EA045097B1 - Химерный антигенный рецептор для bcma на основе однодоменного антитела и его применение - Google Patents

Description

Область техники

Изобретение относится к области клеточной иммунотерапии, в частности, к BCMAспецифическому химерному антигенному рецептору на основе однодоменного антитела и его применению.

Уровень техники

Множественная миелома (ММ) представляет собой гематологическое новообразование, развивающееся в костном мозге и характеризующееся накоплением клональных плазматических клеток. Схемы лечения в основном направлены на апоптоз плазматических клеток и/или снижение активности остеокластов (например, химиотерапия, талидомид, леналидомид, дифосфат и/или ингибитор протеасом, такой как бортезомиб (VELCADE®) или карфилзомиб). В настоящее время множественная миелома остается неизлечимым заболеванием. Выживаемость пациентов в течение более пяти лет после постановки диагноза составляет примерно 45%. У многих пациентов возникает рецидив заболевания после прекращения лечения, и 5-летняя выживаемость пациентов после рецидива составляет менее 20%.

В последние годы иммунотерапия T-клетками с химерными антигенными рецепторами (CART) стала одним из наиболее перспективных методов иммунотерапии опухолей. Химерный антигенный рецептор состоит из одного опухоль-ассоциированного антигенсвязывающего домена, трансмембранного домена, костимулирующего домена и внутриклеточного сигнального домена. При CART-клеточной терапии обычно экспрессируется слитый белок из минимального связывающего фрагмента антитела для распознавания опухоль-ассоциированного антигена (вариабельный одноцепочечный фрагмент или scFv) и последовательности активации T-клеток на поверхности T-клеток посредством технологии генной трансдукции. T-клетки, экспрессирующие молекулы CAR, связываются с опухолевыми антигенами антигензависимым, но не ограниченным MHC образом, специфически индуцируя гибель опухолевых клеток.

Эффективность CART-клеточной терапии зависит от таких свойств, как специфичность антител, распознающих опухоль-ассоциированные антигены, аффинность связывания антигена и т.п. В настоящее время конструирование внутриклеточного сигнального домена CART-клеток достигло успехов, и усилия сконцентрировались и стали ключевыми в конструировании антигенсвязывающего домена в разработке новой CART технологии. Фрагмент с минимальным и единственным функциональным доменом антитела, способный полноценно связываться с антигеном, в антителе из тяжелых цепей альпака (HCAb), а именно вариабельная область антитела из тяжелых цепей, не содержащая легкой цепи (также известная как VHH), имеет простую структуру и молекулярную массу, составляющую примерно 1/10 от молекулярной массы обычного антитела. Его можно эффективно экспрессировать и очистить в экспрессионной системе in vitro (например, в E.coli, дрожжах, эукариотических клетках и растениях). Он обладает высокой специфичностью, высокой аффинностью, низкой иммуногенностью, хорошей инфильтрацией и имеет возможность контактировать с относительно скрытыми мишенями, с которыми вряд ли могут связаться обычные антитела при лечении опухолей. Основываясь на этих преимуществах, одна из тенденций развития CART-клеточной терапии заключается в использовании однодоменных антител в качестве антигенсвязывающей области CAR для модификации CAR.

В отношении злокачественных B-клеточных новообразований очень важным биомаркером Bклеток является BCMA (антиген созревания B-клеток). Его РНК почти всегда находят в клетках множественной миеломы, и белок также обнаруживается на поверхности злокачественных плазматических клеток у пациентов с множественной миеломой. BCMA представляет собой трансмембранный белок типа III, состоящий из 185 аминокислотных остатков, и который относится к суперсемейству рецепторов TNF, и его лиганд принадлежит к суперсемейству TNF, такому как фактор, активирующий B-лимфоцитов (BAFF), лиганд, индуцирующий пролиферацию (APRIL). BCMA может активировать пролиферацию и выживание B-клеток, связываясь с его лигандами. BCMA высоко экспрессируется на поверхности плазматических клеток и клеток множественной миеломы, но не экспрессируется в гемопоэтических стволовых клетках или других клетках нормальной ткани. Следовательно, BCMA можно использовать в качестве идеальной мишени для таргетной терапии MM.

Сущность изобретения

В настоящей заявке сконструировано специфическое однодоменное антитело в качестве антигенсвязывающей области CAR для применения в модификациях CAR и CART-клеточной терапии с использованием средств генной инженерии, и обеспечивается специфический химерный антигенный рецептор (CAR) на основе однодоменного антитела, который включает домен связывания мишени, трансмембранный домен, один или более костимулирующих доменов и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен представляет собой фрагмент связывания антигена, который может связываться с человеческим BCMA (антигеном созревания B-клеток).

В одном аспекте настоящая заявка относится к химерному антигенному рецептору (CAR), включающему: BCMA-связывающий домен, трансмембранный домен, один или более костимулирующих доменов и внутриклеточный сигнальный домен; где BCMA-связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HCDR2), и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HCDR3), где аминокислотная последовательность HCDR1 приведена в SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность

- 1 045097

HCDR2 приведена в SEQ ID NO: 2, и аминокислотная последовательность HCDR3 приведена в SEQ ID

NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления BCMA-связывающий домен представляет собой однодоменное антитело.

В некоторых вариантах осуществления BCMA-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен включает полипептид, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из α-, β- или ζ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления BCMA-связывающий домен связан с трансмембранным доменом через шарнирную область.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления один или более костимулирующих доменов происходят из костимулирующей молекулы, выбранной из группы, состоящей из CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, TRIM и ZAP70.

В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3Z.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, и лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или ее функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10-11, или ее функциональный вариант.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 12-13, или ее функциональный вариант.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из ДНК-векторов, РНК-векторов, плазмид, лентивирусных векторов, аденовирусных векторов и ретровирусных векторов.

В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит промотор EF1, где промотор EF1 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к иммунной эффекторной клетке, содержащей CAR, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.

В некоторых вариантах осуществления иммунная эффекторная клетка выбрана из T-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров (NK).

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к способу получения иммунной эффекторной клетки, включающему введение вектора в иммунную эффекторную клетку.

В некоторых вариантах осуществления в способе иммунная эффекторная клетка выбрана из Tлимфоцитов и естественных клеток-киллеров (NK).

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к композиции, содержащей иммунную эффекторную клетку.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к применению CAR, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или эффекторной иммунной клетки в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к CAR, молекуле нуклеиновой кислоте, вектору или иммунной эффекторной клетке для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA.

В еще одном аспекте настоящая заявка относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA, включающего стадию введения субъекту CAR, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или иммунной эффекторной клетки.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение, связанное с экспрессией

- 2 045097

BCMA, представляет собой рак или злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение, связанное с экспрессией BCMA, выбрано из группы, состоящей из Bклеточного острого лимф областного лейкоза, T-клеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимф областного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, бластноклеточной плазмацитоидной дендритно-клеточной цитомы, лимфомы Беркитта, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественного лимфопролиферативного состояния, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, плазмоцитоидной дендритно-клеточной цитомы, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака легких, миеломы, MGUS, плазмоцитомы, системного амилоидоза, вызванного аномальными легкими цепями, образующими амилоидные отложения, и синдрома POEMS.

Инновации и положительные эффекты настоящей заявки.

