазу посредством центрифугирования (20000xg, 10 минут) и сбора водной фазы (приблизительно 900 мкл) в новую 1,5-мл пробирку. Добавляли 500 мкл 1-бутанола (Wako Pure Chemical Industries) и тщательно перемешивали, а затем проводили разделение посредством центрифугирования (20000xg, 1 минута) и удаление насыщенного водой 1-бутанола. Это действие повторяли до тех пор, пока объем водной фазы на составлял 450 мкл или менее, тем самым уменьшая объем водной фазы. Добавляли 50 мкл 3 М буфера ацетат калия-уксусная кислота (рН 5,2) и 900 мкл этанола и проводили центрифугирование (20000xg, 10 минут) для осаждения ДНК, которую затем промывали 70% этанолом и растворяли в 20 мкл ТЕ.Preparation of a single DNA in step (B) shown in FIG. 4 was carried out as follows. 300 ng of seed plasmid, purified to high purity by ultracentrifugation, was fractionated and diluted to 40 μl with sterile water, then 5 μl of 10x buffer #2 NEB and 5 μl of restriction enzyme SfiI (NEB) were added and the mixture was allowed to react at 37°C within 2 hours. 1 μL of the reaction solution was subjected to electrophoresis to confirm cleavage. The reaction solutions of the two seed plasmids were then combined and 450 μl of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) (Nacalai Tesque) was added and mixed, and then the mixture was separated into a phenolic phase and an aqueous phase by centrifugation (20000xg, 10 minutes) and collect the aqueous phase (approximately 900 µl) into a new 1.5 ml tube. 500 μL of 1-butanol (Wako Pure Chemical Industries) was added and mixed thoroughly, followed by separation by centrifugation (20,000xg, 1 minute) and removal of water-saturated 1-butanol. This action was repeated until the volume of the aqueous phase was 450 μl or less, thereby reducing the volume of the aqueous phase. 50 μl of 3 M potassium acetate-acetic acid buffer (pH 5.2) and 900 μl of ethanol were added and centrifugation (20,000xg, 10 min) was performed to precipitate the DNA, which was then washed with 70% ethanol and dissolved in 20 μl of TE.

(9) Конструирование комбинаторной библиотеки.(9) Construction of a combinatorial library.

Конструирование комбинаторной библиотеки на стадии (С) фиг. 4 проводили следующим образом. Раствор со смесью ДНК, полученный согласно (8), собирали способом сборки генов, представленным в (6), с получением приблизительно 400 трансформантов. Колонии 96 штаммов случайным образом отбирали из полученных трансформантов и культивировали в течение ночи в среде LB, содержавшей 2 мл тетрациклина в концентрации 10 мкг/мл. Добавляли IPTG для увеличения количества копий внутренней части плазмиды, так чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ, и смесь далее культивировали при 37°С в течение 3 часов. Плазмиды экстрагировали из полученной микробной массы. Направление гена каждой из этих экстрагированных плазмид определяли способом ПЦР с использованием набора праймеров, представленных в SEQ ID NO: 27-62 (фиг. 5). В результате, было выявлено 75 клонов, имевших все элементы 12 генов, и в 21 клоне была обнаружена частичная утрата или перекрывание единичных ДНК. Был выявлен 71 тип различных комбинаций в 75 клонах, и в 4 клонах было выявлено перекрывание типов.Construction of a combinatorial library in step (C) of FIG. 4 was carried out as follows. The DNA mixture solution prepared according to (8) was collected by the gene assembly method presented in (6), obtaining approximately 400 transformants. Colonies of 96 strains were randomly selected from the resulting transformants and cultivated overnight in LB medium containing 2 ml of tetracycline at a concentration of 10 μg/ml. IPTG was added to increase the copy number of the internal plasmid so that the final concentration was 1 mM, and the mixture was further cultured at 37°C for 3 hours. Plasmids were extracted from the resulting microbial mass. The gene direction of each of these extracted plasmids was determined by PCR using the primer set shown in SEQ ID NO: 27-62 (Fig. 5). As a result, 75 clones were identified that had all the elements of 12 genes, and in 21 clones partial loss or overlap of single DNA was detected. 71 types of different combinations were identified in 75 clones, and overlapping types were detected in 4 clones.

