EA043507B1 - METHOD FOR INDUCING ANTIGEN ASSOCIATED IMMUNE RESPONSE - Google Patents
METHOD FOR INDUCING ANTIGEN ASSOCIATED IMMUNE RESPONSE Download PDFInfo
- Publication number
- EA043507B1 EA043507B1 EA202000151 EA043507B1 EA 043507 B1 EA043507 B1 EA 043507B1 EA 202000151 EA202000151 EA 202000151 EA 043507 B1 EA043507 B1 EA 043507B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mononuclear cells
- cells
- minus
- phase
- apoptosis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 12
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 6
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 2
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 206010023439 Kidney transplant rejection Diseases 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000011869 Shapiro-Wilk test Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для профилактики и лечения реакции трансплантат против хозяина, отторжения при трансплантации аллогенных органов, кожных Т-клеточных лимфом, а также ряда аутоиммунных заболеваний.The invention relates to the field of medicine and can be used for the prevention and treatment of graft-versus-host disease, rejection during allogeneic organ transplantation, cutaneous T-cell lymphomas, as well as a number of autoimmune diseases.
Одним из применяемых в настоящее время способов борьбы с вышеперечисленными заболеваниями является экстракорпоральный фотоферез (фотоферез, ЭКФ) - введение в организм реципиента особым образом обработанных мононуклеарных клеток.One of the currently used methods of combating the above diseases is extracorporeal photopheresis (photopheresis, ECP) - the introduction of specially treated mononuclear cells into the recipient's body.
Механизм действия этого метода до конца не изучен, однако установлено, что ЭКФ инициирует апоптоз мононуклеаров, завершающийся в кровеносной системе реципиента и предположительно вызывающий иммунный ответ на аутореактивные патогенные лимфоциты.The mechanism of action of this method has not been fully studied, but it has been established that ECP initiates apoptosis of mononuclear cells, which ends in the recipient’s circulatory system and presumably induces an immune response to autoreactive pathogenic lymphocytes.
Известен способ профилактики и лечения отторжения почечного трансплантата, включающий проведение экстракорпорального фотофереза путем введения после операции фотосенсибилизатора, выделение концентрата мононуклеарных клеток, разведение его физраствором с последующим ультрафиолетовым облучением полученной суспензии, возвращение ее в кровеносное русло, отличающийся тем, что первый сеанс фотофереза проводят на 3-4 сутки после трансплантации почки, при этом дополнительно сразу после ультрафиолетового облучения проводят замещение физраствора плазмой крови в том же объеме, а затем осуществляют введение в смесь цитокина - гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора в дозе 80-120 нг/мл, затем осуществляют инкубацию полученного состава в течение 90-120 мин, замещают плазму с цитокином физраствором в том же объеме с последующим возвращением полученной суспензии в кровеносное русло, на курс 15 сеансов, причем в первые две недели проводят два сеанса в неделю, последующие шесть недель по одному сеансу в неделю, в течение третьего месяца два сеанса, четвертый, пятый и шестой месяц - по одному сеансу в месяц (патент РФ 2508924).There is a known method for the prevention and treatment of kidney transplant rejection, which includes carrying out extracorporeal photopheresis by introducing a photosensitizer after surgery, isolating a concentrate of mononuclear cells, diluting it with saline, followed by ultraviolet irradiation of the resulting suspension, returning it to the bloodstream, characterized in that the first session of photopheresis is carried out at 3 -4 days after kidney transplantation, in addition, immediately after ultraviolet irradiation, the saline solution is replaced with blood plasma in the same volume, and then the cytokine - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is introduced into the mixture at a dose of 80-120 ng/ml, then the resulting mixture is incubated composition for 90-120 minutes, replace plasma with cytokine with saline solution in the same volume, followed by returning the resulting suspension to the bloodstream, for a course of 15 sessions, with two sessions per week in the first two weeks, one session per week for the next six weeks , during the third month there are two sessions, the fourth, fifth and sixth months - one session per month (RF patent 2508924).
