EA043345B1 - BTLA AGONIST ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION - Google Patents
BTLA AGONIST ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA043345B1 EA043345B1 EA201992460 EA043345B1 EA 043345 B1 EA043345 B1 EA 043345B1 EA 201992460 EA201992460 EA 201992460 EA 043345 B1 EA043345 B1 EA 043345B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- antibody
- btla
- Prior art date
Links
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 title claims description 105
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 title claims description 76
- 239000000556 agonist Substances 0.000 title description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 114
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 39
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 33
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 29
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 19
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 9
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 6
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 5
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 31
- 102000053464 human BTLA Human genes 0.000 description 30
- 229940122494 BTLA agonist Drugs 0.000 description 29
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 25
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 24
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 9
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 9
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 206010001580 Albuminuria Diseases 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100058686 Mus musculus Btla gene Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102220470115 Amidophosphoribosyltransferase_H68A_mutation Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000648507 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102220492635 Integrin alpha-3_D52Y_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 102220470557 Proteasome subunit beta type-3_E27R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220467908 Protein Dok-7_S30W_mutation Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102220488256 Uromodulin-like 1_R42D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102200002501 c.98G>A Human genes 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- FBFJOZZTIXSPPR-UHFFFAOYSA-N 1-(4-aminobutyl)-2-(ethoxymethyl)imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine Chemical compound C1=CC=CC2=C(N(C(COCC)=N3)CCCCN)C3=C(N)N=C21 FBFJOZZTIXSPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220496116 5-hydroxytryptamine receptor 3B_V80R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710144268 B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220589483 DNA repair protein XRCC4_E55R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102220523789 E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4_E57R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102220604081 Homeobox protein SIX3_E45R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000841411 Homo sapiens Protein ecdysoneless homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 101150007193 IFNB1 gene Proteins 0.000 description 1
- -1 IL12p70 Proteins 0.000 description 1
- 108091008028 Immune checkpoint receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000037978 Immune checkpoint receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220511586 Kappa-casein_D84R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102220592449 Non-homologous end-joining factor 1_Q43A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150058616 Oas2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005775 Parakeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940124613 TLR 7/8 agonist Drugs 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102200087803 c.241A>G Human genes 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000047791 human ECD Human genes 0.000 description 1
- 102000052793 human TNFRSF14 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108700029353 mouse Ifna Proteins 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 102220005392 rs34259907 Human genes 0.000 description 1
- 102200067572 rs41392146 Human genes 0.000 description 1
- 102220065834 rs794726905 Human genes 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940114727 vet one Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Description
Данное изобретение относится к области медицины. Более конкретно, данное изобретение относится к антителам, направленным против В и Т лимфоцитарного аттенюатора (BTLA - В and T LymphocyteThis invention relates to the field of medicine. More specifically, this invention relates to antibodies directed against B and T lymphocyte attenuator (BTLA - B and T Lymphocyte
Attenuator), и их фармацевтическим композициям. Ожидается, что антитела по данному изобретению будут полезны при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как волчанка.Attenuator), and pharmaceutical compositions thereof. The antibodies of the present invention are expected to be useful in the treatment of autoimmune diseases such as lupus.
Волчанка - это аутоиммунное заболевание с гетерогенными признаками, включая проявления на коже, ротовой полости, мышцах и суставах, сердце, периферической крови, легких, почках, репродуктивной системе и ЦНС. Пациенты с волчанкой подвержены риску серьезных и угрожающих жизни сердечно-сосудистых, почечных и психоневрологических заболеваний. Стандарт лечения включает в себя множество стероидов, которые имеют много неблагоприятных и/или опасных побочных эффектов. Существует необходимость в способах лечения для лечения заболеваний, позволяющих уменьшить или исключить использование стероидов.Lupus is an autoimmune disease with heterogeneous features, including manifestations on the skin, oral cavity, muscles and joints, heart, peripheral blood, lungs, kidneys, reproductive system and central nervous system. Patients with lupus are at risk for serious and life-threatening cardiovascular, renal, and neuropsychiatric diseases. Standard treatment includes many steroids that have many adverse and/or dangerous side effects. There is a need for treatments to treat diseases that reduce or eliminate the use of steroids.
Т и В лимфоцитарный аттенюатор (BTLA; CD272) является членом суперсемейства Ig и частью семейства рецепторов контрольных точек, которые отрицательно регулируют активацию иммунных клеток. BTLA в основном экспрессируется на В-клетках, Т-клетках и дендритных клетках. Природный лиганд для BTLA является членом суперсемейства рецепторов ФНО, медиатором проникновения вируса герпеса (HVEM; TNFRSF14).T and B lymphocyte attenuator (BTLA; CD272) is a member of the Ig superfamily and part of a family of checkpoint receptors that negatively regulate immune cell activation. BTLA is mainly expressed on B cells, T cells and dendritic cells. The natural ligand for BTLA is a member of the TNF receptor superfamily, herpes virus entry mediator (HVEM; TNFRSF14).
Сообщалось, что человеческий HVEM-Fc связывается с человеческим BTLA, экспрессированным в клетках 293Т, с KD 112 нМ, как обнаружено с помощью проточной цитометрии. (Cheung et al., PNAS, 13 сентября 2005, 102:37, 13218-13223). Связывание HVEM с BTLA приводит к тирозин-фосфорилированию двух консервативных иммунорецепторных доменов ингибирующего мотива на основе тирозина в цитоплазматическом домене BTLA. Это фосфорилирование приводит к рекрутированию через два домена Src гомологии 2 протеинтирозинфосфатаз, которые придают ингибирующую активность BTLA путем дефосфорилирования и подавления положительного сигналинга клеточных рецепторов (например, трансдукционных сигнальных каскадов рецептора Т-клеток или рецептора В-клеток), таким образом приводя к подавлению активации иммунных клеток. В мышиной модели, склонной к самопроизвольному развитию волчанкоподобных заболеваний (мыши MRL-lpr), мыши с дефицитом BTLA имеют более выраженную лимфоцитарную инфильтрацию в слюнных железах, легких, поджелудочной железе, почках и суставах по сравнению с мышами, экспрессирующими BTLA. Следовательно, антитела-агонисты BTLA могут быть полезны для пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как волчанка.Human HVEM-Fc was reported to bind to human BTLA expressed in 293T cells with a KD of 112 nM as detected by flow cytometry. (Cheung et al., PNAS, September 13, 2005, 102:37, 13218-13223). Binding of HVEM to BTLA results in tyrosine phosphorylation of two conserved immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domains in the cytoplasmic domain of BTLA. This phosphorylation leads to the recruitment, through the two Src homology 2 domains, of protein tyrosine phosphatases, which confer the inhibitory activity of BTLA by dephosphorylation and suppression of positive signaling of cellular receptors (e.g., T-cell receptor or B-cell receptor transduction signaling cascades), thereby leading to suppression of immune activation cells. In a mouse model prone to spontaneous development of lupus-like diseases (MRL-lpr mice), BTLA-deficient mice have greater lymphocytic infiltration in the salivary glands, lungs, pancreas, kidneys, and joints compared with BTLA-expressing mice. Therefore, BTLA agonist antibodies may be useful for patients with autoimmune diseases such as lupus.
Антитела-агонисты к BTLA известны в данной области. Например, в патенте США № 8563694 (патент '694) описаны антитела-агонисты BTLA, которые либо блокируют (Mab21H6 и Mab19A7), либо не блокируют (Mab8D5 и МаЬ8АЗ) связывание HVEM с BTLA. Патент '694 описывает постоянную потребность в разработке методов лечения, которые используют ингибирующую роль BTLA в лимфоцитарных ответах, в то же время допуская связывание BTLA-HVEM. Однако не хватает антител-агонистов BTLA, которые имитируют связывание HVEM с BTLA для лечения аутоиммунных заболеваний. Антитело имитирует связывание HVEM с BTLA, если антитело имеет эпитоп, который значительно перекрывает сайт связывания HVEM, и существует структурное сходство между антителом и HVEM. Существует также недостаток антител-агонистов BTLA, которые связывают человеческие BTLA и пригодны для исследования на доклинических моделях аутоиммунных заболеваний in vivo, таких как мышиные модели и модели обезьян циномолгус. Таким образом, остается потребность в альтернативных антителахагонистах BTLA.Anti-BTLA agonist antibodies are known in the art. For example, US Pat. No. 8,563,694 (the '694 patent) discloses BTLA agonist antibodies that either block (Mab21H6 and Mab19A7) or do not block (Mab8D5 and Mab8A3) the binding of HVEM to BTLA. The '694 patent describes the ongoing need to develop therapies that exploit the inhibitory role of BTLA on lymphocyte responses while allowing BTLA-HVEM binding. However, there is a lack of BTLA agonist antibodies that mimic the binding of HVEM to BTLA for the treatment of autoimmune diseases. An antibody mimics HVEM binding to BTLA if the antibody has an epitope that significantly overlaps the HVEM binding site and there is structural similarity between the antibody and HVEM. There is also a shortage of BTLA agonist antibodies that bind human BTLA and are suitable for study in preclinical in vivo models of autoimmune diseases, such as mouse and cynomolgus monkey models. Thus, there remains a need for alternative BTLA agonist antibodies.
