EA045063B1

EA045063B1 - COMPOSITION FOR RELAXING MUSCLES

Info

Publication number: EA045063B1
Application number: EA202092820
Authority: EA
Inventors: Йонг Джи Чунг; Эюн Ми Ким; Эюнг Джи Ли
Original assignee: Кареджен Ко., Лтд.
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2023-10-27

Description

Область техникиField of technology

Настоящее изобретение относится к пептиду, обладающему физиологической активностью и к включающей его композиции, и, более конкретно, к композиции (например, фармацевтической композиции или косметической композиции) для расслабления мышц или для уменьшения морщин кожи, подавления выработки кожного сала или уменьшения акне, в состав которой входит пептид, обладающий физиологической активностью.The present invention relates to a peptide having physiological activity and to a composition comprising the same, and more particularly to a composition (for example, a pharmaceutical composition or a cosmetic composition) for relaxing muscles or for reducing skin wrinkles, suppressing sebum production or reducing acne, comprising which includes a peptide with physiological activity.

Уровень техникиState of the art

Нейроны (т.е. нервные клетки), составляющие нервную систему животного, имеют аксоны, обладающие особой структурой, которую нельзя найти в других клетках. Аксон имеет тонкую, длинную структуру, которая выступает из тела нервной клетки, так что аксон оказывается связанным с мишенью нейрона, посредством чего передаются сигналы и вещества.Neurons (i.e. nerve cells) that make up an animal's nervous system have axons that have a special structure that cannot be found in other cells. An axon is a thin, long structure that projects from the nerve cell body so that the axon becomes connected to the target neuron, through which signals and substances are transmitted.

Нервно-мышечный синапс имеет специфически дифференцированную синаптическую структуру, в которой терминали аксонов синаптически связаны с клетками скелетных мышц для передачи импульсов от нейронов к мышцам. Аксоны, направленные к скелетным мышцам, представляют собой миелинизированные аксоны, окруженные миелином и разветвляющиеся на различные терминальные дендриты по мере приближения аксонов к мышцам. Разветвленные аксоны окружены миелином, но миелин исчезает на участках аксонов, которые входят в мышцы. В этом случае разветвленные аксоны образуют терминальные бутоны, подобно терминалям аксонов, составляющим другие синапсы, и терминальные бутоны располагаются на поверхности вогнутых мышечных клеток. Такая структура называется моторная бляшка или нервно-мышечный синапс.The neuromuscular junction has a specifically differentiated synaptic structure in which axon terminals synapse with skeletal muscle cells to transmit impulses from neurons to muscles. Axons directed to skeletal muscle are myelinated axons, surrounded by myelin and branching into various terminal dendrites as the axons approach the muscles. Branched axons are surrounded by myelin, but the myelin disappears in the portions of the axons that enter the muscle. In this case, the branched axons form terminal boutons, like the axon terminals that make up other synapses, and the terminal boutons are located on the surface of concave muscle cells. This structure is called a motor plaque or neuromuscular junction.

Как и в других синапсах, на терминалях аксонов нервно-мышечных синапсов имеется множество митохондрий и синаптических пузырьков. Синаптические везикулы нервно-мышечных синапсов содержат ацетилхолин в качестве нейромедиатора. Молекулы SNARE необходимы для высвобождения ацетилхолина, а подавление действия высвобождения ацетилхолина вызывает вялый паралич. Между окончаниями аксонов и мышцами имеются синаптические щели, а клеточные мембраны клеток скелетных мышц, служащие постсинаптическими частями, вдавлены в сторону саркоплазмы, образуя ряд соединительных складок. Поскольку рецептор ацетилхолина присутствует на клеточных мембранах в местах соединительных складок, предполагается, что эта структура служит для расширения области, в которой рецептор может связываться с ацетилхолином.As at other synapses, the axon terminals of neuromuscular synapses contain many mitochondria and synaptic vesicles. Synaptic vesicles at neuromuscular junctions contain acetylcholine as a neurotransmitter. SNARE molecules are required for acetylcholine release, and inhibition of the action of acetylcholine release causes flaccid paralysis. There are synaptic clefts between axon terminals and muscles, and the cell membranes of skeletal muscle cells, serving as postsynaptic parts, are pressed towards the sarcoplasm, forming a series of connecting folds. Because the acetylcholine receptor is present on cell membranes at junctional folds, it is hypothesized that this structure serves to expand the area in which the receptor can bind acetylcholine.

Когда нервные импульсы передаются в нервно-мышечный синапс, чувствительные к напряжению кальциевые каналы терминальной клеточной мембраны открываются, так что ионы кальция попадают в кальциевые каналы. В результате синаптические везикулы сливаются с клеточной мембраной, высвобождая ацетилхолин из везикул в синаптические щели. Высвобождающийся ацетилхолин имеет возможность связываться с ацетилхолиновым рецептором, присутствующим в мембране мышечной клетки, и, таким образом, открываются натриевые каналы, вызывая деполяризацию клеточной мембраны. Импульсы, исходящие из нервно-мышечного синапса, распространяются по поверхности мышечных волокон и передаются в удаленные части мышечных клеток. Импульсы передаются триадам, открывая мембранные кальциевые каналы саркоплазматической сети и высвобождая ионы кальция в саркоплазму. Ионы кальция связаны с тропонином С, и таким образом мышцы начинают сокращаться. Когда импульсы прерываются, ионы кальция возвращаются в цистерны саркоплазматической сети посредством активного транспорта, тем самым вызывая расслабление мышц. Следовательно, при подавлении секреции ацетилхолина из нервно-мышечного синапса импульсы, генерируемые нервно-мышечным синапсом, не передаются мышцам. В этом случае, из-за прерывания импульсов мышцы расслабляются.When nerve impulses are transmitted to the neuromuscular junction, voltage-sensing calcium channels in the terminal cell membrane open so that calcium ions flow into the calcium channels. As a result, synaptic vesicles fuse with the cell membrane, releasing acetylcholine from the vesicles into the synaptic clefts. The released acetylcholine has the ability to bind to the acetylcholine receptor present in the muscle cell membrane and thus sodium channels open, causing depolarization of the cell membrane. Impulses emanating from the neuromuscular synapse propagate along the surface of the muscle fibers and are transmitted to distant parts of the muscle cells. Impulses are transmitted to the triads, opening membrane calcium channels of the sarcoplasmic reticulum and releasing calcium ions into the sarcoplasm. Calcium ions bind to troponin C, and thus the muscles begin to contract. When the impulses are interrupted, calcium ions return to the cisterns of the sarcoplasmic reticulum through active transport, thereby causing muscle relaxation. Therefore, when the secretion of acetylcholine from the neuromuscular junction is suppressed, the impulses generated by the neuromuscular junction are not transmitted to the muscles. In this case, due to the interruption of impulses, the muscles relax.

Между тем, причина или механизм образования мимических морщин зависят от напряжения мышц эпидермиса, тянущих кожу во внутреннем направлении. Такое мышечное напряжение возникает в результате ослабления лицевых мышц и чрезмерной активности нейронов. Чрезмерная нейронная активность характеризуется неконтролируемым чрезмерным высвобождением нейротрансмиттеров, которые стимулируют мышечные волокна. В результате молекулы, контролирующие высвобождение нейротрансмиттеров, снимают напряжение мышц, способствуя разглаживанию морщин на лице. Таким образом, существует потребность в новых действующих ингредиентах, которые эффективны в отношении контроля высвобождения нейротрансмиттеров для лечения мышечного спазма и для уменьшения или устранения асимметрии лица и/или морщин (особенно, мимических морщин).Meanwhile, the cause or mechanism of the formation of facial wrinkles depends on the tension of the muscles of the epidermis, pulling the skin in an inward direction. This muscle tension occurs as a result of weakened facial muscles and excessive neuronal activity. Excessive neural activity is characterized by the uncontrolled excessive release of neurotransmitters that stimulate muscle fibers. As a result, molecules that control the release of neurotransmitters relieve muscle tension, helping to smooth out facial wrinkles. Thus, there is a need for new active ingredients that are effective in controlling the release of neurotransmitters to treat muscle spasm and to reduce or eliminate facial asymmetry and/or wrinkles (especially expression lines).

Известно, что ботулинический токсин способен расслаблять мышцы. Ботулинический токсин чаще всего используется для клинических испытаний и косметических средств с целью разглаживания морщин на лице. Ботулинический токсин вызывает функциональное повреждение белка SNARE и оказывает расслабляющее действие на мышцы, прерывая работу комплекса SNARE, тем самым подавляя секрецию нейромедиатора (например, ацетилхолина).Botulinum toxin is known to relax muscles. Botulinum toxin is most often used in clinical trials and cosmetics to reduce facial wrinkles. Botulinum toxin causes functional damage to the SNARE protein and has a relaxing effect on muscles by interrupting the functioning of the SNARE complex, thereby inhibiting the secretion of a neurotransmitter (eg, acetylcholine).

Ботулинический токсин использовался в качестве миорелаксанта (публикация корейского патента № 2010-0020972) или использовался для уменьшения морщин благодаря способности ботулинического токсина расслаблять мышцы. Однако, поскольку паралитический эффект ботулинического токсина обратим в среднем в течение 6 месяцев, такое лечение требует повторных инъекций ботулинического токсина. Кроме того, поскольку ботулинический токсин имеет размер, распознаваемый иммунной системойBotulinum toxin has been used as a muscle relaxant (Korean Patent Publication No. 2010-0020972) or used to reduce wrinkles due to the ability of botulinum toxin to relax muscles. However, since the paralytic effect of botulinum toxin is reversible within an average of 6 months, this treatment requires repeated injections of botulinum toxin. Additionally, since botulinum toxin is of a size that is recognized by the immune system

- 1 045063 пациента, ботулинический токсин может вызывать иммунный ответ на вводимое лекарственное средство. Поскольку образование антител против ботулинического токсина приводит к значительной потере терапевтической эффективности, это является серьезной проблемой. Поэтому, существует потребность в идентификации молекул, проявляющих паралитический эффект, подобный ботулиническому токсину, но которые имеют более простые и стабильные молекулярные структуры, которые не вызывают иммунного ответа и являются эффективными с точки зрения стоимости производства.- 1 045063 patients, botulinum toxin can cause an immune response to the administered drug. Since the formation of antibodies against botulinum toxin leads to a significant loss of therapeutic efficacy, this is a serious problem. Therefore, there is a need to identify molecules that exhibit a paralytic effect similar to botulinum toxin, but which have simpler and more stable molecular structures that do not induce an immune response and are cost effective to produce.

Между тем, кожный жир вырабатывается сальными железами и выделяется через поры кожи и обладает антибактериальным и цитостатическим действием, образуя пленки на поверхности кожи и волос для защиты нашего организма от вторгшихся микробов. Поры расширяются, когда кожный жир избыточно выделяется сальными железами или когда возникает проблема с прохождением кожного жира через поры. Кожный жир накапливается в таких расширенных порах, и этот кожный жир дополнительно накапливается, смешиваясь с омертвевшими клетками кожи, остатками косметических средств или пылью. Накопившиеся остатки кожного жира окисляются при контакте с радикалами в воздухе и, таким образом, становятся коричневыми или черными, вызывая тем самым образование черных точек. Кроме того, поскольку кожный жир вызывает акне, существует потребность в разработке материалов, способных подавить чрезмерное производство кожного сала.Meanwhile, sebum is produced by the sebaceous glands and secreted through the pores of the skin and has antibacterial and cytostatic effects, forming films on the surface of the skin and hair to protect our body from invading microbes. Pores become enlarged when excess sebum is produced by the sebaceous glands or when there is a problem with the passage of sebum through the pores. Sebum accumulates in these enlarged pores, and this sebum further accumulates by mixing with dead skin cells, cosmetic residue, or dust. The accumulated sebum residues oxidize upon contact with radicals in the air and thus turn brown or black, thereby causing the formation of blackheads. In addition, since sebum causes acne, there is a need to develop materials that can suppress excessive sebum production.

ОписаниеDescription

Техническая проблемаTechnical problem

Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить пептид, обладающий различными типами физиологической активности, такими как расслабление мышц, уменьшение морщин на коже, подавление выработки кожного сала или уменьшение акне, и фармацевтическую или косметическую композицию, включающую его.Thus, the object of the present invention is to provide a peptide having various types of physiological activities, such as muscle relaxation, reduction of skin wrinkles, suppression of sebum production or reduction of acne, and a pharmaceutical or cosmetic composition comprising the same.