Недостатком известного решения является невозможность длительного хранения и транспортировки полученных мононуклеаров и ограниченная доступность экстракорпорального фотофереза в региональных центрах.The disadvantage of the known solution is the impossibility of long-term storage and transportation of the obtained mononuclear cells and the limited availability of extracorporeal photopheresis in regional centers.
Апоптоз - процесс программируемой, индуцируемой самими клетками гибели, который в отличие от некроза является физиологическим процессом утилизации дефектных клеток. Он подразделяется на ранний и поздний. При раннем апоптозе целостность поверхностной мембраны не нарушена, а при позднем - начинается фрагментация поверхностной мембраны. Именно клетки, находящиеся в поздней стадии апоптоза, индуцируют созревание дендритных клеток, превращая их в активные АПК, взаимодействие Т-клеток с которыми приводит к активации Т-регуляторных лимфоцитов.Apoptosis is a process of programmed, cell-induced death, which, unlike necrosis, is a physiological process of disposal of defective cells. It is divided into early and late. With early apoptosis, the integrity of the surface membrane is not impaired, but with late apoptosis, fragmentation of the surface membrane begins. It is the cells that are in the late stage of apoptosis that induce the maturation of dendritic cells, turning them into active APCs, the interaction of T cells with which leads to the activation of T regulatory lymphocytes.
Таким образом, для успешного проведения профилактики и лечения, мононуклеарные клетки должны попадать в кровеносную систему реципиента ещё живыми и начинать апоптоз уже в ней.Thus, for successful prevention and treatment, mononuclear cells must enter the recipient’s circulatory system while still alive and begin apoptosis already there.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа получения мононуклеаров, который бы обеспечивал их долгое хранение, а так же возможность задержки мононуклеаров в состоянии раннего апоптоза для профилактики и лечения ряда иммунных реакций, а именно - реакции трансплантат против хозяина, отторжения при трансплантации аллогенных органов, кожных Т-клеточных лимфом, а также ряда аутоиммунных заболеваний путем введения предварительно криоконсервированных мононуклеаров, без дополнительной обработки.The problem to be solved by the claimed invention is the development of a method for producing mononuclear cells that would ensure their long-term storage, as well as the possibility of delaying mononuclear cells in a state of early apoptosis for the prevention and treatment of a number of immune reactions, namely graft-versus-host disease, rejection during transplantation of allogeneic organs, cutaneous T-cell lymphomas, as well as a number of autoimmune diseases by introducing previously cryopreserved mononuclear cells, without additional processing.
Поставленная задача решается путём получения криоконсервированных мононуклеарных клеток методом, включающим выделение концентрата мононуклеарных клеток и их программное замораживание до -70°C со следующей за этим криоконсервацией в жидком азоте и с последующим размораживанием и введением реципиенту.This problem is solved by obtaining cryopreserved mononuclear cells by a method that includes isolating a concentrate of mononuclear cells and their program freezing to -70°C, followed by cryopreservation in liquid nitrogen and subsequent thawing and administration to the recipient.
Термин программное замораживание подразумевает, что замораживание имеет, как правило, три фазы, характеризующиеся разной скоростью заморозки. Первая фаза - охлаждение мононуклеаров до температуры начала их кристаллизации (1-4°C ниже нуля) характеризуется предпочтительно быстрым кратковременным снижением температуры. Вторая фаза - кристаллизации мононуклеаров (1-10°C ниже нуля) характеризуется медленным снижением температуры и, предпочтительно, наличием, как минимум, одного плато выдержки мононуклеаров при постоянной температуре. Третья фаза замораживания характеризуется постепенным снижением температуры (до -70°C).The term program freezing implies that freezing usually has three phases, characterized by different freezing rates. The first phase - cooling of mononuclear cells to the temperature at which they begin to crystallize (1-4°C below zero) is characterized preferably by a rapid short-term decrease in temperature. The second phase - crystallization of mononuclear cells (1-10°C below zero) is characterized by a slow decrease in temperature and, preferably, the presence of at least one plateau of holding mononuclear cells at a constant temperature. The third phase of freezing is characterized by a gradual decrease in temperature (down to -70°C).