Антитела по данному изобретению стремятся предоставить альтернативные антитела-агонисты BTLA. Такие антитела-агонисты BTLA могут быть полезны при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как волчанка. Такие антитела-агонисты BTLA способны связывать BTLA от множества видов, таких как человек, обезьяна циномолгус, и/или мышиные BTLA. Кроме того, такие антитела-агонисты BTLA демонстрируют повышенную активность in vitro по сравнению с антителом, имеющим такой же вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, что и Mab8D5. Антитела по данному изобретению обладают по меньшей мере одной из этих желательных характеристик.The antibodies of this invention seek to provide alternative BTLA agonist antibodies. Such BTLA agonist antibodies may be useful in the treatment of autoimmune diseases such as lupus. Such BTLA agonist antibodies are capable of binding BTLA from a variety of species, such as human, cynomolgus monkey, and/or murine BTLA. In addition, such BTLA agonist antibodies exhibit increased in vitro activity compared to an antibody having the same heavy chain variable region and light chain variable region as Mab8D5. Antibodies of this invention have at least one of these desirable characteristics.
Одно такое антитело-агонист BTLA способно связывать BTLA человека, обезьяны циномолгус и мыши. Удивительно, но это антитело обладает желаемой перекрестной реактивностью, поскольку оно имитирует связывание HVEM с BTLA. Это антитело также имеет более высокую аффинность связывания с BTLA по сравнению с BTLA, связывающимся с HVEM. Это может принести пользу пациентам, имеющим состояния болезни с переходными уровнями HVEM, где может быть желательно иметь антитело-агонист, имитирующее BTLA, во время, когда у пациента наблюдается снижение HVEM.One such BTLA agonist antibody is capable of binding human, cynomolgus monkey and mouse BTLA. Surprisingly, this antibody has the desired cross-reactivity because it mimics the binding of HVEM to BTLA. This antibody also has a higher binding affinity for BTLA compared to BTLA binding to HVEM. This may benefit patients who have disease states with transient HVEM levels, where it may be desirable to have a BTLA-mimicking agonist antibody at a time when the patient experiences a decrease in HVEM.
Данные изобретения обеспечивают антитела, которые связываются с BTLA и активируют и/или усиливают BTLA-опосредованный сигналинг (антитело-агонист BTLA). Данное изобретение относится к антителу, которое содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR) и вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), где LCVR содержит определяющие комплементарность участки (CDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, a HCVR содержит CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 22, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 25, аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 28, аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 13, аминокислотная после- 1 043345 довательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 16, а аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 19. В одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит LCVR и HCVR, и при этом аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 4, а аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретения, антитело содержит легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС), и при этом аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 2, а аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 1. В еще одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит 2 LC и 2 НС, где аминокислотная последовательность каждой LC представляет собой SEQ ID NO: 2, а аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 1.The present inventions provide antibodies that bind to BTLA and activate and/or enhance BTLA-mediated signaling (BTLA agonist antibody). This invention relates to an antibody that contains a light chain variable region (LCVR) and a heavy chain variable region (HCVR), wherein the LCVR contains the complementarity determining regions (CDRs) of LCDR1, LCDR2 and LCDR3, and the HCVR contains the CDRs of HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and wherein the amino acid sequence of LCDR1 is SEQ ID NO: 22, the amino acid sequence of LCDR2 is SEQ ID NO: 25, the amino acid sequence of LCDR3 is SEQ ID NO: 28, the amino acid sequence of HCDR1 is SEQ ID NO: 13, the amino acid sequence is 1 043345 The sequence of HCDR2 is SEQ ID NO: 16, and the amino acid sequence of HCDR3 is SEQ ID NO: 19. In one embodiment of the invention, the antibody contains LCVR and HCVR, and wherein the amino acid sequence of LCVR is SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence the sequence HCVR is SEQ ID NO: 3. In another embodiment, the antibody comprises a light chain (LC) and a heavy chain (HC), wherein the amino acid sequence LC is SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence HC is SEQ ID NO: 1. In yet another embodiment, the antibody contains 2 LCs and 2 HCs, wherein the amino acid sequence of each LC is SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of each HC is SEQ ID NO: 1.
Данное изобретение также обеспечивает антитело-агонист BTLA, в котором аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 23, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 26, аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 29, аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 14, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 17, а аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, а аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 6, а аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 5. В еще одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит 2 LC и 2 НС, где аминокислотная последовательность каждой LC представляет собой SEQ ID NO: 6, а аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 5.The present invention also provides a BTLA agonist antibody, wherein the amino acid sequence of LCDR1 is SEQ ID NO: 23, the amino acid sequence of LCDR2 is SEQ ID NO: 26, the amino acid sequence of LCDR3 is SEQ ID NO: 29, the amino acid sequence of HCDR1 is SEQ ID NO: 14, the amino acid sequence of HCDR2 is SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence of HCDR3 is SEQ ID NO: 20. In one embodiment of the invention, the amino acid sequence of LCVR is SEQ ID NO: 8 and the amino acid sequence of HCVR is is SEQ ID NO: 7. In another embodiment, the LC amino acid sequence is SEQ ID NO: 6 and the HC amino acid sequence is SEQ ID NO: 5. In yet another embodiment, the antibody contains 2 LCs and 2 HCs wherein the amino acid sequence of each LC is SEQ ID NO: 6 and the amino acid sequence of each HC is SEQ ID NO: 5.
Данное изобретение также обеспечивает антитело-агонист BTLA, в котором аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 24, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 27, аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 30, аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 15, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 18, а аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 21. В одном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 12, а аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 9. В еще одном варианте осуществления изобретения, антитело содержит 2 LC и 2 НС, где аминокислотная последовательность каждой LC представляет собой SEQ ID NO: 10, а аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 9.The present invention also provides a BTLA agonist antibody, wherein the amino acid sequence of LCDR1 is SEQ ID NO: 24, the amino acid sequence of LCDR2 is SEQ ID NO: 27, the amino acid sequence of LCDR3 is SEQ ID NO: 30, the amino acid sequence of HCDR1 is SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of HCDR2 is SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence of HCDR3 is SEQ ID NO: 21. In one embodiment of the invention, the amino acid sequence of LCVR is SEQ ID NO: 12 and the amino acid sequence of HCVR is is SEQ ID NO: 11. In another embodiment, the LC amino acid sequence is SEQ ID NO: 10 and the HC amino acid sequence is SEQ ID NO: 9. In yet another embodiment, the antibody contains 2 LC and 2 HC wherein the amino acid sequence of each LC is SEQ ID NO: 10 and the amino acid sequence of each HC is SEQ ID NO: 9.
Данное изобретение также относится к антителу, которое связывает BTLA, при этом антитело производится с помощью стадий, включающих иммунизацию кроликов Fc-меченным доменом внеклеточного домена (ECD) человеческого BTLA, и усиление белками, меченными BTLA-Fc человека и мыши. Аминокислотная последовательность ECD BTLA человека представляет собой аминокислоты 31-150 SEQ ID NO: 31.The invention also provides an antibody that binds BTLA, wherein the antibody is produced by steps including immunizing rabbits with an Fc-tagged extracellular domain (ECD) of human BTLA and boosting with human and mouse BTLA-Fc-tagged proteins. The amino acid sequence of human ECD BTLA is amino acids 31-150 SEQ ID NO: 31.
Данное изобретение относится к антителу-агонисту BTLA, которое имитирует связывание HVEM с BTLA. Данное изобретение также относится к антителу-агонисту BTLA, которое способно связывать BTLA человека, обезьяны циномолгус и мыши.This invention relates to a BTLA agonist antibody that mimics the binding of HVEM to BTLA. The present invention also provides a BTLA agonist antibody that is capable of binding human, cynomolgus monkey and mouse BTLA.
Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело по данному изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции по данному изобретению можно использовать для лечения одного или более ревматических, нейронных и дерматологических заболеваний, причем такое лечение включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции по данному изобретению. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения, ревматическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из волчаночного нефрита, системной красной волчанки и ревматоидного артрита. В других конкретных вариантах осуществления изобретения дерматологическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из атопического дерматита и псориаза. В других конкретных вариантах осуществления изобретения нейрональное заболевание представляет собой рассеянный склероз.This invention also relates to a pharmaceutical composition containing an antibody of this invention and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients. In some embodiments, the pharmaceutical compositions of this invention can be used to treat one or more rheumatic, neuronal and dermatological diseases, such treatment comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition of this invention. In some specific embodiments of the invention, the rheumatic disease is at least one of lupus nephritis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. In other specific embodiments, the dermatological disease is at least one of atopic dermatitis and psoriasis. In other specific embodiments of the invention, the neuronal disease is multiple sclerosis.