Решение проблемыSolution

Для достижения целей согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.To achieve the objects of one aspect of the present invention, there is provided a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция для расслабления мышц, включающая в качестве действующего ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for muscle relaxation, comprising as an active ingredient a peptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения композиция может находиться в форме фармацевтической композиции или косметической композиции, но настоящее изобретение этим не ограничено.According to one embodiment of the present invention, the composition may be in the form of a pharmaceutical composition or a cosmetic composition, but the present invention is not limited to this.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения пептид может быть включен в количестве от 0,001% по весу до 60% по весу, исходя из 100% по весу композиции для расслабления мышц, но настоящее изобретение этим не ограничено.According to another embodiment of the present invention, the peptide may be included in an amount of from 0.001% by weight to 60% by weight, based on 100% by weight of the muscle relaxant composition, but the present invention is not limited to this.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения композиция может быть использована для профилактики или лечения нервно-мышечного заболевания. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нервно-мышечное заболевание может включать подергивание век, кривошею, цервикальную дистонию, тонический блефароспазм, подмышечный гипергидроз, трещину заднего прохода, кольпоспазм, ахалазию, головную боль, идиопатическую и нейрогенную детрузорную гиперактивность, фокальную дистонию, боль/нарушение височно-нижнечелюстного сустава, диабетическую нейропатию, дисфункцию голосовых связок, косоглазие, хроническую нейропатию, гипертрофию лицевых мышц, детрузорносфинктерную диссинергию или доброкачественную гиперплазию предстательной железы, и головная боль может представлять собой мигрень, но настоящее изобретение не ограничено этим.According to yet another embodiment of the present invention, the composition can be used for the prevention or treatment of a neuromuscular disease. In one preferred embodiment of the present invention, the neuromuscular disorder may include eyelid twitching, torticollis, cervical dystonia, tonic blepharospasm, axillary hyperhidrosis, anal fissure, colpospasm, achalasia, headache, idiopathic and neurogenic detrusor overactivity, focal dystonia, pain/impairment temporomandibular joint, diabetic neuropathy, vocal cord dysfunction, strabismus, chronic neuropathy, facial muscle hypertrophy, detrusorosphincter dyssynergia or benign prostatic hyperplasia, and the headache may be migraine, but the present invention is not limited to this.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид может ингибировать секрецию ацетилхолина.According to yet another embodiment of the present invention, the peptide can inhibit the secretion of acetylcholine.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена косметическая композиция, включающая в качестве действующего ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.According to another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition comprising, as an active ingredient, a peptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения косметическая композиция может использоваться с целью улучшения состояния кожи, например, уменьшения морщин на коже, подавления выработки кожного сала или уменьшения угрей, но настоящее изобретение не ограничено этим.According to one embodiment of the present invention, the cosmetic composition can be used for the purpose of improving skin conditions, for example, reducing skin wrinkles, suppressing sebum production or reducing acne, but the present invention is not limited to this.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения пептид может быть включен в количестве от 0,001% по весу до 60% по весу, исходя из 100% по весу косметической композиции, но настоящее изобретение не ограничено этим.According to another embodiment of the present invention, the peptide may be included in an amount of from 0.001% by weight to 60% by weight, based on 100% by weight of the cosmetic composition, but the present invention is not limited to this.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид может увеличивать экспрессию коллагена, но настоящее изобретение не ограничено этим.According to yet another embodiment of the present invention, the peptide can increase the expression of collagen, but the present invention is not limited to this.

Полезные эффектыBeneficial effects

Поскольку пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, согласно настоящему изобретению обладает физиологической активностью, такой как расслабление мышц, уменьшение морщин на коже, подавление выработки кожного сала и т.п., пептид можно использовать в качестве действующего ингредиента в композиции для расслабления мышц, композиции дляSince the peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1 according to the present invention has physiological activities such as muscle relaxation, reduction of skin wrinkles, suppression of sebum production, etc., the peptide can be used as an active ingredient in compositions for muscle relaxation, compositions for

- 2 045063 уменьшения кожных морщин, композиции для подавления выработки кожного сала, композиции для подавления образования черных точек или композиции для уменьшения акне.- 2 045063 reduction of skin wrinkles, compositions for suppressing sebum production, compositions for suppressing the formation of blackheads or compositions for reducing acne.

Описание фигурDescription of the figures

На фиг. 1 показаны результаты оценки высокотемпературной стабильности пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, при хранении в течение длительного периода времени.In fig. 1 shows the results of evaluating the high temperature stability of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 when stored for an extended period of time.

На фиг. 2 показаны результаты оценки высокотемпературной стабильности пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 2 shows the results of an evaluation of the high temperature stability of a peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 3 показана степень разложения рекомбинантного синтаксина 1А пептидом, включающим аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 3 shows the degree of degradation of recombinant syntaxin 1A by a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 4 показана степень разложения эндогенного синтаксина 1А пептидом, включающим аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 4 shows the extent of degradation of endogenous syntaxin 1A by a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 5 показано ингибирующее действие пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, на образование комплекса SNARE.In fig. 5 shows the inhibitory effect of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the formation of the SNARE complex.

На фиг. 6 показано ингибирующее действие пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, на образование комплекса SNARE.In fig. 6 shows the inhibitory effect of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the formation of the SNARE complex.

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий ингибирующее действие пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, на секрецию ацетилхолина.Fig. 7 is a graph showing the inhibitory effect of a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 on acetylcholine secretion.

На фиг. 8 показан миорелаксантный эффект пептида, который включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 8 shows the muscle relaxant effect of a peptide that includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 9 и 10 показаны результаты сравнения эффектов ботокса и пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, на расслабление мышц.In fig. 9 and 10 show the results of a comparison of the effects of Botox and a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 on muscle relaxation.

На фиг. 11 показаны результаты определения, проникает ли в клетки пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 11 shows the results of determining whether a peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1 penetrates into cells.

На фиг. 12 показаны результаты проверки механизма проникновения в ткань для пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 12 shows the results of a tissue penetration mechanism test for a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 13 показаны результаты проверки того, что механизм проникновения пептида в ткань, который включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, осуществляется вокруг волосяного фолликула.In fig. 13 shows the results of verifying that the tissue penetration mechanism of the peptide, which includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, is around the hair follicle.

На фиг. 14 показаны результаты проверки того, что механизм проникновения пептида в ткань, который включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, осуществляется вокруг сальных желез.In fig. 14 shows the results of verifying that the tissue penetration mechanism of the peptide, which includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, is around the sebaceous glands.

На фиг. 15 и 16 показан уменьшающий морщины эффект пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 15 and 16 show the wrinkle-reducing effect of a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 17 показан повышенный уровень коллагена при нанесении пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 17 shows increased collagen levels upon application of a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 18 показан повышенный уровень эластина при нанесении пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 18 shows increased elastin levels upon application of a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 19 показан повышенный уровень фибронектина при нанесении пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 19 shows increased fibronectin levels upon application of a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

На фиг. 20 показаны результаты уменьшения количества сальных желез и снижения экспрессии маркера, связанного с продукцией кожного сала, при нанесении пептида, включающего аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.In fig. 20 shows the results of reducing the number of sebaceous glands and reducing the expression of a marker associated with sebum production when applying a peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Лучший вариант осуществления изобретенияBest Mode for Carrying Out the Invention

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.Next, the present invention will be described in detail.

1. Пептид по настоящему изобретению.1. The peptide of the present invention.

Настоящее изобретение относится к пептиду, обладающему полезной физиологической активностью, например, различным физиологическим действием, таким как расслабление мышц, уменьшение морщин на коже, подавление выработки кожного сала или уменьшение акне.The present invention relates to a peptide having beneficial physiological activities, for example, various physiological effects such as muscle relaxation, reduction of skin wrinkles, suppression of sebum production or reduction of acne.

Пептид по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту осуществления пептид по настоящему изобретению может состоять из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, но настоящее изобретение этим не ограничено.The peptide of the present invention includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the peptide of the present invention may consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but the present invention is not limited to this.

В данном описании термин пептид относится к линейной молекуле, образованной путем связывания аминокислотных остатков друг с другом посредством пептидных связей. Пептид может быть получен с использованием обычных способов биологического или химического синтеза, известных в соответствующей области, в частности, способов твердофазного синтеза.As used herein, the term peptide refers to a linear molecule formed by linking amino acid residues to each other through peptide bonds. The peptide can be prepared using conventional biological or chemical synthesis methods known in the art, in particular solid phase synthesis methods.

Пептид может включать аминокислотные варианты или фрагменты, которые имеют отличающиеся последовательности в пределах, не влияющих на его функциональные возможности, вследствие делеции, вставки или замены аминокислотного остатка (остатков) или их комбинации. Замена аминокислот без изменения активности пептида в общем известна в соответствующей области. В некоторых случаях пептид может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликози- 3 045063 лирования, метилирования, фарнезилирования и т.п. Поэтому, настоящее изобретение включает пептид, который имеет по существу такую же аминокислотную последовательность, что и пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, и его варианты или активные фрагменты. Выражение практически идентичный белок относится к белку, аминокислотная последовательность которого имеет гомологию по последовательности 60% или более, предпочтительно, 75% или более, например, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, или 99% или более относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но настоящее изобретение этим не ограничено. Белки, имеющие гомологию по аминокислотной последовательности 60% или более и проявляющие такую же активность, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, пептид по настоящему изобретению может дополнительно включать направляющую последовательность, метку, меченый остаток или аминокислотную последовательность, специально подобранную для увеличения периода полужизни или стабильности пептида.The peptide may include amino acid variants or fragments that have different sequences within limits not affecting its functionality, due to deletion, insertion or substitution of amino acid residue(s), or combinations thereof. Substitution of amino acids without changing the activity of the peptide is generally known in the relevant field. In some cases, the peptide may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, etc. Therefore, the present invention includes a peptide that has essentially the same amino acid sequence as the peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and variants or active fragments thereof. The expression substantially identical protein refers to a protein whose amino acid sequence has 60% or more, preferably 75% or more, sequence homology, for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but the present invention is not limited to this. Proteins having 60% or more amino acid sequence homology and exhibiting the same activity are within the scope of the present invention. In addition, the peptide of the present invention may further include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, or an amino acid sequence specifically selected to increase the half-life or stability of the peptide.

Также пептид по настоящему изобретению может быть получен с использованием различных способов, хорошо известных в соответствующей области. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению может быть получен с использованием рекомбинации полинуклеотидов и системы экспрессии белка, или может быть получен с использованием способа синтеза пептида in vitro посредством химического синтеза, такого как пептидный синтез, и способа бесклеточного синтеза белка и аналогичных способов.Also, the peptide of the present invention can be obtained using various methods well known in the relevant field. According to one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention can be produced using polynucleotide recombination and a protein expression system, or can be produced using an in vitro peptide synthesis method through chemical synthesis such as peptide synthesis and a cell-free protein synthesis method and similar methods.

Кроме того, с N- или С-концом пептида по настоящему изобретению может быть связана защитная группа для реализации более высокой химической стабильности, улучшенных фармакологических свойств (периода полужизни, абсорбируемости, титрования, эффективности и т.п.), модифицированной специфичности (например, широкого диапазона спектров биологической активности) и пониженной антигенности. Например, защитной группой может являться ацетильная группа, флуоренилметоксикарбонильная группа, формильная группа, пальмитоильная группа, миристильная группа, стеарильная группа или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Однако защитные группы можно использовать без ограничения, пока защитные группы могут модифицировать пептид, в частности, могут повышать стабильность пептида. Термин стабильность используется в значении, включающем стабильность in vivo, где пептид по настоящему изобретению защищен от атаки ферментов, расщепляющих белок in vivo, a также стабильность при хранении (например, стабильность при хранении при комнатной температуре).In addition, a protecting group may be attached to the N- or C-terminus of the peptide of the present invention to realize higher chemical stability, improved pharmacological properties (half-life, absorbability, titration, potency, etc.), modified specificity (e.g. wide range of spectra of biological activity) and reduced antigenicity. For example, the protecting group may be an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, or a polyethylene glycol (PEG). However, protecting groups can be used without limitation as long as the protecting groups can modify the peptide, in particular can increase the stability of the peptide. The term stability is used to include in vivo stability, where the peptide of the present invention is protected from attack by protein degrading enzymes in vivo, as well as storage stability (eg, stability when stored at room temperature).