Применение вышеописанного способа позволяет обеспечить длительное хранение живых мононуклеарных клеток, а также снизить количество погибших при заморозке мононуклеаров. Так, при заморозке в жидком азоте погибает порядка 13-20% мононуклеарных клеток в результате их повреждения при неконтролируемом выбросе тепла в процессе кристаллизации и при резком снижении температуры клеток. При программном замораживании гибель мононуклеаров составляет примерно 2-4%.The use of the above method allows for long-term storage of living mononuclear cells, as well as reducing the number of dead mononuclear cells during freezing. Thus, when frozen in liquid nitrogen, about 13-20% of mononuclear cells die as a result of their damage due to the uncontrolled release of heat during crystallization and a sharp decrease in cell temperature. With program freezing, the death of mononuclear cells is approximately 2-4%.
На фиг. 1 представлена схема проведения способа.In fig. 1 shows a diagram of the method.
На фиг. 2 представлен пример цитометрического анализа апоптоза в лимфоцитах.In fig. Figure 2 shows an example of a cytometric analysis of apoptosis in lymphocytes.
На фиг. 3 представлено количество лимфоцитов в ранней (А) и поздней (Б) стадиях апоптоза в исследованных лейкоконцентратах.In fig. Figure 3 shows the number of lymphocytes in the early (A) and late (B) stages of apoptosis in the studied leukemia concentrates.
В качестве материалов, подтверждающих возможность осуществления настоящего изобретения, представляем одну из серий проводившихся экспериментов, согласно схеме, представленной на фиг. 1.As materials confirming the possibility of implementing the present invention, we present one of the series of experiments performed, according to the diagram presented in Fig. 1.
Было отобрано 20 образцов мононуклеаров, полученных от 12 пациентов (пяти больным аферез мононуклеаров проводили от 2 до 4 раз в разные дни с интервалом более 1 недели). В исследование было20 samples of mononuclear cells were collected from 12 patients (in five patients, mononuclear cell apheresis was performed 2 to 4 times on different days with an interval of more than 1 week). The study included
- 1 043507 включено 5 женщин и 7 мужчин. Возраст от 19 до 68 лет (медиана 35 лет). В качестве основного заболевания у 10 пациентов был острый лейкоз, 2 пациента с лимфомой. 11 больным была выполнена трансплантация аллогенных гемопоэтических клеток (алло-ТГСК) от полностью совместимого донора: 5 больным от родственных доноров и 6 больным - от неродственных доноров; 1 пациентке от гаплоидентичного донора.- 1 043507 included 5 women and 7 men. Age ranged from 19 to 68 years (median 35 years). The underlying disease was acute leukemia in 10 patients and lymphoma in 2 patients. 11 patients underwent allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HSCT) from a fully compatible donor: 5 patients from related donors and 6 patients from unrelated donors; 1 patient from a haploidentical donor.
Аферез мононуклеаров проводили на клеточном сепараторе SpectraOptia (Terumo BCT, Япония/США) в режиме сбора мононуклеаров со следующими параметрами процедуры: соотношение кровь/антикоагулянт - 12:1; настройка сбора (collection preferred) - 40. В результате было обработано от 0,8 до 1,7 от объема циркулирующей крови (ОЦК) (медиана 1,19), медиана времени процедуры - 180 мин (120-250 мин), медиана объема полученного продукта афереза составила 85 мл (60-120 мл).Mononuclear cell apheresis was performed on a SpectraOptia cell separator (Terumo BCT, Japan/USA) in the mononuclear cell collection mode with the following procedure parameters: blood/anticoagulant ratio - 12:1; collection preference setting - 40. As a result, from 0.8 to 1.7 of the circulating blood volume (CBV) was processed (median 1.19), median procedure time - 180 min (120-250 min), median volume the resulting apheresis product was 85 ml (60-120 ml).