Автор изобретения сконструировал однодоменное антитело, содержащее специфическую аминокислотную последовательность, с использованием средств генной инженерии, и сконструировал химерный антигенный рецептор (CAR), используя однодоменное антитело в качестве связывающего домена (BCMA-связывающего домена). В ходе исследований было установлено, что иммунные клетки (например, CART-клетки), содержащие химерный антигенный рецептор, обладают высокой способностью к киллингу и специфичностью по отношению к ассоциированным опухолям. В частности, CAR эффективно трансфектирует T-лимфоциты здорового человека in vitro и оказывает сильный киллинговый эффект на BCMA-положительных клетках-мишенях; и в экспериментах in vivo он также демонстрирует сильный киллинговый эффект: воспроизведена мышиная модель первичной миеломы для обнаружения с использованием клеток MM.1S, трансфектированных люциферазой, и через 3 суток после введения большая часть флуоресценции исчезает, что указывает на то, что клетки CART обладают высоким терапевтическим действием in vivo.

Более того, иммунные клетки, содержащие химерный антигенный рецептор по настоящей заявке, демонстрируют отличное нацеливание in vitro. Они обладают очень высокой способностью к киллинговому эффекту на клетках, которые являются положительными на экспрессию BCMA, и по существу не обладают киллинговым эффектом на клетках, которые не экспрессируют BCMA. Кроме того, они также демонстрируют отличное нацеливание на опухоль в экспериментах in vivo.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведены результаты проточной цитометрии экспрессии химерного антигенного рецептора в иммунных клетках, содержащих химерный антигенный рецептор по настоящей заявке.

На фиг. 2 приведены результаты проточной цитометрии уровня экспрессии BCMA на поверхности клеток множественной миеломы MM.1S (левая панель) и клеток миелоидного лейкоза K562 (правая панель).

На фиг. 3A-3B приведены результаты оценки киллинга клеток-мишеней после совместной инкубации опухолевых клеток и иммунных клеток, содержащих химерный антигенный рецептор по настоящей заявке.

На фиг. 4A-4B приведены результаты определения уровня цитокинов в супернатанте методом ELISA после совместной инкубации опухолевых клеток и иммунных клеток, содержащих химерный антигенный рецептор по настоящей заявке.

На фиг. 5 приведены результаты оценки обработки мышей, несущих опухоли, иммунными клетками, содержащими химерный антигенный рецептор по настоящей заявке.

На фиг. 6 приведены результаты оценки обработки мышей, несущих опухоли, иммунными клетками, содержащими химерный антигенный рецептор по настоящей заявке.

Подробное описание изобретения

Автор изобретения сконструировал специфическое однодоменное антитело в качестве антигенсвязывающей области CAR для модификации CAR и CART-клеточной терапии средствами генной инженерии и обеспечил специфический химерный антигенный рецептор (CAR) на основе однодоменного антитела, включающий внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, где внеклеточный домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, который может связываться с человеческим BCMA (антигеном созревания B-клеток), выбранный из однодоменного антитела альпака (sdAb, наноантитело).

В рамках настоящей заявки, термин CDR обычно относится к определяющему комплементарность участку, который в основном ответственен за связывание с эпитопами антигенов. CDR тяжелой цепи обычно называются HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые последовательно нумеруются от N-конца. В рамках настоящей заявки, CDR можно определить или идентифицировать обычными методами, например, в соответствии с методом, описанным в публикации Kabat et al. (Wu T.T. and Kabat E.A., J. Exp. Med., 132 (2): 211-50, (1970); Borden P. and Kabat E.A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987), или методом, описанным в публикации Chothia et al. (Chothia C. and Lesk A.M., J. Mol.Biol., 196 (4): 901-917(1987)).

- 3 045097

В рамках настоящей заявки, термин однодоменное антитело (sdAb) обычно относится к фрагменту антитела, состоящему из вариабельной области тяжелой цепи антитела (область VH) или вариабельной области легкой цепи антитела (область VL) (Holt L. et al., Trends in Biotechnology, 21 (11): 484-490), которое также известно как нанотело. Однодоменное антитело имеет молекулярную массу всего примерно 12-15 кДа. Первое однодоменное антитело, также известное как сегмент VHH, было получено генной инженерией из антитела из тяжелых цепей альпака. В настоящей заявке однодоменное антитело может представлять собой однодоменное антитело альпака. Например, сегмент VHH может относиться к известной минимальной антигенсвязывающей единице антитела из тяжелых цепей (Koch-Nolte et al., FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)).

В рамках настоящей заявки, термин трансмембранный домен можно использовать взаимозаменяемо с трансмембранной областью (сокращенно, TM), и он относится к части CAR, которая сливает внеклеточный связывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом и заякоривает CAR к плазматической мембране иммунных эффекторных клеток. Трансмембранный домен можно получить из встречающихся в природе белков или получить синтезом, полусинтезом или рекомбинацией. Домен TM может включать, по меньшей мере, трансмембранный домен следующих белков: α-, β- или ζ-цепи Tклеточного рецептора, CD3ε, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 и PD1. В рамках настоящей заявки, трансмембранный домен может включать полипептид, полученный из белка, выбранного из α-, β- или ζ-цепи Tклеточного рецептора, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154.

В рамках настоящей заявки, термин внутриклеточный сигнальный домен обычно является частью CAR, который участвует в трансдукции информации об эффективном связывании анти-BCMA CAR с полипептидом BCMA человека во внутреннюю часть иммунных эффекторных клеток, для запуска функции эффекторных клеток, например активации, продукции цитокинов, пролиферации и цитотоксической активности, включая высвобождение цитотоксических факторов к CAR-связывающим клеткаммишеням, или другие клеточные ответы, индуцированные связыванием антигенов с внеклеточным доменом CAR. В рамках настоящей заявки, внутриклеточный сигнальный домен может включать сигнальный домен CD3ε.

В рамках настоящей заявки, термин BCMA обычно относится к зрелому клеточному антигену, который относится к члену супер семейства рецепторов фактора некроза опухоли (см. Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1): 129-135, 2000). BCMA может связываться с факторами, активирующими B-клетки (BAFF) и лигандами, индуцирующими пролиферацию (APRIL) (см. Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005). Сообщалось, что в незлокачественных клетках BCMA в основном экспрессируются в субпопуляции плазматических клеток и зрелых B-клетках (см. Laabi et al., EMBO J., 77 (1): 3897-3904, 1992; Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22 (7): 1147-1154, 1994; Kalled et al., 2005; O'Connor et al., J. Exp. Medicine, 199 (1): 91-97, 2004; и Ng et al., J. Immunol., 73 (2): 807-817, 2004). РНК BCMA обычно обнаруживают в клетках множественной миеломы и других лимфомах, и некоторые исследователи обнаружили белок BCMA на поверхности плазматических клеток у пациентов с множественной миеломой (см. Novak et al., Blood, 103 (2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73 (19): 5903-5909, 2007; Bellucci et al., Blood, 105 (10): 3945-3950, 2005; и Moreaux et al., Blood, 703 (8): 3148-3157, 2004). Таким образом, BCMA можно использовать в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения злокачественных опухолей (например, множественной миеломы).

В рамках настоящей заявки, термин BCMA-связывающий домен обычно относится к гуманизированному анти-BCMA антителу, которое может специфически связываться с полипептидом BCMA, экспрессированным на B-клетках, или его антигенсвязывающему фрагменту. В рамках настоящей заявки, связывающий домен может происходить из природных источников, синтетических источников, полусинтетических источников или рекомбинантных источников. В рамках настоящей заявки, внеклеточный связывающий домен может включать анти-BCMA антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Из них антитело может представлять собой полипептид, включающий, по меньшей мере, вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина, который специфически распознает и связывается с эпитопом антигена (например, BCMA), таким как содержащие антигенную детерминанту пептиды, липиды, полисахариды или нуклеиновые кислоты (например, те, которые распознаются иммунными клетками).