2. Фармацевтическая композиция, включающая пептид по настоящему изобретению.2. A pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для расслабления мышц, включающей пептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for muscle relaxation, comprising a peptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Поскольку пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентичен пептиду, описанному в разделе 1: Пептид по настоящему изобретению, то для его конкретного описания см. раздел 1: Пептид по настоящему изобретению. Далее будет описана только конкретная конфигурация фармацевтической композиции.Since the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is identical to the peptide described in Section 1: Peptide of the Present Invention, for a specific description thereof, see Section 1: Peptide of the Present Invention. In the following, only a specific configuration of the pharmaceutical composition will be described.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению обладает миорелаксантной активностью и, таким образом, может использоваться в качестве действующего ингредиента композиции для расслабления мышц. Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для расслабления мышц, которая включает в качестве действующего ингредиента пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.According to one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention has muscle relaxant activity and thus can be used as an active ingredient in a muscle relaxant composition. Accordingly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for muscle relaxation, which includes as an active ingredient a peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Пептид может быть включен в количестве от 0,001% по весу до 60% по весу, например, в количестве от 0,01% по весу до 50% по весу, исходя из 100% по весу фармацевтической композиции для расслабления мышц. Когда содержание пептида в фармацевтической композиции для расслабления мышц меньше нижнего предела, эффект пептида на расслабление мышц может быть недостаточно выражен. С другой стороны, когда содержание пептида превышает верхний предел, может быть получен относительно низкий эффект пептида относительно концентрации добавленного пептида.The peptide may be included in an amount of from 0.001% by weight to 60% by weight, for example, in an amount of from 0.01% by weight to 50% by weight, based on 100% by weight of the pharmaceutical muscle relaxant composition. When the content of the peptide in the pharmaceutical composition for muscle relaxation is less than the lower limit, the effect of the peptide on muscle relaxation may not be sufficiently expressed. On the other hand, when the content of the peptide exceeds the upper limit, a relatively low effect of the peptide can be obtained relative to the concentration of the added peptide.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения нервно-мышечного заболевания. В этом случае фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может неограниченно применяться при нервно-мышечном заболевании до тех пор, пока нервно-мышечное заболевание является заболеванием, которое необходимо лечить расслаблением мышц.The pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of a neuromuscular disease. In this case, the pharmaceutical composition of the present invention can be used without limitation in a neuromuscular disease as long as the neuromuscular disease is a disease that needs to be treated by muscle relaxation.

Термин защита, используемый в настоящем изобретении, относится ко всем типам действий, при которых фармацевтическая композиция по настоящему изобретению задерживает начало нервномышечного заболевания.The term protection as used in the present invention refers to all types of actions in which the pharmaceutical composition of the present invention delays the onset of a neuromuscular disease.

Термин ингибирование, используемый в настоящем изобретении, относится ко всем типам действий, при которых фармацевтическая композиция по настоящему изобретению подавляет начало нервномышечного заболевания.The term inhibition as used in the present invention refers to all types of actions in which the pharmaceutical composition of the present invention suppresses the onset of a neuromuscular disease.

Термин лечение, используемый в настоящем изобретении, относится ко всем типам действий, при которых фармацевтическая композиция по настоящему изобретению улучшает или облегчает симптомы нервно-мышечного заболевания.The term treatment as used in the present invention refers to all types of actions in which the pharmaceutical composition of the present invention improves or alleviates the symptoms of a neuromuscular disease.

- 4 045063- 4 045063

Термин введение, используемый в настоящем изобретении, относится к введению определенного вещества субъекту с использованием любых подходящих способов. В этом случае фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться любыми обычными путями введения, с помощью которых композиция может достигать цели in vivo. Путь введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению особо не ограничивается, но фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться перорально или парентерально. В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться парентерально и, более конкретно, может вводиться путем нанесения композиции на кожу (т.е. дермальным введением). В частности, введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно проводить от одного до четырех раз в день, от двух до трех раз в день или два раза в день. Также введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно проводить в течение периода от 4 недель или более длительного периода, 8 недель или более длительного периода, от 4 недель до 12 недель или от 8 недель до 12 недель.The term administration as used in the present invention refers to the administration of a particular substance to a subject using any suitable methods. In this case, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any conventional routes of administration by which the composition can achieve its purpose in vivo. The route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In particular, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered parenterally and, more particularly, can be administered by applying the composition to the skin (ie, dermal administration). In particular, the administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be carried out from one to four times a day, from two to three times a day or twice a day. Also, the administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be carried out over a period of 4 weeks or a longer period, 8 weeks or a longer period, 4 weeks to 12 weeks, or 8 weeks to 12 weeks.

Термин нервно-мышечное заболевание, используемый в настоящем изобретении, относится к расстройству, которое возникает в периферических нервах и мышцах. Периферический нерв относится к нейронной сети, которая расходится от центральной нервной системы в черепе или позвоночнике, соединяя конечные органы, такие как мышцы или кожа, с центральной нервной системой, и служит для передачи команд, отдаваемых в центральной нервной системе, до конечных органов, таких как мышцы, или передают сенсорную информацию, такую как чувство боли, в центральную нервную систему. Заболевание периферической нервной системы включает дисфункцию периферических нервов, заболевания в нервно-мышечных синапсах, в которых периферические нервы соединены с мышцами, или в самих мышцах и т.п.The term neuromuscular disease as used in the present invention refers to a disorder that occurs in peripheral nerves and muscles. Peripheral nerve refers to the neural network that radiates from the central nervous system in the skull or spine, connecting end organs such as muscles or skin to the central nervous system, and serves to transmit commands issued in the central nervous system to end organs such as like muscles, or transmit sensory information, such as the feeling of pain, to the central nervous system. A peripheral nervous system disease includes dysfunction of the peripheral nerves, diseases at the neuromuscular junction at which the peripheral nerves are connected to the muscles, or in the muscles themselves, and the like.

Неограничивающие примеры нервно-мышечного заболевания включают такие заболевания, как подергивание век, кривошею (неестественное положение шеи, при котором шея наклонена в одну сторону из-за сокращения мышц), шейную дистонию, тонический блефароспазм, подмышечный гипергидроз, анальную трещину, кольпоспазм, ахалазию, головную боль, идиопатическую и нейрогенную детрузорную гиперактивность, фокальную дистонию (конечностей, височно-нижнечелюстных суставов, голосовых связок и т.п.), боль/нарушение височно-нижнечелюстного сустава, диабетическую нейропатию, дисфункцию голосовых связок, косоглазие, хроническую нейропатию, гипертрофию лицевых мышц (в жевательных мышцах и т.п.), детрузорносфинктерную диссинергию или доброкачественную гиперплазию предстательной железы и т.п. Головная боль может представлять собой мигрень.Non-limiting examples of neuromuscular disease include eyelid twitching, torticollis (an abnormal neck position in which the neck is tilted to one side due to muscle contraction), cervical dystonia, tonic blepharospasm, axillary hyperhidrosis, anal fissure, colpospasm, achalasia, headache, idiopathic and neurogenic detrusor overactivity, focal dystonia (limb, temporomandibular joints, vocal cords, etc.), temporomandibular joint pain/disorder, diabetic neuropathy, vocal cord dysfunction, strabismus, chronic neuropathy, facial hypertrophy muscles (in the masticatory muscles, etc.), detrusorosphincteric dyssynergia or benign prostatic hyperplasia, etc. The headache may represent a migraine.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать подходящий носитель, эксципиент или разбавитель, которые обычно используются для изготовления фармацевтической композиции.According to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a suitable carrier, excipient or diluent that is commonly used for the manufacture of the pharmaceutical composition.

Носитель, эксципиент или разбавитель, который можно использовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.п.The carrier, excipient or diluent that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum arabic, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose , amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться для изготовления таких форм, как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сироп, пероральные составы (такие как аэрозоль), препараты для наружного применения, суппозитории и стерильные растворы для инъекций, в зависимости от используемых стандартных способов.The pharmaceutical composition of the present invention can be used for the manufacture of forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrup, oral formulations (such as aerosol), topical preparations, suppositories and sterile injectable solutions, depending on the standard methods used.

При составлении фармацевтическая композиция может быть изготовлена с использованием разбавителя или эксципиента, обычно используемого в данной области, такого как наполнитель, увеличивающий объем агент, связующий агент, смачивающий агент, дезинтегрирующий агент, поверхностноактивное вещество и т.п. Твердый препарат для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, капсулу и т.п. Такой твердый препарат может быть изготовлен путем смешивания соединения по меньшей мере с одним эксципиентом, например крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой или лактозой, желатином и т.п.When formulated, the pharmaceutical composition may be made using a diluent or excipient commonly used in the art, such as a filler, bulking agent, binding agent, wetting agent, disintegrating agent, surfactant, and the like. A solid preparation for oral administration includes a tablet, pill, powder, granule, capsule and the like. Such a solid preparation can be prepared by mixing the compound with at least one excipient, for example starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like.

Кроме того, в дополнение к простым эксципиентам в настоящем изобретении могут использоваться смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк и т.п. Жидкофазный препарат для перорального введения включает суспензию, раствор для внутреннего применения, эмульсию, сироп и т.п. Такой жидкофазный препарат может включать в себя различные эксципиенты, например, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п. в дополнение к инертным разбавителям (например, воде, жидкому парафину), обычно используемым в данной области.Moreover, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like can be used in the present invention. The liquid phase preparation for oral administration includes a suspension, an internal solution, an emulsion, a syrup, and the like. Such a liquid phase preparation may include various excipients, for example, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, a preservative, and the like. in addition to inert diluents (eg, water, liquid paraffin) commonly used in the art.

Препарат для парентерального введения включает стерильный водный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат, суппозиторий и т.п. В качестве неводного растворителя и суспензии можно использовать растительное масло, такое как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или оливковое масло, или сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат, и т.п. В качестве основы суппозитория можно использовать Витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицериновый желатин и т.п.The preparation for parenteral administration includes a sterile aqueous solution, a non-aqueous diluent, a suspension, an emulsion, a lyophilized preparation, a suppository and the like. As the non-aqueous solvent and suspension, a vegetable oil such as propylene glycol, polyethylene glycol or olive oil, or an injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. Witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, lauric oil, glycerin gelatin, etc. can be used as a suppository base.

Твердый препарат для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, кап- 5 045063 сулу и т.п. Такой твердый препарат может быть изготовлен путем смешивания фармацевтической композиции по настоящему изобретению по меньшей мере с одним эксципиентом, например крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой, лактозой, желатином и т.п. Помимо простых эксципиентов, в настоящем изобретении также могут быть использованы смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк и т.п.A solid preparation for oral administration includes a tablet, pill, powder, granule, capsule, and the like. Such a solid preparation can be prepared by mixing the pharmaceutical composition of the present invention with at least one excipient, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like can also be used in the present invention.

Жидкофазный препарат для перорального введения включает суспензию, раствор для внутреннего применения, эмульсию, сироп и т.п. Такой жидкофазный препарат может включать в себя различные эксципиенты, например, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п. в дополнение к инертным разбавителям (например, воде, жидкому парафину), обычно используемым в данной области.The liquid phase preparation for oral administration includes a suspension, an internal solution, an emulsion, a syrup, and the like. Such a liquid phase preparation may include various excipients, for example, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, a preservative, and the like. in addition to inert diluents (eg, water, liquid paraffin) commonly used in the art.

Препарат для нанесения на кожу включает присыпку, эмульсию, суспензию, масло, спрей, мазь, крем-пасту, гель, пену или раствор. Фармацевтический препарат по настоящему изобретению может представлять собой безводную мазь и может содержать парафин, который подходит для местного применения и находится в жидком состоянии при температуре тела, в частности, парафин с низкой вязкостью, или может содержать натуральные жиры или частично синтезированные жиры, например, триглицерид кокосовых жирных кислот, гидрогенизированное масло (например, гидрогенизированное арахисовое масло или касторовое масло), неполный эфир глицерина и жирных кислот (например, моностеарат и дистеарат глицерина), силикон (например, полиметилсилоксан, такой как гексаметилдисилоксан или октаметилтрисилоксан) и т.п. Например, фармацевтический препарат может содержать жирный спирт, который связан с водным кремом и служит для увеличения способности абсорбировать влагу, а также стерины, ланолин, другие эмульгирующие агенты и/или другие добавки.The preparation for application to the skin includes powder, emulsion, suspension, oil, spray, ointment, cream paste, gel, foam or solution. The pharmaceutical preparation of the present invention may be an anhydrous ointment and may contain paraffin that is suitable for topical application and is liquid at body temperature, in particular low viscosity paraffin, or may contain natural fats or partially synthesized fats, such as triglyceride coconut fatty acids, hydrogenated oil (eg, hydrogenated peanut oil or castor oil), glycerol fatty acid partial ester (eg, glycerol monostearate and distearate), silicone (eg, polymethylsiloxane such as hexamethyldisiloxane or octamethyltrisiloxane), and the like. For example, the pharmaceutical preparation may contain a fatty alcohol, which is associated with an aqueous cream and serves to increase the ability to absorb moisture, as well as sterols, lanolin, other emulsifying agents and/or other additives.