Образцы для исследования отбирались непосредственно после афереза мононуклеаров (группы 1.1, 1.2 и 1.3), и после ЭКФ (группы 2.1 и 2.2). Образцы 1.1 и 1.2 отбирали из контейнера системы для сбора мононуклеаров (Spectra Optia Collection Set 10110, TerumoBCT, Япония/США) во встроенный в систему контейнер для отбора проб. Затем осуществляли облучение образцов 2.1 и 2.2 на аппарате Macogenic G2 (Macopharma, Франция) согласно рекомендациям производителя:Samples for the study were collected immediately after mononuclear cell apheresis (groups 1.1, 1.2 and 1.3), and after ECP (groups 2.1 and 2.2). Samples 1.1 and 1.2 were collected from the container of the mononuclear cell collection system (Spectra Optia Collection Set 10110, TerumoBCT, Japan/USA) into the sampling container built into the system. Then samples 2.1 and 2.2 were irradiated using a Macogenic G2 apparatus (Macopharma, France) according to the manufacturer’s recommendations:
продолжительность облучения составила от 546 до 682 с (медиана 606 с) в дозе 2 Дж/см2. После облучения производили отбор образцов 2.1 и 2.2. Часть образцов анализировались сразу (группы 1.1 и 2.1), а часть (группы 1.2, 1.3 и 2.2) замораживали согласно описанной выше программе. Мононуклеары замораживали в холодном растворе полиглюкина с добавлением 10% диметилсульфоксида. Замороженные клетки хранили при заданной температуре не менее 2-х суток. Размораживание осуществляли при 37°C и отмывали средой RPMI1640 с 10% человеческой инактивированной сывороткой IV группы.The duration of irradiation ranged from 546 to 682 s (median 606 s) at a dose of 2 J/cm 2 . After irradiation, samples 2.1 and 2.2 were taken. Some samples were analyzed immediately (groups 1.1 and 2.1), and some (groups 1.2, 1.3 and 2.2) were frozen according to the program described above. Mononuclear cells were frozen in a cold polyglucin solution with the addition of 10% dimethyl sulfoxide. Frozen cells were stored at a given temperature for at least 2 days. Thawing was carried out at 37°C and washed with RPMI1640 medium with 10% human inactivated serum of group IV.
После разморозки анализировали группы 1.2 и 2.2. Часть образцов из каждой группы проанализировали до и после 48-часового культивирования, чтобы проверить изменение уровня апоптоза в динамике.After thawing, groups 1.2 and 2.2 were analyzed. Some samples from each group were analyzed before and after 48-hour cultivation to check changes in the level of apoptosis over time.
Поскольку у разных популяции лейкоцитов апоптоз происходит с различной скоростью на протяжении нескольких суток, 5 образцов были прокультивированы для определения динамики изменения уровня раннего и позднего апоптоза с течением времени. Культивирование проводили в среде RPMI1640 с добавлением 10% человеческой инактивированной сыворотки IV группы, 2 мМ глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Клетки рассаживали по 106 на мл в 24-ячеечные планшеты. Мононуклеары культивировали в течение 2-х суток при температуре 37°C и 5% CO2. Счет клеток производился в камере Горяева после окраски генцианвиолетом на 3% уксусной кислоте или 0,5% трипановым синим.Since apoptosis occurs at different rates in different populations of leukocytes over several days, 5 samples were cultured to determine the dynamics of changes in the level of early and late apoptosis over time. Cultivation was carried out in RPMI1640 medium supplemented with 10% human inactivated serum of group IV, 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin and 50 μg/ml streptomycin. Cells were seeded at 106 cells per ml in 24-cell plates. Mononuclear cells were cultured for 2 days at 37°C and 5% CO 2 . Cells were counted in a Goryaev chamber after staining with gentian violet in 3% acetic acid or 0.5% trypan blue.
