EA044058B1 - DELIVERY OF PROTEINS BASED ON VIRULENCE-ATTENUATED BACTERIA - Google Patents
DELIVERY OF PROTEINS BASED ON VIRULENCE-ATTENUATED BACTERIA Download PDFInfo
- Publication number
- EA044058B1 EA044058B1 EA201991157 EA044058B1 EA 044058 B1 EA044058 B1 EA 044058B1 EA 201991157 EA201991157 EA 201991157 EA 044058 B1 EA044058 B1 EA 044058B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- virulence
- amino acid
- proteins
- bacterial strain
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 606
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 520
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 83
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 229
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 193
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 154
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 153
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 136
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 108
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 108
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 108
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 104
- 239000012639 bacterial effector Substances 0.000 claims description 93
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 claims description 87
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 84
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 77
- 102100023727 Mitochondrial antiviral-signaling protein Human genes 0.000 claims description 69
- 101710142315 Mitochondrial antiviral-signaling protein Proteins 0.000 claims description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 67
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 62
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 61
- 101000595918 Homo sapiens Phospholipase A and acyltransferase 4 Proteins 0.000 claims description 60
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 56
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 54
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 54
- 230000010472 type I IFN response Effects 0.000 claims description 54
- 102100037435 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Human genes 0.000 claims description 52
- 101000952099 Homo sapiens Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 claims description 51
- 102000002164 CARD domains Human genes 0.000 claims description 44
- 108050009503 CARD domains Proteins 0.000 claims description 44
- 102100031256 Cyclic GMP-AMP synthase Human genes 0.000 claims description 41
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 39
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 35
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims description 33
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 26
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 25
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 24
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 23
- 101001082073 Homo sapiens Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710090028 Inositol-3-phosphate synthase 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 102100027353 Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 20
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 14
- 241000896693 Disa Species 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 claims description 10
- PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N c-di-GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=C(C(NC(N)=N5)=O)N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N 0.000 claims description 9
- PDXMFTWFFKBFIN-XPWFQUROSA-N cyclic di-AMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=NC=NC(N)=C5N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 PDXMFTWFFKBFIN-XPWFQUROSA-N 0.000 claims description 8
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 108091005685 RIG-I-like receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 4
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 2
- 101710118064 Cyclic GMP-AMP synthase Proteins 0.000 claims 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 500
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 150
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 134
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 125
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 99
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 98
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 44
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 44
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 43
- 108030002637 Cyclic GMP-AMP synthases Proteins 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 35
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- -1 DFO-B Chemical compound 0.000 description 32
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 31
- ZQXVUBDNHQEMGO-UHFFFAOYSA-N O=C1C2=C(Br)C(Br)=C(Br)C(Br)=C2C(=O)N1C1=NC=CN1 Chemical compound O=C1C2=C(Br)C(Br)=C(Br)C(Br)=C2C(=O)N1C1=NC=CN1 ZQXVUBDNHQEMGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 24
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 24
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 24
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 23
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 23
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 23
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 22
- 101150074358 IFIT2 gene Proteins 0.000 description 21
- 102100027303 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Human genes 0.000 description 21
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 20
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 19
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 19
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 19
- 108010046504 Type IV Secretion Systems Proteins 0.000 description 18
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 16
- 101000650589 Mus musculus Roundabout homolog 3 Proteins 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 15
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 14
- 101100145110 Mus musculus Robo3 gene Proteins 0.000 description 14
- 101150071168 glyQS gene Proteins 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 108010046179 Type VI Secretion Systems Proteins 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 101150028113 Hrk gene Proteins 0.000 description 12
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 12
- 101100258806 Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) glyQ gene Proteins 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 101150049851 glyS gene Proteins 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 11
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 10
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 10
- 101000980932 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Proteins 0.000 description 10
- 101000733249 Homo sapiens Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 description 10
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 10
- 101710196623 Stimulator of interferon genes protein Proteins 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108700000712 BH3 Interacting Domain Death Agonist Proteins 0.000 description 9
- 102000055105 BH3 Interacting Domain Death Agonist Human genes 0.000 description 9
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 9
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 9
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 9
- 231100001143 noxa Toxicity 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 9
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 8
- 101100011368 Caenorhabditis elegans egl-1 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100026693 FAS-associated death domain protein Human genes 0.000 description 8
- 101000911074 Homo sapiens FAS-associated death domain protein Proteins 0.000 description 8
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 8
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 8
- 241000191342 Nematostella vectensis Species 0.000 description 8
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 8
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 8
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 8
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 8
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 8
- 101150059846 trpS gene Proteins 0.000 description 8
- 101150004782 trpS2 gene Proteins 0.000 description 8
- 101000677856 Stenotrophomonas maltophilia (strain K279a) Actin-binding protein Smlt3054 Proteins 0.000 description 7
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 7
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 7
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 7
- 101150079604 glyA1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000044773 human PLAAT4 Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 7
- 241001083548 Anemone Species 0.000 description 6
- 102100027308 Apoptosis regulator BAX Human genes 0.000 description 6
- 108050006685 Apoptosis regulator BAX Proteins 0.000 description 6
- 102100035656 BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 Human genes 0.000 description 6
- 101150023628 Bok gene Proteins 0.000 description 6
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 6
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 6
- 101100423897 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) glnS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150082208 DIABLO gene Proteins 0.000 description 6
- 101100165575 Danio rerio boka gene Proteins 0.000 description 6
- 101100165576 Danio rerio bokb gene Proteins 0.000 description 6
- 102100033189 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Human genes 0.000 description 6
- 101710101225 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Proteins 0.000 description 6
- 101100098219 Dictyostelium discoideum argS1 gene Proteins 0.000 description 6
- 101100311938 Dictyostelium discoideum phesA gene Proteins 0.000 description 6
- 101100423325 Dictyostelium discoideum phesB gene Proteins 0.000 description 6
- 101100480329 Enterococcus faecalis (strain TX4000 / JH2-2) tyrS1 gene Proteins 0.000 description 6
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 6
- 101000803294 Homo sapiens BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 Proteins 0.000 description 6
- 101000873111 Homo sapiens Vesicle transport protein SEC20 Proteins 0.000 description 6
- 102100023162 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Human genes 0.000 description 6
- 101710193388 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Proteins 0.000 description 6
- 101710125839 L-threonine dehydratase Proteins 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 101100129095 Mycobacterium bovis (strain BCG / Tokyo 172 / ATCC 35737 / TMC 1019) lysX gene Proteins 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 101100423624 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) leuS2 gene Proteins 0.000 description 6
- 101710170075 Serine dehydratase-like Proteins 0.000 description 6
- 102100035030 Vesicle transport protein SEC20 Human genes 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- JHYVWAMMAMCUIR-UHFFFAOYSA-N Yersiniabactin Natural products CC(C)(C(O)C1CSC(N1)C1CSC(=N1)c1ccccc1O)C1=NC(C)(CS1)C(O)=O JHYVWAMMAMCUIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150024756 argS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150014732 asnS gene Proteins 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 101150011637 cysS gene Proteins 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 101150024902 glnS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150103988 gltX gene Proteins 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 6
- 101150021684 leuS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150110767 lysS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150056234 lysS1 gene Proteins 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 101150106833 metG gene Proteins 0.000 description 6
- 101150062025 metG1 gene Proteins 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 101150080777 pheS gene Proteins 0.000 description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 6
- 101150046628 thrS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150031421 thrS-cat gene Proteins 0.000 description 6
- 101150101943 tyrS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150112181 valS gene Proteins 0.000 description 6
- ACWBQPMHZXGDFX-QFIPXVFZSA-N valsartan Chemical compound C1=CC(CN(C(=O)CCCC)[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CC=C1C1=CC=CC=C1C1=NN=NN1 ACWBQPMHZXGDFX-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 6
- JHYVWAMMAMCUIR-VQNLDRKJSA-N yersiniabactin Chemical compound C([C@@H](N=1)C2SC[C@H](N2)[C@@H](O)C(C)(C)C=2SC[C@@](C)(N=2)C(O)=O)SC=1C1=CC=CC=C1O JHYVWAMMAMCUIR-VQNLDRKJSA-N 0.000 description 6
- 102000004072 Beclin-1 Human genes 0.000 description 5
- 108090000524 Beclin-1 Proteins 0.000 description 5
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 5
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 5
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 5
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 5
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 5
- 102100024465 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor C Human genes 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100033996 Double-strand break repair protein MRE11 Human genes 0.000 description 5
- 102100039928 Gamma-interferon-inducible protein 16 Human genes 0.000 description 5
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 101710139453 Glycine-tRNA ligase beta subunit Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101000776648 Homo sapiens Cyclic GMP-AMP synthase Proteins 0.000 description 5
- 101000591400 Homo sapiens Double-strand break repair protein MRE11 Proteins 0.000 description 5
- 101000960209 Homo sapiens Gamma-interferon-inducible protein 16 Proteins 0.000 description 5
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000978490 Homo sapiens Mitochondrial antiviral-signaling protein Proteins 0.000 description 5
- 101000874165 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX41 Proteins 0.000 description 5
- 101000864662 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DHX58 Proteins 0.000 description 5
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 5
- 102100035727 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX41 Human genes 0.000 description 5
- 102100030090 Probable ATP-dependent RNA helicase DHX58 Human genes 0.000 description 5
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 5
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 102000056488 human MAVS Human genes 0.000 description 5
- 102000048017 human cGAS Human genes 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 5
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 5
- 101150015399 yopE gene Proteins 0.000 description 5
- 101150091518 APAF1 gene Proteins 0.000 description 4
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 4
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 4
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 4
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 4
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 4
- 101100423982 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) serS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102100038023 DNA fragmentation factor subunit beta Human genes 0.000 description 4
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100479033 Drosophila melanogaster AlaRS gene Proteins 0.000 description 4
- 101100150923 Drosophila melanogaster AlaRS-m gene Proteins 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 101000779372 Escherichia coli (strain K12) Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 101100322888 Escherichia coli (strain K12) metL gene Proteins 0.000 description 4
- 101100099027 Escherichia coli (strain K12) tdcG gene Proteins 0.000 description 4
- 101100324575 Escherichia coli O78:H11 (strain H10407 / ETEC) gspS2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000005133 Glutamate 5-kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 description 4
- 101001032342 Homo sapiens Interferon regulatory factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 101001032341 Homo sapiens Interferon regulatory factor 9 Proteins 0.000 description 4
- 101000850748 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein Proteins 0.000 description 4
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 102100038070 Interferon regulatory factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 102100038251 Interferon regulatory factor 9 Human genes 0.000 description 4
- 101100023016 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) mat gene Proteins 0.000 description 4
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 241001387976 Pera Species 0.000 description 4
- 102000012435 Phosphofructokinase-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010022684 Phosphofructokinase-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100026126 Proline-tRNA ligase Human genes 0.000 description 4
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 4
- 101100205075 Pseudomonas fluorescens ileS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 4
- 102100022501 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Human genes 0.000 description 4
- 229940044665 STING agonist Drugs 0.000 description 4
- 102000019394 Serine hydroxymethyltransferases Human genes 0.000 description 4
- 102100035717 Serine racemase Human genes 0.000 description 4
- 108010006152 Serine racemase Proteins 0.000 description 4
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 description 4
- 108090000925 TNF receptor-associated factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100034779 TRAF family member-associated NF-kappa-B activator Human genes 0.000 description 4
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 4
- 102000002501 Tryptophan-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 4
- 102100033081 Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 241001617360 Yersinia enterocolitica subsp. palearctica Species 0.000 description 4
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 101150001823 alaA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150049313 alaS gene Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 4
- 101150018055 aroH gene Proteins 0.000 description 4
- 101150083869 aroK gene Proteins 0.000 description 4
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 4
- 101150079521 aspS gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 4
- 229940099217 desferal Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 4
- 101150031187 fba gene Proteins 0.000 description 4
- 101150108901 fbaA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150072694 hisS gene Proteins 0.000 description 4
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 101150069930 ileS gene Proteins 0.000 description 4
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 101150095438 metK gene Proteins 0.000 description 4
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 4
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000001686 pro-survival effect Effects 0.000 description 4
- 101150108812 proC gene Proteins 0.000 description 4
- 101150003695 proS gene Proteins 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 4
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 description 4
- 101150051721 serS gene Proteins 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 101150106193 tal gene Proteins 0.000 description 4
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150014795 tktA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150028338 tyrB gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 4
- 102100033391 ATP-dependent RNA helicase DDX3X Human genes 0.000 description 3
- 102100023388 ATP-dependent RNA helicase DHX15 Human genes 0.000 description 3
- 102100023439 ATP-dependent RNA helicase DHX29 Human genes 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 description 3
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 description 3
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 3
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 3
- 101000950671 Chelon ramada Myosin light chain 3, skeletal muscle isoform Proteins 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- 102100028559 Death domain-associated protein 6 Human genes 0.000 description 3
- 102100038713 Death domain-containing protein CRADD Human genes 0.000 description 3
- 102100021757 E3 ubiquitin-protein ligase RNF135 Human genes 0.000 description 3
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 101000870662 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase DDX3X Proteins 0.000 description 3
- 101000907886 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase DHX15 Proteins 0.000 description 3
- 101000907919 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase DHX29 Proteins 0.000 description 3
- 101000957914 Homo sapiens Death domain-containing protein CRADD Proteins 0.000 description 3
- 101001106984 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF135 Proteins 0.000 description 3
- 101001052506 Homo sapiens Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Proteins 0.000 description 3
- 101000665442 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TBK1 Proteins 0.000 description 3
- 101000595548 Homo sapiens TIR domain-containing adapter molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000830956 Homo sapiens Three-prime repair exonuclease 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102100024178 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Human genes 0.000 description 3
- 101150020251 NR13 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 102100038192 Serine/threonine-protein kinase TBK1 Human genes 0.000 description 3
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 3
- 108700001253 Streptococcus sanguis 12 saliva-binding Proteins 0.000 description 3
- 102100036073 TIR domain-containing adapter molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000004399 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000922 TNF receptor-associated factor 3 Proteins 0.000 description 3
- 102000003718 TNF receptor-associated factor 5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000001 TNF receptor-associated factor 5 Proteins 0.000 description 3
- 102100024855 Three-prime repair exonuclease 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010073429 Type V Secretion Systems Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 3
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 3
- 108700017365 bacteria SspA Proteins 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 101150039936 ced-9 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 108010064177 glutamine synthetase I Proteins 0.000 description 3
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101150056694 hisC gene Proteins 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 101150075391 mtnN gene Proteins 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- ICZSAXDKFXTSGL-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[5-carbamoyl-2-[(2-ethyl-5-methylpyrazole-3-carbonyl)amino]benzimidazol-1-yl]butyl]-2-[(2-ethyl-5-methylpyrazole-3-carbonyl)amino]benzimidazole-5-carboxamide Chemical compound CCN1N=C(C)C=C1C(=O)NC1=NC2=CC(=CC=C2N1CCCCN1C(NC(=O)C2=CC(C)=NN2CC)=NC2=CC(=CC=C12)C(N)=O)C(N)=O ICZSAXDKFXTSGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710090429 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase Proteins 0.000 description 2
- 108050004624 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutases Proteins 0.000 description 2
- 108010048295 2-isopropylmalate synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010038550 3-dehydroquinate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 108050006180 3-dehydroquinate synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101710162953 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase Proteins 0.000 description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 2
- 101710185027 5'-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase Proteins 0.000 description 2
- 108010058756 ATP phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100022410 ATP-dependent DNA/RNA helicase DHX36 Human genes 0.000 description 2
- 102100030088 ATP-dependent RNA helicase A Human genes 0.000 description 2
- 101710115626 Acetylornithine/succinyldiaminopimelate aminotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 2
- 241000242759 Actiniaria Species 0.000 description 2
- 102000006268 Alanine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010058060 Alanine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710191958 Amino-acid acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710081557 Aminodeoxyfutalosine nucleosidase Proteins 0.000 description 2
- 101000640990 Arabidopsis thaliana Tryptophan-tRNA ligase, chloroplastic/mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 102000002249 Arginine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010014885 Arginine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102000009042 Argininosuccinate Lyase Human genes 0.000 description 2
- 102000053640 Argininosuccinate synthases Human genes 0.000 description 2
- 108700024106 Argininosuccinate synthases Proteins 0.000 description 2
- 102100023927 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 2
- 108090000314 Asparagine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000012951 Aspartate-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010065272 Aspartate-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 101100508888 Bacillus subtilis (strain 168) iolJ gene Proteins 0.000 description 2
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100189062 Bacillus subtilis (strain 168) proH gene Proteins 0.000 description 2
- 101100154671 Bacillus subtilis (strain 168) tsaE gene Proteins 0.000 description 2
- 101100432721 Bacillus subtilis (strain 168) yopO gene Proteins 0.000 description 2
- 101100432722 Bacillus subtilis (strain 168) yopP gene Proteins 0.000 description 2
- 108010037833 Bacterial Adhesins Proteins 0.000 description 2
- 241001518086 Bartonella henselae Species 0.000 description 2
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010029692 Bisphosphoglycerate mutase Proteins 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 2
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 description 2
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 2
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 2
- 102100025752 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Human genes 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 101000741929 Caenorhabditis elegans Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100026549 Caspase-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000572 Caspase-10 Proteins 0.000 description 2
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 description 2
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 description 2
- 101710090333 Caspase-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 2
- 108010003662 Chorismate synthase Proteins 0.000 description 2
- 101710082464 Cis-aconitate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 2
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 2
- 101100054574 Corynebacterium diphtheriae (strain ATCC 700971 / NCTC 13129 / Biotype gravis) acn gene Proteins 0.000 description 2
- 101100435903 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) aroG gene Proteins 0.000 description 2
- WCZDQPXNBJTKPI-UHFFFAOYSA-O Cyanidin 7-glucoside Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(O)=C(C=C(O)C(=[O+]2)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)C2=C1 WCZDQPXNBJTKPI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108010076010 Cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000004403 Cysteine-tRNA ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000918 Cysteine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- 102100037579 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102100038026 DNA fragmentation factor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 101710147299 DNA fragmentation factor subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101710091772 Death domain-associated protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 108090000129 Diadenylate cyclases Proteins 0.000 description 2
- 108010001625 Diaminopimelate epimerase Proteins 0.000 description 2
- 101100215150 Dictyostelium discoideum aco1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100378193 Dictyostelium discoideum aco2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100190555 Dictyostelium discoideum pkgB gene Proteins 0.000 description 2
- 101100310802 Dictyostelium discoideum splA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 241000588694 Erwinia amylovora Species 0.000 description 2
- 101100449334 Escherichia coli (strain K12) gpmB gene Proteins 0.000 description 2
- 101100122730 Escherichia coli (strain K12) gpmI gene Proteins 0.000 description 2
- 101100420922 Escherichia coli (strain K12) sdaB gene Proteins 0.000 description 2
- 101100105449 Escherichia coli (strain K12) yagE gene Proteins 0.000 description 2
- 101100375798 Escherichia coli (strain K12) ybhJ gene Proteins 0.000 description 2
- 101100106373 Escherichia coli (strain K12) yjhH gene Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- KDHHWXGBNUCREU-HOTGVXAUSA-N Ferric-aerobactin Chemical compound CC(=O)N(O)CCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN(O)C(C)=O KDHHWXGBNUCREU-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 102100035427 Forkhead box protein O1 Human genes 0.000 description 2
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 2
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 2
- 101710107802 Fructose-bisphosphate aldolase class 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710107796 Fructose-bisphosphate aldolase class 2 Proteins 0.000 description 2
- 101150039774 GAPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 2
- 101710198928 Gamma-glutamyl phosphate reductase Proteins 0.000 description 2
- 108010016106 Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010015514 Glutamate-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102100024977 Glutamine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108030004364 Glutamine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 101710137787 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A Proteins 0.000 description 2
- 101710160353 Glycine-tRNA ligase alpha subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000029746 Histidine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108700016229 Histidine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 101000901942 Homo sapiens ATP-dependent DNA/RNA helicase DHX36 Proteins 0.000 description 2
- 101000864670 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase A Proteins 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000950965 Homo sapiens DNA fragmentation factor subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101000877727 Homo sapiens Forkhead box protein O1 Proteins 0.000 description 2
- 101000953492 Homo sapiens Inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001017828 Homo sapiens Leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001129621 Homo sapiens PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000871508 Homo sapiens PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000617728 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 9 Proteins 0.000 description 2
- 101001082184 Homo sapiens Pyrin and HIN domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001109145 Homo sapiens Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 2
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 2
- 102000040104 IAP family Human genes 0.000 description 2
- 108091069885 IAP family Proteins 0.000 description 2
- 108010020748 Imidazole glycerol-phosphate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 206010065973 Iron Overload Diseases 0.000 description 2
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102000029793 Isoleucine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108700040464 Isoleucine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101710148760 L-serine dehydratase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100033303 Leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000043856 Leucine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010071170 Leucine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 101710164888 Lysine-sensitive aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000017737 Lysine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010092041 Lysine-tRNA Ligase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101100435931 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) aroK gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004587 Methionine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010003060 Methionine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000776649 Mus musculus Cyclic GMP-AMP synthase Proteins 0.000 description 2
- 101100010672 Mycobacterium leprae (strain TN) dxs gene Proteins 0.000 description 2
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 description 2
- 101100276922 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dapF2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010061618 O-succinylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 description 2
- 108010083499 Ornithine cyclodeaminase Proteins 0.000 description 2
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 2
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 2
- 102100031152 PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033719 PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 2
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 2
- 102100035215 Phenylalanine-tRNA ligase alpha subunit Human genes 0.000 description 2
- 101710147128 Phenylalanine-tRNA ligase alpha subunit Proteins 0.000 description 2
- 102100035312 Phenylalanine-tRNA ligase beta subunit Human genes 0.000 description 2
- 101710182373 Phenylalanine-tRNA ligase beta subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000011025 Phosphoglycerate Mutase Human genes 0.000 description 2
- 108010038555 Phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 102100021762 Phosphoserine phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 2
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 2
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 2
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 2
- 102100021983 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 9 Human genes 0.000 description 2
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 2
- 101710145525 Probable cinnamyl alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108030004374 Proline-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100176417 Pseudoalteromonas translucida (strain TAC 125) gpmI gene Proteins 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 101100217185 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aruC gene Proteins 0.000 description 2
- 101100282114 Pseudomonas aeruginosa (strain UCBPP-PA14) gap2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 2
- 101710186413 Putative aconitate hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102100027365 Pyrin and HIN domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101100453320 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) pfkC gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004518 Pyrroline-5-carboxylate reductase Human genes 0.000 description 2
- 101710088936 Pyruvate kinase I Proteins 0.000 description 2
- 101710185137 Pyruvate kinase II Proteins 0.000 description 2
- 108090001017 Quinate/shikimate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 102100033729 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100031139 Ribose-5-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 101710088476 Ribose-5-phosphate isomerase A Proteins 0.000 description 2
- 108020000772 Ribose-Phosphate Pyrophosphokinase Proteins 0.000 description 2
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060007030 Ribulose-phosphate 3-epimerase Proteins 0.000 description 2
- 102100026115 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 Human genes 0.000 description 2
- 108050008511 S-adenosylmethionine synthases Proteins 0.000 description 2
- 101150096097 SYCN gene Proteins 0.000 description 2
- 241000533331 Salmonella bongori Species 0.000 description 2
- 108010030161 Serine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 108050008280 Shikimate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101710202600 Shikimate dehydrogenase (NADP(+)) Proteins 0.000 description 2
- 101710131003 Shikimate kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100116197 Streptomyces lavendulae dcsC gene Proteins 0.000 description 2
- 108010056371 Succinyl-diaminopimelate desuccinylase Proteins 0.000 description 2
- 101100022072 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) lysJ gene Proteins 0.000 description 2
- 101100029403 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) pfkA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 101100002724 Thermus thermophilus aroH gene Proteins 0.000 description 2
- 102000001618 Threonine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010029287 Threonine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 241000723790 Tobacco vein mottling virus Species 0.000 description 2
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 2
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 2
- 108020004530 Transaldolase Proteins 0.000 description 2
- 101710110827 Transaldolase A Proteins 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 101710094544 Transketolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710094543 Transketolase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100033108 Transketolase-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710085904 Transketolase-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 2
- 108700016206 Tryptophan-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000018378 Tyrosine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108700024145 Tyrosine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000013625 Valine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108700015935 Valine-tRNA ligases Proteins 0.000 description 2
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 101100398736 Yersinia pestis lcrF gene Proteins 0.000 description 2
- 101100106663 Yersinia pestis yopJ gene Proteins 0.000 description 2
- 102100040310 Z-DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710181770 Z-DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 101150113917 acnA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150053555 acnB gene Proteins 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 101150070427 argC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150089042 argC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150050866 argD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150118463 argG gene Proteins 0.000 description 2
- 101150094408 argI gene Proteins 0.000 description 2
- 101150090235 aroB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150019536 aroF gene Proteins 0.000 description 2
- 101150076125 aroG gene Proteins 0.000 description 2
- 101150007004 aroL gene Proteins 0.000 description 2
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 2
- 108010024239 aromatic amino acid aminotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101150046576 arsC gene Proteins 0.000 description 2
- AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N arsenite(1-) Chemical compound O[As](O)[O-] AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- UUQMNUMQCIQDMZ-UHFFFAOYSA-N betahistine Chemical compound CNCCC1=CC=CC=N1 UUQMNUMQCIQDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 2
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N cystathionine Chemical compound OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150062988 dapF gene Proteins 0.000 description 2
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 2
- NHKCCADZVLTPPO-UHFFFAOYSA-N desferrioxamine E Chemical compound ON1CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC1=O NHKCCADZVLTPPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085933 diguanylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 101150050376 fbaB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150111583 fda gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 2
- 101150091570 gapA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150041871 gltB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150039906 gltD gene Proteins 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 101150055337 glyQ gene Proteins 0.000 description 2
- 101150084612 gpmA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150007491 gpmB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150104722 gpmI gene Proteins 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150118121 hisC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150054929 hisE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150032598 hisG gene Proteins 0.000 description 2
- 101150041745 hisI gene Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150015635 ilvI gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003892 ilvM gene Proteins 0.000 description 2
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 2
- 101150087199 leuA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 2
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 2
- 210000000088 lip Anatomy 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150094164 lysY gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 2
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 101150038284 pfkA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150004013 pfkA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150100557 pfkB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150060387 pfp gene Proteins 0.000 description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 2
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150095149 pgkA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150023849 pheA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150016769 pheT gene Proteins 0.000 description 2
- 108010025593 phenylalanine (histidine) aminotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000030592 phosphoserine aminotransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010088694 phosphoserine aminotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010076573 phosphoserine phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 2
- 101150016674 prs2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150100525 pykA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150053304 pykF gene Proteins 0.000 description 2
- 108020001898 pyrroline-5-carboxylate reductase Proteins 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 102000004688 ribulosephosphate 3-epimerase Human genes 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 101150018078 rpe gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003316 rpiA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150100082 sdaA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003830 serC gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101150040618 talB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 101150027981 tdcB gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 101150071019 tktB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 101150103224 virF gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 101150117464 ydiB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150070490 yopH gene Proteins 0.000 description 2
- 101150053119 yopM gene Proteins 0.000 description 2
- 101150100928 yopT gene Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NUGOLIOAJYZDCF-SSDOTTSWSA-N (2S)-2-benzamido-3,3,3-trihydroxypropanoic acid Chemical compound OC([C@H](NC(C1=CC=CC=C1)=O)C(=O)O)(O)O NUGOLIOAJYZDCF-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- KGMROVDTWHJSIM-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-hydrazinyl-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NN)C(O)=O KGMROVDTWHJSIM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- YYMCVDNIIFNDJK-XFQWXJFMSA-N (z)-1-(3-fluorophenyl)-n-[(z)-(3-fluorophenyl)methylideneamino]methanimine Chemical compound FC1=CC=CC(\C=N/N=C\C=2C=C(F)C=CC=2)=C1 YYMCVDNIIFNDJK-XFQWXJFMSA-N 0.000 description 1
- NMDWGEGFJUBKLB-UHFFFAOYSA-M 2-acetyllactate Chemical compound CC(=O)C(C)(O)C([O-])=O NMDWGEGFJUBKLB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZYPXWYPUWAXTQR-JOBJLJCHSA-N 2-hydroxy-4-[3-[hydroxy-[(e)-oct-2-enoyl]amino]propylamino]-2-[2-[3-[hydroxy-[(e)-oct-2-enoyl]amino]propylamino]-2-oxoethyl]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCCC\C=C\C(=O)N(O)CCCNC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(=O)NCCCN(O)C(=O)\C=C\CCCCC ZYPXWYPUWAXTQR-JOBJLJCHSA-N 0.000 description 1
- 101710181773 3-isopropylmalate dehydratase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710175998 3-isopropylmalate dehydratase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010075604 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000011848 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710119938 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- FCWIGDCVHNNXFS-UHFFFAOYSA-N Acinetobactin Natural products CC1OC(=NC1C(=O)N(O)CCc2c[nH]cn2)c3cccc(O)c3O FCWIGDCVHNNXFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 241000173529 Aconitum napellus Species 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 description 1
- 241000607574 Aeromonas veronii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108010032178 Amino-acid N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007610 Amino-acid N-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000337032 Anaeromyxobacter dehalogenans Species 0.000 description 1
- 102100027153 Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain-containing protein 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710149294 Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain-containing protein 1B Proteins 0.000 description 1
- 101710127675 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 102100029647 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Human genes 0.000 description 1
- 102100040124 Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101100127674 Arabidopsis thaliana LAZY4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000370685 Arge Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 102100035730 B-cell receptor-associated protein 31 Human genes 0.000 description 1
- 101710113110 B-cell receptor-associated protein 31 Proteins 0.000 description 1
- 102100027955 BAG family molecular chaperone regulator 4 Human genes 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100076641 Bacillus subtilis (strain 168) metE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 description 1
- 101000971127 Bartonella henselae Autotransporter adhesin BadA Proteins 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 101150010922 Bmf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 1
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 1
- 241000371430 Burkholderia cenocepacia Species 0.000 description 1
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 1
- 241000722910 Burkholderia mallei Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 101100339117 Campylobacter jejuni subsp. jejuni serotype O:2 (strain ATCC 700819 / NCTC 11168) hisF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032137 Cell death activator CIDE-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100032141 Cell death activator CIDE-A Human genes 0.000 description 1
- 241001647373 Chlamydia abortus Species 0.000 description 1
- 241001647367 Chlamydia muridarum Species 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 101000709520 Chlamydia trachomatis serovar L2 (strain 434/Bu / ATCC VR-902B) Atypical response regulator protein ChxR Proteins 0.000 description 1
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- 241000949031 Citrobacter rodentium Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101150118364 Crkl gene Proteins 0.000 description 1
- 241001135265 Cronobacter sakazakii Species 0.000 description 1
- 101710170530 Cysteine synthase A Proteins 0.000 description 1
- 101150077031 DAXX gene Proteins 0.000 description 1
- 101710182628 DNA fragmentation factor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000605716 Desulfovibrio Species 0.000 description 1
- 241000605762 Desulfovibrio vulgaris Species 0.000 description 1
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 1
- 102100023332 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000939628 Endozoicomonas elysicola Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108010061075 Enterobactin Proteins 0.000 description 1
- SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N Enterobactin Natural products OC1=CC=CC(C(=O)NC2C(OCC(C(=O)OCC(C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001240954 Escherichia albertii Species 0.000 description 1
- 101100075914 Escherichia coli (strain K12) malY gene Proteins 0.000 description 1
- 101000735419 Escherichia coli Pap fimbrial major pilin protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588720 Escherichia fergusonii Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- TZXKOCQBRNJULO-UHFFFAOYSA-N Ferriprox Chemical compound CC1=C(O)C(=O)C=CN1C TZXKOCQBRNJULO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220485781 GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1_S397D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 108091016565 Histidine biosynthesis proteins Proteins 0.000 description 1
- 108050003783 Histidinol-phosphate aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000890622 Homo sapiens Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000697866 Homo sapiens BAG family molecular chaperone regulator 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000914211 Homo sapiens CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Proteins 0.000 description 1
- 101100220364 Homo sapiens CGAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101000775558 Homo sapiens Cell death activator CIDE-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000775570 Homo sapiens Cell death activator CIDE-A Proteins 0.000 description 1
- 101000643956 Homo sapiens Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000950906 Homo sapiens DNA fragmentation factor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000624594 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001001420 Homo sapiens Interferon gamma receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599613 Homo sapiens Interferon lambda receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000844245 Homo sapiens Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Proteins 0.000 description 1
- 101000605630 Homo sapiens Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001099199 Homo sapiens RalA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001089266 Homo sapiens Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000669917 Homo sapiens Rho-associated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000997832 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 description 1
- 101150085950 IL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 1
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035678 Interferon gamma receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037971 Interferon lambda receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 101710167241 Intimin Proteins 0.000 description 1
- 102000001702 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010068964 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710198693 Invasin Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710151482 Ketol-acid reductoisomerase (NADP(+)) Proteins 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 1
- 101710191666 Lactadherin Proteins 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001148567 Lawsonia intracellularis Species 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710164436 Listeriolysin O Proteins 0.000 description 1
- 241001424413 Lucia Species 0.000 description 1
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100123410 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) hacA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150101095 Mmp12 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100286559 Mus musculus Ifih1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101100072787 Mus musculus Irf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000978489 Mus musculus Mitochondrial antiviral-signaling protein Proteins 0.000 description 1
- 101100476480 Mus musculus S100a8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710156256 Myosin phosphatase Rho-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 description 1
- 102100032028 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710138316 O-acetylserine sulfhydrylase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 101150074164 PMAIP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102100038329 Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3 Human genes 0.000 description 1
- 241001517016 Photobacterium damselae Species 0.000 description 1
- 241001148062 Photorhabdus Species 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000881813 Pluralibacter gergoviae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035548 Protein Bop Human genes 0.000 description 1
- 108050008794 Protein Bop Proteins 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108010052646 Protein Translocation Systems Proteins 0.000 description 1
- 102000018819 Protein Translocation Systems Human genes 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241001076189 Proteus hauseri Species 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 241001472782 Proteus penneri Species 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000576783 Providencia alcalifaciens Species 0.000 description 1
- 241001206365 Pseudoalteromonas spongiae Species 0.000 description 1
- 241000947836 Pseudomonadaceae Species 0.000 description 1
- 101000911722 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Type 3 secretion system pilotin Proteins 0.000 description 1
- 241001223182 Pseudomonas plecoglossicida Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 102100039313 Rho-associated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108030006650 S-ribosylhomocysteine lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010048516 S-sulfocysteine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000005886 STAT4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010019992 STAT4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- 101100181662 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) leuC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056836 Sctr gene Proteins 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100021225 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Human genes 0.000 description 1
- 102100021117 Serine protease HTRA2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710146118 Serine protease HTRA2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000607766 Shigella boydii Species 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 101100022900 Shigella flexneri merE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 241000607758 Shigella sp. Species 0.000 description 1
- 241000588717 Shimwellia blattae Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 241001660101 Sodalis Species 0.000 description 1
- 241000894536 Sodalis glossinidius Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010087999 Steryl-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 description 1
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 description 1
- 241000674191 Vibrio azureus Species 0.000 description 1
- 241001378166 Vibrio caribbeanicus Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 241001552442 Vibrio tasmaniensis Species 0.000 description 1
- 241001148039 Vibrio tubiashii Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000520892 Xanthomonas axonopodis Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 241000589652 Xanthomonas oryzae Species 0.000 description 1
- 101000909800 Xenopus laevis Probable N-acetyltransferase camello Proteins 0.000 description 1
- 108700026426 Yersinia LcrV Proteins 0.000 description 1
- 108700002637 Yersinia YopB Proteins 0.000 description 1
- 108700002633 Yersinia YopD Proteins 0.000 description 1
- 101100398739 Yersinia pestis lcrH gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150057540 aar gene Proteins 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940023019 aconite Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- OZZLZFXDNDCIOU-RYUDHWBXSA-N alcaligin Chemical compound O[C@H]1CCN(O)C(=O)CCC(=O)NC[C@@H](O)CCN(O)C(=O)CCC(=O)NC1 OZZLZFXDNDCIOU-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940092524 bartonella henselae Drugs 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229940074375 burkholderia mallei Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-L catecholate(2-) Chemical compound [O-]C1=CC=CC=C1[O-] YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- HJWLJNBZVZDLAQ-HAQNSBGRSA-N chembl2103874 Chemical compound C1C[C@@H](CS(=O)(=O)NC)CC[C@@H]1N(C)C1=NC=NC2=C1C=CN2 HJWLJNBZVZDLAQ-HAQNSBGRSA-N 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112941 cysK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001489 deferasirox Drugs 0.000 description 1
- BOFQWVMAQOTZIW-UHFFFAOYSA-N deferasirox Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1N1C(C=2C(=CC=CC=2)O)=NC(C=2C(=CC=CC=2)O)=N1 BOFQWVMAQOTZIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMSOAWSKCWYLBB-VBGLAJCLSA-N deferasirox Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1N(N\C(N\1)=C\2C(C=CC=C/2)=O)C/1=C\1C(=O)C=CC=C/1 FMSOAWSKCWYLBB-VBGLAJCLSA-N 0.000 description 1
- 229960003266 deferiprone Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N enterobactin Chemical compound OC1=CC=CC(C(=O)N[C@@H]2C(OC[C@@H](C(=O)OC[C@@H](C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024583 exjade Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 101150050908 hisA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107671 hisB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096813 hisF gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000017776 integrin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108060004057 integrin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 101150081723 leuC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 101150078797 luxS gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 101150117293 metC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108178 metE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 101150077403 priA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 1
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000025160 regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220067564 rs150895887 Human genes 0.000 description 1
- 108700027015 salmochelin Proteins 0.000 description 1
- 101150047761 sdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000014794 superficial urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 101150109177 sycT gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- LLMKLMMXMOTPRU-YOAXHERRSA-N vibriobactin Chemical compound O=C([C@@H]1N=C(O[C@H]1C)C=1C(=C(O)C=CC=1)O)NCCCN(C(=O)[C@@H]1[C@H](OC(=N1)C=1C(=C(O)C=CC=1)O)C)CCCNC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O LLMKLMMXMOTPRU-YOAXHERRSA-N 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070603 yadA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150083280 yopB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150088864 yopD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049608 yopQ gene Proteins 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммам бактерий и их применению в способе лечения рака у субъекта.The invention relates to recombinant virulence-attenuated gram-negative strains of bacteria and their use in a method for treating cancer in a subject.
Уровень техникиState of the art
Бактерии используют различные механизмы для прямого впрыскивания белков в клетки-мишени1. Система секреции III типа (type III secretion system, T3SS), используемая такими бактериями, как Yersinia, Shigella и Salmonella2, функционирует подобно наношприцу, который инъецирует так называемые бактериальные эффекторные белки в клетки-хозяева.Bacteria use various mechanisms to directly inject proteins into target cells 1 . The type III secretion system (T3SS), used by bacteria such as Yersinia, Shigella and Salmonella 2 , functions like a nanosyringe that injects so-called bacterial effector proteins into host cells.
T3S использовалась для доставки гибридных пептидов и белков в клетки-мишени. Гетерологичные эффекторы бактериальной T3SS доставлялись в случае, когда исследуемая бактерия являлась трудноподдающейся воздействию генетических средств (такая как Chlamydia trachomatis). Часто репортерные белки сливали с предполагаемыми сигналами секреции T3SS в зависимости от требований исследования для T3SS-зависимой доставки белков, таких как аденилатциклаза Bordetella pertussis, ДГФР (дигидрофолатредуктаза) мыши или поддающаяся фосфорилированию метка. Доставку пептидов, главным образом, проводили с целью вакцинации. Пептиды включали вирусные эпитопы, бактериальные эпитопы (листериолизин О), а также пептиды, представляющие эпитопы раковых клеток человека. В нескольких случаях функциональные эукариотические белки доставляли для модулирования клетки-хозяина, которое осуществляли с помощью нанотел3, ядерных белков (рекомбиназы Cre, MyoD) 45 или Il10 и IL1ra6. Ни одна из вышеупомянутых систем не позволяет осуществлять доставку единичных белков, поскольку в каждом случае при этом кодируются один или множество эндогенных эффекторных белков. Более того, применяемые векторы были сконструированы способом, не позволяющим осуществлять простое клонирование других фрагментов ДНК, кодирующих предпочтительные белки, что препятствует широкому применению системы.T3S has been used to deliver hybrid peptides and proteins to target cells. Heterologous bacterial T3SS effectors were delivered when the bacterium of interest was refractory to genetic targeting (such as Chlamydia trachomatis). Often, reporter proteins were fused to putative T3SS secretion signals depending on the study requirements for T3SS-dependent delivery of proteins such as Bordetella pertussis adenylate cyclase, mouse DHFR (dihydrofolate reductase), or a phosphorylatable tag. Peptide delivery has mainly been carried out for the purpose of vaccination. Peptides included viral epitopes, bacterial epitopes (listeriolysin O), and peptides representing human cancer cell epitopes. In several cases, functional eukaryotic proteins have been delivered for host cell modulation, which has been accomplished using nanobodies 3 , nuclear proteins (Cre recombinase, MyoD) 45 or Il10 and IL1ra 6 . None of the above systems allows delivery of single proteins, since in each case one or multiple endogenous effector proteins are encoded. Moreover, the vectors used were constructed in a manner that does not allow easy cloning of other DNA fragments encoding preferred proteins, preventing widespread use of the system.
Подходы, обеспечивающие адресную доставку лекарственных средств, представляют большой интерес. Например, применяют антитела, распознающие структуры поверхности опухолевых клеток и, в оптимальном случае, селективно связывающиеся с опухолевыми клетками. Для улучшения механизма действия таких антител их можно конъюгировать с терапевтическими средствами или с липидными везикулами, наполненными лекарственными средствами. Одной из проблем при применении таких везикул является надлежащее высвобождение активного компонента. Еще более сложной является доставка терапевтических белков или пептидов, в особенности, при нацеливании на внутриклеточные механизмы. Было испробовано множество альтернативных способов решения данной проблемы доставки терапевтических белков в эукариотические клетки, которые включают проникающие в клетку пептиды (cell penetrating peptides, CPP) или подобные технологии, а также различные способы на основе наночастиц. Все из данных технологий характеризуются недостатками - низкой эффективностью и тем, что груз, поглощенный клеткой посредством эндоцитоза, вероятно, в итоге будет расщеплен в лизосомах. Более того, конфликт между необходимостью обеспечения стабильности транспортирующего груз средства в организме человека и потребностью его дестабилизации и высвобождения в клетке-мишени представляет собой проблему, характерную для таких технологий.Approaches that provide targeted drug delivery are of great interest. For example, antibodies are used that recognize the surface structures of tumor cells and, optimally, selectively bind to tumor cells. To improve the mechanism of action of such antibodies, they can be conjugated to therapeutic agents or to lipid vesicles loaded with drugs. One of the problems with the use of such vesicles is the proper release of the active component. Even more challenging is the delivery of therapeutic proteins or peptides, particularly when targeting intracellular mechanisms. Many alternative methods have been tried to solve this problem of delivering therapeutic proteins to eukaryotic cells, which include cell penetrating peptides (CPP) or similar technologies, as well as various nanoparticle-based methods. All of these technologies have the disadvantages of low efficiency and the fact that cargo taken up by the cell through endocytosis is likely to eventually be broken down in lysosomes. Moreover, the conflict between the need to ensure stability of the cargo transporter in the human body and the need to destabilize and release it in the target cell is a problem inherent in such technologies.
Было показано, что множество бактерий реплицируются в злокачественных солидных опухолях при введении из отдаленного участка, включая Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa и Bifidobacteria. На сегодняшний день в клинической практике применяют только бациллу Кальмета-Герена (БЦЖ, полученную из Mycobacterium bovis). БЦЖ вводят для лечения поверхностного рака мочевого пузыря, хотя лежащий в основе молекулярный механизм остается в значительной степени неизвестным. Разработка штаммов бактерий, способных, например, доставлять груз, образованный внутри бактерии, к участку его действия внутри клеток, таких как раковые клетки, т.е. за пределами бактерии, остается важной задачей.A variety of bacteria have been shown to replicate in malignant solid tumors when introduced from a distant site, including Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, and Bifidobacteria. To date, only Bacillus Calmette-Guerin (BCG, derived from Mycobacterium bovis) is used in clinical practice. BCG is administered to treat superficial bladder cancer, although the underlying molecular mechanism remains largely unknown. The development of strains of bacteria that are capable, for example, of delivering a cargo formed inside the bacterium to its site of action inside cells, such as cancer cells, i.e. outside of bacteria remains an important task.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммам бактерий и их применению в способе лечения рака у субъекта. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий и их применение для лечения рака у субъекта, причем рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий обеспечивают транслокацию различных эффекторов III типа, а также эффекторов IV типа, вирусных белков и, что наиболее важно, функциональных эукариотических белков в раковые клетки, например, в клетки злокачественной солидной опухоли. В настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий с повышенными свойствами экспрессии гетерологичного белка и секреции, который неожиданно является способным стабильно кодировать гетерологичный белок в течение нескольких дней или даже недель in vivo.The present invention relates to recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains and their use in a method of treating cancer in a subject. In some embodiments, the present invention provides recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains and their use for treating cancer in a subject, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains provide translocation of various type III effectors, as well as type IV effectors, viral proteins, and that most importantly, functional eukaryotic proteins into cancer cells, such as malignant solid tumor cells. The present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain with enhanced heterologous protein expression and secretion properties, which is surprisingly capable of stably encoding a heterologous protein for several days or even weeks in vivo.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффек- 1 044058 торного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором.In a first aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein wherein a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing the nucleotide sequence, which contains a gene encoding the specified endogenous protein necessary for growth, operably linked to the promoter.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНКсвязывающий белок типа AraC.In a further aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is operatively linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain additionally contains modulation in the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН).In a further aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in the induction or regulation of an interferon (IFN) response.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором, для применения в способе лечения рака у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта. Аналогично, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение субъекту рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.In a further aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence, encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is operatively linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding said endogenous protein required for growth operably linked to a promoter, for use in a method of treating cancer in a subject, wherein said method comprises administering to the subject said recombinant virulence-attenuated Gram-negative strain of bacteria, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative strain of bacteria is administered in an amount that is sufficient to treat the subject. Similarly, the present invention relates to a method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding the delivery signal from the bacterial effector protein is operably linked to the promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid, containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding said endogenous protein required for growth, operably linked to a promoter, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
Аналогично, настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором, с целью получения лекарственного средства для лечения рака у субъекта.Similarly, the present invention relates to the use of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains the gene, encoding said endogenous protein required for growth, operably linked to a promoter, for the purpose of producing a medicament for the treatment of cancer in a subject.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке сIn a further aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to
- 2 044058- 2 044058
З'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНКсвязывающий белок типа AraC, для применения в способе лечения рака у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.the 3'-end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further comprises modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the direction 3'-5' from a gene encoding an endogenous DNA-binding protein of the AraC type, for use in a method of treating cancer in a subject, the method comprising administering to the subject said recombinant virulence-attenuated Gram-negative strain of bacteria, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative strain of bacteria is administered in an amount , which is sufficient to treat the subject.
Аналогично, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение субъекту рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении З'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта. Аналогично, настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с З'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении З'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC с целью получения лекарственного средства для лечения рака у субъекта.Similarly, the present invention relates to a method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding the delivery signal from the bacterial effector protein is operatively linked to the promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain additionally contains modulation in the thermosensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous A DNA binding protein of the AraC type, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject. Similarly, the present invention relates to the use of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3'-terminus of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is functionally linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain additionally contains modulation in the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type with the purpose obtaining a medicament for treating cancer from a subject.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному по вирулентности грамотрицательному штамму бактерий, содержащему нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с З'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), для применения в способе лечения рака у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.In a further aspect, the present invention relates to a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3'-terminus of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in the induction or regulation of an interferon (IFN) response, for use in a method of treating cancer in a subject, wherein said method includes administering to the subject said recombinant a virulence-attenuated gram-negative bacterial strain, wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
Аналогично, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение субъекту рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.Similarly, the present invention relates to a method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding a delivery signal from the bacterial effector protein is operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in the induction or regulation of an interferon (IFN) response, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
Аналогично, настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, содержащего нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с З'концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН) с целью получения лекарственного средства для лечения рака у субъекта.Similarly, the present invention relates to the use of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain containing a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' terminus of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, the nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in inducing or regulating an interferon (IFN) response for the purpose of producing a drug for treating cancer in a subject.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий и фармацевтически приемлемый носитель, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентностиIn a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the recombinant virulence-attenuated
- З 044058 грамотрицательный штамм бактерий содержит нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий и фармацевтически приемлемый носитель, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC.- Z 044058 gram-negative bacterial strain contains a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, functionally linked to the promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding said endogenous protein necessary for growth, functionally linked to the promoter. In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain contains a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to a 3' - the end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further comprises modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the 3' direction -5' from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий и фармацевтически приемлемый носитель, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН).In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain contains a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to a 3' -the end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in the induction or regulation of an interferon (IFN) response.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1 - характеристика доставки белков с помощью T3SS. Схематическое представление T3SSзависимой секреции белка в окружающую среду (секреции in vitro) (левая часть) или в эукариотические клетки (правая часть). I: показана система секреции типа 3. II: показаны белки, секретированные в окружающую среду, III - белки, транслоцированные через мембрану в цитозоль эукариотических клеток (VII). VI: показан участок двух бактериальных мембран, в который встроена T3SS, и находящийся ниже бактериальный цитозоль. IV представляет собой слитый белок, присоединенный к N-концевому фрагменту YopE1-138 (V).Fig. 1 - Characteristics of protein delivery using T3SS. Schematic representation of T3SS-dependent protein secretion into the environment (in vitro secretion) (left panel) or into eukaryotic cells (right panel). I: type 3 secretion system is shown. II: proteins secreted into the environment are shown, III - proteins translocated through the membrane into the cytosol of eukaryotic cells (VII). VI: Shows the region of two bacterial membranes in which the T3SS is embedded and the underlying bacterial cytosol. IV is a fusion protein attached to the N-terminal fragment of YopE 1 - 138 (V).
Фиг. 2 - описание набора инструментов для доставки на основе секреции III типа. (А) Векторные карты плазмид для клонирования pBad_Si1 и pBad_Si2, которые применяли для получения слитых конструкций с YopE1_138. Шаперон SycE и слияние YopE1_138 находятся под контролем нативного промотора Y. enterocolitica. Две плазмиды отличаются исключительно наличием индуцибельного арабинозой EGFP (enhanced green fluorescent protein, усиленного зеленого флуоресцентного белка), присутствующего на pBad_Si1 (В) Сайт множественного клонирования расположен непосредственно после фрагмента yopE1_ 138 на плазмидах pBad_Si1 и pBad_Si2.Fig. 2 is a description of the type III secretion based delivery toolkit. ( A) Vector maps of the pBad_Si1 and pBad_Si2 cloning plasmids that were used to generate YopE 1_138 fusion constructs. The SycE chaperone and the YopE 1_138 fusion are under the control of the native Y. enterocolitica promoter. The two plasmids differ solely in the presence of arabinose-inducible EGFP (enhanced green fluorescent protein) present on pBad_Si1 (B) The multiple cloning site is located immediately after the yopE1_ 138 fragment on plasmids pBad_Si1 and pBad_Si2.
Фиг. ЗА-q - штаммы Y. enterocolitica, применявшиеся в данном исследовании. Перечень штаммов Y. enterocolitica, применявшихся в данном исследовании, обеспечивает информацию о фоновых штаммах, плазмидах и белках для T3SS-зависимой доставки на соответствующих плазмидах. Также представлена информация об олигонуклеотидах, применявшихся для конструирования соответствующей плазмиды, о каркасной плазмиде и устойчивости к антибиотикам.Fig. ZA-q - strains of Y. enterocolitica used in this study. The list of Y. enterocolitica strains used in this study provides information on the background strains, plasmids, and proteins for T3SS-dependent delivery on the corresponding plasmids. Information is also provided on the oligonucleotides used to construct the corresponding plasmid, the scaffold plasmid, and antibiotic resistance.
Фиг. 4 - плазмида вирулентности Yersinia enterocolitica W227, pYV. Плазмида вирулентности Yersinia штамма W227 (pYV) размером 69673 п.о. представлена в масштабе. Отмечены эффекторные белки T3SS, точка начала репликации и устойчивость к мышьяку (кодируемая генами arsC, В, R и Н): I: точка начала репликации, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT, VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH, XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, В, R и Н.Fig. 4 - virulence plasmid of Yersinia enterocolitica W227, pYV. Yersinia strain W227 virulence plasmid (pYV) size 69673 bp. presented to scale. Effector proteins T3SS, origin of replication and arsenic resistance (encoded by the arsC, B, R and H genes) are marked: I: origin of replication, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT, VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH, XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, B, R and H.
Фиг. 5 - доставка синтетических увеличенных проапоптотических белков. Доставка единичных синтетических белков, состоящих из однократных или тандемных повторов доменов BH3, полученных из проапоптотических белков t-BID или ВАХ, приводит к усиленной индукции апоптоза в раковых клетках 4Т1 и B16F10. Клетки 4Т1 (I) или B16F10 (II) инфицировали Y. enterocolitica AyopHOPEMT, кодируемым на pBad-MycHisA IV: YopE1-138 - удлиненный домен BH3 tBID, V: YopE1.138-линкер-BH3 tBID, VI: YopE1-138-BH3 tBID, VII: YopEM38-(BH3 tBID)3, VIII: YopE1-138-BH3 tBID - BH3 ВАХ или IX: YopE1i38-BH3 BAX - BH3 tBID. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (множественность заражения, МЗ), проводили для каждого штамма, определяли число клеток и вычисляли IC50 с помощью нелинейной регрессии. Указана МЗ IC50 (III).Fig. 5 - delivery of synthetic increased proapoptotic proteins. Delivery of single synthetic proteins consisting of single or tandem repeats of BH3 domains derived from the proapoptotic proteins t-BID or BAX leads to enhanced induction of apoptosis in 4T1 and B16F10 cancer cells. 4T1 (I) or B16F10 (II) cells were infected with Y. enterocolitica AyopHOPEMT encoded on pBad-MycHisA IV: YopE 1-138 - extended domain BH3 tBID, V: YopE 1 . 138 -linker-BH3 tBID, VI: YopE1-138-BH3 tBID, VII: YopE M 38-(BH3 tBID) 3 , VIII: YopE1-138-BH3 tBID - BH3 CVC or IX: YopE1i38-BH3 BAX - BH3 tBID. Titration of bacteria added to cells (multiplicity of infection, MOI) was performed for each strain, cell number was determined, and IC 50 was calculated using nonlinear regression. MZ IC 50 (III) is indicated.
- 4 044058- 4 044058
Фиг. 6 - индукция апоптоза кодируемыми pYV синтетическими проапоптотическими белками. Доставка однократного или тандемного повтора домена BH3 BID, кодируемого на pYV, приводит к индукции апоптоза в раковых клетках 4Т1 и B16F10. Клетки 4Т1 (I) или B16F10 (II) инфицировали Y. enterocolitica AHOPEMAT+IV: pYV-YopE1.138-BH3-Bid или V:+pYV-YopE1.138-(BH3-Bid)2 или VI: с помощью Y. enterocolitica AHOPEMAT pBad-MycHisA-YopE1_138-(BH3-Bid)2 в течение 3 ч. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (МЗ), проводили для каждого штамма, определяли число клеток и вычисляли IC50 (III) с помощью нелинейной регрессии.Fig. 6 - induction of apoptosis by synthetic proapoptotic proteins encoded by pYV. Delivery of single or tandem repeat domain BH3 BID encoded on pYV results in induction of apoptosis in 4T1 and B16F10 cancer cells. 4T1 (I) or B16F10 (II) cells were infected with Y. enterocolitica AHOPEMAT+IV: pYV-YopE 1 . 138 -BH3-Bid or V:+pYV-YopE 1 . 138 -(BH3-Bid)2 or VI: using Y. enterocolitica AHOPEMAT pBad-MycHisA-YopE 1 _ 138 -(BH3-Bid) 2 for 3 hours. Titration of bacteria added to cells (MH) was carried out for each strain, cell number was determined and IC50 (III) was calculated using nonlinear regression.
Фиг. 7 - колонизация опухоли инъецированным в.в. (внутривенно) Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T на модели аллотрансплантата рака молочной железы 4Т1. Число бактерий в опухолях указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани (III). Подсчет проводили в опухолях в день 8 (I) и 14 (II) после инфекции. Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.Fig. 7 - colonization of the tumor by injected i.v. (intravenous) Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T in a 4T1 breast cancer allograft model. The number of bacteria in tumors is reported as colony-forming units (CFU) per g of tissue (III). Counting was carried out in tumors on days 8 (I) and 14 (II) after infection. Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit.
Фиг. 8 - биораспределение инъецированного в.в. Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т на модели аллотрансплантата рака молочной железы 4Т1. Число бактерий в крови (I), селезенке (II), печени (III), легких (IV) и опухоли (V) указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани или на 1 мл крови (VI). Подсчет проводили в день 14 после инфекции. Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения. * обозначает мышь с обширными метастазами, обнаруженными в легких.Fig. 8 - biodistribution of injected i.v. Y. enterocolitica AuopH,O,P,E,M,T in the 4T1 breast cancer allograft model. The number of bacteria in the blood (I), spleen (II), liver (III), lung (IV) and tumor (V) is indicated as colony-forming units (CFU) per 1 g of tissue or per 1 ml of blood (VI). Counting was performed on day 14 postinfection. Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit. * denotes a mouse with extensive metastases found in the lungs.
Фиг. 9 - задержка прогрессирования опухоли на мышах Balb/C дикого типа с п.к. (подкожным) аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1 в.в. инъецировали I: ФБР (фосфатный буферный раствор) или II: 1χ 107 Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2, когда опухоль достигала размера 150-250 мм3. День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (III; с дня 0 по день 9 после в.в. инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли, нормированный к объему опухоли в день 0, указан (IV) в мм3. Среднее значение указано символами, представленные планки погрешностей демонстрируют стандартную ошибку среднего. Статистическую значимость измеряли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA, * указывает значение р <0,05, ** - значение p<0,005.Fig. 9 - delay in tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. (subcutaneous) allograft of 4T1 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells i.v. injected I: PBS (phosphate buffer solution) or II: 1χ 10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1 -138 (BH3-Bid)2 when the tumor reached a size of 150-250 mm 3 . Day v.v. injection of bacteria was designated as day 0. Tumor volume was measured during the following days (III; day 0 to day 9 after i.v. injection of bacteria) using a caliper. The relative tumor volume normalized to the tumor volume at day 0 is indicated (IV) in mm 3 . The mean is indicated by symbols, and the error bars shown show the standard error of the mean. Statistical significance was measured using two-way ANOVA, * indicates p-value <0.05, ** indicates p-value <0.005.
Фиг. 10 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1 в.в. инъецировали I: ФБР или II: 1х107 Y. enterocolitica dHOPEMT, когда опухоль достигала размера 150-250 мм3. День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (III; с дня 0 по день 9 после в.в. инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли, нормированный к объему опухоли в день 0, указан (IV) в мм3. Среднее значение указано символами, представленные планки погрешностей демонстрируют стандартную ошибку среднего.Fig. 10 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells i.v. injected I: PBS or II: 1x10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT when the tumor reached a size of 150-250 mm 3 . Day v.v. injection of bacteria was designated as day 0. Tumor volume was measured during the following days (III; day 0 to day 9 after i.v. injection of bacteria) using a caliper. The relative tumor volume normalized to the tumor volume at day 0 is indicated (IV) in mm 3 . The mean is indicated by symbols, and the error bars shown show the standard error of the mean.
Фиг. 11 - регуляция секреции на основе T3SS посредством контроля экспрессии главного регулятора VirF. А: Анализ секреции in vitro (проводили при температуре 37°С) со штаммами Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющими YopE1_138-(BH3 tBID)2. Экспрессия VirF находится под контролем его природного промотора (I+II), индуцибельного арабинозой промотора (III+IV) или его природного промотора с делецией области шпильки I, контролирующей зависимую от температуры экспрессию (V). Анализ секреции проводили при отсутствии арабинозы (I, III и V) или в присутствии 0,2% арабинозы (II и IV). Секретированный YopE1_138-(BH3 tBID)2 обнаруживали с применением вестерн-блоттинга с антителом, распознающим область YopE1_138. В: Анализ секреции in vitro (проводили при температуре 37°С) со штаммами Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющими YopE1.138-домены Card RIG1 мыши. Экспрессия VirF находится под контролем его природного промотора (I+II) или его природного промотора с делецией области шпильки I, контролирующей зависимую от температуры экспрессию (III). Анализ секреции проводили при отсутствии арабинозы (I и III) или в присутствии 0,2% арабинозы (II). Секретированные YopE1.138-домены Card RIG1 мыши обнаруживали с применением вестерн-блоттинга с антителом, распознающим область YopE1-138.Fig. 11 - regulation of secretion based on T3SS through control of the expression of the master regulator VirF. A: In vitro secretion assay (performed at 37°C) with Y. enterocolitica AHOPEMAT strains delivering YopE1_ 138 -(BH3 tBID) 2 . Expression of VirF is under the control of its native promoter (I+II), its arabinose-inducible promoter (III+IV), or its native promoter with deletion of the hairpin I region controlling temperature-dependent expression (V). The secretion assay was performed in the absence of arabinose (I, III and V) or in the presence of 0.2% arabinose (II and IV). Secreted YopE1_ 138 -(BH3 tBID) 2 was detected using Western blotting with an antibody recognizing the YopE1_ 138 region. B: In vitro secretion assay (performed at 37°C) with YopE 1 -delivering Y. enterocolitica AHOPEMAT strains. 138 -domains of mouse Card RIG1. Expression of VirF is under the control of its native promoter (I+II) or its native promoter with deletion of the hairpin I region controlling temperature-dependent expression (III). The secretion assay was performed in the absence of arabinose (I and III) or in the presence of 0.2% arabinose (II). Secreted YopE 1 . The 138 -domains of mouse Card RIG1 were detected using Western blotting with an antibody recognizing the YopE 1-138 region.
Фиг. 12 - сравнение роста in vitro. Сравнение роста in vitro для II: Y. enterocolitica AHOPEMAT, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd, IV: Y. Enterocolitica AHOPEMT Aasd+pBAD-MycHisA-asd, V: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBAD-MycHisA-asd (обратная ориентация), VI: Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодирующего YopE1_138-(BH3 tBID)2 на pYV и VII: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1.138-(BH3 tBID)2. Бактерии инокулировали в жидкой культуре и выращивали в течение 3 ч. Затем для всех штаммов определяли ОП600 (оптическую плотность при длине волны 600 нм) (I).Fig. 12 - comparison of in vitro growth. Comparison of in vitro growth for II: Y. enterocolitica AHOPEMAT, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd, IV: Y. Enterocolitica AHOPEMT Aasd+pBAD-MycHisA-asd, V: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBAD-MycHisA-asd (reverse orientation ), VI: Y. enterocolitica AHOPEMAT, encoding YopE1_ 138 -(BH3 tBID)2 on pYV and VII: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1. 138 -(BH3 tBID) 2 . Bacteria were inoculated in liquid culture and grown for 3 hours. OD600 (optical density at 600 nm) was then determined for all strains (I).
Фиг. 13 - колонизация опухоли Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd и стабильность pBad-MycHisA-asd: Мышам C57BL/6 дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток меланомы B16F1O в.в. инъецировали 1x106 Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd. В день 1 (I) или день 4 (II) после в.в. инъекции бактерий кровь (V), селезенку (VI), печень (VII), легкие (VIII) и опухоль (IX) отбирали, гомогенизировали, готовили серийные разведения и высевали на чашках с агаром LB, со- 5 044058 держащих налидиксовую кислоту (и не содержащих ампициллин, -IV), или на чашках с агаром LB с ампициллином (+IV), селективных в отношении pBad-MycHisA-asd. Число бактерий в соответствующих образцах указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани или мл крови (III). Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.Fig. 13 - tumor colonization by Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd and stability of pBad-MycHisA-asd: Wild-type C57BL/6 mice with s.c. allograft of melanoma cells B16F1O i.v. injected with 1x106 Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd. On day 1 (I) or day 4 (II) after i.v. bacterial injections, blood (V), spleen (VI), liver (VII), lung (VIII) and tumor (IX) were collected, homogenized, serial diluted and plated on LB agar plates containing nalidixic acid (and free of ampicillin, -IV), or on LB agar plates with ampicillin (+IV), selective for pBad-MycHisA-asd. The number of bacteria in the corresponding samples is reported as colony-forming units (CFU) per gram of tissue or ml of blood (III). Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit.
Фиг. 14 - колонизация опухоли Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd: Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1 в. в. инъецировали 1х106 Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd. В указанные дни после в.в. инъекции бактерий (I) опухоли отбирали, гомогенизировали, готовили серийные разведения и высевали на чашках с агаром LB, содержащих налидиксовую кислоту. Число бактерий в опухолях указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани (II). Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.Fig. 14 - tumor colonization with Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd: Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells. V. injected with 1x10 6 Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pBad-MycHisA-asd. On the indicated days after i.v. injection of bacteria (I) tumors were selected, homogenized, serial dilutions were prepared, and plated on LB agar plates containing nalidixic acid. The number of bacteria in tumors is reported as colony-forming units (CFU) per g of tissue (II). Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit.
Фиг. 15 - генетическая стабильность pYV: Стабильность нативной pYV или pYV-asd в солидных опухолях in vivo. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1 в.в. инъецировали 1χ107 II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT AhaiipmI-virF+pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2 или IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1.138-(BH3 tBID)2. В день 9 после в.в. инъекции бактерий опухоли отбирали, гомогенизировали, готовили серийные разведения и высевали на чашках с агаром LB, содержащих налидиксовую кислоту. После роста на данных чашках единичные колонии от отдельных мышей переносили на чашки с агаром LB с арсенитом натрия и без него, селективные в отношении pYV. Для каждой мыши указан процент колоний, которые росли на чашках с агаром, содержащих арсенит, к числу колоний, которые росли на чашках, не содержащих арсенит (I: в виде %). 100% обозначает, что все выделенные из солидной опухоли колонии все еще содержат плазмиду pYV.Fig. 15 - genetic stability of pYV: Stability of native pYV or pYV-asd in solid tumors in vivo. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells i.v. injected 1χ10 7 II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT AhaiipmI-virF+pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2 or IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2. On day 9 after i.v. injections of tumor bacteria were selected, homogenized, serial dilutions were prepared, and plated on LB agar plates containing nalidixic acid. After growth on these plates, single colonies from individual mice were transferred to LB agar plates with and without sodium arsenite, selective for pYV. For each mouse, the percentage of colonies that grew on agar plates containing arsenite to the number of colonies that grew on plates not containing arsenite is indicated (I: as a %). 100% means that all colonies isolated from a solid tumor still contain the pYV plasmid.
Фиг. 16 - колонизация опухоли. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1 в.в. инъецировали 1χ107 II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT AhairpinI-virF+pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2 или IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1.138-(BH3 tBID)2. В день 9 после в.в. инъекции бактерий опухоли отбирали, гомогенизировали, готовили серийные разведения и высевали на чашках с агаром LB, содержащих налидиксовую кислоту. Число бактерий в опухолях указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани (I). Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.Fig. 16 - tumor colonization. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells i.v. injected 1χ10 7 II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT AhairpinI-virF+pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2 or IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT Aasd+pYV-asd-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2. On day 9 after i.v. injections of tumor bacteria were selected, homogenized, serial dilutions were prepared, and plated on LB agar plates containing nalidixic acid. The number of bacteria in tumors is reported as colony-forming units (CFU) per g of tissue (I). Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit.
Фиг. 17 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь Rig1. Доставка доменов Card Rig1 человека и мыши приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopEi.i38- домены Card Rig1 человека, III: YopE1.138-домены Card Rig1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (IV: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (V: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE (interferon-stimulated responsive element, интерферон-стимулируемый реагирующий элемент).Fig. 17 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - Rig1 pathway. Delivery of human and mouse Card Rig1 domains results in the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on a pBadMycHisA-derived plasmid II: YopEi.i3 8 - human Card Rig1 domains, III: YopE 1 . 138 -domains of mouse Card Rig1. Titration of bacteria added to the cells (IV: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (V: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54, enhanced by the multimeric ISRE (interferon-stimulated responsive element, interferon-stimulated responsive element).