Данное изобретение также относится к способу лечения пациента с одним или более ревматическим, нейронным и дерматологическим заболеванием, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по данному изобретению. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения ревматическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из волчаночного нефрита, системной красной волчанки и ревматоидного артрита. В других конкретных вариантах осуществления изобретения дерматологическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из атопического дерматита и псориаза. В других конкретных вариантах осуществления изобретения нейрональное заболевание представляет собой рассеянный склероз.The present invention also provides a method of treating a patient with one or more rheumatic, neuronal and dermatological diseases, comprising administering to the patient in need thereof an effective amount of an antibody of the present invention. In some such embodiments, the rheumatic disease is at least one of lupus nephritis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. In other specific embodiments, the dermatological disease is at least one of atopic dermatitis and psoriasis. In other specific embodiments of the invention, the neuronal disease is multiple sclerosis.
В данном изобретении также предложено антитело по данному изобретению или его фармацевтическая композиция для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения данThe present invention also provides an antibody of the present invention or a pharmaceutical composition thereof for use in therapy. In some embodiments of the invention,
- 2 043345 ное изобретение относится к антителу по данному изобретению или его фармацевтической композиции для применения при лечении одного или более ревматических, нейрональных и дерматологических заболеваний. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения ревматическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из волчаночного нефрита, системной красной волчанки и ревматоидного артрита. В других конкретных вариантах осуществления изобретения дерматологическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из атопического дерматита и псориаза. В других конкретных вариантах осуществления изобретения нейрональное заболевание представляет собой рассеянный склероз.- 2043345 This invention relates to an antibody of this invention or a pharmaceutical composition thereof for use in the treatment of one or more rheumatic, neuronal and dermatological diseases. In some such embodiments, the rheumatic disease is at least one of lupus nephritis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. In other specific embodiments, the dermatological disease is at least one of atopic dermatitis and psoriasis. In other specific embodiments of the invention, the neuronal disease is multiple sclerosis.
Данное изобретение также предусматривает применение антитела по данному изобретению или его фармацевтической композиции при изготовлении лекарственного средства для лечения одного или более ревматических, нейрональных и дерматологических заболеваний. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения ревматическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из волчаночного нефрита, системной красной волчанки и ревматоидного артрита. В других конкретных вариантах осуществления изобретения дерматологическое заболевание представляет собой по меньшей мере одно из атопического дерматита и псориаза. В других конкретных вариантах осуществления изобретения нейрональное заболевание представляет собой рассеянный склероз.The present invention also provides for the use of an antibody of the present invention or a pharmaceutical composition thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of one or more rheumatic, neuronal and dermatological diseases. In some such embodiments, the rheumatic disease is at least one of lupus nephritis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. In other specific embodiments, the dermatological disease is at least one of atopic dermatitis and psoriasis. In other specific embodiments of the invention, the neuronal disease is multiple sclerosis.
Данное изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9. Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 10.The present invention relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 9. The present invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 10.
Данное изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления изобретения, полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 35, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представляет собой SEQ ID NO: 36.This invention relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, and containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2. This invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide a sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In a particular embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 35, and the polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 36.
Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В конкретном варианте осуществления изобретения, полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, представляет собой SEQ ID NO: 37, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, представляет собой SEQ ID NO: 38.This invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. This invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 6. In a particular embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 37, and the polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is SEQ ID NO: 38.
Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Данное изобретение также относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В конкретном варианте осуществления изобретения, полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, представляет собой SEQ ID NO: 39, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, представляет собой SEQ ID NO: 40.This invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The present invention also relates to a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 10. In a particular embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 is SEQ ID NO: 39, and the polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is SEQ ID NO: 40.
Кроме того, данное изобретение относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Данное изобретение также относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Данное изобретение также относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулуFurther, this invention relates to a mammalian cell containing a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. This invention also relates to a mammalian cell containing a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 5, and a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 6. This invention also relates to a mammalian cell containing the molecule
- 3 043345- 3 043345
ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления изобретения, клеточная линия млекопитающих представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO) или эмбриональной почки китайского хомячка (HEK).DNA comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In one embodiment of the invention, the mammalian cell line is a Chinese hamster ovary (CHO) cell line or Chinese hamster embryonic kidney (HEK).
Данное изобретение также относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем клетка способна экспрессировать антитело, содержащее НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Предпочтительно клетка млекопитающего содержит молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления изобретения, клеточная линия млекопитающих представляет собой клеточную линию CHO или HEK.This invention also relates to a mammalian cell containing a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and/or a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the cell is capable of expressing an antibody comprising an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Preferably, the mammalian cell contains a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 1, and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In one embodiment of the invention, the mammalian cell line is a CHO or HEK cell line.
Данное изобретение также относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и/или молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, причем клетка способна экспрессировать антитело, содержащее НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Предпочтительно клетка млекопитающего содержит молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления изобретения, клеточная линия млекопитающих представляет собой клеточную линию СНО или HEK.This invention also relates to a mammalian cell containing a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and/or a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, wherein the cell is capable of expressing an antibody comprising an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Preferably, the mammalian cell contains a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 5, and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment of the invention, the mammalian cell line is a CHO or HEK cell line.
Данное изобретение также относится к клетке млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и/или молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, где клетка способна экспрессировать антитело, содержащее НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Предпочтительно клетка млекопитающего содержит молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления изобретения, клеточная линия млекопитающих представляет собой клеточную линию СНО или HEK.This invention also relates to a mammalian cell containing a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and/or a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, wherein the cell is capable of expressing an antibody comprising an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. Preferably, the mammalian cell contains a DNA molecule containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 9, and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In one embodiment of the invention, the mammalian cell line is a CHO or HEK cell line.
В другом варианте осуществления изобретения, данное изобретение относится к способу получения антитела, содержащего LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, содержащей ДНК, кодирующую LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстанавливается экспрессированное антитело. Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.In another embodiment, the invention provides a method for producing an antibody comprising an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the method comprising culturing a mammalian cell containing DNA encoding the LC , having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and/or HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, under conditions under which the antibody is expressed, and the expressed antibody is recovered. The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение также относится к способу получения антитела, содержащего LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, содержащей ДНК, кодирующую LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и/или НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстанавливается экспрессированное антитело. Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.This invention also provides a method for producing an antibody comprising an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the method comprising culturing a mammalian cell containing DNA encoding the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and/or HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, under conditions under which the antibody is expressed and the expressed antibody is recovered. The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение также относится к способу получения антитела, содержащего LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, содержащей ДНК, кодирующую LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или НС, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстанавливается экспрессированное антитело. Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.This invention also provides a method for producing an antibody comprising an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, the method comprising culturing a mammalian cell containing DNA encoding the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and/or HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, under conditions under which the antibody is expressed and the expressed antibody is recovered. The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение включает способ получения антитела, причем это антитело содержит две НС и две LC, в которых аминокислотная последовательность каждой из двух НС представляет собой SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность каждой из двух LC представляет собой SEQ ID NO: 2,This invention includes a method for producing an antibody, wherein the antibody comprises two HCs and two LCs, wherein the amino acid sequence of each of the two HCs is SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of each of the two LCs is SEQ ID NO: 2,
- 4 043345 и этот процесс включает- 4 043345 and this process includes
а) культивирование клетки млекопитающего по изобретению, как описано выше, в условиях, при которых антитело экспрессируется; иa) culturing a mammalian cell of the invention as described above under conditions under which the antibody is expressed; And
b) восстановление экспрессированного антитела.b) recovery of the expressed antibody.
Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение также включает способ получения антитела, причем это антитело содержит две НС и две LC, в которых аминокислотная последовательность каждой из двух НС представляет собой SEQ ID NO: 5, а аминокислотная последовательность каждой из двух LC представляет собой SEQ ID NO: 6, и этот процесс включаетThe present invention also includes a method for producing an antibody, wherein the antibody comprises two HCs and two LCs, wherein the amino acid sequence of each of the two HCs is SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of each of the two LCs is SEQ ID NO: 6, and this process includes
a) культивирование клетки млекопитающего по изобретению, как описано выше, в условиях, при которых антитело экспрессируется; иa) culturing a mammalian cell of the invention as described above under conditions under which the antibody is expressed; And
b) восстановление экспрессированного антитела.b) recovery of the expressed antibody.
Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение также включает способ получения антитела, причем это антитело содержит две НС и две LC, в которых аминокислотная последовательность каждой из двух НС представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность каждой из двух LC представляет собой SEQ ID NO: 10, и этот процесс включаетThe present invention also includes a method for producing an antibody, wherein the antibody comprises two HCs and two LCs, wherein the amino acid sequence of each of the two HCs is SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of each of the two LCs is SEQ ID NO: 10, and this process includes
a) культивирование клетки млекопитающего по изобретению, как описано выше, в условиях, при которых антитело экспрессируется; иa) culturing a mammalian cell of the invention as described above under conditions under which the antibody is expressed; And
b) восстановление экспрессированного антитела.b) recovery of the expressed antibody.
Изобретение включает антитело, получаемое способом по изобретению, как описано непосредственно выше.The invention includes an antibody produced by the method of the invention as described immediately above.
Данное изобретение относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по структурному и функциональному эпитопу, имеющему следующие остатки SEQ ID NO: 31: Arg в положении 42 и His в положении 127. Данное изобретение также относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по структурному и функциональному эпитопу, содержащему Arg в положении 42 аминокислотной последовательности, заданной SEQ ID NO: 31.This invention relates to an antibody that contacts human BTLA at a structural and functional epitope having the following residues of SEQ ID NO: 31: Arg at position 42 and His at position 127. This invention also provides an antibody that contacts human BTLA by a structural and functional epitope containing Arg at position 42 of the amino acid sequence given by SEQ ID NO: 31.
Данное изобретение относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по новому структурному эпитопу, имеющему следующие остатки SEQ ID NO: 31: Asp в положении 35, Gln в положении 37, Arg в положении 42, Leu в положении 74, Gly в положении 76, Cys в положении 79, Arg в положении 114, Phe в положении 119, Gln в положении 120, Asn в положении 122, Ser в положении 128. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное антитело 22В3 имитирует связывание HVEM с BTLA, поскольку HCDR3 антитела 22В3 структурно сходно с HVEM. Предпочтительно, когда кристаллическая структура BTLA:антитело выровнена с кристаллической структурой BTLA:HVEM в программе, такой как PyMOL™, петля CDR антитела принимает конформацию, аналогичную петле HVEM, содержащей аминокислотные остатки 69-72 (аминокислоты ELTG из SEQ ID NO: 41).This invention relates to an antibody that contacts human BTLA at a novel structural epitope having the following residues of SEQ ID NO: 31: Asp at position 35, Gln at position 37, Arg at position 42, Leu at position 74, Gly at position 76, Cys at position 79, Arg at position 114, Phe at position 119, Gln at position 120, Asn at position 122, Ser at position 128. In a preferred embodiment of the invention, said 22B3 antibody mimics the binding of HVEM to BTLA, since HCDR3 antibodies 22B3 is structurally similar to HVEM. Preferably, when the BTLA:antibody crystal structure is aligned with the BTLA:HVEM crystal structure in a program such as PyMOL™, the antibody CDR loop adopts a conformation similar to the HVEM loop containing amino acid residues 69-72 (ELTG amino acids of SEQ ID NO: 41).
Данное изобретение относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по функциональному эпитопу, имеющему Asp в положении 52 SEQ ID NO: 31. Антитело связывается с новым структурным эпитопом, имеющим следующие остатки SEQ ID NO: 31: His в положении 46, Glu в положении 55, Glu в положении 103, Pro в положении 104, Leu в положении 106, Pro в положении 107, Thr в позиция 134, Ala в позиции 139.This invention relates to an antibody that contacts human BTLA at a functional epitope having Asp at position 52 of SEQ ID NO: 31. The antibody binds to a novel structural epitope having the following residues of SEQ ID NO: 31: His at position 46, Glu at position 55, Glu at position 103, Pro at position 104, Leu at position 106, Pro at position 107, Thr at position 134, Ala at position 139.
Данное изобретение относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по функциональному эпитопу, имеющему His в положении 68 и Lys в положении 81 SEQ ID NO: 31. В одном варианте осуществления изобретения, антитело связывается с новым структурным эпитопом, имеющим следующие остатки SEQ ID NO: 31: Tyr в положении 62, Ala в положении 64, His в положении 68, Arg в положении 85, Glu в положении 91, Phe в положении 98, Asn в положении 118.This invention provides an antibody that contacts human BTLA at a functional epitope having a His at position 68 and a Lys at position 81 of SEQ ID NO: 31. In one embodiment of the invention, the antibody binds to a novel structural epitope having the following residues of SEQ ID NO: 31: Tyr at position 62, Ala at position 64, His at position 68, Arg at position 85, Glu at position 91, Phe at position 98, Asn at position 118.
Данное изобретение относится к антителу, которое находится в контакте с человеческим BTLA по новому структурному эпитопу, имеющему следующие остатки SEQ ID NO: 31: Asp в положении 35, Gln в положении 37, Arg в положении 42, Leu в положении 74, Gly в положении 76, Cys в положении 79, Arg в положении 114, Phe в положении 119, Gln в положении 120, Asn в положении 122, и Ile в положении 124, Ser в положении 128.This invention relates to an antibody that contacts human BTLA at a novel structural epitope having the following residues of SEQ ID NO: 31: Asp at position 35, Gln at position 37, Arg at position 42, Leu at position 74, Gly at position 76, Cys at position 79, Arg at position 114, Phe at position 119, Gln at position 120, Asn at position 122, and Ile at position 124, Ser at position 128.
Используемый в данном документе термин антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, содержащую 2 НС и 2 LC, связанные дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой LC и НС включает вариабельный участок, из около 100-120 аминокислот, в первую очередь ответственную за распознавание антигена через содержащиеся в нем CDR. CDR перемежаются с участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждый LCVR и HCVR состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDR LC обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а 3 CDR НС обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. CDR содержат большую часть остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Т.е. CDR содержат большую часть остатков, кото- 5 043345 рые находятся в контакте (в пределах 4,5 А) с остатками антигена. Таким образом, функциональная способность антитела связывать определенный антиген в значительной степени зависит от аминокислотных остатков в шести CDR. Назначение аминокислот доменам CDR в участках LCVR и HCVR антител по данному изобретению основано на хорошо известном соглашении нумерации по Кабат (Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication, № 91-3242 (1991)); и Chothia (Chothia C., Lesk A.M., Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 1987, 196:901-17; Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. et al., Conformations of immunoglobulin hypervariable regions, Nature, 1989, 342:877-83). Начальный аминокислотный остаток HCDR1 определяется по Хотиа, а конечный аминокислотный остаток для HCDR1 определяется по Кабат. Начальные и конечные аминокислотные остатки для HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены по Кабат.As used herein, the term antibody is an immunoglobulin molecule containing 2 HC and 2 LC linked by disulfide bonds. The amino-terminal part of each LC and HC includes a variable region of about 100-120 amino acids primarily responsible for antigen recognition through the CDRs it contains. The CDRs are interspersed with regions that are more conserved, called framework regions (FR). Each LCVR and HCVR consists of 3 CDRs and 4 FRs, located from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The 3 CDRs of LC are designated as LCDR1, LCDR2 and LCDR3, and the 3 CDRs of HC are designated as HCDR1, HCDR2 and HCDR3. CDRs contain most of the residues that form specific interactions with the antigen. Those. CDRs contain most of the residues that are in contact (within 4.5 A) with antigen residues. Thus, the functional ability of an antibody to bind a particular antigen is largely dependent on the amino acid residues in the six CDRs. The assignment of amino acids to the CDR domains in the LCVR and HCVR regions of the antibodies of this invention is based on the well-known Kabat numbering convention (Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication, No. 91-3242 (1991)); and Chothia (Chothia C., Lesk A.M., Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 1987, 196:901-17; Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith -Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. et al., Conformations of immunoglobulin hypervariable regions, Nature, 1989, 342:877-83). The starting amino acid residue of HCDR1 is determined by Hotia, and the ending amino acid residue for HCDR1 is determined by Kabat. The starting and ending amino acid residues for HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 were determined by Kabat.
Используемый в данном документе термин эпитоп может относиться к структурному эпитопу (сайтам антигена, которые находятся в контакте с вариабельным участком антитела) и/или функциональному эпитопу (сайтам антигена, которые могут или не могут быть в контакте с вариабельным участком антитела и необходимы для связывания антитела). Структурный эпитоп, определяемый с помощью рентгеновской кристаллографии, где любой остаток на BTLA человека в пределах 4,5 А от другого остатка на связанном Fab, считается сайтом контакта.As used herein, the term epitope can refer to a structural epitope (sites of an antigen that are in contact with an antibody variable region) and/or functional epitope (sites of an antigen that may or may not be in contact with a variable region of an antibody and are required for antibody binding ). A structural epitope, defined by X-ray crystallography, where any residue on human BTLA within 4.5 A of another residue on the bound Fab is considered a contact site.