Доза включающего аминокислотную последовательность пептида, которая содержится в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может варьировать в зависимости от состояния и веса пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути введения и времени введения, но при необходимости может быть выбрана должным образом. Например, пептид, включающий аминокислотную последовательность, можно вводить ежедневно в дозировке от 0,0001 до 1000 мг/кг, в частности, в дозировке от 0,1 до 1000 мг/кг. Пептид можно применять один раз в день или несколькими дробными дозами. Однако доза фармацевтической композиции не ограничивает объем настоящего изобретения. Доза пептида, включающего аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, может колебаться в зависимости от пути введения, тяжести заболевания, пола, веса и возраста пациента и т.п. Следовательно, доза пептида не предназначена для ограничения каким-либо образом объема настоящего изобретения.The dose of the amino acid sequence-containing peptide contained in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route of administration and the time of administration, but can be appropriately selected as necessary. For example, a peptide comprising an amino acid sequence can be administered daily at a dosage of 0.0001 to 1000 mg/kg, in particular at a dosage of 0.1 to 1000 mg/kg. The peptide can be used once a day or in several divided doses. However, the dosage of the pharmaceutical composition does not limit the scope of the present invention. The dosage of a peptide comprising the amino acid sequence of the present invention may vary depending on the route of administration, severity of the disease, gender, weight and age of the patient, and the like. Therefore, the dosage of the peptide is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться млекопитающим (например, мышам, крысам, домашнему скоту, людям и т.п.) различными путями. Можно выбирать способ введения. В этом случае пептид можно, например, вводить всеми способами введения, такими как пероральная, ректальная или внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутриматочная, дуральная или интрацеребровентрикулярная инъекция.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals (eg, mice, rats, livestock, humans, etc.) in various ways. You can choose the method of administration. In this case, the peptide can, for example, be administered by all routes of administration, such as oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine, dural or intracerebroventricular injection.

В дополнение к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, фармацевтическая композиция для профилактики, ингибирования или лечения нервно-мышечного заболевания согласно настоящему изобретению может дополнительно включать один или несколько действующих ингредиентов, обладающих эффектом улучшения, облегчения или профилактики нервно-мышечного заболевания.In addition to the peptide including the amino acid sequence, the pharmaceutical composition for preventing, inhibiting or treating a neuromuscular disease according to the present invention may further include one or more active ingredients having the effect of improving, alleviating or preventing the neuromuscular disease.

Для улучшения, облегчения или профилактики нервно-мышечного заболевания фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с хирургическим вмешательством, гормональной терапией, лекарственным лечением и другими видами лечения с использованием модификатора биологической реакции.To improve, alleviate or prevent a neuromuscular disease, the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with surgery, hormonal therapy, drug treatment and other biological response modifier treatments.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению стабилен при высокой температуре (см. фиг. 1 и 2), разлагает синтаксин 1А, который участвует в высвобождении нейротрансмиттеров, подавляет образование комплекса SNARE (см. фиг. 3-6), ингибирует секрецию ацетилхолина (см. фиг. 7), обладает миорелаксантным эффектом (см. фиг. 8-10), проникает в клетки и проникает в мышечную оболочку ткани, колокализуясь с нейрональным маркером, тем самым проявляя миорелаксантный эффект (см. фиг. 11-14).According to one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention is stable at high temperature (see Figs. 1 and 2), degrades syntaxin 1A, which is involved in the release of neurotransmitters, inhibits the formation of the SNARE complex (see Figs. 3-6), inhibits secretion acetylcholine (see Fig. 7), has a muscle relaxant effect (see Fig. 8-10), penetrates cells and penetrates the muscularis tissue, colocalizing with a neuronal marker, thereby exhibiting a muscle relaxant effect (see Fig. 11-14 ).

3. Косметическая композиция, включающая пептид по настоящему изобретению.3. A cosmetic composition comprising the peptide of the present invention.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к косметической композиции, включающей в качестве действующего ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.Another aspect of the present invention relates to a cosmetic composition comprising as an active ingredient a peptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Поскольку пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентичен пептиду, описанному в разделе 1: Пептид по настоящему изобретению, то для его конкретного описания см. раздел 1: Пептид по настоящему изобретению. Далее будет описана только конкретная конфигурация косметической композиции.Since the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is identical to the peptide described in Section 1: Peptide of the Present Invention, for a specific description thereof, see Section 1: Peptide of the Present Invention. In the following, only a specific configuration of the cosmetic composition will be described.

В настоящем изобретении термин поры относится к небольшим отверстиям, через которые выделяется кожный жир, присутствующий на лице, лбу, носу и т.п., а термин черная точка относится к кожному салу, которое выглядит черным в виде накапливаемой в порах смеси разложившегося кожного сала, старых мертвых клеток кожи и т.п., а загрязнения откладываются вокруг пор.In the present invention, the term pores refers to small openings through which sebum present on the face, forehead, nose, etc. is secreted, and the term blackhead refers to sebum that appears black as a mixture of decomposed sebum accumulated in the pores , old dead skin cells, etc., and impurities are deposited around the pores.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения косметическая композиция поAccording to one embodiment of the present invention, a cosmetic composition according to

- 6 045063 настоящему изобретению может представлять собой косметическую композицию для улучшения состояния кожи. Термин улучшение состояния кожи обычно может означать процесс лечения, улучшения или облегчения повреждения кожи, вызванного внутренними или внешними факторами кожи или их действием. Например, улучшение может означать, что косметическая композиция используется для уменьшения морщин, повышения эластичности кожи, регенерации ран, подавления выработки кожного сала или уменьшения акне и т.п., но настоящее изобретение этим не ограничено.- 6 045063 of the present invention may be a cosmetic composition for improving skin condition. The term skin enhancement can generally refer to the process of treating, improving, or alleviating skin damage caused by or due to intrinsic or extrinsic skin factors. For example, improvement may mean that the cosmetic composition is used to reduce wrinkles, improve skin elasticity, regenerate wounds, suppress sebum production or reduce acne, etc., but the present invention is not limited to these.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению стабилен при высокой температуре (см. фиг. 1 и 2) и имеет эффект уменьшения морщин кожи за счет расслабления мышц или увеличения количества компонентов дермы (см. фиг. 15-19). Компоненты дермы могут включать коллаген, но настоящее изобретение этим не ограничено.According to one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention is stable at high temperature (see FIGS. 1 and 2) and has the effect of reducing skin wrinkles by relaxing muscles or increasing the amount of dermal components (see FIGS. 15-19). Components of the dermis may include collagen, but the present invention is not limited to this.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению стабилен при высокой температуре (см. фиг. 1 и 2), и количество сальных желез снижено, и уровень экспрессии маркера, связанного с выработкой кожного сала, снижен (см. фиг. 20).According to one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention is stable at high temperature (see Fig. 1 and 2), and the number of sebaceous glands is reduced, and the level of expression of a marker associated with sebum production is reduced (see Fig. 20).

Косметическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в жидкой или твердой форме с использованием основного вещества, адъюванта и добавки, обычно используемой в области косметики. Косметические средства в жидкой или твердой форме могут, например, включать лосьон для лица, крем, средство для ванны и т.п., но настоящее изобретение этим не ограничено. Например, основное вещество, адъювант и добавка, обычно используемые в области косметики, включают воду, спирт, пропиленгликоль, стеариновую кислоту, глицерин, цетиловый спирт, жидкий парафин и т.п., но настоящее изобретение не ограничено конкретно ими.The cosmetic composition of the present invention can be prepared in liquid or solid form using a base material, an adjuvant and an additive commonly used in the field of cosmetics. Cosmetics in liquid or solid form may, for example, include facial lotion, cream, bath product and the like, but the present invention is not limited thereto. For example, the base material, adjuvant and additive commonly used in the field of cosmetics include water, alcohol, propylene glycol, stearic acid, glycerin, cetyl alcohol, liquid paraffin and the like, but the present invention is not specifically limited to them.

В дополнение к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, косметическая композиция по настоящему изобретению может включать компоненты, обычно используемые в косметической композиции. Например, косметическая композиция может включать обычные адъюванты и носители, такие как антиоксидант, стабилизирующий агент, солюбилизирующий агент, витамины, пигмент и ароматизатор.In addition to the peptide comprising the amino acid sequence, the cosmetic composition of the present invention may include components commonly used in cosmetic compositions. For example, a cosmetic composition may include conventional adjuvants and carriers such as an antioxidant, a stabilizing agent, a solubilizing agent, vitamins, pigment and flavor.

Косметическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде любых составов, обычно получаемых в предшествующем уровне техники. Например, косметическая композиция может быть составлена для приготовления раствора, суспензии, эмульсии, пасты, геля, крема, лосьона, порошка, суспензии, очищающего средства, содержащего поверхностно-активное вещество, масла, порошковой основы, эмульсионной основы, восковой основы, спрея и т.п., но настоящее изобретение этим не ограничено. Более конкретно, косметическая композиция может быть составлена для приготовления тоника, лосьона, питательного крема, массажного крема, эссенции, крема для глаз, очищающего крема, очищающей пены, очищающей воды, упаковки, спрея, или порошка.The cosmetic composition of the present invention can be formulated in any of the formulations commonly prepared in the prior art. For example, the cosmetic composition may be formulated to formulate a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, suspension, surfactant cleanser, oil, powder base, emulsion base, wax base, spray, etc. etc., but the present invention is not limited to this. More specifically, the cosmetic composition may be formulated to formulate a toner, lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray, or powder.

Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой пасту, крем или гель, в качестве компонента-носителя можно использовать животное масло, растительное масло, воск, парафин, крахмал, трагакант, производное целлюлозы, полиэтиленгликоль, силикон, бентонит, диоксид кремния, тальк, оксид цинка и т.п.When the composition of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, the carrier component can be animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silicon dioxide, talc, zinc oxide, etc.

Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой порошок или спрей, в качестве компонента-носителя можно использовать лактозу, тальк, диоксид кремния, гидроксид алюминия, силикат кальция или порошок полиамида. В частности, когда состав представляет собой спрей, состав может дополнительно включать пропеллент, такой как хлорфторуглеводород, пропан/бутан или диметиловый эфир.When the composition of the cosmetic composition of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder can be used as the carrier component. In particular, when the composition is a spray, the composition may further include a propellant such as a chlorofluorocarbon, propane/butane or dimethyl ether.

Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой эмульсию, в качестве компонента-носителя можно использовать растворитель, солюбилизирующий агент или эмульгирующий агент. Например, компонент-носитель включает воду, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликолевое масло, глицериновый алифатический эфир, полиэтиленгликоль или сложный эфир жирной кислоты и сорбитана.When the composition of the cosmetic composition of the present invention is an emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent can be used as the carrier component. For example, the carrier component includes water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol oil, glycerol aliphatic ether, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid ester.

Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой суспензию, в качестве компонента-носителя можно использовать жидкий разбавитель, такой как вода, этанол или пропиленгликоль, суспендирующий агент, такой как этоксилированный изостеариловый спирт, сложный эфир полиоксиэтиленсорбита и сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар, трагакант и т.п.When the composition of the cosmetic composition of the present invention is a suspension, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, metahydroxide can be used as the carrier component aluminum, bentonite, agar, tragacanth, etc.

Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой очищающее средство, содержащее поверхностно-активное вещество, в качестве компонента-носителя могут быть использованы сульфат алифатического спирта, сульфат эфира алифатического спирта, моноэфир сульфосукцината, производное имидазолиния, метилтаурат, саркозинат, сульфоэфир амида жирной кислоты, алкиламидобетаин, алифатический спирт, глицерид жирной кислоты, диэтаноламид жирной кислоты, растительное масло, производное ланолина, сложный эфир этоксилированного глицерина и жирной кислоты или т.п.When the composition of the cosmetic composition of the present invention is a cleansing agent containing a surfactant, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ester sulfate, sulfosuccinate monoester, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide sulfoester, alkyl amidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, ethoxylated glycerol fatty acid ester or the like.

Косметическая композиция по настоящему изобретению может использоваться сама по себе, или может использоваться в препарате двойного применения, или может использоваться в препарате двойного применения с другой косметической композицией, отличной от косметической композиции по на- 7 045063 стоящему изобретению. Кроме того, косметическая композиция по настоящему изобретению, которая обладает превосходным увлажняющим эффектом и отличным эффектом улучшения кожного барьера, может использоваться в соответствии с обычными способами применения, и число вариантов ее применения может варьировать в зависимости от состояния кожи пользователя или предпочтений пользователя.The cosmetic composition of the present invention may be used by itself, or may be used in a dual-use preparation, or may be used in a dual-use preparation with another cosmetic composition other than the cosmetic composition of the present invention. In addition, the cosmetic composition of the present invention, which has an excellent moisturizing effect and an excellent skin barrier improving effect, can be used in accordance with conventional methods of application, and the number of applications thereof may vary depending on the skin condition of the user or the preference of the user.