Для оценки апоптоза клеток использовали набор FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, США), включающий аннексин V FITC и пропидия йодид (PI). Для отделения лейкоцитов использовали анти-CD45 АРС-Су7 моноклональные антитела (клон 2D1). Для окрашивания брали около 0,2x106 клеток, отмывали 1 мл среды RPMI1640 с 10% человеческой инактивированной сывороткой IV группы. Осадок ресуспензировали в 100 мкл аннексин-связывающего буфера и вносили антитела согласно инструкции к набору. Инкубировали 20 мин при комнатной температуре. После этого добавляли к образцу еще 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили цитометрический анализ с помощью проточного цитофлюориметра BD FACSCanto II (BD Biosciences, США).To assess cell apoptosis, the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, USA), including annexin V FITC and propidium iodide (PI), was used. Anti-CD45 APC-Cy7 monoclonal antibodies (clone 2D1) were used to separate leukocytes. For staining, about 0.2x106 cells were taken and washed with 1 ml of RPMI1640 medium with 10% human inactivated serum of group IV. The sediment was resuspended in 100 μl of annexin-binding buffer and antibodies were added according to the instructions for the kit. Incubated for 20 min at room temperature. After this, another 400 μl of annexin binding buffer was added to the sample and cytometric analysis was performed using a BD FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences, USA).
Цитометрический анализ включал в себя выделение лимфоцитов, основываясь на высоком показателе экспрессии антигена CD45 и низких показателях прямого и бокового светорассеяния этих клеток, с последующим определением количества клеток на ранней и поздней стадиях апоптоза. Клетками на ранних стадиях апоптоза считались те, что связывались только с аннексином V, а на поздних стадиях - и с аннексином V, и с PI.Cytometric analysis involved isolation of lymphocytes based on high CD45 antigen expression and low forward and side scatter values of these cells, followed by determination of the number of cells in early and late stages of apoptosis. Cells at early stages of apoptosis were considered to be those that bound only to annexin V, and at later stages to both annexin V and PI.
Пример определения количества клеток на стадиях раннего и позднего апоптоза представлен на фиг. 2.An example of determining the number of cells at the stages of early and late apoptosis is presented in Fig. 2.
Статистический анализ данных проводили с помощью GraphPad Prism 6. Проверку нормальности распределения выполняли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Сравнение полученных данных осуществляли с помощью парного критерия Уилкоксона с поправками на множественное сравнение. Значимыми признавались отличия при р<0,05.Statistical analysis of data was performed using GraphPad Prism 6. Normality of distribution was tested using the Shapiro-Wilk test. Comparison of the obtained data was carried out using the paired Wilcoxon test with corrections for multiple comparisons. Differences were considered significant at p<0.05.
Сравнение доли лимфоцитов в поздней стадии апоптоза между различными группами показало, что до культивирования в лейкоконцентратах подвергшихся замораживанию и размораживанию (группы 1.2, 1.3 и 2.2) количество клеток было достоверно больше, чем в контрольной группе (образец 1.1) и в группе образцов сразу после ЭКФ (2.1). Доля клеток в ранней стадии апоптоза также была больше в образцах после размораживания как до, так и после ЭКФ (группы 1.2 и 2.2) по сравнению с образцами контрольной группы (1.1) и группы, после ЭКФ, но без криоконсервирования (2.1). При этом в образцах группы 1.3, доля клеток в ранней стадии апоптоза была достоверно (р<0,05) больше по сравнению с группой сразу после ЭКФ (2.1) (фиг. 3А).Comparison of the proportion of lymphocytes in the late stage of apoptosis between different groups showed that before cultivation in leukocyte concentrates subjected to freezing and thawing (groups 1.2, 1.3 and 2.2), the number of cells was significantly higher than in the control group (sample 1.1) and in the group of samples immediately after ECP (2.1). The proportion of cells in the early stage of apoptosis was also greater in samples after thawing both before and after ECP (groups 1.2 and 2.2) compared to samples from the control group (1.1) and the group after ECP but without cryopreservation (2.1). Moreover, in the samples of group 1.3, the proportion of cells in the early stage of apoptosis was significantly (p<0.05) higher compared to the group immediately after ECP (2.1) (Fig. 3A).
После культивирования количество клеток в ранней стадии апоптоза во всех группах достоверно не изменялось, количество же клеток на поздней стадии апоптоза достоверно повышалось во всех группах, кроме контрольной (1.1) (р<0,001), в ней оно не изменялось.After cultivation, the number of cells in the early stage of apoptosis did not change significantly in all groups, while the number of cells in the late stage of apoptosis significantly increased in all groups, except for the control (1.1) (p <0.001), in which it did not change.