(10) Введение комбинаторной библиотеки в дрожжи.(10) Introduction of a combinatorial library into yeast.

комбинаторных библиотек, полученных согласно (9), вводили в дрожжи с использованием способа с ацетатом лития (LiAc). В частности, S. cerevisiae штамма YPH499, который является родительским штаммом, инокулировали в 5 мл среды YPDA (10 г/л сухого дрожжевого экстракта (произведенный Nacalai Tesque), 20 г/л пептона (произведенный Becton Dickinson (BD Difco), 20 г/л глюкозы и 40 мг/л аденинсульфата) и культивировали при 30°С и 150 об/мин в течение ночи. Культуру центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут и среду удаляли, а затем осадок с микробной массой суспендировали посредством 5 мл стерильной дистиллированной воды. Более того, центрифугирование проводили при 3000 об/мин в течение 5 минут, затем супернатант удаляли и осадок с микробной массой суспендировали в 1,5 мл раствора TE/LiAc (150 мкл 10х ТЕ, 150 мкл 10х LiAc и 1200 мкл стерильной дистиллированной воды). 100 мкл суспензии микробной массы переносили в 1,5-мл пробирку Eppendorf, добавляли 1-5 мкл плазмидной ДНК (комбинаторная библиотека) и 2 мкл ДНК-носителя [производимая Takara Bio (Clontech)], затем добавляли 600 мкл раствора TE/LiAc/PEG (60 мкл 10х ТЕ, 60 мкл 10х LiAc и 480 мкл 50% раствора PEG3350), и смесь перемешивали посредством встряхивания в течение 10 секунд. После инкубации раствора со смесью при 30°С в течение 30 минут добавляли 70 мкл диметилсульфоксида (DMSO)combinatorial libraries prepared according to (9) were introduced into yeast using the lithium acetate (LiAc) method. Specifically, S. cerevisiae strain YPH499, which is the parent strain, was inoculated in 5 ml of YPDA medium (10 g/L dry yeast extract (manufactured by Nacalai Tesque), 20 g/L peptone (manufactured by Becton Dickinson (BD Difco), 20 g /l glucose and 40 mg/l adenine sulfate) and cultured at 30°C and 150 rpm overnight.The culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes and the medium was removed, and then the sediment with the microbial mass was suspended with 5 ml sterile distilled water. Moreover, centrifugation was carried out at 3000 rpm for 5 minutes, then the supernatant was removed and the sediment with microbial mass was suspended in 1.5 ml of TE/LiAc solution (150 μl 10x TE, 150 μl 10x LiAc and 1200 μl sterile distilled water).100 µl of microbial suspension was transferred into a 1.5 ml Eppendorf tube, 1-5 µl of plasmid DNA (combinatorial library) and 2 µl of carrier DNA [manufactured by Takara Bio (Clontech)] were added, then 600 µl was added TE/LiAc/PEG solution (60 µl 10x TE, 60 µl 10x LiAc and 480 µl 50% PEG3350 solution), and the mixture was mixed by shaking for 10 seconds. After incubating the solution with the mixture at 30°C for 30 minutes, 70 μl of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added.