Фиг. 18 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь Rig1. Доставка доменов Card Rig1 человека приводит к индукции ИФН I типа в ИФНрепортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1_138-MycHis, III: YopE1_138- домен Card Rig1 человека. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (IV: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (V: ОП650), которая находится под контролем промотора IISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 18 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - Rig1 pathway. Delivery of human Card Rig1 domains results in the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE1_ 138 -MycHis, III: YopE1_ 138 - human Card Rig1 domain. Titration of bacteria added to the cells (IV: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (V: OP650), which is under the control of the IISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter. enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 19 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь Rig1: положительный контроль. Положительный контроль в таком же эксперименте, как на фиг. 18, с применением ИФН гамма для стимуляции ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 стимулировали с помощью ИФН гамма мыши. К клеткам добавляли титр ИФН гамма (I: указан в Ед./мл), и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (II: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФНиндуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 19 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using bacterial T3SS - Rig1 pathway: positive control. Positive control in the same experiment as in FIG. 18, using IFN gamma to stimulate the IFN reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were stimulated with mouse IFN gamma. IFN gamma titer (I: indicated in U/ml) was added to the cells, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (II: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter, enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 20 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь Rig1. Доставка кодируемых pYV доменов Card Rig1 мыши приводит к индукции ИФН I типа в линии клеток рака B16F10. Клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на pYV II: YopE1.138-домены Card Rig1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (III: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали посредством добавления супернатанта клеток к репортерной линии клеток ИФН на основании ак- 6 044058 тивности секретированной щелочной фосфатазы (IV: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 20 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - Rig1 pathway. Delivery of pYV-encoded domains of mouse Card Rig1 results in the induction of type I IFN in the B16F10 cancer cell line. B16F10 cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on pYV II: YopE 1 . 138 -domains of mouse Card Rig1. Titration of bacteria added to the cells (III: indicated in the MS) was performed for each strain, and IFN stimulation was assessed by adding cell supernatant to an IFN reporter cell line based on the activity of secreted alkaline phosphatase (IV: OP650), which is found under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 21 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь Rig1. Доставка кодируемых pYV доменов Card Rig1 мыши приводит к индукции ИФН I типа в линии клеток рака 4Т1. Клетки 4Т1 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на pYV II: YopE1.138-домены Card Rig1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (III: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали посредством добавления супернатанта клеток к репортерной линии клеток ИФН на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (IV: ОП650), которая находится под контролем промотора IISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 21 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - Rig1 pathway. Delivery of pYV-encoded Card Rig1 domains to mice results in the induction of type I IFN in the 4T1 cancer cell line. 4T1 cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on pYV II: YopE 1 . 138 -domains of mouse Card Rig1. Titration of bacteria added to the cells (III: specified in the MH) was performed for each strain, and IFN stimulation was assessed by adding cell supernatant to an IFN reporter cell line based on the activity of secreted alkaline phosphatase (IV: OP650), which is under the control of the IISG54 promoter , consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 22 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1_138- WspR P. aeruginosa (с адаптированным доменом стебля). Титрование бактерий, добавленных к клеткам (III: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (IV: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 22 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - STING pathway. Delivery of enzymes that form cyclic dinucleotides leads to the induction of type I IFN in the IFN-reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE1_ 138 - P. aeruginosa WspR (with an adapted stem domain). Titration of the bacteria added to the cells (III: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (IV: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54, enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 23 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F1O. Репортерные клетки B16F10 оставляли необработанными (I) или инфицировали II: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде III: YopE1_138- DncV V. cholerae, IV: YopE1_138- DisAподобный белок В. cereus, V: YopE1_138-cGAS анемона или VI: YopE1_138- MycHis. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VII: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VIII: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 23 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - STING pathway. Delivery of cyclic dinucleotide-forming enzymes leads to the induction of type I IFN in the IFN-reporter cell line B16F1O. B16F10 reporter cells were left untreated (I) or infected with II: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on a pBadMycHisA-derived plasmid III: YopE1_ 138 - V. cholerae DncV, IV: YopE1_ 138 - B. cereus DisA-like protein, V : YopE1_ 138 -cGAS anemone or VI: YopE1_ 138 - MycHis. Titration of the bacteria added to the cells (VII: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VIII: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 24 - Т388-зависимая секреция IRF3 в супернатант культуры. Эксперимент по секреции in vitro I: Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138- BH3 tBID мыши и II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138IRF3 Ser397Asp мыши. Содержание белка в суммарных лизатах бактерий (А) и преципитированных супернатантах культуры (В) анализировали с помощью вестерн-блоттинга с применением антитела против YopE. Представленные цифры указывают молекулярную массу в кДа при соответствующей высоте.Fig. 24 - T388-dependent secretion of IRF3 into the culture supernatant. In vitro secretion experiment I: Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1. 138 - BH3 tBID mouse and II: Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1. 138 Mouse IRF3 Ser397Asp. The protein content of total bacterial lysates (A) and precipitated culture supernatants (B) was analyzed by Western blotting using an anti-YopE antibody. The numbers presented indicate the molecular weight in kDa at the corresponding height.
Фиг. 25 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS в иммунные клетки - путь Rig1 и STING. Доставка доменов Card Rig1 мыши и ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток RAW264.7. Репортерные клетки RAW264.7 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1_138- DncV V. cholerae, III: YopE1_138- DisA-подобный белок В. cereus, IV: YopE1-138- cGAS анемона или V: YopE1_138- домены Card Rigl мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VI: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VII: ОП650), которая находится под контролем промотора IISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 25 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS into immune cells - the Rig1 and STING pathway. Delivery of mouse Card Rig1 domains and cyclic dinucleotide-forming enzymes results in the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line RAW264.7. RAW264.7 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on a pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE1_ 138 - V. cholerae DncV, III: YopE1_ 138 - B. cereus DisA-like protein, IV: YopE1 -138- anemone cGAS or V: YopE1_ 138 - mouse Card Rigl domains. Titration of the bacteria added to the cells (VI: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VII: OP650), which is under the control of the IISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter, enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 26 - колонизация опухоли инъецированными в.в. штаммами Y. enterocolitica на модели аллотрансплантата рака молочной железы B16F10. Мышам C57BL/6 дикого типа с п.к. аллотрансплантатом раковых клеток меланомы B16F10 в.в. инъецировали I: ФБР, II: 1х107 Y. enterocolitica dHOPEMT, III: Y. enterocolitica dHOPEMT+pYV-YopE1_138 - CARD1.246 RIG1 мыши или IV: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1.138 - CARD1.246 RIG1 мыши, когда опухоль достигала размера 100-315 мм3. Число бактерий в опухолях указано в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г ткани (V). Подсчет проводили в опухолях в день 5 или 8 после инфекции. Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.Fig. 26 - colonization of the tumor with injected i.v. strains of Y. enterocolitica in the B16F10 breast cancer allograft model. Wild-type C57BL/6 mice with s.c. allograft of melanoma cancer cells B16F10 i.v. injected I: PBS, II: 1x10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT, III: Y. enterocolitica dHOPEMT+pYV-YopE1_ 138 - CARD1.246 RIG1 mice or IV: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1. 138 - CARD1.246 RIG1 mouse, when the tumor reached a size of 100-315 mm 3 . The number of bacteria in tumors is reported as colony-forming units (CFU) per g of tissue (V). Counting was performed on tumors on days 5 or 8 postinfection. Each dot represents an individual mouse. The horizontal dotted line represents the detection limit.
Фиг. 27 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - RIG1. Доставка доменов CARD RIG1 человека и мыши приводит к индукции ИФН I типа в ИФНрепортерной линии клеток B16F10. Клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1.138-домены CARD1_245 RIG1 человека, III: YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, IV: YopE1.138-домены CARD1.229 RIG1 мыши, V: YopE1.138-домены CARD1-218 RIG1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VI: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VII: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 27 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - RIG1. Delivery of human and mouse RIG1 CARD domains results in the induction of type I IFN in the B16F10 IFN reporter cell line. B16F10 cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 245 human RIG1, III: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 246 mouse RIG1, IV: YopE 1 . 138 -domains CARD1.229 mouse RIG1, V: YopE 1 . 138 -CA domains of mouse RD1-218 RIG1. Titration of bacteria added to the cells (VI: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VII: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
- 7 044058- 7 044058
Фиг. 28 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - RIG1. Доставка доменов CARD RIG1 человека и мыши приводит к индукции ИФН I типа в ИФНрепортерной линии клеток RAW. Репортерные клетки RAW инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1.138-домены CARD1_245 RIG1 человека, III: YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, IV: YopE1.138домены CARD1-229 RIG1 мыши, V: YopE1-138-домены CARD1-218 RIG1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VI: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VII: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 28 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - RIG1. Delivery of human and mouse RIG1 CARD domains results in the induction of type I IFN in the IFN reporter RAW cell line. RAW reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 245 human RIG1, III: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 246 mouse RIG1, IV: YopE 1 . 138 domains CARD1- 229 RIG1 mouse, V: YopE 1-138 domains CARD 1-218 RIG1 mouse. Titration of bacteria added to the cells (VI: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VII: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 29 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь MDA5. Доставка MDA5 мыши приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F1O. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1.138-MDA51.294 мыши, III: YopE1-138- MDA51-231 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (IV: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (V: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 29 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - MDA5 pathway. Delivery of mouse MDA5 results in the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line B16F1O. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 . 138 -MDA5 1 . 294 mice, III: YopE 1 - 138 - MDA51 - 231 mice. Titration of bacteria added to the cells (IV: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (V: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 30 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - MAVS. Доставка CARD MAVS приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, III: YopE1.138-cGAS161.522 человека, IV: YopE1.138-CARD1.100 MAVS человека. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VI: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 30 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - MAVS. Delivery of CARD MAVS results in the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 246 mouse RIG1, III: YopE1. 138 -cGAS 161 . 522 people, IV: YopE1. 138 -CARD1. 100 MAVS person. Titration of bacteria added to the cells (V: indicated in the MS) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VI: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 31 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - MAVS. Доставка CARD MAVS приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток макрофагов RAW. Репортерные клетки макрофагов RAW инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, III: YopE1.138-CGAS161.522 человека, IV: YopE1.138-CARD1.100 MAVS человека. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VI: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФНиндуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 31 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - MAVS. Delivery of CARD MAVS results in the induction of type I IFN in the IFN-reporter macrophage cell line RAW. RAW macrophage reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 246 mouse RIG1, III: YopE1. 138 -CGAS 161 . 522 humans, IV: YopE1.138-CARD1.100 human MAVS. Titration of bacteria added to the cells (V: indicated in the MS) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VI: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter, enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 32 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1-138-cGAS анемона, III: YopE1.138-cGAS60.422 анемона, IV: YopE1.138-cGAS161.522 человека, V: YopE1-138-CdaAioi-273 Listeria, VI: YopE1-138- DncV V. cholerae, VII: YopE1-138-DisAподобный белок В. cereus. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VIII: обозначено как МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (IX: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 32 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - STING pathway. Delivery of cyclic dinucleotide-forming enzymes leads to the induction of type I IFN in the IFN-reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 - 138 -cGAS anemone, III: YopE 1 . 138 -cGAS 60 . 422 anemones, IV: YopE 1 . 138 -cGAS 161 .5 22 humans, V: YopE1-138-CdaAioi-273 Listeria, VI: YopE1-138- DncV V. cholerae, VII: YopE1-138-DisA-like protein B. cereus. Titration of bacteria added to cells (VIII: designated as M3) was performed for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (IX: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 33 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - путь STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток макрофагов RAW. Репортерные клетки макрофагов RAW инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1-138-cGAS анемона, III: YopE1.138-cGAS60.422 анемона, IV: YopE1.138-cGAS161.522 человека, V: YopE1.138-CdaA101.273 Listeria, VI: YopE1-138- DncV V. cholerae, VII: YopE1.138-DisA-подобный белок В. cereus. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VIII: обозначено как МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (IX: ОП650), которая находится под контролем промотора IISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 33 - delivery of proteins that induce a type I interferon response using the bacterial T3SS - STING pathway. Delivery of cyclic dinucleotide-forming enzymes leads to the induction of type I IFN in the IFN-reporter macrophage cell line RAW. RAW macrophage reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 - 138 -cGAS anemone, III: YopE 1 . 138 -cGAS 60 . 422 anemones, IV: YopE 1 . 138 -cGAS 161 .5 22 people, V: YopE 1 . 138 -CdaA 101 . 2 7 3 Listeria, VI: YopE 1 - 138 - DncV V. cholerae, VII: YopE 1 . 138 -DisA-like protein of B. cereus. Titration of bacteria added to cells (VIII: designated as M3) was performed for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (IX: OP650), which is under the control of the IISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter. enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 34 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS и сравнение с низкомолекулярными агонистами STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1-138-cGAS анемона, III:Fig. 34 - Delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS and comparison with small molecule STING agonists. Delivery of enzymes that form cyclic dinucleotides leads to the induction of type I IFN in the IFN-reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on a pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE 1 - 138 -cGAS anemone, III:
- 8 044058- 8 044058
YopE1.138-cGAS161.522 человека, IV: YopE1.138-домены CARD1_218 RIG1 мыши. Проводили титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VI: ОП650), которая находится под контролем промотора IISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Human YopE1.138-cGAS161.522, IV: YopE 1 . 138 -domains of mouse CARD1_ 218 RIG1. Titration of bacteria added to the cells (V: indicated in the MH) was carried out, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VI: OP650), which is under the control of the IISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 35 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS и сравнение с низкомолекулярными агонистами STING. Доставка циклического динуклеотида приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток B16F10. Репортерные клетки B16F10 обрабатывали низкомолекулярным агонистом STING 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp). Проводили титрование соединения (I: указано в микромолях), и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (II: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 35 - Delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS and comparison with small molecule STING agonists. Delivery of cyclic dinucleotide leads to the induction of type I IFN in the IFN reporter cell line B16F10. B16F10 reporter cells were treated with the small molecule STING agonist 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp). Titration of the compound (I: indicated in micromoles) was carried out, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (II: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 36 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS и сравнение с низкомолекулярными агонистами STING. Доставка ферментов, образующих циклические динуклеотиды, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток RAW. Репортерные клетки RAW инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде II: YopE1_138-cGAS анемона, III: YopE1_138cGAS161-522 человека, IV: YopE1.138-домены CARD1.218 RIG1 мыши). Проводили титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (VI: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 36 - Delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS and comparison with small molecule STING agonists. Delivery of cyclic dinucleotide-forming enzymes leads to the induction of type I IFN in the IFN reporter RAW cell line. RAW reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid II: YopE1_ 138 -cGAS anemone, III: YopE1_ 138 cGAS 161 - 522 human, IV: YopE 1 . 138 CARD1 domains. 218 RIG1 mouse). Titration of bacteria added to the cells (V: indicated in the MH) was carried out, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (VI: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter, enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 37 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS и сравнение с низкомолекулярными агонистами STING. Доставка циклического динуклеотида приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток RAW. Репортерные клетки RAW обрабатывали низкомолекулярным агонистом STING 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp). Проводили титрование соединения (I: указано в микромолях), и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной щелочной фосфатазы (II: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 37 - Delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS and comparison with small molecule STING agonists. Delivery of cyclic dinucleotide leads to the induction of type I IFN in the IFN reporter RAW cell line. RAW reporter cells were treated with the small molecule STING agonist 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp). Titration of the compound (I: indicated in micromoles) was carried out, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted alkaline phosphatase (II: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 38 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS и доказательство зависимости от T3SS-RIG1 и MAVS. Доставка доменов CARD RIG1 или CARD MAVS, слитых с YopE1-138, приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной линии клеток RAW, которая является строго T3SS-зависимой. Репортерные клетки RAW инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT, или II: Y. enterocolitica AHOPEMAT- yopB, или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде III: YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, V: YopE1_138CARD1_100 MAVS человека, или Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде IV: YopE1_138-домены CARD1_246 RIG1 мыши, VI: YopE1_138-CARD1_100 MAVS человека. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (VII: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности секретированной люциферазы Lucia (VIII: ОП650), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Fig. 38 - Delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS and evidence of dependence on T3SS-RIG1 and MAVS. Delivery of CARD RIG1 or CARD MAVS domains fused to YopE1-138 results in the induction of type I IFN in the IFN-reporter cell line RAW, which is strictly T3SS-dependent. RAW reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT, or II: Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid III: YopE 1 . 138 -domains of mouse CARD1_ 246 RIG1, V: YopE1_ 138 CARD1_ 100 human MAVS, or Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, encoded on a plasmid derived from pBadMycHisA IV: YopE 1_ 138 -domains of mouse CARD1_ 246 RIG1, VI: YopE1_ 138 -C ARD1_ 100 MAVS person. Titration of the bacteria added to the cells (VII: indicated in the MH) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on the activity of secreted Lucia luciferase (VIII: OP650), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of the IFN-inducible promoter ISG54 enhanced by a multimeric ISRE.
Фиг. 39 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS в неочищенной смеси клеток из изолята опухоли - RIG1. Доставка доменов CARD RIG1, слитых с YopE1-138, приводит к индукции ИФН I типа в неочищенном изоляте опухоли. Мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 умерщвляли, когда опухоль достигала объема >200 мм3. Опухоли растирали, расщепляли и высевали в виде суспензии отдельных клеток на 24-луночных планшетах. Такие клетки от двух различных опухолей инфицировали I и III: Y. enterocolitica AHOPEMAT или II и IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1_138-домены CARD1_246 RIG1 мыши. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали с применением ELISA для интерферона бета (VI: пикограмм/миллилитр). Пунктирные линии обозначают соответствующие необработанные опухоли, I/II и III/IV каждый представляют собой клетки, полученные из одной и той же опухоли.Fig. 39 - delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS in a crude mixture of cells from a tumor isolate - RIG1. Delivery of RIG1 CARD domains fused to YopE1-138 results in the induction of type I IFN in a crude tumor isolate. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft EMT6 breast cancer cells were killed when the tumor reached a volume of >200 mm 3 . Tumors were ground, digested, and plated as a single cell suspension in 24-well plates. Such cells from two different tumors were infected with I and III: Y. enterocolitica AHOPEMAT or II and IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT, encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1_138 -domains CARD1_246 RIG1 of the mouse. Titration of bacteria added to the cells (V: indicated in the MoH) was performed for each strain, and IFN stimulation was assessed using an interferon beta ELISA (VI: picogram/milliliter). Dashed lines represent the corresponding untreated tumors, I/II and III/IV each representing cells derived from the same tumor.
Фиг. 40 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 внутриопухолево инъецировали ФБР, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День первой внутриопухолевой инъекции ФБР обозначали как день 0, лечение проводили в д0, д1, д5, д6, д10 и д11. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (I: с дня -11 по день 80 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли (объем опухоли в соответствующий день, разделенный на объем опухоли в д0) в мм3 показан в виде логарифмически (log-2) преобразованных данных (II) для каждой мыши.Fig. 40 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. Allograft EMT6 breast cancer cells were injected intratumorally with PBS when the tumor reached a size of 60–130 mm 3 . The day of the first intratumoral injection of PBS was designated as day 0, and treatment was performed on d0, d1, d5, d6, d10, and d11. Tumor volume was measured over the following days (I: day −11 to day 80 after the first bacterial injection) using a caliper. Relative tumor volume (tumor volume on the corresponding day divided by tumor volume in d0) in mm 3 is shown as log-2 transformed data (II) for each mouse.
Фиг. 41 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молоч- 9 044058 ной железы ЕМТ6 внутриопухолево инъецировали 7,5х107 Y. enterocolitica dHOPEMT, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День первой внутриопухолевой инъекции бактерий обозначали как день 0, лечение проводили в д0, д1, д5, д6, д10 и д11. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (I: с дня -11 по день 80 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли (объем опухоли в соответствующий день, разделенный на объем опухоли в д0) в мм3 показан в виде логарифмически (log-2) преобразованных данных (II) для каждой мыши.Fig. 41 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. 9 044058 EMT6 breast cancer cell allograft was injected intratumorally with 7.5x10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT when the tumor reached a size of 60-130 mm 3 . The day of the first intratumoral bacterial injection was designated as day 0, and treatment was performed on d0, d1, d5, d6, d10, and d11. Tumor volume was measured over the following days (I: day −11 to day 80 after the first bacterial injection) using a caliper. Relative tumor volume (tumor volume on the corresponding day divided by tumor volume in d0) in mm 3 is shown as log-2 transformed data (II) for each mouse.
Фиг. 42 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 внутриопухолево инъецировали 7,5х107 Y. enterocolitica dHOPEMT, кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-домены CARD1.246 RIG1 мыши, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День первой внутриопухолевой инъекции бактерий обозначали как день 0, лечение проводили в д0, д1, д5, д6, д10 и д11. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (I: с дня -11 по день 80 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли (объем опухоли в соответствующий день, разделенный на объем опухоли в д0) в мм3 показан в виде логарифмически (log-2) преобразованных данных (II) для каждой мыши.Fig. 42 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. An allograft of EMT6 breast cancer cells was intratumorally injected with 7.5x10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT, encoded on the pBadMycHisA-derived YopE 1 plasmid. 138 CARD1 domains. 2 4 6 RIG1 mice when the tumor reached a size of 60-130 mm 3 . The day of the first intratumoral bacterial injection was designated day 0, and treatment was performed on d0, d1, d5, d6, d10, and d11. Tumor volume was measured over the following days (I: day −11 to day 80 after the first bacterial injection) using a caliper. Relative tumor volume (tumor volume on the corresponding day divided by tumor volume in d0) in mm 3 is shown as log-2 transformed data (II) for each mouse.
Фиг. 43 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 внутриопухолево инъецировали 7,5х107 Y. enterocolitica dHOPEMT, кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-cGAS161.522 человека, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День первой внутриопухолевой инъекции бактерий обозначали как день 0, лечение проводили в д0, д1, д5, д6, д10 и д11. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (I: с дня -11 по день 80 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Относительный объем опухоли (объем опухоли в соответствующий день, разделенный на объем опухоли в д0) в мм3 показан в виде логарифмически (log-2) преобразованных данных (II) для каждой мыши.Fig. 43 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. An allograft of EMT6 breast cancer cells was intratumorally injected with 7.5x10 7 Y. enterocolitica dHOPEMT encoded on the human pBadMycHisA-derived plasmid YopE1.138-cGAS161.522 when the tumor reached a size of 60-130 mm 3 . The day of the first intratumoral bacterial injection was designated as day 0, and treatment was performed on d0, d1, d5, d6, d10, and d11. Tumor volume was measured over the following days (I: day −11 to day 80 after the first bacterial injection) using a caliper. Relative tumor volume (tumor volume on the corresponding day divided by tumor volume in d0) in mm 3 is shown as log-2 transformed data (II) for each mouse.
Фиг. 44 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с повторной антигенной стимуляцией п.к. на противоположной стороне клетками рака молочной железы ЕМТ6 после первой полной ремиссии. Мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 лечили, как описано выше (фиг. 40-43), внутриопухолево 7,5х 107II: Y. enterocolitica dHOPEMT, кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши, Ш: Y. enterocolitica dHOPEMT, кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-cGAS161.522 человека, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День внутриопухолевой инъекции бактерий обозначали как день 0. Мышам с полной регрессией опухоли (или I: мышам, ранее не использованным в экспериментах, в качестве контроля) на противоположную сторону вводили п.к. аллотрансплантат клеток рака молочной железы ЕМТ6. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (IV: вплоть до дня 80 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Указан абсолютный объем опухоли (V) в мм3 для каждой мыши.Fig. 44 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with repeated antigen stimulation s.c. on the opposite side with EMT6 breast cancer cells after the first complete remission. Wild-type Balb/C mice with s.c. Allograft EMT6 breast cancer cells were treated as described above (FIGS. 40-43), intratumorally with 7.5x10 7 II: Y. enterocolitica dHOPEMT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1 . 138 -domains of mouse CARD1-246 RIG1, W: Y. enterocolitica dHOPEMT, encoded on the YopE 1 plasmid derived from pBadMycHisA. 138 -cGAS 161 . 522 people when the tumor reached a size of 60-130 mm 3 . The day of intratumoral bacterial injection was designated as day 0. Mice with complete tumor regression (or I: naïve mice as controls) were injected s.c. on the contralateral side. EMT6 breast cancer cell allograft. Tumor volume was measured over the following days (IV: up to day 80 after the first bacterial injection) using a caliper. The absolute tumor volume (V) in mm 3 for each mouse is indicated.
Фиг. 45 - прогрессирование опухоли у мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 в.в. инъецировали I: ФБР или 5х106 II: Y. enterocolitica dHOPEMT, III: Y. enterocolitica dHOPEMT pYV-YopE1-138-(BH3 tBID)2, IV: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF pYV-YopE1-138(BH3 tBID)2, V: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF Aasd pYV-asd-YopE1.138-(BH3 tBID)2, когда опухоль достигала размера 80-250 мм3. День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0, все мыши получали и.п. (интраперитонеально) Десферал в д-1. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (VI: с дня 0 по день 15 после первой инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Указана медиана объема опухоли (VII) в мм3.Fig. 45 - tumor progression in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of breast cancer cells EMT6 i.v. injected I: PBS or 5x10 6 II: Y. enterocolitica dHOPEMT, III: Y. enterocolitica dHOPEMT pYV-YopE1-138-(BH3 tBID)2, IV: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF pYV-YopE1-1 38 (BH3 tBID )2, V: Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF Aasd pYV-asd-YopE 1 . 138 -(BH3 tBID)2, when the tumor reached a size of 80-250 mm 3 . Day v.v. bacterial injections were designated as day 0, all mice received i.p. (intraperitoneal) Desferal in d-1. Tumor volume was measured over the following days (VI: day 0 to day 15 after the first bacterial injection) using a caliper. The median tumor volume (VII) in mm 3 is indicated.
Фиг. 46 - прогрессирование опухоли у мышей C57BL/6 дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток меланомы B16F10. Мышам C57BL/6 дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток меланомы B16F10 внутриопухолево инъецировали I: ФБР или 7,5х107 II: Y. enterocolitica dHOPEMT, III: кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши, IV: Y. enterocolitica dHOPEMT, кодируемого на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-cGAS161.522 человека, когда опухоль достигала размера 60-130 мм3. День первой внутриопухолевой инъекции бактерий обозначали как день 0, лечение проводили в д0, д1, д2, д3, д6 и д9. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (V: дни) с помощью штангенциркуля. Указан средний объем опухоли (VI) в мм3.Fig. 46 - tumor progression in wild-type C57BL/6 mice with s.c. allograft of B16F10 melanoma cells. Wild-type C57BL/6 mice with s.c. allograft B16F10 melanoma cells were injected intratumorally with I: PBS or 7.5x10 7 II: Y. enterocolitica dHOPEMT, III: encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1 . 138 -domains CARD1-246 of mouse RIG1, IV: Y. enterocolitica dHOPEMT, encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1 . 138 -cGAS 161 . 522 people when the tumor reached a size of 60-130 mm 3 . The day of the first intratumoral bacterial injection was designated day 0, and treatment was performed on d0, d1, d2, d3, d6, and d9. Tumor volume was measured over the following days (V: days) using a caliper. The average tumor volume (VI) in mm 3 is indicated.
Фиг. 47 - биораспределение Y. enterocolitica подвид palearctica на модели аллотрансплантата меланомы мыши B16F10: оценка физического внешнего вида. I: Дни, II: доля мышей с оценкой, III: Y. enterocolitica MRS40 ДТ (дикого типа), IV: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Стрелка указывает на день в.в. инъекции 2х105 бактерий.Fig. 47 - biodistribution of Y. enterocolitica subsp. palearctica in the B16F10 mouse melanoma allograft model: assessment of physical appearance. I: Days, II: proportion of mice with score, III: Y. enterocolitica MRS40 WT (wild type), IV: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. The arrow points to the day v.v. injections of 2x10 5 bacteria.
Фиг. 48 - биораспределение Y. enterocolitica подвид palearctica на модели аллотрансплантата меланомы мыши B16F10: оценка поведения. I: Дни, II: доля мышей с оценкой, III: Y. enterocolitica MRS40 ДТ, IV: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Стрелка указывает на день в.в. инфекции 2х105 бактерий.Fig. 48 - biodistribution of Y. enterocolitica subsp. palearctica in the B16F10 mouse melanoma allograft model: behavioral assessment. I: Days, II: proportion of mice with score, III: Y. enterocolitica MRS40 WT, IV: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. The arrow points to the day v.v. infections 2x10 5 bacteria.
Фиг. 49 - биораспределение Y. enterocolitica подвид palearctica на модели аллотрансплантата меланомы мыши B16F10: масса тела мышей. Массу тела мышей оценивали ежедневно после в.в. инфекцииFig. 49 - biodistribution of Y. enterocolitica subsp. palearctica in the B16F10 mouse melanoma allograft model: body weight of mice. The body weight of mice was assessed daily after i.v. infections
- 10 044058 бактерий. I: Дни, II: масса тела в граммах, III: Y. enterocolitica MRS40 ДТ, IV: Y. enterocolitica- 10 044058 bacteria. I: Days, II: body weight in grams, III: Y. enterocolitica MRS40 DT, IV: Y. enterocolitica
AyopH,O,P,E,M,T. Стрелка указывает на день в.в. инфекции 2х105 бактерий.AyopH,O,P,E,M,T. The arrow points to the day v.v. infections 2x10 5 bacteria.
Фиг. 50 - биораспределение Y. enterocolitica подвид palearctica на модели аллотрансплантата меланомы мыши B16F10: биораспределение Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Подсчет в органах в указанное время оценивали с помощью гомогенизации органа, серийного разведения и подсчета образованных в результате колониеобразующих единиц (КОЕ). День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0, все мыши получали и.п. Десферал в д-1. I: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T, II: КОЕ на 1 г ткани или мл крови, III: день 1, IV: день 4, V: кровь, VI: селезенка, VII: печень, VIII: легкие, IX: опухоль. * обозначает мышь, у которой отсутствовала видимая опухоль.Fig. 50 - biodistribution of Y. enterocolitica subspecies palearctica in the B16F10 mouse melanoma allograft model: biodistribution of Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Organ counts at the indicated times were assessed by organ homogenization, serial dilution, and enumeration of the resulting colony-forming units (CFU). Day v.v. bacterial injections were designated as day 0, all mice received i.p. Desferal in d-1. I: Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T, II: CFU per 1 g of tissue or ml of blood, III: day 1, IV: day 4, V: blood, VI: spleen, VII: liver, VIII: lungs, IX: tumor. * denotes a mouse that had no visible tumor.
Фиг. 51 - биораспределение Y. enterocolitica подвид palearctica на модели аллотрансплантата меланомы мыши B16F10: биораспределение Y. enterocolitica MRS40 ДТ. Подсчет в органах в указанное время оценивали с помощью гомогенизации органа, серийного разведения и подсчета образованных в результате колониеобразующих единиц (КОЕ). День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0, все мыши получали и.п. Десферал в д-1.1: Y. enterocolitica MRS40 ДТ, II: КОЕ на 1 г ткани или мл крови, III: день 1, IV: день 4, V: кровь, VI: селезенка, VII: печень, VIII: легкие, IX: опухоль.Fig. 51 - biodistribution of Y. enterocolitica subspecies palearctica on the B16F10 mouse melanoma allograft model: biodistribution of Y. enterocolitica MRS40 WT. Organ counts at the indicated times were assessed by organ homogenization, serial dilution, and enumeration of the resulting colony-forming units (CFU). Day v.v. bacterial injections were designated as day 0, all mice received i.p. Desferal in d-1.1: Y. enterocolitica MRS40 WT, II: CFU per 1 g of tissue or ml of blood, III: day 1, IV: day 4, V: blood, VI: spleen, VII: liver, VIII: lungs, IX : tumor.
Фиг. 52 - доставка белков, индуцирующих ответ интерферона I типа, с помощью бактериальной T3SS - MAVS, доставленный с помощью бактериальной T3SS, функционирует независимо от эндогенного MAVS.Fig. 52 - delivery of type I interferon response-inducing proteins by bacterial T3SS - MAVS delivered by bacterial T3SS functions independently of endogenous MAVS.
Доставка CARD MAVS с помощью T3SS приводит к индукции ИФН I типа в ИФН-репортерной (люцифераза) линии клеток макрофагов RAW MAVSKO. Репортерные клетки макрофагов RAW MAVSKO инфицировали I: Y. enterocolitica AHOPEMAT или II: Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1-138-CARD1-100 MAVS человека или IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1-138-CARD1-100 MAVS человека. Титрование бактерий, добавленных к клеткам (V: указано в МЗ), проводили для каждого штамма, и стимуляцию ИФН оценивали на основании активности люциферазы (VI: ОЕЛ - относительные единицы люминесценции), которая находится под контролем промотора I-ISG54, состоящего из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE.Delivery of CARD MAVS by T3SS results in the induction of type I IFN in the IFN-reporter (luciferase) macrophage cell line RAW MAVS KO . RAW MAVS KO macrophage reporter cells were infected with I: Y. enterocolitica AHOPEMAT or II: Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, III: Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1-138 -CARD 1-100 human MAVS or IV: Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB, encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1-138 -CARD 1-100 human MAVS. Titration of bacteria added to cells (V: indicated in the MS) was carried out for each strain, and IFN stimulation was assessed based on luciferase activity (VI: REL - relative luminescence units), which is under the control of the I-ISG54 promoter, consisting of IFN- inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммам бактерий и их применению в способе лечения рака, например, злокачественной солидной опухоли, у субъекта.The present invention relates to recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains and their use in a method of treating cancer, such as a malignant solid tumor, in a subject.
С целью толкования настоящего описания будут применяться следующие определения, и, где это применимо, термины, используемые в единственном числе, будут также включать множественное число, и наоборот. Следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения.For the purpose of interpreting this specification, the following definitions will apply and, where applicable, terms used in the singular will also include the plural and vice versa. It should be understood that the terminology used herein is intended solely to describe specific implementations and is not intended to be limiting.
Термин грамотрицательный штамм бактерий в настоящем документе включает следующие бактерии:The term gram-negative bacterial strain as used herein includes the following bacteria:
Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica и другие Salmonella sp. Shigella flexneri и другие Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis.Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmo atis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum , Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temper ate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica and other Salmonella sp. Shigella flexneri and others Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae , Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis.
Предпочтительными грамотрицательными штаммами бактерий согласно настоящему изобретению являются грамотрицательные штаммы бактерий, которые относятся к семействам Enterobacteriaceae иPreferred gram-negative bacterial strains according to the present invention are gram-negative bacterial strains that belong to the families Enterobacteriaceae and
- 11 044058- 11 044058
Pseudomonadaceae. Грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению обычно используют для доставки гетерологичных белков с помощью бактериальной T3SS в эукариотические клетки in vitro и/или in vivo, предпочтительно, in vivo.Pseudomonadaceae. The gram-negative bacterial strain of the present invention is typically used to deliver heterologous proteins via a bacterial T3SS into eukaryotic cells in vitro and/or in vivo, preferably in vivo.
Термин рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий в настоящем документе обозначает рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, генетически трансформированный нуклеотидной молекулой, такой как вектор. Вирулентность такого рекомбинантного грамотрицательного штамма бактерий обычно аттенуирована в результате делеции бактериальных эффекторных белков, обладающих вирулентной активностью, которые транспортируются одним или несколькими бактериальными белками, которые являются частью аппарата системы секреции. Такие эффекторные белки доставляются аппаратом системы секреции в клетки-хозяева, в которых они проявляют свою вирулентную активность в отношении различных белков хозяина и механизмов клетки. Известно множество различных эффекторных белков, которые транспортируются различными типами систем секреции и демонстрируют широкий репертуар биохимических активностей, модулирующих функции регуляторных молекул хозяина. Вирулентность рекомбинантного грамотрицательного штамма бактерий в настоящем документе может быть дополнительно аттенуирована вследствие отсутствия сидерофора, в норме или иногда продуцируемого грамотрицательным штаммом бактерий, в результате чего штамм не продуцирует сидерофор, например, является дефицитным по продукции сидерофора. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации применяют рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, в котором отсутствует сидерофор, в норме или иногда продуцируемый грамотрицательным штаммом бактерий, в результате чего штамм не продуцирует сидерофор, например, является дефицитным по продукции сидерофора, более предпочтительно, применяют штамм Yersinia, в частности, Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF или Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd, с отсутствием сидерофора, в норме или иногда продуцируемого грамотрицательным штаммом бактерий, в результате чего штамм не продуцирует сидерофор, например, является дефицитным по продукции сидерофора, в частности, является дефицитным по продукции иерсиниябактина. Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, который является дефицитным по продукции иерсиниябактина, был описан в публикации WO02077249 и был депонирован 24-го сентября 2001 г. согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в бельгийских Согласованных коллекциях микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM); данному штамму был присвоен учетный номер LMG Р-21013. Рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, предпочтительно, не продуцирует по меньшей мере один, предпочтительно, по меньшей мере два сидерофора, например, является дефицитным по продукции по меньшей мере одного, предпочтительно, по меньшей мере двух сидерофоров, более предпочтительно, рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий не продуцирует ни одного сидерофора.The term recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain as used herein means a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain that has been genetically transformed with a nucleotide molecule, such as a vector. The virulence of such a recombinant gram-negative bacterial strain is usually attenuated as a result of deletion of bacterial effector proteins having virulence activity, which are transported by one or more bacterial proteins that are part of the secretion system apparatus. Such effector proteins are delivered by the secretion system apparatus to host cells, in which they exhibit their virulence activity against various host proteins and cell mechanisms. Many different effector proteins are known that are transported by different types of secretion systems and exhibit a wide repertoire of biochemical activities that modulate the functions of host regulatory molecules. The virulence of the recombinant gram-negative bacterial strain herein may be further attenuated due to the absence of a siderophore normally or occasionally produced by the gram-negative bacterial strain, such that the strain does not produce a siderophore, eg, is deficient in siderophore production. Thus, in a preferred embodiment, a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is used that lacks the siderophore normally or occasionally produced by the Gram-negative bacterial strain, such that the strain does not produce a siderophore, for example, is deficient in siderophore production, more preferably, is used Yersinia strain, in particular Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF or Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P ,E,M,T Aasd pYV-asd, with the absence of a siderophore, normally or sometimes produced by a gram-negative strain of bacteria, as a result of which the strain does not produce a siderophore, for example, it is deficient in the production of siderophore, in particular, it is deficient in the production of yersiniabactin. Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, which is deficient in the production of yersiniabactin, was described in publication WO02077249 and was deposited on September 24, 2001 under the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure in the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM); this strain was assigned the registration number LMG P-21013. The recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain preferably does not produce at least one, preferably at least two siderophores, for example, is deficient in the production of at least one, preferably at least two siderophores, more preferably, the recombinant attenuated virulence, the Gram-negative bacterial strain does not produce a single siderophore.
Термины сидерофор, сидерофор железа или хелатор железа, которые используются в настоящем документе взаимозаменяемо, обозначают соединения с высокой аффинностью к железу, например, малые соединения с высокой аффинностью к железу.The terms siderophore, iron siderophore, or iron chelator, as used interchangeably herein, refer to compounds with high affinity for iron, eg, small compounds with high affinity for iron.
Сидерофоры грамотрицательных бактерий представляют собой, например, энтеробактин и дигидроксибензоилсерин, синтезируемые Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Serratia (но используемые всеми энтеробактериями), пиовердины, синтезируемые Pseudomonas, вибриобактин, синтезируемый Vibrio, ацинетобактин и ацинетоферрин, синтезируемые Acinetobacter, иерсиниябактин и аэробактин, синтезируемые Yersinia, орнибактин, синтезируемый Burkholderia, сальмохелин, синтезируемый Salmonella, аэробактин, синтезируемый Escherichia, Shigella, Salmonella и Yersinia, алкалигин, синтезируемый Bordetella, бизукаберин, синтезируемый Vibrio.Siderophores of gram-negative bacteria are, for example, enterobactin and dihydroxybenzoylserine, synthesized by Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Serratia (but used by all enterobacteria), pyoverdines, synthesized by Pseudomonas, vibriobactin, synthesized by Vibrio, acinetobactin and acinetoferrin, synthesized by Acinetobacter, yersiniabactin and aerobactin, synthesized by Yersinia, ornibactin synthesized by Burkholderia, salmochelin synthesized by Salmonella, aerobactin synthesized by Escherichia, Shigella, Salmonella and Yersinia, alkaligin synthesized by Bordetella, bizukaberin synthesized by Vibrio.
Сидерофоры включают гидроксамат, катехолат и сидерофоры со смешанными лигандами. На сегодняшний день несколько сидерофоров были одобрены для применения у людей, а именно для лечения перенасыщения железом. Предпочтительными сидерофорами являются дефероксамин (также известный как десферриоксамин В, десфероксамин В, DFO-B, DFOA, DFB или Десферал), десферриоксамин Е, деферазирокс (Эксиджад, Десирокс, Дефриджет, Десифер) и деферипрон (Феррипрокс).Siderophores include hydroxamate, catecholate, and mixed-ligand siderophores. To date, several siderophores have been approved for use in humans, namely for the treatment of iron overload. Preferred siderophores are deferoxamine (also known as desferrioxamine B, desferoxamine B, DFO-B, DFOA, DFB, or Desferal), desferrioxamine E, deferasirox (Exjade, Desirox, Defridget, Desifer), and deferiprone (Ferryprox).
Термин эндогенный белок, необходимый для роста, в настоящем документе обозначает белки рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, без которых грамотрицательный штамм бактерий не может расти. Эндогенные белки, необходимые для роста, представляют собой, например, фермент, необходимый для продукции аминокислоты, фермент, участвующий в биосинтезе пептидогликана, фермент, участвующий в биосинтезе ЛПС (липополисахарида), фермент, участвующий в синтезе нуклеотида, или фактор инициации трансляции.The term endogenous protein essential for growth as used herein refers to proteins from a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain without which the Gram-negative bacterial strain cannot grow. Endogenous proteins required for growth are, for example, an enzyme required for amino acid production, an enzyme involved in peptidoglycan biosynthesis, an enzyme involved in LPS (lipopolysaccharide) biosynthesis, an enzyme involved in nucleotide synthesis, or a translation initiation factor.
Термин фермент, необходимый для продукции аминокислоты, в настоящем документе обозначает ферменты, которые связаны с продукцией аминокислоты рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий и без которых грамотрицательный штамм бактерий не может расти. Ферменты, необходимые для продукции аминокислоты, представляют собой, например,The term amino acid production enzyme as used herein refers to enzymes that are associated with amino acid production of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain and without which the Gram-negative bacterial strain cannot grow. The enzymes required for amino acid production are e.g.
- 12 044058 аспартат-бета-полуальдегид-дегидрогеназу (asd), глутаминсинтетазу (glnA), триптофанил-тРНКсинтетазу (trpS) или серин-гидроксиметил-трансферазу (glyA), или транскетолазу 1 (tktA), транскетолазу 2 (tktB), рибулозофосфат 3-эпимеразу (rpe), рибозо-5-фосфат-изомеразу A (rpiA), трансальдолазу A (talA), трансальдолазу В (talB), фосфорибозилпирофосфатсинтазу (prs), АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), бифункциональный белок биосинтеза гистидина HisIE (hisI), 1-(5-фосфорибозил)-5-[(5фосфорибозиламино)метилиденамино]имидазол-4-карбоксамидизомеразу (hisA), субъединицу HisH имидазолглицеролфосфатсинтазы (hisH), субъединицу HisF имидазолглицеролфосфатсинтазы (hisF), бифункциональный белок биосинтеза гистидина HisB (hisB), гистидинолфосфат-аминотрансферазу (hisC), гистидинолдегидрогеназу (hisD), 3-дегидрохинатсинтазу (aroB), 3-дегидрохинатдегидратазу (aroD), шикиматдегидрогеназу (NADP(+)) (aroE), шикиматкиназу 2 (aroL), шикиматкиназу 1 (aroK), 3-фосфошикимат 1-карбоксивинилтрансферазу (агоА), хоризматсинтазу (агоС), Р-белок (pheA), T-белок (tyrA), аминотрансферазу ароматических аминокислот (tyrB), фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазу (aroG), фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазу (aroH), фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазу (aroF), хинат/шикимат-дегидрогеназу (ydiB), АТФ-зависимый изофермент 6-фосфофруктокиназы 1 (pfkA), АТФ-зависимый изофермент 6-фосфофруктокиназы 2 (pfkB), фруктозо-бисфосфатальдолазу класса 2 (fbaA), фруктозо-бисфосфатальдолазу класса 1 (fbaB), триозофосфат-изомеразу (tpiA), пируваткиназу I (pykF), пируваткиназу II (pykA), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу A (gapA), фосфоглицераткиназу (pgk), 2,3-бисфосфоглицерат-зависимую фосфоглицератмутазу (gpmA), 2,3-бисфосфоглицерат-независимую фосфоглицератмутазу (gpmM/yibO), предполагаемую фосфоглицератмутазу (ytjC/gpmB), енолазу (eno), D-3-фосфоглицератдегидрогеназу (serA), фосфосеринаминотрансферазу (serC), фосфосеринфосфатазу (serB), L-сериндегидратазу I (sdaA), L-сериндегидратазу 2 (sdaB), Lтреониндегидратазу катаболическую (tdcB), L-треониндегидратазу биосинтетическую (ilvA), Lсериндегидратазу (tdcG), серинацетилтрансферазу (cysE), цистеинсинтазу A (cysK), цистеинсинтазу В (cysM), бета-цистатионазу (malY), цистатионин бета-лиазу (metC), 5-метилтетрагидроптероилтриглутамат-гомоцистеин-метилтрансферазу (metE), метионинсинтазу (metH), S-аденозилметионинсинтазу (metK), цистатионин гамма-синтазу (metB), гомосерин О-сукцинилтрансферазу (metA), 5'-метилтиоаденозин/S-аденозилгомоцистеин-нуkлеозидазу (mtnN), S-рибозилгомоцистеинлиазу (luxS), цистатион бета-лиазу, цистатион гамма-лиазу, серин-гидроксиметилтрансферазу (glyA), глицингидроксиметилтрансферазу (itaE), малую субъединицу 3-изопропилмалатдегидратазы (leuD), большую субъединицу 3-изопропилмалатдегидратазы (leuC), 3-изопропилмалатдегидрогеназу (leuB), L-треониндегидратазу биосинтетическую (ilvA), большую субъединицу изофермента 3 ацетолактатсинтазы (ilvI), малую субъединицу изофермента 3 ацетолактатсинтазы (ilvH), малую субъединицу изофермента 1 ацетолактатсинтазы (ilvN), малую субъединицу изофермента 2 ацетолактатсинтазы (ilvM), кетол-кислотную редуктоизомеразу (NADP(+)) (ilvC), дегидратазу дигидроксикислоты (ilvD), аминотрансферазу аминокислот с разветвленной цепью (ilvE), бифункциональную дегидрогеназу аспартокиназы/гомосерина 1 (thrA), бифункциональную дегидрогеназу аспартокиназы/гомосерина 2 (metL), 2-изопропилмалатсинтазу (leuA), глутамат-пируват-аминотрансферазу (alaA), аспартат-аминотрансферазу (aspC), бифункциональную дегидрогеназу аспартокиназы/гомосерина 1 (thrA), бифункциональную дегидрогеназу аспартокиназы/гомосерина 2 (metL), лизин-чувствительную аспартокиназу 3 (lysC), аспартат-полуальдегиддегидрогеназу (asd), 2-кето-3-дезокси-галактонат-альдолазу (yagE), 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазу (dapA), 4-гидрокси-тетрагидродипиколинат-редуктазу (dapB), 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6дикарбоксилат N-сукцинилтрансферазу (dapD), сукцинил-диаминопимелат-десукцинилазу (dapE), диаминопимелат-эпимеразу (dapF), предполагаемую лиазу (yjhH), ацетилорнитин/сукцинилдиаминопимелат-аминотрансферазу (argD), цитратсинтазу (gltA), аконитатгидратазу В (acnB), аконитатгидратазу А (acnA), ^охарактеризованную предполагаемую аконитатгидратазу (ybhJ), изоцитратдегидрогеназу (icd), аспартат-аминотрансферазу (aspC), глутамат-пируват-аминотрансферазу (alaA), большую цепь глутаматсинтазы [NADPH] (gltB), малую цепь глутаматсинтазы [NADPH] (gltD), глутаминсинтетазу (glnA), ацетилтрансферазу аминокислот (argA), ацетилглутаматкиназу (argB), N-ацетил-гамма-глутамилфосфат-редуктазу (argC), ацетилорнитин/сукцинилдиаминопимелат-аминотрансферазу (argD), ацетилорнитин-деацетилазу (argE), цепь F орнитинкарбамоилтрансферазы (argF), цепь I орнитинкарбамоилтрансферазы (argI), аргининосукцинатсинтазу (argG), аргининосукцинатлиазу (argH), глутамат 5-киназу (proB), гамма-глутамилфосфатредуктазу (proA), пирролин-5-карбоксилатредуктазу (proC), орнитинциклодеаминазу, лейцин-тРНК лигазу (leuS), глутамин-тРНК лигазу (glnS), серин-тРНК лигазу (serS), бета-субъединицу глицин-тРНК лигазы (glyS), альфа-субъединицу глицин-тРНК лигазы (glyQ), тирозин-тРНК лигазу (tyrS), треонин-тРНК лигазу (thrS), альфа-субъединицу фенилаланин-тРНК лигазы (pheS), бета-субъединицу фенилаланин-тРНК лигазы (pheT), аргинин-тРНК лигазу (argS), гистидин-тРНК лигазу (hisS), валин-тРНК лигазу (valS), аланин-тРНК лигазу (alaS), изолейцин-тРНК лигазу (ileS), пролин-тРНК лигазу (proS), цистеин-тРНК лигазу (cysS), аспарагин-тРНК лигазу (asnS), аспартат-тРНК лигазу (aspS), глутамат-тРНК лигазу (gltX), триптофан-тРНК лигазу (trpS), бета-субъединицу глицин-тРНК лигазы (glyS), метионин-тРНК лигазу (metG), лизин-тРНК лигазу (lysS). Предпочтительные ферменты, необходимые для продукции аминокислоты, представляют собой- 12 044058 aspartate beta-semialdehyde dehydrogenase (asd), glutamine synthetase (glnA), tryptophanyl-tRNA synthetase (trpS) or serine hydroxymethyl transferase (glyA), or transketolase 1 (tktA), transketolase 2 (tktB), ribulose phosphate 3 -epimerase (rpe), ribose-5-phosphate isomerase A (rpiA), transaldolase A (talA), transaldolase B (talB), phosphoribosyl pyrophosphate synthase (prs), ATP phosphoribosyltransferase (hisG), bifunctional histidine biosynthetic protein HisIE (hisI) . -aminotransferase (hisC), histidinol dehydrogenase (hisD), 3-dehydroquinate synthase (aroB), 3-dehydroquinate dehydratase (aroD), shikimate dehydrogenase (NADP(+)) (aroE), shikimate kinase 2 (aroL), shikimate kinase 1 (aroK), 3- phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (agoA), chorismate synthase (agoC), P protein (pheA), T protein (tyrA), aromatic amino acid aminotransferase (tyrB), phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonataldolase (aroG), phospho-2 -dehydro-3-deoxyheptonaldolase (aroH), phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonaldolase (aroF), quinate/shikimate dehydrogenase (ydiB), ATP-dependent isoenzyme 6-phosphofructokinase 1 (pfkA), ATP-dependent isoenzyme 6- phosphofructokinase 2 (pfkB), fructose bisphosphate aldolase class 2 (fbaA), fructose bisphosphate aldolase class 1 (fbaB), triose phosphate isomerase (tpiA), pyruvate kinase I (pykF), pyruvate kinase II (pykA), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A ( gapA), phosphoglycerate kinase (pgk), 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase (gpmA), 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (gpmM/yibO), putative phosphoglycerate mutase (ytjC/gpmB), enolase (eno), D-3 -phosphoglycerate dehydrogenase (serA), phosphoserine aminotransferase (serC), phosphoserine phosphatase (serB), L-serine dehydratase I (sdaA), L-serine dehydratase 2 (sdaB), L-threonine dehydratase catabolic (tdcB), L-threonine dehydratase biosynthetic (ilvA), L-serine dehydratase (tdcG) S -adenosylmethionine synthase (metK), cystathionine gamma synthase (metB), homoserine O-succinyltransferase (metA), 5'-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase (mtnN), S-ribosylhomocysteine lyase (luxS), cystathione beta-lyase, cystathione gamma -lyase, serine hydroxymethyltransferase (glyA), glycine hydroxymethyltransferase (itaE), 3-isopropylmalate dehydratase small subunit (leuD), 3-isopropylmalate dehydratase large subunit (leuC), 3-isopropylmalate dehydrogenase (leuB), biosynthetic L-threonine dehydratase (ilvA), large subunit acetolactate synthase isoenzyme 3 (ilvI), acetolactate synthase isoenzyme 3 small subunit (ilvH), acetolactate synthase isoenzyme 1 small subunit (ilvN), acetolactate synthase isoenzyme 2 small subunit (ilvM), ketol acid reductoisomerase (NADP(+)) (ilvC), dehydrate zu dihydroxy acids (ilvD), branched-chain amino acid aminotransferase (ilvE), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1 (thrA), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 2 (metL), 2-isopropylmalate synthase (leuA), glutamate-pyruvate aminotransferase (alaA), aspartate -aminotransferase (aspC), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1 (thrA), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 2 (metL), lysine-sensitive aspartokinase 3 (lysC), aspartate-semialdehyde dehydrogenase (asd), 2-keto-3-deoxy- galactonate aldolase (yagE), 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (dapA), 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase (dapB), 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2,6dicarboxylate N-succinyltransferase (dapD), succinyl-diaminopimelate -desuccinylase (dapE), diaminopimelate epimerase (dapF), putative lyase (yjhH), acetylornithine/succinyldiaminopimelate aminotransferase (argD), citrate synthase (gltA), aconitate hydratase B (acnB), aconitate hydratase A (acnA), ^characterized putative aconitate hydratase ( ybhJ), isocitrate dehydrogenase (icd), aspartate aminotransferase (aspC), glutamate-pyruvate aminotransferase (alaA), large chain glutamate synthase [NADPH] (gltB), small chain glutamate synthase [NADPH] (gltD), glutamine synthetase (glnA), acetyltransferase Amino acid (Arga), acetylglutamatkinase (Argb), n-acetyl-gamma-glutumilphosphate reductase (Argc), acetylornitin/succinyl-pimino-aminotransferaza (Argd), acetylornitin-deacetylosis, and a circuit F Ornitinkarb MILTRANSFERAZ (Argf), chain I ornitinkarbamoilTransferase ( argI), argininosuccinate synthase (argG), argininosuccinate lyase (argH), glutamate 5-kinase (proB), gamma-glutamylphosphate reductase (proA), pyrroline-5-carboxylate reductase (proC), ornithine cyclodeaminase, leucine-tRNA ligase (leuS), glutamine-tRNA ligase (glnS), serine-tRNA ligase (serS), glycine-tRNA ligase beta subunit (glyS), glycine-tRNA ligase alpha subunit (glyQ), tyrosine-tRNA ligase (tyrS), threonine-tRNA ligase (thrS) , phenylalanine-tRNA ligase alpha subunit (pheS), phenylalanine-tRNA ligase beta subunit (pheT), arginine-tRNA ligase (argS), histidine-tRNA ligase (hisS), valine-tRNA ligase (valS), alanine-tRNA ligase (alaS), isoleucine-tRNA ligase (ileS), proline-tRNA ligase (proS), cysteine-tRNA ligase (cysS), asparagine-tRNA ligase (asnS), aspartate-tRNA ligase (aspS), glutamate-tRNA ligase ( gltX), tryptophan-tRNA ligase (trpS), glycine-tRNA ligase beta subunit (glyS), methionine-tRNA ligase (metG), lysine-tRNA ligase (lysS). The preferred enzymes required for amino acid production are
- 13 044058 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, более предпочтительные ферменты представляют собой asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, наиболее предпочтительный фермент представляет собой asd.- 13 044058 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS , serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, more preferred enzymes are asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, most preferred the enzyme is asd.
Термины грамотрицательный штамм бактерий, дефицитный по продукции аминокислоты, необходимой для роста, и ауксотрофный мутант используются в настоящем документе взаимозаменяемо и обозначают грамотрицательные штаммы бактерий, которые не могут расти при отсутствии по меньшей мере одной обеспечиваемой экзогенно незаменимой аминокислоты или ее предшественника. Аминокислота, по продукции которой штамм является дефицитным, представляет собой, например, аспартат, мезо2,6-диаминопимелиновую кислоту, ароматические аминокислоты или лейцин-аргинин. Такой штамм может быть получен, например, в результате делеции гена аспартат-бета-полуальдегид-дегидрогеназы (Δasd). Такой ауксотрофный мутант не может расти при отсутствии экзогенной мезо-2,6диаминопимелиновой кислоты. Мутация, например, делеция гена аспартат-бета-полуальдегиддегидрогеназы, является в настоящем документе предпочтительной для грамотрицательного штамма бактерий, дефицитного по продукции аминокислоты, необходимой для роста, согласно настоящему изобретению.The terms gram-negative bacterial strain deficient in the production of an amino acid required for growth and auxotrophic mutant are used interchangeably herein to refer to gram-negative bacterial strains that cannot grow in the absence of at least one exogenously provided essential amino acid or its precursor. An amino acid for which the strain is deficient in production is, for example, aspartate, meso2,6-diaminopimelic acid, aromatic amino acids or leucine-arginine. Such a strain can be obtained, for example, as a result of deletion of the aspartate beta-semialdehyde dehydrogenase (Δasd) gene. This auxotrophic mutant cannot grow in the absence of exogenous meso-2,6diaminopimelic acid. A mutation, for example, deletion of the aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase gene, is herein preferred for a Gram-negative bacterial strain deficient in the production of an amino acid required for growth according to the present invention.
Термин грамотрицательный штамм бактерий, дефицитный по продукции белков адгезии, связывающихся с поверхностью эукариотической клетки или внеклеточным матриксом, обозначает мутантные грамотрицательные штаммы бактерий, которые не экспрессируют по меньшей мере один белок адгезии по сравнению с белками адгезии, экспрессируемыми соответствующим штаммом дикого типа. Белки адгезии могут включать, например, протяженные полимерные молекулы адгезии, такие как пили/фимбрии, или нефимбриальные адгезины. Фимбриальные адгезины включают пили 1 типа (такие как Fim-пили E. coli с адгезином FimH), Р-пили (такие как Pap-пили с адгезином PapG из Е. colt), пили 4 типа (такие как белок пилин, например, из P. aeruginosa) или карлин (белки Csg с адгезином CsgA из S. enterica). Нефимбриальные адгезины включают тримерные адгезины-аутотранспортеры, такие как YadA из Y. enterocolitica, ВраА (В. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (В. henselae), NadA (N. meningitidis) или UspA1 (M. catarrhalis), а также другие адгезины-аутотранспортеры, такие как AIDA-1 (Е. coli), а также другие адгезины/инвазины, такие как InvA из Y. enterocolitica или интимин (Е. coli), либо члены семейства Dr или семейства Afa (E. coli). Термины YadA и InvA в настоящем документе обозначают белки из Y. enterocolitica. Аутотранспортер YadA7 связывается с различными формами коллагена, а также фибронектина, в то время как инвазин InvA8 связывается с β-интегринами в мембране эукариотической клетки. Если грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Y. enterocolitica, штамм, предпочтительно, является дефицитным по InvA и/или YadA.The term gram-negative bacterial strain deficient in the production of adhesion proteins that bind to the eukaryotic cell surface or extracellular matrix refers to mutant gram-negative bacterial strains that do not express at least one adhesion protein compared to the adhesion proteins expressed by the corresponding wild-type strain. Adhesion proteins may include, for example, extended polymeric adhesion molecules such as pili/fimbriae, or non-fimbrial adhesins. Fimbrial adhesins include type 1 pili (such as E. coli Fim pili with the adhesin FimH), P pili (such as Pap pili with the PapG adhesin from E. colt), type 4 pili (such as the pilin protein, e.g. P. aeruginosa) or carlin (Csg proteins with the CsgA adhesin from S. enterica). Nonfimbrial adhesins include trimeric autotransporter adhesins such as YadA from Y. enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis), or UspA1 (M. catarrhalis) , as well as other autotransporter adhesins such as AIDA-1 (E. coli), as well as other adhesins/invasives such as InvA from Y. enterocolitica or intimin (E. coli), or members of the Dr family or the Afa family (E .coli). The terms YadA and InvA as used herein refer to proteins from Y. enterocolitica. The autotransporter YadA 7 binds to various forms of collagen as well as fibronectin, while the invasin InvA 8 binds to β-integrins in the eukaryotic cell membrane. If the gram-negative bacterial strain is a Y. enterocolitica strain, the strain is preferably deficient in InvA and/or YadA.
В настоящем документе термин семейство Enterobacteriaceae включает семейство грамотрицательных палочкообразных факультативно анаэробных бактерий, обнаруживаемых в почве, воде, растениях и животных, которые часто присутствуют у позвоночных в качестве патогенов. Бактерии данного семейства характеризуются подобной физиологией и демонстрируют консервативность функциональных элементов и генов соответствующих геномов. Также, будучи оксидаза-отрицательными, все члены данного семейства сбраживают глюкозу, и большинство из них являются нитратвосстанавливающими. Бактерии Enterobacteriaceae согласно настоящему изобретению могут представлять собой любую бактерию из данного семейства и конкретно включают, без ограничения, бактерии следующих родов:As used herein, the term family Enterobacteriaceae includes a family of gram-negative, rod-shaped, facultative anaerobic bacteria found in soil, water, plants and animals that are often present as pathogens in vertebrates. Bacteria of this family are characterized by similar physiology and demonstrate conservation of functional elements and genes of the corresponding genomes. Also, being oxidase negative, all members of this family ferment glucose, and most are nitrate reducing. The Enterobacteriaceae bacteria of the present invention can be any bacterium from this family and specifically includes, without limitation, bacteria from the following genera:
Escherichia, Shigella,Escherichia, Shigella,
Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia или Yersinia.Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia or Yersinia.
- 14 044058- 14 044058
В более конкретных вариантах реализации бактерия относится к видуIn more specific embodiments, the bacterium is of the species
Escherichia coli, Escherichia blattae,Escherichia coli, Escherichia blattae,
Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteuspenneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens или Morganella morganii.Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebs iella oxytoca, Serratia marcescens , Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteuspenneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens or Morganella morganii.
Предпочтительно, грамотрицательный штамм бактерий выбран из группы, состоящей из родовPreferably, the gram-negative bacterial strain is selected from the group consisting of the genera
Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas,Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas,
Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella и Desulfovibrio, более предпочтительно, из группы, состоящей из родовChlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella and Desulfovibrio, more preferably from the group consisting of genera
Yersinia, Escherichia, Salmonella и Pseudomonas, наиболее предпочтительно, из группы, состоящей из родов Y^sinia и Salmonella, в частности, Yersinia.Yersinia, Escherichia, Salmonella and Pseudomonas, most preferably from the group consisting of the genera Y^sinia and Salmonella, in particular Yersinia.
Термин Yersinia в настоящем документе включает все виды Yersinia, включая Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestis. Предпочтительным является Yersinia enterocolitica.The term Yersinia as used herein includes all species of Yersinia, including Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis. Yersinia enterocolitica is preferred.
Термин Salmonella в настоящем документе включает все виды Salmonella, включая Salmonella enterica и S. bongori. Предпочтительным является Salmonella enterica.The term Salmonella as used herein includes all Salmonella species, including Salmonella enterica and S. bongori. Salmonella enterica is preferred.
Промотор в настоящем документе обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию единицы транскрипции.A promoter as used herein refers to a nucleic acid sequence that regulates the expression of a transcription unit.
Область промотора представляет собой регуляторную область, способную связываться с РНКполимеразой в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности, находящейся ниже по течению (в направлении 3'). В области промотора находится сайт инициации транскрипции (который обычно определяют посредством картирования с помощью нуклеазы S1), а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), отвечающие за связывание РНК-полимеразы, такие как предполагаемая область -35 и бокс Прибнова. Термин функционально связанный при описании взаимодействия между двумя нуклеотидами, например, участками ДНК, обозначает ничто иное как то, что данные участки функционально связаны друг с другом и расположены на одном и том же фрагменте нуклеиновой кислоты. Промотор функционально связан со структурным геном, если он контролирует транскрипцию гена и расположен на том же фрагменте нуклеиновой кислоты, что и ген. Обычно промотор является функциональным в указанном грамотрицательном штамме бактерий, т.е. промотор способен экспрессировать слитый белок согласно настоящему изобретению, т.е. промотор способен экспрессировать слитый белок согласно настоящему изобретению без дополнительного применения генетической инженерии или экспрессии дополнительных белков. Более того, функциональный промотор в природе не должен быть контррегулируемым применительно к бактериальной T3SS.The promoter region is a regulatory region capable of binding to RNA polymerase in the cell and initiating transcription of the downstream (3' direction) coding sequence. The promoter region contains the transcription initiation site (usually determined by S1 nuclease mapping) as well as protein-binding domains (consensus sequences) responsible for RNA polymerase binding, such as the putative -35 region and the Pribnow box. The term operably linked, when describing the interaction between two nucleotides, such as sections of DNA, means nothing more than that the sections are operably linked to each other and located on the same nucleic acid fragment. A promoter is functionally associated with a structural gene if it controls transcription of the gene and is located on the same nucleic acid fragment as the gene. Typically the promoter is functional in the specified gram-negative bacterial strain, i.e. the promoter is capable of expressing the fusion protein of the present invention, i.e. the promoter is capable of expressing the fusion protein of the present invention without further use of genetic engineering or expression of additional proteins. Moreover, a functional promoter in nature should not be counter-regulated by the bacterial T3SS.
Термин внехромосомный генетический элемент в настоящем документе обозначает генетический элемент, отличный от хромосомы, содержащийся эндогенно в грамотрицательном штамме бактерий согласно настоящему изобретению, такой как плазмида вирулентности, или который представляет собой экзогенный генетический элемент, которым трансформирован грамотрицательный штамм бактерий и который временно или стабильно интегрирован в хромосому или в генетический элемент, отличный от хромосомы, содержащийся эндогенно, такой как плазмида вирулентности. Такой внехромосомный генетический элемент может представлять собой вектор, такой как вектор экспрессии, вектор для гомологичной рекомбинации или другого типа интеграции в хромосому или в генетический элемент, отличный от хромосомы, содержащийся эндогенно, такой как плазмида вирулентности, фрагменты ДНК для гомологичной рекомбинации или другого типа интеграции в хромосому или в генетический элемент, отличный от хромосомы, содержащийся эндогенно, такой как плазмида вирулентности или элемент РНК, направляющий сайт-специфическую вставку в хромосому или в генетический элемент, отличный от хромосомы, содержащийся эндогенно, такой как плазмида вирулентности, такая как CRISPR/Cas9, и связанная направляющая РНК.The term extrachromosomal genetic element as used herein means a genetic element, other than a chromosome, contained endogenously in a Gram-negative bacterial strain of the present invention, such as a virulence plasmid, or which is an exogenous genetic element with which a Gram-negative bacterial strain is transformed and which is transiently or stably integrated into chromosome or into a genetic element other than a chromosome contained endogenously, such as a virulence plasmid. Such extrachromosomal genetic element may be a vector, such as an expression vector, a vector for homologous recombination or other type of integration into a chromosome, or into a genetic element other than a chromosome contained endogenously, such as a virulence plasmid, DNA fragments for homologous recombination or other type of integration into a chromosome or into a non-chromosomal genetic element contained endogenously, such as a virulence plasmid or RNA element that directs a site-specific insertion into a chromosome or into a non-chromosomal genetic element contained endogenously, such as a virulence plasmid, such as CRISPR/ Cas9, and associated guide RNA.
Термин термочувствительная область РНК в настоящем документе обозначает чувствительную к температуре некодирующую последовательность РНК, которая регулирует экспрессию связанных генов. Обычно термочувствительные области РНК функционируют посредством образования вторичной структуры, такой как шпилечная петля РНК, которая стабильно образуется при репрессивной температуре и является нестабильной при пермиссивной температуре и которая маскирует последовательность РНК,The term temperature-sensitive RNA region as used herein refers to a temperature-sensitive non-coding RNA sequence that regulates the expression of associated genes. Typically, temperature-sensitive regions of RNA function through the formation of a secondary structure, such as an RNA hairpin loop, which forms stably at the repressive temperature and is unstable at the permissive temperature and which masks the RNA sequence,
- 15 044058 необходимую для трансляции, такую как участок связывания рибосомы, таким образом, регулируя экспрессию гена, связанного с такой последовательностью РНК, необходимой для трансляции.- 15 044058 necessary for translation, such as a ribosome binding site, thereby regulating the expression of a gene associated with such RNA sequence necessary for translation.
Термин шпилечная структура РНК или ее части в настоящем документе обозначает вторичную структуру РНК, образованную в результате внутримолекулярного спаривания оснований, которое приводит к образованию структуры петля на стебле. Внутримолекулярное спаривание оснований, обычно в пределах одной цепи РНК, происходит благодаря комплементарным нуклеотидным последовательностям или их частям.The term RNA hairpin structure or portions thereof as used herein refers to the secondary structure of RNA formed by intramolecular base pairing that results in the formation of a stem-loop structure. Intramolecular base pairing, usually within a single strand of RNA, occurs due to complementary nucleotide sequences or parts thereof.
