EA043743B1 - AN ANTIBODY OR ANTIGENE-BINDING FRAGMENT THAT BINDS TO HUMAN SIRPα - Google Patents

AN ANTIBODY OR ANTIGENE-BINDING FRAGMENT THAT BINDS TO HUMAN SIRPα Download PDF

Info

Publication number
EA043743B1
EA043743B1 EA201991851 EA043743B1 EA 043743 B1 EA043743 B1 EA 043743B1 EA 201991851 EA201991851 EA 201991851 EA 043743 B1 EA043743 B1 EA 043743B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
acid sequence
antigen
hsirpa
Prior art date
Application number
EA201991851
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Эненнаам Ханс Ван
Элсас Андреа Ван
Эрик Вутс
Пол Винк
Давид Лютье Хюлсик
Original Assignee
Сайропа Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сайропа Б.В. filed Critical Сайропа Б.В.
Publication of EA043743B1 publication Critical patent/EA043743B1/en

Links

Description

Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет на основании заявки на патент Нидерландов № 2018708, поданной 13 апреля 2017 г., и заявки на патент Нидерландов № 2019166, поданной 3 июляThe present patent application claims priority based on Dutch Patent Application No. 2018708, filed April 13, 2017, and Dutch Patent Application No. 2019166, filed July 3

2017 г., каждая из которых настоящим полностью включена в данную заявку посредством ссылки, включая все таблицы, фигуры и пункты формулы изобретения.2017, each of which is hereby incorporated herein by reference in its entirety, including all tables, figures and claims.

Область техникиField of technology

В настоящем изобретении предложены антитела против SIRPa, а также применение данных антител для лечения заболеваний.The present invention provides antibodies against SIRPa, as well as the use of these antibodies for the treatment of diseases.

Уровень техникиState of the art

Сигнальный регуляторный белок альфа (SIRPa) представляет собой мембранный гликопротеин из семейства SIRP. У представителей семейства SIRP есть некоторые общие структурные мотивы. Данные мотивы включают трансмембранный фрагмент и N-концевой внеклеточный домен, который содержит три Ig-подобные петли, соединенные тремя парами дисульфидных связей. С-концевой внутриклеточный домен, тем не менее, отличается у разных представителей семейства SIRP. SIRPa содержит удлиненный внутриклеточный домен, содержащий четыре остатка тирозина, которые образуют два тирозинсодержащих ингибиторных мотива иммунорецептора (ITIM), тогда как SIRPe1 содержит остаток лизина в трансмембранном домене, за которым следует короткий внутриклеточный хвост, в котором нет мотивов ITIM, служащий в качестве рецептора для DAP12. Было обнаружено восемь однонуклеотидных полиморфизмов SIRPa, при этом наиболее распространенными вариантами являются SIRPaV1 и SIRPaV2 (Takenaka и др., Nat. Immunol. 2007, 8:1313-23).Signal regulatory protein alpha (SIRPa) is a membrane glycoprotein of the SIRP family. Members of the SIRP family share some common structural motifs. These motifs include a transmembrane fragment and an N-terminal extracellular domain, which contains three Ig-like loops connected by three pairs of disulfide bonds. The C-terminal intracellular domain, however, differs among different members of the SIRP family. SIRPa contains an elongated intracellular domain containing four tyrosine residues that form two tyrosine-containing immunoreceptor inhibitory motifs (ITIMs), whereas SIRPe1 contains a lysine residue in the transmembrane domain followed by a short intracellular tail that lacks ITIM motifs, serving as a receptor for DAP12. Eight SIRPa single nucleotide polymorphisms have been identified, with the most common variants being SIRPaV1 and SIRPaV2 (Takenaka et al., Nat. Immunol. 2007, 8:1313-23).

Сигналы съешь меня (т.е. измененное своё) представляют собой внеклеточные сигналы, специфично продуцируемые и представляемые на поверхности апоптических клеток, но не на здоровых клетках, и являются ключевыми для запуска фагоцитоза путем активации фагоцитарных рецепторов и последующих сигнальных каскадов. Для того чтобы сигналы съешь меня были представлены на апоптических клетках, требуется их транспорт наружу из клетки. Определенную категорию сигналов съешь меня предоставляют заякоренные в мембрану белки, такие как фосфатидилсерин (PtdSer) и кальретикулин (CRT). Выставленный наружу PtdSer связывается со своими рецепторами на фагоцитах, чтобы способствовать клиренсу апоптических клеток (процессу, известному как эффероцитоз). Аналогичным образом, экспрессия CRT повышена на поверхности апоптических клеток, и он связывается с родственным LDLрецептору белком 1 (LRP1) на фагоците, тем самым опосредуя поглощение.Eat me signals (i.e., altered self) are extracellular signals specifically produced and presented on the surface of apoptotic cells, but not on healthy cells, and are key to triggering phagocytosis through activation of phagocytic receptors and subsequent signaling cascades. For eat me signals to be presented on apoptotic cells, their transport out of the cell is required. A particular category of eat-me signals is provided by membrane-anchored proteins such as phosphatidylserine (PtdSer) and calreticulin (CRT). Exposed PtdSer binds to its receptors on phagocytes to promote clearance of apoptotic cells (a process known as efferocytosis). Likewise, CRT expression is increased on the surface of apoptotic cells, and it binds to LDL receptor-related protein 1 (LRP1) on the phagocyte, thereby mediating engulfment.

SIRPa обширно экспрессирован на фагоцитах (например, макрофагах, гранулоцитах и дендритных клетках) и действует как ингибиторный рецептор посредством взаимодействия с трансмембранным белком CD47. Данное взаимодействие опосредует ответ, который называют сигналом не ешь меня. Данное взаимодействие отрицательно регулирует эффекторную функцию клеток врожденной иммунной системы, такую как фагоцитоз клетками хозяина. Так как CD47 часто присутствует на опухолевых клетках, считают, что данный сигнал не ешь меня способствует устойчивости опухолей к зависимому от фагоцитов клиренсу. Несмотря на сходства внеклеточных доменов SIRPa и SIRPe1, существуют функциональные различия между представителями семейства SIRP. Например, SIRPe1 не связывает CD47 на детектируемых уровнях и, следовательно, не опосредует сигнал не ешь меня. Вместо этого, SIRPe1 участвует в активации миелоидных клеток.SIRPa is widely expressed on phagocytes (eg, macrophages, granulocytes and dendritic cells) and acts as an inhibitory receptor through interaction with the transmembrane protein CD47. This interaction mediates a response called the don't eat me signal. This interaction negatively regulates the effector function of innate immune cells, such as phagocytosis by host cells. Because CD47 is frequently present on tumor cells, this don't eat me signal is thought to contribute to tumor resistance to phagocyte-dependent clearance. Despite the similarities in the extracellular domains of SIRPa and SIRPe1, there are functional differences between members of the SIRP family. For example, SIRPe1 does not bind CD47 at detectable levels and therefore does not mediate the don't eat me signal. Instead, SIRPe1 is involved in the activation of myeloid cells.

Нарушение передачи сигнала CD47-SIRPa (например, с помощью антагонистических моноклональных антител, которые связываются либо с CD47, либо с SIRPa) по имеющимся сведениям приводит к повышенному фагоцитозу клеток как солидных, так и гематопоэтических опухолей, включая повышенный фагоцитоз клеток глиобластомы in vitro и значительную противоопухолевую активность in vivo.Disruption of CD47-SIRPa signaling (eg, through antagonistic monoclonal antibodies that bind to either CD47 or SIRPa) has been reported to result in increased phagocytosis of both solid and hematopoietic tumor cells, including increased phagocytosis of glioblastoma cells in vitro and significant antitumor activity in vivo.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В первом аспекте настоящего изобретения предложены антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, включающие структурные и функциональные особенности, перечисленные ниже.In a first aspect of the present invention, anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof are provided, including the structural and functional features listed below.

В различных вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий один, два или все три из (i), (ii) и (iii): (i) гипервариабельного участка 1 (CDR1) вариабельной области тяжелой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; (ii) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.In various embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to a human SIRPa, comprising one, two, or all three of (i), (ii), and (iii): (i) hypervariable region 1 (CDR1 ) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 1 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; (ii) a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 2 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 3 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В различных других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий один, два или все три из (i), (ii) и (iii): (i) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 69 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; (ii) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи,In various other embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to a human SIRPa, comprising one, two, or all three of (i), (ii), and (iii): (i) CDR1 of the severe variable region a chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 1 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; (ii) CDR2 of the heavy chain variable region,

- 1 043743 включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 70 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 71 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.- 1 043743 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 70 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 2 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 3 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 75 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 75 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 78 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 78 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 80 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 80 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 82 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 82 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 84 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 84 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 86 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 86 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 88 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 88 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 102 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 102 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 7 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 10 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 12 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 14 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 16 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 18 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 30 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 30 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence.

В различных вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий один, два или все три из (i), (ii) и (iii): (i) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; (ii) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.In various embodiments, the present invention also provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to a human SIRPa, comprising one, two, or all three of (i), (ii), and (iii): (i) lung variable region CDR1 a chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; (ii) a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В различных других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий один, два или все три из (i), (ii) и (iii): (i) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 72 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; (ii) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 73 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 74 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.Various other embodiments of the present invention also provide an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to a human SIRPa, comprising one, two, or all three of (i), (ii), and (iii): (i) a CDR1 variable region a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; (ii) a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 76 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

- 2 043743- 2 043743

SEQ ID NO: 90 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 90 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 92 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 92 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 94 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 94 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 96 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 98 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 98 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 100 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 104 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 8 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 20 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 22 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 24 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 26 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 28 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 28 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 32 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 32 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence.

В различных вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий:In various embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to human SIRPa, comprising:

(i) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2, 3 или более кон сервативных замен;(i) a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 1 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions;

(ii) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и (iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2, 3 или более консервативных замен;(ii) a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 2 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 3 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and (iv) a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions;

(v) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (vi) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.(v) a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (vi) a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В различных других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий:In various other embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to human SIRPa, comprising:

(i) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 69 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2, 3 или более консервативных замен;(i) a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 1 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions;

(ii) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 70 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (iii) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 71 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и (iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 72 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2, 3 или более(ii) a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 2 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (iii) a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 3 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and (iv) a light chain variable region CDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2, 3 or more

- 3 043743 консервативных замен;- 3 043743 conservative substitutions;

(v) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ(v) CDR2 of the light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ

ID NO: 73 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2, 3 или более консервативных замен; и/или (vi) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 74 на 1, 2, 3 или более консервативных замен.ID NO: 73 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions; and/or (vi) a light chain variable region CDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 74 by 1, 2, 3 or more conservative substitutions.

В других дополнительных вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий:In other additional embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to human SIRPa, comprising:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 7 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 10 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 12 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 14 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 16 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 18 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 30 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности; и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:SEQ ID NO: 30 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence; and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 8 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 20 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 22 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 24 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 26 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 28 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 28 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 32 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 32 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence.

В других дополнительных вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с SIRPa человека, содержащий:In other additional embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to human SIRPa, comprising:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 75 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 75 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 78 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 78 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 80 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 80 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 82 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 82 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 84 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 84 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 86 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 86 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 88 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности; иSEQ ID NO: 88 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence; And

- 4 043743- 4 043743

SEQ ID NO: 102 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:SEQ ID NO: 102 or amino acid sequences at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 76 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 90 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 90 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 92 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 92 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 94 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 94 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 96 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 98 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 98 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 100 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 104 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to the stated sequence.

В данном контексте подобие последовательностей основывается на степени идентичности в комбинации со степенью консервативных изменений. Процент подобия последовательностей представляет собой процент аминокислот или нуклеотидов, которые либо идентичны, либо консервативно заменены, то есть подобие последовательностей=процент идентичности последовательностей+процент консервативных изменений. Таким образом, для целей настоящего изобретения консервативные изменения и идентичность считают разновидностями более широкого термина подобие. Таким образом, всякий раз, когда используют термин подобие последовательностей, в его объем входит идентичность последовательностей и консервативные изменения. Согласно некоторым вариантам реализации консервативные изменения не учитывают, и процент подобия последовательностей относится к проценту идентичности последовательностей. В некоторых вариантах реализации изменения в последовательности, допускаемые указанным процентом идентичности последовательностей, все или почти все представляют собой консервативные изменения; то есть когда последовательность идентична на 90%, остальные 10% все или почти все представляют собой консервативные изменения. Термин почти все в данном контексте относится к случаю, когда по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% допускаемых изменений последовательности представляют собой консервативные изменения. В некоторых вариантах реализации тяжелых и/или легких цепей антител допускаемые изменения последовательности находятся внутри каркасных областей, но не в CDR.In this context, sequence similarity is based on the degree of identity in combination with the degree of conserved changes. Percentage sequence similarity is the percentage of amino acids or nucleotides that are either identical or conservatively substituted, i.e., sequence similarity=percentage sequence identity+percentage conservative changes. Thus, for the purposes of the present invention, conservative changes and identity are considered varieties of the broader term similarity. Thus, whenever the term sequence similarity is used, its scope includes sequence identity and conservative changes. In some embodiments, conservative changes are not taken into account, and the percentage of sequence similarity refers to the percentage of sequence identity. In some embodiments, the changes in sequence allowed by the specified percentage of sequence identity are all or substantially all conservative changes; that is, when the sequence is 90% identical, the remaining 10% are all or almost all conservative changes. The term almost all as used herein refers to the case where at least 75%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the permitted sequence changes are conservative changes. In some embodiments of antibody heavy and/or light chains, the permitted sequence changes are within the framework regions, but not in the CDRs.

Предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 7. Ещё более предпочтительно указанное антитело содержит легкую цепь согласно SEQ ID NO: 8. Более предпочтительно тяжелую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 или 30. Более предпочтительно легкую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28 или 32.Preferably, said antibody contains a heavy chain according to SEQ ID NO: 7. Even more preferably, said antibody contains a light chain according to SEQ ID NO: 8. More preferably, the heavy chain is selected from any of the sequences of SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 or 30. More preferably, the light chain is selected from any of SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28 or 32.

В качестве альтернативы указанное антитело содержит тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 75.Alternatively, said antibody contains a heavy chain according to SEQ ID NO: 75.

Ещё более предпочтительно указанное антитело содержит легкую цепь согласно SEQ ID NO: 76. Более предпочтительно тяжелую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NO: 78, 80, 82, 84, 86, 88 или 102. Более предпочтительно легкую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NO: 90, 92, 94, 96, 98, 100 или 104.Even more preferably, said antibody comprises a light chain according to SEQ ID NO: 76. More preferably, the heavy chain is selected from any of SEQ ID NO: 78, 80, 82, 84, 86, 88 or 102. More preferably, the light chain is selected from any of sequences SEQ ID NO: 90, 92, 94, 96, 98, 100 or 104.

В любом из описанных выше вариантов реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть выделенным, согласно определению данного термина в настоящей заявке.In any of the embodiments described above, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be isolated as that term is defined herein.

В любом из описанных выше вариантов реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой рекомбинантное антитело, согласно определению данного термина в настоящей заявке.In any of the embodiments described above, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a recombinant antibody, as that term is defined herein.

В любом из описанных выше вариантов реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полноразмерное антитело, согласно определению данного термина в настоящей заявке.In any of the embodiments described above, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a full-length antibody as that term is defined herein.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно получить из различных видов. Например, антитела согласно настоящему изобретению могут включать последовательности иммуноглобулинов, которые представляют собой последовательности кролика, мыши, крысы, морской свинки, цыпленка, козы, овцы, осла, человека, ламы или верблюдовых, или комбинации таких последовательностей (так называемые химерные антитела). В наиболее предпочтительном случае указанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой человеческие или гуманизи- 5 043743 рованные антитела или антигенсвязывающие фрагменты.Antibodies or antigen binding fragments of the present invention can be obtained from various species. For example, antibodies of the present invention may include immunoglobulin sequences that are rabbit, mouse, rat, guinea pig, chicken, goat, sheep, donkey, human, llama or camelid sequences, or combinations of such sequences (so-called chimeric antibodies). Most preferably, said antibodies or antigen binding fragments are human or humanized antibodies or antigen binding fragments.

Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е. сайты связывания антигенов (например, фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность области (CDR)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая: (i) фрагмент Fab - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2 - бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward и др., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Одноцепочечные антитела также включены посредством ссылки в объем термина антитело. Предпочтительные терапевтические антитела представляют собой интактные антитела IgG. Подразумевают, что термин интактный IgG в данном изобретении означает полипептид, относящийся к классу антител, которые по существу кодируются известным геном иммуноглобулина гамма. У человека данный класс включает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. У мышей данный класс включает IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3. Известные домены Ig в классе IgG антител представляют собой Vh, Cy1, Су2, Су3, Vl и Cl.The term antibody includes antigen-binding portions, i.e. antigen binding sites (eg, fragments, complementarity determining region (CDR) subsequences) that retain the ability to bind antigen, including: (i) a Fab fragment—a monovalent fragment consisting of the VL , VH, CL, and CH1 domains; (ii) fragment F(ab')2 - a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and C H 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the V L and VH domains of one arm of the antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) which consists of a VH domain; and (vi) a dedicated complementarity determining region (CDR). Single chain antibodies are also included by reference within the scope of the term antibody. Preferred therapeutic antibodies are intact IgG antibodies. The term intact IgG as used herein is meant to mean a polypeptide belonging to a class of antibodies that are substantially encoded by the known immunoglobulin gamma gene. In humans, this class includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In mice, this class includes IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3. The known Ig domains in the IgG class of antibodies are Vh, Cy1, Cy2, Cy3, Vl and Cl.

В любом из описанных выше вариантов реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой человеческое или гуманизированное антитело, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи. В одном варианте реализации антитело представляет собой IgG. В предпочтительных вариантах реализации антитело представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4, и предпочтительно представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In any of the embodiments described above, the antibody or antigen binding fragment thereof is a human or humanized antibody containing two heavy chains and two light chains. In one embodiment, the antibody is an IgG. In preferred embodiments, the antibody is IgG1, IgG2, or IgG4, and is preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.

В любом из приведенных выше вариантов реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению могут содержать любые из вариабельных областей легкой цепи, описанных выше, константный домен легкой цепи каппа или лямбда человека и константный домен тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4. Примеры последовательностей константных областей легкой (каппа) и тяжелой (IgG2 и IgG4) цепей, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, перечислены в последовательностях SEQ ID NO: 63, 65, 67 (каждая представляет собой последовательность нуклеотидов), 64, 66 и 68 (каждая представляет собой полипептидную последовательность).In any of the above embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention may comprise any of the light chain variable regions described above, a human kappa or lambda light chain constant domain, and an IgG1, IgG2, or IgG4 heavy chain constant domain. Examples of light (kappa) and heavy (IgG2 and IgG4) constant region sequences that can be used in accordance with the present invention are listed in SEQ ID NOs: 63, 65, 67 (each a nucleotide sequence), 64, 66 and 68 (each being a polypeptide sequence).

Исключительно в качестве примера, в различных вариантах реализации такое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают одну из следующих комбинаций последовательности тяжелой цепи/последовательностей вариабельной области легкой цепи:By way of example only, in various embodiments, such an antibody or antigen binding fragment thereof comprises one of the following combinations of heavy chain sequence/light chain variable region sequences:

SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L1),SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 20 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L1),

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

10/SEQ ID NO10/SEQ ID NO

10/SEQ ID NO10/SEQ ID NO

10/SEQ ID NO10/SEQ ID NO

10/SEQ ID NO10/SEQ ID NO

12/SEQ ID NO12/SEQ ID NO

12/SEQ ID NO12/SEQ ID NO

12/SEQ ID NO12/SEQ ID NO

12/SEQ ID NO12/SEQ ID NO

12/SEQ ID NO12/SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L5), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L1), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L5), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L1), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L5), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L1), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L5), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L1), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L5), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L1), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L2), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L3), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L4), (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L5),78/SEQ ID NO (herein referred to as hSIRPa.50A.H1L2), (herein referred to as hSIRPa.50A.H1L3), (herein referred to as hSIRPa.50A.H1L4), (herein referred to as hSIRPa.50A. H1L5), (in this invention designated hSIRPa.50A.H2L1), (in this invention designated hSIRPa.50A.H2L2), (in this invention designated hSIRPa.50A.H2L3), (in this invention designated hSIRPa.50A.H2L4) , (in this invention denoted hSIRPa.50A.H2L5), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L1), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L2), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L3), ( in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L4), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L5), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L1), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L2), (in this invention in the invention denoted hSIRPa.50A.H4L3), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L4), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L5), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L1), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L2), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L3), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L4), (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L5), (in this invention denoted hSIRPa. 40A.H1L1), (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L2), (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L3), (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L4), (in this invention denoted hSIRPa.40A. H1L5),

- 6 043743- 6 043743

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L6), или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO.100 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L6), 90 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L3 ), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L5), 100 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L6), 90 (in this invention denoted hSIRPa.40A .H3L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa .40A.H3L5), 100 (in this invention designated hSIRPa.40A.H3L6), 90 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L1), 92 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L5), 100 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L6), 90 (in in this invention designated hSIRPa.40A.H5L1), 92 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L2), 94 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L3), 96 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L4), 98 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L5), 100 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L6), 90 (in this invention designated hSIRPa.40A.H6L1), 92 (in this invention designated hSIRPa.40A.H6L2) , 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L5), 100 (in this invention denoted hSIRPa.40A. H6L6), or, in each case, a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the sequence of the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 10 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 20 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In some preferred embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 10 and each light chain comprising SEQ ID NO: 20 or, in each where the sequence is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably each light chain contains a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В другом предпочтительном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 16 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 28, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In another preferred embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 16 and each light chain comprising SEQ ID NO: 28, or, in in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the sequence of the corresponding SEQ ID NO, and most preferably each light chain contains a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В других дополнительных предпочтительных вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 18 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 20 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In other further preferred embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 18 and each light chain comprising SEQ ID NO: 20 or, in in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the sequence of the corresponding SEQ ID NO, and most preferably each light chain contains a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 90, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительноIn some preferred embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 90, or, in in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the sequence with the corresponding SEQ ID NO, and most preferably

- 7 043743 каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.- 7 043743 each light chain contains a constant domain of a human kappa light chain or a human lambda light chain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 92, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In some preferred embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 92, or, in in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the sequence of the corresponding SEQ ID NO, and most preferably each light chain contains a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 96, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобную или идентичную последовательности с соответствующим SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In some preferred embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 96, or, in in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the sequence of the corresponding SEQ ID NO, and most preferably each light chain contains a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В одном варианте реализации антитело против SIRPa согласно настоящему изобретению включает структуру полноразмерного антитела, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи, перечисленные выше, при этом каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1 человека.In one embodiment, the anti-SIRPa antibody of the present invention includes a full-length antibody structure comprising two light chains and two heavy chains listed above, each light chain comprising a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1 constant region.

В одном варианте реализации антитело против SIRPa согласно настоящему изобретению включает структуру полноразмерного антитела, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи, перечисленные выше, при этом каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG2 человека.In one embodiment, the anti-SIRPa antibody of the present invention includes a full-length antibody structure comprising two light chains and two heavy chains listed above, each light chain comprising a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG2 constant region.

В одном варианте реализации антитело против SIRPa согласно настоящему изобретению включает структуру полноразмерного антитела, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи, перечисленные выше, при этом каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG4 человека.In one embodiment, the anti-SIRPa antibody of the present invention includes a full-length antibody structure comprising two light chains and two heavy chains listed above, each light chain comprising a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG4 constant region.

В некоторых вариантах реализации антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению обладают одним, двумя, тремя, четырьмя или более и предпочтительно каждым из следующих функциональных свойств:In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments of the present invention have one, two, three, four, or more, and preferably each of the following functional properties:

связывают белок SIRPaV1 человека, имеющий последовательность SEQ ID NO: 34, с ЕС50 < 1 нМ; и проявляют по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к SIRPaV1(P74A), имеющему последовательность SEQ ID NO: 62; и необязательно также по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к белку SIRPe1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 38 (при этом в каждом случае пониженная EC50 относится к EC50 по отношению к белку SIRPaV1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 34, и в каждом случае предпочтительно измерение проводят с помощью клеточного анализа ELISA (CELISA), описанного далее в данном изобретении; связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ, и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее; связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV2 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ, и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее; не проявляют заметного связывания с белком SIRPe1 при концентрации антитела 50 нМ, предпочтительно 67 нМ и более предпочтительно 100 нМ; или, в качестве альтернативы, при концентрации, которая в 10 раз больше, предпочтительно в 50 раз больше, более предпочтительно в 100 раз больше и еще более предпочтительно в 200 раз больше, чем EC50 антитела по отношению к SIRPaV1 или SIRPaV2;bind the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34, with an EC 50 < 1 nM; and exhibit at least 100 times higher EC 50 relative to SIRPaV1(P74A) having the sequence SEQ ID NO: 62; and optionally also at least 100 times higher EC 50 relative to the human SIRPe1 protein having the sequence SEQ ID NO: 38 (wherein in each case the lower EC 50 refers to the EC 50 relative to the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34, and in each case preferably the measurement is carried out using a cell-based ELISA assay (CELISA) described later in this invention; contact a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC 50 < 10 nM, preferably < 5 nM, more preferably <1.5 nM, even more preferably <1.0 nM, even more preferably <0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less; binds to a cell expressing human SIRPaV2 protein with an EC 50 <10 nM, preferably <5 nM, more preferably <1.5 nM, even more preferably <1.0 nM, even more preferably <0.5 nM, and most preferably equal to or less than about 0.3 nM; does not exhibit detectable binding to SIRPe1 protein at an antibody concentration of 50 nM, preferably 67 nM and more preferably 100 nM; or, alternatively, at a concentration that is 10 times greater, preferably 50 times greater, more preferably 100 times greater, and even more preferably 200 times greater than the EC 50 of the antibody to SIRPaV1 or SIRPaV2;

ингибируют связывание между SIRPa человека и CD47 с IC50 < 10,0 нМ, более предпочтительно < 5,0 нМ, еще более предпочтительно < 2,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 1,0 нМ или менее; и проявляют балл человечности Т20, равный по меньшей мере 79, и более предпочтительно 85.inhibit binding between human SIRPa and CD47 with an IC50 of <10.0 nM, more preferably <5.0 nM, even more preferably <2.5 nM, and most preferably equal to about 1.0 nM or less; and exhibit a T20 humanity score of at least 79, and more preferably 85.

Предпочтительно антитела против SIRPa или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению значительно не связываются с одним или обоими из белков SIRPaV1(P74A) и SIRPe1 при концентрации антитела 100 нМ или, в качестве альтернативы, при концентрации антитела, которая в 200 раз больше, чем EC50 указанного антитела по отношению к SIRPaV1 или SIRPaV2, но при этом связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с ЕС50 < 10 нМ. В наиболее предпочтительном случае каждая легкая цепь содержит константный домен легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая тяжелая цепь содержит константную область IgG1, IgG2 или IgG4 человека.Preferably, the anti-SIRPa antibodies or antigen-binding fragments of the present invention do not significantly bind to one or both of the SIRPaV1(P74A) and SIRPe1 proteins at an antibody concentration of 100 nM or, alternatively, at an antibody concentration that is 200 times the EC 50 of said antibody. antibodies against SIRPaV1 or SIRPaV2, but bind to a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC 50 < 10 nM. Most preferably, each light chain comprises a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain; and each heavy chain contains a human IgG1, IgG2 or IgG4 constant region.

В некоторых вариантах реализации антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагментIn some embodiments, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof

- 8 043743 согласно настоящему изобретению можно конъюгировать с по меньшей мере одним терапевтическим агентом. В одном варианте реализации указанный терапевтический агент представляет собой второе антитело или его фрагмент, иммуномодулятор, гормон, цитотоксический агент, фермент, радионуклид или второе антитело, конъюгированное с по меньшей мере одним иммуномодулятором, ферментом, радиоактивной меткой, гормоном, антисмысловым олигонуклеотидом или цитотоксическим агентом, или комбинацию перечисленных агентов.- 8 043743 according to the present invention can be conjugated with at least one therapeutic agent. In one embodiment, said therapeutic agent is a second antibody or fragment thereof, immunomodulator, hormone, cytotoxic agent, enzyme, radionuclide, or second antibody conjugated to at least one immunomodulator, enzyme, radiolabel, hormone, antisense oligonucleotide, or cytotoxic agent, or a combination of these agents.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены выделенные полипептиды, включающие любую из перечисленных последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 30, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32 или фрагмент любой из указанных последовательностей, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанным последовательностям.The present invention also provides isolated polypeptides comprising any of the following amino acid sequences SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 30, 8, 20, 22, 24, 26, 28 and 32, or a fragment of any of these sequences, or an amino acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequences.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие любое из антител против SIRPa или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению.The present invention also provides isolated nucleic acids encoding any of the anti-SIRPa antibodies or antigen binding fragments of the present invention.

В одном варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:In one embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid that encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 75 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 75 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 78 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 78 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 80 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 80 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 82 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 82 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 84 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 84 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 86 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 86 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 88 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 88 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 102 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 102 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 10 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 12 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 14 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 16 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 18 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 30 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 30 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 10 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 12 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 14 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указан- 9 043743 ной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15 or the sequence nucleic acid that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 18 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 30 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 29, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 78 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 77 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 77, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 80 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 79 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 79, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 82 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 81 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 84 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 83 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 86 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 85 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 85, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 88 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 87 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 87, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 102 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 101 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 101 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В одном варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:In one embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid that encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 76 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 90 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 90 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 92 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 92 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 94 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 94 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 96 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 98 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99%SEQ ID NO: 98 or amino acid sequences of at least 90, 95, 97, 98 or 99%

- 10 043743 подобной или идентичной указанной последовательности,- 10 043743 similar or identical to the specified sequence,

SEQ ID NO: 100 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 104 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 8 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 20 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 22 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 24 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 26 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 28 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 28 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 32 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобной или идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 32 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% similar or identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 20 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 19, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 22 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 21 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 24 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23 or the nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 27, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 32 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 31, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 90 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 89 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 89, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 92 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 91 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 91, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 94 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 93 илиIn some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 93 or

- 11 043743 последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.- 11 043743 a nucleic acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 96 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 95 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 95, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 98 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 97 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to the specified sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 97, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 100 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 99 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 99, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации последовательность аминокислот SEQ ID NO: 104 или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% подобная или идентичная указанной последовательности, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 103 или последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.In some embodiments, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98, or 99% similar or identical to that sequence, is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 103, or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации выделенные нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению в некоторых случаях могут содержать лидерную последовательность.In some embodiments, the isolated nucleic acids of the present invention may, in some cases, contain a leader sequence.

Такие нуклеиновые кислоты могут включать одну или более из следующих последовательностей нуклеиновых кислот:Such nucleic acids may include one or more of the following nucleic acid sequences:

последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 77 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 79 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 81 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 83 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 85 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 87 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 101 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 89 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 91 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 93 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 95 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 97 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 99 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 101 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 103 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности,a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a nucleic acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 79 or a nucleic acid sequence that is at least 90% identical, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 85 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99 % identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 87 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 101 or the nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 89 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence acid SEQ ID NO: 91 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 93 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 95 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 97 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 99, or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 101 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 103 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 11 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence,

- 12 043743 последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и/или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.- 12 043743 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 29 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 21 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 23 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 25 or nucleic acid sequence an acid at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 27, or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence , and/or a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 31 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота может кодировать человеческое или гуманизированное антитело, и включает последовательности нуклеиновых кислот для обеих тяжелой и легкой цепей. В одном варианте реализации антитело представляет собой IgG. В предпочтительных вариантах реализации антитело представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4, и предпочтительно представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации последовательность легкой цепи включает последовательность константного домена легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая последовательность тяжелой цепи включает последовательность константной области IgG1, IgG2 или IgG4 человека.In some embodiments, the nucleic acid may encode a human or humanized antibody, and includes nucleic acid sequences for both the heavy and light chains. In one embodiment, the antibody is an IgG. In preferred embodiments, the antibody is IgG1, IgG2, or IgG4, and is preferably human IgG1, IgG2, or IgG4. In some embodiments, the light chain sequence includes a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain sequence; and each heavy chain sequence includes a human IgG1, IgG2, or IgG4 constant region sequence.

Предпочтительно такие нуклеиновые кислоты включают следующую комбинацию последовательностей нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи:Preferably, such nucleic acids comprise the following combination of heavy chain and light chain variable region nucleic acid sequences:

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

9/SEQ ID NO: 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L1),9/SEQ ID NO: 19 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L1),

9/SEQ ID NO: 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L2),9/SEQ ID NO: 21 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L2),

9/SEQ ID NO: 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L3),9/SEQ ID NO: 23 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L3),

9/SEQ ID NO: 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L4),9/SEQ ID NO: 25 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L4),

9/SEQ ID NO: 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L5),9/SEQ ID NO: 27 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L5),

11/SEQ ID NO11/SEQ ID NO

11/SEQ ID NO11/SEQ ID NO

11/SEQ ID NO11/SEQ ID NO

11/SEQ ID NO11/SEQ ID NO

11/SEQ ID NO11/SEQ ID NO

13/SEQ ID NO13/SEQ ID NO

13/SEQ ID NO13/SEQ ID NO

13/SEQ ID NO13/SEQ ID NO

13/SEQ ID NO13/SEQ ID NO

13/SEQ ID NO13/SEQ ID NO

15/SEQ ID NO15/SEQ ID NO

15/SEQ ID NO15/SEQ ID NO

15/SEQ ID NO15/SEQ ID NO

15/SEQ ID NO15/SEQ ID NO

15/SEQ ID NO15/SEQ ID NO

17/SEQ ID NO17/SEQ ID NO

17/SEQ ID NO17/SEQ ID NO

17/SEQ ID NO17/SEQ ID NO

17/SEQ ID NO17/SEQ ID NO

17/SEQ ID NO17/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

77/SEQ ID NO77/SEQ ID NO

79/SEQ ID NO (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L5), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L1),79/SEQ ID NO (herein referred to as hSIRPa.50A.H2L1), 21 (herein referred to as hSIRPa.50A.H2L2), 23 (herein referred to as hSIRPa.50A.H2L3), 25 (herein referred to as hSIRPa .50A.H2L4), 27 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H2L5), 19 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L1), 21 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L2), 23 (in this invention denoted denoted hSIRPa.50A.H3L3), 25 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L4), 27 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L5), 19 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L1), 21 (in in this invention designated hSIRPa.50A.H4L2), 23 (in this invention designated hSIRPa.50A.H4L3), 25 (in this invention designated hSIRPa.50A.H4L4), 27 (in this invention designated hSIRPa.50A.H4L5), 19 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L1), 21 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L2), 23 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L3), 25 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L4) , 27 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L5), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A. H1L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa. 40A.H2L1),

- 13 043743- 13 043743

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

79/SEQ ID NO79/SEQ ID NO

79/SEQ ID NO79/SEQ ID NO

79/SEQ ID NO79/SEQ ID NO

79/SEQ ID NO79/SEQ ID NO

79/SEQ ID NO79/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

81/SEQ ID NO81/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

83/SEQ ID NO83/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

85/SEQ ID NO85/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO87/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO87/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO87/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO87/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO87/SEQ ID NO

87/SEQ ID NO (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L6), или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.87/SEQ ID NO (herein referred to as hSIRPa.40A.H2L2), 93 (herein referred to as hSIRPa.40A.H2L3), 95 (herein referred to as hSIRPa.40A.H2L4), 97 (herein referred to as hSIRPa .40A.H2L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L2), 93 (in this invention denoted denoted hSIRPa.40A.H3L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L6), 89 (in in this invention designated hSIRPa.40A.H4L1), 91 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L2), 93 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L3), 95 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L4), 97 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L5), 99 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L6), 89 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L1), 91 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L2) , 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A. H5L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa. 40A.H6L4), 97 (herein referred to as hSIRPa.40A.H6L5), 99 (herein referred to as hSIRPa.40A.H6L6), or, in each case, a sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 19 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 19 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 27 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 27 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 89 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 89 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 91 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 91 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 95 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.In some preferred embodiments, the nucleic acid comprises SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 95 or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены векторы экспрессии, содержащие одну или более нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Вектор экспрессии представляет собой молекулу ДНК, содержащую регуляторные элементы, необходимые для транскрипции целевой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Обычно целевую нуклеиновую кислоту помещают под контроль некоторых регуляторных элементов, включая конститутивные или индуцируемые промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы и энхансерные элементы. Говорят, что такая целевая нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторными элементами, если указанный регулирующий элемент контролирует экспрессию указанного гена.The present invention also provides expression vectors containing one or more nucleic acids of the present invention. An expression vector is a DNA molecule containing regulatory elements necessary for transcription of a target nucleic acid in a host cell. Typically, the target nucleic acid is placed under the control of several regulatory elements, including constitutive or inducible promoters, tissue-specific regulatory elements and enhancer elements. Such a target nucleic acid is said to be operably linked to regulatory elements if said regulatory element controls the expression of said gene.

Данные выделенные нуклеиновые кислоты и векторы экспрессии, содержащие их, можно применять для экспрессии антител согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов в рекомбинантных клетках-хозяевах. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением так- 14 043743 же предложены клетки-хозяева, содержащие вектор экспрессии согласно настоящему изобретению.These isolated nucleic acids and expression vectors containing them can be used to express antibodies of the present invention or antigen binding fragments thereof in recombinant host cells. Thus, the present invention also provides host cells containing an expression vector according to the present invention.

Такие векторы экспрессии могут содержать одну или более из следующих последовательностей нуклеиновых кислот, функционально связанных с регуляторными элементами:Such expression vectors may contain one or more of the following nucleic acid sequences operably linked to regulatory elements:

последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 77 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 79 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 81 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 83 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 85 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 87 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 101 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 89 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 91 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 93 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 95 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 97 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 99 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 103 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и/или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a nucleic acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 79 or a nucleic acid sequence that is at least 90% identical, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 85 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99 % identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 87 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 101 or the nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 89 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence acid SEQ ID NO: 91 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 93 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 95 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 97 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 99, or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 103 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 29 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19 or nucleic acid sequence an acid at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 21, or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence , a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23 or a nucleic acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25 or a nucleic acid sequence that is at least 90% identical , 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 27 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, and/or a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 31 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

В некоторых вариантах реализации вектор экспрессии содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие как последовательность тяжелой цепи, так и последовательность легкой цепи антитела против SIRPa согласно настоящему изобретению. Предпочтительно такие векторы экспрессии содержат следующую комбинацию последовательностей нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи:In some embodiments, the expression vector contains nucleic acid sequences encoding both the heavy chain sequence and the light chain sequence of the anti-SIRPa antibody of the present invention. Preferably, such expression vectors contain the following combination of heavy chain and light chain variable region nucleic acid sequences:

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L1),SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 19 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L1),

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L2),SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 21 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L2),

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L3),SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 23 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L3),

- 15 043743- 15 043743

9/SEQ ID NO: 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L4),9/SEQ ID NO: 25 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L4),

9/SEQ ID NO: 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L5),9/SEQ ID NO: 27 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L5),

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L5), 19 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L1), 21 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L2), 23 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L3), 25 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L4), 27 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L5), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L6), 89 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L1), 91 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L2), 93 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L3), 95 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L4), 97 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L5), 99 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L6),11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 13/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 15/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 17/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 77/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 79/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 81/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 83/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 85/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO 87/SEQ ID NO (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L1), 21 (in this invention referred to as hSIRPa. 50A.H2L2), 23 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H2L3), 25 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H2L4), 27 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H2L5), 19 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H3L1), 21 (in this invention designated hSIRPa.50A.H3L2), 23 (in this invention designated hSIRPa.50A.H3L3), 25 (in this invention designated hSIRPa.50A.H3L4), 27 (in this invention in the invention denoted hSIRPa.50A.H3L5), 19 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L1), 21 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L2), 23 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L3), 25 ( in this invention designated hSIRPa.50A.H4L4), 27 (in this invention designated hSIRPa.50A.H4L5), 19 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L1), 21 (in this invention designated hSIRPa.50A.H5L2), 23 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L3), 25 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L4), 27 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L5), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L1 ), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A .H1L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H1L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa .40A.H2L3), 95 (in this invention designated hSIRPa.40A.H2L4), 97 (in this invention designated hSIRPa.40A.H2L5), 99 (in this invention designated hSIRPa.40A.H2L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L4), 97 (in in this invention designated hSIRPa.40A.H3L5), 99 (in this invention designated hSIRPa.40A.H3L6), 89 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L1), 91 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L2), 93 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L3), 95 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L4), 97 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L5), 99 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L6) , 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A. H5L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L6), 89 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L1), 91 (in this invention denoted hSIRPa. 40A.H6L2), 93 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L3), 95 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L4), 97 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L5), 99 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L6),

- 16 043743 или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.- 16 043743 or, in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

В любом из описанных выше вариантов реализации вектор экспрессии может кодировать экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, и включает последовательности нуклеиновых кислот для обеих тяжелой и легкой цепей. В одном варианте реализации антитело представляет собой IgG. В предпочтительных вариантах реализации антитело представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4, и предпочтительно представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации последовательность легкой цепи включает последовательность константного домена легкой цепи каппа человека или легкой цепи лямбда человека; и каждая последовательность тяжелой цепи включает последовательность константной области IgG4 человека.In any of the embodiments described above, the expression vector may encode expression of a human or humanized antibody, and includes nucleic acid sequences for both heavy and light chains. In one embodiment, the antibody is an IgG. In preferred embodiments, the antibody is IgG1, IgG2, or IgG4, and is preferably human IgG1, IgG2, or IgG4. In some embodiments, the light chain sequence includes a human kappa light chain or human lambda light chain constant domain sequence; and each heavy chain sequence includes a human IgG4 constant region sequence.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 9 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 19, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 9 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 19, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 15 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 27, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 15 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 27, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 17 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 19, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 17 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 19, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO or, in each case, a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is isotype IgG1, IgG2 or IgG4.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 79 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 89, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 79 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 89, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 79 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 91, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 79 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 91, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации вектор экспрессии кодирует экспрессию человеческого или гуманизированного антитела, в котором последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 79 и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи включает SEQ ID NO: 95, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO, и наиболее предпочтительно представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.In some preferred embodiments, the expression vector encodes the expression of a human or humanized antibody, wherein the heavy chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 79 and the light chain nucleic acid sequence includes SEQ ID NO: 95, or, in each case, a sequence of at least at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO, and most preferably is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.

В одном варианте реализации клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). В одном варианте реализации клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку человека, такую как клетка НЕК293, клетку хомяка, такую как клетка СНО, и т.д.), бактериальную клетку (например, клетку Е. coli), клетку дрожжей (например, клетку Pichia pastoris, и т.д.), клетку растения (например, клетку Nicotiana benthamiana) и т.д. Клетки млекопитающих предпочтительны благодаря наиболее благоприятным паттернам гликозилирования.In one embodiment, the host cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell. In one embodiment, the host cell is a mammalian cell (eg, a human cell such as a HEK293 cell, a hamster cell such as a CHO cell, etc.), a bacterial cell (eg, an E. coli cell), a yeast cell (eg Pichia pastoris cell, etc.), plant cell (eg Nicotiana benthamiana cell), etc. Mammalian cells are favored due to their most favorable glycosylation patterns.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.The present invention also provides pharmaceutical compositions comprising an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

В одном варианте реализации композиция содержит один или более дополнительных терапевтических агентов. В одном варианте реализации дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из: антитела против CD27 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против LAG3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против APRIL или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против VISTA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против BTLA или его антигенсвязывающего фрагмента; анIn one embodiment, the composition contains one or more additional therapeutic agents. In one embodiment, the additional therapeutic agent is selected from the group consisting of: an anti-CD27 antibody or antigen-binding fragment thereof; antibodies against LAG3 or its antigen-binding fragment; antibodies against APRIL or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIGIT or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against VISTA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against BTLA or an antigen-binding fragment thereof; en

- 17 043743 титела против TIM3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против HVEM или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD70 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD137 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ОХ40 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD28 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против GITR или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ICOS или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT5 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2A или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2C или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2E или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TSLP или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против IL-10 или его антигенсвязывающего фрагмента; IL-10 или пегилированного IL-10; агониста (например, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или растворимого гибридного белка) рецепторного белка TNF; иммуноглобулин-подобного белка; рецептора цитокина; интегрина; активирующих лимфоциты сигнальных молекул (белков SLAM); активирующего NK-клетку рецептора; Toll-подобного рецептора; ОХ40; CD2; CD7; CD27; CD28; CD30; CD40; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18); 4-1BB (CD137); В7-НЗ; ICOS (CD278); GITR; BAFFR; LIGHT; HVEM (LIGHTR); KIRDS2; SLAMF7; NKp80 (KLRF1); NKp44; NKp30; NKp46; CD19; CD4; CD8-альфа; CD8-бета; IL2R-бета; IL2R-гамма; IL7R-альфа; ITGA4; VLA1; CD49a; ITGA4; IA4; CD49D; ITGA6; VLA6; CD49f; ITGAD; CD11d; ITGAE; CD103; ITGAL; ITGAM; CD11b; ITGAX; CD11c; ITGB1; CD29; ITGB2; CD18; ITGB7; NKG2D; NKG2C; TNFR2; TRANCE/RANKL; DNAM1 (CD226); SLAMF4 (CD244; 2B4); CD84; CD96 (TACTILE); CEACAM1; CRTAM; Ly9 (CD229); CD160 (BY55); PSGL1; CD100 (SEMA4D); CD69; SLAMF6 (NTB-A; Ly108); SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3); SLAM7; BLAME (SLAMF8); SELPLG (CD162); LTBR; LAT; GADS; PAG/Cbp; CD19a; лиганда, который специфично связывается с CD83; ингибитора CD47, PD-1, PD-L1; PD-L2; CTLA4; TIM3; LAG3; СЕАСАМ (например; СЕАСАМ-1, -3 и/или -5); VISTA; BTLA; TIGIT; LAIR1; IDO; TDO; CD160; TGFR-бета; и циклического динуклеотида или другого агониста сигнального пути STING.- 17 043743 antibody against TIM3 or its antigen-binding fragment; antibodies against CTLA4 or its antigen-binding fragment; antibodies against HVEM or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against CD70 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD137 or its antigen-binding fragment; antibodies against OX40 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD28 or its antigen-binding fragment; antibodies against PD1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL2 or its antigen-binding fragment; antibodies against GITR or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ICOS or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ILT2 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT3 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT4 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT5 or its antigen-binding fragment; antibodies against 4-1BB or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2A or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2C or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2E or its antigen-binding fragment; antibodies against TSLP or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against IL-10 or an antigen-binding fragment thereof; IL-10 or pegylated IL-10; an agonist (eg, an agonist antibody or antigen-binding fragment or soluble fusion protein thereof) of the TNF receptor protein; immunoglobulin-like protein; cytokine receptor; integrin; lymphocyte-activating signaling molecules (SLAM proteins); NK cell activating receptor; Toll-like receptor; OX40; CD2; CD7; CD27; CD28; CD30; CD40; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18); 4-1BB (CD137); B7-NZ; ICOS (CD278); GITR; BAFFR; LIGHT; HVEM(LIGHTR); KIRDS2; SLAMF7; NKp80 (KLRF1); NKp44; NKp30; NKp46; CD19; CD4; CD8 alpha; CD8-beta; IL2R-beta; IL2R-gamma; IL7R-alpha; ITGA4; VLA1; CD49a; ITGA4; IA4; CD49D; ITGA6; VLA6; CD49f; ITGAD; CD11d; ITGAE; CD103; ITGAL; ITGAM; CD11b; ITGAX; CD11c; ITGB1; CD29; ITGB2; CD18; ITGB7; NKG2D; NKG2C; TNFR2; TRANCE/RANKL; DNAM1 (CD226); SLAMF4 (CD244; 2B4); CD84; CD96 (TACTILE); CEACAM1; CRTAM; Ly9 (CD229); CD160 (BY55); PSGL1; CD100 (SEMA4D); CD69; SLAMF6 (NTB-A; Ly108); SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3); SLAM7; BLAME(SLAMF8); SELPLG (CD162); LTBR; LAT; GADS; PAG/Cbp; CD19a; a ligand that specifically binds to CD83; CD47, PD-1, PD-L1 inhibitor; PD-L2; CTLA4; TIM3; LAG3; SEASAM (for example; SEASAM-1, -3 and/or -5); VISTA; BTLA; TIGIT; LAIR1; IDO; TDO; CD160; TGFR-beta; and a cyclic dinucleotide or other agonist of the STING signaling pathway.

Настоящее изобретение также включает комбинацию, включающую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и второе антитело, которое индуцирует антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (АЗКЦ), при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению повышает опосредованное вторым антителом разрушение клеток. Антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность (АЗКЦ) представляет собой механизм опосредованной клетками иммунной защиты, посредством которого эффекторная клетка иммунной системы активно лизирует целевую клетку, антигены на поверхности мембраны которой были связаны специфическими антителами. Часто считают, что АЗКЦ опосредована клетками-естественными киллерами (NK), но дендритные клетки, макрофаги, моноциты и гранулоциты также могут опосредовать АЗКЦ.The present invention also includes a combination comprising an antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention and a second antibody that induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), wherein the antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention enhances the second antibody-mediated cell destruction. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) is a mechanism of cell-mediated immune defense whereby an effector cell of the immune system actively lyses a target cell whose membrane surface antigens have been bound by specific antibodies. ADCC is often thought to be mediated by natural killer (NK) cells, but dendritic cells, macrophages, monocytes, and granulocytes can also mediate ADCC.

Настоящее изобретение также включает комбинацию, включающую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и второе антитело, которое индуцирует АЗКФ, при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению повышает опосредованный антителами фагоцитоз клеток вторым антителом. Антителозависимый опосредованный клетками фагоцитоз (АЗКФ) представляет собой механизм опосредованной клетками иммунной защиты, с помощью которого клетки-мишени уничтожаются посредством опосредованного гранулоцитами, моноцитами, дендритными клетками или макрофагами фагоцитоза.The present invention also includes a combination comprising an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention and a second antibody that induces ADCP, wherein said antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention enhances antibody-mediated phagocytosis of cells by the second antibody. Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) is a cell-mediated immune defense mechanism by which target cells are killed through granulocyte, monocyte, dendritic cell, or macrophage-mediated phagocytosis.

Клетки-естественные киллеры (NK) играют главную роль в иммунотерапии рака, которая включает нацеливание на антиген опухоли с помощью моноклональных антител (МАТ). В контексте нацеливания клеток NK-клетки можно специфично активировать посредством некоторых Fc-рецепторов, которые экспрессируются на поверхности данных клеток. NK-клетки могут экспрессировать FcyRIIIA и/или FcyRIIC, которые могут связываться с Fc-областью иммуноглобулинов, передавая активирующие сигналы внутри NK-клеток. После активации посредством Fc-рецепторов антителами, связанными с клеткамимишенями, NK-клетки способны лизировать клетки-мишени без примирования и секретировать цитокины, такие как интерферон-гамма, для привлечения клеток приобретенного иммунитета. Аналогичным образом, макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО), экспрессируют рецепторы на поверхности, которые связываются с Fc-фрагментами антител и позволяют им участвовать в АТ-зависимой опосредованной клетками цитотоксичности/фагоцитозе (АЗКЦ/АЗКФ). Так как передача сигнала SIRPa/CD47 индуцирует ответ не ешь меня, который снижает АЗКЦ/АЗКФ, блокирование данной передачи сигнала антителами против SIRPa или антигенсвязывающими фрагментами согласно настоящему изобретению может повышать АЗКЦ в отношении опухолевых клеток, несущих антигенную детерминанту, на которую направлено терапевтическое антитело.Natural killer (NK) cells play a major role in cancer immunotherapy, which involves targeting tumor antigens using monoclonal antibodies (MAbs). In the context of cell targeting, NK cells can be specifically activated through certain Fc receptors that are expressed on the surface of these cells. NK cells can express FcyRIIIA and/or FcyRIIC, which can bind to the Fc region of immunoglobulins, transmitting activating signals within NK cells. Once activated through Fc receptors by antibodies bound to target cells, NK cells are able to lyse target cells without priming and secrete cytokines such as interferon-gamma to attract adaptive immune cells. Likewise, tumor-associated macrophages (TAMs) express receptors on their surface that bind to Fc fragments of antibodies and allow them to participate in AT-dependent cell-mediated cytotoxicity/phagocytosis (ADCC/ADCP). Since SIRPa/CD47 signaling induces a don't eat me response that reduces ADCC/ADCC, blocking this signaling with anti-SIRPa antibodies or antigen binding moieties of the present invention may increase ADCC against tumor cells bearing the antigenic determinant targeted by the therapeutic antibody.

- 18 043743- 18 043743

Такие АЗКЦ/АЗКФ как механизм действия можно применять для лечения различных видов рака и инфекционных заболеваний. Типичный перечень индуцирующих АЗКЦ/АЗКФ антител и конъюгатов антител, которые можно комбинировать с антителами или антигенсвязывающими фрагментами согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничен перечисленными антителами: ритуксимаб, ублитуксимаб, маргетуксимаб, MGN-529, SCT400, велтузумаб, обинутузумаб, ADCT-502, Hul4,18K322A, Hu3F8, динутуксимаб, трастузумаб, цетуксимаб, ритуксимаб-RLI, C.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, и (CD20)2xCD16, эрлотиниб (тарцева), даратумумаб, алемтузумаб, пертузумаб, брентуксимаб, элотузумаб, ибритумомаб, ифаботузумаб, фарлетузумаб, отлертузумаб, каротуксимаб, эпратузумаб, инебилизумаб, лумретузумаб, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, могамулизумаб, ChiLob-7/4, лейкотуксимаб, изатуксимаб, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04, XOMA-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, опортузумаб, энситуксимаб, ведотин (адцетрис), ибритумомаб тиуксетан, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC и адо-трастузумаб эмтанзин (кадсила). Типичный перечень целевых антигенов для таких индуцирующих АЗКЦ/АЗКФ антител включает, но не ограничен перечисленными антигенами: AMHR2, AXL, BCMA, CAIX, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, эндоглин, ЕРНА2, EphA3, FGFR2b, рецептор фолиевой кислоты альфа, фуkозuл-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, антиген миеломы-каппа, MS4A1, рецептор пролактина, ТА-MUCI и PSMA.Such ADCC/ADCP mechanism of action can be used to treat various types of cancer and infectious diseases. A typical list of ADCC/ADCP-inducing antibodies and antibody conjugates that can be combined with antibodies or antigen binding fragments of the present invention includes, but is not limited to, the following antibodies: rituximab, ublituximab, margetuximab, MGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, ADCT-502 , Hul4,18K322A, Hu3F8, dinutuximab, trastuzumab, cetuximab, rituximab-RLI, C.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, and (CD20) 2 xCD16, erlotinib (Tarceva), daratumumab, alemtuzumab, pertuzumab , brentuximab, elotuzumab, ibritumomab, ifabotuzumab, farletuzumab, otlertuzumab, carotuximab, epratuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-836826, B MS-986012, BVX-20 , mogamulizumab, ChiLob-7/4, leukotuximab, isatuximab, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04, XOMA-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003 , IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, oportuzumab, ensituximab, vedotin (Adcetris), ibritumomab tiuxetan, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC and ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla). A typical list of target antigens for such ADCC/ADCP-inducing antibodies includes, but is not limited to, the following antigens: AMHR2, AXL, BCMA, CAIX, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R , GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, endoglin, EPHA2, EphA3, FGFR2b, folic acid receptor alpha, fucosul-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, myeloma-kappa antigen, MS4A1, prolactin receptor, TA-MUCI and PSMA.

В некоторых вариантах реализации второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент индуцирует АЗКФ. Исключительно в качестве примера такие антитела можно выбрать из группы, состоящей из ритуксимаба, ублитуксимаба, маргетуксимаба, MGN-529, SCT400, велтузумаба, обинутузумаба, трастузумаба, цетуксимаба, алемтузумаба, ибритумомаба, фарлетузумаба, инебилизумаба, лумретузумаба, 4G7SDIE, BMS-986012, BVX-20, могамулизумаба, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927, MDX-1097, MOR202 и MOR-208.In some embodiments, the second antibody or antigen-binding fragment thereof induces ADCP. By way of example only, such antibodies may be selected from the group consisting of rituximab, ublituximab, margetuximab, MGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, trastuzumab, cetuximab, alemtuzumab, ibritumomab, farletuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, B MS-986012, BVX -20, mogamulizumab, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927, MDX-1097, MOR202 and MOR-208.

В вариантах реализации, в которых антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению комбинируют с одним или более индуцирующими АЗКЦ/АЗКФ антителами и конъюгатами антител, такие комбинации также можно необязательно применять в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой. В одном варианте реализации дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из: антитела против LAG3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против APRIL или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против VISTA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против BTLA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIM3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против HVEM или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD70 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD137 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ОХ40 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD28 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против GITR или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ICOS или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT5 или его антигенсвязывающего фрагмента; и антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2A или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2C или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2E или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TSLP или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против IL-10 или его антигенсвязывающего фрагмента; и IL-10 или пегилированного IL-10.In embodiments in which antibodies or antigen-binding fragments of the present invention are combined with one or more ADCC/ADCP-inducing antibodies and antibody conjugates, such combinations may also optionally be used in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure. In one embodiment, the additional therapeutic agent is selected from the group consisting of: an anti-LAG3 antibody or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against APRIL or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIGIT or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against VISTA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against BTLA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIM3 or its antigen-binding fragment; antibodies against CTLA4 or its antigen-binding fragment; antibodies against HVEM or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against CD70 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD137 or its antigen-binding fragment; antibodies against OX40 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD28 or its antigen-binding fragment; antibodies against PD1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL2 or its antigen-binding fragment; antibodies against GITR or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ICOS or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ILT2 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT3 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT4 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT5 or its antigen-binding fragment; and antibodies against 4-1BB or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against NKG2A or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2C or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2E or its antigen-binding fragment; antibodies against TSLP or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against IL-10 or an antigen-binding fragment thereof; and IL-10 or pegylated IL-10.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены сосуд или устройство для инъекции, содержащие любое из направленных против SIRPa антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению.The present invention also provides an injection vessel or device containing any of the anti-SIRPa antibodies or antigen binding fragments of the present invention.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ получения направленного против SIRPa антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, включающий: культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела согласно настоящему изобретению (или его антигенсвязывающий фрагмент), при условиях, благоприятных для экспрессии полинуклеотида; и необязательно выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина и/или культуральной среды. В одном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, находятся в одном векторе. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, находятся в различных векторах.The present invention also provides a method for producing an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment according to the present invention, comprising: culturing a host cell containing a polynucleotide encoding the heavy chain and/or light chain of an antibody according to the present invention (or an antigen binding fragment thereof), with conditions favorable for polynucleotide expression; and optionally isolating the antibody or antigen-binding fragment thereof from the host cell and/or culture medium. In one embodiment, the polynucleotide encoding the heavy chain and the polynucleotide encoding the light chain are in the same vector. In another embodiment, the polynucleotide encoding the heavy chain and the polynucleotide encoding the light chain are in different vectors.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества направленногоThe present invention also provides a method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering to said subject an effective amount of targeted

- 19 043743 против SIRPa антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой.- 19 043743 against SIRPa antibody or antigen binding fragment according to the present invention, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure.

В одном варианте реализации субъект, которого нужно лечить, представляет собой человека. В одном варианте реализации дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из: антитела против LAG3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против APRIL или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против VISTA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против BTLA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIM3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против HVEM или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD70 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD137 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ОХ40 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD28 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против GITR или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ICOS или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT5 или его антигенсвязывающего фрагмента; и антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2A или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2C или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2E или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TSLP или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против IL-10 или его антигенсвязывающего фрагмента; и IL-10 или пегилированного IL-10.In one embodiment, the subject to be treated is a human. In one embodiment, the additional therapeutic agent is selected from the group consisting of: an anti-LAG3 antibody or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against APRIL or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIGIT or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against VISTA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against BTLA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIM3 or its antigen-binding fragment; antibodies against CTLA4 or its antigen-binding fragment; antibodies against HVEM or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against CD70 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD137 or its antigen-binding fragment; antibodies against OX40 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD28 or its antigen-binding fragment; antibodies against PD1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL2 or its antigen-binding fragment; antibodies against GITR or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ICOS or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ILT2 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT3 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT4 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT5 or its antigen-binding fragment; and antibodies against 4-1BB or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against NKG2A or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2C or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2E or its antigen-binding fragment; antibodies against TSLP or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against IL-10 or an antigen-binding fragment thereof; and IL-10 or pegylated IL-10.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения инфекции или инфекционного заболевания у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой. В одном варианте реализации субъект, которого нужно лечить, представляет собой человека.The present invention also provides a method of treating an infection or infectious disease in a subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure. In one embodiment, the subject to be treated is a human.

В одном варианте реализации дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из: антитела против LAG3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против APRIL или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIGIT или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против VISTA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против BTLA или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TIM3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против HVEM или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD70 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD137 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ОХ40 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против CD28 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PD1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL1 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против PDL2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против GITR или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ICOS или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT2 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT4 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против ILT5 или его антигенсвязывающего фрагмента; и антитела против 4-1ВВ или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2A или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2C или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против NKG2E или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против TSLP или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела против IL-10 или его антигенсвязывающего фрагмента; и IL-10 или пегилированного IL-10.In one embodiment, the additional therapeutic agent is selected from the group consisting of: an anti-LAG3 antibody or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against APRIL or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIGIT or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against VISTA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against BTLA or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against TIM3 or its antigen-binding fragment; antibodies against CTLA4 or its antigen-binding fragment; antibodies against HVEM or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against CD70 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD137 or its antigen-binding fragment; antibodies against OX40 or its antigen-binding fragment; antibodies against CD28 or its antigen-binding fragment; antibodies against PD1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL1 or its antigen-binding fragment; antibodies against PDL2 or its antigen-binding fragment; antibodies against GITR or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ICOS or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against ILT2 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT3 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT4 or its antigen-binding fragment; antibodies against ILT5 or its antigen-binding fragment; and antibodies against 4-1BB or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against NKG2A or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2C or its antigen-binding fragment; antibodies against NKG2E or its antigen-binding fragment; antibodies against TSLP or an antigen-binding fragment thereof; antibodies against IL-10 or an antigen-binding fragment thereof; and IL-10 or pegylated IL-10.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ обнаружения присутствия пептида SIRPa или его фрагмента в образце, включающий приведение в контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению и детектирование присутствия комплекса между указанным антителом или фрагментом и пептидом; при этом обнаружение указанного комплекса свидетельствует о присутствии пептида SIRPa.The present invention also provides a method for detecting the presence of a SIRPa peptide or fragment thereof in a sample, comprising contacting the sample with an antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention and detecting the presence of a complex between said antibody or fragment and the peptide; Moreover, the detection of this complex indicates the presence of the SIRPa peptide.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг. 1 изображена перекрестная реакционная способность доступных для приобретения антител, направленных против hSIRPa, по отношению к hSIRPe1 и аллель-специфическое связывание с hSIRPaV1 и hSIRPaV2.In fig. 1 depicts the cross-reactivity of commercially available anti-hSIRPa antibodies to hSIRPe1 and allele-specific binding to hSIRPaV1 and hSIRPaV2.

На фиг. 2 изображена реакционная способность антитела KWAR23 по отношению к hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 и hSIRPy.In fig. Figure 2 shows the reactivity of the KWAR23 antibody towards hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 and hSIRPy.

На фиг. 3 изображена реакционная способность клона антитела hSIRPa.50A по отношению к различным аллелям hSIRPa.In fig. Figure 3 shows the reactivity of the hSIRPa.50A antibody clone towards various hSIRPa alleles.

На фиг. 4 изображена способность антитела hSIRPa.50A блокировать связывание рекомбинантного белка hCD47/Fc с экспрессированным на поверхности клетки hSIRPa.In fig. 4 shows the ability of the hSIRPa.50A antibody to block the binding of the recombinant hCD47/Fc protein to hSIRPa expressed on the cell surface.

- 20 043743- 20 043743

На фиг. 5А и фиг. 5В изображено связывание антитела hSIRPa.50A с первичными обогащеннымиIn fig. 5A and FIG. 5B depicts the binding of hSIRPa.50A antibody to primary enriched

CD14+ моноцитами человека.CD14+ human monocytes.

На фиг. 5С и фиг. 5D изображена способность антитела hSIRPa.50A блокировать связывание hCD47 с первичными обогащенными CD14+ моноцитами человека.In fig. 5C and FIG. 5D depicts the ability of the hSIRPa.50A antibody to block the binding of hCD47 to primary enriched CD14+ human monocytes.

На фиг. 6А изображено связывание антитела hSIRPa. 50А с первичными гранулоцитами человека.In fig. 6A depicts the binding of hSIRPa antibody. 50A with primary human granulocytes.

На фиг. 6В изображен фагоцитоз опухолевых клеток первичными гранулоцитами человека в присутствии ритуксимаба плюс или минус антитело hSIRPa.50A.In fig. 6B depicts phagocytosis of tumor cells by primary human granulocytes in the presence of rituximab plus or minus hSIRPa.50A antibody.

На фиг. 6С изображен фагоцитоз опухолевых клеток первичными гранулоцитами человека в присутствии даратумумаба плюс или минус антитело hSIRPa.50A.In fig. 6C depicts phagocytosis of tumor cells by primary human granulocytes in the presence of daratumumab plus or minus hSIRPa.50A antibody.

На фиг. 6D изображен фагоцитоз опухолевых клеток первичными гранулоцитами человека в присутствии алемтузумаба плюс или минус антитело hSIRPa. 50А.In fig. 6D depicts phagocytosis of tumor cells by primary human granulocytes in the presence of alemtuzumab plus or minus hSIRPa antibody. 50A.

На фиг. 6Е изображен фагоцитоз опухолевых клеток первичными гранулоцитами человека в присутствии цетуксимаба плюс или минус антитело hSIRPa. 50А.In fig. 6E depicts phagocytosis of tumor cells by primary human granulocytes in the presence of cetuximab plus or minus hSIRPa antibody. 50A.

На фиг. 7 изображен фагоцитоз опухолевых клеток макрофагами человека в присутствии указанного антитела (ритуксимаба или даратумумаба) плюс или минус антитело hSIRPa.50A.In fig. 7 depicts phagocytosis of tumor cells by human macrophages in the presence of the indicated antibody (rituximab or daratumumab) plus or minus the hSIRPa.50A antibody.

На фиг. 8 изображено блокирование взаимодействия hSIRPa/hCD47 антителом hSIRPa.50A мыши и гуманизированным антителом hSIRPa.50A против hSIRPa.In fig. 8 shows the blocking of the hSIRPa/hCD47 interaction by the mouse hSIRPa.50A antibody and the humanized anti-hSIRPa antibody hSIRPa.50A.

На фиг. 9 изображено связывание антитела hSIRPa.50Ac hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPaVeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a и hSIRPa-VaC1aC2e.In fig. 9 depicts hSIRPa.50Ac antibody binding to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPaVeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a and hSIRPa-VaC1aC2e.

На фиг. 10А изображено выравнивание последовательностей аминокислот домена IgV hSIRPa и hSIRPe1.In fig. 10A depicts an amino acid sequence alignment of the IgV domain of hSIRPa and hSIRPe1.

На фиг. 10В изображено прекращение связывания антитела hSIRPa.50A с hSIRPaV1(P74A).In fig. 10B shows the termination of binding of the antibody hSIRPa.50A to hSIRPaV1(P74A).

На фиг. 11 изображено связывание антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL и hSIRPy.In fig. 11 depicts the binding of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL and hSIRPy.

На фиг. 12 изображено связывание антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3, hSIRPaV4, hSIRPaV5, hSIRPaV6, hSIRPaV8 и hSIRPaV9.In fig. 12 shows the binding of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3, hSIRPaV4, hSIRPaV5, hSIRPaV6, hSIRPaV8 and hSIRPaV9.

На фиг. 13 изображена способность антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A блокировать связывание рекомбинантного белка hCD47/Fc с экспрессированным на поверхности клетки hSIRPa.In fig. 13 shows the ability of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A to block the binding of recombinant hCD47/Fc protein to hSIRPa expressed on the cell surface.

На фиг. 14А и фиг. 14В изображено связывание антитела hSIRPa.40A с первичными обогащенными CD14+ моноцитами человека.In fig. 14A and FIG. 14B depicts the binding of hSIRPa.40A antibody to primary enriched CD14+ human monocytes.

На фиг. 14С и фиг. 14D изображена способность антитела hSIRPa.40A блокировать связывание hCD47 с первичными обогащенными CD14+ моноцитами человека.In fig. 14C and FIG. 14D depicts the ability of the hSIRPa.40A antibody to block the binding of hCD47 to primary enriched CD14+ human monocytes.

На фиг. 15А изображено связывание антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с первичными гранулоцитами человека.In fig. 15A depicts the binding of hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies to primary human granulocytes.

На фиг. 15В изображен фагоцитоз клеток Ramos первичными гранулоцитами человека в присутствии ритуксимаба плюс или минус антитела hSIRPa.40A и hSIRPa.50A.In fig. 15B depicts phagocytosis of Ramos cells by primary human granulocytes in the presence of rituximab plus or minus hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies.

На фиг. 16 изображено повышение антителами hSIRPa.40A и hSIRPa.50A вызванного ритуксимабом фагоцитоза клеток Raji.In fig. 16 shows the enhancement of rituximab-induced phagocytosis of Raji cells by hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies.

На фиг. 17 изображено связывание антитела hSIRPa.40A мыши и гуманизированного антитела hSIRPa.40A с hSIRPa.In fig. 17 depicts binding of mouse hSIRPa.40A antibody and humanized hSIRPa.40A antibody to hSIRPa.

На фиг. 18 изображено блокирование связывания hCD47 с hSIRPa в присутствии вариантов гуманизированного антитела hSIRPa.40A.In fig. 18 depicts the blocking of hCD47 binding to hSIRPa in the presence of humanized antibody variants hSIRPa.40A.

На фиг. 19 изображено связывание антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRP-VyC1eC2e, hSIRP-VeC1yC2e и hSIRP-VeC1eC2y.In fig. 19 depicts the binding of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRP-VyC1eC2e, hSIRP-VeC1yC2e and hSIRP-VeC1eC2y.

На фиг. 20 изображено прекращение связывания антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с hSIRPaV1(P74A).In fig. 20 shows the termination of binding of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A to hSIRPaV1(P74A).

На фиг. 21 изображена способность вариантов химерного антитела hSIRPa.40A влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.In fig. 21 depicts the ability of chimeric antibody variants hSIRPa.40A to influence rituximab-mediated phagocytosis.

На фиг. 22 изображена способность вариантов гуманизированного антитела hSIRPa.40A влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.In fig. 22 depicts the ability of humanized antibody variants hSIRPa.40A to influence rituximab-mediated phagocytosis.

На фиг. 23А изображена способность hSIRPa.50A мыши и вариантов химерного антитела hIgG2 и hIgG4 hSIRPa. 50А влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.In fig. 23A depicts the ability of mouse hSIRPa.50A and hIgG2 and hIgG4 hSIRPa chimeric antibody variants. 50A influence rituximab-mediated phagocytosis.

На фиг. 23В изображена способность вариантов химерного антитела hIgG2 и hIgG4 hSIRPa.50A влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.In fig. 23B depicts the ability of the chimeric antibody variants hIgG2 and hIgG4 hSIRPa.50A to affect rituximab-mediated phagocytosis.

На фиг. 23С изображена способность вариантов химерного антитела hIgG2 и hIgG4 hSIRPa.50A влиять на опосредованный даратумумабом фагоцитоз.In fig. 23C depicts the ability of the hIgG2 and hIgG4 hSIRPa.50A chimeric antibody variants to influence daratumumab-mediated phagocytosis.

На фиг. 23D изображена способность hSIRPa.50A мыши и вариантов химерного антитела hIgG2 hSIRPa. 50А влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз в гранулоцитах.In fig. 23D depicts the ability of mouse hSIRPa.50A and hIgG2 hSIRPa chimeric antibody variants. 50A influence rituximab-mediated phagocytosis in granulocytes.

На фиг. 24А изображена способность hSIRPa.50A мыши и вариантов химерного антителаIn fig. 24A depicts the ability of mouse hSIRPa.50A and chimeric antibody variants

- 21 043743 hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q или hSIRPa.50A.hIgG2 влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.- 21 043743 hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q or hSIRPa.50A.hIgG2 influence rituximab-mediated phagocytosis.

На фиг. 24В изображена способность hSIRPa.50A мыши и вариантов химерного антитела hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q или hSIRPa.50A.hIgG2 влиять на опосредованный даратумумабом фагоцитоз.In fig. 24B depicts the ability of mouse hSIRPa.50A and the chimeric antibody variants hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q, or hSIRPa.50A.hIgG2 to affect daratumumab-mediated phagocytosis.

На фиг. 25 изображена способность вариантов химерного антитела hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G и hIgG2 или hIgG4 hSIRPa.50A влиять на опосредованный ритуксимабом фагоцитоз.In fig. 25 depicts the ability of the chimeric antibody variants hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G and hIgG2 or hIgG4 hSIRPa.50A to influence rituximab-mediated phagocytosis.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Сокращения.Abbreviations.

На всем протяжении подробного описания и примеров настоящего изобретения применяют следующие сокращения:Throughout the detailed description and examples of the present invention, the following abbreviations are used:

АЗКЦ Антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичностьADCC Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

АЗКФ Антителозависимый опосредованный клетками фагоцитозADCP Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis

КЗЦ Комплемент-зависимая цитотоксичностьCZC Complement-dependent cytotoxicity

CDR Определяющая комплементарность область в вариабельных областях иммуноглобулина, определенная с применением системы нумерации по КабатуCDR Complementarity determining region in immunoglobulin variable regions, defined using the Kabat numbering system

СНО Яичник китайского хомячкаSHO Chinese Hamster Ovary

ЕС50 Концентрация, при которой наблюдается 50% полного сигнала связыванияEC50 Concentration at which 50% of the total binding signal is observed

ELISA Твердофазный иммуноферментный анализELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FR Каркасная область антитела: вариабельные области иммуноглобулина за исключением участков CDR.FR Antibody framework region: the variable regions of an immunoglobulin excluding the CDR regions.

HRP Пероксидаза хренаHRP Horseradish peroxidase

IFN ИнтерферонIFN Interferon

IC50 Концентрация, приводящая к 50%-ному ингибированиюIC50 Concentration resulting in 50% inhibition

IgG Иммуноглобулин GIgG Immunoglobulin G

Кабат Система выравнивания и нумерации иммуноглобулинов, впервые предложенная Elvin А.Kabat System of alignment and numbering of immunoglobulins, first proposed by Elvin A.

Kabat ((1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5oe изд., Служба общественного здравоохранения, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд).Kabat ((1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD).

мАТ, или Мат, или МАТ Моноклональное антителоmAb, or Mat, or MAT Monoclonal antibody

SEB Энтеротоксин В стафилококкаSEB Enterotoxin B Staphylococcus

ТТ Столбнячный анатоксинTT Tetanus toxoid

V-область Фрагмент Ig цепей, последовательность которого вариабельна между различными антителами. Она простирается до остатка 109 по Кабату в легкой цепи и 113 - в тяжелой цепи.V region A fragment of Ig chains, the sequence of which is variable between different antibodies. It extends to Kabat residue 109 in the light chain and 113 in the heavy chain.

VH Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулинаVH Immunoglobulin heavy chain variable region

VK Вариабельная область легкой цепи каппа иммуноглобулинаVK Immunoglobulin kappa light chain variable region

VL Вариабельная область легкой цепи иммуноглобулинаVL Immunoglobulin light chain variable region

Определения.Definitions.

Для того чтобы настоящее изобретение можно более легче понять, ниже приведены конкретные определения некоторых технических и научных терминов. За исключением случаев, когда приведены конкретные определения в других местах в данном документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном изобретении, имеют значения, которые обычно понимает средний специалист в области, к которой относится настоящее изобретение.In order that the present invention may be more easily understood, specific definitions of certain technical and scientific terms are provided below. Except as specifically defined elsewhere herein, all other technical and scientific terms used in this invention have the meanings commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention relates.

В данном изобретении, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа терминов включают ссылку на множественное число соответствующих терминов, если в контексте явно не указано иное.In this invention, including the appended claims, the singular forms of terms include reference to the plural of the corresponding terms unless the context clearly indicates otherwise.

Введение и лечение применительно к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости относится к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического агента или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. В объем термина обработка клетки входит контакт реагента с клеткой, а также контакт реагента с жидкостью, при этом жидкость находится в контакте с клеткой. Введение и лечение также означает лечение, например, клетки in vitro и ex vivo реагентом, диагностическим агентом, связывающим соединением или другой клеткой.Administration and treatment, as applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ or biological fluid, refers to the contact of an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic agent or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ or biological fluid. The term cell processing includes contact of a reagent with a cell, as well as contact of a reagent with a liquid, wherein the liquid is in contact with the cell. Administration and treatment also means treating, for example, cells in vitro and ex vivo with a reagent, diagnostic agent, binding compound or other cell.

Лечить или лечение означает вводить терапевтический агент, такой как композиция, содержа- 22 043743 щая любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению, вовнутрь или наружно субъекту или пациенту, проявляющему один или более симптомов заболевания, или у которого подозревают наличие заболевания, по отношению к которому указанный агент обладает терапевтической активностью. Обычно агент вводят в количестве, эффективном для смягчения одного или более симптомов заболевания у получающего лечение субъекта или популяции, либо индуцируя ослабление, либо ингибируя прогрессирование такого(их) симптома(ов) до любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, которое эффективно смягчает любой конкретный симптом заболевания, может изменяться, в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст и масса тела пациента и способность лекарственного средства индуцировать желательный ответ у субъекта. Произошло ли смягчение симптома заболевания, можно оценить с помощью любого клинического измерения, которое обычно используют врачи или другие квалифицированные представители услуг здравоохранения для оценки тяжести или статуса прогрессирования данного симптома.To treat or cure means to administer a therapeutic agent, such as a composition containing any of the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention, internally or externally to a subject or patient exhibiting one or more symptoms of a disease, or suspected of having a disease, with respect to for which said agent has therapeutic activity. Typically, the agent is administered in an amount effective to alleviate one or more symptoms of a disease in the subject or population being treated, either inducing relief or inhibiting the progression of such symptom(s) to any clinically measurable degree. The amount of therapeutic agent that effectively alleviates any particular disease symptom may vary depending on factors such as the stage of the disease, the age and body weight of the patient, and the ability of the drug to induce a desired response in the subject. Whether a disease symptom has improved can be assessed by any clinical measure commonly used by physicians or other qualified health care providers to assess the severity or progression status of a given symptom.

Рекомбинантная экспрессия белка означает транскрипцию и трансляцию экзогенного гена в организме хозяина с получением белка, который в данном изобретении называют рекомбинантным белком.Recombinant protein expression means the transcription and translation of an exogenous gene in the host to produce a protein, which in this invention is called a recombinant protein.

SIRPa и связанные с ним белки.SIRPa and related proteins.

SIRPa относится к классу мембранных белков, известных как парные рецепторы, который включает несколько генов, кодирующих белки (например, SIRPa, SIRPe1 и SIRPy) со сходными внеклеточными участками, но различными трансмембранными и/или цитоплазматическими участками, обладающие противоположными (активирующими или ингибиторными) сигнальными способностями. Подобно SIRPa, существует несколько примеров парных рецепторов на NK-клетках и несколько - на миелоидных клетках, включая семейства рецепторов SIRP и CD200 (Hatherley и др., Mol Cell. 2008; 31: 266-277).SIRPa belongs to a class of membrane proteins known as paired receptors, which includes several genes encoding proteins (for example, SIRPa, SIRPe1 and SIRPy) with similar extracellular regions, but different transmembrane and/or cytoplasmic regions, having opposing (activating or inhibitory) signaling abilities. Like SIRPa, there are several examples of paired receptors on NK cells and several on myeloid cells, including the SIRP and CD200 families of receptors (Hatherley et al., Mol Cell. 2008; 31: 266-277).

SIRPa содержит внеклеточный участок, который можно подразделить на три отдельных домена: Igподобный домен (иммуноглобулин-подобный) V-типа (IgV), Ig-подобный домен С1-типа (IgC1) и Igподобный домен С2-типа (IgC2). Домен IgV также известен как лиганд-связывающий N-концевой домен SIRPa. Подобно SIRPa, родственные белки SIRPe1 и SIRPy также содержат внеклеточный участок, который можно подразделить на домены IgV, IgC1 и IgC2. Тем не менее, SIRPa, SIRPe1 и SIRPy содержат различные цитоплазматические участки. SIRPe 1 содержит очень короткий цитоплазматический участок лишь из 6 аминокислот, в котором отсутствуют сигнальные мотивы для ассоциации с фосфатазами. Вместо этого, данный белок ассоциируется с активирующим DNAX белком 12 (DAP12) - димерным адапторным белком, который связывает аминокислоту с основной боковой цепью в трансмембранном участке SIRPe 1 и способен передавать активирующие сигналы через иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM). SIRPy также содержит короткий цитоплазматический участок из 4 аминокислот, но в нем отсутствует заряженная боковая цепь аминокислоты в трансмембранном участке, и, следовательно, он не связывается с DAP12. Следовательно, SIRPy описан как несигнальный белок (Barclay, A.N. и Brown, M.H., Nat Rev Immunol. 2006; 6: 457-464).SIRPa contains an extracellular region that can be divided into three distinct domains: a V-type Ig-like domain (IgV), a C1-type Ig-like domain (IgC1), and a C2-type Ig-like domain (IgC2). The IgV domain is also known as the ligand binding N-terminal domain of SIRPa. Like SIRPa, the related proteins SIRPe1 and SIRPy also contain an extracellular region that can be subdivided into IgV, IgC1, and IgC2 domains. However, SIRPa, SIRPe1, and SIRPy contain distinct cytoplasmic regions. SIRPe 1 contains a very short cytoplasmic region of only 6 amino acids, which lacks signaling motifs for association with phosphatases. Instead, the protein associates with DNAX activating protein 12 (DAP12), a dimeric adapter protein that binds an amino acid to a major side chain in the transmembrane region of SIRPe 1 and is capable of transducing activating signals through the immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM). SIRPy also contains a short cytoplasmic region of 4 amino acids, but it lacks a charged amino acid side chain in the transmembrane region and therefore does not bind DAP12. Consequently, SIRPy is described as a non-signaling protein (Barclay, A.N. and Brown, M.H., Nat Rev Immunol. 2006; 6: 457-464).

Основным лигандом SIRPa является CD47, который состоит из одного внеклеточного домена IgV, пять раз пронизывающего мембрану домена и короткого цитоплазматического хвоста. CD47 действует как клеточный лиганд, при этом связывание опосредуется через NH2-концевой домен IgV SIRPa. Подтверждение того, что CD47 способствует распознаванию своего, следует из наблюдения, что макрофаги селезенки, полученные из экспрессирующих CD47 мышей, устраняют введенные путем инфузии клетки CD47’/’ крови мышей (Oldenborg и др., Science. 2000; 288: 2051-2054).The main ligand of SIRPa is CD47, which consists of a single extracellular IgV domain, a five-fold membrane-spanning domain, and a short cytoplasmic tail. CD47 acts as a cellular ligand, with binding mediated through the NH2-terminal domain of IgV SIRPa. Confirmation that CD47 promotes self recognition comes from the observation that splenic macrophages derived from CD47-expressing mice eliminate infused CD47'/' cells from mouse blood (Oldenborg et al., Science. 2000; 288: 2051-2054). .

Дополнительно к CD47 были описаны два других лиганда SIRPa, известных как поверхностноактивные белки А и D (Sp-A и Sp-D), оба из которых относятся к семейству коллектинов. Сообщали, что Sp-D связывается с расположенным рядом с мембраной доменом IgC2 SIRPa зависимым от кальция и сахарида образом. Считают, что Sp-A и Sp-D помогают сохранять противовоспалительное окружение в легком путем стимуляции SIRPa на макрофагах альвеол (Gardai и др., Cell. 2003; 115: 13-23).In addition to CD47, two other SIRPa ligands have been described, known as surfactant proteins A and D (Sp-A and Sp-D), both of which belong to the collectin family. Sp-D was reported to bind to the membrane-local IgC2 SIRPa domain in a calcium- and saccharide-dependent manner. Sp-A and Sp-D are thought to help maintain an anti-inflammatory environment in the lung by stimulating SIRPa on alveolar macrophages (Gardai et al., Cell. 2003; 115: 13-23).

Последовательности аминокислот восьми вариантов SIRPa человека представлены в SEQ ID NO: 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52 и 54; примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих данные варианты, представлены в SEQ ID NO: 33, 35, 43, 45, 47, 49, 51 и 53, соответственно.The amino acid sequences of the eight human SIRPa variants are shown in SEQ ID NO: 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52 and 54; examples of nucleic acid sequences encoding these variants are provided in SEQ ID NOs: 33, 35, 43, 45, 47, 49, 51 and 53, respectively.

Для сравнения, последовательности аминокислот SIRPe 1 и SIRPy человека представлены в SEQ ID NO: 38 и 40, соответственно, и примеры последовательностей нуклеиновых кислот представлены в SEQ ID NO: 37 и 39, соответственно.For comparison, the amino acid sequences of human SIRPe 1 and SIRPy are shown in SEQ ID NOs: 38 and 40, respectively, and example nucleic acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 37 and 39, respectively.

Последовательность аминокислот CD47 человека представлена в SEQ ID NO: 42, и пример последовательности нуклеиновой кислоты представлен в SEQ ID NO: 41.The amino acid sequence of human CD47 is provided in SEQ ID NO: 42, and an example nucleic acid sequence is provided in SEQ ID NO: 41.

Модифицированные полипептиды SIRPa hSIRPa-VeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a, hSIRPaVaC1aC2e и hSIRPaV1(P74A), которые обсуждаются далее в данном изобретении, представлены в SEQ ID NO: 56, 58, 60, и 62; примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих данные варианты, перечислены в SEQ ID NO: 55, 57, 59 и 61, соответственно.The modified SIRPa polypeptides hSIRPa-VeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a, hSIRPaVaC1aC2e and hSIRPaV1(P74A), which are discussed later in this invention, are presented in SEQ ID NO: 56, 58, 60, and 62; examples of nucleic acid sequences encoding these variants are listed in SEQ ID NOs: 55, 57, 59 and 61, respectively.

Антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты.Antibodies against SIRPa and their antigen-binding fragments.

В соответствии с настоящим изобретением предложены антитела или их антигенсвязывающиеIn accordance with the present invention, antibodies or antigen-binding antibodies thereof are provided.

- 23 043743 фрагменты, которые связывают SIRPa человека, и применения таких антител или фрагментов. В некоторых вариантах реализации антитела против SIRPa являются выделенными.- 23 043743 fragments that bind human SIRPa, and the use of such antibodies or fragments. In some embodiments, the anti-SIRPa antibodies are isolated.

Способно ли антитело специфично связываться с полипептидной последовательностью (например, SIRPa, hSIRPe 1 человека и т.д.) можно определить, применяя любой анализ, известный в данной области. Примеры анализов, известных в данной области, для определения аффинности связывания включают поверхностный плазмонный резонанс (например, BIACORE) или аналогичную методику (например, KinExa или OCTET).Whether an antibody is able to specifically bind to a polypeptide sequence (eg, SIRPa, human hSIRPe 1, etc.) can be determined using any assay known in the art. Examples of assays known in the art to determine binding affinity include surface plasmon resonance (eg, BIACORE) or similar technique (eg, KinExa or OCTET).

В данном изобретении термин антитело относится к любой форме антитела, которая проявляет желательную биологическую активность. Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е. сайты связывания антигенов (например, фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность области (CDR)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (i) фрагмент Fab -моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2 - бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward и др., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Одно цепочечные антитела также включены посредством ссылки в объем термина антитело. Предпочтительные терапевтические антитела представляют собой интактные антитела IgG. Под термином интактный IgG в данном изобретении подразумевают полипептид, относящийся к классу антител, которые по существу кодируются известным геном иммуноглобулина-гамма. У человека данный класс включает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. У мышей данный класс включает IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Известные домены Ig в классе IgG антител представляют собой VH, Cy1, Cy2, Cy3, VL и CL.As used herein, the term antibody refers to any form of antibody that exhibits the desired biological activity. The term antibody includes antigen-binding portions, i.e. antigen binding sites (eg, fragments, complementarity determining region (CDR) subsequences) that retain the ability to bind antigen, including (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of V L , V H , C L and CH 1 domains; (ii) fragment F(ab') 2 - a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the V L and VH domains of one arm of the antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) which consists of a VH domain; and (vi) a dedicated complementarity determining region (CDR). Single chain antibodies are also included by reference within the scope of the term antibody. Preferred therapeutic antibodies are intact IgG antibodies. The term "intact IgG" as used herein refers to a polypeptide belonging to a class of antibodies that are substantially encoded by a known immunoglobulin gamma gene. In humans, this class includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In mice, this class includes IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Known Ig domains in the IgG class of antibodies are VH, Cy1, Cy2, Cy3, V L and C L .

В объем настоящего изобретения входят антигенсвязывающие SIRPa фрагменты и способы их применения.The present invention includes SIRPa antigen-binding fragments and methods of using them.

В данном изобретении полноразмерное антитело представляет собой, в случае IgG, бивалентную молекулу, содержащую две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь содержит домен VH, за которым следует константный домен (CH1), шарнирная область и еще два константных домена (CH2 и CH3); тогда как каждая легкая цепь содержит один домен VL и один константный домен (CL). Полноразмерное антитело в случае IgM представляет собой декавалентную или додекавалентную молекулу, содержащую 5 или 6 связанных иммуноглобулинов, в указанных иммуноглобулинах каждый мономер содержит два сайта связывания антигенов, образованных тяжелой и легкой цепью.In the present invention, a full-length antibody is, in the case of IgG, a bivalent molecule containing two heavy chains and two light chains. Each heavy chain contains a VH domain, followed by a constant domain ( CH1 ), a hinge region, and two more constant domains ( CH2 and CH3 ); whereas each light chain contains one V L domain and one constant domain ( CL ). A full-length antibody in the case of IgM is a decavalent or dodecavalent molecule containing 5 or 6 linked immunoglobulins, in these immunoglobulins each monomer contains two antigen binding sites formed by a heavy and a light chain.

В данном изобретении, если не указано иначе, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент относится к антигенсвязывающим фрагментам антитела, т.е. фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном, который связывает полноразмерное антитело, например, к фрагментам, в которых сохранен один или более участков CDR. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, но не ограничены перечисленными: фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител, например, sc-Fv; нанотела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.In this invention, unless otherwise specified, an antibody fragment or antigen binding fragment refers to antigen binding fragments of an antibody, i.e. antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen that the full-length antibody binds, for example, fragments that retain one or more CDR regions. Examples of antigen binding fragments include, but are not limited to: Fab, Fab', F(ab') 2 and Fv fragments; diabodies; linear antibodies; single chain antibody molecules, for example sc-Fv; nanobodies and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

В объем настоящего изобретения входят направленные против SIRPa фрагменты Fab и способы их применения. Фрагмент Fab состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент Fab может представлять собой продукт расщепления антитела папаином.The present invention includes anti-SIRPa Fab fragments and methods of using them. The Fab fragment consists of one light chain and CH1 and variable regions of one heavy chain. The heavy chain of a Fab molecule cannot form a disulfide bond with another heavy chain molecule. The Fab fragment may be a papain cleavage product of the antibody.

В объем настоящего изобретения входят антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат область Fc, и способы их применения. Область Fc содержит два фрагмента тяжелой цепи, включающих домены CH3 и CH2 антитела. Указанные два фрагмента тяжелой цепи удерживаются двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов CH3.The present invention includes anti-SIRPa antibodies and antigen binding fragments thereof that contain an Fc region, and methods of using them. The Fc region contains two heavy chain fragments comprising the CH3 and CH2 domains of the antibody. These two heavy chain moieties are held together by two or more disulfide bonds and hydrophobic interactions of CH3 domains.