Когда косметическая композиция по настоящему изобретению представляет собой мыло, очищающий состав, содержащий поверхностно-активные вещества, или очищающий состав, не содержащий поверхностно-активных веществ, косметическую композицию можно стереть, удалить или смыть водой после нанесения на кожу. В качестве конкретного примера мыло представляет собой жидкое мыло, мыльный порошок, твердое мыло и масляное мыло; очищающий состав, содержащий поверхностноактивные вещества, представляет собой очищающую пену, очищающую воду, очищающее полотенце и очищающую упаковку; а не содержащий поверхностно-активные вещества очищающий состав представляет собой очищающий крем, очищающий лосьон, очищающую воду и очищающий гель, но настоящее изобретение этим не ограничено.When the cosmetic composition of the present invention is a soap, a cleansing composition containing surfactants, or a cleansing composition not containing surfactants, the cosmetic composition can be wiped off, removed or washed off with water after application to the skin. As a specific example, the soap includes liquid soap, soap powder, bar soap and oil soap; the surfactant-containing cleaning composition is a cleaning foam, cleaning water, a cleaning towel and a cleaning package; and the surfactant-free cleansing composition includes a cleansing cream, a cleansing lotion, a cleansing water and a cleansing gel, but the present invention is not limited to these.

4. Применение фармацевтической композиции или косметической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению.4. Use of a pharmaceutical composition or cosmetic composition comprising the peptide of the present invention.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению фармацевтической композиции или косметической композиции, которая включает пептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1.Another aspect of the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition or cosmetic composition that includes a peptide comprising the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.

Поскольку пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, идентичен пептиду, как описано в разделе 1. Пептид по настоящему изобретению, см. раздел 1. Пептид по настоящему изобретению для его конкретного описания, идентичен пептиду, описанному в разделе 1. Пептид по настоящему изобретению, то для его конкретного описания см. раздел 1. Пептид по настоящему изобретению. Далее будет описано только применение композиции, включающей пептид.Since the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is identical to the peptide as described in section 1. The peptide of the present invention, see section 1. The peptide of the present invention for its specific description is identical to the peptide described in section 1. The peptide of the present invention, then for a specific description thereof, see section 1. Peptide of the present invention. In the following, only the use of the composition comprising the peptide will be described.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу расслабления мышц, который включает применение пептида или фармацевтической композиции просто на коже или на коже, в которой сокращаются мышцы. Применение может включать применение на коже, но настоящее изобретение этим не ограничено.According to one aspect of the present invention, the present invention relates to a method of muscle relaxation, which includes the application of a peptide or pharmaceutical composition simply to the skin or to the skin in which muscles are contracting. Application may include application to the skin, but the present invention is not limited to this.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу профилактики, ингибирования или лечения нервно-мышечного заболевания, который включает введение пептида или фармацевтической композиции просто субъекту или субъекту, у которого развилось нервномышечное заболевание.According to another aspect of the present invention, the present invention relates to a method of preventing, inhibiting or treating a neuromuscular disease, which includes administering a peptide or pharmaceutical composition to a subject or subject who has developed a neuromuscular disease.

Фармацевтическая композиция описана в разделе 2. Фармацевтическая композиция, включающая пептид по настоящему изобретению.The pharmaceutical composition is described in section 2. The pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention.

Эффективное количество пептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или фармацевтическую композицию, включающую пептид, можно применять у субъекта/вводить субъекту, нуждающемуся в этом.An effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a pharmaceutical composition comprising the peptide, can be administered to/administered to a subject in need thereof.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу уменьшения морщин на коже, который включает применение пептида или косметической композиции просто на коже или на коже, на которой появляются морщины.According to another aspect of the present invention, the present invention relates to a method of reducing wrinkles on the skin, which includes applying a peptide or cosmetic composition to the skin or to the skin on which wrinkles appear.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу подавления выработки кожного сала, который включает применение пептида или косметической композиции на коже.According to another aspect of the present invention, the present invention relates to a method for suppressing sebum production, which includes applying a peptide or cosmetic composition to the skin.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу уменьшения акне, который включает применение пептида или косметической композиции просто на коже или на коже, на которой появляются акне.According to yet another aspect of the present invention, the present invention relates to a method for reducing acne, which includes applying a peptide or cosmetic composition directly to the skin or to skin on which acne appears.

Согласно настоящему изобретению, применение может включать применение на коже, но настоящее изобретение этим не ограничено.According to the present invention, use may include use on the skin, but the present invention is not limited to this.

Косметическая композиция описана в разделе 3. Косметическая композиция, включающая пептид по настоящему изобретению.The cosmetic composition is described in section 3. Cosmetic composition comprising the peptide of the present invention.

Эффективное количество пептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или косметической композиции, включающей пептид, можно применять у субъекта/вводить субъекту, нуждающемуся в этом.An effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a cosmetic composition comprising the peptide, can be administered to/administered to a subject in need thereof.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на его примеры получения, примеры и экспериментальные примеры.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to its production examples, examples and experimental examples.

Однако следует понимать, что нижеследующие примеры получения, примеры и экспериментальные примеры приведены только с целью иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.However, it should be understood that the following preparation examples, examples and experimental examples are provided for the purpose of illustrating the present invention only and are not intended to limit the scope of the present invention.

Пример получения 1: получение нового пептида, обладающего различной физиологической активностью.Preparation Example 1: Preparation of a new peptide having different physiological activities.

Новую пептидную последовательность KFLIK, имеющую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, получали с использованием известного способа. Молекулярная масса новогоA new KFLIK peptide sequence having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained using a known method. Molecular mass of the new

- 8 045063 пептида составила 647,4 Да.- 8,045,063 peptides amounted to 647.4 Da.

Экспериментальный пример 1: оценка высокотемпературной стабильности пептида.Experimental Example 1: Evaluation of High Temperature Stability of the Peptide.

1-1: оценка высокотемпературной устойчивости при длительном хранении.1-1: assessment of high temperature stability during long-term storage.

Пептид по настоящему изобретению, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, растворяли в стерильной дистиллированной воде в концентрации 1000 ppm, хранили при 45°С в течение 7 дней, 14 дней, 28 дней, 60 дней и 75 дней, а затем анализировали с помощью ВЭЖХ.The peptide of the present invention having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 was dissolved in sterile distilled water at a concentration of 1000 ppm, stored at 45°C for 7 days, 14 days, 28 days, 60 days and 75 days, and then analyzed with using HPLC.

В результате, как показано на фиг. 1 видно, что стабильность пептида по настоящему изобретению сохранялась в течение максимального времени наблюдения 75 дней в условиях 45°С.As a result, as shown in FIG. 1 shows that the stability of the peptide of the present invention was maintained for a maximum observation time of 75 days at 45°C.

1-2: оценка высокотемпературной устойчивости.1-2: High temperature stability assessment.

Пептид по настоящему изобретению растворяли в стерильной дистиллированной воде до концентрации 1000 ppm, нагревали при 121°С в течение 15 мин и 30 мин, а затем анализировали с помощью ВЭЖХ.The peptide of the present invention was dissolved in sterile distilled water to a concentration of 1000 ppm, heated at 121°C for 15 minutes and 30 minutes, and then analyzed by HPLC.

В результате, как показано на фиг. 2 видно, что стабильность пептида по настоящему изобретению поддерживалась при 121°С в течение максимального времени нагревания 30 мин.As a result, as shown in FIG. 2 shows that the stability of the peptide of the present invention was maintained at 121°C for a maximum heating time of 30 minutes.

Экспериментальный пример 2: подтверждение степени разложения синтаксина 1А пептидом.Experimental Example 2: Confirmation of the Degradation Degree of Syntaxin 1A by Peptide.

Белок рецептора прикрепления растворимого фактора, чувствительного к N-этилмалеимиду (SNARE), участвует в слиянии мембран, происходящем в клетках. Нейрональный SNARE, участвующий в нейротрансмиссии, связан со связыванием синаптических везикул с пресинаптической мембраной. Синаптические везикулы, несущие нейротрансмиттеры при высвобождении нейротрансмиттеров должны сливаться с пресинаптической мембраной, чтобы сформировать канал высвобождения нейротрансмиттеров. В этом случае слияние происходит через SNARE, представленного в виде белкового комплекса. В частности, в слиянии участвует комплекс t-SNARE, который представляет собой комплекс белка SNAP25 и белка синтаксина 1А, прикрепленного к мембране-мишени, и v-SNARE, прикрепленного к везикулам. Когда процессы конъюгации и скручивания SNARE не завершены полностью, слияние мембран не удается. Поэтому, вследствие того что нейромедиаторы не высвобождаются, мышцы остаются расслабленными. Было подтверждено, обладает ли пептид по настоящему изобретению способностью разлагать синтаксин 1 А, составляющий t-SNARE.The soluble N-ethylmaleimide-sensing factor attachment receptor (SNARE) protein is involved in the membrane fusion that occurs in cells. A neuronal SNARE involved in neurotransmission is associated with the binding of synaptic vesicles to the presynaptic membrane. Synaptic vesicles carrying neurotransmitters upon neurotransmitter release must fuse with the presynaptic membrane to form the neurotransmitter release channel. In this case, fusion occurs through a SNARE, presented as a protein complex. In particular, the t-SNARE complex, which is a complex of the SNAP25 protein and the syntaxin 1A protein attached to the target membrane, and the v-SNARE attached to the vesicles, is involved in fusion. When the SNARE conjugation and folding processes are not completely completed, membrane fusion fails. Therefore, because neurotransmitters are not released, the muscles remain relaxed. It was confirmed whether the peptide of the present invention has the ability to degrade syntaxin 1 A, a constituent of t-SNARE.

2-1: подтверждение степени разложения рекомбинантного синтаксина 1А.2-1: Confirmation of the degree of degradation of recombinant syntaxin 1A.

В экспериментальной группе в реакционном буферном растворе (50 мМ HEPES, 40 мМ 2-МЕ, 20 мкМ ZnCl₂, pH 7,4) обрабатывали 1 мкг рекомбинантного белка синтаксина 1А (Novus bios, США) увеличивающейся концентрацией (20 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) пептида по настоящему изобретению. В отрицательном контроле (Контроль) в реакционном буферном растворе присутствовал только рекомбинантный белок синтаксин 1А. Полученную смесь оставляли реагировать в течение 4 часов при температуре 37°С, а затем анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к синтаксину 1A (Synaptic Systems, Германия).In the experimental group, the reaction buffer solution (50 mM HEPES, 40 mM 2-ME, 20 μM ZnCl ₂ , pH 7.4) was treated with 1 μg of recombinant protein syntaxin 1A (Novus bios, USA) with increasing concentrations (20 μM, 100 μM and 200 μM) of the peptide of the present invention. In the negative control (Control), only recombinant syntaxin 1A protein was present in the reaction buffer solution. The resulting mixture was allowed to react for 4 hours at 37°C and then analyzed by Western blotting using anti-syntaxin 1A antibody (Synaptic Systems, Germany).

В результате было подтверждено, что, когда в раствор добавляли пептид по настоящему изобретению, полоса рекомбинантного белка синтаксина 1А уменьшалась за счет действия пептида по настоящему изобретению в зависимости от концентрации по сравнению с отрицательным контролем, где в раствор не добавляли пептид по настоящему изобретению (фиг. 3).As a result, it was confirmed that when the peptide of the present invention was added to the solution, the recombinant syntaxin 1A protein band was reduced by the effect of the peptide of the present invention in a concentration-dependent manner compared to the negative control where the peptide of the present invention was not added to the solution (Fig. .3).

2-2: подтверждение степени разложения эндогенного синтаксина 1А, экспрессированного в клетках.2-2: confirmation of the degree of degradation of endogenous syntaxin 1A expressed in cells.

В реакционном буферном растворе (50 мМ HEPES, 40 мМ 2-МЕ, 20 мкМ ZnCl₂, pH 7,4) обрабатывали 30 мкг лизата клеток SH-SY5Y увеличивающейся концентрацией (20 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) пептида по настоящему изобретению. В положительном контроле (BoNT/C LC), 0,2 мкМ легкой цепи ботулинического нейротоксина типа С (BoNT/C LC) использовали вместо пептида по настоящему изобретению, а в случае отрицательного контроля (Контроль) в образце присутствовало только 30 мкг 0 мкг лизата клеток SH-SY5Y. Каждую из смесей оставляли реагировать в течение 4 часов при температуре 37°С. Реакционную смесь анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к синтаксину 1A (Synaptic Systems, Германия).In a reaction buffer solution (50 mM HEPES, 40 mM 2-ME, 20 μM ZnCl ₂ , pH 7.4), 30 μg of SH-SY5Y cell lysate was treated with increasing concentrations (20 μM, 100 μM and 200 μM) of the peptide of the present invention. In the positive control (BoNT/C LC), 0.2 μM botulinum neurotoxin light chain type C (BoNT/C LC) was used instead of the peptide of the present invention, and in the case of the negative control (Control), only 30 μg of 0 μg lysate was present in the sample SH-SY5Y cells. Each of the mixtures was left to react for 4 hours at 37°C. The reaction mixture was analyzed by Western blotting using an anti-syntaxin 1A antibody (Synaptic Systems, Germany).