Термин ДНК-связывающий белок типа AraC, также обозначаемый как семейство AraC/XylS, в настоящем документе обозначает бактериальные белки регуляции транскрипции, которые связываются с ДНК посредством мотива спираль-петля-спираль. Большинство членов ДНК-связывающих белков типа AraC являются положительными регуляторами транскрипции и могут характеризоваться минимальным ДНК-связывающим доменом, охватывающим фрагмент размером более 100 остатков, содержащим два субдомена спираль-петля-спираль. ДНК-связывающие белки типа AraC конкретно включают, без ограничения: VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, AraC, XylS, ExsA, PerA, MmsR, RhaS, TcpN, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, MarA, CafR, FapR и InvF. Предпочтительными являются ДНК-связывающие белки типа AraC, участвующие в регуляции механизмов, связанных с вирулентностью, такие как VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, TcpN, CafR, FapR и InvF. Более предпочтительными являются ДНК-связывающие белки типа AraC, участвующие в регуляции активности системы секреции третьего типа, такие как VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD и InvF, наиболее предпочтительными являются VirF и/или LcrF.The term AraC-type DNA binding protein, also referred to as the AraC/XylS family, as used herein refers to bacterial transcriptional regulatory proteins that bind DNA through a helix-loop-helix motif. Most members of the AraC-type DNA-binding proteins are positive regulators of transcription and can be characterized by a minimal DNA-binding domain spanning a fragment of more than 100 residues containing two helix-loop-helix subdomains. AraC-type DNA binding proteins specifically include, but are not limited to: VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, AraC, XylS, ExsA, PerA, MmsR, RhaS, TcpN, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, MarA, CafR, FapR and InvF. Preferred are DNA-binding proteins of the AraC type involved in the regulation of virulence-related mechanisms, such as VirF, LcrF, YbtA, Rns, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD, TcpN, CafR, FapR and InvF. More preferred are DNA-binding proteins of the AraC type involved in the regulation of the activity of the third type secretion system, such as VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD and InvF, most preferred are VirF and/or LcrF.
Термин доставка в настоящем документе обозначает транспортирование белка из рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий в эукариотическую клетку, включая этапы экспрессии гетерологичного белка в рекомбинантном аттенуированном по вирулентности грамотрицательном штамме бактерий, секрецию экспрессированного белка или белков из такого рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий и транслокацию секретированного белка или белков таким рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий в цитозоль эукариотической клетки. Соответственно, термины сигнал доставки или сигнал секреции, которые используются в настоящем документе взаимозаменяемо, обозначают полипептидную последовательность, которая может распознаваться системой секреции и транслокации грамотрицательного штамма бактерий и направляет доставку белка из грамотрицательного штамма бактерий в эукариотические клетки.The term delivery as used herein means the transport of a protein from a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain into a eukaryotic cell, including the steps of expression of the heterologous protein in the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, secretion of the expressed protein or proteins from such recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, and translocation secreted protein or proteins by such a recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria into the cytosol of a eukaryotic cell. Accordingly, the terms delivery signal or secretion signal, as used interchangeably herein, refer to a polypeptide sequence that can be recognized by the secretion and translocation system of a Gram-negative bacterial strain and directs the delivery of a protein from the Gram-negative bacterial strain into eukaryotic cells.
Термин сигнал доставки из бактериального эффекторного белка в настоящем документе обозначает сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функциональный в рекомбинантном грамотрицательном штамме бактерий, т.е. который обеспечивает секрецию экспрессированного в рекомбинантном грамотрицательном штамме бактерий гетерологичного белка из такого рекомбинантного грамотрицательного штамма бактерий с помощью системы секреции, такой как система секреции III типа, IV типа или VI типа, или транслокацию экспрессированного в рекомбинантном грамотрицательном штамме бактерий гетерологичного белка таким рекомбинантным грамотрицательным штаммом бактерий в цитозоль эукариотической клетки с помощью системы секреции, такой как система секреции III типа, IV типа или VI типа. Термин сигнал доставки из бактериального эффекторного белка в настоящем документе также включает фрагмент сигнала доставки из бактериального эффекторного белка, т.е. более короткие версии сигнала доставки, например, сигнал доставки, содержащий до 10, предпочтительно, до 20, более предпочтительно, до 50, еще более предпочтительно, до 100, в частности, до 140 аминокислот сигнала доставки, например, встречающегося в природе сигнала доставки. Таким образом, нуклеотидная последовательность, такая как, например, последовательность ДНК, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, может кодировать полноразмерный сигнал доставки или его фрагмент, причем фрагмент обычно содержит до 30, предпочтительно, до 60, более предпочтительно, до 150, еще более предпочтительно, до 300, в частности, до 420 нуклеиновых кислот.The term bacterial effector protein delivery signal as used herein refers to a bacterial effector protein delivery signal functional in a recombinant gram-negative bacterial strain, i.e. which causes secretion of a heterologous protein expressed in a recombinant gram-negative bacterial strain from such a recombinant gram-negative bacterial strain by a secretion system such as a type III, type IV or type VI secretion system, or translocation of a heterologous protein expressed in a recombinant gram-negative bacterial strain by such a recombinant gram-negative bacterial strain into the cytosol of a eukaryotic cell by a secretion system such as a type III, type IV, or type VI secretion system. The term bacterial effector protein delivery signal as used herein also includes a fragment of a bacterial effector protein delivery signal, i.e. shorter versions of the delivery signal, for example, a delivery signal containing up to 10, preferably up to 20, more preferably up to 50, even more preferably up to 100, in particular up to 140 amino acids of the delivery signal, for example, a naturally occurring delivery signal. Thus, a nucleotide sequence, such as, for example, a DNA sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, may encode a full-length delivery signal or a fragment thereof, the fragment typically containing up to 30, preferably up to 60, more preferably up to 150, more more preferably up to 300, in particular up to 420 nucleic acids.
В настоящем документе секреция белка обозначает транспортирование гетерологичного белка наружу через мембрану клетки рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий. Транслокация белка обозначает транспортирование гетерологичного белка из рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий через плазматическую мембрану эукариотической клетки в цитозоль такой эукариотической клетки.As used herein, protein secretion refers to the transport of a heterologous protein outward across the cell membrane of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain. Protein translocation refers to the transport of a heterologous protein from a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain across the plasma membrane of a eukaryotic cell into the cytosol of such a eukaryotic cell.
Термин бактериальный белок, который является частью аппарата системы секреции, в настоящем документе обозначает бактериальные белки, образующие важные компоненты бактериальной системы секреции 3 типа (T3SS), системы секреции 4 типа (T4SS) и системы секреции 6 типа (T6SS), предпочтительно, T3SS. Без таких белков соответствующая система секреции является нефункциональной при транслокации белков в клетки-хозяева, даже если все другие компоненты системы секреции и бактериальный эффекторный белок, подлежащий транслокации, все еще кодируются и продуцируются.The term bacterial protein that is part of the secretion system apparatus as used herein refers to bacterial proteins that form important components of the bacterial type 3 secretion system (T3SS), type 4 secretion system (T4SS) and type 6 secretion system (T6SS), preferably the T3SS. Without such proteins, the corresponding secretion system is nonfunctional in translocating proteins into host cells, even if all other components of the secretion system and the bacterial effector protein to be translocated are still encoded and produced.
Термин бактериальный эффекторный белок в настоящем документе обозначает бактериальные белки, транспортируемые системами секреции, например, бактериальными белками, которые являются частью аппарата системы секреции, в клетки-хозяева. Такие эффекторные белки доставляются посредст- 16 044058 вом системы секреции в клетку-хозяин, в которой они проявляют, например, вирулентную активность в отношении различных белков хозяина и аппаратов клетки. Известно множество различных эффекторных белков, которые транспортируются различными типами систем секреции и демонстрируют широкий репертуар биохимических активностей, модулирующих функции регуляторных молекул хозяина. Системы секреции включают систему секреции 3 типа (T3SS), систему секреции 4 типа (T4SS) и систему секреции 6 типа (T6SS). Некоторые эффекторные белки (такие как IpaC Shigella flexneri) также относятся к классу бактериальных белков, которые являются частью аппарата системы секреции и обеспечивают транслокацию белка. Рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий в настоящем документе обычно содержит бактериальные белки, образующие необходимые компоненты бактериальной системы секреции 3 типа (T3SS), системы секреции 4 типа (T4SS) и/или системы секреции 6 типа (T6SS), предпочтительно, системы секреции 3 типа (T3SS). Термин бактериальные белки, образующие необходимые компоненты бактериальной T3SS, в настоящем документе обозначает белки, которые в природе образуют инжектисому, например, инжекционную иглу, или которые иным способом являются необходимыми для ее функционирования при транслокации белков в эукариотические клетки. Белки, образующие инжектисому или иным способом являющиеся необходимыми для ее функционирования при транслокации белков в эукариотические клетки, включают, без ограничения:The term bacterial effector protein as used herein refers to bacterial proteins transported by secretion systems, eg, bacterial proteins that are part of the secretion system machinery, into host cells. Such effector proteins are delivered through the secretion system into the host cell, in which they exhibit, for example, virulence activity against various host proteins and cell apparatus. Many different effector proteins are known that are transported by different types of secretion systems and exhibit a wide repertoire of biochemical activities that modulate the functions of host regulatory molecules. The secretion systems include type 3 secretion system (T3SS), type 4 secretion system (T4SS), and type 6 secretion system (T6SS). Some effector proteins (such as IpaC of Shigella flexneri) also belong to a class of bacterial proteins that are part of the secretion system machinery and mediate protein translocation. The recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain herein typically contains bacterial proteins that form essential components of a bacterial type 3 secretion system (T3SS), a type 4 secretion system (T4SS), and/or a type 6 secretion system (T6SS), preferably a type 3 secretion system. type (T3SS). The term bacterial proteins that form essential components of a bacterial T3SS as used herein refers to proteins that naturally form an injectisome, such as an injection needle, or that are otherwise essential for its function in protein translocation into eukaryotic cells. Proteins that form the injectisome or are otherwise essential for its function during protein translocation into eukaryotic cells include, but are not limited to:
SctC, YscC, MxiD, InvG, SsaC, EscC, HrcC, HrcC (секретин), SctD, YscD, MxiG, Prg, SsaD, EscD, HrpQ, HrpW, FliG (внешний белок М-кольца), SctJ, YscJ, MxiJ, PrgK, SsaJ, EscJ, HrcJ, HrcJ, FliF (внутренний белок М-кольца), SctR, YscR, Spa24, SpaP, SpaP, SsaR, EscR, HrcR, HrcR, FliP (малый белок аппарата экспорта), SctS, YscS, Spa9 (SpaQ), SpaQ, SsaS, EscS, HrcS, HrcS, FliQ (малый белок аппарата экспорта), SctT, YscT, Spa29 (SpaR), SpaR, SsaT, EscT, HrcT, HrcT, FliR (малый белок аппарата экспорта), SctU, YscU, Spa40, SpaS, SpaS, SsaU, EscU, HrcU, HrcU, FlhB (белок-переключатель аппарата экспорта), SctV, YscV, MxiA, InvA, SsaV, EscV, HrcV, HrcV, FlhA (большой белок аппарата экспорта), SctK, YscK, MxiK, OrgA, HrpD (вспомогательный цитозольный белок), SctQ, YscQ, Spa33, SpaO, SpaO, SsaQ, EscQ, HrcQA+B, HrcQ, FliM + FliN (белок С-кольца), SctL, YscL, MxiN, OrgB, SsaK, EscL, Orf5, HrpE, HrpF, FliH (статор), SctN, YscN, Spa47, SpaL, InvC, SsaN, EscN, HrcN, HrcN, Flil (АТФаза), SctO, YscO, Spal3, SpaM, Invl, SsaO, Orfl5, HrpO, HrpD, FliJ (Stalk), SctF, YscF, MxiH, PrgI, SsaG, EscF, HrpA, HrpY (белок филамента иглы), SctI, YscI, Mxil, PrgJ, Ssal, EscI, rOrf8, HrpB, HrpJ, (внутренний белок палочки), SctP, YscP, Spa32, SpaN, InvJ, SsaP, EscP, Orfl6, HrpP, HpaP, FliK (регулятор длины иглы), LcrV, IpaD, SipD (гидрофильный транслокатор, белок конца иглы), YopB, IpaB, SipB, SseC, EspD, HrpK, PopFl, PopF2 (гидрофобный транслокатор, поровый белок), YopD, IpaC, SipC, SseD, EspB (гидрофобный транслокатор, поровый белок), YscW, MxiM, InvH (пилотин), SctW, YopN, MxiC, InvE, SsaL, SepL, HrpJ, НраА (привратник).SctC, YscC, MxiD, InvG, SsaC, EscC, HrcC, HrcC (secretin), SctD, YscD, MxiG, Prg, SsaD, EscD, HrpQ, HrpW, FliG (external M-ring protein), SctJ, YscJ, MxiJ, PrgK, SsaJ, EscJ, HrcJ, HrcJ, FliF (internal M-ring protein), SctR, YscR, Spa24, SpaP, SpaP, SsaR, EscR, HrcR, HrcR, FliP (small export apparatus protein), SctS, YscS, Spa9 (SpaQ), SpaQ, SsaS, EscS, HrcS, HrcS, FliQ (small export apparatus protein), SctT, YscT, Spa29 (SpaR), SpaR, SsaT, EscT, HrcT, HrcT, FliR (small export apparatus protein), SctU , YscU, Spa40, SpaS, SpaS, SsaU, EscU, HrcU, HrcU, FlhB (switch protein of the export apparatus), SctV, YscV, MxiA, InvA, SsaV, EscV, HrcV, HrcV, FlhA (large protein of the export apparatus), SctK, YscK, MxiK, OrgA, HrpD (cytosolic accessory protein), SctQ, YscQ, Spa33, SpaO, SpaO, SsaQ, EscQ, HrcQA+B, HrcQ, FliM + FliN (C-ring protein), SctL, YscL, MxiN , OrgB, SsaK, EscL, Orf5, HrpE, HrpF, FliH (stator), SctN, YscN, Spa47, SpaL, InvC, SsaN, EscN, HrcN, HrcN, Flil (ATPase), SctO, YscO, Spal3, SpaM, Invl , SsaO, Orfl5, HrpO, HrpD, FliJ (Stalk), SctF, YscF, MxiH, PrgI, SsaG, EscF, HrpA, HrpY (needle filament protein), SctI, YscI, Mxil, PrgJ, Ssal, EscI, rOrf8, HrpB , HrpJ, (internal rod protein), SctP, YscP, Spa32, SpaN, InvJ, SsaP, EscP, Orfl6, HrpP, HpaP, FliK (needle length regulator), LcrV, IpaD, SipD (hydrophilic translocator, needle end protein), YopB, IpaB, SipB, SseC, EspD, HrpK, PopFl, PopF2 (hydrophobic translocator, pore protein), YopD, IpaC, SipC, SseD, EspB (hydrophobic translocator, pore protein), YscW, MxiM, InvH (pilotin), SctW , YopN, MxiC, InvE, SsaL, SepL, HrpJ, HraA (gatekeeper).
Термин эффекторный белок T6SS или бактериальный эффекторный белок T6SS в настоящем документе обозначает белки, которые в природе инжектируются системами T6S в цитозоль эукариотических клеток или бактерий, и белки, которые в природе секретируются системами T6S, которые могут, например, образовывать транслокационные поры в эукариотической мембране. Термин эффекторный белок T4SS или бактериальный эффекторный белок T4SS в настоящем документе обозначает белки, которые в природе инжектируются системами T4S в цитозоль эукариотических клеток, и белки, которые в природе секретируются системами T4S, которые могут, например, образовывать транслокационную пору в эукариотической мембране. Термин эффекторный белок T3SS или бактериальный эффекторный белок T3SS в настоящем документе обозначает белки, которые в природе инжектируются системами T3S в цитозоль эукариотических клеток, и белки, которые в природе секретируются системами T3S, которые могут, например, образовывать транслокационную пору в эукариотической мембране (включая порообразующие транслокаторы (такие как YopB и YopD Yersinia) и белки конца иглы, такие как LcrV Yersinia). Предпочтительно, применяют белки, которые в природе инжектируются системами T3S в цитозоль эукариотических клеток. Данные факторы вирулентности парализуют или перепрограммируют эукариотическую клетку с пользой для патогена. Эффекторы T3S демонстрируют широкий репертуар биохимических активностей, модулируют функцию критических регуляторных молекул хозяина и включаютThe term T6SS effector protein or bacterial T6SS effector protein as used herein refers to proteins that are naturally injected by T6S systems into the cytosol of eukaryotic cells or bacteria, and proteins that are naturally secreted by T6S systems that may, for example, form translocation pores in the eukaryotic membrane. The term T4SS effector protein or bacterial T4SS effector protein as used herein refers to proteins that are naturally injected by T4S systems into the cytosol of eukaryotic cells, and proteins that are naturally secreted by T4S systems that may, for example, form a translocation pore in the eukaryotic membrane. The term T3SS effector protein or bacterial T3SS effector protein as used herein refers to proteins that are naturally injected by T3S systems into the cytosol of eukaryotic cells, and proteins that are naturally secreted by T3S systems that may, for example, form a translocation pore in the eukaryotic membrane (including pore-forming translocators (such as Yersinia YopB and YopD) and needle tip proteins such as Yersinia LcrV). Preferably, proteins are used that are naturally injected by T3S systems into the cytosol of eukaryotic cells. These virulence factors paralyze or reprogram the eukaryotic cell to the benefit of the pathogen. T3S effectors exhibit a wide repertoire of biochemical activities, modulate the function of critical host regulatory molecules, and turn on
- 17 044058- 17 044058
AvrA, AvrB, AvrBs2,AvrA, AvrB, AvrBs2,
AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, белки семейства GALA, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseESrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2,AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA family proteins , HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseESrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2,
SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopDSteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD
YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.
Термин рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, накапливающийся в злокачественной солидной опухоли, или рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий накапливается в злокачественной солидной опухоли в настоящем документе обозначает рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, который реплицируется в злокачественной солидной опухоли, посредством этого увеличивая число бактерий данного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий внутри злокачественной солидной опухоли. Неожиданно было обнаружено, что рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий после введения субъекту накапливается специфично в злокачественной солидной опухоли, т.е. накапливается специфично в органе, в котором присутствует злокачественная опухоль, причем число бактерий рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий в органах, в которых не присутствует злокачественная солидная опухоль, является низким или не обнаруживаемым.The term recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain accumulating in a malignant solid tumor or recombinant virulence-attenuating Gram-negative bacterial strain accumulating in a malignant solid tumor herein means a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain that replicates in a malignant solid tumor, thereby increasing the number of bacteria of a given recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria inside a malignant solid tumor. Surprisingly, it was discovered that a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, after administration to a subject, accumulates specifically in a malignant solid tumor, i.e. accumulates specifically in an organ in which a malignant tumor is present, and the number of bacteria of a recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria in organs in which a malignant solid tumor is not present is low or undetectable.
В случае внеклеточного обитания бактерий, таких как Yersinia, бактерии преимущественно накапливаются в межклеточном пространстве, образованном между опухолевыми клетками. Внутриклеточно растущие бактерии, такие как Salmonella, преимущественно оккупируют опухолевые клетки и будут обитать внутри таких клеток, хотя также может наблюдаться внеклеточное накопление. Число бактерий рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, накопленное внутри злокачественной солидной опухоли, может находиться, например, в диапазоне от 104 до 109 бактерий на 1 г опухолевой ткани.In the case of extracellular bacteria such as Yersinia, bacteria preferentially accumulate in the intercellular space formed between tumor cells. Intracellularly growing bacteria such as Salmonella will preferentially occupy tumor cells and will reside within such cells, although extracellular accumulation may also occur. The number of bacteria of a recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria accumulated inside a malignant solid tumor can be, for example, in the range from 10 4 to 10 9 bacteria per 1 g of tumor tissue.
Термин рак в настоящем документе обозначает заболевание, при котором абнормальные клетки делятся без контроля и могут инвазировать прилежащие ткани. Раковые клетки могут также распространяться в другие части тела через кровеносную и лимфатическую системы. Существует несколько основных типов рака. Карцинома представляет собой рак, который возникает в коже или тканях, выстилающих или покрывающих внутренние органы. Саркома представляет собой рак, который возникает в кости, суставе, жире, мышцах, кровеносных сосудах или другой соединительной или поддерживающей ткани. Лейкоз представляет собой рак, который возникает в кровообразующей ткани, такой как костный мозг, и вызывает образование и поступление в кровь большого количества абнормальных кровяных клеток. Лимфома и множественная миелома представляют собой типы рака, которые возникают в клетках иммунной системы. Типы рака центральной нервной системы представляют собой типы рака, которые возникают в тканях головного мозга и спинного мозга. Термин рак в настоящем документе включает солидные опухоли, т.е. злокачественные солидные опухоли, такие как, например, саркомы, карциномы и лимфомы, и несолидные опухоли, такие как, например, лейкозы (типы рака крови). Злокачественные солидные опухоли являются предпочтительными. Термин злокачественная солидная опухоль или признак злокачественной солидной опухоли в настоящем документе обозначает абнормальную массу ткани, которая обычно не содержит кисты или жидкие области. Солидные опухоли могут являться доброкачественными (нераковыми) или злокачественными (раковыми). Злокачественные солидные опухоли лечат способами согласно настоящему изобретению. Различные типы злокачественных солидных опухолей называют по типу клеток, которые их образуют. Примерами злокачественных солидных опухолей являются саркомы, карциномы и лимфомы. Лейкозы (рак крови) обычно не образуют злокачественные солидные опухоли (определение согласно Национальному институту рака Национального центра здоровья США). Злокачественные солидные опухоли включают, без ограничения, абнормальную массу клеток, которые могут происходить из различных типов тканей, таких как печень, толстая кишка, ободочная и прямая кишка, кожа, молочная железа, поджелудочная железа, шейка матки, тело матки, мочевой пузырь, желчный пузырь, почки, гортань, губа, полость рта, пищевод, яичник, предстательная железа, жеThe term cancer as used herein refers to a disease in which abnormal cells divide uncontrollably and can invade adjacent tissues. Cancer cells can also spread to other parts of the body through the circulatory and lymphatic systems. There are several main types of cancer. Carcinoma is cancer that occurs in the skin or tissues lining or covering internal organs. Sarcoma is a cancer that occurs in bone, joint, fat, muscle, blood vessels, or other connective or supporting tissue. Leukemia is a cancer that originates in blood-forming tissue such as bone marrow and causes large numbers of abnormal blood cells to be produced and released into the blood. Lymphoma and multiple myeloma are types of cancer that start in cells of the immune system. Central nervous system cancer types are types of cancer that originate in the tissues of the brain and spinal cord. The term cancer as used herein includes solid tumors, i.e. malignant solid tumors, such as, for example, sarcomas, carcinomas and lymphomas, and non-solid tumors, such as, for example, leukemias (types of blood cancer). Malignant solid tumors are preferred. The term malignant solid tumor or malignant solid tumor sign as used herein refers to an abnormal mass of tissue that does not typically contain cysts or fluid areas. Solid tumors can be benign (non-cancerous) or malignant (cancerous). Malignant solid tumors are treated with the methods of the present invention. The different types of malignant solid tumors are named by the type of cells that form them. Examples of malignant solid tumors are sarcomas, carcinomas and lymphomas. Leukemias (blood cancers) do not usually form malignant solid tumors (as defined by the National Cancer Institute of the US National Health Center). Malignant solid tumors include, but are not limited to, an abnormal mass of cells that may originate from a variety of tissue types, such as the liver, colon, colon, rectum, skin, breast, pancreas, cervix, uterine corpus, bladder, gallbladder bladder, kidneys, larynx, lip, oral cavity, esophagus, ovary, prostate gland,
- 18 044058 лудок, яички, щитовидная железа или легкие и, таким образом, включают злокачественные солидные опухоли печени, толстой кишки, ободочной и прямой кишок, кожи, молочной железы, поджелудочной железы, шейки матки, тела матки, мочевого пузыря, желчного пузыря, почек, гортани, губы, полости рта, пищевода, яичника, предстательной железы, желудка, яичек, щитовидной железы или легких. Предпочтительными злокачественными солидными опухолями, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, являются злокачественные солидные опухоли, которые происходят из кожи, молочной железы, печени, поджелудочной железы, мочевого пузыря, предстательной железы и толстой кишки и, таким образом, включают злокачественные солидные опухоли кожи, молочной железы, печени, поджелудочной железы, мочевого пузыря, предстательной железы и толстой кишки. В равной степени предпочтительными злокачественными солидными опухолями, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, являются злокачественные солидные опухоли, связанные с раком печени, такие как гепатоклеточная карцинома.- 18 044058 stomach, testicles, thyroid gland or lungs and thus includes malignant solid tumors of the liver, colon, colon and rectum, skin, breast, pancreas, cervix, uterine body, bladder, gallbladder, kidney, larynx, lip, oral cavity, esophagus, ovary, prostate, stomach, testicles, thyroid or lungs. Preferred malignant solid tumors that can be treated by the methods of the present invention are malignant solid tumors that originate from the skin, breast, liver, pancreas, bladder, prostate and colon and thus include malignant solid tumors of the skin, breast, liver, pancreas, bladder, prostate and colon. Equally preferred malignant solid tumors that can be treated by the methods of the present invention are malignant solid tumors associated with liver cancer, such as hepatocellular carcinoma.
Термин бактериальный эффекторный белок, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, в настоящем документе обозначает бактериальные эффекторные белки, которые транспортируются системами секреции в клетки-хозяева, в которых они проявляют свою вирулентную активность в отношении различных белков и клеточных аппаратов хозяина. Известно множество различных эффекторных белков, которые транспортируются различными типами систем секреции и демонстрируют широкий репертуар биохимических активностей, модулирующих функции регуляторных молекул хозяина. Системы секреции включают систему секреции 3 типа (T3SS), систему секреции 4 типа (T4SS) и систему секреции 6 типа (T6SS). Важно отметить, что некоторые эффекторные белки, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток (такие как IpaC Shigella flexneri), также относятся к классу бактериальных белков, которые являются частью аппарата системы секреции. В случае если бактериальный эффекторный белок, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, также является необходимым для функционирования аппарата секреции, такой белок исключают из данного определения. Эффекторные белки T3SS, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток, обозначают белки, такие какThe term bacterial effector protein that is virulent against eukaryotic cells as used herein refers to bacterial effector proteins that are transported by secretion systems into host cells in which they exert their virulence activity against various host proteins and cellular machinery. Many different effector proteins are known that are transported by different types of secretion systems and exhibit a wide repertoire of biochemical activities that modulate the functions of host regulatory molecules. The secretion systems include type 3 secretion system (T3SS), type 4 secretion system (T4SS), and type 6 secretion system (T6SS). It is important to note that some effector proteins that are virulent against eukaryotic cells (such as IpaC of Shigella flexneri) also belong to a class of bacterial proteins that are part of the secretion system apparatus. If a bacterial effector protein that is virulent against eukaryotic cells is also essential for the functioning of the secretion apparatus, such a protein is excluded from this definition. T3SS effector proteins that are virulent against eukaryotic cells refer to proteins such as
YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT К enterocolitica, или OspF, IpgD, IpgBl Shigella flexneri, или SopE, SopB, SptP Salmonella enterica, или ExoS, ExoT, ExoU, ExoY P. aeruginosa, или Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ E. coli.YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT K enterocolitica, or OspF, IpgD, IpgBl Shigella flexneri, or SopE, SopB, SptP Salmonella enterica, or ExoS, ExoT, ExoU, ExoY P. aeruginosa, or Tir, Map , EspF, EspG, EspH, EspZ E. coli.
Эффекторные белки T4SS, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток, обозначают белки, такие какT4SS effector proteins that are virulent against eukaryotic cells refer to proteins such as
LidA, SidC, SidG, SidH,LidA, SidC, SidG, SidH,
SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, YlfA, YlfB, VipA, VipF, VipD, VpdA, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, CeglO, Ceg23, Ceg29 Legionella pneumophila, или Bep A, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF BepG Bartonella henselae, или VirD2, VirE2, VirE3, VirF Agrobacterium tumefaciens, или CagA Я. Pylori, или коклюшный токсин Bordetella pertussis.SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, YlfA, YlfB, VipA, VipF, VipD, VpdA, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, CeglO, Ceg23, Ceg29 Legionella pneumophila, or Bep A, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF BepG Bartonella henselae, or VirD2, VirE2, VirE3, VirF Agrobacterium tumefaciens, or CagA I. Pylori, or Bordetella pertussis pertussis toxin.
Эффекторные белки T6SS, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток, обозначают белки, такие как белки VgrG Vibrio cholerae (такие как VgrG1).T6SS effector proteins that are virulent against eukaryotic cells are proteins such as the Vibrio cholerae VgrG proteins (such as VgrG1).
Термин эффекторный белок T3SS, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, или эффекторный белок бактериальной T3SS, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, в настоящем документе обозначает белки, которые в природе инжектируются системами T3S в цитозоль эукариотических клеток, и белки, которые в природе секретируются системами T3S, которые могут, например, образовывать транслокационную пору в эукариотической мембране, которые представляют собой факторы вирулентности в отношении эукариотических клеток, т.е. белки парализуют или перепрограммируют эукариотическую клетку с пользой для патогена. Эффекторы демонстрируют широкий репертуар биохимических активностей и модулируют функцию критических регуляторных механизмов хозяина, таких как, например, фагоцитоз и актиновый цитоскелет, передача воспалительных сигналов, апоптоз, эндоцитоз или секреторные пути передачи сигналов29, и включаютThe term T3SS effector protein that is virulent on eukaryotic cells or bacterial T3SS effector protein that is virulent on eukaryotic cells as used herein refers to proteins that are naturally injected by T3S systems into the cytosol of eukaryotic cells and proteins that are naturally secreted by T3S systems, which can, for example, form a translocation pore in the eukaryotic membrane, which are virulence factors against eukaryotic cells, i.e. proteins paralyze or reprogram the eukaryotic cell to the benefit of the pathogen. Effectors display a wide repertoire of biochemical activities and modulate the function of critical host regulatory mechanisms such as, for example, phagocytosis and the actin cytoskeleton, inflammatory signaling, apoptosis, endocytosis or secretory signaling pathways 29 and include
AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl,AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl,
AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml,AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml,
AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, белки семейства GALA, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2,AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA family proteins, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2,
- 19 044058- 19 044058
HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA„ SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseVSrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA„ SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseVSrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.
Эффекторные гены T3SS Yersinia, которые являются вирулентными в эукариотической клетке и могут быть делетированы/подвержены мутации, например, из Y. enterocolitica, представляют собой YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (также называемый YopJ) и YopT10. Соответствующие эффекторные гены, которые являются вирулентными в эукариотической клетке, могут быть делетированы/подвержены мутации из Shigella flexneri (например, OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (например, SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (например, ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) или Е. coli (например, Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Последовательности нуклеиновой кислоты данных генов доступны специалистам в данной области техники, например, в базе данных Genebank (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT из NC_002120 GI:10955536; эффекторные белки S. flexneri из AF386526.1 GI:18462515; эффекторы S. enterica из NC_016810.1 GI:378697983 или FQ312003.1 GI:301156631; эффекторы Р. aeruginosa из АЕ004091.2 GI:110227054 или СР000438.1 GI:115583796 и эффекторные белки Е. coli из NC_011601.1 GI:215485161).Yersinia T3SS effector genes that are virulent in the eukaryotic cell and can be deleted/mutated, for example from Y. enterocolitica, are YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (also called YopJ) and YopT 10 . Corresponding effector genes that are virulent in a eukaryotic cell may be deleted/mutated from Shigella flexneri (e.g. OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (e.g. SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (e.g. ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) or E. coli (for example, Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). The nucleic acid sequences of these genes are available to those skilled in the art, for example, in the Genebank database (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT from NC_002120 GI:10955536; S. flexneri effector proteins from AF386526.1 GI:18462515; effectors S. enterica from NC_016810.1 GI:378697983 or FQ312003.1 GI:301156631, P. aeruginosa effectors from AE004091.2 GI:110227054 or CP000438.1 GI:115583796 and E. coli effector proteins from NC_01 1601.1 GI:215485161) .
Для целей настоящего изобретения гены обозначаются строчными буквами и курсивом для отличия от белков. В случае если гены (обозначенные строчными буквами и курсивом) следуют за названием вида бактерий (такого как Е. coli), они обозначают мутацию соответствующего гена в соответствующем виде бактерий. Например, YopE обозначает эффекторный белок, кодируемый геном yopE. Y. enterocolitica yopE представляет собой Y. enterocolitica, содержащий мутацию в гене yopE.For the purposes of the present invention, genes are designated in lowercase and italics to distinguish them from proteins. When genes (indicated in lowercase and italics) follow the name of a bacterial species (such as E. coli), they indicate a mutation of the corresponding gene in the corresponding bacterial species. For example, YopE refers to the effector protein encoded by the yopE gene. Y. enterocolitica yopE is a Y. enterocolitica containing a mutation in the yopE gene.
В настоящем документе термины полипептид, пептид, белок, полипептидный и пептидный используются взаимозаменяемо и обозначают серию остатков аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями между альфа-амино- и карбоксильными группами соседних остатков. Предпочтительными являются белки, которые содержат аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 10 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере 20 аминокислот.As used herein, the terms polypeptide, peptide, protein, polypeptide and peptide are used interchangeably and refer to a series of amino acid residues linked to each other by peptide bonds between the alpha-amino and carboxyl groups of adjacent residues. Preferred are proteins that contain an amino acid sequence containing at least 10 amino acids, more preferably at least 20 amino acids.
Согласно настоящему изобретению гетерологичный белок включает встречающиеся в природе белки или их часть, а также включает искусственно сконструированные белки или их часть. В настоящем документе термин гетерологичный белок обозначает белок или его часть, отличный от эффекторного белка T3SS или его N-концевого фрагмента, с которым эффекторный белок может быть слит. В частности, гетерологичный белок в настоящем документе обозначает белок или его часть, которая не относится к протеому, т.е. всему природному белку, составляющему конкретный рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, предложенный и применяемый в настоящем изобретении, например, который не относится к протеому, т.е. всему природному белку, составляющему конкретный штамм бактерий рода Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas. Обычно гетерологичный белок получен из животного, включая человека. Предпочтительно, гетерологичный белок представляет собой белок человека или его часть. Более предпочтительно, гетерологичный белок выбран из группы, состоящей из белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков анкириновых повторов, белков передачи сигналов клетки, репортерных белков, факторов транскрипции, протеаз, малых ГТФаз, белков, связанных с GPCR (G-Protein Coupled Receptor, рецептор, сопряженный с G-белком), слитых конструкций нанотел и нанотел, эффекторов бактериальной T3SS, эффекторов бактериальной T4SS и вирусных белков. В особенности предпочтительный гетерологичный белок выбран из группы, состоящей из белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков анкириновых повторов, репортерных белков, малых ГТФаз, белков, связанных с GPCR, слитых конструкций нанотел, эффекторов бактериальной T3SS, эффекторов бактериальной T4SS и вирусных белков. Еще более предпочтительными являются гетерологичные белки, выбранные из группы, состоящей из белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла и белков анкириновых повторов. Наиболее предпочтительными являются белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, или белки, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), в частности, белки, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), такие как гетерологичные белки животных, предпочтительно, человека, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, или белки человека, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН). Белки, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), предпочтительно, представляют собой белки, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН) I типа, более предпочтительно, белки человека, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН) I типа.According to the present invention, a heterologous protein includes naturally occurring proteins or a portion thereof, and also includes artificially engineered proteins or a portion thereof. As used herein, the term heterologous protein refers to a protein or portion thereof other than a T3SS effector protein or an N-terminal fragment thereof to which the effector protein may be fused. In particular, a heterologous protein as used herein refers to a protein or part thereof that is not part of the proteome, i.e. the entire natural protein that makes up a specific recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain proposed and used in the present invention, for example, which does not belong to the proteome, i.e. the entire natural protein that makes up a specific strain of bacteria of the genus Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas. Typically the heterologous protein is derived from an animal, including a human. Preferably, the heterologous protein is a human protein or part thereof. More preferably, the heterologous protein is selected from the group consisting of proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, cell cycle regulators, ankyrin repeat proteins, cell signaling proteins, reporter proteins, factors transcription, proteases, small GTPases, GPCR (G-Protein Coupled Receptor)-related proteins, nanobody-nanobody fusions, bacterial T3SS effectors, bacterial T4SS effectors, and viral proteins. A particularly preferred heterologous protein is selected from the group consisting of proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, cell cycle regulators, ankyrin repeat proteins, reporter proteins, small GTPases, proteins associated with with GPCRs, nanobody fusion constructs, bacterial T3SS effectors, bacterial T4SS effectors, and viral proteins. Even more preferred are heterologous proteins selected from the group consisting of proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, cell cycle regulators and ankyrin repeat proteins. Most preferred are proteins involved in apoptosis or the regulation of apoptosis, or proteins involved in the induction or regulation of the interferon (IFN) response, in particular proteins involved in the induction or regulation of the interferon (IFN) response, such as heterologous animal proteins, preferably human proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, or human proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response. Proteins involved in the induction or regulation of the interferon (IFN) response are preferably proteins involved in the induction or regulation of the type I interferon (IFN) response, more preferably human proteins involved in the induction or regulation of the type I interferon (IFN) response .
- 20 044058- 20 044058
В некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит две нуклеотидные последовательности, кодирующие идентичные или два различных гетерологичных белка, слитых независимо друг от друга в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка.In some embodiments, a gram-negative bacterial strain of the present invention contains two nucleotide sequences encoding identical or two different heterologous proteins fused independently in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein.
В некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит три нуклеотидные последовательности, кодирующие идентичные или три различных гетерологичных белка, слитых независимо друг от друга в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка.In some embodiments, a Gram-negative bacterial strain of the present invention contains three nucleotide sequences encoding identical or three different heterologous proteins fused independently in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein.
Гетерологичный белок, экспрессируемый рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий, обычно характеризуется молекулярной массой от 1 до 150 кДа, предпочтительно, от 1 до 120 кДа, более предпочтительно, от 1 до 100 кДа, наиболее предпочтительно, от 10 до 80 кДа.The heterologous protein expressed by a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain typically has a molecular weight of 1 to 150 kDa, preferably 1 to 120 kDa, more preferably 1 to 100 kDa, most preferably 10 to 80 kDa.
В некоторых вариантах реализации часть гетерологичного белка содержит домен гетерологичного белка. Таким образом, в некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен гетерологичного белка. Предпочтительно, грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую один или два домена гетерологичного белка, более предпочтительно, два домена гетерологичного белка.In some embodiments, the heterologous protein portion comprises a heterologous protein domain. Thus, in some embodiments, the gram-negative bacterial strain of the present invention contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein domain. Preferably, the gram-negative bacterial strain of the present invention contains a nucleotide sequence encoding one or two heterologous protein domains, more preferably two heterologous protein domains.
В некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка.In some embodiments, a Gram-negative bacterial strain of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding repeat domains of a heterologous protein or two or more domains of different heterologous proteins fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein.
Термин гетерологичные белки, которые относятся к одному функциональному классу белков, в настоящем документе обозначает гетерологичные белки, которые выполняют одну и ту же функцию, например, гетерологичные белки, обладающие ферментативной активностью, гетерологичные белки, которые действуют в одном и том же пути передачи сигналов, таком как, например, регуляция клеточного цикла, или характеризуются общим специфичным свойством, такие как, например, относятся к одному классу бактериальных эффекторных белков. Функциональные классы белков представляют собой, например, белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, белки, которые действуют в качестве регуляторов клеточного цикла, белки анкириновых повторов, белки передачи сигналов клетки, белки, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), репортерные белки, факторы транскрипции, протеазы, малые ГТФазы, белки, связанные с GPCR, слитые конструкции нанотел и нанотела, эффекторы бактериальной T3SS, эффекторы бактериальной T4SS или вирусные белки, которые действуют совместно в биологическом процессе установления вирулентности в отношении эукариотических клеток.The term heterologous proteins, which belong to the same functional class of proteins, as used herein refers to heterologous proteins that perform the same function, for example, heterologous proteins that have enzymatic activity, heterologous proteins that act in the same signaling pathway, such as, for example, regulation of the cell cycle, or are characterized by a common specific property, such as, for example, belong to the same class of bacterial effector proteins. Functional classes of proteins are, for example, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, proteins that act as cell cycle regulators, ankyrin repeat proteins, cell signaling proteins, proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, reporter proteins, transcription factors, proteases, small GTPases, GPCR-associated proteins, nanobody-nanobody fusion constructs, bacterial T3SS effectors, bacterial T4SS effectors, or viral proteins that act cooperatively in the biological process of establishing virulence against eukaryotic cells.
Согласно настоящему изобретению домен гетерологичного белка включает домены встречающихся в природе белков, а также включает домены искусственно сконструированных белков. В настоящем документе термин домен гетерологичного белка обозначает домен гетерологичного белка, отличный от домена эффекторного белка T3SS, или домен, отличный от домена, содержащего его N-концевой фрагмент, с которым может быть слит эффекторный белок для получения слитого белка. В частности, домен гетерологичного белка в настоящем документе обозначает домен гетерологичного белка, который не относится к протеому, т.е. всему природному белку, составляющему конкретный рекомбинантный грамотрицательный штамм бактерий, предложенный и применяемый в настоящем изобретении, например, который не относится к протеому, т.е. всему природному белку, составляющему конкретный штамм бактерий рода Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas. Обычно домен гетерологичного белка получен из животного, включая человека. Предпочтительно, домен гетерологичного белка представляет собой домен белка человека. Более предпочтительно, домен гетерологичного белка представляет собой домен белка, выбранный из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), регуляторов клеточного цикла, белков анкириновых повторов, белков передачи сигналов клетки, репортерных белков, факторов транскрипции, протеаз, малых ГТФаз, белков, связанных с GPCR, слитых конструкций нанотел и нанотел, эффекторов бактериальной T3SS, эффекторов бактериальной T4SS и вирусных белков. В особенности предпочтительный домен гетерологичного белка представляет собой домен белка, выбранный из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), регуляторов клеточного цикла, белков анкириновых повторов, репортерных белков, малых ГТФаз, белков, связанных с GPCR, слитых конструкций нанотел, эффекторов бактериальной T3SS, эффекторов бактериальной T4SS и вирусных белков. В особенности еще более предпочтительными являются домены гетерологичных белков, выбранные из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, белков, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), регуляторов клеточного цикла и белков анкириновых повторов. Наиболее предпочтительными являются домены белков, участвующих в индукции или регуляцииAccording to the present invention, the heterologous protein domain includes domains of naturally occurring proteins and also includes domains of artificially engineered proteins. As used herein, the term heterologous protein domain refers to a domain of a heterologous protein other than that of a T3SS effector protein, or a domain other than the domain containing its N-terminal fragment to which the effector protein can be fused to form a fusion protein. In particular, a heterologous protein domain herein refers to a heterologous protein domain that is not part of the proteome, i.e. the entire natural protein constituting a particular recombinant gram-negative bacterial strain proposed and used in the present invention, for example, which does not belong to the proteome, i.e. the entire natural protein that makes up a specific strain of bacteria of the genus Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas. Typically, the heterologous protein domain is derived from an animal, including a human. Preferably, the heterologous protein domain is a human protein domain. More preferably, the heterologous protein domain is a protein domain selected from the group consisting of proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, cell cycle regulators, ankyrin repeat proteins, signal transduction proteins cells, reporter proteins, transcription factors, proteases, small GTPases, GPCR-related proteins, nanobody-nanobody fusion constructs, bacterial T3SS effectors, bacterial T4SS effectors, and viral proteins. A particularly preferred heterologous protein domain is a protein domain selected from the group consisting of proteins involved in apoptosis or the regulation of apoptosis, proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, cell cycle regulators, ankyrin repeat proteins, reporter proteins, small GTPases, GPCR-associated proteins, nanobody fusion constructs, bacterial T3SS effectors, bacterial T4SS effectors, and viral proteins. In particular, even more preferred are heterologous protein domains selected from the group consisting of proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, proteins involved in the induction or regulation of interferon (IFN) response, cell cycle regulators and ankyrin repeat proteins. The most preferred domains are those of proteins involved in the induction or regulation of
- 21 044058 ответа интерферона (ИФН), таких как белки животных, участвующие в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН), предпочтительно, домены гетерологичных белков человека, участвующих в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН).- 21 044058 interferon (IFN) response proteins, such as animal proteins involved in the induction or regulation of the interferon (IFN) response, preferably domains of heterologous human proteins involved in the induction or regulation of the interferon (IFN) response.
Термин повторяющиеся домены гетерологичного белка в настоящем документе обозначает слитый белок, состоящий из нескольких повторов домена гетерологичного белка, причем данные домены могут быть либо напрямую слиты друг с другом, либо между доменами может быть введен вариабельный линкер, например, линкер размером от 1 до 30, предпочтительно, от 2 до 15, более предпочтительно, от 3 до 10 аминокислот. Предпочтительно, применяют повторяющиеся идентичные домены или повторяющиеся домены, которые характеризуются идентичностью аминокислотной последовательности более 80%, обычно более 85%, предпочтительно, более 90%, еще более предпочтительно, более 95%, в частности, более 96%, более конкретно, более 97%, еще более конкретно, более 98%, наиболее конкретно, более 99%. Также предпочтительными являются идентичные домены, которые характеризуются идентичностью аминокислот, составляющей 100%. Предпочтительно, в слитом белке, как указано в настоящем документе, содержатся два повторяющихся домена, более предпочтительно, два повторяющихся идентичных домена или два повторяющихся домена, которые характеризуются идентичностью аминокислотной последовательности более 90%, предпочтительно, более 95%, наиболее предпочтительно, 100%. В настоящем изобретении также предусмотрены более двух, например, три, четыре, пять или шесть повторяющихся доменов.The term heterologous protein repeat domains as used herein means a fusion protein consisting of multiple repeats of a heterologous protein domain, which domains can either be directly fused to each other or a variable linker can be introduced between the domains, for example, a linker of size 1 to 30, preferably from 2 to 15, more preferably from 3 to 10 amino acids. Preferably, repeat identical domains or repeat domains are used which have an amino acid sequence identity of greater than 80%, typically greater than 85%, preferably greater than 90%, even more preferably greater than 95%, in particular greater than 96%, more particularly greater than 97 %, even more specifically, more than 98%, most specifically, more than 99%. Also preferred are identical domains that have 100% amino acid identity. Preferably, the fusion protein as defined herein contains two repeat domains, more preferably two identical repeat domains or two repeat domains that have greater than 90% amino acid sequence identity, preferably greater than 95%, most preferably 100%. The present invention also provides for more than two, for example three, four, five or six repeat domains.
Термин два или более доменов различных гетерологичных белков в настоящем документе обозначает слитый белок, состоящий из одного или нескольких повторов по меньшей мере двух доменов различных гетерологичных белков, например, по меньшей мере двух доменов гетерологичных белков, которые характеризуются идентичностью аминокислотной последовательности 80% или менее, предпочтительно, 60% или менее, более предпочтительно, 40% или менее, причем данные домены могут быть либо напрямую слиты друг с другом, либо между доменами может быть введен вариабельный линкер, например, линкер размером от 1 до 30, предпочтительно, от 2 до 15, более предпочтительно, от 3 до 10 аминокислот. Предпочтительно, два домена различных гетерологичных белков содержатся в слитом белке, как указано в настоящем документе. В настоящем изобретении также предусмотрены более двух, например, три, четыре, пять или шесть доменов различных гетерологичных белков.The term two or more different heterologous protein domains as used herein means a fusion protein consisting of one or more repeats of at least two different heterologous protein domains, e.g., at least two heterologous protein domains that share 80% or less amino acid sequence identity, preferably 60% or less, more preferably 40% or less, and these domains can either be directly fused to each other or a variable linker can be introduced between the domains, for example a linker of size 1 to 30, preferably 2 to 15, more preferably 3 to 10 amino acids. Preferably, two domains of different heterologous proteins are contained in the fusion protein, as defined herein. The present invention also provides more than two, for example three, four, five or six domains of different heterologous proteins.
Домен гетерологичного белка, экспрессируемый рекомбинантным грамотрицательным штаммом бактерий, обычно характеризуется молекулярной массой от 1 до 50 кДа, предпочтительно, от 1 до 30 кДа, более предпочтительно, от 1 до 20 кДа, наиболее предпочтительно, от 1 до 10 кДа.The heterologous protein domain expressed by a recombinant Gram-negative bacterial strain typically has a molecular weight of 1 to 50 kDa, preferably 1 to 30 kDa, more preferably 1 to 20 kDa, most preferably 1 to 10 kDa.
Согласно настоящему изобретению белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН, включают, без ограничения, cGAS, STING, TRIF, TBK1,According to the present invention, proteins involved in the induction or regulation of the IFN response include, but are not limited to, cGAS, STING, TRIF, TBK1,
ПСКэпсилон, IRF3, TREX1, ¥PS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11,PSKepsilon, IRF3, TREX1, ¥PS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11,
DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, 1Р8-1/МА¥8/кардиф/¥18А, Trim25, Trim32, Trim56, риплет, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSml4A, LRRFIP1, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, IFNAR1, IFNAR2, TYK2, JAKI, ISGF3, IL10R2, IFNLR1, IFNGR1, IFNGR2, JAK2, STAT4, ферменты, образующие циклические динуклеотиды (циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ), такие как WspR, DncV, DisA и DisA-подобный белок, CdaA, CdaS и cGAS или их фрагменты.DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, 1Р8-1/МА¥8/cardif/¥18А, Trim25, Trim32, Trim56, riplet, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR , TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSml4A, LRRFIP1, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, IFNAR1, IFNAR2, TYK2, JAKI, ISGF3, IL10R2, IFNLR1, IFNGR1, IF NGR2, JAK2 , STAT4, cyclic dinucleotide-forming enzymes (cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic di-GAMP cyclases), such as WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA, CdaS and cGAS or fragments thereof.
Согласно настоящему изобретению белки участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, включают, без ограничения, cGAS, STING, TRIF,According to the present invention, proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response include, but are not limited to, cGAS, STING, TRIF,
TBK1, ПСКэпсилон, IRF3, TREX1, ¥PS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16,TBK1, PSKepsilon, IRF3, TREX1, ¥PS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16,
MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, №8-1/МА¥8/кардиф/¥18А, Trim25, Trim32, Trim56, риплет, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSml4A, LRRFIPl, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, ферменты, образующие циклические динуклеотиды (циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ), такие как WspR, DncV, DisA и DisA-подобный белок, CdaA, CdaS и cGAS или их фрагменты. Предпочтительные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей изMRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, No. 8-1/MA¥8/cardif/¥18A, Trim25, Trim32, Trim56, riplet, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, TLR3, TLR7, TLR9, DAI, IFI16, IFIX, MRE11, DDX41, LSml4A, LRRFIPl, DHX9, DHX36, DHX29, DHX15, Ku70, cyclic dinucleotide-forming enzymes (cyclic di-AMP, cyclic di-GMP cyclases and cyclic di-GAMP), such as WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA, CdaS and cGAS or fragments thereof. Preferred proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of
- 22 044058 cGAS, STING, TRIF, TBK1,- 22 044058 cGAS, STING, TRIF, TBK1,
ПСКэпсилон, IRF3, TREX1, VPS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, 1Р8-1/МА¥8/кардиф/¥18А, Trim25, Trim32, Trim56, риплет, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, LSml4A, LRRFIP1, DHX29, DHX15 и ферментов, образующих циклические динуклеотиды, таких как циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ, выбранные из группы, состоящей из WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA, CdaS и cGAS или их фрагментов.PSKepsilon, IRF3, TREX1, VPS34, ATG9a, DDX3, LC3, DDX41, IFI16, MRE11, DNA-PK, RIG1, MDA5, LGP2, 1P8-1/MA¥8/cardif/¥18A, Trim25, Trim32, Trim56, riplet , TRAF2, TRAF3, TRAF5, TANK, IRF3, IRF7, IRF9, STAT1, STAT2, PKR, LSml4A, LRRFIP1, DHX29, DHX15 and cyclic dinucleotide-forming enzymes such as cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic dinucleotide cyclases. -GAMP selected from the group consisting of WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA, CdaS and cGAS or fragments thereof.
Более предпочтительные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из cGAS (такого как Uniprot. Q8N884 для белка человека), RIG1 (такого как Uniprot. 095786 для белка человека), MDA5 (такого как Uniprot. Q9BYX4 для белка человека), IPS1/MAVS (такого как Uniprot. Q7Z434 для белка человека), IRF3 (такого как Uniprot. Q14653 для белка человека), IRF7 (такого как Uniprot. Q92985 для белка человека), IRF9 (такого как Uniprot. Q00978 для белка человека) и ферментов, образующих циклические динуклеотиды, таких как циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ, выбранные из группы, состоящей из WspR (такого как Uniprot. Q9HXT9 для белка P. aeruginosa), DncV (такого как Uniprot. Q9KVG7 для белка V. cholerae), DisA и DisA-подобного белка (такого как Uniprot. Q812L9 для белка В. cereus), CdaA (такого как Uniprot. Q8Y5E4 для белка L. monocytogenes), CdaS (такого как Uniprot. 031854 или конститутивная активная мутация L44F, такая как в Seq ID № 114 для белка В. subtilis) и cGAS (такого как Uniprot. Q8N884 для белка человека) или фрагментов данных белков.More preferred proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of cGAS (such as Uniprot. Q8N884 for a human protein), RIG1 (such as Uniprot. 095786 for a human protein), MDA5 (such as Uniprot. Q9BYX4 for human protein), IPS1/MAVS (such as Uniprot. Q7Z434 for human protein), IRF3 (such as Uniprot. Q14653 for human protein), IRF7 (such as Uniprot. Q92985 for human protein), IRF9 (such as Uniprot. Q00978 for human protein) and cyclic dinucleotide forming enzymes such as cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic di-GAMP cyclases selected from the group consisting of WspR (such as Uniprot. Q9HXT9 for P. aeruginosa protein), DncV (such as Uniprot. Q9KVG7 for the V. cholerae protein), DisA and DisA-like protein (such as Uniprot. Q812L9 for the B. cereus protein), CdaA (such as Uniprot. Q8Y5E4 for the L. monocytogenes protein), CdaS (such as Uniprot. 031854 or the constitutive active mutation L44F, such as in Seq ID No. 114 for the B. subtilis protein) and cGAS (such as Uniprot. Q8N884 for human protein) or fragments of these proteins.
IPS-1/MAVS/кардиф/VISA обозначает эукариотический митохондриальный антивирусный сигнальный белок, содержащий N-концевой домен CARD с идентификатором Uniprot (www.uniprot.org) Q7Z434 для последовательности человека и Q8VCF0 для последовательности мыши. Термины IPS1/MAVS, MAVS/IPS-1 и MAVS используются в настоящем документе взаимозаменяемо и обозначают эукариотический митохондриальный антивирусный сигнальный белок, содержащий N-концевой домен CARD с идентификатором (www.uniprot.org) Q7Z434 для последовательности человека и Q8VCF0 для последовательности мыши.IPS-1/MAVS/cardif/VISA designates a eukaryotic mitochondrial antiviral signaling protein containing an N-terminal CARD domain with Uniprot (www.uniprot.org) identifier Q7Z434 for the human sequence and Q8VCF0 for the mouse sequence. The terms IPS1/MAVS, MAVS/IPS-1 and MAVS are used interchangeably herein and refer to a eukaryotic mitochondrial antiviral signaling protein containing an N-terminal CARD domain with identifier (www.uniprot.org) Q7Z434 for the human sequence and Q8VCF0 for the mouse sequence.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из белков, содержащих домен CARD или его фрагменты, и ферментов, образующих циклические динуклеотиды, таких как циклазы циклического диАМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ, или их фрагментов.In some embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of proteins containing a CARD domain or fragments thereof, and cyclic dinucleotide-forming enzymes, such as cyclic diAMP, cyclic di-GMP, and cyclic di-GAMP, or fragments thereof.
Фрагмент гетерологичных белков, участвующих в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, обычно содержит от 25 до 1000 аминокислот, предпочтительно, от 50 до 600 аминокислот, более предпочтительно, от 100 до 400 аминокислот, еще более предпочтительно, от 100 до 362 аминокислот. В некоторых вариантах реализации фрагмент гетерологичных белков, участвующих в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, содержит N-концевой фрагмент гетерологичных белков, участвующих в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, который обычно содержит от 25 до 1000 аминокислот, предпочтительно от 50 до 600 аминокислот, более предпочтительно от 100 до 400 аминокислот, еще более предпочтительно от 100 до 362 аминокислот, в частности от 100 до 246 аминокислот или содержит N-концевой фрагмент гетерологичного белка, участвующего в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, который содержит делецию аминокислотной последовательности, содержащуюся между аминокислотой 1 и аминокислотой 160 N-концевых аминокислот, предпочтительно, делецию аминокислотной последовательности, содержащую N-концевые аминокислоты 1-59 или N-концевые аминокислоты 1-160, и причем N-концевой фрагмент гетерологичного белка, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, обычно содержит от 25 до 1000 аминокислот, предпочтительно, от 50 до 600 аминокислот, более предпочтительно, от 100 до 400 аминокислот, еще более предпочтительно, от 100 до 362 аминокислот.The fragment of heterologous proteins involved in the induction or regulation of the IFN response or the type I IFN response typically contains from 25 to 1000 amino acids, preferably from 50 to 600 amino acids, more preferably from 100 to 400 amino acids, even more preferably from 100 to 362 amino acids amino acids. In some embodiments, the fragment of heterologous proteins involved in the induction or regulation of the IFN response or the type I IFN response comprises an N-terminal fragment of the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the IFN response or the type I IFN response, which typically contains from 25 to 1000 amino acids , preferably from 50 to 600 amino acids, more preferably from 100 to 400 amino acids, even more preferably from 100 to 362 amino acids, in particular from 100 to 246 amino acids or contains an N-terminal fragment of a heterologous protein involved in the induction or regulation of an IFN response or response A type I IFN that contains a deletion of the amino acid sequence contained between amino acid 1 and amino acid 160 of the N-terminal amino acids, preferably a deletion of the amino acid sequence containing N-terminal amino acids 1-59 or N-terminal amino acids 1-160, and wherein the N-terminal a heterologous protein fragment involved in the induction or regulation of the IFN response or type I IFN response typically contains from 25 to 1000 amino acids, preferably from 50 to 600 amino acids, more preferably from 100 to 400 amino acids, even more preferably from 100 to 362 amino acids amino acids.
Гетерологичные белки, содержащие фрагмент домена CARD, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, обычно содержат аминокислотную последовательность от Nконцевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-500, предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100400, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-300, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-294, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-246.Heterologous proteins containing a fragment of the CARD domain involved in the induction or regulation of the IFN response or the type I IFN response typically contain the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-500, preferably the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of the N-terminal amino acids 100,400, more preferably, the amino acid sequence from the N-terminal amino acid 1 to any of the N-terminal amino acids 100-300, more preferably, the amino acid sequence from the N-terminal amino acid 1 to any of the N-terminal amino acids 100 -294, more preferably, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-246.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, содержащие фрагмент домена CARD, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 294,In some embodiments, heterologous proteins containing a fragment of a CARD domain involved in the induction or regulation of an IFN response or a type I IFN response comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence comprising at least an N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 294,
- 23 044058 аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 246, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 245, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем Nконцевую аминокислоту 229, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере Nконцевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 228, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 218, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 217, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 100 и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 101, более конкретно, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 245, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 228, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 217 и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 100 домена CARD человека.- 23 044058 amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 246, amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 245, amino acid sequence, containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 229, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 228, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 218, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 217, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 100 and an amino acid sequence comprising at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 101, more particularly, an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 245, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 228, an amino acid sequence containing at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 217 and an amino acid sequence comprising at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 100 of the human CARD domain.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации гетерологичные белки, содержащие фрагмент домена CARD, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН или ответа ИФН I типа, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 294, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 246, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 245, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 229, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 228, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 218, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 217, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 100, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 101, более конкретно, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 245, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 228, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 217 и аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 100 домена CARD человека.In some preferred embodiments, heterologous proteins comprising a fragment of a CARD domain involved in the induction or regulation of an IFN response or a type I IFN response comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 294 , amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 246, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 245, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 229, amino acid sequence from N -terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 228, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 218, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 217, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 100, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 101, more particularly, an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 245, amino acid sequence N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 228, amino acid sequence N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 217, and amino acid sequence N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 100 of the human CARD domain.
Фрагмент ферментов, образующих циклические динуклеотиды, таких как циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ, обычно содержит аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-600, предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 50 до любой из N-концевых аминокислот 100-550, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 60 до любой из N-концевых аминокислот 100-530, в частности, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 60 до N-концевой аминокислоты 530, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 146 до N-концевой аминокислоты 507 или аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 530, более конкретно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 530 cGAS человека. В некоторых вариантах реализации фрагмент cGAS содержит, в частности, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 60 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 422, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 146 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 507, и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 161 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 522. В некоторых вариантах реализации фрагмент cGAS содержит, более конкретно, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 60 до N-концевой аминокислоты 422, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 146 до N-концевой аминокислоты 507 и аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 522.A fragment of cyclic dinucleotide-forming enzymes, such as cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic di-GAMP cyclases, typically contains the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-600, preferably the amino acid sequence from N-terminal amino acid 50 to any of N-terminal amino acids 100-550, more preferably the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to any of N-terminal amino acids 100-530, in particular the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to N-terminal amino acid 530, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 146 to N-terminal amino acid 507, or the amino acid sequence from N-terminal amino acid 161 to N-terminal amino acid 530, more specifically, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 161 to N -terminal amino acid 530 of human cGAS. In some embodiments, the cGAS fragment comprises, in particular, an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence comprising at least the N-terminal amino acid 60 and no more than the N-terminal amino acid N-terminal amino acid 422, an amino acid sequence comprising at least the N-terminal amino acid 146 and no more than the N-terminal amino acid N-terminal amino acid 507, and an amino acid sequence comprising at least the N-terminal amino acid 161 and no more than the N-terminal amino acid N-terminal amino acid 522. B In some embodiments, the cGAS fragment comprises, more specifically, an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to N-terminal amino acid 422, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 146 to N-terminal amino acid 507, and sequences from N-terminal amino acid 161 to N-terminal amino acid 522.
В более предпочтительном варианте реализации гетерологичный белок, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбран из группы, состоящей из RIG1, MDA5 и MAVS/IPS-1, содержащих домен CARD, или их фрагментов, и cGAS и его фрагмента, в частности, выбран из группы, соIn a more preferred embodiment, the heterologous protein involved in the induction or regulation of the type I IFN response is selected from the group consisting of RIG1, MDA5 and MAVS/IPS-1 containing a CARD domain, or fragments thereof, and cGAS and a fragment thereof, in particular , selected from the group, with
- 24 044058 стоящей из RIG1, содержащего домен CARD, и его фрагмента, MAVS/IPS-1, содержащего домен CARD, и его фрагмента, и cGAS и его фрагмента. Фрагменты данных белков являются в особенности предпочтительными. В данном более предпочтительном варианте реализации RIG1, MDA5 и MAVS/IPS-1, содержащие домен CARD, содержат встречающийся в природе домен или домены CARD и дополнительно С-концевые аминокислоты после встречающегося в природе домена или доменов CARD, содержащие встречающийся в природе геликазный домен в случае RIG-1 или его фрагмента, предпочтительно, фрагмент, содержащий 1-500, более предпочтительно, 1-250, еще более предпочтительно, 1-150 аминокислот, причем встречающийся в природе геликазный домен или его фрагмент не является функциональным, т.е. не связывается с доменом CARD, или содержат в направлении 5'-3' С-концевую последовательность в случае MAVS/IPS-1 или его фрагмента, предпочтительно, фрагмент, содержащий 1-500, более предпочтительно, 1-250, еще более предпочтительно, 1-150 аминокислот. В данных вариантах реализации cGAS и его фрагмент обычно содержат встречающийся в природе синтазный домен (сердцевину N-Тазы и Сконцевой домен; аминокислоты 160-522 cGAS человека, как описано в публикации, 65 и такой как Uniprot. Q8N884 для белка человека), предпочтительно, cGAS и его фрагмент содержит встречающийся в природе синтазный домен, но содержит делецию части или всего N-концевого домена, предпочтительно, делецию всего N-концевого спирального удлинения (N-концевого спирального удлинения; аминокислоты 1-160 cGAS человека, как описано в публикации 65, и такой как Uniprot. Q8N884 для белка человека). Делеция части или всего N-концевого домена, предпочтительно, представляет собой делецию аминокислот 1-59.- 24 044058 consisting of RIG1 containing a CARD domain and a fragment thereof, MAVS/IPS-1 containing a CARD domain and a fragment thereof, and cGAS and a fragment thereof. Fragments of these proteins are particularly preferred. In this more preferred embodiment, the CARD domain-containing RIG1, MDA5, and MAVS/IPS-1 comprise a naturally occurring CARD domain or domains and additionally the C-terminal amino acids after the naturally occurring CARD domain or domains comprising a naturally occurring helicase domain in in the case of RIG-1 or a fragment thereof, preferably a fragment containing 1-500, more preferably 1-250, even more preferably 1-150 amino acids, wherein the naturally occurring helicase domain or fragment thereof is not functional, i.e. does not bind to the CARD domain, or contain in the 5'-3' direction the C-terminal sequence in the case of MAVS/IPS-1 or a fragment thereof, preferably a fragment containing 1-500, more preferably 1-250, even more preferably, 1-150 amino acids. In these embodiments, the cGAS and fragment thereof typically comprise a naturally occurring synthase domain (N-Tase core and C-terminal domain; amino acids 160-522 of human cGAS as described in publication 65 and such as Uniprot. Q8N884 for human protein), preferably cGAS and its fragment contains a naturally occurring synthase domain, but contains a deletion of part or all of the N-terminal domain, preferably a deletion of the entire N-terminal helical extension (N-terminal helical extension; amino acids 1-160 of human cGAS, as described in publication 65 , and such as Uniprot. Q8N884 for human protein). The deletion of part or all of the N-terminal domain is preferably a deletion of amino acids 1-59.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из семейства RIG-I-подобного рецептора (RLR) (таких как RIG1 и MDA5) и его фрагмента, других белков, содержащих домен CARD, участвующих в антивирусной передаче сигналов и индукции ИФН I типа (таких как MAVS/IPS-1) и их фрагментов, и ферментов, образующих циклические динуклеотиды, таких как циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического ди-ГАМФ, выбранные из группы, состоящей из WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA, CdaS и cGAS и их фрагментов, которые приводят к стимуляции STING.In some embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of the RIG-I-like receptor (RLR) family (such as RIG1 and MDA5) and a fragment thereof, other CARD domain-containing proteins , involved in antiviral signaling and induction of type I IFNs (such as MAVS/IPS-1) and their fragments, and enzymes that form cyclic dinucleotides, such as cyclases cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic di-GAMP, selected from the group consisting of WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA, CdaS and cGAS and fragments thereof, which lead to stimulation of STING.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из RIG1, MDA5, LGP2, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA, CdaS и cGAS или их фрагментов, более предпочтительно, выбраны из группы, состоящей из RIG1, WspR, DncV, DisA-подобного белка и cGAS или их фрагментов.In some embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of RIG1, MDA5, LGP2, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA, CdaS, and cGAS or fragments thereof are more preferably selected from the group consisting of RIG1, WspR, DncV, DisA-like protein and cGAS or fragments thereof.
В более предпочтительном варианте реализации белок, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбран из группы, состоящей из RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA и cGAS или их фрагмента, еще более предпочтительно, выбран из группы, состоящей из RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA-подобного белка, CdaA и cGAS или их фрагмента, в частности, выбран из группы, состоящей из RIG1, MAVS/IPS-1 и cGAS или их фрагмента. Фрагменты данных белков являются в особенности предпочтительными.In a more preferred embodiment, the protein involved in the induction or regulation of the type I IFN response is selected from the group consisting of RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA and cGAS, or a fragment thereof , even more preferably, selected from the group consisting of RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA-like protein, CdaA and cGAS or a fragment thereof, in particular selected from the group consisting of RIG1, MAVS/ IPS-1 and cGAS or a fragment thereof. Fragments of these proteins are particularly preferred.