В объем настоящего изобретения входят фрагменты Fab' против SIRPa и способы их применения. Фрагмент Fab' содержит одну легкую цепь и часть или фрагмент одной тяжелой цепи, которая содержит домен VH и домен CH1, а также участок, расположенный между доменами CH1 и CH2, так что может образоваться межцепочечная дисульфидная связь между двумя тяжелыми цепями двух фрагментов Fab' с образованием молекулы F(ab')2.The present invention includes anti-SIRPa Fab' fragments and methods of using them. The Fab' fragment contains one light chain and part or fragment of one heavy chain, which contains a VH domain and a CH1 domain, as well as a region located between the CH1 and CH2 domains, so that an interchain disulfide bond can be formed between the two heavy chains of the two Fab' fragments the formation of the F(ab') 2 molecule.

В объем настоящего изобретения входят фрагменты F(ab')2 против SIRPa и способы их применения. Фрагмент F(ab')2 содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами CH1 и CH2, так что образуется межцепочечная дисульфидная связь между двумя указанными тяжелыми цепями. Фрагмент F(ab')2, следовательно, состоит из двух фрагментов Fab', которые удерживаются вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями. Фрагмент F(ab')2 может представлять собой продукт расщепления антитела пепсином.The present invention includes anti-SIRPa F(ab')2 fragments and methods of using them. The F(ab') 2 fragment contains two light chains and two heavy chains containing part of the constant region between the C H1 and C H2 domains, so that an interchain disulfide bond is formed between the two heavy chains. The F(ab') 2 fragment therefore consists of two Fab' fragments, which are held together by a disulfide bond between the two heavy chains. The F(ab')2 fragment may be a pepsin cleavage product of the antibody.

В объем настоящего изобретения входят фрагменты Fv против SIRPa и способы их применения. Область FV содержит вариабельные области из обеих тяжелой и легкой цепей, но в ней отсутствуют константные области.The present invention includes anti-SIRPa Fv fragments and methods of using them. The FV region contains variable regions from both the heavy and light chains, but lacks constant regions.

В объем настоящего изобретения входят фрагменты scFv против SIRPa и способы их применения.The present invention includes anti-SIRPa scFv fragments and methods of using them.

- 24 043743- 24 043743

Термин одноцепочечные Fv или антитело scFv относится к фрагментам антитела, содержащим домены VH и VL антитела, при этом данные домены находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желательную структуру для связывания антигена. Обзор scFv можно найти в Pluckthun (1994) The Pharmacology Monoclonal Antibodies, том 113, Rosenburg и Moore, ред. SpringerVerlag, Нью-Йорк, с. 269-315. Также см. публикацию международной заявки на патент № WO 88/01649 и патенты США № 4946778 и 5260203.The term single chain Fv or scFv antibody refers to antibody fragments containing the VH and VL domains of the antibody, wherein these domains are located on the same polypeptide chain. Typically, the Fv polypeptide further contains a polypeptide linker between the VH and VL domains, which allows the scFv to form the desired structure for antigen binding. A review of scFv can be found in Pluckthun (1994) The Pharmacology Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg and Moore, eds. SpringerVerlag, New York, p. 269-315. Also see International Patent Application Publication No. WO 88/01649 and US Patent Nos. 4,946,778 and 5,260,203.

В объем настоящего изобретения входят доменные антитела против SIRPa и способы их применения. Доменное антитело представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях две или более областей VH ковалентно соединены с пептидным линкером с получением бивалентного доменного антитела. Две области VH бивалентного доменного антитела могут быть нацелены на один и тот же или различные антигены.The present invention includes anti-SIRPa domain antibodies and methods of using them. A domain antibody is an immunologically functional fragment of an immunoglobulin containing only a heavy chain variable region or a light chain variable region. In some cases, two or more VH regions are covalently linked to a peptide linker to produce a bivalent domain antibody. The two VH regions of a bivalent domain antibody may target the same or different antigens.

В объем настоящего изобретения входят бивалентные антитела против SIRPa и способы их применения. Бивалентное антитело содержит два сайта связывания антигена. В некоторых случаях указанные два сайта связывания специфичны к одинаковым антигенам. Тем не менее, бивалентные антитела могут быть биспецифическими (см. ниже).The present invention includes bivalent anti-SIRPa antibodies and methods of using them. A bivalent antibody contains two antigen binding sites. In some cases, the two binding sites are specific for the same antigens. However, bivalent antibodies can be bispecific (see below).

В объем настоящего изобретения входят диатела против SIRPa и способы их применения. В данном изобретении термин диатела относится к малым фрагментам антител с двумя сайтами связывания антигена, указанные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH) соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (VH-VL или VL-VH). Применяя линкер, который слишком короток, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной цепи, домены Диатела более полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161 и Holliger и др. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Дуотела описаны in Labrij пи др., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (13): 5145-5150. Обзор сконструированных вариантов антител, как правило, см. в Holliger и Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.The present invention includes anti-SIRPa diabodies and methods of using them. In this invention, the term diabodies refers to small antibody fragments with two antigen binding sites, these fragments containing a heavy chain variable domain ( VH ) connected to a light chain variable domain (VL) in one polypeptide chain (VH- VL or VL- V H ). By using a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same chain, Diatel domains are more fully described, for example, in EP 404097; WO 93/11161 and Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Duoteles are described in Labrij pi al., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(13):5145-5150. For a review of engineered antibody variants, generally see Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Обычно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, который модифицирован каким-либо образом, сохраняет по меньшей мере 10% от своей связывающей активности (по сравнению с исходным антителом), когда данная активность выражена на молярной основе.Typically, an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention that is modified in any way retains at least 10% of its binding activity (compared to the parent antibody) when that activity is expressed on a molar basis.

Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению сохраняет по меньшей мере 20, 50, 70, 80, 90, 95 или 100% или более аффинности связывания SIRPa от таковой у исходного антитела. Также предполагается, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению может содержать консервативные или неконсервативные замены аминокислот (называют консервативными вариантами или функциональноконсервативными вариантами антитела), которые по существу не изменяют его биологическую активность.Preferably, the antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention retains at least 20, 50, 70, 80, 90, 95 or 100% or more of the SIRPa binding affinity of that of the parent antibody. It is also contemplated that the antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention may contain conservative or non-conservative amino acid substitutions (referred to as conservative variants or functionally conserved antibody variants) that do not substantially alter its biological activity.

В объем настоящего изобретения входят выделенные антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты и способы их применения. В данном изобретении не предполагается, что термин выделенные относится к полному отсутствию таких биологических молекул, или к отсутствию воды, буферов или солей, или к отсутствию компонентов фармацевтического состава, который содержит указанные антитела или фрагменты. Выделенное антитело, антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота и т.д. представляют собой такие антитело, антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, которые были обнаружены и отделены и/или извлечены из одного или более компонентов их природного окружения. В предпочтительных вариантах реализации антитело, антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту и т.д. очищают до 75% по массе или более, более предпочтительно до 90% по массе или более, еще более предпочтительно до 95% по массе или более, еще более предпочтительно до 98% по массе или более. Таким образом, выделенные биологические молекулы по меньшей мере частично свободны от других биологических молекул из клеток или культур клеток, в которых они получены. Такие биологические молекулы включают нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другой материал, такой как обломки клеток и ростовая среда. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно может быть по меньшей мере частично свободен от компонентов системы экспрессии, таких как биологические молекулы из клетки-хозяина или из ее ростовой среды.The present invention includes isolated anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof and methods for using them. In this invention, the term isolated is not intended to refer to the complete absence of such biological molecules, or to the absence of water, buffers or salts, or to the absence of components of the pharmaceutical composition that contains these antibodies or fragments. Isolated antibody, antigen binding fragment, nucleic acid, etc. are those antibody, antigen binding fragment, nucleic acid that have been discovered and separated and/or extracted from one or more components of their natural environment. In preferred embodiments, an antibody, an antigen binding fragment, a nucleic acid, etc. purified to 75% by weight or more, more preferably to 90% by weight or more, even more preferably to 95% by weight or more, even more preferably to 98% by weight or more. Thus, the isolated biological molecules are at least partially free from other biological molecules from the cells or cell cultures in which they are obtained. Such biological molecules include nucleic acids, proteins, lipids, carbohydrates or other material such as cell debris and growth media. The isolated antibody or antigen binding fragment thereof may further be at least partially free from components of the expression system, such as biological molecules from the host cell or its growth medium.

В объем настоящего изобретения входят химерные антитела против SIRPa (например, константный домен человека/вариабельный домен мыши) и способы их применения. В данном изобретении химерное антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен из первого антитела и константный домен из второго антитела, при этом первое и второе антитела получены из различных видов (патент США № 4816567; и Morrison и др., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855). Обычно вариабельные домены получают из антитела из экспериментального животного (исходного антитела), такого как грызун, и последовательности константных доменов получают из антител человека, так что полученное в результате этого химерное антитело будет с меньшей вероятностью индуцировать нежелательный иммунный ответ у субъекта, представляющего собой человека, чем исходное (например, мышиThe present invention includes chimeric anti-SIRPa antibodies (eg, human constant domain/mouse variable domain) and methods of using them. In this invention, a chimeric antibody is an antibody comprising a variable domain from a first antibody and a constant domain from a second antibody, wherein the first and second antibodies are derived from different species (US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sci USA 81: 6851-6855). Typically, the variable domains are derived from an antibody from an experimental animal (parent antibody), such as a rodent, and the constant domain sequences are derived from human antibodies, such that the resulting chimeric antibody will be less likely to induce an undesirable immune response in a human subject. than the original (for example, mice

- 25 043743 ное) антитело.- 25 043743 new) antibody.

В объем настоящего изобретения входят гуманизированные антитела против SIRPa, их антигенсвязывающие фрагменты (например, антитела крысы или мыши, которые были гуманизированы) и способы их применения. В данном изобретении термин гуманизированное антитело относится к формам антитела, которые содержат последовательности как из антител человека, так и из не относящихся к человеку (например, мышиных или крысиных) антител. Как правило, гуманизированное антитело будет состоять по существу из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют таковым из не относящегося к человеку иммуноглобулина и все или по существу все из каркасных (FR) областей получены из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина человека (Fc). Более подробное описание гуманизированных антител, см., например, в Jones и др., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann и др., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); и Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).The present invention includes humanized anti-SIRPa antibodies, antigen binding fragments thereof (eg, rat or mouse antibodies that have been humanized) and methods of using them. As used herein, the term humanized antibody refers to forms of an antibody that contain sequences from both human and non-human (eg, murine or rat) antibodies. Typically, a humanized antibody will consist of essentially at least one and typically two variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of the non-human immunoglobulin and all or substantially all of the framework (FR) regions derived from the human immunoglobulin sequence. The humanized antibody may optionally contain at least a portion of a human immunoglobulin constant region (Fc). For a more detailed description of humanized antibodies, see, for example, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); and Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).

Обычно, стандартная структурная единица антитела включает тетрамер. Каждый тетрамер содержит две идентичные пары полипептидных цепей, каждая пара содержит одну легкую (приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, которая, главным образом, отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть тяжелой цепи может соответствовать константной области, которая, главным образом, отвечает за эффекторную функцию. Обычно, легкие цепи человека классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Более того, тяжелые цепи человека обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и по ним определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. Внутри легких и тяжелых цепей вариабельные и константные области объединены участком J из приблизительно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит участок D из приблизительно 10 или более аминокислот. См., как правило, Fundamental Immunology, глава 7 (Paul, W., ред., 2ое изд. Raven Press, Нью-Йорк (1989)).Typically, the standard structural unit of an antibody includes a tetramer. Each tetramer contains two identical pairs of polypeptide chains, each pair containing one light chain (approximately 25 kDa) and one heavy chain (approximately 50-70 kDa). The amino-terminal part of each chain contains a variable region of approximately 100-110 or more amino acids, which is primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal portion of the heavy chain may correspond to a constant region that is primarily responsible for effector function. Generally, human light chains are classified as kappa and lambda light chains. Moreover, human heavy chains are typically classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon, and are used to determine the antibody isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. Within the light and heavy chains, the variable and constant regions are united by a J region of approximately 12 or more amino acids, with the heavy chain also containing a D region of approximately 10 or more amino acids. See generally Fundamental Immunology, chapter 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, New York (1989)).

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют сайт связывания на антителе. Таким образом, обычно, интактное антитело содержит два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два указанных сайта связывания, как правило, одинаковые.The variable regions of each light/heavy chain pair form a binding site on the antibody. Thus, typically, an intact antibody contains two binding sites. With the exception of bifunctional or bispecific antibodies, the two specified binding sites are usually the same.

Обычно вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей содержат три гипервариабельных участка, также называемых определяющими комплементарность областями (CDR), расположенных внутри относительно консервативных каркасных областей (FR). Участки CDR обычно скоординированы каркасными областями, что позволяет связывание со специфическим эпитопом. Обычно, от N-конца к Сконцу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи содержат FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Присвоение аминокислот каждому домену, как правило, осуществляется в соответствии с определениями из Sequences of Proteins of Immunological Interest Kabat и др.; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд; 5ое изд.; NIH, номер публикации 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat и др., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia и др., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917, или Chothia и др., (1989) Nature 342:878-883.Typically, the variable domains of both heavy and light chains contain three hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs), located within relatively conserved framework regions (FRs). CDR regions are usually coordinated by framework regions, allowing binding to a specific epitope. Typically, from N-terminus to C-terminus, both the light and heavy chain variable domains comprise FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The assignment of amino acids to each domain is generally carried out in accordance with the definitions from Sequences of Proteins of Immunological Interest by Kabat et al.; National Institutes of Health, Bethesda, MD; 5th ed.; NIH Publication Number 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917, or Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883.

В данном изобретении термин гипервариабельный участок относится к аминокислотным остаткам антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из определяющей комплементарность области или CDR (т.е. CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в вариабельном домене легкой цепи и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в вариабельном домене тяжелой цепи). См. Kabat и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5oe изд. Служба общественного здравоохранения, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд (в котором границы участков CDR антитела обозначены по последовательности); см. также Chothia и Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (в котором границы участков CDR антитела обозначены по структуре). В данном изобретении термин каркас или остатки FR относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельного участка, описанным в данном изобретении как остатки CDR.As used herein, the term hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody or antigen-binding fragment thereof that are responsible for antigen binding. The hypervariable region contains amino acid residues from the complementarity determining region or CDR (ie, CDRL1, CDRL2 and CDRL3 in the light chain variable domain and CDRH1, CDRH2 and CDRH3 in the heavy chain variable domain). See Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (in which the boundaries of the antibody CDR regions are designated by sequence); see also Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (in which the boundaries of the antibody CDR regions are indicated by structure). As used herein, the term framework or FR residues refers to variable domain residues other than hypervariable region residues, described herein as CDR residues.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или выделенный полинуклеотид означает ДНК или РНК, полученную из генома, мРНК, кДНК или полученную синтетическим путем или из некоторой их комбинации, которая не связана со всем или частью полинуклеотида, в котором выделенный полинуклеотид встречается в природе, или связана с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе. Для целей согласно настоящему описанию должно быть очевидно, что в объем термина молекула нуклеиновой кислоты, включающая конкретную последовательность нуклеотидов, не входят интактные хромосомы. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот включающие определенные последовательности нуклеиновых кислот, могут содержать, дополнительно к указанным определенным последовательностям, кодирующие последовательности для вплоть до десяти или даже до двадцати или более других белков или их частей или фрагментов, или могут содержать функционально связанные регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию кодирующей области перечисленных последовательностей нуклеиновых кислот, и/или могут содержать последовательности вектора.An isolated nucleic acid molecule or isolated polynucleotide means DNA or RNA derived from a genome, mRNA, cDNA or synthetically produced, or some combination thereof, that is not associated with all or part of a polynucleotide in which the isolated polynucleotide occurs naturally, or associated with a polynucleotide , with which it is not associated in nature. For purposes of the present specification, it should be apparent that the term nucleic acid molecule including a particular nucleotide sequence does not include intact chromosomes. Isolated nucleic acid molecules comprising defined nucleic acid sequences may contain, in addition to these defined sequences, coding sequences for up to ten or even up to twenty or more other proteins or parts or fragments thereof, or may contain operably linked regulatory sequences that control expression coding region of the listed nucleic acid sequences, and/or may contain vector sequences.

- 26 043743- 26 043743

Формулировка контролирующие последовательности относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной с ними кодирующей последовательности в конкретном организме хозяина. Контролирующие последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают промотор, необязательно последовательность оператора и участок связывания рибосомы. Известно, что в эукариотических клетках используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.The term control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Control sequences that are suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид функционально связаны, когда они помещены в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в составе пребелка и участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию указанной последовательности; или участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции. Как правило, но не всегда, функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК контактируют, и, в случае секреторного лидера, контактируют и находятся в фазе считывания. Тем не менее, энхансеры не обязательно должны контактировать. Соединение осуществляют путем лигирования в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, то применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с обычной практикой.A nucleic acid or polynucleotide is operably linked when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA of a presequence or secretory leader is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as part of a preprotein and participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of said sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is located to facilitate translation. Typically, but not always, operably linked means that the linked DNA sequences are in contact, and, in the case of a secretory leader, are in contact and in reading phase. However, enhancers do not necessarily need to contact. The connection is made by ligation at convenient restriction sites. If such sites are absent, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with standard practice.

В данном изобретении формулировки клетка, линия клеток и культура клеток используют взаимозаменяемо, и все такие названия включают потомство клеток. Таким образом, формулировки трансформанты и трансформированные клетки включают первичные клетки субъекта и культуры, полученные из них, независимо от количества пересеваний. Также понятно, что не все потомство будет содержать совершенно идентичную ДНК, вследствие преднамеренных или самопроизвольных мутаций. Мутантное потомство с такой же функцией или биологической активностью, которую выявляли путем скрининга в исходных трансформированных клетках, входит в объем изобретения. Если предполагаются отличные обозначения, то они будут ясны из контекста.In this invention, the terms cell, cell line and cell culture are used interchangeably, and all such names include progeny cells. Thus, the expressions transformants and transformed cells include the primary cells of the subject and the cultures derived therefrom, regardless of the number of passages. It is also clear that not all offspring will contain exactly identical DNA, due to intentional or spontaneous mutations. Progeny mutants with the same function or biological activity as identified by screening in the original transformed cells are within the scope of the invention. If distinct notations are intended, they will be clear from the context.

В данном изобретении зародышевая последовательность относится к последовательности из не перестроенных последовательностей ДНК иммуноглобулинов. Можно использовать любой подходящий источник не перестроенных последовательностей иммуноглобулинов. Зародышевые последовательности человека можно получить, например, из баз данных зародышевых последовательностей JOINSOLVER на сайте в Интернете Национального института артрита и скелетно-мышечных и кожных заболеваний Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов. Зародышевые последовательности мыши можно получить, например, как описано в Giudicelli и др. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D256-D261.In the present invention, a germinal sequence refers to a sequence of non-rearranged immunoglobulin DNA sequences. Any suitable source of non-rearranged immunoglobulin sequences can be used. Human germline sequences can be obtained, for example, from the JOINSOLVER germline sequence databases on the Internet site of the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health of the United States. Mouse germline sequences can be obtained, for example, as described in Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D256-D261.

Физические и функциональные свойства типичных антител против SIRPa.Physical and functional properties of typical anti-SIRPa antibodies.

В соответствии с настоящим изобретением предложены антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, обладающие определенными структурными и функциональными особенностями, и способы применения антител или их антигенсвязывающих фрагментов для лечения или предотвращения заболевания (например, рака или инфекционного заболевания).The present invention provides anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof having certain structural and functional features, and methods of using the antibodies or antigen-binding fragments thereof to treat or prevent a disease (eg, cancer or an infectious disease).

Выше описано, что антитела и фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается любое из антител против SIRPa или их антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению, также входят в объем настоящего изобретения. В одном варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом SIRPa человека, с которым связывается антитело, содержащее одну из следующих комбинаций последовательности тяжелой цепи/последовательности легкой цепи (или в каждом случае последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности):As described above, antibodies and fragments that bind to the same epitope to which any of the anti-SIRPa antibodies or antigen binding fragments thereof of the present invention bind are also included within the scope of the present invention. In one embodiment, the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same human SIRPa epitope to which an antibody containing one of the following heavy chain sequence/light chain sequence combinations (or in each case an amino acid sequence, at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence):

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L1),SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 20 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L1),

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 22 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L2),SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 22 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L2),

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 24 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L3),SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 24 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L3),

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 26 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L4),SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 26 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L4),

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 28 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H1L5),SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 28 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H1L5),

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L1),SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 20 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L1),

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 22 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L2),SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 22 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L2),

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 24 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L3),SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 24 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L3),

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 26 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L4),SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 26 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L4),

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 28 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H2L5),SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 28 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H2L5),

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L1),SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 20 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H3L1),

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 22 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L2),SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 22 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H3L2),

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 24 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L3),SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 24 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H3L3),

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 26 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L4),SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 26 (in this invention referred to as hSIRPa.50A.H3L4),

- 27 043743- 27 043743

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NOSEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

14/SEQ ID NO14/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

16/SEQ ID NO16/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

18/SEQ ID NO18/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

78/SEQ ID NO78/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

80/SEQ ID NO80/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

82/SEQ ID NO82/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

84/SEQ ID NO84/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

86/SEQ ID NO86/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO88/SEQ ID NO

88/SEQ ID NO (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H3L5), 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L1), 22 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L2), 24 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L3), 26 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L4), 28 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H4L5), 20 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L1), 22 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L2), 24 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L3), 26 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L4), 28 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.50A.H5L5), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H1L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H2L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H3L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H4L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H5L6), 90 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L1), 92 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L2), 94 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L3), 96 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L4), 98 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L5), 100 (в данном изобретении обозначают hSIRPa.40A.H6L6).88/SEQ ID NO (herein referred to as hSIRPa.50A.H3L5), 20 (herein referred to as hSIRPa.50A.H4L1), 22 (herein referred to as hSIRPa.50A.H4L2), 24 (herein referred to as hSIRPa .50A.H4L3), 26 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L4), 28 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H4L5), 20 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L1), 22 (in this invention denoted denoted hSIRPa.50A.H5L2), 24 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L3), 26 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L4), 28 (in this invention denoted hSIRPa.50A.H5L5), 90 (in in this invention designated hSIRPa.40A.H1L1), 92 (in this invention designated hSIRPa.40A.H1L2), 94 (in this invention designated hSIRPa.40A.H1L3), 96 (in this invention designated hSIRPa.40A.H1L4), 98 (in this invention designated hSIRPa.40A.H1L5), 100 (in this invention designated hSIRPa.40A.H1L6), 90 (in this invention designated hSIRPa.40A.H2L1), 92 (in this invention designated hSIRPa.40A.H2L2) , 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H2L5), 100 (in this invention denoted hSIRPa.40A. H2L6), 90 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa. 40A.H3L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L5), 100 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H3L6), 90 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H4L2), 94 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L3), 96 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L4), 98 (in this invention designated hSIRPa.40A.H4L5), 100 (in this invention in the invention denoted hSIRPa.40A.H4L6), 90 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H5L3), 96 ( in this invention designated hSIRPa.40A.H5L4), 98 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L5), 100 (in this invention designated hSIRPa.40A.H5L6), 90 (in this invention designated hSIRPa.40A.H6L1), 92 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L2), 94 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L3), 96 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L4), 98 (in this invention denoted hSIRPa.40A.H6L5 ), 100 (in this invention referred to as hSIRPa.40A.H6L6).

Доступно несколько способов картирования эпитопов для антител на целевых антигенах, включая: масс-спектрометрию, основанную на водородно-дейтериевом обмене, масс-спектрометрию, сопряжен ную с перекрестным связыванием, рентгеноструктурный анализ, анализ pepscan и сайт-направленный мутагенез. Например, ВДО (водородно-дейтериевый обмен), сопряженный с протеолизом и массспектрометрией, можно применять для определения эпитопа для антитела на специфическом антигене Y. ВДО-МС основывается на точном измерении и сравнении степени включения дейтерия антигеном при инкубации в D2O отдельно и в присутствии специфичного к нему антитела в различные промежутки времени. Дейтерий обменивается с водородом на амидном каркасе белков в открытых областях, тогда как области антигена, связанные с антителом, будут защищены, и в них будет наблюдаться меньший обмен или не будет обмена при анализе протеолитических фрагментов с помощью ЖХ/МС/МС. Масс спектрометрия, сопряженная с перекрестным связыванием, начинается со связывания антитела и антигена с массивным меченым химическим линкером для перекрестного связывания. Затем присутствие комSeveral methods are available to map epitopes for antibodies on target antigens, including: hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, cross-linking mass spectrometry, X-ray diffraction analysis, pepscan analysis, and site-directed mutagenesis. For example, HDE (hydrogen-deuterium exchange) coupled to proteolysis and mass spectrometry can be used to determine the epitope for an antibody on a specific antigen Y. HDE-MS is based on the precise measurement and comparison of the degree of deuterium incorporation by the antigen when incubated in D 2 O alone and in the presence of an antibody specific to it at various periods of time. Deuterium exchanges with hydrogen on the amide backbone of proteins in exposed regions, whereas antibody-bound regions of antigen will be protected and exhibit less or no exchange when proteolytic fragments are analyzed by LC/MS/MS. Cross-linking mass spectrometry begins with the binding of antibody and antigen to a bulk labeled chemical linker for cross-linking. Then the presence of

- 28 043743 плекса подтверждают путем детектирования большой массы с помощью матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ). Так как после реакции перекрестного связывания комплекс АТ/АГ чрезвычайно стабилен, его можно подвергать воздействию множества различных ферментов и условий расщепления с получением множества различных перекрывающихся пептидов. Идентификацию данных пептидов проводят, применяя методики масс-спектрометрии высокого разрешения и МС/МС. Идентификацию перекрестно сшитых пептидов проводят, применяя массивную метку, связанную с перекрестно сшивающими реагентами. После фрагментации МС/МС и анализа результатов как эпитоп, так и паратоп определяют в одном эксперименте.- 28 043743 plex is confirmed by large mass detection using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). Because the AT/AG complex is extremely stable after the cross-coupling reaction, it can be subjected to many different enzymes and cleavage conditions to produce many different overlapping peptides. Identification of these peptides is carried out using high-resolution mass spectrometry and MS/MS techniques. Identification of cross-linked peptides is carried out using a bulk tag associated with cross-linking reagents. After MS/MS fragmentation and analysis of the results, both the epitope and paratope are determined in one experiment.

В объем настоящего изобретения также входят выделенные антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты (например, гуманизированные антитела), включающие вариант цепи иммуноглобулина, описанный в данном изобретении, при этом указанный вариант проявляет одно или более из следующих свойств:Also included within the scope of the present invention are isolated anti-SIRPa antibodies and antigen binding fragments thereof (e.g., humanized antibodies) comprising an immunoglobulin chain variant described herein, which variant exhibits one or more of the following properties:

связывает белок SIRPaV1 человека, имеющий последовательность SEQ ID NO: 34, с ЕС50 < 1 нМ; и проявляет по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к SIRPaV1(P74A), имеющему последовательность SEQ ID NO: 62; и необязательно также по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к белку SIRPe1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 38 (при этом в каждом случае пониженная EC50 относится к EC50 по отношению к белку SIRPaV1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 34, и в каждом случае предпочтительно измерение проводят с помощью клеточного анализа ELISA (CELISA), описанного далее в данном изобретении;binds the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34, with EC5 0 < 1 nM; and exhibits at least 100 times higher EC 50 relative to SIRPaV1(P74A) having the sequence SEQ ID NO: 62; and optionally also at least 100 times higher EC 50 relative to the human SIRPe1 protein having the sequence SEQ ID NO: 38 (wherein in each case the lower EC 50 refers to the EC 50 relative to the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34, and in each case, preferably the measurement is carried out using a cell-based ELISA assay (CELISA) described later in this invention;

связывается с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее; связывается с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV2 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее; не проявляет заметного связывания с белком SIRPe 1 при концентрации антитела 50 нМ, предпочтительно 67 нМ и более предпочтительно 100 нМ; или, в качестве альтернативы, при концентрации, которая в 10 раз больше, предпочтительно в 50 раз больше, более предпочтительно в 100 раз больше и еще более предпочтительно в 200 раз больше, чем EC50 антитела по отношению к SIRPaV1 или SIRPaV2;binds to a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC50 < 10 nM, preferably < 5 nM, more preferably < 1.5 nM, even more preferably < 1.0 nM, even more preferably < 0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less; binds to a cell expressing the human SIRPaV2 protein with an EC 50 < 10 nM, preferably < 5 nM, more preferably < 1.5 nM, even more preferably < 1.0 nM, even more preferably < 0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less; does not exhibit detectable binding to SIRPe 1 protein at antibody concentrations of 50 nM, preferably 67 nM, and more preferably 100 nM; or, alternatively, at a concentration that is 10 times greater, preferably 50 times greater, more preferably 100 times greater, and even more preferably 200 times greater than the EC 50 of the antibody to SIRPaV1 or SIRPaV2;

ингибирует связывание между SIRPa человека и CD47 с IC50 < 10,0 нМ, более предпочтительно < 5,0 нМ, еще более предпочтительно < 2,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 1,0 нМ или менее; и проявляет балл человечности Т20, равный по меньшей мере 79, и более предпочтительно 85%.inhibits binding between human SIRPa and CD47 with an IC50 of <10.0 nM, more preferably <5.0 nM, even more preferably <2.5 nM, and most preferably equal to about 1.0 nM or less; and exhibits a T20 Humanity score of at least 79, and more preferably 85%.

В других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены антитела, или их антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают SIRPa человека (например, гуманизированные антитела) и содержат домены VH и домены VL с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32. В других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены антитела, или их антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают SIRPa человека (например, гуманизированные антитела) и содержат домены VH и домены VL с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32. В других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены антитела, или их антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают SIRPa человека (например, гуманизированные антитела) и содержат домены VH и домены VL с последовательностью, по меньшей мере на 97% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18, и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32. В других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены антитела, или их антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают SIRPa человека (например, гуманизированные антитела) и содержат домены VH и домены VL с последовательностью, по меньшей мере на 98% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32. В других вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены антитела, или их антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают SIRPa человека (например, гуманизированные антитела) и содержат домены VH и домены VL с последовательностью, по меньшей мере на 99% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32. Предпочтительно в каждом случае различия в последовательностях между SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32 и указанными вариантами состоят из консервативных замен и наиболее предпочтительно ограничены заменами в каркасных остатках.In other embodiments, the present invention provides antibodies, or an antigen binding fragment thereof, that bind human SIRPa (e.g., humanized antibodies) and contain VH domains and VL domains with sequence identity at least 90% identical to the sequences of SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28, and 32. In other embodiments, the present invention provides antibodies, or an antigen-binding fragment thereof, that bind Human SIRPa (e.g., humanized antibodies) and contain V H domains and V L domains with sequence identity at least 95% identical to SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28, and 32. In other embodiments, the present invention provides antibodies, or an antigen-binding fragment thereof, that bind human SIRPa (e.g., humanized antibodies) and contain VH domains and VL domains with at least 97% sequence identity to SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18, and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28, and 32. In other embodiments, the present invention provides antibodies, or an antigen-binding fragment thereof, that bind Human SIRPas (e.g., humanized antibodies) and contain V H domains and V L domains with at least 98% sequence identity to SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28, and 32. In other embodiments, the present invention provides antibodies, or an antigen-binding fragment thereof, that bind human SIRPa (e.g., humanized antibodies) and contain V H domains and V L domains with sequence identity at least 99% identical to the sequences of SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28, and 32. Preferably, in each case, sequence differences between SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82 , 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30; and 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 and 32, and said embodiments consist of conservative substitutions and are most preferably limited to substitutions in the framework residues.

В следующих источниках представлены алгоритмы BLAST, которые часто применяют для анализа последовательностей: BLAST ALGORITHMS: Camacho, С. и др. (2009): ВМС Bioinformatics 10:421; AltThe following sources provide BLAST algorithms that are often used for sequence analysis: BLAST ALGORITHMS: Camacho, S. et al. (2009): BMC Bioinformatics 10:421; Alt

- 29 043743 schul и др. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., и др., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., и др., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., и др., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., и др., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., и др., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., и др., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. и др., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., и др., A model of evolutionary change in proteins в Atlas of Protein Sequence and Structure (1978), том 5, прил. 3. M.O. Dayhoff (ред.), с. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Вашингтон, федеральный округ Колумбия; Schwartz, R.M., и др., Matrices for detecting distant relationships в Atlas of Protein Sequence and Structure (1978), том 5, прил. 3. M.O. Dayhoff (ред.), с. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Вашингтон, федеральный округ Колумбия; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., идр., (1991)Methods 3:66-70; Henikoff, S., идр., (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., и др., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., и др., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., идр., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, А., идр., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; и Altschul, S.F. Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments в Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ред.), (1997), с. 1-14, пленум, Нью-Йорк. В настоящей заявке сравнения процентов идентичности предпочтительно осуществляют с помощью алгоритма BLAST, при этом параметры указанного алгоритма выбирают для получения наибольшего совпадения между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей (например, ожидаемый порог: 10; длина слова: 6; максимальные совпадения в запрошенном диапазоне: 0; матрица: BLOSUM 62; цены гэпов: наличие - 11, удлинение - 1; корректировка матрицы весов в зависимости от состава и удовлетворения условиям).- 29 043743 schul et al (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., A model of evolutionary change in proteins in Atlas of Protein Sequence and Structure (1978), vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), p. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., Matrices for detecting distant relationships in Atlas of Protein Sequence and Structure (1978), vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), p. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al. (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997), p. 1-14, plenum, New York. In the present application, percent identity comparisons are preferably carried out using the BLAST algorithm, wherein the parameters of said algorithm are selected to obtain the largest match between corresponding sequences over the entire length of the respective reference sequences (e.g., expected threshold: 10; word length: 6; maximum matches in the requested range : 0; matrix: BLOSUM 62; gap prices: presence - 11, extension - 1; adjustment of the weight matrix depending on the composition and satisfaction of conditions).

Формулировки консервативно модифицированные варианты или консервативная замена относятся к заменам аминокислот в белке на другие аминокислоты, обладающие сходными свойствами (например, зарядом, размером боковых цепей, гидрофобностью/гидрофильностью, конформацией остова и жесткостью, и т.д.), так что данные изменения часто можно осуществить без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области известно, что, как правило, замены одной аминокислоты в несущественных областях полипептида значительно не изменяют биологическую активность (см., например, Watson и др. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., с. 224 (4oe изд.)). Кроме того, замены на структурно или функционально сходные аминокислоты с меньшей вероятностью нарушат биологическую активность. Примеры консервативных замен описаны в следующей табл. 1.Conservatively modified variant or conservative substitution formulations refer to substitutions of amino acids in a protein with other amino acids that have similar properties (e.g., charge, side chain size, hydrophobicity/hydrophilicity, backbone conformation and rigidity, etc.), such that these changes are often can be carried out without changing the biological activity of the protein. Those skilled in the art will know that, in general, single amino acid substitutions in non-essential regions of a polypeptide do not significantly alter biological activity (see, for example, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co. , pp. 224 (4th ed.)). In addition, substitutions with structurally or functionally similar amino acids are less likely to disrupt biological activity. Examples of conservative substitutions are described in the following table. 1.

Таблица 1Table 1

Примеры консервативных замен аминокислотExamples of conservative amino acid substitutions

Исходный остаток Original balance Консервативная замена Conservative substitution Ala (А) Ala (A) Gly; Ser Gly; Ser Arg(R) Arg(R) Lys; His Lys; His Asn (Ν) Asn(Ν) Gin; His Gin; His Asp (D) Asp (D) Glu; Asn Glu; Asn Cys(C) Cys(C) Ser; Ala Ser; Ala Gln(Q) Gln(Q) Asn Asn Glu (E) Glu (E) Asp; Gin Asp; Gin Gly (G) Gly (G) Ala Ala His (H) His(H) Asn; Gin Asn; Gin He (I) He(I) Leu; Val Leu; Val Leu (L) Leu (L) He; Val He; Val Lys (K) Lys (K) Arg; His Arg; His Met (M) Met(M) Leu; He; Tyr Leu; He; Tyr Phe (F) Phe(F) Tyr; Met; Leu Tyr; Met; Leu Pro (P) Pro (P) Ala Ala Ser (S) Ser (S) Thr Thr Thr (T) Thr (T) Ser Ser Trp (W) Trp(W) Tyr; Phe Tyr; Phe Tyr(Y) Tyr(Y) Trp; Phe Trp; Phe Val (V) Val(V) He; Leu He; Leu

Функционально консервативные варианты антител согласно настоящему изобретению также входятFunctionally conserved antibody variants of the present invention also include

- 30 043743 в объем настоящего изобретения. Функционально консервативные варианты в данном изобретении относятся к антителам или фрагментам, в которых один или несколько аминокислотных остатков были заменены без изменения желательного свойства, такого как аффинность и/или специфичность к антигену. Такие варианты включают, но не ограничены заменой аминокислоты на таковую, обладающую сходными свойствами, например, консервативные замены аминокислот из табл. 1. Также предложены выделенные полипептиды, содержащие домены VL антител против SIRPa согласно настоящему изобретению (например, последовательности SEQ ID NO: 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32), и выделенные полипептиды, содержащие домены VH антител против SIRPa согласно настоящему изобретению (например, последовательности SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30), содержащие до 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более замен аминокислот, и предпочтительно консервативных замен.- 30 043743 within the scope of the present invention. Functionally conserved variants in this invention refer to antibodies or fragments in which one or more amino acid residues have been replaced without changing the desired property, such as affinity and/or specificity for an antigen. Such options include, but are not limited to, replacing an amino acid with one that has similar properties, for example, conservative amino acid substitutions from table. 1. Also provided are isolated polypeptides containing the V L domains of anti-SIRPa antibodies according to the present invention (for example, the sequences SEQ ID NO: 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 8, 20, 22, 24, 26, 28 and 32), and isolated polypeptides containing the VH domains of the anti-SIRPa antibodies of the present invention (e.g., SEQ ID NOs: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30) containing up to 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acid substitutions, and preferably conservative substitutions.

В объем настоящего изобретения дополнительно входят полинуклеотиды, кодирующие любой из полипептидов или иммуноглобулиновых цепей антител против SIRPa и их антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению. Например, в объем настоящего изобретения входят полинуклеотиды, кодирующие аминокислоты, описанные в любой из последовательностей SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 и 30; и последовательностей SEQ ID NO: 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32.The present invention further includes polynucleotides encoding any of the polypeptides or immunoglobulin chains of anti-SIRPa antibodies and antigen binding fragments thereof according to the present invention. For example, polynucleotides encoding amino acids described in any of SEQ ID NOs: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 102, 7, 10, 12, 14, 16, 18 and 30 are included within the scope of the present invention ; and SEQ ID NOs: 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 104, 8, 20, 22, 24, 26, 28 and 32.

В одном варианте реализации предложен выделенный полинуклеотид, например, ДНК, кодирующая указанные полипептидные цепи выделенных антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном изобретении. В одном варианте реализации выделенный полинуклеотид кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий по меньшей мере один вариабельный домен легкой цепи (VL) зрелого иммуноглобулина согласно настоящему изобретению и/или по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи (VH) зрелого иммуноглобулина согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации выделенный полинуклеотид кодирует обе легкую цепь и тяжелую цепь на одной полинуклеотидной молекуле, и в других вариантах реализации легкая и тяжелая цепи кодируются на отдельных полинуклеотидных молекулах. В другом варианте реализации указанные полинуклеотиды дополнительно кодируют сигнальную последовательность.In one embodiment, an isolated polynucleotide, for example, DNA, encoding the polypeptide chains of the isolated antibodies or antigen binding fragments described in this invention is provided. In one embodiment, the isolated polynucleotide encodes an antibody or antigen binding fragment thereof comprising at least one light chain variable domain ( VL ) of a mature immunoglobulin of the present invention and/or at least one heavy chain variable domain (VH) of a mature immunoglobulin of the present invention . In some embodiments, the isolated polynucleotide encodes both the light chain and the heavy chain on a single polynucleotide molecule, and in other embodiments, the light and heavy chains are encoded on separate polynucleotide molecules. In another embodiment, said polynucleotides further encode a signal sequence.

В настоящем изобретении также предложены векторы, например, векторы экспрессии, такие как плазмиды, содержащие выделенные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, при этом указанный полинуклеотид функционально связан с контролирующими последовательностями, которые распознаются клеткой-хозяином, когда указанную клетку-хозяина трансфицируют указанным вектором. Также предложены клетки-хозяева, содержащие вектор согласно настоящему изобретению, и способы получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или полипептида, описанных в данном изобретении, включающие культивирование клетки-хозяина, несущей вектор экспрессии или нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноглобулиновые цепи антитела или их антигенсвязывающий фрагмент, в культуральной среде и выделение антигена или антигенсвязывающего фрагмента антитела из указанной клетки-хозяина или культуральной среды.The present invention also provides vectors, for example, expression vectors such as plasmids containing isolated polynucleotides of the present invention, wherein said polynucleotide is operably linked to control sequences that are recognized by a host cell when said host cell is transfected with said vector. Also provided are host cells containing a vector according to the present invention, and methods for producing an antibody or an antigen-binding fragment or polypeptide thereof described in this invention, including culturing a host cell carrying an expression vector or a nucleic acid encoding the immunoglobulin chains of an antibody or an antigen-binding fragment thereof, in a culture medium and recovering an antigen or an antigen-binding antibody fragment from said host cell or culture medium.

Аффинность связывания.Binding affinity.

В качестве примера, но не ограничения, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, могут связывать SIRPa человека бивалентно со значением KD, равным 10х10’9 М или меньше, что определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (например, BIACORE) или аналогичной методики (например, KinExa или интерферометрии биослоя (OCTET)). В одном варианте реализации антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, могут связывать SIRPa человека бивалентно со значением KD, равным приблизительно 5-10x10’9 М, что определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (например, BIACORE) или аналогичной методики (например, KinExa или OCTET). Аффинность рассчитывают как KD=koff/kon (kof представляет собой константу скорости диссоциации, Kon представляет собой константу скорости ассоциации и KD представляет собой константу равновесия). Аффинность можно определить при равновесии путем измерения фракции связанного (r) меченого лиганда при различных концентрациях (с). Результаты представляют графически, используя уравнение Скэтчарда: г/с=К(п-г), где г=моли связанного лиганда/моль рецептора при равновесии; с=концентрация свободного лиганда при равновесии; К=равновесная константа ассоциации; и п=количество сайтов связывания лигандов на молекуле рецептора. С помощью графического анализа r/с наносят на ось у, а r наносят на ось х, таким образом получая график Скэтчарда. Измерение аффинности антитела с помощью анализа Скэтчарда хорошо известно в данной области. См., например, van Erp и др., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson и Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988.By way of example, and not limitation, the antibodies and antigen-binding fragments described in this invention can bind human SIRPa bivalently with a K D value of 10 x 10' 9 M or less, as determined by surface plasmon resonance (eg, BIACORE) or similar techniques (eg KinExa or biolayer interferometry (OCTET)). In one embodiment, the antibodies and antigen-binding fragments described in this invention can bind human SIRPa bivalently with a KD value of approximately 5-10x10'9 M, as determined by surface plasmon resonance (e.g., BIACORE) or similar methodology (e.g. KinExa or OCTET). Affinity is calculated as K D =k off /k on (kof is the dissociation rate constant, K on is the association rate constant and KD is the equilibrium constant). Affinity can be determined at equilibrium by measuring the fraction of bound (r) labeled ligand at various concentrations (c). The results are presented graphically using the Scatchard equation: g/c=K(n-g), where g=moles of bound ligand/mol of receptor at equilibrium; c=concentration of free ligand at equilibrium; K=equilibrium association constant; and n=number of ligand binding sites on the receptor molecule. Using graphical analysis, r/c is plotted on the y-axis and r is plotted on the x-axis, thereby obtaining a Scatchard plot. Measuring antibody affinity using the Scatchard assay is well known in the art. See, for example, van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988.

Человечность.Humanity.

Для целей настоящего документа человечность измеряют, используя анализатор балла Т20 для количественного определения человечности вариабельной области моноклональных антител, как описано в Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC Biotechnology. 2013: 13:55. doi: 10.1186/1472-6750-13-55).For the purposes of this document, humanity is measured using the T20 score analyzer to quantify the humanity of the variable region of monoclonal antibodies, as described in Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC Biotechnology. 2013: 13:55. doi:10.1186/1472-6750-13-55).

- 31 043743- 31 043743

Предусмотрен доступный через интернет инструмент для расчета балла Т20 последовательностей антител с применением баз данных Т20 Cutoff Human Databases: http://abAnalyzer.lakepharma.com. При вычислении балла Т20 вводимой белковой последовательности вариабельной области VH, VK или VL сначала присваивается нумерация по Кабату и идентифицируются остатки CDR. Полноразмерную последовательность или последовательность только каркаса (с удаленными остатками CDR) сравнивают с каждой последовательностью в соответствующей базе данных антител, применяя алгоритм blastp (белокбелок) BLAST. Идентичность последовательностей при каждом попарном сравнении выбирают, и после анализа каждой последовательности в базе данных указанные последовательности сортируют от высокого уровня к низкому на основании идентичности указанных последовательностей с вводимой последовательностью. Процент идентичности 20 самых совпадающих (Top 20) последовательностей усредняют с получением балла Т20.An online tool is available to calculate the T20 score of antibody sequences using the T20 Cutoff Human Databases: http://abAnalyzer.lakepharma.com. When calculating the T20 score, the input VH, VK or VL variable region protein sequence is first assigned a Kabat numbering and CDR residues are identified. The full-length sequence or the scaffold-only sequence (with the CDRs removed) is compared to each sequence in the corresponding antibody database using the BLAST algorithm. The sequence identity of each pairwise comparison is selected, and after each sequence in the database is analyzed, the sequences are sorted from high to low based on the identity of the sequences to the input sequence. The percent identity of the 20 most matching (Top 20) sequences is averaged to obtain a T20 score.

Для каждого типа цепи (VH, VK, VL) и длины последовательности (полноразмерная или только каркас) в базах данных All Human Databases каждая последовательность антитела была оценена среди соответствующей базы данных, применяя анализатор балла Т20. Балл Т20 получали для 20 самых совпадающих последовательностей после исключения самой вводимой последовательности (усредняли процент идентичности последовательностей от 2 до 21, поскольку последовательность 1 всегда представляла собой само вводимое антитело). Баллы Т20 для каждой группы сортировали от высокого к низкому. Убывание балла было приблизительно линейным для большинства последовательностей; тем не менее, баллы Т20 для нижних ~15% антител начинали резко уменьшаться. Следовательно, нижние 15 процентов последовательностей удаляли, и остальные последовательности образовывали базы данных Т20 Cutoff Human Databases, при этом отсечка балла Т20 указывала на наиболее низкий балл Т20 последовательности в новой базе данных.For each chain type (VH, VK, VL) and sequence length (full-length or backbone only) in the All Human Databases, each antibody sequence was scored against the corresponding database using the T20 score analyzer. A T20 score was obtained for the 20 most matching sequences after excluding the input sequence itself (the percentage of sequence identity from 2 to 21 was averaged, since sequence 1 was always the input antibody itself). T20 scores for each group were sorted from high to low. The decrease in score was approximately linear for most sequences; however, T20 scores for the bottom ~15% of antibodies began to decline sharply. Therefore, the bottom 15 percent of sequences were removed and the remaining sequences formed the T20 Cutoff Human Databases, with the T20 cutoff score indicating the lowest T20 score of the sequence in the new database.

В данном изобретении человеческое антитело представляет собой антитело, балл человечности Т20 которого составляет по меньшей мере 79% и более предпочтительно по меньшей мере 85%.In the present invention, the human antibody is an antibody whose T20 humanness score is at least 79%, and more preferably at least 85%.

Способность антител против hSIRPa блокировать связывание с CD47Ability of anti-hSIRPa antibodies to block binding to CD47

В некоторых вариантах реализации антитела против SIRPa или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению способны блокировать связывание SIRPa человека с CD47 человека. Способность блокировать связывание SIRPa человека с CD47 человека можно определить, применяя любой способ, известный в данной области. В одном варианте реализации способность антител блокировать связывание SIRPa человека с CD47 человека определяют, применяя анализ ELISA.In some embodiments, anti-SIRPa antibodies or antigen-binding fragments of the present invention are capable of blocking the binding of human SIRPa to human CD47. The ability to block human SIRPa binding to human CD47 can be determined using any method known in the art. In one embodiment, the ability of antibodies to block binding of human SIRPa to human CD47 is determined using an ELISA assay.

Способы получения антител и их антигенсвязывающих фрагментов.Methods for producing antibodies and their antigen-binding fragments.

Таким образом, в объем настоящего изобретения входят способы получения антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, включающие культивирование клетки гибридомы, которая экспрессирует антитело или фрагмент, при условии, благоприятном для такой экспрессии, и необязательно выделение антитела или фрагмента из гибридомы и/или ростовой среды (например, культуральной среды).Thus, within the scope of the present invention are methods for producing an antibody against SIRPa or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention, comprising culturing a hybridoma cell that expresses the antibody or fragment, under conditions favorable for such expression, and optionally isolating the antibody or fragment from the hybridoma and/ or growth medium (eg, culture medium).

Антитела против SIRPa, описанные в данном изобретении, также можно получить рекомбинантным способом (например, в системе экспрессии E. coli/T7, в системе экспрессии клетки млекопитающего или в системе экспрессии низших эукариот). В данном варианте реализации нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуноглобулиновые молекулы антител согласно настоящему изобретению (например, VH или VL), можно встроить в плазмиду на основе рЕТ и экспрессировать в системе E. coli/T7. Например, в объем настоящего изобретения входят способы экспрессии антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, или его иммуноглобулиновой цепи, в клетке-хозяине (например, бактериальной клеткехозяине, такой как E.coli, такой как BL21 или BL21DE3), включающие экспрессию РНК-полимеразы Т7 в клетке, которая также содержит полинуклеотид, кодирующий цепь иммуноглобулина, которая функционально связана с промотором Т7. Например, в одном варианте реализации настоящего изобретения бактериальная клетка-хозяин, такая как Е. coli, содержит полинуклеотид, кодирующий ген РНК-полимеразы Т7, функционально связанный с промотором lac, и экспрессию полимеразы и указанной цепи индуцируют путем инкубации клетки-хозяина с IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозидом).The anti-SIRPa antibodies described in this invention can also be produced recombinantly (eg, in an E. coli/T7 expression system, in a mammalian cell expression system, or in a lower eukaryotic expression system). In this embodiment, nucleic acids encoding immunoglobulin antibody molecules of the present invention (eg, VH or VL) can be inserted into a pET-based plasmid and expressed in the E. coli/T7 system. For example, within the scope of the present invention are methods for expressing an antibody, or an antigen binding fragment thereof, or an immunoglobulin chain thereof, in a host cell (e.g., a bacterial host cell such as E. coli, such as BL21 or BL21DE3), including expression of T7 RNA polymerase in a cell that also contains a polynucleotide encoding an immunoglobulin chain that is operably linked to the T7 promoter. For example, in one embodiment of the present invention, a bacterial host cell, such as E. coli, contains a polynucleotide encoding a T7 RNA polymerase gene operably linked to a lac promoter, and expression of the polymerase and said chain is induced by incubating the host cell with IPTG ( isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside).

Существует несколько способов, с помощью которых можно получить рекомбинантные антитела, которые известны в данной области. Один пример способа рекомбинантного получения антител описан в патенте США № 4816567.There are several methods by which recombinant antibodies can be produced that are known in the art. One example of a method for recombinant production of antibodies is described in US Pat. No. 4,816,567.

Трансформацию можно осуществить с помощью любого известного способа внедрения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы внедрения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию с фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, заключение полинуклеотида(ов) в липосомы, биолистическую инъекцию и непосредственную микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот можно внедрить в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США № 4399216; 4912040; 4740461 и 4959455.Transformation can be accomplished using any known method of introducing polynucleotides into a host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, electroporation, liposome entrapment of the polynucleotide(s), biolistic injection, and direct microinjection of DNA into nuclei. In addition, nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells using viral vectors. Methods for transforming cells are well known in the art. See, for example, US Pat. No. 4,399,216; 4912040; 4740461 and 4959455.

Таким образом, в объем настоящего изобретения входят рекомбинантные способы получения антиThus, the scope of the present invention includes recombinant methods for producing anti

- 32 043743 тела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, или его иммуноглобулиновой цепи, включающие введение полинуклеотида, кодирующего одну или более иммуноглобулиновых цепей антитела или фрагмента (например, тяжелую и/или легкую цепи иммуноглобулина); культивирование клетки-хозяина (например, СНО, или Pichia, или Pichia pastor is) при условии, благоприятном для такой экспрессии, и необязательно выделение антитела, или фрагмента, или цепи из клетки-хозяина и/или среды, в которой растили клетку-хозяина.- 32 043743 bodies against SIRPa or an antigen-binding fragment according to the present invention, or an immunoglobulin chain thereof, comprising the introduction of a polynucleotide encoding one or more immunoglobulin chains of the antibody or fragment (for example, heavy and/or light chains of an immunoglobulin); culturing a host cell (e.g., CHO, or Pichia, or Pichia pastor is) under conditions favorable for such expression, and optionally isolating the antibody or fragment or chain from the host cell and/or the medium in which the host cell was grown .

Антитела против SIRPa также можно синтезировать с помощью любого из способов, представленных в патенте США № 6331415.Antibodies against SIRPa can also be synthesized using any of the methods presented in US patent No. 6331415.

Эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, включая клетки млекопитающих в качестве хозяев для экспрессии антител, или фрагментов, или цепей иммуноглобулинов, описанных в данном изобретении, хорошо известны в данной области и включают многие иммортализованные линии клеток, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Такие линии клеток включают, среди прочих, клетки яичника китайского хомячка (СНО), NSO, клетки SP2, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки А549, клетки 3T3, клетки HEK-293 и множество других линий клеток. Клетки млекопитающих-хозяев включают клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, крупного рогатого скота, лошади и хомяка. Особенно предпочтительные линии клеток выбирают путем определения линий клеток с высокими уровнями экспрессии. Другие линии клеток, которые можно применять, представляют собой линии клеток насекомого, таких как клетки Sf9, клетки амфибий, клетки бактерий, клетки растений и клетки грибов. Клетки грибов включают клетки дрожжей и филаментного гриба, включая, например,Eukaryotic and prokaryotic host cells, including mammalian cells, as hosts for the expression of antibodies, or fragments, or immunoglobulin chains described in this invention, are well known in the art and include many immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection (ATCC). . Such cell lines include, among others, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NSO cells, SP2 cells, HeLa cells, newborn hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney (COS) cells, human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2), A549 cells, 3T3 cells, HEK-293 cells and many other cell lines. Mammalian host cells include human, mouse, rat, dog, monkey, pig, goat, bovine, equine and hamster cells. Particularly preferred cell lines are selected by identifying cell lines with high expression levels. Other cell lines that can be used are insect cell lines such as Sf9 cells, amphibian cells, bacterial cells, plant cells and fungal cells. Fungal cells include yeast and filamentous fungal cells including e.g.

Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens и Neurospora crassa. Pichia sp., любой Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, любой Kluyveromyces sp., Candida albicans, любой Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, любой Fusarium sp., Yarrowia lipolytica и Neurospora crassa.Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica , Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venena tum, Physcomitrella patens and Neurospora crassa . Pichia sp., any Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, any Kluyveromyces sp., Candida albicans, any Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, any Fusarium sp., Yarrowia lipolytica and Neurospora crassa.

Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие тяжелую цепь или его антигенсвязывающую часть или фрагмент, и/или легкую цепь или ее антигенсвязывающий фрагмент, внедряют в клетки млекопитающих-хозяев, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы позволить экспрессию антитела, или фрагмента, или цепи в клеткаххозяевах или секрецию в культуральную среду, в которой растили клеток-хозяев.When recombinant expression vectors encoding a heavy chain or an antigen-binding portion or fragment thereof, and/or a light chain or an antigen-binding fragment thereof are introduced into mammalian host cells, antibodies are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow expression of the antibody , or fragment, or chain in host cells or secretion into the culture medium in which the host cells were grown.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и цепи иммуноглобулина можно извлечь из культуральной среды, применяя стандартные способы очистки белка. Кроме того, экспрессию антител и их антигенсвязывающих фрагментов и цепей иммуноглобулина согласно настоящему изобретению (или других полученных из них молекул) линиями клеток-продуцентов можно повысить, применяя множество известных методик. Например, система экспрессии гена глутаминсинтетазы (система GS) представляет собой обычный подход для повышения экспрессии при некоторых условиях. Система GS обсуждается целиком или частично в рамках Европейских патентов № 0216846, 0256055, и 0323997 и 0338841. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения в клетках млекопитающих-хозяев (например, СНО) отсутствует ген глутаминсинтетазы, и их растят в отсутствие глутамина в среде, при этом, тем не менее, полинуклеотид, кодирующий цепь иммуноглобулина, содержит ген глутаминсинтетазы, который дополняет отсутствующий ген в клетке-хозяине.Antibodies and their antigen-binding fragments and immunoglobulin chains can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods. In addition, the expression of antibodies and their antigen-binding fragments and immunoglobulin chains of the present invention (or other molecules derived therefrom) by producer cell lines can be increased using a variety of known techniques. For example, the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is a common approach to increase expression under certain conditions. The GS system is discussed in whole or in part within European Patent Nos. 0216846, 0256055, and 0323997 and 0338841. Thus, in one embodiment of the present invention, mammalian host cells (eg, CHO) lack the glutamine synthetase gene and are grown in the absence of glutamine in environment, while, nevertheless, the polynucleotide encoding the immunoglobulin chain contains a glutamine synthetase gene, which complements the missing gene in the host cell.

В объем настоящего изобретения входят способы очистки антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, включающие введение образца, содержащего антитело или фрагмент, в среду для очистки (например, катионообменную среду, анионообменную среду, среду гидрофобного обмена, аффинную среду для очистки (например, белок-А, белок-G, белокA/G, белок-L)) и либо сбор очищенного антитела или фрагмента из фракции фильтрата указанного образца, который не связывается со средой; либо отбрасывание фракции фильтрата и элюирование связанного антитела или фрагмента из среды и сбор элюата. В одном варианте реализации настоящего изобретения среда находится в колонке, на которую наносят образец. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ очистки осуществляют после рекомбинантной экспрессии антитела или фрагмента в клетке-хозяине, например, когда клетку-хозяина сначала лизируют и необязательно лизат очищают от нерастворимых материалов перед очисткой на среде.The present invention includes methods for purifying an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention, comprising introducing a sample containing the antibody or fragment into a purification medium (e.g., cation exchange medium, anion exchange medium, hydrophobic exchange medium, affinity purification medium (e.g. , protein-A, protein-G, protein A/G, protein-L)) and either collecting a purified antibody or fragment from a filtrate fraction of said sample that does not bind to the medium; or discarding the filtrate fraction and eluting the bound antibody or fragment from the medium and collecting the eluate. In one embodiment of the present invention, the medium is contained in a column onto which the sample is applied. In one embodiment of the present invention, the purification method is carried out after recombinant expression of the antibody or fragment in a host cell, for example, when the host cell is first lysed and optionally the lysate is cleared of insoluble materials before media purification.

Обычно, гликопротеины, полученные в конкретной линии клеток или трансгенном животном, будут иметь паттерн гликозилирования, свойственный для гликопротеинов, полученных в данной линииTypically, glycoproteins produced in a particular cell line or transgenic animal will have a glycosylation pattern characteristic of glycoproteins produced in that line.

- 33 043743 клеток или трансгенном животном. Следовательно, конкретный паттерн гликозилирования антитела будет зависеть от конкретной линии клеток или трансгенного животного, применяемых для получения антитела. Тем не менее, все антитела, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, предложенными в данном изобретении, или включающие последовательности аминокислот, предложенные в данном изобретении, входят в объем настоящего изобретения независимо от паттерна гликозилирования, который может быть у указанных антител. Аналогично, в конкретных вариантах реализации антитела с паттерном гликозилирования, включающим только нефукозилированные N-гликаны, могут быть предпочтительными, так как было показано, что данные антитела обычно проявляют большую эффективность, чем их фукозилированные аналоги как in vitro, так и in vivo (см., например, Shinkawa и др., J. Biol. Chem. 278: 34663473 (2003); патенты США № 6946292 и 7214775). Данные антитела с нефукозилированными Nгликанами, вероятно, не будут иммуногенными, так как их углеводные структуры являются нормальным компонентом в популяции, которая присутствует в IgG сыворотки человека.- 33 043743 cells or transgenic animal. Therefore, the specific glycosylation pattern of an antibody will depend on the particular cell line or transgenic animal used to produce the antibody. However, all antibodies encoded by the nucleic acid molecules provided by this invention or comprising amino acid sequences provided by this invention are within the scope of the present invention regardless of the glycosylation pattern that said antibodies may have. Likewise, in particular embodiments, antibodies with a glycosylation pattern that includes only non-fucosylated N-glycans may be preferred as these antibodies have generally been shown to be more potent than their fucosylated counterparts both in vitro and in vivo (see eg, Shinkawa et al., J Biol Chem 278: 34663473 (2003; US Patent Nos. 6,946,292 and 7,214,775). These antibodies with non-fucosylated Nglycans are not likely to be immunogenic since their carbohydrate structures are a normal component of the population that is present in human serum IgG.

В объем настоящего изобретения входят биспецифические и бифункциональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты со специфичностью связывания с SIRPa и другим антигеном, таким как, например, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44, CD52, CD56, CD70, CD96, CD97, CD99, CD117, CD123, c-Met, CEA, EGFR, EpCAM, HER2, HER3, PSMA, PTHR2, мезотелин, PD-1, PD-L1, TIM3, и способы их применения. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелой/легкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получить с помощью различных способов, включая слияние гибридом или соединение фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai, и др., (1990) Clin. Ехр. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, и др., (1992) J Immunol. 148:1547-1553. Кроме того, биспецифические антитела можно получить в виде диател (Holliger, и др., (1993) PNAS USA 90:6444-6448) или Janusin (Traunecker, и др., (1991) EMBOJ. 10:3655-3659 и Traunecker, и др., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52). В объем настоящего изобретения входят дуотела, которые представляют собой биспецифические антитела с нормальными структурами IgG (Labrijn и др., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (13): 5145-5150).The present invention includes bispecific and bifunctional antibodies and antigen binding fragments with specificity for binding to SIRPa and other antigen, such as, for example, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44, CD52, CD56, CD70, CD96, CD97, CD99, CD117, CD123, c-Met, CEA, EGFR, EpCAM, HER2, HER3, PSMA, PTHR2, mesothelin, PD-1, PD-L1, TIM3, and methods of using them. A bispecific or bifunctional antibody is an artificial hybrid antibody containing two different heavy/light chain pairs and two different binding sites. Bispecific antibodies can be produced using various methods, including hybridoma fusion or joining of Fab' fragments. See, for example, Songsivilai, et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, et al., (1992) J Immunol. 148:1547–1553. In addition, bispecific antibodies can be prepared as diabodies (Holliger, et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448) or Janusin (Traunecker, et al., (1991) EMBOJ. 10:3655-3659 and Traunecker, et al., (1992) Int J Cancer Suppl 7:51-52). The present invention includes duobodies, which are bispecific antibodies with normal IgG structures (Labrijn et al., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (13): 5145-5150).

В объем настоящего изобретения дополнительно входят антигенсвязывающие SIRPa фрагменты антител против SIRPa, описанных в данном изобретении. Фрагменты антитела включают фрагменты F(ab)2, которые можно получить путем ферментативного расщепления IgG, например, пепсином. Фрагменты Fab можно получить, например, путем восстановления F(ab)2 с помощью дитиотреитола или меркаптоэтиламина.The present invention further includes SIRPa antigen-binding fragments of the anti-SIRPa antibodies described herein. Antibody fragments include F(ab) 2 fragments, which can be obtained by enzymatic digestion of IgG, for example with pepsin. Fab fragments can be obtained, for example, by reduction of F(ab) 2 using dithiothreitol or mercaptoethylamine.

Иммуноглобулины можно распределить по различным классам в зависимости от последовательностей аминокислот константного домена их тяжелых цепей. В некоторых вариантах реализации различные константные домены можно присоединить к гуманизированным областям VL и VH, полученным из CDR, предложенных в данном изобретении. Существует по меньшей мере пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; IgA1 и IgA2. В объем настоящего изобретения входят антитела и антигенсвязывающие фрагменты любого из данных классов или подклассов антител.Immunoglobulins can be classified into different classes depending on the amino acid sequences of the constant domain of their heavy chains. In some embodiments, various constant domains can be attached to the humanized V L and VH regions derived from the CDRs provided herein. There are at least five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these can be further subdivided into subclasses (isotypes), such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4; IgA1 and IgA2. The scope of the present invention includes antibodies and antigen-binding fragments of any of these classes or subclasses of antibodies.

В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, например, человеческую константную область, такую как человеческая константная область тяжелой цепи γ1, γ2, γ3 или γ4 или ее вариант. В другом варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи, например, человеческую константную область легкой цепи, такую как область легкой цепи лямбда или каппа человека или ее вариант. В качестве примера, но не ограничения, человеческая константная область тяжелой цепи может представлять собой у4 и человеческая константная область легкой цепи может представлять собой каппа. В альтернативном варианте реализации Fc-область антитела представляет собой γ4 с мутацией Ser228Pro (Schuurman, J и др., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain constant region, for example, a human constant region, such as a human γ1, γ2, γ3, or γ4 heavy chain constant region, or a variant thereof. In another embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain constant region, for example, a human light chain constant region, such as a human lambda or kappa light chain region or a variant thereof. By way of example, and not limitation, the human heavy chain constant region may be y4 and the human light chain constant region may be kappa. In an alternative embodiment, the Fc region of the antibody is γ4 with the Ser228Pro mutation (Schuurman, J et al., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).

В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG1. В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG2. В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG4.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain constant region of the IgG1 subtype. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain constant region of the IgG2 subtype. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain constant region of the IgG4 subtype.

Конструирование антител.Construction of antibodies.

Дополнительно включены варианты реализации, в которых антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой сконструированные антитела с введенными модификациями в каркасных остатках внутри вариабельных доменов антитела, например, чтобы улучшить свойства антитела или фрагмента. Обычно, такие модификации каркаса вводят, чтобы снизить иммуногенность антитела или фрагмента. Это обычно осуществляют путем замены не относящихся к CDR остатков в вариабельных доменах (т.е. каркасных остатков) в исходном (например, из грызуна) антителе или фрагменте на аналогичные остатки из иммунного репертуара вида, в котором антитело будут применять, например, на человеческие остатки в случае лекарств для человека. Такое антитело или фрагмент называютAdditionally included are embodiments in which anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof are engineered antibodies with modifications introduced to framework residues within the variable domains of the antibody, for example, to improve the properties of the antibody or fragment. Typically, such framework modifications are introduced to reduce the immunogenicity of the antibody or fragment. This is typically accomplished by replacing non-CDR residues in the variable domains (i.e., framework residues) in the original (e.g., rodent) antibody or fragment with similar residues from the immune repertoire of the species in which the antibody will be used, e.g., human residues in the case of human medicines. Such an antibody or fragment is called

- 34 043743 гуманизированным антителом или фрагментом. В некоторых случаях необходимо повысить аффинность или изменить специфичность сконструированного (например, гуманизированного) антитела. Один подход состоит в мутировании одного или более каркасных остатков на соответствующую зародышевую последовательность. В частности, антитело или фрагмент, который подвергли соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от зародышевой последовательности, из которой получено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркаса антитела или фрагмента с зародышевыми последовательностями, из которых получено антитело или фрагмент. Другой подход состоит в возвращении к исходному остатку (например, грызуна) в одном или более положениях сконструированного (например, гуманизированного) антитела, например, чтобы восстановить аффинность связывания, которая могла быть утрачена в процессе замены каркасных остатков (см., например, патент США № 5693762, патент США № 5585089 и патент США № 5530101).- 34 043743 humanized antibody or fragment. In some cases, it is necessary to increase the affinity or change the specificity of the engineered (eg, humanized) antibody. One approach is to mutate one or more framework residues to the corresponding germline sequence. In particular, an antibody or fragment that has been somatically mutated may contain framework residues that differ from the germline sequence from which the antibody is derived. Such residues can be identified by comparing the backbone sequences of the antibody or fragment with the germline sequences from which the antibody or fragment is derived. Another approach is to return to the original residue (eg, rodent) at one or more positions of the engineered (eg, humanized) antibody, for example, to restore binding affinity that may have been lost during the process of replacing framework residues (see, for example, US Pat. No. 5693762, US Patent No. 5585089 and US Patent No. 5530101).

В некоторых вариантах реализации антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты сконструированы (например, гуманизированы), чтобы они содержали модификации в каркасе и/или участках CDR для улучшения их свойств. Такие сконструированные изменения могут быть основаны на молекулярном моделировании. Можно сконструировать молекулярную модель вариабельной области последовательности исходного (не относящегося к человеку) антитела, чтобы понять структурные особенности антитела, и использовать ее для определения потенциальных областей на антителе, которые могут взаимодействовать с антигеном. Общепринятые участки CDR основаны на выравнивании последовательностей иммуноглобулинов и идентификации вариабельных областей. Kabat и др., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. Kabat, и др.; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд; 5ое изд.; публикация NIH № 91-3242; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat и др., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616. Chothia и коллеги тщательно исследовали конформации петель в кристаллических структурах антител и предположили наличие гипервариабельных петель. Chothia, и др., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 или Chothia, и др., (1989) Nature 342:878-883. Существуют вариации между участками, классифицируемыми как CDR и как гипервариабельные петли. В более поздних исследованиях (Raghunathan и др., (2012) J. Mol. Recog. 25, 3, 103-113) анализировали несколько кристаллических комплексов антитело-антиген и наблюдали, что антигенсвязывающие области в антителах не обязательно строго соответствуют остаткам CDR или гипервариабельным петлям. Молекулярную модель вариабельной области не относящегося к человеку антитела можно использовать в качестве опорной при выборе участков, которые потенциально могут связываться с антигеном. На практике потенциальные антигенсвязывающие области, выявленные на основании модели, отличаются от обычных CDR или гипервариабельных петель. Для молекулярного моделирования можно применять коммерчески доступное научное программное обеспечение, такое как Discovery Studio (BIOVIA, Dassault Systems)). Человеческие каркасные остатки можно выбрать на основании лучшего совпадения с не относящейся к человеку последовательностью как в каркасных областях, так и в участках CDR. Для FR4 (каркаса 4) в VH сравнивают участки VJ зародышевых последовательностей человека с соответствующими не относящимися к человеку участками. В случае FR4 (каркаса 4) в VL сравнивают участки J-каппа и J-лямбда зародышевых последовательностей человека с соответствующими не относящимися к человеку участками. После обнаружения подходящих каркасов человека CDR прививают на выбранные каркасы человека. В некоторых случаях некоторые остатки на границе VL-VH можно сохранить такими, как в не относящейся к человеку (исходной) последовательности. Молекулярные модели также можно применять для идентификации остатков, которые потенциально могут изменять конформации CDR и, следовательно, связывание с антигеном. В некоторых случаях, данные остатки сохраняют такими, как в не относящейся к человеку (исходной) последовательности. Молекулярные модели также можно применять, чтобы определить выставленные в растворитель аминокислоты, которые могут привести к нежелательным эффектам, таким как гликозилирование, дезаминирование и окисление. Фильтры возможности разработки можно ввести ранее на этапе разработки, чтобы исключить/минимизировать такие потенциальные проблемы.In some embodiments, anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof are engineered (eg, humanized) to contain modifications in the framework and/or CDR regions to improve their properties. Such engineered changes can be based on molecular modeling. A molecular model of the variable region sequence of a parent (non-human) antibody can be constructed to understand the structural features of the antibody and used to identify potential regions on the antibody that may interact with the antigen. Conventional CDR regions are based on immunoglobulin sequence alignments and identification of variable regions. Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, MD; 5th ed.; NIH Publication No. 91-3242; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609–6616. Chothia et al carefully examined loop conformations in antibody crystal structures and suggested the presence of hypervariable loops. Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 or Chothia, et al. (1989) Nature 342:878-883. There is variation between regions classified as CDRs and hypervariable loops. More recent studies (Raghunathan et al., (2012) J. Mol. Recog. 25, 3, 103-113) analyzed several crystalline antibody-antigen complexes and observed that the antigen-binding regions in antibodies do not necessarily strictly correspond to CDR or hypervariable residues loops. A molecular model of the variable region of a non-human antibody can be used as a reference in selecting regions that can potentially bind the antigen. In practice, potential antigen-binding regions identified from the model are different from conventional CDRs or hypervariable loops. Commercially available scientific software such as Discovery Studio (BIOVIA, Dassault Systems) can be used for molecular modeling. Human framework residues can be selected based on the best match to non-human sequence in both framework regions and CDR regions. For FR4 (framework 4) in VH, the VJ regions of human germline sequences are compared with the corresponding non-human regions. In the case of FR4 (scaffold 4), the human germline J-kappa and J-lambda regions of the VL are compared with the corresponding non-human regions. Once suitable human scaffolds are found, the CDRs are grafted onto the selected human scaffolds. In some cases, some residues at the VL-VH boundary may be retained as in the non-human (original) sequence. Molecular models can also be used to identify residues that have the potential to alter CDR conformations and thus antigen binding. In some cases, these residues are retained as they were in the non-human (original) sequence. Molecular models can also be used to identify solvent-exposed amino acids that may lead to undesirable effects such as glycosylation, deamination, and oxidation. Development feasibility filters can be introduced earlier in the development phase to eliminate/minimize such potential problems.

Другой тип модификации каркаса включает мутирование одного или более остатков внутри каркасной области, или даже внутри одного или более участков CDR, чтобы удалить Т-клеточные эпитопы и тем самым снизить потенциальную иммуногенность антитела. Данный подход также называют деиммунизацией, и он описан более подробно в патенте США № 7125689.Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework region, or even within one or more CDR regions, to remove T cell epitopes and thereby reduce the potential immunogenicity of the antibody. This approach is also called deimmunization and is described in more detail in US Pat. No. 7,125,689.

В конкретных вариантах реализации потребуется заменить некоторые аминокислоты, содержащие выставленные боковые цепи, на другие аминокислотные остатки, чтобы обеспечить большую химическую стабильность конечного антитела, чтобы избежать дезаминирования или изомеризации. Дезаминирование аспарагина может происходить в последовательностях NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG или QS и приводить к образованию остатка изоаспарагиновой кислоты, который вводит изгиб в полипептидную цепь и снижает ее стабильность (эффект изоаспарагиновой кислоты). Изомеризация может происходить в последовательностях DG, DS, DA или DT. В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему описанию не содержат сайты дезаминирования или изомеризма аспарагина.In particular embodiments, it will be necessary to replace some amino acids containing exposed side chains with other amino acid residues to provide greater chemical stability of the final antibody to avoid deamination or isomerization. Deamination of asparagine can occur at the sequences NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG or QS and result in the formation of an isoaspartic acid residue, which introduces a kink into the polypeptide chain and reduces its stability (isoaspartic acid effect). Isomerization can occur in the sequences DG, DS, DA or DT. In some embodiments, the antibodies of the present disclosure do not contain asparagine deamination or isomerism sites.

Например, остаток аспарагина (Asn) можно заменить на Gln или Ala, чтобы уменьшить возможность образования изоаспартата в каких-либо последовательностях Asn-Gly, особенно внутри CDR. Сходная проблема может происходить в последовательности Asp-Gly. Reissner и Aswad (2003) Cell. Mol.For example, an asparagine (Asn) residue can be replaced with Gln or Ala to reduce the possibility of isoaspartate formation in any Asn-Gly sequences, especially within CDRs. A similar problem may occur in the Asp-Gly sequence. Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol.

- 35 043743- 35 043743

Life Sci. 60:1281. Образование изоаспартата может ослаблять или полностью подавлять связывание антитела с целевым антигеном. См. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 в 734. В одном варианте реализации аспарагин заменяют на глутамин (Gln). Также может потребоваться изменить аминокислоту, расположенную рядом с остатком аспарагина (Asn) или глутамина (Gln), чтобы снизить вероятность дезаминирования, которое происходит с большей частотой, когда малые аминокислоты встречаются рядом с аспарагином или глутамином. См., Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Кроме того, любые остатки метионина (обычно выставленные в растворитель Met) в CDR можно заменить на Lys, Leu, Ala или Phe или другие аминокислоты, чтобы уменьшить вероятность окисления серы в метионине, что может уменьшить аффинность связывания антигена, а также способствует молекулярной гетерогенности в конечном препарате антитела. Id. Кроме того, чтобы предотвратить или минимизировать потенциально расщепляющиеся пептидные связи Asn-Pro, может быть желательно изменить любые комбинации AsnPro, обнаруженные в CDR, на Gln-Pro, Ala-Pro или Asn-Al. Антитела с такими заменами затем подвергают скринингу, чтобы удостовериться в том, что замены не снижают аффинность или специфичность антитела по отношению к SIRPa, или другую желательную биологическую активность до неприемлемых уровней.Life Sci. 60:1281. The formation of isoaspartate can weaken or completely inhibit the binding of the antibody to the target antigen. See Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 to 734. In one embodiment, asparagine is replaced by glutamine (Gln). It may also be necessary to change the amino acid located near an asparagine (Asn) or glutamine (Gln) residue to reduce the likelihood of deamination, which occurs with greater frequency when small amino acids occur near asparagine or glutamine. See Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Additionally, any methionine residues (usually exposed in Met solvent) in the CDR can be replaced with Lys, Leu, Ala or Phe or other amino acids to reduce the likelihood of sulfur oxidation in methionine, which can reduce antigen binding affinity and also promote molecular heterogeneity in final antibody preparation. Id. Additionally, to prevent or minimize potential Asn-Pro cleavable peptide bonds, it may be desirable to change any AsnPro combinations found in the CDR to Gln-Pro, Ala-Pro, or Asn-Al. Antibodies with such substitutions are then screened to ensure that the substitutions do not reduce the antibody's affinity or specificity for SIRPa, or other desired biological activity, to unacceptable levels.

Таблица 2table 2

Типичные стабилизирующие CDR вариантыTypical CDR stabilizing options

Остаток CDR Remaining CDR Стабилизирующий вариант последовательности Stabilizing sequence variant Asn-Gly (N-G) Asn-Gly (N-G) Gln-Gly, Ala-Gly, или Asn-Ala (Q-G), (A-G) или (N-A) Gln-Gly, Ala-Gly, or Asn-Ala (Q-G), (A-G) or (N-A) Asp-Gly (D-G) Asp-Gly (D-G) Glu-Gly, Ala-Gly или Asp-Ala (E-G), (A-G) или (D-A) Glu-Gly, Ala-Gly or Asp-Ala (E-G), (A-G) or (D-A) Met (Μ) Met(Μ) Lys, Leu, Ala, или Phe (K), (L), (А) или (F) Lys, Leu, Ala, or Phe (K), (L), (A) or (F) Asn (N) Asn (N) Gln или Ala (Q) или (A) Gln or Ala (Q) or (A) Asn-Pro (N-P) Asn-Pro (N-P) Gln-Pro, Ala-Pro или Asn-Ala (Q-P), (А-P) или (N-A) Gln-Pro, Ala-Pro or Asn-Ala (Q-P), (A-P) or (N-A)

Другой тип модификации каркаса включает мутирование одного или более остатков внутри каркасных областей, чтобы предотвратить агрегацию. Риск агрегации антитела можно оценить, применяя пространственную склонность к агрегации. См., Chennamsetty, N et al. (2010) J. Phys. Chem. 114, 6614-6624. В указанном способе необходимо рассчитать поверхность, доступную растворителю (ПДР), для каждого атома. Показатель молекулярной агрегации затем рассчитывают как сумму всех показателей для атомов. Для данного радиуса и размера молекулы это приблизительный критерий ее совокупной склонности к агрегации. Остатки с высоким показателем агрегации заменяют на остатки с более низким показателем (например, более гидрофильные аминокислоты).Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework regions to prevent aggregation. The risk of antibody aggregation can be assessed using spatial aggregation propensity. See Chennamsetty, N et al. (2010) J. Phys. Chem. 114, 6614-6624. In this method, it is necessary to calculate the solvent accessible surface area (SAS) for each atom. The molecular aggregation index is then calculated as the sum of all atomic indices. For a given radius and size of a molecule, this is an approximate measure of its overall propensity to aggregate. Residues with a high aggregation index are replaced with residues with a lower aggregation index (for example, more hydrophilic amino acids).

Конструирование Fc-области антител.Construction of the Fc region of antibodies.

Антитела (например, гуманизированные антитела) и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали модификации внутри Fc-области, как правило, чтобы изменить одно или более свойств антитела, таких как время полувыведения в сыворотке крови, фиксация комплемента, связывание с Fc-рецептором и/или эффекторная функция (например, антиген-зависимая опосредованная клетками цитотоксичность). Более того, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно химически модифицировать (например, к антителу можно присоединить одну или более химических молекул) или модифицировать, чтобы изменить их гликозилирование, чтобы снова изменить одно или более свойств антитела или фрагмента. Каждый из данных вариантов реализации более подробно описан ниже. Нумерация остатков в Fc-области соответствует EU-индексу по Кабату.Antibodies (e.g., humanized antibodies) and antigen binding fragments thereof described herein can also be engineered to contain modifications within the Fc region, typically to change one or more properties of the antibody, such as serum half-life , complement fixation, Fc receptor binding, and/or effector function (eg, antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity). Moreover, the antibodies and antigen binding fragments thereof described herein can be chemically modified (eg, one or more chemical molecules can be attached to the antibody) or modified to alter their glycosylation to again change one or more properties of the antibody or fragment. Each of these embodiments is described in more detail below. The numbering of residues in the Fc region corresponds to the EU index according to Kabat.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также включают антитела и фрагменты с модифицированными (или блокированными) Fc-областями, чтобы получить измененные эффекторные функции. См., например, патент США номер 5624821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702. Такие модификации можно использовать для усиления или подавления различных реакций иммунной системы с возможными полезными эффектами для диагностики и терапии. Изменения Fc-области включают изменения аминокислот (замены, делеции и вставки), гликозилирование или дегликозилирование, и добавление множества Fc-областей. Изменения Fc также могут изменить время полувыведения антител в терапевтических антителах, позволяя менее частое введение дозы и, следовательно, большее удобство и применение меньшего количества материала. См. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 на стр. 734-35.The antibodies and antigen-binding fragments thereof described in this invention also include antibodies and fragments with modified (or blocked) Fc regions to obtain altered effector functions. See, for example, US patent number 5624821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702. Such modifications can be used to enhance or suppress various immune system responses, with possible beneficial effects for diagnosis and therapy. Fc region changes include amino acid changes (substitutions, deletions and insertions), glycosylation or deglycosylation, and the addition of multiple Fc regions. Fc changes can also alter the antibody half-life of therapeutic antibodies, allowing for less frequent dosing and therefore greater convenience and use of less material. See Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at pp. 734-35.

В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настояще- 36 043743 му изобретению представляет собой антитело или фрагмент изотипа IgG4, содержащий мутацию серина на пролин в положении, соответствующем положению 228 (S228P; EU-индекс; SEQ ID NO: 66) в шарнирной области константной области тяжелой цепи. Сообщали, что данная мутация нарушает гетерогенность дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями в шарнирной области (Angal и др. (1993). Mol.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention is an antibody or fragment of the IgG4 isotype comprising a serine to proline mutation at a position corresponding to position 228 (S228P; EU index; SEQ ID NO: 66) in the hinge regions of the heavy chain constant region. This mutation was reported to disrupt the heterogeneity of disulfide bridges between heavy chains in the hinge region (Angal et al. (1993). Mol.

Immunol. 30:105-108; положение 241 на основании системы нумерации по Кабату).Immunol. 30:105-108; provision 241 based on the Kabat numbering system).

В одном варианте реализации настоящего изобретения шарнирная область СН1 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области увеличено или уменьшено. Данный подход дополнительно описан в патенте США № 5677425. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН1 изменяют, например, чтобы облегчить сборку легкой и тяжелой цепей или чтобы повысить или снизить стабильность антитела.In one embodiment of the present invention, the CH1 hinge region is modified such that the number of cysteine residues in the hinge region is increased or decreased. This approach is further described in US Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the CH1 hinge region is varied, for example, to facilitate the assembly of light and heavy chains or to increase or decrease the stability of the antibody.

В другом варианте реализации шарнирную область Fc антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению мутируют, чтобы уменьшить биологическое время полувыведения антитела или фрагмента. В частности, одну или более мутаций аминокислот вводят в поверхность раздела между доменами СН2-СН3 шарнирного фрагмента Fc, так что ослабляется связывание антитела или фрагмента со стафилококковым белком A (SpA) по сравнению со связыванием SpA нативным шарнирным доменом Fc. Данный подход более подробно описан в патенте США № 6165745.In another embodiment, the Fc hinge region of an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention is mutated to reduce the biological half-life of the antibody or fragment. Specifically, one or more amino acid mutations are introduced into the interface between the CH2-CH3 domains of the Fc hinge fragment such that binding of the antibody or fragment to staphylococcal protein A (SpA) is reduced compared to SpA binding by the native Fc hinge domain. This approach is described in more detail in US patent No. 6165745.

В другом варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению модифицируют, чтобы увеличить его биологическое время полувыведения. Возможны различные подходы. Например, можно ввести одну или более из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США № 6277375. В качестве альтернативы, чтобы увеличить его биологическое время полувыведения, антитело можно изменить внутри области СН1 или CL, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора реутилизации, полученный из двух петель домена СН2 Fc-области IgG, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022.In another embodiment, an antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention is modified to increase its biological half-life. Various approaches are possible. For example, one or more of the following mutations may be introduced: T252L, T254S, T256F, as described in US Pat. No. 6,277,375. Alternatively, to increase its biological half-life, the antibody may be modified within the CH1 or CL region to contain a binding epitope recycling receptor derived from two loops of the C H 2 domain of the IgG Fc region, as described in US patents No. 5,869,046 and 6,121,022.

В других дополнительных вариантах реализации Fc-область изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на отличный аминокислотный остаток, чтобы изменить эффекторную(ые) функцию(и) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно заменить на отличный аминокислотный остаток, так что у антитела изменится аффинность к эффекторному лиганду и сохранится способность связывать антиген исходного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменена, может представлять собой, например, Fc-рецептор или компонент комплемента С1. Данный подход более подробно описан в патентах США № 5624821 и 5648260.In other further embodiments, the Fc region is modified by replacing at least one amino acid residue with a different amino acid residue to change the effector function(s) of the antibody or antigen binding fragment thereof. For example, one or more amino acids selected from amino acid residues 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, and 322 can be replaced with a different amino acid residue such that the antibody changes affinity for the effector ligand and retains the ability to bind the antigen of the original antibody . The effector ligand for which the affinity is changed may be, for example, an Fc receptor or a complement component C1. This approach is described in more detail in US patents No. 5624821 and 5648260.

В другом примере одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменить на отличный аминокислотный остаток, так что у антитела изменится связывание C1q и/или уменьшится или нарушится комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ). Данный подход более подробно описан в патенте США № 6194551.In another example, one or more amino acids selected from amino acid residues 329, 331 and 322 can be replaced with a different amino acid residue such that the antibody changes C1q binding and/or reduces or impairs complement-dependent cytotoxicity (CDC). This approach is described in more detail in US patent No. 6194551.

В другом примере один или более аминокислотных остатков в положениях аминокислот 231 и 239 изменены, чтобы тем самым изменить способность антитела фиксировать комплемент. Данный подход описан дополнительно в публикации РСТ WO 94/29351.In another example, one or more amino acid residues at amino acid positions 231 and 239 are changed to thereby alter the ability of the antibody to fix complement. This approach is further described in PCT publication WO 94/29351.

Белки согласно настоящему изобретению, которые предпочтительно представляют собой антитела и наиболее предпочтительно антитела IgG или их фрагменты, могут обладать измененными (например, по сравнению с немодифицированным антителом) свойствами связывания FcyR (примеры свойств связывания включают, но не ограничены перечисленными: специфичность связывания, равновесную константу диссоциации (KD), скорости диссоциации и ассоциации (koff и kn, соответственно), аффинность и/или авидность связывания), и некоторые изменения более или менее желательны. В данной области известно, что равновесную константу диссоциации (KD) определяют как koff/kon, и Ka представляет собой величину, обратную KD.Proteins of the present invention, which are preferably antibodies and most preferably IgG antibodies or fragments thereof, may have altered (e.g., compared to an unmodified antibody) FcyR binding properties (examples of binding properties include, but are not limited to: binding specificity, equilibrium constant dissociation (K D ), dissociation and association rates (ko ff and kn, respectively), binding affinity and/or avidity), and some changes are more or less desirable. It is known in the art that the equilibrium dissociation constant (K D ) is defined as k off /k on , and Ka is the reciprocal of K D .

Аффинности и свойства связывания Fc-области с ее лигандом можно определить с помощью различных способов анализа in vitro (анализов на основе биохимии или иммунологии), известных в данной области для определения взаимодействий Fc-FcyR, т.е. специфического связывания Fc-области с FcyR, включая, но не ограничиваясь равновесными способами (например, твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) или радиоиммуноанализом (RIA)), или кинетическими анализами (например, анализом BIACORE®, Octet® или KinExa®), и другими способами, такими как непрямые анализы связывания, анализы конкурентного ингибирования, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), электрофорез и хроматография в геле (например, гель-фильтрация). В данных и других способах может использоваться метка на одном или более исследуемых компонентах и/или могут использоваться различные способы детектирования, включая, но не ограничиваясь перечисленными: хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки.The affinities and binding properties of the Fc region to its ligand can be determined using various in vitro assays (biochemistry or immunology based assays) known in the art to detect Fc-FcyR interactions, i.e. specific binding of the Fc region to FcyR, including but not limited to equilibrium methods (eg, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or radioimmunoassay (RIA)), or kinetic assays (eg, BIACORE®, Octet® or KinExa® assay), and others by methods such as indirect binding assays, competitive inhibition assays, fluorescence resonance energy transfer (FRET), electrophoresis and gel chromatography (eg, gel filtration). These and other methods may use a label on one or more components of interest and/or may use various detection methods, including, but not limited to, chromogenic, fluorescent, luminescent or isotopic labels.

В некоторых вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению связываются с одним или более FcyR человека, выбранными из группы, состоящей из FcyRI, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRIIIA-F158 и FcyRIIIA-V158, с аффинностью, по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 30 раз и более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз меньшей, чем эквивалентный белок, содержащий Fc- 37 043743 область константного домена тяжелой цепи IgG1 человека дикого типа (SEQ ID NO: 119) или Fc-область константного домена тяжелой цепи IgG4 человека дикого типа (SEQ ID NO: 66).In some embodiments, the proteins of the present invention bind to one or more human FcyRs selected from the group consisting of FcyRI, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRIIIA-F158, and FcyRIIIA-V158, with an affinity of at least 10-fold, preferably at least 30-fold and more preferably at least 100-fold smaller than an equivalent protein containing the wild-type human IgG1 heavy chain constant domain Fc-37 043743 region (SEQ ID NO: 119) or the wild-type human IgG4 heavy chain constant domain Fc region type (SEQ ID NO: 66).

В различных вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению содержат Fc-область иммуноглобулина, содержащую область С2 иммуноглобулина и область С3 иммуноглобулина и шарнирную область иммуноглобулина. В качестве примера, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой Fc-область IgG, Fc-область IgE или Fc-область IgA. В некоторых предпочтительных вариантах реализации указанный белок содержит две Fc-области иммуноглобулина, каждая Fc-область иммуноглобулина содержит область С2 иммуноглобулина и область C3 иммуноглобулина и шарнирную область иммуноглобулина, при этом шарнирная область одной из Fc-областей иммуноглобулина связана с шарнирной областью другой Fc-области иммуноглобулина с образованием димерной структуры Fc. В наиболее предпочтительном случае такой белок представляет собой человеческий или гуманизированный белок IgG.In various embodiments, the proteins of the present invention comprise an immunoglobulin Fc region comprising an immunoglobulin C2 region and an immunoglobulin C3 region and an immunoglobulin hinge region. As an example, the Fc region of an immunoglobulin may be an IgG Fc region, an IgE Fc region, or an IgA Fc region. In some preferred embodiments, the protein comprises two immunoglobulin Fc regions, each immunoglobulin Fc region comprising an immunoglobulin C2 region and an immunoglobulin C3 region and an immunoglobulin hinge region, wherein the hinge region of one of the immunoglobulin Fc regions is linked to the hinge region of the other Fc region immunoglobulin with the formation of a dimeric Fc structure. Most preferably, the protein is a human or humanized IgG protein.