В рамках настоящей заявки, термин костимулирующий домен обычно относится к внутриклеточному сигнальному домену костимулирующей молекулы. Например, костимулирующая молекула может представлять собой молекулу клеточной поверхности, отличную от рецептора антигена или Fcрецептора, которая может обеспечивать второй сигнал, необходимый для эффективной активации и функций T-лимфоцитов. Например, костимулирующий домен может быть выбран из группы, состоящей из CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM и ZAP70.

- 4 045097

В рамках настоящей заявки, термин шарнирная область обычно относится к домену в химерном антигенном рецепторе, который располагает связывающий домен от поверхности эффекторных клеток, чтобы он играл надлежащую роль в клетка/клеточном контакте, связывании антигена и активации. В рамках настоящей заявки, шарнирная область может располагаться между связывающим доменом и трансмембранным доменом. Шарнирная область может происходить из природных источников, синтетических источников, полусинтетических источников или рекомбинантных источников. Шарнирная область может содержать аминокислотную последовательность встречающейся в природе шарнирной области иммуноглобулина или искусственно модифицированной (включая делецированную, замененную или вставленную) шарнирной области иммуноглобулина.

В рамках настоящей заявки, термин лидерная последовательность обычно относится к последовательности, расположенной перед кодирующей областью структурного гена, которая может транскрибироваться, но не может транслироваться. В настоящей заявке лидерная последовательность может начинаться от 5'-конца до первого кода гена, кодирующего химерный антигенный рецептор. В рамках настоящей заявки, лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или ее функциональный вариант.

В рамках настоящей заявки, термин функциональный вариант обычно относится к аминокислотной последовательности, имеющей по существу такие же функции с ней (например, обладающей свойствами химерного антигенного рецептора) и имеющей, по меньшей мере 85% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или, по меньшей мере 100%) идентичность последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариант аминокислотной последовательности представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую по существу такие же функции с ней (например, обладающую свойствами химерного антигенного рецептора), и включающую одно или более (например, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 или более) из замен, делеций или добавлений аминокислот на основе аминокислотной последовательности.

В рамках настоящей заявки, термин лентивирусный вектор обычно относится к вектору генной терапии, разработанному на основе вируса. В рамках настоящей заявки, вирус может представлять собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIA) или вирус иммунодефицита кошек (FIV). Лентивирусный вектор обладает способностью инфицировать как митотические клетки, так и немитотические клетки, может эффективно инфицировать почти все клетки млекопитающих, включая нейроны, гепатоциты, кардиомиоциты, опухолевые клетки, эндотелиальные клетки, стволовые клетки и т.п., и имеет высокую эффективность инфицирования.

В рамках настоящей заявки, термин промотор EF1 обычно относится к промотору, который может постоянно поддерживать транскрипцию регулируемого гена-мишени на определенном уровне. В рамках настоящей заявки, промотор EF1 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14. В рамках настоящей заявки, уровень экспрессии химерного антигенного рецептора, регулируемый промотором EF1, может подвергнуться повышающей или понижащей регуляции не более чем на 5%, не более чем на 4%, не более чем на 3%, не более чем на 2%, не более чем на 1%, не более чем 0,5%, не более чем 0,1%, не более чем 0,01% или менее. В рамках настоящей заявки, промотор EF1 может располагаться выше нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор.

В рамках настоящей заявки, термин T-лимфоциты обычно относится к клеткам, которые включают тимоциты, незрелые T-лимфоциты, зрелые T-лимфоциты, T-лимфоциты в состоянии покоя или активированные T-лимфоциты. T-клетки могут представлять собой хелперные Т (Th)-клетки, такие как хелперные T1 (Th1) клетки или хелперные T2 (Th2) клетки. T-клетки могут быть хелперными T-клетками (HTL; CD4+T-клетки), CD4 T-клетками, цитотоксическими T-клетками (CTL; CD8+T-клетки), CD4+CD8+T-клетками или CD4’CD8’T-клетками. Альтернативно, T-лимфоциты могут включать нативные T-клетки и T-клетки памяти.

В рамках настоящей заявки, термин естественные клетки-киллеры обычно относится к субпопуляции лейкоцитов, которые являются компонентом врожденной иммунной системы. NK-клетки играют важную роль в отторжении у хозяина опухолей и инфицированных вирусом клеток. NK-клетки обладают цитотоксичностью и индуцируют апоптоз. NK-клетки можно использовать для подавления вирусной инфекции и продукции антигенспецифических цитотоксических T-клеток посредством адаптивного иммунного ответа, тем самым элиминируя инфекцию.

В рамках настоящей заявки, термин опухоль обычно относится к новому аномальному разрастанию, которое развивается в результате клональной аномальной пролиферации определенной клетки в локальной ткани, которая теряет нормальную регуляцию роста на уровне гена под действием различных канцерогенных факторов. Ее также называют новообразованием, потому что такое новообразование в основном представляет собой массивные узелковые образования. В рамках настоящей заявки, рак может включать плоскоклеточную карциному, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), перитонеальную карци

- 5 045097 ному, гепатоцеллюлярную карциному, карциному желудка или рак желудка (включая рак желудочнокишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак печени, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или матки, рак слюнной железы, рак почки или почечноклеточный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени, рак головы и шеи, Bклеточную лимфому (включая низкодифференцированную/фолликулярную NHL; мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; промежуточную/фолликулярную NHL, диффузную NHL с промежуточной дифференцировкой клеток; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL из мелких клеток с нерасщепленными ядрами высокой степени злокачественности, лимфому, ассоциированную со СПИДом, макроглобулинемию Вальденстрема, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD). В рамках настоящей заявки, рак может включать рак или злокачественные опухоли, связанные с экспрессией BCMA. Например, рак может быть выбран из группы, состоящей из B-клеточного острого лимф областного лейкоза, T-клеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимф областного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, бластноклеточной плазмацитоидной дендритно-клеточной цитомы, лимфомы Беркитта, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественного лимфопролиферативного состояния, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, плазмоцитоидной дендритно-клеточной цитомы, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака легких, миеломы, MGUS, плазмоцитомы, системного амилоидоза, вызванного аномальными легкими цепями, образующими амилоидные отложения, и синдрома POEMS.

В рамках настоящей заявки, обеспечивается химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий BCMA-связывающий домен, трансмембранный домен, один или более костимулирующих доменов и внутриклеточный сигнальный домен; где BCMA-связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HCDR2), и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HCDR3), где аминокислотная последовательность HCDR1 приведена в SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность HCDR2 приведена в SEQ ID NO: 2, и аминокислотная последовательность HCDR3 приведена в SEQ ID NO: 3.

В рамках настоящей заявки, BCMA-связывающий домен может связываться или ассоциироваться с BCMA с K_a (т.е. константой равновесия ассоциации связывающего взаимодействия при 1/М), больше или равной примерно 10⁵ М^-1 (например, выше или равной примерно 10⁵ М^-1, выше или равной примерно 10⁶ М^-1, выше или равной примерно 10⁷ М^-1, выше или равной примерно 10⁸ М^-1, выше или равной примерно 10⁹ М^-1, выше или равной примерно 10¹⁰ М^-1, выше или равной примерно 10¹¹ М^-1, выше или равной примерно 10¹² М^-1, выше или равной примерно 10¹³ М^-1 или выше), или с константой равновесия диссоциации Kd ниже или равной примерно 10^-5 М (например, ниже или равной примерно 10^-5 М, ниже или равной примерно 10^-6 М, ниже или равной примерно 10^-7 М, ниже или равной примерно 10^-8 М, ниже или равной примерно 10^-9 М, ниже или равной примерно 10^-10 М, ниже или равной примерно 10^-11 М, ниже или равной примерно 10^-12 М, ниже или равной примерно 10^-13 М или ниже).