Антитела по данному изобретению могут быть получены и очищены с использованием известных способов. Например, последовательности к ДНК кодирующие НС (например, аминокислотную последовательность, заданную SEQ ID NO: 1) и LC (например, аминокислотную последовательность, заданную SEQ ID NO: 2), могут быть клонированы и встроены в вектор экспрессии GS (глютаминсинтетаза). Затем сконструированный вектор экспрессии иммуноглобулина может стабильно трансфицироваться в клетки СНО. Специалист в данной области поймет, что экспрессия антител у млекопитающих приводит к гликозилированию, как правило, в высоко консервативных сайтах N-гликозилирования в участке Fc. Стабильные клоны могут быть проверены на экспрессию антитела, специфически связывающегося с BTLA. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для производства антител в биореакторах. Среда, в которую было секретировано антитело, может быть очищена обычными методами. Например, среда может быть удобно нанесена на колонку с протеином А или G сефарозой FF, которая была уравновешена совместимым буфером, таким как фосфатно-солевой буферный раствор. Колонку промывают для удаления неспецифических связывающих компонентов. Связанное антитело элюируется, например, градиентом рН, и фракции антитела выявляются, например, с помощью SDS-PAGE, и затем объединяются. Антитело можно концентрировать и/или стерильно фильтровать, используя обычные методики. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалять обычными способами, включая эксклюзионную, с гидрофобным взаимодействием, ионообменную или гидроксиапатитную хроматографию. Продукт можно незамедлительно замораживать, например, при -70°C или можно лиофилизировать.Antibodies of this invention can be prepared and purified using known methods. For example, DNA sequences encoding HC (eg, the amino acid sequence given by SEQ ID NO: 1) and LC (eg, the amino acid sequence given by SEQ ID NO: 2) can be cloned and inserted into a GS (glutamine synthetase) expression vector. The constructed immunoglobulin expression vector can then be stably transfected into CHO cells. One skilled in the art will appreciate that expression of antibodies in mammals results in glycosylation, typically at highly conserved N-glycosylation sites in the Fc region. Stable clones can be tested for expression of an antibody that specifically binds to BTLA. Positive clones can be propagated in serum-free culture medium to produce antibodies in bioreactors. The medium into which the antibody has been secreted can be purified by conventional methods. For example, the medium can be conveniently applied to a Protein A or G Sepharose FF column that has been equilibrated with a compatible buffer such as phosphate buffered saline. The column is washed to remove nonspecific binding components. Bound antibody is eluted, for example, by a pH gradient, and antibody fractions are detected, for example, by SDS-PAGE, and then pooled. The antibody can be concentrated and/or sterile filtered using conventional techniques. Soluble aggregates and multimers can be effectively removed by conventional methods, including size exclusion, hydrophobic interaction, ion exchange or hydroxyapatite chromatography. The product can be immediately frozen, for example at -70°C, or can be lyophilized.
Антитело по данному изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, которая может быть получена способами, хорошо известными в данной области, и содержит антитело по данному изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей.The antibody of this invention can be included in a pharmaceutical composition, which can be prepared by methods well known in the art, and contains the antibody of this invention and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.
Фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество антитело по данному изобретению, можно вводить пациенту с риском или проявлением заболеваний или расстройств, как описано в данном документе, первичными путями (например, подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным или трансдермальным). Эффективное количество относится к количеству, необходимому (в дозировках и в течение периодов времени и для средств введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивида, а также от способности антитела вызывать необходимый ответ у индивида. Эффективным количеством является также количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела по данному изобретению перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.A pharmaceutical composition containing an effective amount of an antibody of this invention can be administered to a patient at risk for or exhibiting diseases or disorders as described herein by primary routes (eg, subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, or transdermal). An effective amount refers to the amount needed (in dosages and periods of time and means of administration) to achieve the desired therapeutic result. The effective amount of the antibody may vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual, as well as the ability of the antibody to elicit the desired response in the individual. An effective amount is also an amount at which any toxic or harmful effects of the antibody of this invention are outweighed by the therapeutically beneficial effects.
Антитела по данному изобретению можно использовать при лечении пациентов. Более конкретно, ожидается, что антитела по данному изобретению будут лечить одно или более заболеваний, связанных с ревматическим, нейрональным и дерматологическим заболеванием. Ревматические заболевания характеризуются воспалением, которое может поражать суставы, мышцы и/или органы человека. Одним из таких ревматических заболеваний является системная красная волчанка (СКВ).Antibodies of this invention can be used in the treatment of patients. More specifically, the antibodies of the present invention are expected to treat one or more diseases associated with rheumatic, neuronal and dermatological diseases. Rheumatic diseases are characterized by inflammation that can affect a person's joints, muscles and/or organs. One such rheumatic disease is systemic lupus erythematosus (SLE).
Используемые в данном документе взаимозаменяемо лечение и/или лечить и/или лечение предназначены для обозначения всех процессов, в которых может происходить замедление, прерывание, сдерживание, контроль, остановка или обращение прогрессирования расстройств, описанных в данном документе, но не обязательно указывают на полное устранение всех симптомов расстройства. Лечение включает введение антитела по данному изобретению для лечения заболевания или состояния у человека, на которое благоприятно влияет увеличение активности BTLA, и включаетWhen used interchangeably herein, treat and/or treat and/or cure are intended to refer to all processes by which slowing, interrupting, containing, controlling, stopping, or reversing the progression of the disorders described herein may occur, but does not necessarily indicate complete elimination all symptoms of the disorder. Treatment involves administering an antibody of the present invention to treat a disease or condition in a person that is benefited by an increase in BTLA activity and includes
- 6 043345 (а) ингибирование дальнейшего развития заболевания; и (b) облегчение заболевания, т.е. вызывание регрессии заболевания или расстройства или облегчение симптомов или их осложнений.- 6 043345 (a) inhibition of further development of the disease; and (b) alleviation of the disease, i.e. causing regression of a disease or disorder or alleviation of symptoms or complications thereof.
Конструирование антитела.Antibody construction.
Антитела по данному изобретению были получены путем иммунизации кроликов Fc-меченым доменом внеклеточного домена (ECD) человеческого BTLA и усиления с помощью мышиного BTLA-Fcмеченного белка (25F7) или поочередно человеческими и мышиными меченными BTLA-Fc белками (22В3 и 23С8). Для выявления перекрестной реактивности проводили скрининг BTLA человека, мыши и обезьяны циномолгус, меченных гистидином. Аминокислотная последовательность BTLA человека задана SEQ ID NO: 31, аминокислотная последовательность BTLA мыши Balbc задана SEQ ID NO: 32, аминокислотная последовательность C57BL6 задана SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность BTLA обезьяны циномолгус задана SEQ ID NO: 34. Затем антитела были гуманизированы и аффинность созрела.Antibodies of the present invention were prepared by immunizing rabbits with Fc-tagged extracellular domain (ECD) domain of human BTLA and boosting with mouse BTLA-Fc-tagged protein (25F7) or alternately with human and murine BTLA-Fc-tagged proteins (22B3 and 23C8). Histidine-tagged human, mouse, and cynomolgus monkey BTLA were screened to detect cross-reactivity. The amino acid sequence of human BTLA is given by SEQ ID NO: 31, the amino acid sequence of Balbc mouse BTLA is given by SEQ ID NO: 32, the amino acid sequence of C57BL6 is given by SEQ ID NO: 33, and the amino acid sequence of cynomolgus monkey BTLA is given by SEQ ID NO: 34. The antibodies were then humanized and affinity has matured.
ПримерыExamples
Экспрессия и очистка сконструированных антител-агонистов BTLA.Expression and purification of engineered BTLA agonist antibodies.