В некоторых вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению включают мутированную Fc-область IgG4, и предпочтительно белок представляет собой IgG, содержащий две мутированные Fc-области IgG4, образующие димерную структуру Fc. В качестве примера, мутированная Fcобласть IgG4 может содержать одну из мутаций, или комбинаций мутаций, перечисленных в табл. 3. Система нумерации константной области, используемая в данной таблице, соответствует EU-индексу, описанному в Kabat и др. (1991, публикация NIH 91-3242, Национальная служба технической информации, Спрингфилд, Вирджиния). В таблице первая буква и число представляет собой немодифицированную аминокислоту и ее положение и вторая буква представляет замещающую аминокислоту в указанном положении. Для тех ячеек, которые содержат комбинации более чем одной мутации, каждая мутация в указанной комбинации отделена символом /.In some embodiments, the proteins of the present invention comprise a mutated IgG4 Fc region, and preferably the protein is an IgG comprising two mutated IgG4 Fc regions forming a dimeric Fc structure. As an example, a mutated IgG4 F region may contain one of the mutations, or combinations of mutations, listed in Table 1. 3. The constant region numbering system used in this table follows the EU index described in Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). In the table, the first letter and number represents the unmodified amino acid and its position and the second letter represents the substituting amino acid at the specified position. For those cells that contain combinations of more than one mutation, each mutation in the specified combination is separated by a /.

Таблица 3Table 3

N297Q N297Q L235E L235E N297Q/L235E N297Q/L235E F234A F234A Q268A Q268A F23 4A/L23 5A/G237А/Р23 8А F23 4A/L23 5A/G237A/P23 8A F234A/L235A/AG236 /G237A/P238A F234A/L235A/AG236 /G237A/P238A F234A/L235A/G237A /P238A/Q268A F234A/L235A/G237A /P238A/Q268A F234A/L235A/AG236/G237A /P238A/Q268A F234A/L235A/AG236/G237A /P238A/Q268A F234A/L235A F234A/L235A L235E/P329G L235E/P329G L235A/G237A/E318A L235A/G237A/E318A F234A/L235A/G237A /P238S F234A/L235A/G237A /P238S F234A/L235A/AG236 /G237A/P238S F234A/L235A/AG236 /G237A/P238S F234A/L235A/G237A /P238S/Q268A F234A/L235A/G237A /P238S/Q268A F234A/L235A/AG236 /G237A/P238S/Q268A F234A/L235A/AG236 /G237A/P238S/Q268A

В некоторых вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению включают мутированную Fc-область IgG1, и предпочтительно белок представляет собой IgG, содержащий две мутированные Fc-области IgG1, образующие димерную структуру Fc. В качестве примера, мутированная Fcобласть IgG1 может содержать одну из мутаций, перечисленных в табл. 4. Система нумерации константной области, используемая в данной таблице, соответствует EU-индексу, описанному в Kabat и др. (1991, публикация NIH 91-3242, Национальная служба технической информации, Спрингфилд, Вирджиния). В таблице первая буква и число представляет собой немодифицированную аминокислоту и ее положение и вторая буква представляет замещающую аминокислоту в указанном положении.In some embodiments, the proteins of the present invention comprise a mutated IgG1 Fc region, and preferably the protein is an IgG comprising two mutated IgG1 Fc regions forming a dimeric Fc structure. As an example, a mutated IgG1 F region may contain one of the mutations listed in Table 1. 4. The constant region numbering system used in this table follows the EU index described in Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). In the table, the first letter and number represents the unmodified amino acid and its position and the second letter represents the substituting amino acid at the specified position.

- 38 043743- 38 043743

Таблица 4Table 4

K222Y K222Y Р232К R232K А231К A231K E233N E233N E233Q E233Q E233R E233R E233S E233S Е233Т E233T Е233Н E233N Е233А E233A E233V E233V E233L E233L E233F E233F Е233М E233M E233Y E233Y E233W E233W E233G E233G L234D L234D L234E L234E L234N L234N L234Q L234Q L234T L234T L234H L234H L234F L234F L234K L234K L234R L234R L234S L234S L234A L234A L234M L234M L234V L234V L235E L235E L235T L235T L235F L235F L235K L235K L235R L235R L235A L235A L235M L235M L235W L235W L235N L235N L235Q L235Q L235H L235H L235V L235V G236A G236A G236N G236N G236R G236R G236H G236H G236L G236L G236F G236F G236P G236P G237A G237A G237E G237E G237N G237N G237Q G237Q G237K G237K G237R G237R G237S G237S G237T G237T G237H G237H G237L G237L G237I G237I G237F G237F G237M G237M G237Y G237Y G237P G237P Р238К R238K P238N P238N P238R P238R P238S P238S Р238Т R238T P238Y P238Y P238G P238G Р238А P238A S239A S239A S239N S239N S239F S239F S239K S239K S239R S239R S239V S239V S239W S239W S239P S239P S239H S239H S239Y S239Y D249H D249H V240A V240A F241W F241W F241L F241L F243W F243W F243L F243L F243E F243E Р244Н Р244Н Р245А P245A P247V P247V P247G P247G V253I V253I V263I V263I V263T V263T V263M V263M V264D V264D V264E V264E V264K V264K V264F V264F V264M V264M V264H V264H V264W V264W V264G V264G V264Q V264Q V264A V264A V264L V264L D265A D265A D265E D265E D265Q D265Q D265S D265S D265H D265H D265V D265V D265L D265L D265F D265F D265M D265M D265Y D265Y D265N D265N D265G D265G

- 39 043743- 39 043743

V266T V266T V266M V266M V266A V266A S267G S267G S267H S267H S267N S267N S267P S267P S267R S267R S267T S267T S267F S267F S267W S267W E269A E269A E269K E269K E269S E269S E269V E269V E269F E269F E269I E269I E269M E269M E269W E269W E269H E269H E269T E269T E269L E269L E269N E269N E269Y E269Y E269R E269R E269P E269P E269G E269G D270A D270A D270N D270N D270E D270E D270Q D270Q D270T D270T D270H D270H D270R D270R D270S D270S D270L D270L D270I D270I D270F D270F D270W D270W D270P D270P D270G D270G P271H P271H P271Q P271Q P271K P271K P271R P271R P271S P271S P271V P271V P271F P271F P271W P271W D280L D280L D280W D280W D280P D280P E293F E293F E294A E294A E293Y E293Y E294K E294K E294R E294R E294S E294S E294V E294V E294L E294L E294F E294F Q295A Q295A Q295W Q295W Q295P Q295P Q295G Q295G Y296E Y296E Y296Q Y296Q Y296D Y296D Y296N Y296N Y296S Y296S Y296T Y296T Y296L Y296L Y296I Y296I Y296A Y296A Y296V Y296V Y296M Y296M N297S N297S N297D N297D N297Q N297Q N297A N297A S298T S298T S298N S298N S298K S298K S298R S298R T299A T299A T299H T299H T299D T299D T299E T299E T299N T299N T299Q T299Q T299K T299K T299R T299R T299I T299I T299F T299F T299M T299M T299Y T299Y T299W T299W T299S T299S T299V T299V T299P T299P T299G T299G Y300E Y300E Y300K Y300K Y300R Y300R Y300S Y300S Y300P Y300P Y300W Y300W V303A V303A V303D V303D W313F W313F E318A E318A E318V E318V E318Q E318Q E318H E318H E318L E318L E318Y E318Y K320A K320A K322A K322A K322E K322E N325A N325A

- 40 043743- 40 043743

N325V N325V N325H N325H N325K N325K N325Y N325Y N325W N325W N325P N325P N325G N325G N325Q N325Q N325D N325D N325E N325E N325L N325L N325I N325I A327Q A327Q А327Е A327E A327N A327N A327L A327L A327I A327I A327F A327F A327W A327W L328N L328N L328F L328F L328H L328H L328R L328R L328T L328T L328V L328V L328I L328I L328P L328P L328M L328M L328E L328E L328A L328A Р329А P329A P329F P329F P329D P329D P329N P329N P329Q P329Q Р329К R329K P329S P329S Р329Т R329T Р329Н Р329Н P329V P329V P329L P329L Р329М R329M P329Y P329Y P329W P329W P329G P329G P329R P329R A330L A330L A330R A330R АЗЗОР AZZOR АЗЗОТ AZZOT A330V A330V A330F A330F АЗ ЗОН AZ ZON Р331А P331A P331S P331S P331N P331N Р331Е P331E I332K I332K I332N I332N I332Q I332Q I332T I332T I332H I332H I332Y I332Y I332A I332A I332R I332R E333N E333N E333R E333R I336E I336E I336Y I336Y S337H S337H

В некоторых вариантах реализации мутированная Fc-область IgG1 может содержать одну из комбинаций мутаций, перечисленных в табл. 5. Система нумерации константной области, используемая в данной таблице, соответствует EU-индексу, описанному в Kabat и др. (1991, публикация NIH 91-3242, Национальная служба технической информации, Спрингфилд, Вирджиния). В таблице первая буква и число представляет собой немодифицированную аминокислоту и ее положение и вторая буква представляет замещающую аминокислоту в указанном положении. Для каждой из комбинаций более чем одной мутации каждая мутация в указанной комбинации отделена символом / и делеции обозначены символом Δ.In some embodiments, the mutated IgG1 Fc region may contain one of the combinations of mutations listed in Table. 5. The constant region numbering system used in this table follows the EU index described in Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). In the table, the first letter and number represents the unmodified amino acid and its position and the second letter represents the substituting amino acid at the specified position. For each of the combinations of more than one mutation, each mutation in the specified combination is separated by the symbol / and deletions are indicated by the symbol Δ.

Таблица 5Table 5

C220S/C226S/C229S/P238S C220S/C226S/C229S/P238S C226S/C229S/E233P/L234V/ L235A C226S/C229S/E233P/L234V/ L235A E233P/L234V/L235A E233P/L234V/L235A E233P/L234V/L235A/AG236 E233P/L234V/L235A/AG236 E233P/L234V/L235A/AG236/ A327G/A330S/P331S E233P/L234V/L235A/AG236/ A327G/A330S/P331S L234A/L235A L234A/L235A L235A/G237A L235A/G237A L235A/G237A/E318S/K320S/ K322S L235A/G237A/E318S/K320S/ K322S L235A/G237A/P331A L235A/G237A/P331A L234F/L235E L234F/L235E L234F/L235E/D265A L234F/L235E/D265A L234F/L235E/D265A/ L234F/L235E/D265A/

- 41 043743- 41 043743

N297Q/P331S N297Q/P331S L234F/L235E/N297Q L234F/L235E/N297Q L234F/L235E/P329G L234F/L235E/P329G L234F/L235A/K322Q/ M252Y/S254T/T256E L234F/L235A/K322Q/ M252Y/S254T/T256E L234F/L235Q/K322Q/M252Y/ S254T/T256E L234F/L235Q/K322Q/M252Y/ S254T/T256E L234F/L235Q/P331G/M252Y/ S254T/T256E L234F/L235Q/P331G/M252Y/ S254T/T256E G236R/L328R G236R/L328R S239D/D265I/N297D/I332E S239D/D265I/N297D/I332E S23 9D/D265L/N297D43 32E S23 9D/D265L/N297D43 32E S239D/D265F/N297D/ I332E S239D/D265F/N297D/ I332E S239D/D265Y/N297D/I332E S239D/D265Y/N297D/I332E S23 9D/D265T/N297D43 32E S23 9D/D265T/N297D43 32E S239D/N297D/A330Y/ I332E S239D/N297D/A330Y/ I332E S23 9D/F241S/F243H/V262T/V26 4T/N297D/K326E/I332E S23 9D/F241S/F243H/V262T/V26 4T/N297D/K326E/I332E V264E/N297D/I332E V264E/N297D/I332E D265A/P331S D265A/P331S D265A/N297Q D265A/N297Q N297D/D265Y/T299L/I332E N297D/D265Y/T299L/I332E N297D/D265Y/I332E N297D/D265Y/I332E N297DJ332E/Y296D N297DJ332E/Y296D N297D4332E N297D4332E N297DJ332E/Y296E N297DJ332E/Y296E N297DJ332E/Y296N N297DJ332E/Y296N N297DJ332E/Y296Q N297DJ332E/Y296Q N297DJ332E/Y296H N297DJ332E/Y296H N297DJ332E/Y296T N297DJ332E/Y296T N297D/I332E/T299V N297D/I332E/T299V N297D/I332E/T299I N297D/I332E/T299I N297D4332E/T299L N297D4332E/T299L N297D/I332E/T299F N297D/I332E/T299F N297D/I332E/T299H N297D/I332E/T299H N297D/I332E/T299E N297D/I332E/T299E N297D/I332E/A330Y N297D/I332E/A330Y N297D/I332E/S298A/ A330Y N297D/I332E/S298A/ A330Y N297E/D265F4332E N297E/D265F4332E N297E/I332E N297E/I332E F241E/F243R/V262E/ V264R F241E/F243R/V262E/ V264R F241E/F243Q/V262T/V264E F241E/F243Q/V262T/V264E F241L/F243L/V262I/V264I F241L/F243L/V262I/V264I F241W/F243W F241W/F243W F241W/F243W/V262A/V264A F241W/F243W/V262A/V264A F241L/V262I F241L/V262I F243L/V262I/V264W F243L/V262I/V264W F241Y/F243Y/V262T/V264T F241Y/F243Y/V262T/V264T F241E/F243R/V262E/V264R F241E/F243R/V262E/V264R F241E/F243Q/V262T/V264E F241E/F243Q/V262T/V264E F241R/F243Q/V262T/V264R F241R/F243Q/V262T/V264R F241E/F243Y/V262T/V264R F241E/F243Y/V262T/V264R P244H/P245A/P247V P244H/P245A/P247V F241E/F243R/V262E/V264R/I332 E F241E/F243R/V262E/V264R/I332 E F241E/F243Y/V262T/V264R F241E/F243Y/V262T/V264R F241E/F243Y/V262T/ V264R/I332E F241E/F243Y/V262T/ V264R/I332E S239E/D265G S239E/D265G S239E/D265N S239E/D265N S239E/D265Q S239E/D265Q M252Y/S254T/T256E M252Y/S254T/T256E S267Q/A327S S267Q/A327S S267L/A327S S267L/A327S N297S/I332E N297S/I332E S239N/I332N S239N/I332N S239N4332Q S239N4332Q S239Q4332N S239Q4332N S239Q4332Q S239Q4332Q S298N/Y300S S298N/Y300S S298N/T299A/Y300S S298N/T299A/Y300S N297Q/S298N/Y300S N297Q/S298N/Y300S E318S/K320S/K322S E318S/K320S/K322S E318S/K320S/K322S/P31 IA E318S/K320S/K322S/P31IA L328E/I332E L328E/I332E L328N/I332E L328N/I332E L234A/L235A/G237A/P238A /H268A/A330S/P331S L234A/L235A/G237A/P238A /H268A/A330S/P331S L234A/L235A/G237A/P238S/H26 8A/A330S/P331S L234A/L235A/G237A/P238S/H26 8A/A330S/P331S L234A/L235A/G237A/P238A/H26 8A/A330S/P331S L234A/L235A/G237A/P238A/H26 8A/A330S/P331S L328Q/I332E L328Q/I332E L328H/I332E L328H/I332E

В некоторых вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению содержат Fc-область IgG2 дикого типа или мутированную Fc-область IgG2, и предпочтительно белок представляет собой IgG, содержащий две дикого типа или мутированные Fc-области IgG2 для образования димерной структуры Fc. Мутированная Fc-область IgG2 может содержать одну из мутаций или комбинаций мутаций, перечисленных в табл. 6. Система нумерации константной области, используемая в данной таблице, соответствует EU-индексу, описанному в Kabat и др. (1991, публикация NIH 91-3242, Национальная служба технической информации, Спрингфилд, Вирджиния). В таблице первая буква и число представляет собой немодифицированную аминокислоту и ее положение и вторая буква представляет замещающую аминокислоту в указанном положении. Для тех ячеек, которые содержат комбинации более чем одной мутации, каждая мутация в указанной комбинации отделена символом /.In some embodiments, the proteins of the present invention comprise a wild-type IgG2 Fc region or a mutated IgG2 Fc region, and preferably the protein is an IgG containing two wild-type or mutated IgG2 Fc regions to form a dimeric Fc structure. The mutated IgG2 Fc region may contain one of the mutations or combinations of mutations listed in Table. 6. The constant region numbering system used in this table follows the EU index described in Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). In the table, the first letter and number represents the unmodified amino acid and its position and the second letter represents the substituting amino acid at the specified position. For those cells that contain combinations of more than one mutation, each mutation in the specified combination is separated by a /.

- 42 043743- 42 043743

Таблица 6Table 6

V234A V234A G237A G237A A235E/G237A A235E/G237A V234A/A235E/G237A V234A/A235E/G237A V234A/G237A V234A/G237A V234A/G237A/P238S V234A/G237A/P238S H268Q/V309L/A330S/P331S H268Q/V309L/A330S/P331S V234A/G237A/H268A/V309L/ A330S/P331S V234A/G237A/H268A/V309L/ A330S/P331S V234A/G237A/H268Q/V309L /A330S/P331S V234A/G237A/H268Q/V309L/A330S/P331S V234A/G237A/P238S/H268A/V3 09L/A330S/P331S V234A/G237A/P238S/H268A/V3 09L/A330S/P331S P233S/V234A/G237A/P238S P233S/V234A/G237A/P238S P233SA^234A/G237A/H268A/ V309L/A330S/P331S P233SA^234A/G237A/H268A/ V309L/A330S/P331S P233S/V234A/G237A/H268Q/V3 09L/A330S/P331S P233S/V234A/G237A/H268Q/V3 09L/A330S/P331S P233S/V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S P233S/V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S

Получение антител с модифицированным гликозилированием.Production of antibodies with modified glycosylation.

В еще одном варианте реализации антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению содержат конкретный паттерн гликозилирования. Например, можно получить афукозилированное или агликозилированное антитело или фрагмент (т.е. в антителе отсутствует фукоза или гликозилирование, соответственно). Паттерн гликозилирования антитела или фрагмента можно изменить, чтобы, например, повысить аффинность или авидность антитела или фрагмента к антигену SIRPa. Такие модификации можно осуществить, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования внутри последовательности антитела или фрагмента. Например, можно осуществить одну или более замен аминокислот, которые приведут к удалению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельной области, чтобы тем самым предотвратить гликозилирование в данном сайте. Такое дегликозилирование может повысить аффинность или авидность антитела или фрагмента к антигену. См., например, патенты США № 5714350 и 6350861.In yet another embodiment, the antibodies or antigen binding fragments of the present invention contain a particular glycosylation pattern. For example, an antibody or fragment may be afucosylated or aglycosylated (ie, the antibody lacks fucose or glycosylation, respectively). The glycosylation pattern of the antibody or fragment can be changed to, for example, increase the affinity or avidity of the antibody or fragment for the SIRPa antigen. Such modifications can be made, for example, by changing one or more glycosylation sites within the antibody or fragment sequence. For example, one or more amino acid substitutions may be made that will remove one or more glycosylation sites of the variable region backbone, thereby preventing glycosylation at that site. Such deglycosylation may increase the affinity or avidity of the antibody or fragment for the antigen. See, for example, US Patent Nos. 5,714,350 and 6,350,861.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, могут дополнительно включать антитела, полученные в клетках-хозяевах из низших эукариот, в частности, клеткихозяева из грибов, таких как дрожжи и мицелиальные грибы, подвергали генетической инженерии, чтобы получить гликопротеины с паттернами гликозилирования, подобными таковым у млекопитающего или человека (см., например, Choi и др., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5022-5027; Hamilton и др., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton и др., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett и др., Yeast 28(3):237-52 (2011); Hamilton и др., Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-92 (2007)). Особым преимуществом данных генетически модифицированных клеток-хозяев над применяемыми в настоящее время линиями клеток млекопитающего является возможность контролировать профиль гликозилирования гликопротеинов, которые получены в указанных клетках, так что можно получить композиции гликопротеинов, в которых преобладает конкретная структура N-гликанов (см., например, патент США № 7029872 и патент США № 7449308). Данные генетически модифицированные клетки-хозяева применяли для получения антител, которые преимущественно содержат конкретные структуры N-гликанов (см., например, Li и др., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215).The antibodies and antigen-binding fragments described in this invention may further include antibodies obtained in host cells from lower eukaryotes, in particular, host cells from fungi, such as yeast and filamentous fungi, have been genetically engineered to produce glycoproteins with glycosylation patterns similar to that of a mammal or a human (see, for example, Choi et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5022-5027; Hamilton et al., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton and al., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett et al., Yeast 28(3):237-52 (2011); Hamilton et al., Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-92 (2007 )). A particular advantage of these genetically modified host cells over currently used mammalian cell lines is the ability to control the glycosylation profile of the glycoproteins that are produced in these cells, so that glycoprotein compositions can be obtained in which a particular N-glycan structure predominates (see, for example, US Patent No. 7029872 and US Patent No. 7449308). These genetically modified host cells have been used to produce antibodies that preferentially contain specific N-glycan structures (see, for example, Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215).

В конкретных вариантах реализации антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, дополнительно включают те, которые получены в клетках-хозяевах из низших эукариот и которые содержат фукозилированные и нефукозилированные гибридные и сложные N-гликаны, включая разделенные и многоантенные виды, включая, но не ограничиваясь такими N-гликанами, как GlcNAc(i.4)Man3GlcNAc2; Gal(i.4)GlcNAc(i-4)Man3GlcNAc2; NANA(i-4)Gal(i-4)GlcNAc(i.4)Man3GlcNAc2.In specific embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments thereof described herein further include those produced in lower eukaryotic host cells and which contain fucosylated and non-fucosylated hybrid and complex N-glycans, including split and multiantennary species, including but not limited to not limited to N-glycans such as GlcNAc(i. 4) Man3GlcNAc2; Gal(i.4)GlcNAc(i-4)Man 3 GlcNAc 2 ; NANA(i-4)Gal(i-4)GlcNAc(i.4)Man 3 GlcNAc2.

В конкретных вариантах реализации антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данном изобретении, могут включать антитела или фрагменты, содержащие по меньшей мере один гибридный N-гликан, выбранный из группы, состоящей из GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; и NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2.In specific embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments thereof provided herein may include antibodies or fragments comprising at least one hybrid N-glycan selected from the group consisting of GlcNAcMan 3 GlcNAc 2 ; GalGlcNAcMan5GlcNAc 2 ; and NANAGalGlcNAcMan 5 GlcNAc2.

В конкретных аспектах гибридный N-гликан является преобладающим видом N-гликана в композиции.In certain aspects, the hybrid N-glycan is the predominant N-glycan species in the composition.

В конкретных вариантах реализации антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данном изобретении, включают антитела и фрагменты, содержащие по меньшей мере один сложный Nгликан, выбранный из группы, состоящей изIn specific embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments thereof provided herein include antibodies and fragments comprising at least one complex N-glycan selected from the group consisting of

GlcNАсМапз GlcN Ас2; GalGlcN АсМащ GlcNАс 2;GlcNAcMapz GlcN Ac 2 ; GalGlcN AcMasch GlcNAc 2 ;

NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcN Ac2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;NANAGalGlcNAcMan 3 GlcNAc 2 ; GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc2; GalGlcN Ac 2 Man 3 GlcNAc 2 ; Gal 2 GlcNAc2Man 3 GlcNAc2;

NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; и NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2.NANAGal2GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc2; and NANA2Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 .

В конкретных аспектах сложный N-гликан является преобладающим видом N-гликана в составе. В дополнительных аспектах сложный N-гликан представляет собой конкретный вид N-гликана, который содержит в составе приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% сложных Nгликанов. В одном варианте реализации антитело и их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данном изобретении, включают сложные N-гликаны, в которых по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% сложных N-гликанов включают структуру NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, при этом данная структура афукозилирована. Такие структуры можно получить, например, в сконструированныхIn certain aspects, the complex N-glycan is the predominant N-glycan species in the composition. In additional aspects, a complex N-glycan is a specific type of N-glycan that contains about 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99, or 100% complex N-glycans. In one embodiment, the antibody and antigen binding fragments thereof provided herein include complex N-glycans that are at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99, or 100% complex N-glycans include the structure NANA 2 Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 , and this structure is afucosylated. Such structures can be obtained, for example, in designed

- 43 043743 клетках-хозяевах Pichia pastoris.- 43 043743 host cells of Pichia pastoris.

В конкретных вариантах реализации N-гликан фукозилирован. Как правило, фукоза находится в а1,3-связи с GlcNAc на восстанавливающем конце N-гликана, в а1,6-связи с GlcNAc на восстанавливающем конце N-гликана, в а1,2-связи с Gal на невосстанавливающем конце N-гликана, в а1,3-связи с GlcNac на невосстанавливающем конце N-гликана, или в α 1,4-связи с GlcNAc на невосстанавливающем конце N-гликана.In certain embodiments, the N-glycan is fucosylated. Typically, fucose is in an α1,3 bond with GlcNAc at the reducing end of the N-glycan, in an α1,6 bond with GlcNAc at the reducing end of the N-glycan, in a1,2 bond with Gal at the non-reducing end of the N-glycan, in an α1,3-linkage to GlcNac at the non-reducing end of the N-glycan, or in an α1,4-linkage to GlcNAc at the non-reducing end of the N-glycan.

Следовательно, в конкретных из описанных выше аспектов композиций гликопротеинов гликоформа находится в а1,3-связи или а1,6-связи с фукозой для получения гликоформы, выбранной из группы, состоящей изTherefore, in particular aspects of the glycoprotein compositions described above, the glycoform is in an a1,3-linkage or an a1,6-linkage with fucose to produce a glycoform selected from the group consisting of

Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc),Man 3 GlcNAc 2 (Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc 2 (Fuc), Man 3 GlcNAc 2 (Fuc),

GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc),GlcNAcMan 3 GlcNAc 2 (Fuc), GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 (Fuc), GalGlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 (Fuc),

Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), иGal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 (Fuc), NANAGal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 (Fuc), and

NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc);NANA 2 Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 (Fuc);

в а1,3-связи или а1,4-связи с фукозой для получения гликоформы, выбранной из группы, состоящей изin an a1,3-bond or a1,4-bond with fucose to obtain a glycoform selected from the group consisting of

GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuci.GlcNAc(Fuc)Man 5 GlcNAc 2 , GlcNAc(Fuc)Man 3 GlcNAc 2 , GlcNAc 2 (Fuci.

2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc 1 -2)Man3 GlcNAc2, 2 )Man 3 GlcNAc 2 , GalGlcNAc 2 (Fuci- 2 )Man 3 GlcNAc 2 , Gal 2 GlcNAc 2 (Fuc 1 -2)Man3 GlcNAc2,

NANAGal2GlcNAc2(Fuci.2)Man3GlcNAc2, и NANA2Gal2GlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2;NANAGal2GlcNAc2(Fuci. 2 )Man 3 GlcNAc 2 , and NANA 2 Gal 2 GlcNAc 2 (Fuci- 2 )Man 3 GlcNAc 2 ;

или в α 1,2-связи с фукозой для получения гликоформы, выбранной из группы, состоящей изor in α 1,2-linkage with fucose to obtain a glycoform selected from the group consisting of

Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2,Gal(Fuc)GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 ,

Gal2(Fuci.2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuci.2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, и NANA2Gal2(Fuci2)GlcNAc2Man3GlcNAc2.Gal 2 (Fuci. 2 )GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 , NANAGal 2 (Fuci. 2 )GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 , and NANA 2 Gal 2 (Fuci 2 )GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 .

В дополнительных аспектах антитела (например, гуманизированные антитела) или их антигенсвязывающие фрагменты содержат N-гликаны с высоким содержанием маннозы, включая, но не ограничиваясь перечисленными: MansGlcNAcz, MaipGlcNAcz, MangGlcNAci, ManjGlcNAca, MaruGlcNAcz, или Nгликаны, которые состоят из структуры N-гликана Man3GlcNAc2.In additional aspects, antibodies (e.g., humanized antibodies) or antigen-binding fragments thereof comprise high-mannose N-glycans, including but not limited to: MansGlcNAcz, MaipGlcNAcz, MangGlcNAci, ManjGlcNAca, MaruGlcNAcz, or N-glycans that are composed of an N-glycan structure Man 3 GlcNAc2.

В дополнительных к описанным выше аспектам сложные N-гликаны дополнительно включают фукозилированные и нефукозилированные разделенные и многоантенные виды.In addition to the aspects described above, complex N-glycans further include fucosylated and non-fucosylated split and multiantennary species.

В данном изобретении термины N-гликан и гликоформа используют взаимозаменяемо, и они относятся к N-связанному олигосахариду, например, такому, который присоединен с помощью аспарагин-N-ацетилглюкозаминовой связи к остатку аспарагина полипептида. N-связанные гликопротеины содержат остаток N-ацетилглюкозамина, связанный с азотом амида остатка аспарагина в белке. Преобладающие сахара, обнаруженные на гликопротеинах, представляют собой глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, N-ацетилгалактозамин (GalNAc), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA)). Процессинг сахарных групп происходит котрансляционно в просвете эндоплазматического ретикулума (ЭР) и продолжается посттрансляционно в аппарате Г ольджи для N-связанных гликопротеинов.In this invention, the terms N-glycan and glycoform are used interchangeably and refer to an N-linked oligosaccharide, for example one that is attached via an asparagine-N-acetylglucosamine linkage to an asparagine residue of a polypeptide. N-linked glycoproteins contain an N-acetylglucosamine residue linked to the amide nitrogen of an asparagine residue in the protein. The predominant sugars found on glycoproteins are glucose, galactose, mannose, fucose, N-acetylgalactosamine (GalNAc), N-acetylglucosamine (GlcNAc), and sialic acid (eg, N-acetylneuraminic acid (NANA)). Processing of sugar groups occurs cotranslationally in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) and continues posttranslationally in the Golgi apparatus for N-linked glycoproteins.

N-гликаны содержат общую пентасахаридную сердцевину Man3GlcNAc2 (Man относится к маннозе; Glc относится к глюкозе и NAc относится к N-ацетилу; GlcNAc относится к Nацетилглюкозамину). Обычно, в структурах N-гликанов невосстанавливающий конец находится слева и восстанавливающий конец находится справа. Восстанавливающий конец N-гликана представляет собой конец, который присоединен к остатку Asn, содержащему сайт гликозилирования на белке. N-гликаны отличаются по количеству ветвей (антенн), содержащих периферические сахара (например, GlcNAc, галактозу, фукозу и сиаловую кислоту), которые добавлены в сердцевинную структуру Man3GlcNAc2 (Man3), которую также называют триманнозной сердцевиной, пентасахаридной сердцевиной или пауциманнозной сердцевиной. N-гликаны классифицируют в соответствии с их разветвленными составляющими (например, высокоманнозные, сложные или гибридные). Высокоманнозный тип Nгликана содержит пять или более остатков маннозы. Сложный тип N-гликана обычно содержит по меньшей мере один GlcNAc, присоединенный к 1,3-маннозному плечу, и по меньшей мере один GlcNAc, присоединенный к 1,6-маннозному плечу триманнозной сердцевины. Сложные N-гликаны также могут содержать остатки галактозы (Gal) или N-ацетилгалактозамина (GalNAc), которые необязательно модифицированы сиаловой кислотой или ее производными (например, NANA или NeuAc, где Neu относится к нейраминовой кислоте и Ас относится к ацетилу). Сложные N-гликаны также могут содержать внутрицепочечные замены, включающие разделяющий GlcNAc и сердцевинную фукозу (Fuc). Сложные N-гликаны также могут содержать множество антенн на триманнозной сердцевине, их часто называют многоантенными гликанами. Гибридный N-гликан содержит по меньшей мере один GlcNAc на конце 1,3-маннозного плеча триманнозной сердцевины и ноль или более манноз на 1,6маннозном плече триманнозной сердцевины. Различные N-гликаны также называют гликоформами.N-glycans contain a common pentasaccharide core Man 3 GlcNAc2 (Man refers to mannose; Glc refers to glucose and NAc refers to N-acetyl; GlcNAc refers to N-acetylglucosamine). Typically, in N-glycan structures, the non-reducing end is on the left and the reducing end is on the right. The reducing end of an N-glycan is the end that is attached to an Asn residue containing a glycosylation site on the protein. N-glycans differ in the number of branches (antennas) containing peripheral sugars (e.g., GlcNAc, galactose, fucose, and sialic acid) that are added to the Man 3 GlcNAc2 (Man3) core structure, which is also called the trimannose core, pentasaccharide core, or paucimannose core . N-glycans are classified according to their branched constituents (eg, high-mannose, complex, or hybrid). The high mannose type of Nglycan contains five or more mannose residues. The complex type of N-glycan typically contains at least one GlcNAc attached to the 1,3-mannose arm and at least one GlcNAc attached to the 1,6-mannose arm of the trimannose core. Complex N-glycans may also contain galactose (Gal) or N-acetylgalactosamine (GalNAc) residues, which are optionally modified with sialic acid or its derivatives (for example, NANA or NeuAc, where Neu refers to neuraminic acid and Ac refers to acetyl). Complex N-glycans may also contain intrachain substitutions involving the spacer GlcNAc and core fucose (Fuc). Complex N-glycans can also contain multiple antennae on the trimannose core and are often called multiantennary glycans. The hybrid N-glycan contains at least one GlcNAc at the end of the 1,3-mannose arm of the trimannose core and zero or more mannoses at the 1,6-mannose arm of the trimannose core. The various N-glycans are also called glycoforms.

- 44 043743- 44 043743

По отношению к сложным N-гликанам термины G-2, G-1, G0, G1, G2, А1 и А2 означают следующее. G-2 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризовать какIn relation to complex N-glycans, the terms G-2, G-1, G0, G1, G2, A1 and A2 mean the following. G-2 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as

Man3GlcNAc2, термин G-1 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризовать как GlcNAcMangGlcNAi^, термин G0 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризовать как Glc4Ac2Man3GlcNAc2, термин G1 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризо вать как GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, термин G2 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризовать как Ga^G^NA^Ma^GleNAc^, термин А1 относится к структуре N-гликана, которую можно охарактеризовать как NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, и термин А2 относится к структуре N-гликана,Man3GlcNAc 2 , the term G-1 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as GlcNAcMangGlcNAi^, the term G0 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as Gl c 4Ac 2 Man3GlcNAc 2 , the term G1 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as G a lGlcNAc2Man3GlcNAc 2 , the term G2 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as Ga^G^NA^Ma^GleNAc^, the term A1 refers to the N-glycan structure, which can be characterized as NANAGal 2 GlcNAc 2 Man3GlcNAc 2 and the term A2 refers to the N-glycan structure,

NANAoGaGGlcNAcoMa^GlcNAco которую можно охарактеризовать как z z лэ zNANAoGaGGlcNAcoMa^GlcNAco which can be characterized as z z le z

Если не указано иначе, то термины G-2, G-1, G0, G1, G2, А1 и А2 относятся к видам Nгликана, в которых отсутствует фукоза, присоединенная к остатку GlcNAc на восстанавливающем конце N-гликана. Когда термин содержит F, F указывает на то, что данный вид N-гликана содержит остаток фукозы на остатке GlcNAc на восстанавливающем конце N-гликана. Например, все обозначения G0F, G1F, G2F, A1F и A2F указывают на то, что N-гликан дополнительно содержит остаток фукозы, присоединенный к остатку GlcNAc на восстанавливающем конце N-гликана. Низшие эукариоты, такие как дрожжи и мицелиальные грибы, обычно не продуцируют N-гликаны, которые продуцируют фукозу.Unless otherwise noted, the terms G-2, G-1, G0, G1, G2, A1 and A2 refer to N-glycan species that lack fucose attached to a GlcNAc residue at the reducing end of the N-glycan. When the term contains F, F indicates that the N-glycan species contains a fucose residue on a GlcNAc residue at the reducing end of the N-glycan. For example, the designations G0F, G1F, G2F, A1F and A2F all indicate that the N-glycan further contains a fucose residue attached to a GlcNAc residue at the reducing end of the N-glycan. Lower eukaryotes such as yeast and filamentous fungi do not typically produce the N-glycans that produce fucose.

В отношении многоантенных N-гликанов, термин многоантенный N-гликан относится к Nгликанам, которые дополнительно содержат остаток GlcNAc на остатке маннозы, составляющем невосстанавливающий конец 1,6 плеча или 1,3 плеча N-гликана, или остаток GlcNAc на каждом из остатков маннозы, составляющих невосстанавливающий конец 1,6 плеча и 1,3 плеча N-гликана. Таким образом, многоантенные N-гликаны можно охарактеризовать формуламиWith respect to multi-antennary N-glycans, the term multi-antennary N-glycan refers to N-glycans that additionally contain a GlcNAc residue on a mannose residue constituting the non-reducing end of the 1,6 arm or 1,3 arm of the N-glycan, or a GlcNAc residue on each of the mannose residues, constituting the non-reducing end of the 1,6 arms and 1,3 arms of the N-glycan. Thus, multiantennary N-glycans can be characterized by the formulas

GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal^. 4)GlcNAc(2_4)Man3GlcNAc2 или NANA^^Gal^^GIcNAc^^jMai^GIcNAc^.GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal^. 4)GlcNAc( 2 _4)Man3GlcNAc 2 or NANA^^Gal^^GIcNAc^^jMai^GIcNAc^.

Термин 1-4 относится к 1, 2, 3 или 4 остаткам.The term 1-4 refers to 1, 2, 3 or 4 residues.

В отношении разделенных N-гликанов, термин разделенный N-гликан относится к N-гликанам, в которых остаток GlcNAc связан с остатком маннозы на восстанавливающем конце N-гликана. Разделенный N-гликан можно охарактеризовать формулой ГГУАсзМапзС1сУАс2. в которой каждый остаток маннозы связан на своем невосстанавливающем конце с остатком GlcNAc. Напротив, если многоантенный N-гликан обозначается GlcNAc3Man3GlcNAc2, то данная формула указывает на то, что два остатка GlcNAc связаны с остатком маннозы на невосстанавливающем конце одного из двух плеч N-гликанов и один остаток GlcNAc связан с остатком маннозы на невосстанавливающем конце другого плеча Nгликана.With respect to split N-glycans, the term split N-glycan refers to N-glycans in which a GlcNAc residue is linked to a mannose residue at the reducing end of the N-glycan. The separated N-glycan can be characterized by the formula GGUAc3Map3C1cUAAc2 . in which each mannose residue is linked at its non-reducing end to a GlcNAc residue. In contrast, if a multiantennary N-glycan is designated Gl c NAc3Man3GlcNAc 2 , then this formula indicates that two GlcNAc residues are linked to a mannose residue at the non-reducing end of one of the two N-glycan arms and one GlcNAc residue is linked to a mannose residue at the non-reducing end of the other Nglycan arm.

В некоторых вариантах реализации белки согласно настоящему изобретению содержат агликозилированную Fc-область. В качестве примера, Fc-область IgG1 можно агликозилировать путем делеции или замены остатка N297.In some embodiments, the proteins of the present invention comprise an aglycosylated Fc region. As an example, the Fc region of IgG1 can be aglycosylated by deletion or substitution of the N297 residue.

Физические свойства антител.Physical properties of antibodies.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, могут дополнительно содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области либо легкой, либо тяжелой цепи иммуноглобулина. Такие сайты гликозилирования могут приводить к повышенной иммуногенности антитела или фрагмента или к изменению рК антитела вследствие измененного связывания с антигеном (Marshall и др. (1972) Аппи Rev Biochem 41:673-702; Gala и Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick и др. (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh и др. (1985) Nature 316:452-7; Mimura и др. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотиве, содержащем последовательность N-X-S/T.The antibodies and antigen-binding fragments thereof described in this invention may further contain one or more glycosylation sites in the variable region of either the light or heavy chain of an immunoglobulin. Such glycosylation sites may result in increased immunogenicity of the antibody or fragment or a change in the pK of the antibody due to altered binding to antigen (Marshall et al. (1972) Appy Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489- 94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al (2000) Mol Immunol 37:697–706). Glycosylation is known to occur in a motif containing the sequence N-X-S/T.

У каждого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента будет уникальная изоэлектрическая точка (pI), которая, как правило, попадает в диапазон рН между 6 и 9,5. pI для антитела IgG1 обычно попадает в диапазон рН 7 - 9,5 и pI для антитела IgG4 обычно попадает в диапазон рН 6-8.Each antibody or antigen-binding fragment will have a unique isoelectric point (pI), which typically falls in the pH range between 6 and 9.5. The pI for an IgG1 antibody typically falls in the pH range of 7-9.5 and the pI for an IgG4 antibody typically falls in the pH range of 6-8.

Каждому антителу или антигенсвязывающему фрагменту свойственна температура плавления, при этом более высокая температура плавления свидетельствует о большей общей стабильности in vivo (Krishnamurthy R и Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Обычно, TM1 (температура начала разворачивания) может быть большей чем 60°С, большей чем 65°С или большей чем 70°С. Точку плавления антитела или фрагмента можно измерить, применяя дифференциальную сканирующую калориметрию (Chen и др. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando и др. (1999) Immunol Lett 68:47-52) или круговой дихроизм (Murray и др. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).Each antibody or antigen binding fragment has an inherent melting point, with a higher melting point indicating greater overall stability in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Typically, T M1 (unfolding start temperature) may be greater than 60°C, greater than 65°C, or greater than 70°C. The melting point of an antibody or fragment can be measured using differential scanning calorimetry (Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52) or circular dichroism (Murray et al. (2002) J Chromatogr Sci 40:343-9).

В дополнительном варианте реализации выбирают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые быстро не деградируют. Деградацию антитела или фрагмента можно измерить, применяя капиллярный электрофорез (КЭ) и МАЛДИ-МС (Alexander AJ и Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).In a further embodiment, antibodies and antigen-binding fragments thereof are selected that are not rapidly degraded. Degradation of an antibody or fragment can be measured using capillary electrophoresis (CE) and MALDI-MS (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

В дополнительном варианте реализации выбирают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают минимальной склонностью к агрегации, которая может приводить к запуску нежела- 45 043743 тельного иммунного ответа и/или измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам.In a further embodiment, antibodies and antigen-binding fragments thereof are selected that have a minimal tendency to aggregate, which could result in triggering an undesirable immune response and/or altered or adverse pharmacokinetic properties.

Как правило, приемлемыми являются антитела и фрагменты с агрегацией 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее или 5% или менее. Агрегацию можно измерить с помощью нескольких методик, включая эксклюзионную хроматографию (ЭХГ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и рассеяние света.In general, antibodies and fragments with an aggregation of 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less are acceptable. Aggregation can be measured using several techniques, including size exclusion chromatography (SEC), high performance liquid chromatography (HPLC), and light scattering.

Конъюгаты антител.Antibody conjugates.

Антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также можно конъюгировать с химической молекулой. Химическая молекула может представлять собой, среди прочего, полимер, меченый радиоактивной меткой нуклеотид или цитотоксический фактор. В конкретных вариантах реализации химическая молекула представляет собой полимер, который увеличивает время полувыведения антитела или фрагмента в организме субъекта. Подходящие полимеры включают, но не ограничены гидрофильными полимерами, которые включают, но не ограничены полиэтиленгликолем (ПЭГ) (например, ПЭГ с молекулярной массой 2, 5, 10, 12, 20, 30 или 40 кДа), декстраном и монометоксиполиэтиленгликолем (мПЭГ). Lee и др. (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) описывает конъюгированные с ПЭГ одноцепочечные антитела. Wen и др. (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) описывают конъюгирование антител с ПЭГ, который присоединен к хелатору радиометаллов (диэтилентриаминпентауксусной кислоте (ДТПА)).Antibodies against SIRPa and their antigen binding fragments described in this invention can also be conjugated to a chemical molecule. The chemical molecule may be, among other things, a polymer, a radiolabeled nucleotide, or a cytotoxic factor. In specific embodiments, the chemical molecule is a polymer that increases the half-life of the antibody or fragment in the body of a subject. Suitable polymers include, but are not limited to, hydrophilic polymers, which include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG) (e.g., 2, 5, 10, 12, 20, 30, or 40 kDa PEG), dextran, and monomethoxy polyethylene glycol (mPEG). Lee et al. (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) describes PEG-conjugated single chain antibodies. Wen et al. (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) describe the conjugation of antibodies to PEG, which is attached to a radiometal chelator (diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)).

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также могут быть конъюгированы с метками, такими как 99Tc, 90Y, n1In, 32Р, 14С, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, и 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr и 56Fe.Antibodies and their antigen binding fragments described in this invention can also be conjugated to labels such as 99 Tc, 90 Y, n1 In, 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 11 C, 15 O, 13 N, 18 F, 35 S, 51 Cr, 57 To, 226 Ra, 60 Co, 59 Fe, 57 Se , 152 Eu, 67 Cu, 217 Ci, 211 At, 212 Pb, 47 Sc, 109 Pd, 234 Th, and 40 K, 157 Gd, 55 Mn, 52 Tr and 56 Fe.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также могут быть пегилированы, например, чтобы повысить их биологическое время полувыведения (например, в сыворотке). Для того чтобы пегилировать антитело или фрагмент, указанное антитело или фрагмент обычно приводят в реакцию с реакционноспособной формой полиэтиленгликоля (ПЭГ), такой как реакционноспособный эфир или альдегидное производное ПЭГ, при условиях, в которых одна или более групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. В конкретных вариантах реализации пегилирование осуществляют посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В данном изобретении предполагают, что в объем термина полиэтиленгликоль входят любые формы ПЭГ, которые применяли для дериватизации других белков, такие как моно-(С1-С10)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В некоторых вариантах реализации антитело или фрагмент, который нужно пегилировать, представляет собой агликозилированное антитело или фрагмент. Способы пегилирования белков известны в данной области, и их можно применять для антител согласно настоящему изобретению. См., например, EO 0154316 и EP 0401384.Antibodies and antigen binding fragments described in this invention can also be pegylated, for example, to increase their biological half-life (eg, in serum). In order to PEGylate an antibody or fragment, the antibody or fragment is typically reacted with a reactive form of polyethylene glycol (PEG), such as a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more PEG groups are attached to the antibody or antibody fragment. In specific embodiments, the PEGylation is accomplished through an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive PEG molecule (or a similar reactive water-soluble polymer). As used herein, the term polyethylene glycol is intended to include any form of PEG that has been used to derivatize other proteins, such as mono-(C1-C 10 )-alkoxy or aryloxy polyethylene glycol or polyethylene glycol maleimide. In some embodiments, the antibody or fragment to be pegylated is an aglycosylated antibody or fragment. Methods for PEGylation of proteins are known in the art and can be used for the antibodies of the present invention. See for example EO 0154316 and EP 0401384.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также могут быть конъюгированы с флуоресцентными или хемилюминесцентными метками, включая флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов, флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, изотиоцианат, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, орто-фталевый альдегид, флуорескамин, 152Eu, дансил, умбеллиферон, люциферин, люминоловую метку, изолюминоловую метку, метку ароматического эфира акридиния, имидазоловую метку, метку соли акридиния, метку оксалатного сложного эфира, эквориновую метку, 2,3-дигидрофталазиндионы, биотин/авидин, спиновые метки и стабильные свободные радикалы.The antibodies and antigen-binding moieties described in this invention can also be conjugated to fluorescent or chemiluminescent labels, including fluorophores such as rare earth metal chelates, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, isothiocyanate, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, ortho-phthalic альдегид, флуорескамин, 152 Eu, дансил, умбеллиферон, люциферин, люминоловую метку, изолюминоловую метку, метку ароматического эфира акридиния, имидазоловую метку, метку соли акридиния, метку оксалатного сложного эфира, эквориновую метку, 2,3-дигидрофталазиндионы, биотин/авидин, спиновые labels and stable free radicals.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с цитотоксическим фактором, таким как дифтерийный токсин, А-цепь экзотоксина Pseudomonas aeruginosa, А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки и соединения из Aleuritesfordii (например, жирные кислоты), диантиновые белки, белки PAPI, PAPII и PAP-S из Phytoiacca americana, ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Saponaria officinalis, митогеллин, рестицин, феномицин и еномицин.The antibodies and antigen binding fragments thereof of the present invention may also be conjugated to a cytotoxic factor such as diphtheria toxin, Pseudomonas aeruginosa exotoxin A chain, ricin A chain, abrin A chain, modecin A chain, alpha-sarcin, proteins and compounds from Aleuritesfordii (eg fatty acids), dianthin proteins, PAPI, PAPII and PAP-S proteins from Phytoiacca americana, inhibitor from Momordica charantia, curcin, crotin, inhibitor from Saponaria officinalis, mitogellin, resticin, phenomycin and enomycin.

Можно применять любой способ, известный в данной области, для конъюгирования антител и их антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению с различными молекулами, включая способы, описанные у Hunter и др., (1962) Nature 144:945; David и др., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain и др., (1981) J. Immonol. Meth. 40:219; и Nygren, I, (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Способы конъюгирования антител и их фрагментов стандартны и очень хорошо известны в данной области.Any method known in the art can be used to conjugate the antibodies and antigen binding fragments thereof of the present invention to various molecules, including those described in Hunter et al., (1962) Nature 144:945; David et al. (1974) Biochemistry 13:1014; Pain et al., (1981) J. Immonol. Meth. 40:219; and Nygren, I, (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Methods for conjugating antibodies and fragments thereof are standard and very well known in the art.

Терапевтические применения антител против SIRPa.Therapeutic applications of anti-SIRPa antibodies.

Дополнительно предложены способы лечения субъектов, включая субъекта, представляющего собой человека, нуждающихся в лечении, с помощью выделенных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном изобретении. В одном варианте реализации настоящего изобретения такой субъект страдает от инфекции или инфекционного заболевания.Additionally provided are methods of treating subjects, including human subjects, in need of treatment with isolated antibodies or antigen binding fragments thereof described herein. In one embodiment of the present invention, such a subject is suffering from an infection or infectious disease.

В другом варианте реализации настоящего изобретения такой субъект страдает от рака. В одном варианте реализации рак представляет собой, например, остеосаркому, рабдомиосаркому, нейробластому, рак почки, лейкоз, переходно-клеточный рак почки, рак мочевого пузыря, рак Вильмса, рак яични- 46 043743 ков, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак кости, рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого), рак желудка, колоректальный рак, рак шейки матки, синовиальную саркому, рак головы и шеи, плоскоклеточную карциному, множественную миелому, почечно-клеточный рак, ретинобластому, гепатобластому, печеночно-клеточную карциному, меланому, рабдоидную опухоль почки, саркому Юинга, хондросаркому, рак головного мозга, глиобластому, менингиому, аденому гипофиза, вестибулярную шванному, примитивную нейроэктодермальную опухоль, медуллобластому, астроцитому, анапластическую астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, папиллому хориоидного сплетения, истинную полицитемию, тромбоцитемию, идиопатический миелофиброз, саркому мягких тканей, рак щитовидной железы, рак эндометрия, карциноидный рак или рак печени, рак молочной железы или рак желудка. В одном варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой метастатический рак, например, из описанных выше видов.In another embodiment of the present invention, such a subject suffers from cancer. In one embodiment, the cancer is, for example, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, neuroblastoma, renal cancer, leukemia, transitional cell renal cancer, bladder cancer, Wilms cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, cancer prostate, bone cancer, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer), stomach cancer, colorectal cancer, cervical cancer, synovial sarcoma, head and neck cancer, squamous cell carcinoma, multiple myeloma, renal cell cancer, retinoblastoma, hepatoblastoma, liver -cell carcinoma, melanoma, rhabdoid tumor of the kidney, Ewing's sarcoma, chondrosarcoma, brain cancer, glioblastoma, meningioma, pituitary adenoma, vestibular schwannoma, primitive neuroectodermal tumor, medulloblastoma, astrocytoma, anaplastic astrocytoma, oligodendroglioma, ependymoma, choroid papilloma weaving, polycythemia vera , thrombocythemia, idiopathic myelofibrosis, soft tissue sarcoma, thyroid cancer, endometrial cancer, carcinoid or liver cancer, breast cancer or stomach cancer. In one embodiment of the present invention, the cancer is a metastatic cancer, for example, from the types described above.

Раки, от которых можно лечить антителами или антигенсвязывающими фрагментами, композициями и способами согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены перечисленными видами рака: сердце: саркома (ангиосаркома, фибросаркома, рабдомиосаркома, липосаркома), миксома, рабдомиома, фиброма, липома и тератома; легкое: бронхогенная карцинома (плоскоклеточная, недифференцированная мелкоклеточная, недифференцированная крупноклеточная, аденокарцинома), альвеолярная (бронхиолярная) карцинома, бронхиальная аденома, саркома, лимфома, хондроматозная гамартома, мезотелиома; желудочно-кишечный тракт: пищевод (плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, лейомиосаркома, лимфома), желудок (карцинома, лимфома, лейомиосаркома), поджелудочная железа (протоковая аденокарцинома, инсулинома, глюкагонома, гастринома, карциноидные опухоли, випома), тонкий кишечник (аденокарцинома, лимфома, карциноидные опухоли, саркома Капоши, лейомиома, гемангиома, липома, нейрофиброма, фиброма), толстый кишечник (аденокарцинома, тубулярная аденома, ворсинчатая аденома, гамартома, лейомиома), колоректальный рак; урогенитальный тракт: почка (аденокарцинома, опухоль Вильмса (нефробластома), лимфома, лейкоз), мочевой пузырь и уретра (плоскоклеточная карцинома, переходно-клеточная карцинома, аденокарцинома), предстательная железа (аденокарцинома, саркома), яичко (семинома, тератома, эмбриональная карцинома, тератокарцинома, хориокарцинома, саркома, карцинома из интерстициальных клеток, фиброма, фиброаденома, аденоматоидные опухоли, липома); печень: гепатома (печеночно-клеточная карцинома), холангиокарцинома, гепатобластома, ангиосаркома, печеночно-клеточная аденома, гемангиома; кость: остеогенная саркома (остеосаркома), фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная лимфома (ретикулоклеточная саркома), множественная миелома, злокачественная гигантоклеточная опухоль хордома, остеохронфрома (костно-хрящевые экзостозы), доброкачественная хондрома, хондробластома, хондромиксофиброма, остеоид-остеома и гигантоклеточные опухоли; нервная система: череп (остеома, гемангиома, гранулема, ксантома, деформирующий остит), оболочки головного мозга (менингиома, менингиосаркома, глиоматоз), головной мозг (астроцитома, медуллобластома, глиома, эпендимома, герминома (пинеалома), многоформная глиобластома, олигодендроглиома, шваннома, ретинобластома, врожденные опухоли), нейрофиброма спинного мозга, менингиома, глиома, саркома); гинекологические: матка (карцинома эндометрия), шейка матки (карцинома шейки матки, предопухолевая дисплазия шейки матки), яичники (карцинома яичника (серозная цистаденокарцинома, мукоидная цистаденокарцинома, недифференцированная карцинома), гранулезотекаклеточная опухоль, опухоли из клеток Сертоли-Лейдига, дисгерминома, злокачественная тератома), вульва (плоскоклеточная карцинома, внутриэпителиальная карцинома, аденокарцинома, фибросаркома, меланома), влагалище (светлоклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, ботриоидная саркома (эмбриональная рабдомиосаркома), фаллопиевы трубы (карцинома), молочная железа; гематологические: кровь (миелоидный лейкоз (острый и хронический), острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественная миелома, миелодиспластический синдром), болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома (злокачественная лимфома); кожа: злокачественная меланома, базально-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, саркома Капоши, родимые пятна, диспластические невусы, липома, ангиома, дерматофиброма, келоиды, псориаз; и надпочечные железы: нейробластома. Таким образом, термин раковая клетка в данном изобретении включает клетку, пораженную любым из указанных выше состояний.Cancers that can be treated with antibodies or antigen-binding fragments, compositions and methods of the present invention include, but are not limited to: heart: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, liposarcoma), myxoma, rhabdomyoma, fibroma, lipoma and teratoma; lung: bronchogenic carcinoma (squamous cell, undifferentiated small cell, undifferentiated large cell, adenocarcinoma), alveolar (bronchiolar) carcinoma, bronchial adenoma, sarcoma, lymphoma, chondromatous hamartoma, mesothelioma; gastrointestinal tract: esophagus (squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, leiomyosarcoma, lymphoma), stomach (carcinoma, lymphoma, leiomyosarcoma), pancreas (ductal adenocarcinoma, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, carcinoid tumors, VIPoma), small intestine (adenocarcinoma, lymphoma , carcinoid tumors, Kaposi's sarcoma, leiomyoma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), large intestine (adenocarcinoma, tubular adenoma, villous adenoma, hamartoma, leiomyoma), colorectal cancer; urogenital tract: kidney (adenocarcinoma, Wilms tumor (nephroblastoma), lymphoma, leukemia), bladder and urethra (squamous cell carcinoma, transitional cell carcinoma, adenocarcinoma), prostate gland (adenocarcinoma, sarcoma), testicle (seminoma, teratoma, embryonal carcinoma , teratocarcinoma, choriocarcinoma, sarcoma, interstitial cell carcinoma, fibroma, fibroadenoma, adenomatoid tumors, lipoma); liver: hepatoma (hepatocellular carcinoma), cholangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, hepatocellular adenoma, hemangioma; bone: osteosarcoma (osteosarcoma), fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, malignant lymphoma (reticulocellular sarcoma), multiple myeloma, malignant giant cell tumor chordoma, osteochronphroma (osteocartilaginous exostoses), benign chondroma, chondrobe lastoma, chondromyxofibroma, osteoid -osteoma and giant cell tumors; nervous system: skull (osteoma, hemangioma, granuloma, xanthoma, osteitis deformans), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), brain (astrocytoma, medulloblastoma, glioma, ependymoma, germinoma (pinealoma), glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma , retinoblastoma, congenital tumors), neurofibroma of the spinal cord, meningioma, glioma, sarcoma); Gynecological: uterus (endometrial carcinoma), cervix (cervical carcinoma, preventing cervix dysplasia), ovaries (ovarian carcinoma (serous cystadenocarcynoma, mucoid cystadenocyesomic, nonsense carcinoma), granuleolo -cell tumor, tumors made of cells of Crains of Crains. Lyadiga, dyserminom, malignant teratoma ), vulva (squamous cell carcinoma, intraepithelial carcinoma, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (clear cell carcinoma, squamous cell carcinoma, botryoid sarcoma (embryonic rhabdomyosarcoma), fallopian tube (carcinoma), breast; hematological: blood (myeloid leukemia (acute and chronic), acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, myeloproliferative diseases, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome), Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma (malignant lymphoma); skin: malignant melanoma, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, Kaposi's sarcoma, birthmarks, dysplastic nevi, lipoma, angioma, dermatofibroma, keloids, psoriasis; and adrenal glands: neuroblastoma. Thus, the term cancer cell in this invention includes a cell affected by any of the above conditions.

В одном варианте реализации раки, от которых можно лечить антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, описанными в данном изобретении, композициями и способами согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными: рак молочной железы, рак желудка, пищевода рак, карциному гастроэзофагеального соединения, колоректальный рак, рак головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, нейробластому, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичников, рак легких, плоскоклеточную карциному, меланому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких, рак почки, почечноклеточную карциному, рак щитовидной железы, многоформную глиобластому, рак фаллопиевых труб, перитонеальный рак, ангиосаркому, печеночно-клеточную карциному, хориокарциному, саркому мягких тканей, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому, Вклеточную неходжкинскую лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лим- 47 043743 фому, лимфому из клеток мантийной зоны, миелодиспластический синдром, острый миелоцитарный лейкоз, Т-клеточную лимфому, лимфому из клеток-естественных киллеров, внеузловую лимфому из клеток маргинальной зоны, острый лимфоцитарный лейкоз, множественную миелому.In one embodiment, cancers that can be treated with the antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention, the compositions and methods of the present invention include, but are not limited to: breast cancer, gastric cancer, esophageal cancer, gastroesophageal junction carcinoma, colorectal cancer , head and neck cancer, non-small cell lung cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, bladder cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, lung cancer, squamous cell carcinoma, melanoma, pancreatic cancer, prostate cancer, small cell lung cancer, kidney cancer , renal cell carcinoma, thyroid cancer, glioblastoma multiforme, fallopian tube cancer, peritoneal cancer, angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, choriocarcinoma, soft tissue sarcoma, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelocytic leukemia, non-Hodgkin's lymphoma, Cellular non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, mantle zone cell lymphoma, myelodysplastic syndrome, acute myelocytic leukemia, T-cell lymphoma, natural killer cell lymphoma, extranodal marginal zone cell lymphoma, acute lymphocytic leukemia, multiple myeloma.

В одном варианте реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять для лечения инфекций и инфекционных заболеваний. В данном изобретении термин инфекция относится к любому состоянию в по меньшей мере одной клетке организма (т.е. субъекта), которая инфицирована инфекционным агентом (например, у субъекта наблюдается инфекция внутриклеточным патогеном, например, хроническая инфекция внутриклеточным патогеном). В данном изобретении термин инфекционный агент относится к чужеродному биологическому объекту (т.е. патогену), который индуцирует экспрессию CD47 (например, повышенную экспрессию CD47) в по меньшей мере одной клетке инфицированного организма. Например, инфекционные агенты включают, но не ограничены бактериями, вирусами, простейшими и грибами.In one embodiment, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention can be used to treat infections and infectious diseases. As used herein, the term infection refers to any condition in at least one cell of an organism (ie, a subject) that is infected with an infectious agent (eg, the subject has an infection with an intracellular pathogen, eg, a chronic infection with an intracellular pathogen). As used herein, the term infectious agent refers to a foreign biological entity (ie, a pathogen) that induces CD47 expression (eg, CD47 overexpression) in at least one cell of an infected organism. For example, infectious agents include, but are not limited to, bacteria, viruses, protozoa, and fungi.

Внутриклеточные патогены представляют особый интерес. Инфекционные заболевания представляют собой расстройства, вызванные инфекционными агентами. Некоторые инфекционные агенты не вызывают известных симптомов или заболевания при некоторых условиях, но потенциально могут вызывать симптомы или заболевание при измененных условиях. Заявленные способы можно применять для лечения хронических инфекций патогенами, например, включая, но не ограничиваясь вирусными инфекциями, например, ретровирусом, лентивирусом, гепаднавирусом, вирусами герпеса, поксвирусами, вирусами папилломы человека и т.д.; внутриклеточными бактериальными инфекциями, например, Mycobacteria, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonella, родом Yersinia, Helicobacter pylori и т.д.; и внутриклеточными простейшими патогенами, например, родом Plasmodium, родом Trypanosoma, родом Lamblia, родом Toxoplasma, родом Leishmania и т.д.Intracellular pathogens are of particular interest. Infectious diseases are disorders caused by infectious agents. Some infectious agents do not cause known symptoms or disease under some conditions, but have the potential to cause symptoms or disease under altered conditions. The claimed methods can be used to treat chronic infections with pathogens, for example, including, but not limited to, viral infections, for example, retrovirus, lentivirus, hepadnavirus, herpes viruses, poxviruses, human papillomaviruses, etc.; intracellular bacterial infections, for example, Mycobacteria, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonella, Yersinia genus, Helicobacter pylori, etc.; and intracellular protozoan pathogens, for example, Plasmodium genus, Trypanosoma genus, Lamblia genus, Toxoplasma genus, Leishmania genus, etc.

В некотором варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения субъектов с применением антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, в которых указанный субъект страдает от вирусной инфекции. В одном варианте реализации вирусная инфекция представляет собой инфекцию вирусом, выбранным из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита (А, В или С), вируса герпеса (например, вируса варицелла-зостер (ВЗВ), вируса простого герпеса (ВПГ-1), вируса гепатита А (ВГА-6), ВПГ-II и цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр), аденовируса, вируса гриппа, флавивирусов, эховируса, риновируса, вируса Коксаки, коронавируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса свинки, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса коровьей оспы, Тлимфотропного вируса человека (вируса HTLV), вируса денге, вируса папилломы, вируса моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса Джона Каннингема (вируса JC) или вируса арбовирусного энцефалита.In some embodiment, the present invention provides methods of treating subjects using an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention, wherein the subject is suffering from a viral infection. In one embodiment, the viral infection is an infection with a virus selected from the group consisting of human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis virus (A, B, or C), herpes virus (e.g., varicella-zoster virus (VZV), herpes simplex virus (HSV-1), hepatitis A virus (HAV-6), HSV-II and cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus), adenovirus, influenza virus, flaviviruses, echovirus, rhinovirus, coxsackie virus, coronavirus, respiratory syncytial virus , mumps virus, rotavirus, measles virus, rubella virus, parvovirus, vaccinia virus, human lymphotropic virus (HTLV virus), dengue virus, papilloma virus, molluscan virus, poliovirus, rabies virus, John Cunningham virus (JC virus) or arbovirus encephalitis.

В некотором варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения субъектов с применением антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, в которых указанный субъект страдает от бактериальной инфекции. В одном варианте реализации бактериальная инфекция представляет собой инфекцию бактериями, выбранными из группы, состоящей из хламидий, риккетсиальных бактерий, микобактерий, стафилококков, стрептококков, пневмококков, менингококков и гонококков, клебсиеллы, протеуса, серратии, псевдомонад,In some embodiment, the present invention provides methods of treating subjects using an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention, wherein the subject is suffering from a bacterial infection. In one embodiment, the bacterial infection is an infection with bacteria selected from the group consisting of chlamydia, rickettsial bacteria, mycobacteria, staphylococci, streptococci, pneumococci, meningococci and gonococci, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas,

Legionella,Legionella,

Corynebacterium diphtheriae, Salmonella, бацилл, Vibrio cholerae, Clostridium tetan, Clostridium botulinum, Bacillus anthricis, Yersinia pestis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Borriella.Corynebacterium diphtheriae, Salmonella, bacilli, Vibrio cholerae, Clostridium tetan, Clostridium botulinum, Bacillus anthricis, Yersinia pestis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis and Borriella.

В некотором варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения субъектов с применением антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, в которых указанный субъект страдает от грибковой инфекции. В одном варианте реализации грибковая инфекция представляет собой инфекцию грибом, выбранным из группы, состоящей изIn some embodiment, the present invention provides methods of treating subjects using an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention, wherein the subject is suffering from a fungal infection. In one embodiment, the fungal infection is an infection with a fungus selected from the group consisting of

Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и т.д.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger и т.д.), родаMucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasma capsulatum.Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis and Histoplasma capsulatum.

В некотором варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения субъектов с применением антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, в которых указанный субъект страдает от паразитарной инфекции. В одном варианте реализации паразитарная инфекция представляет собой инфекцию паразитом, выбранным из группы, состоящей изIn some embodiment, the present invention provides methods of treating subjects using an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention, wherein the subject is suffering from a parasitic infection. In one embodiment, the parasitic infection is an infection with a parasite selected from the group consisting of

- 48 043743- 48 043743

Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba, Giardia lambia,Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba, Giardia lambia,

Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii и Nippostrongylus brasiliensis.Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii and Nippostrongylus brasiliensis.

Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек, собака, кошка, лошадь, корова, мышь, крыса, обезьяна (например, яванский макак, например, Масаса fascicularis) или кролик. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека.The subject may be a mammal such as a human, dog, cat, horse, cow, mouse, rat, monkey (eg, cynomolgus, eg, Masasa fascicularis) or rabbit. In preferred embodiments of the present invention, the subject is a human.

Термин в сочетании с указывает на то, что компоненты, которые вводят в способе согласно настоящему изобретению (например, антитело против SIRPa (например, гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент вместе с противораковым агентом), можно включить в состав одной композиции для одновременной доставки или включить в состав отдельных двух или более композиций (например, набора). Каждый компонент можно вводить субъекту в момент времени, отличный от времени введения другого компонента; например, каждое введение можно осуществить неодновременно (например, отдельно или последовательно) с несколькими интервалами в течение данного периода времени. Более того, отдельные компоненты можно вводить субъекту одним и тем же или различными путями.The term in combination with indicates that the components that are administered in the method according to the present invention (for example, an anti-SIRPa antibody (for example, a humanized antibody) or an antigen binding fragment thereof together with an anticancer agent) can be included in a single composition for simultaneous delivery or include in two or more separate compositions (for example, a set). Each component may be administered to a subject at a time different from the time of administration of the other component; for example, each administration may be performed non-simultaneously (eg, separately or sequentially) at multiple intervals over a given period of time. Moreover, the individual components may be administered to a subject by the same or different routes.

В конкретных вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять отдельно или в сочетании с другими дополнительными терапевтическими агентами и/или терапевтическими процедурами для лечения или предотвращения любого заболевания, такого как рак, например, как обсуждалось в данном изобретении, у субъекта, нуждающегося в таком лечении или предотвращении. Композиции, например, фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, содержащие такие антитела и фрагменты в сочетании с дополнительными терапевтическими агентами также входят в объем настоящего изобретения.In specific embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention can be used alone or in combination with other additional therapeutic agents and/or therapeutic procedures for the treatment or prevention of any disease, such as cancer, for example, as discussed in this invention, in a subject in need of such treatment or prevention. Compositions, for example pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier, containing such antibodies and fragments in combination with additional therapeutic agents are also within the scope of the present invention.

Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения рака у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном изобретении, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой. В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения инфекции или инфекционного заболевания у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном изобретении, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой. В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ повышения активности иммунной клетки, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном изобретении. В одном варианте реализации указанный способ применяют для: лечения рака, лечения инфекции или инфекционного заболевания или в качестве адъюванта вакцины.Accordingly, the present invention provides a method of treating cancer in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof described herein, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure. The present invention also provides a method of treating an infection or infectious disease in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof described herein, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure. The present invention also provides a method of increasing the activity of an immune cell, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof described herein. In one embodiment, the method is used to: treat cancer, treat an infection or infectious disease, or as a vaccine adjuvant.

В конкретных вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять отдельно или в сочетании с противоопухолевыми вакцинами. Примеры противоопухолевых вакцин включают, но не ограничены перечисленными: вакцины против рака, вызванного инфекцией вирусом папилломы человека (ВПЧ), такие как гардасил®, гардасил 9® и церварикс®; вакцины, которые предотвращают рак печени, вызванный вирусом гепатита В, такие как энджерикс-В® и рекомбивакс НВ®; терапию онколитическими вирусами, которые запускают иммунный ответ, такими как имлигик®; ДНК-вакцины, такие как вакцина на основе плазмидной ДНК Synchotrope МА2М и ZYC101; ДНК-вакцина, специфичная к маммаглобину-А (см. Clinical Cancer Res. 2014 20(23):5964-75); вакцины на основе вектора, такие как PSA-TRICOM (проствак), PANVAC-VF, вакцины на основе Listeria monocytogenes (см., например, Therapeutic Advances in Vaccines, 2014, 2(5) 137-148), вакцины на основе листерий (листерии, экспрессирующие одну или более вакцин от рака, такие как листерии-мезотелин (например, CRS-207), ADXS-HPV, аксалимоген филолисбак, листерии-HER2/Neu, листерии-EGFRvIII), Adeno-CEA; аллогенные вакцины, такие как GVAX, BLP-25 (против муцина 1 вируса Анкара), белагенпуматуцел-L, TG4010, вакцина с аналогом эпидермального фактора роста CIMAvax, NY-ESO, GM.CD40L-CCL21; аутологичные вакцины, такие как: Adeno-CD40L, BCG, INGN-225, вакцины на основе дендритных клеток, такие как провенж® (сипулеуцел-Т), rF-CEA-MUC1-TRICOM (панвакDC); антигенные вакцины, такие как MUC-1 (стимувакс), NY-ESO-1, GP-100, Mage-Аз (ген A3, кодирующий антиген меланомы), INGN-225 (см. Pharmacology & Therapeutics 153 (2015) 1-9).In specific embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention can be used alone or in combination with antitumor vaccines. Examples of cancer vaccines include, but are not limited to: vaccines against cancer caused by human papillomavirus (HPV) infection, such as Gardasil®, Gardasil 9® and Cervarix®; vaccines that prevent liver cancer caused by the hepatitis B virus, such as Engerix-B® and Recombivax HB®; therapy with oncolytic viruses that trigger an immune response, such as Imligic®; DNA vaccines such as Synchotrope MA2M and ZYC101 plasmid DNA vaccines; mammaglobin-A-specific DNA vaccine (see Clinical Cancer Res. 2014 20(23):5964-75); vector-based vaccines such as PSA-TRICOM, PANVAC-VF, Listeria monocytogenes vaccines (see, for example, Therapeutic Advances in Vaccines, 2014, 2(5) 137-148), Listeria vaccines ( Listeria expressing one or more cancer vaccines, such as Listeria-mesothelin (eg, CRS-207), ADXS-HPV, Axalimogene filolisbac, Listeria-HER2/Neu, Listeria-EGFRvIII), Adeno-CEA; allogeneic vaccines such as GVAX, BLP-25 (Ankara virus mucin 1), belagenpumatucel-L, TG4010, CIMAvax epidermal growth factor analogue vaccine, NY-ESO, GM.CD40L-CCL21; autologous vaccines such as: Adeno-CD40L, BCG, INGN-225, dendritic cell-based vaccines such as Provenge® (sipuleucel-T), rF-CEA-MUC1-TRICOM (panvacDC); antigen vaccines such as MUC-1 (Stimuvax), NY-ESO-1, GP-100, Mage-Az (the A3 gene encoding melanoma antigen), INGN-225 (see Pharmacology & Therapeutics 153 (2015) 1-9 ).

Сигналы съешь меня можно увеличить с помощью цитотоксических методов лечения, таких как лучевая терапия или лечение химиотерапевтическими агентами, включая, но не ограничиваясь перечисленными агентами: антрациклины (доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон), оксалиплатин, бортезомиб, циклофосфамид, блеомицин, вориностат, паклитаксел, 5-фторурацил, цитарабин, преднизолон, доцетаксел, митомицин С, топотекан/камптотецин, этопозид, золедроновая кислота, метотрексат, ибрутиниб, афлиберцепт, бевацизумаб, торемифен, винбластин, винкристин, иделалисиб, меркаптопурин, талидомид, сорафениб. Таким образом, в некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять в со- 49 043743 четании с химиотерапевтическими агентами, в сочетании с лучевой терапией и т.д. В конкретных вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять отдельно или в сочетании с таргетной терапией. Примеры таргетной терапии включают: гормональную терапию, терапию ингибиторами передачи сигнала (например, ингибиторами EGFR, такими как цетуксимаб (эрбитукс) и эрлотиниб (тарцева)); ингибиторами CD20 (например, ритуксимабом (ритуксан) и офатумумабом (арзерра)); ингибиторами CD38 (например, даратумумабом (дарзалекс)); ингибиторами CD52 (например, алемтузумабом (кэмпас)); ингибиторами HER2 (например, трастузумабом (герцептин) и пертузумабом (перьета)); ингибиторами BCR-ABL (такими как иматиниб (гливек) и дазатиниб (спрайсел)); ингибиторами ALK (такими как кризотиниб (ксалкори) и церитиниб (зикадия)); ингибиторами BRAF (такими как вемурафениб (зелбораф) и дабрафениб (тафинлар)), модуляторами экспрессии генов (например, децитабином (дакоген) и вориностатом (золинза)), индукторами апоптоза (например, бортезомибом (велкейд) и карфилзомибом (кипролис)), ингибиторами ангиогенеза (например, бевацизумабом (авастин) и рамуцирумабом (цирамза)), иммуномодуляторными имидсодержащими лекарственными средствами (например, талидомидом, леналидомидом, помалидомидом и апремиластом), моноклональными антителами, присоединенными к токсинами (например, брентуксимабом ведотин (адцетрис) и адо-трастузумабом эмтанзин (кадсила)).Eat me signals can be increased by cytotoxic treatments such as radiation therapy or treatment with chemotherapeutic agents, including but not limited to the following agents: anthracyclines (doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone), oxaliplatin, bortezomib, cyclophosphamide, bleomycin, vorinostat , paclitaxel, 5-fluorouracil, cytarabine, prednisolone, docetaxel, mitomycin C, topotecan/camptothecin, etoposide, zoledronic acid, methotrexate, ibrutinib, aflibercept, bevacizumab, toremifene, vinblastine, vincristine, idelalisib, mercaptopurine, thalidomide, sorapheny b. Thus, in some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof described herein may be used in combination with chemotherapeutic agents, in combination with radiation therapy, etc. In specific embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can be used alone or in combination with targeted therapy. Examples of targeted therapies include: hormone therapy, signal transduction inhibitor therapy (eg, EGFR inhibitors such as cetuximab (Erbitux) and erlotinib (Tarceva)); CD20 inhibitors (eg, rituximab (Rituxan) and ofatumumab (Arzerra)); CD38 inhibitors (eg, daratumumab (Darzalex)); CD52 inhibitors (eg alemtuzumab (Campas)); HER2 inhibitors (such as trastuzumab (Herceptin) and pertuzumab (Perjeta)); BCR-ABL inhibitors (such as imatinib (Gleevec) and dasatinib (Spricel)); ALK inhibitors (such as crizotinib (Xalkori) and ceritinib (Zikadia)); BRAF inhibitors (such as vemurafenib (Zelboraf) and dabrafenib (Tafinlar)), gene expression modulators (such as decitabine (Dacogen) and vorinostat (Zolinza)), apoptosis inducers (such as bortezomib (Velcade) and carfilzomib (Kyprolis)), inhibitors angiogenesis (eg, bevacizumab (Avastin) and ramucirumab (Cyramza)), immunomodulatory imide-containing drugs (eg, thalidomide, lenalidomide, pomalidomide, and apremilast), monoclonal antibodies attached to toxins (eg, brentuximab vedotin (Adcetris) and ado-trastuzumab emtansine (kadsila)).

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, предпочтительно могут найти применение в сочетании с таргетной терапией, в которой антитела используются, чтобы опосредовать АЗКЦ/АЗКФ. Доступны функциональные биоанализы, чтобы проанализировать механизм действия лекарственного антитела и отличить АЗКФ как механизм действия от АЗКЦ. В качестве примера, в анализе антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) обычно используют нормальные мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека или эффекторные клетки, выделенные из них. Вариативность анализа можно снизить, используя выбранные группы доноров с определенными вариациями числа копий гена (CNV) или генотипами Fcy-рецептора IIa (FcyRIIa/CD32a), IIIa (FcγRШa/CD16а) или IIIb (FcyRIIIb/CD16b), такими как FcyRIIIa-158 V/V по сравнению с V/F или F/F, FcyRIIIa-131 H/H по сравнению с H/R или R/R, и полиморфными вариантами FcyRIIIb-NA1 и -NA2. В качестве альтернативы, эффекторные клетки, такие как МКПК, полученные из МКПК клеткиестественные киллеры (NK), гранулоциты, моноциты, полученные из моноцитов макрофаги или дендритный клетки (ДК) можно заменить на экспрессирующую FcyRIIIa линию клеток (например, сконструированные NK92). Уничтожение клеток-мишеней можно оценить путем измерения высвобождения специфических зондов из предварительно меченых клеток-мишеней, применяя 51хром (Cr51) или флуоресцентные красители, такие как кальцеин-ацетоксиметил (кальцеин-АМ), карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир (CFSE), 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(и-6)-карбоксифлуоресцеин (BCECF), европий (Eu) или йодид пропидия (PI), или путем измерения высвобождения цитозольных ферментов, таких как лактатдегидрогеназа (ЛДГ), или высвобождения нуклеозидтрифосфата (АТФ).The antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention may preferably find use in combination with targeted therapy in which the antibodies are used to mediate ADCC/ADCP. Functional bioassays are available to analyze the mechanism of action of a drug antibody and distinguish ADCP as a mechanism of action from ADCC. As an example, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assays typically use normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or effector cells isolated from them. Assay variability can be reduced by using selected groups of donors with specific gene copy number variations (CNVs) or Fcy receptor genotypes IIa (FcyRIIa/CD32a), IIIa (FcγRIIIa/CD16a) or IIIb (FcyRIIIb/CD16b), such as FcyRIIIa-158 V /V versus V/F or F/F, FcyRIIIa-131 H/H versus H/R or R/R, and the polymorphic variants FcyRIIIb-NA1 and -NA2. Alternatively, effector cells such as PBMCs, PBMC-derived natural killer (NK) cells, granulocytes, monocytes, monocyte-derived macrophages, or dendritic cells (DCs) can be replaced with an FcyRIIIa-expressing cell line (eg, engineered NK92). Target cell killing can be assessed by measuring the release of specific probes from pre-labeled target cells using 51 chromium (Cr 51 ) or fluorescent dyes such as calcein acetoxymethyl (calcein AM), carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), 2',7 '-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein (BCECF), europium (Eu) or propidium iodide (PI), or by measuring the release of cytosolic enzymes such as lactate dehydrogenase (LDH), or the release nucleoside triphosphate (ATP).

Наоборот, антителозависимый опосредованный клетками фагоцитоз (АЗКФ) можно оценить путем измерения разрушения клеток-мишеней путем фагоцитоза, опосредованного гранулоцитами, моноцитами, дендритными клетками или макрофагами. В анализе АЗКФ используют полученные из МКПК клетки или миелоидные линии клеток, такие как клетки HL-60, ТНР-1 и U937, дифференцированные в макрофаги или гранулоциты. Стимулы, которые широко используют для индукции дифференцировки в макрофаги моноцитарных линий клеток, включают форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), 1,25дигидроксивитамин D3 (VD3) и ретиноевую кислоту (РК). Также известно, что РК индуцирует конечную дифференцировку в гранулоциты, например, клеток HL-60. Фагоцитоз клеток-мишеней можно оценить путем отслеживания интернализации эффекторными клетками специфических зондов из клетокмишеней, предварительно меченых флуоресцентными красителями, такими как краситель пролиферации клеток eFluor450, CFSE и рН-чувствительные красители, включая pHrodo и CypHer5E. Фагоцитоз измеряют по увеличению количества флуоресцентно меченых эффекторных клеток, применяя проточную цитометрию или флуоресцентную микроскопию. Также доступны анализы репортерного гена для оценки АЗКФ. Для того чтобы измерить функцию АЗКФ в анализе репортерного гена, клетки-мишени сначала инкубируют с титрованным интересующим антителом. После связывания антитела с распознаваемой мишенью на поверхности целевой клетки добавляют сконструированные эффекторные клетки Jurkat. Если произошла активация пути АЗКФ, то клетки Jurkat продуцируют продукт люциферазу путем экспрессии репортерного гена NFAT-RE-luc2. Затем измеряют активность люциферазы после периода индукции в течение 4-24 ч после добавления реагента для анализа люциферазы. Дозозависимую ответную реакцию в анализе в микротитрационном планшете можно использовать для количественного определения относительной биологической активности терапевтического антитела по сравнению с кривой зависимости доза-эффект подходящего эталонного объекта.Conversely, antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) can be assessed by measuring the destruction of target cells by phagocytosis mediated by granulocytes, monocytes, dendritic cells, or macrophages. The ADCF assay uses PBMC-derived cells or myeloid cell lines, such as HL-60, THP-1 and U937 cells, differentiated into macrophages or granulocytes. Stimuli that are widely used to induce differentiation into macrophages of monocytic cell lines include phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 1,25-dihydroxyvitamin D3 (VD3), and retinoic acid (RA). It is also known that RA induces terminal differentiation into granulocytes, for example, of HL-60 cells. Phagocytosis of target cells can be assessed by monitoring the internalization by effector cells of specific probes from target cells prelabeled with fluorescent dyes such as the cell proliferation dye eFluor450, CFSE, and pH-sensitive dyes including pHrodo and CypHer5E. Phagocytosis is measured by the increase in the number of fluorescently labeled effector cells using flow cytometry or fluorescence microscopy. Reporter gene assays are also available to evaluate ADCF. To measure ADCP function in a reporter gene assay, target cells are first incubated with a titrated antibody of interest. After the antibody binds to the recognized target on the surface of the target cell, engineered Jurkat effector cells are added. If the ADCP pathway is activated, Jurkat cells produce the product luciferase by expressing the reporter gene NFAT-RE-luc2. Luciferase activity is then measured after an induction period of 4-24 hours after addition of the luciferase assay reagent. The dose response in a microtiter plate assay can be used to quantify the relative biological activity of a therapeutic antibody compared to the dose-response curve of a suitable reference entity.

В конкретных вариантах реализации антитела против SIRPa или их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с противораковым терапевтическим агентом или иммуномодуляторным лекарственным средством, таким как ингибитор иммуномодуляторного рецептора, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфичноIn specific embodiments, anti-SIRPa antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention may be used in combination with an anticancer therapeutic agent or an immunomodulatory drug, such as an immunomodulatory receptor inhibitor, e.g., an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically

- 50 043743 связывается с указанным рецептором.- 50 043743 binds to the specified receptor.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с одним или более из: агониста (например, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или растворимого гибридного белка) белка рецептора TNF, иммуноглобулин-подобного белка, рецептора цитокина, интегрина, активирующих лимфоциты сигнальных молекул (белков SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, Toll-подобного рецептора, ОХ40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), В7-НЗ, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2Rгамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (TACTILE), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAM7, BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфично связывается с CD83; или ингибитора CD47, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, СЕАСАМ (например, СЕАСАМ-1, -3 и/или -5), VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, IDO, TDO, CD160 и/или TGFR-бета.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with one or more of: an agonist (e.g., an agonist antibody or antigen binding fragment thereof, or a soluble fusion protein) TNF receptor protein, immunoglobulin-like protein, receptor cytokine, integrin, lymphocyte-activating signaling molecules (SLAM proteins), NK cell activating receptor, Toll-like receptor, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) , 4-1BB (CD137), B7-НЗ, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-alpha , CD8-beta, IL2R-beta, IL2Rgamma, IL7R-alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX , CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (TACTILE), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAM7, BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT , GADS, PAG/Cbp, CD19a and a ligand that specifically binds to CD83; or inhibitor CD47, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, SEACAM (e.g. SEACAM-1, -3 and/or -5), VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, IDO, TDO, CD160 and/or TGFR-beta.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с одним или более циклическими динуклеотидами или другими агонистами сигнального пути STING. STING (стимулятор генов интерферона, также известный как ТМЕМ173, MITA, ERIS и MPYS) представляет собой трансмембранный белок, локализованный в ЭР, который претерпевает изменение конформации в ответ на непосредственное связывание циклических динуклеотидов (ЦДН), приводящее к последующему сигнальному каскаду, включающему активацию TBK1, фосфорилирование IRF-3 и продукцию IFN-β и других цитокинов. Сигнальный путь STING в антигенпредставляющих клетках содержащего опухоль хозяина участвует в индукции спонтанного ответа CD8+ Т-клеток на антигены опухолевого происхождения. Активация данного пути и последующая продукция IFN-β по имеющимся сведениям также способствует противоопухолевому действию облучения. Агонисты STING и их применения описаны, например, в US20060040887, US20080286296, US20120041057, US20140205653, WO2014179335, WO 2014179760, US20150056224, WO 2015185565, WO 2016096174, WO 2016145102, WO 2017011444, WO 2017027645, WO 2017027646, WO 2017123657, WO 2017123669, WO 2017175147, WO 2017175156, WO 2018045204, WO 2018009648, WO 2018006652, WO 2018013887, WO 2018013908, US20180002369, US20180092937 и US20180093964.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with one or more cyclic dinucleotides or other agonists of the STING signaling pathway. STING (stimulator of interferon genes, also known as TMEM173, MITA, ERIS and MPYS) is an ER-localized transmembrane protein that undergoes a conformational change in response to direct binding of cyclic dinucleotides (CDNs), leading to a subsequent signaling cascade involving activation of TBK1 , phosphorylation of IRF-3 and production of IFN-β and other cytokines. The STING signaling pathway in antigen presenting cells of the tumor host is involved in the induction of spontaneous CD8+ T cell responses to tumor-derived antigens. Activation of this pathway and subsequent production of IFN-β is also reported to contribute to the antitumor effects of radiation. STING agonists and their uses are described, for example, in US20060040887, US20080286296, US20120041057, US20140205653, WO2014179335, WO 2014179760, US20150056224, WO 2015185565, WO 2016096174, WO 2016145102, WO 2017011444, WO 2017027645, WO 2017027646, WO 2017123657, WO 2017123669, WO 2017175147, WO 2017175156, WO 2018045204, WO 2018009648, WO 2018006652, WO 2018013887, WO 2018013908, US20180002369, US20180092937 and US20180093964.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с одним или более из: антитела против CD47, антитела против PD-1 (например, ниволумаба, пембролизумаба), антитела против PDL1, антитела против TIGIT, антитела против APRIL, антитела против CTLA4, антитела против CS1 (например, элотузумаба), антитела против KIR2DL1/2/3 (например, лирилумаба), антитела против CD137 (например, урелумаба), антитела против GITR (например, TRX518), антитела против PD-L1 (например, BMS-936559, MSB0010718C или MPDL3280A), антитела против PD-L2, антитела против ILT1, антитела против ILT2, антитела против ILT3, антитела против ILT4, антитела против ILT5, антитела против ILT6, антитела против ILT7, антитела против ILT8, антитела против CD40, антитела против ОХ40, антитела против ICOS, антитела против KIR2DL1, антитела против KIR2DL2/3, антитела против KIR2DL4, антитела против KIR2DL5A, антитела против KIR2DL5B, антитела против KIR3DL1, антитела против KIR3DL2, антитела против KIR3DL3, антитела против NKG2A, антитела против NKG2C, антитела против NKG2E, антитела против 4-1ВВ (например, PF-05082566), антитела против TSLP, антитела против IL-10, IL-10 или пегилированного IL-10, или любого низкомолекулярного органического ингибитора таких мишеней.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention is in combination with one or more of: an anti-CD47 antibody, an anti-PD-1 antibody (e.g., nivolumab, pembrolizumab), an anti-PDL1 antibody, an anti-TIGIT antibody, anti-APRIL, anti-CTLA4, anti-CS1 (eg, elotuzumab), anti-KIR2DL1/2/3 (eg, lirilumab), anti-CD137 (eg, urelumab), anti-GITR (eg, TRX518), anti- PD-L1 (eg, BMS-936559, MSB0010718C, or MPDL3280A), anti-PD-L2, anti-ILT1, anti-ILT2, anti-ILT3, anti-ILT4, anti-ILT5, anti-ILT6, anti-ILT7, anti anti-ILT8, anti-CD40, anti-OX40, anti-ICOS, anti-KIR2DL1, anti-KIR2DL2/3, anti-KIR2DL4, anti-KIR2DL5A, anti-KIR2DL5B, anti-KIR3DL1, anti-KIR3DL2, anti-KIR3DL3, anti anti-NKG2A, anti-NKG2C, anti-NKG2E, anti-4-1BB (eg, PF-05082566), anti-TSLP, anti-IL-10, IL-10, or pegylated IL-10, or any small molecule organic inhibitor of such targets .

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD20 (например, ритуксимабом, офатумумабом, окрелизумабом, обинутузумабом, окаратузумабом, ублитуксимабом, велтузумабом, ибритумомабом тиуксетан, тозитумомабом, BVX-20, SCT-400 или PRO131921).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is in combination with an anti-CD20 antibody (e.g., rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ublituximab, veltuzumab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, BVX-20, SCT -400 or PRO131921).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD38 (например, даратумумабом, изатуксимабом или MOR202).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with an anti-CD38 antibody (eg, daratumumab, isatuximab, or MOR202).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против EGFR (например, цетуксимабом, CetuGEX, панитумумабом, нимотузумабом, депатуксизумабом или AFM-21).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-EGFR antibody (eg, cetuximab, CetuGEX, panitumumab, nimotuzumab, depatuxizumab, or AFM-21).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвя- 51 043743 зывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом противIn one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-SIRPa antibody.

HER2 (например, трастузумабом, TrasGEX, пертузумабом, маргетуксимабом или ADCT-502).HER2 (eg, trastuzumab, TrasGEX, pertuzumab, margetuximab, or ADCT-502).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом противIn one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-SIRPa antibody.