В рамках настоящей заявки, аффинность между BCMA-связывающим доменом и BCMA можно определить обычными методами, используемыми в данной области, например, конкурентным ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), или ассоциацией связывания или анализом замещения с использованием меченых лигандов, или с использованием поверхностного плазмонного резонанса (такого как Biacore T100, который можно получить от Biacore, Inc., Piscataway, NJ) или технологии оптических биосенсоров.

В рамках настоящей заявки, BCMA-связывающий домен может представлять собой однодоменное антитело. BCMA-связывающий домен, подходящий для конструирования химерного антигенного рецептора по настоящей заявке, включает, не ограничиваясь этим, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот в BCMA-связывающем домене; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с BCMA-связывающим доменом.

В настоящей заявке трансмембранный домен может включать полипептид, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из α-, β- или ζ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3Z, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В рамках настоящей заявки, трансмембранный домен может происходить из трансмембранного домена CD8a. В

- 6 045097 рамках настоящей заявки, трансмембранный домен может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот в трансмембранном домене; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с трансмембранным доменом.

В рамках настоящей заявки, BCMA-связывающий домен может быть связан с трансмембранным доменом через шарнирную область. В рамках настоящей заявки, CAR может содержать одну или более шарнирных областей между BCMA-связывающим доменом и трансмембранным доменом. Шарнирная область может содержать определенные мутации или замены аминокислот, например, такие, в которых остаток пролина мутирован или заменен другим аминокислотным остатком (например, остатком серина). В рамках настоящей заявки, шарнирная область может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот шарнирной области; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с шарнирной областью.

В рамках настоящей заявки, костимулирующий домен может функционировать антигеннезависимым (например, BCMA-независимым) образом, для обеспечения вторичного или костимулирующего сигнала. В рамках настоящей заявки, CAR может содержать один или более костимулирующих доменов. Множество костимулирующих доменов может повышать эффективность и способность к размножению иммунных клеток (например, T-клеток и NK-клеток), экспрессирующих CAR. Например, костимулирующий домен может быть связан с С-концом трансмембранного домена. В рамках настоящей заявки, один или более костимулирующих доменов могут происходить из костимулирующей молекулы, выбранной из CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PDL1), CD278 (iCoS), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, TRIM и ZAP70. В рамках настоящей заявки, костимулирующий домен может происходить из CD137. В рамках настоящей заявки, костимулирующий домен может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот в костимулирующем домене; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с костимулирующим доменом.

В рамках настоящей заявки, внутриклеточный сигнальный домен может преимущественно активироваться TCR (например, комплексом TCR/CD3) антигензависимым образом. В рамках настоящей заявки, внутриклеточный сигнальный домен может происходить из TCRZ, FcRy, FcRe, CD3y, CD3δ, CD3ε, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В рамках настоящей заявки, внутриклеточный сигнальный домен может включать сигнальный домен CD3Z. Например, внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот во внутриклеточном сигнальном домене; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с внутриклеточным сигнальным доменом.

В рамках настоящей заявки, CAR может дополнительно включать лидерную последовательность. Например, лидерная последовательность может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот в лидерной последовательности; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с лидерной последовательностью.

В рамках настоящей заявки, CAR может содержать линкер между соответствующими доменами. Например, линкер включается для достижения правильного расстояния и конфигурации между соответствующими доменами. Например, линкер может связывать трансмембранный домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В рамках настоящей заявки, линкер может содержать следующие аминокислотные

- 7 045097 последовательности: GGG, (GGGGS) n и GGRRGGGS.

В CAR по настоящей заявке трансмембранный домен может происходить из CD8a, костимулирующий домен может происходить из CD137, и внутриклеточный сигнальный домен может происходить из CD3Z.

В рамках настоящей заявки, CAR может содержать BCMA-связывающий домен, включающий HCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, HCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и HCDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, трансмембранный домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, шарнирную область, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, внутриклеточный сигнальный домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и лидерную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

В рамках настоящей заявки, CAR может содержать BCMA-связывающий домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, трансмембранный домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, шарнирную область, включающую аминокислотная последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, внутриклеточный сигнальный домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и лидерную последовательность, включающая аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

В рамках настоящей заявки, CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10-11, или ее функциональный вариант. Из них функциональный вариант выбран из группы, состоящей из белков или полипептидов, образованных заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот в CAR; и белков или полипептидов, имеющих 90% или более (например, по меньшей мере, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или больше) гомологию последовательности с CAR.

Настоящая заявка относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая может кодировать CAR.

В рамках настоящей заявки, молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 12-13, или ее функциональный вариант. Например, функциональный вариант может включать полинуклеотид, имеющий, по меньшей мере, примерно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательности с последовательностью из SEQ ID NO: 12-13 или вариантом, при условии, что она все еще может кодировать CAR.

Настоящая заявка относится к вектору, который может содержать молекулу нуклеиновой кислоты.

В рамках настоящей заявки, вектор может включать одно или более из ориджина репликации, селективного бокса, промотора, энхансера, сигнала инициации трансляции (последовательность ШайнаДальгарно или последовательность Козака), интрона, последовательности полиаденилирования, 5'- и 3'нетранслируемой области. Например, вектор может содержать промотор EF1, и промотор EF1 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14. В рамках настоящей заявки, вектор может быть выбран из плазмид, фагов, искусственных хромосом (например, дрожжевой искусственной хромосомы, YAC) и вируса животных. Например, вектор может быть выбран из ДНК-векторов, РНКвекторов, плазмид, лентивирусных векторов, аденовирусных векторов и ретровирусных векторов.

Настоящая заявка относится к иммунной эффекторной клетке, которая может содержать CAR, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.

В рамках настоящей заявки, иммунная эффекторная клетка может быть выбрана из T-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров (NK).

Настоящая заявка относится к способу получения эффекторной иммунной клетки, включающему введение вектора в эффекторную иммунную клетку. Например, CAR вводится и экспрессируется в иммунных клетках для перенацеливания CAR специфически на антиген-мишень (например, BCMA). В настоящей заявке иммунная эффекторная клетка может быть выбрана из T-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров (NK). В рамках настоящей заявки, способ может включать стадию получения иммунных эффекторных клеток от субъекта. Например, T-лимфоциты можно получить из мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатических узлов, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцита, плеврального выпота, ткани селезенки и опухоли. Кроме того, способ может дополнительно включать стадию селекции определенной клеточной субпопуляции из иммунной эффекторной клетки. Например, определенная субпопуляция T-клеток может быть выбрана в соответствии со специфической экспрессией CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA и CD45RO.

Настоящая заявка относится к композиции, которая может содержать эффекторную иммунную

- 8 045097 клетку.

В рамках настоящей заявки, композиция может содержать фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтически приемлемые носители могут быть выбраны из группы, состоящей из эксципиентов, скользящих веществ, подсластителей, разбавителей, консервантов, красок/красителей, усилителей вкуса, поверхностно-активных веществ, смачивающих агентов, диспергаторов, суспендирующих агентов, стабилизаторов, изотонических агентов, растворителей, поверхностно-активных веществ и эмульгаторов.

В рамках настоящей заявки, композиция может дополнительно включать дополнительные активные ингредиенты, такие как одно или более из цитокинов, факторов роста, гормонов, низкомолекулярных химических активных ингредиентов, пролекарств и антител.

В рамках настоящей заявки, количество иммунных эффекторных клеток в композиции может представлять собой эффективное количество. Эффективное количество может представлять собой минимальное количество, при котором можно достичь положительного или желаемого профилактического или терапевтического эффекта. Например, эффективное количество может зависеть от тяжести заболевания, возраста, массы тела, пола или других факторов субъекта.