В результате было подтверждено, что, когда в раствор добавляли пептид по настоящему изобретению, полоса рекомбинантного белка синтаксина 1А уменьшалась за счет действия пептида по настоящему изобретению в зависимости от концентрации, как и в положительном контроле, где в раствор добавляли BoNT/C LC (фиг. 4).As a result, it was confirmed that when the peptide of the present invention was added to the solution, the band of the recombinant syntaxin 1A protein was reduced due to the effect of the peptide of the present invention in a concentration-dependent manner, as in the positive control where BoNT/C LC was added to the solution (Fig. . 4).

Краткое изложение экспериментального примера 2.Summary of Experimental Example 2.

Пептид по настоящему изобретению разлагает рекомбинантный синтаксин 1А или эндогенный синтаксин 1А, и, таким образом, комплекс SNARE не образуется. Следовательно, ожидается, что пептид по настоящему изобретению будет иметь эффект миорелаксации, поскольку не будет происходить высвобождения нейромедиаторов.The peptide of the present invention degrades recombinant syntaxin 1A or endogenous syntaxin 1A, and thus the SNARE complex is not formed. Therefore, the peptide of the present invention is expected to have a muscle relaxant effect since there will be no release of neurotransmitters.

Экспериментальный пример 3: анализ образования комплекса SNAREExperimental Example 3: SNARE Complex Formation Assay

3-1: анализ с использованием вестерн-блоттинга.3-1: Western blot analysis.

Было подтверждено, ингибируется ли комплекс SNARE, образующийся в клетках, разложением синтаксина 1А под действием пептида по настоящему изобретению. В частности, после проведения весIt was confirmed whether the SNARE complex formed in cells is inhibited by the degradation of syntaxin 1A by the peptide of the present invention. In particular, after carrying out the weight

- 9 045063 терн-блоттинга определяли плотность полосы комплекса SNARE, имеющей ожидаемый размер. Клетки SH-SY5Y высевали с плотностью 3x105 клеток/лунку в 6-луночный планшет. После культивирования клеток в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой DMEM. Полученный культуральный раствор обрабатывали возрастающей концентрацией (10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ) пептида по настоящему изобретению. Для положительного контроля раствор обрабатывали 0,2 мкМ BoNT/C LC. В отрицательном контроле (Контроль) образец не обрабатывали. Через 24 часа после обработки образца клетки собирали и получали лизат, который затем анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к синтаксину 1А (Synaptic Systems, Германия). Размер полосы комплекса SNARE составлял 75 кДа.- 9 045063 turn blotting determined the density of the SNARE complex band having the expected size. SH-SY5Y cells were seeded at a density of 3x105 cells/well in a 6-well plate. After culturing the cells overnight, the medium was replaced with serum-free DMEM. The resulting culture solution was treated with increasing concentrations (10 μM, 50 μM and 100 μM) of the peptide of the present invention. For a positive control, the solution was treated with 0.2 μM BoNT/C LC. In the negative control (Control), the sample was not treated. 24 hours after sample treatment, the cells were harvested and a lysate was obtained, which was then analyzed by Western blotting using an anti-syntaxin 1A antibody (Synaptic Systems, Germany). The SNARE complex band size was 75 kDa.

Исходя из результатов вестерн-блоттинга было замечено, что, когда в раствор добавляли пептид по настоящему изобретению, образование комплекса SNARE в клетках SH-SY5Y ингибировалось, как и в случае положительного контроля, где в раствор добавляли BoNT/C LC (фиг. 5). Принимая во внимание результаты экспериментального примера 2, ожидалось, что образование комплекса SNARE должно было ингибироваться вследствие разложения синтаксина 1А пептидом по настоящему изобретению.From the results of Western blotting, it was observed that when the peptide of the present invention was added to the solution, the formation of the SNARE complex in SH-SY5Y cells was inhibited, as in the case of the positive control, where BoNT/C LC was added to the solution (Fig. 5) . Taking into account the results of Experimental Example 2, it was expected that the formation of the SNARE complex should be inhibited due to the degradation of syntaxin 1A by the peptide of the present invention.

3-2: анализ с использованием коиммунопреципитации (Co-IP).3-2: Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay.

Коиммунопреципитацию использовали с целью обнаружения белка, который связывается с другим определенным белком в неденатурирующих условиях. Клетки SH-SY5Y высевали с плотностью 3x105 клеток/лунку в 6-луночный планшет. После культивирования клеток в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой DMEM. Полученный культуральный раствор обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации 50 мкМ в течение 24 ч. Для положительного контроля раствор обрабатывали 0,2 мкМ BoNT/C LC. В отрицательном контроле (Контроль) образец не обрабатывали. Был получен клеточный лизат, который иммунопреципитировали с использованием антитела к SNAP-25 (Synaptic Systems, Германия) с последующим вестерн-блоттингом с использованием антитела к SNAP-25 и антитела к синтаксину 1А (Synaptic Systems, Германия).Coimmunoprecipitation has been used to detect a protein that binds to another specific protein under nondenaturing conditions. SH-SY5Y cells were seeded at a density of 3x105 cells/well in a 6-well plate. After culturing the cells overnight, the medium was replaced with serum-free DMEM. The resulting culture solution was treated with the peptide of the present invention at a concentration of 50 μM for 24 hours. For a positive control, the solution was treated with 0.2 μM BoNT/C LC. In the negative control (Control), the sample was not treated. A cell lysate was obtained and immunoprecipitated using anti-SNAP-25 antibody (Synaptic Systems, Germany), followed by Western blotting using anti-SNAP-25 antibody and anti-syntaxin 1A antibody (Synaptic Systems, Germany).

В результате было подтверждено, что взаимодействие между SNAP-25 и синтаксином 1А ингибировалось, поскольку образование комплекса SNARE в клетках SH-SY5Y подавлялось добавлением пептида по настоящему изобретению (фиг. 6). На фиг. 6 часть Исходи.кол-во на IP представляет количество белка синтаксина 1А и SNAP-25, обнаруженного в клеточном лизате, полученном до IP, а часть Иммунопреципитация: анти-SNAP-25 представляет результаты, полученные при анализе конечного продукта (полученного после иммунопреципитации с использованием антитела к SNAP-25) с использованием антитела к SNAP-25 или антитела к синтаксину 1А. То есть в Иммунопреципитации: анти-SNAP-25 панель SNAP-25 показывает результаты, полученные путем повторного обнаружения SNAP-25, который был преципитирован антителом к SNAP-25 из клеточного лизата, а панель синтаксин 1А показывает результаты, полученные при анализе преципитата, который был осажден антителом к SNAP-25 из клеточного лизата, с использованием антитела к синтаксину 1А. Можно видеть, что комплекс SNARE не формировался, потому что количество синтаксина 1А сохранялось в отрицательном контроле (Контроль), где образец не обрабатывали, в панели синтаксин 1А. И также можно видеть, что образование комплекса SNARE ингибировалось, потому что количество синтаксина 1А было снижено в группе, обработанной пептидом по изобретению, и в группе, обработанной BoNT/C LC.As a result, it was confirmed that the interaction between SNAP-25 and syntaxin 1A was inhibited because the formation of the SNARE complex in SH-SY5Y cells was suppressed by the addition of the peptide of the present invention (Fig. 6). In fig. Part 6 Original Count per IP represents the amount of syntaxin 1A and SNAP-25 protein detected in the cell lysate obtained before IP, and the Immunoprecipitation: anti-SNAP-25 part represents the results obtained from the analysis of the final product (obtained after immunoprecipitation with using an anti-SNAP-25 antibody) using an anti-SNAP-25 antibody or an anti-syntaxin 1A antibody. That is, in Immunoprecipitation: the anti-SNAP-25 SNAP-25 panel shows results obtained by re-detection of SNAP-25 that was precipitated with anti-SNAP-25 antibody from a cell lysate, and the syntaxin 1A panel shows results obtained by analyzing the precipitate that was precipitated with anti-SNAP-25 antibody from the cell lysate using anti-syntaxin 1A antibody. It can be seen that the SNARE complex was not formed because the amount of syntaxin 1A was maintained in the negative control (Control), where the sample was not treated, in the syntaxin 1A panel. And it can also be seen that the formation of the SNARE complex was inhibited because the amount of syntaxin 1A was reduced in the group treated with the peptide of the invention and in the group treated with BoNT/C LC.

Краткое содержание экспериментального примера 3.Summary of experimental example 3.

Можно видеть, что образование комплекса SNARE ингибировалось при обработке пептидом по настоящему изобретению. Рассматривая результаты экспериментального примера 2, можно также заметить, что синтаксин 1А разлагался при воздействии пептида по настоящему изобретению, тем самым ингибируя образование комплекса SNARE. Следовательно, ожидалось, что пептид по настоящему изобретению оказывает эффект миорелаксации, поскольку не высвобождаются нейротрансмиттеры вследствие ингибирования образования комплекса SNARE.It can be seen that the formation of the SNARE complex was inhibited when treated with the peptide of the present invention. Considering the results of Experimental Example 2, it can also be noted that syntaxin 1A was degraded upon exposure to the peptide of the present invention, thereby inhibiting the formation of the SNARE complex. Therefore, the peptide of the present invention was expected to have a muscle relaxant effect since neurotransmitters are not released due to inhibition of SNARE complex formation.

Экспериментальный пример 4: подтверждение ингибирующего действия пептида на секрецию ацетилхолина.Experimental Example 4: Confirmation of the inhibitory effect of the peptide on acetylcholine secretion.

Было проверено, оказывает ли пептид по настоящему изобретению, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, ингибирующее действие на секрецию ацетилхолина. Клетки нейробластомы костного мозга человека SH-SY5Y высевали и культивировали в течение 24 часов в СО₂инкубаторе. Среду заменяли бессывороточной средой, и клетки культивировали в течение 48 часов. Полученный культуральный раствор обрабатывали возрастающей концентрацией (1 мкМ, 10 мкМ и 50 мкМ) пептида по настоящему изобретению, а затем обрабатывали 50 нМ столбнячным токсином в качестве положительного контроля. Кроме того, культуральный раствор обрабатывали никотином (NIC) с хлоридом калия (KCl) в качестве фактора, стимулирующего секрецию ацетилхолина, а затем культивировали в течение 30 мин. Группу, в которой культуральный раствор обрабатывали никотином и хлоридом калия, но не обрабатывали пептидом по настоящему изобретению или столбнячным токсином, использовали в качестве отрицательного контроля. Когда культивирование было завершено, среду отделяли, и измеряли уровень секреции ацетилхолина в среде с использованием набора для анализа холина/ацетилхолина.It was tested whether the peptide of the present invention comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has an inhibitory effect on the secretion of acetylcholine. Human bone marrow neuroblastoma cells SH-SY5Y were seeded and cultured for 24 hours in a CO ₂ incubator. The medium was replaced with serum-free medium, and the cells were cultured for 48 hours. The resulting culture solution was treated with increasing concentrations (1 μM, 10 μM and 50 μM) of the peptide of the present invention, and then treated with 50 nM tetanus toxin as a positive control. In addition, the culture solution was treated with nicotine (NIC) with potassium chloride (KCl) as an acetylcholine secretagogue and then cultured for 30 min. A group in which the culture solution was treated with nicotine and potassium chloride, but not with the peptide of the present invention or tetanus toxin, was used as a negative control. When the culture was completed, the medium was separated, and the level of acetylcholine secretion in the medium was measured using a choline/acetylcholine assay kit.

- 10 045063- 10 045063

Как показано на фиг. 7, было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению концентрационно-зависимо снижает содержание ацетилхолина относительно уровня секретируемого ацетилхолина в нормальной группе (Контроль). Также было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению обладает превосходным ингибирующим действием на секрецию ацетилхолина, когда образец обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации 50 мкМ, по сравнению с положительным контролем, в котором образец обрабатывали столбнячным токсином.As shown in FIG. 7, it was confirmed that the peptide of the present invention concentration-dependently reduces the content of acetylcholine relative to the level of secreted acetylcholine in the normal group (Control). It was also confirmed that the peptide of the present invention has a superior inhibitory effect on acetylcholine secretion when the sample was treated with the peptide of the present invention at a concentration of 50 μM, compared with the positive control in which the sample was treated with tetanus toxin.