HER3 (например, лумретузумабом, патритумабом или LJM716).HER3 (eg, lumretuzumab, patritumab, or LJM716).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD19 (например, инебилизумабом, блинатумомабом, DI-B4, MDX-1342, MEDI-551, MOR208 или 4G7SDIE).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is in combination with an anti-CD19 antibody (eg, inebilizumab, blinatumomab, DI-B4, MDX-1342, MEDI-551, MOR208, or 4G7SDIE).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD52 (например, алемтузумабом).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-CD52 antibody (eg, alemtuzumab).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ЕрСАМ (например, адекатумумабом, катумаксомабом, эдреколомабом или ING-1).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-EpCAM antibody (eg, adecatumumab, catumaxomab, edrecolomab, or ING-1).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против SLAMF7 (например, элотузумабом или ABBV-838).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with an anti-SLAMF7 antibody (eg, elotuzumab or ABBV-838).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против PD-1 (например, ниволумабом или пембролизумабом).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with an anti-PD-1 antibody (eg, nivolumab or pembrolizumab).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против PDL1 (например, BMS-936559, MSB0010718C или MPDL3280A).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-PDL1 antibody (eg, BMS-936559, MSB0010718C, or MPDL3280A).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CTLA4 (например, ипилимумабом или тремелимумабом).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-CTLA4 antibody (eg, ipilimumab or tremelimumab).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD137 (например, урелумабом).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-CD137 antibody (eg, urelumab).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против GITR (например, TRX518 или FPA154).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-GITR antibody (eg, TRX518 or FPA154).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ОХ40 (например, MEDI6469, MOXR0916 или INCAGN1949).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-OX40 antibody (eg, MEDI6469, MOXR0916, or INCAGN1949).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD40 (например, лукатумумабом, дацетузумабом, АРХ005М, ChiLob7/4, СР-870,893 или JNJ-64457107). В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CS1.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is in combination with an anti-CD40 antibody (eg, lucatumumab, dacetuzumab, APX005M, ChiLob7/4, CP-870,893, or JNJ-64457107). In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-CS1 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL1/2/3.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR2DL1/2/3 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD137 (например, урелумабом).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-CD137 antibody (eg, urelumab).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против GITR (например, TRX518).In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-GITR antibody (eg, TRX518).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против PDL2.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-PDL2 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL1.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ITL1 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL2.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ITL2 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL3.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ITL3 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвя- 52 043743 зывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL4.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-ITL4 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL5.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ITL5 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL6.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-ITL6 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL7.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ITL7 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ITL8.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-ITL8 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против CD40.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-CD40 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ОХ40.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-OX40 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL1.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR2DL1 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL2/3.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR2DL2/3 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL4.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR2DL4 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL5A.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-KIR2DL5A antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR2DL5B.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR2DL5B antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR3DLL.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention is combined with an anti-KIR3DLL antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR3DL2.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR3DL2 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против KIR3DL3.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-KIR3DL3 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против NKG2A.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-NKG2A antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против NKG2C.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-NKG2C antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против ICOS.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-ICOS antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против 41ВВ.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-41BB antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против IL10.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-IL10 antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с антителом против TSLP.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention is combined with an anti-TSLP antibody.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с IL-10 или пегилированным IL-10.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof of the present invention is combined with IL-10 or pegylated IL-10.

- 53 043743- 53 043743

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с одним или более из ингибиторов (например, малой органической молекулой или антителом или его антигенсвязывающим фрагментом), таких как ингибитор MTOR (мишени рапамицина в клетках млекопитающих), цитотоксический агент, агент на основе платины, ингибитор EGFR, ингибитор VEGF, стабилизатор микротрубочек, таксан, ингибитор CD20, ингибитор CD52, ингибитор CD30, ингибитор RANK (рецептора активатора ядерного фактора каппа В), ингибитор RANKL (лиганда рецептора активатора ядерного фактора каппа В), ингибитор ERK, ингибитор МАР-киназы, ингибитор AKT, ингибитор MEK, ингибитор PI3K, ингибитор HER1, ингибитор HER2, ингибитор HER3, ингибитор HER4, ингибитор Вс12, ингибитор CD22, ингибитор CD79b, ингибитор ErbB2 или ингибитор фарнезилпротеинтрансферазы.In one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is in combination with one or more inhibitors (e.g., a small organic molecule or antibody or antigen binding fragment thereof), such as an MTOR (mammalian target of rapamycin) inhibitor , cytotoxic agent, platinum-based agent, EGFR inhibitor, VEGF inhibitor, microtubule stabilizer, taxane, CD20 inhibitor, CD52 inhibitor, CD30 inhibitor, RANK inhibitor, RANKL inhibitor ), an ERK inhibitor, a MAP kinase inhibitor, an AKT inhibitor, a MEK inhibitor, a PI3K inhibitor, a HER1 inhibitor, a HER2 inhibitor, a HER3 inhibitor, a HER4 inhibitor, a Bc12 inhibitor, a CD22 inhibitor, a CD79b inhibitor, an ErbB2 inhibitor, or a farnesyl protein transferase inhibitor.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с любым одним или более из следующих агентов: 13-цис-ретиноевая кислота, 3-[5(метилсульфонилпиперадинметил)индолил]хинолон, 4-гидрокситамоксифен, 5-дезоксиуридин, 5'дезокси-5-фторуридин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 7-гидроксистауроспорин, А-443654, абиратеронацетат, абраксан, АВТ-578, аколбифен, ADS-100380, ALT-110, алтретамин, амифостин, аминоглутетимид, амрубицин, амсакрин, анагрелид, анастрозол, ангиостатин, АР-23573, ARQ-197, арзоксифен, AS252424, AS-605240, аспарагиназа, AT-9263, атрасентан, акситиниб, AZD1152, вакцина против бациллы Кальмета-Герена (БЦЖ), батабулин, ВС-210, бесодутокс, бевацизумаб, бикалутамид, Bio111, BIO140, блеомицин, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, бортезомиб, бусерелин, бусульфан, кальцитриол, камптотецин, канертиниб, капецитабин, карбоплатин, кармустин, СС8490, цедираниб, CG1521, CG-781, хламидоцин, хлорамбуцил, хлортоксин, циленгитид, циметидин, цисплатин, кладрибин, клодронат, COL-3, CP-724714, циклофосфамид, ципротерон, ципротеронацетат, цитарабин, цитозинарабинозид, дакарбазин, дациностат, дактиномицин, далотузумаб, данусертиб, дазатаниб, даунорубицин, декатаниб, дегуелин, денилейкин, дезоксикоформицин, депсипептид, диарилпропионитрил, диэтилстильбэстрол, дифтитокс, доцетаксел, довитиниб, доксорубицин, дролоксифен, эдотекарин, меченый иттрием-90 эдотреотид, эдотреотид, EKB-569, EMD121974, эндостатин, энзалутамид, энзастаурин, эпирубицин, эпитилон В, ERA-923, эрбитукс, эрлотиниб, эстрадиол, эстрамустин, этопозид, эверолимус, эксеместан, фиклатузумаб, финастерид, флавопиридол, флоксуридин, флударабин, флудрокортизон, флуоксиместерон, флутамид, схема лечения FOLFOX, фулвестрант, галетерон, гефитиниб, гемцитабин, гиматекан, гозерелин, гозерелина ацетат, госсипол, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, гидроксипрогестеронкапроат, гидроксимочевина, IC87114, идарубицин, идоксифен, ифосфамид, М862, иматиниб, IMC1C11, INCB24360, INO1001, интерферон, интерлейкин-12, ипилимумаб, иринотекан, JNJ-16241199, кетоконазол, KRX-0402, талидомид, леналидомид, помалидомид, апремиласт, лапатиниб, лазофоксифен, летрозол, лейковорин, лейпролид, лейпролид ацетат, левамизол, липосома entrapped паклитаксел, ломустин, лонафарниб, лукантон, LY292223, LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, маримастат, мехлоретамин, медроксипрогестеронацетат, мегестролацетат, мелфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митрамицин, митомицин, митотан, митоксантрон, тозасертиб, MLN8054, неовастат, нератиниб, неурадиаб, нилотиниб, нилутамид, нолатрексид, NVP-BEZ235, облимерсен, октреотид, офатумумаб, ореговомаб, ортеронел, оксалиплатин, паклитаксел, палбоциклиб, памидронат, панитумумаб, пазопаниб, PD0325901, PD184352, ПЭГ-интерферон, пеметрексед, пентостатин, перифозин, фенилаланинмустард, PI-103, пиктилисиб, PIK-75, пипендоксифен, PKI-166, пликамицин, порфимер, преднизон, прокарбазин, прогестин, РХ-866, R-763, ралоксифен, ралтитрексид, разоксин, ридафоролимус, ритуксимаб, ромидепсин, RTA744, рубитекан, скриптаид, Sdx102, селициклиб, селуметиниб, семаксаниб, SF1126, сиролимус, SN36093, сорафениб, спиронолактон, скваламин, SR13668, стрептозоцин, SU6668, субероиланилидгидроксамовая кислота, сунитиниб, синтетический эстроген, талампанель, талимоген лагерпарепвек, тамоксифен, темозоломид, темсиролимус, тенипозид, тесмилифен, тестостерон, тетрандрин, TGX-221, талидомид, тиогуанин, тиотепа, тремелимумаб, типифарниб, тивозаниб, TKI-258, TLK286, топотекан, торемифена цитрат, трабектедин, трастузумаб, третиноин, трихостатин А, трицирибинфосфата моногидрат, трипторелина памоат, TSE-424, урациловый иприт, вальпроевая кислота, валрубицин, вандетаниб, ваталаниб, ловушка VEGF (VEGF Trap), винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, витаксин, витеспан, вориностат, VX-745, вортманнин, Xr311, занолимумаб, ZK186619, ZK-304709, ZM336372, ZSTK474.In one embodiment of the present invention, the anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is in combination with any one or more of the following agents: 13-cis-retinoic acid, 3-[5(methylsulfonylpiperadinemethyl)indolyl]quinolone, 4-hydroxytamoxifen, 5-deoxyuridine, 5'deoxy-5-fluorouridine, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, 7-hydroxystaurosporine, A-443654, abiraterone acetate, abraxane, ABT-578, akolbifene, ADS-100380, ALT-110, altretamine, amifostine, aminoglutethimide, amrubicin, amsacrine, anagrelide, anastrozole, angiostatin, AR-23573, ARQ-197, arzoxifene, AS252424, AS-605240, asparaginase, AT-9263, atrasentan, axitinib, AZD1152, Bacillus Calmette-Guéré vaccine on (BCG), batabulin, BC-210, besodutox, bevacizumab, bicalutamide, Bio111, BIO140, bleomycin, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, bortezomib, buserelin, busulfan, calcitriol, camptothecin, canertinib, capets itabine, carboplatin, carmustine, CC8490, cediranib, CG1521, CG-781, chlamydocin, chlorambucil, chlorotoxin, cilengitide, cimetidine, cisplatin, cladribine, clodronate, COL-3, CP-724714, cyclophosphamide, cyproterone, cyproterone acetate, cytarabine, cytosine arabinoside, dacarbazine, dacinostat, dactinomycin, dalotuzumab, danusertib, dasatanib, daunorubicin, decatanib, deguelin, denileukin, deoxycoformycin, depsipeptide, diarylpropionitrile, diethylstilbestrol, diftitox, docetaxel, dovitinib, doxorubicin, droloxifene, edotecarin, yttrium-90 labeled edotreotide , edotreotide, EKB-569, EMD121974, endostatin, enzalutamide, enzastaurin, epirubicin, epitilon B, ERA-923, erbitux, erlotinib, estradiol, estramustine, etoposide, everolimus, exemestane, ficlatuzumab, finasteride, flavopiridol, floxuridine, fludarabine, fludrocortisone, fluoxymesterone, flutamide, scheme treatment FOLFOX, fulvestrant , galeterone, gefitinib, gemcitabine, gimatecan, goserelin, goserelin acetate, gossypol, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, hydroxyprogesterone caproate, hydroxyurea, IC87114, idarubicin, idoxifene, ifosfamide, M862, and matinib, IMC1C11, INCB24360, INO1001, interferon, interleukin- 12, ipilimumab, irinotecan, JNJ-16241199, ketoconazole, KRX-0402, thalidomide, lenalidomide, pomalidomide, apremilast, lapatinib, lasofoxifene, letrozole, leucovorin, leuprolide, leuprolide acetate, levamisole, liposome entrapped paclitaxel, lomu stine, lonafarnib, lucanton, LY292223 , LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, marimastat, mechlorethamine, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, melphalan, mercaptopurine, mesna, methotrexate, mithramycin, mitomycin, mitotane, mitoxant ron, tosasertib, MLN8054, neovastat, neratinib, neuradiab, nilotinib, nilutamide, nolatrexide , NVP-BEZ235, oblimersen, octreotide, ofatumumab, oregovomab, orteronel, oxaliplatin, paclitaxel, palbociclib, pamidronate, panitumumab, pazopanib, PD0325901, PD184352, PEG-interferon, pemetrexed, pentostatin, perifosine, phenylalaninemustar d, PI-103, pictilisib, PIK -75, пипендоксифен, PKI-166, пликамицин, порфимер, преднизон, прокарбазин, прогестин, РХ-866, R-763, ралоксифен, ралтитрексид, разоксин, ридафоролимус, ритуксимаб, ромидепсин, RTA744, рубитекан, скриптаид, Sdx102, селициклиб, селуметиниб , semaxanib, SF1126, sirolimus, SN36093, sorafenib, spironolactone, squalamine, SR13668, streptozocin, SU6668, suberoylanilide hydroxamic acid, sunitinib, synthetic estrogen, talampanel, talimogen laherparepvec, tamoxifen, temozolomide, temsiro limus, teniposide, tesmilifene, testosterone, tetrandrine, TGX- 221, thalidomide, thioguanine, thiotepa, tremelimumab, tipifarnib, tivozanib, TKI-258, TLK286, topotecan, toremifene citrate, trabectedin, trastuzumab, tretinoin, trichostatin A, triciribine phosphate monohydrate, triptorelin pamoate, TSE-424, uracil mustard, valproic acid, valrubicin, vandetanib, vatalanib, VEGF Trap, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, vitaxin, vitespan, vorinostat, VX-745, wortmannin, Xr311, zanolimumab, ZK186619, ZK-304709, ZM336372, ZSTK474.

Неограничивающие примеры подходящих противораковых агентов для применения в комбинации с антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению включают цитостатические агенты, иммуномодулирующие лекарственные средства на основе имидов, цитотоксические агенты, агенты для таргетной терапии (малые молекулы, биологические агенты, миРНК и микроРНК) против рака и неопластических заболеваний,Non-limiting examples of suitable anti-cancer agents for use in combination with an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention include cytostatic agents, imide-based immunomodulatory drugs, cytotoxic agents, targeted therapy agents (small molecules, biological agents, siRNAs and microRNAs) against cancer and neoplastic diseases,

1) антиметаболиты (такие как метотрексат, 5-фторурацил, гемцитабин, флударабин, капецитабин),1) antimetabolites (such as methotrexate, 5-fluorouracil, gemcitabine, fludarabine, capecitabine),

2) алкилирующие агенты, такие как темозоломид, циклофосфамид,2) alkylating agents such as temozolomide, cyclophosphamide,

3) взаимодействующие с ДНК и повреждающие ДНК агенты, такие как цисплатин, оксалиплатин, доксорубицин,3) DNA-interacting and DNA-damaging agents such as cisplatin, oxaliplatin, doxorubicin,

- 54 043743- 54 043743

4) ионизирующее облучение, такое как лучевая терапия,4) ionizing radiation such as radiation therapy,

5) ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид, доксорубицин,5) topoisomerase II inhibitors, such as etoposide, doxorubicin,

6) ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан, топотекан,6) topoisomerase I inhibitors, such as irinotecan, topotecan,

7) взаимодействующие с тубулином агенты, такие как паклитаксел, доцетаксел, абраксан, эпотилоны,7) agents interacting with tubulin, such as paclitaxel, docetaxel, abraxane, epothilones,

8) ингибиторы белка веретена деления кинезина,8) inhibitors of the kinesin spindle protein,

9) ингибиторы контрольных точек сборки веретена деления,9) inhibitors of spindle assembly checkpoints,

10) ингибиторы поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), такие как олапариб, MK-4827 и велипариб,10) poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors such as olaparib, MK-4827 and veliparib,

11) ингибиторы матриксной металлопротеиназы (ММР),11) matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors,

12) ингибиторы протеаз, такие как ингибиторы катепсина D и катепсина K,12) protease inhibitors, such as cathepsin D and cathepsin K inhibitors,

13) ингибиторы протеасом или убиквитинилирования, такик как бортезомиб,13) proteasome or ubiquitinylation inhibitors, such as bortezomib,

14) активатор мутантного р53 для восстановления активности р53 дикого типа,14) activator of mutant p53 to restore the activity of wild-type p53,

15)аденовирусный р5315) adenoviral p53

16) ингибиторы Bcl-2, такие как АВТ-263,16) Bcl-2 inhibitors, such as ABT-263,

17) модуляторы белков теплового шока (БТШ), такие как гелданамицин и 17-AAG,17) heat shock protein (HSP) modulators, such as geldanamycin and 17-AAG,

18) ингибиторы гистоновых дезацетилаз (HDAC), такие как вориностат (SAHA),18) histone deacetylase (HDAC) inhibitors such as vorinostat (SAHA),

19) агенты, модулирующие половые гормоны,19) agents that modulate sex hormones,

a. антиэстрогены, такие как тамоксифен, фулвестрант,a. antiestrogens such as tamoxifen, fulvestrant,

b. селективные модуляторы рецептора эстрогенов (SERM), такие как ралоксифен,b. selective estrogen receptor modulators (SERMs), such as raloxifene,

c. антиандрогены, такие как бикалутамид, флутамид,c. antiandrogens such as bicalutamide, flutamide,

d. агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (РФЛГ), такие как лейпролид,d. luteinizing hormone releasing factor (LRF) agonists such as leuprolide,

e. ингибиторы 5 а-редуктазы, такие как финастерид,e. 5 α-reductase inhibitors such as finasteride,

f. лиаза цитохрома Р450 С17 (CYP450c17, также называемая 17аС);f. cytochrome P450 C17 lyase (CYP450c17, also called 17aC);

g. ингибиторы ароматазы, такие как летрозол, анастрозол, эксеместан,g. aromatase inhibitors such as letrozole, anastrozole, exemestane,

20) ингибиторы киназы EGFR, такие как гефитиниб, эрлотиниб, лапатиниб,20) EGFR kinase inhibitors, such as gefitinib, erlotinib, lapatinib,

21) двойные ингибиторы erbB1 и erbB2, такие как лапатиниб,21) dual inhibitors of erbB1 and erbB2, such as lapatinib,

22) ингибиторы киназ, направленных на множество мишеней (серин/треониновых и/или тирозинкиназ),22) kinase inhibitors targeting multiple targets (serine/threonine and/or tyrosine kinases),

а. ингибиторы киназы ABL - иматиниб, нилотиниб, дазатиниб,A. ABL kinase inhibitors - imatinib, nilotinib, dasatinib,

b. ингибиторы VEGFR-1, VEGFR-2, PDGFR, KDR, FLT, c-Kit, Tie2, Raf, MEK и ERK, такие как сунитиниб, сорафениб, вандетаниб, пазопаниб, PLX-4032, акситиниб, PTK787, GSK-1120212,b. inhibitors of VEGFR-1, VEGFR-2, PDGFR, KDR, FLT, c-Kit, Tie2, Raf, MEK and ERK, such as sunitinib, sorafenib, vandetanib, pazopanib, PLX-4032, axitinib, PTK787, GSK-1120212,

c. ингибиторы Polo-подобной киназы,c. Polo-like kinase inhibitors,

d. ингибиторы киназы Aurora,d. Aurora kinase inhibitors,

e. ингибитор JAK,e. JAK inhibitor

f. ингибиторы киназы с-МЕТ,f. c-MET kinase inhibitors,

g. ингибиторы циклин-зависимых киназ, такие как ингибитор CDK1 и CDK2 динациклиб SCH 727965 (см. Parry и др., Molecular Cancer Therapeutics 9 (8): 2344-53 (2010)) и ингибиторы CDK4/6, такие как рибоциклиб, палбоциклиб, абемациклиб и трилациклиб,g. cyclin-dependent kinase inhibitors such as the CDK1 and CDK2 inhibitor dinaciclib SCH 727965 (see Parry et al., Molecular Cancer Therapeutics 9 (8): 2344-53 (2010)) and CDK4/6 inhibitors such as ribociclib, palbociclib, abemaciclib and trilaciclib,

h. ингибиторы PI3K и mTOR, такие как GDC-0941, BEZ-235, BKM-120 и AZD-8055,h. PI3K and mTOR inhibitors such as GDC-0941, BEZ-235, BKM-120 and AZD-8055,

i. рапамицин и его аналоги, такие как темсиролимус, эверолимус и дефоролимус,i. rapamycin and its analogues, such as temsirolimus, everolimus and deforolimus,

23) и другие противораковые (также известные как антинеопластические) агенты включают, но не ограничены перечисленными: ара-С, адриамицин, цитоксан, карбоплатин, урациловый иприт, хлорметин, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, фосфат флударабина, пентостатин, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, навельбин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, тенипозид, цитарабин, пеметрексед, идарубицин, митрамицин, дезоксикоформицин, митомицин-С, L-аспарагиназу, тенипозид, этинилэстрадиол, диэтилстильбэстрол, тестостерон, преднизон, флуоксиместерон, дромостанолон пропионат, тестолактон, мегестрола ацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамцинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглутетимид, эстрамустин, флутамида медроксипрогестеронацетат, торемифен, гозерелин, карбоплатин, гидроксимочевину, амсакрин, прокарбазин, митотан, митоксантрон, левамизол, дроллоксафин, гексаметилмеламин, бексксар, зевалин, трисенокс, профимер, тиотепа, алтретамин, доксил, онтак, депоцит, аранесп, нейпоген, неуласта, кепиванс.23) and other anticancer (also known as antineoplastic) agents include, but are not limited to: ara-C, adriamycin, cytoxan, carboplatin, uracil mustard, chlormethine, ifosfamide, melphalan, chlorambucil, pipobromane, triethylenemelamine, triethylene thiophosphoramine, busulfan, carmustine, lomustine, streptozocin, dacarbazine, floxuridine, cytarabine, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, fludarabine phosphate, pentostatin, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, navelbine, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, teniposide, cytarabine, pemetrexed , idarubicin , mithramycin, deoxycoformycin, mitomycin-C, L-asparaginase, teniposide, ethinyl estradiol, diethylstilbestrol, testosterone, prednisone, fluoxymesterone, dromostanolone propionate, testolactone, megestrol acetate, methylprednisolone, methyltestosterone, prednisolone, triamcinolone, chlorine trianisene, hydroxyprogesterone, aminoglutethimide, estramustine, flutamide medroxyprogesterone acetate, toremifene, goserelin, carboplatin, hydroxyurea, amsacrine, procarbazine, mitotane, mitoxantrone, levamisole, drolloxafine, hexamethylmelamine, bexxar, zevalin, trisenox, profimer, thiotepa, altretamine, doxil, ontak, depocit, aranesp, neupogen, not Ulasta, Capivans.

24) ингибиторы фарнезилпротеинтрансферазы, такие как SARASAR™(4-[2-[4-[(11R)-3,10-дибром8-хлор-6, 11-дигидро-5Н-бензо[5,6]циклогепта[1,2-b]пиридин-11-ил]-1-пиперидинил]-2-оксоэтил]пиперидинкарбоксамид, типифарниб,24) farnesyl protein transferase inhibitors, such as SARASAR™(4-[2-[4-[(11R)-3,10-dibromo8-chloro-6, 11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2 -b]pyridin-11-yl]-1-piperidinyl]-2-oxoethyl]piperidinecarboxamide, tipifarnib,

25) интерфероны, такие как интрон А, ПегИнтрон,25) interferons, such as intron A, PegIntron,

26) антитела против erbB1, такие как цетуксимаб, панитумумаб,26) antibodies against erbB1, such as cetuximab, panitumumab,

27) антитела против erbB2, такие как трастузумаб,27) antibodies against erbB2, such as trastuzumab,

28) антитела против CD52, такие как алемтузумаб,28) anti-CD52 antibodies such as alemtuzumab,

29) антитела против CD20, такие как ритуксимаб,29) anti-CD20 antibodies such as rituximab,

- 55 043743- 55 043743

30) антитела против CD33, такие как гемтузумаба озогамицин,30) anti-CD33 antibodies such as gemtuzumab ozogamicin,

31) антитела против VEGF, такие как авастин,31) anti-VEGF antibodies such as Avastin,

32) лиганды TRIAL, такие как лексатумумаб, мапатумумаб и AMG-655,32) TRIAL ligands such as lexatumumab, mapatumumab and AMG-655,

33) антитела против CTLA-4, такие как ипилимумаб,33) antibodies against CTLA-4, such as ipilimumab,

34) антитела против СТА1, СЕА, CD5, CD19, CD22, CD30, CD44, CD44V6, CD55, CD56, ЕрСАМ, FAP, MHCII, HGF, IL-6, MUC1, PSMA, TAL6, TAG-72, TRAILR, VEGFR, IGF-2, FGF,34) antibodies against CTA1, CEA, CD5, CD19, CD22, CD30, CD44, CD44V6, CD55, CD56, EpCAM, FAP, MHCII, HGF, IL-6, MUC1, PSMA, TAL6, TAG-72, TRAILR, VEGFR, IGF-2, FGF,

35) антитела против IGF-1R, такие как далотузумаб (MK-0646) и робатумумаб (SCH 717454).35) antibodies against IGF-1R, such as dalotuzumab (MK-0646) and robatumumab (SCH 717454).

Термин модуляторы рецептора эстрогенов относится к соединениям, которые препятствуют или ингибируют связывание эстрогена с рецептором независимо от механизма. Примеры модуляторов рецептора эстрогенов включают, но не ограничены перечисленными: тамоксифен, ралоксифен, идоксифен, LY353381, LY117081, торемифен, фулвестрант, 4-[7-(2,2-диметил-1-оксопропокси-4-метил-2-[4-[2-(1пиперидинил)этокси]фенил] -2Н-1 -бензопиран-3-ил] -фенил-2,2-диметилпропаноат, 4,4'дигидроксибензофенон-2,4-динитрофенил-гидразон и SH646.The term estrogen receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of estrogen to the receptor, regardless of mechanism. Examples of estrogen receptor modulators include, but are not limited to: tamoxifen, raloxifene, idoxifene, LY353381, LY117081, toremifene, fulvestrant, 4-[7-(2,2-dimethyl-1-oxopropoxy-4-methyl-2-[4- [2-(1piperidinyl)ethoxy]phenyl]-2H-1-benzopyran-3-yl]-phenyl-2,2-dimethylpropanoate, 4,4'dihydroxybenzophenone-2,4-dinitrophenyl-hydrazone and SH646.

Термин модуляторы рецептора андрогенов относится к соединениям, которые препятствуют или ингибируют связывание андрогенов с рецептором независимо от механизма. Примеры модуляторов рецептора андрогенов включают финастерид и другие ингибиторы 5а-редуктазы, нилутамид, флутамид, бикалутамид, лиарозол и абиратерона ацетат.The term androgen receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of androgens to the receptor, regardless of mechanism. Examples of androgen receptor modulators include finasteride and other 5a-reductase inhibitors, nilutamide, flutamide, bicalutamide, liarozole and abiraterone acetate.

Термин модуляторы рецептора ретиноидов относится к соединениям, которые препятствуют или ингибируют связывание ретиноидов с рецептором независимо от механизма. Примеры таких модуляторов рецептора ретиноидов включают бексаротен, третиноин, 13-цис-ретиноевую кислоту, 9-цисретиноевую кислоту, α-дифторметилорнитин, ILX23-7553, транс-N-(4'-гидроксифенил)ретинамид и N-4карбоксифенилретинамид.The term retinoid receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of retinoids to the receptor, regardless of mechanism. Examples of such retinoid receptor modulators include bexarotene, tretinoin, 13-cis-retinoic acid, 9-cisretinoic acid, α-difluoromethylornithine, ILX23-7553, trans-N-(4'-hydroxyphenyl)retinamide and N-4carboxyphenylretinamide.

Цитотоксические/цитостатические агенты относятся к соединениям, которые индуцируют гибель клеток или ингибируют пролиферацию клеток, главным образом, путем непосредственного препятствования функционированию клетки, или ингибируют или препятствуют митозу клетки, включая алкилирующие агенты, факторы некроза опухоли, интеркаляторы, активируемые гипоксией соединения, ингибиторы микротрубочек/стабилизирующие микротрубочки агенты, ингибиторы митотических кинезинов, ингибиторы гистоновых дезацетилаз, ингибиторы киназ, участвующих в продвижении по митотическому делению, ингибиторы киназ, участвующих в путях передачи сигналов фактора роста и цитокинов, антиметаболиты, модификаторы биологического ответа, гормональные/антигормональные терапевтические агенты, гематопоэтические факторы роста, агенты для таргетной терапии на основе моноклональных антител, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы протеасомы, ингибиторы убиквитинлигазы и ингибиторы киназы aurora.Cytotoxic/cytostatic agents refer to compounds that induce cell death or inhibit cell proliferation, primarily by directly interfering with cell function, or inhibit or interfere with cell mitosis, including alkylating agents, tumor necrosis factors, intercalators, hypoxia-activated compounds, microtubule inhibitors/ microtubule stabilizing agents, mitotic kinesin inhibitors, histone deacetylases inhibitors, inhibitors of kinases involved in mitotic progression, inhibitors of kinases involved in growth factor and cytokine signaling pathways, antimetabolites, biological response modifiers, hormonal/antihormonal therapeutic agents, hematopoietic growth factors , monoclonal antibody targeted therapy agents, topoisomerase inhibitors, proteasome inhibitors, ubiquitin ligase inhibitors and aurora kinase inhibitors.

Примеры цитотоксических/цитостатических агентов включают, но не ограничены перечисленными: координационные соединения платины, сертенеф, кахектин, ифосфамид, тазонермин, лонидамин, карбоплатин, алтретамин, преднимустин, дибромдулцитол, ранимустин, фотемустин, недаплатин, оксалиплатин, темозоломид, гептаплатин, эстрамустин, импросульфантозилат, трофосфамид, нимустин, диброспидия хлорид, пумитепа, лобаплатин, сатраплатин, профиромицин, цисплатин, ирофулвен, дексифосфамид, цис-аминдихлор(2-метилпиридин)платину, бензилгуанин, глуфосфамид, GPX100, (транс, транс, транс)бис-мю-(гексан-1,6-диамин)-мю-[диамин-платина(II)]бис[диамин(хлор)платина(II)]тетрахлорид, диаризидинилспермин, триоксид мышьяка, 1-(11-додециламино-10-гидроксиундецил)-3,7-диметилксантин, зорубицин, идарубицин, даунорубицин, бизантрен, митоксантрон, пирарубицин, пинафид, валрубицин, амрубицин, антинеопластон, 3'-деамино-3'-морфолино-13-деоксо-10-гидроксикарминомицин, аннамицин, галарубицин, элинафид, MEN10755, 4-деметокси-3-деамино-3-азиридинил-4-метилсульфонилдаунорубицин (см. WO 00/50032).Examples of cytotoxic/cytostatic agents include, but are not limited to: platinum coordination compounds, sertenef, cachectin, ifosfamide, tazonermine, lonidamine, carboplatin, altretamine, prednimustine, dibromodulcitol, ranimustine, fotemustine, nedaplatin, oxaliplatin, temozolomide, heptaplatin, estramustine, improsulfanthozy lat, trophosfamide, nimustine, dibrospidium chloride, pumitepa, lobaplatin, satraplatin, profiromycin, cisplatin, irofulven, dexifosfamide, cis-amindichloro(2-methylpyridine)platinum, benzylguanine, glufosfamide, GPX100, (trans, trans, trans)bis-mu-(hexane) -1,6-diamine)-mu-[diamine-platinum(II)]bis[diamine(chloro)platinum(II)]tetrachloride, diarisidinylspermine, arsenic trioxide, 1-(11-dodecylamino-10-hydroxyundecyl)-3, 7-dimethylxanthine, zorubicin, idarubicin, daunorubicin, bisanthrene, mitoxantrone, pyrarubicin, pinafide, valrubicin, amrubicin, antineoplaston, 3'-deamino-3'-morpholino-13-deoxo-10-hydroxycarminomycin, annamycin, galarubicin, elinafide, MEN10755, 4-demethoxy-3-deamino-3-aziridinyl-4-methylsulfonyldaunorubicin (see. WO 00/50032).

Примером активируемого гипоксией соединения является тирапазамин.An example of a hypoxia-activated compound is tirapazamine.

Примеры ингибиторов протеасом включают, но не ограничены перечисленными: лактацистин и MLN-341 (велкейд).Examples of proteasome inhibitors include, but are not limited to: lactacystin and MLN-341 (Velcade).

Примеры ингибиторов микротрубочек/стабилизирующих микротрубочки агентов обычно включают таксаны. Конкретные соединения включают паклитаксел (таксол®), виндезина сульфат, 3',4'дидегидро-4'-дезокси-8'-норвинкалейкобластин, доцетаксол (таксотер®), ризоксин, доластатин, мивобулин изетионат, ауристатин, цемадотин, RPR109881, BMS184476, винфлунин, криптофицин, 2,3,4,5,6пентафтор-N-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамид, ангидровинбластин, N,N-диметил-L-валил-Lвалил-N-метил-L-валил-L-пролил-L-пролин-трет-бутиламид, TDX258, эпотилоны (см., например, патенты США № 6284781 и 6288237) и BMS188797.Examples of microtubule inhibitors/microtubule stabilizing agents typically include taxanes. Specific compounds include paclitaxel (Taxol®), vindesine sulfate, 3',4'didehydro-4'-deoxy-8'-norvincaleucoblastin, docetaxol (Taxotere®), rhizoxin, dolastatin, mivobulin isethionate, auristatin, cemadotin, RPR109881, BMS184476, vinflunine, cryptophycin, 2,3,4,5,6pentafluoro-N-(3-fluoro-4-methoxyphenyl)benzenesulfonamide, anhydrovine blastine, N,N-dimethyl-L-valyl-Lvalyl-N-methyl-L-valyl-L -prolyl-L-proline-tert-butylamide, TDX258, epothilones (see, for example, US Patent Nos. 6284781 and 6288237) and BMS188797.

Некоторые примеры ингибиторов топоизомеразы представляют собой топотекан, гикаптамин, иринотекан, рубитекан, 6-этоксипропионил-3',4'-О-экзо-бензилиден-чартреузин, 9-метокси-N,N-диметил-5нитропиразоло[3,4,5-k1]акридин-2-(6Н) пропанамин, 1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4метил-1H,12Н-бензо[де]пирано[3',4':b,7]-индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9Н,15Н)дион, луртотекан, 7[2-(N-изопропиламино)этил]-(20S)камптотецин, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, этопозида фосфат, тенипозид, собузоксан, 2'-диметиламино-2'-дезоксиэтопозид, GL331, N-[2-(диметиламино)этил]Some examples of topoisomerase inhibitors are topotecan, hycaptamine, irinotecan, rubitecan, 6-ethoxypropionyl-3',4'-O-exo-benzylidene-chartreusine, 9-methoxy-N,N-dimethyl-5nitropyrazolo[3,4,5- k1]acridine-2-(6H)propanamine, 1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4' :b,7]-indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)dione, lurtothecan, 7[2-(N-isopropylamino)ethyl]-(20S)camptothecin, BNP1350, BNPI1100, BN80915 , BN80942, etoposide phosphate, teniposide, sobuzoxane, 2'-dimethylamino-2'-deoxyetoposide, GL331, N-[2-(dimethylamino)ethyl]

- 56 043743- 56 043743

9-гидрокси-5,6-диметил-6Н-пиридо[4,3-Ь]карбазол-1-карбоксамид, асулакрин, (5а,5аВ,8aa,9b)-9-[2-[N-[2(диметиламино)этил]-М-метиламино]этил]-5-[4-гидроокси-3,5-диметоксифенил]-5,5а,6,8,8а,9гексогидрофуро(3',4':6,7)нафто(2,3-d)-1,3-диоксол-6-он, 2,3-(метилендиокси)-5-метил-7-гидрокси-8метоксибензо[с]-фенантридиний, 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион, 5-(3аминопропиламино)-7,10-дигидрокси-2-(2-гидроксиэтиламинометил)-6Н-пиразоло[4,5,1-de]акридин-6он, N-[1-[2(диэтиламино)этиламино]-7-метокси-9-оксо-9Н-тиоксантен-4-илметил]формамид, N-(2(диметиламино)этил)акридин-4-карбоксамид, 6-[[2-(диметиламино)этил]амино]-3-гидрокси-7Ниндено[2,1-с]хинолин-7-он и димесна.9-hydroxy-5,6-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole-1-carboxamide, asulacrine, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2(dimethylamino )ethyl]-M-methylamino]ethyl]-5-[4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl]-5,5a,6,8,8a,9hexohydrofuro(3',4':6,7)naphtho(2 ,3-d)-1,3-dioxol-6-one, 2,3-(methylenedioxy)-5-methyl-7-hydroxy-8methoxybenzo[c]phenanthridinium, 6,9-bis[(2-aminoethyl) amino]benzo[g]isoquinoline-5,10-dione, 5-(3aminopropylamino)-7,10-dihydroxy-2-(2-hydroxyethylaminomethyl)-6H-pyrazolo[4,5,1-de]acridin-6one, N-[1-[2(diethylamino)ethylamino]-7-methoxy-9-oxo-9H-thioxanthen-4-ylmethyl]formamide, N-(2(dimethylamino)ethyl)acridine-4-carboxamide, 6-[[ 2-(dimethylamino)ethyl]amino]-3-hydroxy-7Nindeno[2,1-c]quinolin-7-one and dimesna.

Примеры ингибиторов митотических кинезинов и, в частности, митотического кинезина KSP человека описаны в публикациях WO03/039460, WO03/050064, WO03/050122, WO03/049527, WO03/049679, WO03/049678, WO04/039774, WO03/079973, WO03/099211, WO03/105855, WO03/106417, WO04/037171, WO04/058148, WO04/058700, WO04/126699, WO05/018638, WO05/019206, WO05/019205, WO05/018547, WO05/017190, US2005/0176776. В некотором варианте реализации ингибиторы митотических кинезинов включают, но не ограничены перечисленными: ингибиторы KSP, ингибиторы MKLP1, ингибиторы CENP-E, ингибиторы MCKA и ингибиторы Rab6-KIFL.Examples of inhibitors of mitotic kinesins and, in particular, human mitotic kinesin KSP are described in publications WO03/039460, WO03/050064, WO03/050122, WO03/049527, WO03/049679, WO03/049678, WO04/039774, WO03/ 079973, WO03/ 099211, WO03/105855, WO03/106417, WO04/037171, WO04/058148, WO04/058700, WO04/126699, WO05/018638, WO05/019206, WO05/019205, WO05/0 18547, WO05/017190, US2005/0176776. In some embodiment, mitotic kinesin inhibitors include, but are not limited to, KSP inhibitors, MKLP1 inhibitors, CENP-E inhibitors, MCKA inhibitors, and Rab6-KIFL inhibitors.

Примеры ингибиторов гистоновых дезацетилаз включают, но не ограничены перечисленными: SAHA, TSA, оксамфлатин, PXD101, MG98 и скриптаид. Дополнительное описание других ингибиторов гистоновых дезацетилаз можно найти в следующей рукописи: Miller, Т.А. и др. J. Med. Chem. 46(24):5097-5116(2003).Examples of histone deacetylase inhibitors include, but are not limited to: SAHA, TSA, oxamflatin, PXD101, MG98 and scriptaid. Additional description of other histone deacetylase inhibitors can be found in the following manuscript: Miller, T.A. et al. J. Med. Chem. 46(24):5097–5116(2003).

Ингибиторы киназ, участвующих в продвижении по митотическому делению включают, но не ограничены перечисленными: ингибиторы киназы aurora, ингибиторы подобных Polo киназ (PLK; в частности, ингибиторы PLK-1), ингибиторы bub-1 и ингибиторы bub-R1. Примером ингибитора киназы aurora является VX-680.Inhibitors of kinases involved in mitotic progression include, but are not limited to: aurora kinase inhibitors, Polo-like kinase (PLK) inhibitors; particularly PLK-1 inhibitors, bub-1 inhibitors, and bub-R1 inhibitors. An example of an aurora kinase inhibitor is VX-680.

Антипролиферативные агенты включают антисмысловые РНК- и ДНК-олигонуклеотиды, такие как G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 и INX3001, и антиметаболиты, такие как эноцитабин, кармофур, тегафур, пентостатин, доксифлуридин, триметрексат, флударабин, капецитабин, галоцитабин, цитарабин окфосфат, фостеабин натрия гидрат, ралтитрексид, палтитрексид, эмитефур, тиазофурин, децитабин, нолатрексид, пеметрексед, нелзарабин, 2'-дезокси-2'-метилиденцитидин, 2'-фторметилен-2'дезоксицитидин, N-[5-(2,3-дигидробензофурил)сульфонил]-N'-(3,4-дихлорфенил)мочевина, N6-[4дезокси-4-[N2-[2(Е),4(Е)-тетрадекадиеноил]глициламино]-L-глицеро-В-L-манногептопиранозил]аденин, аплидин, эктеинасцидин, троксацитабин, 4-[2-амино-4-оксо-4,6,7,8-тетрагидро-3Н-пиримидино[5,4b][1,4]тиазин-6-ил-(S)-этил]-2,5-тиеноил-L-глутаминовая кислота, аминоптерин, 5-флуроурацил, аланозин, 11-ацетил-8-(карбамоилоксиметил)-4-формил-6-метокси-14-окса-1,11-диазатетрацикло(7,4,1,0,0)тетрадека-2,4,6-триен-9-иловый сложный эфир уксусной кислоты, свайнсонин, лометрексол, дексразоксан, метиониназа, 2'-циано-2'-дезокси-N4-пальмитоил-1-В-D-арабинофуранозила цитозин, 3аминопиридин-2-карбоксальдегидтиосемикарбазон и трастузумаб.Antiproliferative agents include antisense RNA and DNA oligonucleotides such as G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 and INX3001, and antimetabolites such as enocytabine, carmofur, tegafur, pentostatin, doxifluridine, trimetrexate, fludarabine, capecitabine, halocitabine, cytarabine oxophosphate, osteabin sodium hydrate, raltitrexide, paltitrexide, emitefur, thiazofurin, decitabine, nolatrexide, pemetrexed, nelzarabine, 2'-deoxy-2'-methylidenecytidine, 2'-fluoromethylene-2'deoxycytidine, N-[5-(2,3-dihydrobenzofuryl) sulfonyl]-N'-(3,4-dichlorophenyl)urea, N6-[4deoxy-4-[N2-[2(E),4(E)-tetradecadienoyl]glycylamino]-L-glycero-B-L-mannoheptopyranosyl ]adenine, aplidine, ecteinascidin, troxacitabine, 4-[2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimidino[5,4b][1,4]thiazin-6-yl-( S)-ethyl]-2,5-thienoyl-L-glutamic acid, aminopterin, 5-fluorouracil, alanosine, 11-acetyl-8-(carbamoyloxymethyl)-4-formyl-6-methoxy-14-oxa-1,11 -diazatetracyclo(7,4,1,0,0)tetradeca-2,4,6-trien-9-yl acetic acid ester, swainsonine, lometrexol, dexrazoxane, methioninase, 2'-cyano-2'-deoxy-N4 -palmitoyl-1-B-D-arabinofuranosyl cytosine, 3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone and trastuzumab.

Примеры агентов для таргетной терапии на основе моноклональных антител включают такие терапевтические агенты, в которых цитотоксические агенты или радиоактивные изотопы присоединены к моноклональному антителу, специфичному к раковой клетке или специфичному к целевой клетке. Примеры включают бексксар.Examples of monoclonal antibody targeted therapy agents include those therapeutic agents in which cytotoxic agents or radioactive isotopes are attached to a cancer cell-specific or target cell-specific monoclonal antibody. Examples include bexxar.

Ингибитор пренилпротеинтрансферазы относится к соединению, которое ингибирует любой один или любую комбинацию ферментов пренилпротеинтрансфераз, включая фарнезилпротеинтрансферазу (ФПТазу), геранилгеранилпротеинтрансферазу типа I (ГГПТазу-I) и геранилгеранилпротеинтрансферазу типа II (ГГПТазу-II, также называемую Rab-ГГПТазой).A prenyl protein transferase inhibitor refers to a compound that inhibits any one or any combination of prenyl protein transferase enzymes, including farnesyl protein transferase (FPTase), geranylgeranyl protein transferase type I (GGPTase-I), and geranylgeranyl protein transferase type II (GGPTase-II, also called Rab-GGPTase).

Примеры ингибиторов пренилпротеинтрансфераз можно найти в следующих публикациях и патентах: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, патенте США № 5420245, патенте США № 5523430, патенте США № 5532359, патенте США № 5510510, патенте США № 5589485, патенте США № 5602098, публикации европейского патента 0618221, публикации европейского патента 0675112, публикации европейского патента 0 604 181, публикации европейского патента 0 696 593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, патенте США № 5661152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, патенте США № 5571792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436 и патенте США № 5532359. Для примера роли ингибитора пренилпротеинтрансферазы в ангиогенезе см. European J. of Cancer, том 35, № 9, с. 1394-1401 (1999).Examples of prenylprotein transferase inhibitors can be found in the following publications and patents: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987 , US Patent No. 5420245, US Patent No. 5523430, US Patent No. 5532359, US Patent No. 5510510, US Patent No. 5589485, US Patent No. 5602098, European Patent Publication 0618221, European Patent Publication 0675112, European Patent Publication 0 604 181, European publications Patent 0 696 593, Wo 94/19357, Wo 95/08542, Wo 95/11917, Wo 95/12612, Wo 95/12572, Wo 95/10514, US Patent No. 5661152, Wo 95/10515, Wo 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, US patent No. 5571792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436 and US patent No. 5532359. For an example of the role of a prenylprotein transferase inhibitor in angiogenesis, see European J. of Cancer, vol. 35, no. 9, p. 1394-1401 (1999).

Термин ингибиторы ангиогенеза относится к соединениям, которые ингибируют образование новых кровеносных сосудов независимо от механизма. Примеры ингибиторов ангиогенеза включают, но не ограничены перечисленными: ингибиторы тирозинкиназы, такие как ингибиторы тирозинкиназных рецепторов Flt-1 (VEGFR1) и Flk-1/KDR (VEGFR2), ингибиторы эпидермальных факторов роста, факторовThe term angiogenesis inhibitors refers to compounds that inhibit the formation of new blood vessels regardless of mechanism. Examples of angiogenesis inhibitors include, but are not limited to: tyrosine kinase inhibitors, such as Flt-1 (VEGFR1) and Flk-1/KDR (VEGFR2) tyrosine kinase receptor inhibitors, inhibitors of epidermal growth factors,

- 57 043743 роста фибробластов или тромбоцитов, ингибиторы ММР (матриксной металлопротеиназы), блокатор интегрина, интерферон-α, интерлейкин-12, полисульфат пентозана, ингибиторы циклооксигеназы, включая нестероидные противовоспалительные средства (НПВП), такие как аспирин и ибупрофен, а также селективные ингибиторы циклооксигеназы-2, такие как целекоксиб и рофекоксиб (PNAS, том 89, с. 7384 (1992); JNCI, том 69, с. 475 (1982); Arch. Opthalmol, том 108, с. 573 (1990); Anal Rec, том 238, с. 68 (1994); FEBS Letters, том 372, с. 83 (1995); Clin, Orthop. том 313, с. 76 (1995); J. Mol. Endocrinol, том 16, с. 107 (1996); Jpn. J. Pharmacol, том 75, с. 105 (1997); Cancer Res., том 57, с. 1625 (1997); Cell, том 93, с. 705 (1998); Intl. J. Mol. Med., том 2, с. 715 (1998); J. Biol. Chem., том 274, с. 9116 (1999)), стероидные противовоспалительные средства (такие как кортикостероиды, минералокортикоиды, дексаметазон, преднизон, преднизолон, метилпред, бетаметазон), карбоксиамидотриазол, комбретастатин А-4, скваламин, 6-Охлорацетилкарбонилфумагиллол, талидомид, ангиостатин, тропонин-1, антагонисты ангиотензина II (см. Fernandez и др., J. Lab. Clin. Med. 105: 141-145 (1985)) и антитела к VEGF (см. Nature Biotechnology, том 17, с. 963-968 (October 1999); Kim и др., Nature, 362, 841-844 (1993); WO 00/44777 и WO 00/61186).- 57 043743 fibroblast or platelet growth, MMP (matrix metalloproteinase) inhibitors, integrin blocker, interferon-α, interleukin-12, pentosan polysulfate, cyclooxygenase inhibitors, including non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as aspirin and ibuprofen, as well as selective inhibitors cyclooxygenase-2, such as celecoxib and rofecoxib (PNAS vol. 89, p. 7384 (1992); JNCI, vol. 69, p. 475 (1982); Arch. Opthalmol, vol. 108, p. 573 (1990); Anal Rec , vol. 238, p. 68 (1994); FEBS Letters, vol. 372, p. 83 (1995); Clin, Orthop. vol. 313, p. 76 (1995); J. Mol. Endocrinol, vol. 16, p. 107 (1996); Jpn. J. Pharmacol, volume 75, page 105 (1997); Cancer Res., volume 57, page 1625 (1997); Cell, volume 93, page 705 (1998); Intl. J. Mol. Med., vol. 2, p. 715 (1998); J. Biol. Chem., vol. 274, p. 9116 (1999)), steroidal anti-inflammatory drugs (such as corticosteroids, mineralocorticoids, dexamethasone, prednisone, prednisolone, methylpred , betamethasone), carboxyamidotriazole, combretastatin A-4, squalamine, 6-Ochloroacetylcarbonylfumagillol, thalidomide, angiostatin, troponin-1, angiotensin II antagonists (see. Fernandez et al., J. Lab. Clin. Med. 105: 141-145 (1985)) and anti-VEGF antibodies (see Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 963-968 (October 1999); Kim et al., Nature, 362, 841-844 (1993); WO 00 /44777 and WO 00/61186).

Другие примеры ингибиторов ангиогенеза включают, но не ограничены перечисленными: эндостатин, украин, ранпирназу, IM862, 5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1оксаспиро[2,5]окт-6-ил(хлорацетил)карбамат, ацетилдинаналин, 5-амино-1-[[3,5-дихлор-4-(4хлорбензоил)фенил]метил]-1H-1,2,3-триазол-4-карбоксамид, СМ101, скваламин, комбретастатин, RPI4610, NX31838, сульфатизированный маннопентаозфосфат, 7,7-(карбонил-бис[имино-N-метил-4,2пирролокарбонилимино[М-метил-4,2-пиррол]карбонилимино]-бис-(1,3-нафталиндисульфонат) и 3-[(2,4диметилпиррол-5-ил)метилен]-2-индолинон (SU5416).Other examples of angiogenesis inhibitors include, but are not limited to: endostatin, ukrain, ranpirnase, IM862, 5-methoxy-4-[2-methyl-3-(3-methyl-2-butenyl)oxiranyl]-1oxaspiro[2,5] oct-6-yl(chloroacetyl)carbamate, acetyldinanaline, 5-amino-1-[[3,5-dichloro-4-(4chlorobenzoyl)phenyl]methyl]-1H-1,2,3-triazole-4-carboxamide, CM101, squalamine, combretastatin, RPI4610, NX31838, sulfated mannopentaose phosphate, 7,7-(carbonyl-bis[imino-N-methyl-4,2pyrrolocarbonylimino[M-methyl-4,2-pyrrole]carbonylimino]-bis-(1, 3-naphthalene disulfonate) and 3-[(2,4dimethylpyrrol-5-yl)methylene]-2-indolinone (SU5416).

Другие терапевтические агенты, которые модулируют или ингибируют ангиогенез и также могут применяться в комбинации с соединениями согласно настоящему изобретению, включают агенты, которые модулируют или ингибируют системы свертывания крови и фибринолиза (обзор см. в Clin. Chem. La. Med. 38:679-692 (2000)). Примеры таких агентов, которые модулируют или ингибируют пути свертывания крови и фибринолиза, включают, но не ограничены перечисленными: гепарин (см. Thromb. Haemost. 80:10-23 (1998)), низкомолекулярные гепарины и ингибиторы карбоксипептидазы U (также известные как ингибиторы активного ингибитора активируемого тромбином фибринолиза [TAFIa]) (см. Thrombosis Res. 101:329-354 (2001)). Ингибиторы TAFIa были описаны в заявках США, серийный номер 60/310927 (поданной 8 августа 2001 г.) и 60/349925 (поданной 18 января 2002 г.)Other therapeutic agents that modulate or inhibit angiogenesis and may also be used in combination with the compounds of the present invention include agents that modulate or inhibit the coagulation and fibrinolytic systems (for a review, see Clin. Chem. La. Med. 38:679- 692 (2000)). Examples of such agents that modulate or inhibit the coagulation and fibrinolysis pathways include, but are not limited to: heparin (see Thromb. Haemost. 80:10-23 (1998)), low molecular weight heparins, and carboxypeptidase U inhibitors (also known as inhibitors active inhibitor of thrombin-activated fibrinolysis [TAFIa]) (see Thrombosis Res. 101:329-354 (2001)). TAFIa inhibitors were described in US Application Serial Nos. 60/310927 (filed August 8, 2001) and 60/349925 (filed January 18, 2002)

Агенты, которые препятствуют контрольным точкам клеточного цикла, относятся к соединениям, которые ингибируют протеинкиназы, которые передают сигналы контрольных точек клеточного цикла, тем самым сенсибилизируя раковую клетку к повреждающим ДНК агентам. Такие агенты включают ингибиторы киназ ATR, ATM, CHK11 и CHK12 и ингибиторы киназ cdk и cdc, и, в частности, примерами таких агентов служат 7-гидроксистауроспорин, флавопиридол, CYC202 (Cyclacel) и BMS-387032.Agents that interfere with cell cycle checkpoints refer to compounds that inhibit protein kinases that transmit cell cycle checkpoint signals, thereby sensitizing the cancer cell to DNA-damaging agents. Such agents include ATR, ATM, CHK11 and CHK12 kinase inhibitors and cdk and cdc kinase inhibitors, and in particular, examples of such agents include 7-hydroxystaurosporine, flavopiridol, CYC202 (Cyclacel) and BMS-387032.

Агенты, которые препятствуют рецепторным тирозинкиназам (RTK), относятся к соединениям, которые ингибируют RTK и, следовательно, механизмы, вовлеченные в онкогенез и прогрессирование опухоли. Такие агенты включают ингибиторы c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 и c-Met. Дополнительные агенты включают ингибиторы RTK, описанные у Bume-Jensen и Hunter, Nature, 411:355-365, 2001.Agents that interfere with receptor tyrosine kinases (RTKs) refer to compounds that inhibit RTKs and therefore mechanisms involved in tumorigenesis and tumor progression. Such agents include inhibitors of c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 and c-Met. Additional agents include RTK inhibitors described in Bume-Jensen and Hunter, Nature, 411:355-365, 2001.

Ингибиторы пути передачи сигнала пролиферации клеток и выживаемости относятся к соединениям, которые ингибируют сигнальные каскады от рецепторов на поверхности клетки. Такие агенты включают ингибиторы серин/треонинкиназ (включая, но не ограничиваясь ингибиторами Akt, такими как описанные в WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, 60/734188, 60/652737, 60/670469), ингибиторами киназы Raf (например, PLX-4032), ингибиторами MEK (например, Arry-162, RO-4987655 и GSK-1120212), ингибиторами mTOR (например, AZD-8055, BEZ-235 и эверолимусом) и ингибиторами PI3K (например, GDC-0941, BKM-120).Cell proliferation and survival signaling pathway inhibitors refer to compounds that inhibit signaling cascades from cell surface receptors. Such agents include serine/threonine kinase inhibitors (including but not limited to Akt inhibitors such as those described in WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/0961 35, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, 60/734188, 60/652737, 60/670469), Raf kinase inhibitors (for example, PLX-4032), inhibitors MEK (eg Arry-162, RO-4987655 and GSK-1120212), mTOR inhibitors (eg AZD-8055, BEZ-235 and everolimus) and PI3K inhibitors (eg GDC-0941, BKM-120).

Используемый выше термин блокаторы интегрина относится к соединениям, которые селективно антагонизируют, ингибируют или противодействуют связыванию физиологического лиганда с интегрином αγβ3, к соединениям, которые избирательно антагонизируют, ингибируют или противодействуют связыванию физиологического лиганда с интегрином αγβ5, к соединениям, которые антагонизируют, ингибируют или противодействуют связыванию физиологического лиганда как с интегрином ave3, так и с интегрином aJL, и к соединениям, которые антагонизируют, ингибируют или противодействуют активности конкретного(ых) интегрина(ов), экспрессированного(ых) на эндотелиальных клетках капилляра. Термин также относится к антагонистам интегринов ave6, ave8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, и α6β4. Термин также относится к антагонистам любой комбинации интегринов ave3, α„β, ave8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1 и α6β4.As used above, the term integrin blockers refers to compounds that selectively antagonize, inhibit or antagonize the binding of a physiological ligand to α γ β 3 integrin, compounds that selectively antagonize, inhibit or antagonize the binding of a physiological ligand to α γ β 5 integrin, compounds that antagonize, inhibit or antagonize the binding of physiological ligand to both integrin ave 3 and integrin aJL, and to compounds that antagonize, inhibit or antagonize the activity of specific integrin(s) expressed on capillary endothelial cells . The term also refers to antagonists of integrins ave 6 , ave 8 , α1β1, α2β1 , α5β1 , α6β1 , and α6β4 . The term also refers to antagonists of any combination of integrins a v e 3 , α„β, a v e 8 , α1β1, α2 β1, α5 β1, α6 β1 and α6β4 .

Некоторые конкретные примеры ингибиторов тирозинкиназы включают N-(трифторметилфенил)-5метилизоксазол-4-карбоксамид, 3-[(2,4-диметилпиррол-5-ил)метилиденил)индолин-2-он, 17(аллиламино)-17-деметоксигелданамицин, 4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-метокси-6-[3-(4- 58 043743 морфолинил)пропоксил]хиназолин, №(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин,Some specific examples of tyrosine kinase inhibitors include N-(trifluoromethylphenyl)-5methylisoxazole-4-carboxamide, 3-[(2,4-dimethylpyrrol-5-yl)methylidenyl)indolin-2-one, 17(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin, 4 -(3-chloro-4-fluorophenylamino)-7-methoxy-6-[3-(4- 58 043743 morpholinyl)propoxy]quinazoline, N(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)-4 -quinazolinamine,

BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-гексагидро-10-(гидроксиметил)-10-гидрокси-9-метил-9,12-эиокси-1Hдииндоло[1,2,3-fg:3',2',Γ-k1]иирроло[3,4-i][1,6]бензодиазоцин-1-он, SH268, генистеин, STI571, СЕР2563, 4-(3-хлорфениламино)-5,6-диметил-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидинметан сульфонат, 4-(3-бром-4гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин, 4-(4'-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин, SU6668, STI571A, N-4-хлорфенил-4-(4-пиридилметил)-1-фталазинамин HEMD121974.BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-hexahydro-10-(hydroxymethyl)-10-hydroxy-9-methyl-9,12-eioxy-1Hdiindolo[1,2,3-fg:3',2 ',Γ-k1]iirrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocin-1-one, SH268, genistein, STI571, CEP2563, 4-(3-chlorophenylamino)-5,6-dimethyl-7H-pyrrolo [2,3-d]pyrimidinemethane sulfonate, 4-(3-bromo-4hydroxyphenyl)amino-6,7-dimethoxyquinazoline, 4-(4'-hydroxyphenyl)amino-6,7-dimethoxyquinazoline, SU6668, STI571A, N-4 -chlorophenyl-4-(4-pyridylmethyl)-1-phthalazinamine HEMD121974.

Комбинации заявленных в настоящей заявке антител или антигенсвязывающих фрагментов с агонистами PPAR-γ (т.е. PPAR-гамма) и агонистами PPAR-δ (т.е. PPAR-дельта) могут быть полезны для лечения некоторых злокачественных новообразований. PPAR-γ и PPAR-δ представляют собой ядерные рецепторы γ и δ, активируемые пролифераторами пероксисом. Экспрессия PPAR-γ на эндотелиальных клетках и их участие в ангиогенезе было описано в литературе (см. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31: 909-913; J. Biol. Chem. 1999; 274: 9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2000; 41: 2309-2317). Совсем недавно, было показано, что агонисты PPAR-γ ингибируют ангиогенный ответ на VEGF in vitro: малеат как троглитазона, так и росиглитазона ингибирует развитие неоваскуляризации сетчатки у мышей (Arch. Ophthamol. 2001; 119: 709-717). Примеры агонистов PPAR-γ и агонистов PPAR- γ/α включают, но не ограничены перечисленными: линпарзу®, рукапариб®, талазопариб®, нирапариб, велипариб®, тиазолидиндионы (такие как DRF2725, CS-011, троглитазон, росиглитазон и пиоглитазон), фенофибрат, гемфиброзил, клофибрат, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, МСС-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-дипропил-3трифторметил-1,2-бензизоксазол-6-ил)окси]-2-метилпропионовую кислоту и 2(R)-7-(3-(2-хлор-4-(4фторфенокси)фенокси)пропокси)-2-этилхроман-2-карбоновую кислоту.Combinations of the antibodies or antigen-binding fragments claimed herein with PPAR-γ agonists (ie, PPAR-gamma) and PPAR-δ agonists (ie, PPAR-delta) may be useful for the treatment of certain malignancies. PPAR-γ and PPAR-δ are peroxisome proliferator-activated nuclear receptors γ and δ. The expression of PPAR-γ on endothelial cells and their involvement in angiogenesis has been described in the literature (see J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31: 909-913; J. Biol. Chem. 1999; 274: 9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis Sci 2000;41:2309-2317). More recently, PPAR-γ agonists have been shown to inhibit the angiogenic response to VEGF in vitro: both troglitazone and rosiglitazone maleate inhibit the development of retinal neovascularization in mice (Arch. Ophthamol. 2001; 119: 709-717). Examples of PPAR-γ agonists and PPAR-γ/α agonists include, but are not limited to: linparza®, rucaparib®, talazoparib®, niraparib, veliparib®, thiazolidinediones (such as DRF2725, CS-011, troglitazone, rosiglitazone and pioglitazone), fenofibrate, gemfibrozil, clofibrate, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU1827 16, DRF552926, 2-[(5.7- dipropyl-3trifluoromethyl-1,2-benzisoxazol-6-yl)oxy]-2-methylpropionic acid and 2(R)-7-(3-(2-chloro-4-(4fluorophenoxy)phenoxy)propoxy)-2-ethylchroman -2-carboxylic acid.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению также могут быть полезны для лечения или предотвращения рака молочной железы в комбинации с ингибиторами ароматазы. Примеры ингибиторов ароматазы включают, но не ограничены перечисленными: анастрозол, летрозол и эксеместан.The antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention may also be useful for the treatment or prevention of breast cancer in combination with aromatase inhibitors. Examples of aromatase inhibitors include, but are not limited to, anastrozole, letrozole, and exemestane.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению также может быть полезен для лечения рака в комбинации со следующими химиотерапевтическими агентами: абареликс (пленаксис депо®); альдеслейкин (прокин®); альдеслейкин (пролейкин®); алемтузумаб (кэмпас®); алитретиноин (панретин®); аллопуринол (зилоприм®); алтретамин (гексален®); амифостин (этиол®); анастрозол (аримидекс®); триоксид мышьяка (тризенокс®); аспарагиназа (элспар®); азацитидин (вайдаза®); бендамустина гидрохлорид (треанда®); бевацизумаб (авастин®); капсулы бексаротен (таргретин®); гель бексаротен (таргретин®); блеомицин (бленоксан®); бортезомиб (велкейд®); брефельдин А; бусульфан внутривенный (бусульфекс®); бусульфан пероральный (милеран®); калустерон (метосарб®); капецитабин (кселода®); карбоплатин (параплатин®); кармустин (BCNU®, BiCNU®); кармустин (глиадел®); кармустин с полифепросаном 20, имплантат (глиадел вафер®); целекоксиб (целебрекс®); цетуксимаб (эрбитукс®); хлорамбуцил (лейкеран®); цисплатин (платинол®); кладрибин (леустатин®, 2CdA®); клофарабин (клолар®); циклофосфамид (цитоксан®, неозар®); циклофосфамид (цитоксан инъекционный®); циклофосфамид (цитоксан таблетка®); цитарабин (цитозар-U®); цитарабин липосомальный (депоцит®); дакарбазин (DTIC-дом®); дактиномицин, актиномицин D (космеген®); далтепарин натрия инъекционный (фрагмин®); даратумумаб (дарзалекс®); дарбэпоэтин альфа (аранесп®); дазатиниб (спрайсел®); даунорубицин липосомальный (даунозом®); даунорубицин, дауномицин (даунорубицин®); даунорубицин, дауномицин (церубидин®); дегареликс (фирмагон®); денилейкин дифтитокс (онтак®); дексразоксан (зинекард®); дексразоксана гидрохлорид (тотект®); дидемнин В; 17-DMAG; доцетаксел (таксотер®); доксорубицин (адриамицин PFS®); доксорубицин (адриамицин®, рубекс®); доксорубицин (адриамицин PFS инъекционный®); доксорубицин липосомальный (доксил®); дромостанолона пропионат (дромостанолон®); дромостанолона пропионат (мастерон инъекционный®); экулизумаб инъекционный (солирис®); раствор Эллиота В (раствор ЭллиотаВ®); элтромбопаг (промакта®); эпирубицин (элленс®); эпоэтин альфа (эпоген®); эрлотиниб (тарцева®); эстрамустин (эмцит®); этинилэстрадиол; этопозида фосфат (этопофос®); этопозид, VP-16 (вепезид®); эверолимус таблетки (афинитор®); эксеместан (аромазин®); ферумокситол (ферагем инъекционный®); филграстим (нейпоген®); флоксуридин (интраартериальный) (FUDR®); флударабин (флудара®); фторурацил, 5-FU (адруцил®); фулвестрант (фазлодекс®); гефитиниб (пресса®); гелданамицин; гемцитабин (гемзар®); гемтузумаб озогамицин (милотарг®); гозерелин ацетат (золадекс имплантат®); гозерелина ацетат (золадекс®); гистрелина ацетат (гистрелин имплантат®); гидроксимочевина (гидреа®); ибритумомаб тиуксетан (зевалин®); идарубицин (идамицин®); ифосфамид (IFEX®); иматиниба мезилат (гливек®); интерферон альфа 2а (роферон А®); интерферон альфа-2Ь (интрон А ®); йобенгуан I 123 инъекционный (адревью®); иринотекан (камптозар®); иксабепилон (иксемпра®); лапатиниб таблетки (тайкерб®); леналидомид (ревлимид®); летрозол (фемара®); лейковорин (велковорин®, лейковорин®); лейпролида ацетат (элигард®); левамизол (эргамизол®); ломустин, CCNU (CeeBU®); мехлорэтамин, азотистый иприт (мустарген®); мегестро- 59 043743 ла ацетат (мегейс®); мелфалан, L-PAM (алкеран®); меркаптопурин, 6-МР (пуринтол®); месна (меснекс®); месна (меснекс табс®); метотрексат (метотрексат®); метоксален (увадекс®); 8метоксипсорален; митомицин С (мутамицин®); митотан (лизодрен®); митоксантрон (новантрон®); митрамицин; нандролона фенилпропионат (дураболин-50®); неларабин (арранон®); нилотиниб (тасигна®); нофетумомаб (верлума®); офатумумаб (арзерра®); опрелвекин (ньюмега®); оксалиплатин (элоксатин®); паклитаксел (паксен®); паклитаксел (таксол®); связанные с белком частицы паклитаксела (абраксан®); палифермин (кепиванс®); памидронат (аредиа®); панитумумаб (вектибикс®); пазопаниб таблетки (вотриент®); пегадемаза (адаген (пегадемаза бычья)®); пэгаспаргаза (онкаспар®); пэгфилграстим (неуласта®); пеметрексед динатрия (алимта®); пентостатин (нипент®); пипоброман (верцит®); плериксафор (мозобаил®); пликамицин, митрамицин (митрацин®); порфимер натрия (фотофрин®); пралатрексат инъекционный (фолотин®); прокарбазин (матулан®); хинакрин (атабрин®); рапамицин; расбуриказа (элитек®); ралоксифена гидрохлорид (эвиста®); ритуксимаб (ритуксан®); ромидепсин (истодакс®); ромиплостим (энплейт®); сарграмостим (лейкин®); сарграмостим (прокин®); сорафениб (нексавар®); стрептозоцин (заносар®); сунитиниба малеат (сутент®); тальк (склерозол®); тамоксифен (нолвадекс®); темозоломид (темодар®); темсиролимус (торизел®); тенипозид, VM-26 (вумон®); тестолактон (теслак®); тиогуанин, 6-TG (тиогуанин®); тиопурин; тиотепа (тиоплекс®); топотекан (гикамтин®); торемифен (фарестон®); тозитумомаб (бексксар®); тозитумомабЯ-131, тозитумомаб (бексксар®); трансретиноевая кислота; трастузумаб (герцептин®); третиноин, ATRA (весаноид®); триэтиленмеламин; урациловый иприт (урациловый иприт капсулы®); валрубицин (валстар®); винбластин (велбан®); винкристин (онковин®); винорелбин (навельбин®); вориностат (золинза®); вортманнин и золедронаат (зомета®).The antibody or antigen binding fragment thereof of the present invention may also be useful for the treatment of cancer in combination with the following chemotherapeutic agents: Abarelix (Plenaxis Depot®); aldesleukin (Prokin®); aldesleukin (proleukin®); alemtuzumab (Campas®); Alitretinoin (Panretin®); allopurinol (Zyloprim®); altretamine (hexalene®); amifostine (ethiol®); anastrozole (arimidex®); arsenic trioxide (trizenox®); asparaginase (elspar®); azacitidine (Vidaza®); bendamustine hydrochloride (Treanda®); bevacizumab (Avastin®); bexarotene capsules (Targretin®); bexarotene gel (targretin®); bleomycin (blenoxan®); bortezomib (Velcade®); brefeldin A; intravenous busulfan (busulfex®); oral busulfan (Mileran®); calusterone (metosarb®); capecitabine (Xeloda®); carboplatin (paraplatin®); carmustine (BCNU®, BiCNU®); carmustine (Gliadel®); carmustine with polypheprosan 20, implant (Gliadel Wafer®); celecoxib (Celebrex®); cetuximab (Erbitux®); chlorambucil (Leukeran®); cisplatin (platinol®); cladribine (leustatin®, 2CdA®); clofarabine (Clolar®); cyclophosphamide (Cytoxan®, Neozar®); cyclophosphamide (cytoxan injection®); cyclophosphamide (cytoxan tablet®); cytarabine (Cytosar-U®); cytarabine liposomal (Depocyt®); dacarbazine (DTIC-dom®); dactinomycin, actinomycin D (cosmegen®); dalteparin sodium injection (Fragmin®); daratumumab (Darzalex®); darbepoetin alfa (aranesp®); dasatinib (Sprycel®); liposomal daunorubicin (daunosom®); daunorubicin, daunomycin (daunorubicin®); daunorubicin, daunomycin (cerubidin®); degarelix (Firmagon®); denileukin diftitox (Ontak®); dexrazoxane (Zinecard®); dexrazoxane hydrochloride (Totect®); didemnin B; 17-DMAG; docetaxel (Taxotere®); doxorubicin (Adriamycin PFS®); doxorubicin (Adriamycin®, Rubex®); doxorubicin (Adriamycin PFS injection®); doxorubicin liposomal (Doxil®); dromostanolone propionate (dromostanolone®); dromostanolone propionate (Masteron injection®); eculizumab injection (soliris®); Elliott B solution (Elliott B® solution); eltrombopag (Promacta®); epirubicin (Ellens®); Epoetin alfa (Epogen®); erlotinib (Tarceva®); estramustine (Emcyt®); ethinyl estradiol; etoposide phosphate (etopophos®); etoposide, VP-16 (Vepezid®); everolimus tablets (Afinitor®); exemestane (Aromasin®); ferumoxytol (feragem injection®); filgrastim (Neupogen®); floxuridine (intra-arterial) (FUDR®); fludarabine (fludara®); fluorouracil, 5-FU (adrucil®); fulvestrant (Faslodex®); gefitinib (press®); geldanamycin; gemcitabine (gemzar®); gemtuzumab ozogamicin (mylotarg®); goserelin acetate (zoladex implant®); goserelin acetate (Zoladex®); histrelin acetate (histrelin implant®); hydroxyurea (Hydrea®); ibritumomab tiuxetan (Zevalin®); idarubicin (idamycin®); ifosfamide (IFEX®); imatinib mesylate (Gleevec®); interferon alpha 2a (roferon A®); interferon alpha-2b (intron A ®); iobenguane I 123 injection (adreview®); irinotecan (Camptosar®); ixabepilone (ixempra®); lapatinib tablets (Tykerb®); lenalidomide (Revlimid®); letrozole (Femara®); leucovorin (velcovorin®, leucovorin®); leuprolide acetate (Eligard®); levamisole (ergamisole®); lomustine, CCNU (CeeBU®); mechlorethamine, nitrogen mustard (mustargen®); megestro- 59 043743 la acetate (megace®); melphalan, L-PAM (alkeran®); mercaptopurine, 6-MP (purinthol®); mesna (mesnex®); mesna (mesnex tabs®); methotrexate (methotrexate®); methoxalene (Uvadex®); 8methoxypsoralen; mitomycin C (mutamycin®); mitotane (lysodren®); mitoxantrone (novantrone®); mithramycin; nandrolone phenylpropionate (durabolin-50®); nelarabine (arranone®); nilotinib (Tasigna®); nofetumomab (Verluma®); ofatumumab (Arzerra®); oprelvequin (Nyumega®); oxaliplatin (eloxatin®); paclitaxel (Paxen®); paclitaxel (Taxol®); protein-bound particles of paclitaxel (Abraxane®); palifermin (Cepivance®); pamidronate (Aredia®); panitumumab (Vectibix®); pazopanib tablets (votrient®); pegademase (adagen (bovine pegademase)®); pegaspargase (oncaspar®); pegfilgrastim (neulasta®); pemetrexed disodium (Alimta®); pentostatin (Nipent®); Pipobroman (Vercit®); plerixafor (mozobail®); plicamycin, mithramycin (mitracin®); sodium porfimer (Photofrin®); injectable pralatrexate (folotin®); procarbazine (Matulan®); quinacrine (atabrine®); rapamycin; rasburicase (Elitek®); raloxifene hydrochloride (Evista®); rituximab (Rituxan®); romidepsin (Istodax®); romiplostim (enplate®); sargramostim (Leukin®); sargramostim (Prokin®); sorafenib (Nexavar®); streptozocin (Zanosar®); sunitinib maleate (Sutent®); talc (sclerozol®); tamoxifen (Nolvadex®); temozolomide (Temodar®); temsirolimus (Torisel®); teniposide, VM-26 (Vumon®); testolactone (teslak®); thioguanine, 6-TG (thioguanine®); thiopurine; thiotepa (thioplex®); topotecan (hycamtin®); toremifene (Fareston®); tositumomab (Bexxar®); tositumomabY-131, tositumomab (Bexxar®); transretinoic acid; trastuzumab (Herceptin®); tretinoin, ATRA (vesanoid®); triethylenemelamine; uracil mustard (uracil mustard capsules®); valrubicin (Valstar®); vinblastine (Velban®); vincristine (Oncovin®); vinorelbine (navelbine®); vorinostat (Zolinza®); wortmannin and zoledronaate (Zometa®).

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению находится в сочетании с одним или более противорвотными средствами, включая, но не ограничиваясь перечисленными: казопитант (GlaxoSmithKline), нетупитант (MGI-Helsinn) и другие антагонисты рецептора NK-1, палоносетрон (реализуемый как Алокси от MGI Pharma), апрепитант (реализуемый как эменд от Merck & Co.; Рауэй, НьюДжерси), дифенгидрамин (реализуемый как бенадрил® от Pfizer; Нью-Йорк, Нью-Йорк), гидроксизин (реализуемый как атаракс® от Pfizer; Нью-Йорк, Нью-Йорк), метоклопрамид (реализуемый как реглан® от АН Robins Co; Ричмонд, Виргиния), лоразепам (реализуемый как ативан® от Wyeth; Мадисон, НьюДжерси), алпразолам (реализуемый как ксанакс® от Pfizer; Нью-Йорк, Нью-Йорк), галоперидол (реализуемый как галдол® от Ortho-McNeil; Раритан, Нью-Джерси), дроперидол (инапсин®), дронабинол (реализуемый как маринол® от Solvay Pharmaceuticals, Inc.; Мариетта, Джорджия), дексаметазон (реализуемый как декадрон® от Merck & Co.; Рауэй, Нью-Джерси), метилпреднизолон (реализуемый как медрол® от Pfizer; Нью-Йорк, Нью-Йорк), прохлорперазин (реализуемый как компазин® от Glaxosmithkline; Парк Исследовательский треугольник, Северная Каролина), гранисетрон (реализуемый как китрил® от Hoffmann-La Roche Inc.; Натли, Нью-Джерси), ондансетрон (реализуемый как зофран® от Glaxosmithkline; Парк Исследовательский треугольник, Северная Каролина), доласетрон (реализуемый как анземет® от Sanofi-Aventis; Нью-Йорк, Нью-Йорк), трописетрон (реализуемый как навобан® от Novartis; Ист Ганновер, Нью-Джерси).In one embodiment of the present invention, the anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is in combination with one or more antiemetics, including, but not limited to: casopitant (GlaxoSmithKline), netupitant (MGI-Helsinn) and other NK-receptor antagonists. 1, palonosetron (marketed as Aloxi from MGI Pharma), aprepitant (marketed as Emend from Merck &Co.; Rahway, NJ), diphenhydramine (marketed as Benadryl® from Pfizer; New York, NY), hydroxyzine (marketed as atarax® from Pfizer; New York, NY), metoclopramide (marketed as Raglan® from AN Robins Co; Richmond, VA), lorazepam (marketed as Ativan® from Wyeth; Madison, NJ), alprazolam (marketed as Xanax® from Pfizer; New York, New York), haloperidol (marketed as Haldol® from Ortho-McNeil; Raritan, NJ), droperidol (inapsin®), dronabinol (marketed as Marinol® from Solvay Pharmaceuticals, Inc.; Marietta , Georgia), dexamethasone (marketed as Decadron® from Merck &Co.; Rahway, NJ), methylprednisolone (marketed as Medrol® from Pfizer; New York, NY), prochlorperazine (marketed as Compazine® from Glaxosmithkline; Research Triangle Park, NC), granisetron (marketed as Kytril® from Hoffmann -La Roche Inc.; Nutley, NJ), ondansetron (marketed as Zofran® from Glaxosmithkline; Research Triangle Park, NC), dolasetron (marketed as Anzemet® from Sanofi-Aventis; New York, NY), tropisetron (marketed as Navobane® from Novartis; East Hanover, NJ).

Другие побочные действия от лечения рака включают недостаточность красных и белых клеток крови. Соответственно, в одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент находится в сочетании с агентом, который лечит или предотвращает такую недостаточность, таким как, например, филграстим, ПЭГ-филграстим, эритропоэтин, эпоэтин альфа или дарбэпоэтин альфа.Other side effects from cancer treatment include a deficiency of red and white blood cells. Accordingly, in one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof is in combination with an agent that treats or prevents such deficiency, such as, for example, filgrastim, PEG-filgrastim, erythropoietin, epoetin alfa, or darbepoetin alfa.

В одном варианте реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в сочетании с противораковой лучевой терапией. Например, в одном варианте реализации настоящего изобретения лучевая терапия представляет собой дистанционную лучевую терапию (ЕВТ): способ доставки пучка рентгеновских лучей высоких энергий в местонахождение опухоли. Луч генерируют снаружи пациента (например, с помощью линейного ускорителя) и направляют в очаг опухоли. Данные рентгеновские лучи могут уничтожить раковые клетки, и тщательное планирование лечения позволяет сберечь окружающие нормальные ткани. Никакие радиоактивные источники не помещают внутрь организма пациента. В одном варианте реализации настоящего изобретения лучевая терапия представляет собой протонную лучевую терапию: тип конформной терапии, при которой больную ткань бомбардируют протонами вместо рентгеновских лучей. В одном варианте реализации настоящего изобретения лучевая терапия представляет собой конформную дистанционную лучевую терапию: процедуру, в которой применяют передовую технологию, чтобы адаптировать лучевую терапию для структур тела индивида. В одном варианте реализации настоящего изобретения лучевая терапия представляет собой брахитерапию: временное помещение радиоактивных материалов внутрь организма, обычно используемое для доставки дополнительной дозы - или очаговойIn one embodiment of the present invention, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention is administered in combination with anticancer radiation therapy. For example, in one embodiment of the present invention, the radiation therapy is external beam radiation therapy (EBT): a method of delivering a beam of high energy X-rays to the location of a tumor. The beam is generated from outside the patient (for example, using a linear accelerator) and directed to the tumor site. These X-rays can destroy cancer cells, and careful treatment planning can spare surrounding normal tissue. No radioactive sources are placed inside the patient's body. In one embodiment of the present invention, the radiation therapy is proton radiation therapy: a type of conformal therapy in which diseased tissue is bombarded with protons instead of X-rays. In one embodiment of the present invention, the radiation therapy is conformal external beam radiation therapy: a procedure that uses advanced technology to tailor the radiation therapy to an individual's body structures. In one embodiment of the present invention, radiation therapy is brachytherapy: the temporary placement of radioactive materials inside the body, typically used to deliver an additional dose - or focal

- 60 043743 дозы - радиации в данную область.- 60 043743 doses - radiation to this area.

В одном варианте реализации настоящего изобретения хирургическая процедура, которую проводят в сочетании с антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом, представляет собой хирургическую туморэктомию.In one embodiment of the present invention, the surgical procedure that is performed in combination with an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof is a surgical tumorectomy.

Применения в экспериментах и для диагностики.Applications in experiments and diagnostics.

Антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно применять в качестве агентов для аффинной очистки. В данном процессе антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола из сефадекса, стекла или агарозы или фильтровальная бумага, применяя способы, хорошо известные в данной области. Иммобилизованное антитело или фрагмент приводят в контакт с образцом, содержащим белок SIRPa (или его фрагмент), который нужно очистить, и после этого подложку промывают подходящим растворителем, который удалит по существу весь содержащийся в образце материал, кроме белка SIRPa, который связан с иммобилизованным антителом или фрагментом. Наконец, подложку промывают растворителем, который элюирует связанный SIRPa (например, белком А). Такие иммобилизованные антитела и фрагменты входят в объем настоящего изобретения.Antibodies against SIRPa and their antigen binding fragments described in this invention can be used as agents for affinity purification. In this process, anti-SIRPa antibodies and antigen-binding fragments thereof are immobilized on a solid phase, such as Sephadex, glass or agarose resin or filter paper, using methods well known in the art. The immobilized antibody or fragment is brought into contact with a sample containing the SIRPa protein (or fragment thereof) to be purified, and thereafter the support is washed with a suitable solvent that will remove substantially all of the material contained in the sample other than the SIRPa protein that is bound to the immobilized antibody. or a fragment. Finally, the support is washed with a solvent that elutes bound SIRPa (eg, protein A). Such immobilized antibodies and fragments are within the scope of the present invention.

Дополнительно предложены антигены для получения вторичных антител, которые пригодны, например, для проведения анализов вестерн-блот и других иммуноанализов, которые обсуждаются в данном изобретении.Additionally provided are antigens for the production of secondary antibodies that are useful, for example, in Western blot assays and other immunoassays discussed herein.

Антитела против SIRPa (например, гуманизированные антитела) и их антигенсвязывающие фрагменты также могут быть полезны в диагностических анализах для выявления белка SIRPa, например, обнаружения его экспрессии в определенных клетках, тканях или сыворотке, например, в миелоидных клетках, таких как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы и дендритные клетки. Такие диагностические способы могут быть полезны для диагностики различных заболеваний.Anti-SIRPa antibodies (e.g., humanized antibodies) and antigen-binding fragments thereof may also be useful in diagnostic assays to detect SIRPa protein, for example, detecting its expression in certain cells, tissues or serum, for example, in myeloid cells such as monocytes, macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils and dendritic cells. Such diagnostic methods can be useful for diagnosing various diseases.

В объем настоящего изобретения входит анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), включающий применение антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном изобретении.Within the scope of the present invention is an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) assay comprising the use of an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof described herein.

Например, такой способ включает следующие этапы:For example, this method includes the following steps:

(a) покрыть субстрат (например, поверхность лунки микротитрационного планшета, например, пластикового планшета) антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом;(a) coat a substrate (eg, the surface of a well of a microtiter plate, eg a plastic plate) with an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof;

(b) нанести образец, в котором необходимо исследовать присутствие SIRPa, на субстрат;(b) apply the sample to be tested for the presence of SIRPa onto the substrate;

(c) промыть планшет, чтобы удалить несвязанный материал из образца;(c) rinse the plate to remove unbound material from the sample;

(d) нанести меченые детектируемой меткой антитела (например, связанные с ферментом антитела), которые также специфичны к антигену SIRPa;(d) apply detectably labeled antibodies (eg, enzyme-linked antibodies) that are also specific for the SIRPa antigen;

(e) промыть субстрат, чтобы удалить несвязанные меченые антитела;(e) wash the substrate to remove unbound labeled antibodies;

(f) если меченые антитела связаны с ферментом, то нанести химическое вещество, которое фермент превращает в флуоресцентный сигнал; и (g) детектировать присутствие меченого антитела.(f) if the labeled antibody is bound to an enzyme, apply a chemical that the enzyme converts into a fluorescent signal; and (g) detect the presence of the labeled antibody.

Обнаружение метки, связанной с субстратом, свидетельствует о присутствии белка SIRPa.Detection of a label bound to the substrate indicates the presence of the SIRPa protein.

В дополнительном варианте реализации меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент помечен пероксидазой, которая реагирует с АБТС (например, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6сульфоновой кислотой)) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидином, чтобы вызвать изменение цвета, которое можно детектировать. В качестве альтернативы меченое антитело или фрагмент помечено детектируемым радиоактивным изотопом (например, 3Н), который можно детектировать с помощью сцинтилляционного счетчика в присутствии сцинтиллятора.In a further embodiment, the labeled antibody or antigen binding fragment thereof is labeled with a peroxidase that reacts with ABTS (e.g., 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6sulfonic acid)) or 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, to cause a color change that can be detected. Alternatively, the labeled antibody or fragment is labeled with a detectable radioactive isotope (eg, 3 H), which can be detected using a scintillation counter in the presence of a scintillator.

Антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению можно применять в процедуре вестерн-блотинга или белкового иммуноблотинга. Такая процедура входит в объем настоящего изобретения и включает, например:The anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used in a Western blotting or protein immunoblotting procedure. Such a procedure is within the scope of the present invention and includes, for example:

(1) необязательный перенос белков из образца, в котором необходимо исследовать присутствие SIRPa (например, из электрофоретического разделения в ПААГ или ПААГ/ДСН белков в образце), на мембрану или другой твердый субстрат, применяя способ, известный в данной области (например, полусухой блоттинг или блоттинг в резервуаре (Tank-блоттинг)); приведение в контакт мембраны или другого твердого субстрата, в котором необходимо исследовать присутствие связанного SIRPa или его фрагмента, с антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению.(1) optionally transferring proteins from the sample in which the presence of SIRPa is to be examined (e.g., from PAGE or SDS-PAGE of proteins in the sample) to a membrane or other solid substrate using a method known in the art (e.g., semi-dry blotting or tank blotting (Tank blotting)); contacting a membrane or other solid substrate in which the presence of bound SIRPa or a fragment thereof is to be assayed with an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention.

(2) промывку мембраны один или несколько раз, чтобы удалить не связанное антитело против SIRPa или его фрагмент и другие не связанные вещества; и (3) детектирование связанного антитела против SIRPa или его фрагмента.(2) washing the membrane one or more times to remove unbound anti-SIRPa antibody or fragment thereof and other unbound substances; and (3) detecting the bound anti-SIRPa antibody or fragment thereof.

Такая мембрана может быть в виде нитроцеллюлозной мембраны или мембраны на основе винила (например, поливинилиденфторида (ПВДФ)), на которую перенесли белки, в которых необходимо исследовать присутствие SIRPa, из неденатурирующего ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле)Such a membrane can be in the form of a nitrocellulose membrane or a vinyl-based membrane (for example, polyvinylidene fluoride (PVDF)), onto which the proteins in which the presence of SIRPa is to be examined are transferred from non-denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)

- 61 043743 или ПААГ/ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия) (например, после электрофоретического разделения в геле). Перед приведением в контакт мембраны с антителом против SIRPa или его фрагментом, указанную мембрану необязательно блокируют, например, обезжиренным сухим молоком или тому подобным, чтобы связать сайты неспецифического связывания белков на мембране.- 61 043743 or PAGE/SDS (polyacrylamide gel electrophoresis with the addition of sodium dodecyl sulfate) (for example, after electrophoretic separation in the gel). Before contacting the membrane with an anti-SIRPa antibody or fragment thereof, the membrane is optionally blocked, for example, with nonfat dry milk or the like, to bind nonspecific protein binding sites on the membrane.

Детектирование связанного антитела или фрагмента свидетельствует о том, что белок SIRPa присутствует на мембране или субстрате и в образце. Детектирование связанного антитела или фрагмента можно осуществить путем связывания указанного антитела или фрагмента со вторичным антителом (антителом против иммуноглобулинов), которое помечено детектируемой меткой, а затем обнаружения присутствия вторичного антитела.Detection of bound antibody or fragment indicates that SIRPa protein is present on the membrane or substrate and in the sample. Detection of a bound antibody or fragment can be accomplished by binding said antibody or fragment to a secondary antibody (anti-immunoglobulin antibody) that is labeled with a detectable label, and then detecting the presence of the secondary antibody.

Антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также можно применять для иммуногистохимии. Такой способ входит в объем настоящего изобретения и включает, например, (1) приведение в контакт клетки (например, образца, содержащего миелоидные клетки, такие как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы и дендритные клетки), в которой необходимо проверить присутствие белка SIRPa, с антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению; и (2) обнаружение антитела или фрагмента на клетке или в клетке.Antibodies against SIRPa and their antigen binding fragments described in this invention can also be used for immunohistochemistry. Such a method is within the scope of the present invention and includes, for example, (1) contacting a cell (for example, a sample containing myeloid cells such as monocytes, macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils and dendritic cells) in which the presence of a protein is to be tested SIRPa, with an anti-SIRPa antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention; and (2) detection of the antibody or fragment on or in a cell.

Если сами антитело или фрагмент помечены детектируемой меткой, то их можно детектировать напрямую. В качестве альтернативы, антитело или фрагмент может быть связано меченым детектируемой меткой вторичным антителом, которое детектируют.If the antibody or fragment itself is labeled with a detectable label, it can be detected directly. Alternatively, the antibody or fragment may be bound to a detectably labeled secondary antibody that is detected.

Некоторые антитела против SIRPa и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, также можно применять для визуализации опухоли in vivo. Такой способ может включать инъекцию меченого радиоактивной меткой антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента в организм пациента, в котором необходимо проверить присутствие опухоли, ассоциированной с экспрессией SIRPa (например, которая экспрессирует SIRPa, например, на поверхности опухолевой клетки), с последующей радионуклидной визуализацией организма пациента, чтобы детектировать присутствие меченого антитела или фрагмента, например, в локусах, содержащих высокую концентрацию антитела или фрагмента, которые связаны с опухолью. Обнаружение локусов свидетельствует о присутствии SIRPa+ опухоли и опухолевых клеток.Certain anti-SIRPa antibodies and their antigen-binding fragments described in this invention can also be used for in vivo tumor imaging. Such a method may involve injection of a radiolabeled anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof into the body of a patient in which the presence of a tumor associated with SIRPa expression (e.g., that expresses SIRPa, for example, on the surface of a tumor cell) is to be tested, followed by radionuclide imaging of the body patient to detect the presence of a labeled antibody or fragment, for example, at loci containing a high concentration of antibody or fragment that are associated with a tumor. Detection of loci indicates the presence of SIRPa + tumor and tumor cells.