Настоящая заявка относится к применению CAR, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или эффекторной иммунной клетки в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA.

Настоящая заявка относится к CAR, молекуле нуклеиновой кислоты, вектору или иммунной эффекторной клетке для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA.

Настоящая заявка относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией BCMA, включая стадию введения субъекту CAR, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или иммунной эффекторной клетки.

В рамках настоящей заявки, заболевание или нарушение, связанное с экспрессией BCMA, представляет собой рак или злокачественную опухоль. В настоящей заявке заболевание или нарушение, связанное с экспрессией BCMA, выбрано из группы, состоящей из B-клеточного острого лимф областного лейкоза, T-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, бластноклеточной плазмацитоидной дендритно-клеточной цитомы, лимфомы Беркитта, диффузной Bкрупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественного лимфопролиферативного состояния, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, плазмоцитоидной дендритно-клеточной цитомы, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака легких, миеломы, MGUS, плазмоцитомы, системного амилоидоза, вызванного аномальными легкими цепями, образующими амилоидные отложения, и синдрома POEMS.

В рамках настоящей заявки, способ введения лекарственного средства может включать аэрозольную ингаляцию, инъекцию, прием внутрь, инфузию, имплантацию или трансплантацию. Например, инъекция может включать внутрисосудистые, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрисуставные, интраорбитальные, интратуморальные, внутрисердечные, внутрикожные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, субэпидермальные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные и внутримышечные инъекции, или прямую инъекцию в опухоль или лимфатический узел.

Далее настоящая заявка дополнительно иллюстрируется подробными примерами. Следует понимать, что следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящей заявки и не ограничивают содержание изобретения.

Примеры.

Пример 1. Получение гена VHH однодоменного анти-BCMA антитела.

1) Создание библиотеки однодоменных анти-BCMA антител.

Здоровых взрослых альпаков иммунизировали многократными подкожными инъекциями в шею и спину антигеном BCMA, полученным из Beijing Yiqiao Shenzhou Ltd. При иммунизации антиген и равный объем адъюванта Фрейнда смешивали для 4-6 иммунизации. Следили за всасыванием введенной массы в местах инъекций и наблюдали для подтверждения правильности иммунизации. Интервал между иммунизациями составлял 7-15 суток. После четвертой иммунизации отбирали образцы крови для определения иммунного титра к антигену. Когда титр достигал более 10000 (метод ELISA), то отбирали образец крови (примерно 100 мл) для выделения лимфоцитов для экстракции РНК, которую обратно транскрибировали в кДНК. Фрагмент вариабельной области VHH антитела из тяжелых цепей альпака дважды амплифицировали с помощью ПЦР. Фрагмент VHH был сконструирован в библиотеке фагового дисплея, и продукт фрагмента гена, несущего однодоменное антитело, трансформировали в компетентные клетки, с получением иммунной библиотеки однодоменных антител.

2) Скрининг однодоменного анти-BCMA антитела.

Молекулы однодоменных антител экспонировали на поверхности фага с помощью технологии фа

- 9 045097 гового дисплея, и затем скринировали для получения антигенспецифических однодоменных антител. С помощью фагового твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) антиген разбавляли 100 мМ NaHCO3 (pH 8,0) до конечной концентрации 100 мкг/мл, и 100 мкл покрывали 96-луночный планшет, выдерживали в течение ночи при 4°C. После промывания PBS и покрытия 1% обезжиренным молоком фаги добавляли для инкубации в течение 1-2 ч. Затем элюировали антигенспецифические фаги и инфицировали клетки TG1, которые помещали и культивировали в культуральный планшет со средой LB, содержащей ампициллин. С помощью нескольких раундов скрининга постепенно достигалось концентрирование. Для определения ELISA было отобрано большое количество положительных клонов, и положительные клоны секвенировали. По данным выравнивания последовательностей идентифицировали уникальные клоны и разделяли на каркасную область (FR) и определяющий комплементарность участок (CDR).

Клоны с правильными результатами секвенирования инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин, и культивировали в течение ночи при 37°C на шейкере. 1 мл бактериального раствора инокулировали в 300 мл среды LB и культивировали при 37°C на шейкере до OD_{600 нм}=0,6-0,9. Добавляли 1М IPTG и культивировали в течение ночи при 28°C на шейкере. Бактерии собирали центрифугированием. Сырой экстракт антитела получали осмотическим методом. Однодоменное антитело метили ProteinL и очищали с помощью аффинной хроматографии с выходом более 10 мг/л. Аффинность антитела определяли с помощью технологии SPR для дальнейшего скрининга однодоменных антител с высокой специфичностью. Согласно вышеуказанному варианту осуществления в целом было получено 6 однодоменных анти-ВСМА антител, и было выбрано однодоменное антитело с более высокой аффинностью.

Из них одно однодоменное анти-ВСМА антитело было названо ВСМА sdAb I. Посредством секвенирования было установлено, что аминокислотные последовательности HCDR1-3 ВСМА sdAb I представляют таковые, последовательно представленные в SEQ ID NO: 1-3.

Пример 2. Конструирование вектора гена химерного антигенного рецептора.

Два генных сегмента синтезировали в Taihe Biotechnology Co., Ltd. Один из них представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15, которая находится в ВСМА sdAb I, полученном в примере 1; и другая представляет собой сконструированный структурный ген CAR поколения 2 (шарнирная область CD8a, трансмембранный домен+костимулирующий домен 4-1BB+внутриклеточный сигнальный домен CD3Z, и нуклеотидная последовательность, кодирующая структурный ген CAR поколения 2, содержащий эти домены, представляет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16). После получения синтетического гена проводили молекулярное клонирование для конструирования ВСМАспецифического CAR. Продукты ПЦР с последовательностями SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 получали с помощью ПЦР. ПЦР с перекрывающимися праймерами использовали для получения гена ВСМА CAR, связыванием двух фрагментов (его нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 12). Лентивирусный вектор Pre и ген ВСМА CAR ферментативно расщепляли, связывали и трансформировали. Собирали клоны и экстрагировали плазмиды. Проводили секвенирование для подтверждения правильной последовательности лентивирусного вектора Pre-Lenti-EF1-BCMA.

1) SEQ ID NO: 15:

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaagtccaactccaggcttcc ggtggcggtctggcacagcctggagggtccctgcggctctcctgcgcagcaagtggcaggactttcagtacctactttatggcctggttcag acagccacctggcaaaggcctcgaatacgtcggagggattaggtggtctgacggtgtccctcactacgctgacagtgtgaagggtcggttc accattagcagagacaacgctaagaatacagtgtacctgcaaatgaactcactgagagctgaggatactgctgtgtacttctgcgcatctcgc ggaatcgctgacgggtcagactttggctcctatggacagggcacccaggtgactgtgagttcc

2) SEQ ID NO: 16:

ccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcg cccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttg gccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatt tatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaa gttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtac gatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatg aactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttt accagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

Пример 3. Получение лентивируса ВСМА-специфического химерного антигенного рецептора.