В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1 обычно содержит аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из Nконцевых аминокислот 100-500, предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-400, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-300. В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент RIG1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 246, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 245, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 229, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 228, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 218, и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 217; и фрагмент MAVS/IPS-1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 100 и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 1 и не более чем N-концевую аминокислоту 101.In this more preferred embodiment, the RIG1, MDA5, MAVS/IPS-1 fragment typically comprises the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-500, preferably the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N- terminal amino acids 100-400, more preferably, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-300. In this more preferred embodiment, the RIG1 fragment comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence comprising at least the N-terminal amino acid 1 and no more than the N-terminal amino acid 246, an amino acid sequence comprising at least the N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 245, an amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 229, an amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more N-terminal amino acid 228, an amino acid sequence comprising at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 218, and an amino acid sequence containing at least N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 217 ; and the MAVS/IPS-1 fragment contains an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence containing at least an N-terminal amino acid 1 and no more than an N-terminal amino acid 100 and an amino acid sequence containing at least an N-terminal amino acid 1 and no more than N-terminal amino acid 101.
В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент RIG1 содержит, более конкретно, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 246, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 245, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 229, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 228, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 218 и аминокислотнойIn this more preferred embodiment, the RIG1 fragment comprises, more specifically, an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 246, an amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 245, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 229, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 228, amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 218 and amino acid
- 25 044058 последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 217; и фрагмент MAVS/IPS-1 содержит, более конкретно, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 100 и аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 1 до N-концевой аминокислоты 101. В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент cGAS обычно содержит аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 1 до любой из N-концевых аминокислот 100-600, предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 50 до любой из N-концевых аминокислот 100-550, более предпочтительно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 60 до любой из N-концевых аминокислот 100-530, в частности, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 60 до N-концевой аминокислоты 530, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 146 до N-концевой аминокислоты 507 или аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 530, более конкретно, аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 60 до N-концевой аминокислоты 530 или аминокислотную последовательность от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 530 cGAS человека. В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент cGAS содержит, в частности, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 60 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 422, аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 146 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 507, и аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере N-концевую аминокислоту 161 и не более чем N-концевую аминокислоту N-концевую аминокислоту 522.- 25 044058 sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 217; and the MAVS/IPS-1 fragment comprises, more specifically, an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 100 and an amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to N-terminal amino acid 101 In this more preferred embodiment, the cGAS fragment typically comprises the amino acid sequence from N-terminal amino acid 1 to any of N-terminal amino acids 100-600, preferably the amino acid sequence from N-terminal amino acid 50 to any of N-terminal amino acids 100-550 more preferably, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to any of N-terminal amino acids 100-530, in particular, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to N-terminal amino acid 530, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 146 to N-terminal amino acid 507 or the amino acid sequence from N-terminal amino acid 161 to N-terminal amino acid 530, more specifically, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to N-terminal amino acid 530 or the amino acid sequence from N-terminal amino acid 161 to N- terminal amino acid 530 of human cGAS. In this more preferred embodiment, the cGAS fragment comprises, in particular, an amino acid sequence selected from the group consisting of an amino acid sequence comprising at least an N-terminal amino acid 60 and no more than an N-terminal amino acid, an N-terminal amino acid 422, an amino acid sequence containing at least an N-terminal amino acid 146 and no more than an N-terminal amino acid N-terminal amino acid 507, and an amino acid sequence containing at least an N-terminal amino acid 161 and no more than an N-terminal amino acid N-terminal amino acid 522 .
В данном более предпочтительном варианте реализации фрагмент cGAS более конкретно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 60 до N-концевой аминокислоты 422, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 146 до N-концевой аминокислоты 507, аминокислотной последовательности от N-концевой аминокислоты 161 до N-концевой аминокислоты 522.In this more preferred embodiment, the cGAS fragment more specifically comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence from N-terminal amino acid 60 to N-terminal amino acid 422, the amino acid sequence from N-terminal amino acid 146 to N-terminal amino acid 507, amino acid sequence from N-terminal amino acid 161 to N-terminal amino acid 522.
В еще более предпочтительном варианте реализации белок, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбран из группы, состоящей из доменов CARD1.245 RIG1 человека (SEQ ID NO: 37), доменов CARD1_228 RIG1 человека (SEQ ID NO: 128), доменов CARD1_217 RIG1 человека (SEQ ID NO: 129), доменов CARD1.246 RIG1 мыши (SEQ ID NO: 38), доменов CARD1-229 RIG1 мыши (SEQ ID NO: 110), доменов CARD1_218 RIG1 мыши (SEQ ID NO: 111), домена CARD1.100 MAVS человека (SEQ ID NO: 116), домена CARD1.101 MAVS мыши (SEQ ID NO: 130), cGAS N. vectensis (SEQ ID NO: 43), CGAS161.522 человека (SEQ ID NO: 115), cGAS146-507 мыши (SEQ ID NO: 131) и cGAS60_422 N. vectensis (SEQ ID NO: 117).In an even more preferred embodiment, the protein involved in the induction or regulation of the type I IFN response is selected from the group consisting of human RIG1 CARD1.245 domains (SEQ ID NO: 37), human RIG1 CARD1_228 domains (SEQ ID NO: 128) , human CARD1_ 217 RIG1 domains (SEQ ID NO: 129), CARD1 domains. 246 mouse RIG1 (SEQ ID NO: 38), CARD1-229 mouse RIG1 domains (SEQ ID NO: 110), CARD1_ domains 218 mouse RIG1 (SEQ ID NO: 111), CARD1 domain. 100 human MAVS (SEQ ID NO: 116), CARD1.101 domain mouse MAVS (SEQ ID NO: 130), N. vectensis cGAS (SEQ ID NO: 43), CGAS161. 522 human (SEQ ID NO: 115), mouse cGAS 146 - 507 (SEQ ID NO: 131) and N. vectensis cGAS 60 - 422 (SEQ ID NO: 117).
В конкретном предпочтительном варианте реализации белок участвует в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, причем белок, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбран из группы, состоящей из доменов CARD1.245 RIG1 человека, (SEQ ID NO: 37), доменов CARD1_228 RIG1 человека (SEQ ID NO: 128), доменов CARD1_217 RIG1 человека (SEQ ID NO: 129), домена CARD1_100 MAVS человека (SEQ ID NO: 116) и cGAS161_522 человека (SEQ ID NO: 115).In a particular preferred embodiment, the protein is involved in the induction or regulation of the type I IFN response, wherein the protein involved in the induction or regulation of the type I IFN response is selected from the group consisting of CARD1 domains. 245 human RIG1 domains, (SEQ ID NO: 37), CARD1_ domains 228 human RIG1 domains (SEQ ID NO: 128), human CARD1_ domains 217 RIG1 (SEQ ID NO: 129), human CARD1_ domain 100 MAVS (SEQ ID NO: 116) and cGAS 161_522 humans (SEQ ID NO: 115) .
В более конкретном предпочтительном варианте реализации белок, участвующий в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбран из группы, состоящей из доменов CARD1.245 RIG1 человека, доменов CARD1.246 RIG1 мыши, доменов CARD1.229 RIG1 мыши, доменов CARD1.218 RIG1 мыши, MAVS1_100 человека, cGAS N. vectensis, cGAS161-522 человека и cGAS60-422 N. vectensis.In a more specific preferred embodiment, the protein involved in the induction or regulation of the type I IFN response is selected from the group consisting of CARD1 domains. 245 human RIG1, CARD1 domains. 246 mouse RIG1, CARD1 domains. 229 mouse RIG1, CARD1 domains. 218 mouse RIG1, human MAVS1_ 100 , N. vectensis cGAS, human cGAS 161 - 522 and N. vectensis cGAS 60 - 422 .
Семейство RIG-I-подобного рецептора (RLR) содержит белки, выбранные из группы, состоящей из RIG1, MDA5 и LGP2. Предпочтительные гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, представляют собой белки RIG1 и MDA5, содержащие домен CARD, в частности, белок RIG1, содержащий домен CARD. Другие белки, содержащие домен CARD, участвующие в индукции ИФН I типа, включают белки, выбранные из группы, состоящей из MAVS/IPS-1.The RIG-I-like receptor (RLR) family contains proteins selected from the group consisting of RIG1, MDA5 and LGP2. Preferred heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are the CARD domain-containing proteins RIG1 and MDA5, in particular the CARD domain-containing protein RIG1. Other CARD domain-containing proteins involved in the induction of type I IFN include proteins selected from the group consisting of MAVS/IPS-1.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы белков, содержащих домен CARD RIG1, домен CARD MDA5 и/или домен CARD MAVS/IPS-1, и WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA, CdaS и cGAS и их фрагментов, предпочтительно, выбраны из группы белков, содержащих домен CARD RIG1 и/или домен CARD MAVS/IPS-1, и WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA и cGAS или их фрагментов.In some preferred embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group of proteins comprising a RIG1 CARD domain, an MDA5 CARD domain, and/or a MAVS/IPS-1 CARD domain, and WspR, DncV, DisA, and DisA -like protein, CdaA, CdaS and cGAS and fragments thereof are preferably selected from the group of proteins containing the RIG1 CARD domain and/or the MAVS/IPS-1 CARD domain, and WspR, DncV, DisA and DisA-like protein, CdaA and cGAS or their fragments.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из домена CARD RIG1, домена CARD MDA5, домена CARD MAVS/IPS-1, WspR, DncV, DisA и DisA-подобного белка, CdaA, CdaS и cGAS, более предпочтительно, выбраны из группы, состоящей из домена CARD RIG1, WspR, DncV, DisA-подобного белка и cGAS.In some preferred embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response are selected from the group consisting of RIG1 CARD domain, MDA5 CARD domain, MAVS/IPS-1 CARD domain, WspR, DncV, DisA, and DisA-like protein , CdaA, CdaS and cGAS are more preferably selected from the group consisting of the RIG1 CARD domain, WspR, DncV, DisA-like protein and cGAS.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, содержат один или несколько (например, два, три или четыре)In some preferred embodiments, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response comprise one or more (e.g., two, three, or four)
- 26 044058 доменов CARD, предпочтительно, содержат один или несколько (например, два, три или четыре) доменов CARD RIG1, MDA5 и/или MAVS/IPS-1, предпочтительно, RIG1 и/или MAVS/IPS-1. В более предпочтительном варианте реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, содержат домены CARD RIG1 или MDA5, в частности, RIG1.- 26044058 CARD domains preferably comprise one or more (eg two, three or four) RIG1, MDA5 and/or MAVS/IPS-1 CARD domains, preferably RIG1 and/or MAVS/IPS-1. In a more preferred embodiment, the heterologous proteins involved in the induction or regulation of the type I IFN response contain RIG1 or MDA5 CARD domains, in particular RIG1.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, выбраны из группы, состоящей из белка, индуцирующего ответ ИФН I типа, без ферментативной функции или белка, индуцирующего ответ ИФН I типа, с ферментативной функцией. Белок, индуцирующий ответ ИФН I типа, без ферментативной функции, включенный в настоящее изобретение, обычно содержит по меньшей мере один домен CARD, предпочтительно, два домена CARD. Домен CARD обычно состоит из комплекта от шести до семи альфа-спиралей, предпочтительно, упорядоченности от шести до семи антипараллельных альфа-спиралей с гидрофобной сердцевиной и внешней поверхностью, состоящей из заряженных остатков. Белок, индуцирующий ответ ИФН I типа, с ферментативной функцией, включенный в настоящее изобретение, обычно содержит фермент, образующий циклический динуклеотид (циклазы циклического ди-АМФ, циклического ди-ГМФ и циклического диГАМФ) или его домен, которые приводят к стимуляции STING, предпочтительно, диаденилатциклазу (DAC), дигуанилатциклазу (DGC) или ГМФ-АМФ-циклазу (GAC) или их домен.In some embodiments, the heterologous proteins involved in inducing or regulating the type I IFN response are selected from the group consisting of a type I IFN response-inducing protein without enzymatic function or a type I IFN response-inducing protein with enzymatic function. The type I IFN response-inducing protein without enzymatic function included in the present invention typically contains at least one CARD domain, preferably two CARD domains. The CARD domain typically consists of an array of six to seven alpha helices, preferably an arrangement of six to seven antiparallel alpha helices with a hydrophobic core and an outer surface of charged residues. The type I IFN response-inducing protein with enzymatic function included in the present invention typically contains a cyclic dinucleotide-forming enzyme (cyclic di-AMP, cyclic di-GMP and cyclic diGAMP cyclases) or a domain thereof that leads to stimulation of STING, preferably , diadenylate cyclase (DAC), diguanylate cyclase (DGC) or GMP-AMP cyclase (GAC) or a domain thereof.
Согласно настоящему изобретению белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, включают, без ограничения, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apaf1, каспазу 9, каспазу 3, каспазу 6, каспазу 7, каспазу 10, DFFA, DFFB, ROCK1, АРР, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), семейство IAP, LC8, РР2В, белки 14-3-3, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, каспазу8, каспазу2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIP, FKHR, GSK3, CDK и их ингибиторы, такие как семейство INK4 (pl6(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) и семейство Cip1/Waf1/Kip1-2 (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2). Предпочтительно, применяют Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, каспазу9, каспазу3, каспазу6, каспазу7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, каспазу8, каспазу2, RIP, RAIDD, FKHR, CDK и их ингибиторы, такие как семейство INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), наиболее предпочтительно, BIM, Bid, усеченный Bid, FADD, каспазу 3 (и ее субъединицы), Bax, Bad, Akt, CDK и их ингибиторы, такие как семейство INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))11-13. Дополнительно белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, включают DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid и tBid, Egl-1, Bcl-Gs, цитохром С, беклин, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 8.According to the present invention, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis include, but are not limited to, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apaf1, caspase 9, caspase 3, caspase 6, caspase 7 , caspase 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP family, LC8, PP2B, proteins 14-3-3, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, caspase8, caspase2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIP, FKHR, GSK3, CDK and their inhibitors, such as the INK4 family (pl6(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) and the Cip1/Waf1/Kip1-2 family (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1) , p57(Kip2) Preferably, Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, caspase9, caspase3, caspase6, caspase7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1 are used (S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, caspase8, caspase2, RIP, RAIDD, FKHR, CDK and their inhibitors such as INK4 family (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d )), most preferably BIM, Bid, truncated Bid, FADD, caspase 3 (and its subunits), Bax, Bad, Akt, CDK and their inhibitors such as the INK4 family (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18 (Ink4c), p19(Ink4d)) 11-13 . Additionally, proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis include DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid and tBid, Egl-1, Bcl-Gs, cytochrome C, beclin, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 8.
Белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из проапоптотических белков, антиапоптотических белков, ингибиторов путей, предотвращающих апоптоз, и ингибиторов путей передачи сигналов или путей, способствующих выживанию. Проапоптотические белки включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклина 1, Egl-1 и CED-13, цитохрома С, FADD, семейства каспаз и CDK и их ингибиторов, таких как семейство INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), или выбранные из группы, состоящей из Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклина 1, Egl-1 и CED-13, цитохрома С, FADD и семейства каспаз. Предпочтительными являются Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, Smac/Diablo, FADD, семейство каспаз, CDK и их ингибиторы, такие как семейство INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)). В равной степени предпочтительными являются Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, Smac/Diablo, FADD, семейство каспаз.Proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis are selected from the group consisting of pro-apoptotic proteins, anti-apoptotic proteins, inhibitors of anti-apoptosis pathways, and inhibitors of signaling or pro-survival pathways. Pro-apoptotic proteins include proteins selected from the group consisting of Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid and tBid, Bok, Apaf1, Smac/Diablo , BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, beclin 1, Egl-1 and CED-13, cytochrome C, FADD, caspase family and CDK and their inhibitors such as INK4 family (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18( Ink4c), p19(Ink4d)), or selected from the group consisting of Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid and tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, beclin 1, Egl-1 and CED-13, cytochrome C, FADD and caspase family. Preferred are Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid and tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, beclin 1, Egl-1 and CED-13, Smac/Diablo, FADD, caspase family, CDKs and their inhibitors such as INK4 family (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) . Equally preferred are Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid and tBid, Bok, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, beclin 1, Egl-1 and CED-13, Smac/Diablo, FADD, caspase family.
Антиапоптотические белки включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, семейства IAP и Bfl-1.Anti-apoptotic proteins include proteins selected from the group consisting of Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, IAP family and Bfl-1.
Предпочтительными являются Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 и Bfl-1.Preferred are Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 and Bfl-1.
Ингибиторы путей, предотвращающих апоптоз, включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bad, Noxa и Cdc25A. Предпочтительными являются Bad и Noxa.Inhibitors of anti-apoptosis pathways include proteins selected from the group consisting of Bad, Noxa and Cdc25A. Bad and Noxa are preferred.
Ингибиторы путей передачи сигналов или путей, способствующих выживанию, включают белки, выбранные из группы, состоящей из PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, р38. Предпочтительными являются PTEN, ROCK, PP2A и PHLPP.Inhibitors of signaling or pro-survival pathways include proteins selected from the group consisting of PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Preferred are PTEN, ROCK, PP2A and PHLPP.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из белков ВНЗ-только, каспаз и белков внутриклеточной передачи сигналов контроля апоптоза рецепторами смерти. Белки ВН3-только являются предпочтительными. Белки ВНЗ-только включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bad, BIM, Bid и tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, беклина 1, Egl-1 и CED-13. Предпочтительными являются Bad, BIM, Bid и tBid, в частности, tBid.In some embodiments, the heterologous proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis are selected from the group consisting of B3-only proteins, caspases, and intracellular death receptor apoptosis control signaling proteins. BH3-only proteins are preferred. BNZ-only proteins include proteins selected from the group consisting of Bad, BIM, Bid and tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 and CED-13. The preferred ones are Bad, BIM, Bid and tBid, in particular tBid.
Каспазы включают белки, выбранные из группы, состоящей из каспазы 1, каспазы 2, каспазы 3, каспазы 4, каспазы 5, каспазы 6, каспазы 7, каспазы 8, каспазы 9, каспазы 10. Предпочтительными являются каспаза 3, каспаза 8 и каспаза 9.Caspases include proteins selected from the group consisting of caspase 1, caspase 2, caspase 3, caspase 4, caspase 5, caspase 6, caspase 7, caspase 8, caspase 9, caspase 10. Preferred are caspase 3, caspase 8 and caspase 9 .
- 27 044058- 27 044058
Белки внутриклеточной передачи сигналов контроля апоптоза рецепторами смерти включают белки, выбранные из группы, состоящей из FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8,Intracellular signaling proteins for the control of apoptosis by death receptors include proteins selected from the group consisting of FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8,
CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, семейства 14-3-3, FLIP, DFF40 и 45,CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, families 14-3-3, FLIP, DFF40 and 45,
РЕА-15, SODD. Предпочтительными являются FADD и TRADD.REA-15, SODD. FADD and TRADD are preferred.
В некоторых вариантах реализации два гетерологичных белка, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, содержатся в грамотрицательном штамме бактерий, причем один белок представляет собой проапоптотический белок, а второй белок представляет собой ингибитор путей, предотвращающих апоптоз, или причем один белок представляет собой проапоптотический белок, а второй белок представляет собой ингибитор путей передачи сигналов или путей, способствующих выживанию.In some embodiments, two heterologous proteins involved in apoptosis or the regulation of apoptosis are contained in a gram-negative bacterial strain, wherein one protein is a proapoptotic protein and the second protein is an inhibitor of pathways that prevent apoptosis, or wherein one protein is a proapoptotic protein and the second protein is an inhibitor of signaling or pro-survival pathways.
Проапоптотические белки, включенные в настоящее изобретение, обычно содержат альфаспиральную структуру, предпочтительно, гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями, и обычно содержат по меньшей мере один из доменов ВН1, ВН2, BH3 или ВН4, предпочтительно, содержат по меньшей мере один домен BH3. Обычно проапоптотические белки, включенные в настоящее изобретение, не обладают ферментативной активностью.Proapoptotic proteins included in the present invention typically contain an alpha helical structure, preferably a hydrophobic helix surrounded by amphipathic helices, and typically contain at least one of BH1, BH2, BH3 or BH4 domains, preferably containing at least one BH3 domain. Typically, the proapoptotic proteins included in the present invention do not have enzymatic activity.
Антиапоптотические белки, включенные в настоящее изобретение, обычно содержат альфаспиральную структуру, предпочтительно, гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями, и содержат комбинацию различных доменов ВН1, ВН2, BH3 и ВН4, предпочтительно, комбинацию различных доменов ВН1, ВН2, BH3 и ВН4, в которой присутствует домен ВН1 и ВН2, более предпочтительно, ВН4-ВНЗ-ВН1-ВН2, ВН1-ВН2, ВН4-ВН1-ВН2 или ВНЗ-ВН1-ВН2 (от N- к С-концу). Дополнительно также включены белки, содержащие по меньшей мере один домен BIR.Antiapoptotic proteins included in the present invention typically contain an alpha helical structure, preferably a hydrophobic helix surrounded by amphipathic helices, and contain a combination of different BH1, BH2, BH3 and BH4 domains, preferably a combination of different BH1, BH2, BH3 and BH4 domains, in which there is a BH1 and BH2 domain, more preferably BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1-BH2 or BH3-BH1-BH2 (from N- to C-terminus). Additionally also included are proteins containing at least one BIR domain.
Ингибиторы путей, предотвращающих апоптоз, включенные в настоящее изобретение, обычно содержат альфа-спиральную структуру, предпочтительно, гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями, и обычно содержат один домен BH3.Inhibitors of anti-apoptosis pathways included in the present invention typically contain an alpha helical structure, preferably a hydrophobic helix surrounded by amphipathic helices, and typically contain a single BH3 domain.
Каждый из доменов ВН1, ВН2, BH3 или ВН4 обычно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот в длину. Таким образом, в некоторых вариантах реализации гетерологичные белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из гетерологичных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, которые составляют от приблизительно 5 до приблизительно 200, предпочтительно, от приблизительно 5 до приблизительно 150, более предпочтительно, от приблизительно 5 до приблизительно 100, наиболее предпочтительно, от приблизительно 5 до приблизительно 50, в частности, от приблизительно 5 до приблизительно 25 аминокислот в длину.Each of the BH1, BH2, BH3 or BH4 domains is typically from about 5 to about 50 amino acids in length. Thus, in some embodiments, the heterologous proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis are selected from the group consisting of heterologous proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis that are from about 5 to about 200, preferably from about 5 to about 150 , more preferably from about 5 to about 100, most preferably from about 5 to about 50, in particular from about 5 to about 25 amino acids in length.
В некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую два домена гетерологичных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, предпочтительно, два повторяющихся, более предпочтительно, два идентичных повторяющихся домена белка, участвующего в апоптозе или регуляции апоптоза, или два домена различных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, наиболее предпочтительно, два идентичных повторяющихся домена белка, участвующего в апоптозе или регуляции апоптоза. В некоторых вариантах реализации грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую два домена гетерологичных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, причем один представляет собой домен проапоптотического белка, а другой представляет собой домен белка, который представляет собой ингибитор путей, предотвращающих апоптоз, или причем один представляет собой домен проапоптотического белка, а другой домен представляет собой домен белка, который представляет собой ингибитор путей передачи сигналов или путей, способствующих выживанию.In some embodiments, a gram-negative bacterial strain of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding two domains of heterologous proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, preferably two repeat, more preferably two identical repeat domains of a protein involved in apoptosis or regulation of apoptosis, or two domains of different proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, most preferably two identical repeat domains of a protein involved in apoptosis or regulation of apoptosis. In some embodiments, a gram-negative bacterial strain of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding two domains of heterologous proteins involved in apoptosis or regulation of apoptosis, one being a pro-apoptotic protein domain and the other being a protein domain that is an inhibitor of pathways that prevent apoptosis. , or wherein one is a pro-apoptotic protein domain and the other domain is a protein domain that is an inhibitor of signaling pathways or pro-survival pathways.
Конкретный предпочтительный гетерологичный белок представляет собой домен BH3 индуктора апоптоза tBID, более конкретно, домен BH3, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-32, предпочтительно, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32.A particularly preferred heterologous protein is the BH3 domain of the apoptosis inducer tBID, more specifically a BH3 domain comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 29-32, preferably SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32.
В равной степени предпочтительным является домен BH3 регулятора апоптоза ВАХ, более конкретно, домен ВАХ, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33-36, предпочтительно, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. В SEQ ID NO приведены последовательности человека и мыши, однако в равной степени включены домены BH3 tBID и ВАХ всех других видов.Equally preferred is the BH3 domain of the apoptosis regulator BAX, more particularly a BAX domain comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33-36, preferably SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36. In SEQ ID NO includes human and mouse sequences, but the BH3 tBID and BAX domains of all other species are included equally.
В некоторых вариантах реализации повторяющиеся домены гетерологичных белков представляют собой домен BH3, предпочтительно, повторяющиеся домены BH3 индуктора апоптоза tBID, более предпочтительно, повторяющиеся домены BH3 индуктора апоптоза tBID, содержащиеся в SEQ ID NO: 29-32 или SEQ ID NO: 25, или SEQ ID NO: 19, еще более предпочтительно, два повторяющихся домена BH3 индуктора апоптоза tBID, наиболее предпочтительно, два повторяющихся домена BH3 индуктора апоптоза tBID, содержащегося в SEQ ID NO: 29-32, или SEQ ID NO: 25, или SEQ ID NO: 19, в частности, два повторяющихся домена BH3 индуктора апоптоза tBID, содержащиеся в последовательности SEQ ID NO: 27. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации грамотрицательный штамм бактерий и/или вектор согласно настоящему изобретению содержит вторую последовательность ДНК, кодирующую два повторяющихся домена BH3, более предпочтительно, два повторяющихся домена BH3 индуктора апоптоза tBID. Два повторяющихся домена могут быть соединены линкером длиной 1-30 аминокислот, предпочтительно, 2-15 аминокислот, более предпочтительно, длиной 3-10 аминокислот.In some embodiments, the heterologous protein repeat domains are a BH3 domain, preferably the tBID apoptosis inducer BH3 repeat domains, more preferably the tBID apoptosis inducer BH3 repeat domains contained in SEQ ID NO: 29-32 or SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 19, even more preferably, two BH3 repeat domains of the apoptosis inducer tBID, most preferably, two BH3 repeat domains of the tBID apoptosis inducer contained in SEQ ID NOs: 29-32, or SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 19, in particular, the two BH3 repeat domains of the apoptosis inducer tBID contained in the sequence SEQ ID NO: 27. Thus, in a preferred embodiment, the gram-negative bacterial strain and/or vector of the present invention contains a second DNA sequence encoding two BH3 repeat domains, more preferably, two BH3 repeat domains of the apoptosis inducer tBID. The two repeat domains may be connected by a linker of 1-30 amino acids in length, preferably 2-15 amino acids in length, more preferably 3-10 amino acids in length.
- 28 044058- 28 044058
В некоторых вариантах реализации два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домены гетерологичных белков, которые относятся к одному функциональному классу белков, предпочтительно, различные гетерологичные белки двух или более доменов представляют собой различные гетерологичные белки из класса белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза. В предпочтительном варианте реализации два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домен BH3 индуктора апоптоза tBID и домен BH3 регулятора апоптоза ВАХ, в частности, слитые домены BH3, содержащиеся в последовательности SEQ ID NO: 24 и 28. Два домена различных гетерологичных белков могут быть соединены линкером длиной 1-30 аминокислот, предпочтительно, 2-15 аминокислот, более предпочтительно, длиной 3-10 аминокислот.In some embodiments, the two or more domains of the different heterologous proteins are heterologous protein domains that belong to the same functional class of proteins, preferably, the different heterologous proteins of the two or more domains are different heterologous proteins from a class of proteins involved in apoptosis or the regulation of apoptosis. In a preferred embodiment, the two or more domains of different heterologous proteins are the BH3 domain of the apoptosis inducer tBID and the BH3 domain of the apoptosis regulator BAX, particularly the BH3 fusion domains contained in SEQ ID NOs: 24 and 28. The two domains of different heterologous proteins may be connected by a linker of 1-30 amino acids in length, preferably 2-15 amino acids in length, more preferably 3-10 amino acids in length.
Другой конкретный предпочтительный гетерологичный белок представляет собой домен белка, участвующего в индукции или регуляции ответа ИФН I типа, более конкретно, домен CARD RIG1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 38, 110, 111, 128, 129, домен CARD MDA5, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44-47, 112, 113, предпочтительно, SEQ ID NO: 112 или 113, или домен CARD MAVS/IPS-1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, 48-49, предпочтительно, SEQ ID NO: 116, полноразмерный cGAS, такой как cGAS N. vectensis (SEQ ID NO: 43), CGAS161522 человека (SEQ ID NO: 115), cGAS60-422N. vectensis (SEQ ID NO: 117) или cGAS146-507 мыши (SEQ ID NO: 131). Наиболее конкретно, домен CARD RIG1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 38, 110, 111, 128, 129, белок домена CARD, состоящий из MAVS/IPS-1, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, 48-49, предпочтительно, SEQ ID NO: 116, и полноразмерный cGAS, такой как cGAS N. vectensis (SEQ ID NO: 43), CGAS161-522 человека (SEQ ID NO: 115), CGAS60-422 N. vectensis (SEQ ID NO: 117) или CGAS146-507 мыши (SEQ ID NO: 131).Another particularly preferred heterologous protein is a domain of a protein involved in the induction or regulation of a type I IFN response, more specifically a RIG1 CARD domain containing a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 37, 38, 110, 111, 128, 129, an MDA5 CARD domain containing a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44-47, 112, 113, preferably SEQ ID NO: 112 or 113, or a MAVS/IPS-1 CARD domain containing a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 116, 48-49, preferably SEQ ID NO: 116, full-length cGAS such as N. vectensis cGAS (SEQ ID NO: 43), human CGAS 161522 (SEQ ID NO: 115) , N. vectensis cGAS 60-422 (SEQ ID NO: 117) or mouse cGAS 146-507 (SEQ ID NO: 131). Most specifically, a RIG1 CARD domain protein consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 37, 38, 110, 111, 128, 129, a CARD domain protein consisting of MAVS/IPS-1 containing a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 116, 48-49, preferably SEQ ID NO: 116, and full-length cGAS such as N. vectensis cGAS (SEQ ID NO: 43), human CGAS161-522 (SEQ ID NO: 115) , N. vectensis CGAS60-422 (SEQ ID NO: 117) or mouse CGAS146-507 (SEQ ID NO: 131).
В некоторых вариантах реализации гетерологичные белки представляют собой фермент, конвертирующий пролекарство. В данных вариантах реализации рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий экспрессирует, предпочтительно, экспрессирует и секретирует фермент, конвертирующий пролекарство. Фермент, конвертирующий пролекарство, как указано в настоящем документе, включает ферменты, конвертирующие нетоксичные пролекарства в токсичное лекарственное средство, предпочтительно, ферменты, выбранные из группы, состоящей из цитозиндезаминазы, пурин-нуклеозидфосфорилазы, тимидинкиназы, бета-галактозидазы, карбоксилэстераз, нитроредуктаз, карбоксипептидаз и бета-глюкуронидаз, более предпочтительно, ферменты, выбранные из группы, состоящей из цитозиндезаминазы, пурин-нуклеозидфосфорилазы, тимидинкиназы и бетагалактозидазы.In some embodiments, the heterologous proteins are a prodrug converting enzyme. In these embodiments, the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain expresses, preferably expresses and secretes, a prodrug-converting enzyme. A prodrug converting enzyme as defined herein includes enzymes that convert non-toxic prodrugs into a toxic drug, preferably enzymes selected from the group consisting of cytosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, thymidine kinase, beta-galactosidase, carboxylesterases, nitroreductases, carboxypeptidases and beta-glucuronidases, more preferably enzymes selected from the group consisting of cytosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, thymidine kinase and beta-galactosidase.
Термин сайт расщепления протеазы в настоящем документе обозначает специфичный аминокислотный мотив в аминокислотной последовательности, например, в аминокислотной последовательности белка или слитого белка, который расщепляется специфичной протеазой, распознающей аминокислотный мотив. Обзор см. в публикации14. Примеры сайтов расщепления протеазы представляют собой аминокислотные мотивы, которые расщепляются протеазой, выбранной из группы, состоящей из энтерокиназы (легкая цепь), энтеропептидазы, протеазы PreScission, протеазы риновируса человека (HRV 3С), протеазы TEV, протеазы TVMV, протеазы фактор Ха и тромбина. Следующие аминокислотные мотивы распознаются соответствующими протеазами:The term protease cleavage site as used herein refers to a specific amino acid motif in an amino acid sequence, for example, in the amino acid sequence of a protein or fusion protein, which is cleaved by a specific protease recognizing the amino acid motif. For an overview, see publication 14 . Examples of protease cleavage sites are amino acid motifs that are cleaved by a protease selected from the group consisting of enterokinase (light chain), enteropeptidase, PreScission protease, human rhinovirus (HRV 3C) protease, TEV protease, TVMV protease, factor Xa protease, and thrombin. The following amino acid motifs are recognized by the corresponding proteases:
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: энтерокиназа (легкая цепь)/энтеропептидаза,Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: enterokinase (light chain)/enteropeptidase,
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: протеаза PreScission/протеаза риновируса человека (HRV 3С), Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser и модифицированные мотивы на основе, Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (где χ представляет собой любую аминокислоту), распознаваемые протеазой TEV (tobacco etch virus, вируса гравировки табака),Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: PreScission protease/human rhinovirus protease (HRV 3C), Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser and modified motifs based on, Glu-X-X- Tyr-X-Gln-Gly/Ser (where χ is any amino acid), recognized by the TEV (tobacco etch virus) protease,
Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: протеаза TVMV,Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: TVMV protease,
Ile-(Glu или Asp)-Gly-Arg. протеаза фактор Ха,Ile-(Glu or Asp)-Gly-Arg. protease factor Xa,
Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: тромбин.Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: thrombin.
Сайты расщепления протеазы в настоящем документе включают убиквитин. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах реализации убиквитин используют в качестве сайта расщепления протеазы, т.е. нуклеотидная последовательность кодирует убиквитин в качестве сайта расщепления протеазы, который может быть расщеплен специфичными убиквитин-процессирующими протеазами на Nконцевом сайте, например, который может быть расщеплен специфичными убиквитинпроцессирующими протеазами, называемыми деубиквитинизирующими ферментами, на N-концевом сайте эндогенно в клетке, в которую был доставлен слитый белок. Убиквитин процессируется на С-конце группой эндогенных убиквитин-специфичных С-концевых протеаз (деубиквитинизирующие ферменты, ДУБ). Расщепление убиквитина под действием ДУБ, как полагают, происходит на самом С-конце убиквитина (после G76).Protease cleavage sites herein include ubiquitin. Thus, in some preferred embodiments, ubiquitin is used as a protease cleavage site, i.e. nucleotide sequence encodes ubiquitin as a protease cleavage site that can be cleaved by specific ubiquitin-processing proteases at the N-terminal site, for example, which can be cleaved by specific ubiquitin-processing proteases called deubiquitinating enzymes at the N-terminal site endogenously in the cell into which it was delivered fusion protein. Ubiquitin is processed at the C-terminus by a group of endogenous ubiquitin-specific C-terminal proteases (deubiquitinating enzymes, DUBs). The degradation of ubiquitin by DUB is believed to occur at the very C-terminus of ubiquitin (after G76).
Индивидуум, субъект или пациент представляет собой позвоночное. В определенных вариантах реализации позвоночное представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, без огра- 29 044058 ничения, приматов (включая человека и нечеловекообразных приматов) и грызунов (например, мышей и крыс). В предпочтительных вариантах реализации субъект представляет собой человека.The individual, subject, or patient is a vertebrate. In certain embodiments, the vertebrate is a mammal. Mammals include, but are not limited to, primates (including humans and non-human primates) and rodents (eg, mice and rats). In preferred embodiments, the subject is a human.
Термин мутация в настоящем документе используется в качестве общего термина и включает изменения одной пары оснований и множества пар оснований. Такие мутации могут включать замены, мутации со сдвигом рамки, делеции, вставки и усечения.The term mutation is used herein as a general term and includes single base pair and multiple base pair changes. Such mutations may include substitutions, frameshift mutations, deletions, insertions and truncations.
Термин сигнал внутриядерной локализации в настоящем документе обозначает аминокислотную последовательность, которая помечает белок для импорта в ядро эукариотической клетки и, предпочтительно, включает вирусный сигнал внутриядерной локализации, такой как NLS, полученный из большого Т-антигена SV40 (PPKKKRKV).The term nuclear localization signal as used herein refers to an amino acid sequence that marks a protein for import into the nucleus of a eukaryotic cell and preferably includes a viral nuclear localization signal, such as the NLS derived from SV40 large T antigen (PPKKKRKV).
Термин сайт множественного клонирования в настоящем документе обозначает короткую последовательность ДНК, содержащую несколько сайтов рестрикции для расщепления рестрикционными эндонуклеазами, такими какThe term multiple cloning site as used herein refers to a short DNA sequence containing multiple restriction sites for digestion by restriction endonucleases such as
Acll, Hindlll, SspI, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, Bael, BsaXI, AflIII, Spel, Bsrl, BmrI, Bglll, Afel, Alul, Stul, Seal, Clal, BspDI, PI-SceI, Nsil, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, Pmll, Dralll, Alel, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutl, TspRI, Ndel, Nlalll, CviAII, Fatl, MslI, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, Faul, Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, Acil, SacII, BsrBI, MspI, Hpall, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, Neil, Avril, Mnll, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, BpulOI, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, EagI, Rsrll, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspAH, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNI, Xhol, Earl, Acul, PstI, Bpml, Ddel, Sfcl, AflII, BpuEI, Smll, Aval, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, Aatll, Zral, TthllllPflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kl, SacI, BseRI, Piel, Nt.BstNBI, Mlyl, Hinfl, EcoRV, Mbol, Sau3AI, DpnIIBfuCI, Dpnl, BsaBI, Tfil, BsrDI, Nb.BsrDI, Bbvl, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, Nael, NgoMIV, Bgll, AsiSI, BtgZI, HinPlI, Hhal, BssHII, Notl, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, Nhel, Bmtl, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, Tsel, ApeKI, Bspl286I, Alwl, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, Haelll, Phol, Fsel, Sfil, Nari, KasI, Sfol, PluTI, Asci, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlalV, Kpnl, Acc65I, Bsal, HphI, BstEII, Avail, BanI, BaeGI, BsaHI, Banll, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, Sall, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, Bsgl, AccI, Hpyl66II, Tsp45I, Hpal, Pmel, Hindi, BsiHKAI, Apol, NspI, BsrFI, BstYI, Haell, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-Ceul, SnaBI, I-Scel, BspHI, BspEI, Mmel, TaqaI, Nrul, Hpyl88I, Нру188Ш, Xbal, Bell, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, Msel, PacI, Psil, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, предпочтительно, Xhol, Xbal, Hindlll, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, Sall, BstBI.Acll, Hindlll, SspI, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, Bael, BsaXI, AflIII, Spel, Bsrl, BmrI, Bglll, Afel, Alul, Stul, Seal, Clal, BspDI, PI-SceI, Nsil, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, Pmll, Dralll, Alel, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutl, TspRI, Ndel, Nlalll, CviAII, Fatl, MslI, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, Faul, Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, Acil, SacII, BsrBI, MspI, Hpall, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, Neil, Avril, Mnll, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, BpulOI, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, EagI, Rsrll, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspAH, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNI, Xhol, Earl, Acul, PstI, Bpml, Ddel, Sfcl, AflII, BpuEI, Smll, Aval, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, Aatll, Zral, TthllllPflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kl, SacI, BseRI, Piel, Nt.BstNBI, Mlyl, Hinfl, EcoRV, Mbol, Sau3AI, DpnIIBfuCI, Dpnl, BsaBI, Tfil, BsrDI, Nb.BsrDI, Bbvl, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, Nael, NgoMIV, Bgll, AsiSI, BtgZI, HinPlI, Hhal, BssHII, Notl, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, Nhel, Bmtl, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, Tsel, ApeKI, Bspl286I, Alwl, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, Haell, Phol, Fsel, Sfil, Nari, KasI, Sfol, PluTI, Asci, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlalV, Kpnl, Acc65I, Bsal, HphI, BstEII, Avail, BanI, BaeGI, BsaHI, Banll, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, Sall, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, Bsgl, AccI, Hpyl66II, Tsp45I, Hpal, Pmel, Hindi, BsiHKAI, Apol, NspI, BsrFI, BstYI, Haell, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-Ceul, SnaBI, I-Scel, BspHI, BspEI, Mmel, TaqaI, Nrul, Hpyl88I, Nru188Sh, Xbal, Bell, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, Msel, PacI, Psil, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, preferably, Xhol, Xbal, Hindllll, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, Sall, BstBI.
Термин сайт множественного клонирования в настоящем документе также обозначает короткую последовательность ДНК, используемую для событий рекомбинации, как, например, в стратегии клонирования Gateway, или для способов, таких как сборка Гиббсона или клонирование в TOPO-системе.The term multiple cloning site as used herein also refers to a short DNA sequence used for recombination events, such as in the Gateway cloning strategy, or for methods such as Gibbson assembly or TOPO cloning.
Термин штамм дикого типа или грамотрицательный штамм бактерий дикого типа в настоящем документе обозначает встречающийся в природе вариант или встречающийся в природе вариант, содержащий генетические модификации, позволяющие применять векторы, такие как делеционные мутации в рестрикционных эндонуклеазах или генах устойчивости к антибиотикам. Данные штаммы содержат хромосомную ДНК, а также в некоторых случаях (например, Y. enterocolitica, S. flexneri) - немодифицированную плазмиду вирулентности.The term wild-type strain or wild-type gram-negative bacterial strain as used herein refers to a naturally occurring variant or naturally occurring variant containing genetic modifications allowing the use of vectors, such as deletion mutations in restriction endonucleases or antibiotic resistance genes. These strains contain chromosomal DNA, and also in some cases (for example, Y. enterocolitica, S. flexneri) an unmodified virulence plasmid.
Термин штамм Yersinia дикого типа в настоящем документе обозначает встречающийся в природе вариант (такой как Y. enterocolitica Е40) или встречающийся в природе вариант, содержащий генетические модификации, позволяющие применять векторы, такие как делеционные мутации в рестрикционных эндонуклеазах или генах устойчивости к антибиотикам (такой как Y. enterocolitica MRS40, чувствительное к ампициллину производное Y. enterocolitica Е40) Данные штаммы содержат хромосомную ДНК, а также немодифицированную плазмиду вирулентности (называемую pYV). Y. enterocolitica подвид palearctica обозначает низкопатогенные штаммы Y. enterocolitica, которые отличаются от более вирулентных штаммов подвида enterocolitica15,16. В Y. enterocolitica подвид palearctica отсутствует, по сравнению с Y.The term wild-type Yersinia strain as used herein means a naturally occurring variant (such as Y. enterocolitica E40) or a naturally occurring variant containing genetic modifications allowing the use of vectors, such as deletion mutations in restriction endonucleases or antibiotic resistance genes (such as Y. enterocolitica MRS40, an ampicillin-sensitive derivative of Y. enterocolitica E40) These strains contain chromosomal DNA as well as an unmodified virulence plasmid (called pYV). Y. enterocolitica subspecies palearctica refers to low pathogenic strains of Y. enterocolitica that are distinct from the more virulent strains of enterocolitica subspecies 15,16 . In Y. enterocolitica there is no subspecies palearctica, compared to Y.
- 30 044058 enterocolitica подвид enterocolitica, остров высокой патогенности (high-pathogenicity island, HPI). Данный- 30 044058 enterocolitica subspecies enterocolitica, high-pathogenicity island (HPI). The
HPI кодирует сидерофор железа, называемый иерсиниябактин17. Отсутствие иерсиниябактина в Y. enterocolitica подвид palearctica делает данный подвид менее патогенным и зависимым от индуцируемого системно доступного железа для персистентной инфекции, например, в печени или селезенке17. Железо может стать доступным для бактерии в индивидууме, например, в результате предварительного введения дефероксамина, хелатора железа, который применяют для лечения перенасыщения железом у пациентовHPI encodes an iron siderophore called yersiniabactin 17 . The absence of yersiniabactin in Y. enterocolitica subspecies palearctica makes the subspecies less pathogenic and dependent on inducible systemically available iron for persistent infection, for example in the liver or spleen 17 . Iron may become available to the bacterium in the individual, for example, by pre-administration of deferoxamine, an iron chelator used to treat iron overload in patients
Термин содержать обычно используют в значении включать, иначе говоря, допуская присутствие одного или нескольких свойств или компонентов.The term contain is usually used to mean include, that is, allowing the presence of one or more properties or components.
Термин приблизительно обозначает диапазон значений ±10% от указанного значения. Например, фраза приблизительно 200 включает ±10% от 200 или от 180 до 220.The term approximately indicates a range of ±10% of the specified value. For example, the phrase approximately 200 includes ±10% of 200 or 180 to 220.
В одном аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, содержащий нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором.In one aspect, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain comprising a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence , encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, is operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain further contains a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains the gene, encoding the specified endogenous protein required for growth, operably linked to the promoter.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, содержащий нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в РНК в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНКсвязывающий белок типа AraC.In a further aspect, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain comprising a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence, encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, operably linked to a promoter, and wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain additionally contains a modulation in RNA in the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, содержащий нуклеотидную молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с промотором, и причем гетерологичный белок представляет собой белок, участвующий в индукции или регуляции ответа интерферона (ИФН).In a further aspect, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain comprising a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the nucleotide sequence, encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, operably linked to a promoter, and wherein the heterologous protein is a protein involved in the induction or regulation of an interferon (IFN) response.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, как описано в настоящем документе, для применения в способе лечения рака у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта. Предпочтительно, в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, как описано в настоящем документе, для применения в способе лечения рака - злокачественной солидной опухоли - у субъекта, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий накапливается в злокачественной солидной опухоли и причем указанный способ включает введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.In a further aspect, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain as described herein for use in a method of treating cancer in a subject, the method comprising administering to the subject said recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, the recombinant virulence-attenuated bacterial strain a gram-negative strain of bacteria is administered in an amount that is sufficient to treat the subject. Preferably, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain as described herein for use in a method of treating cancer - a malignant solid tumor - in a subject, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain accumulates in a malignant solid tumor, and wherein said the method includes administering to a subject said recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria, wherein the recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
В некоторых вариантах реализации рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий является дефицитным по продукции по меньшей мере одного бактериального эффекторного белка, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток.In some embodiments, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is deficient in the production of at least one bacterial effector protein that is virulent against eukaryotic cells.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий трансформирован нуклеотидной молекулой, например, вектором, который содержит в направлении от 5' к 3' промотор;In one embodiment of the present invention, a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain is transformed with a nucleotide molecule, for example, a vector that contains a 5' to 3' promoter;
первую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связанную с указанным промотором;a first nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein operably linked to said promoter;
вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом указанной первой нуклеотидной последовательности.a second nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of said first nucleotide sequence.
- 31 044058- 31 044058
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий трансформирован нуклеотидной молекулой, например, вектором, который содержит в направлении от 5' к 3' первую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал доставки или его фрагмент из бактериального эффекторного белка;In one embodiment of the present invention, a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is transformed with a nucleotide molecule, for example, a vector that contains, in the 5' to 3' direction, a first nucleotide sequence encoding a delivery signal or fragment thereof from a bacterial effector protein;
вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом указанной первой нуклеотидной последовательности.a second nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of said first nucleotide sequence.
Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, фланкирована на 3'-конце нуклеотидной последовательностью, гомологичной нуклеотидной последовательности хромосомы или эндогенной плазмиды вирулентности на 3'-конце сигнала доставки из бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. Более предпочтительно, данная нуклеотидная последовательность, фланкирующая гомологичный белок на 3'-конце, является гомологичной нуклеотидной последовательности, лежащей в пределах 10 т.п.о. на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки из бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. В частности, данная нуклеотидная последовательность, фланкирующая гомологичный белок на его 3'-конце, является гомологичной нуклеотидной последовательности в пределах того же оперона на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, что и сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, или ее фрагменту. В данном варианте реализации трансформацию обычно проводят так, чтобы слитая нуклеотидная последовательность была встроена в результате гомологичной рекомбинации на эндогенной плазмиде вирулентности или хромосоме, предпочтительно, на эндогенной плазмиде вирулентности, рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, и чтобы слитая нуклеотидная последовательность была функционально связана с промотором эндогенной плазмиды вирулентности или хромосомы, например, хромосомного острова патогенности. Предпочтительно, слитая нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором эндогенной плазмиды вирулентности. В данном варианте реализации нуклеотидная последовательность содержит сигнал доставки или его фрагмент из бактериального эффекторного белка, предпочтительно, его фрагмент, который обеспечивает гомологичную рекомбинацию в гомологичном сайте на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, предпочтительно, на эндогенной плазмиде вирулентности, которая в результате приводит к тому, что нуклеотидная последовательность размещается в рамке с 3'-концом сигнала доставки хромосомы или эндогенной плазмиды вирулентности, который функционально связан с эндогенным промотором.Preferably, the nucleotide sequence encoding the heterologous protein is flanked at the 3' end by a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of the chromosome or endogenous virulence plasmid at the 3' end of the delivery signal from the bacterial effector protein or a fragment thereof. More preferably, the nucleotide sequence flanking the homologous protein at the 3' end is homologous to a nucleotide sequence within 10 kb. on the chromosome or on an endogenous virulence plasmid at the 3' end of the delivery signal from a bacterial effector protein or fragment thereof. In particular, a given nucleotide sequence flanking a homologous protein at its 3' end is homologous to a nucleotide sequence within the same operon on the chromosome or on an endogenous virulence plasmid as the delivery signal from the bacterial effector protein, or a fragment thereof. In this embodiment, the transformation is typically carried out such that the fusion nucleotide sequence is inserted by homologous recombination on an endogenous virulence plasmid or chromosome, preferably an endogenous virulence plasmid, of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, and that the fusion nucleotide sequence is operably linked to the promoter of an endogenous virulence plasmid or chromosome, for example, a chromosomal pathogenicity island. Preferably, the fusion nucleotide sequence is operably linked to the promoter of the endogenous virulence plasmid. In this embodiment, the nucleotide sequence comprises a delivery signal or fragment thereof from a bacterial effector protein, preferably a fragment thereof, which enables homologous recombination at a homologous site on the chromosome or on an endogenous virulence plasmid, preferably on an endogenous virulence plasmid, which results in that the nucleotide sequence is placed in frame with the 3' end of the chromosome delivery signal or endogenous virulence plasmid, which is operably linked to the endogenous promoter.
В следующем варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий или рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий трансформирован нуклеотидной молекулой, предпочтительно, нуклеотидной молекулой ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, и нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной или идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, или которая является гомологичной или идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент сигнала доставки из бактериального эффекторного белка, причем сигнал доставки из бактериального эффекторного белка или его фрагмент кодируется на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, которая является гомологичной или идентичной нуклеотидной последовательности сигнала доставки из бактериального эффекторного белка или ее фрагменту, расположена на 5'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок. Более предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, фланкирована на 3'-конце нуклеотидной последовательностью, гомологичной нуклеотидной последовательности хромосомы или эндогенной плазмиды вирулентности на 3'-конце сигнала доставки из бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. Еще более предпочтительно, данная нуклеотидная последовательность, фланкирующая гомологичный белок на 3'-конце, является гомологичной нуклеотидной последовательности, лежащей в пределах 10 т.п.о. на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки из бактериального эффекторного белка, или ее фрагменту. В частности, данная нуклеотидная последовательность, фланкирующая гомологичный белок на 3'-конце, является гомологичной нуклеотидной последовательности и находится в пределах того же оперона на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, что и сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, или ее фрагменту. В данном варианте реализации трансформацию обычно проводят так, чтобы нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, была встроена на эндогенной плазмиде вирулентности или хромосоме рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, предпочтительно, на эндогенной плазмиде вирулентности, на 3'-конце сигнала доставки из бактериального эффекторного белка, кодируемого хромосомой или эндогенной плазмидой вирулентности, причем гетерологичный белок, слитый с сигналом доставки, экспрессируется и секретируется.In a further embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain or the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is transformed with a nucleotide molecule, preferably a DNA nucleotide molecule, which contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein and a nucleotide sequence that is homologous or identical to the nucleotide a sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, or which is homologous or identical to a nucleotide sequence encoding a fragment of a delivery signal from a bacterial effector protein, wherein the delivery signal from a bacterial effector protein or a fragment thereof is encoded on the chromosome or on an endogenous virulence plasmid of the recombinant virulence attenuated gram-negative strain of bacteria. Preferably, a nucleotide sequence that is homologous or identical to the nucleotide sequence of the delivery signal from the bacterial effector protein or a fragment thereof is located at the 5' end of the nucleotide sequence encoding the heterologous protein. More preferably, the nucleotide sequence encoding the heterologous protein is flanked at the 3' end by a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of the chromosome or endogenous virulence plasmid at the 3' end of the delivery signal from the bacterial effector protein, or a fragment thereof. Even more preferably, the nucleotide sequence flanking the homologous protein at the 3' end is homologous to a nucleotide sequence within 10 kb. on the chromosome or on an endogenous virulence plasmid at the 3' end of the delivery signal from a bacterial effector protein, or a fragment thereof. In particular, the nucleotide sequence flanking the homologous protein at the 3' end is homologous to the nucleotide sequence and is located within the same operon on the chromosome or on the endogenous virulence plasmid as the delivery signal from the bacterial effector protein, or a fragment thereof. In this embodiment, the transformation is typically carried out such that the nucleotide sequence encoding the heterologous protein is inserted on an endogenous virulence plasmid or chromosome of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain, preferably on the endogenous virulence plasmid, at the 3' end of the delivery signal from the bacterial effector a protein encoded by a chromosome or an endogenous virulence plasmid, wherein the heterologous protein fused to the delivery signal is expressed and secreted.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит делецию хромосомного гена, кодирующегоIn one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains a deletion of the chromosomal gene encoding
- 32 044058 эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором. В норме ген, кодирующий эндогенный белок, необходимый для роста, на эндогенной плазмиде вирулентности кодирует тот же эндогенный белок, необходимый для роста, который кодируется делетированным хромосомным геном. Предпочтительно, ген, кодирующий эндогенный фермент, необходимый для роста, и расположенный на эндогенной плазмиде вирулентности, содержит его эндогенный промотор и его эндогенный терминатор транскрипции. В случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, ген, кодирующий эндогенный фермент, необходимый для роста, расположен на эндогенной плазмиде вирулентности pYV и, предпочтительно, содержит его эндогенный промотор и его эндогенный терминатор транскрипции. Ген, кодирующий эндогенный фермент, необходимый для роста, эндогенный промотор и эндогенный терминатор транскрипции, предпочтительно, расположены на расстоянии 122 п.о. в направлении 3'-5' от старта orf155 (SycO) на эндогенной плазмиде вирулентности, например, на pYV. Ген, кодирующий эндогенный фермент, необходимый для роста, эндогенный промотор и эндогенный терминатор транскрипции, обычно заменяет вставку последовательности, обнаруженную в pYVe40, плазмиде вирулентности штаммов Y. enterocolitica MRS40 и E40, но не в pYVe227, плазмиде вирулентности Y. enterocolitica W227O3 (Genbank: AF102990.1).- 32 044058 endogenous protein necessary for growth, and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding the specified endogenous protein necessary for growth, operably linked to a promoter. Normally, the gene encoding an endogenous growth protein on an endogenous virulence plasmid encodes the same endogenous growth protein encoded by the deleted chromosomal gene. Preferably, the gene encoding an endogenous enzyme required for growth and located on an endogenous virulence plasmid contains its endogenous promoter and its endogenous transcription terminator. In case the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, the gene encoding the endogenous enzyme required for growth is located on the endogenous virulence plasmid pYV and preferably contains its endogenous promoter and its endogenous transcription terminator. The gene encoding the endogenous enzyme required for growth, the endogenous promoter and the endogenous transcription terminator are preferably located at a distance of 122 bp. in the 3'-5' direction from the start of orf155 (SycO) on an endogenous virulence plasmid, for example, on pYV. The gene encoding an endogenous enzyme required for growth, an endogenous promoter, and an endogenous transcription terminator typically replaces the insertion sequence found in pYVe40, the virulence plasmid of Y. enterocolitica strains MRS40 and E40, but not in pYVe227, the virulence plasmid of Y. enterocolitica W227O3 (Genbank: AF102990.1).
В случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, эндогенная плазмида вирулентности представляет собой pYV (plasmid of Yersinia Virulence, плазмида вирулентности Yersinia). В случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, эндогенное месторасположение для вставки представляет собой один из кластеров генов, называемых SpiI или SpiII (для острова патогенности Salmonella), положение, в котором эффекторный белок кодируется в другом месте или, в качестве альтернативы, одну из плазмид вирулентности Salmonella (SVP).If the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, the endogenous virulence plasmid is pYV (plasmid of Yersinia Virulence, Yersinia virulence plasmid). In the event that the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain, the endogenous location for insertion is one of the gene clusters called SpiI or SpiII (for the Salmonella pathogenicity island), a position at which the effector protein is encoded elsewhere or, in alternatively, one of the Salmonella virulence plasmids (SVPs).
Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, слитый в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, встроена на эндогенной плазмиде вирулентности в нативном сайте бактериального эффекторного белка, например, в нативном сайте фактора вирулентности, предпочтительно, в случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, - в нативном сайте YopE или другого Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), предпочтительно, в нативном сайте YopE, или в случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, - в нативном сайте эффекторного белка, кодируемого в SpiI, SpiII или кодируемого в другом месте, предпочтительно, в нативном сайте эффекторного белка, кодируемого в SpiI или SpiII, более предпочтительно, в нативном сайте SopE или SteA. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, слитый в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с нативным промотором бактериального эффекторного белка, присутствующим на эндогенной плазмиде вирулентности, например, в случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, - с нативным промотором из гена вирулона Yersinia, как указано ниже, более предпочтительно, с нативным промотором YopE или другим промотором Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), предпочтительно, с нативным промотором YopE, или в случае если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, - с нативным промотором из острова патогенности SpiI или SpiII или из эффекторного белка, кодируемого в другом месте, как указано ниже, более предпочтительно, с нативным промотором SopE, InvB или SteA.Preferably, a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is inserted on an endogenous virulence plasmid at the native site of the bacterial effector protein, for example, at the native site of a virulence factor, preferably if the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, at the native site of YopE or another Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferably at the native YopE site, or if the recombinant virulence-attenuated the gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain at the native site of an effector protein encoded by SpiI, SpiII or encoded elsewhere, preferably at the native site of an effector protein encoded by SpiI or SpiII, more preferably at the native site of SopE or SteA. Preferably, the nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein is operably linked to a native bacterial effector protein promoter present on an endogenous virulence plasmid, for example in the case where the recombinant is attenuated in terms of virulence, the gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, - with a native promoter from the Yersinia virulon gene, as indicated below, more preferably with a native YopE promoter or another Yop promoter (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferably with a native the YopE promoter, or if the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain, with a native promoter from the SpiI or SpiII pathogenicity island or from an effector protein encoded elsewhere as specified below, more preferably with a native SopE promoter , InvB or SteA.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором, причем ген, кодирующий эндогенный белок, необходимый для роста, выбран из гена, кодирующего фермент, необходимый для продукции аминокислоты, гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе пептидогликана, гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе ЛПС, гена, кодирующего фермент, участвующий в синтезе нуклеотида, и гена, кодирующего фактор инициации трансляции.In one embodiment of the present invention, a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain comprises a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous growth protein and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding said endogenous growth protein operably linked with a promoter, wherein the gene encoding an endogenous protein necessary for growth is selected from a gene encoding an enzyme necessary for the production of an amino acid, a gene encoding an enzyme involved in the biosynthesis of peptidoglycan, a gene encoding an enzyme involved in the biosynthesis of LPS, a gene encoding an enzyme , involved in the synthesis of the nucleotide, and the gene encoding the translation initiation factor.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит делецию хромосомного гена, кодирующего эндогенный белок, необходимый для роста, и эндогенную плазмиду вирулентности, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий указанный эндогенный белок, необходимый для роста, функционально связанный с промотором, и причем ген, кодирующий эндогенный фермент, необходимый для роста, представляет собой ген, кодирующий фермент, необходимый для проIn one embodiment of the present invention, a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain comprises a deletion of a chromosomal gene encoding an endogenous growth protein and an endogenous virulence plasmid containing a nucleotide sequence that contains a gene encoding said endogenous growth protein operably linked with a promoter, and wherein the gene encoding an endogenous enzyme necessary for growth is a gene encoding an enzyme necessary for production
- 33 044058 дукции аминокислоты, причем фермент, необходимый для продукции аминокислоты, выбран из группы, состоящей из аспартат-бета-полуальдегид-дегидрогеназы (asd), глутаминсинтетазы (glnA), триптофанилтРНК-синтетазы (trpS) или серин-гидроксиметил-трансферазы (glyA) или транскетолазы 1 (tktA), транскетолазы 2 (tktB), рибулозофосфат 3-эпимеразы (rpe), рибозо-5-фосфат-изомеразы A (rpiA), трансальдолазы A (talA), трансальдолазы В (talB), фосфорибозилпирофосфатсинтазы (prs), АТФ-фосфорибозилтрансферазы (hisG), бифункционального белка биосинтеза гистидина HisIE (hisI), 1-(5фосфорибозил)-5-[(5-фосфорибозиламино)метилиденамино]имидазол-4-карбоксамид-изомеразы (hisA), субъединицы HisH имидазолглицеролфосфатсинтазы (hisH), субъединицы HisF имидазолглицеролфосфатсинтазы (hisF), бифункционального белка биосинтеза гистидина HisB (hisB), гистидинолфосфатаминотрансферазы (hisC), гистидинолдегидрогеназы (hisD), 3-дегидрохинатсинтазы (aroB), 3-дегидрохинатдегидратазы (aroD), шикиматдегидрогеназы (NADP(+)) (aroE), шикиматкиназы 2 (aroL), шикиматкиназы 1 (aroK), 3-фосфошикимат 1-карбоксивинилтрансферазы (aroA), хоризматсинтазы (aroC), Р-белка (pheA), T-белка (tyrA), аминотрансферазы ароматических аминокислот (tyrB), фосфо-2-дегидро-3дезоксигептонатальдолазы (aroG), фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазы (aroH), фосфо-2дегидро-3-дезоксигептонатальдолазы (aroF), хинат/шикимат-дегидрогеназы (ydiB), АТФ-зависимого изофермента 6-фосфофруктокиназы 1 (pfkA), АТФ-зависимого изофермента 6-фосфофруктокиназы 2 (pfkB), фруктозо-бисфосфатальдолазы класса 2 (fbaA), фруктозо-бисфосфат альдолазы класса 1 (fbaB), триозофосфат-изомеразы (tpiA), пируваткиназы I (pykF), пируваткиназы II (pykA), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы A (gapA), фосфоглицераткиназы (pgk), 2,3-бисфосфоглицерат-зависимой фосфоглицератмутазы (gpmA), 2,3-бисфосфоглицерат-независимой фосфоглицератмутазы (gpmM/yibO), предполагаемой фосфоглицератмутазы (ytjC/gpmB), енолазы (eno), D-3-фосфоглицератдегидрогеназы (serA), фосфосеринаминотрансферазы (serC), фосфосеринфосфатазы (serB), L-сериндегидратазы I (sdaA), Lсериндегидратазы 2 (sdaB), L-треониндегидратазы катаболической (tdcB), L-треониндегидратазы биосинтетической (ilvA), L-сериндегидратазы (tdcG), серинацетилтрансферазы (cysE), цистеинсинтазы A (cysK), цистеинсинтазы В (cysM), бета-цистатионазы (malY), цистатионин бета-лиазы (metC), 5-метилтетрагидроптероилтриглутамат-гомоцистеин-метилтрансферазы (metE), метионинсинтазы (metH), S-аденозилметионинсинтазы (metK), цистатионин гамма-синтазы (metB), гомосерин О-сукцинилтрансферазы (metA), 5'метилтиоаденозин/S-аденозилгомоцистеин-нуклеозидазы (mtnN), S-рибозилгомоцистеинлиазы (luxS), цистатион бета-лиазы, цистатион гамма-лиазы, серин-гидроксиметилтрансферазы (glyA), глицингидроксиметилтрансферазы (itaE), малой субъединицы 3-изопропилмалатдегидратазы (leuD), большой субъединицы 3-изопропилмалатдегидратазы (leuC), 3-изопропилмалатдегидрогеназы (leuB), L-треониндегидратазы биосинтетической (ilvA), большой субъединицы изофермента 3 ацетолактатсинтазы (ilvI), малой субъединицы изофермента 3 ацетолактатсинтазы (ilvH), малой субъединицы изофермента 1 ацетолактатсинтазы (ilvN), малой субъединицы изофермента 2 ацетолактатсинтазы (ilvM), кетол-кислотной редуктоизомеразы (NADP(+)) (ilvC), дегидратазы дигидроксикислоты (ilvD), аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью (ilvE), бифункциональной дегидрогеназы аспартокиназы/гомосерина 1 (thrA), бифункциональной дегидрогеназы аспартокиназы/гомосерина 2 (metL), 2-изопропилмалатсинтазы (leuA), глутамат-пируват-аминотрансферазы (alaA), аспартатаминотрансферазы (aspC), бифункциональной дегидрогеназы аспартокиназы/гомосерина 1 (thrA), бифункциональной дегидрогеназы аспартокиназы/гомосерина 2 (metL), лизин-чувствительной аспартокиназы 3 (lysC), аспартат-полуальдегид-дегидрогеназы (asd), 2-кето-3-дезокси-галактонат-альдолазы (yagE), 4гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазы (dapA), 4-гидрокси-тетрагидродипиколинат-редуктазы (dapB), 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат N-сукцинилтрансферазы (dapD), сукцинилдиаминопимелат-десукцинилазы (dapE), диаминопимелат-эпимеразы (dapF), предполагаемой лиазы (yjhH), ацетилорнитин/сукцинилдиаминопимелат-аминотрансферазы (argD), цитратсинтазы (gltA), аконитатгидратазы В (acnB), аконитатгидратазы А (acnA), неохарактеризованной предполагаемой аконитатгидратазы (ybhJ), изоцитратдегидрогеназы (icd), аспартат-аминотрансферазы (aspC), глутамат-пируватаминотрансферазы (alaA), большой цепи глутаматсинтазы [NADPH] (gltB), малой цепи глутаматсинтазы [NADPH] (gltD), глутаминсинтетазы (glnA), ацетилтрансферазы аминокислот (argA), ацетилглутаматкиназы (argB), N-ацетил-гамма-глутамил-фосфат редуктазы (argC), ацетилорнитин/сукцинилдиаминопимелат-аминотрансферазы (argD), ацетилорнитин-деацетилазы (argE), цепи F орнитинкарбамоилтрансферазы (argF), цепи I орнитинкарбамоилтрансферазы (argI), аргининосукцинатсинтазы (argG), аргининосукцинатлиазы (argH), глутамат 5-киназы (proB), гамма-глутамилфосфатредуктазы (proA), пирролин-5-карбоксилатредуктазы (proC), орнитинциклодеаминазы, лейцин-тРНК лигазы (leuS), глутамин-тРНК лигазы (glnS), серин-тРНК лигазы (serS), бета-субъединицы глицин-tPFIK лигазы (glyS), альфа-субъединицы глицин-тРНК лигазы (glyQ), тирозин-тРНК лигазы (tyrS), треонин-тРНК лигазы (thrS), альфа-субъединицы фенилаланин-тРНК лигазы (pheS), бета-субъединицы фенилаланин-тРНК лигазы (pheT), аргинин-тРНК лигазы (argS), гистидин-тРНК лигазы (hisS), валин-тРНК лигазы (valS), аланин-тРНК лигазы (alaS), изолейцин-тРНК лигазы (ileS), пролин-тРНК лигазы (proS), цистеин-тРНК лигазы (cysS), аспарагин-тРНК лигазы (asnS), аспартат-тРНК лигазы (aspS), глутамат-тРНК лигазы (gltX), триптофан-тРНК лигазы (trpS), бета-субъединицу глицин-тРНК лигазы (glyS), метионин-тРНК лигазы (metG), лизин-тРНК лигазы (lysS). Предпочтительные ферменты, необходимые для продукции аминокислоты, представляют собой- 33 044058 amino acid production, wherein the enzyme necessary for the production of the amino acid is selected from the group consisting of aspartate beta-semialdehyde dehydrogenase (asd), glutamine synthetase (glnA), tryptophanyl tRNA synthetase (trpS) or serine hydroxymethyl transferase (glyA ) or transketolase 1 (tktA), transketolase 2 (tktB), ribulose phosphate 3-epimerase (rpe), ribose 5-phosphate isomerase A (rpiA), transaldolase A (talA), transaldolase B (talB), phosphoribosyl pyrophosphate synthase (prs) , ATP phosphoribosyltransferase (hisG), bifunctional histidine biosynthetic protein HisIE (hisI), 1-(5-phosphoribosyl)-5-[(5-phosphoribosylamino)methylidenamino]imidazole-4-carboxamide isomerase (hisA), subunit HisH imidazoleglycerol phosphate synthase (hisH) , HisF subunits of imidazoleglycerol phosphate synthase (hisF), bifunctional histidine biosynthesis protein HisB (hisB), histidinol phosphate aminotransferase (hisC), histidinol dehydrogenase (hisD), 3-dehydroquinate synthase (aroB), 3-dehydroquinate dehydratase (aroD), shikimate dehydrogenase (NADP(+)) (aroE ), shikimate kinase 2 (aroL), shikimate kinase 1 (aroK), 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (aroA), chorismate synthase (aroC), P protein (pheA), T protein (tyrA), aromatic amino acid aminotransferase (tyrB), phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonaldolase (aroG), phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonataldolase (aroH), phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonataldolase (aroF), quinate/shikimate dehydrogenase (ydiB), ATP-dependent isoenzyme 6- phosphofructokinase 1 (pfkA), ATP-dependent isoenzyme 6-phosphofructokinase 2 (pfkB), fructose bisphosphate aldolase class 2 (fbaA), fructose bisphosphate aldolase class 1 (fbaB), triose phosphate isomerase (tpiA), pyruvate kinase I (pykF), pyruvate kinase II (pykA), glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase A (gapA), phosphoglycerate kinase (pgk), 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase (gpmA), 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (gpmM/yibO), putative phosphoglycerate mutase (ytjC/ gpmB), enolase (eno), D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (serA), phosphoserine aminotransferase (serC), phosphoserine phosphatase (serB), L-serine dehydratase I (sdaA), L-serine dehydratase 2 (sdaB), L-threonine dehydratase catabolic (tdcB), L -threonine dehydratase biosynthetic (ilvA), L-serine dehydratase (tdcG), serine acetyltransferase (cysE), cysteine synthase A (cysK), cysteine synthase B (cysM), beta-cystathionase (malY), cystathionine beta-lyase (metC), 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate- homocysteine methyltransferase (metE), methionine synthase (metH), S-adenosylmethionine synthase (metK), cystathionine gamma synthase (metB), homoserine O-succinyltransferase (metA), 5'methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase (mtnN), S- ribosylgomocysteinliasis (luxs), cystaione beta-Liazia, cystaion gamma-liazia, serine-hydroxymethyltransferase (Glya), glycinghydroxymethyltransferase, small subunit 3-izpropilmalatdehydase (LeuD), large subunit of 3-ampolm Latdehydratase (LEC), 3-Izopropilmalatdehydrogenase (LEUB ), L-threonine dehydratase biosynthetic (ilvA), large subunit of isoenzyme 3 acetolactate synthase (ilvI), small subunit of isoenzyme 3 acetolactate synthase (ilvH), small subunit of isoenzyme 1 acetolactate synthase (ilvN), small subunit of isoenzyme 2 acetolactate synthase (ilvM), ketol acid relative reductoisomerase (NADP(+)) (ilvC), dihydroxy acid dehydratase (ilvD), branched-chain amino acid aminotransferase (ilvE), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1 (thrA), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 2 (metL), 2-isopropylmalate synthase (leuA ), glutamate pyruvate aminotransferase (alaA), aspartate aminotransferase (aspC), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1 (thrA), bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 2 (metL), lysine-sensitive aspartokinase 3 (lysC), aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd), 2-keto-3-deoxy-galactonate aldolase (yagE), 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (dapA), 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase (dapB), 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2,6 -dicarboxylate N-succinyltransferase (dapD), succinyldiaminopimelate desuccinylase (dapE), diaminopimelate epimerase (dapF), putative lyase (yjhH), acetylornithine/succinyldiaminopimelate aminotransferase (argD), citrate synthase (gltA), aconitate hydratase B (acnB), aconite athydratase A (acnA), uncharacterized putative aconitate hydratase (ybhJ), isocitrate dehydrogenase (icd), aspartate aminotransferase (aspC), glutamate pyruvate aminotransferase (alaA), large chain glutamate synthase [NADPH] (gltB), small chain glutamate synthase [NADPH] (gltD) , glutaminesynthesis (GLNA), amino acid acetyltransferase (Arga), acetylglutamatkinase (Argb), n-acetyl-gamma-phosphate reductase (Argc), acetilornitin/succinopiminopimela-aminotransferase Lornin-deacilasis (Arge), chains f ornitinkarbamoiltransferase (argF), ornithine carbamoyltransferase chain I (argI), argininosuccinate synthase (argG), argininosuccinate lyase (argH), glutamate 5-kinase (proB), gamma-glutamyl phosphate reductase (proA), pyrroline-5-carboxylate reductase (proC), ornithine cyclodeaminase, leucine-tRNA ligase (leuS), glutamine-tRNA ligase (glnS), serine-tRNA ligase (serS), glycine-tPFIK ligase beta subunit (glyS), glycine-tRNA ligase alpha subunit (glyQ), tyrosine-tRNA ligase (tyrS) , threonine tRNA ligase (thrS), phenylalanine tRNA ligase alpha subunit (pheS), phenylalanine tRNA ligase beta subunit (pheT), arginine tRNA ligase (argS), histidine tRNA ligase (hisS), valine tRNA ligase (valS), alanine-tRNA ligase (alaS), isoleucine-tRNA ligase (ileS), proline-tRNA ligase (proS), cysteine-tRNA ligase (cysS), asparagine-tRNA ligase (asnS), aspartate-tRNA ligase ( aspS), glutamate-tRNA ligase (gltX), tryptophan-tRNA ligase (trpS), glycine-tRNA ligase beta subunit (glyS), methionine-tRNA ligase (metG), lysine-tRNA ligase (lysS). The preferred enzymes required for amino acid production are
- 34 044058 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, более предпочтительными являются asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, наиболее предпочтительным является asd.- 34 044058 tktA, rpe, prs, aroK, tyrB, aroH, fbaA, gapA, pgk, eno, tdcG, cysE, metK, glyA, asd, dapA/B/D/E/F, argC, proC, leuS, glnS , serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, more preferred are asd, glyA, leuS, glnS, serS, glyS/Q, tyrS, thrS, pheS/T, argS, hisS, valS, alaS, ileS, proS, cysS, asnS, aspS, gltX, trpS, glyS, metG, lysS, most preferred is asd .