Экспериментальный пример 5: подтверждение влияния на расслабление мышц пальцев ног у мышей 100 мкг пептида по настоящему изобретению вводили в икроножную мышцу 7-недельным самкам мышей C57BL/6, а затем проводили наблюдения. Эффект расслабления мышц определяли с использованием цифровой оценки отведения пальцев (DAS). Отведение относится к движению вытягивания конечностей, и показатель DAS получают путем измерения степени снижения способности у животного реагировать вздрагиванием в икроножной мышце. Оценка DAS имеет диапазон от 0 до 4. В этом случае более высокая оценка означает более высокий эффект расслабления мышц (фиг. 8А). То есть более высокий балл означает, что реакция вздрагивания в большей степени подавляется посредством таких механизмов, как подавление секреции ацетилхолина и т.п. Оценка 0 означает, что все пять пальцев ноги разделены, оценка 1 означает, что два пальца ноги зафиксированы во время отведения, оценка 2 означает, что большой палец и два пальца ноги не разделены, оценка 3 означает, что большой палец и три пальца стопы зафиксированы, а оценка 4 означает, что все пять пальцев стопы зафиксированы.Experimental Example 5: Confirmation of the Effect on Toe Muscle Relaxation in Mice 100 μg of the peptide of the present invention was injected into the gastrocnemius muscle of 7-week-old female C57BL/6 mice, and then observations were made. The effect of muscle relaxation was determined using digital abduction assessment (DAS). Abduction refers to the movement of extending the limbs, and the DAS score is obtained by measuring the degree of reduction in the animal's ability to respond with a flinch in the gastrocnemius muscle. The DAS score ranges from 0 to 4. In this case, a higher score indicates a greater muscle relaxation effect (Fig. 8A). That is, a higher score means that the startle response is suppressed to a greater extent through mechanisms such as suppression of acetylcholine secretion, etc. A score of 0 means that all five toes are separated, a score of 1 means that two toes are fixed during abduction, a score of 2 means that the big toe and two toes are not separated, a score of 3 means that the big toe and three toes are fixed , and a score of 4 means that all five toes are fixed.

Как показано на фиг. 8b, реакция вздрагивания наблюдалась перед обработкой пептидом по настоящему изобретению, все пять пальцев ног были разделены, что было оценено в 0 баллов. С другой стороны, действие пептида по настоящему изобретению на расслабление мышц увеличивает баллы DAS через 3 часа после инъекции пептида по настоящему изобретению, и оценка 4 была зарегистрирована через 17 часов после инъекции пептида по настоящему изобретению.As shown in FIG. 8b, the flinch response was observed before treatment with the peptide of the present invention, all five toes were separated, which was scored 0 points. On the other hand, the muscle relaxation effect of the peptide of the present invention increases DAS scores 3 hours after injection of the peptide of the present invention, and a score of 4 was recorded 17 hours after injection of the peptide of the present invention.

Экспериментальный пример 6: сравнение миорелаксантных эффектов пептида и ботокса.Experimental Example 6: Comparison of the muscle relaxant effects of the peptide and Botox.

100 мкг пептида по настоящему изобретению и 0,6 единицы ВТХ-А типа (BoNT-A) инъецировали в каждую из икроножных мышц двух 7-недельных самок мышей C57BL/6, а затем проводили DAS-анализ.100 μg of the peptide of the present invention and 0.6 units of BTX-A type (BoNT-A) were injected into each of the gastrocnemius muscles of two 7-week-old female C57BL/6 mice, and then DAS analysis was performed.

Как показано на фиг. 9 и 10, группа, получавшая пептид по изобретению, показала лучший эффект расслабления мышц после 20 часов введения по сравнению с группой, которой ничего не вводили, и имела эффект, аналогичный эффекту BoNT-A.As shown in FIG. 9 and 10, the group receiving the peptide of the invention showed a better muscle relaxation effect after 20 hours of administration compared to the group receiving nothing, and had an effect similar to that of BoNT-A.

Краткое содержание экспериментальных примеров 4-6.Summary of experimental examples 4-6.

Пептид по настоящему изобретению можно эффективно использовать для облегчения нервномышечного заболевания или улучшения морщин, поскольку пептид по настоящему изобретению подавляет секрецию ацетилхолина in vitro и демонстрирует эффект расслабления мышц in vivo, подобно ботоксу.The peptide of the present invention can be effectively used to alleviate neuromuscular disease or improve wrinkles because the peptide of the present invention suppresses the secretion of acetylcholine in vitro and exhibits a muscle relaxing effect in vivo, similar to Botox.

Экспериментальный пример 7: подтверждение проникновения пептида в клетки или механизма проникновения в ткань.Experimental Example 7: Confirmation of peptide cell penetration or tissue penetration mechanism.

Конъюгат родамин-пептид по изобретению, используемый для подтверждения проникновения пептида по настоящему изобретению в клетки или механизма проникновения в ткань, получали следующим образом. 10 мг/мл раствора пептида по настоящему изобретению получали с использованием 100 мМ бикарбоната натрия (рН 9,0). 1 мг/мл раствора NHS-родамина (Thermo Scientific, 46406) получали с использованием диметилформамида. Растворы смешивали таким образом, чтобы молярное соотношение пептида по настоящему изобретению и конъюгата NHS-родамин составляло 1:10. Полученную смесь оставляли реагировать при комнатной температуре в течение часа при переворачивании в защищенном от света месте. Реакционный раствор подвергали диализу и затем анализировали с помощью ЖХ/МС для подтверждения конъюгации между родамином и пептидом по настоящему изобретению.The rhodamine-peptide conjugate of the invention, used to confirm the penetration of the peptide of the present invention into cells or the mechanism of penetration into tissue, was prepared as follows. A 10 mg/ml solution of the peptide of the present invention was prepared using 100 mM sodium bicarbonate (pH 9.0). A 1 mg/mL solution of NHS-rhodamine (Thermo Scientific, 46406) was prepared using dimethylformamide. The solutions were mixed so that the molar ratio of the peptide of the present invention and the NHS-rhodamine conjugate was 1:10. The resulting mixture was left to react at room temperature for an hour while inverting, protected from light. The reaction solution was dialyzed and then analyzed by LC/MS to confirm the conjugation between rhodamine and the peptide of the present invention.

7-1: подтверждение проникновения пептида в клетки.7-1: Confirmation of peptide penetration into cells.

Клетки SH-SY5Y высевали с плотностью 3x105 клеток/лунку в 6-луночный планшет. После культивирования клеток в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой DMEM. В культуральный раствор добавляли возрастающие концентрации пептида по настоящему изобретению, меченного флуоресцентным веществом (т.е. родамином), в течение 4 часов. Через 4 часа культуральный раствор обрабатывали 4%-м параформальдегидом для фиксации клеток. После этого ядра клеток окрашивали DAPI с использованием набора для окрашивания DAPI (Invitrogen, США). Проникновение пептида в клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Синий цвет представляет собой ядра клеток, окрашенных DAPI, а красный цвет представляет собой конъюгат пептид по изобретению-родамин.SH-SY5Y cells were seeded at a density of 3x105 cells/well in a 6-well plate. After culturing the cells overnight, the medium was replaced with serum-free DMEM. Increasing concentrations of the peptide of the present invention, labeled with a fluorescent substance (ie rhodamine), were added to the culture solution over a period of 4 hours. After 4 hours, the culture solution was treated with 4% paraformaldehyde to fix the cells. Cell nuclei were then stained with DAPI using a DAPI staining kit (Invitrogen, USA). The penetration of the peptide into cells was observed using a fluorescence microscope. The blue color represents the nuclei of cells stained with DAPI, and the red color represents the inventive peptide-rhodamine conjugate.

Как показано на фиг. 11, было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению проникал в клетки SH-SY5Y, когда в культуральный раствор добавляли пептид по настоящему изобретению.As shown in FIG. 11, it was confirmed that the peptide of the present invention entered SH-SY5Y cells when the peptide of the present invention was added to the culture solution.

7-2: подтверждение механизма проникновения пептида в ткань.7-2: confirmation of the mechanism of peptide penetration into tissue.

Со спинки 7-недельной крысы SD удаляли шерсть, и на спинку крысы наносили родамин и пептид по настоящему изобретению. Через час крысу забивали для анализа. Область кожной ткани, на которую наносили препараты, собирали и фиксировали в формалине в течение суток. Из фиксированной ткани получали парафиновый блок, и приготавливали срезы на микротоме, которые затем иммуногистохимически окрашивали с использованием антитела к нейрональному маркеру TrkB (Cell Signaling, США). После этого окрашивали ядра клеток с использованием набора для окрашивания DAPI (Invitrogen, США).The back of a 7-week-old SD rat was dehaired, and rhodamine and the peptide of the present invention were applied to the back of the rat. An hour later, the rat was sacrificed for analysis. The area of skin tissue to which the drugs were applied was collected and fixed in formaldehyde for 24 hours. A paraffin block was obtained from the fixed tissue, and sections were prepared on a microtome, which were then immunohistochemically stained using an antibody to the neuronal marker TrkB (Cell Signaling, USA). After this, cell nuclei were stained using a DAPI staining kit (Invitrogen, USA).

- 11 045063- 11 045063

Проникновение пептида в клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Синий представляет ядра клеток, окрашенных DAPI, красный представляет конъюгат пептид по изобретению-родамин, а зеленый представляет TrkB (маркер нервных волокон).The penetration of the peptide into cells was observed using a fluorescence microscope. Blue represents DAPI-stained cell nuclei, red represents the inventive peptide-rhodamine conjugate, and green represents TrkB (a nerve fiber marker).

На основе полученных результатов было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению проникал в мышечную оболочку кожной ткани, когда кожу обрабатывали пептидом по настоящему изобретению, как показано на фиг. 12. Также было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению локализовался совместно с нейрональным маркером. При увеличении изображения на фиг. 12 было подтверждено, что пептид по настоящему изобретению и нейроны вокруг волосяных фолликулов или сальных желез имели совместную локализацию (фиг. 13 и 14).Based on the results obtained, it was confirmed that the peptide of the present invention penetrated into the muscle layer of the skin tissue when the skin was treated with the peptide of the present invention, as shown in FIG. 12. It was also confirmed that the peptide of the present invention co-localized with a neuronal marker. When enlarging the image in FIG. 12 it was confirmed that the peptide of the present invention and neurons around hair follicles or sebaceous glands were co-localized (Figs. 13 and 14).

Краткое содержание экспериментального примера 7.Summary of Experimental Example 7.

Пептид по настоящему изобретению может проникать в клетки, проникает в мышечную оболочку кожной ткани и локализуется вместе с нейрональным маркером в мышечной оболочке. Следовательно, ожидается, что пептид по настоящему изобретению участвует в образовании комплекса SNARE, участвующего в доставке нейротрансмиттеров нейронов, тем самым проявляя эффект расслабления мышц.The peptide of the present invention can penetrate into cells, penetrates the muscularis propria of skin tissue, and colocalizes with a neuronal marker in the muscularis propria. Therefore, it is expected that the peptide of the present invention participates in the formation of a SNARE complex involved in the delivery of neurotransmitters to neurons, thereby exhibiting a muscle relaxation effect.

Экспериментальный пример 8: подтверждение эффекта пептида на уменьшение морщин (повышенная экспрессия дермальных компонентов).Experimental Example 8: Confirmation of the peptide's effect on wrinkle reduction (increased expression of dermal components).

Раствор липосом, включающий 4000 ppm пептида по настоящему изобретению, наносили на спинку 7-недельной лысой мыши в возрасте дважды в день в течение всего 12 недель. После того как область нанесения наблюдалась невооруженным глазом, кожную ткань собирали и фиксировали в формалине. Из фиксированной ткани готовили парафиновый блок и нарезали на микротоме для подготовки предметных стекол.A liposome solution comprising 4000 ppm of the peptide of the present invention was applied to the back of a 7 week old hairless mouse twice daily for a total of 12 weeks. After the application area was observed with the naked eye, the skin tissue was collected and fixed in formaldehyde. The fixed tissue was prepared into a paraffin block and cut on a microtome to prepare slides.

8-1: подтверждение эффекта уменьшения морщин.8-1: Confirmation of wrinkle reduction effect.

В группе мышей, которым в течение 12 недель наносили раствор липосом, включающий пептид по настоящему изобретению, за животными наблюдали невооруженным глазом и проводили наблюдения под микроскопом. В результате было замечено, что морщины значительно уменьшались в результате эффекта миорелаксации у всех мышей по сравнению с контрольной группой, которой наносили только раствор липосом (фиг. 15 и 16).In a group of mice that were treated with a liposome solution comprising the peptide of the present invention for 12 weeks, the animals were observed with the naked eye and observed under a microscope. As a result, it was observed that wrinkles were significantly reduced as a result of the muscle relaxation effect in all mice compared to the control group that received only the liposome solution (Figs. 15 and 16).

8-2: оценка уровня экспрессии коллагена.8-2: Collagen expression level assessment.