За сутки до упаковки вируса клетки 293T (полученные в ATCC) переваривали трипсином и инокулировали на 10 см чашку из расчета 1x10' клеток/чашку. После трансфекции клеток в дополнение к плазмиде Pre-Lenti-EF1-BCMA, полученной в примере 2, каждую плазмиду необходимо было котрансфектировать с упаковочными плазмидами psPAX2, pMD2.0G. Из них использовали 5 мкг Pre-Lenti-EFlBCMA, 3,75 мкг плазмиды psPAX2 и 1,25 мкг плазмиды pMD2.0G. После трансфекции смесь трех вышеуказанных плазмид добавляли в 500 мкл среды MEM. В отдельную микроцентрифужную пробирку на 25

- 10 045097 мкл добавляли реагент Lipofectamine 2000 (липосома) в 500 мкл среды MEM. Затем разбавленный реагент для трансфекции добавляли по каплям над разбавленной плазмидой, хорошо перемешивали, центрифугировали и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин. Наконец, смесь плазмиды и реагента для трансфекции добавляли на культуральную чашку диаметром 10 см, осторожно встряхивали 10 раз, хорошо перемешивали и помещали в термостат. Через 3 суток трансфекции вирус собирали. 10 мл вирусосодержащего супернатанта культуры переносили в центрифужную пробирку емкостью 50 мл и центрифугировали при 4°C при 1250 об/мин в течение 5 мин для удаления мертвых клеток 293Т. Затем вирусосодержащего супернатант фильтровали, концентрировали, упаковывали и хранили при -80°C для использования.

Пример 4. Получение T-клеток, модифицированных ВСМА-специфическим химерным антигенным рецептором.

1) Получение T-лимфоцитов.

В стерильных условиях у добровольцев отбирали 10 мл венозной крови. В центрифужную пробирку емкостью 50 мл добавляли 10 мл изолятов человеческих лимфоцитов (Dakewei Bioengineering Co., Ltd.). Кровь медленно вносили с помощью электрического пистолета-дозатора в центрифужную пробирку, по стенке. Центрифужную пробирку помещали в центрифугу и центрифугировали при 700 g при 22°C в течение 25 мин. После окончания центрифугирования РВМС находятся в белом мембранном слое между верхним слоем плазмы и отделившимся раствором. Белый мембранный слой, как можно полнее, отсасывали в другую центрифужную пробирку с помощью пипетки Пастера (добавляя 30 мл среды 1640). В данном случае нужно быть осторожными, чтобы не отсосать отделившийся раствор. Центрифугировали при 250 g, 22°C, в течение 10 мин. Верхнюю жидкость отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 3 мл среды 1640 и подсчитывали для выделения T-клеток.

1х10⁷ клеток помещали в микроцентрифужную пробирку и центрифугировали при 250 g при 22°C в течение 10 мин. Верхнюю жидкость отбрасывали, клеточные осадки ресуспендировали в 80 мкл буфера для разделения магнитными шариками и добавляли 20 мкл CD3MicroBeads (Meitianni). Смесь помещали при 4°C в холодильник на 1 ч для обеспечения достаточного связывания. Через 1 ч в микроцентрифужную пробирку добавляли 1 мл буфера для разделения магнитными шариками и центрифугировали при 250 g при 4°C в течение 10 мин. В течение этого периода готовили колонку для фильтрования, помещали на магнит и промывали 500 мкл буфера (буфер стекал вниз под действием силы тяжести). После центрифугирования супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера. Добавляли колонку, и буфер стекал вниз под действием силы тяжести. После вытекания клеточной суспензии колонку промывали четыре раза 500 мкл буфера. Колонку удаляли с магнита, и T-клетки промывали 1 мл буфера в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл. Клетки центрифугировали при 250 g при 4°C в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в среде Х-vivo 15, содержащей IL2 (Lonza), и инокулировали из расчета 2x106 T-клеток/лунку (в 6-луночном планшете) после подсчета.

2) Инфицирование T-клеток лентивирусом.

После культивирования в течение ночи для инфицирования в течение ночи добавляли раствор вируса Pre-Lenti-EF1-BCMA с MOI=2, полученный в примере 3. На сутки 2 добавляли 1 мл свежей среды. На сутки 3 T-клетки были достаточно активированы и быстро пролиферировали. В это время T-клетки переносили в культуральную колбу емкостью 25 см. На сутки 5 после инфицирования эффективность экспрессии молекул BCMA CAR на поверхности T-клеток определяли с помощью биомеченного белка BCMA Fc для получения BCMA-специфических CART-клеток. Экспрессию CAR на поверхности клеточной мембраны определяли проточной цитометрией. Результаты анализа проточной цитометрией экспрессии молекул BCMA CAR на поверхности клеток BCMA CART приведены на фиг. 1. Результаты на фиг. 1 показывают, что эффективность экспрессии CAR в клетках BCMA CART, полученных в примере 4, составляет более 50%.

Пр имер 5. Оценка функции T-клеток, модифицированных BCMA-специфическим химерным антигенным рецептором.

1) Оценка функции in vitro.

Клетки множественной миеломы MM.1S и клетки миелоидного лейкоза K562 (полученные из ATCC) анализировали проточной цитометрией. Результаты приведены на фиг. 2. Результаты на фиг. 2 показывают, что молекулы BCMA эффективно экспрессируются в клетках MM. 1S, но не экспрессируются в клетках K562.

Опыты по оценке киллинга клеток in vitro проводили с помощью набора для детектирования LDH (Promega). Клетки BCMA CART, полученные в примере 4, и клетки-мишени (такие как клетки MM.1S или клетки K562), использованные с четырьмя градиентами в соответствии с числовым соотношением (то есть множественностью инфекции), а именно 0,5:1, 1:1, 2:1 и 4:1. Из них клетки-мишени составляли 3x10⁴ клеток/лунку, и системы во всех остальных лунках дополняли до 200 мкл средой X-VIVO/средой 1640. 96-луночный планшет инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в термостате. Через 17 ч в лунку с максимальным высвобождением добавляли 20 мкл лизата. При тщательном перемешивании клетки полностью разрушались. 96-луночный планшет инкубировали в CO2 инкубаторе в течение 2 ч. Через 2 ч отмечали

- 11 045097 лунку с максимальным высвобождением. После того, как все клетки-мишени лизировались, 50 мкл супернатанта отбирали из каждой лунки и переносили в 96-луночный планшет с плоским дном, и затем в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора субстрата и проявляли в темноте в течение 30 мин. Через 30 мин в лунках наблюдали изменение цвета, где лунки с максимальным высвобождением MM. 1S и лунки, содержащая клетки BCMA CART, имели относительно темные цвета. Измерения проводили с помощью ридера для ферментов при длине волны 490 нм. Результаты определения способности к киллингу получали с использованием набора для определения LDH.

Результаты приведены на фиг. 3, киллинговый эффект для клеток K562 показан на фиг. 3A; и киллинговый эффект для клеток MM.1S показан на фиг. 3B. Результаты на фиг. 3 показывают, что BCMAспецифические CART-клетки, полученные в примере 4, могут специфически индуцировать гибель BCMA-положительных клеток с высокой киллинговой активностью, например, выше 40%. В то же время эти BCMA-специфические CART-клетки не оказывают киллингового эффекта на BCMA-отрицательных клетках.

Опухолевые клетки MM.1S и клетки BCMA CART, полученные в примере 4, совместно инкубировали и детектировали методом ELISA на содержание IFN-γ и TNFa в супернатанте. Результаты приведены на фиг. 4, где содержание IFN-γ показано на фиг. 4A, и содержание TNFa показано на фиг. 4B. Результаты на фиг. 4 показывают, что различная множественность инфекции может повышать уровни экспрессии цитокинов IFN-γ и TNFa, оказывая киллинговый эффект на опухоли. Это доказывает специфический характер киллингового эффекта BCMA CART-клеток с другой точки зрения.

2) Эксперименты на животных.