- 13 045394 и переворачивали и перемешивали, а затем далее инкубировали при 42°С в течение 15 минут. После проведения центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 секунд супернатант полностью удаляли, добавляли 250 мкл 100х исходного раствора аминокислот, свободного от L-лейцина (4 г/л аденинсульфата, 2 г/л L-гистидина, 4 г/л L-триптофана, 2 г/л урацила и 3 г/л L-лизина), осадок с микробной массой суспендировали и добавляли 550 мкл стерильной дистиллированной воды, а затем все количество суспензии распределяли на чашке агаром со средой SD (6,7 г/л азотистых оснований дрожжей без аминокислот (YNB) [произведенные Becton Dickinson (BD Difco)] и 20 г/л глюкозы) (к среде добавляли 20 г/л порошкового агара) и сушили, а затем инкубировали при 30°С в течение 3 суток с получением трансформанта.- 13 045394 and inverted and mixed, and then further incubated at 42°C for 15 minutes. After centrifugation at 14,000 rpm for 5 seconds, the supernatant was completely removed, 250 μl of a 100x amino acid stock solution free of L-leucine (4 g/L adenine sulfate, 2 g/L L-histidine, 4 g/L L-leucine) was added. tryptophan, 2 g/l uracil and 3 g/l L-lysine), the sediment with the microbial mass was suspended and 550 μl of sterile distilled water was added, and then the entire amount of the suspension was distributed on an agar plate with SD medium (6.7 g/l nitrogenous yeast bases without amino acids (YNB) [manufactured by Becton Dickinson (BD Difco)] and 20 g/L glucose) (20 g/L powder agar was added to the medium) and dried and then incubated at 30°C for 3 days to obtain transformant.

(11) Оценка способности продуцировать изобутанол в почкующихся дрожжах Колонии полученных дрожжевых трансформантов инокулировали в 5 мл селективной среды SD (среда SD с добавлением 100 ч исходного раствора аминокислот, свободного от L-лейцина) и культивировали при 30°С и при 150 об/мин в течение 3 суток. После проведения центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и удаления среды осадок с микробной массой суспендировали в 5 мл стерильной дистиллированной воды. После проведения дополнительного центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и удаления супернатанта осадок с микробной массой суспендировали в 5 мл новой селективной среды SD и культивировали при 30°С и при 150 об/мин в течение 48 часов. После центрифугирования культуры при 3000 об/мин в течение 5 минут супернатант собирали. 5100 мкл собранного супернатанта среды добавляли к 45900 мкл ацетона, смесь перемешивали путем встряхивания и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 минут, а затем супернатант собирали. Собранный супернатант переносили в стеклянный флакон и концентрацию изобутанола, содержащегося в среде, количественно определяли с использованием колонки DB-FFAP [производимая Agilent Technologies] с газовым хроматографическим массспектрометром (GCMS QP2010 Ultra [производимый Shimadzu]). В результате были получены штаммы, демонстрировавшие различное продуцирование изобутанола, имевшие 146 мг/л клона 96, как показано на фиг. 5. Среди них были получены штаммы с более высоким продуцированием изобутанола (29 мг/л и 15 мг/л, соответственно), чем продуцирование дрожжевыми штаммами, в которые была внесена затравочная плазмида для сверхэкспрессии и затравочная плазмида для подавления экспрессии генов.(11) Evaluation of the ability to produce isobutanol in budding yeast Colonies of the resulting yeast transformants were inoculated into 5 ml of selective SD medium (SD medium supplemented with 100 h of amino acid stock solution free of L-leucine) and cultured at 30°C and 150 rpm within 3 days. After centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes and removal of the medium, the sediment with the microbial mass was suspended in 5 ml of sterile distilled water. After further centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes and removal of the supernatant, the microbial pellet was suspended in 5 ml of new selective SD medium and cultured at 30°C and 150 rpm for 48 hours. After centrifuging the culture at 3000 rpm for 5 minutes, the supernatant was collected. 5100 μl of the collected supernatant medium was added to 45900 μl of acetone, the mixture was mixed by shaking and centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was collected. The collected supernatant was transferred into a glass vial and the concentration of isobutanol contained in the medium was quantified using a DB-FFAP column [manufactured by Agilent Technologies] with a gas chromatography mass spectrometer (GCMS QP2010 Ultra [manufactured by Shimadzu]). The result was strains that exhibited variable isobutanol production, having 146 mg/L of clone 96, as shown in FIG. 5. Among them, strains with higher isobutanol production (29 mg/L and 15 mg/L, respectively) were obtained than the production of yeast strains in which a seed plasmid for overexpression and a seed plasmid for suppressing gene expression were introduced.