Методики визуализации включают визуализацию ОФЭКТ (однофотонная эмиссионная компьютерная томография) или визуализацию ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография). Метки включают, например, йод-123 (123I) и технеций-99т (99mTc), например, в сочетании с визуализацией ОФЭКТ или nC, 13N, 15O или 18F, например, в сочетании с визуализацией ПЭТ, или индий-Ш (см., например, Gordon и др., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440).Imaging techniques include SPECT (single photon emission computed tomography) imaging or PET (positron emission tomography) imaging. Tags include, for example, iodine-123 ( 123 I) and technetium-99t ( 99m Tc), for example, in combination with SPECT imaging or nC , 13 N, 15 O or 18 F, for example, in combination with PET imaging, or indium-III (see, for example, Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440).

Фармацевтические композиции и введение.Pharmaceutical compositions and administration.

Для получения фармацевтических или стерильных композиций антител против SIRPa и антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences и U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания (1984).To prepare pharmaceutical or sterile compositions of anti-SIRPa antibodies and antigen binding fragments according to the present invention, the antibody or antigen binding fragment thereof is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Составы терапевтических и диагностических агентов можно получить путем смешивания с приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами, например, в форме лиофилизированных порошков, кашиц, водных растворов или суспензий (см., например, Hardman и др. (2001) Goodman и Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Нью-Йорк, Нью-Йорк; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, и Wilkins, Нью-Йорк, Нью-Йорк; Avis и др. (ред.) (1993) Pharmaceutical dosage forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, Нью-Йорк; Lieberman и др. (ред.) (1990) Pharmaceutical dosage forms: Tablets, Marcel Dekker, Нью-Йорк; Lieberman и др. (ред.) (1990) Pharmaceutical dosage forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, Нью-Йорк; Weiner и Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк, Нью-Йорк).Formulations of therapeutic and diagnostic agents can be prepared by admixture with suitable carriers, excipients or stabilizers, for example in the form of lyophilized powders, slurries, aqueous solutions or suspensions (see, for example, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, New York; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, New York; Avis et al (eds. .) (1993) Pharmaceutical dosage forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical dosage forms: Tablets, Marcel Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) ) (1990) Pharmaceutical dosage forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, New York; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, New York).

Токсичность и терапевтическую эффективность антител согласно настоящему изобретению, которые вводят отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом, можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение доз токсического и терапевтического действия представляет собой терапевтический индекс (LD50/ED50). Результаты, полученные в данных анализах культур клеток и исследованиях на животных, можно применять для определения диапазона дозировок для применения у человека. Дозировка таких соединений предпочтительно находится внутри диапазона концентраций в кровотоке, который включает ED50 без токсичности или с небольшой токсичностью. Дозировка может изменяться внутри данного диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и пути введения.The toxicity and therapeutic efficacy of the antibodies of the present invention, which are administered alone or in combination with another therapeutic agent, can be determined using standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals, for example, to determine the LD 50 (dose lethal to 50% of the population) and ED 50 (dose therapeutically effective for 50% of the population). The ratio of doses of toxic and therapeutic effects is the therapeutic index (LD 50 /ED 50 ). The results obtained from these cell culture assays and animal studies can be used to determine dosage ranges for use in humans. The dosage of such compounds is preferably within a bloodstream concentration range that includes the ED50 with no or little toxicity. Dosage may vary within this range depending on the dosage form used and route of administration.

- 62 043743- 62 043743

В дополнительном варианте реализации дополнительный терапевтический агент вводят субъекту в сочетании с антителом против SIRPa или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящему изобретению в соответствии с Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57oe издание (1 ноября 2002 г.)).In a further embodiment, the additional therapeutic agent is administered to a subject in combination with an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention in accordance with Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002)).

Способ введения можно варьировать. Пути введения включают пероральный, ректальный, трансмукозальный, интестинальный, парентеральный; внутримышечный, подкожный, внутрикожный, интрамедуллярный, интратекальный, напрямую внутрь желудочка, внутривенный, интраперитонеальный, интраназальный, внутриглазной, ингаляцию, инсуффляцию, топический, кожный, трансдермальный или интраартериальный.The method of administration can be varied. Routes of administration include oral, rectal, transmucosal, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutaneous, intradermal, intramedullary, intrathecal, direct intraventricle, intravenous, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalation, insufflation, topical, cutaneous, transdermal or intraarterial.

В конкретных вариантах реализации антитела против SIRPa или их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно вводить инвазивным путем, например, путем инъекции. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент, или содержащую его фармацевтическую композицию, вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно, интраартериально, внутрь опухоли или посредством ингаляции, аэрозольной доставки. Введение неинвазивными путями (например, перорально; например, в пилюле, капсуле или таблетке) также входит в объем настоящего изобретения.In certain embodiments, anti-SIRPa antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention can be administered by an invasive route, such as by injection. In additional embodiments of the present invention, the anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof, or a pharmaceutical composition containing it, is administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraarterially, intratumorally, or by inhalation, aerosol delivery. Administration by non-invasive routes (eg, orally; eg, in a pill, capsule or tablet) is also within the scope of the present invention.

В соответствии с настоящим изобретением предложен сосуд (например, пластиковый или стеклянный флакон, например, с крышкой или хроматографической колонкой, полой иглой или цилиндром шприца), содержащий любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению или содержащую их фармацевтическую композицию. В соответствии с настоящим изобретением также предложено устройство для инъекции, содержащее любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению или содержащую их фармацевтическую композицию. Устройство для инъекции представляет собой устройство, которое вводит вещество в организм пациента парентеральным путем, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным. Например, устройство для инъекции может представлять собой шприц (например, предварительно наполненный фармацевтической композицией, такой как автоматический инжектор), который, например, включает цилиндр или тубу для удерживания жидкости, которую будут вводить путем инъекции (например, антитела или фрагмента или содержащей их фармацевтической композиции), иглу для прокалывания кожи и/или кровеносных сосудов для инъекции указанной жидкости; и поршень для выталкивания жидкости из цилиндра и через канал иглы. В одном варианте реализации настоящего изобретения устройство для инъекции, которое содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению или содержащую их фармацевтическую композицию, представляет собой устройство для внутривенной (в/в) инъекции. Такое устройство содержит антитело или фрагмент или содержащую их фармацевтическую композицию в катетере или троакаре/игле, которую можно присоединить к пробирке, которую можно присоединить к пакету или резервуару для удерживания жидкости (например, солевого раствора; или раствора Рингера с лактатом, содержащего NaCl, лактат натрия, KCl, CaCl2 и необязательно содержащего глюкозу), которую вводят в организм пациента через катетер или троакар/иглу. Антитело или фрагмент или содержащую их фармацевтическую композицию можно, в одном варианте реализации настоящего изобретения, ввести в устройство, после того как троакар и катетер ввели в вену субъекта и троакар удалили из вставленного катетера. В/в устройство, например, можно ввести в периферическую вену (например, в кисти или руке); в верхнююю полую вену или нижнюю полую вену, или внутрь правого предсердия (например, центральный в/в катетер); или в подключичную, внутреннюю яремную или бедренную вену и, например, продвинуть по направлению к сердцу, пока оно не достигнет верхней полой вены или правого предсердия (например, центральный венозный катетер). В одном варианте реализации настоящего изобретения устройство для инъекции представляет собой автоматический инжектор; безыгольный инжектор или внешний инфузионный насос. В безыгольном инжекторе используют узкую струю жидкости под высоким давлением, которая проникает в эпидермис, чтобы ввести антитело или фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию в организм пациента. Внешние инфузионные насосы представляют собой медицинские устройства, которые доставляют антитело или фрагмент или содержащую его фармацевтическую композицию в организм пациента в контролируемых количествах. Внешние инфузионные насосы могут иметь электрический или механический привод. Различные насосы работают различными способами, например, шприцевой насос удерживает жидкость в резервуаре шприца, и подвижный поршень контролирует доставку жидкости, эластомерный насос удерживает жидкость в растяжимом баллонном резервуаре, и давление от эластичных стенок баллона совершает доставку жидкости. В перистальтическом насосе набор роликов передавливает гибкие трубки, проталкивая жидкость вперед. В многоканальном насосе жидкости можно доставлять из множества резервуаров при множестве скоростей.The present invention provides a vessel (eg, a plastic or glass vial, eg, with a cap or chromatography column, hollow needle or syringe barrel) containing any of the antibodies or antigen-binding moieties of the present invention or a pharmaceutical composition containing them. The present invention also provides an injection device containing any of the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention or a pharmaceutical composition containing them. An injection device is a device that introduces a substance into a patient's body through a parenteral route, such as intramuscular, subcutaneous, or intravenous. For example, the injection device may be a syringe (e.g., pre-filled with a pharmaceutical composition, such as an auto-injector), which, for example, includes a barrel or tube for holding a liquid to be injected (e.g., an antibody or fragment or pharmaceutical containing the same). composition), a needle for piercing the skin and/or blood vessels to inject said liquid; and a piston for pushing fluid out of the cylinder and through the needle bore. In one embodiment of the present invention, an injection device that contains an antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention or a pharmaceutical composition containing them is an intravenous (IV) injection device. Such a device contains the antibody or fragment, or a pharmaceutical composition containing the same, in a catheter or trocar/needle that can be attached to a tube that can be attached to a bag or reservoir to retain a liquid (eg, saline; or lactated Ringer's solution containing NaCl, lactate sodium, KCl, CaCl 2 and optionally containing glucose), which is introduced into the patient’s body through a catheter or trocar/needle. The antibody or fragment, or a pharmaceutical composition containing the same, can, in one embodiment of the present invention, be administered to the device after the trocar and catheter have been inserted into a vein of the subject and the trocar has been removed from the inserted catheter. The IV device, for example, can be inserted into a peripheral vein (eg, in the hand or arm); into the superior vena cava or inferior vena cava, or into the right atrium (for example, a central IV catheter); or into the subclavian, internal jugular or femoral vein and, for example, advance towards the heart until it reaches the superior vena cava or right atrium (for example, a central venous catheter). In one embodiment of the present invention, the injection device is an automatic injector; needleless injector or external infusion pump. A needleless injector uses a narrow, high-pressure jet of liquid that penetrates the epidermis to deliver an antibody or fragment, or a pharmaceutical composition containing it, into the patient's body. External infusion pumps are medical devices that deliver an antibody or fragment, or a pharmaceutical composition containing it, into the patient's body in controlled quantities. External infusion pumps can be electrically or mechanically driven. Different pumps work in different ways, for example, a syringe pump holds liquid in a syringe reservoir and a movable piston controls the delivery of the liquid, an elastomeric pump holds liquid in an expandable balloon reservoir and pressure from the elastic walls of the balloon delivers the fluid. In a peristaltic pump, a set of rollers presses on flexible tubes, pushing fluid forward. In a multi-channel pump, fluids can be delivered from multiple reservoirs at multiple speeds.

Фармацевтические композиции, описанные в данном изобретении, также можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожной инъекции, такого как устройства, описанные в патентах США № 6620135; 6096002; 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Такие безыгольные устройства, содержащие указанную фармацевтическую композицию, также входят в объемThe pharmaceutical compositions described in this invention can also be administered using a needle-free subcutaneous injection device, such as the devices described in US Pat. No. 6,620,135; 6096002; 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 or 4596556. Such needleless devices containing the specified pharmaceutical composition are also included in the scope

- 63 043743 настоящего изобретения. Фармацевтические композиции, описанные в данном изобретении, также можно вводить путем инфузии. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей для введения фармацевтических композиций включают имплантаты и модули, описанные в: патенте США № 4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США № 4447233, в котором описан инфузионный насос для доставки лекарственного средства с определенной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором описано имплантируемое инфузионное устройство с регулируемым расходом для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного средства, содержащая многокамерные отделения. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули хорошо известны специалистам в данной области, и те из них, которые содержат фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, входят в объем настоящего изобретения.- 63 043743 of the present invention. The pharmaceutical compositions described in this invention can also be administered by infusion. Examples of well-known implants and modules for administering pharmaceutical compositions include the implants and modules described in: US Pat. No. 4,487,603, which describes an implantable microinfusion pump for dosing a drug at a controlled rate; US Pat. No. 4,447,233, which describes an infusion pump for delivering a drug at a specific infusion rate; US Patent No. 4,447,224, which describes an implantable, controlled-flow infusion device for continuous drug delivery; US patent No. 4439196, which describes an osmotic drug delivery system containing multi-chamber compartments. Many other such implants, delivery systems and modules are well known to those skilled in the art, and those containing the pharmaceutical compositions of the present invention are within the scope of the present invention.

В качестве альтернативы, можно вводить антитело против SIRPa или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению местным, а не системным путем, например, посредством инъекции антитела или фрагмента непосредственно в опухоль. Более того, можно вводить антитело или фрагмент в направленной системе доставки лекарственного средства, например, в липосоме, покрытой тканеспецифическим антителом, нацеленным, например, на опухоль. Указанные липосомы будут нацелены и селективно поглощены пораженной тканью. Такие способы и липосомы входят в объем настоящего изобретения.Alternatively, the anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment of the present invention may be administered locally rather than systemically, for example by injecting the antibody or fragment directly into a tumor. Moreover, it is possible to administer the antibody or fragment in a targeted drug delivery system, for example, in a liposome coated with a tissue-specific antibody targeting, for example, a tumor. These liposomes will be targeted and selectively absorbed by the affected tissue. Such methods and liposomes are included within the scope of the present invention.

Схема введения зависит от нескольких факторов, включая скорость метаболизма в сыворотке или ткани терапевтического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, тяжесть симптомов, иммуногенность терапевтического антитела и доступность клеток-мишеней в биологической среде. Предпочтительно, схема введения позволяет доставить достаточное количество терапевтического антитела или фрагмента, чтобы добиться улучшения целевого болезненного состояния, в то же время минимизируя нежелательные побочные действия. Соответственно, количество доставленного биологического агента отчасти зависит от конкретного терапевтического антитела и тяжести состояния, которое лечат. Доступно руководство по выбору подходящих доз терапевтических антител или их фрагментов (см., например, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Оксфордшир, Великобритания; Kresina (ред.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Нью-Йорк, Нью-Йорк; Bach (ред.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, НьюЙорк, Нью-Йорк; Baert и др. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom и др. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon и др. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz и др. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh и др. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky и др. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).The schedule of administration depends on several factors, including the rate of serum or tissue metabolism of the therapeutic antibody or antigen-binding fragment thereof, the severity of symptoms, the immunogenicity of the therapeutic antibody, and the availability of target cells in the biological environment. Preferably, the dosage regimen allows for the delivery of sufficient amounts of the therapeutic antibody or fragment to achieve improvement in the target disease state while minimizing undesirable side effects. Accordingly, the amount of biological agent delivered depends in part on the specific therapeutic antibody and the severity of the condition being treated. Guidance is available on the selection of appropriate doses of therapeutic antibodies or their fragments (see, for example, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY Bach (ed) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY Baert et al (2003) New Engl J Med. 348:601-608; Milgrom et al (1999) New Engl J Med 341:1966-1973; Slamon et al (2001) New Engl J Med 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl J Med 342:613-619; Ghosh et al (2003) New Engl J Med 348:24-32; Lipsky et al (2000) New Engl J Med 342:613-619; 343:1594-1602).

Подходящую дозу определяет практикующий врач, например, используя параметры или факторы, которые, как известно или предполагается в данной области, влияют на лечение. Как правило, введение дозы начинают с количества, немного меньшего, чем оптимальная доза, а затем повышают с небольшим шагом до тех пор, пока не добьются желательного или оптимального эффекта в соотношении с какимилибо негативными побочными действиями. Важные диагностические критерии включают симптомы, например, воспаления или уровень выработанных воспалительных цитокинов. Обычно, желательно, чтобы биологический агент, который будут применять, был получен из того же вида, что и животное, направленное на лечение, что позволяет минимизировать какой-либо иммунный ответ на реагент. В случае субъекта, представляющего собой человека, например, могут быть желательны гуманизированные и полностью человеческие антитела.The appropriate dose is determined by the practitioner, for example, using parameters or factors that are known or suspected in the art to influence treatment. Typically, dosing is started with an amount slightly less than the optimal dose and then increased in small increments until the desired or optimal effect is achieved in relation to any negative side effects. Important diagnostic criteria include symptoms such as inflammation or levels of inflammatory cytokines produced. Generally, it is desirable that the biological agent to be used be derived from the same species as the animal being treated, thereby minimizing any immune response to the reagent. In the case of a human subject, for example, humanized and fully human antibodies may be desirable.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном изобретении, можно вводить путем непрерывной инфузии, или дозами, которые вводят, например, ежедневно, 1-7 раз в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в квартал, один раз в полгода, раз в год и т.д. Дозы можно вводить, например, внутривенно, подкожно, топически, перорально, назально, ректально, внутримышечно, внутрицеребрально, интраспинально или посредством ингаляции. Суммарная еженедельная доза, как правило, составляет по меньшей мере 0,05 мкг/кг массы тела, если брать шире, по меньшей мере 0,2, 0,5, 1, 10, 100 мкг/кг, 0,25, 1,0, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/мл, 10, 25, 50 мг/кг или более (см., например, Yang и др. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herald и др. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu и др. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji и др. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 151-144). Дозы также можно вводить, чтобы добиться заранее установленной целевой концентрации антитела против SIRPa в сыворотке субъекта, например, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 мкг/мл или более. В других вариантах реализации антитело против SIRPa согласно настоящему изобретению вводят, например, подкожно или внутривенно, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в 4 недели, один раз в месяц, один раз в два месяца или один раз в квартал в количестве 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 или 2500 мг/субъекта.The antibodies or antigen-binding fragments thereof described in this invention can be administered by continuous infusion, or in doses that are administered, for example, daily, 1-7 times a week, once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, once a quarter, once every six months, once a year, etc. Doses may be administered, for example, intravenously, subcutaneously, topically, orally, nasally, rectally, intramuscularly, intracerebrally, intraspinal, or by inhalation. The total weekly dose is typically at least 0.05 mcg/kg body weight, more broadly at least 0.2, 0.5, 1, 10, 100 mcg/kg, 0.25, 1. 0, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10, 25, 50 mg/kg or more (see, for example, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427- 434; Herald et al (2002) New Engl J Med 346:1692-1698; Liu et al (1999) J Neurol Neurosurg Psych 67: 451-456; Portielji et al (20003) Cancer Immunol Immunother 52: 151–144). Doses can also be administered to achieve a predetermined target concentration of anti-SIRPa antibody in the subject's serum, for example, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml or more. In other embodiments, the anti-SIRPa antibody of the present invention is administered, for example, subcutaneously or intravenously, once a week, once every two weeks, once every 4 weeks, once a month, once every two months, or once a quarter at 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 or 2500 mg/subject.

В данном изобретении термин эффективное количество относится к количеству антитела против SIRPa или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, которое при введеAs used herein, the term effective amount refers to the amount of an anti-SIRPa antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention that, when administered

- 64 043743 нии отдельно или в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом в клетку, ткань или субъекта эффективно индуцирует измеримое улучшение одного или более симптомов заболевания, например, рака, или течения рака. Эффективная доза дополнительно относится к такому количеству антитела или его фрагмента, которого достаточно, чтобы привести к по меньшей мере частичному снижению выраженности симптомов, например, уменьшению размеров или исчезновению опухоли, отсутствию роста опухоли, увеличению времени выживания. В отношении отдельного активного ингредиента, который вводят отдельно, эффективная доза относится к данному ингредиенту отдельно. В отношении комбинации, эффективная доза относится к объединенным количествам активных ингредиентов, которые приводят к терапевтическому эффекту, которые вводят либо в комбинации, либо последовательно, либо одновременно. Эффективное количество терапевтического средства будет приводить к улучшению диагностического критерия или параметра по меньшей мере на 10%; обычно по меньшей мере на 20%; предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%; более предпочтительно по меньшей мере на 40%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%. Эффективное количество также может приводить к улучшению субъективного критерия в случаях, когда субъективные критерии используют для оценки тяжести заболевания.- 64 043743 alone or in combination with an additional therapeutic agent into a cell, tissue or subject effectively induces a measurable improvement in one or more symptoms of a disease, such as cancer, or the course of cancer. An effective dose further refers to an amount of an antibody or fragment thereof that is sufficient to result in at least partial relief of symptoms, eg, tumor shrinkage or disappearance, absence of tumor growth, increased survival time. For a single active ingredient that is administered separately, the effective dose refers to that ingredient separately. With respect to a combination, the effective dose refers to the combined amounts of active ingredients that produce a therapeutic effect, which are administered either in combination, sequentially or simultaneously. An effective amount of a therapeutic agent will result in an improvement in the diagnostic criterion or parameter by at least 10%; usually by at least 20%; preferably at least about 30%; more preferably at least 40%, and most preferably at least 50%. An effective amount may also lead to an improvement in the subjective criterion in cases where subjective criteria are used to assess the severity of the disease.

Наборы.Sets.

Дополнительно предложены наборы, содержащие один или более компонентов, которые включают, но не ограничены антителом против SIRPa или антигенсвязывающим фрагментом, обсуждаемыми в данном изобретении, в сочетании с одним или более дополнительными компонентами, включая, но не ограничиваясь фармацевтически приемлемым носителем и/или терапевтическим агентом, обсуждаемыми в данном изобретении. Антитело или фрагмент и/или терапевтический агент можно включить в состав беспримесной композиции или комбинировать с фармацевтически приемлемым носителем в фармацевтической композиции.Additionally provided are kits containing one or more components, which include, but are not limited to, an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment discussed herein, in combination with one or more additional components, including, but not limited to, a pharmaceutically acceptable carrier and/or a therapeutic agent discussed in this invention. The antibody or fragment and/or therapeutic agent can be included in a neat composition or combined with a pharmaceutically acceptable carrier in a pharmaceutical composition.

В одном варианте реализации набор содержит антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению или содержащую его фармацевтическую композицию в одном контейнере (например, в стерильном стеклянном или пластиковом флаконе) и/или терапевтический агент и содержащую его фармацевтическую композицию в другом контейнере (например, в стерильном стеклянном или пластиковом флаконе).In one embodiment, the kit contains an anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention or a pharmaceutical composition containing it in one container (e.g., a sterile glass or plastic vial) and/or a therapeutic agent and a pharmaceutical composition containing it in another container (e.g. in a sterile glass or plastic bottle).

В другом варианте реализации набор содержит комбинацию согласно настоящему изобретению, включающую антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, необязательно в комбинации с одним или более терапевтическими агентами, включенными в один состав, необязательно в фармацевтической композиции в одном общем контейнере.In another embodiment, the kit contains a combination according to the present invention, comprising an anti-SIRPa antibody or an antigen binding fragment thereof according to the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier, optionally in combination with one or more therapeutic agents included in one composition, optionally in a pharmaceutical composition in one general container.

Если набор содержит фармацевтическую композицию для парентерального введения субъекту, то набор может содержать устройство для осуществления такого введения. Например, набор может содержать одну или более игл для подкожных инъекций или другие устройства для инъекций, которые обсуждались выше.If the kit contains a pharmaceutical composition for parenteral administration to a subject, then the kit may contain a device for effecting such administration. For example, the kit may contain one or more hypodermic needles or other injection devices as discussed above.

Набор может содержать листок-вкладыш, содержащий информацию, касающуюся фармацевтических композиций и лекарственных форм в наборе. Как правило, такая информация помогает пациентам и врачам эффективно и безопасно применять заявленные фармацевтические композиции и лекарственные формы. Например, во вкладыше могут быть указаны следующие сведения, касающиеся комбинации согласно настоящему изобретению: фармакокинетика, фармакодинамика, клинические исследования, параметры эффективности, показания и применение, противопоказания, предупреждения, предостережения, нежелательные реакции, передозировка, правильная дозировка и введение, как их поставлять, правильные условия хранения, ссылки на источники, информация о производителе/дистрибьюторе и информация о патентах.The kit may include a package insert containing information regarding the pharmaceutical compositions and dosage forms in the kit. Generally, such information assists patients and physicians in using the claimed pharmaceutical compositions and dosage forms effectively and safely. For example, the package insert may include the following information regarding the combination of the present invention: pharmacokinetics, pharmacodynamics, clinical studies, efficacy parameters, indications and use, contraindications, warnings, cautions, adverse reactions, overdose, correct dosage and administration, how to supply them, correct storage conditions, links to sources, manufacturer/distributor information and patent information.

Набор может также содержать второй терапевтический агент, например, один или более из следующий агентов: антитело против CD47, антитело против APRIL, антитело против PD-1 (например, ниволумаб, пембролизумаб, антитело против PDL1, антитело против TIGIT, антитело против CTLA4, антитело против CS1 (например, элотузумаб), антитело против KIR2DL1/2/3 (например, лирилумаб), антитело против CD137 (например, урелумаб), антитело против GITR (например, TRX518), антитело против PD-L1 (например, BMS-936559, MSB0010718C или MPDL3280A), антитело против PD-L2, антитело против ILT1, антитело против ILT2, антитело против ILT3, антитело против ILT4, антитело против ILT5, антитело против ILT6, антитело против ILT7, антитело против ILT8, антитело против CD40, антитело против ОХ40, антитело против ICOS, антитело против KIR2DL1, антитело против KIR2DL2/3, антитело против KIR2DL4, антитело против KIR2DL5A, антитело против KIR2DL5B, антитело против KIR3DL1, антитело против KIR3DL2, антитело против KIR3DL3, антитело против NKG2A, антитело против NKG2C, антитело против NKG2E, антитело против 4-1ВВ (например, PF-05082566), антитело против TSLP, антитело против IL-10, IL-10 или пегилированный IL-10, или любой низкомолекулярный органический ингибитор таких мишеней; антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из следующих антигенов: AMHR2, AXL, ВСМА, СА IX, CD4,The kit may also contain a second therapeutic agent, for example, one or more of the following agents: anti-CD47 antibody, anti-APRIL antibody, anti-PD-1 antibody (e.g., nivolumab, pembrolizumab, anti-PDL1 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-CS1 (eg, elotuzumab), anti-KIR2DL1/2/3 (eg, lirilumab), anti-CD137 (eg, urelumab), anti-GITR (eg, TRX518), anti-PD-L1 (eg, BMS-936559 , MSB0010718C or MPDL3280A), anti-PD-L2, anti-ILT1, anti-ILT2, anti-ILT3, anti-ILT4, anti-ILT5, anti-ILT6, anti-ILT7, anti-ILT8, anti-CD40, anti OX40, anti-ICOS, anti-KIR2DL1, anti-KIR2DL2/3, anti-KIR2DL4, anti-KIR2DL5A, anti-KIR2DL5B, anti-KIR3DL1, anti-KIR3DL2, anti-KIR3DL3, anti-NKG2A, anti-NKG2C, anti- NKG2E, anti-4-1BB antibody (eg, PF-05082566), anti-TSLP antibody, anti-IL-10 antibody, IL-10 or pegylated IL-10, or any small molecule organic inhibitor of such targets; the antibody or antigen-binding fragment thereof binds to an antigen selected from the group consisting of the following antigens: AMHR2, AXL, BCMA, CA IX, CD4,

- 65 043743- 65 043743

CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, эндоглин, ЕРНА2, EphA3, FGFR2b, рецептор фолиевой кислоты альфа, фукозил-GMl, HER2, HER3, IL1RAP, антиген миеломы-каппа, MS4A1, рецептор пролактина, TA-MUC1 и PSMA; ритуксимаб, ублитуксимаб, маргетуксимаб, IMGN-529, SCT400, велтузумаб, обинутузумаб, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, динутуксимаб, трастузумаб, цетуксимаб, ритуксимаб-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18IL2, KM2812, AFM13 и (CD20)2xCD16, эрлотиниб (тарцева), даратумумаб, алемтузумаб, пертузумаб, брентуксимаб, элотузумаб, ибритумомаб, ифаботузумаб, фарлетузумаб, отлертузумаб, каротуксимаб, эпратузумаб, инебилизумаб, лумретузумаб, 4G7SDIE, AFm21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, могамулизумаб, ChiLob-7/4, лейкотуксимаб, изатуксимаб, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04, ХОМА-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, опортузумаб, энситуксимаб, ведотин (адцетрис), ибритумомаб тиуксетан, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC, и адо-трастузумаб эмтанзин (кадсила); лучевая терапия или химиотерапевтические агенты включая, но не ограничиваясь перечисленными: антрациклины (доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон), оксалиплатин, бортезомиб, циклофосфамид, блеомицин, вориностат, паклитаксел, 5-фторурацил, цитарабин, преднизолон, доцетаксел, митомицин С, топотекан/камптотецин, этопозид, золедроновую кислоту, метотрексат, ибрутиниб, афлиберцепт, бевацизумаб, торемифен, винбластин, винкристин, иделалисиб, меркаптопурин, талидомид, сорафениб; циклический динуклеотид или другой агонист сигнального пути STING; и т.д.CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, endoglin, EPHA2, EphA3, FGFR2b, folic acid receptor alpha, fucosyl-GMl , HER2, HER3, IL1RAP, myeloma-kappa antigen, MS4A1, prolactin receptor, TA-MUC1 and PSMA; rituximab, ublituximab, margetuximab, IMGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, dinutuximab, trastuzumab, cetuximab, rituximab-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18IL2, KM28 12, AFM13 and (CD20) 2 xCD16, erlotinib (Tarceva), daratumumab, alemtuzumab, pertuzumab, brentuximab, elotuzumab, ibritumomab, ifabotuzumab, farletuzumab, otlertuzumab, carotuximab, epratuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, AFm21, AFM 22, LY-3022855, SNDX-6352 , AFM13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, mogamulizumab, ChiLob-7/4, leukotuximab, isatuximab, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04 , HOMA-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, oportuzumab, ensituximab, vedotin (adcetris), ibritumomab tiuxetan, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC , and ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla); radiation therapy or chemotherapy agents including, but not limited to: anthracyclines (doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone), oxaliplatin, bortezomib, cyclophosphamide, bleomycin, vorinostat, paclitaxel, 5-fluorouracil, cytarabine, prednisolone, docetaxel, mitomycin C, topotecan/camptothecin, etoposide, zoledronic acid, methotrexate, ibrutinib, aflibercept, bevacizumab, toremifene, vinblastine, vincristine, idelalisib, mercaptopurine, thalidomide, sorafenib; a cyclic dinucleotide or other agonist of the STING signaling pathway; etc.

Наборы для детектирования и терапевтические наборы.Detection kits and therapeutic kits.

Для удобства, антитело против SIRPa или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению могут быть предложены в наборе, т.е. в упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями по проведению диагностического анализа или детектирования. Если антитело или фрагмент помечены ферментом, то набор будет содержать субстраты и кофакторы, необходимые для данного фермента (например, субстрат-предшественник, который образует детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, можно включить в набор другие вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и тому подобные вещества. Относительные количества различных реагентов могут изменяться в широком диапазоне, чтобы обеспечить концентрации в растворе реагентов, которые по существу оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут быть предложены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, содержащих вспомогательные вещества, которые при растворении позволят получить раствор с подходящей концентрацией реагентов.For convenience, the anti-SIRPa antibody or antigen binding fragment thereof according to the present invention may be provided in a kit, i.e. in a packaged combination of reagents in predetermined quantities with instructions for performing diagnostic analysis or detection. If the antibody or fragment is labeled with an enzyme, then the kit will contain the substrates and cofactors required for that enzyme (eg, a precursor substrate that forms a detectable chromophore or fluorophore). In addition, other excipients may be included in the kit, such as stabilizers, buffers (eg, blocking buffer or lysis buffer), and the like. The relative amounts of the various reagents can be varied over a wide range to provide concentrations in the reagent solution that substantially optimize the sensitivity of the assay. In particular, the reagents may be offered in the form of dry powders, usually lyophilized, containing excipients which, when dissolved, will provide a solution with a suitable concentration of the reagents.

Также предложены реагенты и наборы для диагностики или детектирования, содержащие один или более таких реагентов для применения в различных анализах детектирования, включая, например, иммуноанализы, такие как ELISA (сэндвич-типа или конкурентный формат). Компоненты набора можно предварительно присоединить к твердой подложке или можно нанести на поверхность твердой подложки в процессе использования набора. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения средства выработки сигнала могут быть поставлены заранее связанными с антителом или фрагментом согласно настоящему изобретению, или может потребоваться их комбинирование с одним или более компонентами, например, буферами, конъюгатами антитело-фермент, субстратами ферментов или тому подобными компонентами, перед применением. Наборы также могут содержать дополнительные реагенты, например, блокирующие реагенты для уменьшения неспецифического связывания с поверхностью твердой фазы, реагенты для промывки, субстраты ферментов и тому подобные реагенты. Поверхность твердой фазы может быть представлена в виде пробирки, гранулы, микротитрационного планшета, микросферы или других материалов, подходящих для иммобилизации белков, пептидов или полипептидов. В конкретных аспектах фермент, который катализирует образование хемилюминесцентного или хромогенного продукта или восстановление хемилюминесцентного или хромогенного субстрата представляет собой компонент средств выработки сигнала. Такие ферменты хорошо известны в данной области. Наборы могут содержать любой из захватывающих агентов и детектирующих реагентов, описанных в данном изобретении. Необязательно набор также может содержать инструкции по осуществлению способов согласно настоящему изобретению.Also provided are diagnostic or detection reagents and kits containing one or more such reagents for use in various detection assays, including, for example, immunoassays such as ELISA (sandwich or competitive format). The components of the kit can be pre-attached to a solid support or can be applied to the surface of a solid support while the kit is in use. In some embodiments of the present invention, the signal generating means may be provided pre-associated with the antibody or fragment of the present invention, or may need to be combined with one or more components, such as buffers, antibody-enzyme conjugates, enzyme substrates, or the like, before application. The kits may also contain additional reagents, for example, blocking reagents to reduce nonspecific binding to solid phase surfaces, washing reagents, enzyme substrates, and the like reagents. The solid phase surface may be in the form of a tube, bead, microtiter plate, microsphere, or other materials suitable for immobilizing proteins, peptides, or polypeptides. In particular aspects, an enzyme that catalyzes the formation of a chemiluminescent or chromogenic product or the reduction of a chemiluminescent or chromogenic substrate is a component of the signal generating means. Such enzymes are well known in the art. The kits may contain any of the capture agents and detection reagents described in this invention. Optionally, the kit may also contain instructions for performing the methods of the present invention.

Также предложен набор, содержащий антитело против SIRPa (например, гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент, упакованный в контейнер, такой как флакон или бутылка, и дополнительно содержащий этикетку, прикрепленную к контейнеру или упакованную вместе с контейнером, на указанной этикетке описано содержимое контейнера и приведены указания и/или инструкции по применению содержимого контейнера для лечения одного или более болезненных состояний, описанных в данном изобретении.Also provided is a kit containing an anti-SIRPa antibody (e.g., a humanized antibody) or an antigen-binding fragment thereof packaged in a container, such as a vial or bottle, and further comprising a label affixed to or packaged with the container, said label describing the contents of the container and provides directions and/or instructions for use of the contents of the container for the treatment of one or more disease conditions described in this invention.

В одном аспекте набор предназначен для лечения рака и содержит антитело против SIRPa (например, гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент и дополнительный терапевтический агент или вакцину. Набор необязательно может дополнительно содержать шприц для парентерального, например, внутривенного введения. В другом аспекте набор содержит антитело против SIRPaIn one aspect, the kit is for the treatment of cancer and contains an anti-SIRPa antibody (eg, a humanized antibody) or an antigen-binding fragment thereof and an additional therapeutic agent or vaccine. The kit may optionally further comprise a syringe for parenteral, eg intravenous, administration. In another aspect, the kit contains an anti-SIRPa antibody

- 66 043743 (например, гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент и этикетку, прикрепленную к контейнеру или упакованную вместе с контейнером, описывающую применение антитела или его фрагмента вместе с вакциной или дополнительным терапевтическим агентом. В другом дополнительном аспекте набор содержит вакцину или дополнительный терапевтический агент и этикетку, прикрепленную к контейнеру или упакованную вместе с контейнером, описывающую применение вакцины или дополнительного терапевтического агента вместе с антителом против SIRPa или его фрагментом. В некоторых вариантах реализации антитело против SIRPa и вакцина или дополнительный терапевтический агент находятся в отдельных флаконах или объединены в одной фармацевтической композиции.- 66 043743 (eg, a humanized antibody) or an antigen binding fragment thereof and a label affixed to the container or packaged with the container describing the use of the antibody or fragment thereof with a vaccine or additional therapeutic agent. In another further aspect, the kit contains a vaccine or additional therapeutic agent and a label affixed to the container or packaged with the container describing the use of the vaccine or additional therapeutic agent with an anti-SIRPa antibody or fragment thereof. In some embodiments, the anti-SIRPa antibody and the vaccine or additional therapeutic agent are contained in separate vials or combined in a single pharmaceutical composition.

Выше в разделе комбинированной терапии обсуждалось, что для совместного введения двух терапевтических агентов не требуется, чтобы указанные агенты вводили в одно и то же время или одним и тем же путем, при условии, что периоды времени, когда указанные агенты оказывают свое терапевтическое действие, перекрываются. Одновременное или последовательное введение входит в объем настоящего изобретения, как и введение в различные дни или недели.It was discussed above in the section on combination therapy that coadministration of two therapeutic agents does not require that the agents be administered at the same time or by the same route, provided that the periods of time in which the agents exert their therapeutic effects overlap . Simultaneous or sequential administration is within the scope of the present invention, as is administration on different days or weeks.

Также можно подготовить терапевтические наборы и наборы для детектирования, описанные в данном изобретении, которые содержат по меньшей мере один из следующих компонентов: антитело, пептид, антигенсвязывающий фрагмент или полинуклеотид, описанные в данном изобретении, - и инструкции по применению композиции в качестве детектирующего реагента или терапевтического агента. Контейнеры для применения в таких наборах обычно могут включать по меньшей мере один флакон, пробирку, колбу, бутылку, шприц или другой подходящий контейнер, в который можно поместить одну или более детектирующих и/или терапевтических композиций, и предпочтительно подходящим образом разделить на аликвоты. Если также предложен второй терапевтический агент, то набор также может содержать второй отзличный контейнер, в который можно поместить данную вторую детектирующую и/или терапевтическую композицию. В качестве альтернативы, множество соединений можно получить в одной фармацевтической композиции и можно упаковать в один контейнер, такой как флакон, колба, шприц, бутылка или другой подходящий один контейнер. Наборы, описанные в данном изобретении, также обычно будут содержать средства для удерживания флакона(ов) рядом друг с другом для коммерческой продажи, такие как, например, изготовленные литьем под давлением или выдувным формованием пластиковые контейнеры, в которых удерживается(ются) желательный(е) флакон(ы). Если в наборе содержится радиоактивная метка, хромогенная метка, флуорогенная метка или другой тип детектируемой метки или средств обнаружения, то вводящий метку агент либо может быть предложен в том же контейнере, что и сама детектирующая или терапевтическая композиция, либо, в качестве альтернативы, может быть помещен во второй отличный контейнер, в который данную вторую композицию можно поместить и подходящим образом разделить на аликвоты. В качестве альтернативы, детектирующий реагент и метку можно получить в одном контейнере, и, в большинстве случаев, набор также обычно будет содержать средства для удерживания флакона(ов) рядом друг с другом для коммерческой продажи и/или удобной упаковки и доставки.It is also possible to prepare therapeutic kits and detection kits described in this invention, which contain at least one of the following components: an antibody, peptide, antigen binding fragment or polynucleotide described in this invention, and instructions for use of the composition as a detection reagent or therapeutic agent. Containers for use in such kits may typically include at least one vial, tube, flask, bottle, syringe or other suitable container into which one or more detection and/or therapeutic compositions can be placed and preferably suitably aliquoted. If a second therapeutic agent is also provided, the kit may also contain a second distinct container into which the second detection and/or therapeutic composition can be placed. Alternatively, the plurality of compounds may be formulated in a single pharmaceutical composition and may be packaged in a single container, such as a vial, flask, syringe, bottle, or other suitable single container. The kits described in this invention will also typically contain means for holding the vial(s) side by side for commercial sale, such as, for example, injection molded or blow molded plastic containers in which to hold the desired ) bottle(s). If the kit contains a radioactive label, chromogenic label, fluorogenic label or other type of detectable label or detection means, the labeling agent either may be offered in the same container as the detection or therapeutic composition itself, or alternatively may be placed in a second distinct container into which the second composition can be placed and suitably aliquoted. Alternatively, the detection reagent and tag may be provided in a single container and, in most cases, the kit will also typically contain means for holding the vial(s) close together for commercial sale and/or convenient packaging and shipping.

Также предложено устройство или аппарат для осуществления способов детектирования или мониторинга, описанных в данном изобретении. Такое устройство может включать камеру или пробирку, в которую можно внести образец, систему для работы с жидкостью, возможно включающую клапаны или насосы, чтобы направлять поток образца по устройству, необязательно фильтры для выделения плазмы или сыворотки из крови, камеры для смешивания для добавления захватывающих агентов или детектирующих реагентов и необязательно детектирующее устройство для обнаружения количества детектируемой метки, связанной с иммунокомплексом захватывающего агента. Поток образца может быть пассивным (например, под действием капиллярных, гидростатических или других сил, которые не требуют дополнительных манипуляций со стороны устройства после нанесения образца) или активным (например, под действием приложенной силы, созданной механическими насосами, электроосмотическими насосами, центробежной силы или повышенного давления воздуха), или осуществляться комбинацией активных и пассивных сил.Also provided is a device or apparatus for implementing the detection or monitoring methods described in this invention. Such a device may include a chamber or tube into which the sample can be introduced, a fluid handling system possibly including valves or pumps to direct the flow of the sample through the device, optionally filters for separating plasma or serum from the blood, mixing chambers for adding entrapment agents or detection reagents and optionally a detection device for detecting the amount of detectable label associated with the capture agent immunocomplex. Sample flow can be passive (for example, due to capillary, hydrostatic, or other forces that do not require additional manipulation by the device after application of the sample) or active (for example, under the influence of applied force generated by mechanical pumps, electroosmotic pumps, centrifugal force, or increased air pressure), or be carried out by a combination of active and passive forces.

В дополнительных вариантах реализации также предложен процессор, машиночитаемая память и процедура, которая хранится в машиночитаемой памяти и пригодна для выполнения процессором для осуществления любого из способов, описанных в данном изобретении. Примеры подходящих компьютеризованных систем, сред и/или конфигураций включают персональные компьютеры, серверные компьютеры, портативные или переносные устройства, многопроцессорные системы, системы на основе микропроцессора, компьютерные приставки, программируемую бытовую электронику, сетевые ПК, миникомпьютеры, универсальные электронно-вычислительные машины, распределенную вычислительную среду, которые включают любые из описанных выше систем или устройств или любые другие системы, известные в данной области.Additional embodiments also provide a processor, a computer-readable memory, and a procedure that is stored in the computer-readable memory and is suitable for execution by the processor to implement any of the methods described in this invention. Examples of suitable computerized systems, environments and/or configurations include personal computers, server computers, portable or portable devices, multiprocessor systems, microprocessor-based systems, set-top boxes, programmable consumer electronics, networked PCs, minicomputers, mainframes, distributed computing environments, which include any of the systems or devices described above or any other systems known in the art.

- 67 043743- 67 043743

Предпочтительные варианты реализацииPreferred Implementations

Вариант реализации 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются сEmbodiment 1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to

SIRPa человека, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат один или более и необязательно каждый из перечисленных:Human SIRPa, characterized in that the antibody or antigen-binding fragment thereof contains one or more, and optionally each, of the following:

a. CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 69 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2 или 3 консервативные замены,a. Heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 1 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

b. CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 70 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2 или 3 консервативные замены,b. A heavy chain variable region CDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

c. CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 71 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2 или 3 консервативные замены,c. A heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 3 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

d. CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 72 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2 или 3 консервативные замены,d. A light chain variable region CDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

e. CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 73 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2 или 3 консервативные замены, иe. A light chain variable region CDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2 or 3 conservative substitutions, and

f. CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 74 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2 или 3 консервативные замены, или отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат один или более и необязательно каждый из перечисленных:f. A light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2 or 3 conservative substitutions, or wherein the antibody or antigen binding fragment thereof contains one or more and optionally each of the following:

g. CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2 или 3 консервативные замены,g. Heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 1 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

h. CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2 или 3 консервативные замены,h. A heavy chain variable region CDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

i. CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2 или 3 консервативные замены,i. A heavy chain variable region CDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 3 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

j. CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2 или 3 консервативные замены,j. A light chain variable region CDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 4 by 1, 2 or 3 conservative substitutions,

k. CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1, 2 или 3 консервативные замены, иk. A light chain variable region CDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2 or 3 conservative substitutions, and

l. CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2 или 3 консервативные замены.l. A light chain variable region CDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2 or 3 conservative substitutions.

Вариант реализации 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 1, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают каждую из последовательностей тяжелой цепи, включающих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 69 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 69 на 1, 2 или 3 консервативные замены; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 70 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 70 на 1, 2 или 3 консервативные замены; и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 71 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 71 на 1, 2 или 3 консервативные замены; и/или ка ждую из последовательностей легкой цепи, включающих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 72 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 72 на 1,2 или 3 консервативные замены; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 73 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 73 на 1, 2 или 3 консервативные замены; и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 74 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 74 на 1, 2 или 3 консервативные замены;Embodiment 2. The antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises each of the heavy chain sequences comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 or an amino acid sequence other than SEQ ID NO: 69 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 70 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 71 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; and/or each of a light chain sequence comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 72 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; an amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 73 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 74 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 74 by 1, 2 or 3 conservative substitutions;

или отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают каждую из последовательностей тяжелой цепи, включающих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 на 1, 2 или 3 консервативные замены; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 2 на 1, 2 или 3 консервативные замены; и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 3 на 1, 2 или 3 консервативныеor wherein the antibody or antigen binding fragment thereof comprises each of the heavy chain sequences comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence other than SEQ ID NO: 1 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 3 by 1, 2 or 3 conserved

- 68 043743 замены; и/или каждую из последовательностей легкой цепи, включающих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 на 1, 2 или 3 консервативные замены; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 5 на 1,2 или 3 консервативные замены; и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 или последовательность аминокислот, отличающуюся от SEQ ID NO: 6 на 1, 2 или 3 консервативные замены.- 68 043743 replacements; and/or each of the light chain sequences comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 4 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; amino acid sequence SEQ ID NO: 5 or amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 5 by 1, 2 or 3 conservative substitutions; and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence differing from SEQ ID NO: 6 by 1, 2 or 3 conservative substitutions.

Вариант реализации 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 2, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают одну или обе из перечисленных:Embodiment 3. The antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 2, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof includes one or both of the following:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 75 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 75 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 78 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 78 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 80 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 80 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 82 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 82 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 84 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 84 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 86 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 86 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 88 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 88 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 102 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности; и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:SEQ ID NO: 102 or amino acid sequences at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence; and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 76 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 90 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 90 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 92 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 92 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 94 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 94 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 96 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 98 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 98 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 100 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 104 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности;SEQ ID NO: 104 or amino acid sequences at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence;

или отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают одну или обе из перечисленных:or characterized in that the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises one or both of the following:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 7 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 10 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 12 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 14 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 16 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 18 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, and

- 69 043743- 69 043743

SEQ ID NO: 30 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности; и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:SEQ ID NO: 30 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence; and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 8 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 20 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 22 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 24 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности,SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence,

SEQ ID NO: 26 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 28 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности, иSEQ ID NO: 28 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, and

SEQ ID NO: 32 или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной указанной последовательности.SEQ ID NO: 32 or an amino acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence.

Вариант реализации 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 3, отличающиеся тем, что антитело или его фрагмент обладают следующими свойствами:Embodiment 4. An antibody or an antigen-binding fragment thereof according to embodiment 3, characterized in that the antibody or fragment thereof has the following properties:

связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с EC50 <10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее;bind to a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC 50 of <10 nM, preferably <5 nM, more preferably <1.5 nM, even more preferably <1.0 nM, even more preferably <0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less;

связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV2 человека, с EC50 <10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее;bind to a cell expressing the human SIRPaV2 protein with an EC 50 of <10 nM, preferably <5 nM, more preferably <1.5 nM, even more preferably <1.0 nM, even more preferably <0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less;

не проявляют заметного связывания с белком SIRPe 1 при концентрации антитела 50 нМ, предпочтительно 67 нМ и более предпочтительно 100 нМ; или, в качестве альтернативы, при концентрации, которая в 10 раз больше, предпочтительно в 50 раз больше, более предпочтительно в 100 раз больше и еще более предпочтительно в 200 раз больше, чем EC50 антитела по отношению к SIRPaV1 или SIRPaV2;do not exhibit detectable binding to SIRPe 1 protein at an antibody concentration of 50 nM, preferably 67 nM, and more preferably 100 nM; or, alternatively, at a concentration that is 10 times greater, preferably 50 times greater, more preferably 100 times greater, and even more preferably 200 times greater than the EC 50 of the antibody to SIRPaV1 or SIRPaV2;

ингибируют связывание между SIRPa человека и CD47 с IC50 < 10,0 нМ, более предпочтительно < 5,0 нМ, еще более предпочтительно < 2,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 1,0 нМ или менее; и проявляют балл человечности Т20, равный по меньшей мере 79, и более предпочтительно 85.inhibit binding between human SIRPa and CD47 with an IC50 of <10.0 nM, more preferably <5.0 nM, even more preferably <2.5 nM, and most preferably equal to about 1.0 nM or less; and exhibit a T20 humanity score of at least 79, and more preferably 85.

Вариант реализации 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 1, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат одну из следующих комбинаций последовательности тяжелой цепи/последовательности легкой цепи:Embodiment 5. The antibody or antigen binding fragment thereof of Embodiment 1, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof comprises one of the following heavy chain sequence/light chain sequence combinations:

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 78/SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO: 100,

- 70 043743- 70 043743

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 90,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 94,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 96,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 96,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 98,

SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 16/SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 28, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID.SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 28, or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to the corresponding SEQ ID.

Вариант реализации 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 1-5, отличающиеся тем, что антитело представляет собой интактный IgG.Embodiment 6. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 1-5, characterized in that the antibody is an intact IgG.

Вариант реализации 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 1-6, отличающиеся тем, что антитело включает Fc-область IgG2 дикого типа или мутированную Fc-область IgG2.Embodiment 7. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 1-6, wherein the antibody comprises a wild-type IgG2 Fc region or a mutated IgG2 Fc region.

Вариант реализации 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 1-6, отличающиеся тем, что антитело включает мутированную Fc-область IgG1.Embodiment 8. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 1-6, wherein the antibody includes a mutated IgG1 Fc region.

Вариант реализации 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 1-6, отличающиеся тем, что антитело включает мутированную Fc-область IgG4.Embodiment 9. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 1-6, wherein the antibody includes a mutated IgG4 Fc region.

Вариант реализации 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом SIRPa человека, с которым связывается антитело согласно варианту реализации 5.Embodiment 10. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same human SIRPa epitope to which the antibody of Embodiment 5 binds.

Вариант реализации 11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1 -10, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.Embodiment 11. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 10, characterized in that the antibody or antigen-binding fragment thereof is humanized.

Вариант реализации 12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 10 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 20.Embodiment 12. The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 10 and each light chain comprising SEQ ID NO: 20.

Вариант реализации 13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 16 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 28.Embodiment 13. The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 16 and each light chain comprising SEQ ID NO: 28.

Вариант реализации 14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из ва- 71 043743 риантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 18 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 20.Embodiment 14. The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of Embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 18 and each light chain includes SEQ ID NO: 20.

Вариант реализации 15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 90.Embodiment 15. The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 90.

Вариант реализации 16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 92.Embodiment 16. The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 92.

Вариант реализации 17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-11, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 80 и каждая легкая цепь включает SEQ ID NO: 95.Embodiment 17. The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of embodiments 1-11, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, each heavy chain comprising SEQ ID NO: 80 and each light chain comprising SEQ ID NO: 95.

Вариант реализации 18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1 - 17, паттерн гликозилирования которых характерен для экспрессии в клетке млекопитающего, и которые необязательно гликозилированы путем экспрессии в клетке СНО.Embodiment 18. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 17, the glycosylation pattern of which is characteristic of expression in a mammalian cell, and which is optionally glycosylated by expression in a CHO cell.

Вариант реализации 19. Выделенный полипептид, включающий последовательность аминокислот согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 30, 8, 20, 22, 24, 26, 28 и 32, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 19. An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence according to any of SEQ ID NO: 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 76, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 30, 8, 20, 22, 24, 26, 28 and 32, or an amino acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 20. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно вариантам реализации 1-18, или любой из полипептидов согласно варианту реализации 19.Embodiment 20. An isolated nucleic acid encoding any of the antibodies or antigen binding fragments of Embodiments 1-18, or any of the polypeptides of Embodiment 19.

Вариант реализации 21. Выделенная нуклеиновая кислота согласно варианту реализации 20, включающая:Embodiment 21. The isolated nucleic acid of Embodiment 20, comprising:

последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 77 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 79 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 81 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 83 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 85 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 87 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 101 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 89 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 91 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 93 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 95 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 97 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 99 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 103 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15 или последовательность нуклеиновой ки- 72 043743 слоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и/или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a nucleic acid sequence that is at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 79 or a nucleic acid sequence that is at least 90% identical, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 85 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99 % identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 87 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 101 or the nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 89 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence acid SEQ ID NO: 91 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 93 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 95 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 97 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 99, or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 103 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the stated sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 11 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 29 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to said sequence, nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99 % identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 21 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23 or the nucleic acid sequence of at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, a nucleic acid sequence acid SEQ ID NO: 27 or a nucleic acid sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence, and/or a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 31 or a nucleic acid sequence at least 90 , 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 22. Вектор экспрессии, включающий выделенную нуклеиновую кислоту согласно варианту реализации 20 или 21.Embodiment 22. An expression vector including the isolated nucleic acid of Embodiment 20 or 21.

Вариант реализации 23. Вектор экспрессии согласно варианту реализации 22, кодирующий как последовательность тяжелой цепи, так и последовательность легкой цепи антитела против SIRPa, указанные векторы экспрессии содержат следующие комбинации первой последовательности нуклеиновой кислоты/второй последовательности нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из:Embodiment 23. The expression vector of Embodiment 22 encoding both a heavy chain sequence and a light chain sequence of an anti-SIRPa antibody, said expression vectors comprising the following combinations of a first nucleic acid sequence/second nucleic acid sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 89,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 91,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 93,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 93,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 95,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 97,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 97,

SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO: 99,

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 23,

- 73 043743- 73 043743

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 11/ SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 11/ SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 11/ SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 11/ SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 15/SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 25 иSEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 25 and

SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 27, или, в каждом случае, последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную соответствующему SEQ ID NO.SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 27, or, in each case, a sequence that is at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to the corresponding SEQ ID NO.

Вариант реализации 24. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии согласно варианту реализации 22 или 23.Embodiment 24. A host cell containing the expression vector of Embodiment 22 or 23.

Вариант реализации 25. Клетка-хозяин согласно варианту реализации 24, которая продуцирует полноразмерное антитело против SIRPa.Embodiment 25. The host cell of Embodiment 24 that produces a full-length anti-SIRPa antibody.

Вариант реализации 26. Клетка-хозяин согласно одному из вариантов реализации 24 или 25, которая представляет собой бактериальную клетку, клетку человека, клетку млекопитающего, клетку Pichia, клетку растения, клетку НЕК293 или клетку яичника китайского хомячка.Embodiment 26. The host cell of one of embodiments 24 or 25, which is a bacterial cell, a human cell, a mammalian cell, a Pichia cell, a plant cell, a HEK293 cell, or a Chinese hamster ovary cell.

Вариант реализации 27. Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1 -18 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.Embodiment 27. A composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 18 and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Вариант реализации 28. Композиция согласно варианту реализации 27, дополнительно содержащая второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые индуцируют АЗКЦ и/или АЗКФ, отличающаяся тем, что указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению повышает опосредованное вторым антителом разрушение клеток.Embodiment 28. The composition of Embodiment 27 further comprising a second antibody or an antigen-binding fragment thereof that induces ADCC and/or ADCP, wherein said antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention enhances the second antibody-mediated cell destruction.

Вариант реализации 29. Композиция согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из AMHR2, AXL, ВСМА, СА IX, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, эндоглина, ЕРНА2, EphA3, FGFR2b, рецептора фолиевой кислоты альфа, фукозила-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, антигена миеломы-каппа, MS4A1, рецептора пролактина, TA-MUC1 и PSMA.Embodiment 29. The composition of Embodiment 28, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof binds to an antigen selected from the group consisting of AMHR2, AXL, BCMA, CA IX, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30 , CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvIII, endoglin, EPHA2, EphA3, FGFR2b, folic acid receptor alpha, fucosyl-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, myeloma antigen -kappa, MS4A1, prolactin receptor, TA-MUC1 and PSMA.

Вариант реализации 30. Композиция согласно варианту реализации 29, отличающаяся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из ритуксимаба, ублитуксимаба, маргетуксимаба, IMGN-529, SCT400, велтузумаба, обинутузумаба, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, динутуксимаба, трастузумаба, цетуксимаба, ритуксимаба-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, (CD20)2xCD16, эрлотиниба (тарцева), даратумумаба, алемтузумаба, пертузумаба, брентуксимаба, элотузумаба, ибритумомаба, ифаботузумаба, фарлетузумаба, отлертузумаба, каротуксимаба, эпратузумаба, инебилизумаба, лумретузумаба, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, могамулизумаба, ChiLob-7/4, лейкотуксимаба, изатуксимаба, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04, XOMA213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, опортузумаба, энситуксимаба, ведотина (адцетрис), ибритумомаба тиуксетана, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC и адо-трастузумаба эмтанзина (кадсила).Embodiment 30. The composition of Embodiment 29, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of rituximab, ublituximab, margetuximab, IMGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, dinutuximab, trastuzumab, cetuximab, rituximab-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, (CD20)2xCD16, erlotinib (Tarceva), daratumumab, alemtuzumab, pertuzumab, brentuximab, elotuzumab, Ibrit umomaba, ifabotuzumab, farletuzumab, otlertuzumab, carotuximab, epratuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, mogamu lizumab, ChiLob-7/ 4, leukotuximab, isatuximab, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN-04, XOMA213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-10 97, MOR202, MOR-208, oportuzumab, ensituximab, vedotin (Adcetris), ibritumomab tiuxetan, ABBV-838, HuMax-AXL-ADC and ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla).

Вариант реализации 31. Композиция согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент индуцирует АЗКФ.Embodiment 31. The composition of Embodiment 28, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof induces ADCP.

Вариант реализации 32. Композиция согласно варианту реализации 31, отличающаяся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из ритуксимаба, ублитуксимаба, маргетуксимаба, IMGN-529, SCT400, велтузумаба, обинутузумаба, трастузумаба, цетук- 74 043743 симаба, алемтузумаба, ибритумомаба, фарлетузумаба, инебилизумаба, лумретузумаба, 4G7SDIE, BMS986012, BVX-20, могамулизумаба, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927,Embodiment 32. The composition according to embodiment 31, characterized in that the second antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of rituximab, ublituximab, margetuximab, IMGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, trastuzumab, cetuc-74 043743 simab, alemtuzumab, ibritumomab, farletuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, BMS986012, BVX-20, mogamulizumab, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927,

MDX-1097, MOR202 и MOR-208.MDX-1097, MOR202 and MOR-208.

Вариант реализации 33. Композиция согласно варианту реализации 27, дополнительно содержащая один или более агентов, выбранных из группы, состоящей из антитела против CD27, антитела против CD47, антитела против APRIL, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против TIGIT, антитела против CTLA4, антитела против CS1, антитела против KIR2DL1/2/3, антитела против CD137, антитела против GITR, антитела против PD-L2, антитела против ILT1, антитела против ILT2, антитела против ILT3, антитела против ILT4, антитела против ILT5, антитела против ILT6, антитела против ILT7, антитела против ILT8, антитела против CD40, антитела против ОХ40, антитела против ICOS, антитела против KIR2DL1, антитела против KIR2DL2/3, антитела против KIR2DL4, антитела против KIR2DL5A, антитела против KIR2DL5B, антитела против KIR3DL1, антитела против KIR3DL2, антитела против KIR3DL3, антитела против NKG2A, антитела против NKG2C, антитела против NKG2E, антитела против 4-1ВВ, антитела против TSLP, антитела против IL-10, IL-10 пегилированного IL-10, агониста (например, агонистического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или растворимого гибридного белка) белка рецептора TNF, иммуноглобулин-подобного белка, рецептора цитокина, интегрина, активирующих лимфоциты сигнальных молекул (белков SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, Toll-подобного рецептора, ОХ40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), В7-НЗ, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (TACTILE), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAM7, BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфично связывается с CD83, ингибитора CD47, ингибитора PD1, ингибитора PD-L1, ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA4, ингибитора TIM3, ингибитора LAG3, ингибитора СЕАСАМ (например, СЕАСАМ-1, -3 и/или -5), ингибитора VISTA, ингибитора BTLA, ингибитора TIGIT, ингибитора LAIR1, ингибитора IDO, ингибитора TDO, ингибитора CD160, ингибитора TGFR-бета и циклического динуклеотида или другого агониста сигнального пути STING.Embodiment 33. The composition of Embodiment 27, further comprising one or more agents selected from the group consisting of anti-CD27 antibody, anti-CD47 antibody, anti-APRIL antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIGIT antibody , anti-CTLA4 antibodies, anti-CS1 antibodies, anti-KIR2DL1/2/3 antibodies, anti-CD137 antibodies, anti-GITR antibodies, anti-PD-L2 antibodies, anti-ILT1 antibodies, anti-ILT2 antibodies, anti-ILT3 antibodies, anti-ILT4 antibodies, anti-ILT5 antibodies , anti-ILT6 antibodies, anti-ILT7 antibodies, anti-ILT8 antibodies, anti-CD40 antibodies, anti-OX40 antibodies, anti-ICOS antibodies, anti-KIR2DL1 antibodies, anti-KIR2DL2/3 antibodies, anti-KIR2DL4 antibodies, anti-KIR2DL5A antibodies, anti-KIR2DL5B antibodies, anti-KIR3DL1 antibodies , anti-KIR3DL2 antibodies, anti-KIR3DL3 antibodies, anti-NKG2A antibodies, anti-NKG2C antibodies, anti-NKG2E antibodies, anti-4-1BB antibodies, anti-TSLP antibodies, anti-IL-10 antibodies, IL-10 pegylated IL-10, agonist (eg, agonist antibody or antigen-binding fragment thereof or soluble fusion protein) TNF receptor protein, immunoglobulin-like protein, cytokine receptor, integrin, lymphocyte-activating signaling molecules (SLAM proteins), NK cell activating receptor, Toll-like receptor, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-NZ, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-alpha, CD8-beta, IL2R-beta, IL2R-gamma, IL7R-alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6 , VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (TACTILE), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAM7, BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, PAG/Cbp, CD19a, ligand that specifically binds to CD83, CD47 inhibitor, PD1 inhibitor, PD-L1 inhibitor, PD-L2 inhibitor, CTLA4 inhibitor, TIM3 inhibitor, LAG3 inhibitor, CEACAM inhibitor (e.g. CEACAM-1, -3 and/or -5), VISTA inhibitor, BTLA inhibitor, TIGIT inhibitor, LAIR1 inhibitor, IDO inhibitor, TDO inhibitor, CD160 inhibitor, TGFR-beta inhibitor and cyclic dinucleotide or other STING signaling pathway agonist.

Вариант реализации 34. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий: культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно вариантам реализации 1-18, при условиях, благоприятных для экспрессии полинуклеотида; и необязательно выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина и/или культуральной среды.Embodiment 34. A method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: culturing a host cell containing a polynucleotide encoding the heavy chain and/or light chain of any of the antibodies or antigen-binding fragments according to embodiments 1-18, under conditions favorable for expression of the polynucleotide ; and optionally isolating the antibody or antigen-binding fragment thereof from the host cell and/or culture medium.

Вариант реализации 35. Способ обнаружения присутствия пептида SIRPa или его фрагмента в образце, включающий приведение в контакт образца с антителом или его фрагментом согласно любому из вариантов реализации 1 - 18 и детектирование присутствия комплекса между указанным антителом или фрагментом и пептидом; при этом обнаружение указанного комплекса свидетельствует о присутствии пептида SIRPa.Embodiment 35. A method for detecting the presence of a SIRPa peptide or fragment thereof in a sample, comprising contacting the sample with an antibody or fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 18 and detecting the presence of a complex between said antibody or fragment and the peptide; Moreover, the detection of this complex indicates the presence of the SIRPa peptide.

Вариант реализации 36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 1-18 или композиция согласно любому из вариантов реализации 21-25 для лечения рака или инфекционного заболевания.Embodiment 36. An antibody or antigen binding fragment thereof according to any of embodiments 1-18 or a composition according to any one of embodiments 21-25 for treating cancer or an infectious disease.

Вариант реализации 37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно вариантам реализации 1 - 18 или композиция согласно любому из вариантов реализации 27-33 для снижения передачи сигнала SIRPa/CD47 у субъекта, представляющего собой человека.Embodiment 37. The antibody or antigen binding fragment thereof of Embodiments 1 to 18 or the composition of any of Embodiments 27 to 33 for reducing SIRPa/CD47 signaling in a human subject.

Вариант реализации 38. Способ лечения рака у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов реализации 1-18, или вектора экспрессии согласно одному из вариантов реализации 22 или 23, или клетки-хозяина согласно одному из вариантов реализации 24 26, или композиции согласно одному из вариантов реализации 27 - 33, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой.Embodiment 38. A method of treating cancer in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof according to any one of Embodiments 1-18, or an expression vector according to one of Embodiments 22 or 23, or a host cell according to one of embodiments 24-26, or a composition according to one of embodiments 27-33, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure.

Вариант реализации 39. Способ лечения рака у субъекта, представляющего собой человека, включающий:Embodiment 39. A method of treating cancer in a human subject, comprising:

введение указанному субъекту эффективного количества:administering to a specified subject an effective amount of:

(i) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые индуцируют АЗКЦ и/или АЗКФ; и (ii) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов реализации 118, или вектора экспрессии согласно одному из вариантов реализации 22 или 23, или клетки-хозяина согласно одному из вариантов реализации 24-26, или композиции согласно одному из вариантов реализации 27-33, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой,(i) antibodies or an antigen-binding fragment thereof that induce ADCC and/or ADCP; and (ii) an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 118, or an expression vector according to one of embodiments 22 or 23, or a host cell according to one of embodiments 24-26, or a composition according to one of embodiments 27- 33, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure,

- 75 043743 при этом введение (ii) повышает разрушение клеток, опосредованное антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые индуцируют АЗКЦ и/или АЗКФ.- 75 043743 wherein the introduction of (ii) increases cell destruction mediated by an antibody or an antigen-binding fragment thereof that induces ADCC and/or ADCP.

Вариант реализации 40. Способ согласно варианту реализации 39, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые индуцируют АЗКЦ и/или АЗКФ, связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из AMHR2, AXL, ВСМА, СА IX, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvDI, эндоглина, ЕРНА2, EphA3, FGFR2b, рецептора фолиевой кислоты альфа, фукозила-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, антигена миеломы-каппа, MS4A1, рецептора пролактина, TA-MUC1 и PSMA.Embodiment 40. The method according to embodiment 39, characterized in that the antibody or antigen-binding fragment thereof, which induces ADCC and/or ADCP, binds to an antigen selected from the group consisting of AMHR2, AXL, BCMA, CA IX, CD4, CD16 , CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD40, CD52, CD98, CSF1R, GD2, CCR4, CS1, EpCam, EGFR, EGFRvDI, endoglin, EPHA2, EphA3, FGFR2b, folic acid receptor alpha, fucosyl-GM1, HER2, HER3, IL1RAP, myeloma-kappa antigen, MS4A1, prolactin receptor, TA-MUC1 and PSMA.

Вариант реализации 41. Способ согласно варианту реализации 40, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые индуцируют АЗКЦ и/или АЗКФ, выбраны из группы, состоящей из ритуксимаба, ублитуксимаба, маргетуксимаба, IMGN-529, SCT400, велтузумаба, обинутузумаба, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, динутуксимаба, трастузумаба, цетуксимаба, ритуксимаба-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, (CD20)2xCD16, эрлотиниба (тарцева), даратумумаба, алемтузумаба, пертузумаба, брентуксимаба, элотузумаба, ибритумомаба, ифаботузумаба, фарлетузумаба, отлертузумаба, каротуксимаба, эпратузумаба, инебилизумаба, лумретузумаба, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-836826, BMS-986012, BVX-20, могамулизумаба, ChiLob-7/4, лейкотуксимаба, изатуксимаба, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN04, XOMA-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, опортузумаба, энситуксимаба, ведотина (адцетрис), ибритумомаба тиуксетана, ABBV-838, HuMax-AXLADC и адо-трастузумаба эмтанзина (кадсила).Embodiment 41. The method of Embodiment 40, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof that induces ADCC and/or ADCP is selected from the group consisting of rituximab, ublituximab, margetuximab, IMGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, ADCT-502, Hul4.18K322A, Hu3F8, dinutuximab, trastuzumab, cetuximab, rituximab-RLI, c.60C3-RLI, Hul4.18-IL2, KM2812, AFM13, (CD20)2xCD16, erlotinib (Tarceva), daratumumab, alemtuzumab, pertuzumab, brentuximab, elotuzumab, ibritumomab, ifabotuzumab, farletuzumab, otlertuzumab, carotuximab, epratuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, AFM21, AFM22, LY-3022855, SNDX-6352, AFM-13, BI-8 36826, BMS-986012, BVX- 20, mogamulizumab, ChiLob-7/4, leukotuximab, isatuximab, DS-8895, FPA144, GM102, GSK-2857916, IGN523, IT1208, ADC-1013, CAN04, XOMA-213, PankoMab-GEX, chKM-4927, IGN003, IGN004, IGN005, MDX-1097, MOR202, MOR-208, oportuzumab, ensituximab, vedotin (Adcetris), ibritumomab tiuxetan, ABBV-838, HuMax-AXLADC and ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla).

Вариант реализации 42. Способ согласно варианту реализации 39 или 40, отличающийся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент индуцирует АЗКФ.Embodiment 42. The method of Embodiment 39 or 40, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof induces ADCP.

Вариант реализации 43. Способ согласно варианту реализации 42, отличающийся тем, что второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из ритуксимаба, ублитуксимаба, маргетуксимаба, IMGN-529, SCT400, велтузумаба, обинутузумаба, трастузумаба, цетуксимаба, алемтузумаба, ибритумомаба, фарлетузумаба, инебилизумаба, лумретузумаба, 4G7SDIE, BMS986012, BVX-20, могамулизумаба, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927, MDX-1097, MOR202 и MOR-208.Embodiment 43. The method of Embodiment 42, wherein the second antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of rituximab, ublituximab, margetuximab, IMGN-529, SCT400, veltuzumab, obinutuzumab, trastuzumab, cetuximab, alemtuzumab, ibritumomab, farletuzumab, inebilizumab, lumretuzumab, 4G7SDIE, BMS986012, BVX-20, mogamulizumab, ChiLob-7/4, GM102, GSK-2857916, PankoMab-GEX, chKM-4927, MDX-1097, MOR202 and MOR-208.

Вариант реализации 44. Способ лечения инфекции или инфекционного заболевания у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов реализации 1-18, или вектора экспрессии согласно одному из вариантов реализации 22 или 23, или клетки-хозяина согласно одному из вариантов реализации 24-26, или композиции согласно одному из вариантов реализации 27-33, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой.Embodiment 44. A method of treating an infection or infectious disease in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof according to any one of embodiments 1-18, or an expression vector according to one of embodiments 22 or 23, or a host cell according to one of embodiments 24-26, or a composition according to one of embodiments 27-33, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure.

Вариант реализации 45. Антитело, обладающее одним или несколькими из следующих свойств:Embodiment 45: An antibody having one or more of the following properties:

связывает белок SIRPaV1 человека, имеющий последовательность SEQ ID NO: 34, с EC50 < 1 нМ; проявляет по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к SIRPaV1(P74A), имеющему последовательность SEQ ID NO: 62; и проявляет по меньшей мере в 100 раз более высокую ЕС50 по отношению к белку SIRPe1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 38, предпочтительно измерение проводят с помощью клеточного анализа ELISA;binds the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34, with an EC 50 < 1 nM; exhibits at least 100-fold higher EC 50 relative to SIRPaV1(P74A) having the sequence SEQ ID NO: 62; and exhibits at least 100 times higher EC 50 relative to the human SIRPe1 protein having the sequence SEQ ID NO: 38, preferably measured using a cell-based ELISA assay;

связывается с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее;binds to a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC 50 < 10 nM, preferably < 5 nM, more preferably < 1.5 nM, even more preferably < 1.0 nM, even more preferably < 0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less;

связывается с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV2 человека, с EC50 < 10 нМ, предпочтительно < 5 нМ, более предпочтительно < 1,5 нМ, еще более предпочтительно < 1,0 нМ, еще более предпочтительно < 0,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 0,3 нМ или менее;binds to a cell expressing the human SIRPaV2 protein with an EC 50 < 10 nM, preferably < 5 nM, more preferably < 1.5 nM, even more preferably < 1.0 nM, even more preferably < 0.5 nM, and most preferably equal to about 0.3 nM or less;

не проявляет заметного связывания с белком SIRPe1 при концентрации антитела 50 нМ, предпочтительно 67 нМ и более предпочтительно 100 нМ; или, в качестве альтернативы, при концентрации, которая в 10 раз больше, предпочтительно в 50 раз больше, более предпочтительно в 100 раз больше и еще более предпочтительно в 200 раз больше, чем EC50 антитела по отношению к SIRPaV1 или SIRPaV2;does not exhibit detectable binding to the SIRPe1 protein at an antibody concentration of 50 nM, preferably 67 nM, and more preferably 100 nM; or, alternatively, at a concentration that is 10 times greater, preferably 50 times greater, more preferably 100 times greater, and even more preferably 200 times greater than the EC 50 of the antibody to SIRPaV1 or SIRPaV2;

ингибирует связывание между SIRPa человека и CD47 с IC50 < 10,0 нМ, более предпочтительно < 5,0 нМ, еще более предпочтительно < 2,5 нМ и наиболее предпочтительно равной приблизительно 1,0 нМ или менее; и проявляет балл человечности Т20, равный по меньшей мере 79, и более предпочтительно 85.inhibits binding between human SIRPa and CD47 with an IC50 of <10.0 nM, more preferably <5.0 nM, even more preferably <2.5 nM, and most preferably equal to about 1.0 nM or less; and exhibits a T20 Humanity score of at least 79, and more preferably 85.

Вариант реализации 46. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45, которые связывают белок SIRPaV1 человека, имеющий последовательность SEQ ID NO: 34, с ЕС50 < 1 нМ; проявляют по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к SIRPaV1(P74A), имеющему последовательность SEQ ID NO: 62; и проявляют по меньшей мере в 100 раз более высокую EC50 по отношению к белку SIRPe1 человека, имеющему последовательность SEQ ID NO: 38.Embodiment 46. The antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 45 that binds the human SIRPaV1 protein having the sequence SEQ ID NO: 34 with an EC 50 < 1 nM; exhibit at least 100 times higher EC 50 relative to SIRPaV1(P74A) having the sequence SEQ ID NO: 62; and exhibit at least 100-fold higher EC 50 relative to the human SIRPe1 protein having the sequence SEQ ID NO: 38.

- 76 043743- 76 043743

Вариант реализации 47. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 20 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 10 или последовательность, по меньшей мере наEmbodiment 47. An antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 45 or 46, which contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 20 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 10 or the sequence of at least

90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 48. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 28 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 16 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 48. An antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 45 or 46, which contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 28 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 16 or a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 49. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 20 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 18 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 49. An antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 45 or 46, which contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 20 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 18 or a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 50. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 90 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 80 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 50. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to Embodiment 45 or 46, which contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 90 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 80 or a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 51. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 92 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 80 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 51. An antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 45 or 46, which contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 92 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 80 or a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 52. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно варианту реализации 45 или 46, которые содержат одну или две легкие цепи, включающие SEQ ID NO: 96 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности, и одну или две тяжелые цепи, включающие SEQ ID NO: 80 или последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичную указанной последовательности.Embodiment 52. An antibody or antigen binding fragment thereof of Embodiment 45 or 46 that contains one or two light chains comprising SEQ ID NO: 96 or a sequence that is at least 90, 95, 97, 98, or 99% identical to said sequence. , and one or two heavy chains comprising SEQ ID NO: 80 or a sequence at least 90, 95, 97, 98 or 99% identical to the specified sequence.

Вариант реализации 53. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 45 - 52, отличающиеся тем, что антитело представляет собой интактный IgG.Embodiment 53. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 45 to 52, characterized in that the antibody is an intact IgG.

Вариант реализации 54. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 45 - 52, отличающиеся тем, что антитело включает Fc-область IgG2 дикого типа или мутированную Fc-область IgG2.Embodiment 54. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 45 to 52, wherein the antibody comprises a wild-type IgG2 Fc region or a mutated IgG2 Fc region.

Вариант реализации 55. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 45 - 52, отличающиеся тем, что антитело включает мутированную Fc-область IgG1.Embodiment 55. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 45 to 52, wherein the antibody includes a mutated IgG1 Fc region.

Вариант реализации 56. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно одному из вариантов реализации 45 - 52, отличающиеся тем, что антитело включает мутированную Fc-область IgG4.Embodiment 56. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to one of embodiments 45 to 52, wherein the antibody includes a mutated IgG4 Fc region.

Вариант реализации 57. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом SIRPa человека, с которым связывается антитело согласно одному из вариантов реализации 45 - 52.Embodiment 57. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same human SIRPa epitope to which the antibody of one of embodiments 45 to 52 binds.

Вариант реализации 58. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 45 - 52, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.Embodiment 58. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 45 to 52, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is humanized.

Вариант реализации 59. Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 45 - 52 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.Embodiment 59. A composition comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 45 to 52 and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Вариант реализации 60. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 45 - 52 или композиция согласно варианту реализации 59 для лечения рака или инфекционного заболевания.Embodiment 60. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 45 to 52 or a composition according to embodiment 59 for treating cancer or an infectious disease.

Вариант реализации 61. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов реализации 45 - 52 или композиция согласно варианту реализации 59 для снижения передачи сигнала SIRPa/CD47 у субъекта, представляющего собой человека.Embodiment 61. The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of Embodiments 45 to 52 or the composition of Embodiment 59 for reducing SIRPa/CD47 signaling in a human subject.

Вариант реализации 62. Способ лечения рака у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов реализации 45 - 52 или композиции согласно варианту реализации 59, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой.Embodiment 62. A method of treating cancer in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof according to any one of Embodiments 45 to 52 or a composition according to Embodiment 59, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure .

Вариант реализации 63. Способ лечения инфекции или инфекционного заболевания у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту эффективного количест- 77 043743 ва антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов реализации 45 - 52 или композиции согласно варианту реализации 59, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом или терапевтической процедурой.Embodiment 63. A method of treating an infection or infectious disease in a human subject, comprising administering to said subject an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 45-52 or a composition according to embodiment 59, optionally in combination with an additional therapeutic agent or therapeutic procedure.

Основные способы.Basic methods.

Стандартные способы молекулярной биологии описаны в Sambrook, Fritsch и Maniatis (1982 и 1989 2ое издание, 2001 3е издание) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк; Sambrook и Russell (2001) Molecular Cloning, 3е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк; Wu (1993) Recombinant DNA, том 217, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния). Стандартные способы также можно найти в Ausbel и др. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, тома 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Нью-Йорк, Нью-Йорк, в котором описано клонирование в бактериальных клетках и мутагенез ДНК (том 1), клонирование в клетках млекопитающих и дрожжах (том 2), гликоконъюгаты и экспрессия белка (том 3) и биоинформатика (том 4).Standard molecular biology techniques are described in Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 and 1989 2nd edition, 2001 3rd edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Wu (1993) Recombinant DNA, volume 217, Academic Press, San Diego, California). Standard methods can also be found in Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, volumes 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, New York, which covers cloning in bacterial cells and DNA mutagenesis (Volume 1), cloning in mammalian cells and yeast (Volume 2), glycoconjugates and protein expression (Volume 3), and bioinformatics (Volume 4).

Описаны способы очистки белка, включая иммунопреципитацию, хроматографию, электрофорез, центрифугирование и кристаллизацию (Coligan и др. (2000) Current Protocols in Protein Science, том 1, John Wiley and Sons, Inc., Нью-Йорк). Описаны химический анализ, химическая модификация, посттрансляционная модификация, получение гибридных белков, гликозилирование белков (см., например, Coligan и др. (2000) Current Protocols in Protein Science, том 2, John Wiley and Sons, Inc., Нью-Йорк; Ausubel и др. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, том 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, с. 16.0.5 -16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, Сент-Луис, Миссури; стр. 45 - 89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, Нью-Джерси, с. 384-391). Описано получение, очистка и фрагментация поликлональных и моноклональных антител (Coligan и др. (2001) Current Protcols in Immunology, том 1, John Wiley and Sons, Inc., Нью-Йорк; Harlow и Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринт Харбор, Нью-Йорк; Harlow и Lane, выше). Доступны стандартные методики для определения характеристик взаимодействий лиганд/рецептор (см., например, Coligan и др. (2001) Current Protcols in Immunology, том 4, John Wiley, Inc., Нью-Йорк).Methods for protein purification have been described, including immunoprecipitation, chromatography, electrophoresis, centrifugation and crystallization (Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, volume 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Chemical analysis, chemical modification, post-translational modification, production of fusion proteins, protein glycosylation are described (see, for example, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, volume 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al (2001) Current Protocols in Molecular Biology, volume 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5 -16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45 - 89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, NJ, pp. 384-391). The preparation, purification and fragmentation of polyclonal and monoclonal antibodies are described (Coligan et al. (2001) Current Proceedings in Immunology, volume 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprint Harbor, New York; Harlow and Lane, above). Standard techniques are available for characterizing ligand/receptor interactions (see, for example, Coligan et al. (2001) Current Proceedings in Immunology, volume 4, John Wiley, Inc., New York).

Можно получить моноклональные, поликлональные и гуманизированные антитела (см., например, Sheperd и Dean (ред.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Нью-Йорк, Нью-Йорк; Kontermann и Dubel (ред.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Нью-Йорк; Harlow и Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, с. 139 243; Carpenter и др. (2000) J. Immonol. 165:6205; Не и др. (1998) J. Immonol. 160:1029; Tang и др. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Васа и др. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia и др. (1989) Nature 342:877-883; Foote и Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; патент США номер 6329511).Monoclonal, polyclonal and humanized antibodies can be prepared (see, for example, Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, New York; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 139-243; Carpenter et al. (2000) J. Immonol 165:6205 Ne et al (1998) J Immonol 160:1029 Tang et al (1999) J Biol Chem 274:27371-27378 Vasa et al (1997) J Biol Chem 272:10678-10684; Chothia et al (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J Mol Biol 224:487-499; US patent number 6329511).

Альтернативой гуманизированию является применение библиотек антител человека, отображенных на фаге, или библиотек антител человека в трансгенных мышах (Vaughan и др. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez и др. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom и Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas и др. (2θθ1) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк; Kay и др. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния; de Bruin и др. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).An alternative to humanization is the use of human antibody libraries displayed on phage or human antibody libraries in transgenic mice (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez and al (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al (2θθ1) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, California; de Bruin et al (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399) .

Описаны одноцепочечные антитела и диатела (см., например, Malecki и др. (2002) Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:213-218; Conrath и др. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter и др. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson и Kortt (1999) J. Immonol. Methods 231:177-189; и патент США номер 4946778). Предложены бифункциональные антитела (см., например, Mack и др. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immonol. Methods 248:7-15; Volkel и др. (20θ1) Protein Engineering 14:815-823; Segal и др. (2001) J. Immonol. Methods 248:1-6; Brennan и др. (1985) Science 229:81-83; Raso и др. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker и др. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; и патенты США № 5932448, 5532210 и 6129914).Single chain antibodies and diabodies have been described (see, for example, Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350 Desmyter et al (2001) J Biol Chem 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J Immonol Methods 231:177-189; and US Patent No. 4,946,778). Bifunctional antibodies have been proposed (see, for example, Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immonol. Methods 248:7-15; Volkel et al. (20θ1) Protein Engineering 14:815-823; Segal et al (2001) J Immonol Methods 248:1-6; Brennan et al (1985) Science 229:81-83; Raso et al (1997) J Biol Chem 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker et al (1991) EMBO J 10:3655-3659; and US Patent Nos. 5932448, 5532210 and 6129914).

Также предложены биспецифические антитела (см., например, Azzoni и др. (1998) J. Immonol. 161:3493; Kita и др. (1999) J. Immonol. 162:6901; Merchant и др. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey и др. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng и др. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst и др. (2000) J. Immonol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).Bispecific antibodies have also been proposed (see, for example, Azzoni et al. (1998) J. Immonol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immonol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol Chem 74:9115 Pandey et al (2000) J Biol Chem 275:38633 Zheng et al (2001) J Biol Chem 276:12999 Propst et al (2000) J Immonol 165:2214 Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

Очистка антигена не требуется для получения антител. Животных можно иммунизировать клетками, несущими интересующий антиген. Из иммунизированных животных затем можно выделить спленоциты, и полученные спленоциты можно слить с линией клеток миеломы для получения гибридомы (см., например, Meyaard и др. (1997) Immunity 7:283-290; Wright и др. (2000) Immunity 13:233-242; Preston и др., выше; Kaithamana и др. (1999) J. Immonol. 163:5157-5164).Antigen purification is not required to obtain antibodies. Animals can be immunized with cells carrying the antigen of interest. Splenocytes can then be isolated from immunized animals, and the resulting splenocytes can be fused with a myeloma cell line to produce a hybridoma (see, for example, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13: 233-242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immonol. 163:5157-5164).

Антитела можно конъюгировать, например, с низкомолекулярными лекарственными средствами, ферментами, липосомами, полиэтиленгликолем (ПЭГ). Антитела полезны для включения в наборы, для терапевтических, диагностических или других целей и включают антитела, соединенные, например, с красителями, радиоактивными изотопами, ферментами или металлами, например, коллоидным золотом (см., например, Le Doussal и др. (1991) J. Immonol. 146:169-175; Gibellini и др. (1998) J. Immonol. 160:3891-3898; Hsing и Bishop (1999) J. Immonol. 162:2804-2811; Everts и др. (2002) J. Immonol. 168:883- 78 043743Antibodies can be conjugated, for example, with small molecule drugs, enzymes, liposomes, polyethylene glycol (PEG). Antibodies are useful for inclusion in kits for therapeutic, diagnostic or other purposes and include antibodies coupled, for example, to dyes, radioactive isotopes, enzymes or metals, for example colloidal gold (see, for example, Le Doussal et al. (1991) J Immonol 146:169-175 Gibellini et al (1998) J Immonol 160:3891-3898 Hsing and Bishop (1999) J Immonol 162:2804-2811 Everts et al (2002) J Immonol 168:883-78 043743

889).889).

Доступны способы проточной цитометрии, включая сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) (см., например, Owens и др. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Хобокен, Нью-Джерси; Givan (2001) Flow Cytometry, 2oe изд.; Wiley-Liss, Хобокен, Нью-Джерси; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Хобокен, Нью-Джерси). Доступны флуоресцентные реагенты, подходящие для модификации нуклеиновых кислот, включая праймеры и зонды из нуклеиновых кислот, полипептиды и антитела, для применения, например, в качестве диагностических реагентов (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Юджин, Орегон; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, Сент-Луис, Миссури).Flow cytometry techniques are available, including fluorescence-excited cell sorting (FACS) (see, for example, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd edn; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Fluorescent reagents suitable for modifying nucleic acids are available, including nucleic acid primers and probes, polypeptides and antibodies, for use, for example, as diagnostic reagents (Molecular Probes (2003) Catalog, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma -Aldrich (2003) Catalog, St. Louis, MO).

Описаны стандартные способы гистологии иммунной системы (см., например, Muller-Harmelink (ред.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Нью-Йорк, Нью-Йорк; Hiatt и др. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, и Wilkins, Филадельфия, Пенсильвания; Louis и др. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Нью-Йорк, Нью-Йорк).Standard techniques for the histology of the immune system have been described (see, for example, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, New York; Hiatt et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia, PA; Louis et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

Доступны пакеты программного обеспечения и базы данных для определения, например, антигенных фрагментов, лидерных последовательностей, укладки белков, функциональных доменов, сайтов гликозилирования и выравнивания последовательностей (см., например, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Бетесда, Мэриленд); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., Сан-Диего, Калифорния); DeCypher® (TimeLogic Corp., Кристал Бэй, Невада); Menne и др. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne и др. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren и др. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; vonHeijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; vonHeijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:46834690).Software packages and databases are available to determine, for example, antigenic fragments, leader sequences, protein folding, functional domains, glycosylation sites, and sequence alignments (see, for example, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD) ; GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, California); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) ) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; vonHeijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; vonHeijne (1986) Nucleic Acids Res 14:46834690).

ПримерыExamples

Следующие примеры служат для пояснения настоящего изобретения. Ни в коем случае не предполагается, что данные примеры ограничивают объем настоящего изобретения.The following examples serve to illustrate the present invention. In no way are these examples intended to limit the scope of the present invention.

Пример 1. Специфичность доступных для приобретения антител против hSIRPa.Example 1. Specificity of commercially available anti-hSIRPa antibodies.

Специфичность связывания различных доступных для приобретения моноклональных антител против hSIRPa (табл. 7) с вариантом 1 hSIRPa (hSIRPaV1; номер доступа в GenBank: NM001040022.1) (SEQ ID NO: 34), вариантом 2 hSIRPa (hSIRPaV2; номер доступа в GenBank: D86043.1) (SEQ ID NO: 36), hSIRPe1 (номер доступа в GenBank: NM006065.4) (SEQ ID NO: 38), вариантом 3 транскрипта hSIRPe1/hSIRPeL (номер доступа в NCBI: NM001135844.3) (SEQ ID NO: 117) и hSIRPy (номер доступа в NCBI: NM018556.3) (SEQ ID NO: 40) оценивали с помощью клеточного ELISA (CELISA). Реакционную способность подтверждали, применяя клетки Сно-Κι (АТСС CCL-61), которые были временно трансфицированы, с применением липофектамина 2000, кДНК, кодирующей полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL и hSIRPy, субклонированную в вектор pCI-neo (Promega, Мадисон, Висконсин). Клетки CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1, CHO-K1.hSIRPeL и CHO-K1.hSIRPy высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96луночные культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% в течение 24 ч. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (используемыми при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с антителом козы против IgG мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционная способность против hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL и hSIRPy с помощью стабилизированного хромогена тетраметилбензидина (ТМБ) (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).Binding specificity of various commercially available anti-hSIRPa monoclonal antibodies (Table 7) to hSIRPa variant 1 (hSIRPaV1; GenBank accession number: NM001040022.1) (SEQ ID NO: 34), hSIRPa variant 2 (hSIRPaV2; GenBank accession number: D86043.1) (SEQ ID NO: 36), hSIRPe1 (GenBank accession number: NM006065.4) (SEQ ID NO: 38), hSIRPe1/hSIRPeL transcript variant 3 (NCBI accession number: NM001135844.3) (SEQ ID NO: 117) and hSIRPy (NCBI accession number: NM018556.3) (SEQ ID NO: 40) were assessed using cell-based ELISA (CELISA). Reactivity was confirmed using Cho-Κι (ATCC CCL-61) cells that had been transiently transfected, using Lipofectamine 2000, with cDNA encoding the full-length open reading frame of hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL and hSIRPy subcloned into the pCI-neo vector ( Promega, Madison, WI). CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1, CHO-K1.hSIRPeL and CHO-K1.hSIRPy cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest ) and penicillin/streptomycin (Gibco)), into 96-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 24 hours. Then the culture medium was removed and the cells were incubated for 1 hour at 37° C, 5% CO 2 and 95% humidity with purified anti-hSIRPa antibodies (used at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions). Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T, and immunoreactivity against hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL, and hSIRPy was visualized using stabilized tetramethylbenzidine (TMB) chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC 50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).