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий дополнительно содержит модуляцию в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC. Модуляция в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC, может представлять собой делецию, вставку или замену в термочувствительной области РНК. Делеция или вставка обычно включает делецию или вставку одного или нескольких, предпочтительно, от приблизительно 30 до приблизительно 100 нуклеотидов, более предпочтительно, от приблизительно 40 до приблизительно 60 нуклеотидов. Замена обычно включает замену одного или нескольких, предпочтительно, от приблизительно 3 до приблизительно 30 нуклеотидов, более предпочтительно, от приблизительно 3 до приблизительно 15 нуклеотидов. Предпочтительно, модуляция в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC, представляет собой делецию, предпочтительно, делецию от приблизительно 30 до приблизительно 100 нуклеотидов, более предпочтительно, от приблизительно 40 до приблизительно 60 нуклеотидов в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC. Эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC и термочувствительная область РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего ДНКсвязывающий белок типа AraC, обычно расположены на эндогенной плазмиде вирулентности, содержащейся в рекомбинантном аттенуированном по вирулентности грамотрицательном штамме бактерий. ДНК-связывающий белок типа AraC, предпочтительно, выбран из группы, состоящей из VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD и InvF. Более предпочтительно, ДНК-связывающий белок типа AraC выбран из группы, состоящей из VirF и LcrF. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой Yersinia enterolitica, и ДНК-связывающий белок типа AraC представляет собой VirF.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain further comprises a modulation in a temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction of a gene encoding an endogenous DNA-binding protein such as AraC. Modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the direction 3'-5' from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type can be a deletion, insertion or substitution in the temperature-sensitive region of the RNA. The deletion or insertion typically involves the deletion or insertion of one or more, preferably from about 30 to about 100 nucleotides, more preferably from about 40 to about 60 nucleotides. The substitution typically involves a substitution of one or more, preferably from about 3 to about 30 nucleotides, more preferably from about 3 to about 15 nucleotides. Preferably, the modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous AraC-type DNA binding protein is a deletion, preferably a deletion of about 30 to about 100 nucleotides, more preferably from about 40 to about 60 nucleotides nucleotides in the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type. The endogenous DNA-binding protein of the AraC type and the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the DNA-binding protein of the AraC type are usually located on an endogenous virulence plasmid contained in a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain. The AraC type DNA binding protein is preferably selected from the group consisting of VirF, LcrF, MxiE, ExsA, PerA, HrpX, HrpB, GadX, HilC, HilD and InvF. More preferably, the AraC type DNA binding protein is selected from the group consisting of VirF and LcrF. In some embodiments, the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain is Yersinia enterolitica, and the AraC-type DNA binding protein is VirF.
Предпочтительно, модуляция в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC, включает модуляцию, которая нарушает шпильку РНК, предпочтительно, шпильку I, в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНКсвязывающий белок типа AraC. Более предпочтительно, модуляция в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC, включает делецию, которая устраняет шпилечную структуру РНК или ее части, предпочтительно, части шпильки I, в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC. Делеция, которая устраняет шпилечную структуру РНК или ее части, обычно включает делецию от приблизительно 30 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно, от приблизительно 40 до приблизительно 60 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой Yersinia enterolitica, и делеция включает делецию нуклеотидов в положении от -111 до -57 в направлении 3'-5' кодирующей последовательности virF (где -1 представляет собой 1 основание в направлении 3'-5' от основания А стартового кодона ATG кодирующей последовательности virF).Preferably, modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous AraC-type DNA binding protein involves modulation that disrupts the RNA hairpin, preferably hairpin I, in the 3'-5' direction from the gene encoding endogenous DNA-binding protein of the AraC type. More preferably, the modulation in the temperature-sensitive region of the RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding the endogenous AraC-type DNA binding protein involves a deletion that eliminates the RNA hairpin structure or portions thereof, preferably a portion of hairpin I, in the 3'-direction. 5' from the gene encoding the endogenous DNA-binding protein of the AraC type. A deletion that eliminates an RNA hairpin structure or portions thereof typically involves a deletion of about 30 to about 100 nucleotides, preferably about 40 to about 60 nucleotides. In some embodiments, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is Yersinia enterolitica, and the deletion includes a deletion of nucleotides at positions -111 to -57 in the 3' to 5' direction of the virF coding sequence (where -1 represents 1 base in the 3 '-5' from base A of the ATG start codon of the virF coding sequence).
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий выбран из группы, состоящей из родов Yersinia, Escherichia, Salmonella и Pseudomonas. В одном варианте реализации рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий выбран из группы, состоящей из родов Yersinia и Salmonella. Предпочтительно, рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, более предпочтительно, штамм Yersinia enterocolitica. Наиболее предпочтительным является Yersinia enterocolitica E40 (0:9, биотип 2)19 или его чувствительные к ампициллину производные, такие как Y. enterocolitica MRS40 (также называемый Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40), описанные в публикации20. Y. enterocolitica E40 и его производное Y. enterocolitica MRS40, описанные в публикации 20, являются идентичными Y. enterocolitica подвид palearctica E40 и его производному Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40, описанным в публикациях15,17,21 Также предпочтительно рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, более предпочтительно, штамм Salmonella enterica. Наиболее предпочтительным является Salmonella enterica серовар Тифимуриум SL1344, описанный в коллекции культур Управления здравоохранения Англии (NCTC 13347).In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is selected from the group consisting of the genera Yersinia, Escherichia, Salmonella, and Pseudomonas. In one embodiment, the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain is selected from the group consisting of the genera Yersinia and Salmonella. Preferably, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, more preferably a Yersinia enterocolitica strain. Most preferred is Yersinia enterocolitica E40 (0:9, biotype 2) 19 or its ampicillin-sensitive derivatives, such as Y. enterocolitica MRS40 (also called Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40), described in publication 20 . Y. enterocolitica E40 and its derivative Y. enterocolitica MRS40, described in publication 20 , are identical to Y. enterocolitica subspecies palearctica E40 and its derivative Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40, described in publications 15,17,21 Also preferably recombinant virulence-attenuated Gram-negative the bacterial strain is a Salmonella strain, more preferably a Salmonella enterica strain. The most preferred is Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344, described in the Culture Collection of Public Health England (NCTC 13347).
- 35 044058- 35 044058
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм, который не продуцирует сидерофор, например, является дефицитным по продукции сидерофора, предпочтительно, не продуцирует сидерофоры, например, является дефицитным по продукции любого сидерофора. Такой штамм представляет собой, например, Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40, описанный в публикациях15,17,20,21, который не продуцирует иерсиниябактин и который является предпочтительным.In some embodiments of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a strain that does not produce a siderophore, e.g., is deficient in the production of a siderophore, preferably does not produce a siderophore, e.g., is deficient in the production of any siderophore. Such a strain is, for example, Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40, described in publications 15,17,20,21 , which does not produce yersiniabactin and which is preferred.
В одном варианте реализации настоящего изобретения сигнал доставки из бактериального эффекторного белка содержит бактериальный эффекторный белок или его N-концевой фрагмент, предпочтительно, бактериальный эффекторный белок, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, или его N-концевой фрагмент.In one embodiment of the present invention, the bacterial effector protein delivery signal comprises a bacterial effector protein or an N-terminal fragment thereof, preferably a bacterial effector protein that is virulent against eukaryotic cells or an N-terminal fragment thereof.
В одном варианте реализации настоящего изобретения сигнал доставки из бактериального эффекторного белка представляет собой эффекторный белок бактериальной T3SS, включающий эффекторный белок бактериальной T3SS или его N-концевой фрагмент, причем эффекторный белок T3SS или его Nконцевой фрагмент может содержать сайт связывания шаперонов. Эффекторный белок T3SS или его Nконцевой фрагмент, который содержит сайт связывания шаперонов, является в особенности подходящим в качестве сигнала доставки в настоящем изобретении. Предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей изIn one embodiment of the present invention, the bacterial effector protein delivery signal is a bacterial T3SS effector protein, comprising a bacterial T3SS effector protein or an N-terminal fragment thereof, wherein the T3SS effector protein or an N-terminal fragment thereof may comprise a chaperone binding site. A T3SS effector protein or an N-terminal fragment thereof that contains a chaperone binding site is particularly suitable as a delivery signal in the present invention. Preferred T3SS effector proteins or N-terminal fragments thereof are selected from the group consisting of
SopE, SopE2, SptP, YopE,SopE, SopE2, SptP, YopE,
ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspHl,VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAOl, HopPtoD2, HopUl, белков семейства GALA, AvrBs2, AvrDl, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD и AvrXv3.ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspHl, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAOl, HopPtoD2, HopUl, GALA family proteins, AvrBs2, AvrDl, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD and AvrXv3.
Более предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей изMore preferred T3SS effector proteins or N-terminal fragments thereof are selected from the group consisting of
SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO,SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO,
YopP, YopE, YopM, YopT, из которых наиболее предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей из W1· SoPE· SoPB· γ”'’ OsPF· ΥοΡΗ· YoP°> ΥοΡΡ· ΥοΡΕ· ΥοΡΜ> ΥοΡΤ· в частности, YopE или его N-концевого фрагмента.YopP, YopE, YopM, YopT, of which the most preferred T3SS effector proteins or their N-terminal fragments are selected from the group consisting of W 1 · So P E · So P B · γ "'' Os P F · Υο Ρ Η · Yo P°> Υο Ρ Ρ · Υο Ρ Ε · Υο Ρ Μ > Υο Ρ Τ · in particular, YopE or its N-terminal fragment.
В равной степени предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей изEqually preferred T3SS effector proteins or N-terminal fragments thereof are selected from the group consisting of
SopE, SopE2, SptP, SteA,SopE, SopE2, SptP, SteA,
SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAOl, HopUl, белков семейства GALA, AvrBs2, AvrDl, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD и AvrXv3.SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAOl, HopUl, GALA family proteins, AvrBs2, AvrDl, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD and AvrXv3.
В равной степени более предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей изEqually more preferred T3SS effector proteins or N-terminal fragments thereof are selected from the group consisting of
SopE, SptP,SopE, SptP,
SteA, SifB, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE,SteA, SifB, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE,
YopT, среди которых в равной степени наиболее предпочтительные эффекторные белки T3SS или их Nконцевые фрагменты выбраны из группы, состоящей изYopT, among which the equally most preferred T3SS effector proteins or their N-terminal fragments are selected from the group consisting of
- 36 044058- 36 044058
IpgBl, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE иIpgBl, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE and
YopT, в частности, SopE, SteA или YopE или их N-концевых фрагментов, более конкретно, SteA или YopE или их N-концевых фрагментов, наиболее конкретно, YopE или его N-концевого фрагмента.YopT, in particular SopE, SteA or YopE or N-terminal fragments thereof, more particularly SteA or YopE or N-terminal fragments thereof, most particularly YopE or N-terminal fragment thereof.
В некоторых вариантах реализации сигнал доставки из бактериального эффекторного белка кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей бактериальный эффекторный белок или его Nконцевой фрагмент, причем его N-концевой фрагмент содержит по меньшей мере первые 10, предпочтительно, по меньшей мере первые 20, более предпочтительно, по меньшей мере первые 100 аминокислот эффекторного белка бактериальной T3SS.In some embodiments, the bacterial effector protein delivery signal is encoded by a nucleotide sequence comprising a bacterial effector protein or an N-terminal fragment thereof, wherein the N-terminal fragment thereof comprises at least the first 10, preferably at least the first 20, more preferably at least the first 100 amino acids of the bacterial T3SS effector protein.
В некоторых вариантах реализации сигнал доставки из бактериального эффекторного белка кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей эффекторный белок бактериальной T3SS или его N-концевой фрагмент, причем эффекторный белок бактериальной T3SS или его N-концевой фрагмент содержит сайт связывания шаперонов.In some embodiments, the delivery signal from the bacterial effector protein is encoded by a nucleotide sequence comprising a bacterial T3SS effector protein or an N-terminal fragment thereof, wherein the bacterial T3SS effector protein or N-terminal fragment thereof comprises a chaperone binding site.
Предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты, которые содержат сайт связывания шаперонов, включают следующие комбинации сайта связывания шаперонов и эффекторного белка T3SS или его N-концевого фрагментаPreferred T3SS effector proteins or N-terminal fragments thereof that contain a chaperone binding site include the following combinations of a chaperone binding site and a T3SS effector protein or N-terminal fragment thereof
SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycOYopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycDYopD. Более предпочтительными являются SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF.SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycOYopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycDYopD. More preferred are SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF.
Наиболее предпочтительным является YopE или его N-концевой фрагмент, содержащий сайт связывания шаперонов SycE, такой как N-концевой фрагмент эффекторного белка YopE, содержащий Nконцевые 138 аминокислот эффекторного белка YopE, обозначаемый в настоящем документе как YopE^ 138 и представленный в SEQ ID NO: 2, или SopE или его N-концевой фрагмент, содержащий сайт связывания шаперонов InvB, такой как N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE, содержащий Nконцевые 81 или 105 аминокислот эффекторного белка SopE, обозначаемый в настоящем документе как SopE1-81 или SopE1-105, соответственно, и представленный в SEQ ID NO: 6 и 7.Most preferred is YopE or an N-terminal fragment thereof containing the SycE chaperone binding site, such as an N-terminal YopE effector protein fragment containing the N-terminal 138 amino acids of the YopE effector protein, referred to herein as YopE^ 138 and represented by SEQ ID NO: 2, or SopE or an N-terminal fragment thereof containing an InvB chaperone binding site, such as an N-terminal fragment of a SopE effector protein containing the N-terminal 81 or 105 amino acids of the SopE effector protein, referred to herein as SopE 1-81 or SopE 1- 105 , respectively, and presented in SEQ ID NO: 6 and 7.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, и сигнал доставки из бактериального эффекторного белка содержит эффекторный белок YopE или его N-концевую часть, предпочтительно, эффекторный белок YopE Y. enterocolitica или его N-концевую часть. Предпочтительно, сайт связывания SycE содержится в N-концевой части эффекторного белка YopE. В связи с этим Nконцевой фрагмент эффекторного белка YopE может содержать N-концевые 12, 16, 18, 52, 53, 80 или 138 аминокислот22,24. Наиболее предпочтительным является N-концевой фрагмент эффекторного белка YopE, содержащий N-концевые 138 аминокислот эффекторного белка YopE, например, как описано в публикации Forsberg and Wolf-Watz25, обозначаемый в настоящем документе как YopE1-138 и представленный в SEQ ID NO: 2.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, and the delivery signal from the bacterial effector protein comprises a YopE effector protein or an N-terminal portion thereof, preferably a Y. enterocolitica YopE effector protein or an N-terminal portion thereof . Preferably, the SycE binding site is contained in the N-terminal portion of the YopE effector protein. In this regard, the N-terminal fragment of the effector protein YopE may contain the N-terminal 12, 16, 18, 52, 53, 80 or 138 amino acids 22,24 . Most preferred is an N-terminal YopE effector protein fragment containing the N-terminal 138 amino acids of the YopE effector protein, for example, as described by Forsberg and Wolf-Watz 25 , referred to herein as YopE 1-138 and represented by SEQ ID NO: 2.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, и сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, кодируемый нуклеотидной последовательностью, содержит эффекторный белок SopE или SteA или его N-концевую часть, предпочтительно, эффекторный белок SopE или SteA Salmonella enterica или его N-концевую часть. Предпочтительно, сайт связывания шаперонов содержится в N-концевой части эффекторного белка SopE. В связи с этим N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE может содержать N-концевые 81 или 105 аминокислот. Наиболее предпочтительным является полноразмерный SteA (SEQ ID NO: 5) и N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE, содержащий N-концевые 105 аминокислот эффекторного белка, например, как описано в SEQ ID NO: 7.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain, and the bacterial effector protein delivery signal encoded by the nucleotide sequence comprises a SopE or SteA effector protein or an N-terminal portion thereof, preferably a SopE or SteA effector protein Salmonella enterica or its N-terminal part. Preferably, the chaperone binding site is contained in the N-terminal part of the SopE effector protein. In this regard, the N-terminal fragment of the SopE effector protein may contain the N-terminal 81 or 105 amino acids. Most preferred is full-length SteA (SEQ ID NO: 5) and an N-terminal SopE effector protein fragment containing the N-terminal 105 amino acids of the effector protein, for example, as described in SEQ ID NO: 7.
Специалисту в данной области техники известны способы идентификации полипептидных последовательностей эффекторного белка, которые способны доставлять белок. Например, один такой способ описан в публикации Sory et al. 19. Вкратце, полипептидные последовательности, например, из различных частей белков Yop, можно слить в рамке с репортерным ферментом, таким как активируемый кальмодулином аденилатциклазный домен (или Cya) циклолизина Bordetella pertussis. Доставка гибридного белка Yop-Cya в цитозоль эукариотических клеток отмечается появлением циклазной активности в инфицированных эукариотических клетках, которая приводит к накоплению цАМФ. Применяя такой подход, специалист в данной области техники может при необходимости определить минимальное требование к последовательности, т.е. непрерывную аминокислотную последовательность наиболее короткой длины, которая способна доставлять белок, см., например, публикацию19. Соответственно, предпочтительные сигналы доставки согласно настоящему изобретению состоят из по меньшей мере минимальной последовательности аминокислот эффекторного белка T3SS, которая способна доставлять белок.One skilled in the art will know methods for identifying effector protein polypeptide sequences that are capable of delivering the protein. For example, one such method is described in Sory et al. 19 . Briefly, polypeptide sequences, for example from various parts of the Yop proteins, can be fused in frame to a reporter enzyme such as the calmodulin-activated adenylate cyclase domain (or Cya) of Bordetella pertussis cyclolysine. Delivery of the Yop-Cya fusion protein into the cytosol of eukaryotic cells is marked by the appearance of cyclase activity in infected eukaryotic cells, which leads to the accumulation of cAMP. Using this approach, one skilled in the art can, if necessary, determine the minimum sequence requirement, i.e. for a contiguous amino acid sequence of the shortest length that is capable of delivering a protein, see, for example, publication 19 . Accordingly, preferred delivery signals of the present invention consist of at least the minimum amino acid sequence of a T3SS effector protein that is capable of delivering the protein.
В одном варианте реализации в настоящем изобретении предложен рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, который является дефицитным по продукIn one embodiment, the present invention provides a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain that is deficient in
- 37 044058 ции по меньшей мере одного бактериального эффекторного белка, более предпочтительно, который является дефицитным по продукции по меньшей мере одного бактериального эффекторного белка, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, еще более предпочтительно, который является дефицитным по продукции по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS, наиболее предпочтительно, который является дефицитным по продукции по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток. В некоторых вариантах реализации рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий являются дефицитными по продукции по меньшей мере одного, предпочтительно, по меньшей мере двух, более предпочтительно, по меньшей мере трех, еще более предпочтительно, по меньшей мере четырех, в частности, по меньшей мере пяти, более конкретно, по меньшей мере шести, наиболее конкретно, всех бактериальных эффекторных белков, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток. В некоторых вариантах реализации рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий являются дефицитными по продукции по меньшей мере одного, предпочтительно, по меньшей мере двух, более предпочтительно, по меньшей мере трех, еще более предпочтительно, по меньшей мере четырех, в частности, по меньшей мере пяти, более конкретно, по меньшей мере шести, наиболее конкретно, всех функциональных бактериальных эффекторных белков, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток, так, что полученный в результате рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий продуцирует меньше бактериальных эффекторных белков или продуцирует бактериальные эффекторные белки в меньшей степени по сравнению с грамотрицательным штаммом бактерий дикого типа, не аттенуированным по вирулентности, т.е. по сравнению с грамотрицательным штаммом бактерий дикого типа, который в норме продуцирует бактериальные эффекторные белки, или так, что полученный в результате рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий больше не продуцирует какие-либо функциональные бактериальные эффекторные белки, которые являются вирулентными в отношении эукариотических клеток.- 37 044058 tion of at least one bacterial effector protein, more preferably, which is deficient in the production of at least one bacterial effector protein, which is virulent against eukaryotic cells, even more preferably, which is deficient in the production of at least one effector a T3SS protein, most preferably, that is deficient in the production of at least one T3SS effector protein that is virulent against eukaryotic cells. In some embodiments, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains are deficient in the production of at least one, preferably at least two, more preferably at least three, even more preferably at least four, in particular at least five, more specifically, at least six, most specifically, all bacterial effector proteins that are virulent against eukaryotic cells. In some embodiments, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains are deficient in the production of at least one, preferably at least two, more preferably at least three, even more preferably at least four, in particular at least five, more specifically, at least six, most specifically, all functional bacterial effector proteins that are virulent against eukaryotic cells, such that the resulting recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain produces fewer bacterial effector proteins or produces bacterial effector proteins to a lesser extent compared to a gram-negative strain of wild-type bacteria that is not attenuated in virulence, i.e. compared to a wild-type Gram-negative bacterial strain that normally produces bacterial effector proteins, or such that the resulting recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain no longer produces any functional bacterial effector proteins that are virulent against eukaryotic cells.
Согласно настоящему изобретению такой мутантный грамотрицательный штамм бактерий, т.е. такой рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, который является дефицитным по продукции по меньшей мере одного бактериального эффекторного белка, например, который является дефицитным по продукции по меньшей мере одного бактериального эффекторного белка, который является вирулентным в отношении эукариотических клеток, например, такой мутантный штамм Yersinia может быть получен посредством введения по меньшей мере одной мутации в по меньшей мере один ген, кодирующий эффектор. Предпочтительно, такие гены, кодирующие эффектор, включают Y°pE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ и YopT, если речь идет о штамме Yersinia. Предпочтительно, такие гены, кодирующие эффектор, включаютAccording to the present invention, such a mutant gram-negative bacterial strain, i.e. such a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain that is deficient in the production of at least one bacterial effector protein, for example, that is deficient in the production of at least one bacterial effector protein that is virulent against eukaryotic cells, for example, such a mutant strain Yersinia can be obtained by introducing at least one mutation in at least one gene encoding an effector. Preferably, such effector encoding genes include Y°pE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ and YopT in the case of a Yersinia strain. Preferably, such effector encoding genes include
AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB,AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB,
SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB,SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB,
SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspHl, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, Srfl, SptP, если речь идет о штамме Salmonella. Наиболее предпочтительно, все гены, кодирующие эффектор, делетированы. Специалист в данной области техники может применять любое количество стандартных методик для получения мутаций в данных эффекторных генах T3SS. В руководстве Sambrook et al. в общем виде описаны данные методики. См. руководство Sambrook et al.26. Согласно настоящему изобретению мутацию можно ввести в области промотора гена, кодирующего эффектор, так, чтобы экспрессия такого эффекторного гена была устранена.SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspHl, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, Srfl, SptP, if we are talking about the Salmonella strain. Most preferably, all genes encoding the effector are deleted. One skilled in the art can employ any number of standard techniques to obtain mutations in these T3SS effector genes. The manual by Sambrook et al. These methods are described in general terms. See Sambrook et al. for guidance. 26 . According to the present invention, a mutation can be introduced in the promoter region of a gene encoding an effector, so that the expression of such an effector gene is eliminated.
Мутацию также можно ввести в кодирующую область гена, кодирующего эффектор, так, чтобы каталитическая активность кодируемого эффекторного белка была устранена. Каталитическая активность эффекторного белка обычно обозначает функцию эффекторного белка, направленную на клетку-мишень, т.е. токсичность. Такая активность регулируется каталитическими мотивами в каталитическом домене эффекторного белка. Подходы для идентификации каталитического домена и/или каталитических мотивов эффекторного белка хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, публикации27,28.A mutation can also be introduced into the coding region of a gene encoding an effector such that the catalytic activity of the encoded effector protein is eliminated. Effector protein catalytic activity generally refers to the function of the effector protein directed toward a target cell, i.e. toxicity. Such activity is regulated by catalytic motifs in the catalytic domain of the effector protein. Approaches for identifying the catalytic domain and/or catalytic motifs of an effector protein are well known to those skilled in the art. See, for example, publications 27,28 .
Соответственно, одна предпочтительная мутация согласно настоящему изобретению представляет собой делецию всего каталитического домена. Другая предпочтительная мутация представляет собой мутацию со сдвигом рамки считывания в гене, кодирующем эффектор, так, что каталитический домен не присутствует в белковом продукте, экспрессированном с такого гена со сдвигом рамки считывания. Наиболее предпочтительная мутация представляет собой мутацию с делецией всей кодирующей области эффекторного белка. Настоящим изобретением также предусмотрены другие мутации, такие как небольшие делеции или замены пар оснований, которые вводят в каталитические мотивы эффекторного белка и которые приводят в нарушению каталитической активности данного эффекторного белка.Accordingly, one preferred mutation according to the present invention is a deletion of the entire catalytic domain. Another preferred mutation is a frameshift mutation in a gene encoding an effector such that the catalytic domain is not present in the protein product expressed from such a frameshift gene. The most preferred mutation is one that deletes the entire coding region of the effector protein. The present invention also provides other mutations, such as small deletions or base pair substitutions, that are introduced into the catalytic motifs of an effector protein and that result in disruption of the catalytic activity of the effector protein.
- 38 044058- 38 044058
Мутации, которые получают в генах функциональных бактериальных эффекторных белков, можно ввести в конкретный штамм с помощью множества способов. Один из таких способов включает клонирование мутированного гена в векторе-самоубийце, который способен вводить мутированную последовательность в штамм в результате аллельного обмена. Пример такого вектора-самоубийцы описан в публикации29.Mutations that are obtained in the genes of functional bacterial effector proteins can be introduced into a particular strain using a variety of methods. One such method involves cloning the mutated gene into a suicide vector, which is capable of introducing the mutated sequence into the strain through allelic exchange. An example of such a suicide vector is described in publication 29 .
Таким образом, мутации, полученные во множестве генов, можно последовательно ввести в грамотрицательный штамм бактерий, получая полимутантный, например, шестикратно мутантный рекомбинантный штамм. Порядок, в котором вводят данные мутантные последовательности, неважен. При определенных условиях может быть желательно получить мутации только некоторых, но не всех эффекторных генов. Соответственно, в настоящем изобретении также предусмотрен полимутантный Yersinia, отличный от шестикратно мутантного Yersinia, например, двукратно мутантный, трехкратно мутантный, четырехкратно мутантный и пятикратно мутантные штаммы. Для цели доставки белков система секреции и транслокации настоящего мутантного штамма должна быть интактной.Thus, mutations obtained in multiple genes can be sequentially introduced into a Gram-negative bacterial strain, resulting in a polymutant, for example, sixfold mutant, recombinant strain. The order in which these mutant sequences are introduced is not important. Under certain conditions, it may be desirable to obtain mutations in only some, but not all, effector genes. Accordingly, the present invention also provides polymutant Yersinia other than sixfold mutant Yersinia, such as doubly mutant, triply mutant, quadruple mutant and quintuple mutant strains. For the purpose of protein delivery, the secretion and translocation system of the present mutant strain must be intact.
Предпочтительный рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий согласно настоящему изобретению представляет собой шестикратно мутантный штамм Yersinia, в котором все гены, кодирующие эффектор, мутированы так, что полученный в результате Yersinia больше не продуцирует каких-либо функциональных эффекторных белков. Такой шестикратно мутантный штамм Yersinia обозначают как АуорН,О,Р,Е,М,Т для Y. enterocolitica. В качестве примера, такой шестикратный мутант может быть получен из штамма MRS40 Y. enterocolitica с получением Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т (также называемого в настоящем документе Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т или Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т), который является предпочтительным. Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т, который является дефицитным по продукции иерсиниябактина, был описан в публикации WO02077249 и был депонирован 24ого сентября 2001 года согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в бельгийских Согласованных коллекциях микроорганизмов (ВССМ); данному штамму был присвоен учетный номер LMG Р-21013.A preferred recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain of the present invention is a six-fold mutant strain of Yersinia in which all effector-encoding genes are mutated such that the resulting Yersinia no longer produces any functional effector proteins. This sixfold mutant strain of Yersinia is designated as AuopH,O,P,E,M,T for Y. enterocolitica. As an example, such a sixfold mutant can be obtained from Y. enterocolitica strain MRS40 to yield Y. enterocolitica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T (also referred to herein as Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 AuopH,O,P ,E,M,T or Y. enterocolitica AuopH,O,P,E,M,T), which is preferred. Y. enterocolitica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T, which is deficient in the production of yersiniabactin, was described in publication WO02077249 and was deposited on September 24, 2001 under the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure in the Belgian Harmonized Collections of Microorganisms (HCCM); this strain was assigned the registration number LMG P-21013.
Более предпочтительным является Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т, который содержит делецию на эндогенной плазмиде вирулентности pYV, устраняющую шпилечную структуру РНК или ее части, такую как делеция шпильки I (Hairpin I) в направлении 3'-5' от гена, кодирующего эндогенный ДНК-связывающий белок типа AraC (AHairpinI-virF), такой как Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т AHairpinI-virF (также называемый Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т AHairpinI-virF). В равной степени предпочтительным является Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т, который содержит делецию хромосомного гена, кодирующего asd, и эндогенную плазмиду вирулентности pYV, содержащую нуклеотидную последовательность, которая содержит ген, кодирующий asd, функционально связанный с промотором (pYV-asd), такой как Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd pYV-asd (также называемый в настоящем документе Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd). В особенности предпочтительным является Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd AHairpinI-virF pYV-asd, который содержит обе модификации, описанные выше (также называемый в настоящем документе Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd). В особенности предпочтительными штаммами являются Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т AHairpinI-virF (также называемый Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т AHairpinI-virF), Y. enterocolitica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd pYV-asd (также называемый в настоящем документе Y. Enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd) или Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd (также называемый в настоящем документе Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd AHairpinI-virF pYV-asd), которые являются дефицитными по продукции сидерофора, предпочтительно, не продуцируют сидерофоры, например, являются дефицитными по продукции любого сидерофора, как в случае всех штаммов Y. enterocolitica подвид palearctica. Таким образом, в равной степени в особенности предпочтительными штаммами являются Y. enterocolitica подвид palearctica AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF (также называемый Y. enterocolitica подвид palearctica AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF), Y. enterocolitica подвид palearctica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd, также называемый в настоящем документе Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd) или Y. enterocolitica подвид palearctica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd (также называемый в настоящем документе Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd).More preferred is Y. enterocolitica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T, which contains a deletion on the endogenous virulence plasmid pYV eliminating the RNA hairpin structure or part thereof, such as deletion of Hairpin I in the 3' direction 5' from a gene encoding an endogenous DNA binding protein of the AraC type (AHairpinI-virF), such as Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF (also called Y. enterocolitica AyopH,O,P ,E,M,T AHairpinI-virF). Equally preferred is Y. enterocolitica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T, which contains a deletion of the chromosomal gene encoding asd, and the endogenous virulence plasmid pYV containing a nucleotide sequence that contains the gene encoding asd, operably linked to promoter (pYV-asd) such as Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd (also referred to herein as Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV -asd). Particularly preferred is Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd, which contains both modifications described above (also referred to herein as Y. enterocolitica AyopH,O,P,E ,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd). Particularly preferred strains are Y. enterocolitica MRS40 AHairpinI-virF (also called Y. enterocolitica AHairpinI-virF), Y. enterocolitica MRS40 AHairpinI-virF ,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd (also referred to herein as Y. Enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd) or Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P, E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd (also referred to herein as Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd) that are deficient in siderophore production, preferably do not produce siderophores, for example, are deficient in the production of any siderophore, as is the case with all strains of Y. enterocolitica subsp. palearctica. Thus, equally particularly preferred strains are Y. enterocolitica subsp. palearctica AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI-virF (also called Y. enterocolitica subsp palearctica AyopH,O,P,E,M,T AHairpinI -virF), Y. enterocolitica subspecies palearctica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd, also referred to herein as Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd pYV-asd) or Y. enterocolitica subspecies palearctica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd (also referred to herein as Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd AHairpinI-virF pYV-asd ).
Нуклеотидные молекулы, такие как векторы, которые можно применять согласно настоящему изобретению для трансформации грамотрицательного штамма бактерий, могут зависеть от используемых грамотрицательных штаммов бактерий, как известно специалисту. Нуклеотидные молекулы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают векторы экспрессии (включая синтетические или полученные иным способом модифицированные версии эндогенных плазмид вирулентности), векторы для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности и нуклеотидные последовательности, такие как, например, фрагменты ДНК для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности. Векторы экспрессии, которые являются подходящими, например, в штаммах Yersinia, Es- 39 044058 cherichia, Salmonella или Pseudomonas, представляют собой, например, плазмиды pUC, pBad, pACYC, pUCP20 и рЕТ. Векторы для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности, которые являются подходящими, например, в штамме Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, представляют собой, например, pKNG101. Фрагменты ДНК для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности обозначают способы, применяемые, например, в штамме Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, как, например, генетическая инженерия лямбда-red. Векторы для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности либо фрагменты ДНК для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности могут встраивать нуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению так, что, например, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, слитая в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, функционально связана с эндогенным промотором рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий. Таким образом, если применяют вектор для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности либо фрагмент ДНК для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности, эндогенный промотор может кодироваться на эндогенной бактериальной ДНК (хромосомной или плазмидной ДНК), и только соответствующая нуклеотидная последовательность будет обеспечена сконструированным вектором для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности либо фрагментом ДНК для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности. В качестве альтернативы, если применяют вектор для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности либо нуклеотидную молекулу, такую как, например, нуклеотидная последовательность для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности, эндогенный промотор и сигнал доставки из бактериального эффекторного белка может кодироваться на эндогенной бактериальной ДНК (хромосомной или плазмидной ДНК), и только нуклеотидная молекула, такая как, например, нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный белок, будет обеспечена вектором для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности либо нуклеотидной молекулой, такой как, например, нуклеотидная последовательность для хромосомной вставки или вставки плазмиды вирулентности. Таким образом, не требуется, чтобы промотор обязательно содержался в векторе, применяемом для трансформации рекомбинантных аттенуированных по вирулентности грамотрицательных штаммов бактерий, т.е. рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий согласно настоящему изобретению могут быть трансформированы вектором, который не содержит промотор.Nucleotide molecules, such as vectors, that can be used according to the present invention to transform a gram-negative bacterial strain may depend on the gram-negative bacterial strains used, as is known to one skilled in the art. Nucleotide molecules that can be used according to the present invention include expression vectors (including synthetic or otherwise modified versions of endogenous virulence plasmids), chromosomal insertion or virulence plasmid insertion vectors, and nucleotide sequences, such as, for example, DNA fragments for chromosomal insertion or virulence plasmid inserts. Expression vectors that are suitable, for example, in strains of Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas are, for example, the plasmids pUC, pBad, pACYC, pUCP20 and pET. Vectors for chromosomal insertion or virulence plasmid insertion that are suitable, for example, in a Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas strain are, for example, pKNG101. DNA fragments for chromosomal insertion or insertion of a virulence plasmid indicate methods used, for example, in a strain of Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas, such as lambda-red genetic engineering. Vectors for chromosomal insertion or virulence plasmid insertion, or DNA fragments for chromosomal insertion or virulence plasmid insertion, can insert nucleotide sequences according to the present invention such that, for example, a nucleotide sequence encoding a heterologous protein is fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding delivery signal from a bacterial effector protein, functionally linked to the endogenous promoter of a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain. Thus, if a vector for chromosomal or virulence plasmid insertion or a DNA fragment for chromosomal insertion or virulence plasmid insertion is used, the endogenous promoter may be encoded on the endogenous bacterial DNA (chromosomal or plasmid DNA), and only the corresponding nucleotide sequence will be provided by the constructed vector for chromosomal or virulence plasmid insertion. insertion or insertion of a virulence plasmid or a DNA fragment for a chromosomal insertion or insertion of a virulence plasmid. Alternatively, if a chromosomal or virulence plasmid insertion vector or a nucleotide molecule is used, such as, for example, a nucleotide sequence for a chromosomal or virulence plasmid insertion, the endogenous promoter and delivery signal from the bacterial effector protein may be encoded on the endogenous bacterial DNA (chromosomal or plasmid DNA), and only a nucleotide molecule, such as, for example, a nucleotide sequence encoding a heterologous protein, will be provided by a vector for a chromosomal or virulence plasmid insertion, or a nucleotide molecule, such as, for example, a nucleotide sequence for a chromosomal or virulence plasmid insertion . Thus, it is not required that the promoter be necessarily contained in the vector used for the transformation of recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains, i.e. The recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains of the present invention can be transformed with a vector that does not contain a promoter.
В предпочтительном варианте реализации нуклеотидная молекула, например, вектор согласно настоящему изобретению, содержит в направлении от 5' к 3' первую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал доставки или его фрагмент из бактериального эффекторного белка;In a preferred embodiment, the nucleotide molecule, for example, a vector according to the present invention, contains in the 5' to 3' direction a first nucleotide sequence encoding a delivery signal or fragment thereof from a bacterial effector protein;
вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом указанной первой нуклеотидной последовательности.a second nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of said first nucleotide sequence.
Предпочтительный вектор, например, предпочтительный вектор экспрессии для Yersinia, выбран из группы, состоящей из pBad_Si_1 и pBad_Si_2. pBad_Si2 был сконструирован путем клонирования фрагмента SycE-YopE1.138, содержащего эндогенные промоторы для YopE и SycE, из очищенного pYV40 в сайт KpnI/HindIII pBad-MycHisA (Invitrogen). Дополнительные модификации включают удаление фрагмента NcoI/BgIII pBad-MycHisA путем расщепления, обработку фрагментом Кленова и повторное лигирование. Дополнительно на 3'-конце YopE1_138 были добавлены следующие сайты расщепления: XbaIXhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 аналогичен pBad_Si2, но кодирует EGFP, амплифицированный из pEGFPC1 (Clontech) в сайте NcoI/BgIII под контролем индуцибельного арабинозой промотора. В равной степени предпочтительным является применение модифицированных версий эндогенной плазмиды вирулентности Yersinia pYV, кодирующих гетерологичные белки в виде слияний с сигнальной последовательностью T3SS.A preferred vector, eg a preferred expression vector for Yersinia, is selected from the group consisting of pBad_Si_1 and pBad_Si_2. pBad_Si2 was constructed by cloning the SycE-YopE 1 fragment. 138 containing endogenous promoters for YopE and SycE, from purified pYV40 into the KpnI/HindIII site of pBad-MycHisA (Invitrogen). Additional modifications include removal of the NcoI/BgIII fragment of pBad-MycHisA by cleavage, treatment with Klenow fragment, and religation. Additionally, the following cleavage sites were added at the 3' end of YopE1_ 138 : XbaIXhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 is similar to pBad_Si2 but encodes EGFP amplified from pEGFPC1 (Clontech) at the NcoI/BgIII site under the control of an arabinose-inducible promoter. Equally preferred is the use of modified versions of the endogenous Yersinia virulence plasmid pYV, encoding heterologous proteins as fusions to the T3SS signal sequence.
Предпочтительный вектор, например, предпочтительный вектор экспрессии для Salmonella, выбран из группы, состоящей из pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269. Плазмиды pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269, содержащие соответствующий эндогенный промотор и фрагмент SteA1_20 (pSi_266), полноразмерную последовательность SteA (pSi_267), фрагмент SopE1_81 (pSi_268) или фрагмент SopE1_105 (pSi_269), амплифицировали из геномной ДНК S. enterica SL1344 и клонировали в сайт NcoI/KpnI pBadMycHisA (Invitrogen).A preferred vector, for example a preferred expression vector for Salmonella, is selected from the group consisting of pSi_266, pSi_267, pSi_268 and pSi_269. Plasmids pSi_266, pSi_267, pSi_268 and pSi_269, containing the corresponding endogenous promoter and fragment SteA1_ 20 (pSi_266), the full-length SteA sequence (pSi_267), fragment SopE1_ 81 (pSi_268) or fragment SopE1_ 105 (pSi_269), were amplified from genomic DNA of S. enterica SL1344 and cloned into the NcoI/KpnI site of pBadMycHisA (Invitrogen).
Нуклеотидные молекулы, например, векторы согласно настоящему изобретению, могут содержать другие элементы последовательности, такие как 3'-последовательность терминации (включая стоп-кодон и последовательность поли-А), или ген, предоставляющий лекарственную устойчивость, который позволяет проводить селекцию трансформантов, получивших настоящий вектор.Nucleotide molecules, for example, the vectors of the present invention, may contain other sequence elements, such as a 3' termination sequence (including a stop codon and a poly-A sequence), or a drug resistance gene that allows selection of transformants receiving the present invention. vector.
Рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные штаммы бактерий можно трансформировать нуклеотидными молекулами, например, векторами согласно настоящему изобретению, множеством известных способов. Для целей настоящего изобретения способы трансформации с целью введения вектора включают, без ограничения, электропорацию, трансформацию, опосредованную фосфатом кальция, конъюгацию или их комбинации. Например, нуклеотидными молекулами, например,Recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains can be transformed with nucleotide molecules, such as the vectors of the present invention, in a variety of known ways. For purposes of the present invention, methods of transformation to introduce a vector include, but are not limited to, electroporation, calcium phosphate-mediated transformation, conjugation, or combinations thereof. For example, nucleotide molecules, e.g.
- 40 044058 вектором, можно трансформировать первый штамм бактерий с помощью стандартной процедуры электропорации. Затем такие нуклеотидные молекулы, например, вектор, могут быть перенесены из первого штамма бактерий в желаемый штамм с помощью конъюгации, процесса, также называемого мобилизацией. Трансформант (т.е. грамотрицательные штаммы бактерий, захватившие вектор) можно отобрать, например, с помощью антибиотиков. Данные методики хорошо известны в данной области техники. См., например, публикацию19.- 40 044058 vector, the first strain of bacteria can be transformed using a standard electroporation procedure. Such nucleotide molecules, such as a vector, can then be transferred from the first strain of bacteria to the desired strain through conjugation, a process also called mobilization. The transformant (i.e., gram-negative strains of bacteria that have captured the vector) can be selected, for example, using antibiotics. These techniques are well known in the art. See, for example, publication 19 .
Согласно настоящему изобретению промотор, функционально связанный с бактериальным эффекторным белком рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий согласно настоящему изобретению, может представлять собой нативный промотор эффекторного белка T3SS соответствующего штамма или совместимого штамма бактерий либо промотор, применяемый в векторах экспрессии, которые являются подходящими, например, в штамме Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, например, pUC и pBad. Такие промоторы представляют собой промотор Т7, промотор Plac или индуцибельный арабинозой промотор Ara-bad. Если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, промотор может быть получен из гена вирулона Yersinia. Ген вирулона Yersinia обозначает гены на плазмиде pYV Yersinia, экспрессия которых контролируется как температурой, так и осуществлением контакта с клеткой-мишенью. Такие гены включают гены, кодирующие элементы аппарата секреции (гены Ysc), гены, кодирующие транслокаторы (YopB, YopD и LcrV), гены, кодирующие контрольные элементы (YopN, TyeA и LcrG), гены, кодирующие эффекторные шапероны T3SS (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO и SycT), и гены, кодирующие эффекторы (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT и YopP/YopJ), а также другие белки, кодируемые pYV, такие как VirF и YadA.According to the present invention, the promoter operably linked to the bacterial effector protein of the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain of the present invention may be the native T3SS effector protein promoter of the corresponding strain or a compatible bacterial strain, or a promoter used in expression vectors that are suitable, for example, in a strain of Yersinia, Escherichia, Salmonella or Pseudomonas, for example pUC and pBad. Such promoters are the T7 promoter, the Plac promoter or the arabinose inducible Ara-bad promoter. If the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, the promoter may be derived from the Yersinia virulon gene. The Yersinia virulon gene refers to genes on the pYV Yersinia plasmid whose expression is controlled by both temperature and contact with the target cell. Such genes include genes encoding elements of the secretion apparatus (Ysc genes), genes encoding translocators (YopB, YopD and LcrV), genes encoding control elements (YopN, TyeA and LcrG), genes encoding T3SS effector chaperones (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO, and SycT), and genes encoding effectors (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT, and YopP/YopJ), as well as other proteins encoded by pYV, such as VirF and YadA.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего функциональный эффектор T3SS. Если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Yersinia, промотор выбран из любого одного из YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM и YopP/YopJ. Более предпочтительно, промотор получен из YopE или SycE. Наиболее предпочтительным является промотор YopE.In a preferred embodiment of the present invention, the promoter is the native promoter of a gene encoding a functional T3SS effector. If the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Yersinia strain, the promoter is selected from any one of YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM and YopP/YopJ. More preferably, the promoter is derived from YopE or SycE. Most preferred is the YopE promoter.
Если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, промотор может быть получен из острова патогенности SpiI или SpiII или из эффекторного белка, кодируемого в другом месте. Такие гены включают гены, кодирующие элементы аппарата секреции, гены, кодирующие транслокаторы, гены, кодирующие контрольные элементы, гены, кодирующие эффекторные шапероны T3SS, и гены, кодирующие эффекторы, а также другие белки, кодируемые SPI-1 или SPI-2. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего функциональный эффектор T3SS. Если рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий представляет собой штамм Salmonella, промотор выбран из любого одного из эффекторных белков. Более предпочтительно, промотор получен из SopE, InvB или SteA. В некоторых вариантах реализации промотор представляет собой искусственно индуцируемый промотор, такой как, например, индуцибельный арабинозой промотор, который является предпочтительным. В данном случае бактерии обычно обеспечивают арабинозой, которая затем индуцирует бактериальную экспрессию белка, подлежащего доставке.If the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain, the promoter may be derived from the pathogenicity island SpiI or SpiII or from an effector protein encoded elsewhere. Such genes include genes encoding secretion apparatus elements, genes encoding translocators, genes encoding control elements, genes encoding T3SS effector chaperones, and genes encoding effectors, as well as other proteins encoded by SPI-1 or SPI-2. In a preferred embodiment of the present invention, the promoter is the native promoter of a gene encoding a functional T3SS effector. If the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is a Salmonella strain, the promoter is selected from any one of the effector proteins. More preferably, the promoter is derived from SopE, InvB or SteA. In some embodiments, the promoter is an artificially inducible promoter, such as, for example, an arabinose inducible promoter, which is preferred. In this case, the bacteria are typically provided with arabinose, which then induces bacterial expression of the protein to be delivered.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт расщепления протеазы. Сайт расщепления протеазы обычно расположен на нуклеотидной молекуле, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, слитую в рамке с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, между нуклеотидной последовательностью, кодирующей гетерологичный белок, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнал доставки. Получение функционального и в общем виде применимого сайта расщепления позволяет отщеплять сигнал доставки после транслокации. Поскольку сигнал доставки может препятствовать правильной локализации и/или функционированию транслоцированного белка в клетках-мишенях, введение сайта расщепления протеазы между сигналом доставки и белком, представляющим интерес, обеспечивает доставку в эукариотические клетки практически нативных белков. Предпочтительно, сайт расщепления протеазы представляет собой аминокислотный мотив, который расщепляется протеазой или ее каталитическими доменами, выбранной из группы, состоящей из энтерокиназы (легкая цепь), энтеропептидазы, протеазы PreScission, протеазы риновируса человека 3C, протеазы TEV, протеазы TVMV, протеазы фактор Ха и тромбина, более предпочтительно, аминокислотный мотив, который расщепляется протеазой TEV. В равной степени предпочтительный сайт расщепления протеазы представляет собой аминокислотный мотив, который расщепляется протеазой или ее каталитическими доменами, выбранной из группы, состоящей из энтерокиназы (легкая цепь), энтеропептидазы, протеазы PreScission, протеазы риновируса человека 3C, протеазы TEV, протеазы TVMV, протеазы фактор Ха, убиквитин-процессирующей протеазы, называемой деубиквитинизирующими ферментами, и тромбина. Наиболее предпочтительным является аминокислотный мотив, кото- 41 044058 рый расщепляется протеазой TEV или убиквитин-процессирующей протеазой. Таким образом, в следующем варианте реализации настоящего изобретения гетерологичный белок отщепляется от сигнала доставки из бактериального эффекторного белка протеазой. Предпочтительными способами отщепления являются способы, в которых:In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains a nucleotide sequence encoding a protease cleavage site. The protease cleavage site is typically located on a nucleotide molecule that contains a nucleotide sequence encoding a heterologous protein fused in frame to the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein, between the nucleotide sequence encoding the heterologous protein and the nucleotide sequence encoding delivery signal. Obtaining a functional and generally useful cleavage site allows the delivery signal to be cleaved after translocation. Since the delivery signal may interfere with the proper localization and/or function of the translocated protein in target cells, the introduction of a protease cleavage site between the delivery signal and the protein of interest allows delivery of essentially native proteins into eukaryotic cells. Preferably, the protease cleavage site is an amino acid motif that is cleaved by a protease or its catalytic domains selected from the group consisting of enterokinase (light chain), enteropeptidase, PreScission protease, human rhinovirus 3C protease, TEV protease, TVMV protease, factor Xa protease, and thrombin, more preferably an amino acid motif that is cleaved by TEV protease. An equally preferred protease cleavage site is an amino acid motif that is cleaved by a protease or its catalytic domains selected from the group consisting of enterokinase (light chain), enteropeptidase, PreScission protease, human rhinovirus 3C protease, TEV protease, TVMV protease, protease factor Xa, ubiquitin-processing proteases called deubiquitinating enzymes, and thrombin. Most preferred is an amino acid motif that is cleaved by TEV protease or ubiquitin-processing protease. Thus, in a further embodiment of the present invention, the heterologous protein is cleaved from the delivery signal from the bacterial effector protein by a protease. Preferred cleavage methods are those in which:
а) протеаза транслоцируется в эукариотическую клетку рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий, как описано в настоящем документе, который экспрессирует слитый белок, содержащий сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, и протеазу в качестве гетерологичного белка; илиa) the protease is translocated into a eukaryotic cell by a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain as described herein that expresses a fusion protein containing a delivery signal from a bacterial effector protein and the protease as a heterologous protein; or
b) протеаза экспрессируется конститутивно или временно в эукариотической клетке.b) the protease is expressed constitutively or transiently in the eukaryotic cell.
Обычно рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, применяемый для доставки желаемого белка в эукариотическую клетку, и рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, транслоцирующий протеазу в эукариотическую клетку, являются различными.Typically, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain used to deliver the desired protein into the eukaryotic cell and the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain that translocates the protease into the eukaryotic cell are different.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу для мечения или акцепторный сайт для молекулы для мечения. Дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу для мечения или акцепторный сайт для молекулы для мечения, обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок. Предпочтительная молекула для мечения или акцепторный сайт для молекулы для мечения выбраны из группы, состоящей из усиленного зеленого флуоресцентного белка (enhanced green fluourescent protein, EGFP), кумарина, акцепторного сайта кумаринлигазы, резоруфина, акцепторного сайта резоруфинлигазы, тетрацистеинового мотива, применяемого с красителем FlAsH/ReAsH (Life Technologies). Наиболее предпочтительным является резоруфин и акцепторный сайт резоруфинлигазы или EGFP. Применение молекулы для мечения или акцепторного сайта для молекулы для мечения приведет к присоединению молекулы для мечения к гетерологичному белку, представляющему интерес, который затем будет доставлен в таком виде в эукариотическую клетку и сделает возможным отслеживание белка, например, с помощью микроскопии живых клеток.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains an additional nucleotide sequence encoding a labeling molecule or an acceptor site for a labeling molecule. An additional nucleotide sequence encoding a labeling molecule or an acceptor site for a labeling molecule is typically fused to the 5' end or 3' end of a nucleotide sequence encoding a heterologous protein. The preferred labeling molecule or acceptor site for the labeling molecule is selected from the group consisting of enhanced green fluorescent protein (EGFP), coumarin, coumarin ligase acceptor site, resorufin, resorufin ligase acceptor site, tetracysteine motif used with the FlAsH dye. ReAsH (Life Technologies). Most preferred is resorufin and resorufin ligase acceptor site or EGFP. The use of a tagging molecule or an acceptor site for a tagging molecule will attach the tagging molecule to a heterologous protein of interest, which will then be delivered as such into the eukaryotic cell and enable tracking of the protein, for example, by live cell microscopy.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую пептидную метку. Дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая пептидную метку, обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains an additional nucleotide sequence encoding a peptide tag. An additional nucleotide sequence encoding a peptide tag is typically fused to the 5' end or 3' end of a nucleotide sequence encoding a heterologous protein.
Предпочтительная пептидная метка выбрана из группы, состоящей из метки Мус, метки His, метки Flag, метки НА, метки Strep или метки V5 или комбинации двух или более меток из данной группы. Наиболее предпочтительными являются метка Мус, метка Flag, метка His и сочетание меток Мус и His. Применение пептидной метки обеспечит возможность отслеживать меченный белок, например, с помощью иммунофлуоресценции или вестерн-блоттинга с применением антител против метки. Дополнительно применение пептидной метки позволяет проводить аффинную очистку желаемого белка после секреции в супернатант культуры или после транслокации в эукариотические клетки, в обоих случаях с применением способа очистки, подходящего для соответствующей метки (например, металл-хелатной аффинной очистки при применении с меткой His или очистки на основе антитела против Flag при применении с меткой Flag).The preferred peptide tag is selected from the group consisting of a Myc tag, a His tag, a Flag tag, a HA tag, a Strep tag, or a V5 tag, or a combination of two or more tags from this group. Most preferred are a Myc tag, a Flag tag, a His tag, and a combination of Myc and His tags. The use of a peptide tag will provide the ability to monitor the tagged protein, for example, using immunofluorescence or Western blotting using antibodies against the tag. Additionally, the use of a peptide tag allows affinity purification of the desired protein after secretion into the culture supernatant or after translocation into eukaryotic cells, in both cases using a purification method suitable for the appropriate tag (e.g., metal chelate affinity purification when used with a His tag or purification on based anti-Flag antibody when used with a Flag tag).
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал внутриядерной локализации (nuclear localization signal, NLS). Дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал внутриядерной локализации (NLS), обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок, причем указанная дополнительная нуклеотидная последовательность кодирует сигнал внутриядерной локализации (NLS). Предпочтительный NLS выбран из группы, состоящей из NLS большого Т-антигена SV40 и его производных30, а также других вирусных NLS. Наиболее предпочтительным является NLS большого Т-антигена SV40 и его производные.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains an additional nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal (NLS). An additional nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal (NLS) is typically fused to the 5' end or 3' end of a nucleotide sequence encoding a heterologous protein, said additional nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal (NLS). The preferred NLS is selected from the group consisting of the SV40 large T antigen NLS and its derivatives 30 as well as other viral NLSs. Most preferred is the SV40 large T antigen NLS and its derivatives.
В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий содержит сайт множественного клонирования. Сайт множественного клонирования обычно расположен на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки из бактериального эффекторного белка, и/или на 5'-конце или 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок. В векторе может содержаться один или более одного сайта множественного клонирования. Предпочтительный сайт множественного клонирования выбран из группы рестрикционных ферментов, состоящей из XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, Sad, SalI, BstBI. Наиболее предпочтительными являются XbaI, XhoI, BstBI и HindIII.In one embodiment of the present invention, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain contains a multiple cloning site. The multiple cloning site is typically located at the 3' end of a nucleotide sequence encoding a delivery signal from a bacterial effector protein and/or at the 5' end or 3' end of a nucleotide sequence encoding a heterologous protein. The vector may contain one or more than one multiple cloning site. The preferred multiple cloning site is selected from the group of restriction enzymes consisting of XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, Sad, SalI, BstBI. Most preferred are XbaI, XhoI, BstBI and HindIII.
Слитый белок, экспрессируемый рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий согласно настоящему изобретению, также обозначают как слитый белокThe fusion protein expressed by the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain of the present invention is also referred to as fusion protein
- 42 044058 или гибридный белок, т.е. слитый белок или гибрид сигнала доставки и гетерологичного белка. Слитый белок может также содержать, например, сигнал доставки и два или более различных гетерологичных белков.- 42 044058 or hybrid protein, i.e. a fusion protein or hybrid of a delivery signal and a heterologous protein. The fusion protein may also comprise, for example, a delivery signal and two or more different heterologous proteins.
В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения рака у субъекта, например, лечения злокачественных солидных опухолей, включающие доставку гетерологичных белков, как описано в настоящем документе выше, в раковые клетки, например, в клетки злокачественной солидной опухоли. Белки можно доставить, т.е. транслоцировать в раковую клетку, например, в клетки злокачественной солидной опухоли, во время введения рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий субъекту, или их можно доставить, т.е. транслоцировать в раковую клетку, например, в клетки злокачественной солидной опухоли, в более позднее время, например, после того, как рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий достигнет раковой клетки, например, участка злокачественной солидной опухоли, и/или достигнет раковой клетки, например, участка злокачественной солидной опухоли, и реплицируется, как описано выше. Время доставки можно регулировать, например, с помощью промотора, который применяют для экспрессии гетерологичных белков в рекомбинантном аттенуированном по вирулентности грамотрицательном штамме бактерий. В первом случае гетерологичным белком может управлять конститутивный промотор или, более предпочтительно, эндогенный промотор бактериального эффекторного белка. В случае отсроченной доставки белков гетерологичным белком может управлять искусственно индуцируемый промотор, такой как индуцибельный арабинозой промотор. В данном случае после того, как бактерии достигли желаемого участка и накопились в нем, субъекту будут вводить арабинозу. Затем арабиноза индуцирует бактериальную экспрессию белка, подлежащего доставке.The present invention provides methods for treating cancer in a subject, eg, treating malignant solid tumors, comprising delivering heterologous proteins, as described hereinabove, to cancer cells, eg, malignant solid tumor cells. Proteins can be delivered, i.e. translocate into a cancer cell, for example, into malignant solid tumor cells, during the administration of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative strain of bacteria to a subject, or they can be delivered, i.e. translocate into a cancer cell, e.g., a malignant solid tumor cell, at a later time, e.g., after a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain reaches a cancer cell, e.g., a site of a malignant solid tumor, and/or reaches a cancer cell, e.g. , site of a malignant solid tumor, and replicates as described above. The delivery time can be controlled, for example, using a promoter, which is used for the expression of heterologous proteins in a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain. In the first case, the heterologous protein may be driven by a constitutive promoter or, more preferably, an endogenous promoter of a bacterial effector protein. In the case of delayed delivery of proteins, the heterologous protein can be driven by an artificially inducible promoter, such as an arabinose inducible promoter. In this case, after the bacteria have reached and accumulated in the desired area, arabinose will be administered to the subject. Arabinose then induces bacterial expression of the protein to be delivered.
Таким образом, в одном варианте реализации способ лечения рака включает:Thus, in one embodiment, a method of treating cancer includes:
i) культивирование рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, как описано в настоящем документе;i) cultivating a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain as described herein;
ii) введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий посредством осуществления контакта раковой клетки с рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий по п. i), причем слитый белок, который содержит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и гетерологичный белок, экспрессируется рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий и транслоцируется в раковую клетку; и необязательно iii) расщепление слитого белка так, что гетерологичный белок отщепляется от сигнала доставки из бактериального эффекторного белка внутри раковой клетки, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.ii) administering to the subject said recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain by contacting the cancer cell with the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain according to claim i), wherein a fusion protein that contains a delivery signal from a bacterial effector protein and a heterologous protein is expressed by the recombinant attenuated by virulence, a gram-negative strain of bacteria and translocates into a cancer cell; and optionally iii) cleaving the fusion protein such that the heterologous protein is cleaved from the delivery signal from the bacterial effector protein within the cancer cell, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
Раковые клетки для доставки гетерологичных белков обычно представляют собой раковые клетки от типов рака, выбранных из несолидных опухолей, выбранных из группы, состоящей из саркомы, лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, типов рака центральной нервной системы и злокачественных солидных опухолей, которые включают, без ограничения, абнормальную массу клеток, которые могут происходить из различных типов тканей, таких как печень, толстая кишка, ободочная и прямая кишка, кожа, молочная железа, поджелудочная железа, шейка матки, тело матки, мочевой пузырь, желчный пузырь, почки, гортань, губа, полость рта, пищевод, яичник, предстательная железа, желудок, яички, щитовидная железа или легкие, и, таким образом, включают злокачественные солидные опухоли печени, толстой кишки, ободочной и прямой кишок, кожи, молочной железы, поджелудочной железы, шейки матки, тела матки, мочевого пузыря, желчного пузыря, почек, гортани, губы, полости рта, пищевода, яичника, предстательной железы, желудка, яичек, щитовидной железы или легких. Предпочтительно, раковые клетки для доставки гетерологичных белков представляют собой злокачественные солидные опухоли.Cancer cells for delivery of heterologous proteins are typically cancer cells from cancer types selected from non-solid tumors selected from the group consisting of sarcoma, leukemia, lymphoma, multiple myeloma, central nervous system cancer types, and malignant solid tumors, which include, but are not limited to , an abnormal mass of cells that can originate from various types of tissues, such as the liver, colon, colon, rectum, skin, breast, pancreas, cervix, corpus uterus, bladder, gallbladder, kidney, larynx, lip , oral cavity, esophagus, ovary, prostate, stomach, testes, thyroid or lung, and thus includes malignant solid tumors of the liver, colon, colorectum, skin, breast, pancreas, cervix, body of the uterus, bladder, gall bladder, kidneys, larynx, lip, oral cavity, esophagus, ovary, prostate, stomach, testes, thyroid or lungs. Preferably, the cancer cells for delivery of heterologous proteins are malignant solid tumors.
Таким образом, в одном предпочтительном варианте реализации рак представляет собой злокачественную солидную опухоль, и способ включает:Thus, in one preferred embodiment, the cancer is a malignant solid tumor, and the method includes:
i) культивирование рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, как описано в настоящем документе;i) cultivating a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain as described herein;
ii) введение субъекту указанного рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий посредством осуществления контакта клетки злокачественной солидной опухоли с рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий по п. i), причем слитый белок, который содержит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и гетерологичный белок, экспрессируется рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий и транслоцируется в клетку злокачественной солидной опухоли; и необязательно iii) расщепление слитого белка так, что гетерологичный белок отщепляется от сигнала доставки из бактериального эффекторного белка внутри клетки злокачественной солидной опухоли, причем рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта.ii) administering to the subject said recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain by contacting a malignant solid tumor cell with the recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain of claim i), wherein a fusion protein that contains a delivery signal from a bacterial effector protein and a heterologous protein is expressed a recombinant gram-negative strain of bacteria attenuated in virulence and translocated into the cell of a malignant solid tumor; and optionally iii) cleaving the fusion protein such that the heterologous protein is cleaved from the delivery signal from the bacterial effector protein within the malignant solid tumor cell, wherein the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is administered in an amount that is sufficient to treat the subject.
В некоторых вариантах реализации по меньшей мере два слитых белка, каждый из которых содер- 43 044058 жит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и гетерологичный белок, экспрессируются рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий и транслоцируются в эукариотическую клетку, например, раковую клетку, способами согласно настоящему изобретению.In some embodiments, at least two fusion proteins, each comprising a delivery signal from a bacterial effector protein and a heterologous protein, are expressed by a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain and translocated into a eukaryotic cell, such as a cancer cell, by methods according to the present invention.
Рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий можно культивировать так, чтобы экспрессировался слитый белок, который содержит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и гетерологичный белок, согласно способам, известным в данной области техники (например, см. публикацию FDA, Bacteriological Analytical Manual (ВАМ), chapter 8: Yersinia enterocolitica). Предпочтительно, рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий можно культивировать в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, например, при температуре 28°С. Для индукции экспрессии T3SS и, например, генов, зависимых от промотора YopE/SycE, бактерии можно выращивать при температуре 37°С. В одном варианте реализации осуществляют контакт раковой клетки, например, клетки злокачественной солидной опухоли, с двумя рекомбинантными аттенуированными по вирулентности грамотрицательными штаммами бактерий по п. i), причем первый рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий экспрессирует первый слитый белок, который содержит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и первый гетерологичный белок, а второй рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий экспрессирует второй слитый белок, который содержит сигнал доставки из бактериального эффекторного белка и второй гетерологичный белок, так, что первый и второй слитый белок транслоцируются в клетку злокачественной солидной опухоли. Данный вариант реализации обеспечивает коинфекцию раковой клетки, например, клетки злокачественной солидной опухоли, двумя штаммами бактерий в качестве надежного способа для доставки, например, двух различных гибридных белков в отдельные клетки для направления их функционального взаимодействия.A recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain can be cultured to express a fusion protein that contains a delivery signal from a bacterial effector protein and a heterologous protein, according to methods known in the art (for example, see the FDA publication, Bacteriological Analytical Manual (BAM) , chapter 8: Yersinia enterocolitica). Preferably, the recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain can be cultured in brain heart extract broth, for example at 28°C. To induce expression of T3SS and, for example, YopE/SycE promoter-dependent genes, bacteria can be grown at 37°C. In one embodiment, a cancer cell, for example, a malignant solid tumor cell, is contacted with two recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strains according to claim i), wherein the first recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain expresses a first fusion protein that contains a delivery signal from a bacterial effector protein and a first heterologous protein, and a second recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain expresses a second fusion protein that contains a delivery signal from the bacterial effector protein and a second heterologous protein such that the first and second fusion proteins are translocated into a malignant solid tumor cell. This embodiment allows for co-infection of a cancer cell, for example a malignant solid tumor cell, with two strains of bacteria as a reliable method for delivering, for example, two different fusion proteins into individual cells to direct their functional interaction.
Специалисты в данной области техники могут также применять множество вариантов анализа для определения того, была ли доставка слитого белка успешной. Например, слитый белок можно обнаружить с помощью иммунофлуоресценции с применением антител, распознающих слитую метку (такую как метка Мус). Определение также может основываться на ферментативной активности белка, доставку которого проводят, например, как в анализе, описанном в публикации19.Those skilled in the art may also employ a variety of assays to determine whether delivery of the fusion protein has been successful. For example, the fusion protein can be detected by immunofluorescence using antibodies that recognize the fusion tag (such as the Myc tag). The determination may also be based on the enzymatic activity of the protein being delivered, for example, as in the assay described in publication 19 .
В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, как описано в настоящем документе, необязательно содержащая подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Таким образом, в настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий, как описано в настоящем документе, для применения в способе лечения рака, например, злокачественной солидной опухоли у субъекта.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain as described herein, optionally containing a suitable pharmaceutically acceptable carrier. Thus, the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain as described herein for use in a method of treating cancer, for example, a malignant solid tumor in a subject.
Рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные бактерии могут быть приготовлены для удобного и эффективного введения в количестве, которое является достаточным для лечения субъекта, в виде фармацевтической композиции с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Единичная лекарственная форма рекомбинантных аттенуированных по вирулентности грамотрицательных бактерий или фармацевтической композиции, подлежащей введению, может, например, содержать рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные бактерии в количестве от приблизительно 105 до приблизительно 109 бактерий на 1 мл, предпочтительно, от приблизительно 106 до приблизительно 108 бактерий на 1 мл, более предпочтительно, от приблизительно 107 до приблизительно 108 бактерий на 1 мл, наиболее предпочтительно, приблизительно 108 бактерий на 1 мл.Recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacteria can be formulated for convenient and effective administration in an amount sufficient to treat a subject in the form of a pharmaceutical composition with a suitable pharmaceutically acceptable carrier. A unit dosage form of recombinant virulence-attenuated gram-negative bacteria or pharmaceutical composition to be administered may, for example, contain recombinant virulence-attenuated gram-negative bacteria in an amount of from about 10 5 to about 10 9 bacteria per ml, preferably from about 10 6 to about 10 8 bacteria per 1 ml, more preferably from about 10 7 to about 10 8 bacteria per 1 ml, most preferably about 10 8 bacteria per 1 ml.
Под количеством, достаточным для лечения субъекта, или эффективным количеством, которые используются в настоящем документе взаимозаменяемо, подразумевают количество бактерии или бактерий, достаточно высокое, чтобы в значительной степени положительно изменить состояние, лечение которого проводят, но достаточно низкое, чтобы избежать серьезных побочных эффектов (при обоснованном соотношении польза/риск), в рамках здравого медицинского суждения. Эффективное количество бактерии будет варьировать в зависимости от конкретной поставленной цели, возраста и физического состояния субъекта, лечение которого проводят, длительности лечения, природы сопутствующей терапии и конкретной применяемой бактерии. Эффективное количество бактерии будет, таким образом, представлять собой минимальное количество, которое обеспечит желаемый эффект. Обычно субъекту вводят количество от приблизительно 105 до приблизительно 109 бактерий, например, от приблизительно 105 до приблизительно 109 бактерий/м2 поверхности тела, предпочтительно, от приблизительно 106 до приблизительно 108 бактерий, например, от приблизительно 106 до приблизительно 108 бактерий/м2 поверхности тела, более предпочтительно, от приблизительно 107 до приблизительно 108 бактерий, например, от приблизительно 107 до приблизительно 108 бактерий/м2 поверхности тела, наиболее предпочтительно, 108 бактерий, например, 108 бактерий/м2 поверхности тела.By an amount sufficient to treat the subject, or an effective amount, as used interchangeably herein, is meant an amount of bacterium or bacteria that is high enough to significantly beneficially modify the condition being treated, but low enough to avoid serious side effects ( with a reasonable benefit/risk ratio), within the bounds of sound medical judgment. The effective amount of bacterium will vary depending on the specific purpose desired, the age and physical condition of the subject being treated, the duration of treatment, the nature of the concomitant therapy and the particular bacterium used. An effective amount of bacteria will therefore be the minimum amount that will provide the desired effect. Typically, the subject is administered an amount of from about 10 5 to about 10 9 bacteria, such as from about 10 5 to about 10 9 bacteria/m 2 of body surface, preferably from about 10 6 to about 10 8 bacteria, such as from about 10 6 to about 10 8 bacteria/m 2 body surface, more preferably about 10 7 to about 10 8 bacteria, e.g. about 10 7 to about 10 8 bacteria/m 2 body surface, most preferably 10 8 bacteria, e.g. 8 bacteria/ m2 body surface.
Однократная доза рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий для введения субъекту, например, человеку, для лечения рака, например, злокачественной солидной опухоли, составляет обычно от приблизительно 104 до приблизительно 1010 бактерий,A single dose of a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain for administration to a subject, e.g., a human, for the treatment of cancer, e.g., a malignant solid tumor, is typically from about 10 4 to about 10 10 bacteria,
- 44 044058 например, от приблизительно 104 бактерий/м2 поверхности тела до приблизительно 1010 бактерий/м2 поверхности тела, предпочтительно, от приблизительно 105 до приблизительно 109 бактерий, например, от приблизительно 105 до приблизительно 109 бактерий/м2 поверхности тела, более предпочтительно, от приблизительно 106 до приблизительно 108 бактерий, например, от приблизительно 106 до приблизительно 108 бактерий/м2 поверхности тела, еще более предпочтительно, от приблизительно 107 до приблизительно 108 бактерий, например, от приблизительно 107 до приблизительно 108 бактерий/м2 поверхности тела, наиболее предпочтительно, 108 бактерий, например, 108 бактерий/м2 поверхности тела суммарных рекомбинантных аттенуированных по вирулентности грамотрицательных бактерий.- 44 044058 for example from about 10 4 bacteria/m 2 body surface to about 10 10 bacteria/m 2 body surface, preferably from about 10 5 to about 10 9 bacteria, for example from about 10 5 to about 10 9 bacteria/ m 2 body surface, more preferably from about 10 6 to about 10 8 bacteria, for example from about 10 6 to about 10 8 bacteria/m 2 body surface, even more preferably from about 10 7 to about 10 8 bacteria, for example , from about 10 7 to about 10 8 bacteria/m 2 body surface, most preferably, 10 8 bacteria, for example, 10 8 bacteria/m 2 body surface total recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacteria.
Примеры веществ, которые могут выступать в качестве фармацевтических носителей, представляют собой сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетаты целлюлозы; порошковый трагакант; солод; желатин; тальк; стеариновые кислоты; стеарат магния; сульфат кальция; карбонат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао-бобов; многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль; агар; альгиновые кислоты; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; экстракты клюквы и фосфатный буферный раствор; обезжиренное сухое молоко; а также другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах, такие как, например, витамин С, эстроген и эхинацея. Также могут присутствовать смачивающие средства и смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия, а также красящие средства, ароматизирующие вещества, смазывающие вещества, вспомогательные вещества, вещества, способствующие таблетированию, стабилизаторы, антиоксиданты и консерванты.Examples of substances that can act as pharmaceutical carriers are sugars such as lactose, glucose and sucrose; starches such as corn starch and potato starch; cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose and cellulose acetates; powdered tragacanth; malt; gelatin; talc; stearic acids; magnesium stearate; calcium sulfate; calcium carbonate; vegetable oils such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil and cocoa bean oil; polyhydric alcohols such as propylene glycol, glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; agar; alginic acids; pyrogen-free water; isotonic saline solution; cranberry extracts and phosphate buffer solution; skim milk powder; as well as other non-toxic compatible substances used in pharmaceutical formulations, such as, for example, vitamin C, estrogen and echinacea. Wetting agents and lubricants such as sodium lauryl sulfate may also be present, as well as coloring agents, flavoring agents, lubricants, excipients, tabletting agents, stabilizers, antioxidants and preservatives.
Способы введения рекомбинантных аттенуированных по вирулентности грамотрицательных бактерий субъекту можно выбрать из группы, состоящей из внутривенного, внутриопухолевого, интраперитонеального и перорального введения. Несмотря на то, что настоящее изобретение не предназначено быть ограниченным каким-либо конкретным способом применения, внутривенное или внутриопухолевое введение бактерий или фармацевтических композиций является предпочтительным.Methods of administering recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacteria to a subject can be selected from the group consisting of intravenous, intratumoral, intraperitoneal, and oral administration. Although the present invention is not intended to be limited to any particular mode of administration, intravenous or intratumoral administration of bacteria or pharmaceutical compositions is preferred.
В зависимости от пути введения может требоваться, чтобы активные компоненты, которые содержат бактерии, были покрыты материалом для защиты указанных организмов от действия ферментов, кислот и других природных условий, которые могут инактивировать указанные организмы. С целью введения бактерий путем, отличным от парентерального введения, бактерии должны быть покрыты материалом для защиты от инактивации или должны вводиться вместе с указанным материалом. Например, бактерии можно вводить совместно с ингибиторами ферментов или в липосомах. Ингибиторы ферментов включают ингибитор трипсина поджелудочной железы, диизопропилфлуорофосфат (DFP) и тразилол. Липосомы включают эмульсии Р40 вода-в-масле-в-воде, а также общепринятые и специально разработанные липосомы, которые транспортируют бактерии, такие как Lactobacillus, или их побочные продукты, к внутренней мишени субъекта-хозяина.Depending on the route of administration, the active ingredients that contain bacteria may be required to be coated with a material to protect said organisms from enzymes, acids and other natural conditions that may inactivate said organisms. For the purpose of administering bacteria by a route other than parenteral administration, the bacteria must be coated with a material to protect against inactivation or must be administered together with the specified material. For example, bacteria can be administered together with enzyme inhibitors or in liposomes. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropyl fluorophosphate (DFP), and trazylol. Liposomes include P40 water-in-oil-in-water emulsions, as well as conventional and specially formulated liposomes that transport bacteria, such as Lactobacillus, or their byproducts, to the internal target of the host subject.
Одну бактерию можно ввести саму по себе или в сочетании с второй, отличной бактерией. Любое число различных бактерий можно применять в сочетании. Под в сочетании с подразумевают вместе, по существу одновременно или последовательно. Композиции можно также вводить в форме таблетки, драже или капсулы, например, такой как высушенная сублимацией капсула, содержащая бактерии или фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, либо в виде замороженного раствора бактерий или фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, содержащего DMSO или глицерол. Другая предпочтительная форма применения включает приготовление лиофилизированных капсул бактерий или фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Еще одна предпочтительная форма применения включает приготовление высушенной теплом капсулы бактерий или фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению.One bacterium can be administered on its own or in combination with a second, different bacterium. Any number of different bacteria may be used in combination. By in combination with is meant together, substantially simultaneously or sequentially. The compositions may also be administered in the form of a tablet, dragee or capsule, such as a freeze-dried capsule containing the bacteria or pharmaceutical compositions of the present invention, or as a frozen solution of the bacteria or pharmaceutical compositions of the present invention containing DMSO or glycerol. Another preferred form of use involves the preparation of lyophilized capsules of bacteria or pharmaceutical compositions according to the present invention. Another preferred form of use involves the preparation of heat-dried capsules of bacteria or pharmaceutical compositions according to the present invention.
Рекомбинантные аттенуированные по вирулентности грамотрицательные бактерии или фармацевтическую композицию, подлежащие введению, можно ввести с помощью инъекции. Формы, подходящие для инъекционного применения, включают моносептические или стерильные водные растворы (в случае водорастворимых компонентов) либо дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии непосредственно перед применением. Во всех случаях форма должна быть моносептической или стерильной и должна быть жидкой в той степени, чтобы ее можно было с легкостью ввести через шприц. Форма должна быть стабильной в условиях производства и хранения. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерол, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), подходящие смеси данных компонентов и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические вещества, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить посредством применения в композиции веществ, которые отсрочивают всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.The recombinant virulence-attenuated gram-negative bacteria or pharmaceutical composition to be administered can be administered by injection. Forms suitable for injectable use include monoseptic or sterile aqueous solutions (in the case of water-soluble components) or dispersions and sterile powders for preparation of sterile injectable solutions or dispersions immediately before use. In all cases, the form must be monoseptic or sterile and must be fluid to the extent that it can be easily administered by syringe. The shape must be stable under production and storage conditions. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyhydric alcohol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures of these components and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, through the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of a dispersion. In many cases it will be preferable to include isotonic substances, such as sugars or sodium chloride, in the composition. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by using substances in the composition that delay absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рекомбинантный аттенуированный поIn some embodiments of the present invention, the recombinant attenuated
- 45 044058 вирулентности грамотрицательный штамм бактерий вводят субъекту совместно с сидерофором. Данные варианты реализации являются предпочтительными. Сидерофоры, которые можно вводить совместно, представляют собой сидерофоры, включая гидроксамат, катехолат и сидерофоры со смешанными лигандами. Предпочтительные сидерофоры представляют собой дефероксамин (также известный как десферриоксамин В, десфероксамин В, DFO-B, DFOA, DFB или Десферал), десферриоксамин Е, деферазирокс (Эксиджад, Десирокс, Дефриджет, Десифер) и деферипрон (Феррипрокс), более предпочтительным является дефероксамин. Дефероксамин представляет собой бактериальный сидерофор, продуцируемый актинобактерией Streptomyces pilosus, который является коммерчески доступным, например, от компании Novartis Pharma Schweiz AG (Швейцария).- 45 044058 virulence gram-negative strain of bacteria is administered to the subject together with a siderophore. These embodiments are preferred. Siderophores that can be co-administered are siderophores including hydroxamate, catecholate and mixed ligand siderophores. Preferred siderophores are deferoxamine (also known as desferrioxamine B, desferoxamine B, DFO-B, DFOA, DFB or Desferal), desferrioxamine E, deferasirox (Exjade, Desirox, Defridget, Desifer) and deferiprone (Ferryprox), with deferoxamine being more preferred. Deferoxamine is a bacterial siderophore produced by the actinobacterium Streptomyces pilosus, which is commercially available, for example, from Novartis Pharma Schweiz AG (Switzerland).
Совместное введение с сидерофором можно проводить до, одновременно с или после введения рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий. Предпочтительно, сидерофор вводят до введения рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий, более предпочтительно, вводят по меньшей мере за 1 ч, предпочтительно, по меньшей мере за 6 ч, более предпочтительно, по меньшей мере за 12 ч, в частности, по меньшей мере за 24 ч до введения субъекту рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий. В конкретном варианте реализации субъект получает предварительное лечение десфреоксамином за 24 ч до инфицирования рекомбинантным аттенуированным по вирулентности грамотрицательным штаммом бактерий для обеспечения роста бактерий. Обычно сидерофор вводят совместно в однократной дозе от приблизительно 0,5x10’5 моль до приблизительно 1x10’3 моль, более предпочтительно, от приблизительно 1x10’5 моль до приблизительно 1x10’4 моль, предпочтительно, от приблизительно 3,5x10’5 моль до приблизительно 1,1x10’4 моль на 1 кг массы тела. Обычно десфероксамин вводят совместно в однократной дозе от приблизительно 20 мг до приблизительно 60 мг, предпочтительно, от приблизительно 20 мг до приблизительно 60 мг на 1 кг массы тела.Co-administration with a siderophore can be carried out before, simultaneously with or after the introduction of a recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria. Preferably, the siderophore is administered before the introduction of a recombinant virulence-attenuated gram-negative bacterial strain, more preferably administered at least 1 hour before, preferably at least 6 hours before, more preferably at least 12 hours before, in particular at least 24 hours before the subject is administered a recombinant virulence-attenuated gram-negative strain of bacteria. In a specific embodiment, the subject is pretreated with desphreoxamine 24 hours prior to infection with a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain to promote bacterial growth. Typically, the siderophore is co-administered in a single dose of from about 0.5x10'5 mole to about 1x10'3 mole, more preferably from about 1x10'5 mole to about 1x10'4 mole, preferably from about 3.5x10'5 mole to about 1.1x10'4 mol per 1 kg of body weight. Typically, desferoxamine is coadministered at a single dose of about 20 mg to about 60 mg, preferably about 20 mg to about 60 mg, per kg of body weight.
Режимы дозирования при введении рекомбинантного аттенуированного по вирулентности грамотрицательного штамма бактерий или фармацевтической композиции, описанных в настоящем документе, будут варьировать в зависимости от конкретной поставленной цели, возраста и физического состояния субъекта, лечение которого проводят, длительности лечения, природы сопутствующей терапии и конкретной применяемой бактерии, как известно специалисту. Рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий обычно вводят субъекту согласно режиму введения доз, состоящему из однократной дозы каждые 1-20 дней, предпочтительно, каждые 1-10 дней, более предпочтительно, каждые 1-7 дней. Период введения составляет обычно от приблизительно 20 до приблизительно 60 дней, предпочтительно, приблизительно 30-40 дней. В качестве альтернативы, период введения составляет обычно от приблизительно 8 до приблизительно 32 недель, предпочтительно, от приблизительно 8 до приблизительно 24 недель, более предпочтительно, от приблизительно 12 до приблизительно 16 недель.Dosage regimens for administering a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain or pharmaceutical composition described herein will vary depending on the specific purpose intended, the age and physical condition of the subject being treated, the duration of treatment, the nature of the concomitant therapy, and the specific bacterium used. as known to the specialist. The recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain is typically administered to a subject according to a dosing regimen consisting of a single dose every 1-20 days, preferably every 1-10 days, more preferably every 1-7 days. The administration period is usually from about 20 to about 60 days, preferably about 30-40 days. Alternatively, the administration period is typically from about 8 to about 32 weeks, preferably from about 8 to about 24 weeks, more preferably from about 12 to about 16 weeks.
В следующем варианте реализации в настоящем изобретении предложен набор для лечения рака, например, такого как злокачественные солидные опухоли, предпочтительно, у человека. Такие наборы, как правило, будут содержать рекомбинантный аттенуированный по вирулентности грамотрицательный штамм бактерий или фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и инструкции по применению набора. В некоторых вариантах реализации наборы содержат носитель, упаковку или контейнер, который разделен с получением одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., причем каждый из контейнера или контейнеров содержит один из отдельных элементов для применения в способе, описанном в настоящем документе. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и лабораторные пробирки. В других вариантах реализации контейнеры изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластик.In a further embodiment, the present invention provides a kit for treating cancer, such as, for example, malignant solid tumors, preferably in humans. Such kits will typically contain a recombinant virulence-attenuated Gram-negative bacterial strain or pharmaceutical composition described herein and instructions for use of the kit. In some embodiments, the kits contain a carrier, package, or container that is divided into one or more containers, such as vials, tubes, and the like, each of the container or containers containing one of the individual elements for use in the method described in this document. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes and laboratory tubes. In other embodiments, the containers are made from a variety of materials, such as glass or plastic.
ПримерыExamples
Пример 1.Example 1.
А) Материалы и методы.A) Materials and methods.
Штаммы бактерий и условия роста.Bacterial strains and growth conditions.
Штаммы, применявшиеся в данном исследовании, перечислены на фиг. ЗА-M. Е. coli Top10, который применяли для очистки и клонирования плазмиды, и Е. coli Sm10λ pir, который применяли для конъюгации, а также Е. coli BW19610 31, который применяли для размножения pKNG101, выращивали общепринятым способом на чашках с агаром LB и в бульоне LB при температуре 37°С. Ампициллин использовали в концентрации 200 мкг/мл (Yersinia) или 100 мкг/мл (Е. coli) для отбора векторов экспрессии. Стрептомицин использовали в концентрации 100 мкг/мл для отбора векторов-самоубийц. Y. enterocolitica MRS40 (0:9, биотип 2)20, не устойчивое к ампициллину Е40-производное19, и полученные из него штаммы выращивали общепринятым способом на сердечно-мозговом экстракте (Brain Heart Infusion BHI; Difco) при к.т. (комнатной температуре). Ко всем штаммам Y. enterocolitica добавляли налидиксовую кислоту (35 мкг/мл), а ко всем штаммам Y. enterocolitica asd дополнительно добавляли 100 мкг/мл мезо-2,6-диаминопимелиновой кислоты (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 выращивали общепринятым способом на чашках с агаром LB и в бульоне LB при температуре 37°С. Ампициллин испольThe strains used in this study are listed in Fig. FOR-M. E. coli Top10, which was used for plasmid purification and cloning, and E. coli Sm10λ pir, which was used for conjugation, as well as E. coli BW19610 31 , which was used for propagation of pKNG101, were grown in the conventional manner on LB agar plates and in broth LB at 37°C. Ampicillin was used at a concentration of 200 μg/ml (Yersinia) or 100 μg/ml (E. coli) for selection of expression vectors. Streptomycin was used at a concentration of 100 μg/ml to select suicide vectors. Y. enterocolitica MRS40 (0:9, biotype 2) 20 , an E40 derivative 19 that is not resistant to ampicillin, and strains obtained from it were grown in a conventional manner on brain heart extract (Brain Heart Infusion BHI; Difco) at RT. (room temperature). Nalidixic acid (35 μg/ml) was added to all Y. enterocolitica strains, and 100 μg/ml meso-2,6-diaminopimelic acid (mDAP, Sigma Aldrich) was additionally added to all Y. enterocolitica asd strains. S. enterica SL1344 was grown conventionally on LB agar plates and in LB broth at 37°C. Ampicillin is used
- 46 044058 зовали в концентрации 100 мкг/мл для отбора векторов экспрессии в S. enterica.- 46 044058 was called at a concentration of 100 μg/ml for the selection of expression vectors in S. enterica.
Г енетические манипуляции с Y. enterocolitica.Genetic manipulations of Y. enterocolitica.
Генетические манипуляции с Y. enterocolitica были описаны в публикации32,33. Вкратце, мутаторы для модификации или делеции генов в плазмидах pYV или на хромосоме конструировали с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами из 2-х фрагментов с применением в качестве матрицы очищенной плазмиды pYV40 или геномной ДНК, что приводило к получению фланкирующих последовательностей размером 200-250 п.о. на обеих сторонах делетированной или модифицированной части соответствующего гена. Полученные в результате фрагменты клонировали в pKNG101 29 в Е. coli BW19610 31. Плазмидами с подтвержденной последовательностью трансформировали Е. coli Sm10X pir, из которого плазмиды мобилизировали в соответствующий штамм Y. enterocolitica. Мутанты, несущие встроенный вектор, размножали для получения нескольких поколений без давления отбора. Затем для отбора клонов, которые утратили вектор, использовали сахарозу. Наконец, мутанты идентифицировали с помощью ПЦР для отбора колоний. Конкретные мутаторы (pSi_408, pSi_419) перечислены в табл. III.Genetic manipulation of Y. enterocolitica has been described 32,33 . Briefly, mutators to modify or delete genes in pYV plasmids or on the chromosome were constructed by PCR with overlapping 2-fragment primers using purified pYV40 plasmid or genomic DNA as a template, resulting in flanking sequences of 200–250 bp. O. on both sides of the deleted or modified part of the corresponding gene. The resulting fragments were cloned into pKNG101 29 in E. coli BW19610 31 . E. coli Sm10X pir was transformed with sequence-confirmed plasmids, from which the plasmids were mobilized into the corresponding strain of Y. enterocolitica. Mutants carrying the integrated vector were propagated to produce multiple generations without selection pressure. Sucrose was then used to select clones that had lost the vector. Finally, mutants were identified using colony selection PCR. Specific mutators (pSi_408, pSi_419) are listed in Table. III.
Конструкция плазмид.Plasmid construction.
Плазмиду pBad_Si2 или pBad_Si1 (фиг. 2) применяли для клонирования слитых белков с Nконцевыми 138 аминокислотами YopE (SEQ ID NO: 2). pBad_Si2 была сконструирована путем клонирования содержащих фрагмент SycE-YopE1-138 эндогенных промоторов для YopE и SycE из очищенной pYV40 в сайт KpnI/HindIII pBad-MycHisA (Invitrogen). Дополнительные модификации включают удаление фрагмента NcoI/BglII pBad-MycHisA путем расщепления, обработку фрагментом Кленова и повторное лигирование. Двунаправленный терминатор транскрипции (ВВа_B1006; iGEM foundation) клонировали в разрез KpnI, обработанный фрагментом Кленова (pBad_Si2), или сайт разреза BglII (pBad_Si1). Затем на 3'-конце YopE1-138 были добавлены следующие сайты расщепления: Xbal-XhoI-BstBI-(HindIII) (фиг. 2 В). pBad_Si1 аналогична pBad_Si2, но кодирует EGFP, амплифицированный из pEGFP-C1 (Clontech) в сайте NcoI/BglII под контролем индуцибельного арабинозой промотора. Плазмиды pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269, содержащие соответствующий эндогенный промотор и фрагмент SteA1-20 (pSi_266), полноразмерную последовательность SteA (pSi_267), фрагмент SopE1-81 (pSi_268) или фрагмент SopE1-105 (pSi_269), амплифицировали из геномной ДНК S. enterica SL1344 и клонировали в сайт NcoI/KpnI pBad-MycHisA (Invitrogen).Plasmid pBad_Si2 or pBad_Si1 (Fig. 2) was used to clone fusion proteins with the N-terminal 138 amino acids of YopE (SEQ ID NO: 2). pBad_Si2 was constructed by cloning the SycE-YopE 1-138 fragment-containing endogenous promoters for YopE and SycE from purified pYV40 into the KpnI/HindIII site of pBad-MycHisA (Invitrogen). Additional modifications include removal of the NcoI/BglII fragment of pBad-MycHisA by digestion, treatment with Klenow fragment, and religation. A bidirectional transcription terminator (BBa_B1006; iGEM foundation) was cloned into a KpnI cut treated with a Klenow fragment (pBad_Si2) or a BglII cut site (pBad_Si1). The following cleavage sites were then added at the 3′ end of YopE 1-138 : Xbal-XhoI-BstBI-(HindIII) (Fig. 2 B). pBad_Si1 is similar to pBad_Si2 but encodes EGFP amplified from pEGFP-C1 (Clontech) at the NcoI/BglII site under the control of an arabinose-inducible promoter. PSI_266, psi_267, psi_268 and psi_269 plasmids containing the corresponding endogenous promoter and fragment Stea 1-20 (PSI_266), a full-size sequence of Stea (PSI_267), fragment Sope 1-81 (PSI_268) or fragment SOPE 1-105 (PS I_269), amplified from genomic DNA of S. enterica SL1344 and cloned into the NcoI/KpnI site of pBad-MycHisA (Invitrogen).
Полноразмерные гены или их фрагменты амплифицировали со специфичными праймерами, перечисленными в табл. I ниже, и клонировали в виде слияний с YopE1-138 в плазмиду pBad_Si2 или, в случае z-BIM (SEQ ID NO: 16), - в pBad_Si1 (см. табл. II ниже). Для слияния с SteA или SopE синтетические конструкции ДНК расщепляли KpnI/HindII и клонировали в pSi_266, pSi_267, pSi_268 или pSi_269, соответственно. В случае генов бактериальных видов в качестве матрицы применяли очищенную геномную ДНК (S. flexneri M90T, Salmonella enterica подвид enterica серовар Тифимуриум SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Для генов человека применяли универсальную библиотеку к ДНК (Clontech), если не указано обратное (фиг. 3А-М, гены данио-рерио амплифицировали из библиотеки к ДНК (любезно предоставленной М. Affolter)). Лигированные плазмиды клонировали в Е. coli Top10. Секвенированные плазмиды переносили посредством электропорации в желаемый штамм Y. enterocolitica или S. enterica с применением настроек для стандартной электропорации Е. coli.Full-length genes or their fragments were amplified with specific primers listed in Table. I below and cloned as fusions with YopE 1-138 into plasmid pBad_Si2 or, in the case of z-BIM (SEQ ID NO: 16), into pBad_Si1 (see Table II below). For fusion with SteA or SopE, synthetic DNA constructs were digested with KpnI/HindII and cloned into pSi_266, pSi_267, pSi_268, or pSi_269, respectively. In the case of genes from bacterial species, purified genomic DNA was used as a template (S. flexneri M90T, Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). For human genes, a universal DNA library (Clontech) was used unless otherwise noted (Fig. 3A-M, zebrafish genes were amplified from a DNA library (kindly provided by M. Affolter)). The ligated plasmids were cloned into E. coli Top10. Sequenced plasmids were transferred by electroporation into the desired strain of Y. enterocolitica or S. enterica using the settings for standard E. coli electroporation.
Таблица I № Si Праймера_: ПоследовательностьTable I No. Si Primer_: Sequence
Seq_Id_No_51: Праймер №: Si_285Seq_Id_No_51: Primer No.: Si_285
CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAGCATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_52: Праймер №: Si_286Seq_Id_No_52: Primer No.: Si_286
GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCATGGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
Seq_Id_No_53: Праймер №: Si_287Seq_Id_No_53: Primer No.: Si_287
CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTGCGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG
Seq_Id_No_54: Праймер №: Si_288Seq_Id_No_54: Primer No.: Si_288
GTT AA AGC TTttcgaatctagactcgagCGT GGCGA ACTGGTCGTT AA AGC TTttcgaatctagactcgagCGT GGCGA ACTGGTC
Seq_Id_No_55: Праймер №: Si_387Seq_Id_No_55: Primer No.: Si_387
CGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAACGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAA
Seq_Id_No_56: Праймер №: Si_391 CGTAtctagaGGCAACCGCAGCASeq_Id_No_56: Primer No.: Si_391 CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA
Seq_Id_No_57: Праймер №: Si_389Seq_Id_No_57: Primer No.: Si_389
GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTgGTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg
Seq_Id_No_58: Праймер №: Si_436Seq_Id_No_58: Primer No.: Si_436
CGTAtctagaATGCCCCGCCCCCGTAtctagaATGCCCCGCCCC
- 47 044058- 47 044058
Seq_Id_No_59: Праймер №: Si_437Seq_Id_No_59: Primer No.: Si_437
GTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAATGTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAAT
Seq_Id_No_60: Праймер №: Si_438Seq_Id_No_60: Primer No.: Si_438
CGTAtctagaATGTCTGACACGTCCAGAGAGCGTAtctagaATGTCTGACACGTCCAGAGAG
Seq_Id_No_61: Праймер №: Si_439Seq_Id_No_61: Primer No.: Si_439
GTTAAAGCTTTCATCTTCTTCGCAGGAAAAAGGTTAAAGCTTTCATCTTCTTCGCAGGAAAAAG
Seq_Id_No_62: Праймер №: Si 463Seq_Id_No_62: Primer No.: Si 463
C AGT ctcgaggaaagcttgtttaaggggcC AGT ctcgaggaaagcttgtttaaggggc
Seq_Id_No_63: Праймер №: Si_464 cagtTTCGAAttagcgacggcgacgSeq_Id_No_63: Primer No.: Si_464 cagtTTCGAAttagcgacggcgacg
Seq_Id_No_64: Праймер №: Si_476Seq_Id_No_64: Primer No.: Si_476
GTTAAAGCTTttACTTGTACAGCTCGTCCATGTTAAAGCTTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
Seq_Id_No_65: Праймер №: Si_494Seq_Id_No_65: Primer No.: Si_494
CGTAtctagaATGGCCGAGCCTTGCGTAtctagaATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_66: Праймер №: Si_495Seq_Id_No_66: Primer No.: Si_495
GTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCCGTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCC
Seq_Id_No_67: Праймер №: Si_504Seq_Id_No_67: Primer No.: Si_504
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTA TGCCCCGCCCCCGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTTCAAAGTA TGCCCCGCCCC
Seq_Id_No_68: Праймер №: Si_505Seq_Id_No_68: Primer No.: Si_505
GTTAAAGCTTCCCACCGTACTCGTCAATtcGTTAAAGCTTCCCACGTACTCGTCAATtc
Seq_Id_No_69: Праймер №: Si_508Seq_Id_No_69: Primer No.: Si_508
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTA TGGCCGAGCCTTGCGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTTCAAAGTA TGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_70: Праймер №: Si_509Seq_Id_No_70: Primer No.: Si_509
GTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCcGTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCc
Seq_Id_No_71: Праймер №: Si_511Seq_Id_No_71: Primer No.: Si_511
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTG TGAGCAAGGGCGAGCGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTTCAAAGTG TGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_72: Праймер №: Si_512Seq_Id_No_72: Primer No.: Si_512
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTC CGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAGCGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTTCAAAGTC CGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAG
Seq_Id_No_73: Праймер №: Si_513Seq_Id_No_73: Primer No.: Si_513
GTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCGTCC ATGTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCGTCC AT
- 48 044058- 48 044058
Seq_Id_No_74: Праймер №: Si_515Seq_Id_No_74: Primer No.: Si_515
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTG ATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTGCGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTTCAAAGTG ATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_75: Праймер №: Si_677Seq_Id_No_75: Primer No.: Si_677
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAAATT GGTGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTATTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAAATT GGTGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTA
Seq_Id_No_76: Праймер №: Si_678Seq_Id_No_76: Primer No.: Si_678
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGCGGGTACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGCGGG
CAATATTATGAATAATTTCTTCGAATAGTAACAATATTATGAATAATTTCTTCGAATAGTAA
Seq_Id_No_77: Праймер №: Si_682Seq_Id_No_77: Primer No.: Si_682
TTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGATGA ACTGGATAGCTAAGCTTGGAGTATTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGATGA ACTGGATAGCTAAGCTTGGAGTA
Seq_Id_No_78: Праймер №: Si_683Seq_Id_No_78: Primer No.: Si_683
TACTCCAAGCTTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGCGGCGCAGACATTCGC TCAGTTTTTTCTCGAGTAGTAATACTCCAAGCTTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGCGGCGCAGACATTCGC TCAGTTTTTTCTCGAGTAGTAA
Seq_Id_No_79: Праймер №: Si_580 catgccatggatttatggtcatagatatgacctcSeq_Id_No_79: Primer No.: Si_580 catgccatggatttatggtcatagatatgacctc
Seq_Id_No_80: Праймер №: Si_612Seq_Id_No_80: Primer No.: Si_612
CGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaagCGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaag
Seq_Id_No_81: Праймер №: Si_613Seq_Id_No_81: Primer No.: Si_613
CGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagcCGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagc
Seq_Id_No_82: Праймер №: Si_614 catgccatggCGGCAAGGCTCCTCSeq_Id_No_82: Primer No.: Si_614 catgccatggCGGCAAGGCTCCTC
Seq_Id_No_83: Праймер №: Si_615 cggggtaccTTTATTTGTCAACACTGCCCSeq_Id_No_83: Primer No.: Si_615 cggggtaccTTTATTTGTCAACACTGCCC
Seq_Id_No_84: Праймер №: Si_616 cggggtaccTGCGGGGTCTTTACTCGSeq_Id_No_84: Primer No.: Si_616 cggggtaccTGCGGGGTCTTTTACTCG
Seq_Id_No_85: Праймер №: Si_585Seq_Id_No_85: Primer No.: Si_585
CAGTctcgagATGCAGATCTTCGTCAAGACCAGTctcgagATGCAGATCTTCGTCAAGAC
Seq_Id_No_86: Праймер №: Si_586Seq_Id_No_86: Primer No.: Si_586
GTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGACGTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGAC
Seq_Id_No_87: Праймер №: Si_588 cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTGSeq_Id_No_87: Primer No.: Si_588 cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
Seq_Id_No_88: праймер № 733Seq_Id_No_88: primer no. 733
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC CGTTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC CG
- 49 044058- 49 044058
Seq_Id_No_89: праймер № 735Seq_Id_No_89: Primer No. 735
TACTCCTTCGAATTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGTACTCCTTTCGAATTAATGATCCATTTCATCACCAATTTG
Seq_Id_No_90: праймер № 736Seq_Id_No_90: primer no. 736
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGTTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCAAAAACTGAGCGAATGTCTGCG
Seq_Id_No_91: праймер № 738Seq_Id_No_91: primer no. 738
TACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGTACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATG
Seq_Id_No_92: праймер № 734Seq_Id_No_92: Primer No. 734
TACTCCTTCGAAGGCACCATGATCCATTTCATCACCAATTTGGTACTCCTTCGAAGGCACCATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
Seq_ID_No_93: праймер № 725:Seq_ID_No_93: Primer No. 725:
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCTTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC
Seq_ID_No_94: праймер № 726:Seq_ID_No_94: Primer No. 726:
TACTCCAAGCTTACGGTTGAATATTATGATCCATTTCATCACCAATTTGGTACTCCAAGCTTACGGTTGAATATTATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
Seq_ID_No_95: праймер № 727:Seq_ID_No_95: Primer No. 727:
TTACTATTCGAAGCCGGTGGTGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCTTACTATTCGAAGCCGGTGGTGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCC
Seq_ID_No_96: праймер № 728:Seq_ID_No_96: Primer No. 728:
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCATACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCA
Seq_ID_No_97: праймер № 737:Seq_ID_No_97: Primer No. 737:
TACTCCTTCGAAGGCACCGCTATCCAGTTCATCACCAATGTACTCCTTCGAAGGCACCGCTATCCAGTTCATCACCAATG
Seq_ID_No_101: праймер № 869:Seq_ID_No_101: Primer No. 869:
gatcgtcgacTTAAGTTCAATGGAGCGTTTAATATCgatcgtcgacTTAAGTTCAATGGAGCGTTTAATATC
Seq_ID_No_102: праймер № 870:Seq_ID_No_102: Primer No. 870:
ctttgactggcgagaaacgcT С TT A AC AT GAGGC T GAGC T CctttgactggcgagaaacgcT C TT A AC AT GAGGC T GAGC T C
Seq_ID_No_103: праймер № 871:Seq_ID_No_103: Primer No. 871:
GAGCTCAGCCTCATGTTAAGAgcgtttctcgccagtcaaagGAGCTCAGCCTCATGTTAAGAgcgtttctcgccagtcaaag
Seq_ID_No_104: праймер № 872:Seq_ID_No_104: Primer No. 872:
gatagcccccgagcctgtGCACTTTGTCATTAACCTCAGCgatagccccgagcctgtGCACTTTGTCATTAACCTCAGC
Seq_ID_No_105: праймер № 873:Seq_ID_No_105: Primer No. 873:
GCTG AGGTT A AT GAC A A AGT GCacaggctcgggggctatcGCTG AGGTT A AT GAC A A AGT GCacaggctcggggggctatc
Seq_ID_No_106: праймер № 874:Seq_ID_No_106: Primer No. 874:
catgtctagaCCCTCAGCATAATAACGACTCcatgtctagaCCCTCAGCATAATAACGACTC
Seq_ID_No_107: праймер № 600:Seq_ID_No_107: Primer No. 600:
catgacatgtTGGCGTTTCTCGCCcatgacatgtTGGCGTTTCTCGCC
Seq_ID_No_108: праймер № 601:Seq_ID_No_108: Primer No. 601:
- 50 044058 catgacatgtATTAACCTCAGCCCTGACTATAAG- 50 044058 catgacatgtATTAACCTCAGCCCTGACTATAAG
Seq_ID_No_l 19: праймер № 1010:Seq_ID_No_l 19: primer no. 1010:
cacatgtctagaCAACCGTTTCCGAAAGGTGATCTGcacatgtctagaCAACCGTTTCCGAAAGGTGATCTG
Seq_ID_No_l20: праймер № 1012: atccCAagctTATTGGCGTTGGGTGGTAAAAATTTTGSeq_ID_No_l20: primer no. 1012: atccCAagctTATTGGCGTTGGGTGGTAAAAATTTTG
Seq_ID_No_l2l: праймер № 1021: cacatgtctagaATGACCGCCGAACAACGCSeq_ID_No_l2l: primer no. 1021: cacatgtctagaATGACCGCCGAACAACGC
Seq_ID_No_l22: праймер № 1022: catgaagcttaCGGACCCGGATTTTGGCTC >Seq_ID_No_123: праймер № 1023:Seq_ID_No_l22: primer no. 1022: catgaagcttaCGGACCCGGATTTTGGCTC >Seq_ID_No_123: primer no. 1023:
catgaagcttaCGGTTCTTCTTGAATAAAAATTTGAATGcatgaagcttaCGGTTCTTCTTGAATAAAAATTTGAATG
Seq_ID_No_l24: праймер № 1024: catgaagcttaTTGCAGCACTTTCGGCCAATTTSeq_ID_No_l24: primer no. 1024: catgaagcttaTTGCAGCACTTTCGGCCAATTT
Seq_ID_No_l25: праймер № 1025:Seq_ID_No_l25: primer no. 1025:
cacatgtctaga AT GAGC ATTGT GT GT AGC GCcacatgtctaga AT GAGC ATTGT GT GT AGC GC
Seq_ID_No_l26: праймер № 1026: catgaagcttaGCTTTCATCCACGGCCGGSeq_ID_No_l26: primer no. 1026: catgaagcttaGCTTTCATCCACGGCCGG
Seq_ID_No_l27: праймер № 1027: catgaagcttaATTACCGGTTTGGCGCAGCSeq_ID_No_l27: primer no. 1027: catgaagcttaATTACCGGTTTGGCGCAGC
Таблица II Клонированные слитые белкиTable II Cloned fusion proteins
- 51 044058- 51 044058
- 52 044058- 52 044058
- 53 044058- 53 044058
- 54 044058- 54 044058
- 55 044058- 55 044058
Таблица IIITable III
Мутаторы для генетической модификацииMutators for genetic modification
- 56 044058- 56 044058
Секреция Yop.Secretion of Yop.
Индуцию регулона yop проводили посредством переноса культуры в температуру 37°С в BHI-Ох (пермиссивные условия для секреции)34. В качестве источника углерода добавляли глюкозу (4 мг/мл). Суммарные клетки и фракции супернатанта разделяли путем центрифугирования при 20800 g в течение 10 мин при температуре 4°С. Осадок клеток отбирали в виде суммарной фракции клеток. Белки в супернатанте преципитировали 10% трихлоруксусной кислотой (масса/объем) на конечном этапе в течение 1 ч при температуре 4°С. После центрифугирования (20800 g в течение 15 мин) и удаления супернатанта полученный в результате осадок промывали в ледяном ацетоне в течение ночи. Образцы снова центрифугировали, супернатант отбрасывали, осадок высушивали на воздухе и ресуспендировали в 1х ДСН (додецилсульфате натрия) и красителе для нанесения.Induction of the yop regulon was carried out by transferring the culture to 37°C in BHI-Ox (permissive conditions for secretion) 34 . Glucose (4 mg/ml) was added as a carbon source. Total cells and supernatant fractions were separated by centrifugation at 20,800 g for 10 min at 4°C. The cell sediment was collected as a total cell fraction. Proteins in the supernatant were precipitated with 10% trichloroacetic acid (w/v) in a final step for 1 h at 4°C. After centrifugation (20,800 g for 15 min) and removal of the supernatant, the resulting precipitate was washed in ice-cold acetone overnight. The samples were centrifuged again, the supernatant was discarded, the pellet was air dried and resuspended in 1x SDS and loading dye.
Секретированные белки анализировали методом ПААГ-ДСН (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия); в каждом случае на дорожку наносили белки, секретированные 3x108 бактерий. Обнаружение конкретных секретированных белков методом иммуноблоттинга проводили с применением 12,5% гелей ПААГ-ДСН. Для обнаружения белков в суммарных клетках на дорожку наносили 2x108 бактерий, если не указано обратное, и белки разделяли на 12,5% гелях ПААГ-ДСН перед обнаружением методом иммуноблоттинга.Secreted proteins were analyzed by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis); in each case, proteins secreted by 3x108 bacteria were applied to the lane. Detection of specific secreted proteins by immunoblotting was performed using 12.5% SDS-PAGE gels. To detect proteins in total cells, 2x108 bacteria were loaded per lane unless otherwise noted, and proteins were separated on 12.5% SDS-PAGE gels prior to detection by immunoblotting.
Иммуноблоттинг проводили с применением моноклональных антител крысы против YopE (MIPA193-13A9; 1:1000, 35). Антисыворотку предварительно абсорбировали дважды в течение ночи против Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΑΤ asd для снижения фонового окрашивания. Обнаружение проводили с помощью вторичных антител, направленных против антител крысы и конъюгированных с пероксидазой хрена (1:5000; Southern biotech), с последующим развитием визуализации с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (LumiGlo, KPM).Immunoblotting was performed using rat monoclonal antibody against YopE (MIPA193-13A9; 1:1000, 35 ). Antiserum was preabsorbed twice overnight against Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΑΤ asd to reduce background staining. Detection was performed using secondary antibodies directed against rat antibodies and horseradish peroxidase-conjugated (1:5000; Southern biotech), followed by imaging with ECL chemiluminescent substrate (LumiGlo, KPM).
Культура клеток и инфекции.Cell culture and infection.
Клетки HeLa Ccl2 и B16F10 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) с добавлением 10% ЭТС (эмбриональной телячьей сыворотки) и 2 мМ L-глутамина (cDMEM). Клетки 4Т1 культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% ЭТС и 2 мМ Lглутамина. Y. enterocolitica выращивали в BHI с добавками в течение ночи при к.т., разводили в свежем BHI до ОП600 0,2 и выращивали в течение 2 ч при к.т. до повышения температуры до 37°С на шейкере с водяной баней в течение еще 30 мин или в течение 1 ч в случае доставки EGFP. Наконец, бактерии собирали путем центрифугирования (ОЦУ, относительное центробежное ускорение, 6000, 30 с) и промывали один раз DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. Наконец, бактерии собирали путем центрифугирования (6000 ОЦУ, 30 с) и промывали один раз DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. Клетки, которые высевали в 96-луночные (для анализа иммунофлуоресценции) или 6луночные (для вестерн-блоттинга) планшеты, инфицировали при указанных МЗ в DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. После добавления бактерий планшеты центрифугировали в течение 1 мин при 1750 об./мин и помещали в температуру 37°С на указанные периоды времени. Внеклеточные бактерии уничтожали гентамицином (100 мг/мл), если это указано. В случае анализа иммунофлуоресценции анализы инфекционности останавливали с помощью фиксации в 4% ПФА (параформальдегиде). Для анализа методом вестерн-блоттинга клетки промывали дважды ледяным ФБР и с целью лизирования клеток добавляли буфер для лизиса PhosphoSafe (Novagen). После инкубации на льду клетки центрифугировали (16000 ОЦУ, 25 мин, 4°С).HeLa Ccl2 and B16F10 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and 2 mM L-glutamine (cDMEM). 4T1 cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS and 2 mM Lglutamine. Y. enterocolitica was grown in supplemented BHI overnight at RT, diluted in fresh BHI to an OD 600 of 0.2, and grown for 2 h at RT. until the temperature rises to 37°C on a water bath shaker for another 30 min or 1 h if EGFP is delivered. Finally, bacteria were collected by centrifugation (RCCA, 6000, 30 s) and washed once with DMEM supplemented with 10 mM HEPES and 2 mM L-glutamine. Finally, bacteria were collected by centrifugation (6000 RCC, 30 s) and washed once with DMEM supplemented with 10 mM HEPES and 2 mM L-glutamine. Cells that were seeded in 96-well (for immunofluorescence analysis) or 6-well (for Western blotting) plates were infected at the indicated MOIs in DMEM supplemented with 10 mM HEPES and 2 mM L-glutamine. After adding bacteria, the plates were centrifuged for 1 min at 1750 rpm and placed at 37°C for the indicated periods of time. Extracellular bacteria were killed with gentamicin (100 mg/ml) when indicated. For immunofluorescence assays, infectivity assays were stopped by fixation in 4% PFA (paraformaldehyde). For Western blot analysis, cells were washed twice with ice-cold PBS, and PhosphoSafe lysis buffer (Novagen) was added to lyse the cells. After incubation on ice, the cells were centrifuged (16,000 RCU, 25 min, 4°C).
Супернатанты собирали и анализировали для определения суммарного содержания белка методом Брэдфорда - методом с бицинхониновой кислотой (Pierce), после чего проводили анализ методом ПААГДСН и вестерн-блоттинга с применением антитела против актина (Millipore), против Bid (Cell Signaling), против Мус (Santa Cruz), против каспазы-3 р17 (Cell Signaling) и против Ink4C (Cell Signaling).Supernatants were collected and analyzed for total protein content by the Bradford bicinchoninic acid method (Pierce), followed by SDS-PAGE and Western blotting using anti-actin (Millipore), anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa) antibodies. Cruz), anti-caspase-3 p17 (Cell Signaling) and anti-Ink4C (Cell Signaling).
- 57 044058- 57 044058
Вестерн-блоттинг транспонированных с помощью T3SS белков из инфицированных клеток. Клетки HeLa в 6-луночных планшетах инфицировали при МЗ 100, как описано выше. В случае коинфекции с транслоцирующим протеазу TEV штаммом Y. enterocolitica задавали ОП600 штаммов, и две бактериальные суспензии перед добавлением к клеткам перемешивали в пробирке в соотношении 1: 1 (если не указано обратное). По окончании инфицирования клетки дважды промывали ледяным ФБР и собирали путем соскабливания в небольшой объем ледяного ФБР. После центрифугирования (16000 ОЦУ, 5 мин, 4°С) осадок растворяли в 0,002% дигитонине с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Roche complete, Roche). Растворенный осадок инкубировали а течение 5 мин на льду, а затем центрифугировали (16000 ОЦУ, 25 мин, 4°С). Супернатанты собирали и анализировали для определения суммарного содержания белка методом Брэдфорда - методом с бицинхониновой кислотой (Pierce), после чего проводили анализ методом ПААГ-ДСН и вестерн-блоттинга с применением антитела против Мус (Santa Cruz, 9E11) или против Ink4C (Cell Signaling).Western blot analysis of T3SS-transposed proteins from infected cells. HeLa cells in 6-well plates were infected at MOI 100 as described above. In the case of coinfection with a TEV protease translocating strain of Y. enterocolitica, an OD of 600 strains was set, and the two bacterial suspensions were mixed in a 1:1 ratio in a tube before being added to the cells (unless otherwise stated). At the end of infection, cells were washed twice with ice-cold PBS and collected by scraping into a small volume of ice-cold PBS. After centrifugation (16,000 RCC, 5 min, 4°C), the sediment was dissolved in 0.002% digitonin with the addition of a protease inhibitor cocktail (Roche complete, Roche). The dissolved sediment was incubated for 5 min on ice and then centrifuged (16,000 RCC, 25 min, 4°C). Supernatants were collected and analyzed for total protein content by the Bradford bicinchoninic acid method (Pierce), followed by SDS-PAGE and Western blotting using anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) or anti-Ink4C (Cell Signaling) antibodies. .
Автоматизированная микроскопия и анализ изображений. Изображения были автоматически получены с помощью системы ImageXpress Micro (Molecular devices, Саннивей, США). Количественное определение интенсивностей окрашивания против Мус проводили с применением программного обеспечения MetaXpress (Molecular devices, Саннивей, США). Области в пределах клеток, за исключением областей ядра и областей, содержащих бактерии, выбирали вручную (круги площадью 40 пикселей), записывали среднюю интенсивность.Automated microscopy and image analysis. Images were automatically acquired using an ImageXpress Micro system (Molecular devices, Sunnyway, USA). Quantitative determination of anti-Myc staining intensities was carried out using MetaXpress software (Molecular devices, Sunnyway, USA). Regions within cells, excluding nuclear regions and regions containing bacteria, were manually selected (40 pixel circles), and the average intensity was recorded.
Биораспределение на моделях аллотрансплантата опухоли на мышах B16-F1O и 4Т1.Biodistribution in B16-F1O and 4T1 tumor allograft mouse models.
Все эксперименты на животных были одобрены (лицензия 1908; Kantonales Veterinaramt BaselStadt) и проводились в соответствии с местными руководствами (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) и законом Швейцарии о защите животных (Tierschutz-Gesetz). Мышей C57Bl/6 и BALB/c в возрасте 6 недель заказывали в компании Janvier Labs. После по меньшей мере одной недели адаптации мышам проводили анестезию изофлураном и подкожно инъецировали в бок C57BP6 и BALB/c 100 мкл клеток В16Р10 или 4Т1 (1x105-1x106 клеток), соответственно. В течение всего эксперимента проводили оценку поведения и внешнего вида мышей, поверхностной температуры, а также измеряли массу тела.All animal experiments were approved (license 1908; Kantonales Veterinaramt BaselStadt) and carried out in accordance with local guidelines (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) and the Swiss animal welfare law (Tierschutz-Gesetz). C57Bl/6 and BALB/c mice, 6 weeks old, were ordered from Janvier Labs. After at least one week of adaptation, mice were anesthetized with isoflurane and injected subcutaneously into the flank of C57BP6 and BALB/c with 100 μl of B16P10 or 4T1 cells (1x105-1x106 cells), respectively. Throughout the experiment, the behavior and appearance of the mice, surface temperature, and body weight were measured.
После развития опухолей мышам вводили раствор Десферала 8 мг/мл (10 мл/кг) путем и.п. инъекции. На следующий день мышей инфицировали Y. enterocolitica MRS40 или Y. enterocolitica MRS40 ΔΗΟΡΕΜΑΤ (2x105, 1x106 или 1x107 бактерий) путем инъекции в хвостовую вену. Инокулюм, который в.в. вводили мышам, подтверждали с помощью посева методом разведения. В некоторых экспериментах прогрессирование опухоли отслеживали путем ежедневных изменений длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,523хдлинахширина2. В соответствующие дни после анализа мышей умерщвляли с помощью ингаляции CO2. Немедленно отбирали образец крови путем аспирации из сердца. Отбирали печень, селезенку, легкие и опухоль и определяли их массу. Органы и опухоль гомогенизировали. КОЕ в каждом образце определяли путем точечного нанесения серийных разведений на чашки с агаром LB, содержащие налидиксовую кислоту (35 мкг/мл).After tumor development, mice were administered Desferal solution 8 mg/ml (10 ml/kg) by i.p. injections. The next day, mice were infected with Y. enterocolitica MRS40 or Y. enterocolitica MRS40 ΔΗΟΡΕΜΑΤ (2x105, 1x106 or 1x107 bacteria) by tail vein injection. The inoculum, which i.v. administered to mice, confirmed by culture by dilution method. In some experiments, tumor progression was monitored by daily changes in tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.523 x length x width 2 . On appropriate days after analysis, mice were sacrificed by CO2 inhalation. A blood sample was immediately collected by cardiac aspiration. The liver, spleen, lungs and tumor were collected and their weight was determined. The organs and tumor were homogenized. CFU in each sample was determined by spot-plating serial dilutions onto LB agar plates containing nalidixic acid (35 μg/ml).
Прямой анализ активации интерферона I типа. Клетки меланомы мыши B16F10, RAW264.7 мыши дикого типа или макрофаги с нокаутом MAVS, стабильно экспрессирующие секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP) или секретируемую люциферазу Lucia под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE, заказывали в компании InvivoGen (B16-Blue ISG, RAW-Blue ISG, RAW-Lucia ISG и RAW-Lucia ISG-KO-MAVS). Условия роста и анализ ИФН I типа адаптировали на основании протоколов, предоставленных InvivoGen. Вкратце, 12500 клеток В16-Blue ISG, или 30000 клеток RAW-Blue, RAW-Lucia или RAW-Lucia KO-MAVS ISG в 150 мкл среды для анализа (RPMI+2мМ Lглутамина+10% ЭТС для клеток B16-Blue ISG; DMEM+2мМ L-глутамина+10% ЭТС для клеток RAWBlue, RAW-Lucia и RAW-Lucia KO-MAVS ISG) на лунку высевали в 96-луночный планшет с плоским дном (NUNC или Corning). На следующий день клетки инфицировали штаммами бактерий для оценки посредством добавления 15 мкл на лунку желаемой множественности заражения (МЗ, разводили в среде для анализа). Через 2 ч инкубации (37°С и 5% CO2) бактерии убивали добавлением среды для анализа, содержащей пенициллин (100 Ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Инкубацию продолжали в течение 20-24 ч. Обнаружение SEAP и люциферазы проводили согласно протоколам QUANTI-Blue™ и QUANTILuc™ (InvivoGen), соответственно. Для обнаружения SEAP: 20 мкл супернатанта клеток инкубировали с 180 мкл реактива для обнаружения (QUANTI-Blue™, InvivoGen). Планшет инкубировали при температуре 37°С, и активность SEAP измеряли путем считывания ОП при 650 нм с применением считывающего устройства для микропланшетов (Molecular Devices). В качестве положительного контроля использовали ИФН у мыши (базовый раствор: 1000000 Ед./мл), разведенный до соответствующих концентраций в среде для анализа. Для обнаружения люциферазы: к 20 мкл супернатанта клеток добавляли 50 мкл реактива для обнаружения (QUANTI-Luc™, InvivoGen) в непрозрачных планшетах (ThermoScientific). Немедленно измеряли люминесценцию с применением считывающего устройства для планшетов (BioTek).Direct assay for type I interferon activation. B16F10, wild-type mouse RAW264.7 mouse melanoma cells, or MAVS knockout macrophages stably expressing secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) or secreted Lucia luciferase under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter , enhanced with a multimeric ISRE, was ordered from InvivoGen (B16-Blue ISG, RAW-Blue ISG, RAW-Lucia ISG and RAW-Lucia ISG-KO-MAVS). Growth conditions and type I IFN assays were adapted from protocols provided by InvivoGen. Briefly, 12,500 B16-Blue ISG cells, or 30,000 RAW-Blue, RAW-Lucia, or RAW-Lucia KO-MAVS ISG cells in 150 μl assay medium (RPMI+2mM Lglutamine+10% FBS for B16-Blue ISG cells; DMEM +2mM L-glutamine+10% FBS for RAWBlue, RAW-Lucia and RAW-Lucia KO-MAVS ISG cells) per well were seeded in a 96-well flat bottom plate (NUNC or Corning). The next day, cells were infected with bacterial strains for evaluation by adding 15 μl per well of the desired multiplicity of infection (MOI, diluted in assay medium). After 2 h of incubation (37°C and 5% CO2), bacteria were killed by adding assay medium containing penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). Incubation was continued for 20-24 hours. SEAP and luciferase detection were performed according to QUANTI-Blue™ and QUANTILuc™ protocols (InvivoGen), respectively. For SEAP detection: 20 μl of cell supernatant was incubated with 180 μl of detection reagent (QUANTI-Blue™, InvivoGen). The plate was incubated at 37°C and SEAP activity was measured by reading the OD at 650 nm using a microplate reader (Molecular Devices). Mouse IFN (stock solution: 1,000,000 U/ml) diluted to appropriate concentrations in the assay medium was used as a positive control. For luciferase detection: 50 μL of detection reagent (QUANTI-Luc™, InvivoGen) in opaque plates (ThermoScientific) was added to 20 μl of cell supernatant. Luminescence was measured immediately using a plate reader (BioTek).
Непрямой анализ активации интерферона I типа. Клетки B16F10 или 4Т1 мыши инфицировали с указанной множественностью заражения (МЗ) штаммами бактерий, которые оценивали, в течение в сум- 58 044058 ме 4 ч, как описано выше. Затем супернатант клеток переносили на клетки меланомы мыши B16F10, стабильно экспрессирующие секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP) под контролем промотора I-ISG54 (состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE; заказывали в компании InvivoGen, клетки B16-Blue ISG). Условия роста и анализ ИФН I типа адаптировали на основании протоколов, предоставленных InvivoGen. Вкратце, 12500 клеток В16-Blue ISG в 150 мкл среды для анализа (RPMI+2 мМ L-глутамин+10% ЭТС) на лунку высевали в 96-луночный планшет с плоским дном (NUNC). На следующий день всю среду удаляли и добавляли 100 мкл супернатанта клеток, предварительно инфицированных B16F10 или 4Т1. Планшеты инкубировали в течение 2024 ч при температуре 37°С и 5% CO2. Обнаружение SEAP проводили согласно протоколу QUANTIBlue™ (InvivoGen). 20 мкл супернатанта клеток инкубировали с 180 мкл реактива для обнаружения (QUANTI-Blue™, InvivoGen). Планшет инкубировали при температуре 37°С, и активность SEAP измеряли путем считывания ОП при 650 нм с применением считывающего устройства для микропланшетов (Molecular Devices).Indirect type I interferon activation assay. Mouse B16F10 or 4T1 cells were infected at the indicated multiplicity of infection (MOI) with the bacterial strains assessed for a total of 4 h as described above. The cell supernatant was then transferred to B16F10 mouse melanoma cells stably expressing secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) under the control of the I-ISG54 promoter (consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE; ordered from InvivoGen, B16-Blue ISG cells). Growth conditions and type I IFN assays were adapted from protocols provided by InvivoGen. Briefly, 12,500 B16-Blue ISG cells in 150 μl assay medium (RPMI+2 mM L-glutamine+10% FBS) per well were seeded in a 96-well flat-bottom plate (NUNC). The next day, all medium was removed and 100 μl of supernatant of cells preinfected with B16F10 or 4T1 was added. The plates were incubated for 2024 hours at 37°C and 5% CO 2 . SEAP detection was performed according to the QUANTIBlue™ protocol (InvivoGen). 20 μl of cell supernatant was incubated with 180 μl of detection reagent (QUANTI-Blue™, InvivoGen). The plate was incubated at 37°C and SEAP activity was measured by reading the OD at 650 nm using a microplate reader (Molecular Devices).
Исследование прогрессирования опухоли на модели аллотрансплантата опухоли B16F10 на мышах после внутриопухолевого лечения. Все эксперименты на животных были одобрены ответственными органами и проводились в соответствии с местными руководствами и законами о защите животных. Самок мышей С57В1/6 в возрасте 5-7 недель заказывали в компании Charles River (L'Arbresles). После по меньшей мере одной недели адаптации мышам проводили анестезию изофлураном, и в правый бок мышей подкожно инъецировали 1x106 клеток B16-F10 в 200 мкл RPMI 1640. Через регулярные промежутки времени оценивали поведение и внешний вид мышей и измеряли массу тела.Study of tumor progression in a B16F10 tumor allograft mouse model after intratumoral treatment. All animal experiments were approved by the responsible authorities and were carried out in accordance with local animal welfare guidelines and laws. Female C57B1/6 mice aged 5-7 weeks were ordered from Charles River (L'Arbresles). After at least one week of adaptation, mice were anesthetized with isoflurane and 1x106 B16-F10 cells in 200 μl RPMI 1640 were injected subcutaneously into the right flank of the mice. At regular intervals, the behavior and appearance of the mice were assessed and body weight was measured.
Лечение начинали, когда опухоли достигали объема 60-130 мм3 (определяли как день 0). Мышам вводили штаммы бактерий, оценку которых проводили, в дни 0, 1, 2, 3, 6 и 9 путем внутриопухолевой инъекции (7,5x107 бактерий в 50 мкл ФБР на введение) с анестезией изофлураном. Инокулюм, который внутриопухолево вводили мышам, подтверждали с помощью посева методом разведения. В качестве контроля мышам инъецировали только не содержащий эндотоксины ФБР. За 24 ч до последнего введения бактерий (день 8) мышам вводили раствор Десферала 8 мг/мл (10 мл/кг) путем и.п. инъекции. Прогрессирование опухоли отслеживали путем измерения длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,5хдлинахширина2. Объем опухоли, превышающий 1500 мм3, определяли как конечную точку для человека.Treatment began when tumors reached a volume of 60-130 mm 3 (defined as day 0). Mice were administered the bacterial strains assessed on days 0, 1, 2, 3, 6, and 9 by intratumoral injection (7.5 x 107 bacteria in 50 μl PBS per injection) under isoflurane anesthesia. The inoculum that was intratumorally injected into mice was confirmed by dilution culture. As a control, mice were injected with endotoxin-free PBS only. 24 hours before the last administration of bacteria (day 8), mice were administered a solution of Desferal 8 mg/ml (10 ml/kg) by i.p. injections. Tumor progression was monitored by measuring tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.5 x length x width 2 . Tumor volume greater than 1500 mm 3 was defined as the end point for humans.
Исследование прогрессирования опухоли и повторной антигенной стимуляции на моделях аллотрансплантата опухоли на мышах ЕМТ-6 после внутриопухолевого лечения. Все эксперименты на животных были одобрены ответственными органами и проводились в соответствии с местными руководствами и законами о защите животных. Самок мышей BALB/c в возрасте 5-7 недель (BALB/cByJ) заказывали в компании Charles River (L'Arbresles). После по меньшей мере одной недели адаптации мышам проводили анестезию изофлураном, и в правый бок мышей подкожно инъецировали 1x106 клеток ЕМТ-6 в 200 мкл RPMI 1640. Через регулярные промежутки времени оценивали поведение и внешний вид мышей и измеряли массу тела.Study of tumor progression and antigenic re-stimulation in EMT-6 mouse tumor allograft models after intratumoral treatment. All animal experiments were approved by the responsible authorities and were carried out in accordance with local animal welfare guidelines and laws. Female BALB/c mice aged 5–7 weeks (BALB/cByJ) were ordered from Charles River (L'Arbresles). After at least one week of adaptation, mice were anesthetized with isoflurane and 1 x 106 EMT-6 cells in 200 μl RPMI 1640 were injected subcutaneously into the right flank of the mice. At regular intervals, the behavior and appearance of the mice were assessed and body weight was measured.
Лечение начинали, когда опухоли достигали объема 60-130 мм3 (определяли как день 0). Мышам вводили штаммы бактерий, оценку которых проводили, в дни 0, 1, 5, 6, 10 и 11 путем внутриопухолевой инъекции (7,5x107 бактерий в 50 мкл ФБР на введение) с анестезией изофлураном. Инокулюм, который внутриопухолево вводили мышам, подтверждали с помощью посева методом разведения. В качестве контроля мышам инъецировали только не содержащий эндотоксины ФБР. За 24 ч до последнего введения бактерий (день 10) мышам вводили раствор Десферала 8 мг/мл (10 мл/кг) путем и.п. инъекции. Прогрессирование опухоли отслеживали путем измерения длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,5хдлинахширина2. Объем опухоли, превышающий 1500 мм3, определяли как конечную точку для человека. Мышам, у которых наблюдалась полная регрессия опухоли в день 54 после начала лечения, проводили анестезию изофлураном, и в противоположный (левый) бок относительно первой инъекции опухолевых клеток подкожно инъецировали 1x106 клеток ЕМТ-6 в 200 мкл RPMI 1640. В качестве контрольной группы в исследование включали ранее не использованных в экспериментах мышей, которым ранее не трансплантировали клетки ЕМТ6. Прогрессирование опухоли отслеживали путем измерения длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,5χдлинаχширина2. Объем опухоли, превышающий 1500 мм3, определяли как конечную точку для человека.Treatment began when tumors reached a volume of 60-130 mm 3 (defined as day 0). Mice were administered the bacterial strains assessed on days 0, 1, 5, 6, 10, and 11 by intratumoral injection (7.5 x 107 bacteria in 50 μl PBS per injection) under isoflurane anesthesia. The inoculum that was intratumorally injected into mice was confirmed by dilution culture. As a control, mice were injected with endotoxin-free PBS only. 24 hours before the last administration of bacteria (day 10), mice were administered a solution of Desferal 8 mg/ml (10 ml/kg) by i.p. injections. Tumor progression was monitored by measuring tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.5 x length x width 2 . Tumor volume greater than 1500 mm 3 was defined as the end point for humans. Mice that showed complete tumor regression on day 54 after the start of treatment were anesthetized with isoflurane, and 1x106 EMT-6 cells in 200 μl RPMI 1640 were injected subcutaneously into the opposite (left) side relative to the first tumor cell injection. included mice that had not previously been used in experiments and had not previously been transplanted with EMT6 cells. Tumor progression was monitored by measuring tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.5 x length x width 2 . Tumor volume greater than 1500 mm 3 was defined as the end point for humans.