Антитела-агонисты BTLA по данному изобретению могут быть экспрессированы и очищены по существу следующим образом. Соответствующую клетку-хозяина, такую как FIEK 293 или СНО, можно временно или стабильно трансфицировать экспрессионной системой для секреции антител, используя оптимальное предварительно определенное отношение векторов HC:LC (например, 1:3 или 1:2) или один вектор системы кодирования как НС, так и LC. Осветленную среду, в которую происходила секреция антитела, можно очищать, используя любой из многих обычно применяемых способов. Например, в случае фрагмента Fab среду удобно наносить на колонку MabSelect (GE Healthcare) или колонку KappaSelect (GE Healthcare), уравновешенную совместимым буфером, таким как фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4). Колонку можно промывать для удаления неспецифических связывающих компонентов. Связанное антитело можно элюировать, например, градиентом рН (например, от 20 мМ Трис-буфера, рН 7,0, до 10 мМ цитратного натриевого буфера, рН 3,0, или от фосфатно-солевого буферного раствора, рН от 7,4, до 100 мМ глицинового буфера, рН 3,0). Обнаружение фракций антител можно проводить, например, с помощью SDS-PAGE, а затем проводить их объединение. Дальнейшая очистка является необязательной, в зависимости от предполагаемого использования. Антитело можно концентрировать и/или стерильно фильтровать, используя обычные методики. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалять обычными способами, включая эксклюзионную, с гидрофобным взаимодействием, ионообменную, мультимодальную или гидроксиапатитную хроматографию. Чистота антитела после этих стадий хроматографии составляет между от около 95% до около 99%. Продукт можно хранить в холодильнике, незамедлительно замораживать при -70°C или можно лиофилизировать. Аминокислотные SEQ ID NO: для приведенных в качестве примеров антител по данному изобретению показаны ниже.The BTLA agonist antibodies of the present invention can be expressed and purified essentially as follows. An appropriate host cell, such as FIEK 293 or CHO, can be transiently or stably transfected with an expression system for antibody secretion using an optimal predetermined ratio of HC:LC vectors (e.g., 1:3 or 1:2) or a single coding system vector as HC , and LC. The clarified medium into which the antibody is secreted can be purified using any of many commonly used methods. For example, in the case of a Fab fragment, the medium is conveniently applied to a MabSelect column (GE Healthcare) or a KappaSelect column (GE Healthcare) equilibrated with a compatible buffer such as phosphate buffered saline (pH 7.4). The column can be washed to remove nonspecific binding components. The bound antibody can be eluted, for example, by a pH gradient (for example, from 20 mM Tris buffer, pH 7.0, to 10 mM sodium citrate buffer, pH 3.0, or from phosphate buffered saline, pH 7.4, up to 100 mM glycine buffer, pH 3.0). Detection of antibody fractions can be carried out, for example, using SDS-PAGE, and then pooling them. Further cleaning is optional, depending on intended use. The antibody can be concentrated and/or sterile filtered using conventional techniques. Soluble aggregates and multimers can be effectively removed by conventional methods, including size exclusion, hydrophobic interaction, ion exchange, multimodal or hydroxyapatite chromatography. The purity of the antibody after these chromatography steps is between about 95% and about 99%. The product can be stored in the refrigerator, immediately frozen at -70°C or can be lyophilized. Amino acid SEQ ID NO: for exemplary antibodies of this invention are shown below.
Таблица 1 Аминокислотные последовательности приведенных ___________в качестве примеров антител-агонистов BTLA___________Table 1 Amino acid sequences of ___________as examples of BTLA___________ agonist antibodies
Аффинность и кинетика связывания.Binding affinity and kinetics.
Аффинность и кинетику связывания антител-агонистов BTLA по данному изобретению (22В3, 23С8 и 25F7) с BTLA измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием Biacore® 3000 (GE Healthcare). Аффинность связывания измеряют путем иммобилизации BTLA-белка около 120 RU (человека, крысы, мыши (Balbc или C57BL6) или BTLA обезьяны циномолгус) посредством аминного связывания на чипе Biacore® CM5, и протекающего антитела-агониста BTLA, начиная с 500 нМ в 2-кратного серийного разведения до 15,6 нМ. Эксперименты проводят при 25°C в буфере HBSEP (GE Healthcare BR100669; 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4). Для каждого цикла, 250 мкл образца антитела пропускают через ячейку потока 1 и 2 при 50 мкл/мин, а затем диссоциируют в течение 10 мин. Поверхность чипа регенерируют с 5 мкл инъекции глицинового буфера при рН 1,5 при 10 мкл/мл потока. Данные соответствуют модели связывания Ленгмюра 1: 1 для получения kon, kf и для вычисления KD. Следуя процедурам, по существу, как описано выше, были соблюдены следующие параметры (показанные в табл. 2). Данные, представленные ниже, представляют собой среднее из трех экспериментов для человека, цино, крысы и мыши для 22В3.The binding affinity and kinetics of the BTLA agonist antibodies of this invention (22B3, 23C8 and 25F7) to BTLA were measured by surface plasmon resonance using a Biacore® 3000 (GE Healthcare). Binding affinity is measured by immobilizing approximately 120 RU BTLA protein (human, rat, mouse (Balbc or C57BL6) or cynomolgus BTLA) via amine coupling on a Biacore® CM5 chip, and flowing BTLA agonist antibody starting at 500 nM in 2- multiple serial dilution to 15.6 nM. Experiments were performed at 25°C in HBSEP buffer (GE Healthcare BR100669; 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% surfactant P20, pH 7.4). For each cycle, 250 μl of antibody sample is passed through flow cells 1 and 2 at 50 μl/min and then dissociated for 10 min. The chip surface is regenerated with a 5 μL injection of glycine buffer at pH 1.5 at 10 μL/mL flow. The data fit a 1:1 Langmuir coupling model to obtain k on , kf and to calculate K D . Following the procedures essentially as described above, the following parameters (shown in Table 2) were met. The data presented below is the average of three experiments for human, cyno, rat and mouse for 22B3.
- 7 043345- 7 043345
Таблица 2table 2
Аффинность и кинетика связыванияAffinity and binding kinetics
Как показано выше в табл. 2, антитела-агонисты BTLA по данному изобретению связывают BTLA. В частности, антитело 22В3 способно связывать BTLA человека, мыши и макаки циномолгус.As shown in the table above. 2, the BTLA agonist antibodies of the present invention bind BTLA. In particular, antibody 22B3 is able to bind human, mouse and cynomolgus macaque BTLA.
Связывание с первичными клетками.Binding to primary cells.
Способность антител BTLA по данному изобретению (22В3, 23С8 и 25F7) связывать первичные клетки разных видов определяют с помощью FACS. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяют из образца донорской крови (Банк крови Сан-Диего, # LRS-WBC) с использованием пробирок Ficoll (GE # 17-1440-02) и SepMate (STEMCELL # 15450) в соответствии с протоколом производителя. РВМС цино (Worldwide Primates # CA-10) оттаивают после жидкого азота и промывают один раз буфером FACS (таким же, как указано выше).The ability of the BTLA antibodies of this invention (22B3, 23C8 and 25F7) to bind primary cells of different species was determined using FACS. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from a donor blood sample (San Diego Blood Bank, #LRS-WBC) using Ficoll (GE #17-1440-02) and SepMate (STEMCELL #15450) tubes according to the manufacturer's protocol . Cyno PBMCs (Worldwide Primates #CA-10) were thawed after liquid nitrogen and washed once with FACS buffer (same as above).
Селезенки самцов мышей C57BL6 (JAX) или самок крыс Sprague Dawley (Harlan) собирают, объединяют и диссоциируют на суспензии отдельных клеток с использованием клеточного сита и поршня шприца через коническую пробирку объемом 50 мл, промытую RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной теплом FBS и 2 мМ ЭДТА. Клетки осаждают, среду удаляют, и эритроциты лизируют путем ресуспендирования осадка в 2 мл лизирующего буфера ACK (gibco # A10492-01) в течение приблизительно 2 мин перед гашением полной RPMI. Лизированные клетки можно осадить и промыть один раз в буфере FACS (DPBS 1X, содержащий 3% FBS, 20 мМ HEPES и 2 мМ ЭДТА).Spleens from male C57BL6 mice (JAX) or female Sprague Dawley rats (Harlan) were collected, pooled, and dissociated into single cell suspensions using a cell strainer and syringe plunger through a 50 mL conical tube washed with RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated FBS and 2 mM EDTA. Cells are pelleted, medium is removed, and red blood cells are lysed by resuspending the pellet in 2 ml of ACK lysis buffer (gibco #A10492-01) for approximately 2 min before quenching with full RPMI. Lysed cells can be pelleted and washed once in FACS buffer (DPBS 1X containing 3% FBS, 20 mM HEPES and 2 mM EDTA).
Выделенные первичные клетки определяют количественно с использованием счетчика клеток Countess, и ресуспендируют при 2х106 клеток на мл в буфере FACS. Эксперименты с проточной цитометрией проводят в тот же день, что и выделение клеток, с помощью высева 50 мкл (~0,1х106) клеток в 96-луночный планшет (Greiner # 650101). Неспецифическое связывание антител предотвращают добавлением 1 мкл Fc-блокатора (например, из BD # 553142) в течение 15 мин при 4°C без промывания.Isolated primary cells are quantified using a Countess cell counter and resuspended at 2 x 10 6 cells per ml in FACS buffer. Flow cytometry experiments are performed on the same day as cell isolation by seeding 50 μl (~0.1 x 10 6 ) cells into a 96-well plate (Greiner #650101). Nonspecific antibody binding is prevented by adding 1 μl of Fc blocker (eg, from BD #553142) for 15 min at 4°C without washing.