(12) Селекция наилучшей плазмиды из библиотеки и переконструирование библиотеки.(12) Selection of the best plasmid from the library and library redesign.

Конструировали новую комбинаторную библиотеку с плазмидой, использованной в трансформации для получения клона 8, 42, 68 или 96, в которых продуцирование изобутанола составляло 120 мг/мл или более, в качестве затравочной плазмиды (фиг. 6). Сначала культивировали большое количество Bacillus subtilis, имевших описанную выше плазмиду, плазмиду экстрагировали способом ультрацентрифугирования, представленным в (7), и единичные ДНК, смешанные в эквимолярном количестве, получали способом, представленным в (8). Затем, проводили сборку генов, представленную в (6), для конструирования комбинаторной библиотеки 2-го цикла, состоявшей приблизительно из 200 трансформантов. 24 колонии, случайным образом отобранные из этой библиотеки, подвергали экстракции плазмиды из Bacillus subtilis, полученную плазмиду индивидуально вводили в дрожжи способом, представленным в (10), и продуцирование изобутанола определяли способом, представленным в (11). Для плазмиды, экстрагированной из Bacillus subtilis, направление гена в каждой единичной ДНК по отдельности идентифицировали способом, описанным в (9). Эти результаты представлены на фиг. 7. Что касается библиотеки, 6-я, 9-я, 11-я и 12-я единичные ДНК, которые являются общими в четырех затравочных плазмидах, были общими в 22 клонах за исключением двух клонов, т.е. клонов 3 и 12, в которых сборка была неполной, и остальные единичные ДНК, как правило, отражали ожидаемое соотношение композиции для затравочных плазмид. Среди 22 клонов было 19 типов различных комбинаций, и 2 из них были идентичными клонам 68 и 96 первой библиотеки, которые были затравочными плазмидами. Клоны 8, 4, 23 и 13 имели продуцирование изобутанола 173, 171, 169, 164 мг/л, соответственно, причем были получены многие клоны, демонстрирующие более высокую продуктивность, чем наиболее высокая величина 146 мг/л первой библиотеки.A new combinatorial library was constructed with the plasmid used in the transformation to obtain clone 8, 42, 68 or 96, in which isobutanol production was 120 mg/ml or more, as the seed plasmid (Fig. 6). First, a large number of Bacillus subtilis having the above-described plasmid were cultured, the plasmid was extracted by the ultracentrifugation method presented in (7), and single DNAs mixed in equimolar amounts were obtained by the method presented in (8). The gene assembly shown in (6) was then performed to construct a 2nd round combinatorial library of approximately 200 transformants. 24 colonies randomly selected from this library were subjected to plasmid extraction from Bacillus subtilis, the resulting plasmid was individually introduced into yeast by the method presented in (10), and isobutanol production was determined by the method presented in (11). For the plasmid extracted from Bacillus subtilis, the direction of the gene in each DNA unit was individually identified by the method described in (9). These results are presented in Fig. 7. Regarding the library, the 6th, 9th, 11th and 12th DNA units, which are common in the four seed plasmids, were common in 22 clones with the exception of two clones, i.e. clones 3 and 12, in which assembly was incomplete, and the remaining single DNAs generally reflected the expected composition ratio for seed plasmids. Among the 22 clones, there were 19 types of different combinations, and 2 of them were identical to clones 68 and 96 of the first library, which were seed plasmids. Clones 8, 4, 23 and 13 had isobutanol production of 173, 171, 169, 164 mg/L, respectively, with many clones being obtained showing higher productivity than the highest value of 146 mg/L of the first library.

Промышленная применимость.Industrial applicability.