- 79 043743- 79 043743

Таблица 7Table 7

Доступные для приобретения антитела против hSIRPa, используемые для сравнения с антителами, полученными в данном изобретенииCommercially available anti-hSIRPa antibodies used for comparison with the antibodies produced in this invention

Мишень Target Клон Clone Номер в каталоге Catalog number Компания Company Вид View Реакционная способность Reactivity Изотип Isotype hSIRPa hSIRPa SE5A5 SE5A5 323802 323802 Biolegend Biolegend МЫШЬ MOUSE человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa 7B3 7B3 LS- C340387 LS- C340387 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa 1B5 1B5 LS- C338479 LS- C338479 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa 1C6 1C6 LS- C338477 LS- C338477 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa 27 27 sc-136067 sc-136067 Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology мышь mouse человек, мышь, крыса man, mouse, rat IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa SE7C2 SE7C2 sc-23863 sc-23863 Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology мышь mouse человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa P3C4 P3C4 LS- C179629- 100 LS- C179629- 100 CliniSciences CliniSciences мышь mouse человек Human IgG2a IgG2a hSIRPa hSIRPa 2A4A5 2A4A5 W172-3 W172-3 MBL International MBL International мышь mouse человек Human IgG2a IgG2a hSIRPa hSIRPa 15-414 15-414 LS-C58098 LS-C58098 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgG2a IgG2a hSIRPa hSIRPa 1H1 1H1 LS- C338476 LS- C338476 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgG2a IgG2a hSIRPa hSIRPa C-7 C-7 sc-376884 sc-376884 Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology мышь mouse человек Human IgG2a IgG2a hSIRPa hSIRPa 03 03 11612- MM03-100 11612- MM03-100 Sino Biological Inc. Sino Biological Inc. мышь mouse человек Human IgG2b IgG2b hSIRPa hSIRPa 5E10 5E10 LS C83566 LS C83566 LifeSpan Biosciences LifeSpan Biosciences мышь mouse человек Human IgG2b IgG2b hSIRPa hSIRPa 602411 602411 MAB4546 MAB4546 R&D R&D мышь mouse человек Human IgG2b IgG2b hSIRPa hSIRPa EPR16264 EPR16264 abl91419 abl91419 Abeam Abeam кролик rabbit человек, мышь, крыса man, mouse, rat IgG IgG hSIRPa hSIRPa D6I3M D6I3M 13379S 13379S Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology кролик rabbit человек, мышь, крыса, обезьяна man, mouse, rat, monkey IgG IgG hSIRPa hSIRPa 001 001 50956- ROOllOOu g 50956- ROOllOOu g Sino Biological Inc. Sino Biological Inc. кролик rabbit мышь, человек mouse, man IgG IgG hSIRPa hSIRPa REA144 REA144 130-099- 768 130-099- 768 Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec человек Human человек Human IgGl IgGl hSIRPa hSIRPa KWAR23 KWAR23 TAB- 453CT TAB- 453CT Creative Biolabs Creative Biolabs человек Human человек Human IgG4 IgG4

На фиг. 1 и в следующей табл. 8 представлено, что доступные для приобретения антитела против hSIRPa вступают в перекрестную реакцию по меньшей мере с hSIRPe1, hSIRPeL или hSIRPy или демонстрируют аллель-специфическое связывание с hSIRPaV2. Антитело KWAR23 вступает в перекрестную реакцию со всеми исследованными представителями семейства рецепторов SIRP: оно связывается с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL и hSIRPy.In fig. 1 and in the next table. 8 shows that commercially available anti-hSIRPa antibodies cross-react with at least hSIRPe1, hSIRPeL or hSIRPy or exhibit allele-specific binding to hSIRPaV2. Antibody KWAR23 cross-reacts with all tested members of the SIRP receptor family: it binds to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPeL and hSIRPy.

- 80 043743- 80 043743

Таблица 8Table 8

Антитело Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaV2, ЕС50 (нМ) hSIRPaV2 binding, EC50 (nM) Связывание hSIRP31, ЕС50 (нМ) hSIRP31 binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPy, ЕС50 (нМ) hSIRPy binding, EC50 (nM) Связывание hSIRP3L, ЕС50 (нМ) hSIRP3L binding, EC50 (nM) hSIRPa.50A hSIRPa.50A 1,626 1.626 1,627 1.627 н/о But 1,475 1.475 0,639 0.639 Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) 0,372 0.372 0,186 0.186 0,185 0.185 0,200 0.200 0,122 0.122 Антитело против hSIRPa (клон 7ВЗ) Antibody against hSIRPa (clone 7B3) 0,187 0.187 0,300 0.300 0,255 0.255 н/о But 0,206 0.206 Антитело против hSIRPa (клон 1В5) Antibody against hSIRPa (clone 1B5) н/о But 0,122 0.122 н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 1С6) Antibody against hSIRPa (clone 1C6) 0,739 0.739 0,167 0.167 2,965 2.965 15,589 15,589 2,008 2,008 Антитело против hSIRPa (клон 27) Anti-hSIRPa antibody (clone 27) н/о But н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон SE7C2) Antibody against hSIRPa (clone SE7C2) 1,269* 1.269* 0,300 0.300 н/о But 1,525 1.525 26,818* 26.818* Антитело против hSIRPa (клон РЗС4) Antibody against hSIRPa (clone P3S4) 0,288 0.288 2,154 2,154 0,383 0.383 0,365 0.365 0,136 0.136 Антитело против hSIRPa (клон 2А4А5) Antibody against hSIRPa (clone 2A4A5) н/о But 1,005 1.005 8,633 8,633 н/о But 12,156* 12.156* Антитело против hSIRPa (клон 15-414) Anti-hSIRPa antibody (clone 15-414) н/о But н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 1Н1) Antibody against hSIRPa (clone 1H1) н/о But 0,204 0.204 н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон С-7) Antibody against hSIRPa (clone C-7) н/о But н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 03) Anti-hSIRPa antibody (clone 03) 96,016* 96.016* 15,059* 15,059* 16,043* 16,043* 17,303* 17.303* 9,109* 9.109* Антитело против hSIRPa (клон 5Е10) Antibody against hSIRPa (clone 5E10) н/о But н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 602411) Anti-hSIRPa antibody (clone 602411) 0,068 0.068 н/о But 0,081 0.081 3,622 3.622 0,060 0.060 Антитело против hSIRPa (клон EPR16264) Anti-hSIRPa antibody (clone EPR16264) н/о But 2,450* 2,450* н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон D6I3M) Antibody against hSIRPa (clone D6I3M) 18,690* 18,690* 8,762* 8,762* н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 001) Anti-hSIRPa antibody (clone 001) 18,081* 18,081* н/о But н/о But 0,494 0.494 6,253* 6.253* Антитело против hSIRPa (клон REA144) Anti-hSIRPa antibody (clone REA144) 5,243* 5.243* 3,274* 3.274* 4,534* 4.534* 3,212* 3.212* 2,147* 2.147* KWAR23 KWAR23 0,067 0.067 0,062 0.062 0,140 0.140 0,043 0.043 0,097 0.097

Значения со знаком * были экстраполированы; н/о - не обнаружили.Values marked * have been extrapolated; n/a - not found.

Пример 2. Иммунизация и селекция антител против hSIRPa.Example 2. Immunization and selection of antibodies against hSIRPa.

Для того чтобы получить антитела SIRPa, которые связываются со всеми известными аллелями SIRPa и не связываются с SIRPe1, мышей иммунизировали экспрессионной конструкцией pCI-neo, ко- 81 043743 дирующей hSIRPaV1 и hSIRPaV2. Мышей иммунизировали с помощью генной пушки, применяя генную пушку Helios (BioRad, Геркулес, Калифорния) и покрытые ДНК золотые пули (BioRad), следуя инструкциям производителя. Вкратце, частицы золота диаметром 1 мкм покрывали кДНК pCI-neohSIRPaV1 или pCI-neo-hSIRPaV2 и коммерчески доступными векторами экспрессии Flt3L мыши и GMCSF мыши в соотношении 2:1:1 (оба от Aldevron, Фарго, Северная Дакота). Всего использовали 1 мкг плазмидной ДНК для покрытия 500 мкг частиц золота. В частности, самок мышей BALB/C в возрасте 7-8 недель (Harlan) иммунизировали в уши с помощью генной пушки, проведя 3 цикла введения в оба уха.To generate SIRPa antibodies that bind to all known SIRPa alleles and do not bind to SIRPa1, mice were immunized with the pCI-neo expression construct encoding hSIRPaV1 and hSIRPaV2. Mice were immunized with a gene gun using the Helios gene gun (BioRad, Hercules, CA) and DNA-coated gold bullets (BioRad) following the manufacturer's instructions. Briefly, 1-μm gold particles were coated with pCI-neohSIRPaV1 or pCI-neo-hSIRPaV2 cDNA and commercially available mouse Flt3L and mouse GMCSF expression vectors in a 2:1:1 ratio (both from Aldevron, Fargo, ND). A total of 1 μg of plasmid DNA was used to coat 500 μg of gold particles. Specifically, 7-8 week old female BALB/C mice (Harlan) were immunized into the ears using a gene gun, giving 3 rounds of administration to both ears.

Для позитивной и негативной селекции В-клеток и целей CELISA получали стабильные линии клеток CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 и CHO-K1.hCD47 путем трансфекции клеток Сно-Κι вектором pCI-neo, кодирующим полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 и hCD47 (номер доступа в NCBI: NM001777.3) (SEQ ID NO: 42), соответственно. Стабильные клоны получали с помощью метода серийных разведений.For positive and negative B cell selection and CELISA purposes, stable cell lines CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 and CHO-K1.hCD47 were generated by transfecting Cho-Κι cells with the pCI-neo vector encoding full-length open reading frame hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 and hCD47 (NCBI accession number: NM001777.3) (SEQ ID NO: 42), respectively. Stable clones were obtained using the serial dilution method.

Титр антител оценивали с помощью CELISA, применяя стабильные линии клеток СНОK1.hSIRPaV1 и CHO-K1.hSIRPaV2. Данные экспрессирующие hSIRPa линии клеток СНО-К1 поддерживали в DMEM-F12 (Gibco), дополненной 10% фетальной бьией сывороткой (Hyclone) и 80 Ед. пенициллина/стрептомицина (Gibco). Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном при плотности 8x104 клеток/лунку и культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% до достижения конфлюэнтности слоев клеток. Клетки инкубировали с каждым образцом разбавленных мышиных сывороток в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Затем клетки промывали фосфатносолевым буферным раствором (ФБР)/0,05% Tween-20 (ФБР-Т) и инкубировали с конъюгатом антитела козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech) в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность антитела против hSIRPa с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Титр антитела против hSIRPa был выше, чем 1:2500, в каждом отдельном образце сыворотки мыши, что детектировали после двух иммунизации ДНК. Всех мышей, у которых продемонстрировали реакционную способность против hSIRPaV1 и hSIRPaV2, иммунизировали последний третий раз и умерщвляли 14 дней спустя. Обедненные эритроцитами популяции клеток селезенки и лимфоузлов получали, как описано ранее (Steenbakkers и др., 1992, J. Immonol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers и др., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134), и замораживали при -180°С.Antibody titer was assessed by CELISA using the stable cell lines CHOK1.hSIRPaV1 and CHO-K1.hSIRPaV2. These hSIRPa-expressing CHO-K1 cell lines were maintained in DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 10% fetal serum (Hyclone) and 80 U. penicillin/streptomycin (Gibco). Cells were seeded in 96-well flat-bottom culture plates at a density of 8x104 cells/well and cultured at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity until the cell layers were confluent. Cells were incubated with each diluted mouse serum sample for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity. Cells were then washed with phosphate buffered saline (PBS)/0.05% Tween-20 (PBS-T) and incubated with goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech) for 1 h at 37°C, 5% CO2 and humidity 95%. Cells were then washed three times with PBS-T and anti-hSIRPa antibody immunoreactivity was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). Reactions were stopped by adding 0.5 M H2SO4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. The anti-hSIRPa antibody titer was greater than 1:2500 in every single mouse serum sample as detected after two DNA immunizations. All mice that showed reactivity against hSIRPaV1 and hSIRPaV2 were immunized for a final third time and sacrificed 14 days later. RBC-depleted spleen and lymph node cell populations were prepared as previously described (Steenbakkers et al., 1992, J. Immonol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134 ), and frozen at -180°C.

Для селекции продуцирующих антитело против hSIRPa В-клеток была спроектирована и разработана стратегия селекции, которая позволяла связывать преимущественно В-клетки, экспрессирующие антитела, которые связываются с hSIRPaV1 и hSIRPaV2. Спленоциты и лимфатические узлы собирали из иммунизированных hSIRPaV1/V2 мышей, и выделенные клетки инкубировали с CHO-K1.hSIRPe1, которые высевали в культуральные флаконы Т25 и облучали 30 грей. Через 1 ч не связавшиеся клетки осторожно удаляли, возвратно-поступательно перемещая флакон. Среду, содержащую не связавшиеся клетки, затем переносили в новый флакон Т25, содержащий облученные клетки CHO-K1.hSIRPe1. Данную процедуру выполняли всего три раза на льду, чтобы осуществить негативную селекцию вступающих в реакцию с hSIRPe 1 В-клеток. Затем среду, содержащую не связавшиеся В-клетки, инкубировали с клетками CHO-K1.hSIRPaV1 и CHO-K1.hSIRPaV2, которые были облучены 3000 грей. После 1,5 ч инкубации на льду не связавшиеся клетки удаляли с помощью множества этапов промывки, применяя культуральную среду. Затем флаконы Т25, содержащие клетки CHO-K1.hSIRPaV1 и CHO-K1.hSIRPaV2 со связанными лимфоцитами, собирали с помощью трипсина-ЭДТА (Sigma). Связавшиеся В-клетки культивировали, как описано у Steenbakkers и др., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134. Вкратце, прошедшие селекцию В-клетки смешивали с 10% (в объемном отношении) супернатанта Т-клеток и 50000 облученных (25 грей) подкармливающих клеток EL-4 B5 в конечном объеме 200 мкл среды в 96-луночных культуральных планшетах с плоским дном. В день восемь супернатанты подвергали скринингу на реакционную способность по отношению к hSIRPaV1 и hSIRPaV2 с помощью CELISA, как описано ниже.To select for anti-hSIRPa antibody-producing B cells, a selection strategy was designed and developed to preferentially bind to B cells expressing antibodies that bind to hSIRPaV1 and hSIRPaV2. Splenocytes and lymph nodes were collected from hSIRPaV1/V2-immunized mice, and isolated cells were incubated with CHO-K1.hSIRPe1, which were seeded into T25 culture flasks and irradiated with 30 Gy. After 1 h, unbound cells were carefully removed by moving the flask back and forth. The medium containing unbound cells was then transferred to a new T25 flask containing irradiated CHO-K1.hSIRPe1 cells. This procedure was performed a total of three times on ice to negatively select hSIRPe 1-reactive B cells. The medium containing unbound B cells was then incubated with CHO-K1.hSIRPaV1 and CHO-K1.hSIRPaV2 cells, which were irradiated to 3000 Gy. After 1.5 h of incubation on ice, unbound cells were removed through multiple washing steps using culture medium. T25 flasks containing CHO-K1.hSIRPaV1 and CHO-K1.hSIRPaV2 cells with associated lymphocytes were then harvested using trypsin-EDTA (Sigma). Bound B cells were cultured as described by Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134. Briefly, selected B cells were mixed with 10% (v/v) T cell supernatant and 50,000 irradiated (25 Gray) EL-4 B5 feeder cells in a final volume of 200 μl of medium in 96-well flat-bottom culture plates. On day eight, supernatants were screened for reactivity to hSIRPaV1 and hSIRPaV2 using CELISA as described below.

CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2 и CHO-K1.hSIRPe1 высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 10% фетальной бьией сывороткой (Hyclone) и 80 Ед. пенициллина/стрептомицина (Gibco)) в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% до достижения конфлюэнтности. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с супернатантами из культур В-клеток. Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с конъюгатом антитела козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и иммунореакционную способность антитела против hSIRPaV1, антитела против hSIRPaV2 и антитела против hSIRPe 1 визуализировали с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм.CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2 and CHO-K1.hSIRPe1 were plated in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 10% fetal serum (Hyclone) and 80 U penicillin/streptomycin (Gibco)) in 96-well culture plates were flat-bottomed and cultured at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity until confluent. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with supernatants from B cell cultures. Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T, and the immunoreactivity of anti-hSIRPaV1, anti-hSIRPaV2, and anti-hSIRPe 1 was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm.

Иммунореакционную способность по отношению к SIRPy человека оценивали с помощью ELISA, применяя покрытые рекомбинантным hSIRPy/Fc-белком (R&D Systems, номер в каталоге 4486-SB-050; SEQ ID NO: 108) 96-луночные планшеты с плоским дном MaxiSorp. Покрытые белком 96-луночныеImmunoreactivity to human SIRPy was assessed by ELISA using recombinant hSIRPy/Fc protein-coated (R&D Systems, catalog no. 4486-SB-050; SEQ ID NO: 108) MaxiSorp 96-well flat-bottom plates. Protein-coated 96-well

- 82 043743 планшеты блокировали в ФБР/1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). ФБР/1% БСА удаляли и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с супернатантами из культур В-клеток. Затем планшеты промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгатом антитела козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech). Затем лунки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность, направленную против hSIRPy, с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм.- 82 043743 plates were blocked in PBS/1% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour at room temperature (RT). PBS/1% BSA was removed and the plates were incubated for 1 h at room temperature with supernatants from B cell cultures. The plates were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at room temperature with goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech). Wells were then washed three times with PBS-T and immunoreactivity against hSIRPy was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H2SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm.

Клоны В-клеток из способных вступать в реакцию с hSIRPa супернатантов, который были неспособны или которые были минимально способны вступать в реакцию с hSIRPe 1 иммортализовали путем миниэлектрослияния, следуя опубликованным процедурам (Steenbakkers и др., 1992, J. Immonol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers и др., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-34), с некоторыми незначительными отклонениями (например, реакцию с проназой пропустили). Вкратце, В-клетки смешивали с 106 клеток миеломы мыши Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL-1581) в изомолярном буфере для электрослияния (Eppendorf). Электрослияние проводили в камере для слияния емкостью 50 мкл под действием переменного электрического поля в течение 15 с (1 МГц, среднеквадратическое напряжение переменного тока 23) с последующим прямоугольным импульсом сильного поля постоянного тока длительностью 10 мс (180 вольт постоянного тока) и снова переменным электрическим полем в течение 15 с (1 МГц, среднеквадратическое напряжение переменного тока 23). Содержимое камеры переносили в селективную среду для гибридом и высевали в 96-луночный планшет при условиях предельных разведений. В день 10 после электрослияния супернатанты гибридом подвергали скринингу для обнаружения активности связывания hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe 1 и hSIRPy с помощью CELISA и ELISA, как описано выше. Гибридомы, которые секретировали в супернатант антитела, которые специфично связывали hSIRPaV1 и hSIRPaV2, замораживали при -180°С (партия -1), а также субклонировали методом предельных разведений, чтобы сохранить их целостность и стабильность. Стабильные гибридомы замораживали при -180°С (партия -LD1) до достижения конфлюэнтности слоев клеток.B cell clones from hSIRPa-reactive supernatants that were unable or minimally able to react with hSIRPe 1 were immortalized by minielectrofusion following published procedures (Steenbakkers et al., 1992, J. Immonol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-34), with some minor deviations (eg, the pronase reaction was omitted). Briefly, B cells were mixed with 106 Sp2/0-Ag14 mouse myeloma cells (ATCC CRL-1581) in isomolar electrofusion buffer (Eppendorf). Electrofusion was performed in a 50 μL fusion chamber under an alternating electric field for 15 s (1 MHz, AC rms voltage 23) followed by a 10 ms high-field DC rectangular pulse (180 volts DC) and again an alternating electric field. for 15 s (1 MHz, AC 23 rms voltage). The contents of the chamber were transferred to selective medium for hybridomas and seeded into a 96-well plate under limiting dilution conditions. At day 10 after electrofusion, hybridoma supernatants were screened for hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe 1, and hSIRPy binding activity by CELISA and ELISA as described above. Hybridomas that secreted antibodies into the supernatant that specifically bound hSIRPaV1 and hSIRPaV2 were frozen at -180°C (batch -1) and subcloned by limiting dilution to maintain their integrity and stability. Stable hybridomas were frozen at -180°C (lot -LD1) until the cell layers were confluent.

Дальнейшую селекцию гибридом проводили путем оценки способности блокировать взаимодействие hSIRPaV1/hCD47 в формате CELISA. Для оценки блокирования hCD47 клетки СНО-K1.hCD47 высевали в 384-луночный культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в культуральной среде. Рекомбинантный белок hSIRPa/Fc (R&D Systems, номер в каталоге 4546-SA-050; SEQ ID NO: 107) предварительно инкубировали с серией разведений супернатантов гибридомы, содержащих реагирующие с hSIRPa антитела и контрольные антитела (при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях) в течение 30 мин при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Конфлюэнтные клетки СНО-K1.hCD47 промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч со смесями, содержащими реагирующие с hSIRPa антитела и рекомбинантный белок hSIRPa/Fc, при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Затем клетки промывали ФБР-Т с последующим добавлением конъюгата антител козы против IgG человека с HRP (Jackson Immuno Research) к клеткам, которые инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали связывание белка hSIRPa/Fc с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм.Further selection of hybridomas was carried out by assessing the ability to block the hSIRPaV1/hCD47 interaction in the CELISA format. To assess hCD47 blocking, CHO-K1.hCD47 cells were seeded in 384-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity in culture medium. Recombinant hSIRPa/Fc protein (R&D Systems, catalog number 4546-SA-050; SEQ ID NO: 107) was preincubated with a series of dilutions of hybridoma supernatants containing hSIRPa-reactive antibodies and control antibodies (at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions ) for 30 min at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity. Confluent CHO-K1.hCD47 cells were washed with PBS-T and incubated for 1 hour with mixtures containing hSIRPa-reactive antibodies and recombinant hSIRPa/Fc protein at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity. The cells were then washed with PBS-T followed by the addition of goat anti-human IgG-HRP conjugate (Jackson Immuno Research) to the cells, which were incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity. Cells were then washed three times with PBS-T and hSIRPa/Fc protein binding was visualized using stabilized TMB chromogen (Invitrogen). Reactions were stopped by adding 0.5 M H2SO4 and absorbance was read at 450 and 610 nm.

Прошедшие селекцию стабильные гибридомы культивировали в бессывороточных средах в течение 7 дней; супернатанты собирали и антитела очищали, применяя смолу с белком А MabSelect Sure, следуя инструкциям производителя (GE Healthcare). Концентрации антител определяли, применяя спектрофотометриию. Супернатанты из культур гибридом использовали для изотипирования гибридом. Вкратце, изотипирование проводили, применяя набор для изотипирования моноклональных антител мыши (Biorad), основанный на индикаторной полоске с полосами иммобилизованных антител козы против антител мыши к каждому из обычных изотипов и легких цепей мыши. Все полученные антитела идентифицировали как IgG1 мыши. Последовательности антител были установлены путем секвенирования вариабельных областей IgG1 мыши материала гибридомы, которое проводили в LakePharma, применяя следующий способ: выделяли общую РНК клеток гибридом, что позволяло синтезировать кДНК. Проводили быструю амплификацию концов кДНК (RACE), которая позволяла клонирование положительных фрагментов в вектор ТОРО (Thermo Fisher Scientific). Клоны ТОРО секвенировали и последовательности аннотировали, применяя VBASE2 (Retter и др., VBASE2, an integrative V gene database. Nucleic Acids Res. 2005, 1 января; 33 (выпуск базы данных): D671-4).The selected stable hybridomas were cultured in serum-free media for 7 days; supernatants were collected and antibodies were purified using MabSelect Sure protein A resin following the manufacturer's instructions (GE Healthcare). Antibody concentrations were determined using spectrophotometry. Supernatants from hybridoma cultures were used for hybridoma isotyping. Briefly, isotyping was performed using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Biorad) based on an indicator strip with immobilized goat anti-mouse antibody bands to each of the common mouse isotypes and light chains. All antibodies obtained were identified as mouse IgG1. The antibody sequences were determined by sequencing the mouse IgG1 variable regions of the hybridoma material, which was performed at LakePharma using the following method: total RNA of the hybridoma cells was isolated, which allowed the synthesis of cDNA. Rapid amplification of cDNA ends (RACE) was performed, which allowed cloning of positive fragments into the TOPO vector (Thermo Fisher Scientific). TOPO clones were sequenced and sequences annotated using VBASE2 (Retter et al., VBASE2, an integrative V gene database. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1; 33 (Database Issue): D671-4).

Пример 3. Определение характеристик антител против hSIRPa.Example 3 Characterization of anti-hSIRPa antibodies.

Специфичность связывания антитела hSIRPa.50А с hSIRPa сравнивали с таковой у антитела KWAR23 (канадский патент 2939293 А1) в формате CELISA. Клетки Сно-Κι временно трансфицировали кДНК hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe 1 и hSIRPy (номер доступа в GenBank: NM018556.3) (SEQ ID NO: 39). Затем оценивали связывание hSIRPa с помощью CELISA, применяя клетки CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 и CHO-K1.hSIRPy. Детектирование связанного антитела осуществляли с помощью антитела козы против IgG мыши-HRP (Southern Biotech) для антител мыши, включая hSIRPa.50A и контрольные антитела, или, в качестве альтернативы, с помощью конъюгата антител козыThe binding specificity of antibody hSIRPa.50A to hSIRPa was compared with that of antibody KWAR23 (Canadian patent 2939293 A1) in CELISA format. Cho-Κι cells were transiently transfected with hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe 1 and hSIRPy cDNAs (GenBank accession number: NM018556.3) (SEQ ID NO: 39). hSIRPa binding was then assessed by CELISA using CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 and CHO-K1.hSIRPy cells. Detection of bound antibody was performed using goat anti-mouse IgG-HRP (Southern Biotech) for mouse antibodies including hSIRPa.50A and control antibodies, or alternatively using goat antibody conjugate

- 83 043743 против IgG человека с HRP (Jackson Immuno Research) для антитела KWAR23. KWAR23 (SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131) экспрессировался в виде химерного антитела IgG4 каппа человека в клетках СНО. На фиг. 2 и в следующей табл. 9 показано, что антитело KWAR23 вступает в перекрестную реакцию со всеми исследованными представителями семейства рецепторов SIRP: оно связывается с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 и hSIRPy. Значения EC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).- 83 043743 anti-human IgG with HRP (Jackson Immuno Research) for antibody KWAR23. KWAR23 (SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131) was expressed as a chimeric human IgG4 kappa antibody in CHO cells. In fig. 2 and in the next table. Figure 9 shows that the KWAR23 antibody cross-reacts with all tested members of the SIRP receptor family: it binds to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1 and hSIRPy. EC5 0 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal was observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

Таблица 9Table 9

Антитело Antibody ЕС50 связывания hSIRPaVl (нМ) EC50 hSIRPaVl binding (nM) ЕС50 связывания hSIRPaV2 (нМ) hSIRPaV2 binding EC50 (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO KWAR23 KWAR23 0,081 0.081 0,001 0.001 0,051 0.051 0,004 0.004 hSIRPa.50A hSIRPa.50A 1,365 1.365 0,164 0.164 1,296 1,296 0,186 0.186 Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) 0,304 0.304 0,200 0.200 Антитело против hSIRPy (клон LSB2.20) Anti-hSIRPy antibody (clone LSB2.20) н/о But н/о But Антитело Antibody ЕС50 связывания hSIRPpl (нМ) EC50 hSIRPpl binding (nM) ЕС50 связывания hSIRPy (нМ) EC50 hSIRPy binding (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO KWAR23 KWAR23 0,161 0.161 0,007 0.007 0,040 0.040 0,002 0.002 hSIRPa.50A hSIRPa.50A н/о But н/о But 1,249 1,249 0,179 0.179 Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) 0,192 0.192 0,168 0.168 Антитело против hSIRPy (клон LSB2.20) Anti-hSIRPy antibody (clone LSB2.20) н/о But 0,265 0.265

Пустые квадраты указывают на измерения n=1. н/о - не обнаружено.Empty squares indicate n=1 measurements. n/a - not found.

Кроме того, специфичность hSIRPa.50A ко всем известным аллелям hSIRPa (аллельным вариантам, описанным у Takenaka и др., 2007, Nat Immunol. 8:1313-1323) дополнительно исследовали с помощью CELISA, используя такую же стратегию, как описанная выше. Для этой цели связывание hSIRPa.50A оценивали, применяя клетки СНО-Ki, которые были временно трансфицированы кДНК, кодирующими полноразмерные hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3 (NA07056_V3) (SEQ ID NO: 43), hSIRPaV4 (NA11832_V4) (SEQ ID NO: 45), hSIRPaV5 (NA18502_V5) (SEQ ID NO: 47), hSIRPaV6 (NA18507_V6) (SEQ ID NO: 49), hSIRPaV8 (NA18570_V8) (SEQ ID NO: 51) и hSIRPaV9 (NA18943_V9) (SEQ ID NO: 53). На фиг. 3 и в следующей табл. 10 продемонстрирована реакционная способность клона антитела hSIRPa.50A с каждым из данных аллелей hSIRPa. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).In addition, the specificity of hSIRPa.50A for all known hSIRPa alleles (allelic variants described in Takenaka et al., 2007, Nat Immunol. 8:1313-1323) was further examined by CELISA using the same strategy as described above. For this purpose, hSIRPa.50A binding was assessed using CHO-Ki cells that were transiently transfected with cDNAs encoding full-length hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3 (NA07056_V3) (SEQ ID NO: 43), hSIRPaV4 (NA11832_V4) (SEQ ID NO: 45) , hSIRPaV5 (NA18502_V5) (SEQ ID NO: 47), hSIRPaV6 (NA18507_V6) (SEQ ID NO: 49), hSIRPaV8 (NA18570_V8) (SEQ ID NO: 51) and hSIRPaV9 (NA18943_V9) (SEQ ID NO: 53). In fig. 3 and in the next table. 10 demonstrates the reactivity of the hSIRPa.50A antibody clone with each of these hSIRPa alleles. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

__________________Таблица 10____________________________________Table 10_________________

Антитело Antibody hSIRPa.50A hSIRPa.50A Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) hSIRPaVl hSIRPaVl ЕС50 (нМ) EC50 (nM) 0,936 0.936 0,327 0.327 СО CO 0,285 0.285 0,107 0.107 hSIRPaV2 hSIRPaV2 ЕС50 (нМ) EC50 (nM) 0,665 0.665 0,200 0.200 СО CO 0,106 0.106 0,046 0.046 hSIRPaV3 hSIRPaV3 ЕС50 (нМ) EC50 (nM) 0,688 0.688 0,226 0.226 СО CO 0,097 0.097 0,052 0.052

- 84 043743- 84 043743

hSIRPaV4 hSIRPaV4 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,824 0.824 0,256 0.256 CO CO 0,280 0.280 0,085 0.085 hSIRPaV5 hSIRPaV5 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,765 0.765 0,276 0.276 CO CO 0,210 0.210 0,086 0.086 hSIRPaV6 hSIRPaV6 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,954 0.954 0,098 0.098 CO CO 0,437 0.437 0,050 0.050 hSIRPaV8 hSIRPaV8 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,644 0.644 0,300 0.300 CO CO 0,066 0.066 0,061 0.061 hSIRPaV9 hSIRPaV9 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,733 0.733 0,260 0.260 CO CO 0,205 0.205 0,079 0.079

Пример 4. Способность hSIRPa.50A блокировать hCD47.Example 4. Ability of hSIRPa.50A to block hCD47.

С помощью проточной цитометрии анализировали способность антитела hSIRPa.50A блокировать связывание рекомбинантного белка hCD47/Fc (R&D Systems, номер в каталоге 4670-CD-050; SEQ ID NO: 109) с экспрессированным на поверхности клетки hSIRPa. Для данной цели линии клеток моноцитов ТНР-1 (АТСС TIB-202) и U-937 (ATCC CRL-1593.2) использовали в качестве источника hSIRPa в данном анализе. Клетки ТНР-1 и U-937 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и антителом hSIRPa.50A (200 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с меченным DyLight 488 рекомбинантным белком hCD47/Fc в течение 30 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).The ability of the hSIRPa.50A antibody to block the binding of recombinant hCD47/Fc protein (R&D Systems, catalog number 4670-CD-050; SEQ ID NO: 109) to hSIRPa expressed on the cell surface was analyzed using flow cytometry. For this purpose, the monocyte cell lines THP-1 (ATCC TIB-202) and U-937 (ATCC CRL-1593.2) were used as a source of hSIRPa in this assay. THP-1 and U-937 cells were seeded into 96-well culture plates with a rounded bottom and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and hSIRPa.50A antibody (200 μg/ml and its dilutions) in PBS/1 % BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 30 min at 4°C. After this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

На фиг. 4 и в следующей табл. 11 представлено, что связывание рекомбинантного hCD47, гибридизованного с доменом Fc IgG1 человека, отслеживали в присутствии возрастающих количеств антитела hSIRPa.50A. Антитело hSIRPa.50A блокировало взаимодействие hSIRPa/hCD47, что выявили, применяя способ на основе проточной цитометрии, описанный выше. Значения IC50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.In fig. 4 and in the next table. 11 shows that the binding of recombinant hCD47 hybridized to the Fc domain of human IgG1 was monitored in the presence of increasing amounts of hSIRPa.50A antibody. The hSIRPa.50A antibody blocked the hSIRPa/hCD47 interaction as determined using the flow cytometry-based method described above. IC50 values for blocking hCD47 were calculated from these data. IC 50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

Таблица 11Table 11

Антитело Antibody THP-1 THP-1 U-937 U-937 IC50 (нМ) IC50 (nM) IC50 (нМ) IC50 (nM) hSIRPa.50A hSIRPa.50A 4,605 4.605 7,164 7,164

Затем исследовали связывание hSIRPa.50A с hSIRPa, экспрессированным на первичных CD14+ моноцитах человека. Кроме того, оценивали способность hSIRPa. 50А блокировать взаимодействие между hSIRPa и рекомбинантным белком hCD47/Fc. Для данной цели CD14+ моноциты выделяли из очищенных фиколлом мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), применяя коктейль для обогащения моноцитами человека RosetteSep (Stemcell). Процент моноцитов, присутствующих после обогащения, определяли с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences), на основании окрашивания CD14, применяя детектирующее антитело мыши против CD14 человека, конъюгированное с АРС-Су7 (BD Biosciences). Затем обогащенные CD14+ МКПК высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 40 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec), содержащим антитело hSIRPa.50A (25 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА, при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с меченым FITC детектирующим антителом козы против Ig мыши (BD Biosciences) в ФБР/1% БСА в течение 40 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).The binding of hSIRPa.50A to hSIRPa expressed on primary human CD14+ monocytes was then examined. In addition, the ability of hSIRPa was assessed. 50A block the interaction between hSIRPa and the recombinant protein hCD47/Fc. For this purpose, CD14+ monocytes were isolated from Ficoll-purified human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the RosetteSep human monocyte enrichment cocktail (Stemcell). The percentage of monocytes present after enrichment was determined by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences) based on CD14 staining using a mouse anti-human CD14 detection antibody conjugated to APC-Cy7 (BD Biosciences). CD14+-enriched PBMCs were then seeded into 96-well culture plates with rounded bottoms and incubated for 40 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) containing hSIRPa.50A antibody (25 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA, at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with FITC-labeled goat anti-mouse Ig detection antibody (BD Biosciences) in PBS/1% BSA for 40 min at 4°C. Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

На фиг. 5А и В и в следующей табл. 12 указано, что hSIRPa.50A связывается с первичными обогащенными CD14+ моноцитами человека. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания. Чтобы оценить блокирующую способность hSIRPa.50A, обогащенные CD14+ моноциты высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и антителом hSIRPa.50A (200 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. После этого клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с 10 мкг/мл меченого DyLight 488 рекомбинантного белка hCD47/Fc в течение 45 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточнойIn fig. 5A and B and in the following table. 12 indicates that hSIRPa.50A binds to primary enriched CD14+ human monocytes. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed. To evaluate the blocking ability of hSIRPa.50A, enriched CD14+ monocytes were seeded into 96-well round-bottom culture plates and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and hSIRPa.50A antibody (200 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA at 4°C. After this, the cells were washed three times with PBS/1% BSA and incubated with 10 μg/ml DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 45 min at 4°C. After this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow

- 85 043743 цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). На фиг. 5С и D и в следующей табл. 12 продемонстрирована способность антитела hSIRPa.50A блокировать взаимодействие hSIRPa/hCD47. Значения- 85 043743 cytometry on FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). In fig. 5C and D and in the following table. 12 demonstrates the ability of the hSIRPa.50A antibody to block the hSIRPa/hCD47 interaction. Values

IC50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.The IC 50 for blocking hCD47 was calculated from these data. IC 50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

Таблица 12Table 12

Антитело Antibody Донор 1 Donor 1 Донор 2 Donor 2 ЕС50 (нМ) EC50 (nM) IC50 (нМ) IC50 (nM) ЕС50 (нМ) EC50 (nM) IC50 (нМ) IC50 (nM) hSIRPa.50A hSIRPa.50A 7,381 7,381 4,618 4.618 3,081 3,081 1,035 1.035

Пример 5. Функциональность MAT hSIRPa.50A в анализе фагоцитоза гранулоцитами человека.Example 5: Functionality of MAT hSIRPa.50A in human granulocyte phagocytosis assay.

Для того чтобы подтвердить функциональность hSIRPa.50A в первичных иммунных клетках, гранулоциты (например, эффекторные клетки) выделяли из крови с ЭДТА здоровых доноров человека. Сначала кровь с ЭДТА от каждого донора объединяли и центрифугировали при 300 g в течение 6 мин при 20°С. Затем удаляли плазму путем аспирации и оставшиеся клетки крови осторожно ресуспендировали. Клетки обрабатывали лизирующим эритроциты (RBC) буфером (155 мМ NH4Cl; 10 мМ KHCO3) и инкубировали в течение 10 мин на льду. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 7 мин. Супернатанты, содержащие лизированные RBC, удаляли путем аспирации и оставшиеся клетки крови осторожно ресуспендировали в лизирующем RBC буфере и держали на льду в течение 1 мин. Лизис RBC останавливали путем добавления аналитической среды (IMDM (Gibco), дополненной 10% фетальной бьией сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)). Клетки крови центрифугировали при 300 g в течение 6 минут и супернатанты удаляли путем аспирации, чтобы удалить как можно больше оставшихся RBC. Затем клетки крови с лизированными эритроцитами ресуспендировали в аналитической среде, содержащей 10 нг/мл IFNy, и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Не прикрепившиеся клетки крови, содержащие гранулоциты человека, собирали путем легкой промывки культурального планшета аналитической средой (моноциты удаляли благодаря их прикреплению к пластиковой поверхности). Процент гранулоцитов, присутствующих в суспензии клеток, определяли с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences) на основании высоких значений прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Связывание hSIRPa.50A с гранулоцитами человека оценивали путем инкубации клеток в течение 30 мин при 4°С с антителом hSIRPa.50A (25 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА, содержащем 10% аутологичной сыворотки (ФБР/1% БСА/10% сыворотки). Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА/10% сыворотки и инкубировали в течение 30 мин при 4°С с меченым FITC детектирующим антителом козы против Ig мыши (BD Biosciences). После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА/10% сыворотки и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). На фиг. 6А показано, что hSIRPa.50A связывается с первичными гранулоцитами человека. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания.To confirm the functionality of hSIRPa.50A in primary immune cells, granulocytes (eg, effector cells) were isolated from EDTA blood of healthy human donors. First, EDTA blood from each donor was pooled and centrifuged at 300 g for 6 min at 20°C. The plasma was then removed by aspiration and the remaining blood cells were carefully resuspended. Cells were treated with red blood cell (RBC) lysis buffer (155 mM NH 4 Cl; 10 mM KHCO 3 ) and incubated for 10 min on ice. The cells were then centrifuged at 300 g for 7 min. Supernatants containing lysed RBCs were removed by aspiration, and the remaining blood cells were carefully resuspended in RBC lysis buffer and kept on ice for 1 min. RBC lysis was stopped by adding assay medium (IMDM (Gibco) supplemented with 10% fetal serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)). Blood cells were centrifuged at 300 g for 6 minutes and supernatants were removed by aspiration to remove as many remaining RBCs as possible. Blood cells containing lysed red blood cells were then resuspended in assay medium containing 10 ng/ml IFNy, and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity. Unattached blood cells containing human granulocytes were collected by lightly washing the culture plate with assay medium (monocytes were removed due to their adherence to the plastic surface). The percentage of granulocytes present in the cell suspension was determined by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences) based on high forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) values. The binding of hSIRPa.50A to human granulocytes was assessed by incubating the cells for 30 min at 4°C with the hSIRPa.50A antibody (25 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA containing 10% autologous serum (PBS/1% BSA/10% whey). Cells were then washed three times with PBS/1% BSA/10% serum and incubated for 30 min at 4°C with FITC-labeled goat anti-mouse Ig detection antibody (BD Biosciences). Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA/10% serum, and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). In fig. 6A shows that hSIRPa.50A binds to primary human granulocytes. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed.

Затем клетки-мишени метили флуоресцентной меткой: либо красителем для оценки пролиферации клеток eFluor450 (eBioscience) в случае клеток лимфомы Raji (ECACC 85011429), Daudi (ЕСАСС 85011437), Ramos (ECACC 85030802) и BJAB (DSMZ АСС-757), либо, в качестве альтернативы, раствором для мечения клеток Vybrant DiD (Thermo Fisher Scientific) для клеток FaDu. Мечение проводили, следуя инструкциям производителя. Меченые клетки-мишени совместно культивировали в течение 2-3 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с выделенными первичными гранулоцитами человека в соотношении 1:1 (7,5x104 клеток каждой мишени и эффектора на лунку 96-луночного культурального планшета с закругленным дном) в присутствии 0,1 мкг/мл ритуксимаба (антитела против hCD20). Кроме того, клетки совместно культивировали с 0,1 мкг/мл ритуксимаба в присутствии 10 мкг/мл hSIRPa.50A. Фагоцитоз анализировали путем определения процента гранулоцитов, положительных по eFluor450 (или DID), применяя проточную цитометрию на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).The target cells were then labeled with a fluorescent label: either the dye for assessing cell proliferation eFluor450 (eBioscience) in the case of lymphoma cells Raji (ECACC 85011429), Daudi (ECACC 85011437), Ramos (ECACC 85030802) and BJAB (DSMZ ACC-757), or, alternatively, Vybrant DiD cell labeling solution (Thermo Fisher Scientific) for FaDu cells. Labeling was performed following the manufacturer's instructions. Labeled target cells were co-cultured for 2-3 hours at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity with isolated primary human granulocytes in a 1:1 ratio (7.5x104 cells of each target and effector per well of a 96-well culture round-bottomed tablet) in the presence of 0.1 μg/ml rituximab (anti-hCD20 antibody). In addition, cells were co-cultured with 0.1 μg/ml rituximab in the presence of 10 μg/ml hSIRPa.50A. Phagocytosis was analyzed by determining the percentage of granulocytes positive for eFluor450 (or DID) using flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

По сравнению с изотипическим контролем IgG1 мыши, hSIRPa.50A эффективно повышает фагоцитоз опухолевых клеток, вызванный ритуксимабом (фиг. 6В). Той же процедуре следовали с другими существующими терапевтическими антителами, такими как 0,05 мкг/мл даратумумаба (антитела против hCD38), 0,1 мкг/мл алемтузумаба (антитела против hCD52) и 0,1 мкг/мл цетуксимаба (антитела против hEGFR) (фиг. 6С-Е). Полученные результаты продемонстрировали, что hSIRPa.50A повышает опосредованный антителами фагоцитоз опухолевых клеток гранулоцитами человека.Compared with a mouse IgG1 isotype control, hSIRPa.50A effectively enhanced rituximab-induced tumor cell phagocytosis (Fig. 6B). The same procedure was followed with other existing therapeutic antibodies such as 0.05 μg/ml daratumumab (anti-hCD38 antibody), 0.1 μg/ml alemtuzumab (anti-hCD52 antibody) and 0.1 μg/ml cetuximab (anti-hEGFR antibody) (Fig. 6C-E). Our results demonstrated that hSIRPa.50A enhances antibody-mediated phagocytosis of tumor cells by human granulocytes.

Пример 6. Функциональность MAT hSIRPa.50A в анализе фагоцитоза макрофагами человека.Example 6: Functionality of MAT hSIRPa.50A in human macrophage phagocytosis assay.

Блокирование CD47 антителом hSIRPa.50A повышает фагоцитоз опухолевых клеток лимфомы человека макрофагами человека. Макрофаги человека получали путем сначала обогащения CD14+ моноцитами очищенных фиколлом мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), применяя коктейль для обогащения моноцитами человека RosetteSep (Stemcell). Моноциты высевали в 96- 86 043743 луночные микропланшеты с плоским дном CellCarrier (Perkin Elmer) и культивировали в среде для макрофагов (IMDM (Gibco), дополненной 8,5% фетальной бьией сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), содержащей 50 нг/мл колониестимулирующего фактора моноцитов человека (M-CSF), в течение 7 дней при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%, чтобы вызвать дифференцировку в макрофаги. Данные полученные из моноцитов макрофаги (MDM) прикрепляются к субстрату, позволяя смыть другие клетки. Клетки лимфомы человека Raji, Daudi, Ramos и BJAB подсчитывали и метили красителем для оценки пролиферации клеток eFluor450 (eBioscience), следуя инструкциям производителя. После мечения клетки лимфомы смешивали с аналитической средой (RPMI (Gibco), дополненной 10% фетальной бычей сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), содержащей 10 мкг/мл антитела против hSIRPa, соответствующие изотипические контроли и либо 0,1 мкг/мл ритуксимаба (антитела против hCD20), либо 0,05 мкг/мл даратумумаба (антитела против hCD38). Клетки лимфомы затем добавляли в отдельные лунки, содержащие MDM, при соотношении опухолевых клеток и фагоцитов 2,5:1, смешивали и инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в течение 2 ч. После инкубации лунки промывали ФБР, чтобы удалить большую часть нефагоцитированных опухолевых клеток, и клетки фиксировали в 2% формальдегиде в течение 10 мин при КТ. Лунки затем промывали и выдерживали в ФБР/3% БСА в темноте при 4°С в течение ночи. Клетки лимфомы, присутствующие в лунках, окрашивали конъюгированным с биотином клоном HIB19 антитела против CD19 человека (eBioscience) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем доокрашивали конъюгированным с Alexa Fluor 488 стрептавидином (Thermo Fisher Scientific) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем окрашивали ядра DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific) в течение 10 мин при комнатной температуре, смесь удаляли и добавляли ФБР в каждую лунку. Клетки анализировали с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа Operetta (Perkin Elmer). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения Columbus версии 2.6.Blocking CD47 with hSIRPa.50A enhances phagocytosis of human lymphoma tumor cells by human macrophages. Human macrophages were generated by first enriching CD14+ monocytes from Ficoll-purified human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the RosetteSep human monocyte enrichment cocktail (Stemcell). Monocytes were seeded into 96-86 043743 CellCarrier flat-bottomed microplates (Perkin Elmer) and cultured in macrophage medium (IMDM (Gibco) supplemented with 8.5% fetal serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)) containing 50 ng/ml human monocyte colony stimulating factor (M-CSF), for 7 days at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity to induce differentiation into macrophages. These monocyte-derived macrophages (MDMs) adhere to the substrate, allowing other cells to be washed away. Raji, Daudi, Ramos, and BJAB human lymphoma cells were counted and labeled with cell proliferation dye eFluor450 (eBioscience) following the manufacturer's instructions. After labeling, lymphoma cells were mixed with assay medium (RPMI (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)) containing 10 μg/ml anti-hSIRPa antibody, appropriate isotype controls, and either 0.1 μg /ml rituximab (antibodies against hCD20), or 0.05 μg/ml daratumumab (antibodies against hCD38). Lymphoma cells were then added to individual wells containing MDM at a tumor cell to phagocyte ratio of 2.5:1, mixed and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 2 hours. After incubation, the wells were washed with PBS to remove most of the nonphagocytosed tumor cells, and the cells were fixed in 2% formaldehyde for 10 min at RT. The wells were then washed and kept in PBS/3% BSA in the dark at 4°C overnight. Lymphoma cells present in the wells were stained with biotin-conjugated anti-human CD19 antibody clone HIB19 (eBioscience) for 1 h at room temperature and then counterstained with Alexa Fluor 488-conjugated streptavidin (Thermo Fisher Scientific) for 1 h at room temperature. The nuclei were then stained with DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific) for 10 min at room temperature, the mixture was removed, and PBS was added to each well. Cells were analyzed using an Operetta automated fluorescence microscope (Perkin Elmer). The results were processed and analyzed using Columbus software version 2.6.

На фиг. 7 показано, что hSIRPa.50A повышает опосредованную ритуксимабом и даратумумабом фагоцитарную активность. Проводили количественный анализ фагоцитоза клеток лимфомы человека, используя индекс фагоцитоза, описанный далее: (количество опухолевых клеток внутри макрофагов/количество макрофагов)х100; подсчитывая по меньшей мере 200 макрофагов на образец.In fig. 7 shows that hSIRPa.50A increases rituximab- and daratumumab-mediated phagocytic activity. A quantitative analysis of phagocytosis of human lymphoma cells was carried out using the phagocytosis index described below: (number of tumor cells inside macrophages/number of macrophages)x100; counting at least 200 macrophages per sample.

Пример 7. Разработка гуманизированного антитела и прививка CDR.Example 7 Humanized Antibody Development and CDR Grafting.

Антитело мыши hSIRPa.50A гуманизировали, применяя методику прививки CDR (см., например, патент США № 5225539 и Williams, D.G. и др., 2010, Antibody Engineering, том 1, глава 21).The hSIRPa.50A mouse antibody was humanized using the CDR grafting technique (see, for example, US Pat. No. 5,225,539 and Williams, D.G. et al., 2010, Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 21).

Сначала идентифицировали человеческие зародышевые последовательности, применяя IgBLAST (Ye J. и др., 2013, Nucleic Acids Res. 41:W34-40). Для человеческой зародышевой последовательности VH hSIRPa.50A был идентифицирован V-ген IGHV1/OR15-2*02 (идентичность 75,2%) и для человеческой зародышевой последовательности VL был идентифицирован IGKV1-27*01 (идентичность 74,0%). Данные две зародышевые последовательности использовали для непосредственной прививки последовательностей CDR мыши, в результате чего получили следующие две конструкции кДНК: SEQ ID NO: 17 (VH) и SEQ ID NO: 25 (VL).First, human germline sequences were identified using IgBLAST (Ye J. et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41:W34-40). For the human VH germline sequence hSIRPa.50A, the V gene IGHV1/OR15-2*02 (75.2% identity) was identified and for the human VL germline sequence IGKV1-27*01 (74.0% identity) was identified. These two seed sequences were used to graft the mouse CDR sequences directly, resulting in the following two cDNA constructs: SEQ ID NO: 17 (VH) and SEQ ID NO: 25 (VL).

Затем создали базу данных, содержащую все человеческие последовательности, доступные в базе данных IMGT (Lefranc, M.-P. и др., 1999, Nucleic Acid Res. 27:209-212), в которой было идентифицировано 85848 отдельных последовательностей. Данные последовательности запрашивали в TBLASTN (2.2.31+), чтобы идентифицировать шаблонные последовательности, которые демонстрируют наибольшую идентичность каркасам последовательностей VH и VL hSIRPa.50A. Было идентифицировано три последовательности VH и три последовательности VL, которые продемонстрировали показатель подобия 75% или выше и у которых были сходные длины CDR, предпочтительно идентичные таковым в CDR1, CDR2, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 VL hSIRPa.50, соответственно.A database was then created containing all human sequences available in the IMGT database (Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acid Res. 27:209-212), in which 85,848 individual sequences were identified. Sequence data was queried in TBLASTN (2.2.31+) to identify template sequences that showed the highest identity to the backbone VH and VL sequences of hSIRPa.50A. Three VH sequences and three VL sequences were identified that demonstrated a similarity score of 75% or higher and that had similar CDR lengths, preferably identical to those in CDR1, CDR2, CDR3 VH and CDR1, CDR2 and CDR3 VL hSIRPa.50, respectively.

Для тяжелой цепи каркасы, кодируемые последовательностями под номерами доступа в GenBank (Benson, D.A. и др., 2013, Nucleic Acids Res. 41(D1): D36-42) AB066948, AB067235 и U84168, выбирали в качестве матриц для прямой прививки последовательностей CDR VH hSIRPa.50A, в результате чего получали следующие конструкции кДНК: SEQ ID NO: 9, 11 и 13, соответственно. Для легкой цепи каркасы, кодируемые последовательностями под номерами доступа в GenBank JF894288, АВ363321 и L12101, выбирали в качестве матриц для прямой прививки последовательностей CDR VL hSIRPa.50A, в результате чего получали следующие конструкции кДНК: SEQ ID NO: 19, 21 и 23. Определения каркаса и CDR соответствуют описаным у Kabat и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., и др., Департамент здравоохранения и социальных служб США (1983)).For the heavy chain, scaffolds encoded by GenBank accession numbers (Benson, D.A. et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41(D1): D36-42) AB066948, AB067235, and U84168 were selected as templates for direct grafting of CDR sequences VH hSIRPa.50A, resulting in the following cDNA constructs: SEQ ID NO: 9, 11 and 13, respectively. For the light chain, scaffolds encoded by GenBank accession numbers JF894288, AB363321, and L12101 were selected as templates for direct grafting of hSIRPa.50A VL CDR sequences, resulting in the following cDNA constructs: SEQ ID NOs: 19, 21, and 23. The scaffold and CDR definitions are as described in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., US Department of Health and Human Services (1983)).

Для того чтобы понять влияние гуманизированных каркасных остатков на структуру Fv, создали гомологичную модель Fv hSIRPa.50A мыши, применяя Antibody Modeling Cascade (параметры по умолчанию) в составе Discovery Studio 4.5. Гомологичную модель строили на основе PDB ID 1CIC для легкой цепи и Fv и PDB ID 4Q0X для тяжелой цепи. Последовательности CDR прививали in silico, чтобы исследовать остатки, которые расположены близко к любому из CDR и которые могут влиять на конформацию петли, называемые остатками Верньера. Идентифицировали остатки, которые могут влиять на конформацию петли и которые находятся в пределах < 5А от поверхности CDR, и заменили их на амиTo understand the effect of humanized scaffold residues on Fv structure, a homologous mouse Fv model hSIRPa.50A was created using Antibody Modeling Cascade (default parameters) within Discovery Studio 4.5. The homologous model was built based on PDB ID 1CIC for the light chain and Fv and PDB ID 4Q0X for the heavy chain. CDR sequences were grafted in silico to examine residues that are located close to any of the CDRs and that may influence the conformation of the loop, called Vernier residues. We identified residues that could influence loop conformation that were within <5A of the CDR surface and replaced them with ami

- 87 043743 нокислоту мыши в данном положении. В полученных в результате этого матрицах проверяли присутствие мотивов посттрансляционных модификаций (ПТМ), применяя Discovery Studio 4.5, и где это возможно (т.е. не остатки CDR, не остатки Верньера) заменяли их, чтобы предотвратить ПТМ. Для тяжелой цепи удаление мотивов ПТМ предсказанной последовательности и структурные ограничения (т.е. жесткость каркаса) в VH hSIRPa.50A привели к разработке одной дополнительной конструкции: SEQ ID NO: 15. Для легкой цепи удаление ПТМ привело к разработке следующей конструкции: SEQ ID NO: 27.- 87 043743 mouse acid in this position. The resulting matrices were checked for the presence of post-translational modification motifs (PTMs) using Discovery Studio 4.5 and where possible (i.e., non-CDR residues, non-Vernier residues) replaced to prevent PTMs. For the heavy chain, removal of the predicted sequence PTM motifs and structural constraints (i.e., scaffold rigidity) in the hSIRPa.50A VH led to the development of one additional construct: SEQ ID NO: 15. For the light chain, removal of the PTM led to the development of the following construct: SEQ ID NO: 27.

Последовательности CDR прививали на каждую из идентифицированных матриц, экспрессированных в виде IgG4 (SEQ ID NO: 65), каппа (SEQ ID NO: 63) антитела человека, клонированного в вектор pcDNA3.1(+) (Thermo Fisher Scientific) для временной трансфекции клеток эмбриональной почки человека FreeStyle 293-F (HEK293T/17, АТСС CRL-11268). В каждом случае использовали вариант IgG4, несущий стабилизирующую мутацию Adair (Angal S. и др., 1993, Mol Immunol. 30: 105-108), где серин 228 превращен в пролин.CDR sequences were grafted onto each of the identified templates expressed as IgG4 (SEQ ID NO: 65), kappa (SEQ ID NO: 63) human antibody cloned into the pcDNA3.1(+) vector (Thermo Fisher Scientific) to transiently transfect cells human embryonic kidney FreeStyle 293-F (HEK293T/17, ATCC CRL-11268). In each case, an IgG4 variant carrying the Adair stabilizing mutation was used (Angal S. et al., 1993, Mol Immunol. 30: 105-108), where serine 228 is converted to proline.

Пример 8. Синтез, экспрессия и очистка гуманизированных конструкций.Example 8 Synthesis, expression and purification of humanized constructs.

Плазмиды, кодирующие конструкции тяжелых цепей и легких цепей, смешивали в соотношении 1:1 (всего 30 мкг) и временно экспрессировали путем трансфекции ими клеток FreeStyle 293-F, применяя реагент для трансфекции 293fectin(Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Супернатанты (30 мл) собирали через 7 дней и антитела очищали, применяя смолу с белком A MabSelect Sure, следуя инструкциям производителя (GE Healthcare). Буфер заменяли на буфер 10 мМ гистидин, 100 мМ NaCl, pH 5,5, применяя колонки для высаливания Zeba (Thermo Fisher Scientific). Концентрацию очищенных антител определяли на основании ОП на 280 нм (Nanodrop ND-1000). Уровень эндотоксина определяли с помощью ЛАЛ-теста, следуя инструкциям производителя (Lonza).Plasmids encoding the heavy chain and light chain constructs were mixed in a 1:1 ratio (30 μg total) and transiently expressed by transfecting them into FreeStyle 293-F cells using 293fectin transfection reagent (Invitrogen) following the manufacturer's instructions. Supernatants (30 ml) were collected after 7 days and antibodies were purified using MabSelect Sure protein A resin following the manufacturer's instructions (GE Healthcare). The buffer was changed to 10 mM histidine, 100 mM NaCl, pH 5.5 using Zeba salting out columns (Thermo Fisher Scientific). The concentration of purified antibodies was determined based on the OD at 280 nm (Nanodrop ND-1000). Endotoxin levels were determined using the LAL test following the manufacturer's instructions (Lonza).

Пример 9. Связывание гуманизированных антител SIRPa.Example 9 Binding of Humanized SIRPa Antibodies.

Связывание гуманизированных антител против hSIRPa исследовали в формате CELISA. Связывание антител против hSIRPa с SIRPaV1, SIRPaV2, hSIRPe1 и hSIRPy человека подтверждали, применяя клетки Сно-Κι, которые были временно трансфицированы кДНК, кодирующей полноразмерную открытую рамку считывания каждой из данных соответствующих мишеней, субклонированную в вектор pCIneo. Клетки CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPp1 и CHO-K1.hSIRPy высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% до достижения конфлюэнтности слоев клеток. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (10 мкг/мл и ее разведения). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с конъюгатом антител козы против IgG человека с HRP (Jackson Immuno Research) или с конъюгатом антител козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность антитела против hSIRPa с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). В табл. 13 представлены значения ЕС50 гуманизированных антител против hSIRPa.The binding of humanized anti-hSIRPa antibodies was examined in CELISA format. Binding of anti-hSIRPa antibodies to human SIRPaV1, SIRPaV2, hSIRPe1 and hSIRPy was confirmed using Cho-Κι cells that had been transiently transfected with cDNA encoding the full-length open reading frame of each of these respective targets subcloned into the pCIneo vector. CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPp1 and CHO-K1.hSIRPy cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin ( Gibco)), into 96-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity until the cell layers were confluent. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with purified anti-hSIRPa antibodies (10 μg/ml and its dilutions). Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-human IgG-HRP conjugate (Jackson Immuno Research) or goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T and anti-hSIRPa antibody immunoreactivity was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). Reactions were stopped by adding 0.5 M H2SO4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC 50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). In table 13 shows the EC 50 values of humanized antibodies against hSIRPa.

Табл. 13. Связывание гуманизированного и исходного антител hSIRPa. 50А с клетками СНОK1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 и CHO-K1.hSIRPy. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).Table 13. Binding of humanized and parent hSIRPa antibodies. 50A with CHOK1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-K1.hSIRPe1 and CHO-K1.hSIRPy cells. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

Таблица 13Table 13

Антител о Antibody Связывание hSIRPaVl, EC50 (нМ) Binding hSIRPaVl, EC50 (nM) Связывание hSIRPaV2, ЕС50 (нМ) Binding hSIRPaV2, EC50 (nM) Связывание hSIRPpi, ЕС50 (нМ) Binding hSIRPpi, EC50 (nM) Связывание hSIRPy, ЕС50 (нМ) Binding hSIRPy, EC50 (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO hSIRPa.5 0H1L1 hSIRPa.5 0H1L1 0,883 0.883 0,212 0.212 0,864 0.864 0,109 0.109 н/о But н/о But 1,485* 1.485* 0,120 0.120 hSIRPa.5 0H1L2 hSIRPa.5 0H1L2 0,781 0.781 0,104 0.104 0,816 0.816 0,161 0.161 н/о But н/о But 1,259* 1.259* 0,155 0.155 hSIRPa.5 0H1L3 hSIRPa.5 0H1L3 1,094 1,094 0,112 0.112 1,107 1.107 0,238 0.238 н/о But н/о But 2,579* 2.579* 0,672 0.672 hSIRPa.5 0H1L4 hSIRPa.5 0H1L4 1,488 1,488 0,259 0.259 1,621 1.621 0,320 0.320 н/о But н/о But 7,435* 7.435* 0,208 0.208

- 88 043743- 88 043743

hSIRPa.5 0H1L5 hSIRPa.5 0H1L5 0,962 0.962 0,235 0.235 0,848 0.848 0,239 0.239 h/o h/o h/o h/o 1,013* 1.013* 0,115 0.115 hSIRPa.5 0H3L1 hSIRPa.5 0H3L1 1,097 1,097 0,286 0.286 1,056 1.056 0,303 0.303 h/o h/o h/o h/o 1,424* 1.424* 0,080 0.080 hSIRPa.5 0H3L2 hSIRPa.5 0H3L2 1,055 1.055 0,347 0.347 0,999 0.999 0,450 0.450 h/o h/o h/o h/o 1,502* 1,502* 0,305 0.305 hSIRPa.5 0H3L3 hSIRPa.5 0H3L3 1,159 1.159 0,417 0.417 1,160 1,160 0,429 0.429 h/o h/o h/o h/o 2,471* 2.471* 0,530 0.530 hSIRPa.5 0H3L4 hSIRPa.5 0H3L4 1,261 1.261 0,317 0.317 1,520 1,520 0,333 0.333 h/o h/o h/o h/o 5,175* 5.175* 0,210 0.210 hSIRPa.5 0H3L5 hSIRPa.5 0H3L5 0,878 0.878 0,097 0.097 0,868 0.868 0,190 0.190 h/o h/o h/o h/o 1,199* 1,199* 0,120 0.120 hSIRPa.5 0H4L1 hSIRPa.5 0H4L1 0,683 0.683 0,027 0.027 0,681 0.681 0,156 0.156 h/o h/o h/o h/o 0,950* 0.950* 0,171 0.171 hSIRPa.5 0H4L2 hSIRPa.5 0H4L2 0,737 0.737 0,110 0.110 0,651 0.651 0,147 0.147 h/o h/o h/o h/o 0,871* 0.871* 0,062 0.062 hSIRPa.5 0H4L3 hSIRPa.5 0H4L3 0,933 0.933 0,078 0.078 0,898 0.898 0,133 0.133 h/o h/o h/o h/o 1,596* 1,596* 0,144 0.144 hSIRPa.5 0H4L4 hSIRPa.5 0H4L4 1,197 1,197 0,175 0.175 1,240 1,240 0,238 0.238 h/o h/o h/o h/o 1,980* 1,980* 0,681 0.681 hSIRPa.5 0H4L5 hSIRPa.5 0H4L5 0,701 0.701 0,136 0.136 0,661 0.661 0,161 0.161 h/o h/o h/o h/o 0,808* 0.808* 0,038 0.038 hSIRPa.5 0H5L1 hSIRPa.5 0H5L1 0,731 0.731 0,039 0.039 0,709 0.709 0,063 0.063 h/o h/o h/o h/o 1,028* 1.028* 0,087 0.087 hSIRPa.5 0H5L2 hSIRPa.5 0H5L2 0,675 0.675 0,086 0.086 0,572 0.572 0,023 0.023 h/o h/o h/o h/o 0,822* 0.822* 0,046 0.046 hSIRPa.5 0H5L3 hSIRPa.5 0H5L3 1,029 1.029 0,084 0.084 0,796 0.796 0,004 0.004 h/o h/o h/o h/o 1,612* 1.612* 0,247 0.247 hSIRPa.5 0H5L4 hSIRPa.5 0H5L4 1,169 1.169 0,197 0.197 1,115 1.115 0,060 0.060 h/o h/o h/o h/o 4,028* 4.028* 0,342 0.342 hSIRPa.5 0H5L5 hSIRPa.5 0H5L5 0,681 0.681 0,066 0.066 0,611 0.611 0,030 0.030 h/o h/o h/o h/o 0,868* 0.868* 0,028 0.028 hSIRPa.5 0A hSIRPa.5 0A 1,365 1.365 0,164 0.164 1,296 1,296 0,186 0.186 h/o h/o h/o h/o 1,249* 1.249* 0,179 0.179

Стоит отметить, что варианты с тяжелой цепью Н2 не возможно было экспрессировать в клетках FreeStyle 293-F; значения, помеченые *, были экстраполированы; н/о - не обнаружено.It is worth noting that H2 heavy chain variants could not be expressed in FreeStyle 293-F cells; values marked * were extrapolated; n/a - not found.

Связывание исходного и гуманизированного антител против hSIRPa с hSIRPy дополнительно оценивали, применяя клетки NK-92MI (АТСС CRL-2408) - линию клеток-естественных киллеров, независимых от интерлейкина-2 (IL-2), полученную из линии клеток NK-92. Клетки NK-92MI высевали в 96луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 30 мин с вариантами гуманизированного антитела hSIRPa.50A (100 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали в течение 30 мин при 4°С с меченым FITC детектирующим антителом мыши против IgG4 человека (Abcam) или детектирующим антителом осла против IgG мыши (Jackson Immuno Research) в ФБР/1% БСА. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения Flow Jo версии 10 (FlowJo, LLC).Binding of parent and humanized anti-hSIRPa antibodies to hSIRPy was further assessed using NK-92MI cells (ATCC CRL-2408), an interleukin-2 (IL-2) independent natural killer cell line derived from the NK-92 cell line. NK-92MI cells were seeded in 96-well round-bottom culture plates and incubated for 30 min with humanized antibody variants hSIRPa.50A (100 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated for 30 min at 4°C with FITC-labeled mouse anti-human IgG4 detection antibody (Abcam) or donkey anti-mouse IgG detection antibody (Jackson Immuno Research) in PBS/1% BSA. . Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA, and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using Flow Jo software version 10 (FlowJo, LLC).

Пример 10. Блокирование связывания hCD47 с hSIRPa гуманизированными антителами hSIRPa.50A.Example 10. Blocking the binding of hCD47 to hSIRPa with humanized antibodies hSIRPa.50A.

Блокирование hCD47 оценивали с помощью проточной цитометрии полной панели гуманизированных антител hSIRPa.50A. Для этой цели клетки HEK293 (АТСС CRL-1573) временно трансфицировали, применяя липофектамин 2000 (Invitrogen), вектором pCI-neo, кодирующим полноразмерную открытую рамку считывания SIRPaV1 человека. Трансфицированные клетки культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в среде (DMEM-F12 (Gibco) с 10% фетальной бычей сывороткой (Gibco) и пеницилли- 89 043743 ном/стрептомицином (Gibco)) до достижения конфлюэнтности. Затем клетки отделяли, высевали в 96луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 30 мин с вариантами гуманизированного антитела hSIRPa.50A (100 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с рекомбинантным белком hCD47/Fc (ModiQuest; SEQ ID NO: 42) в течение 30 мин при 4°С. Впоследствии клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали в течение 30 мин при 4°С с детектирующим антителом мыши против шарнира IgG1 человека, конъюгированным с FITC (Southern. Biotech). После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC) и наносили на график, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (фиг. 8).Blocking of hCD47 was assessed by flow cytometry of a complete panel of humanized hSIRPa.50A antibodies. For this purpose, HEK293 cells (ATCC CRL-1573) were transiently transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) with the pCI-neo vector encoding the full-length human SIRPaV1 open reading frame. Transfected cells were cultured at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity in medium (DMEM-F12 (Gibco) with 10% fetal bovine serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)) until confluent. Cells were then separated, seeded into 96-well round-bottom culture plates and incubated for 30 min with humanized antibody variants hSIRPa.50A (100 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with recombinant hCD47/Fc protein (ModiQuest; SEQ ID NO: 42) for 30 min at 4°C. Cells were subsequently washed three times with PBS/1% BSA and incubated for 30 min at 4°C with mouse anti-human IgG1 hinge detection antibody conjugated to FITC (Southern. Biotech). Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA, and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC) and plotted using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (Fig. 8).

Как показано на фиг. 8, отслеживали связывание рекомбинантного hCD47, гибридизованного с доменом Fc IgG1 человека, в присутствии возрастающих количеств вариантов гуманизированного антитела hSIRPa.50A. Все варианты антитела блокировали взаимодействие hSIRPa/hCD47.As shown in FIG. 8, the binding of recombinant hCD47 hybridized to the Fc domain of human IgG1 was monitored in the presence of increasing amounts of humanized antibody variants hSIRPa.50A. All antibody variants blocked the hSIRPa/hCD47 interaction.

Пример 11. Связывающий домен hSIRPa.50A.Example 11: hSIRPa.50A binding domain.

Для того чтобы определить область связывания hSIRPa.50A было разработано несколько мутантов обмена SIRPa на основе последовательностей аминокислот SIRPaV1 и hSIRPe1 человека. В зависимости от укладки SIRPa внеклеточную область можно подразделить на три отдельных домена: Ig-подобный (иммуноглобулин-подобный) домен V-типа (IgV), Ig-подобный домен С1-типа (IgC1) и Ig-подобный домен С2-типа (IgC2). Домен IgV также известен как связывающий лиганд N-концевой домен SIRPa (который связывается с CD47). Мутанты SIRPaV1/e1 человека были разработаны на основе полноразмерной последовательности hSIRPaV1 (SEQ ID NO: 33), и каждый отдельный Ig-подобный домен был заменен на эквивалентный домен из SIRPe1 человека (SEQ ID NO: 37). КДНК, кодирующие указанные конструкции: hSIRPa-VeC1aC2a (SEQ ID NO: 55), hSIRPa-VaC1eC2a (SEQ ID NO: 57) и hSIRPa-VaC1aC2e (SEQ ID NO: 59), - синтезировали (GeneArt) и субклонировали в вектор pCI-neo. Связывание hSIRPa.50A с мутантами обмена исследовали, применяя CELISA. Для этой цели клетки СНО-К1 временно трансфицировали, применяя липофектамин 2000, векторами pCI-neo, кодирующими hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPa-VeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a и hSIRPa-VaC1aC2e, соответственно. Трансфицированные клетки культивировали при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% в среде (DMEM-F12 (Gibco) с 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)) до достижения конфлюэнтности. Затем клетки трипсинизировали и высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в культуральной среде до достижения конфлюэнтности. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с антителом hSIRPa.50A и клоном SE5A5 антитела против hSIRPa. Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с конъюгатом антитела козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech). После этого клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность антитела против hSIRPa с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм.To define the binding region of hSIRPa.50A, several SIRPa exchange mutants were designed based on the amino acid sequences of human SIRPaV1 and hSIRPe1. Depending on the folding of SIRPa, the extracellular region can be divided into three distinct domains: V-type Ig-like (immunoglobulin-like) domain (IgV), C1-type Ig-like domain (IgC1), and C2-type Ig-like domain (IgC2). ). The IgV domain is also known as the ligand binding N-terminal domain of SIRPa (which binds CD47). Human SIRPaV1/e1 mutants were designed based on the full-length hSIRPaV1 sequence (SEQ ID NO: 33), and each individual Ig-like domain was replaced with the equivalent domain from human SIRPe1 (SEQ ID NO: 37). cDNAs encoding the indicated constructs: hSIRPa-VeC1aC2a (SEQ ID NO: 55), hSIRPa-VaC1eC2a (SEQ ID NO: 57) and hSIRPa-VaC1aC2e (SEQ ID NO: 59) were synthesized (GeneArt) and subcloned into the vector pCI- neo. The binding of hSIRPa.50A to exchange mutants was examined using CELISA. For this purpose, CHO-K1 cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 with pCI-neo vectors encoding hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRPa-VeC1aC2a, hSIRPa-VaC1eC2a and hSIRPa-VaC1aC2e, respectively. Transfected cells were cultured at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity in medium (DMEM-F12 (Gibco) with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin (Gibco)) until confluent. Cells were then trypsinized and seeded into 96-well flat-bottom culture plates and cultured at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity in culture medium until confluent. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with hSIRPa.50A antibody and anti-hSIRPa antibody clone SE5A5. Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T and anti-hSIRPa antibody immunoreactivity was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). Reactions were stopped by adding 0.5 M H2SO4 and absorbance was read at 450 and 610 nm.

Продемонстрировали утрату связывания антитела согласно настоящему изобретению с мутантом hSIRPa-VeC1aC2a, что свидетельствует о связывании hSIRPa.50A с доменом IgV hSIRPa (фиг. 9, табл. 14). Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).Loss of binding of the antibody of the present invention to the hSIRPa-VeC1aC2a mutant was demonstrated, indicating binding of hSIRPa.50A to the IgV domain of hSIRPa (Fig. 9, Table 14). EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

- 90 043743- 90 043743

Таблица 14Table 14

Антитело Antibody hSIRPa.50A hSIRPa.50A Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) hSIRPaVl hSIRPaVl EC50 (hM) EC50 (hM) 0,321 0.321 0,117 0.117 CO CO 0,018 0.018 0,001 0.001 hSIRPaV2 hSIRPaV2 EC50 (hM) EC50 (hM) 0,215 0.215 0,084 0.084 CO CO 0,012 0.012 0,012 0.012 hSIRPpl hSIRPpl EC50 (hM) EC50 (hM) h/o h/o 0,180 0.180 CO CO h/o h/o 0,025 0.025 hSIRPa- VpClaC2a hSIRPa- VpClaC2a EC50 (hM) EC50 (hM) h/o h/o 0,121 0.121 CO CO h/o h/o 0,003 0.003 hSIRPa- VaClpC2a hSIRPa- VaClpC2a EC50 (hM) EC50 (hM) 0,345 0.345 0,135 0.135 CO CO 0,008 0.008 0,013 0.013 hSIRPa- VaClaC2p hSIRPa- VaClaC2p EC50 (hM) EC50 (hM) 0,408 0.408 0,127 0.127 CO CO 0,039 0.039 0,028 0.028

Для того чтобы точно определить аминокислоты, участвующие во взаимодействии hSIRPα.50А с доменом IgV, получили несколько точечных мутантов hSIRPaV1 на основании различий в отдельных аминокислотах между hSIRPaV1/V2 и hSIRPe1. На фиг. 10А показано выравнивание домена IgV hSIRPa и hSIRPpL Аминокислоты в домене IgV hSIRPa, которые изменены в hSIRPp1, мутировали, применяя набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II (Stratagene) и полноразмерную последовательность hSIRPaV1 (SEQ ID NO: 33) в качестве донора кДНК. Связывание hSIRPa.50A с точечными мутантами hSIRPaV1 исследовали, применяя CELISA. Для этой цели клетки СНО-Ki временно трансфицировали, применяя липофектамин 2000, кДНК, кодирующей полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1 и его мутантов и hSIRPe1, субклонированную в вектор pCI-neo. Трансфицированные клетки высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в течение 24 ч. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (используемыми при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с антителом козы против IgG мыши-HRP (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность против hSIRPaV1, мутантов hSIRPaV1 и hSIRPp1 с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах). На фиг. 10В и в следующей табл. 15 показано, что пролин в положении 74 (Р74) представляет собой важную аминокислоту для специфического связывания hSIRPa.50A с hSIRPaV1. Экспрессия hSIRPaV1(P74A) (SEQ ID NO: 61), в котором Р74 заменен на аланин, на клетках СНО-Ki приводит к утрате связывания антитела hSIRPa.50A. Данный пролин отсутствует в последовательности домена IgV hSIRPpLTo precisely identify the amino acids involved in the interaction of hSIRPα.50A with the IgV domain, several point mutants of hSIRPaV1 were generated based on differences in individual amino acids between hSIRPaV1/V2 and hSIRPe1. In fig. 10A shows an alignment of the IgV domain of hSIRPa and hSIRPpL. The amino acids in the IgV domain of hSIRPa that are altered in hSIRPp1 were mutated using the QuikChange II site-directed mutagenesis kit (Stratagene) and the full-length hSIRPaV1 sequence (SEQ ID NO: 33) as donor cDNA. The binding of hSIRPa.50A to hSIRPaV1 point mutants was examined using CELISA. For this purpose, CHO-Ki cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 with cDNA encoding the full-length open reading frame of hSIRPaV1 and its mutants and hSIRPe1 subcloned into the pCI-neo vector. Transfected cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin (Gibco)) in 96-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 24 hours. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with purified anti-hSIRPa antibodies (used at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions) . Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T and immunoreactivity against hSIRPaV1, hSIRPaV1 and hSIRPp1 mutants was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC 50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments). In fig. 10B and in the following table. 15 shows that proline at position 74 (P74) is an important amino acid for the specific binding of hSIRPa.50A to hSIRPaV1. Expression of hSIRPaV1(P74A) (SEQ ID NO: 61), in which P74 is replaced by alanine, on CHO-Ki cells results in loss of hSIRPa.50A antibody binding. This proline is absent from the IgV hSIRPpL domain sequence

Таблица 15Table 15

Антитело Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPpi, ЕС50 (нМ) hSIRPpi binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl(P74A), ЕС50 (нМ) Binding hSIRPaVl(P74A), EC50 (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO hSIRPa.50A hSIRPa.50A 0,535 0.535 0,152 0.152 н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против Antibody against 0,164 0.164 0,008 0.008 0,156 0.156 0,009 0.009 0,150 0.150 0,013 0.013 hSIRPa (клон SE5A5) hSIRPa (clone SE5A5)

Пример 12. Определение характеристик антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A.Example 12. Characterization of antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A.

Специфичность связывания антител hSIRPa.40A и hSIRPa.50A с hSIRPa сравнивали в формате CELISA. Вкратце, клетки СНО-Ki временно трансфицировали кДНК hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPp1, hSIRPPL и hSIRPY. Затем оценивали связывание hSIRPa с помощью CELISA, применяя клетки СНОThe binding specificity of hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies to hSIRPa was compared in CELISA format. Briefly, CHO-Ki cells were transiently transfected with hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPp1, hSIRPPL, and hSIRPY cDNAs. hSIRPa binding was then assessed by CELISA using CHO cells

- 91 043743- 91 043743

K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-Kl.hSIRPpi, CHO-Kl.hSIRPpL и СНО-Kl.hSIRPy. Детектирование связанного антитела осуществляли с помощью антитела козы против IgG мыши-HRP (Southern Biotech). На фиг. 11 и в следующей табл. 16 показано, что антитела hSIRPa.40A и hSIRPa.50A связываются с hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPeL и hSIRPy, но не проявляют детектируемого связывания с hSIRPe1. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV2, CHO-Kl.hSIRPpi, CHO-Kl.hSIRPpL and CHO-Kl.hSIRPy. Detection of bound antibody was performed using goat anti-mouse IgG-HRP (Southern Biotech). In fig. 11 and in the next table. 16 shows that antibodies hSIRPa.40A and hSIRPa.50A bind to hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPeL and hSIRPy, but do not exhibit detectable binding to hSIRPe1. EC50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

Таблица 16Table 16

Антител о Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPpi, ЕС50 (нМ) Binding hSIRPpi, EC50 (nM) Связывание hSIRPy, ЕС50 (нМ) hSIRPy binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPpL, ЕС50 (нМ) hSIRPpL binding, EC50 (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO hSIRPa. 40А hSIRPa. 40A 0,109 0.109 0,036 0.036 0,088 0.088 0,002 0.002 н/о But н/о But 0,099 0.099 0,055 0.055 0,141 0.141 0,078 0.078 hSIRPa. 50А hSIRPa. 50A 1,428 1.428 0,371 0.371 1,156 1.156 0,127 0.127 н/о But н/о But 1,990 1,990 0,827 0.827 0,632 0.632 0,277 0.277

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

Кроме того, дополнительно исследовали специфичность hSIRPa.40A ко всем известным аллелям hSIRPa (аллельным вариантам, описанным у Takenaka и др., Nat Immunol. 8:1313-1323 (2007)) с помощью CELISA, используя такую же стратегию, как описанная выше. Для этой цели связывание hSIRPa.40A оценивали, применяя клетки Сно-Κι, которые были временно трансфицированы кДНК, кодирующими полноразмерные hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3 (NA07056_V3) (SEQ ID NO: 44), hSIRPaV4 (NA11832_V4) (SEQ ID NO: 46), hSIRPaV5 (NA18502_V5) (SEQ ID NO: 48), hSIRPaV6 (NA18507_V6) (SEQ ID NO: 50), hSIRPaV8 (NA18570_V8) (SEQ ID NO: 52), и hSIRPaV9 (NA18943_V9) (SEQ ID NO: 54). На фиг. 12 и в следующей табл. 17 продемонстрировали реакционную способность клона антитела hSIRPa.40A по отношению к каждому из данных аллелей hSIRPa. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).In addition, the specificity of hSIRPa.40A for all known hSIRPa alleles (allelic variants described in Takenaka et al., Nat Immunol. 8:1313-1323 (2007)) was further examined by CELISA using the same strategy as described above. For this purpose, hSIRPa.40A binding was assessed using Cho-Κι cells that were transiently transfected with cDNAs encoding full-length hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPaV3 (NA07056_V3) (SEQ ID NO: 44), hSIRPaV4 (NA11832_V4) (SEQ ID NO: 46) , hSIRPaV5 (NA18502_V5) (SEQ ID NO: 48), hSIRPaV6 (NA18507_V6) (SEQ ID NO: 50), hSIRPaV8 (NA18570_V8) (SEQ ID NO: 52), and hSIRPaV9 (NA18943_V9) (SEQ ID NO: 54). In fig. 12 and in the next table. 17 demonstrated the reactivity of the antibody clone hSIRPa.40A against each of these hSIRPa alleles. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

Таблица 17Table 17

Антитело Antibody hSIRPa.40A hSIRPa.40A hSIRPa.50A hSIRPa.50A hSIRPaVl hSIRPaVl EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,134 0.134 1,690 1,690 hSIRPaV2 hSIRPaV2 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,089 0.089 1,066 1,066 hSIRPaV3 hSIRPaV3 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,107 0.107 1,767 1,767 hSIRPaV4 hSIRPaV4 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,100 0.100 1,297 1,297 hSIRPaV5 hSIRPaV5 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,115 0.115 1,260 1,260 hSIRPaV6 hSIRPaV6 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,136 0.136 2,219 2,219 hSIRPaV8 hSIRPaV8 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,089 0.089 1,508 1,508 hSIRPaV9 hSIRPaV9 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,115 0.115 1,367 1,367

Пример 13. Способность hSIRPa.40А блокировать hCD47.Example 13. Ability of hSIRPa.40A to block hCD47.

С помощью проточной цитометрии анализировали способность антитела hSIRPa.40A блокировать связывание рекомбинантного белка hCD47/Fc (R&D Systems, номер в каталоге 4670-CD-050; SEQ ID NO: 109) с экспрессированным на поверхности клетки hSIRPa. Для данной цели, линии клеток моноцитов ТНР-1 (АТСС TIB-202) и U-937 (ATCC CRL-1593.2) использовали в качестве источника hSIRPa в данном анализе. Клетки ТНР-1 и U-937 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и антителом hSIRPa.40A (100 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с меченным DyLight 488 рекомбинантным белком hCD47/Fc в течение 30 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).The ability of the hSIRPa.40A antibody to block the binding of recombinant hCD47/Fc protein (R&D Systems, catalog number 4670-CD-050; SEQ ID NO: 109) to hSIRPa expressed on the cell surface was analyzed using flow cytometry. For this purpose, monocyte cell lines THP-1 (ATCC TIB-202) and U-937 (ATCC CRL-1593.2) were used as a source of hSIRPa in this assay. THP-1 and U-937 cells were seeded into 96-well culture plates with rounded bottoms and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and hSIRPa.40A antibody (100 μg/ml and its dilutions) in PBS/1 % BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 30 min at 4°C. After this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

На фиг. 13 и в следующей табл. 18 представлено, что связывание рекомбинантного hCD47, гибридизованного с доменом Fc IgG1 человека, отслеживали в присутствии возрастающих количеств антителаIn fig. 13 and in the next table. 18 shows that the binding of recombinant hCD47 hybridized to the Fc domain of human IgG1 was monitored in the presence of increasing amounts of antibody

- 92 043743 hSIRPa.40A. Антитело hSIRPa.40A блокировало взаимодействие hSIRPa/hCD47, что выявили, применяя способ на основе проточной цитометрии, описанный выше. Значения IC50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.- 92 043743 hSIRPa.40A. The hSIRPa.40A antibody blocked the hSIRPa/hCD47 interaction as determined using the flow cytometry-based method described above. IC50 values for blocking hCD47 were calculated from these data. IC50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

Таблица 18Table 18

Антитело Antibody ТНР-1 TNR-1 U-937 U-937 IC50 (нМ) IC50 (nM) IC50 (нМ) IC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,646 0.646 1,344 1,344 hSIRPa.50A hSIRPa.50A 7,833 7,833 19,501 19,501

Затем исследовали связывание hSIRPa.40A с hSIRPa, экспрессированным на первичных CD14+ моноцитах человека. Кроме того, оценивали способность hSIRPa.40A блокировать взаимодействие между hSIRPa и рекомбинантным белком hCD47/Fc. Для данной цели CD14+ моноциты выделяли из очищенных фиколлом мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), применяя коктейль для обогащения моноцитами человека RosetteSep (Stemcell). Процент моноцитов, присутствующих после обогащения, определяли с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences), на основании окрашивания CD14, применяя детектирующее антитело мыши против CD14 человека, конъюгированное с APC-Cy7(BD Biosciences). Затем обогащенные CD14+ МКПК высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 40 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec), содержащим антитело hSIRPa.40А (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА, при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с меченым Alexa Fluor 647 детектирующим антителом козы против IgG мыши (Invitrogen) в ФБР/1% БСА в течение 40 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).The binding of hSIRPa.40A to hSIRPa expressed on primary human CD14+ monocytes was then examined. In addition, the ability of hSIRPa.40A to block the interaction between hSIRPa and the recombinant hCD47/Fc protein was assessed. For this purpose, CD14+ monocytes were isolated from Ficoll-purified human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the RosetteSep human monocyte enrichment cocktail (Stemcell). The percentage of monocytes present after enrichment was determined by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences) based on CD14 staining using a mouse anti-human CD14 detection antibody conjugated to APC-Cy7 (BD Biosciences). CD14+-enriched PBMCs were then seeded into 96-well culture plates with rounded bottoms and incubated for 40 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) containing hSIRPa.40A antibody (20 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA, at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with Alexa Fluor 647-labeled goat anti-mouse IgG detection antibody (Invitrogen) in PBS/1% BSA for 40 min at 4°C. Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

На фиг. 14А и В показано, что hSIRPa.40A связывается с первичными обогащенными CD14+ моноцитами человека. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания. Для того чтобы оценить блокирующую способность hSIRPa.40A, обогащенные CD14+ моноциты высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и антителом hSIRPa.40A (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. После этого клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с 10 мкг/мл меченого DyLight 488 рекомбинантного белка hCD47/Fc в течение 45 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). На фиг. 14 С и D продемонстрирована способность антитела hSIRPa.40A блокировать взаимодействие hSIRPa/hCD47. Значения IC50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.In fig. 14A and B show that hSIRPa.40A binds to primary enriched CD14+ human monocytes. EC5 0 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed. To evaluate the blocking ability of hSIRPa.40A, CD14+ enriched monocytes were seeded into 96-well round-bottom culture plates and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and hSIRPa.40A antibody (20 μg/ml and its dilutions). ) in PBS/1% BSA at 4°C. After this, the cells were washed three times with PBS/1% BSA and incubated with 10 μg/ml DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 45 min at 4°C. Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). In fig. 14 C and D demonstrate the ability of the hSIRPa.40A antibody to block the hSIRPa/hCD47 interaction. IC 50 values for blocking hCD47 were calculated from these data. IC 50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

Пример 14. Функциональность MAT hSIRPa.40A в анализе фагоцитоза гранулоцитами человека.Example 14: Functionality of MAT hSIRPa.40A in human granulocyte phagocytosis assay.

Для того чтобы подтвердить функциональность hSIRPa.40A в первичных иммунных клетках, гранулоциты (например, эффекторные клетки) выделяли из крови с ЭДТА здоровых доноров человека. Сначала кровь с ЭДТА от каждого донора объединяли и центрифугировали при 300 g в течение 6 мин при 20°С. Затем удаляли плазму путем аспирации и оставшиеся клетки крови осторожно ресуспендировали. Клетки обрабатывали лизирующим эритроциты (RBC) буфером (155 мМ NH4Cl; 10 мМ KHCO3) и инкубировали в течение 10 мин на льду. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 7 мин. Супернатанты, содержащие лизированные RBC, удаляли путем аспирации и оставшиеся клетки крови осторожно ресуспендировали в лизирующем RBC буфере и держали на льду в течение 1 мин. Лизис RBC останавливали путем добавления аналитической среды (IMDM (Gibco), дополненной 10% фетальной бьией сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)). Клетки крови центрифугировали при 300 g в течение 6 минут и супернатанты удаляли путем аспирации, чтобы удалить как можно больше оставшихся RBC. Затем клетки крови с лизированными эритроцитами ресуспендировали в аналитической среде, содержащей 10 нг/мл IFNy, и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95%. Не прикрепившиеся клетки крови, содержащие гранулоциты человека, собирали путем легкой промывки культурального планшета аналитической средой (моноциты удаляли благодаря их прикреплению к пластиковой поверхности). Процент гранулоцитов, присутствующих в суспензии клеток, определяли с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences) на основании высоких значений прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Связывание hSIRPa.40A с гранулоцитами человека оценивали путем инкубации клеток в течение 30 мин при 4°С с антителом hSIRPa.40A (25 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА, содержащем 10% аутологичной сыворотки (ФБР/1% БСА/10% сыворотки).To confirm the functionality of hSIRPa.40A in primary immune cells, granulocytes (eg, effector cells) were isolated from EDTA blood of healthy human donors. First, EDTA blood from each donor was pooled and centrifuged at 300 g for 6 min at 20°C. The plasma was then removed by aspiration and the remaining blood cells were carefully resuspended. Cells were treated with red blood cell (RBC) lysis buffer (155 mM NH 4 Cl; 10 mM KHCO 3 ) and incubated for 10 min on ice. The cells were then centrifuged at 300 g for 7 min. Supernatants containing lysed RBCs were removed by aspiration, and the remaining blood cells were carefully resuspended in RBC lysis buffer and kept on ice for 1 min. RBC lysis was stopped by adding assay medium (IMDM (Gibco) supplemented with 10% fetal serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)). Blood cells were centrifuged at 300 g for 6 minutes and supernatants were removed by aspiration to remove as many remaining RBCs as possible. Blood cells containing lysed red blood cells were then resuspended in assay medium containing 10 ng/ml IFNy, and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity. Unattached blood cells containing human granulocytes were collected by lightly washing the culture plate with assay medium (monocytes were removed due to their adherence to the plastic surface). The percentage of granulocytes present in the cell suspension was determined by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences) based on high forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) values. The binding of hSIRPa.40A to human granulocytes was assessed by incubating the cells for 30 min at 4°C with the hSIRPa.40A antibody (25 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA containing 10% autologous serum (PBS/1% BSA/10% whey).