Связывание с антителами BTLA тестируют в различных концентрациях путем серийного разведения в буфере FACS. Например, очищенное антитело и контроли, начиная с разных концентраций, сначала разбавляют до 30 мкг/мл, а серийные разведения 1:3 исходного материала проводят в общей сложности до 10 титрований (плюс необработанный контроль). Титры антител инкубируют с клетками в течение 20 мин при 4°C и промывают буфером FACS до окрашивания. Клетки окрашивают с использованием антител, конъюгированных с флуорохромом, для идентификации конкретных типов клеток (например, CD19 В-клеток, CD4 Т-клеток или CD8 Т-клеток) или с использованием вторичного антитела для выявления наличия или отсутствия связывания антител с этим подмножеством. Окрашивание проводят в течение 20 мин при 4°C и промывают 3 раза буфером FACS перед анализом на проточном цитометре. Результаты анализируют с использованием стандартного программного обеспечения для анализа FACS (например, FACSDiva) и сообщают как среднюю интенсивность флуоресценции вторичного антитела для каждого титрования. Положительный результат, который указывает на связывание, определяется средней интенсивностью флуоресцентного окрашивания выше фона.Binding to BTLA antibodies is tested at various concentrations by serial dilution in FACS buffer. For example, purified antibody and controls, starting at different concentrations, are first diluted to 30 μg/ml, and serial 1:3 dilutions of the starting material are performed for a total of 10 titrations (plus untreated control). Antibody titers were incubated with cells for 20 min at 4°C and washed with FACS buffer prior to staining. Cells are stained using fluorochrome-conjugated antibodies to identify specific cell types (eg, CD19 B cells, CD4 T cells, or CD8 T cells) or using a secondary antibody to detect the presence or absence of antibody binding to that subset. Staining was carried out for 20 min at 4°C and washed 3 times with FACS buffer before analysis on a flow cytometer. Results are analyzed using standard FACS analysis software (e.g., FACSDiva) and reported as the average fluorescence intensity of the secondary antibody for each titration. A positive result, which indicates binding, is determined by the average intensity of fluorescent staining above background.
Следуя процедурам, в основном, как описано выше, антитело 22В3 связывается с BTLA-экспрессирующими клетками человека, обезьяны циномолгус, крысы и мыши, антитело 23С8 связывается с BTLA-экспрессирующими клетками человека и Cynomolgus, a антитело 25F7 связывается сFollowing procedures essentially as described above, antibody 22B3 binds to BTLA-expressing human, cynomolgus, rat and mouse cells, antibody 23C8 binds to BTLA-expressing human and Cynomolgus cells, and antibody 25F7 binds to
- 8 043345- 8 043345
BTLA-экспрессирующими клетками человека, обезьяны циномолгус и мыши.BTLA-expressing cells from humans, cynomolgus monkeys, and mice.
Антитело-агонист BTLA индуцированное фосфорилирование.BTLA agonist antibody-induced phosphorylation.
Для определения способности антител-агонистов BTLA по данному изобретению (22В3 и 25F7) индуцировать фосфорилирование тирозина в линии В-клеток человека антитело BTLA связывают с 24-луночным культуральным планшетом при 10 мкг/мл в течение одного часа при 37°C час. Планшет промывают ФСБ для удаления любого несвязанного антитела. Линию В-клеток, экспрессирующих BTLA человека, такую как Ramos.2G6.4C10 клеточную линию В-лимфоцита человека (АТСС), можно добавлять в лунки при 10x106 клеток/мл и инкубировать при 37°C в течение 30 мин. Клетки удаляют и лизируют в буфере для полного лизиса (MSD) и замораживают при -80°C в течение по меньшей мере 30 мин.To determine the ability of the BTLA agonist antibodies of this invention (22B3 and 25F7) to induce tyrosine phosphorylation in a human B cell line, BTLA antibody was coupled to a 24-well culture plate at 10 μg/ml for one hour at 37°C hour. The plate is washed with PBS to remove any unbound antibody. A B cell line expressing human BTLA, such as the Ramos.2G6.4C10 human B cell line (ATCC), can be added to wells at 10 x 106 cells/ml and incubated at 37°C for 30 minutes. Cells are removed and lysed in complete lysis buffer (MSD) and frozen at -80°C for at least 30 minutes.
Фосфорилированный-BTLA обнаруживают при помощи Meso Sector S 600. Планшеты для определения стрептавидина готовят путем инкубации в блокирующем растворе (MSD) в течение одного часа при комнатной температуре. Биотинилированное антитело для захвата BTLA (5A5) наносят на планшет в течение одного часа при комнатной температуре с последующими тремя или более стадиями триспромывки. Клеточные лизаты инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Общий BTLA детектируют с помощью антитела SULFO-TAG против BTLA (ANC6E9), а фосфорилированный BTLA измеряют с помощью антифосфотриозинового антитела SULFO-TAG (PY20; MSD) с последующими тремя или более этапами трис-промывки. Добавление 2x Read Buffer T (MSD) затем добавляют в лунки непосредственно перед анализом с использованием Meso Sector S 600.Phosphorylated-BTLA is detected using Meso Sector S 600. Streptavidin plates are prepared by incubation in blocking solution (MSD) for one hour at room temperature. Biotinylated BTLA capture antibody (5A5) is applied to the plate for one hour at room temperature, followed by three or more tri-wash steps. Cell lysates are incubated for 2 hours at room temperature. Total BTLA was detected using the anti-BTLA antibody SULFO-TAG (ANC6E9), and phosphorylated BTLA was measured using the antiphosphotriosine antibody SULFO-TAG (PY20; MSD), followed by three or more Tris wash steps. Addition of 2x Read Buffer T (MSD) is then added to the wells immediately prior to analysis using the Meso Sector S 600.
Следуя процедурам, в основном, как описано выше, антитело 22В3 приводило к 2,44-кратному увеличению фосфорилирования тирозина BTLA по сравнению с фоном по сравнению с отрицательным контролем, а антитело 25F7 приводило к 1,47-кратному увеличению фосфорилирования тирозина BTLA по сравнению с фоном по сравнению с отрицательным контролем. Эти данные демонстрируют, что антитела-агонисты BTLA 22B3 и 25F7 способны индуцировать фосфорилирование BTLA в линии В-клеток человека.Following procedures essentially as described above, antibody 22B3 resulted in a 2.44-fold increase in BTLA tyrosine phosphorylation over background compared to negative control, and antibody 25F7 resulted in a 1.47-fold increase in BTLA tyrosine phosphorylation compared to background compared to negative control. These data demonstrate that the BTLA agonist antibodies 22B3 and 25F7 are able to induce BTLA phosphorylation in a human B cell line.
Ингибирование пролиферации первичных В-клеток человека.Inhibition of proliferation of primary human B cells.
Активность антител-агонистов BTLA по данному изобретению in vitro оценивают по способности ингибировать пролиферацию первичных В-клеток человека. Первичные В-клетки человека выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека с использованием набора для выделения В-клеток человека (EasySep) и ресуспендируют в соответствующих средах первичных клеток человека. Анти-IgM наносят на планшеты вместе с титрами изотипического контроля или антителом BTLA и инкубируют в течение одного часа при 37°C с последующей стадией промывки ФСБ. Изолированные человеческие В-клетки добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 72 ч при 37°C с 5% СО2 с последующим импульсом [3Н]-тимидина в течение последних 18 ч. После инкубации планшеты извлекают и помещают на сухой лед на 30 мин, а затем хранят при -20°C до готовности к сбору. Клетки лизируют путем оттаивания и собирают с помощью Harvester 9600 (Tomtec). Пролиферацию оценивают путем измерения включения [3Н]-тимидина с помощью микропланшетного счетчика MicroBeta2 2450 (Perkin Elmer).The in vitro activity of the BTLA agonist antibodies of this invention is assessed by its ability to inhibit the proliferation of primary human B cells. Primary human B cells are isolated from healthy human peripheral blood mononuclear cells using a human B cell isolation kit (EasySep) and resuspended in appropriate primary human cell media. Anti-IgM is applied to the plates along with isotype control titers or BTLA antibody and incubated for one hour at 37°C followed by a wash step with PBS. Isolated human B cells are added to each well and incubated for 72 hours at 37°C with 5% CO 2 followed by a pulse of [ 3 H]-thymidine for the last 18 hours. After incubation, the plates are removed and placed on dry ice for 30 min and then stored at -20°C until ready for harvest. Cells were lysed by thawing and harvested using a Harvester 9600 (Tomtec). Proliferation is assessed by measuring [ 3 H]-thymidine incorporation using a MicroBeta 2 2450 microplate counter (Perkin Elmer).
Подсчеты используются для оценки относительного пролиферативного ответа в этом анализе, а процент ингибирования рассчитывается с использованием уравненияCounts are used to estimate the relative proliferative response in this assay, and percentage inhibition is calculated using Eq.
[% ингибирования=(AVGmaxsignal-signalample)/AVGmaxsignalχ 100], которое можно использовать для определения значения IC50 с помощью графического программного обеспечения (GraphPad Prism).[% inhibition=(AVGmaxsignal-signalample)/AVGmaxsignalχ 100], which can be used to determine the IC 50 value using graphics software (GraphPad Prism).