В соответствии с настоящим изобретением, является возможным быстрое и эффективное конструирование комбинаторной библиотеки длинноцепочечной ДНК. В частности, поскольку в рамках настоящего изобретения возможно повторно использовать множество плазмид, отобранных из одной и той же библиотеки, для конструирования новой химерной библиотеки даже без подтверждения генотипа полученной плазмиды, настоящее изобретение имеет отличительный признак, состоящий в том, что является возможным быстрое конструирование второй и последующей библиотек.In accordance with the present invention, it is possible to quickly and efficiently construct a combinatorial library of long-stranded DNA. In particular, since it is possible within the scope of the present invention to reuse multiple plasmids selected from the same library to construct a new chimeric library even without confirming the genotype of the resulting plasmid, the present invention has the distinctive feature that it is possible to quickly construct a second and subsequent libraries.

Claims (17)

1. Способ получения фрагмента ДНК, причем фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в хозяине; и ДНКвставку, в которой единичные ДНК связаны, отличающийся тем, что способ включает:1. A method for producing a DNA fragment, wherein the DNA fragment has at least one DNA insert element comprising: DNA containing an origin of replication effective in the host; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes: (А) обработку множества типов плазмид, содержащих элемент ДНК-вставки, в котором связано множество типов единичных ДНК, способных быть связанными в определенном порядке связывания, с(A) processing multiple types of plasmids containing a DNA insert element in which multiple types of single DNAs capable of being linked in a specific binding order are associated with - 14 045394 использованием фермента рестрикции, пригодного для каждой плазмиды, для расщепления указанных плазмид на множество типов единичных ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК; и (В) повторную сборку множества типов единичных ДНК способом OGAB с использованием множества типов растворов со смесями единичных ДНК, полученного на стадии (А), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.- 14 045394 using a restriction enzyme suitable for each plasmid to cleave said plasmids into multiple types of single DNA and produce multiple types of solutions with mixtures of single DNA; and (B) reassembling multiple types of single DNA units using the OGAB method using multiple types of single DNA mixture solutions obtained in step (A) to obtain a long-stranded DNA fragment. 2. Способ по п.1, где указанный фрагмент ДНК представляет собой фрагмент ДНК для трансформации клетки.2. The method according to claim 1, where the specified DNA fragment is a DNA fragment for cell transformation. 3. Способ по п.2, где указанный ориджин репликации эффективен в микроорганизме-хозяине и указанный фрагмент ДНК для трансформации клетки предназначен для трансформации микробной клетки.3. The method according to claim 2, wherein said origin of replication is effective in the host microorganism and said DNA fragment for cell transformation is intended for transformation of the microbial cell. 4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий приготовление указанного множества типов плазмид перед стадией (А).4. The method according to any one of claims 1 to 3, further comprising preparing said plurality of types of plasmids before step (A). 5. Способ по любому из пп.1-3, где указанное множество типов плазмид приготовлено способом OGAB.5. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein said plurality of types of plasmids are prepared by the OGAB method. 6. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что все соотношения между молярными концентрациями для фрагментов ДНК в указанном множестве типов растворов со смесями единичных ДНК, полученных на стадии (А), составляют от 0,8 до 1,2.6. The method according to any one of claims 1-3, characterized in that all the ratios between the molar concentrations for DNA fragments in the specified set of types of solutions with mixtures of single DNA obtained in stage (A) are from 0.8 to 1.2 . 7. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в указанном множестве типов плазмид количество типов единичных ДНК, содержащихся в одном типе элемента ДНК-вставки, составляет от 3 до 60.7. The method according to any one of claims 1-3, characterized in that in the specified set of types of plasmids, the number of types of single DNA contained in one type of DNA insert element ranges from 3 to 60. 8. Способ по любому из пп.1-3, где количество типов ферментов рестрикции, используемых на стадии (А), составляет три или менее.8. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the number of types of restriction enzymes used in step (A) is three or less. 9. Способ по любому из пп.1-3, где фермент рестрикции представляет собой фермент рестрикции, который образует выступающий конец.9. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the restriction enzyme is a restriction enzyme that forms a protruding end. 10. Плазмида, содержащая фрагмент ДНК, полученный способом по любому из пп. 1-3.10. Plasmid containing a DNA fragment obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-3. 11. Способ получения фрагмента ДНК, причем фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, содержащий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в хозяине; и ДНК-вставку, в которой связаны единичные ДНК, отличающийся тем, что способ включает:11. A method for producing a DNA fragment, wherein the DNA fragment has at least one DNA insert element comprising: DNA containing an origin of replication effective in the host; and a DNA insert in which single DNAs are linked, characterized in that the method includes: (А' ) приготовление множества типов плазмид, содержащих фрагмент ДНК, полученный способом по любому из пп.1-3;(A') preparing multiple types of plasmids containing a DNA fragment obtained by the method according to any one of claims 1 to 3; (В' ) обработку множества типов плазмид, приготовленного на стадии (А'), ферментом рестрикции, пригодным для каждой плазмиды, для расщепления указанных плазмид на множество типов единичных ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК; и (С) повторную сборку указанного множества типов единичных ДНК способом OGAB с использованием растворов со смесями единичных ДНК, полученных на стадии (В'), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК.(B') treating the plurality of types of plasmids prepared in step (A') with a restriction enzyme suitable for each plasmid to cleave said plasmids into a plurality of single DNA types and produce a plurality of types of single DNA mixture solutions; and (C) reassembling said plurality of single DNA types using the OGAB method using the single DNA mixture solutions obtained in step (B') to produce a long-stranded DNA fragment. 12. Способ по п.11, отличающийся селекцией множества типов плазмид, содержащих полученный фрагмент длинноцепочечной ДНК, и повторным применением плазмид в качестве плазмид на стадии (В').12. The method according to claim 11, characterized by selecting multiple types of plasmids containing the resulting long-chain DNA fragment, and reusing the plasmids as plasmids in step (B'). 13. Способ конструирования химерной плазмидной библиотеки, включающий использование способа по любому из пп.1-3.13. A method for constructing a chimeric plasmid library, comprising using the method according to any one of claims 1-3. 14. Способ трансформации клеток, включающий трансформацию клетки фрагментом ДНК, полученным способом по любому из пп.1-3.14. A method for transforming cells, including transforming a cell with a DNA fragment obtained by the method according to any one of claims 1-3. 15. Композиция для трансформации клеток, содержащая фрагмент ДНК, полученный способом по любому из пп.1-3.15. Composition for cell transformation containing a DNA fragment obtained by the method according to any one of claims 1-3. 16. Способ трансформации клетки представляющим интерес фрагментом ДНК, где указанный фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, включающий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в указанной клетке в качестве хозяина; и ДНК-вставку, где указанная ДНК-вставка образована путем связывания множества типов единичных ДНК, способных быть связанными в определенном порядке связывания, где указанный способ включает (A) обработку множества типов плазмид, содержащих элемент ДНК-вставки, с использованием фермента рестрикции, пригодного для каждой плазмиды, для расщепления указанных плазмид на множество типов единичных ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК;16. A method of transforming a cell with a DNA fragment of interest, wherein said DNA fragment has at least one DNA insertion element comprising: DNA containing an origin of replication effective in said cell as a host; and a DNA insert, wherein said DNA insert is formed by binding a plurality of types of single DNAs capable of being linked in a particular binding order, wherein said method comprises (A) treating a plurality of types of plasmids containing the DNA insert element using a restriction enzyme suitable for each plasmid, to cleave said plasmids into multiple types of single DNAs and produce multiple types of solutions with mixtures of single DNAs; (B) повторную сборку множества типов единичных ДНК способом OGAB с использованием множества типов растворов со смесями единичных ДНК, полученного на стадии (А), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК; и (C) трансформацию указанной клетки указанным фрагментом длинноцепочечной ДНК.(B) reassembling multiple types of single DNA units using the OGAB method using multiple types of solutions with mixtures of single DNA units obtained in step (A) to obtain a long-stranded DNA fragment; and (C) transforming said cell with said long-chain DNA fragment. 17. Способ получения клетки, содержащей представляющий интерес фрагмент ДНК, где указанный фрагмент ДНК имеет по меньшей мере один элемент ДНК-вставки, включающий: ДНК, содержащую ориджин репликации, эффективный в указанной клетке в качестве хозяина; и ДНК-вставку, где указанная ДНК-вставка образована путем связывания множества типов единичных ДНК, способных быть связанными в определенном порядке связывания, где указанный способ включает (А) обработку множества типов плазмид, содержащих элемент ДНК-вставки, с использованием фермента рестрикции, пригодного для каждой плазмиды, для расщепления указанных плазмид на мно-17. A method of producing a cell containing a DNA fragment of interest, wherein said DNA fragment has at least one DNA insert element comprising: DNA containing an origin of replication effective in said cell as a host; and a DNA insert, wherein said DNA insert is formed by binding a plurality of types of single DNAs capable of being linked in a particular binding order, wherein said method comprises (A) treating the plurality of types of plasmids containing the DNA insert element using a restriction enzyme suitable for each plasmid, to cleave these plasmids into multi- - 15 045394 жество типов единичных ДНК и получения множества типов растворов со смесями единичных ДНК;- 15 045394 variety of types of single DNA and obtaining many types of solutions with mixtures of single DNA; (B) повторную сборку множества типов единичных ДНК способом OGAB с использованием множества типов растворов со смесями единичных ДНК, полученного на стадии (А), с получением фрагмента длинноцепочечной ДНК; и (C) трансформацию указанной клетки указанным фрагментом длинноцепочечной ДНК.(B) reassembling multiple types of single DNA units using the OGAB method using multiple types of solutions with mixtures of single DNA units obtained in step (A) to obtain a long-stranded DNA fragment; and (C) transforming said cell with said long-chain DNA fragment.
EA202192652 2019-04-01 2020-03-24 METHOD FOR CONSTRUCTION OF CHIMERIC PLASMID LIBRARY EA045394B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-069798 2019-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045394B1 true EA045394B1 (en) 2023-11-22