Клетки линии множественной миеломы человека MM. 1S трансфектировали для экспрессии репортерного гена люциферазы с получением MM.1S-luc. Среду 1640, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), обычной инкубировали в атмосфере 5% CO₂ в термостате при 37°C. Клетки линии MM.1S-luc вводили из расчета 1,5x106 клеток/200 мкл PBS в хвостовую вену мышей (50 мышей, половина самцов и половина самок) в течение 17 суток. Затем всех животных визуализировали. Мыши, однородно несущие опухоли, входили в опытную группу и их произвольно разделяли на 5 групп (половина самцов и половина самок, по 8 мышей в каждой группе), то есть группу с внеклеточной жидкостью, контрольную группу T, а также группы с BCMA CART в низкой, средней и высокой дозе. Из них, группе с внеклеточной жидкости вводили внеклеточную жидкость в хвостовую вену, контрольной группе T вводили контрольные T-клетки в хвостовую вену, и группе с BCMA CART в низкой, средней и высокой дозе вводили в хвостовую вену клетки BCMA CART, полученные в примере 4.

Через 3 суток мышей анестезировали и внутрибрюшинно вводили субстрат люциферазы. Опухолевую нагрузку в контрольных группах (группа с внеклеточной жидкостью и контрольная группа T) и группах обработки BCMA CART определяли с помощью системы визуализации для мелких животных in vivo. Результаты на сутки 3 и 7 после лечения показаны на фиг. 5 и 6 соответственно.

Результаты на фиг. 5 показывают, что при визуализации опухолевые клетки практически отсутствуют в группах обработки BCMA CART в высокой и средней дозах, в то время как опухолевая нагрузка в контрольных группах высокая, тем самым указывая, что BCMA CART может эффективно элиминировать BCMA-положительные опухолевые клетки. После того, как клетки BCMA CART вводили обратно в вену, то интенсивность сигнала флуоресценции у мышей на сутки 3 начала снижаться по сравнению с группой с внеклеточной жидкостью и контрольной группой T, указывая на то, что опухолевая нагрузка снижалась. По данным фиг. 6 следует, что интенсивность сигнала флуоресценции у мышей на сутки 7 практически не определялась. Можно видеть, что BCMA CART также демонстрирует сильный терапевтический эффект на заболевания, связанные с экспрессией BCMA в эксперименте на животных in vivo.

Специалисты в данной области техники должны понимать, что, несмотря на то, что здесь было показано и подробно описано много примерных вариантов осуществления настоящей заявки, тем не менее, многие другие вариации или модификации в соответствии с принципами настоящей заявки можно непосредственно определить или получить из раскрытия настоящей заявки, не отступая от сущности или объема настоящей заявки. Таким образом, объем настоящей заявки следует понимать и рассматривать как охватывающий все другие варианты или модификации.

Список последовательностей <110> SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA CO. LTD.

<12 0> ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР ДЛЯ BCMA НА ОСНОВЕ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <130> 0087-PA-003EA <160> 16

- 12 045097 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность HCDR1 BCMA-связывающего домена < 400>1

Thr Tyr Phe Met Ala <210>2 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотная последовательность HCDR2 BCMA-связывающего домена <400>2

Gly Gly Ile Arg Trp Ser Asp Gly Val Pro His Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 1015

Lys Gly <210>3 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотная последовательность HCDR3 BCMA-связывающего домена <400>3

Cys Ala Ser Arg Gly Ile Ala Asp Gly Ser Asp Phe Gly Ser <210>4 <211>120 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность BCMA-связывающего домена < 400>4

Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly 15

Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 2025

Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr

- 13 045097

Phe Met Ala Trp Phe 35

Arg Gln Pro Pro Gly 40

Lys Gly Leu Glu Tyr Val 45

Gly Gly Ile Arg Trp 50

Ser Asp Gly Val Pro 55

His Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr 65

Ile Ser Arg Asp Asn 70

Ala Lys Asn Thr Val Tyr 75 80

Leu Gln Met Asn Ser

Leu Arg Ala Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Phe Cys 95

Ala Ser Arg Gly Ile

100

Ala Asp Gly Ser Asp

105

Phe Gly Ser Tyr Gly Gln

110

Gly Thr Gln Val Thr 115

Val Ser Ser

120 < 210> 5 < 211> 21 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность трансмембранного домена < 400>5

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

5 1015

Ser Leu Val Ile Thr < 210>6 < 211>49 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность шарнирной области < 400> 6

Pro 1

Ala

Lys

Pro

Thr 5

Thr

Thr

Pro

Ala

Pro 10

Arg

Pro

Pro

Thr

Pro 15

Ala

Pro

Thr

Ile

Ala 20

Ser

Gln

Pro

Leu

Ser 25

Leu

Arg

Pro

Glu

Ala 30

Cys

Arg

Pro

Ala

Ala

Gly

Gly

Ala

Val

His

Thr

Arg

Gly

Leu

Asp

Phe

Ala

Cys

- 14 045097

Asp < 210> 7 < 211> 42 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность костимулирующего домена <400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 1 5

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

Arg Pro Val

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 2530

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

3540 <210>8 <211>114 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотная последовательность внутриклеточного сигнального домена <400> 8

Leu Arg Val 1

Lys Phe 5

Ser Arg Ser Ala Asp Ala

Gly Gln Asn

Gln Leu 20

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 25

Tyr Asp Val

Leu Asp

Lys Arg Arg Gly Arg Asp 40

Pro Ala Tyr Gln Gln 15

Gly Arg Arg Glu Glu 30

Pro Glu Met Gly Gly 45

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln

55

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 60

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 65 70

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

80

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 85

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 90 95

- 15 045097

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

100

105

110

Pro Arg <210> 9 <211> 21 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность лидерной последовательности <400>9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

5 1015

His Ala Ala Arg Pro <210>10 <211>369 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> аминокислотная последовательность полного CAR (включая лидерную последовательность) < 400>10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

5 1015

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu 20 2530

Ala Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 35 4045

Thr Phe Ser Thr Tyr Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 5560

Gly Leu Glu Tyr Val Gly Gly Ile Arg Trp Ser Asp Gly Val Pro His 65 70 7580

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 9095

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105110

- 16 045097

Ala Val Tyr Phe Cys 115

Ala Ser Arg Gly Ile 120

Ala Asp Gly Ser Asp 125

Gly Ser Tyr Gly Gln 130

Gly Thr Gln Val Thr

135

Val Ser Ser Pro Ala

140

Pro Thr Thr Thr Pro 145

Ala Pro Arg Pro Pro 150

Thr Pro Ala Pro Thr 155

Ala Ser Gln Pro Leu

165

Ser Leu Arg Pro Glu

170

Ala Cys Arg Pro Ala

175

Gly Gly Ala Val His

180

Thr Arg Gly Leu Asp

185

Phe Ala Cys Asp Ile

190

Ile Trp Ala Pro Leu

195

Ala Gly Thr Cys Gly

200

Val Leu Leu Leu Ser

205

Val Ile Thr Leu Tyr

210

Cys Lys Arg Gly Arg

215

Lys Lys Leu Leu Tyr

220

Phe Lys Gln Pro Phe 225

Met Arg Pro Val Gln 230

Thr Thr Gln Glu Glu 235

Gly Cys Ser Cys Arg

245

Phe Pro Glu Glu Glu

250

Glu Gly Gly Cys Glu

255

Arg Val Lys Phe Ser

260

Arg Ser Ala Asp Ala

265

Pro Ala Tyr Gln Gln

270

Gln Asn Gln Leu Tyr

275

Asn Glu Leu Asn Leu

280

Gly Arg Arg Glu Glu

285

Asp Val Leu Asp Lys 290

Arg Arg Gly Arg Asp

295

Pro Glu Met Gly Gly 300

Pro Gln Arg Arg Lys 305

Asn Pro Gln Glu Gly 310

Leu Tyr Asn Glu Leu 315

Lys Asp Lys Met Ala

325

Glu Ala Tyr Ser Glu

330

Ile Gly Met Lys Gly

335

Arg Arg Arg Gly Lys

340

Gly His Asp Gly Leu

345

Tyr Gln Gly Leu Ser

350

Phe

Lys

Ile 160

Ala

Tyr

Leu

Ile

Asp 240

Leu

Gly

Tyr

Lys

Gln 320

Glu

Thr

Pro

Ala Thr Lys Asp Thr

Tyr Asp Ala Leu His

Met Gln Ala Leu Pro

- 17 045097

355

Arg

360

365 <210> 11 <211> 348 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотная последовательность полного CAR (не включая лидерную последовательность) <400>11

Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 2530

Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 4045

Gly Gly Ile Arg Trp Ser Asp Gly Val Pro His Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 9095

Ala Ser Arg Gly Ile Ala Asp Gly Ser Asp Phe Gly Ser Tyr Gly Gln

100 105110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro

115 120125

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

130 135140

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

145 150 155160

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

165 170175

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

- 18 045097

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

205

180

185

190

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

195 200

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

210 215

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

220

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

225 230

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

235 240

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

245

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

250 255

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

260

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

265 270

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

275 280

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys

285

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

290 295

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 300

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

305 310

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

315 320

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

325

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

330 335

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 340

Leu Pro Pro Arg 345 <210> 12 <211> 1110 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR (включая дерную последовательность) < 400> 12 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccggaagtcc aactccaggc ttccggtggc ggtctggcac agcctggagg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcaagtgg caggactttc agtacctact ttatggcctg gttcagacag ccacctggca aaggcctcga atacgtcgga gggattaggt ggtctgacgg tgtccctcac tacgctgaca gtgtgaaggg tcggttcacc attagcagag acaacgctaa gaatacagtg ли60

120

180

240

300

- 19 045097 tacctgcaaa ggaatcgctg tccccagcga gcgtcgcagc cacacgaggg tgtggggtcc ctcctgtata ggctgtagct agcaggagcg aatctaggac atggggggaa aaagataaga aaggggcacg cttcacatgc <210> 13 <211> 1047 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR (не лидерную оследовательность) < 400> 13 gaagtccaac tcctgcgcag cctggcaaag gctgacagtg ctgcaaatga atcgctgacg ccagcgaagc tcgcagcccc acgagggggc ggggtccttc ctgtatatat tgtagctgcc tgaactcact acgggtcaga agcccaccac ccctgtccct ggctggactt ttctcctgtc tattcaaaca gccgatttcc cagacgcccc gaagagagga agccgcagag tggcggaggc atggccttta aggccctgcc tccaggcttc caagtggcag gcctcgaata tgaagggtcg actcactgag ggtcagactt ccaccacgac tgtccctgcg tggacttcgc tcctgtcact tcaaacaacc gatttccaga gagagctgag ctttggctcc gacgccagcg gcgcccagag cgcctgtgat actggttatc accatttatg agaagaagaa cgcgtaccag gtacgatgtt aaggaagaac ctacagtgag ccagggtctc ccctcgctaa cggtggcggt gactttcagt cgtcggaggg gttcaccatt agctgaggat tggctcctat gccagcgccg cccagaggcg ctgtgatatc ggttatcacc atttatgaga agaagaagaa gatactgctg tatggacagg ccgcgaccac gcgtgccggc atctacatct accctttact agaccagtac gaaggaggat cagggccaga ttggacaaga cctcaggaag attgggatga agtacagcca ctggcacagc acctacttta attaggtggt agcagagaca actgctgtgt ggacagggca cgaccaccaa tgccggccag tacatctggg ctttactgca ccagtacaaa ggaggatgtg tgtacttctg gcacccaggt caacaccggc cagcggcggg gggcgccctt gcaaacgggg aaactactca gtgaactgag accagctcta gacgtggccg gcctgtacaa aaggcgagcg ccaaggacac ctggagggtc tggcctggtt ctgacggtgt acgctaagaa acttctgcgc cccaggtgac caccggcgcc cggcgggggg cgcccttggc aacggggcag ctactcaaga aactgagagt cgcatctcgc gactgtgagt gcccaccatc gggcgcagtg ggccgggact cagaaagaaa agaggaagat agtgaagttc taacgagctc ggaccctgag tgaactgcag ccggaggggc ctacgacgcc

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1110 cctgcggctc cagacagcca ccctcactac tacagtgtac atctcgcgga tgtgagttcc caccatcgcg cgcagtgcac cgggacttgt aaagaaactc ggaagatggc gaagttcagc включая

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

- 20 045097 aggagcgcag ctaggacgaa gggggaaagc gataagatgg gggcacgatg cacatgcagg acgcccccgc gagaggagta cgcagagaag cggaggccta gcctttacca ccctgccccc gtaccagcag cgatgttttg gaagaaccct cagtgagatt gggtctcagt tcgctaa ggccagaacc gacaagagac caggaaggcc gggatgaaag acagccacca agctctataa gtggccggga tgtacaatga gcgagcgccg aggacaccta cgagctcaat ccctgagatg actgcagaaa gaggggcaag cgacgccctt

780

840

900

960

1020

1047 <210> 14 <211> 553 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> последовательность нуклеиновой кислоты промотора EF1 <400> 14 aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc gcctacgcta gac

120

180

240

300

360

420

480

540

553 <210> 15 <211> 423 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность нуклеиновой кислоты BCMA sdAb I <400> 15 atggccttac ccggaagtcc ctctcctgcg ccacctggca tacgctgaca tacctgcaaa cagtgaccgc aactccaggc cagcaagtgg aaggcctcga gtgtgaaggg tgaactcact cttgctcctg ttccggtggc caggactttc atacgtcgga tcggttcacc gagagctgag ccgctggcct ggtctggcac agtacctact gggattaggt attagcagag gatactgctg tgctgctcca agcctggagg ttatggcctg ggtctgacgg acaacgctaa tgtacttctg cgccgccagg gtccctgcgg gttcagacag tgtccctcac gaatacagtg cgcatctcgc

120

180

240

300

360

-

Claims (7)

1. ggaatcgctg acgggtcaga ctttggctcc tatggacagg gcacccaggt gactgtgagt

   420 tcc

   423 <210> 16 < 211> 687 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

   < 223> ген структуры CAR второго поколения < 400>16 ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg60 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac120 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt180 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc240 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc300 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc360 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat420 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg480 gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa540 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag600 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt660 cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa687

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Химерный антигенный рецептор (CAR), где указанный CAR включает: BCMA (антиген созревания B-клеток)-связывающий домен, трансмембранный домен, один или более костимулирующих доменов и внутриклеточный сигнальный домен; где BCMA-связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HCDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HCDR2), и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HCDR3), где аминокислотная последовательность HCDR1 приведена в SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность HCDR2 приведена в SEQ ID NO: 2 и аминокислотная последовательность HCDR3 приведена в SEQ ID NO: 3, где BCMA-связывающий домен представляет собой однодоменное антитело.
2. 2. CAR по п.1, где BCMA-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее функциональный вариант.
3. 3. CAR по любому из пп.1, 2, где трансмембранный домен включает полипептид, происходящий из белка, выбранного из группы, состоящей из α-, β- или ζ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154.
4. 4. CAR по любому из пп.1-3, где указанный трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, или ее функциональный вариант.
5. 5. CAR по любому из пп.1-4, где BCMA-связывающий домен связан с трансмембранным доменом через шарнирную область.
6. 6. CAR по п.5, где указанная шарнирная область содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или ее функциональный вариант.
7. 7. CAR по любому из пп.1-6, где один или более костимулирующих доменов происходят из костимулирующей молекулы, выбранной из группы, состоящей из CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76,

   -