- 93 043743- 93 043743

Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА/10% сыворотки и инкубировали в течение 30 мин при 4°С с меченым FITC детектирующим антителом козы против Ig мыши (BD Biosciences). После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА/10% сыворотки и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). На фиг. 15А и в следующей табл. 19 показано, что hSIRPot.40A связывается с первичными гранулоцитами человека. Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания.Cells were then washed three times with PBS/1% BSA/10% serum and incubated for 30 min at 4°C with FITC-labeled goat anti-mouse Ig detection antibody (BD Biosciences). Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA/10% serum, and analyzed by flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). In fig. 15A and in the following table. 19 shows that hSIRPot.40A binds to primary human granulocytes. EC 50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed.

Таблица 19Table 19

Антитело Antibody Донор 1 Donor 1 ЕС50 (нМ) EC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 1,227 1.227 hSIRPa.50A hSIRPa.50A 4,298 4,298

Затем клетки-мишени Ramos (ЕСАСС 85030802) метили флуоресцентным красителем для оценки пролиферации клеток eFluor450 (eBioscience). Мечение проводили, следуя инструкциям производителя. Меченые клетки-мишени совместно культивировали в течение 2-3 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с выделенными первичными гранулоцитами человека в соотношении 1:1 (7,5x104 клеток каждой мишени и эффектора на лунку 96-луночного культурального планшета с закругленным дном) в присутствии 0,1 мкг/мл ритуксимаба (антитела против hCD20). Кроме того, клетки совместно культивировали с 0,1 мкг/мл ритуксимаба в присутствии 10 мкг/мл hSIRPa.40A. Фагоцитоз анализировали путем определения процента гранулоцитов, положительных по eFluor450, применяя проточную цитометрию на FACSCanto II (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC).Target cells Ramos (ECACC 85030802) were then labeled with the fluorescent cell proliferation dye eFluor450 (eBioscience). Labeling was performed following the manufacturer's instructions. Labeled target cells were co-cultured for 2-3 hours at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity with isolated primary human granulocytes in a 1:1 ratio (7.5x10 4 cells of each target and effector per well of a 96-well culture plate with a rounded bottom) in the presence of 0.1 μg/ml rituximab (antibodies against hCD20). In addition, cells were co-cultured with 0.1 μg/ml rituximab in the presence of 10 μg/ml hSIRPa.40A. Phagocytosis was analyzed by determining the percentage of granulocytes positive for eFluor450 using flow cytometry on a FACSCanto II (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC).

По сравнению с изотипическим контролем IgGl мыши, hSIRPa.40A эффективно повышает фагоцитоз опухолевых клеток, вызванный ритуксимабом (фиг. 15В).Compared with a mouse IgGl isotype control, hSIRPa.40A effectively enhanced rituximab-induced tumor cell phagocytosis (Figure 15B).

Пример 15. Функциональность MAT hSIRPa.40A в анализе фагоцитоза макрофагами человека.Example 15: Functionality of MAT hSIRPa.40A in human macrophage phagocytosis assay.

Блокирование CD47 антителом hSIRPa.40A повышает фагоцитоз опухолевых клеток лимфомы человека макрофагами человека. Макрофаги человека получали путем сначала обогащения CD 14 моноцитами очищенных фиколлом мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), применяя коктейль для обогащения моноцитами человека RosetteSep (Stemcell). Моноциты высевали в 96луночные микропланшеты с плоским дном CellCarrier (Perkin Elmer) и культивировали в среде для макрофагов (IMDM (Gibco), дополненной 8,5% фетальной бьией сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), содержащей 50 нг/мл колониестимулирующего фактора моноцитов человека (M-CSF), в течение 7 дней при 37°С, 5% СО2 и влажности 95%, чтобы вызвать дифференцировку в макрофаги. Данные полученные из моноцитов макрофаги (MDM) прикрепляются к субстрату, позволяя смыть другие клетки. Клетки лимфомы человека Raji подсчитывали и метили красителем для оценки пролиферации клеток eFluor450 (eBioscience), следуя инструкциям производителя. После мечения клетки лимфомы смешивали с аналитической средой (RPMI (Gibco), дополненной 10% фетальной бычей сывороткой (Gibco) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), содержащей 100 мкг/мл антитела против hSIRPoc и разведения указанной концентрации, соответствующее антитело изотипического контроля и 1 мкг/мл ритуксимаба (антитела против hCD20). Клетки лимфомы затем добавляли в отдельные лунки, содержащие MDM, при соотношении опухолевых клеток и фагоцитов 2,5:1, смешивали и инкубировали при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% в течение 2 ч. После инкубации лунки промывали ФБР, чтобы удалить большую часть нефагоцитированных опухолевых клеток, и клетки фиксировали в 2% формальдегиде в течение 10 мин при КТ. Лунки затем промывали и выдерживали в ФБР/3% БСА в темноте при 4°С в течение ночи. Клетки лимфомы, присутствующие в лунках, окрашивали конъюгированным с биотином клоном HIB19 антитела против CD 19 человека (eBioscience) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем доокрашивали конъюгированным с Alexa Fluor 488 стрептавидином (Thermo Fisher Scientific) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем окрашивали ядра DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific) в течение 10 мин при комнатной температуре, смесь удаляли и добавляли ФБР в каждую лунку. Клетки анализировали с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа Operetta (Perkin Elmer). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения Columbus версии 2.6.Blocking CD47 with hSIRPa.40A enhances phagocytosis of human lymphoma tumor cells by human macrophages. Human macrophages were prepared by first enriching CD 14 monocytes with Ficoll-purified human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the RosetteSep human monocyte enrichment cocktail (Stemcell). Monocytes were seeded into CellCarrier 96-well flat-bottom microplates (Perkin Elmer) and cultured in macrophage medium (IMDM (Gibco) supplemented with 8.5% fetal serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)) containing 50 ng/ml human monocyte colony-stimulating factor (M-CSF), for 7 days at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity to induce differentiation into macrophages. These monocyte-derived macrophages (MDMs) adhere to the substrate, allowing other cells to be washed away. Human Raji lymphoma cells were counted and labeled with the cell proliferation dye eFluor450 (eBioscience) following the manufacturer's instructions. After labeling, lymphoma cells were mixed with assay medium (RPMI (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (Gibco)) containing 100 μg/ml anti-hSIRPoc antibody and dilutions of the indicated concentration, the appropriate isotype control antibody, and 1 μg/ml rituximab (antibodies against hCD20). Lymphoma cells were then added to individual wells containing MDM at a tumor cell to phagocyte ratio of 2.5:1, mixed and incubated at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity for 2 hours. After incubation, the wells were washed with PBS, to remove most of the nonphagocytosed tumor cells, and the cells were fixed in 2% formaldehyde for 10 min at RT. The wells were then washed and kept in PBS/3% BSA in the dark at 4°C overnight. Lymphoma cells present in the wells were stained with biotin-conjugated anti-human CD 19 antibody clone HIB19 (eBioscience) for 1 h at room temperature and then counterstained with Alexa Fluor 488-conjugated streptavidin (Thermo Fisher Scientific) for 1 h at room temperature. . The nuclei were then stained with DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific) for 10 min at room temperature, the mixture was removed, and PBS was added to each well. Cells were analyzed using an Operetta automated fluorescence microscope (Perkin Elmer). The results were processed and analyzed using Columbus software version 2.6.

На фиг. 16 показано, что hSIRPa.40A повышает опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность. Проводили количественный анализ фагоцитоза клеток лимфомы человека, используя индекс фагоцитоза, описанный далее: (количество опухолевых клеток внутри макрофагов/количество макрофагов)х100; подсчитывая по меньшей мере 200 макрофагов на образец.In fig. 16 shows that hSIRPa.40A increases rituximab-mediated phagocytic activity. A quantitative analysis of phagocytosis of human lymphoma cells was carried out using the phagocytosis index described below: (number of tumor cells inside macrophages/number of macrophages)x100; counting at least 200 macrophages per sample.

Пример 16. Разработка гуманизированного антитела и прививка CDR.Example 16 Humanized Antibody Development and CDR Grafting.

Антитело мыши hSIRPa.40A гуманизировали, применяя методику прививки CDR (см., например, патент США № 5225539 и Williams, D.G. и др., 2010, Antibody Engineering, том 1, глава 21). Сначала идентифицировали зародышевые последовательности человека, применяя IgBLAST (Ye J. и др., NucleicThe hSIRPa.40A mouse antibody was humanized using the CDR grafting technique (see, for example, US Pat. No. 5,225,539 and Williams, D.G. et al., 2010, Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 21). First, human germline sequences were identified using IgBLAST (Ye J. et al., Nucleic

-94043743-94043743

Acids Res. 41:W34-40 (2013). Для человеческой зародышевой последовательности VH hSIRPa.40A был идентифицирован V-ген IGHV1-46*01 (идентичность 62,2%) и для человеческой зародышевой последовательности VL был идентифицирован IGKVl-39*01 (идентичность 68,4%). Данные две зародышевые последовательности использовали в качестве матрицы для прививки последовательностей CDR мыши, в результате чего получили следующие две конструкции кДНК: SEQ ID NO: 87 (VH) и SEQ ID NO: 99 (VL).Acids Res. 41:W34-40 (2013). For the human VH germline sequence hSIRPa.40A, the V gene IGHV1-46*01 (62.2% identity) was identified and for the human VL germline sequence IGKVl-39*01 (68.4% identity) was identified. These two germline sequences were used as a template to graft the mouse CDR sequences, resulting in the following two cDNA constructs: SEQ ID NO: 87 (VH) and SEQ ID NO: 99 (VL).

Затем создали базу данных, содержащую все человеческие последовательности, доступные в базе данных IMGT (Lefranc, M.-P. и др., Nucleic Acid Res. 27:209-212 (1999)), в которой было идентифицировано 85848 отдельных последовательностей. Данные последовательности запрашивали в TBLASTN (2.2.31+), чтобы идентифицировать шаблонные последовательности, которые демонстрируют наибольшую идентичность каркасам последовательностей VH и VL hSIRPa.40A. Было идентифицировано четыре последовательности VH и четыре последовательности VL, которые продемонстрировали показатель подобия 80% или выше и у которых были сходные длины CDR, предпочтительно идентичные таковым в CDR1, CDR2, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 VL hSIRPa.40, соответственно.A database was then created containing all human sequences available in the IMGT database (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acid Res. 27:209-212 (1999)), in which 85,848 individual sequences were identified. Sequence data was queried in TBLASTN (2.2.31+) to identify template sequences that showed the highest identity to the backbone VH and VL sequences of hSIRPa.40A. Four VH sequences and four VL sequences were identified that demonstrated a similarity score of 80% or higher and that had similar CDR lengths, preferably identical to those in CDR1, CDR2, CDR3 VH and CDR1, CDR2 and CDR3 VL hSIRPa.40, respectively.

Для тяжелой цепи каркасы, кодируемые последовательностями под номерами доступа в GenBank (Benson, D.A. и др., Nucleic Acids Res. 41(Dl):D36-42 (2013)) L39130, DJ031925, DJ326840 и EF177968, выбирали в качестве матриц для прививки последовательностей CDR VH hSIRPa.40A, в результате чего получали следующие конструкции кДНК: SEQ ID NO: 77, 79, 81 и 83, соответственно. Для легкой цепи каркасы, кодируемые последовательностями под номерами доступа в GenBank AY731031, DQ840993, AY942002 и DQ535171, выбирали в качестве матриц для прямой прививки последовательностей CDR VL hSIRPa.40A, в результате чего получали следующие конструкции кДНК: SEQ ID NO: 89, 91, 93 и 95. Кроме того, была создана база данных, содержащая все гуманизированные последовательности антител, доступные в общедоступном домене, в которой было идентифицировано 300 последовательностей. Данные последовательности запрашивали в BLASTP (2.2.31+), чтобы идентифицировать шаблонные последовательности, которые демонстрируют наибольшую идентичность каркасам последовательностей VH и VL hSIRPa.40A. Для тяжелой цепи каркас гемтузумаба выбрали в качестве матрицы для прививки последовательностей CDR VH hSIRPa.40A, в результате чего получили следующую конструкцию кДНК SEQ ID NO: 85. Для легкой цепи каркас алацизумаба выбрали в качестве матрицы для прививки последовательностей CDR VL hSIRPa.40A, в результате чего получили следующую конструкцию кДНК - SEQ ID NO: 97.For the heavy chain, scaffolds encoded by GenBank accession numbers (Benson, D.A. et al., Nucleic Acids Res. 41(Dl):D36-42 (2013)) L39130, DJ031925, DJ326840, and EF177968 were selected as grafting templates hSIRPa.40A VH CDR sequences, resulting in the following cDNA constructs: SEQ ID NO: 77, 79, 81 and 83, respectively. For the light chain, the scaffolds encoded by GenBank accession numbers AY731031, DQ840993, AY942002, and DQ535171 were selected as templates for direct grafting of hSIRPa.40A VL CDR sequences, resulting in the following cDNA constructs: SEQ ID NO: 89, 91, 93 and 95. In addition, a database containing all humanized antibody sequences available in the public domain was created, in which 300 sequences were identified. Sequence data was queried in BLASTP (2.2.31+) to identify template sequences that showed the highest identity to the backbone VH and VL sequences of hSIRPa.40A. For the heavy chain, the gemtuzumab framework was selected as a template for grafting hSIRPa.40A VH CDR sequences, resulting in the following cDNA construct SEQ ID NO: 85. For the light chain, the alacizumab framework was selected as a grafting template for hSIRPa.40A VL CDR sequences, in resulting in the following cDNA construct - SEQ ID NO: 97.

Определения каркаса и CDR соответствуют описаным у Kabat и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., и др., Департамент здравоохранения и социальных служб США, (1983)).The scaffold and CDR definitions are as described in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., US Department of Health and Human Services, (1983)).

Для того чтобы исследовать влияние гуманизированных каркасных остатков на структуру Fv, создали гомологичную модель Fv hSIRPa.40A мыши, применяя Antibody Modeling Cascade (параметры по умолчанию) в составе Discovery Studio 4.5. Гомологичную модель строили на основе PDB ID 3UMT для легкой цепи, PDB ID 1EHL для тяжелой цепи и PDB ID 3BGF для Fv. Последовательности CDR прививали in silico, чтобы исследовать остатки, которые расположены близко к любому из CDR и которые могут влиять на конформацию петли, называемые остатками Верньера. Идентифицировали остатки, которые могут влиять на конформацию петли и которые находятся в пределах < 5А от поверхности CDR, и заменили их на аминокислоту мыши в данном положении. В полученных в результате этого матрицах проверяли присутствие мотивов посттрансляционных модификаций (ПТМ), применяя Discovery Studio 4.5, и где это возможно (т.е. не остатки CDR, не остатки Верньера) заменяли их, чтобы предотвратить ПТМ. CDR2 VH содержал сайт гликозилирования, который удалили путем мутации аспарагина на серии.To investigate the effect of humanized scaffold residues on Fv structure, a homologous mouse Fv model hSIRPa.40A was generated using Antibody Modeling Cascade (default parameters) within Discovery Studio 4.5. The homology model was built based on PDB ID 3UMT for the light chain, PDB ID 1EHL for the heavy chain, and PDB ID 3BGF for Fv. CDR sequences were grafted in silico to examine residues that are located close to any of the CDRs and that may influence the conformation of the loop, called Vernier residues. Residues that may affect loop conformation that are within <5A of the CDR surface were identified and replaced with a mouse amino acid at that position. The resulting matrices were checked for the presence of post-translational modification motifs (PTMs) using Discovery Studio 4.5 and where possible (i.e., non-CDR residues, non-Vernier residues) replaced to prevent PTMs. CDR2 VH contained a glycosylation site that was removed by mutating the asparagine on the series.

Последовательности CDR прививали на каждую из идентифицированных матриц, экспрессированных в виде IgG2 (SEQ ID NO: 68), каппа (SEQ ID NO: 64) антитела, клонированного в вектор pcDNA3.1(+) (Thermo Fisher Scientific) для временной трансфекции клеток эмбриональной почки человека FreeStyle 293-F (HEK293T/17, АТСС CRL-11268).CDR sequences were grafted onto each of the identified templates expressed as IgG2 (SEQ ID NO: 68), kappa (SEQ ID NO: 64) antibodies cloned into the pcDNA3.1(+) vector (Thermo Fisher Scientific) for transient transfection of embryonic cells human kidney FreeStyle 293-F (HEK293T/17, ATCC CRL-11268).

Пример 17. Синтез, экспрессия и очистка химерных и гуманизированных конструкций.Example 17. Synthesis, expression and purification of chimeric and humanized constructs.

Плазмиды, кодирующие гуманизированные конструкции тяжелых цепей и легких цепей, смешивали в соотношении 1:1 (всего 30 мкг) и временно экспрессировали путем трансфекции ими клеток FreeStyle 293-F, применяя реагент для трансфекции 293fectin (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Супернатанты (30 мл) собирали через 7 дней, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и очищали антитела, применяя смолу с белком A MabSelect Sure, следуя инструкциям производителя (GE Healthcare). Буфер заменяли на буфер 10 мМ гистидин, 100 мМ NaCl, pH 5,5, применяя колонки для высаливания Zeba (Thermo Fisher Scientific). Концентрацию очищенных антител определяли на основании ОП на 280 нм (Nanodrop ND-1000). Уровень эндотоксина определяли с помощью ЛАЛ-теста, следуя инструкциям производителя (Lonza).Plasmids encoding the humanized heavy chain and light chain constructs were mixed in a 1:1 ratio (30 μg total) and transiently expressed by transfecting them into FreeStyle 293-F cells using 293fectin transfection reagent (Invitrogen) following the manufacturer's instructions. Supernatants (30 ml) were collected after 7 days, filtered through a 0.22 μm filter, and antibodies purified using MabSelect Sure Protein A Resin following the manufacturer's instructions (GE Healthcare). The buffer was changed to 10 mM histidine, 100 mM NaCl, pH 5.5 using Zeba salting out columns (Thermo Fisher Scientific). The concentration of purified antibodies was determined based on the OD at 280 nm (Nanodrop ND-1000). Endotoxin levels were determined using the LAL test following the manufacturer's instructions (Lonza).

Пример 18. Связывание гуманизированных антител SIRPa.Example 18 Binding of Humanized SIRPa Antibodies.

Связывание исходного и гуманизированных антител против hSIRPa оценивали с помощью проточной цитометрии, применяя стабильную линию клеток CHO-K1.hSIRPaV1. Клетки CHO-K1.hSIRPaV1 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 40Binding of parent and humanized anti-hSIRPa antibodies was assessed by flow cytometry using the stable cell line CHO-K1.hSIRPaV1. CHO-K1.hSIRPaV1 cells were seeded in 96-well culture plates with rounded bottom and incubated for 40

- 95 043743 мин с указанными вариантами гуманизированного антитела hSIRPa.40A (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали в течение 40 мин при 4°С либо с меченым Alexa Fluor 647 детектирующим антителом козы против IgG мыши (Invitrogen), либо с меченым Alexa Fluor 647 детектирующим антителом осла против IgG человека (Jackson Immuno Research) в ФБР/1% БСА. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad- 95 043743 min with the indicated variants of the humanized antibody hSIRPa.40A (20 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated for 40 min at 4°C with either Alexa Fluor 647-labeled goat anti-mouse IgG detection antibody (Invitrogen) or Alexa Fluor 647-labeled donkey anti-human IgG detection antibody (Jackson Immuno Research) in PBS/1% BSA. After this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). EC50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad

Software, Inc) (фиг. 17 и табл. 20).Software, Inc) (Fig. 17 and Table 20).

Таблица 20Table 20

Антитело Antibody hSIRPaVl hSIRPaVl EC50 (нМ) EC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,022 0.022 hSIRPa.40HlLl hSIRPa.40HlLl h/o h/o hSIRPa.40HlL2 hSIRPa.40HlL2 h/o h/o hSIRPa.40HlL3 hSIRPa.40HlL3 h/o h/o hSIRPa.40HlL4 hSIRPa.40HlL4 h/o h/o hSIRPa.40HlL5 hSIRPa.40HlL5 h/o h/o hSIRPa.40HlL6 hSIRPa.40HlL6 h/o h/o hSIRPa.40H2Ll hSIRPa.40H2Ll 0,264 0.264 hSIRPa.40H2L2 hSIRPa.40H2L2 0,298 0.298 hSIRPa.40H2L3 hSIRPa.40H2L3 0,300 0.300 hSIRPa.40H2L4 hSIRPa.40H2L4 0,315 0.315 hSIRPa.40H2L5 hSIRPa.40H2L5 0,284 0.284 hSIRPa.40H2L6 hSIRPa.40H2L6 0,251 0.251 hSIRPa.40H3Ll hSIRPa.40H3Ll 1,644 1,644 hSIRPa.40H3L2 hSIRPa.40H3L2 1,404 1,404 hSIRPa.40H3L3 hSIRPa.40H3L3 1,501 1,501 hSIRPa.40H3L4 hSIRPa.40H3L4 0,693 0.693 hSIRPa.40H3L5 hSIRPa.40H3L5 2,302 2,302 hSIRPa.40H3L6 hSIRPa.40H3L6 0,833 0.833 hSIRPa.40H4Ll hSIRPa.40H4Ll 3,308 3,308 hSIRPa.40H4L2 hSIRPa.40H4L2 3,360 3,360 hSIRPa.40H4L3 hSIRPa.40H4L3 3,072 3,072 hSIRPa.40H4L4 hSIRPa.40H4L4 3,471 3.471 hSIRPa.40H4L5 hSIRPa.40H4L5 4,828 4.828 hSIRPa.40H4L6 hSIRPa.40H4L6 3,028 3,028 hSIRPa.40H5Ll hSIRPa.40H5Ll 2,011 2,011 hSIRPa.40H5L2 hSIRPa.40H5L2 1,919 1,919 hSIRPa.40H5L3 hSIRPa.40H5L3 2,268 2,268 hSIRPa.40H5L4 hSIRPa.40H5L4 0,869 0.869 hSIRPa.40H5L5 hSIRPa.40H5L5 2,954 2.954 hSIRPa.40H5L6 hSIRPa.40H5L6 2,197 2,197 hSIRPa.40H6Ll hSIRPa.40H6Ll 2,349 2,349 hSIRPa.40H6L2 hSIRPa.40H6L2 3,002 3,002 hSIRPa.40H6L3 hSIRPa.40H6L3 3,014 3,014 hSIRPa.40H6L4 hSIRPa.40H6L4 1,279 1,279 hSIRPa.40H6L5 hSIRPa.40H6L5 3,785 3.785 hSIRPa.40H6L6 hSIRPa.40H6L6 2,677 2,677

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

- 96 043743- 96 043743

Пример 19. Блокирование связывания hCD47 с hSIRPa гуманизированными антителами hSIRPa.40A.Example 19. Blocking the binding of hCD47 to hSIRPa with humanized antibodies hSIRPa.40A.

Блокирование hCD47 оценивали с помощью проточной цитометрии для полной панели гуманизированных антител hSIRPa.40A. Для этой цели линию моноцитов U-937 (ATCC CRL-1593.2) использовали в качестве источника hSIRPa в данном анализе. Клетки U-937 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и с исходными антителом или вариантами гуманизированного антитела hSIRPa.40A (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с 10 мкг/мл меченого DyLight 488 рекомбинантного белка hCD47/Fc в течение 30 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC) и наносили на график, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).Blocking of hCD47 was assessed by flow cytometry for the full panel of humanized hSIRPa.40A antibodies. For this purpose, the monocyte line U-937 (ATCC CRL-1593.2) was used as a source of hSIRPa in this assay. U-937 cells were seeded in 96-well round-bottom culture plates and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and with the parent antibody or humanized antibody variants hSIRPa.40A (20 μg/ml and its dilutions) in PBS /1% BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with 10 μg/ml DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 30 min at 4°C. Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). Results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC) and plotted using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).

На фиг. 18 и в следующей табл. 21 представлено, что связывание рекомбинантного hCD47, гибридизованного с доменом Fc IgG1 человека, отслеживали в присутствии возрастающих количеств вариантов гуманизированного антитела hSIRPa.40A. Гуманизированное hSIRPa.40A блокировало взаимодействие hSIRPa/hCD47, что выявили, применяя способ на основе проточной цитометрии, описанный выше. Значения IC50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.In fig. 18 and in the next table. 21 shows that the binding of recombinant hCD47 hybridized to the Fc domain of human IgG1 was monitored in the presence of increasing amounts of humanized antibody variants hSIRPa.40A. Humanized hSIRPa.40A blocked the hSIRPa/hCD47 interaction as determined using the flow cytometry-based method described above. IC 50 values for blocking hCD47 were calculated from these data. IC 50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

Таблица 21Table 21

Антитело Antibody U-937 U-937 IC50 (нМ) IC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 1,122 1.122 hSIRPa.40HlLl hSIRPa.40HlLl h/o h/o hSIRPa.40HlL2 hSIRPa.40HlL2 h/o h/o hSIRPa.40HlL3 hSIRPa.40HlL3 h/o h/o hSIRPa.40HlL4 hSIRPa.40HlL4 h/o h/o hSIRPa.40HlL5 hSIRPa.40HlL5 h/o h/o hSIRPa.40HlL6 hSIRPa.40HlL6 h/o h/o hSIRPa.40H2Ll hSIRPa.40H2Ll 0,638 0.638 hSIRPa.40H2L2 hSIRPa.40H2L2 0,773 0.773 hSIRPa.40H2L3 hSIRPa.40H2L3 0,685 0.685 hSIRPa.40H2L4 hSIRPa.40H2L4 0,718 0.718 hSIRPa.40H2L5 hSIRPa.40H2L5 0,745 0.745 hSIRPa.40H2L6 hSIRPa.40H2L6 0,901 0.901

- 97 043743- 97 043743

hSIRPa.40H3Ll hSIRPa.40H3Ll 0,980* 0.980* hSIRPa.40H3L2 hSIRPa.40H3L2 h/o h/o hSIRPa.40H3L3 hSIRPa.40H3L3 2,625* 2.625* hSIRPa.40H3L4 hSIRPa.40H3L4 1,784* 1.784* hSIRPa.40H3L5 hSIRPa.40H3L5 2,435* 2.435* hSIRPa.40H3L6 hSIRPa.40H3L6 97,762* 97.762* hSIRPa.40H4Ll hSIRPa.40H4Ll 10,002* 10,002* hSIRPa.40H4L2 hSIRPa.40H4L2 7,579* 7.579* hSIRPa.40H4L3 hSIRPa.40H4L3 75,422* 75.422* hSIRPa.40H4L4 hSIRPa.40H4L4 3,153* 3.153* hSIRPa.40H4L5 hSIRPa.40H4L5 5,171* 5.171* hSIRPa.40H4L6 hSIRPa.40H4L6 3,512* 3.512* hSIRPa.40H5Ll hSIRPa.40H5Ll 34,977* 34.977* hSIRPa.40H5L2 hSIRPa.40H5L2 h/o h/o hSIRPa.40H5L3 hSIRPa.40H5L3 h/o h/o hSIRPa.40H5L4 hSIRPa.40H5L4 10,772* 10.772* hSIRPa.40H5L5 hSIRPa.40H5L5 h/o h/o hSIRPa.40H5L6 hSIRPa.40H5L6 0,247* 0.247* hSIRPa.40H6Ll hSIRPa.40H6Ll 2,391* 2,391* hSIRPa.40H6L2 hSIRPa.40H6L2 20,427* 20.427* hSIRPa.40H6L3 hSIRPa.40H6L3 9,208* 9.208* hSIRPa.40H6L4 hSIRPa.40H6L4 3,797* 3.797* hSIRPa.40H6L5 hSIRPa.40H6L5 20,421* 20.421* hSIRPa.40H6L6 hSIRPa.40H6L6 9,750* 9,750*

Значения, отмеченные *, были экстраполированы; н/о - не обнаружено.Values marked * have been extrapolated; n/a - not found.

Пример 20. Связывающий домен hSIRPa.40A.Example 20: hSIRPa.40A binding domain.

Для того чтобы определить область связывания hSIRPa.40A было разработано несколько мутантов обмена SIRPe1 на основе последовательностей аминокислот SIRPe1 и SIRPy человека. В зависимости от укладки SIRPa/β 1/y внеклеточную область можно подразделить на три отдельных домена: Ig-подобный (иммуноглобулин-подобный) домен V-типа (IgV), Ig-подобный домен С1-типа (IgC1) и Ig-подобный домен С2-типа (IgC2). Домен IgV также известен как связывающий лиганд N-концевой домен SIRPa и SIRPy (который связывается с CD47). Мутанты SIRPe 1/y человека были разработаны на основе полноразмерной последовательности hSIRPe1 (SEQ ID NO: 38), и каждый отдельный Ig-подобный домен был заменен на эквивалентный домен из SIRPy человека (SEQ ID NO: 40). КДНК, кодирующие указанные конструкции: hSIRP-VyC1eC2e (SEQ ID NO: 110), hSIRP-VeC1yC2e (SEQ ID NO: 112) и hSIRPVeC1eC2y (SEQ ID NO: 114), - синтезировали (GeneArt) и субклонировали в вектор pCI-neo. Связывание hSIRPa.40A с мутантами обмена исследовали, применяя CELISA. Для этой цели клетки СНО-К1 временно трансфицировали, применяя липофектамин 2000, векторами pCI-neo, кодирующими hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRP-VyC1eC2e, hSIRP-VeC1yC2e и hSIRP-VeC1eC2y, соответственно. Трансфицированные клетки культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в среде (DMEM-F12 (Gibco) с 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)) до достижения конфлюэнтности. Затем клетки трипсинизировали и высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и культивировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в культуральной среде до достижения конфлюэнтности. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с антителом hSIRPa.40A, антителом hSIRPa.50A и клоном SE5A5 антитела против hSIRPa. Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с конъюгатом антитела козы против IgG мыши с HRP (Southern Biotech). После этого клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность антитела против hSIRPa с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм.To define the binding region of hSIRPa.40A, several SIRPe1 exchange mutants were designed based on the amino acid sequences of human SIRPe1 and SIRPy. Depending on the folding of SIRPa/β 1/y, the extracellular region can be divided into three distinct domains: V-type Ig-like (immunoglobulin-like) domain (IgV), C1-type Ig-like domain (IgC1) and Ig-like domain C2 type (IgC2). The IgV domain is also known as the ligand binding domain of N-terminal SIRPa and SIRPy (which binds CD47). Human SIRPe 1/y mutants were designed based on the full-length hSIRPe1 sequence (SEQ ID NO: 38), and each individual Ig-like domain was replaced with the equivalent domain from human SIRPy (SEQ ID NO: 40). cDNAs encoding the indicated constructs: hSIRP-VyC1eC2e (SEQ ID NO: 110), hSIRP-VeC1yC2e (SEQ ID NO: 112) and hSIRPVeC1eC2y (SEQ ID NO: 114) were synthesized (GeneArt) and subcloned into the pCI-neo vector. The binding of hSIRPa.40A to exchange mutants was examined using CELISA. For this purpose, CHO-K1 cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 with pCI-neo vectors encoding hSIRPaV1, hSIRPaV2, hSIRPe1, hSIRP-VyC1eC2e, hSIRP-VeC1yC2e and hSIRP-VeC1eC2y, respectively. Transfected cells were cultured at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity in medium (DMEM-F12 (Gibco) with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin (Gibco)) until confluent. Cells were then trypsinized and seeded into 96-well flat-bottom culture plates and cultured at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity in culture medium until confluent. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with hSIRPa.40A antibody, hSIRPa.50A antibody and anti-hSIRPa antibody clone SE5A5. Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T and anti-hSIRPa antibody immunoreactivity was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm.

Продемонстрировали наличие связывания антитела согласно настоящему изобретению с мутантом hSIRP-VyC1eC2e, что свидетельствует о связывании hSIRPa.40A с доменом IgV hSIRPa и hSIRPy (фиг.The antibody of the present invention was demonstrated to bind to the hSIRP-VyC1eC2e mutant, indicating binding of hSIRPa.40A to the IgV domain of hSIRPa and hSIRPy (Fig.

- 98 043743 и табл. 22). Значения ЕС50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).- 98 043743 and table. 22). EC50 values represent the concentration at which 50% of the total binding signal is observed (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

_____________________________Таблица 22__________________________________________________________Table 22______________________________

Антитело Antibody hSIRPa.40A hSIRPa.40A hSIRPa.50A hSIRPa.50A Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Antibody against hSIRPa (clone SE5A5) hSIRPaVl hSIRPaVl EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,133 0.133 0,968 0.968 0,350 0.350 CO CO 0,065 0.065 0,432 0.432 0,136 0.136 hSIRPaV2 hSIRPaV2 EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,101 0.101 0,821 0.821 0,224 0.224 CO CO 0,051 0.051 0,183 0.183 0,076 0.076 hSIRP|H hSIRP|H EC50 (нМ) EC50 (nM) h/o h/o h/o h/o 0,249 0.249 CO CO h/o h/o h/o h/o 0,091 0.091 hSIRP-VyCipC2p hSIRP-VyCipC2p EC50 (нМ) EC50 (nM) 0,123 0.123 2,524 2,524 0,287 0.287 CO CO 0,040 0.040 0,609 0.609 0,026 0.026 hSIRP-V3ClyC23 hSIRP-V3ClyC23 EC50 (нМ) EC50 (nM) h/o h/o h/o h/o 0,309 0.309 CO CO h/o h/o h/o h/o 0,140 0.140 hSIRP-V3C13C2y hSIRP-V3C13C2y EC50 (нМ) EC50 (nM) h/o h/o h/o h/o 0,231 0.231 CO CO h/o h/o h/o h/o 0,079 0.079

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

Для того чтобы точно определить аминокислоты, участвующие во взаимодействии hSIRPα.40А с доменом IgV, получили несколько точечных мутантов hSIRPaV1 на основании различий в отдельных аминокислотах между hSIRPaV1/V2 и hSIRPe 1. На следующем выравнивании последовательностей показано выравнивание домена IgV hSIRPa и hSIRPp 1.To precisely identify the amino acids involved in the interaction of hSIRPα.40A with the IgV domain, several point mutants of hSIRPaV1 were generated based on differences in individual amino acids between hSIRPaV1/V2 and hSIRPe 1. The following sequence alignment shows the alignment of the IgV domain of hSIRPa and hSIRPp 1.

Выравнивание последовательностей домена IgV.IgV domain sequence alignment.

Р GRELIYNQKEGHFPRV hSIRPaVl EEELOVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIOWFRGAG hSIRPaV2 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAG P ARELIYNQKEGHFPRV hSIRP|H еВвЕОУКЭРЙКЯ VSVA A GES ATI ,R cTOtSI JP VGPTM1WFR GAG g GRELIYNQKEGHFPRV hSIRPaVl TTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSG hSIRPaV2 TTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPD-TEFKSG hSIRP|H TTVSELTKRNN|jDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGP GRELIYNQKEGHFPRV hSIRPaVl EEELOVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIOWFRGAG hSIRPaV2 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAG P ARELIYNQKEGHFPRV hSIRP|H EVVEOUKERYKYA VSVA A GES ATI ,R cTOtSI JP V GPTM1WFR GAG g GRELIYNQKEGHFPRV hSIRPaVl TTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSG hSIRPaV2 TTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPD-TEFKSG hSIRP|H TTVSELTKRNN|jDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSG

Аминокислоты в домене IgV hSIRPa, которые изменены в hSIRPp1, мутировали, применяя набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II (Stratagene) и полноразмерную последовательность hSIRPaV1 (SEQ ID NO: 33) в качестве донора кДНК. Связывание hSIRPa.40A с точечными мутантами hSIRPaV1 исследовали, применяя CELISA. Для этой цели клетки Сно-Κι временно трансфицировали, применяя липофектамин 2000, кДНК, кодирующей полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1 и его мутантов и hSIRPe 1, субклонированную в вектор pCI-neo. Трансфицированные клетки высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в течение 24 ч. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (используемыми при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% с антителом козы против IgG мыши-HRP (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность против hSIRPaV1, мутантов hSIRPaV1 и hSIRPe 1 с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (среднее значение и стандартное отклонение рассчитывали по значениям, полученным в двух независимых экспериментах).The amino acids in the IgV domain of hSIRPa that are altered in hSIRPp1 were mutated using the QuikChange II site-directed mutagenesis kit (Stratagene) and the full-length hSIRPaV1 sequence (SEQ ID NO: 33) as donor cDNA. The binding of hSIRPa.40A to hSIRPaV1 point mutants was examined using CELISA. For this purpose, Cho-Κι cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 with cDNA encoding the full-length open reading frame of hSIRPaV1 and its mutants and hSIRPe 1 subcloned into the pCI-neo vector. Transfected cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin (Gibco)) in 96-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 24 hours. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with purified anti-hSIRPa antibodies (used at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions) . Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 h at 37°C, 5% CO2, and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T and immunoreactivity against hSIRPaV1, hSIRPaV1 and hSIRPe 1 mutants was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC 50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc) (mean and standard deviation were calculated from values obtained in two independent experiments).

- 99 043743- 99 043743

На фиг. 20 и в следующей табл. 23 показано, что пролин в положении 74 (Р74) представляет собой важную аминокислоту для специфического связывания hSIRPa.40A с hSIRPaV1. Экспрессия hSIRPaV1(P74A) (SEQ ID NO: 61), в котором Р74 заменен на аланин, на клетках Сно-Κι приводит к утрате связывания антитела hSIRPa.40A. Данный пролин не присутствует в последовательности доменаIn fig. 20 and in the next table. 23 shows that proline at position 74 (P74) is an important amino acid for the specific binding of hSIRPa.40A to hSIRPaV1. Expression of hSIRPaV1(P74A) (SEQ ID NO: 61), in which P74 is replaced by alanine, on Cho-Κι cells results in loss of hSIRPa.40A antibody binding. This proline is not present in the domain sequence

IgV hSIRPe1, и может играть роль в правильной конформации домена IgV.IgV hSIRPe1, and may play a role in the correct conformation of the IgV domain.

Таблица 23Table 23

Антитело Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPpi, ЕС50 (нМ) hSIRPpi binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl(P74A), ЕС50 (нМ) Binding hSIRPaVl(P74A), EC50 (nM) Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO Среднее Average СО CO hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,065 0.065 0,006 0.006 н/о But н/о But н/о But н/о But hSIRPa.50A hSIRPa.50A 0,534 0.534 0,152 0.152 н/о But н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) 0,163 0.163 0,008 0.008 0,156 0.156 0,009 0.009 0,149 0.149 0,013 0.013

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

Пример 21. Функциональность химерных вариантов MAT hSIRPa.40A в анализе фагоцитоза макрофагами человека.Example 21. Functionality of chimeric variants of the MAT hSIRPa.40A in the human macrophage phagocytosis assay.

Функциональность вариабельных доменов hSIRPa.40A, привитых на различные константные домены Fc, оценивали с помощью анализа фагоцитоза in vitro, применяя макрофаги человека. Условия эксперимента для анализа фагоцитоза макрофагами человека были аналогичны таковым, объясненным выше в примере 15. Меченые клетки лимфомы Raji смешивали с аналитической средой, содержащей либо 10 мкг/мл, либо 1 мкг/мл вариантов химерного антитела hSIRPa.40A и 1 мкг/мл ритуксимаба, а затем добавляли к MDM при соотношении опухолевых клеток к фагоцитам 2,5:1. Клетки инкубировали при 37°С, 5% CO2 и влажности 95% в течение 2 ч.The functionality of hSIRPa.40A variable domains grafted onto different Fc constant domains was assessed by in vitro phagocytosis assay using human macrophages. The experimental conditions for the human macrophage phagocytosis assay were similar to those explained above in Example 15. Labeled Raji lymphoma cells were mixed with assay medium containing either 10 μg/ml or 1 μg/ml hSIRPa.40A chimeric antibody variants and 1 μg/ml rituximab , and then added to MDM at a tumor cell to phagocyte ratio of 2.5:1. Cells were incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 2 h.

Анализ проводили с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа Operetta (Perkin Elmer) и результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения Columbus версии 2.6. Проводили количественный анализ фагоцитоза клеток лимфомы человека, используя индекс фагоцитоза, описанный далее: (количество опухолевых клеток внутри макрофагов/количество макрофагов)х 100; подсчитывая по меньшей мере 200 макрофагов на образец.Analysis was performed using an Operetta automated fluorescence microscope (Perkin Elmer) and the results were processed and analyzed using Columbus software version 2.6. A quantitative analysis of phagocytosis of human lymphoma cells was carried out using the phagocytosis index described below: (number of tumor cells inside macrophages/number of macrophages) x 100; counting at least 200 macrophages per sample.

На фиг. 21 показано, что химерное антитело дикого типа (ДТ) hSIRPa.40A.hIgG4 не повышает опосредованный ритуксимабом фагоцитоз, тогда как инертные варианты химерного антитела hSIRPa.40A.hIgG1 (SEQ ID NO: 119), содержащие мутации N297Q (SEQ ID NO: 126), L234A.L235A (LALA) (SEQ ID NO: 123) или L234A.L235A.P329G (LALAPG) (SEQ ID NO: 125), повышают опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность зависимым от концентрации образом. Аналогичным образом, hSIRPa.40A.hIgG2 и инертный вариант химерного антитела hSIRPa.40A.hIgG2, содержащий мутации V234A.G237A.P238S.H268A.V309L.A330S.P331S (Sigma) (SEQ ID NO: 122), повышает опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность зависимым от концентрации образом.In fig. 21 shows that the wild-type (WT) chimeric antibody hSIRPa.40A.hIgG4 does not enhance rituximab-mediated phagocytosis, whereas inert variants of the chimeric antibody hSIRPa.40A.hIgG1 (SEQ ID NO: 119) containing the N297Q mutations (SEQ ID NO: 126 ), L234A.L235A (LALA) (SEQ ID NO: 123) or L234A.L235A.P329G (LALAPG) (SEQ ID NO: 125), increase rituximab-mediated phagocytic activity in a concentration-dependent manner. Similarly, hSIRPa.40A.hIgG2 and an inert variant of the chimeric antibody hSIRPa.40A.hIgG2 containing mutations V234A.G237A.P238S.H268A.V309L.A330S.P331S (Sigma) (SEQ ID NO: 122) enhance rituximab-mediated phagocytic activity in a concentration-dependent manner.

Пример 22. Функциональность вариантов гуманизированного MAT hSIRPa.40A в анализе фагоцитоза макрофагами человека.Example 22: Functionality of humanized MAT hSIRPa.40A variants in a human macrophage phagocytosis assay.

Функциональность выбранного набора вариантов гуманизированного антитела hSIRPa.40A оценивали с помощью анализа фагоцитоза in vitro, применяя макрофаги человека. Условия эксперимента для анализа фагоцитоза макрофагами человека были аналогичны таковым, объясненным в примере 6.The functionality of a selected set of humanized antibody variants hSIRPa.40A was assessed using an in vitro phagocytosis assay using human macrophages. The experimental conditions for analyzing phagocytosis by human macrophages were similar to those explained in Example 6.

На фиг. 22 показано, что варианты гуманизированного антитела hSIRPa.40A повышают опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность зависимым от концентрации образом, аналогично антителу KWAR23, привитому на Fc hIgG2.In fig. 22 shows that variants of the humanized antibody hSIRPa.40A enhance rituximab-mediated phagocytic activity in a concentration-dependent manner, similar to the KWAR23 antibody grafted onto hIgG2 Fc.

Пример 23. Функциональность вариантов химерного MAT hSIRPa.50A в анализе фагоцитоза макрофагами человека.Example 23. Functionality of chimeric MAT hSIRPa.50A variants in human macrophage phagocytosis assay.

Функциональность вариабельных доменов hSIRPa.50A, привитых на различные константные домены Fc, оценивали с помощью анализа фагоцитоза in vitro, применяя макрофаги человека. На фиг. 23А показано, что химерное антитело hSIRPa.50A.hIgG4 незначительно повышает опосредованный ритуксимабом фагоцитоз, тогда как химерное антитело hSIRPa.50A.hIgG2 повышает опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность аналогично антителу hSIRPa.50A.mIgG1 мыши (SEQ ID NO: 120). На фиг. 23В продемонстрировано, что химерное антитело hSIRPa.50A.hIgG2 эффективно повышает фагоцитоз опухолевых клеток, вызванный ритуксимабом, зависимым от концентрации образом по сравнению с изотипическим контролем IgG2 человека. Аналогично, hSIRPa.50A.hIgG2 повышает опосредованный даратумумабом фагоцитоз (антитело против hCD38, применяли при концентрации 0,05 мкг/мл) (фиг. 23С).The functionality of hSIRPa.50A variable domains grafted onto different Fc constant domains was assessed by in vitro phagocytosis assay using human macrophages. In fig. 23A shows that the chimeric antibody hSIRPa.50A.hIgG4 modestly increases rituximab-mediated phagocytosis, while the chimeric antibody hSIRPa.50A.hIgG2 increases rituximab-mediated phagocytic activity similar to the mouse antibody hSIRPa.50A.mIgG1 (SEQ ID NO: 120). In fig. 23B demonstrated that the chimeric antibody hSIRPa.50A.hIgG2 effectively enhanced rituximab-induced tumor cell phagocytosis in a concentration-dependent manner compared with human IgG2 isotype control. Similarly, hSIRPa.50A.hIgG2 increased daratumumab-mediated phagocytosis (anti-hCD38 antibody used at 0.05 μg/ml) (FIG. 23C).

- 100 043743- 100 043743

Кроме того, hSIRPa.50A.hIgG2 также повышало опосредованный ритуксимабом фагоцитоз в гранулоцитах человека. На фиг. 23D показано, что химерное антитело hSIRPa.50A.hIgG2 повышает фагоцитарную активность, вызванную ритуксимабом, до сходного уровня с таковым у антитела hSIRPa.50A.mIgG1 мыши. Аналогичным образом, на фиг. 24А показано, что химерные антитела hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q (SEQ ID NO: 127) или hSIRPa.50A.hIgG2 повышают опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность клетками MDM человека до сходного уровня с таковым у антитела hSIRPa.50A.mIgG1 мыши (ритуксимаб применяли при концентрации 1 мкг/мл). Аналогичные наблюдения были сделаны на фиг. 24В, где фагоцитоз был вызван даратумумабом (0,05 мкг/мл). На фиг. 25 показано, что химерные антитела hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q и hSIRPa.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G также повышают опосредованную ритуксимабом фагоцитарную активность клетками MDM человека до сходного уровня с таковым у антитела hSIRPa.50A.hIgG2 (ритуксимаб применяли при концентрации 1 мкг/мл). Химерные варианты MAT hSIRPa.50A, содержащие Fc-область hIgG1 или hIgG4 дикого типа, не повышали фагоцитоз опухолевых клеток.In addition, hSIRPa.50A.hIgG2 also increased rituximab-mediated phagocytosis in human granulocytes. In fig. 23D shows that the chimeric antibody hSIRPa.50A.hIgG2 increases phagocytic activity induced by rituximab to a similar level to that of the mouse antibody hSIRPa.50A.mIgG1. Likewise, in FIG. 24A shows that chimeric antibodies hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q, hSIRPa.50A.hIgG4.N297Q (SEQ ID NO: 127) or hSIRPa.50A.hIgG2 increase rituximab-mediated phagocytic activity in human MDM cells to a similar level to that of the hSIRPa antibody .50A.mIgG1 mice (rituximab was used at a concentration of 1 μg/ml). Similar observations were made in Fig. 24B, where phagocytosis was induced by daratumumab (0.05 μg/ml). In fig. 25 shows that the chimeric antibodies hSIRPa.50A.hIgG1.N297Q and hSIRPa.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G also increase rituximab-mediated phagocytic activity in human MDM cells to a similar level to that of the hSIRPa.50A.hIgG2 antibody (rituximab was used at a concentration 1 µg/ml). Chimeric variants of MAT hSIRPa.50A containing the Fc region of wild-type hIgG1 or hIgG4 did not increase phagocytosis of tumor cells.

Пример 24. Сравнение антител KWAR23, клона 18D5, hSIRPa.50A и hSIRPa.40A.Example 24 Comparison of antibodies KWAR23, clone 18D5, hSIRPa.50A and hSIRPa.40A.

Непосредственное сравнение специфичности моноклональных антител против hSIRPa: KWAR23, клона 18D5 (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129) из WO2017/178653, hSIRPa.50A и hSIRPa.40A, - в отношении связывания с hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2 и hSIRPe1 оценивали с помощью CELISA. Реакционную способность подтверждали, применяя клетки Сно-Κι (АТСС CCL-61), экспрессирующие кДНК, кодирующую полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2 и hSIRPe1, субклонированную в вектор pCI-neo (Promega, Мадисон, Висконсин). Клетки CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV1(P74A), CHO-K1.hSIRPaV2 и CHO-K1.hSIRPe1 высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96-луночные культуральные планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% в течение 24 ч. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (используемыми при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с антителом козы против IgG мыши-HRP (SouthernBiotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и визуализировали иммунореакционную способность против hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2 и hSIRPe1 с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС50 -концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).Direct comparison of the specificity of monoclonal antibodies against hSIRPa: KWAR23, clone 18D5 (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129) from WO2017/178653, hSIRPa.50A and hSIRPa.40A, - in relation to binding to hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2 and hSIRPe1 were assessed by CELISA. Reactivity was confirmed using Cno-Κι cells (ATCC CCL-61) expressing cDNA encoding the full-length open reading frame of hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2, and hSIRPe1 subcloned into the pCI-neo vector (Promega, Madison, WI). CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV1(P74A), CHO-K1.hSIRPaV2 and CHO-K1.hSIRPe1 cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin /streptomycin (Gibco)), into 96-well flat-bottom culture plates and incubated at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity for 24 hours. The culture medium was then removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C , 5% CO 2 and 95% humidity with purified anti-hSIRPa antibodies (used at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions). Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity with goat anti-mouse IgG-HRP (SouthernBiotech). Cells were then washed three times with PBS-T, and immunoreactivity against hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), hSIRPaV2, and hSIRPe1 was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). The reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO 4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).

Связывание с hSIRPy оценивали с помощью проточной цитометрии, применяя линию клеток Тклеточного лейкоза Jurkat E6.1 (ЕСАСС 88042803). Клетки Jurkat высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 40 мин с антителами против hSIRPa (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали в течение 40 мин при 4°С с меченым Alexa Fluor 647 детектирующим антителом козы против IgG мыши (Invitrogen) в ФБР/1% БСА. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC). Значения ЕС50 - концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).Binding to hSIRPy was assessed by flow cytometry using the Jurkat E6.1 T cell leukemia cell line (ECACC 88042803). Jurkat cells were seeded in 96-well round-bottom culture plates and incubated for 40 min with anti-hSIRPa antibodies (20 μg/ml and its dilutions) in PBS/1% BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated for 40 min at 4°C with Alexa Fluor 647-labeled goat anti-mouse IgG detection antibody (Invitrogen) in PBS/1% BSA. Following this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). The results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC). EC 50 values, the concentration at which 50% of the total binding signal is observed, were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc).

В табл. 24 представлено, что антитело KWAR23 и клон 18D5 вступают в перекрестную реакцию по меньшей мере с hSIRPe1 и вариантом Р74А hSIRPaV1. Антитела hSIRPa.50A и hSIRPa.40A согласно настоящему изобретению не связываются ни с hSIRPe1, ни с вариантом Р74А hSIRPaV1 при исследуемых условиях. В этом отношении антитела hSIRPa.50A и hSIRPa.40A согласно настоящему изобретению сходным образом отличаются от клона антитела SIRP29 из WO2013/056352. На фиг. 7А и В WO2017/178653 сравнивается связывание клона SIRP29 и KWAR23 с SIRPe1 (обозначен sirp-b, № продукта ABIN3077231 в antibodies-online.com), и продемонстрировано, что каждый из клона SIRP29 и KWAR23 обладает наномолярной аффинностью по отношению к SIRPe1.In table 24 shows that antibody KWAR23 and clone 18D5 cross-react with at least hSIRPe1 and the P74A variant of hSIRPaV1. The hSIRPa.50A and hSIRPa.40A antibodies of the present invention bind to neither hSIRPe1 nor the P74A variant of hSIRPaV1 under the conditions tested. In this respect, the hSIRPa.50A and hSIRPa.40A antibodies of the present invention are similarly different from the SIRP29 antibody clone of WO2013/056352. In fig. 7A and B of WO2017/178653 compare the binding of clone SIRP29 and KWAR23 to SIRPe1 (designated sirp-b, product no. ABIN3077231 at antibodies-online.com), and demonstrate that clone SIRP29 and KWAR23 each have nanomolar affinity for SIRPe1.

- 101 043743- 101 043743

Таблица 24Table 24

Антитело Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl(P74A), ЕС50 (нМ) Binding hSIRPaVl(P74A), EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPpi, ЕС50 (нМ) hSIRPpi binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPy, ЕС50 (нМ) hSIRPy binding, EC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,114 0.114 н/о But 0,093 0.093 н/о But 0,369 0.369 hSIRPa.50A hSIRPa.50A 0,773 0.773 н/о But 0,645 0.645 н/о But - - KWAR23 KWAR23 0,070 0.070 0,049 0.049 0,049 0.049 0,033 0.033 0,003 0.003 18D5 18D5 0,134 0.134 0,055 0.055 н/о But 0,055 0.055 н/о But

н/о - не обнаружено; - не исследовали.n/a - not detected; - have not been explored.

Блокирование hCD47 антителами KWAR23, клоном 18D5 и hSIRPa.40А оценивали с помощью проточной цитометрии. Для данной цели линии клеток моноцитов ТНР-1 (АТСС TIB-202) и U-937 (АТСС CRL-1593.2) использовали в качестве источника hSIRPa в данном анализе. Клетки ТНР-1 и U-937 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с закругленным дном и инкубировали в течение 45 мин с блокирующим FcR реагентом (Miltenyi Biotec) и указанными антителами против hSIRPa (20 мкг/мл и ее разведения) в ФБР/1% БСА при 4°С. Затем клетки промывали три раза ФБР/1% БСА и инкубировали с 10 мкг/мл меченого DyLight 488 рекомбинантного белка hCD47/Fc в течение 30 мин при 4°С. После данной процедуры мечения клетки промывали два раза, ресуспендировали в ФБР/1% БСА, содержащем 0,1 мкг/мл DAPI (BioLegend), и анализировали с помощью проточной цитометрии на FACSVerse (BD Biosciences). Результаты обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC) и наносили на график, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). Связывание рекомбинантного hCD47, гибридизованного с доменом Fc IgGl человека, отслеживали в присутствии возрастающих количеств антител против hSIRPa. Значения 1С50 для блокирования hCD47 рассчитывали по этим данным. Значения IC50 представляют собой концентрацию, при которой наблюдается половина ингибирования.Blocking of hCD47 by antibodies KWAR23, clone 18D5 and hSIRPa.40A was assessed by flow cytometry. For this purpose, the monocyte cell lines THP-1 (ATCC TIB-202) and U-937 (ATCC CRL-1593.2) were used as a source of hSIRPa in this assay. THP-1 and U-937 cells were seeded into 96-well culture plates with rounded bottoms and incubated for 45 min with FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec) and the indicated anti-hSIRPa antibodies (20 μg/ml and its dilutions) in PBS/1 % BSA at 4°C. Cells were then washed three times with PBS/1% BSA and incubated with 10 μg/ml DyLight 488-labeled recombinant hCD47/Fc protein for 30 min at 4°C. After this labeling procedure, cells were washed twice, resuspended in PBS/1% BSA containing 0.1 μg/ml DAPI (BioLegend), and analyzed by flow cytometry on a FACSVerse (BD Biosciences). Results were processed and analyzed using FlowJo software version 10 (FlowJo, LLC) and plotted using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc). Binding of recombinant hCD47 hybridized to the Fc domain of human IgGl was monitored in the presence of increasing amounts of anti-hSIRPa antibodies. 1C50 values for blocking hCD47 were calculated from these data. IC50 values represent the concentration at which half of the inhibition is observed.

В табл. 18 и табл. 25 представлено, что антитела hSIRPa.40А, hSIRPa.50A и KWAR23 блокируют связывание rhCD47/Fc с обеими линиями клеток моноцитов ТНР-1 и U-937, которые экспрессируют аллель hSIRPaV2 и hSIRPaVl, соответственно. Клон антитела 18D5 блокирует связывание rhCD47/Fc с линией моноцитов U-937, но не блокирует связывание rhCD47/Fc с линией моноцитов ТНР-1, в соответствии с наблюдением, что 18D5 не связывается с hSIRPaV2 (табл. 24). В этом отношении, антитела hSIRPa.50A и hSIRPa.40A согласно настоящему изобретению сходным образом отличаются от клона антитела 18D5.In table 18 and table. 25 shows that antibodies hSIRPa.40A, hSIRPa.50A and KWAR23 block the binding of rhCD47/Fc to both monocyte cell lines THP-1 and U-937, which express the hSIRPaV2 and hSIRPaVl allele, respectively. Antibody clone 18D5 blocked the binding of rhCD47/Fc to the U-937 monocyte line, but did not block the binding of rhCD47/Fc to the THP-1 monocyte line, consistent with the observation that 18D5 does not bind to hSIRPaV2 (Table 24). In this regard, the hSIRPa.50A and hSIRPa.40A antibodies of the present invention are similarly different from the 18D5 antibody clone.

Таблица 25Table 25

Антитело Antibody ТНР-1 TNR-1 U-937 U-937 IC50 (нМ) IC50 (nM) IC50 (нМ) IC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,548 0.548 1,417 1.417 KWAR23 KWAR23 0,132 0.132 0,284 0.284 18D5 18D5 н/о But 1,522 1.522

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

Пример 25. Картирование границы взаимодействия между hSIRPa-hSIRPa.40A и hSIRPahSIRPa.50A.Example 25 Mapping the interaction boundary between hSIRPa-hSIRPa.40A and hSIRPahSIRPa.50A.

Аминокислоты на hSIRPa, с которыми связываются hSIRPa.40A или hSIRPa.50А, установили с помощью процедуры, которая включала перекрестное связывание дейтерированного химического вещества с последующим ферментативным расщеплением и детектированием с применением массспектрометрии. Сначала антитело hSIRPa.40A и антиген rhSIRPa-HIS (SinoBiological 11612-Н08Н-100, SEQ ID NO: 132) или антитело hSIRPa.50A и антиген rhSIRPa-HIS инкубировали, чтобы вызвать связывание, и проверяли целостность и уровень агрегации с помощью масс-спектрометра Ultraflex III MALDI TOF (Bruker), оборудованного модулем взаимодействия НМ4 (CovalX). Для данных контрольных экспериментов получали серию разведений 10 мкл образцов антитела или антигена (разведение в 1 - 128 раз, начиная с 1 мг/мл). Из каждого образца 9 мкл подвергали перекрестному связыванию, применяя набор для анализа К200 MALDI MS, следуя инструкциям производителя (CovalX), и инкубировали в течение 180 мин, тогда как 1 мкл непосредственно использовали в масс-спектрометрическом анализе (МАЛДИ больших масс). В масс-спектрометрическом анализе показали, что у антитела и антигена были ожидаемые молекулярные массы: hSIRPa.40A=151,68 кДа (152,78 кДа с кросслинкером), hSIRPa.50A=151,80 кДа (153,17 кДа с кросслинкером) и rhSIRPa-HIS=46,05 кДа (48,67 кДа с кросслинкером). Для определения характеристик комплекса антиген-антитело получали смесь с избытком антигена (соотношение анThe amino acids on hSIRPa to which hSIRPa.40A or hSIRPa.50A bind were determined using a procedure that involved deuterated chemical cross-linking followed by enzymatic digestion and detection using mass spectrometry. First, hSIRPa.40A antibody and rhSIRPa-HIS antigen (SinoBiological 11612-H08H-100, SEQ ID NO: 132) or hSIRPa.50A antibody and rhSIRPa-HIS antigen were incubated to induce binding, and the integrity and level of aggregation were checked by mass Ultraflex III MALDI TOF spectrometer (Bruker) equipped with an HM4 interaction module (CovalX). For these control experiments, a series of dilutions of 10 μl of antibody or antigen samples were prepared (1- to 128-fold dilution, starting at 1 mg/ml). From each sample, 9 μl was cross-linked using the K200 MALDI MS assay kit following the manufacturer's instructions (CovalX) and incubated for 180 min, while 1 μl was directly used in the mass spectrometry analysis (high mass MALDI). Mass spectrometric analysis showed that the antibody and antigen had the expected molecular weights: hSIRPa.40A=151.68 kDa (152.78 kDa with crosslinker), hSIRPa.50A=151.80 kDa (153.17 kDa with crosslinker) and rhSIRPa-HIS=46.05 kDa (48.67 kDa with crosslinker). To determine the characteristics of the antigen-antibody complex, a mixture with an excess of antigen was prepared (ratio an

- 102043743 тиген:антитело для rhSIRPa-HIS:hSIRPa.40A 10,8 мкМ:8,5 мкМ и соотношение антиген:антитело для rhSIRPa-HIS:hSIRPa.50A 5,4 мкМ:2,13 мкМ). 9 мкл образца смеси антиген-антитело подвергали перекрестному связыванию, применяя набор для анализа K200 MALDI-MS, согласно инструкциям производителя, тогда как 1 мкл непосредственно использовали в масс-спектрометрическом анализе. Обнаруженные массы антитела и антигена (hSIRPa.40A: 151,18 кДа, rhSIRPa-HIS: 45,93 кДа, hSIRPa.50A: 151,69 кДа, rhSIRPa-HIS: 46,18 кДа) соответствовали определенным ранее молекулярным массам. Комплексы антиген-антитело, после перекрестного связывания, детектировали в виде двух нековалентных комплексов со стехиометрическими составами 1:1 (195,24 кДа) и 2:1 (240,48 кДа) для rhSIRPa-HIS:hSIRPa.40A и в виде одного нековалентного комплекса со стехиометрическим составом 1:1 (198,24 кДа) для rhSIRPaHIS:hSIRPa.50A. Антитело и антиген связывались нековалентно; нековалентные агрегаты или неспецифические мультимеры не были обнаружены.- 102043743 antigen:antibody for rhSIRPa-HIS:hSIRPa.40A 10.8 µM:8.5 µM and antigen:antibody ratio for rhSIRPa-HIS:hSIRPa.50A 5.4 µM:2.13 µM). A 9 μl sample of the antigen-antibody mixture was cross-linked using the K200 MALDI-MS assay kit according to the manufacturer's instructions, while 1 μl was directly used in the mass spectrometry analysis. The detected antibody and antigen masses (hSIRPa.40A: 151.18 kDa, rhSIRPa-HIS: 45.93 kDa, hSIRPa.50A: 151.69 kDa, rhSIRPa-HIS: 46.18 kDa) were consistent with the previously determined molecular masses. Antigen-antibody complexes, after cross-linking, were detected as two non-covalent complexes with stoichiometric compositions of 1:1 (195.24 kDa) and 2:1 (240.48 kDa) for rhSIRPa-HIS:hSIRPa.40A and as one non-covalent complex with a stoichiometric composition of 1:1 (198.24 kDa) for rhSIRPaHIS:hSIRPa.50A. The antibody and antigen were bound non-covalently; noncovalent aggregates or nonspecific multimers were not detected.

Затем проводили идентификацию rhSIRPa-HIS методом отпечатков пептидных масс. Образцы подвергали протеолизу ASP-N, трипсином, химотрипсином, эластазой и термолизином (Roche Diagnostic), следуя инструкциям производителя, а затем анализировали с помощью МС/МС на nLC-LTQ Orbitrap, применяя систему Ultimate 3000 (Dionex) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Такая схема протеолиза приводила к покрытию 98% последовательности обнаруженными пептидами.RhSIRPa-HIS was then identified using the peptide mass fingerprint method. Samples were proteolyzed with ASP-N, trypsin, chymotrypsin, elastase and thermolysin (Roche Diagnostic) following the manufacturer's instructions and then analyzed by MS/MS on an nLC-LTQ Orbitrap using an Ultimate 3000 system (Dionex) coupled with a mass spectrometer LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). This proteolysis scheme resulted in 98% sequence coverage by detected peptides.

Для того чтобы определить взаимодействующие аминокислоты антитела hSIRPa.40A и hSIRPa.50A на антигене rhSIRPa-HIS с высоким разрешением, комплекс антиген-антитело (отношение rhSIRPaHIS:hSIRPa.40A составляло 10,8 мкМ:8,5 мкМ, отношение rhSIRPa-HIS:hSIRPa.50A составляло 5,4 мкМ:2,13 мкМ) инкубировали с дейтерированными кросслинкерами d0/d12 (набор K200 MALDI) в течение 180 мин и подвергали мультиферментативному расщеплению ферментами ASP-N, трипсином, химотрипсином, эластазой и термолизином. После обогащения перекрестно-связанными пептидами образцы анализировали с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением (nLC-Orbitrap MS) и полученные результаты анализировали, применяя XQuest (Jin Lee, Mol. Biosyst. 4:816-823 (2008)) и Stavrox (Gotze и др., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23:76-87 (2012)). Аминокислоты hSIRPa.40A и hSIRPa.50A, взаимодействующие с rhSIRPa-HIS, картировали на SIRPaV1 человека (SEQ ID NO: 34). Перекрестносвязанные остатки hSIRPa.40A изображены жирным шрифтом в прямоугольниках и остатки hSIRPa.50A изображены жирным шрифтом и подчеркнуты:In order to determine the interacting amino acids of the hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies on the rhSIRPa-HIS antigen with high resolution, the antigen-antibody complex (rhSIRPaHIS:hSIRPa.40A ratio was 10.8 μM:8.5 μM, rhSIRPa-HIS ratio: hSIRPa.50A was 5.4 μM:2.13 μM) was incubated with deuterated d0/d12 crosslinkers (K200 MALDI kit) for 180 min and subjected to multienzymatic digestion with ASP-N, trypsin, chymotrypsin, elastase and thermolysin enzymes. After enrichment of cross-linked peptides, samples were analyzed using high-resolution mass spectrometry (nLC-Orbitrap MS) and the results obtained were analyzed using XQuest (Jin Lee, Mol. Biosyst. 4:816-823 (2008)) and Stavrox (Gotze et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23:76-87 (2012)). The amino acids hSIRPa.40A and hSIRPa.50A interacting with rhSIRPa-HIS were mapped to human SIRPaV1 (SEQ ID NO: 34). Cross-linked hSIRPa.40A residues are shown in bold in boxes and hSIRPa.50A residues are shown in bold and underlined:

MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRG AGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDF[s|iRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEF[k|sGAGTEL svra|k|psapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstak VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQL TWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHP KEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDT NDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEY ASVQVPRKMEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRG AGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDF[s|iRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEF[k|sGAGTEL svra|k|psapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfk ngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstak VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQL TWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHP KEQGSNTAAENTGSNERNIYIV VGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDT NDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEY ASVQVPRK

Расстояние между С-альфа атомами остатка Р74 и обнаруженных перекрестно-связанных остатков измеряли в Discovery Studio, используя кристаллическую структуру SIRPa (PDB ID 4CMM). Перекрестно-связанные остатки, обнаруженные для hSIRPa.50A, находятся в пределах расстояния между С-альфа атомами, составляющего от 14,0 до 21,4 ангстрем, от остатка Р74; перекрестно-связанные остатки, обнаруженные для hSIRPa.40A, находятся в пределах расстояния между С-альфа атомами, составляющего от 16,2 до 33,5 ангстрем, от остатка Р74. Расстояния между С-альфа атомами попадают в ожидаемый диапазон площади поверхности эпитоп-паратоп, равной 700 A2 (Rowley и др., Biotech. Ann. Rev. 10:151-188 (2004)).The distance between the C-alpha atoms of residue P74 and the detected cross-linked residues was measured in Discovery Studio using the crystal structure of SIRPa (PDB ID 4CMM). The cross-linked residues found for hSIRPa.50A are within a C-alpha distance of 14.0 to 21.4 Å from residue P74; The cross-linked residues found for hSIRPa.40A are within a C-alpha distance of 16.2 to 33.5 Å from residue P74. The distances between C-alpha atoms fall within the expected epitope-paratope surface area range of 700 A 2 (Rowley et al., Biotech. Ann. Rev. 10:151-188 (2004)).

Обнаруженные остатки и площадь поверхности явно отличаются от таковых для связывающего эпитопа антитела против hSIRPa - KWAR23 (Ring и др., Proa Natl Acad. Sci. USA 114:E10578-E10585 (2017)).The detected residues and surface area are clearly different from those of the anti-hSIRPa antibody binding epitope KWAR23 (Ring et al., Proa Natl Acad. Sci. USA 114:E10578-E10585 (2017)).

Пример 26. Сравнение связывания антител против hSIRPa с hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A) и hSJRPp1.Example 26 Comparison of binding of anti-hSIRPa antibodies to hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A) and hSJRPp1.

Специфичность связывания моноклональных антител против hSIRPa (например, включая антитела против hSIRPa, известные в данной области: KWAR23 (патент США СА2939293 A1), 18D5 (патент WO2017/178653 А2) и различные доступные для приобретения антитела против hSIRPa) с hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A) и hSIRPe1 оценивали с помощью CELISA. Реакционную способность подтверждали, применяя клетки СНО-К1 (АТСС CCL-61), экспрессирующие кДНК, кодирующую полноразмерную открытую рамку считывания hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A) и hSIRPp1, субклонированную в вектор pCI-neo (Promega, Мадисон, Висконсин). Клетки CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV1(P74A) и CHOK1.hSIRPp1 высевали в культуральную среду (DMEM-F12 (Gibco), дополненную 5% сывороткой новорожденных телят (BioWest) и пенициллином/стрептомицином (Gibco)), в 96-луночные культуральныеBinding specificity of anti-hSIRPa monoclonal antibodies (e.g., including anti-hSIRPa antibodies known in the art: KWAR23 (US patent CA2939293 A1), 18D5 (patent WO2017/178653 A2) and various commercially available anti-hSIRPa antibodies) to hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A ) and hSIRPe1 were assessed by CELISA. Reactivity was confirmed using CHO-K1 cells (ATCC CCL-61) expressing cDNA encoding the full-length open reading frame of hSIRPaV1, hSIRPaV1(P74A), and hSIRPp1 subcloned into the pCI-neo vector (Promega, Madison, WI). CHO-K1.hSIRPaV1, CHO-K1.hSIRPaV1(P74A) and CHOK1.hSIRPp1 cells were seeded in culture medium (DMEM-F12 (Gibco) supplemented with 5% newborn calf serum (BioWest) and penicillin/streptomycin (Gibco)), in 96-well culture

- 103 043743 планшеты с плоским дном и инкубировали при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% в течение 24 ч. Затем культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% с очищенными антителами против hSIRPa (используемыми при концентрации 10 мкг/мл и ее разведениях). Затем клетки промывали ФБР-Т и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2 и влажности 95% либо с антителом козы против IgG мыши-HRP (Southern Biotech), либо с антителом козы против IgG человека-HRP (Jackson Immuno Research), либо с антителом козы против IgG кролика-HRP (Southern Biotech). Затем клетки промывали три раза ФБР-Т и иммунореакционную способность против hSIRPaVl, hSIRPaVl(P74A) и hSIRPpi визуализировали с помощью стабилизированного хромогена ТМБ (Invitrogen). Реакции останавливали добавлением 0,5 М H2SO4 и считывали поглощение на 450 и 610 нм. Значения ЕС5о -концентрацию, при которой наблюдается 50% полного сигнала связывания - рассчитывали, применяя GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc)- 103 043743 plates with a flat bottom and incubated at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity for 24 hours. Then the culture medium was removed and the cells were incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO 2 and 95 humidity % with purified anti-hSIRPa antibodies (used at a concentration of 10 μg/ml and its dilutions). Cells were then washed with PBS-T and incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity with either goat anti-mouse IgG-HRP (Southern Biotech) or goat anti-human IgG-HRP (Jackson Immuno Research) or goat anti-rabbit IgG-HRP (Southern Biotech). Cells were then washed three times with PBS-T, and immunoreactivity against hSIRPaVl, hSIRPaVl(P74A), and hSIRPpi was visualized using TMB stabilized chromogen (Invitrogen). Reactions were stopped by adding 0.5 M H 2 SO4 and absorbance was read at 450 and 610 nm. EC 5 o values - the concentration at which 50% of the total binding signal is observed - were calculated using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc)

В табл. 26 представлено, что KWAR23, клон 18D5 и все доступные для приобретения моноклональные антитела против hSIRPa способны связываться с вариантом Р74А hSIRPaVl, тогда как антитела hSIRPa.40A и hSIRPa.50А согласно настоящему изобретению не связываются с вариантом Р74А hSIRPaVl при исследованных условиях.In table 26 shows that KWAR23, clone 18D5 and all commercially available anti-hSIRPa monoclonal antibodies are able to bind to the P74A variant of hSIRPaVl, whereas the hSIRPa.40A and hSIRPa.50A antibodies of the present invention do not bind to the P74A variant of hSIRPaVl under the conditions tested.

Таблица 26Table 26

Антитело Antibody Связывание hSIRPaVl, ЕС50 (нМ) hSIRPaVl binding, EC50 (nM) Связывание hSIRPaVl(P74A), ЕС50 (нМ) Binding hSIRPaVl(P74A), EC50 (nM) Связывание hSIRPfl, ЕС50 (нМ) hSIRPfl binding, EC50 (nM) hSIRPa.40A hSIRPa.40A 0,053 0.053 н/о But н/о But hSIRPa.50A hSIRPa.50A 0,307 0.307 н/о But н/о But KWAR23 KWAR23 0,135 0.135 0,077 0.077 0,065 0.065 18D5 18D5 0,128 0.128 0,073 0.073 0,064 0.064 Антитело против hSIRPa (клон SE5A5) Anti-hSIRPa antibody (clone SE5A5) 0,156 0.156 0,207 0.207 0,105 0.105 Антитело против hSIRPa (клон 7ВЗ) Antibody against hSIRPa (clone 7B3) 0,122 0.122 0,141 0.141 0,115 0.115 Антитело против hSIRPa (клон 1С6) Antibody against hSIRPa (clone 1C6) 0,329 0.329 0,440 0.440 >2,817 >2.817 Антитело против hSIRPa (клон 27) Anti-hSIRPa antibody (clone 27) н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон SE7C2) Antibody against hSIRPa (clone SE7C2) >7,010 >7,010 >6,139 >6.139 н/о But Антитело против hSIRPa (клон РЗС4) Antibody against hSIRPa (clone P3S4) 0,179 0.179 0,197 0.197 0,160 0.160 Антитело против hSIRPa (клон 2А4А5) Antibody against hSIRPa (clone 2A4A5) н/о But н/о But >6,456 >6,456 Антитело против hSIRPa (клон 15-414) Anti-hSIRPa antibody (clone 15-414) н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 1Н1) Antibody against hSIRPa (clone 1H1) н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон С-7) Antibody against hSIRPa (clone C-7) н/о But н/о But н/о But Антитело против hSIRPa (клон 03) Anti-hSIRPa antibody (clone 03) > 8,247 > 8,247 > 8,992 >8,992 > 6,092 > 6,092 Антитело против hSIRPa (клон 5Е10) Antibody against hSIRPa (clone 5E10) н/о But н/о But н/о But

- 104043743- 104043743

Антитело против hSIRPa (клон 602411) Anti-hSIRPa antibody (clone 602411) 0,047 0.047 0,076 0.076 0,051 0.051 Антитело против hSIRPa (клон EPR16264) Anti-hSIRPa antibody (clone EPR16264) >1,166 >1.166 > 1,999 > 1,999 н/о But Антитело против hSIRPa (клон D6I3M) Antibody against hSIRPa (clone D6I3M) >6,413 >6,413 > 121,509 > 121,509 н/о But Антитело против hSIRPa (клон 001) Anti-hSIRPa antibody (clone 001) >0,868 >0.868 > 1,192 > 1.192 н/о But Антитело против hSIRPa (клон REA144) Anti-hSIRPa antibody (clone REA144) >3,661 >3,661 > 4,793 > 4,793 >3,075 >3.075

н/о - не обнаружено.n/a - not found.

Пример 27. Последовательности, упоминаемые в настоящем описании.Example 27 Sequences mentioned herein.

Описание Description SEQ ID NO: SEQ ID NO: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SUBSEQUENCE CDR1 тяжелой цепи Heavy chain CDR1 1 1 NYYIH NYYIH 50А 50A (последовательность аминокислот) CDR2 тяжелой цепи 50А (последовательность аминокислот) (amino acid sequence) CDR2 heavy chain 50A (amino acid sequence) 2 2 WIYPGNVNTKYNEKFKA WIYPGNVNTKYNEKFKA CDR3 тяжелой цепи Heavy chain CDR3 3 3 PTIIATDFDV PTIIATDFDV 50А (последовательность аминокислот) CDR1 легкой цепи 50А (последовательность аминокислот) 50A (amino acid sequence) Light chain CDR1 50A (amino acid sequence) 4 4 KASQGVGTAVG KASQGVGTAVG CDR2 легкой цепи 50А (последовательность аминокислот) Light chain CDR2 50A (amino acid sequence) 5 5 WASTRHT WASTRHT CDR3 легкой цепи 50А (последовательность аминокислот) CDR3 light chain 50A (amino acid sequence) 6 6 QQYSTYPFT QQYSTYPFT

- 105 043743- 105 043743

Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела 50 (консенсусная последовательность) Heavy chain variable region humanized antibody 50 (consensus sequence) 7 7 EVQLX1X2SGX3EX4VKPGASVX5X6SCKASGFTFTNYYIHWVR QX7PX8QGLEWX9GWIYPGNVNTKYNEKFKAX10X11X12X13TA DKSTSTX14YMX15LSSLX16SX17DX18AWYCARPTIIATDFDVW GQGTX19VTVSS где: Xi = Q, V Х2 = Q, Е Хз = A, S Х4 = V, L Х5 = К, М Хе = V, I Х7 = A, R Х8 = G, Е Х9 = I, М Хю = R, К Хп = V, А Х12 = Т, I Х1з = I, М Х14 = А, V Xi5 = D,E,Q Xie = R, ТEVQLX1X2SGX3EX4VKPGASVX5X6SCKASGFTFTNYYIHWVR QX7PX8QGLEWX9GWIYPGNVNTKYNEKFKAX10X11X12X13TA DKSTSTX14YMX15LSSLX16SX17DX18AWYCARPTIIATDFDVW GQGTX19VTVSS where: Xi = Q, V X 2 = Q , E X3 = A, S X 4 = V, L X 5 = K, M Xe = V, I X 7 = A, R X 8 = G, E X 9 = I, M Xyu = R, K Xn = V, A X12 = T, I X1z = I, M X14 = A, V Xi5 = D,E,Q Xie = R, T

- 106043743- 106043743

Х17 = Е, D Х18 = т, М Х19 = т, L X17 = E, D X18 = t, M X19 = t, L Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела 50 (консенсусная последовательность) Light chain variable region humanized antibody 50 (consensus sequence) 8 8 X1X2X3X4TQSPSX5LSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQX6 KPGKX7PKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTX8FTLX9IX10X11 LQPEDX12AX13YYCQQYSTYPFTFGGGTKX14EIK где: Xi = D, Е Х2 = I, L Хз = V, Q Х4 = L, М Х5 = F, S Хе = Q, К Х7 = A, S, V х8 = Е, D Х9 = Т, А Хю = S, N Хп = S, N, G Xi2 = F, I, V Х1з = A, D, Т Xi4 = L, VX1X2X3X4TQSPSX5LSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQX6 KPGKX7PKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTX8FTLX9IX10X11 LQPEDX12AX13YYCQQYSTYPFTFGGGTKX14EIK where: Xi = D, E Х 2 = I, L Хз = V, Q Х 4 = L, M X 5 = F, S Xe = Q, K X 7 = A, S, V x 8 = E , D Х9 = Т, А Ху = S, N Хп = S, N, G Xi2 = F, I, V Х1з = A, D, Т Xi4 = L, V VH1 hSIRPa. 50 А (последовательность нуклеотидов) VH1 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 9 9 GAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCC GCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCTACCTCCACCGCCTA CATGGACCTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT GAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCC GCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCTACCTCCACC GCCTA CATGGACCTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT VH1 hSIRPa. 50 А (последовательность аминокислот) VH1 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 10 10 EVQLQQSGAEVVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP GQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTITADKSTSTAYMD LSSLRSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS EVQLQQSGAEVVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP GQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTITADKSTSTAYMD LSSLRSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS VH2 hSIRPa. 50 А (последовательность нуклеотидов) VH2 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 11 eleven GAAGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCTCCGAGCTCGTGAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCA AGGCCACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGCCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTG GAAGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCTCCGAGCTCGTGAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCA AGGCCACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACC GCCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTG

- 107 043743- 107 043743

TACTACTGTGCCCGGCCTACCATCATTGCCACCGACTTCGA TGTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT TACTACTGTGCCCGGCCTACCATCATTGCCACCGACTTCGA TGTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT VH2 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VH2 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 12 12 EVQLVESGSELVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP GQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATITADKSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTLVTVSS EVQLVESGSELVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP GQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATITADKSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTLVTVSS VH3 hSIRPa. 50 A (последовательность нуклеотидов) VH3 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 13 13 GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCCGTGATGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTTC ACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGCGGC CAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCGG CAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCCG CGTGATCATGACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGTGTAC ATGCAGCTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCGA CGTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCCGTGATGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTTC ACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGCGGC CAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCGG CAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCCG CGTGATCATGACCGCCGACAAGTCCACCTCCA CCGTGTAC ATGCAGCTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCAGACCACCATCATTGCCACCGACTTCGA CGTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT VH3 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VH3 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 14 14 EVQLVQSGAEVVKPGASVMISCKASGFTFTNYYIHWVRQRP GQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVIMTADKSTSTVYM QLSSLTSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTLVTVSS EVQLVQSGAEVVKPGASVMISCKASGFFTNYYIHWVRQRP GQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVIMTADKSTSTVYM QLSSLTSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTLVTVSS VH4 hSIRPa. 50 A (последовательность нуклеотидов) VH4 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 15 15 GAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAGCTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGCGG CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCA AGGCCACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGCCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT GAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAGCTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGCGG CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCA AGGCCACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCG CCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT VH4 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VH4 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 16 16 EVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQRP GQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATITADKSTSTAYM ELSSLTSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQRP GQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATITADKSTSTAYM ELSSLTSEDTAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS VH5 hSIRPa. 50 A (последовательность нуклеотидов) VH5 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 17 17 GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCCGAGCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCC GCGTGACCATGACCGCCGACAAGTCTACCTCCACCGCCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGACGACATGGCCGTG TACTACTGCGCCAGACCCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTT CACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCC CCCGAGCAGGGACTGGAATGGATCGGCTGGATCTACCCCG GCAACGTGAACACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCC GCGTGACCATGACCGCCGACAAGTCTACCTCCA CCGCCTA CATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGACGACATGGCCGTG TACTACTGCGCCACACCACCATCATTGCCACCGACTTCG ACGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCT VH5 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VH5 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 18 18 EVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP EQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTADKSTSTAYM ELSSLRSDDMAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGFTFTNYYIHWVRQAP EQGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTADKSTSTAYM ELSSLRSDDMAVYYCARPTIIATDFDVWGQGTTVTVSS

- 108 043743- 108 043743

VL1 hSIRPa.50A (последовательность нуклеотидов) VL1 hSIRPa.50A (nucleotide sequence) 19 19 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCAGCTTCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCG AGGATTTCGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCAGCTTCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTG CAGCCCG AGGATTTCGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG VL1 hSIRPa.50A (последовательность аминокислот) VL1 hSIRPa.50A (amino acid sequence) 20 20 DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPGK APKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAA YYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPGK APKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAA YYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK VL2 hSIRPa.50A (последовательность нуклеотидов) VL2 hSIRPa.50A (nucleotide sequence) 21 21 GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAACCTGCAGCCCG AGGACTTCGCCGACTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAACCTGC AGCCCG AGGACTTCGCCGACTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL2 hSIRPa.50A (последовательность аминокислот) VL2 hSIRPa.50A (amino acid sequence) 22 22 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPG KAPKLLTYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTTSNLQPEDFA DYYCQQYSTYPFTFGGGTKVEIK DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPG KAPKLLTYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTTSNLQPEDFA DYYCQQYSTYPFTFGGGTKVEIK VL3 hSIRPa.50A (последовательность нуклеотидов) VL3 hSIRPa.50A (nucleotide sequence) 23 23 GAGCTCGTGATGACCCAGTCCCCTTCCAGCCTGTCTGCCTC CGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTTACCCTGGCCATCTCCAGCCTGCAGCCCG AGGATATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GAGCTCGTGATGACCCAGTCCCCTTCCAGCCTGTCTGCCTC CGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCTACCAG ACACACCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTTACCCTGGCCATCTCCAGCCTGCA GCCCG AGGATATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG ХАЗ hSIRPa.50A (последовательность аминокислот) HAZ hSIRPa.50A (amino acid sequence) 24 24 ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPG KAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDIA DYYCQQYSTYPFTFGGGTKVEIK ELVMTQSPSSLSSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPG KAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDIA DYYCQQYSTYPFTFGGGTKVEIK VL4 hSIRPa.50A (последовательность нуклеотидов) VL4 hSIRPa.50A (nucleotide sequence) 25 25 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGCTGGTATCAGAAAAAGCCCG GCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAG ACACACCGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACGGCCTGCAGCCTG AGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGCTGGTATCAGAAAAAGCCCG GCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAG ACACACCGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACGGCCTGCAGC CTG AGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG

- 109 043743- 109 043743

VL4 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VL4 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 26 26 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQKKPG KVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTINGLQPEDV ATYYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK DIQMTQSPSSLSSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQKKPG KVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTINGLQPEDV ATYYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK VL5 hSIRPa. 50 A (последовательность нуклеотидов) VL5 hSIRPa. 50 A (nucleotide sequence) 27 27 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCAGCTTCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCCG GCAAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAG ACACACCGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCAACCTGCAGCCCG AGGACTTCGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCAGCTTCCTGTCTGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCTCAG GGCGTGGGCACCGCTGTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCCG GCAAGTCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAG ACACACCGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCAACCTG AGCCCG AGGACTTCGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTACTCCACCTA CCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG VL5 hSIRPa. 50 A (последовательность аминокислот) VL5 hSIRPa. 50 A (amino acid sequence) 28 28 DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPGK SPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFAA YYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQGVGTAVGWYQQKPGK SPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFAA YYCQQYSTYPFTFGGGTKLEIK VH мыши hSIRPa. 50A (последовательность нуклеотидов) VH mice hSIRPa. 50A (nucleotide sequence) 29 29 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGC CTGGGGCTTCAGTTAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTC ACCTTCACAAACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGC CTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGG AAATGTTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAG GCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGGCCTCTGAGGACTCTGCGGTCTA TTTCTGTGCAAGACCTACGATAATAGCTACGGACTTCGAT GTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGC CTGGGGCTTCAGTTAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTC ACCTTCACAAACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGC CTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGG AAATGTTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAG GCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTA CA TGCAGCTCAGCAGCCTGGCCTCTGAGGACTCTGCGGTCTA TTTCTGTGCAAGACCTACGATAATAGCTACGGACTTCGAT GTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA VH мыши hSIRPa. 50A (последовательность аминокислот) VH mice hSIRPa. 50A (amino acid sequence) 30 thirty QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFTFTNYYIHWVKQRPG QGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATLTADKSSTTAYMQL SSLASEDSAVYFCARPTIIATDFDVWGAGTTVTVSS QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFTFTNYYIHWVKQRPG QGLEWIGWIYPGNVNTKYNEKFKAKATLTADKSSTTAYMQL SSLASEDSAVYFCARPTIIATDFDVWGAGTTVTVSS VL мыши hSIRPa. 50A (последовательность нуклеотидов) hSIRPa mouse VL. 50A (nucleotide sequence) 31 31 GACATTGTCATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATC AGTAGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCA GGGTGTGGGTACTGCTGTAGGCTGGTATCAACAGAAACCA GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCC GGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATC TGGGACAGATTTCAGTCTCGCCATTAGCAATGTGCAGTCT GAAGACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCACCT ATCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAATCTAGAAATAAA А GACATTGTCATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATC AGTAGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCA GGGTGTGGGTACTGCTGTAGGCTGGTATCAACAGAAACCA GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCC GGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATC TGGGACAGATTTCAGTCTCGCCATTAGCAATGTGCAG TCT GAAGACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCACCT ATCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAATCTAGAAATAAA A VL мыши hSIRPa. 50A (последовательность аминокислот) hSIRPa mouse VL. 50A (amino acid sequence) 32 32 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQGVGTAVGWYQQKP GQSPRLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFSLAISNVQSEDL ADYFCQQYSTYPFTFGGGTNLEIK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQGVGTAVGWYQQKP GQSPRLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFSLAISNVQSEDL ADYFCQQYSTYPFTFGGGTNLEIK SIRPaVl человека (последовательность нуклеотидов) Human SIRPaVl (nucleotide sequence) 33 33 ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCCGGCCGCCTCGGGCCGC TGCTCTGCCTGCTGCTCGCCGCGTCCTGCGCCTGGTCAGGA GTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCCGGCCGCCTCGGGCCGC TGCTCTGCCTGCTGCTCGCCGCGTCCTGCGCCTGGTCAGGA GTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC

- 110 043743- 110 043743

AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGC GCTGCACTGCGACCTCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCA GTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTAC AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTT CAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCG CATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGT TTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAA ACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACG GCTTCTCACCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAA TGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCA AGGTGGTGCTGACCCGCGAGGACGTTCACTCTCAAGTCAT CTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCAC CCACCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCGTGAGGGCAGAGAA CCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGT CCCGGACAGAAACGGCCTCAACCGTTACAGAGAACAAGG ATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGT ATCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTG GAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCATGAC CTGAAGGTCTCAGCCCACCCGAAGGAGCAGGGCTCAAATA CCGCCGCTGAGAACACTGGATCTAATGAACGGAACATCTA TATTGTGGTGGGTGTGGTGTGCACCTTGCTGGTGGCCCTAC TGATGGCGGCCCTCTACCTCGTCCGAATCAGACAGAAGAA AGCCCAGGGCTCCACTTCTTCTACAAGGTTGCATGAGCCC GAGAAGAATGCCAGAGAAATAACACAGGACACAAATGAT ATCACATATGCAGACCTGAACCTGCCCAAGGGGAAGAAG CCTGCTCCCCAGGCTGCGGAGCCCAACAACCACACGGAGT ATGCCAGCATTCAGACCAGCCCGCAGCCCGCGTCGGAGGA CACCCTCACCTATGCTGACCTGGACATGGTCCACCTCAAC CGGACCCCCAAGCAGCCGGCCCCCAAGCCTGAGCCGTCCT TCTCAGAGTACGCCAGCGTCCAGGTCCCGAGGAAG AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGC GCTGCACTGCGACCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCA GTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTAC AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTT CAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCG CATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGT TTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAA ACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACG GCTTCTCACCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAA TGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACC CC GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCA AGGTGGTGCTGACCCGCGAGGACGTTCACTCTCAAGTCAT CTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCAC CCACCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCGTGAGGGCAGAGAA CCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTA CCCC CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGT CCCGGACAGAAACGGCCTCAACCGTTACAGAGAACAAGG ATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGT ATCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTG GAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCATGAC CTGAAGGTCTCAGCCCACCCGAAGGAGCAGGGCTCAAATA CC C CTGCTCCCCAGGCTGCGGAGCCCAACAACCACACGGAGT ATGCCAGCATTCAGACCAGCCCGCAGCCCGCGTCGGAGGA CACCCTCACCTATGCTGACCTGGACATGGTCCACCTCAAC CGGACCCCCAAGCAGCCGGCCCCCAAGCCTGAGCCGTCCT TCTCAGAGTACGCCAGCGTCCAGGTCCCGAGGAAG SIRPaVl человека (последовательность аминокислот) Human SIRPaVl (amino acid sequence) 34 34 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESV SYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP

- 111 043743- 111 043743

PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAA EPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK SIRPaV2 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV2 (nucleotide sequence) 35 35 ATGGAACCTGCCGGACCTGCCCCTGGCAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGAGCGTGTCCGTGGCTGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGC ACTGTACCGTGACCAGCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGAGCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCAGCATCA GCATCTCCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTA CTGCGTGAAGTTCAGAAAGGGCAGCCCCGACACCGAGTTC AAGAGCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAGC CTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGCCAGAGCTACA CCTCAGCACACCGTGTCTTTCACATGCGAGAGCCACGGCT TCAGCCCCAGAGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGG CAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTG GGCGAGTCCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACCGCCAAGG TGGTGCTGACCCGCGAGGATGTGCACAGCCAAGTGATCTG CGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAGA GGCACCGCTAACCTGAGCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCA CCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACCA AGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCTCAG AGACTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGAAACGTGTCCA GAACCGAGACAGCCAGCACCGTGACAGAGAACAAGGACG GCACATACAACTGGATGAGCTGGCTGCTCGTGAACGTGTC CGCCCACAGAGATGACGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCTAAGAGCCACGACCTG AAGGTGTCCGCTCACCCCAAAGAGCAGGGCAGCAACACC GCCGCTGAGAACACAGGCAGCAACGAGAGAAACATCTAC ATCGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCT GATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCAGACAGAAGAAG GCCCAGGGCTCCACCTCCAGCACCAGACTGCACGAGCCTG AGAAGAACGCCCGCGAGATCACCCAGGACACCAACGACA TCACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCC TGCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACAGAGTAC ATGGAACCTGCCGGACCTGCCCCTGGCAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGAGCGTGTCCGTGGCTGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGC ACTGTACCGTGACCAGCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGAGCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCAGCATCA GCATCTCCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTA CTGCGTGAAGTTCAGAAAGGGCAGCCCCGACACCGAGTTC AAGAGCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAGC CTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGCCA GAGCTACA CCTCAGCACACCGTGTCTTTCACATGCGAGAGCCACGGCT TCAGCCCCAGAGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGG CAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTG GGCGAGTCCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACCGCCAAGG TGGTGCTGACCCGCGAGGATGTGCACAGCCAAGTGATCTG CGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGC GATCCTCTGAGA GGCACCGCTAACCTGAGCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCA CCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACCA AGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCTCAG AGACTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGAAACGTGTCCA GAACCGAGACAGCCAGCACCGTGACAGAGAACAAGGACG GCACATACAACTGGATGAGCTGGCTG CTCGTGAACGTGTC CGCCCACAGAGATGACGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCTAAGAGCCACGACCTG AAGGTGTCCGCTCACCCCAAAGAGCAGGGCAGCAACACC GCCGCTGAGAACACAGGCAGCAACGAGAGAAACATCTAC ATCGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCT GATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATC AGACAGAAGAAG GCCCAGGGCTCCACCTCCAGCACCAGACTGCACGAGCCTG AGAAGAACCGCCCGCGATCACCCAGGACACCAACGACA TCACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCC TGCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACAGAGTAC

- 112 043743- 112 043743

GCCAGCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCAGCGAGGACA CACTGACATACGCCGATCTGGACATGGTGCACCTGAACAG AACCCCCAAGCAGCCCGCTCCCAAGCCCGAGCCTAGCTTC TCTGAGTACGCCTCCGTGCAGGTGCCCAGAAAA GCCAGCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCAGCGAGGACA CACTGACATACGCCGATCTGGACATGGTGCACCTGAACAG AACCCCCAAGCAGCCCGCTCCCAAGCCCGAGCCTAGCTTC TCTGAGTACGCCTCCGTGCAGGTGCCCAGAAAA SIRPaV2 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV2 (amino acid sequence) 36 36 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEG HFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGS PDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAK VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLE VTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTET ASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDG QPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVV CTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREIT QDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPA SEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEG HFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGS PDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAK VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLE VTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTET ASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDG QPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVV CTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQ GSTSSTRLHEPEKNAREIT QDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPA SEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK SIRPpi человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPpi (nucleotide sequence) 37 37 ATGCCCGTGCCAGCCTCCTGGCCCCACCTTCCTAGTCCTTT CCTGCTGATGACGCTACTGCTGGGGAGACTCACAGGAGTG GCAGGTGAGGACGAGCTACAGGTGATTCAGCCTGAAAAG TCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAGTCGGCCACTCTGCGCT GTGCTATGACGTCCCTGATCCCTGTGGGGCCCATCATGTG GTTTAGAGGAGCTGGAGCAGGCCGGGAATTAATCTACAAT CAGAAAGAAGGCCACTTCCCACGGGTAACAACTGTTTCAG AACTCACAAAGAGAAACAACCTGGACTTTTCCATCAGCAT CAGTAACATCACCCCAGCAGACGCCGGCACCTACTACTGT GTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCTGACGACGTGGAGTTTA AGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACC CTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGTGAGGGCCACA CCTGAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCATGGCT TCTCTCCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAATGG GAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCCGCA GGAGACAGTGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCAGGG TGGTGCTGACCCGTGGGGACGTTCACTCTCAAGTCATCTG CGAGATAGCCCACATCACCTTGCAGGGGGACCCTCTTCGT GGGACTGCCAACTTGTCTGAGGCCATCCGAGTTCCACCCA CCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCATGAGGGCAGAGAACCA GGCAAACGTCACCTGCCAGGTGAGCAATTTCTACCCCCGG GGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAATGTGTCCC GGACAGAAACAGCTTCGACCCTCATAGAGAACAAGGATG GCACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAACACCTG TGCCCACAGGGACGATGTGGTGCTCACCTGTCAGGTGGAG ATGCCCGTGCCAGCCTCCTGGCCCCACCTTCCTAGTCCTTT CCTGCTGATGACGCTACTGCTGGGGAGACTCACAGGAGTG GCAGGTGAGGACGAGCTACAGGTGATTCAGCCTGAAAAG TCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAGTCGGCCACTCTGCGCT GTGCTATGACGTCCCTGATCCCTGTGGGGCCCATCATGTG GTTTAGAGGAGCTGGAGCAGGCCGGGAATTAATCTACA AT CAGAAAGAAGGCCACTTCCCACGGGTAACAACTGTTTCAG AACTCACAAAGAGAAACAACCTGGACTTTTCCATCAGCAT CAGTAACATCACCCCAGCAGACGCCGGCACCTACTACTGT GTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCTGACGACGTGGAGTTTA AGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACC CTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGTGAGGGCCA CA CCTGAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCATGGCT TCTCTCCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAATGG GAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCCGCA GGGACAGTGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCAGGG TGGTGCTGACCCGTGGGGACGTTCACTCTCAAGTCATCTG CGAGATAGCCCACATCACCTTGCAGGGGGACCCTC TTCGT GGGACTGCCAACTTGTCTGAGGCCATCCGAGTTCCACCCA CCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCATGAGGGCAGAGAACCA GGCAAACGTCACCTGCCAGGTGAGCAATTTCTACCCCCGG GGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAATGTGTCCC GGACAGAAACAGCTTCGACCCTCATAGAGAACAAGGATG GCACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAACACC TG TGCCCACAGGGACGATGTGGTGCTCACCTGTCAGGTGGAG

- 113 043743- 113 043743

CATGATGGGCAGCAAGCAGTCAGCAAAAGCTATGCCCTGG AGATCTCAGCGCACCAGAAGGAGCACGGCTCAGATATCAC CCATGAAGCAGCGCTGGCTCCTACTGCTCCACTCCTCGTA GCTCTCCTCCTGGGCCCCAAGCTGCTACTGGTGGTTGGTGT CTCTGCCATCTACATCTGCTGGAAACAGAAGGCC CATGATGGGCAGCAAGCAGTCAGCAAAAGCTATGCCCTGG AGATCTCAGCGCACCAGAAGGAGCACGGCTCAGATATCAC CCATGAAGCAGCGCTGGCTCCTACTGCTCCACTCCTCGTA GCTCTCCTCCTGGGCCCCAAGCTGCTACTGGTGGTTGGTGT CTCTGCCATCTACATCTGCTGGAAACAGAAGGCC SIRPp1 человека (последовательность аминокислот) human SIRPp1 (amino acid sequence) 38 38 MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHSTA RVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTL EVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSRT ETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEHD GQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALLL GPKLLLWGVSAIYICWKQKA MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHS TA RVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTL EVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSRT ETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEHD GQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALLL GPKLLLWGVSAIYICWKQKA SIRPy человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPy (nucleotide sequence) 39 39 ATGCCTGTCCCAGCCTCCTGGCCCCATCCTCCTGGTCCTTT CCTGCTTCTGACTCTACTGCTGGGACTTACAGAAGTGGCA GGTGAGGAGGAGCTACAGATGATTCAGCCTGAGAAGCTCC TGTTGGTCACAGTTGGAAAGACAGCCACTCTGCACTGCAC TGTGACCTCCCTGCTTCCCGTGGGACCCGTCCTGTGGTTCA GAGGAGTTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTACAATCAAA AAGAAGGCCACTTCCCCAGGGTAACAACAGTTTCAGACCT CACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATCAGT AGCATCACCCCAGCAGATGTCGGCACATACTACTGTGTGA AGTTTCGAAAAGGGAGCCCTGAGAACGTGGAGTTTAAGTC TGGACCAGGCACTGAGATGGCTTTGGGTGCCAAACCCTCT GCCCCCGTGGTATTGGGCCCTGCGGCGAGGACCACACCTG AGCATACAGTGAGTTTCACCTGTGAGTCCCATGGCTTCTCT CCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGGAATG AGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCCACAGGACA GAGTGTGGCCTACAGCATCCGCAGCACAGCCAGGGTGGTA CTGGACCCCTGGGACGTTCGCTCTCAGGTCATCTGCGAGG TGGCCCATGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTTCGTGGGAC TGCCAACTTGTCTGAGGCCATCCGAGTTCCACCCACCTTGG AGGTTACTCAACAGCCCATGAGGGTGGGGAACCAGGTAA ACGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCCCAGAGCCT ACAGCTGACCTGGTCGGAGAATGGAAACGTGTGCCAGAG AGAAACAGCCTCGACCCTTACAGAGAACAAGGATGGTAC CTACAACTGGACAAGCTGGTTCCTGGTGAACATATCTGAC CAAAGGGATGATGTGGTCCTCACCTGCCAGGTGAAGCATG ATGGGCAGCTGGCGGTCAGCAAACGCCTTGCCCTAGAGGT ATGCCTGTCCCAGCCTCCTGGCCCCATCCTCCTGGTCCTTT CCTGCTTCTGACTCTACTGCTGGGACTTACAGAAGTGGCA GGTGAGGAGGAGCTACAGATGATTCAGCCTGAGAAGCTCC TGTTGGTCACAGTTGGAAAGACAGCCACTCTGCACTGCAC TGTGACCTCCCTGCTTCCCGTGGGACCCGTCCTGTGGTTCA GAGGAGTTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTACAA TCAAA AAGAAGGCCACTTCCCCAGGGTAACAACAGTTTCAGACCT CACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATCAGT AGCATCACCCCAGCAGATGTCGGCACATACTACTGTGTGA AGTTTCGAAAAGGGAGCCCTGAGAACGTGGAGTTTAAGTC TGGACCAGGCACTGAGATGGCTTTGGGTGCCAAACCCTCT GCCCCCGTGGTATTGGGCCCTGCGGCGAGGACCACA CCTG AGCATACAGTGAGTTTCACCTGTGAGTCCCATGGCTTCTCT CCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGGAATG AGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCCACAGGACA GAGTGTGGCCTACAGCATCCGCAGCACAGCCAGGGTGGTA CTGGACCCCTGGGACGTTCGCTCTCAGGTCATCTGCGAGG TGGCCCATGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTTC GTGGGAC TGCCAACTTGTCTGAGGCCATCCGAGTTCCACCCACCTTGG AGGTTACTCAACAGCCCATGAGGGTGGGGAACCAGGTAA ACGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCCCAGAGCCT ACAGCTGACCTGGTCGGAGAATGGAAACGTGTGCCAGAG AGAAACAGCCTCGACCCTTACAGAGAACAAGGATGGTAC CTACAACTGGACAAGCTGGTTCCCTGGTGA ACATATCTGAC CAAAGGGATGATGTGGTCCTCACCTGCCAGGTGAAGCATG ATGGGCAGCTGGCGGTCAGCAAACGCCTTGCCCTAGAGGT

- 114 043743- 114 043743

CACAGTCCACCAGAAGGACCAGAGCTCAGATGCTACCCCT GGCCCGGCATCATCCCTTACTGCGCTGCTCCTCATAGCTGT CCTCCTGGGCCCCATCTACGTCCCCTGGAAGCAGAAGACC CACAGTCCACCAGAAGGACCAGAGCTCAGATGCTACCCCT GGCCCGGCATCATCCCTTACTGCGCTGCTCCTCATAGCTGT CCTCCTGGGCCCCATCTACGTCCCCTGGAAGCAGAAGACC SIRPy человека (последовательность аминокислот) human SIRPy (amino acid sequence) 40 40 MPVPASWPHPPGPFLLLTLLLGLTEVAGEEELQMIQPEKLLL VTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEG HFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGS PENVEFKSGPGTEMALGAKPSAPVVLGPAARTTPEHTVSFTC ESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPTGQSVAYSIRSTA RVVLDPWDVRSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRVGNQVNVTCQVRKFYPQSLQLTWSENGNVCQ RETASTLTENKDGTYNWTSWFLVNISDQRDDWLTCQVKHD GQLAVSKRLALEVTVHQKDQSSDATPGPASSLTALLLIAVLL GPIYVPWKQKT MPVPASWPHPPGPFLLLTLLLGLTEVAGEEELQMIQPEKLLL VTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEG HFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGS PENVEFKSGPGTEMALGAKPSAPVVLGPAARTTPEHTVSFTC ESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPTG QSVAYSIRSTA RVVLDPWDVRSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRVGNQVNVTCQVRKFYPQSLQLTWSENGNVCQ RETASTLTENKDGTYNWTSWFLVNISDQRDDWLTCQVKHD GQLAVSKRLALEVTVHQKDQSSDATPGPASSLTALLLIAVLL GPIYVPWKQKT CD47 человека (последовательность нуклеотидов) human CD47 (nucleotide sequence) 41 41 ATGTGGCCTCTGGTGGCCGCTCTGCTGCTGGGCTCTGCTTG TTGTGGATCCGCCCAGCTGCTGTTCAACAAGACCAAGTCC GTGGAGTTCACCTTCTGCAACGATACCGTCGTGATCCCCTG CTTCGTGACCAACATGGAAGCCCAGAACACCACCGAGGTG TACGTGAAGTGGAAGTTCAAGGGCCGGGACATCTACACCT TCGACGGCGCCCTGAACAAGTCCACCGTGCCCACCGATTT CTCCAGCGCCAAGATCGAGGTGTCACAGCTGCTGAAGGGC GACGCCTCCCTGAAGATGGACAAGTCCGACGCCGTGTCCC ACACCGGCAACTACACCTGTGAAGTGACCGAGCTGACCAG AGAGGGCGAGACAATCATCGAGCTGAAGTACCGGGTGGT GTCCTGGTTCAGCCCCAACGAGAACATCCTGATCGTGATC TTCCCCATCTTCGCCATCCTGCTGTTCTGGGGCCAGTTCGG CATCAAGACCCTGAAGTACAGATCCGGCGGCATGGACGA AAAGACAATCGCCCTGCTGGTGGCTGGCCTCGTGATCACC GTGATTGTGATCGTGGGCGCTATCCTGTTCGTGCCCGGCG AGTACAGCCTGAAGAATGCTACCGGCCTGGGCCTGATTGT GACCTCCACCGGAATCCTGATCCTGCTGCACTACTACGTGT TCTCCACCGCTATCGGCCTGACCTCCTTCGTGATCGCCATT CTCGTGATCCAAGTGATCGCCTACATCCTGGCCGTCGTGG GCCTGTCCCTGTGTATCGCCGCCTGCATCCCTATGCACGGC CCCCTGCTGATCTCCGGCCTGTCTATTCTGGCCCTGGCTCA GCTGCTGGGACTGGTGTACATGAAGTTCGTGGCCTCCAAC CAGAAAACCATCCAGCCCCCTCGGAAGGCCGTGGAAGAA CCCCTGAACGCCTTCAAAGAATCCAAGGGCATGATGAACG ACGAA ATGTGGCCTCTGGTGGCCGCTCTGCTGCTGGGCTCTGCTTG TTGTGGATCCGCCCAGCTGCTGTTCAACAAGACCAAGTCC GTGGAGTTCACCTTCTGCAACGATACCGTCGTGATCCCCTG CTTCGTGACCAACATGGAAGCCCAGAACACCACCGAGGTG TACGTGAAGTGGAAGTTCAAGGGCCGGGACATCTACACCT TCGACGGCGCCCTGAACAAGTCCACCGTG CCCACGATTT CTCCAGCGCCAAGATCGAGGTGTCACAGCTGCTGAAGGGC GACGCCTCCCTGAAGATGGACAAGTCCGACGCCGTGTCCC ACACCGGCAACTACACCTGTGAAGTGACCGAGCTGACCAG AGAGGGCGAGACAATCATCGAGCTGAAGTACCGGGTGGT GTCCTGGTTCAGCCCCAACGAGAACATCCTGATCGTGATC TTCCCCATCTTCGCCATCCTGCTG TTCTGGGGCCAGTTCGG CATCAAGACCCTGAAGTACAGATCCGGCGGCATGGACGA AAAGACAATCGCCCTGCTGGTGGCTGGCCTCGTGATCACC GTGATTGTGATCGTGGGCGCTATCCTGTTCGTGCCCGGCG AGTACAGCCTGAAATGCTACCGGCCTGGGCCTGATTGT GACCTCCACCGGAATCCTGATCCTGCTGCACTACGTGT TCTCCACCGCTATCGGCC TGACCTCCTTCGTGATCGCCATT CTCGTGATCCAAGTGATCGCCTACATCCTGGCCGTCGTGG GCCTGTCCCTGTGTATCGCCGCCTGCATCCCTATGCACGGC CCCCTGCTGATCTCCGGCCTGTCTATTCTGGCCCTGGCTCA GCTGCTGGGACTGGTGTACATGAAGTTCGTGGCCTCCAAC CAGAAAACCATCCAGCCCCCTCGGAAGGCCGTGGAAGAA CCCCTGAACGCCTTC AAAGAATCCAAGGGCATGATGAACG ACGAA CD47 человека (последовательность аминокислот) human CD47 (amino acid sequence) 42 42 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCF VTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSS AKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGE MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCF VTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSS AKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGE

- 115 043743- 115 043743

TIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRS GGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGL IVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSL CIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQP PRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE TIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRS GGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGL IVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSL CIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQP PRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE SIRPaV3 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV3 (nucleotide sequence) 43 43 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGCT GTGTACCGTGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCCAGT GGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTGATCTACAA CCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCC GAGTCCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCTCCATCTCCA TCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTACTG CGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACACCGAGTTCAAG TCTGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAACCTT CTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGCTAGAGCTACCCCT CAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTCAG CCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCAAC GAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTGGGCG AGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAGGTGGT GCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCGAG GTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAGAGGCA CCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCACCCT GGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAACCAAGT GAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGCGG CTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCGGA CCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGATGGCA CCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGTCCGCC CACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAACAC GACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGAGCCACGATCTGAAGG TGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCGCCGC TGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACATCGTC GTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTGATGG CTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGGCCCA GGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGAGAAG AACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACATCACC TACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCTGCCC CTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACGCCTC CATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACACCCTG ACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGGACCC ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGCT GTGTACCGTGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCCAGT GGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTG ATCTACAA CCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCC GAGTCCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCTCCATCTCCA TCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTG CGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACACCGAGTTCAAG TCTGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAACCTT CTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGCTA GAGCTACCCCT CAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTCAG CCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCAAC GAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTGGGCG AGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAGGTGGT GCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCGAG GTGGCCCACGTGACACTGCAGGGC GATCCTCTGAGAGGCA CCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCACCCT GGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAACCAAGT GAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGCGG CTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCGGA CCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGATGGCA CCTACAATTGGATGTCTTGGCT GCTCGTGAACGTGTCCGCC CACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAACAC GACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGAGCCACGATCTGAAGG TGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCGCCGC TGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACATCGTC GTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTGATGG CTGCCCTGTACCTCG TGCGGATCCGGCAGAAGAAGGCCCA GGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGAGAAG AACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACATCACC TACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCTGCCC CTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACGCCTC CATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACACCCTG ACCTACGCTGATCTGGA CATGGTGCACCTGAACCGGACCC

- 116 043743- 116 043743

CCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCTCTGA GTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA CCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCTCTGA GTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA SIRPaV3 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV3 (amino acid sequence) 44 44 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VSVAAGESAILLCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEG HFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGS PDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAK VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLE VTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTET ASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDG QPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVV CTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREIT QDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPA SEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VSVAAGESAILLCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEG HFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGS PDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAK VVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLE VTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTET ASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDG QPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVV CTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQ GSTSSTRLHEPEKNAREIT QDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPA SEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK SIRPaV4 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV4 (nucleotide sequence) 45 45 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGGCCTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGC ACTGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGACCCATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGA TGGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGGCCTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCATCCTGC ACTGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGACCCATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCC GCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAG GGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGA TGGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGC TCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG

- 117 043743- 117 043743

CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAA GCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA SIRPaV4 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV4 (amino acid sequence) 46 46 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEGLQVIQPDK SVSVAAGESAILHCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEGLQVIQPDK SVSVAAGESAILHCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGE SVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIR QKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK SIRPaV5 человека (последовательность нуклеотидов) Human SIRPaV5 (nucleotide sequence) 47 47 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTTCGTGCTGGTGGCCGCTGGCGAGACAGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTTCGTGCTGGTGGCCGCTGGCGAGACAGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTG ATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTG CCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT

- 118043743- 118043743

GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACTGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACTGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTC TGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGG ACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA SIRPaV5 человека (последовательность аминокислот) Human SIRPaV5 (amino acid sequence) 48 48 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKF VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKF VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGE SVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIR QKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK SIRPaV6 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV6 (nucleotide sequence) 49 49 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT

- 119043743- 119043743

CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCCCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCCCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTC CCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAG AGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAG CTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCA CCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCC CGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA SIRPaV6 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV6 (amino acid sequence) 50 50 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESV SYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQ KKAQGSTSSTRLHEPEKNA

- 120 043743- 120 043743

REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK SIRPaV8 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV8 (nucleotide sequence) 51 51 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGTCCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCTCCATCTC CATCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACACCGAGTTCA AGTCTGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGCTAGAGCTACCC CTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTGGG CGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAGGTG GTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCG AGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAGAGG CACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCACC CTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACCAA GTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGC GGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCG GACCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGATGG CACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGTCC GCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAA CACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGAGCCACGATCTGA AGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCGC CGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACATC GTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTGA TGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGGC CCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGAG AAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACATC ACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCTG CCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACGC CTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACACC CTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGGA CCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCTC TGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGCCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGTCCACCAAGCGCGAGAACATGGACTTCTCCATCTC CATCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACACCGAGTTCA AGTCTGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGC TAGAGCTACCC CTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGTGGG CGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAGGTG GTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCG AGGTGGCCCACGTGACACTGCAGG GCGATCCTCTGAGAGG CACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCCACC CTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACCAA GTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGC GGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCG GACCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGATGG CACCTACAATTGGATGTCCT GGCTGCTCGTGAACGTGTCC GCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAA CACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGAGCCACGATCTGA AGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCGC CGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACATC GTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTGA TGGCCGCTCTGTACC TCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGGC CCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGAG AAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACATC ACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCTG CCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACGC CTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACACC CTGACCTACGCTGATC TGGACATGGTGCACCTGAACCGGA CCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCTC TGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA

- 121 043743- 121 043743

SIRPaV8 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV8 (amino acid sequence) 52 52 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKE GHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKG SPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTC ESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTA KVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPT LEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRT ETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHD GQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGV VCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREI TQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQP ASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKE GHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKG SPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTC ESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TA KVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPT LEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRT ETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHD GQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGV VCTLLVALLMAALYLVRIRQKKA QGSTSSTRLHEPEKNAREI TQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQP ASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK SIRPaV9 человека (последовательность нуклеотидов) human SIRPaV9 (nucleotide sequence) 53 53 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCTCCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCTCCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCC GCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAG GGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCCGTGCGGGCTGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTC CTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG

- 122 043743- 122 043743

ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA SIRPaV9 человека (последовательность аминокислот) human SIRPaV9 (amino acid sequence) 54 54 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSY SIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQK KAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK hSIRPa-V3ClaC2a (последовательность нуклеотидов) hSIRPa-V3ClaC2a (nucleotide sequence) 55 55 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAGGACGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAG AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGA GATGCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCAT GTGGTTTAGAGGCGCTGGCGCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGCTGACCAAGCGGAACAACCTGGACTTCTCCATCTC CATCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCCGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAGGACGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAG AAGTCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGA GATGCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCAT GTGGTTTAGAGGCGCTGGCGCTGGCAGAGAGCTGATCT AC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGAGCTGACCAAGCGGAACAACCTGGACTTCTCCATCTC CATCAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCCGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCC GCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGAGCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAG GGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC

- 123 043743- 123 043743

ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTGTGCGGGCCGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCTGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCCGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTGTGCGGGCCGAGAACC AAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCA GCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCC CGGACCGAGACAGCCAGCACCGTGACCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGC CAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCTCTGCTG ATGGCTGCCCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACT GCACGAGCCTGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCCGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCC TAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA hSIRPa-V3ClaC2a (последовательность аминокислот) hSIRPa-V3ClaC2a (amino acid sequence) 56 56 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEDELQVIQPEKS VSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKE GHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKG SPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFT CESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHST AKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPP TLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSR TETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEH DGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVG VVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAR EITQDTNDIIYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQ PASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPR К MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEDELQVIQPEKS VSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKE GHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKG SPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFT CESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSY SIHST AKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPP TLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSR TETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEH DGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVG VVCTLLVALLMAALYLVRIRQ KKAQGSTSSTRLHEPEKNAR EITQDTNDIIYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQ PASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPR K hSIRPa-VaC13C2a (последовательность нуклеотидов) hSIRPa-VaC13C2a (nucleotide sequence) 57 57 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC

- 124 043743- 124 043743

TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCCGTGGTGTCTGGACCTGCCGTGCGAGCTA CCCCTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCAGC CGGCGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGA GTGGTGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAG AGGCACCGCTAACCTGTCTGAGACAATCCGGGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACTCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGA TGGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCCAACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCCGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCCGTGGTGTCTGGACCTGCCGTGCGAGCTA CCCCTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACC AACGTGGACCCAGC CGGCGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGA GTGGTGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAG AGGCACCGCTAACCTGTCTGAGACAATCCGGGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACTCAGCAGCCAGTGCGGGCCGAGAAC CAAGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTT CTACCCCC AGCGGCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCGTGACCGAGAACAAGGA TGGCACCTACAATTGGATGTCTTGGCTGCTCGTGAACGTGT CCGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGA ACACGACGGCCAGCCTGCCGTGTCCAAGTCCCACGATCTG AAGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCTCC AACACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCTAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CCCAGGGCTCTACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCCGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCA AGAAGCCT GCCCCTCAGGCCGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA hSIRPa-VaC13C2a (последовательность аминокислот) hSIRPa-VaC13C2a (amino acid sequence) 58 58 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHS TARVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSETIRVPP TLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSR TETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEH DGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVG VVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAR EITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQ PASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPR MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSY SIHS TARVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSETIRVPP TLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSR TETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEH DGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVG VVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKA QGSTSSTRLHEPEKNAR EITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQ PASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPR

- 125 043743- 125 043743

К TO hSIRPa-VaClaC23 (последовательность нуклеотидов) hSIRPa-VaClaC23 (nucleotide sequence) 59 59 ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCCGCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAAC CAGGCCAACGTGACCTGCCAGGTGTCCAACTTCTACCCTC GGGGCCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACACCT GTGCCCACCGGGACGATGTGGTGCTGACCTGTCAGGTGGA ACACGATGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCTCTG GAAGTGTCCGCCCACCCCAAAGAGCAGGGCTCTAATACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCCAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCGGATCCGGCAGAAGAAGG CTCAGGGCTCCACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCTGA GAAGAACGCCAGAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGGTGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA ATGGAACCTGCCGGCCCTGCTCCTGGTAGACTGGGACCTC TGCTGTGTCTGCTGCTGGCCGCCTCTTGTGCTTGGAGCGGA GTGGCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCCGAC AAGTCCGTGCTGGTGGCTGCTGGCGAGACTGCCACCCTGA GATGTACCGCCACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCTATCCA GTGGTTTAGAGGCGCTGGCCCTGGCAGAGAGCTGAT CTAC AACCAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGT CCGACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCG GATCGGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTAC TGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGT TCAAATCCGGCGCTGGCACCGAGCTGTCTGTGCGGGCTAA ACCTTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGCCCTGCC GCTAGAGCTA CCCCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGC TTCAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACG GCAACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGT GGGCGAGTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCCACCGCCAAG GTGGTGCTGACACGCGAGGACGTGCACTCCCAAGTGATCT GCGAGGTGGCCCACGTGACACTGCAG GGCGATCCTCTGAG AGGCACCGCCAACCTGTCCGAGACAATCAGAGTGCCCCCC ACCCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAAC CAGGCCAACGTGACCTGCCAGGTGTCCAACTTCTACCCTC GGGGCCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTC CCGGACCGAGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGAT GGCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGC TCGTGAACACCT GTGCCCACCGGGACGATGTGGTGCTGACCTGTCAGGTGGA ACACGATGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCTCTG GAAGTGTCCGCCCACCCCAAAGAGCAGGGCTCTAATACCG CCGCTGAGAACACCGGCTCCAACGAGCGGAACATCTACAT CGTCGTGGGCGTCGTGTGCACCCTGCTGGTGGCACTGCTG ATGGCCGCTCTGTACCTCGTGCG GATCCGGCAGAAGAAGG CTCAGGGCTCCACCTCCTCCACCAGACTGCACGAGCCTGA GAAGAACGCCAGAGATCACCCAGGACACCAACGACAT CACCTACGCCGACCTGAACCTGCCCAAGGGCAAGAAGCCT GCCCCTCAGGCTGCCGAGCCTAACAACCACACCGAGTACG CCTCCATCCAGACCAGCCCTCAGCCTGCCTCTGAGGACAC CCTGACCTACGCTGATCTGGACATGG TGCACCTGAACCGG ACCCCCAAGCAGCCAGCTCCTAAGCCCGAGCCTAGCTTCT CTGAGTACGCCAGCGTGCAGGTGCCCCGGAAA

- 126 043743- 126 043743

hSIRPa-VaClaC2p (последовательность аминокислот) hSIRPa-VaClaC2p (amino acid sequence) 60 60 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVS RTETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVE HDGQQAVSKSYALEVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIV VGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKN AREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQT SPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQ VPRK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESV SYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVS RTETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVE HDGQQAVSKSYALEVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIV VGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKA QGSTSSTRLHEPEKN AREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQT SPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQ VPRK SIRPaVl(P74A) человека (последовательность нуклеотидов) SIRPaVl(P74A) person (nucleotide sequence) 61 61 ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCCGGCCGCCTCGGGCCGC TGCTCTGCCTGCTGCTCGCCGCGTCCTGCGCCTGGTCAGGA GTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGC GCTGCACTGCGACCTCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCA GTGGTTCAGAGGAGCTGGAGCAGGCCGGGAATTAATCTAC AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTT CAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCG CATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGT TTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAA ACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACG GCTTCTCACCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAA TGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCA AGGTGGTGCTGACCCGCGAGGACGTTCACTCTCAAGTCAT CTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCAC CCACCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCGTGAGGGCAGAGAA CCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGT CCCGGACAGAAACGGCCTCAACCGTTACAGAGAACAAGG ATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGT ATCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTG GAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCATGAC CTGAAGGTCTCAGCCCACCCGAAGGAGCAGGGCTCAAATA CCGCCGCTGAGAACACTGGATCTAATGAACGGAACATCTA ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCCGGCCGCCTCGGGCCGC TGCTCTGCCTGCTGCTCGCCGCGTCCTGCGCCTGGTCAGGA GTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGC GCTGCACTGCGACCTCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCA GTGGTTCAGAGGAGCTGGAGCAGGCCGGGAATTAATCTAC AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTT CAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCG CATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGT TTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAA ACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACG GCTTCCACCCAGAGACATCACCCTGAAATGGTTCAAAAA TGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCA AGGTGGTGCTGACCCGCGAGGACGTTCACTCTCAAGTCAT CTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCT CTT CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCAC CCACCTTGGAGGTTACTCAACAGCCCGTGAGGGCAGAGAA CCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGT CCCGGACAGAAACGGCCTCAACCGTTACAGAGAACAAGG ATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATG T ATCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTG GAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCATGAC CTGAAGGTCTCAGCCCACCCGAAGGAGCAGGGCTCAAATA CCGCCGCTGAGAACACTGGATCTAATGAACGGAACATCTA

- 127 043743- 127 043743

TATTGTGGTGGGTGTGGTGTGCACCTTGCTGGTGGCCCTAC TGATGGCGGCCCTCTACCTCGTCCGAATCAGACAGAAGAA AGCCCAGGGCTCCACTTCTTCTACAAGGTTGCATGAGCCC GAGAAGAATGCCAGAGAAATAACACAGGACACAAATGAT ATCACATATGCAGACCTGAACCTGCCCAAGGGGAAGAAG CCTGCTCCCCAGGCTGCGGAGCCCAACAACCACACGGAGT ATGCCAGCATTCAGACCAGCCCGCAGCCCGCGTCGGAGGA CACCCTCACCTATGCTGACCTGGACATGGTCCACCTCAAC CGGACCCCCAAGCAGCCGGCCCCCAAGCCTGAGCCGTCCT TCTCAGAGTACGCCAGCGTCCAGGTCCCGAGGAAG TATTGTGGTGGGTGTGGTGTGCACCTTGCTGGTGGCCCTAC TGATGGCGGCCCTTACCTCGTCCGAATCAGACAGAAGAA AGCCCAGGGCTCCACTTCTTCTACAAGGTTGCATGAGCCC GAGAAGAATGCCAGAGAAATAACACAGGACACAAATGAT ATCACATATGCAGACCTGAACCTGCCCAAGGGGAAGAAG CCTGCTCCCCAGGCTGCGGAGCCCAACAACCACACGG AGT ATGCCAGCATTCAGACCAGCCCGCAGCCCGCGTCGGAGGA CACCCTCACCTATGCTGACCTGGACATGGTCCACCTCAAC CGGACCCCCAAGCAGCCGGCCCCCAAGCCTGAGCCGTCCT TCTCAGAGTACGCCAGCGTCCAGGTCCCGAGGAAG SIRPaVl(P74A) человека (последовательность аминокислот) SIRPaVl(P74A) person (amino acid sequence) 62 62 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGAGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGAGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESV SYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVV GVVCTLLVALLMAALYLVRIRQ KKAQGSTSSTRLHEPEKNA REITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSP QPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVP RK Константный домен каппа человека (последовательность нуклеотидов) Human kappa constant domain (nucleotide sequence) 63 63 CGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTC CGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTTCTGTCGTGTGC CTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGT GGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGG AATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTC CCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAG AAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGC CTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGT GC CGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTC CGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTTCTGTCGTGTGC CTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGT GGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGG AATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTC CCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGC CGACTACGAG AAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGC CTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGT GC Константный домен каппа человека (белковая последовательность) Constant domain human kappa (protein subsequence) 64 64 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC Константные домены IgG4 человека (включающие S228P) (последовательность нуклеотидов) Human IgG4 constant domains (including S228P) (nucleotide sequence) 65 65 GCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTG CTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCC TCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTGTCCTG GAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTTCCA GCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGT GCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTG CTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCC TCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTGTCCTG GAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTTCCA GCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGT

- 128 043743- 128 043743

CGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCAAGACCTAC ACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTCC TTGCCCAGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCTTCTGTGTTTC TGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCG GACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAG GAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCG TGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAAC AGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGT GCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTG CAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAAAAG ACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAG GTGTACACACTGCCTCCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACC CCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCC TGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCTCGCCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTG ATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCC TGTCCCTGTCTCTGGGAAAA CGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCAAGACCTAC ACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTCC TTGCCCAGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCTTCTGTGTTTC TGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCG GACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGA TGTGTCCCAG GAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCG TGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAAC AGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGT GCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTG CAAGGTGTCCAACAAGGCCTGCCCAGCTCCATCGAAAAG ACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCC CGGGAACCCCAG GTGTACACACTGCCTCCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACC CCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCC TGAGAACAACTACAAGACCACCCCCTGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCTCGCCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTT CTCCTGCAGCGTG ATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCC TGTCCCTGTCTCTGGGAAAA Константные домены IgG4 человека (включающие S228P) (белковая последовательность) Constant domains Human IgG4 (including S228P) (protein sequence) 66 66 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Константные домены IgG2 человека (последовательность нуклеотидов) Human IgG2 constant domains (nucleotide sequence) 67 67 GCTTCTACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTG TAGCAGAAGCACCAGCGAGTCTACAGCCGCTCTGGGCTGT CTGGTCAAGGACTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTG GAATAGCGGAGCACTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCA GCTGTGCTGCAAAGCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGT GGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTGGCACCCAGACCTAC ACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGG ACAAGACCGTGGAACGGAAGTGCTGCGTGGAATGCCCTCC TTGTCCTGCTCCTCCAGTGGCTGGCCCTTCCGTGTTTCTGTT CCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGG ATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGA AGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTT GCTTCTACAAAGGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTG TAGCAGAAGCACCAGCGAGTCTACAGCCGCTCTGGGCTGT CTGGTCAAGGACTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTG GAATAGCGGAGCACTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCA GCTGTGCTGCAAAGCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGT GGTCACAGTGCCCAGCAGCAATTTTG GCACCCAGACCTAC ACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGG ACAAGACCGTGGAACGGAAGTGCTGCGTGGAATGCCCTCC TTGTCCTGCTCCTCCAGTGGCTGGCCCTTCCGTGTTTCTGTT CCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGG ATCCTGAGGTGCAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGA AGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTT

- 129 043743- 129 043743

CAACAGCACCTTCAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTG CATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAG GTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCA TCAGCAAGACCAAAGGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTTTA CACACTTCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCA GGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC GACATCXiCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAG AACAACTACAAGACCACACCTCCTATGCTGGACTCCGACG GCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTC CAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGT CTCTGAGCCCCGGCAAA где: Xi = G, Т CAACAGCACCTTCAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTG CATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAG GTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCA TCAGCAAGACCAAAGGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTTTA CACACTTCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCA GGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCA GC GACATCXiCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAG AACAACTACAAGACCACACCTCCTATGCTGGACTCCGACG GCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTC CAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCAGAAGTCCCTGT CTCTGAGCCCCGGCAAA Where: Xi = G, T Константные домены IgG2 человека (белковая последовательность) Human IgG2 constant domains (protein sequence) 68 68 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIXiVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK где: Xi = A, S ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIXiVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Where: Xi = A, S CDR1 тяжелой цепи 40А (последовательность аминокислот) Heavy chain CDR1 40A (amino acid sequence) 69 69 SYWMH SYWMH CDR2 тяжелой цепи 40А (последовательность аминокислот) CDR2 heavy chain 40A (amino acid sequence) 70 70 AIYPVNNDTTYNQKFKG AIYPVNNDTTYNQKFKG CDR3 тяжелой цепи 40А (последовательность аминокислот) CDR3 heavy chain 40A (amino acid sequence) 71 71 SFYYSLDAAWFVY SFYYSLDAAWFVY CDR1 легкой цепи 40А (последовательность аминокислот) Light chain CDR1 40A (amino acid sequence) 72 72 RASQDIGSRLN RASQDIGSRLN

- 130043743- 130043743

CDR2 легкой цепи 40А (последовательность аминокислот) CDR2 light chain 40A (amino acid sequence) 73 73 ATSSLDS ATSSLDS CDR3 легкой цепи 40А (последовательность аминокислот) CDR3 light chain 40A (amino acid sequence) 74 74 LQYASSPFT LQYASSPFT Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела 40 (консенсусная последовательность) Heavy chain variable region humanized antibody 40 (consensus sequence) 75 75 EVQX1X2QSGAX3X4X5KPGASVKX6SCKASGSTFTSYWMHWV X7QX8PGQGLEWX9GAIYPWSDTTYNQKFKGX10X11TX12TVX 13X14SX15STX16YMX17LSSLX18X19EDX20AWYCX21RSFYYSLD AAWFVYWGQGTX22X23TVSS где: Xi = F, L Х2 = Q, R, V Хз = Е, V Х4 = L, V Х5 = А, К, V Хе = L, Μ, V Х7 = К, R Х8 = A, R, Т Х9 = I, М Хю = К, R Хп = А, V Х12 = L, М Xi3=D, V Х14=К,Т Х15 = A, S, Т Хю = А, V Х17 = Е, Q X18=R,T X19 = F, S Х20 = S, Т Х21 = А, Т Х22 = L, Т Х23 = L, VEVQX1X2QSGAX3X4X5KPGASVKX6SCKASGSTFTSYWMHWV X7QX8PGQGLEWX9GAIYPWSDTTYNQKFKGX10X11TX12TVX 13X14SX15STX16YMX17LSSLX18X19EDX20AWYCX21RSFYYSLD AAWFVYWGQGTX22X23 TVSS where: Xi = F, L X 2 = Q, R, V X3 = E, V X 4 = L, V X 5 = A, K, V Xe = L, Μ, V X 7 = K, R X 8 = A, R, T X 9 = I, M Xu = K, R Xn = A, V X12 = L, M Xi3=D, V X14 = K, T X15 = A, S, T Xi = A , V X17 = E, Q X18=R,T X19 = F, S X20 = S, T X21 = A, T X22 = L, T X23 = L, V Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела 40 (консенсусная последовательность) Light chain variable region humanized antibody 40 (consensus sequence) 76 76 DIQMTQSPSSLSASX1GX2RVX3ITCRASQDIGSRLNWLQQX4P GKAX5KRLIYATSSLDSGVPX6RFSGSX7SGX8X9X10X11LTISX12 LQPEDFATYYCLQYASSPFTFGX13GTKX14EIX15 где: Xi = L, V DIQMTQSPSSLSASX1GX2RVX3ITCRASQDIGSRLNWLQQX4P GKAX5KRLIYATSSLDSGVPX6RFSGSX7SGX8X9X10X11LTISX12 LQPEDFATYYCLQYASSPFTFGX13GTKX14EIX15 Where: Xi = L, V

- 131 043743- 131 043743

Х2 = D, Е Хз = S, Т X. = К, Т х5 = I, р Хе = к, S Х7 = G, R х8 = s, т Х9 = D, Е Xio = F,Y Хп = S, Т Х12 = G, S Х13 = G, Q X14 = L, V Х15 = н, КX 2 = D, E X3 = S, T X. = K, T x 5 = I, p Xe = k, S X 7 = G, R x 8 = s, t X 9 = D, E Xio = F, Y Xn = S, T X12 = G, S X13 = G, Q X14 = L, V X15 = n, K VHl hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VHl hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 77 77 GAGGTGCAGTTCTTGCAGTCTGGTGCCGTGCTGGCTAGAC CTGGAACCTCCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTC CACCTTCACCTCTTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGG CCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGCTCTGTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAG AGCCAAGCTGACCGTGGCCACCTCTGCTTCTATCGCCTACC TGGAATTTTCCAGCCTGACCAACGAGGACTCCGCCGTGTA CTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCTT GGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGTC СТСТ GAGGTGCAGTTCTTGCAGTCTGGTGCCGTGCTGGCTAGAC CTGGAACCTCCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTC CACCTTCACCTCTTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGG CCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGCTCTGTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAG AGCCAAGCTGACCGTGGCCACCTCTGCTTC TATCGCCTACC TGGAATTTTCCAGCCTGACCAACGAGGACTCCGCCGTGTA CTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCTT GGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGTC TTST VHl hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VHl hSIRPa.40A (amino acid sequence) 78 78 EVQFLQSGAVLARPGTSVKISCKASGSTFTSYWMHWVKQRP GQGLEWIGALYPVNSDTTYNQKFKGRAKLTVATSASIAYLEF SSLTNEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSS EVQFLQSGAVLARPGTSVKISCKASGSTFTSYWMHWVKQRP GQGLEWIGALYPVNSDTTYNQKFKGRAKLTVATSASIAYLEF SSLTNEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSS VH2 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VH2 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 79 79 GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCTGAGGTTGTGAAGC CTGGCGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGGCCC CTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCTGCCTCCACCGCCTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCACCCGGTCCTTCTACTACTCCCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACCGTGT ССТСТ GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCTGAGGTTGTGAAGC CTGGCGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGGCCC CTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCTGCCTC CACCGCCTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCACCCGGTCCTTCTACTACTCCCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACCGTGT CCST VH2 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VH2 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 80 80 EVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGSTFTSYWMHWVKQA PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSASTAYM ELSSLRSEDTAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSS EVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGSTFTSYWMHWVKQA PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSASTAYM ELSSLRSEDTAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSS

- 132043743- 132043743

VH3 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VH3 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 81 81 GAGGTGCAGCTGAGACAGTCTGGCGCTGTGCTTGTGAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGACC CCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGCTATCTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCTTAC ATGCAGCTGTCCAGCCTGACCTCTGAGGACTCCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGT ССТСТ GAGGTGCAGCTGAGACAGTCTGGCGCTGTGCTTGTGAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGACC CCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGCTATCTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGC TTAC ATGCAGCTGTCCAGCCTGACCCTCTGAGGACTCCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGT CCST VH3 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VH3 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 82 82 EVQLRQSGAVLVKPGASVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQT PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYM QLSSLTSEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTTLTVSS EVQLRQSGAVLVKPGASVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQT PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYM QLSSLTSEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTTLTVSS VH4 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VH4 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 83 83 GAGGTGCAGTTCGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTC CAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCATGACCGTCGTGACCTCCACCTCCACCGTGTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGT ССТСТ GAGGTGCAGTTCGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTC CAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCATGACCGTCGTGACCTCCACCTCC ACCGTGTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGT CCST VH4 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VH4 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 84 84 EVQFVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSTFTSYWMHWVRQA PGQGLEWMGAIYPVNSDTTYNQKFKGRVTMTVVTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTV SS EVQFVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSTFTSYWMHWVRQA PGQGLEWMGAIYPVNSDTTYNQKFKGRVTMTVVTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTV SS VH5 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VH5 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 85 85 GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGTGCCGTGTTGGCTAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGG CCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGCTATCTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCTTAC ATGCAGCTGTCCAGCCTGACCTTCGAGGACTCCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGT ССТСТ GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGTGCCGTGTTGGCTAAGC CTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGG CCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGCTATCTACCCTG TGAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCTCCACC GCTTAC ATGCAGCTGTCCAGCCTGACCTTCGAGGACTCCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGT CCST VH5 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VH5 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 86 86 EVQLQQSGAVLAKPGASVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQR PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYM QLSSLTFEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAVLAKPGASVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQR PGQGLEWIGAIYPVNSDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYM QLSSLTFEDSAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTTLTVSS

- 133 043743- 133 043743

VH6 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VH6 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 87 87 GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTC CAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCATGACCGTGGACACCTCCACCAGCACCGTGTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGT ССТСТ GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTCC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTC CAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGCTATCTACCCCGT GAACTCCGACACCACCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCATGACCGTGGACACCTCCACCAGCA CCGTGTAC ATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGT ACTACTGCGCCCGGTCCTTCTACTACTCTCTGGACGCCGCT TGGTTTGTGTACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTGT CCST VH6 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VH6 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 88 88 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSTFTSYWMHWVRQA PGQGLEWMGAIYPVNSDTTYNQKFKGRVTMTVDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTV SS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSTFTSYWMHWVRQA PGQGLEWMGAIYPVNSDTTYNQKFKGRVTMTVDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTV SS VL1 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL1 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 89 89 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGACCCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTCTCCCTGACCATCTCTGGACTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCCAC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGACCCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTCTCCCTGACCATCTCTGGACTGCAGCCT GA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCCAC VL1 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL1 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 90 90 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQTPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFSLTISGLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKVEIH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQTPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFSLTISGLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKVEIH VL2 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL2 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 91 91 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCTCCTCTC CATTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTTACCTGACAATCAGCTCCCTGCAGC CTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCTCCTCTC CATTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL2 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL2 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 92 92 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGQGTKVEIK VL3 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL3 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 93 93 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG

- 134 043743- 134 043743

GCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG GCACCGACTTTACCCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG VL3 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL3 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 94 94 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKLEIK VL4 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL4 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 95 95 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCCCTAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTG GCACCGAGTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG A GCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL4 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL4 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 96 96 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK APKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK APKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGGGTKVEIK VL5 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL5 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 97 97 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCAAGAGATTCTCCGGCTCTAGATCC GGCTCCGACTATACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTG AGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCTCCTCT CCATTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTC TGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCAAGAGATTCTCCGGCTCTAGATCC GGCTCCGACTATACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCC TG AGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCTCCTCT CCATTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL5 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL5 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 98 98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGK AIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATY YCLQY AS SPFTFGQGTKVEIK VL6 hSIRPa.40A (последовательность нуклеотидов) VL6 hSIRPa.40A (nucleotide sequence) 99 99 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCTTC CCTGGGCGAGAGAGTGTCCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCTTC CCTGGGCGAGAGAGTGTCCATCACCTGTAGAGCCTCTCAG GACATCGGCTCCAGACTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCCATCAAGAGACTGATCTACGCCACCTCCAGCCT GGATTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTAGATCTG GCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCT GA GGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGTACGCCAGCTCTC CATTCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL6 hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) VL6 hSIRPa.40A (amino acid sequence) 100 100 DIQMTQSPSSLSASLGERVSITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKA IKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQY AS SPFTFGGGTKVEIK DIQMTQSPSSLSSASLGERVSITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKA IKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQY AS SPFTFGGGTKVEIK

- 135 043743- 135 043743

VH мыши hSIRPa. 40A (последовательность нуклеотидов) VH mice hSIRPa. 40A (nucleotide sequence) 101 101 GAGGTTCAGTTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGC CAGGGACTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGGGG CCTGGACAGGGTCTGCAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGT AAATAATGATACTACCTATAATCAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCGAACTCACTGTAGTCACTTCCACCAGCACTGCCTACA TGGAGGTCAGTAGTCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTA TTACTGTACAAGATCGTTCTACTATAGTCTCGACGCGGCCT GGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT GCA GAGGTTCAGTTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGC CAGGGACTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTC CACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGGGG CCTGGACAGGGTCTGCAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGT AAATAATGATACTACCTATAATCAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCGAACTCACTGTAGTCACTTCCACCAGCACTGCC TACA TGGAGGTCAGTAGTCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTA TTACTGTACAAGATCGTTCTACTATAGTCTCGACGCGGCCT GGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT GCA VH мыши hSIRPa. 40A (последовательность аминокислот) VH mice hSIRPa. 40A (amino acid sequence) 102 102 EVQFQQSGTVLARPGTSVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQG PGQGLQWIGAIYPVNNDTTYNQKFKGKAELTVVTSTSTAYM EVSSLTNEDSAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSA EVQFQQSGTVLARPGTSVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQG PGQGLQWIGAIYPVNNDTTYNQKFKGKAELTVVTSTSTAYM EVSSLTNEDSAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSA VL мыши hSIRPa. 40A (последовательность нуклеотидов) hSIRPa mouse VL. 40A (nucleotide sequence) 103 103 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTC TCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAG GACATTGGTAGTAGGTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAG ATGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCACATCCAGTTT AGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCT GGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCGGCCTTGAGTCTGA AGACTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTC CGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTC TCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAG GACATTGGTAGTAGGTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAG ATGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCACATCCAGTTT AGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCT GGGTCAGATTATCTCTCACCATCAGCGGCCTTGA GTCTGA AGACTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTC CGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAC VL мыши hSIRPa.40A (последовательность аминокислот) Mouse VL hSIRPa.40A (amino acid sequence) 104 104 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWLQQEPDGT IKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISGLESEDFVDYY CLQYASSPFTFGGGTKLEIN DIQMTQSPSSLSSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWLQQEPDGT IKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISGLESEDFVDYY CLQYASSPFTFGGGTKLEIN Тяжелая цепь мыши hSIRPa.40A (последовательность аминокислот; константный домен подчеркнут, сигнальный пептид не показан) Mouse heavy chain hSIRPa.40A (amino acid sequence; constant domain underlined, signal peptide not shown) 105 105 EVQFQQSGTVLARPGTSVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQG PGQGLQWIGAIYPVNNDTTYNQKFKGKAELTVVTSTSTAYM EVSSLTNEDSAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSA AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTW EVQFQQSGTVLARPGTSVKMSCKASGSTFTSYWMHWVKQG PGQGLQWIGAIYPVNNDTTYNQKFKGKAELTVVTSTSTAYM EVSSLTNEDSAVYYCTRSFYYSLDAAWFVYWGQGTLVTVSA AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTW NSGSLSSGVHTFPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNV AHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV NSGSLSSGVHTFPAVLOSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNV AHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV LTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVOFSWFVDDVEVHTAOTOPR EEOFNSTFRSVSELPIMHODWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKT LTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVOFSWFVDDVEVHTAOTOPR EEOFNSTFRSVSELPIMHODWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKT ISKTKGRPKAPOVYTIPPPKEOMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT ISKTKGRPKAPOVYTIPPPKEOMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWOWNGOPAENYKNTOPIMDTDGSYFVYSKLNVOKSNWE VEWOWNGOPAENYKNTOPIMDTDGSYFVYSKLNVOKSNWE AGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK AGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK Легкая цепь мыши hSIRPa.40A (последовательность аминокислот; константный домен подчеркнут, Mouse light chain hSIRPa.40A (amino acid sequence; constant domain emphasized, 106 106 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWLQQEPDGT IKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISGLESEDFVDYY CLOYASSPFTFGGGTKLEINRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGAS VVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERONGVLNSWTDODSKDST DIQMTQSPSSLSSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWLQQEPDGT IKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISGLESEDFVDYY CLOYASSPFTFGGGTKLEINRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGAS VVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERONGVLNSWTDODSKDST YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSSTSPIVKSFNRNEC

- 136043743- 136043743

сигнальный пептид не показан) signal peptide not shown) rhSIRPa/Fc (последовательность аминокислот) rhSIRPa/Fc (amino acid sequence) 107 107 (GVAG)EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQ WFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIG NITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAP VVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSD FQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTL QGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRK FYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLL VNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQG SNTAAENTGSNERIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (GVAG)EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQ WFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIG NITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAP VVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSD FQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHS QVICEVAHVTL QGDPLRGTAANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRK FYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLL VNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQG SNTAAENTGSNERIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK rhSIRPy/Fc (последовательность аминокислот) rhSIRPy/Fc (amino acid sequence) 108 108 VLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIR ISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS APVVLGPAARTTPEHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELS DFQTNVDPTGQSVAYSIRSTARVVLDPWDVRSQVICEVAHV TLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTLEVTQQPMRAGNQVNVTCQ VRKFYPQSLQLTWLENGNVCQRETASTLTENKDGTYNWTS WFLVNISDQRDDVVLTCQVKHDGQLAVSKRLALEVTVHQK DQSSDATPGPASIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIR ISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS APVVLGPAARTTPEHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELS DFQTNVDPTGQSVAYSIRSTARVVLDPWDVRSQVICEVAHV TLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTLEVTQ QPMRAGNQVNVTCQ VRKFYPQSLQLTWLENGNVCQRETASTLTENKDGTYNWTS WFLVNISDQRDDVVLTCQVKHDGQLAVSKRLALEVTVHQK DQSSDATPGPASIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK rhCD47/Fc (последовательность аминокислот) rhCD47/Fc (amino acid sequence) 109 109 QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWK FKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMD KSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPIEGRM DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQWTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWK FKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMD KSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPIEGRM DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQWTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK hSIRP-VyC13C23 (последовательность нуклеотидов) hSIRP-VyC13C23 (nucleotide sequence) НО BUT ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGAGGAACTGCAGATGATCCAGCCCGAGAAG ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGAGGAACTGCAGATGATCCAGCCCGAGAAG

- 137 043743- 137 043743

CTGCTGCTCGTGACCGTGGGCAAGACCGCCACCCTGCACT GCACCGTGACATCCCTGCTGCCTGTGGGACCCGTGCTGTG GTTTAGAGGCGTGGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC CAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG ACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCGGAT CTCCAGCATCACCCCTGCCGACGTGGGCACCTACTACTGC GTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGAGAACGTGGAGTTCA AGTCTGGCCCAGGCACCGAGATGGCCCTGGGCGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGTGCGGGCTACCC CTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGTCCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGCCGG CGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGAGTGG TGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCGA GATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAGAGGC ACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCACCC TGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAACCAGG CCAACGTGACCTGTCAGGTGTCCAACTTCTACCCTCGGGG CCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCGG ACCGAGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGACGGC ACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACACCTGTG CCCACAGGGACGACGTGGTGCTGACATGCCAGGTGGAAC ACGATGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCCCTGGA AATCTCCGCCCATCAGAAAGAGCACGGCTCCGATATCACC CACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACCGCTCCTCTGCTGGTGGC TCTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGGCGTG TCCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA CTGCTGCTCGTGACCGTGGGCAAGACCGCCACCCTGCACT GCACCGTGACATCCCTGCTGCCTGTGGGACCCGTGCTGTG GTTTAGAGGCGTGGGCCCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC CAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG ACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCTCCATCCGGAT CTCCAGCATCACCCCTGCCGACGTGGGCACCTACTACT GC GTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGAGAACGTGGAGTTCA AGTCTGGCCCAGGCACCGAGATGGCCCTGGGCGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCCGTGCGGGCTACCC CTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGTCCGACTTCCAGACCAACGTGGA CCCTGCCGG CGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGAGTGG TGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCGA GATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAGAGGC ACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCACCC TGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAACCAGG CCAACGTGACCTGTCAGGTGTCCAACTTC TACCCTCGGGG CCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCCGG ACCGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGACGGC ACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACACCTGTG CCCACAGGGACGACGTGGTGCTGACATGCCAGGTGGAAC ACGATGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCCCTGGA AATCTCCGCCCATCAGAAAGAGCACGGCTCCGATA TCACC CACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACCGCTCCTCTGCTGGTGGC TCTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGGCGTG TCCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA hSIRP-VyC13C23 (последовательность аминокислот) hSIRP-VyC13C23 (amino acid sequence) 111 111 MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEEELQMIQPEKLL LVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKG SPENVEFKSGPGTEMALGAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFT CESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHST ARVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSR TETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEH DGQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALL LGPKLLLVVGVSAIYICWKQKA MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEEELQMIQPEKLL LVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKG SPENVEFKSGPGTEMALGAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFT CESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDP AGDSVSYSIHST ARVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSR TETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEH DGQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALL LGPKLLLVVGVSAIYICWK QKA hSIRP-V3ClyC23 (последовательность нуклеотидов) hSIRP-V3ClyC23 (nucleotide sequence) 112 112 ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGATGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAGAAG TCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGAGAT ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGATGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAGAAG TCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGAGAT

- 138 043743- 138 043743

GCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCATGTG GTTTAGAGGCGCTGGCGCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC CAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG AGCTGACCAAGCGGAACAACCTGGACTTCTCCATCTCCAT CAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTACTGC GTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGTTCA AATCCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCCGTGCGGGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGCTGGGACCTGCCGCTAGAACCACC CCTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTT CAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGC AACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTACCG GCCAGTCCGTGGCCTACTCCATCAGATCCACCGCCAGAGT GGTGCTGGACCCTTGGGATGTGCGGTCCCAAGTGATCTGC GAGGTGGCCCATGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAGAG GCACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCAC CCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAACCA GGCCAACGTGACCTGCCAGGTGTCCAACTTCTACCCTCGG GGCCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCC GGACCGAGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGATG GCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACACCTG TGCCCACCGGGATGACGTGGTGCTGACTTGTCAGGTGGAA CACGACGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCCCTGG AAATCTCCGCCCATCAGAAAGAGCACGGCTCCGATATCAC CCACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACCGCTCCTCTGCTGGTGG CTCTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGGCGT GTCCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA GCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCATGTG GTTTAGAGGCGCTGGCGCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC CAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG AGCTGACCAAGCGGAACAACCTGGACTTCTCCATCTCCAT CAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTGC GTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGTTCA AATCCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCCGTGCGGGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGCTGGGACCTGCCGCTAGAACCACC CCTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTT CAGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGC AACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTACCG GCCAGTCCGTGGCCTACTCCATCAGATCCACCGCCAGAG T GGTGCTGGACCCTTGGGATGTGCGGTCCCAAGTGATCTGC GAGGTGGCCCATGTGACACTGCAGGGCGATCCTCTGAGAG GCACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCAC CCTGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGCCGAGAACCA GGCCAACGTGACCTGCCAGGTGTCCAACTTCTACCCTCGG GGCCTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATG TGTCCC GGACCGAGACAGCCTCCACCCTGATCGAGAACAAGGATG GCACCTACAATTGGATGTCCTGGCTGCTCGTGAACACCTG TGCCCACCGGGATGACGTGGTGCTGACTTGTCAGGTGGAA CACGACGGCCAGCAGGCCGTGTCCAAGTCCTACGCCCTGG AAATCTCCGCCCATCAGAAAGAGCACGGCTCCGATATCAC CCACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACCGCTCCTC TGCTGGTGG CTCTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGGCGT GTCCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA hSIRP-VpClyC2p (последовательность аминокислот) hSIRP-VpClyC2p (amino acid sequence) 113 113 MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVLGPAARTTPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPTGQSVAYSIRSTA RVVLDPWDVRSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSR TETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEH DGQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALL LGPKLLLVVGVSAIYICWKQKA MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVLGPAARTTPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPTGQSVAYSI RSTA RVVLDPWVRSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSEAIRVPPT LEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSR TETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEH DGQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALL LGPKLLLVVGVSAIYICWKQKA hSIRP-VpClpC2y (последовательность нуклеотидов) hSIRP-VpClpC2y (nucleotide sequence) 114 114 ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGATGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAGAAG TCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGAGAT GCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCATGTG ATGCCCGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCAGCCCCTT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGGCTGACAGGCGTG GCAGGCGAAGATGAGCTGCAAGTGATCCAGCCCGAGAAG TCCGTGTCTGTGGCCGCTGGCGAGTCTGCCACCCTGAGAT GCGCTATGACCTCCCTGATCCCCGTGGGCCCCATCATGTG

- 139 043743- 139 043743

GTTTAGAGGCGCTGGCGCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC CAGAAAGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG AGCTGACCAAGCGGAACAACCTGGACTTCTCCATCTCCAT CAGCAACATCACCCCTGCCGACGCCGGCACCTACTACTGC GTGAAGTTCCGGAAGGGCTCCCCCGACGACGTGGAGTTCA AATCCGGCGCTGGAACCGAGCTGTCCGTGCGGGCTAAACC TTCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCTGTGCGCGCTACCC CTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGCCGG CGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGAGTGG TGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGATCTGCGA GATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAGAGGC ACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCACCC TGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGTGGGCAACCAAG TGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGTC CCTGCAGCTGACTTGGAGCGAGAATGGCAACGTGTGCCAG AGAGAGACAGCCTCCACCCTGACCGAGAACAAGGACGGA ACCTACAACTGGACCTCCTGGTTCCTCGTGAACATCTCCGA CCAGCGGGACGACGTGGTGCTGACATGCCAAGTGAAGCA CGATGGACAGCTGGCCGTGTCCAAGCGGCTGGCTCTGGAA GTGACAGTGCACCAGAAAGAGCACGGCTCCGACATCACCC ACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACAGCTCCTCTGCTGGTGGCT CTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGGCGTGT CCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA T TCTGCCCCTGTGGTGTCTGGACCTGCTGTGCGCGCTACCC CTGAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGTCCCACGGCTTC AGCCCTCGGGACATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGCA ACGAGCTGAGCGACTTCCAGACCAACGTGGACCCTGCCGG CGACTCCGTGTCCTACTCCATCCACTCTACCGCCAGAGTGG TGCTGACCAGAGGCGACGTGCACTCCCAAGTGAT CTGCGA GATCGCCCATATCACACTGCAGGGCGACCCCCTGAGAGGC ACCGCCAATCTGTCTGAGGCCATCAGAGTGCCCCCCACCC TGGAAGTGACCCAGCAGCCTATGAGAGTGGGCAACCAAG TGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCCCAGTC CCTGCAGCTGACTTGGAGCGAGAATGGCAACGTGTGCCAG AGAGACAGCCTCCACCCTGACCGAGAACAAGGA CGGA ACCTACAACTGGACCTCCTGGTTCCTCGTGAACATCTCCGA CCAGCGGGACGACGTGGTGCTGACATGCCAAGTGAAGCA CGATGGACAGCTGGCCGTGTCCAAGCGGCTGGCTCTGGAA GTGACAGTGCACCAGAAAGAGCACGGCTCCGACATCACCC ACGAGGCCGCTCTGGCTCCTACAGCTCCTCTGCTGGTGGCT CTGCTGCTGGGACCTAAGCTGCTGCTGGTCGTGGG CGTGT CCGCCATCTACATCTGCTGGAAGCAGAAGGCCTGA hSIRP-V3C13C2y (последовательность аминокислот) hSIRP-V3C13C2y (amino acid sequence) 115 115 MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHSTA RVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTL EVTQQPMRVGNQVNVTCQVRKFYPQSLQLTWSENGNVCQR ETASTLTENKDGTYNWTSWFLVNISDQRDDVVLTCQVKHDG QLAVSKRLALEVTVHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALLLG PKLLLVVGVSAIYICWKQKA MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEDELQVIQPEKSV SVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEG HFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHS TA RVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTL EVTQQPMRVGNQVNVTCQVRKFYPQSLQLTWSENGNVCQR ETASTLTENKDGTYNWTSWFLVNISDQRDDVVLTCQVKHDG QLAVSKRLALEVTVHQKEHGSDITHEAALAPTAPLLVALLLG PKLLLVVGVSAIYICWKQ K.A. 5ΙΡΡβΕ человека (последовательность нуклеотидов) 5ΙΡΡβΕ person (nucleotide sequence) 116 116 ATGCCTGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCTCTCCATT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGACTGACAGGTGTT GCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCTGACAAG AGCATCTCTGTGGCCGCTGGCGAATCTGCCACACTGCACT GTACCGTGACATCTCTGATCCCTGTGGGCCCCATCCAGTG GTTTAGAGGTGCTGGACCTGGCAGAGAGCTGATCTACAAC ATGCCTGTGCCTGCCTCTTGGCCTCATCTGCCCTCTCCATT TCTGCTGATGACCCTGCTGCTGGGCAGACTGACAGGTGTT GCTGGCGAAGAGGAACTGCAAGTGATCCAGCCTGACAAG AGCATCTCTGTGGCCGCTGGCGAATCTGCCACACTGCACT GTACCGTGACATCTCTGATCCCTGTGGGCCCCATCCAGTG GTTTAGAGGTGCTGGACCTGGCAGAGAGCTGATCTACA A.C.

- 140 043743- 140 043743

CAGAAAGAGGGACACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG ACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCAGCATCCGGAT CAGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTACTGC GTGAAGTTCAGAAAGGGCAGCCCCGACCACGTCGAGTTTA AAAGCGGAGCCGGCACAGAGCTGAGCGTGCGGGCTAAAC CTTCTGCTCCTGTGGTGTCTGGACCAGCCGCTAGAGCTACA CCTCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGAGCCACGGCTT CAGCCCCAGAGATATCACCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGC AACGAGCTGTCCGACTTCCAGACCAATGTGGACCCAGCCG GCGATAGCGTGTCCTACAGCATTCACAGCACCGCCAAGGT GGTGCTGACCCGGGAAGATGTGCACAGCCAAGTGATTTGC GAGGTGGCCCACGTTACCCTGCAAGGCGATCCTCTGAGAG GAACCGCCAACCTGAGCGAGACAATCCGGGTGCCACCTAC ACTGGAAGTGACCCAGCAGCCTGTGCGGGCCGAGAATCA AGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCTCAG AGACTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCC GGACCGAGACAGCCAGCACACTGACCGAGAACAAGGATG GCACCTACAATTGGATGAGCTGGCTGCTGGTCAATGTGTC TGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAA CACGATGGCCAGCCTGCCGTGTCTAAGAGCCACGACCTGA AGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCAGCAATACTGC CCCTGGACCTGCTCTTGCTTCTGCCGCTCCTCTGCTGATCG CCTTTCTGCTGGGACCTAAGGTGCTGCTGGTTGTGGGAGT GTCCGTGATCTACGTGTACTGGAAGCAGAAGGCC CAGAAAGAGGGACACTTCCCCAGAGTGACCACCGTGTCCG ACCTGACCAAGCGGAACAACATGGACTTCAGCATCCGGAT CAGCAACATCACCCCTGCCGATGCCGGCACCTACTGC GTGAAGTTCAGAAAGGGCAGCCCCGACCACGTCGAGTTTA AAAGCGGAGCCGGCACAGAGCTGAGCGTGCGGGCTAAAC CTTCTGCTCCTGTGGTGTCTGGACCAGCCGCTAGAGCTACA CC TCAGCACACCGTGTCTTTTACCTGCGAGAGCCACGGCTT CAGCCCCAGAGATTCACCCCTGAAGTGGTTCAAGAACGGC AACGAGCTGTCCGACTTCCAGACCAATGTGGACCCAGCCG GCGATAGCGTGTCCTACAGCATTCACAGCACCGCCAAGGT GGTGCTGACCCGGGAAGATGTGCACAGCCAAGTGATTTGC GAGGTGGCCCACGTTACCCTGCAAGGCGATCCTCTGA GAG GAACCGCCAACCTGAGCGAGACAATCCGGGTGCCACCTAC ACTGGAAGTGACCCAGCAGCCTGTGCGGGCCGAGAATCA AGTGAACGTGACCTGCCAAGTGCGGAAGTTCTACCCTCAG AGACTGCAGCTGACCTGGCTGGAAAACGGCAATGTGTCCC GGACCGAGACAGCCAGCACACTGACCGAGAACAAGGATG GCACCTACAATTGGATGAGCTGGCTGCTGGTCAATG TGTC TGCCCACCGGGACGATGTGAAGCTGACATGCCAGGTGGAA CACGATGGCCAGCCTGCCGTGTCTAAGAGCCACGACCTGA AGGTGTCCGCTCATCCCAAAGAGCAGGGCAGCAATACTGC CCCTGGACCTGCTCTTGCTTCTGCCGCTCCTCTGCTGATCG CCTTTCTGCTGGGACCTAAGGTGCTGCTGGTTGTGGGAGT GTCCGTGATCTACGTGTACTGGAAGCAGAA GGCC SIRP3L человека (последовательность аминокислот) Human SIRP3L (amino acid sequence) 117 117 MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEEELQVIQPDKSIS VAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGH FPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DHVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHSTA KVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPT LEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRT ETASTLTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHD GQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAPGPALASAAPLLIAFLL GPKVLLVVGVSVIYVYWKQKA MPVPASWPHLPSPFLLMTLLLGRLTGVAGEEELQVIQPDKSIS VAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGH FPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSP DHVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCE SHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSV SYSIHSTA KVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPT LEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRT ETASTLTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHD GQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAPGPALASAAPLLIAFLL GPKVLLVVGVSVIYV YWKQKA Константные домены IgGl человека (последовательность нуклеотидов) Human IgGl constant domains (nucleotide sequence) 118 118 GCCAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCT CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GCCAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCT CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT

- 141 043743- 141 043743

GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG TCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA Константные домены IgGl человека (последовательность аминокислот) Human IgGl constant domains (amino acid sequence) 119 119 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Константные домены IgGl мыши (последовательность аминокислот) Mouse IgGl constant domains (amino acid sequence) 120 120 AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWN SGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVA HPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSV FIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVE VHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVN NKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCL VVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKL NMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWN SGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVA HPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSV FIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVE VHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQD WMSGKEFKCKVN NKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCL VVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKL NMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK Константный домен каппа мыши (последовательность аминокислот) Constant domain mouse kappa (amino acid sequence) 121 121 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNS YTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNS YTCEATHKTSTSSPIVKSFNRNEC Константные домены IgG2 человека, мутант V234A-G237A-P238S- Human IgG2 constant domains, mutant V234A-G237A-P238S- 122 122 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK

- 142 043743- 142 043743

H268A-V309L-A330S- P331S (Sigma) (последовательность аминокислот) H268A-V309L-A330S- P331S (Sigma) (amino acid sequence) DTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIXiVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK где: Xi = A, S DTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIXiVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Where: Xi = A, S Константные домены IgGl человека, мутант L234A-L235A (последовательность аминокислот) Human IgGl constant domains, mutant L234A-L235A (amino acid sequence) 123 123 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Константные домены IgGl человека, мутант L234A-L235A-P329G (последовательность нуклеотидов) Human IgGl constant domains, mutant L234A-L235A-P329G (nucleotide sequence) 124 124 GCTAGCACAAAGGGCCCTAGTGTGTTTCCTCTGGCTCCCTC TTCCAAATCCACTTCTGGTGGCACTGCTGCTCTGGGATGCC TGGTGAAGGATTACTTTCCTGAACCTGTGACTGTCTCATGG AACTCTGGTGCTCTGACTTCTGGTGTCCACACTTTCCCTGC TGTGCTGCAGTCTAGTGGACTGTACTCTCTGTCATCTGTGG TCACTGTGCCCTCTTCATCTCTGGGAACCCAGACCTACATT TGTAATGTGAACCACAAACCATCCAACACTAAAGTGGACA AAAAAGTGGAACCCAAATCCTGTGACAAAACCCACACCTG CCCACCTTGTCCGGCGCCTGAAGCGGCGGGAGGACCTTCT GTGTTTCTGTTCCCCCCCAAACCAAAGGATACCCTGATGAT CTCGCGAACCCCTGAGGTGACATGTGTGGTGGTGGATGTG TCTCATGAGGACCCCGAAGTCAAATTTAATTGGTATGTCG ACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAAACCAAGCCTAGAG AGGAACAGTACAATTCAACCTACAGAGTCGTCAGTGTGCT GACTGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAATAC AAGTGTAAAGTCTCAAACAAGGCCCTGGGAGCTCCAATTG AGAAAACAATCTCAAAGGCCAAAGGACAGCCTAGGGAAC CCCAGGTCTACACCCTGCCACCTTCGAGAGACGAACTGAC CAAAAACCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTC TACCCTTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGTCAAATGGAC AGCCTGAGAACAACTACAAAACAACCCCCCCTGTGCTGGA TTCTGATGGCTCTTTCTTTCTGTACTCCAAACTGACTGTGG ACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTC TGTCATGCATGAGGCTCTGCATAACCACTACACTCAGAAA TCCCTGTCTCTGTCTCCCGGGAAA GCTAGCACAAAGGGCCCTAGTGTGTTTCCTCTGGCTCCCTC TTCCAAATCCACTTCTGGTGGCACTGCTGCTCTGGGATGCC TGGTGAAGGATTACTTTCCTGAACCTGTGACTGTCTCATGG AACTCTGGTGCTCTGACTTCTGGTGTCCACACTTTCCCTGC TGTGCTGCAGTCTAGTGGACTGTACTCTCTGTCATCTGTGG TCACTGTGCCCTCTTCATCTCTGG GAACCCAGACCTACATT TGTAATGTGAACCACAAACCATCCAACACTAAAGTGGACA AAAAAGTGGAACCCAAATCCTGTGACAAAACCCACACCTG CCCACCTTGTCCGGCGCCTGAAGCGGCGGGAGGACCTTCT GTGTTTCTGTTCCCCCCCAAACCAAAGGATACCCTGATGAT CTCGCGAACCCCTGAGGTGACATGTGTGGTGGTGGATGTG TCTCATGAGGACCCCGAAG TCAAATTTAATTGGTATGTCG ACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAAACCAAGCCTAGAG AGGAACAGTACAATTCAACCTACAGAGTCGTCAGTGTGCT GACTGTGCTGCATCAGGATGGCTGAATGGCAAGGAATAC AAGTGTAAAGTCTCAAACAAGGCCCTGGGAGCTCCAATTG AGAAAACAATCTCAAAGGCCAAAGGACAGCCTAGGGAAC CCCAGGTCTACACCCTGCCA CCTTCGAGAGACGAACTGAC CAAAAACCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTC TACCCTTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGTCAAATGGAC AGCCTGAGAACAACTACAAAACAACCCCCCCTGTGCTGGA TTCTGATGGCTCTTTCTTTCTGTACTCCAAACTGACTGTGG ACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTTCTTGCTC TGTCATGCATGAGGCT CTGCATAACCACTACACTCAGAAA TCCCTGTCTCTGTCTCCCGGGAAA

- 143 043743- 143 043743

Константные домены IgGl человека, мутант L234A-L235A-P329G (последовательность аминокислот) Human IgGl constant domains, mutant L234A-L235A-P329G (amino acid sequence) 125 125 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Константные домены IgGl человека, мутант N297Q (последовательность аминокислот) Human IgGl constant domains, mutant N297Q (amino acid sequence) 126 126 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYQSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Константные домены IgG4 человека, мутант S228P-N297Q (последовательность аминокислот) Human IgG4 constant domains, mutant S228P-N297Q (amino acid sequence) 127 127 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFQSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK VH 18D5 (последовательность аминокислот) VH 18D5 (amino acid sequence) 128 128 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWVHWVKQR PIQGLEWIGNIDPSDSDTHYNQKFKDKASLTVDKSSSTAYMQ LSSLTFEDSAVYYCVRGGTGTMAWFAYWGQGTLVTVSA QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWVHWVKQR PIQGLEWIGNIDPSDSDTHYNQKFKDKASLTVDKSSSTAYMQ LSSLTFEDSAVYYCVRGGTGTMAWFAYWGQGTLVTVSA VL 18D5 (последовательность аминокислот) VL 18D5 (amino acid sequence) 129 129 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSYGNTYLYWYL QKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDLGVYFCFQGTHVPYTFGSGTKLEIK DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSYGNTYLYWYL QKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDLGVYFCFQGTHVPYTFGSGTKLEIK VH KWAR23 (последовательность аминокислот) VH KWAR23 (amino acid sequence) 130 130 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVQQRT EQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQDKATITADTSSNTAYLHL SSLTSEDTAVYYCARWGAYWGQGTLVTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVQQRT EQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQDKATITADTSSNTAYLHL SSLTSEDTAVYYCARWGAYWGQGTLVTVSS VL KWAR23 (последовательность аминокислот) VL KWAR23 (amino acid sequence) 131 131 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGS SPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAS YFCHQWS SYPRTFGAGTKLELK QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGS SPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAS YFCHQWS SYPRTFGAGTKLELK rhSIRPa-HIS (последовательность аминокислот) rhSIRPa-HIS (amino acid sequence) 132 132 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHS MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKS VLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKE GHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRK GSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSF TCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESV SYSIHS TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERHHHH НН TAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVP PTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVS RTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVE HDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERHHHH NN

Все противопоставленные материалы, цитированные в данном изобретении, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, запись в базе данных (например, последовательности Genbank или записи GeneID), заявка на патент или патент были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки. Заявители подразумевают, что данное положение о включении посредством ссылки, в соответствии со Сводом федеральных нормативных документов, раздел 37, § 1.57(b)(1), относится ко всем без исключения отдельным публикациям, записям в базе данных (например, последовательностям Genbank или записям GeneID), заявкам на патент или патентам, каждыйAll contrary materials cited herein are incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, database entry (e.g., Genbank sequences or GeneID entries), patent application, or patent were specifically and separately identified as being included via link. Applicants intend that this incorporation by reference provision, in accordance with 37 CFR § 1.57(b)(1), applies to any and all individual publications, database records (e.g., Genbank sequences or records GeneID), patent applications or patents, each

- 144 -- 144 -

Claims (22)

из которых явно идентифицирован в соответствии со Сводом федеральных нормативных документов, раздел 37, §1.57(b)(2), даже если такое цитирование не расположено в непосредственной близости от специально предназначенного для этого положения о включении посредством ссылки. Включение специально предназначенных положений о включении посредством ссылки, если они есть, в настоящее описание никоим образом не ослабляет данное основное положение о включении посредством ссылки. Не предполагается, что цитирование противопоставленных материалов в данном изобретении является допущением, что данный противопоставленный материал принадлежит к известному уровню техники, оно также не является каким-либо допущением в отношении содержимого или даты данных публикаций или документов. В тех случаях, когда в противопоставленных материалах приведено определение заявленного термина, которое противоречит определениям, предложенным в настоящем описании, для понимания заявленного изобретения следует использовать определения, предложенные в настоящем описании.of which is expressly identified pursuant to 37 CFR §1.57(b)(2), even if such citation is not located in close proximity to a specifically intended incorporation by reference provision. The inclusion of express incorporation provisions, if any, in this specification does not in any way impair this general incorporation provision. The citation of referenced material in this invention is not intended to constitute an assumption that the referenced material is prior art, nor is it any assumption as to the contents or date of those publications or documents. In cases where the opposing materials provide a definition of a claimed term that conflicts with the definitions proposed in this description, the definitions proposed in this description should be used to understand the claimed invention. Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами реализации, описанными в данном изобретении. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, дополнительно к описанным в данном изобретении, станут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания и сопроводительных фигур. Предполагают, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.The present invention is not intended to be limited in scope to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention, in addition to those described herein, will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying figures. Such modifications are intended to be within the scope of the appended claims. Полагают, что предшествующей текстовой части описания изобретения будет достаточно, чтобы позволить специалисту в данной области осуществить настоящее изобретение. Различные модификации настоящего изобретения дополнительно к тем, которые показаны и описаны в данном изобретении, станут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания, и они входят в объем прилагаемой формулы изобретения.It is believed that the foregoing textual portion of the description of the invention will be sufficient to enable one skilled in the art to practice the present invention. Various modifications of the present invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and are intended to be included within the scope of the appended claims. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются c SIRPa человека, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность тяжелой цепи, содержащую HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 69; HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 70; и HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 71; и последовательность легкой цепи, содержащую LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 72; LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 73; и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 74.1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to human SIRPa, wherein said antibody or antigen-binding fragment comprises a heavy chain sequence comprising HCDR1 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 69; HCDR2 with amino acid sequence SEQ ID NO: 70; and HCDR3 with amino acid sequence SEQ ID NO: 71; and a light chain sequence containing LCDR1 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 72; LCDR2 with amino acid sequence SEQ ID NO: 73; and LCDR3 with amino acid sequence SEQ ID NO: 74. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанные антитело или его фрагмент имеют следующие характеристики:2. An antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where said antibody or fragment thereof has the following characteristics: связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV1 человека, с ЕС50 менее 10 нМ, предпочтительно менее 5 нМ, более предпочтительно менее 1,5 нМ, еще более предпочтительно менее 1,0 нМ, еще более предпочтительно менее 0,5 нМ и наиболее предпочтительно приблизительно 0,3 нМ или менее;bind to a cell expressing the human SIRPaV1 protein with an EC 50 of less than 10 nM, preferably less than 5 nM, more preferably less than 1.5 nM, even more preferably less than 1.0 nM, even more preferably less than 0.5 nM, and most preferably about 0.3 nM or less; связываются с клеткой, экспрессирующей белок SIRPaV2 человека, с ЕС50 менее 10 нМ, предпочтительно менее 5 нМ, более предпочтительно менее 1,5 нМ, еще более предпочтительно менее 1,0 нМ, еще более предпочтительно менее 0,5 нМ и наиболее предпочтительно приблизительно 0,3 нМ или менее;bind to a cell expressing human SIRPaV2 protein with an EC 50 of less than 10 nM, preferably less than 5 nM, more preferably less than 1.5 nM, even more preferably less than 1.0 nM, even more preferably less than 0.5 nM, and most preferably about 0.3 nM or less; не характеризуются детектируемым связыванием с белком SIRPe1 при концентрации антитела 50 нМ, предпочтительно 67 нМ и более предпочтительно 100 нМ; или, альтернативно, в концентрации, которая в 10 раз больше, предпочтительно в 50 раз, более предпочтительно в 100 раз и еще более предпочтительно в 200 раз больше, чем ЕС50 антитела против SIRPaV1 или SIRPaV2;are not characterized by detectable binding to the SIRPe1 protein at an antibody concentration of 50 nM, preferably 67 nM and more preferably 100 nM; or, alternatively, at a concentration that is 10 times greater, preferably 50 times greater, more preferably 100 times greater, and even more preferably 200 times greater than the EC 50 of the anti-SIRPaV1 or SIRPaV2 antibody; ингибируют связывание между SIRPa человека и CD47 с IC50 менее 10,0 нМ, более предпочтительно менее 5,0 нМ, еще более предпочтительно менее 2,5 нМ и наиболее предпочтительно приблизительно 1,0 нМ или менее; и показывает балл человечности Т20 по меньшей мере 79, и более предпочтительно 85.inhibit binding between human SIRPa and CD47 with an IC 50 of less than 10.0 nM, more preferably less than 5.0 nM, even more preferably less than 2.5 nM, and most preferably about 1.0 nM or less; and shows a T20 humanity score of at least 79, and more preferably 85. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат одну из следующих комбинаций последовательности вариабельной области тяжелой цепи/последовательности вариабельной области легкой цепи:3. An antibody or antigen-binding fragment according to claim 1 or 2, wherein said antibody or antigen-binding fragment comprises one of the following combinations of a heavy chain variable region sequence/light chain variable region sequence: SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 92,SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 96.SEQ ID NO: 80/SEQ ID NO: 96. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-3, где указанное антитело представляет собой интактный IgG.4. An antibody or antigen-binding fragment according to one of claims 1 to 3, wherein said antibody is an intact IgG. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-4, где указанное антитело содержит Fc-область дикого типа IgG2 или мутированную Fc-область IgG2, или где указанное антитело содержит мутированную Fc-область IgG1, или где указанное антитело содержит мутированную Fcобласть IgG4.5. An antibody or antigen-binding fragment according to one of claims 1 to 4, wherein said antibody contains a wild-type IgG2 Fc region or a mutated IgG2 Fc region, or wherein said antibody contains a mutated IgG1 Fc region, or wherein said antibody contains a mutated Fc region IgG4. 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где указанные антитело или 6. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 5, wherein said antibody or - 145 043743 антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.- 145 043743 antigen-binding fragment humanized. 7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, которое представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, где каждая вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 80, и каждая вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 90, или где каждая вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 80, и каждая вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 92, или где каждая вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 80, и каждая вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 96.7. The antibody or antigen binding fragment according to any one of claims 1 to 6, which is a humanized antibody that contains two heavy chains and two light chains, wherein each heavy chain variable region contains SEQ ID NO: 80, and each light chain variable region contains SEQ ID NO: 90, or where each heavy chain variable region contains SEQ ID NO: 80, and each light chain variable region contains SEQ ID NO: 92, or where each heavy chain variable region contains SEQ ID NO: 80, and each the light chain variable region contains SEQ ID NO: 96. 8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, которые содержат паттерн гликозилирования, характерный для экспрессии клеткой млекопитающего, и, необязательно, гликозилирование в результате экспрессии в клетке СНО.8. An antibody or antigen binding fragment according to any one of claims 1 to 7, which comprises a glycosylation pattern characteristic of expression by a mammalian cell, and optionally glycosylation resulting from expression in a CHO cell. 9. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из антител или любой из антигенсвязывающих фрагментов по пп.1-8.9. An isolated nucleic acid encoding any of the antibodies or any of the antigen-binding fragments according to claims 1-8. 10. Выделенная нуклеиновая кислота по п.9, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 79, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи; и по меньшей мере одну из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 89, кодирующей вариабельную область легкой цепи, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 91, кодирующей вариабельную область легкой цепи, или последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 95, кодирующей вариабельную область легкой цепи.10. The isolated nucleic acid according to claim 9, comprising the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 79 encoding the heavy chain variable region; and at least one of a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 89 encoding a light chain variable region, a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 91 encoding a light chain variable region, or a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 95 encoding a light chain variable region chains. 11. Вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.9 или 10.11. An expression vector containing the isolated nucleic acid according to claim 9 or 10. 12. Вектор экспрессии по п.11, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую как последовательность тяжелой цепи, так и последовательность легкой цепи антитела против SIRPa, при этом указанный вектор экспрессии содержит следующие последовательность первой нуклеиновой кислоты/последовательность второй нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из:12. The expression vector according to claim 11, containing a nucleic acid sequence encoding both a heavy chain sequence and a light chain sequence of an anti-SIRPa antibody, wherein said expression vector contains the following first nucleic acid sequence/second nucleic acid sequence selected from the group, consisting of: SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 89,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 95.SEQ ID NO: 79/SEQ ID NO: 95. 13. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.11 или 12 для экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8.13. A host cell containing an expression vector according to claim 11 or 12 for expressing an antibody or antigen binding fragment according to any one of claims 1 to 8. 14. Клетка-хозяин по п.13, которая продуцирует полноразмерное антитело против SIRPa.14. The host cell of claim 13, which produces a full-length anti-SIRPa antibody. 15. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, клетку человека, клетку млекопитающего, клетку Pichia, клетку растения, клетку HEK293 или клетку яичников китайского хомяка (СНО).15. The host cell according to claim 14, wherein said host cell is a bacterial cell, a human cell, a mammalian cell, a Pichia cell, a plant cell, a HEK293 cell, or a Chinese hamster ovary (CHO) cell. 16. Композиция для лечения состояния, характеризующегося передачей сигналов SIRPa/CD47, у субъекта, нуждающегося в этом, путем блокирования передачи сигналов hSIRPa/hCD47, содержащая в эффективном количестве антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.16. A composition for treating a condition characterized by SIRPa/CD47 signaling in a subject in need thereof by blocking hSIRPa/hCD47 signaling, comprising an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 8 and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. 17. Композиция по п.16, где указанное состояние представляет собой рак или инфекцию.17. The composition of claim 16, wherein said condition is cancer or infection. 18. Способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и легкую цепь любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов по пп.1-8, в условиях, благоприятных для экспрессии указанного полинуклеотида.18. A method for producing an antibody or antigen-binding fragment, comprising culturing a host cell containing a polynucleotide encoding the heavy chain and the light chain of any of the antibodies or antigen-binding fragments according to claims 1 to 8, under conditions favorable for the expression of the specified polynucleotide. 19. Способ по п.18, дополнительно включающий выделение антитела или антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина и/или культуральной среды.19. The method of claim 18, further comprising isolating the antibody or antigen-binding fragment from the host cell and/or culture medium. 20. Способ обнаружения присутствия пептида SIRPa или его фрагмента в образце, включающий приведение в контакт указанного образца с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-8 и обнаружение присутствия комплекса между указанным антителом или фрагментом и пептидом, где обнаружение указанного комплекса указывает на присутствие пептида SIRPa.20. A method for detecting the presence of a SIRPa peptide or fragment thereof in a sample, comprising contacting said sample with an antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 8 and detecting the presence of a complex between said antibody or fragment and the peptide, where detection of said complex indicates presence of the SIRPa peptide. 21. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для лечения состояния, характеризующегося передачей сигналов SIRPa/CD47, у нуждающегося в этом субъекта путем блокирования передачи сигналов hSIRPa/hCD47.21. Use of an antibody or antigen binding fragment according to any one of claims 1 to 8 for treating a condition characterized by SIRPa/CD47 signaling in a subject in need thereof by blocking hSIRPa/hCD47 signaling. 22. Применение по п.21, где указанное состояние представляет собой рак или инфекцию.22. Use according to claim 21, wherein said condition is cancer or infection. - 146 -- 146 -
EA201991851 2017-04-13 2018-04-13 AN ANTIBODY OR ANTIGENE-BINDING FRAGMENT THAT BINDS TO HUMAN SIRPα EA043743B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL2018708 2017-04-13
NL2019166 2017-07-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043743B1 true EA043743B1 (en) 2023-06-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220135677A1 (en) Anti-sirp alpha antibodies
JP7379345B2 (en) Anti-PD-1/LAG3 bispecific antibody
JP7002588B2 (en) Anti-CD27 antibody
EP2970475A1 (en) Treatment and prevention of acute kidney injury using anti-alpha v beta 5 antibodies
US20220251194A1 (en) Anti-pd-1/lag3/tigit trispecific antibodies and anti-pd-1/lag3 bicpecific antibodies
US20210032342A1 (en) Anti-pd-1 antibodies
US20230183354A1 (en) Anti-cd103 antibodies
NL2018708B1 (en) ANTI-SIRPα ANTIBODIES
EA043743B1 (en) AN ANTIBODY OR ANTIGENE-BINDING FRAGMENT THAT BINDS TO HUMAN SIRPα
CN110650976B (en) Anti-SIRP alpha antibodies
RU2788095C2 (en) Anti-pd-1 antibodies