Исследование прогрессирования опухоли на моделях аллотрансплантата опухоли ЕМТ-6 на мышах после внутривенного лечения. Все эксперименты на животных были одобрены ответственными органами и проводились в соответствии с местными руководствами и законами о защите животных. Самок мышей BALB/c в возрасте 5-6 недель (BALB/cByJ) заказывали в компании Charles River (L'Arbresles). После по меньшей мере одной недели адаптации мышам проводили анестезию изофлураном, и в правый бок мышей подкожно инъецировали 1x106 клеток ЕМТ-6 в 200 мкл RPMI 1640. Через регулярные промежутки времени оценивали поведение и внешний вид мышей и измеряли массу тела.Study of tumor progression in EMT-6 tumor allograft mouse models after intravenous treatment. All animal experiments were approved by the responsible authorities and were carried out in accordance with local animal welfare guidelines and laws. Female BALB/c mice aged 5–6 weeks (BALB/cByJ) were ordered from Charles River (L'Arbresles). After at least one week of adaptation, mice were anesthetized with isoflurane and 1 x 106 EMT-6 cells in 200 μl RPMI 1640 were injected subcutaneously into the right flank of the mice. At regular intervals, the behavior and appearance of the mice were assessed and body weight was measured.
Мышей рандомизировали на группы лечения, когда опухоли достигали объема 80-250 мм3 (определяли как день 0). За 24 ч до рандомизации (Д-1) мышам вводили раствор Десферала 8 мг/мл (10 мл/кг)Mice were randomized to treatment groups when tumors reached a volume of 80-250 mm 3 (defined as day 0). 24 hours before randomization (D-1), mice were injected with Desferal solution 8 mg/ml (10 ml/kg)
- 59 044058 путем и.п. инъекции. В день 0 мышам вводили штаммы бактерий, оценку которых проводили, путем внутривенной инъекции (5х106 бактерий в 100 мкл ФБР на введение) с анестезией изофлураном. Инокулюм, который внутривенно вводили мышам, подтверждали с помощью посева методом разведения. В качестве контроля мышам инъецировали только не содержащий эндотоксины ФБР. Прогрессирование опухоли отслеживали путем измерения длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,5хдлинахширина2. Объем опухоли, превышающий 1500 мм3, определяли как конечную точку для человека.- 59 044058 by IP injections. On day 0, mice were administered the bacterial strains being assessed by intravenous injection (5 x 10 6 bacteria in 100 μl PBS per injection) under isoflurane anesthesia. The inoculum that was intravenously injected into mice was confirmed by dilution culture. As a control, mice were injected with endotoxin-free PBS only. Tumor progression was monitored by measuring tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.5 x length x width 2 . Tumor volume greater than 1500 mm3 was defined as the human end point.
Измерение секреции ИФНв после инфекции изолятов опухолевых клеток.Measurement of IFNβ secretion following infection of tumor cell isolates.
Все эксперименты на животных были одобрены (лицензия 1908; Kantonales Veterinaramt BaselStadt) и проводились в соответствии с местными руководствами (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) и законом Швейцарии о защите животных (Tierschutz-Gesetz). Мышей BALB/c в возрасте 6 недель заказывали в компании Janvier Labs. Через неделю адаптации мышам проводили анестезию изофлураном, и в бок мышей подкожно инъецировали 100 мкл клеток ЕМТ-6 (1 х 106 клеток). В течение всего эксперимента проводили оценку поведения и внешнего вида мышей, поверхностной температуры и измеряли массу тела. Прогрессирование опухоли отслеживали путем измерения длины и ширины опухоли с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли как 0,5хдлинахширина2. В день анализа опухоли отбирали, разрезали на небольшие кусочки размером 1-2 мм, расщепляли в течение 1-1,5 часов и пропускали через нейлоновую сеть с размером ячейки 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Определяли число клеток в данном неочищенном изоляте клеток, и в 24-луночный планшет с плоским дном (Corning) высевали по 300000 клеток на лунку в среде роста (DMEM+L-глутамина+заменимые аминокислоты+10% ЭТС). Через 1 ч инкубации при температуре 37°С и 5% CO2 клетки инфицировали штаммами бактерий, оценку которых проводили, посредством добавления по 100 мкл на лунку титра бактерий (различная МЗ, разведение в среде роста). Через 1 ч инкубации (37°С и 5% CO2) бактерии убивали добавлением среды роста, содержащей пенициллин (100 Ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Инкубацию продолжали в течение еще 3 ч. Планшет центрифугировали для сбора всех клеток на дне ячеек и анализировали концентрацию ИФНв в супернатанте с помощью ELISA для ИФН-β мыши LumiKine™ Xpress (Invivogen) согласно инструкциям производителя.All animal experiments were approved (license 1908; Kantonales Veterinaramt BaselStadt) and carried out in accordance with local guidelines (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) and the Swiss animal welfare law (Tierschutz-Gesetz). 6-week-old BALB/c mice were ordered from Janvier Labs. After a week of adaptation, mice were anesthetized with isoflurane, and 100 μl of EMT-6 cells (1 x 10 6 cells) were injected subcutaneously into the flank of the mice. Throughout the experiment, the mice's behavior and appearance, surface temperature, and body weight were measured. Tumor progression was monitored by measuring tumor length and width using a digital caliper. Tumor volume was determined as 0.5 x length x width 2 . On the day of analysis, tumors were collected, cut into small pieces of 1–2 mm, digested for 1–1.5 hours, and passed through a 70-μm nylon mesh to obtain a single-cell suspension. The cell number of a given crude cell isolate was determined and 300,000 cells per well were seeded into a 24-well flat-bottom plate (Corning) in growth medium (DMEM+L-glutamine+nonessential amino acids+10% FBS). After 1 hour of incubation at 37°C and 5% CO 2 , the cells were infected with bacterial strains, which were assessed by adding 100 μl per well of bacterial titer (various MO, dilution in growth medium). After 1 h of incubation (37°C and 5% CO 2 ), bacteria were killed by adding growth medium containing penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). Incubation was continued for an additional 3 hours. The plate was centrifuged to collect all cells at the bottom of the wells, and the concentration of IFNβ in the supernatant was analyzed using the LumiKine™ Xpress mouse IFNβ ELISA (Invivogen) according to the manufacturer's instructions.
В) Результаты.B) Results.
Система доставки белков на основе секреции 3 типа слитых белков YopE.Protein delivery system based on the secretion of type 3 YopE fusion proteins.
Несмотря на то, что самый N-конец эффектора T3SS YopE Y. enterocolitica (SEQ ID № 1) содержит сигнал секреции, достаточный для транслокации гетерологичных белков22, он не содержит сайт связывания шаперона (chaperone-binding site, CBS) для его шаперона (SycE) 36. Авторы настоящего изобретения выбрали N-концевые 138 аминокислот YopE (SEQ ID NO: 2) для слияния с белками, подлежащими доставке, поскольку данный подход, как было показано, демонстрировал наилучшие результаты при транслокации других гетерологичных субстратов T3S 24. Поскольку данные N-концевые 138 аминокислот YopE содержат CBS, авторы настоящего изобретения затем решили коэкспрессировать SycE. Фрагмент SycE-YopE1-138, клонированный из очищенной плазмиды вирулентности pYV40 Y. enterocolitica, содержит эндогенные промоторы YopE и его шаперона SycE (фиг. 2). Вследствие этого SycE и любой слитый белок YopE1_138 индуцируется быстрым сдвигом температуры от выращивания при к.т. до 37°С. Время культивирования при температуре 37°С будет влиять на количество слитого белка, присутствующее в бактериях. На 3'-конце YopE1_138 добавляли сайт множественного клонирования (multiple cloning site, MCS) (фиг. 2 В), за которым следовали Мус и 6х метка His, а также стоп-кодон.Although the very N terminus of the Y. enterocolitica T3SS effector YopE (SEQ ID no. 1) contains a secretion signal sufficient for the translocation of heterologous proteins 22 , it does not contain a chaperone-binding site (CBS) for its chaperone ( SycE) 36 . We selected the N-terminal 138 amino acids of YopE (SEQ ID NO: 2) to be fused to the proteins to be delivered because this approach has been shown to perform best in the translocation of other heterologous T3S substrates 24 . Since the N-terminal 138 amino acids of YopE contain CBS, we then decided to coexpress SycE. The SycE-YopE fragment 1 - 138 , cloned from the purified Y. enterocolitica virulence plasmid pYV40, contains the endogenous promoters of YopE and its chaperone SycE (Fig. 2). As a consequence, SycE and any YopE1_ 138 fusion protein are induced by a rapid temperature shift from growth at RT. up to 37°C. The culture time at 37°C will influence the amount of fusion protein present in the bacteria. A multiple cloning site (MCS) was added at the 3' end of YopE1_ 138 (Fig. 2 B), followed by Myc and a 6x His tag, as well as a stop codon.
Фоновый штамм тщательно выбирали. Во-первых, для ограничения транслокации эндогенных эффекторов авторы настоящего изобретения использовали штамм Y. enterocolitica, в котором были делетированы все известные эффекторы, Yop Н, О, Р, Е, М и Т (названный AHOPEMAT) 37. Помимо этого, авторы настоящего изобретения иногда использовали ауксотрофный мутант, который не может расти при отсутствии экзогенной мезо-2,6-диаминопимелиновой кислоты38. В данном штамме был делетирован ген аспартат-бета-полуальдегид-дегидрогеназы (Aasd), и его классифицировали как соответствующий уровню биологической безопасности 1 согласно Швейцарскому агентству безопасности (поправка к А010088/2). Помимо этого, авторы настоящего изобретения делетировали белки адгезии YadA и/или InvA для обеспечения большего выбора фоновых штаммов. В то время как применение штаммов yadA или yadA/invA снизило индуцированную фоновую передачу сигналов39, также оказывалось влияние на количество доставленного белка40.The background strain was carefully selected. First, to limit the translocation of endogenous effectors, we used a Y. enterocolitica strain in which all known effectors, Yop H, O, P, E, M, and T, were deleted (termed AHOPEMAT) 37 . In addition, the present inventors have sometimes used an auxotrophic mutant that cannot grow in the absence of exogenous meso-2,6-diaminopimelic acid 38 . The aspartate beta-semialdehyde dehydrogenase (Aasd) gene was deleted in this strain and was classified as biosafety level 1 according to the Swiss Safety Agency (amendment A010088/2). In addition, we have deleted the adhesion proteins YadA and/or InvA to provide greater selection of background strains. While administration of yadA or yadA/invA strains reduced induced background signaling 39 , there was also an effect on the amount of protein delivered 40 .
Удаление добавки YopE1-138 после транслокации слитого белка в эукариотическую клетку.Removal of the YopE 1 - 138 additive after translocation of the fusion protein into a eukaryotic cell.
Несмотря на то, что фрагмент YopE1.138 обеспечивает большое преимущество при бактериальной доставке, он может препятствовать функции и/или локализации слитых белков. Вследствие этого его удаление после доставки белков будет оптимальным. С данной целью авторы настоящего изобретения ввели два сайта расщепления TEV (ENLYFQS) 41,43 между YopE1.138 и партнером слияния (регулятор транскрипции ET1-Myc (SEQ ID NO: 9 и 11)44 и INK4C человека (SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10)). Для сохранения преимуществ представленного способа авторы настоящего изобретения дополнительно слили протеазу TEV (вариант S219V; 45) с YopE1-138 (SEQ ID NO: 12) в другом штамме Y. enterocolitica.Despite the fact that the fragment YopE1. 138 provides a major advantage for bacterial delivery, it can interfere with the function and/or localization of fusion proteins. As a result, its removal after delivery of proteins will be optimal. To this end, we introduced two TEV cleavage sites (ENLYFQS) 41,43 between YopE1.138 and the fusion partner (transcription regulator ET1-Myc (SEQ ID NO: 9 and 11) 44 and human INK4C (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10)). To maintain the advantages of the present method, the present inventors further fused the TEV protease (variant S219V; 45 ) to YopE1-138 (SEQ ID NO: 12) in another Y. enterocolitica strain.
- 60 044058- 60 044058
Клетки HeLa инфицировали обоими штаммами одновременно. Для обеспечения анализа только транслоцированной фракции белков инфицированные клетки HeLa лизировали в течение 2 ч после инфекции дигитонином, который, как известно, не лизирует бактерии(46;). Анализ методом вестерн-блоттинга выявил присутствие YopE1_138-2x сайт расщепления TEV-ET1-Myc или YopE1_138-2x сайт расщепления TEVFlag-INK4C-Myc, только когда клетки инфицировали соответствующим штаммом. После расщепления данного лизата клеток очищенной протеазой TEV в течение ночи наблюдали смещенную полосу. Данная полоса соответствует ЕТ1-Мус или Flag-INK4C с N-концевыми остатками сайта расщепления TEV, наиболее вероятно, только одним серином. После коинфекции клеток штаммом, доставляющим протеазу TEV, становится видимым такой же отщепленный фрагмент ЕТ1-Мус или Flag-INK4C; это свидетельствует, что протеаза TEV, доставленная с помощью T3SS, является функциональной, и что единичные клетки были инфицированы обоими штаммами бактерий. Несмотря на то что расщепление еще не закончено, большинство транслоцированных белков отщепляется уже через 2 ч после инфекции, и даже расщепление очищенной протеазой TEV в течение ночи не позволило достичь более высокую степень расщепления. Как сообщается, для зависимого от протеазы TEV расщепления может требоваться оптимизация в зависимости от слитого белка 47,48. Вследствие этого зависимое от протеазы TEV удаление добавки YopE1_138 после транслокации впервые обеспечивает доставку белков с помощью T3SS для практически нативных гетерологичных белков с изменением аминокислотного состава только на одну N-концевую аминокислоту. Альтернативный подход по сравнению с зависимым от протеазы TEV расщеплением фрагмента YopE заключается во встраивании в слитый белок, представляющий интерес, убиквитина. Действительно, убиквитин процессируется на С-конце группой эндогенных убиквитин-специфичных Сконцевых протеаз (деубиквитинизирующие ферменты, ДУБ). Поскольку расщепление, как полагают, происходит на самом С-конце убиквитина (после G76), белок, представляющий интерес, не должен содержать дополнительной аминокислотной последовательности. Данный способ исследовали на слитом белке YopE1.138-Убиквитин-Flag-INK4C-MycHis. В контрольных клетках, инфицированных экспрессирующими YopE1_138-Flag-INK4C-MycHis бактериями, была обнаружена полоса, соответствующая YopE1_ 138-Flag-INK4C-MycHis; это свидетельствует об эффективной транслокации слитого белка. Когда клетки инфицировали в течение 1 ч экспрессирующими YopE1.138-Убиквитин-Flag-INK4C-MycHis бактериями, была визуализирована дополнительная полоса, соответствующая по размеру Flag-INK4C-MycHis; это свидетельствует, что часть слитого белка была отщеплена. Данный результат демонстрирует, что введение убиквитина в слитый белок делает возможным отщепление фрагмента YopE1_138 без потребности в экзогенной протеазе.HeLa cells were infected with both strains simultaneously. To ensure analysis of only the translocated fraction of proteins, infected HeLa cells were lysed within 2 h after infection with digitonin, which is not known to lyse bacteria ( 46 ;). Western blot analysis revealed the presence of YopE1_138-2x TEV-ET1-Myc cleavage site or YopE1_138-2x TEVFlag-INK4C-Myc cleavage site only when cells were infected with the corresponding strain. After digestion of this cell lysate with purified TEV protease overnight, a shifted band was observed. This band corresponds to ET1-Myc or Flag-INK4C with N-terminal TEV cleavage site residues, most likely serine only. After coinfection of cells with a TEV protease-delivering strain, the same cleaved fragment of ET1-Myc or Flag-INK4C becomes visible; this indicates that the TEV protease delivered by the T3SS is functional and that single cells were infected with both strains of bacteria. Although cleavage is not yet complete, most translocated proteins are cleaved within 2 h postinfection, and even overnight digestion with purified TEV protease did not achieve a higher degree of cleavage. It has been reported that TEV protease‐dependent cleavage may require optimization depending on the fusion protein 47 , 48 . Consequently, TEV protease-dependent removal of the YopE1_ 138 additive after translocation enables protein delivery via T3SS for the first time for essentially native heterologous proteins with a change in amino acid composition of only one N-terminal amino acid. An alternative approach to TEV protease-dependent cleavage of the YopE fragment is to incorporate ubiquitin into the fusion protein of interest. Indeed, ubiquitin is processed at the C-terminus by a group of endogenous ubiquitin-specific C-terminal proteases (deubiquitinating enzymes, DUBs). Since cleavage is believed to occur at the very C-terminus of ubiquitin (after G76), the protein of interest should not contain any additional amino acid sequence. This method was tested on the YopE 1 fusion protein. 138 -Ubiquitin-Flag-INK4C-MycHis. In control cells infected with bacteria expressing YopE 1 _ 138 -Flag-INK4C-MycHis, a band corresponding to YopE 1 _ 138 -Flag-INK4C-MycHis was detected; this indicates efficient translocation of the fusion protein. When cells were infected for 1 h with YopE expressing 1 . 138 -Ubiquitin-Flag-INK4C-MycHis bacteria, an additional band corresponding in size to Flag-INK4C-MycHis was visualized; this indicates that part of the fusion protein has been cleaved off. This result demonstrates that the introduction of ubiquitin into the fusion protein allows cleavage of the YopE 1_138 fragment without the need for an exogenous protease.
Аттенуирование по вирулентности путем делеции/мутации бактериальных эффекторных белков с вирулентной активностью в отношении эукариотических клеток.Virulence attenuation by deletion/mutation of bacterial effector proteins with virulence activity against eukaryotic cells.
В случае Y. enterocolitica вирулентность снижали в результате делеции шести эндогенных эффекторных белков, называемых внешние белки Yersinia (Yersinia outer proteins, Yop), более конкретно, YopH, О, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopHA1-352, yopOA65-558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135]) 37. Данные Yop кодируются на плазмиде вирулентности Yersinia (pYV), плазмиде размером приблизительно 70 т.п.о., на которой кодируется полная система секреции 3 типа (T3SS), а также другие белки, обуславливающие вирулентность (фиг. 4). YopH, О, Р, Е, М и Т представляют собой шесть эффекторных белков, которые доставляются в клетки-хозяева бактериальной системой секреции третьего типа для модулирования и ослабления иммунной системы. Каждый Yop обладает специфической биохимической активностью в клетке-хозяине. YopT отщепляет С-концевой цистеин Rho-ГТФаз и, таким образом, удаляет изопренильную группу, которая заякоривает ГТФазы в мембрану. Данная инактивация Rho в связи с изменением расположения позволяет избежать фагоцитоза иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы49. В том же пути YopE выступает в качестве белка, активирующего ГТФазу (GTPase activating protein, GAP), для Rho-ГТФаз, деактивируя их. Это приводит к снижению уровня фагоцитоза и ингибированию высвобождения иммунными клетками ИЛ-1 бета49. Более того, YopO выступает в качестве ингибитора диссоциации нуклеотида гуанидина (guanidine nucleotide dissociation inhibitor, GDI), деактивируя Rho-ГТФазы. YopO также содержит серин/треонин-киназный домен, оказывающий действие на актиновый цитоскелет способом, который до конца не понятен49. YopH представляет собой тирозинфосфатазу, воздействующую на белки фокальной адгезии, такие как киназа фокальной адгезии (Focal adhesion kinase, Fak), паксиллин и другие, таким образом, в высокой степени предотвращая фагоцитоз макрофагами и нейтрофилами49. Было обнаружено, что YopP, обозначаемый YopJ у Y. pseudotuberculosis или Y. pestis, инактивирует в иммунных клетках путь MAPK/NFkB, предотвращая высвобождение ФНОа и ИЛ-8, стимулированных присутствием бактерий, из иммунных клеток. Более того, было обнаружено, что YopP индуцирует в иммунных клетках апоптоз, что может быть связано с эффектом, нарушающим путь МАРК, который в своем активированном состоянии защищает клетки от апоптоза49. Роль YopM пока что полностью не ясна, но было обнаружено, что он связан с рибосомальной S6 киназой 1 (ribosomal S6 kinase 1, RSK1) и С-подобной протеинкиназой 2 (protein kinase C-like 2, PRK2). Представляется, что YopM может стимулировать фосфорилирование RSK1 и, таким образом, воздействовать на нижестоящие мишени, такие как, например, прогрессирование клеточного цикла49. В результате делецииIn the case of Y. enterocolitica, virulence was reduced by deletion of six endogenous effector proteins called Yersinia outer proteins (Yop), more specifically YopH, O, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopHA1-352, yopOA65 -558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135]) 37 . The Yop data are encoded on the Yersinia virulence plasmid (pYV), an approximately 70-kb plasmid that encodes the complete type 3 secretion system (T3SS) as well as other virulence proteins (Fig. 4). YopH, O, P, E, M, and T are six effector proteins that are delivered to host cells by the bacterial type 3 secretion system to modulate and attenuate the immune system. Each Yop has specific biochemical activity in the host cell. YopT cleaves off the C-terminal cysteine of Rho GTPases and thus removes the isoprenyl group that anchors the GTPases to the membrane. This inactivation of Rho due to repositioning allows it to avoid phagocytosis by immune cells such as macrophages and neutrophils 49 . In the same pathway, YopE acts as a GTPase activating protein (GAP) for Rho GTPases, deactivating them. This results in decreased levels of phagocytosis and inhibition of immune cell release of IL‐1 beta 49 . Moreover, YopO acts as a guanidine nucleotide dissociation inhibitor (GDI), deactivating Rho GTPases. YopO also contains a serine/threonine kinase domain that acts on the actin cytoskeleton in a manner that is not fully understood 49 . YopH is a tyrosine phosphatase that acts on focal adhesion proteins such as focal adhesion kinase (Fak), paxillin and others, thereby highly preventing phagocytosis by macrophages and neutrophils 49 . YopP, designated YopJ in Y. pseudotuberculosis or Y. pestis, was found to inactivate the MAPK/NFkB pathway in immune cells, preventing the release of TNF-α and IL-8 stimulated by the presence of bacteria from immune cells. Moreover, YopP was found to induce apoptosis in immune cells, which may be due to its effect on the MAPK pathway, which in its activated state protects cells from apoptosis 49 . The role of YopM is not yet fully understood, but it has been found to be associated with ribosomal S6 kinase 1 (RSK1) and protein kinase C-like 2 (PRK2). It appears that YopM may stimulate RSK1 phosphorylation and thus affect downstream targets such as, for example, cell cycle progression 49 . As a result of deletion
- 61 044058 одного или нескольких из данных Yop защитный механизм бактерий против иммунной системы кардинально нарушается50. Мутацию соответствующих yop подтверждали методом ПЦР в соответствующей области и с помощью анализа секреции in vitro. Анализ секреции in vitro методом ПААГ-ДСН и окрашивание Кумасси голубым подтвердили отсутствие полноразмерного YopH,O,M и YopE.- 61 044058 one or more of the data Yop the protective mechanism of bacteria against the immune system is fundamentally impaired 50 . The mutation of the corresponding yops was confirmed by PCR in the corresponding region and by in vitro secretion assay. In vitro secretion analysis by SDS-PAGE and Coomassie blue staining confirmed the absence of full-length YopH,O,M and YopE.
Более того, был сконструирован штамм Y. enterocolitica с делециями в asd (аспартат-полуальдегиддегидрогеназе). Мутация в asd приводит к полной утрате способности к росту без добавления мезодиаминопимелиновой кислоты. Данный подход позволяет получить не содержащие антибиотики системы, поддерживающие плазмиду, на основании присутствия asd на соответствующей плазмиде. Аналогично, можно использовать другие ауксотрофные мутанты.Moreover, a Y. enterocolitica strain with deletions in asd (aspartate semialdehyde dehydrogenase) was constructed. Mutation in asd results in complete loss of growth ability without the addition of mesodiaminopimelic acid. This approach produces antibiotic-free plasmid-maintaining systems based on the presence of asd on the corresponding plasmid. Likewise, other auxotrophic mutants can be used.
Получение усиленных проапоптотических бактерий.Obtaining enhanced proapoptotic bacteria.
Для оптимизации доставки или проапоптотических белков получали штаммы, трансформированные различными проапоптотическими белками, согласно табл. IV.To optimize delivery or proapoptotic proteins, strains transformed with various proapoptotic proteins were obtained, according to Table. IV.
Таблица IVTable IV
Штаммы, трансформированные различными проапоптотическими белкамиStrains transformed with various proapoptotic proteins
- 62 044058- 62 044058
Укорачивание доставляемых белков до существенных доменов, необходимых для передачи сигналов (например, домена BH3 t-BID (SEQ ID NO: 19)), может увеличить эффективность уничтожения клеток (фиг. 5). Не опираясь на какую-либо теорию, считают, что данное увеличение эффективности, вероятно, связано с увеличением количества продукции белка и последующей доставки с помощью T3SS благодаря меньшему размеру доставляемого белка. Введение линкера между частью YopE и доменом BH3 tBID (SEQ ID NO: 23) снижало эффективность, как и удлинение домена BH3 на 4 дополнительные аминокислоты (SEQ ID NO: 22) (фиг. 5).Shortening the delivered proteins to essential domains required for signaling (eg, the BH3 domain of t-BID (SEQ ID NO: 19)) can increase the efficiency of cell killing (Fig. 5). Without being bound by any theory, it is believed that this increase in efficacy is likely due to an increase in the amount of protein production and subsequent delivery by the T3SS due to the smaller size of the protein delivered. Introducing a linker between the YopE portion and the BH3 domain of tBID (SEQ ID NO: 23) reduced efficiency, as did extending the BH3 domain by 4 additional amino acids (SEQ ID NO: 22) (Fig. 5).
Дополнительно получали синтетические грузы с повторами таких существенных доменов (например, домена BH3 t-BID (SEQ ID NO: 27)) или с комбинациями данных существенных доменов (например, домена BH3 t-BID и домена BH3 ВАХ (SEQ ID NO: 24 и 28)). Неожиданно было обнаружено, что тандемные повторы одинаковых или различных доменов BH3 приводят в результате к усилению индукции апоптоза на раковых линиях клеток (включая клетки 4Т1 и B16F10, фиг. 5). Было обнаружено, что IC50 (половина максимальной ингибирующей концентрации), обозначающая число бактерий на эукариотическую клетку (МЗ), необходимое для гибели 50% таких клеток, снижается после доставки тандемных повторов домена BH3 tBID по сравнению с единичным доменом BH3 tBID (фиг. 5). Данный результат был неожиданным, поскольку размер белка увеличивается при слиянии с вторым доменом BH3 t-BID. В связи с этим можно было ожидать снижения уровней экспрессии и доставки YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) по сравнению с YopE1-138-BH3 tBID (SEQ ID NO: 19 и 25), и в лучшем случае можно было ожидать эквивалентных уровней. Для достижения увеличения активности по уничтожению клеток слитые домены BH3 tBID должны одновременно действовать совместно после доставки в эукариотические клетки с помощью T3SS. В случае только одного домена BH3 tBID в YopE1-138-(BH3 tBID)2 конструкция будет функциональной и в лучшем случае можно ожидать такую же эффективность, как для YopE1-138-BH3 tBID.Additionally, synthetic cargoes with repeats of such essential domains (e.g., the BH3 t-BID domain (SEQ ID NO: 27)) or combinations of these essential domains (for example, the BH3 t-BID domain and the BH3 BAX domain (SEQ ID NO: 24 and 28)). Surprisingly, tandem repeats of the same or different BH3 domains were found to result in enhanced induction of apoptosis in cancer cell lines (including 4T1 and B16F10 cells, FIG. 5). The IC 50 (half maximum inhibitory concentration), indicating the number of bacteria per eukaryotic cell (MC) required to kill 50% of eukaryotic cells, was found to be reduced following delivery of BH3 tBID tandem repeats compared to a single BH3 tBID domain (Figure 5). ). This result was unexpected because the size of the protein increases when fused to the second BH3 domain of t-BID. In this regard, one would expect a decrease in the levels of expression and delivery of YopE 1-138 -(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) compared to YopE 1-138 -BH3 tBID (SEQ ID NO: 19 and 25), and at best, equivalent levels could be expected. To achieve enhanced cell killing activity, the BH3 tBID fusion domains must simultaneously act together upon delivery into eukaryotic cells by the T3SS. In the case of only one BH3 tBID domain in YopE 1-138 -(BH3 tBID)2, the design will be functional and, at best, the same efficiency as for YopE 1-138 -BH3 tBID can be expected.
С целью увеличения генетической стабильности YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) для исследований in vivo авторы настоящего изобретения клонировали YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) путем гомологичной рекомбинации на плазмиде вирулентности Yersinia pYV в нативном сайте YopE и под контролем нативного промотора YopE (с применением плазмид-мутаторов pSI_408 npSI_419). Такие мутаторы содержат последовательность ДНК, кодирующую желаемый белок, фланкированную с обеих сторон последовательностями размером 200-250 п.о., которые соответствуют сайту соответствующего гена, в котором должна пройти интеграция. Данными плазмидами трансформировали Е. coli Sm10λ pir, из которых плазмиды мобилизировали в соответствующий штамм Y. enterocolitica. Мутантов, несущих вектор, размножали для получения нескольких поколений без давления отбора. Затем для отбора клонов, которые утратили вектор, использовали сахарозу. Наконец, мутанты идентифицировали с помощью ПНР для отбора колоний. Эндогенные белки для транспортирования с помощью T3SS (называемые внешние белки Yersinia, Yop) кодируются Y. enterocolitica на данной плазмиде размером 70 т.о., называемой плазмидой вирулентности Yersinia (pYV), которая дополнительно кодирует аппарат T3SS. Оценивали способность штаммов Yersinia, кодирующих YopE1-138-(BH3 tBID) (SEQ ID NO: 19 и 25) или YopE1-138(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) на плазмиде вирулентности Yersinia pYV в нативном сайте YopE и под контролем нативного промотора YopE, индуцировать апоптоз в раковых клетках (включая клетки 4Т1 и B16F10, фиг. 6). Было обнаружено, что IC50 (половина максимальной ингибирующей концентрации), обозначающая число бактерий на эукариотическую клетку (МЗ), необходимое для гибели 50% таких клеток, снижается после доставки тандемных повторов домена BH3 tBID по сравнению с единичным доменом BH3 tBID, когда оба белка кодируются на плазмиде вирулентности Yersinia pYV в нативном сайте YopE и под контролем нативного промотора YopE (фиг. 6). Это согласуется с результатами, полученными с плазмидой экспрессии, обеспечивающей доставку данных белков (фиг. 5). Данный результат вновь был неожиданным, поскольку при слиянии с вторым доменом BH3 t-BID размер белка увеличивается. В связи с этим можно было ожидать снижения уровней экспрессии и доставки YopE1-138-(BH3In order to increase the genetic stability of YopE 1-138 -(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) for in vivo studies, the present inventors cloned YopE 1-138 -(BH3 tBID) 2 (SEQ ID NO: 27) by homologous recombination on the Yersinia pYV virulence plasmid in the native YopE site and under the control of the native YopE promoter (using mutator plasmids pSI_408 npSI_419). Such mutators contain a DNA sequence encoding the desired protein, flanked on both sides by 200-250 bp sequences that correspond to the site of the corresponding gene where integration should take place. These plasmids were used to transform E. coli Sm10λ pir, from which the plasmids were mobilized into the corresponding strain of Y. enterocolitica. Mutants carrying the vector were propagated to produce several generations without selection pressure. Sucrose was then used to select clones that had lost the vector. Finally, mutants were identified using PNR for colony selection. Endogenous proteins for transport by the T3SS (termed Yersinia extrinsic proteins, Yop) are encoded by Y. enterocolitica on a given 70-kb plasmid, called the Yersinia virulence plasmid (pYV), which additionally encodes the T3SS machinery. The ability of Yersinia strains encoding YopE 1-138 -(BH3 tBID) (SEQ ID NO: 19 and 25) or YopE 1-138 (BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) on the Yersinia virulence plasmid pYV at the native site of YopE was assessed and under the control of the native YopE promoter, induce apoptosis in cancer cells (including 4T1 and B16F10 cells, Fig. 6). It was found that the IC 50 (half maximum inhibitory concentration), indicating the number of bacteria per eukaryotic cell (MC) required to kill 50% of such cells, is reduced after delivery of tandem repeats of the BH3 tBID domain compared to a single BH3 tBID domain when both proteins are encoded on the Yersinia virulence plasmid pYV at the native YopE site and under the control of the native YopE promoter (Fig. 6). This is consistent with the results obtained with the expression plasmid delivering these proteins (Fig. 5). This result was again unexpected, since the size of the protein increases when fused with the second domain of BH3 t-BID. In this regard, one would expect a decrease in the levels of expression and delivery of YopE1-138-(BH3
- 63 044058 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) по сравнению с YopE1.138-BH3 tBID (SEQ ID NO: 19 и 25), и в лучшем случае можно было ожидать эквивалентных уровней. Для достижения увеличения активности по уничтожению клеток слитые домены BH3 tBID должны одновременно действовать совместно после доставки с помощью T3SS в эукариотические клетки. В случае только одного домена BH3 tBID в YopE1-138-(BH3 tBID)2 конструкция будет функциональной, и в лучшем случае можно ожидать такую же эффективность, как для YopE1-138-BH3 tBID. Более того, сравнивали способность штаммов Yersinia, кодирующих YopE1-138(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27), на плазмиде вирулентности Yersinia pYV в нативном сайте YopE и под контролем нативного промотора YopE, индуцировать апоптоз в раковых клетках с доставкой YopE1-138(BH3 tBID)2 на основе плазмиды экспрессии (на основе pBad-MycHisA). В соответствии с более высоким числом копий pBad-MycHisA (20-25 копий) по сравнению с pYV (сообщалось о 1-6 копиях) доставка YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) на основе pBad-MycHisA привела к незначительному снижению значения IC50 на клетках 4Т1 и B16F10 (фиг. 6).- 63 044058 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) compared to YopE1. 138 -BH3 tBID (SEQ ID NOs: 19 and 25), and at best equivalent levels would be expected. To achieve enhanced cell killing activity, the BH3 tBID fusion domains must simultaneously act together upon delivery by the T3SS into eukaryotic cells. In the case of only one BH3 tBID domain in YopE 1-138 -(BH3 tBID) 2 the design will be functional and, at best, the same efficiency as for YopE 1-138 -BH3 tBID can be expected. Moreover, the ability of Yersinia strains encoding YopE1-138 (BH3 tBID) 2 (SEQ ID NO: 27), on the Yersinia pYV virulence plasmid at the native YopE site and under the control of the native YopE promoter, to induce apoptosis in cancer cells delivered by YopE 1 was compared -138 (BH3 tBID) 2 based on expression plasmid (based on pBad-MycHisA). Consistent with the higher copy number of pBad-MycHisA (20-25 copies) compared to pYV (1-6 copies reported), delivery of YopE 1-138 -(BH3 tBID) 2 (SEQ ID NO: 27) based on pBad- MycHisA resulted in a slight decrease in the IC 50 value on 4T1 and B16F10 cells (Fig. 6).
Исследования биораспределения на модели меланомы на мышах.Biodistribution studies in a mouse model of melanoma.
Для подтверждения возможности применения грамотрицательных бактерий с мутацией или мутациями на ключевых детерминантах вирулентности, таких как эффекторы T3SS, в качестве опухольспецифичного носителя, проводили исследования на аллотрансплантатах опухоли на мышах с применением надежно отработанной модели меланомы B16F10 (АТСС № CRL-6475). Когда п.к. опухоли достигали определенного размера (приблизительно 100-200 мм3), мышей в.в. инфицировали 2x105 КОЕ Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 или Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т. Для обеспечения роста бактерий мышам предварительно вводили десфреоксамин за 24 ч до инфицирования. Мыши, инфицированные штаммом Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 ДТ, характеризовались повышенным баллом при оценке внешнего вида и поведения (фиг. 47-48), и у них наблюдалась значительная потеря массы тела в течение первых 48 ч инфекции (фиг. 49), что заставило авторов настоящего изобретения умертвить всех мышей в данной группе уже в день 2 после инфекции. Напротив, у мышей, инфицированных аттенуированным по вирулентности штаммом Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т, не наблюдалось значительной потери массы тела, и они все еще получали нормальный балл при оценке по внешнему виду и поведению (фиг. 47-49) в день 4 после инфекции. У мышей, инфицированных штаммом ДТ (Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40), живые бактерии были обнаружены во всех изученных органах и, более того, в крови (фиг. 51). Хотя бактерии ДТ были обнаружены в злокачественной солидной опухоли, такое же или даже большее число бактерий было обнаружено в других органах, наибольшее - в селезенке (фиг. 51). Наоборот, у мышей, инфицированных Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т, в день 1 после инфекции живые бактерии, главным образом, были обнаружены в злокачественной солидной опухоли, а число бактерий, обнаруженных в селезенке, печени и легких, было низким. Примечательно, что в день 4 после инфекции число бактерий в злокачественной солидной опухоли увеличилось в несколько десятков раз (и достигло более 108 КОЕ/г опухолевой ткани), в то время как во всех остальных изученных органах число бактерий снизилось ниже предела обнаружения (фиг. 50). Таким образом, Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40 АуорН,О,Р,Е,М,Т накапливался в день 4 после инфекции в участке злокачественной солидной опухоли в дозе, превышающей приблизительно (минимально) в один миллион раз дозу в селезенке или печени (при расчете дозы по сравнению с пределом обнаружения).To confirm the feasibility of using Gram-negative bacteria with a mutation or mutations in key virulence determinants, such as T3SS effectors, as a tumor-specific carrier, tumor allograft studies were performed in mice using the well-established B16F10 melanoma model (ATCC No. CRL-6475). When p.c. tumors reached a certain size (approximately 100-200 mm 3 ), mice i.v. infected with 2x105 CFU of Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40 or Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T. To ensure bacterial growth, mice were pretreated with desphreoxamine 24 h before infection. Mice infected with the Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40 WT strain had increased scores on measures of appearance and behavior (Fig. 47-48), and they experienced significant weight loss during the first 48 hours of infection (Fig. 49), which forced the authors of the present invention to kill all mice in this group already on day 2 after infection. In contrast, mice infected with the virulence-attenuated strain of Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T did not experience significant weight loss and still scored normal on appearance and behavior assessments ( Fig. 47-49) on day 4 after infection. In mice infected with the WT strain (Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40), live bacteria were found in all organs studied and, moreover, in the blood (Fig. 51). Although DT bacteria were found in the malignant solid tumor, equal or greater numbers of bacteria were found in other organs, most notably in the spleen (Fig. 51). In contrast, in mice infected with Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T, on day 1 postinfection, live bacteria were mainly found in the malignant solid tumor, and the number of bacteria found in the spleen liver and lungs was low. It is noteworthy that on day 4 after infection, the number of bacteria in a malignant solid tumor increased several tens of times (and reached more than 10 8 CFU/g of tumor tissue), while in all other organs studied the number of bacteria decreased below the detection limit (Fig. 50). Thus, Y. enterocolitica subspecies palearctica MRS40 AuopH,O,P,E,M,T accumulated at day 4 postinfection at the site of a malignant solid tumor to a dose approximately (minimum) one million times greater than the dose in the spleen or liver (at calculation of dose versus detection limit).
Аналогично высокое число бактерий на 1 г солидных опухолей в день 5 или 8 после внутривенного введения в латеральную хвостовую вену мышей с меланомой B16F10 было определено для Y. enterocolitica dHOPEMT, Y. enterocolitica dHOPEMT+pYV-YopE1-138- CARD RIG1 мыши или Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1.138 - CARD RIG1 мыши (фиг. 26). Это подтверждает, что груз гетерологичного белка и дополнительные мутации, влияющие на регуляцию T3SS (VirF), не влияют на колонизацию бактериями солидных опухолей на моделях на мышах.Similarly high numbers of bacteria per gram of solid tumors on day 5 or 8 after intravenous injection into the lateral tail vein of mice with B16F10 melanoma were determined for Y. enterocolitica dHOPEMT, Y. enterocolitica dHOPEMT+pYV- YopE1-138 - CARD RIG1 mouse, or Y. enterocolitica dHOPEMT AHairpinI-VirF+pYV-YopE1. 138 - CARD RIG1 mouse (Fig. 26). This confirms that heterologous protein cargo and additional mutations affecting T3SS regulation (VirF) do not affect bacterial colonization of solid tumors in mouse models.
Полученные результаты подтверждают данную стратегию аттенуации по вирулентности с помощью мутации ключевых детерминант вирулентности для получения бактериального носителя, который специфично нацелен на злокачественную солидную опухоль.Our results support this virulence attenuation strategy by mutating key virulence determinants to produce a bacterial host that specifically targets solid tumor malignancies.
Подтверждение опухоль-специфичного роста in vivo до дня 14 после введения бактерий.Confirmation of tumor-specific growth in vivo up to day 14 after bacterial administration.
Эксперимент по колонизации опухоли генетически модифицированными Y. enterocolitica повторяли на сингенной аллотрансплантатной модели на мышах (модель рака молочной железы 4Т1), и колонизацию бактериями отслеживали в течение двух недель. На этот раз мышей инфицировали 1x106 колониеобразующих единиц (КОЕ) Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Хотя и были получены результаты, подобные результатам, полученным на модели B16F10, в течение первых дней после инфекции, авторы настоящего изобретения смогли дополнительно продемонстрировать, что колонизация опухоли согласованно обнаруживалась в день 8 и вплоть до дня 14 после инфекции (фиг. 7). Более того, колонизация оставалась высокоспецифичной, и во всех других изученных органах было обнаружено лишь незначительное число бактерий (фиг. 8). Данные результаты свидетельствуют, что Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T способен устанавливать персистентную колонизацию опухоли, тем самым предотвращая клиренс со стороны иммунной системы.The tumor colonization experiment with genetically modified Y. enterocolitica was repeated in a syngeneic allograft mouse model (4T1 breast cancer model), and bacterial colonization was monitored over a two-week period. This time, mice were infected with 1x106 colony-forming units (CFU) of Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T. Although results similar to those obtained in the B16F10 model were obtained during the first days postinfection, we were able to further demonstrate that tumor colonization was consistently detected at day 8 and up to day 14 postinfection (Fig. 7). Moreover, colonization remained highly specific, and only minor numbers of bacteria were detected in all other organs examined (Fig. 8). These results indicate that Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T is able to establish persistent colonization of the tumor, thereby preventing clearance by the immune system.
- 64 044058- 64 044058
Эффективность Y. enterocolitica AHOPEMAT по отсрочиванию прогрессирования опухоли.Efficacy of Y. enterocolitica AHOPEMAT in delaying tumor progression.
Для оценки влияния YopE1-138-(BH3 tBID)2, доставленного в опухолевые клетки in vivo, авторы настоящего изобретения проводили исследование на мышах Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы 4Т1. Целью авторов настоящего изобретения была оценка штамма Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодирующего YopE1-138-(BH3 tBID)2, на плазмиде вирулентности Yersinia pYV в нативном сайте YopE и под контролем нативного промотора YopE, который дополнительно оптимизировали путем делеции области шпильки I в направлении 3'-5' от VirF для увеличения количества доставленных белков. Мышам в.в. инъецировали ФБР или 1х107 Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-virF pYV-YopE1-138-(BH3 tBID)2, когда опухоль достигала размера 150-250 мм3. День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (с дня 0 по день 9 после в.в. инъекции бактерий) с помощью штангенциркуля. Объем опухоли нормировали к объему опухоли в день 0 для учета любой исходной гетерогенности размера опухоли. Лечение Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF pYV-YopE1-138-(BH3 tBID)2 продемонстрировало влияние на прогрессирование объема опухоли со статистически значимым снижением опухоли в день 8, 9 и 10 после введения бактерий (фиг. 9). Важно отметить, что было обнаружено, что Y. enterocolitica AHOPEMAT сам по себе не влиял на прогрессирование опухоли на модели рака на мышах 4Т1 (фиг. 10). Данные результаты подчеркивают, что такие бактерии и их T3SS можно применять для препятствования прогрессированию опухоли.To evaluate the effect of YopE 1-138 -(BH3 tBID)2 delivered to tumor cells in vivo, we conducted a study in wild-type Balb/C mice with s.c. allograft of 4T1 breast cancer cells. The aim of the present invention was to evaluate the Y. enterocolitica strain AHOPEMAT, encoding YopE 1-138 -(BH3 tBID)2, on the Yersinia virulence plasmid pYV at the native YopE site and under the control of the native YopE promoter, which was further optimized by deleting the hairpin I region in the direction 3'-5' of VirF to increase the amount of delivered proteins. Mice i.v. were injected with PBS or 1x10 7 Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-virF pYV-YopE1-138-(BH3 tBID)2 when the tumor reached a size of 150-250 mm 3 . Day v.v. injection of bacteria was designated as day 0. Tumor volume was measured over the following days (from day 0 to day 9 after i.v. injection of bacteria) using a caliper. Tumor volume was normalized to tumor volume at day 0 to account for any baseline heterogeneity in tumor size. Treatment with Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF pYV-YopE1-138-(BH3 tBID) 2 demonstrated an effect on tumor volume progression, with statistically significant tumor reduction at days 8, 9, and 10 after bacteria administration (Figure 9). Importantly, Y. enterocolitica AHOPEMAT alone was found to have no effect on tumor progression in the 4T1 mouse cancer model (Figure 10). These results highlight that such bacteria and their T3SS can be used to inhibit tumor progression.
Y. enterocolitica AHOPEMAT с делецией в термочувствительной области РНК в направлении 3'-5' от гена, кодирующего ДНК-связывающий белок типа AraC.Y. enterocolitica AHOPEMAT with a deletion in the temperature-sensitive region of RNA in the 3'-5' direction from the gene encoding a DNA-binding protein of the AraC type.
Наиболее известные гены вирулентности Yersinia не экспрессируются за пределами эукариотического хозяина и индуцируются только после поступления в окружающую среду хозяина. Экспрессия данных генов вирулентности индуцируется резким повышением температуры, связанным с поступлением в хозяина. Таким образом в особенности регулируются кодируемые pYV факторы вирулентности, такие как T3SS и ее эффекторные белки (Yop). При комнатной температуре (20-25°С) гены, необходимые для регуляции T3SS, образования T3SS самой по себе и доставляемых эффекторов, не экспрессируются, и экспрессия индуцируется только после такого повышения температуры до 37°С. Экспрессия большинства кодируемых pYV генов вирулентности (yadA и генов, связанных с T3SS) индуцируется температурой, и для этого требуется ДНК-связывающий белок типа AraC VirF в Y. enterocolitica (LcrF - в других видах Yersinia). Считают, что терморегуляция экспрессии LcrF осуществляется посредством плавления при более высоких температурах петли на стебле РНК в мРНК, которая в нерасплавленном состоянии изолирует сайт связывания рибосомы, таким образом, предотвращая трансляцию51. В Y. enterocolitica, напротив, было показано, что транскрипция VirF зависит, главным образом, от температуры52. Совсем недавние исследования продемонстрировали более сложную картину с участием термолабильного регулятора, называемого YmoA 51, хотя было обнаружено, что термосенсор РНК в направлении 3'-5' от LcrF, главным образом, отвечает за температурную регуляцию LcrF и, таким образом, зависимых от температуры генов вирулентности.The best known virulence genes of Yersinia are not expressed outside the eukaryotic host and are induced only after entry into the host environment. Expression of these virulence genes is induced by a sharp increase in temperature associated with entry into the host. In this way, pYV-encoded virulence factors such as the T3SS and its effector proteins (Yop) are particularly regulated. At room temperature (20–25°C), the genes required for the regulation of the T3SS, the formation of the T3SS itself, and the delivered effectors are not expressed, and expression is induced only after this increase in temperature to 37°C. Expression of most pYV-encoded virulence genes (yadA and T3SS-associated genes) is temperature-inducible and requires the AraC-type DNA-binding protein VirF in Y. enterocolitica (LcrF in other Yersinia species). Thermoregulation of LcrF expression is thought to occur through the melting at higher temperatures of a loop on the RNA stem into mRNA, which in the unmelted state isolates the ribosome binding site, thereby preventing translation 51 . In Y. enterocolitica, in contrast, VirF transcription has been shown to depend primarily on temperature 52 . More recent studies have demonstrated a more complex picture involving a thermolabile regulator called YmoA 51 , although a thermosensor RNA 3′–5′ of LcrF has been found to be primarily responsible for temperature regulation of LcrF and thus temperature-dependent genes virulence.
Для увеличения уровней секреции гетерологичного груза, экспрессированного с pYV под контролем нативного промотора YopE, целью авторов настоящего изобретения было делетирование одной из данных шпилечных структур РНК в Y. enterocolitica в направлении 3'-5' от VirF. Несмотря на то, что важность таких петель на стебле РНК на Y. enterocolitica не была однозначно показана, и температурная индукция была скорее характерной изменениям транскрипции, авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать шпильку I 51 в направлении 3'-5' от VirF Y. enterocolitica. Затем авторы настоящего изобретения удалили путем гомологичной рекомбинации части шпильки I (от -111 до -57, как в публикации51) и оценивали способность секреции кодируемого pYV белка YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) или YopE1-138- CARD2RIG-1 мыши (SEQ ID NO: 38) (каждый в нативном сайте YopE) в анализе секреции in vitro (фиг. 11). Неожиданно было обнаружено, что делеция части области шпильки I в направлении 3'-5' от VirF в Y. enterocolitica увеличила секрецию гетерологичных белков in vitro (фиг. 11 А и В), в отличие от предыдущих сообщений о Y. enterocolitica52, в которых считали, что транскрипция VirF являлась основной движущей силой терморегуляции.To increase secretion levels of heterologous cargo expressed from pYV under the control of the native YopE promoter, the present inventors aimed to delete one of these RNA hairpin structures in Y. enterocolitica in the 3'-5' direction of VirF. Although the importance of such RNA stem loops in Y. enterocolitica has not been unequivocally demonstrated and temperature induction was more likely to be characteristic of transcriptional changes, we were able to identify hairpin I 51 3'-5' of Y. enterocolitica VirF. We then removed by homologous recombination parts of hairpin I (-111 to -57, as in publication 51 ) and assessed the secretion capacity of the pYV-encoded protein YopE 1-138 -(BH3 tBID) 2 (SEQ ID NO: 27) or YopE 1-138 - mouse CARD2RIG-1 (SEQ ID NO: 38) (each at the native YopE site) in an in vitro secretion assay (Fig. 11). Surprisingly, it was found that deletion of part of the hairpin I region 3′-5′ of VirF in Y. enterocolitica increased the secretion of heterologous proteins in vitro (Fig. 11 A and B), in contrast to previous reports in Y. enterocolitica 52 , in which believed that VirF transcription was the main driving force of thermoregulation.
Чтобы сделать возможной искусственную индукцию экспрессии T3SS и доставки белков с помощью T3SS, авторы настоящего изобретения заменили в другом штамме эндогенный промотор VirF на pYV индуцибельным арабинозой промотором, известным из pBad-MycHisA. Помимо замены промотора VirF, авторы настоящего изобретения ввели в направлении 3'-5' (в обратной ориентации) полный ген araC. Затем авторы настоящего изобретения оценивали способность секреции YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) (кодируемый pYV; в нативном сайте YopE) при отсутствии или в присутствии арабинозы в анализе секреции in vitro (фиг. 11А). Было обнаружено, что гетерологичный белок секретируется с помощью T3SS только после добавления арабинозы, что согласуется с регуляцией экспрессии VirF арабинозой.To allow artificial induction of T3SS expression and protein delivery by T3SS, we replaced the endogenous VirF promoter on pYV with an arabinose-inducible promoter known from pBad-MycHisA in another strain. In addition to replacing the VirF promoter, the present inventors introduced in the 3'-5' direction (in reverse orientation) the complete araC gene. We then assessed the secretion capacity of YopE1-138-(BH3 tBID)2 (SEQ ID NO: 27) (encoded by pYV; at the native site of YopE) in the absence or presence of arabinose in an in vitro secretion assay (FIG. 11A). The heterologous protein was found to be secreted by the T3SS only after the addition of arabinose, consistent with regulation of VirF expression by arabinose.
Y. enterocolitica AHOPEMAT с увеличенной стабильностью гетерологичного груза (in vitro и in vivo).Y. enterocolitica AHOPEMAT with increased heterologous cargo stability (in vitro and in vivo).
Было продемонстрировано, что Y. enterocolitia AyopH,O,P,E,M,T является высокоспецифичнымY. enterocolitia AyopH,O,P,E,M,T has been demonstrated to be highly specific
- 65 044058 штаммом для нацеливания на солидные опухоли в экспериментах авторов настоящего изобретения на мышах; при этом было обнаружено, что зависимая от T3SS доставка цитотоксических белков эффективна в культуре клеток на раковых клетках. Для объединения двух данных свойств необходимо оптимально сконструировать бактерии, колонизирующие солидную опухоль, чтобы они стабильно кодировали цитотоксический груз в течение нескольких дней или даже недель, in vivo. В связи с регуляторными требованиями использование классической устойчивости к антибиотикам для поддержания чужеродной плазмиды в бактериях является неприемлемым. Таким образом, в исследованиях на аллотрансплантатах на мышах авторы настоящего изобретения оценивали систему поддержания плазмиды, не включающую устойчивость к антибиотикам. Данная система основана на хромосомной делеции существенного гена (такого как аспартат-полуальдегид-дегидрогеназа, asd) и кодировании данного гена на гетерологичной плазмиде для поддержания роста бактерий. Дополнение делеции asd для поддержания плазмиды было продемонстрировано ранее53, хотя сообщалось о сложностях с воспроизводимостью и персистенцией в течение нескольких дней54. Авторы настоящего изобретения адаптировали данную систему для применения в Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T, в котором авторы настоящего изобретения дополнительно делетировали кодируемый хромосомно asd (что привело к получению Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd), который затем возвращали на плазмиду со средним числом копий, pBad-MycHisA (pBad-MycHisAasd). Ген asd клонировали из Y. enterocolitica 8081 и встраивали в сайт PciI pBad-MycHisA в прямой и обратной ориентации, соответственно, с его эндогенным промотором и терминатором транскрипции. Характеристики роста полученных в результате штаммов Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBadMycHisA-asd (прямая или обратная ориентация asd) сравнивали в культуральных колбах in vitro (среда BHI) с ДТ и родительскими штаммами Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd (фиг. 12). В обеих ориентациях pBad-MycHisA-asd восстанавливал фенотип, наблюдаемый после делеции asd (фиг. 12). Напротив, на модели меланомы B16F10 на мышах, а также на модели 4Т1 авторы настоящего изобретения обнаружили, что Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBad-MycHisA-asd не колонизирует солидные опухоли в достаточной степени (фиг. 13 и 14), и из нескольких выделенных колоний авторам настоящего изобретения не удалось восстановить плазмиду pBad-MycHisA-asd. Более того, колонии, выделенные из модели меланомы B16F10 на мышах, подтверждали применительно к росту на содержащих ампициллин планшетах, который подтверждал наличие плазмиды pBad-MycHisA-asd, кодирующей устойчивость к ампициллину. В день 4 после в.в. инъекции только незначительная фракция выделенных колоний демонстрировала устойчивость к ампициллину (фиг. 13). Данный результат может отражать утрату pBadMycHisA-asd, но также может быть связан с утратой только гена устойчивости к ампициллину или с трудностями при повторном начале экспрессии гена устойчивости к ампициллину, достаточно быстром, чтобы избежать гибели под действием ампициллина. В любом случае колонизация опухоли Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBad-MycHisA-asd, которая наблюдалась на модели меланомы B16F10 на мышах, а также на модели 4Т1, продемонстрировала быстрое снижение числа бактерий в солидной опухоли, в отличие от Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т. Таким образом, делеция хромосомного asd и дополнение на pBad-MycHisA приводит к резкому снижению выживаемости и способности бактерий размножаться in vivo. Данное наблюдение согласуется с сообщениями о снижении жизнеспособности вследствие несбалансированных уровней asd 54.- 65 044058 strain for targeting solid tumors in the experiments of the authors of the present invention on mice; however, T3SS-dependent delivery of cytotoxic proteins was found to be effective in cell culture on cancer cells. To combine these two properties, it is necessary to optimally engineer solid tumor-colonizing bacteria to stably encode cytotoxic cargo for days or even weeks in vivo. Due to regulatory requirements, the use of classical antibiotic resistance to maintain a foreign plasmid in bacteria is unacceptable. Thus, in mouse allograft studies, we evaluated a plasmid maintenance system that does not include antibiotic resistance. This system is based on the chromosomal deletion of an essential gene (such as aspartate semialdehyde dehydrogenase, asd) and the encoding of this gene on a heterologous plasmid to support bacterial growth. Complementation of an asd deletion for plasmid maintenance has been demonstrated previously 53 , although difficulties with reproducibility and persistence over several days have been reported 54 . The present inventors adapted this system for use in Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T, in which the present inventors further deleted the chromosomally encoded asd (resulting in Y. enterocolitica AyopH,O,P,E, M,T Aasd), which was then returned to the medium copy number plasmid, pBad-MycHisA (pBad-MycHisAasd). The asd gene was cloned from Y. enterocolitica 8081 and inserted into the PciI site of pBad-MycHisA in forward and reverse orientation, respectively, with its endogenous promoter and transcription terminator. The growth characteristics of the resulting Y. enterocolitica strains AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBadMycHisA-asd (direct or reverse asd orientation) were compared in in vitro culture flasks (BHI medium) with WT and parental Y. enterocolitica strains AyopH,O,P,E,M,T Aasd (Fig. 12). In both orientations, pBad-MycHisA-asd restored the phenotype observed after asd deletion (Fig. 12). In contrast, in a mouse model of B16F10 melanoma, as well as in a 4T1 model, we found that Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBad-MycHisA-asd did not colonize solid tumors to a sufficient extent (Fig. 13 and 14), and from several isolated colonies the authors of the present invention were unable to recover the plasmid pBad-MycHisA-asd. Moreover, colonies isolated from the B16F10 mouse model of melanoma were confirmed by growth on ampicillin-containing plates, which confirmed the presence of the pBad-MycHisA-asd plasmid encoding ampicillin resistance. On day 4 after i.v. injection, only a small fraction of isolated colonies showed resistance to ampicillin (Fig. 13). This result may reflect loss of pBadMycHisA-asd, but may also be due to loss of the ampicillin resistance gene alone or difficulty in restarting ampicillin resistance gene expression quickly enough to avoid killing by ampicillin. In any case, tumor colonization with Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pBad-MycHisA-asd, which was observed in the B16F10 mouse model of melanoma, as well as in the 4T1 model, demonstrated a rapid decrease in the number of bacteria in the solid tumor , in contrast to Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Э,М,Т. Thus, deletion of chromosomal asd and addition of pBad-MycHisA leads to a sharp decrease in the survival and ability of bacteria to reproduce in vivo. This observation is consistent with reports of decreased viability due to unbalanced asd levels 54 .
Эндогенные белки для транспортирования с помощью T3SS (называемые внешние белки Yersinia, Yop) кодируются Y. enterocolitica на плазмиде размером 70 т.о. Данная плазмида, называемая плазмидой вирулентности Yersinia (pYV), дополнительно кодирует аппарат T3SS. Авторы настоящего изобретения оценивали стабильность плазмиды pYV на аллотрансплантатной модели 4Т1 на мышах. Авторы настоящего изобретения успешно выделили pYV из штаммов, отобранных в день 9 или 10 после инфекции мыши (фиг. 15). Затем авторы настоящего изобретения провели анализы, подтверждающие присутствие и функциональность T3SS выделенных штаммов бактерий через восемь дней роста в солидной опухоли in vivo. Таким образом, авторы настоящего изобретения посчитали pYV вектором, предпочтительным для кодирования гетерологичного груза с целью доставки in vivo. Несмотря на это, авторы настоящего изобретения обнаружили, что процент колоний бактерий, несущих плазмиду pYV, является гетерогенным после роста в течение 9-10 дней в солидных опухолях 4Т1 на мышах (фиг. 15). Помимо собственной нестабильности pYV, штамм Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T утратил селективное преимущество увеличения вирулентности Yop in vivo.Endogenous proteins for transport by the T3SS (called Yersinia extrinsic proteins, Yop) are encoded by Y. enterocolitica on a 70 kb plasmid. This plasmid, called the Yersinia virulence plasmid (pYV), additionally encodes the T3SS apparatus. The present inventors evaluated the stability of the pYV plasmid in the 4T1 allograft mouse model. We have successfully isolated pYV from strains collected at day 9 or 10 post infection of mice (FIG. 15). We then performed assays confirming the presence and functionality of the T3SS of the isolated bacterial strains after eight days of growth in a solid tumor in vivo. Thus, the present inventors have considered pYV to be a vector of choice for encoding heterologous cargo for in vivo delivery. Despite this, the present inventors have found that the percentage of bacterial colonies carrying the pYV plasmid is heterogeneous after growth for 9-10 days in 4T1 solid tumors in mice (Fig. 15). In addition to the intrinsic instability of pYV, the Y. enterocolitica strain AyopH,O,P,E,M,T has lost the selective advantage of increasing Yop virulence in vivo.
Для стабилизации pYV и, таким образом, гетерологичного груза, кодируемого на pYV, авторы настоящего изобретения адаптировали asd-систему для применения в Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T на pYV. Авторы настоящего изобретения делетировали кодируемый хромосомно asd (что привело к получению Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd), который затем возвращали на pYV (называемую pYVasd). Ген asd клонировали из Y. enterocolitica 8081 (Y. enterocolitica подвид enterocolitica 8081; эталонная последовательность NCBI: NC_008800.1) и встраивали путем гомологичной рекомбинации в pYV (в природную область вставки перед SycO) с его эндогенным промотором и терминатором транскрипции. Характеристики роста полученных в результате штаммов Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pYVasd сравнивали в культуральных колбах in vitro (среда BHI) с ДТ и родительскими штаммами Y. enterocoTo stabilize pYV and thus the heterologous cargo encoded on pYV, we adapted the asd system for use in Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T on pYV. We have deleted the chromosomally encoded asd (resulting in Y. enterocolitica AuopH,O,P,E,M,T Aasd), which is then returned to pYV (referred to as pYVasd). The asd gene was cloned from Y. enterocolitica 8081 (Y. enterocolitica subspecies enterocolitica 8081; NCBI reference sequence: NC_008800.1) and inserted by homologous recombination into pYV (in the natural insertion region upstream of SycO) with its endogenous promoter and transcription terminator. The growth characteristics of the resulting Y. enterocolitica strains AyopH,O,P,E,M,T Aasd+pYVasd were compared in in vitro culture flasks (BHI medium) with WT and parental Y. enteroco strains
- 66 044058 litica AyopH,O,P,E,M,T Aasd (фиг. 12). pYV-asd был способен восстанавливать фенотип, наблюдаемый после делеции asd (фиг. 12), при этом восстановление не было полным, и могло наблюдаться незначительное снижение роста in vitro. Напротив, на сингенной модели рака 4Т1 на мышах in vivo авторы настоящего изобретения обнаружили, что Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd+pYV-asd эффективно колонизирует солидные опухоли (фиг. 16). Поразительно, но было обнаружено, что все колонии, выделенные из солидной опухоли в день 9-10 после инъекции, все еще содержали плазмиду pYV (селекция на содержащих арсенит планшетах для роста; устойчивость к арсениту связана с присутствием генов arsRBC на pYV 55) (фиг. 15). Следовательно, pYV-asd неожиданно продемонстрировала, что является стабильным in vivo вектором для кодирования гетерологичных белков, подлежащих экспрессии в солидных опухолях путем колонизации бактерий, в течение нескольких дней и недель в исходном штамме Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т Aasd.- 66 044058 litica AyopH,O,P,E,M,T Aasd (Fig. 12). pYV-asd was able to restore the phenotype observed after asd deletion (Fig. 12), although the restoration was not complete and a slight reduction in in vitro growth could be observed. In contrast, in an in vivo syngeneic mouse model of 4T1 cancer, we found that Y. enterocolitica AuopH,O,P,E,M,T Aasd+pYV-asd efficiently colonizes solid tumors (Fig. 16). Strikingly, all colonies isolated from solid tumors at days 9–10 post-injection were found to still contain the pYV plasmid (selection on arsenite-containing growth plates; arsenite resistance is associated with the presence of arsRBC genes on pYV 55 ) (Fig. . 15). Therefore, pYV-asd was unexpectedly demonstrated to be a stable in vivo vector for encoding heterologous proteins to be expressed in solid tumors by bacterial colonization within days and weeks in the original Y. enterocolitica strain AuopH,O,P,E,M. T Aasd.
Эффективность Y. enterocolitica AHOPEMT по отсрочиванию прогрессирования опухоли и влияние изменения активности VirF, а также увеличения стабильности.Efficacy of Y. enterocolitica AHOPEMT in delaying tumor progression and the impact of altering VirF activity as well as increasing stability.
Эксперименты, подобные проведенным с клетками 4Т1 (фиг. 9 и 10), проводили на модели рака молочной железы ЕМТ6 на мышах, в которой мышам Balb/C дикого типа п.к. вводили аллотрансплантат клеток рака молочной железы ЕМТ6 и лечили однократным в.в. введением бактерий, когда опухоль достигала размера приблизительно 80-250 мм3. День в.в. инъекции бактерий обозначали как день 0, все мыши получали и.п. инъекцию Десферала за один день до Д0. Лечение Y. enterocolitica AHOPEMAT не влияло на прогрессирование опухоли по сравнению с солевым раствором. Y. enterocolitica AHOPEMAT pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2 продемонстрировал незначительное влияние на прогрессирование опухоли, которое усиливалось при применении Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF pYV-YopE1.138-(BH3 tBID)2 (фиг. 45). Данные результаты подчеркивают, что такие бактерии и их T3SS можно применять для препятствования прогрессированию опухоли, и что манипуляции с активностью VirF можно применять для модуляции активности бактериальной T3SS после введения in vivo. Более того, применение Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF Aasd pYV-asd-YopE1_138-(BH3 tBID)2 дополнительно усиливает влияние на прогрессирование опухоли (фиг. 45), подчеркивая преимущества усиленной генетической стабильности после системного введения.Experiments similar to those performed with 4T1 cells (Figs. 9 and 10) were performed in the EMT6 mouse model of breast cancer, in which wild-type Balb/C mice s.c. infused with EMT6 breast cancer cell allograft and treated with a single i.v. introduction of bacteria when the tumor reached a size of approximately 80-250 mm3. Day v.v. bacterial injections were designated as day 0, all mice received i.p. injection of Desferal one day before D0. Treatment of Y. enterocolitica with AHOPEMAT had no effect on tumor progression compared with saline. Y. enterocolitica AHOPEMAT pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2 showed a minor effect on tumor progression, which was enhanced by Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF pYV-YopE1. 138 -(BH3 tBID)2 (Fig. 45). These results highlight that such bacteria and their T3SS can be used to interfere with tumor progression, and that manipulation of VirF activity can be used to modulate bacterial T3SS activity after administration in vivo. Moreover, the use of Y. enterocolitica AHOPEMAT AHairpinI-VirF Aasd pYV-asd-YopE1_ 138 -(BH3 tBID)2 further enhances the effect on tumor progression (Fig. 45), highlighting the benefits of enhanced genetic stability after systemic administration.
Доставка триггерных белков пути RIG-1-подобного рецептора с помощью бактериальной T3SS для индукции ответа ИФН I типа.Delivery of RIG-1-like receptor pathway trigger proteins by bacterial T3SS to induce type I IFN response.