Срезы тканей окрашивали с использованием набора для трехцветного окрашивания по Массону (Abcam, США), а затем наблюдали с помощью оптического микроскопа.Tissue sections were stained using a Masson tricolor staining kit (Abcam, USA) and then observed using an optical microscope.

Было подтверждено, что уровень экспрессии коллагена увеличился в группе мышей, которым наносили раствор липосом, включающий пептид по настоящему изобретению, в течение 12 недель, по сравнению с контрольной группой, которой наносили только раствор липосом (фиг. 17).It was confirmed that the expression level of collagen increased in the group of mice that were treated with a liposome solution including the peptide of the present invention for 12 weeks, compared with the control group that was treated with only the liposome solution (FIG. 17).

8-3: оценка уровня экспрессии эластина и фибронектина.8-3: assessment of the expression level of elastin and fibronectin.

Срезы тканей иммуногистохимически окрашивали с использованием антител к эластину и антител к фибронектину (Cell signaling, США) с последующим окрашиванием ядер с использованием набора для окрашивания DAPI (Invitrogen, США). Окрашенные слайды ткани наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа.Tissue sections were immunohistochemically stained using anti-elastin antibodies and anti-fibronectin antibodies (Cell signaling, USA), followed by nuclear staining using a DAPI staining kit (Invitrogen, USA). Stained tissue slides were observed using a fluorescence microscope.

Было подтверждено, что уровни экспрессии эластина и фибронектина увеличивались в группе мышей, которым наносили раствор липосом, включающий пептид по настоящему изобретению, в течение 12 недель, по сравнению с контрольной группой, которой наносили только раствор липосом (фиг. 18 и 19).It was confirmed that the expression levels of elastin and fibronectin were increased in the group of mice that were treated with a liposome solution including the peptide of the present invention for 12 weeks, compared with the control group that was treated with only the liposome solution (FIGS. 18 and 19).

Экспериментальный пример 9: подтверждение ингибирующего действия пептида на продукцию кожного сала.Experimental Example 9: Confirmation of the inhibitory effect of the peptide on sebum production.

Раствор липосом, включающий 4000 ppm пептида по настоящему изобретению, наносили на спинку голой мыши в возрасте 7 недель дважды в день в течение всего 12 недель. После того как нанесенная область наблюдалась невооруженным глазом, кожную ткань собирали и фиксировали в формалине. Из фиксированной ткани готовили парафиновый блок и нарезали на микротоме для подготовки предметных стекол. Срезы ткани иммуногистохимически окрашивали с использованием антитела к синтазе жирных кислот (Cell Signaling, США) в качестве маркера, связанного с выработкой кожного сала, и окрашенные слайды ткани наблюдали с помощью оптического микроскопа.A liposome solution comprising 4000 ppm of the peptide of the present invention was applied to the back of a 7 week old nude mouse twice daily for a total of 12 weeks. After the applied area was observed with the naked eye, the skin tissue was collected and fixed in formaldehyde. The fixed tissue was prepared into a paraffin block and cut on a microtome to prepare slides. Tissue sections were immunohistochemically stained using fatty acid synthase antibody (Cell Signaling, USA) as a marker associated with sebum production, and the stained tissue slides were observed using an optical microscope.

Было подтверждено, что количество сальных желез и уровень экспрессии маркера, связанного с выработкой кожного сала, был снижен в группе мышей, которым наносили липосомный раствор, включающий пептид по настоящему изобретению, в течение 12 недель, по сравнению с контрольной группой, которой наносили только раствор липосом (фиг. 20). На левой панели фиг. 20 показаны результаты, полученные при нанесении липосом, не включающих пептид, в течение 12 недель, а на правой панели показаны результаты, полученные при нанесении липосом, содержащей 4000 ppm пептида, в течение 12 недель. На этой фиг. можно видеть, что коричневые иммуноокрашенные участки были блеклыми и количество иммуноокрашенных участков уменьшалось при нанесении липосом с пептидом.It was confirmed that the number of sebaceous glands and the expression level of a marker associated with sebum production were reduced in a group of mice that were treated with a liposomal solution including the peptide of the present invention for 12 weeks, compared with a control group that received only the solution liposomes (Fig. 20). In the left panel of FIG. 20 shows the results obtained when liposomes containing no peptide were applied for 12 weeks, and the right panel shows the results obtained when liposomes containing 4000 ppm of peptide were applied for 12 weeks. In this fig. It can be seen that the brown immunostained areas were faded and the number of immunostained areas decreased when the peptide liposomes were applied.

Пример получения 2: изготовление косметического состава.Preparation example 2: production of a cosmetic composition.

2-1: изготовление эссенции.2-1: Making essence.

Эссенцию изготавливали с использованием пептида по настоящему изобретению исходя из содержания (частей по весу), приведенного в нижеследующей табл. 1.The essence was prepared using the peptide of the present invention based on the content (parts by weight) shown in the following table. 1.

- 12 045063- 12 045063

Таблица 1Table 1

Композици Compositions Содержание (части по весу) Contents (parts by weight) Триэтаноламин Triethanolamine 0,25 0.25 Карбоксивиниловый полимер Carboxyvinyl polymer 0,22 0.22 Глицерин Glycerol 4 4 Бутиленгликоль Butylene glycol 2 2 Пептид по изобретению Peptide according to the invention 1,5 1.5 Пчелиный воск Beeswax 0,5 0.5 Цетостеариловый спирт Cetostearyl alcohol 1 1 Глицерил моностеарат Glyceryl monostearate 1 1 Сквален Squalene 4 4 Очищенная вода Purified water Нужное количество Required quantity

2-2: изготовление тоника.2-2: making tonic.

Тоник, включающий пептид по настоящему изобретению в качестве действующего ингредиента, изготавливали, как указано в нижеследующей табл. 2.A tonic containing the peptide of the present invention as an active ingredient was prepared as shown in the following table. 2.

Таблица 2table 2

Базовые вещества Basic substances Содержание (части по весу) Contents (parts by weight) 1,3- бутиленгликоль 1,3-butylene glycol 1,00 1.00 Динатриевая соль ЭДТА Disodium salt EDTA 0,05 0.05 Аллантоин Allantoin 0,10 0.10 Глицирризат калия Potassium glycyrrhizate 0,05 0.05 Лимонная кислота Lemon acid 0,01 0.01 Цитрат натрия Sodium citrate 0,02 0.02 Глицерет-26 Glyceret-26 1,00 1.00 Арбутин Arbutin 2,00 2.00 Масло касторовое гидрогенизированное ПЭГ-40 Hydrogenated castor oil PEG-40 1,00 1.00 Этанол Ethanol 30,00 30.00 Пептид по изобретению Peptide according to the invention 1,5 1.5 Краситель Dye Следовое количество Trace amount Ароматизатор Flavoring Следовое количество Trace amount Очищенная вода Purified water До нужного объема To the required volume

2-3: изготовление питательного крема.2-3: making nourishing cream.

Питательный крем, включающий пептид по настоящему изобретению в качестве действующего ингредиента, изготавливали на основе композиций, перечисленных в нижеследующей табл. 3.A nourishing cream containing the peptide of the present invention as an active ingredient was prepared based on the compositions listed in the following table. 3.

Таблица 3Table 3

Базовые вещества Basic substances Содержание (части по весу) Contents (parts by weight) 1,3-Бутиленгликоль 1,3-Butylene glycol 7,0 7.0 Глицерин Glycerol 1,0 1.0 D-пантенол D-panthenol 0,1 0.1 Силикат магния и алюминия Magnesium aluminum silicate 0,3 0.3

- 13 045063- 13 045063

ПЭГ-40 стеарат PEG-40 stearate 1,2 1.2 Стеариновая кислота Stearic acid 2,0 2.0 Полисорбат 60 Polysorbate 60 1,5 1.5 Глицерил стеарат, липофильный Glyceryl stearate, lipophilic 2,0 2.0 Сорбитана сесквиолеат Sorbitan sesquioleate 1,5 1.5 Цетеариловый спирт Cetearyl alcohol 3,0 3.0 Минеральное масло Mineral oil 4.0 4.0 Сквален Squalene 3,8 3.8 Пептид по изобретению Peptide according to the invention 1,5 1.5 Растительное масло Vegetable oil 1,8 1.8 Диметикон Dimethicone 0,4 0.4 Глицирризата калия Potassium glycyrrhizate Следовое количество Trace amount Аллантоиновый Allantoin Следовое количество Trace amount гиалуроната натрия sodium hyaluronate Следовое количество Trace amount Токоферилацетат Tocopheryl acetate Нужное количество Required quantity Триэтаноламин Triethanolamine Нужное количество Required quantity Ароматизатор Flavoring Нужное количество Required quantity Очищенная вода Purified water До нужного объема To the required volume

2-4: изготовление лосьона.2-4: making lotion.

Лосьон, содержащий пептид по настоящему изобретению в качестве действующего ингредиента, изготавливали на основе композиций, перечисленных в следующей табл. 4.A lotion containing the peptide of the present invention as an active ingredient was prepared based on the compositions listed in the following table. 4.

Таблица 4Table 4

Базовые вещества Basic substances Содержание (части по весу) Contents (parts by weight) Цетостеариловый спирт Cetostearyl alcohol 1,6 1.6 Стеариновая кислота Stearic acid 1,4 1.4 Глицерат моностеариновой кислоты, липофильный Monostearic acid glycerate, lipophilic 1,8 1.8 Стеарат ПЭГ-100 PEG-100 stearate 2,6 2.6 Сорбитана сесквиолеат Sorbitan sesquioleate 0,6 0.6 Сквален Squalene 4,8 4.8 Масло макадамии Macadamia oil 2 2 Масло жожоба Jojoba oil 2 2 Токоферола ацетат Tocopherol acetate 0,4 0.4 Метилполисилоксан Methylpolysiloxane 0,2 0.2 Токоферола ацетат Tocopherol acetate 0,4 0.4 1,3 -Бутиленгликоль 1,3 -Butylene glycol 4 4 Ксантановая камедь Xanthan gum 0,1 0.1 Глицерин Glycerol 4 4 D-пантенол D-panthenol 0,15 0.15 Пептид по изобретению Peptide according to the invention 1,0 1.0 Аллантоин Allantoin 0,1 0.1 Карбомер (2%-й водн. раствор) Carbomer (2% aqueous solution) 4 4 Триэтаноламин Triethanolamine 0,15 0.15 Этанол Ethanol 3 3 Очищенная вода Purified water Нужное количество Required quantity

--

Claims

Preparation Example 3: Manufacturing of a Pharmaceutical Composition.

3-1: Making powder

Peptide according to the invention 2 g

Lactose 1 g

To make the powder, the components were mixed and then placed in a sealed container.

3-2: making tablet

Peptide according to the invention 100 mg

Corn starch 100 mg

Lactose 100 mg

Magnesium stearate 2 mg

To make a tablet according to the conventional tablet preparation method, the components were mixed and then the tablet was compressed.

3-3: Capsule making

Peptide according to the invention 100 mg

Corn starch 100 mg

Lactose 100 mg

Magnesium stearate 2 mg

To prepare the capsule, according to a conventional capsule manufacturing method, the components were mixed and then filled into a gelatin capsule.

3-4: Pill Making

Peptide according to the invention 1 g

Lactose 1.5g

Glycerin 1 g

Xylitol 0.5g

The components were mixed and then processed in accordance with the usual method of making a pill, so that the components were included in an amount of 4 g per pill.

3-5: making granules

Peptide according to the invention 150 mg

Soybean extract 50 mg

Glucose 200 mg

Starch 600 mg

The components were mixed, and then 100 mg of 30% ethanol was added to them. The resulting mixture was dried at a temperature of 60°C to obtain granules, which were then placed in packaging.

CLAIM

1. A pharmaceutical composition for muscle relaxation containing a peptide consisting of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.

2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the peptide is included in an amount of from 0.001% by weight to 60% by weight, based on 100% by weight of the pharmaceutical composition for muscle relaxation.

3. The pharmaceutical composition according to claim 1, which is used for the prevention or treatment of a neuromuscular disease.

4. The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the neuromuscular disease includes any disease selected from the group consisting of eyelid twitching, torticollis, cervical dystonia, tonic blepharospasm, axillary hyperhidrosis, anal fissure, colpospasm, achalasia, headache, idiopathic and neurogenic detrusor overactivity, focal dystonia, temporomandibular joint pain/disorder, diabetic neuropathy, vocal cord dysfunction, strabismus, chronic neuropathy, facial muscle hypertrophy, detrusor sphincter dyssynergia and benign prostatic hyperplasia.

5. The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the headache is a migraine.

6. Pharmaceutical composition according to claim 1, where the peptide suppresses the secretion of acetylcholine.

7. A cosmetic composition containing a peptide consisting of the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1 as an active ingredient, wherein the cosmetic composition is used to improve skin wrinkles, increase skin elasticity, suppress production

-