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11643648B2 (en) Method for constructing chimeric plasmid library
Riley et al. Approaches to genetic tool development for rapid domestication of non-model microorganisms
US20170088845A1 (en) Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
US11713471B2 (en) Class II, type V CRISPR systems
AU2002227882C1 (en) Concatemers of differentially expressed multiple genes
Fernández‐Cabezón et al. Evolutionary approaches for engineering industrially relevant phenotypes in bacterial cell factories
AU2002227882A1 (en) Concatemers of differentially expressed multiple genes
Cao et al. Unlocking nature’s biosynthetic potential by directed genome evolution
WO2014100799A2 (en) Cyanobacterium sp. for production of compounds
Crook et al. Identification of gene knockdown targets conferring enhanced isobutanol and 1-butanol tolerance to Saccharomyces cerevisiae using a tunable RNAi screening approach
Yilmaz et al. Towards next-generation cell factories by rational genome-scale engineering
CN118291459A (en) 3' UTR sequences for promoting mRNA translation and uses thereof
Li et al. Non-homologous end joining-mediated insertional mutagenesis reveals a novel target for enhancing fatty alcohols production in Yarrowia lipolytica
WO2014182657A1 (en) Increasing homologous recombination during cell transformation
EA045394B1 (en) METHOD FOR CONSTRUCTION OF CHIMERIC PLASMID LIBRARY
JPH09510360A (en) DNA encoding an enzyme of glycolytic pathway used in alcohol-producing yeast
Siyang et al. Advances in genome evolution of Saccharomyces cerevisiae
Sengupta et al. CRISPR-Cas mediated genome engineering of cyanobacteria
CN113151265A (en) Method for inhibiting expression of lncRNA in nucleus based on CRISPR-dCase9 system
Yang et al. The small RNA sr8384 is a crucial regulator of cell growth in solventogenic clostridia
US12123014B2 (en) Class II, type V CRISPR systems
CN113677795B (en) Novel DAHP synthetase
Ganesan Developing Next-Generation Tools for Metabolic Engineering in Non-conventional Yeast Yarrowia lipolytica
US20230119263A1 (en) Pseudomonas mutant strains with enhanced xylose and galactose utilization
WO2022071888A1 (en) A dna assembly mix and method of uses thereof