- 2 043507- 2 043507
Учитывая данные нашей работы, можно сказать, что процент лимфоцитов в поздней стадии апоптоза через 2-е суток культивирования сопоставим при криоконсервировании лейкоконцентрата, проведении ЭКФ, а также при проведении ЭКФ с последующим криоконсервированием лейкоконцентрата. Таким образом, учитывая отсутствие значимой разницы, обоснованным является проведение сбора мононуклеаров, разделение мононуклеаров на несколько доз для криоконсервирования с последующим возвратом продукта пациенту.Taking into account the data of our work, we can say that the percentage of lymphocytes in the late stage of apoptosis after 2 days of cultivation is comparable when cryopreserving leukemia concentrate, performing ECP, as well as when performing ECP with subsequent cryopreservation of leukemia concentrate. Thus, given the absence of a significant difference, it is reasonable to collect mononuclear cells, divide the mononuclear cells into several doses for cryopreservation, and then return the product to the patient.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043507B1 true EA043507B1 (en) | 2023-05-29 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Merrill et al. | Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin | |
| Villalobos et al. | A cause of the thrombocytopenia and leukopenia that occur in dogs during deep hypothermia | |
| Almizraq et al. | Extracellular vesicles in transfusion-related immunomodulation and the role of blood component manufacturing | |
| US7648699B2 (en) | Preventing transfusion related complications in a recipient of a blood transfusion | |
| Guttmann et al. | Renal transplantation in the inbred rat: IX. Hematopoietic origin of an immunogenic stimulus of rejection | |
| EP2641623B1 (en) | Apparatus and methods for providing cryopreserved ecp-treated mononuclear cells | |
| Gašová et al. | PBPC collection techniques: standard versus large volume leukapheresis (LVL) in donors and in patients | |
| EP2839741A1 (en) | Apheresis platelets with fixed residual plasma volume | |
| CN113164517A (en) | Cell compositions derived from dead donors for promoting graft tolerance and their manufacture and use | |
| US20190224494A1 (en) | Apparatus and method for batch photoactivation of mononuclear cells with cryopreservation | |
| EP3711789A1 (en) | Apparatus and method for batch photoactivation of mononuclear cells | |
| Watts et al. | Evaluation of clinical scale CD34+ cell purification: experience of 71 immunoaffinity column procedures | |
| Cecyn et al. | Large-volume leukapheresis for peripheral blood progenitor cell collection in low body weight pediatric patients: a single center experience | |
| US20190099544A1 (en) | Systems and methods for returning treated mononuclear cells to a blood source | |
| US20030149011A1 (en) | Methods and reagents for extracorporeal immunomodulatory therapy | |
| Diaz et al. | Peripheral blood progenitor cell collection by large-volume leukapheresis in low-weight children | |
| Galmeas et al. | A Simplified Method for Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells with-80dGC Mechanical Freezer with Dimethyl Sulfoxide as the Sole Cryoprotectant | |
| Balint et al. | Stem cell harvesting protocol research in autologous transplantation setting: large volume vs. conventional cytapheresis | |
| RU2743816C1 (en) | Method for obtaining cryopreserved mononuclear cells | |
| EA043507B1 (en) | METHOD FOR INDUCING ANTIGEN ASSOCIATED IMMUNE RESPONSE | |
| RU2752967C1 (en) | Method for induction of antigen-associated immune response | |
| EA043591B1 (en) | METHOD FOR OBTAINING CRYOPRESERVED MONONUCLEAR CELLS | |
| Singhal et al. | Collection of peripheral blood stem cells after a preceding autograft: unfavorable effect of prior interferon-α therapy | |
| RU2508924C1 (en) | Method for prevention and treatment of renal graft rejection | |
| RU2799019C1 (en) | Method of storage of non-cryopreserved autologous hematopoietic stem cells from peripheral blood |