Цитозольные нуклеиновые кислоты воспринимаются рецептором, таким как члены семейства RIG1-подобного рецептора (RLR), которые обнаруживают РНК из патогена в цитозоле56. RIG-1 и MDA5 состоят из двух N-концевых доменов CARD и центрального (DExD/H) геликазного домена, воспринимающего специфичные нуклеотиды56. Связывание со стимуляторной РНК вызывает структурные перестройки в RIG-I (и MDA5), в результате которых CARD высвобождается для последующего связывания с незаякоренными связанными с К63 цепями убиквитина для образования олигомеров56 (а в случае MDA5 для образования филаментов56). Олигомеризованные домены CARD RIG-I и MDA5 взаимодействуют с доменом CARD MAVS. Данное взаимодействие стимулирует полимеризацию единичного домена CARD MAVS, которая индуцирует нижестоящую передачу сигналов, в конечном итоге приводящую к индукции генов ИФН I типа56.Cytosolic nucleic acids are sensed by a receptor such as members of the RIG1‐like receptor (RLR) family, which detect RNA from the pathogen in the cytosol 56 . RIG‐1 and MDA5 consist of two N‐terminal CARD domains and a central (DExD/H) helicase domain that senses specific nucleotides 56 . Binding to stimulatory RNA induces structural rearrangements in RIG-I (and MDA5), which release the CARD for subsequent binding to unanchored K63-linked ubiquitin chains to form oligomers 56 (and in the case of MDA5, to form filaments 56 ). The oligomerized CARD domains of RIG-I and MDA5 interact with the CARD domain of MAVS. This interaction stimulates polymerization of the single CARD domain of MAVS, which induces downstream signaling, ultimately leading to the induction of type I IFN genes 56 .
Авторы настоящего изобретения получили штаммы бактерий, экспрессирующие два N-концевых домена CARD RIG-1, полученного от человека или мыши, слитые с N-концевым бактериальным сигналом секреции для доставки с помощью T3SS, в частности, YopE1.138 (SEQ ID NO: 37 и 38). Доставку слитого белка YopE1_138 - CARD2 RIG-1 оценивали с помощью стандартного анализа секреции in vitro, и функциональность доставленных белков оценивали на репортерной линии клеток для индукции ИФН I типа. Репортерные клетки меланомы мыши B16F10 для стимуляции ИФН I типа основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки инфицировали различными количествами (МЗ) штаммов бактерий, экспрессированных из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующих белок YopE1_138 - CARD2 RIG-1. N-концевые домены CARD RIG-1 мыши и человека продемонстрировали индукцию дозозависимого ответа ИФН I типа в репортерной линии клеток (фиг. 17), в то время как фоновый штамм бактерий (Y. enterocolitica AHOPEMAT) не был способен индуцировать такой ответ (фиг. 17). Домены CARD RIG-1 человека и мыши индуцировали подобный ответ ИФН I типа на репортерной линии клеток мыши (фиг. 17), что согласуется с высокой степенью идентичности (76%) и подобия (88,5%) последовательности. Таким образом, слияние с N-концевым сигналом секреции бактерий привело к успешной доставке экспрессированных в бактериях белков YopE1_138 - CARD2 RIG-1 человека и мыши и не предотвратило фолдинг и функцию доменов CARD RIG-1 в эукариотической клетке. Это означает, что слитые с YopE домены CARD RIG1 все еще способны мультимеризоваться и индуцировать мультимеризацию MAVS, что является неожиданным.The present inventors have obtained bacterial strains expressing two N-terminal CARD domains of human or mouse-derived RIG-1 fused to an N-terminal bacterial secretion signal for delivery by a T3SS, specifically YopE 1 . 138 (SEQ ID NO: 37 and 38). Delivery of the YopE1_138 - CARD2 RIG-1 fusion protein was assessed using a standard in vitro secretion assay, and the functionality of the delivered proteins was assessed in a reporter cell line for type I IFN induction. B16F10 mouse melanoma reporter cells for type I IFN stimulation rely on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with different amounts (MO) of bacterial strains expressed from a plasmid derived from pBadMycHisA (pBad_Si2) and translocating the YopE1_ 138 - CARD2 RIG-1 protein. The N-terminal CARD domains of mouse and human RIG-1 demonstrated the induction of a dose-dependent type I IFN response in the reporter cell line (Fig. 17), while the background bacterial strain (Y. enterocolitica AHOPEMAT) was unable to induce such a response (Fig. 17). The human and mouse RIG-1 CARD domains induced a similar type I IFN response in a mouse reporter cell line (Fig. 17), consistent with a high degree of sequence identity (76%) and similarity (88.5%). Thus, fusion with the N-terminal secretion signal of bacteria led to the successful delivery of human and mouse YopE1_ 138 - CARD2 RIG-1 proteins expressed in bacteria and did not prevent the folding and function of the RIG-1 CARD domains in the eukaryotic cell. This means that RIG1 CARD domains fused to YopE are still able to multimerize and induce MAVS multimerization, which is unexpected.
В следующих экспериментах с применением данной репортерной линии клеток ИФН I типа B16F10 авторы настоящего изобретения сравнивали Y. enterocolitica AHOPEMAT с Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде (pBad_Si2) YopE1.138-MycHis или YopE1_138- 67 044058In the following experiments using this type I IFN reporter cell line B16F10, we compared Y. enterocolitica AHOPEMAT with Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid (pBad_Si2) YopE1. 138 -MycHis or YopE1_ 138 - 67 044058
CARD2Rig1 человека. Вновь доставка доменов CARD RIG-1 человека индуцировала дозозависимый ответ ИФН I типа, тогда как Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющиеCARD2Rig1 person. Again, delivery of human RIG-1 CARD domains induced a dose-dependent type I IFN response, whereas Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT delivering
YopE1.138-MycHis, не оказывали влияния на ответ ИФН I типа (фиг. 18). В этом же анализе авторы настоящего изобретения сравнивали потенциал индукции ИФН I типа бактерий, доставляющих доменыYopE1. 138 -MycHis had no effect on the type I IFN response (Fig. 18). In the same assay, we compared the type I IFN induction potential of bacteria delivering domains
CARD RIG-1, с положительным контролем, интерфероном гамма (ИФНу) мыши.CARD RIG-1, with positive control, mouse interferon gamma (IFN).
Весьма неожиданно было установлено, что бактериальная доставка доменов CARD RIG-1 была способна индуцировать максимальный ответ репортерной линии клеток, подобный ответу, полученному в положительном контроле индукции ИФН I типа, ИФНу (фиг. 18 и 19).Quite surprisingly, it was found that bacterial delivery of RIG-1 CARD domains was able to induce a maximal response in the reporter cell line, similar to that obtained in the positive control for type I IFN induction, IFNu (FIGS. 18 and 19).
В следующих экспериментах авторы настоящего изобретения инфицировали клетки рака молочной железы мыши 4Т1 или клетки меланомы B16F10 ДТ и переносили супернатант, предположительно, содержащий ИФН, через 4 ч на репортерную линию клеток ИФН I типа B16F10. Данным способом авторы настоящего изобретения сравнивали Y. enterocolitica AHOPEMAT с Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодирующим на эндогенной плазмиде вирулентности (pYV) YopE1.138 - CARD2RIG1 мыши. Доставка кодируемых pYV доменов CARD RIG-1 мыши индуцировала дозозависимый ответ ИФН I типа, тогда как Y. enterocolitica AHOPEMAT не оказывал влияния на ответ ИФН I типа на клетках B16F1O ДТ (фиг. 20) или 4Т1 (фиг. 21).In the following experiments, we infected 4T1 mouse breast cancer cells or B16F10 melanoma cells with WT and transferred the supernatant, presumably containing IFN, 4 hours later to the B16F10 type I IFN reporter cell line. In this manner, the present inventors compared Y. enterocolitica AHOPEMAT with Y. enterocolitica AHOPEMAT encoding YopE1 on an endogenous virulence plasmid (pYV). 138 - CARD2RIG1 mouse. Delivery of pYV-encoded mouse RIG-1 CARD domains induced a dose-dependent type I IFN response, whereas Y. enterocolitica AHOPEMAT had no effect on the type I IFN response in B16F1O WT (Fig. 20) or 4T1 (Fig. 21) cells.
В следующем эксперименте оценивали потенциал нескольких версий, состоящих из различных длин CARD RIG-1 мыши, индуцировать ответ ИФН I типа. Домены CARD RIG-1, как прогнозируют, кодируются аминокислотами 1-172 (последовательность мыши, Uniprot № Q6Q899). Авторы настоящего изобретения оценивали YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши, YopE1.138-домены CARD1.229 RIG1 мыши и YopE1.138-домены CARD1.218 RIG1 мыши на ИФН-репортерных клетках меланомы B16F10, а также ИФН-репортерных клетках макрофагов RAW (фиг. 27-28). Было обнаружено, что YopE1.138домены CARD1_246 RIG1 мыши, YopE1.138-домены CARD1-229 RIG1 мыши и YopE1.138-домены CARD1-218 RIG1 мыши являются в равной степени активными. В следующем эксперименте авторы настоящего изобретения оценивали биологическую активность доставленных с помощью бактерий MDA5. Авторы настоящего изобретения клонировали несколько версий, состоящих из различных длин CARD MDA5 мыши, и оценивали их биологическую активность при индукции ответа ИФН I типа на ИФН-репортерных клетках B16F10. Домены CARD MDA5, как прогнозируют, кодируются аминокислотами 1-190 (последовательность мыши, Uniprot № Q8R5F7). Авторы настоящего изобретения оценивалиThe next experiment assessed the potential of several versions consisting of different lengths of mouse RIG-1 CARD to induce a type I IFN response. The CARD domains of RIG-1 are predicted to be encoded by amino acids 1-172 (mouse sequence, Uniprot no. Q6Q899). The present inventors evaluated YopE 1 . 138 -domains CARD1-246 of mouse RIG1, YopE 1 . 138 -domains CARD1.229 of mouse RIG1 and YopE 1 . 138 CARD1 domains. 218 mouse RIG1 on B16F10 melanoma IFN reporter cells, as well as RAW macrophage IFN reporter cells (Fig. 27-28). It was found that YopE 1 . 138 domains CARD 1 _ 246 mouse RIG1, YopE 1 . 138 CARD domains 1-229 of mouse RIG1 and YopE 1 . The 138 CARD domains 1-218 of mouse RIG1 are equally active. In the next experiment, the present inventors evaluated the biological activity of bacterially delivered MDA5. We have cloned several versions consisting of different lengths of mouse MDA5 CARD and assessed their biological activity in inducing type I IFN responses in B16F10 IFN reporter cells. The CARD domains of MDA5 are predicted to be encoded by amino acids 1-190 (mouse sequence, Uniprot no. Q8R5F7). The inventors of the present invention have evaluated
YopE1.138-домены CARD1.294 MDA5 мыши и YopE1.138-домены CARD1.231 MDA5 мыши на ИФНрепортерных клетках меланомы B16F10. Было обнаружено, что все варианты являются активными (фиг. 29). Неожиданно было обнаружено, что активность доставленных CARD MDA5 была гораздо менее высокой, чем CARD RIG-1, даже несмотря на то, что белки характеризовались весьма подобной биологической функцией и структурой белка, состоящей из двух N-концевых доменов CARD и центрального (DExD/H) геликазного домена, воспринимающего специфичные нуклеотиды56.YopE 1 . 138 -domains CARD1.294 of mouse MDA5 and YopE 1 . 138 -domains of mouse CARD1.231 MDA5 on IFN reporter B16F10 melanoma cells. All variants were found to be active (FIG. 29). Surprisingly, it was found that the activity of the delivered MDA5 CARDs was much less high than the RIG-1 CARDs, even though the proteins had very similar biological function and a protein structure consisting of two N-terminal CARD domains and a central (DExD/H ) helicase domain that senses specific nucleotides 56 .
Доставка триггерных белков пути cGAS/STING с помощью бактериальной T3SS для индукции ответа ИФН I типа.Delivery of cGAS/STING pathway trigger proteins by bacterial T3SS to induce type I IFN response.
В пути cGAS/STING цитозольная двухцепочечная ДНК обнаруживается в результате связывания с ферментом циклической ГМФ-АМФ синтазой (cGAS). После связывания с дсДНК (двухспиральной ДНК) cGAS активируется и продуцирует второй мессенджер-циклический динуклеотид, циклический ГМФ-АМФ (цГАМФ). цГАМФ напрямую связывается с рецепторным белком эндоплазматического ретикулума STING (Stimulator of IFN Genes, стимулятор генов ИФН). После связывания с цГАМФ STING активируется и индуцирует путь передачи сигналов, приводящий к транскрипции ИФН I типа и других корегулируемых генов57. CGAS человека продуцирует 2',3'-цГАМФ (содержащий 2'-5' и 3'-5' фосфодиэфирные связи), однако было показано, что другие циклические динуклеотиды способны индуцировать STING мыши или человека на различных уровнях. Такие циклические динуклеотиды включают 3',3'цГАМФ (например, продуцируемый DncV Vibrio cholera или некоторыми эукариотическими cGAS), циклический ди-АМФ (например, продуцируемый CdaA или DisA различных грамположительных видов) или циклический ди-ГМФ (например, продуцируемый WspR Pseudomonas aeruginosa)57,58. В то время как STING человека ДТ (и STING мыши) распознает 2',3'-цГАМФ, 3',3'-цГАМФ, циклический диАМФ и циклический ди-ГМФ, некоторые природные варианты STING человека отвечают на данные агонисты различным образом59. Для активации пути cGAS/STING после доставки белков бактериями авторы настоящего изобретения клонировали подлежащий экспрессии WspR P. aeruginosa, продуцирующий циклический ди-ГМФ, и доставляли с использованием Y. enterocolitica с помощью T3SS. Для увеличения активности WspR применяли только его домен GGDEF (дигуанилатциклазный домен), и домен стебля, расположенный в направлении 3'-5', заменяли мотивом лейциновой молнии GCN4 из дрожжей. Известно, что для проявления активности WspR необходима димеризация, и было продемонстрировано, что лейциновая молния GCN4 образует параллельные двойные спирали и, таким образом, выступает в качестве мощного модуля демеризации. Мотив GCN4 был слит с доменом GGDEF WspR, включая природный линкер между GGDEF и спиральным стеблем, чтобы обеспечить междоменную гибкость, сравнимую с WspR дикого типа60.In the cGAS/STING pathway, cytosolic double-stranded DNA is found through binding to the enzyme cyclic GMP-AMP synthase (cGAS). After binding to dsDNA (double-stranded DNA), cGAS is activated and produces a second messenger cyclic dinucleotide, cyclic GMP-AMP (cGAMP). cGAMP directly binds to the endoplasmic reticulum receptor protein STING (Stimulator of IFN Genes, stimulator of IFN genes). Upon binding to cGAMP, STING is activated and induces a signal transduction pathway leading to the transcription of type I IFN and other coregulated genes 57 . Human CGAS produces 2',3'-cGAMP (containing 2'-5' and 3'-5' phosphodiester linkages), but other cyclic dinucleotides have been shown to induce mouse or human STING at varying levels. Such cyclic dinucleotides include 3',3'cGAMP (e.g., produced by Vibrio cholera DncV or some eukaryotic cGAS), cyclic di-AMP (e.g., produced by CdaA or DisA of various Gram-positive species), or cyclic di-GMP (e.g., produced by Pseudomonas aeruginosa WspR ) 57.58 . While human WT STING (and mouse STING) recognizes 2′,3′‐cGAMP, 3′,3′‐cGAMP, cyclic diAMP and cyclic di‐GMP, some natural variants of human STING respond differently to these agonists 59 . To activate the cGAS/STING pathway after bacterial delivery of proteins, we cloned the expressible cyclic di-GMP-producing P. aeruginosa WspR and delivered it to Y. enterocolitica via T3SS. To increase the activity of WspR, only its GGDEF domain (diguanylate cyclase domain) was used, and the stem domain located in the 3′-5′ direction was replaced with the leucine zipper motif GCN4 from yeast. Dimerization is known to be required for WspR activity to occur, and the leucine zipper GCN4 has been demonstrated to form parallel double helices and thus act as a potent demerization module. The GCN4 motif was fused to the GGDEF domain of WspR, including a natural linker between GGDEF and the helical stem, to provide interdomain flexibility comparable to wild-type WspR 60 .
- 68 044058- 68 044058
Доставку слитого белка YopE1-138 - лейциновая молния GCN4 - домен GGDEF WspR (сокращенно: YopE1-138 - WspR) (SEQ ID NO: 39) оценивали на репортерной линии клеток для индукции ИФН I типа. Репортерные клетки меланомы мыши B16F10 для стимуляции ИФН I типа основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки инфицировали различными количествами (МЗ) штаммов бактерий, экспрессированных из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующих белок YopE1-138 - WspR. Домен GGDEF WspR P. aeruginosa, слитый с мотивом лейциновой молнии GCN4, продемонстрировал дозозависимую индукцию ответа ИФН I типа в репортерной линии клеток (фиг. 22), в то время как фоновый штамм бактерий (Y. enterocolitica AHOPEMAT) не был способен индуцировать такой ответ (фиг. 22). Таким образом, слияние с N-концевым сигналом секреции бактерий привело к успешной доставке экспрессированного в бактериях белка YopE1-138 - лейциновая молния GCN4 (дрожжи) - GGDEF WspR (P. aeruginosa) и не предотвратило фолдинг и функцию данного состоящего из трех частей белка в эукариотической клетке. Это означает, что слитые с YopE лейциновая молния GCN4 - GGDEF WspR все еще способны димеризоваться и, таким образом, приводить к получению активных доменов GGDEF, что является неожиданным.Delivery of the YopE1-138 -leucine zipper GCN4-GGDEF domain WspR (abbreviated: YopE 1-138 -WspR) fusion protein (SEQ ID NO: 39) was assessed in a reporter cell line for the induction of type I IFN. B16F10 mouse melanoma reporter cells for type I IFN stimulation rely on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with different amounts (MO) of bacterial strains expressed from a plasmid derived from pBadMycHisA (pBad_Si2) and translocating the YopE1-138 -WspR protein. The GGDEF domain of P. aeruginosa WspR fused to the leucine zipper motif of GCN4 demonstrated dose-dependent induction of a type I IFN response in the reporter cell line (Fig. 22), while the background bacterial strain (Y. enterocolitica AHOPEMAT) was unable to induce such a response. (Fig. 22). Thus, fusion with the N-terminal secretion signal of bacteria led to the successful delivery of the bacterially expressed protein YopE1-138 -leucine zipper GCN4 (yeast)-GGDEF WspR (P. aeruginosa) and did not prevent the folding and function of this three-part protein in eukaryotic cell. This means that YopE leucine zipper fused GCN4 - GGDEF WspRs are still able to dimerize and thus result in active GGDEF domains, which is unexpected.
Для следующих экспериментов авторы настоящего изобретения клонировали DncV V. cholerae (продуцирующий 3',3'-цГАМФ)57, DisA-подобный белок Bacillus cereus (продуцирующий циклический ди-АМФ)61 и cGAS эукариотического анемона (Nematostella vectensis) (продуцирующий 3',3'-цГАМФ)57, которые, как сообщалось, являются активными при отсутствии внешних стимулов, для экспрессии и транслокации бактериями. Циклазы типа DisA обычно образуют октамеры61, которые могут быть не совместимыми с N-концевым слиянием YopE и бактериальной доставкой. DisA-подобный белок В. cereus (код PDB 2fb5) идентифицировали на основании структурного подобия диаденилатциклазному (DAC) домену классических белков DisA 61, но, что примечательно, в нем отсутствуют все спирали, которые, как известно для других белков DisA, необходимы для мультимеризации. Авторы настоящего изобретения, таким образом, решили использовать преимущество предположительно мономерного активного DisA-подобного белка из В. cereus (код PDB 2fb5; остатки 76-205).For the following experiments, we cloned V. cholerae DncV (producing 3′,3′-cGAMP) 57 , Bacillus cereus DisA-like protein (producing cyclic di-AMP) 61 and eukaryotic anemone (Nematostella vectensis) cGAS (producing 3′, 3'-cGAMP) 57 , which have been reported to be active in the absence of external stimuli for expression and translocation by bacteria. DisA-type cyclases typically form octamers 61 which may be incompatible with N-terminal YopE fusion and bacterial delivery. The B. cereus DisA-like protein (PDB code 2fb5) was identified based on structural similarity to the diadenylate cyclase (DAC) domain of classical DisA proteins 61, but notably lacks all of the helices that other DisA proteins are known to require for multimerization . The present inventors therefore decided to take advantage of the putatively monomeric active DisA-like protein from B. cereus (PDB code 2fb5; residues 76-205).
Доставку слитого белка YopE1-138 - DncV V. cholerae (SEQ ID NO: 41), YopE1-138 - DisA-подобный белок В. cereus (SEQ ID NO: 42) и YopE1-138 - cGAS анемона (SEQ ID NO: 43) оценивали на репортерной линии клеток для индукции ИФН I типа. Репортерные клетки меланомы мыши B16F10 для стимуляции ИФН I типа основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки инфицировали различными количествами (МЗ) штаммов бактерий, экспрессированных из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующих YopE1-138 DncV V. cholerae, YopE1-138 - DisA-подобный белок В. cereus и YopE1-138 - cGAS анемона. YopE1-138 - DncV V. cholerae, YopE1-138 - DisA-подобный белок В. cereus и YopE1-138- cGAS анемона все продемонстрировали дозозависимую индукцию ответа ИФН I типа в репортерной линии клеток (фиг. 23), в то время как фоновый штамм бактерий (Y. enterocolitica AHOPEMAT) или Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющий YopE1-138-MycHis, не были способны индуцировать такой ответ (фиг. 23). cGAS анемона (Nematostella vectensis), продуцирующий 3',3'-цГАМФ, продемонстрировал наивысшую активность, вместе с тем было обнаружено, что DncV V. cholerae (продуцирующий 3',3'-цГАМФ) и DisA-подобный белок Bacillus cereus (продуцирующий циклический ди-АМФ) активируют ответ ИФН I типа в аналогичной степени.Delivery of V. cholerae YopE1- 138 - DncV fusion protein (SEQ ID NO: 41), B. cereus YopE1- 138 - DisA-like protein (SEQ ID NO: 42) and YopE1- 138 - anemone cGAS (SEQ ID NO: 43 ) was assessed in a reporter cell line for type I IFN induction. B16F10 mouse melanoma reporter cells for type I IFN stimulation rely on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with different quantities (MZ) of bacterial strains expressed from a pBadMycHisA-derived plasmid (pBad_Si2) and translocating YopE 1-138 DncV V. cholerae, YopE1-138 - DisA-like protein of B. cereus and YopE1- 138 - anemone cGAS. V. cholerae YopE1-138 -DncV, B. cereus YopE1-138 -DisA-like protein, and anemone YopE1-138 -cGAS all demonstrated dose-dependent induction of a type I IFN response in a reporter cell line (Fig. 23), while background strain of bacteria (Y. enterocolitica AHOPEMAT) or Y. enterocolitica AHOPEMAT delivering YopE1-138 - MycHis were not able to induce such a response (Fig. 23). Anemone (Nematostella vectensis) cGAS, which produces 3',3'-cGAMP, showed the highest activity, while DncV of V. cholerae (producing 3',3'-cGAMP) and DisA-like protein of Bacillus cereus (producing cyclic di-AMP) activate the type I IFN response to a similar extent.
Таким образом, слияние с N-концевым сигналом секреции бактерий привело к успешной доставке экспрессированных в бактериях белков YopE1-138 - DncV V. cholerae, YopE1-138 - DisA-подобный белок В. cereus и YopE1-138 - cGAS анемона и не предотвратило фолдинг и функцию данных белков в эукариотической клетке, что не могло быть предсказано.Thus, fusion with the N-terminal secretion signal of bacteria led to the successful delivery of the bacterially expressed proteins YopE1-138-DncV V. cholerae, YopE1-138 -DisA- like protein B. cereus and YopE1-138 -cGAS anemone and did not prevent folding and the function of these proteins in a eukaryotic cell, which could not be predicted.
В качестве альтернативы, IRF3 мыши, центральный фактор транскрипции, функционирующий ниже RLR- или cGAS/STING-зависимой передачи сигналов 62, клонировали для экспрессии и транспортирования бактериями. При отсутствии активации IRF-3 находится в латентной конформации в цитоплазме. Только после активации вышестоящих рецепторов, таких как RIG-1, MDA5 или STING, IRF-3 фосфорилируется посредством TBK1 и IKKε и, таким образом, активируется. Фосфорилирование IRF-3 приводит к димеризации, транслокации в ядро и связыванию с коактиваторами62. Для получения конститутивно активной версии IRF3 авторы настоящего изобретения заменили один из наиболее важных сайтов фосфорилирования (Ser397 в IRF3 мыши) на Asp 62. Доставку слитого белка YopE1-138 - IRF3 Ser397Asp мыши (SEQ ID NO: 40) оценивали в анализе секреции in vitro, в котором искусственно индуцировали секрецию белка в окружающую жидкость. После преципитации белка с помощью трихлоруксусной кислоты для определения секретированных количеств белка применяли анализ методом вестерн-блоттинга с антителом против YopE (фиг. 24). Хотя штаммы АНОРЕМТ, кодирующие YopE1-138 - BH3 tBID мыши, привели к получению мощной полосы в секретированной фракции (на уровне 15-20 кДа), было обнаружено, что также, хотя и в меньшей степени, секретируется YopE1-138 - IRF3 Ser397Asp мыши (на уровне 50-75 Да) (фиг. 24). Анализ суммарной фракции бактериальных клеток выявил, что уровни экспрессии YopE1-138 - BH3 tBID мыши и YopE1-138 - IRF3 Ser397Asp мыши являются сопоставимыми, хотя дляAlternatively, mouse IRF3, a central transcription factor that functions downstream of RLR‐ or cGAS/STING‐dependent signaling 62 , has been cloned for expression and transport in bacteria. In the absence of activation, IRF-3 resides in a latent conformation in the cytoplasm. Only after activation of upstream receptors such as RIG-1, MDA5 or STING, IRF-3 is phosphorylated by TBK1 and IKKε and thus activated. Phosphorylation of IRF‐3 leads to dimerization, nuclear translocation and binding to coactivators 62 . To obtain a constitutively active version of IRF3, we replaced one of the most important phosphorylation sites (Ser397 in mouse IRF3) with Asp 62 . Delivery of the mouse YopE1-138 -IRF3 Ser397Asp fusion protein (SEQ ID NO: 40) was assessed in an in vitro secretion assay in which secretion of the protein into the surrounding fluid was artificially induced. After protein precipitation with trichloroacetic acid, Western blot analysis with anti-YopE antibody was used to determine secreted amounts of protein (FIG. 24). Although ANOREMT strains encoding mouse YopE1-138 -BH3 tBID resulted in a strong band in the secreted fraction (at 15-20 kDa), mouse YopE1-138 -IRF3 Ser397Asp was also found to be secreted, although to a lesser extent. (at the level of 50-75 Da) (Fig. 24). Analysis of the total fraction of bacterial cells revealed that the expression levels of mouse YopE1-138 -BH3 tBID and mouse YopE1-138 -IRF3 Ser397Asp are comparable, although for
- 69 044058- 69 044058
YopE1-138 - IRF3 Ser397Asp мыши наблюдался паттерн полос деградации (фиг. 24)Mouse YopE1-138 -IRF3 Ser397Asp showed a degradation band pattern (Figure 24)
Доставка триггерных белков путей cGAS/STING и RIG-1-подобного рецептора с помощью бактериальной T3SS для индукции ответа ИФН I типа в иммунных клетках.Delivery of cGAS/STING and RIG-1-like receptor pathway trigger proteins via bacterial T3SS to induce type I IFN responses in immune cells.
Доставку слитого белка YopE1-138 - CARD2 RIG-1 мыши, YopE1-138 - DncV V. cholerae, YopE1-138 DisA-подобный белок В. cereus и YopE1-138 - cGAS анемона оценивали на иммунной репортерной линии клеток для индукции ИФН I типа.Delivery of mouse YopE1- 138 - CARD2 RIG-1 fusion protein, YopE 1-138 - V. cholerae DncV, B. cereus YopE 1-138 DisA-like protein and anemone YopE1- 138 - cGAS fusion protein was assessed in an immune reporter cell line for IFN induction Type I
Репортерные клетки макрофагов RAW264.7 мыши для стимуляции ИФН I типа были основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки инфицировали различными количествами (МЗ) штаммов бактерий, экспрессированных из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующих YopE1-138- CARD2RIG-1 мыши, YopE1.138-DncV V. cholerae, YopE1-138 - DisA-подобный белок В. cereus и YopE1-138- cGAS анемона. YopE1138- CARD2RIG-1 мыши, YopE1-138 - DncV V. cholerae и YopE1-138- cGAS анемона все продемонстрировали дозозависимую индукцию ответа ИФН I типа на данной иммунной репортерной линии клеток (фиг. 25), в то время как фоновый штамм бактерий (Y. enterocolitica AHOPEMAT) не был способен индуцировать такой ответ (фиг. 25). YopE1-138 - CARD2 RIG-1 мыши продемонстрировал наивысшую активность, за ним следовали cGAS анемона (Nematostella vectensis), продуцирующий 3',3-цГАМФ, и DncV V. cholerae (продуцирующий 3',3'-цГАМФ). Было обнаружено, что DisA-подобный белок Bacillus cereus (продуцирующий циклический ди-АМФ) лишь слабо активировал ответ ИФН I типа.Mouse RAW264.7 macrophage reporter cells for type I IFN stimulation were based on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with different amounts (MO) of bacterial strains expressed from a pBadMycHisA-derived plasmid (pBad_Si2) and translocating mouse YopE1-138 -CARD 2 RIG-1, YopE1. 138 -DncV of V. cholerae, YopE1- 138 - DisA-like protein of B. cereus and YopE1- 138 - cGAS of anemone. Mouse YopE1-138 -CARD2RIG-1, V. cholerae YopE1-138 -DncV, and anemone YopE1-138 -cGAS all demonstrated dose-dependent induction of a type I IFN response in this immune reporter cell line (Fig. 25), while the background bacterial strain (Y. enterocolitica AHOPEMAT) was not able to induce such a response (Fig. 25). Mouse YopE1- 138 - CARD2 RIG-1 showed the highest activity, followed by anemone (Nematostella vectensis) cGAS producing 3′,3-cGAMP and V. cholerae DncV (producing 3′,3′-cGAMP). The Bacillus cereus DisA-like protein (producing cyclic di-AMP) was found to only weakly activate the type I IFN response.
Для следующих экспериментов авторы настоящего изобретения клонировали аминокислоты 161522 cGAS человека (Uniprot № Q8N884 и SEQ ID NO: 115; продуцирующий 2',3'-цГАМФ)57 для экспрессии и транслокации бактериями. Репортерные клетки меланомы мыши B16F10 и макрофаги мыши RAW для стимуляции ИФН I типа были основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки были инфицированы различными количествами (МЗ) штаммов бактерий, экспрессированных из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующих YopE1-138 - cGAS161-522 человека, и продемонстрировали дозозависимую индукцию ответа ИФН I типа в репортерной линии клеток, так же как штамм бактерий, экспрессированный из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующий YopE1_138 - cGAS анемона, YopE1_138 - CGAS60.422 анемона, YopE1-138 - CdaA101-273 Listeria, YopE1-138- DncV V. cholerae или YopE1-138 DisA-подобный белок В. cereus (фиг. 32-33). Наиболее мощная активация наблюдалась для YopE1_138 cGAS161-522 человека, за ним следовали YopE1-138 - cGAS анемона, YopE1-138 - CGAS60-422 анемона. Интересно отметить, что наиболее короткий вариант cGAS60_422 анемона был незначительно более активным. YopEi.i38 - CdaA101-273 Listeria, YopE1_138 - DncV V. cholerae или YopE1_138 - DisA-подобный белок В. cereus также демонстрировали дозозависимую активацию ИФН, хотя и в меньшей степени, чем белки cGAS (фиг. 32-33).For the following experiments, we cloned human cGAS amino acids 161522 (Uniprot No. Q8N884 and SEQ ID NO: 115; producing 2',3'-cGAMP) 57 for expression and translocation in bacteria. B16F10 mouse melanoma reporter cells and RAW mouse macrophages for type I IFN stimulation were based on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with varying numbers (MO) of bacterial strains expressed from a pBadMycHisA-derived plasmid (pBad_Si2) and translocating human YopE1- 138 - cGAS 161 - 522 , and demonstrated a dose-dependent induction of a type I IFN response in the reporter cell line, as well as strain bacteria, expressed from a plasmid derived from pBadMycHisA (pBad_Si2) and translocating YopE1_ 138 - cGAS anemone, YopE1_ 138 - CGAS 60 .4 22 anemone, YopE1- 138 - CdaA 101 - 273 Listeria, YopE1- 138 - DncV V. cholerae or Y opE1- 138 DisA-like protein of B. cereus (Fig. 32-33). The most powerful activation was observed for human YopE1_ 138 cGAS 161 - 522 , followed by anemone YopE1- 138 - cGAS, anemone YopE1- 138 - CGAS 60 - 422 . It is interesting to note that the shortest anemone cGAS 60_422 variant was marginally more active . YopEi.i3 8 - CdaA 101 - 273 Listeria, YopE1_ 138 - DncV V. cholerae or YopE1_ 138 - DisA-like protein of V. cereus also showed dose-dependent activation of IFN, although to a lesser extent than cGAS proteins (Fig. 32-33 ).
Доставка MAVS с помощью бактериальной T3SS для индукции ответа ИФН I типа.Delivery of MAVS by a bacterial T3SS to induce type I IFN response.
Цитозольные нуклеиновые кислоты воспринимаются рецептором, таким как члены семейства RIG1-подобного рецептора (RLR), которые обнаруживают РНК из патогена в цитозоле56. RIG-1 и MDA5 состоят из двух N-концевых доменов CARD и центрального (DExD/H) геликазного домена, воспринимающего специфичные нуклеотиды56. Связывание со стимуляторной РНК вызывает структурные перестройки в RIG-I (и MDA5), которые высвобождают CARD для последующего связывания с незаякоренными связанными с K63 цепями убиквитина для образования олигомеров56 (а в случае MDA5 - для образования филаментов56). Олигомеризованные домены CARD RIG-I и MDA5 взаимодействуют с доменом CARD MAVS. Данное взаимодействие стимулирует полимеризацию единичного домена CARD MAVS, которая индуцирует нижестоящую передачу сигналов, в конечном итоге приводящую к индукции генов ИФН I типа56.Cytosolic nucleic acids are sensed by a receptor such as members of the RIG1‐like receptor (RLR) family, which detect RNA from the pathogen in the cytosol 56 . RIG‐1 and MDA5 consist of two N‐terminal CARD domains and a central (DExD/H) helicase domain that senses specific nucleotides 56 . Binding to stimulatory RNA induces structural rearrangements in RIG-I (and MDA5) that release the CARD for subsequent binding to unanchored K63-linked ubiquitin chains to form oligomers 56 (and in the case of MDA5, to form filaments 56 ). The oligomerized CARD domains of RIG-I and MDA5 interact with the CARD domain of MAVS. This interaction stimulates polymerization of the single CARD domain of MAVS, which induces downstream signaling, ultimately leading to the induction of type I IFN genes 56 .
Авторы настоящего изобретения получили штаммы бактерий (на основе Y. enterocolitica AHOPEMAT), экспрессирующие N-концевые домены CARD MAVS, полученные от человека, слитые с N-концевым бактериальным сигналом секреции для доставки с помощью T3SS, в частности, YopE1-138. Доставку слитого белка YopE1_138 - CARD MAVS оценивали с помощью стандартного анализа секреции in vitro, и функциональность доставленных белков оценивали на репортерной линии клеток для индукции ИФН I типа. Репортерные клетки меланомы мыши B16F10 и макрофаги мыши RAW для стимуляции ИФН I типа были основаны на активности секретированной щелочной фосфатазы, находящейся под контролем промотора I-ISG54, который состоит из ИФН-индуцибельного промотора ISG54, усиленного мультимерным ISRE. Репортерные клетки инфицировали различными количествами (МЗ) Y. enterocolitica AHOPEMAT, экспрессированного из полученной из pBadMycHisA плазмиды (pBad_Si2) и транслоцирующего белок YopE1-138 - CARD MAVS человека. N-концевой домен CARD MAVS мыши продемонстрировал дозозависимую индукцию ответа ИФН I типа в репортерной линии клеток (фиг. 30-31), в то время как фоновый штамм бактерий (Y. enterocolitica AHOPEMAT) не был способен индуцировать такой ответ (фиг. 30-31). cGAS человека и домены CARD RIG-1 мыши индуцировали ответ ИФН I типа анало- 70 044058 гичным образом на репортерных линиях клеток мыши (фиг. 30-31), причем RIG-1 демонстрировал наивысший потенциал активации, за ним следовали MAVS и cGAS. Таким образом, слияние с N-концевым сигналом секреции бактерий привело к успешной доставке экспрессированного в бактериях белка YopE1_ 138 - CARD MAVS человека и не предотвратило фолдинг и функцию домена CARD MAVS в эукариотической клетке. Это означает, что слитый с YopE домен CARD MAVS все еще способен мультимеризоваться и индуцировать мультимеризацию MAVS, что является неожиданным. Еще более неожиданным является то, что было показано, что только CARD MAVS был неспособен индуцировать нижестоящую передачу сигналов ИФН 64, после чего авторы настоящего изобретения обнаружили, что слитый с YopE домен CARD MAVS мощно активирует путь ИФН I типа.The present inventors have obtained bacterial strains (based on Y. enterocolitica AHOPEMAT) expressing human-derived N-terminal CARD domains of MAVS fused to an N-terminal bacterial secretion signal for delivery via T3SS, specifically YopE1-138 . Delivery of the YopE1_ 138 - CARD MAVS fusion protein was assessed using a standard in vitro secretion assay, and the functionality of the delivered proteins was assessed in a reporter cell line for type I IFN induction. B16F10 mouse melanoma reporter cells and RAW mouse macrophages for type I IFN stimulation were based on secreted alkaline phosphatase activity under the control of the I-ISG54 promoter, which consists of the IFN-inducible ISG54 promoter enhanced by a multimeric ISRE. Reporter cells were infected with varying amounts (MZ) of Y. enterocolitica AHOPEMAT, expressed from a pBadMycHisA-derived plasmid (pBad_Si2) and translocating the human YopE1-138 -CARD MAVS protein. The N-terminal CARD domain of mouse MAVS demonstrated a dose-dependent induction of a type I IFN response in a reporter cell line (Figures 30-31), while the background bacterial strain (Y. enterocolitica AHOPEMAT) was unable to induce such a response (Figures 30-31). 31). Human cGAS and mouse RIG-1 CARD domains induced type I IFN responses in a similar manner in mouse reporter cell lines (FIGS. 30-31), with RIG-1 showing the highest activation potential, followed by MAVS and cGAS. Thus, fusion with the N-terminal secretion signal of bacteria led to the successful delivery of the human YopE1_ 138 - CARD MAVS protein expressed in bacteria and did not prevent the folding and function of the CARD MAVS domain in the eukaryotic cell. This means that the MAVS CARD domain fused to YopE is still able to multimerize and induce MAVS multimerization, which is unexpected. Even more surprisingly, it was shown that CARD MAVS alone was unable to induce downstream IFN signaling 64 , whereupon we discovered that the YopE fusion domain of CARD MAVS potently activates the type I IFN pathway.
Более того, было продемонстрировано, что С-концевой трансмембранный домен MAVS является существенным для функционирования MAVS после трансфекции ДНК, и было продемонстрировано, что домен CARD MAVS сам по себе является неактивным при экспрессии из трансфицированных конструкций ДНК 66. Более того, было продемонстрировано, что CARD MAVS, слитый с трансмембранной областью, которая обладает способностью при экспрессии из трансфицированной ДНК или в виде очищенного белка активировать ответ ИФН I типа64,66, зависел от эндогенных MAVS, агрегацию и, таким образом, активацию которых он начинал64. Авторы настоящего изобретения с применением линии клеток MAVS КО смогли продемонстрировать (фиг. 52), что доставленный бактериями слитый с YopE CARD MAVS является активным без эндогенных MAVS, присутствующих на митохондриях. То, что CARD MAVS, слитый с YopE, способен мультимеризоваться и активировать нижестоящие партнеры без трансмембранного домена и, более того, без эндогенных MAVS, является неожиданным.Moreover, the C‐terminal transmembrane domain of MAVS has been demonstrated to be essential for MAVS function following DNA transfection, and the CARD domain of MAVS itself has been demonstrated to be inactive when expressed from transfected DNA constructs 66 . Moreover, it was demonstrated that the CARD of MAVS fused to a transmembrane region, which has the ability, when expressed from transfected DNA or as a purified protein, to activate the type I IFN response 64,66 , was dependent on endogenous MAVS for aggregation and thus activation he started 64 . The present inventors, using the MAVS KO cell line, were able to demonstrate (FIG. 52) that bacterially delivered YopE CARD fused MAVS is active without endogenous MAVS present on mitochondria. That CARD MAVS fused to YopE is able to multimerize and activate downstream partners without a transmembrane domain and, furthermore, without endogenous MAVS is unexpected.
Сравнительный анализ с низкомолекулярным агонистом STING с целью индукции ответа ИФН I типа in vitro.Comparative analysis with a small molecule STING agonist to induce a type I IFN response in vitro.
Циклические динуклеотиды представляют собой хорошо известные агонисты пути STING, приводящие к нижестоящей индукции передачи сигналов ИФН I типа. Агонисты STING были описаны в литературе59 и, как было обнаружено, они, главным образом, воздействуют на иммунные клетки, причем наивысшая активность была продемонстрирована на дендритных клетках59. Передача сигналов RLR, напротив, как было обнаружено, экспрессируется более повсеместно63. Авторы настоящего изобретения, таким образом, сравнивали бактерии Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющие ферменты, которые образуют циклические динуклеотиды (YopE1_138-cGAS анемона и YopE1-138-cGAS человека), или бактерии, доставляющие YopE1.138-домены CARD1_218 RIG1 мыши, с низкомолекулярным агонистом STING 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp) (подобен ADU-S100 от компании Aduro Biotech) на иммунных клетках (ИФНрепортерные клетки макрофаги RAW) и неиммунных клетках (ИФН-репортерные клетки меланомы B16F1) в отношении интерферон-индуцирующего потенциала. На иммунных клетках аналогичный активирующий потенциал наблюдался для низкомолекулярного агониста STING 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp) и всех трех исследованных штаммов бактерий, доставляющих белок (YopE1-138-cGAS анемона, YopE1-138cGAS человека или YopE1.138-домены CARD1.218RIG1 мыши), в то время как бактерии Y. enterocolitica AHOPEMAT, не доставляющие белок, продемонстрировали весьма слабый активирующий потенциал (фиг. 34-37). На неиммунных клетках (раковые клетки, меланома) доставленные бактериями YopE1_138домены CARD1_218 RIG1 мыши, доставленные бактериями YopE1_138-cGAS анемона и YopE1_138-cGAS человека работали в равной степени хорошо и практически превосходили низкомолекулярный агонист STING, что подчеркивает более повсеместное присутствие RLR по сравнению со STING (фиг. 34-37).Cyclic dinucleotides are well-known agonists of the STING pathway, leading to downstream induction of type I IFN signaling. STING agonists have been described in the literature 59 and have been found to primarily act on immune cells, with the highest activity demonstrated on dendritic cells 59 . RLR signaling, in contrast, has been found to be more ubiquitously expressed 63 . The present inventors thus compared Y. enterocolitica AHOPEMAT bacteria delivering enzymes that form cyclic dinucleotides (anemone YopE1_ 138 -cGAS and human YopE 1 - 138 -cGAS) or bacteria delivering YopE 1 . 138 -domains CARD1_ 218 RIG1 mouse, with low molecular weight agonist STING 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp) (similar to ADU-S100 from Aduro Biotech) on immune cells (IFN reporter cells RAW macrophages) and non-immune cells (IFN-reporter melanoma B16F1 cells) regarding interferon-inducing potential. On immune cells, a similar activating potential was observed for the low-molecular-weight STING agonist 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp) and all three studied protein-delivering bacterial strains (YopE 1 - 138 -cGAS anemone, YopE 1 - 138 human cGAS or YopE 1 . 138 domains of mouse CARD1. 218 RIG1), while the bacteria Y. enterocolitica AHOPEMAT, which do not deliver the protein, showed a very weak activating potential (Fig. 34-37). On non-immune cells (cancer cells, melanoma), bacteria-delivered mouse YopE1_ 138 CARD1_ 218 RIG1 domains, bacteria-delivered anemone YopE1_ 138 -cGAS and human YopE1_ 138 -cGAS performed equally well and were virtually superior to the small molecule STING agonist, highlighting the more ubiquitous presence of RLRs compared to STING (Figs. 34-37).
Строгая зависимость от T3SS доставленных бактериями доменов CARD RIG1 или CARD MAVS.Strict T3SS dependence of bacterially delivered CARD domains RIG1 or CARD MAVS.
Для доказательства строго зависимого от T3SS транспортирования делетировали один из белков T3SS, образующий транслокационную пору в мембране эукариотической клетки (YopB). Потенциал таких бактерий с делетированным yopB (называемых Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB), экспрессирующих YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши или YopE1_138 - CARD1_100 MAVS человека, оценивали на ИФН-репортерной линии клеток макрофагов RAW и сравнивали с экспрессирующими yopB бактериями Y. enterocolitica AHOPEMAT, также экспрессирующими YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши или YopE1_138 - CARD1_100 MAVS человека (фиг. 38). Хотя бактерии с yopB дикого типа, экспрессирующие YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши или YopE1.138-CARD1.100 MAVS человека, демонстрировали дозозависимую активацию ответа ИФН I типа, штаммы с делетированным yopB, экспрессирующие эти же белки, были неспособны индуцировать такой ответ выше фонового уровня, обусловленного фоновым штаммом бактерий, который не экспрессировал белок, подлежащий доставке (фиг. 38). Это подтверждает, что YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши или YopE1-138 - CARD1-100 MAVS человека оба транспортировались через иглу T3SS в эукариотические клетки-мишени.To prove strictly T3SS-dependent transport, one of the T3SS proteins that forms the translocation pore in the eukaryotic cell membrane (YopB) was deleted. The potential of such yopB-deleted bacteria (referred to as Y. enterocolitica AHOPEMAT-yopB) expressing YopE 1 . The 138 -domains of mouse CARD1_ 246 RIG1 or human YopE1_ 138 - CARD1_ 100 MAVS were assessed in the IFN-reporter macrophage cell line RAW and compared with the yopB-expressing bacteria Y. enterocolitica AHOPEMAT, which also expresses YopE 1 . 138 - domains CARD 1-246 of mouse RIG1 or YopE1_ 138 - CARD1_ 100 of human MAVS (Fig. 38). Although bacteria with wild-type yopB expressing YopE 1 . 138 -domain CARD1_ 246 mouse RIG1 or YopE1.138-CARD1.100 human MAVS demonstrated dose-dependent activation of the type I IFN response, yopB-deleted strains expressing these same proteins were unable to induce such a response above the background level due to the background bacterial strain, which did not express the protein to be delivered (Fig. 38). This confirms that YopE 1 . The 138 -domains of mouse CARD1-246 RIG1 or human YopE1- 138 -CARD1-100 MAVS were both transported through the T3SS needle into eukaryotic target cells.
Индукция ответа ИФН I типа в неочищенном изоляте опухоли/Induction of type I IFN response in a crude tumor isolate/
Для подтверждения того, что ответ ИФН I типа можно инициировать в микроокружении опухоли, авторы настоящего изобретения проводили анализ на неочищенных изолятах опухоли, инфицированных ex vivo штаммами бактерий, с последующим анализом интерферона бета методом ELISA. Мышей Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6 умерщвляли, когда опухоль достигала объема. Опухоли растирали, расщепляли и высевали в виде суспензии отдельных клеток на 24To confirm that the type I IFN response can be initiated in the tumor microenvironment, we analyzed crude tumor isolates infected ex vivo with bacterial strains, followed by interferon beta ELISA. Wild-type Balb/C mice with s.c. allograft EMT6 breast cancer cells were killed when the tumor reached volume. Tumors were ground, split and seeded as a suspension of individual cells for 24
- 71 044058 луночных планшетах. Такие клетки от двух различных опухолей оставляли неинфицированными (пунктирные линии на фиг. 39) или инфицировали Y. enterocolitica AHOPEMAT или Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодируемым на полученной из pBadMycHisA плазмиде YopE1.138-домены CARD1_246 RIG1 мыши. Стимуляцию ИФН оценивали с применением ELISA для интерферона бета, и было продемонстрировано, что, хотя Y. enterocolitica AHOPEMAT был неспособен индуцировать секрецию интерферона бета, инфекция Y. enterocolitica AHOPEMAT, кодирующим YopE1.138-домены CARD1.246 RIG1 мыши, привела к дозозависимой секреции интерферона бета неочищенным изолятом опухоли двух различных опухолей (фиг. 39). Это подтверждает, что доставленные с помощью бактерий домены CARD RIG1 способны индуцировать продукцию интерферона в смешанных популяциях клеток, состоящих из раковых клеток, иммунных клеток и всех других клеток, в микроокружении опухоли.- 71 044058 well plates. Such cells from two different tumors were left uninfected (dashed lines in Fig. 39) or infected with Y. enterocolitica AHOPEMAT or Y. enterocolitica AHOPEMAT encoded on the pBadMycHisA-derived plasmid YopE 1 . 138 -domains CARD 1 _ 246 mouse RIG1. IFN stimulation was assessed using an interferon beta ELISA and it was demonstrated that although Y. enterocolitica AHOPEMAT was unable to induce interferon beta secretion, infection with Y. enterocolitica AHOPEMAT encoding YopE 1 . The 138 -domain CARD1.246 mouse RIG1 resulted in dose-dependent secretion of interferon beta by a crude tumor isolate of two different tumors (Fig. 39). This confirms that bacterially delivered RIG1 CARD domains are capable of inducing interferon production in mixed cell populations consisting of cancer cells, immune cells, and all other cells in the tumor microenvironment.
Эффективность Y. enterocolitica AHOPEMAT, доставляющего CARD RIG1 или cGAS, по отсрочиванию прогрессирования опухоли/Efficacy of Y. enterocolitica AHOPEMAT delivering CARD RIG1 or cGAS in delaying tumor progression/
Для оценки влияния YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши и YopE1_138-cGAS человека, доставленных в опухолевые клетки in vivo, авторы настоящего изобретения проводили исследование на мышах Balb/C дикого типа с п.к. аллотрансплантатом клеток рака молочной железы ЕМТ6. Мышам внутриопухолево (в.о.) инъецировали ФБР (фиг. 40) или 7,5x107 Y. enterocolitica AHOPEMAT, Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1-138 домены CARD1.246 RIG1 мыши или Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1-138 cGAS человека, когда опухоль достигала размера приблизительно 60-130 мм3. День первой в.о. инъекции бактерий обозначали как день 0. Мышам вводили в.о. инъекции в Д0, Д1, Д5, Д6, Д10 и Д11. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней с помощью штангенциркуля. Лечение Y. enterocolitica AHOPEMAT самим по себе продемонстрировало влияние на прогрессирование объема опухоли, у 4/14 мышей наблюдалась полная регрессия опухоли (фиг. 41). Было обнаружено, что Y. enterocolitica AHOPEMAT, который доставляет белок, индуцирующий ответ ИФН I типа, будь то CARD RIG1 или cGAS, приводил к более выраженному влиянию на прогрессирование опухоли; у 8/14 (CARD RIG1) или 8/15 (cGAS) мышей наблюдалась полная и длительная регрессия опухоли (фиг. 42-43). Данные результаты подчеркивают, что такие бактерии и их T3SS можно применять, чтобы весьма значительно препятствовать прогрессированию опухоли, и что доставка белков, индуцирующих ИФН I типа, хорошо подходит для индукции регрессии первичной опухоли.To assess the impact of YopE 1 . 138 -domains CARD 1-246 mouse RIG1 and human YopE 1 _ 138 -cGAS delivered to tumor cells in vivo, the authors of the present invention conducted a study on wild-type Balb/C mice with p.c. allograft of EMT6 breast cancer cells. Mice were injected intratumorally (i.t.) with PBS (Fig. 40) or 7.5x107 Y. enterocolitica AHOPEMAT, Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE 1-138 mouse CARD1.246 RIG1 domains or Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE 1-138 cGAS person when the tumor reached a size of approximately 60-130 mm 3 . Day one v.o. bacterial injections were designated as day 0. Mice were injected i.o. injections on D0, D1, D5, D6, D10 and D11. Tumor volume was measured over the following days using a caliper. Treatment of Y. enterocolitica with AHOPEMAT alone demonstrated an effect on tumor volume progression, with 4/14 mice experiencing complete tumor regression (FIG. 41). Y. enterocolitica AHOPEMAT, which delivers a type I IFN response-inducing protein, either CARD RIG1 or cGAS, was found to result in a greater effect on tumor progression; 8/14 (CARD RIG1) or 8/15 (cGAS) mice experienced complete and long-term tumor regression (Fig. 42-43). These results highlight that such bacteria and their T3SS can be used to very significantly inhibit tumor progression, and that delivery of type I IFN-inducing proteins is well suited for inducing regression of the primary tumor.
Затем за мышами с полной регрессией опухоли наблюдали вплоть до дня 65 после исходной аллотранплантации опухоли, после чего в день 65 проводили повторную антигенную стимуляцию клетками рака молочной железы ЕМТ6 на противоположной стороне для оценки иммуно-опосредованной памяти и системной активности против данных раковых клеток. В данном исследовании повторной антигенной стимуляции дополнительное лечение не вводили, и за мышами просто наблюдали применительно к прогрессированию опухоли на противоположной стороне и сравнивали с ранее не использованными в экспериментах мышами (мышами, которых ранее не подвергали воздействию клеток рака молочной железы ЕМТ6, но все другие параметры которых, такие как возраст, были идентичными). Было обнаружено, что в то время как на ранее не использованных в экспериментах мышах п.к. аллотрансплантированные опухолевые клетки привели к росту опухоли, все мыши с предварительно вылеченной опухолью ЕМТ6 с полной регрессией на противоположной стороне были защищены от роста опухоли (фиг. 44). Следует отметить, что опухоли у мышей с предшествующей полной регрессией, индуцированной лечением бактериями, на противоположной стороне начинали расти в течение нескольких дней и достигали объемов вплоть до >100 мм3 (при максимальном объеме приблизительно в день 10 после второй трансплантации), а затем сморщивались (фиг. 44). Данный лаг-период может свидетельствовать об адаптивном ответе иммунной системы, которому требуется несколько дней, прежде чем полностью установиться.Mice with complete tumor regression were then followed until day 65 after initial tumor allografting, after which, on day 65, antigen challenge was repeated with EMT6 breast cancer cells on the contralateral side to assess immune-mediated memory and systemic activity against these cancer cells. In this antigen rechallenge study, no additional treatment was administered, and the mice were simply monitored for tumor progression on the contralateral side and compared with naïve mice (mice that had not previously been exposed to EMT6 breast cancer cells, but all other parameters which, such as age, were identical). It was found that while in mice not previously used in experiments, s.c. allografted tumor cells resulted in tumor growth, all EMT6 tumor-pretreated mice with complete regression on the contralateral side were protected from tumor growth (FIG. 44). It is noteworthy that tumors in mice with previous complete regression induced by bacterial treatment on the contralateral side began to grow within a few days and reached volumes of up to >100 mm 3 (with a maximum volume at approximately day 10 after the second transplantation) and then shriveled (Fig. 44). This lag period may indicate an adaptive immune system response that takes several days to fully establish.
В следующих экспериментах для оценки влияния YopE1.138-домены CARD1-246 RIG1 мыши и YopE1_ 138-cGAS человека, доставленных в опухолевые клетки in vivo, авторы настоящего изобретения провели исследование на мышах C57BL/6 дикого типа с п.к. аллотрансплантатом раковых клеток меланомы B16F10. Мышам внутриопухолево (в.о.) инъецировали ФБР или 7,5х107 Y. enterocolitica AHOPEMAT, Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138 домены CARD1-246 RIG1 мыши или Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138 cGAS человека, когда опухоль достигала размера приблизительно 75 мм3. День первой в.о. инъекции бактерий обозначали как день 0. Мышам вводили в.о. инъекции в Д0, Д1, Д2, Д3, Д6 и Д9. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней с помощью штангенциркуля. Лечение Y. enterocolitica AHOPEMAT самим по себе продемонстрировало влияние на прогрессирование объема опухоли, у 1/15 мышей наблюдалась полная регрессия опухоли (фиг. 46). Было обнаружено, что Y. enterocolitica AHOPEMAT, который доставлял белок, индуцирующий ответ ИФН I типа, будь то CARD RIG1 или cGAS, приводил к весьма выраженному влиянию на прогрессирование опухоли; у 5/15 (CARD RIG1) или 8/15 (cGAS) мышей наблюдалась полная и длительная регрессия опухоли (фиг. 46). Данные результаты подчеркивают, что такие бактерии и их T3SS можно применять, чтобы весьма значительно препятствовать прогрессированию опухоли, и что доставка белков, индуцирующих ИФН I типа, хорошо подходит для индукции регрессии первичной опухоли. Примечательно, особенно в случае бактерий, доставляющих YopE1_138-cGAS человека, что сразу после первых введений наблюдалось увеличение объема опухо- 72 044058 ли по сравнению с контролем, получавшим ФБР, что может быть вызвано миграцией лейкоцитов в опухоль (псевдопрогрессирование), вызванной внутриклеточной доставкой белка cGAS, индуцирующегоIn the following experiments to evaluate the effect of YopE 1 . 138 -CA domains RD1-246 mouse RIG1 and human YopE1_ 138-cGAS delivered to tumor cells in vivo, the present inventors conducted a study on wild-type C57BL/6 mice with p.c. allograft of B16F10 melanoma cancer cells. Mice were injected intratumorally (i.t.) with PBS or 7.5x10 7 Y. enterocolitica AHOPEMAT, Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138 mouse CARD1-246 RIG1 domains, or human Y. enterocolitica AHOPEMAT+YopE1.138 cGAS when the tumor reached size approximately 75 mm 3 . Day one v.o. bacterial injections were designated as day 0. Mice were injected i.o. injections at D0, D1, D2, D3, D6 and D9. Tumor volume was measured over the following days using a caliper. Treatment of Y. enterocolitica with AHOPEMAT alone demonstrated an effect on tumor volume progression, with 1/15 mice experiencing complete tumor regression (FIG. 46). It was found that Y. enterocolitica AHOPEMAT, which delivered a type I IFN response-inducing protein, either CARD RIG1 or cGAS, resulted in a very pronounced effect on tumor progression; 5/15 (CARD RIG1) or 8/15 (cGAS) mice experienced complete and long-term tumor regression (Fig. 46). These results highlight that such bacteria and their T3SS can be used to very significantly inhibit tumor progression, and that delivery of type I IFN-inducing proteins is well suited for inducing regression of the primary tumor. It is noteworthy, especially in the case of bacteria delivering human YopE1_ 138 -cGAS, that immediately after the first administrations there was an increase in tumor volume compared to PBS-treated controls, which may be caused by the migration of leukocytes into the tumor (pseudoprogression) caused by intracellular delivery cGAS inducing protein
ИФН I типа.Type I IFN.
Перечень литературных источниковList of literary sources
Hayes, С. S., Aoki, S. К. & Low, D. A. Bacterial contact-dependent delivery systems. Annu Rev Genet 44, 71-90, doi: 10.1146/annurev.genet.42.110807.091449 (2010).Hayes, S. S., Aoki, S. K. & Low, D. A. Bacterial contact-dependent delivery systems. Annu Rev Genet 44, 71-90, doi: 10.1146/annurev.genet.42.110807.091449 (2010).
Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4, 811825, doi:nrmicrol526 [pii]10.1038/nrmicrol526 (2006).Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4, 811825, doi:nrmicrol526 [pii]10.1038/nrmicrol526 (2006).
Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Direct injection of functional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, el5227, doi:10.1371/joumal.pone.0015227 (2010).Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Direct injection of functional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, el5227, doi:10.1371/joumal.pone.0015227 (2010).
Bichsel, C. et al. Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Reprogram 15, 117-125, doi:10.1089/cell.2012.0058 (2013).Bichsel, C. et al. Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Reprogram 15, 117–125, doi:10.1089/cell.2012.0058 (2013).
Bichsel, C. et al. Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells. PLoS One 6, el6465, doi:10.1371/journal.pone.0016465 (2011).Bichsel, C. et al. Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells. PLoS One 6, el6465, doi:10.1371/journal.pone.0016465 (2011).
Chamekh, M. etal. Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-Ira in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol 180, 4292-4298 (2008).Chamekh, M. et al. Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-Ira in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol 180, 4292-4298 (2008).
Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the yopA gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989).Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the yopA gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989).
Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769778 (1987).Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification of invaders: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769778 (1987).
Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Ann Med 37, 234-249, doi:R673752030212825Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Ann Med 37, 234-249, doi:R673752030212825
[pii] 10.1080/07853890510037329 (2005).[pii]10.1080/07853890510037329 (2005).
Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, doi: 10.1111/j. 1462-5822.2007.01109.x (2008).Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, doi: 10.1111/j. 1462-5822.2007.01109.x (2008).
Brenner, D. & Mak, T. W. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii]10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009).Brenner, D. & Mak, T. W. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii]10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009).
Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi:10.1007/978-l-4020-6554-5_3 (2008).Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi:10.1007/978-l-4020-6554-5_3 (2008).
Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(l 1)01283-9Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(l 1)01283-9
[pii]10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011).[pii]10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011).
Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif 80, 283-293, doi:S1046-5928(l 1)00203-8 [pii]10.1016/j.pep.2011.08.005 (2011).Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif 80, 283-293, doi:S1046-5928(l 1)00203-8 [pii]10.1016/j.pep.2011.08.005 (2011).
Howard, S. L. et al. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. J Bacteriol 188, 3645-3653, doi:10.1128/JB.188.10.36453653.2006 (2006).Howard, S. L. et al. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. J Bacteriol 188, 3645-3653, doi:10.1128/JB.188.10.36453653.2006 (2006).
Thomson, N. R. et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS Genet 2, e206, doi: 10.1371/joumal.pgen.0020206 (2006).Thomson, N. R. et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS Genet 2, e206, doi: 10.1371/joumal.pgen.0020206 (2006).
Pelludat, C., Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype 0:8 high-pathogenicity island to Y.Pelludat, C., Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype 0:8 high-pathogenicity island to Y.
- 73 044058 enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, confers a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immunity 1832-1841 (2002).- 73 044058 enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, concerns a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immunity 1832-1841 (2002).
Mulder, B., Michiels, T., Simonet, M., Sory, Μ. P. & Cornelis, G. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227. Infect Immun 57, 2534-2541 (1989).Mulder, B., Michiels, T., Simonet, M., Sory, M. P. & Cornelis, G. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227. Infect Immun 57, 2534-2541 (1989).
Sory, Μ. P. & Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583-594 (1994).Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583-594 (1994).
Sarker, M. R., Neyt, C., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacterial 180, 1207-1214 (1998).Sarker, M. R., Neyt, C., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacterial 180, 1207-1214 (1998).
Neubauer, H., Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi:10.1016/S14384221(00)80107-1 (2000).Neubauer, H., Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi:10.1016/S14384221(00)80107-1 (2000).
Feldman, M. F., Muller, S., Wuest, E. & Cornelis, G. R. SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 [pii] (2002).Feldman, M. F., Muller, S., Wuest, E. & Cornelis, G. R. SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 [pii] (2002).
Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacterial 187, 707-715, doi:10.1128/JB.187.2.707-715.2005 (2005).Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacterial 187, 707-715, doi:10.1128/JB.187.2.707-715.2005 (2005).
Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01623.x (2011).Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as a toolbox for studying the biological cell effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01623.x (2011).
Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacterial 172, 1547-1555 (1990).Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacterial 172, 1547-1555 (1990).
Sambrook, J. (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001).Sambrook, J. (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001).
Alto, Ν. M. & Dixon, J. E. Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. MethodsEnzymol 439, 131-143, doi:S00766879(07)00410-7 [pii]10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008).Alto, N. M. & Dixon, J. E. Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. MethodsEnzymol 439, 131-143, doi:S00766879(07)00410-7 [pii]10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008).
Alto, Ν. M. et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133-145, doi:S0092-8674(05)01229-8 [pii] 10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006).Alto, N. M. et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133–145, doi:S0092-8674(05)01229-8 [pii] 10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006).
Kaniga, K., Delor, I. & Cornelis, G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-l 119(91)905997 [pii] (1991).Kaniga, K., Delor, I. & Cornelis, G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-l 119(91)905997 [pii] (1991).
Yoneda, Y. et al. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992).Yoneda, Y. et al. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992).
Metcalf, W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994).Metcalf, W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994).
Diepold, A. et al. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. Embo J 29, 1928-1940, doi:emboj201084Diepold, A. et al. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. Embo J 29, 1928-1940, doi:emboj201084
[pii]10.1038/emboj.2010.84 (2010).[pii]10.1038/emboj.2010.84 (2010).
- 74 044058- 74 044058
Iriarte, M., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence factors. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995).Iriarte, M., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on the expression of virulence factors. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995).
Cornelis, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7 [pii] (1987).Cornelis, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7 [pii] (1987).
Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I., Sory, Μ. P. & Cornelis, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. InfectImmun 70, 4165-4176 (2002).Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I., Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. InfectImmun 70, 4165-4176 (2002).
Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. JBacteriol 182, 4811-4821 (2000).Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. JBacteriol 182, 4811-4821 (2000).
Iriarte, M. & Cornelis, G. R. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998).Iriarte, M. & Cornelis, G. R. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998).
Kudryashev, M. et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife 2, e00792, doi:10.7554/eLife.0079200792 [pii] (2013).Kudryashev, M. et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife 2, e00792, doi:10.7554/eLife.0079200792 [pii] (2013).
Schulte, R. et al. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rei p65-p65 homodimers. FASEB Л4,14711484 (2000).Schulte, R. et al. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rei p65-p65 homodimers. FASEB L4, 14711484 (2000).
Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I., Agrain, C. & Cornelis, G. R. Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science 307, 1278, doi:307/5713/1278 [pii] 10.1126/science. 1107679 (2005).Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I., Agrain, C. & Cornelis, G. R. Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science 307, 1278, doi:307/5713/1278 [pii] 10.1126/science. 1107679 (2005).
Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 3391-3395 (1988).Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 3391-3395 (1988).
Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The PT specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949-955, doi: 10.1016/S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 [pii] (2002).Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The PT specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949-955, doi: 10.1016/S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 [pii] (2002).
Liang, H., Gao, H., Maynard, C. A. & Powell, W. A. Expression of a selfprocessing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis. BiotechnolLett 27, 435-442, doi:10.1007/sl0529-005-1884-9 (2005).Liang, H., Gao, H., Maynard, C. A. & Powell, W. A. Expression of a self-processing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis. BiotechnolLett 27, 435-442, doi:10.1007/sl0529-005-1884-9 (2005).
Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi:10.1038/nbt731nbt731 [pii] (2002).Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi:10.1038/nbt731nbt731 [pii] (2002).
Kapust, R. B. et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993-1000 (2001).Kapust, R. B. et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993-1000 (2001).
Lee, V. T., Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol of HeLa cells: one-step translocation of YopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998).Lee, V. T., Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol of HeLa cells: one-step translocation of YopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998).
Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092-8674(10)00783-X [pii]10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010).Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092-8674(10)00783-X [pii]10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010).
Henrichs, T. et al. Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA 102, 4246-4251, doi: 102/12/4246 [pii]10.1073/pnas.0408520102 (2005).Henrichs, T. et al. Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA 102, 4246-4251, doi: 102/12/4246 [pii]10.1073/pnas.0408520102 (2005).
Aepfelbacher, M., Trasak, C. & Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007).Aepfelbacher, M., Trasak, C. & Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007).
Trulzsch, K., Sporleder, T., Igwe, E. I., Russmann, H. & Heesemann, J. Contribution of the major secreted yops of Yersinia enterocolitica 0:8 toTrulzsch, K., Sporleder, T., Igwe, E. I., Russmann, H. & Heesemann, J. Contribution of the major secreted yops of Yersinia enterocolitica 0:8 to
--
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16205439.9 | 2016-12-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044058B1 true EA044058B1 (en) | 2023-07-20 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2017384611B2 (en) | Virulence attenuated bacteria based protein delivery | |
JP2019500026A (en) | Attenuated bacteria for the treatment of malignant solid tumors | |
US20230382956A1 (en) | Bacteria based protein delivery | |
EA044058B1 (en) | DELIVERY OF PROTEINS BASED ON VIRULENCE-ATTENUATED BACTERIA | |
US20240165169A1 (en) | Pharmaceutical Combinations for Treating Cancer | |
BR122024010821A2 (en) | ATTENUATED VIRULENT RECOMBINANT GRAM-NEGATIVE BACTERIAL STRAIN AND ITS USE | |
US20240165265A1 (en) | Pharmaceutical Combinations for Treating Cancer | |
Bryant | Substrate targeting and recognition in the flagellar type III secretion pathway | |
EA040558B1 (en) | BACTERIA WITH REDUCED VIRULENCE FOR THE TREATMENT OF MALIGNANT SOLID TUMORS | |
Zhou | The Molecular Basis of SSRA Deletion Phenotype in Different Bacteria | |
Rowley | Characterisation of the S. Typhimurium σE regulon | |
Balbontín Soria | Genetic and molecular analysis of small regulatory RNAs in Salmonella enterica |