Следуя процедурам, в основном, как описано выше, антитело-агонист BTLA22B3 было способно ингибировать первичную пролиферацию В-клеток in vitro с рассчитанной IC50 0,32±0,1 нМ, антитело 23С8 было способно ингибировать первичную пролиферацию В-клеток in vitro с рассчитанной IC50 0,14 нМ, и антитело 25F7 было способно ингибировать первичную пролиферацию В-клеток in vitro с рассчитанной IC50 0,17 нМ. В аналогичном эксперименте антитело 22В3 было способно ингибировать первичную пролиферацию В-клеток с рассчитанной IC50 0,32 нМ, и антитело, имеющее тот же HCVR и LCVR, что и Mab8D5 (SEQ ID NO: 11 и 18 в патенте '694 соответственно) ингибировало первичную пролиферацию Вклеток с рассчитанной IC50 6,38 нМ. Эти данные демонстрируют, что антитела-агонисты BTLA 22B3, 23С8 и 25F7 способны ингибировать пролиферацию В-клеток in vitro, и что антитело 22В3 обладает большей активностью in vitro по сравнению с Mab8D5.Following the procedures essentially as described above, the agonist antibody BTLA22B3 was able to inhibit primary B cell proliferation in vitro with a calculated IC 50 of 0.32 ± 0.1 nM, antibody 23C8 was able to inhibit primary B cell proliferation in vitro with a calculated IC 50 of 0.14 nM, and antibody 25F7 was able to inhibit primary B cell proliferation in vitro with a calculated IC 50 of 0.17 nM. In a similar experiment, antibody 22B3 was able to inhibit primary B cell proliferation with a calculated IC 50 of 0.32 nM, and an antibody having the same HCVR and LCVR as Mab8D5 (SEQ ID NOs: 11 and 18 in the '694 patent, respectively) inhibited primary proliferation of B cells with a calculated IC 50 of 6.38 nM. These data demonstrate that the BTLA agonist antibodies 22B3, 23C8 and 25F7 are able to inhibit B cell proliferation in vitro, and that antibody 22B3 has greater activity in vitro compared to Mab8D5.
Гуманизированная NSG модель мыши GvHD.Humanized NSG GvHD mouse model.
Предотвращение заболевания трансплантат против хозяина, вызванного РВМС человека, определяется in vivo.Prevention of graft-versus-host disease caused by human PBMC is determined in vivo.
Вкратце, самок мышей NSG (JAX Labs, Stock # 05557), возрастом приблизительно 8-10 недель, нормализуют и делят на группы лечения (n=8 мышей на группу лечения) на основании базовых измерений массы тела. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из программы доноров крови (Банк крови Сан-Диего, # LRS-WBC) с использованием пробирок Ficoll (GE # 17-1440-02) и SepMate (STEMCELL # 15450) в соответствии с протоколом производителя. РВМС ресуспендируют в количестве примерно 150x106 клеток на мл ФСБ. Группы лечения ослеплены по отношению к дозироваBriefly, female NSG mice (JAX Labs, Stock #05557), approximately 8-10 weeks old, were normalized and divided into treatment groups (n=8 mice per treatment group) based on baseline body weight measurements. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the blood donor program (San Diego Blood Bank, #LRS-WBC) using Ficoll (GE #17-1440-02) and SepMate (STEMCELL #15450) tubes according to the manufacturer's protocol. PBMCs are resuspended at approximately 150 x 106 cells per ml of PBS. Treatment groups were blinded to dosage
- 9 043345 нию.- 9 043345 nu.
В день 1 100 мкл (15х106 клеток) РВМС, суспендированных в ФСБ (как описано выше) (или 100 мкл ФСБ для не приживленных контролей), вводят внутривенно (в/в) в хвост каждой мыши. Мышам еженедельно (QW) вводят антитело по данному изобретению (22В3 или 23С8) или контроли в различных концентрациях в носителе ФСБ путем подкожных (п/к) инъекций. Три независимых исследования выполняются по существу, как описано в данном документе. Дозирующие концентрации для каждого исследования составляют [исследование 1 (антитело 22В3): 0,1, 1,0, 5,0, 10,0 и 20,0 мг/кг; исследование 2 (антитело 22В3 или 23С8): 0,001, 0,01, 10,0 и 100 мпк; и исследование 3: 0,001, 0,005, 0,01, 0,1, 0,5 и 1,0 мпк].On day 1, 100 μl (15 x 10 6 cells) of PBMC suspended in PBS (as described above) (or 100 μl PBS for non-engrafted controls) was injected intravenously (iv) into the tail of each mouse. Mice are administered weekly (QW) with the antibody of this invention (22B3 or 23C8) or controls at various concentrations in PBS vehicle by subcutaneous (SC) injection. Three independent studies are performed essentially as described herein. The dosing concentrations for each study are [study 1 (antibody 22B3): 0.1, 1.0, 5.0, 10.0 and 20.0 mg/kg; study 2 (antibody 22B3 or 23C8): 0.001, 0.01, 10.0 and 100 mpc; and Study 3: 0.001, 0.005, 0.01, 0.1, 0.5 and 1.0 mpc].
Исследование прекращают, и мышей умерщвляют до того, как животные изотипического контроля теряют 20% от исходной массы тела (исследования 1 и 2) или день 28 (исследование 3). Массу записывают (исследование 1 и исследование 2), сыворотку собирают для анализа цитокинов (исследование 1; анализ проводят с помощью MSD ИФА; анализируются цитокины ФНОа, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ12р70, ИЛ-13, ИЛ-2 и ИЛ-8) и селезенки собирают для фенотипирования/фармакодинамического анализа (измеренного по уменьшению популяции CD 8 Т-клеток; исследование 1 и исследование 3).The study is stopped and mice are sacrificed before isotype control animals have lost 20% of their initial body weight (studies 1 and 2) or day 28 (study 3). The mass is recorded (Study 1 and Study 2), the serum is collected for cytokine analysis (Study 1; analysis is carried out using MSD ELISA; the cytokines analyzed are TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4, IL12p70, IL-13, IL- 2 and IL-8) and spleens were collected for phenotyping/pharmacodynamic analysis (measured by CD 8 T cell population reduction; Study 1 and Study 3).
Следуя процедурам, по существу, как описано выше, были получены следующие данные.Following procedures essentially as described above, the following data were obtained.
Животные, обработанные антителом 22В3 в исследовании 1, продемонстрировали следующее (в дозах 0,1, 1,0, 5,0, 10,0 или 20,0 мг/кг антитела):Animals treated with 22B3 antibody in Study 1 demonstrated the following (at doses of 0.1, 1.0, 5.0, 10.0 or 20.0 mg/kg antibody):
(i) схожую массу тела в конце исследования по сравнению с массой тела контрольных животных без трансплантации;(i) similar body weight at the end of the study compared with the body weight of control animals without transplantation;
(ii) снижение цитокинов ФНОа, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-4 и ИЛ-12р70 по сравнению с животными изотипического контроля; и (iii) снижение популяции CD8 Т-клеток по сравнению с животными изотипического контроля (фенотипирование/фармакодинамический анализ).(ii) a decrease in the cytokines TNFa, IL-10, IL-6, IL-4 and IL-12p70 compared to isotype control animals; and (iii) reduction in CD8 T cell population compared to isotype control animals (phenotyping/pharmacodynamic analysis).
Данные исследования 2 демонстрируют, что мыши, получавшие 0,01 мг/кг антитела 22В3, или 1,0, 5,0 или 10,0 мг/кг антитела 23С8, имели сходные массы тела в конце исследования по сравнению с массами тела контрольных животных без трансплантации. Исследование 2 не продемонстрировало активность 22В3 в отношении массы тела при 10,0 мг/кг, что может отражать естественную изменчивость доноров этой модели. В исследовании 3 антитело 22В3 продемонстрировало фармакодинамическую активность in vivo при следующих дозах антитела: 0,01, 0,1, 0,5 и 1,0 мг/кг. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что антитело 22В3 и антитело 23С8 были эффективными в предотвращении GvHD in vivo.Data from Study 2 demonstrate that mice treated with 0.01 mg/kg 22B3 antibody, or 1.0, 5.0, or 10.0 mg/kg 23C8 antibody had similar body weights at the end of the study compared to control animals. without transplantation. Study 2 did not demonstrate 22B3 activity on body weight at 10.0 mg/kg, which may reflect natural donor variability in this model. In Study 3, antibody 22B3 demonstrated pharmacodynamic activity in vivo at the following antibody doses: 0.01, 0.1, 0.5 and 1.0 mg/kg. Taken together, these data demonstrate that antibody 22B3 and antibody 23C8 were effective in preventing GvHD in vivo.
MIFNa-индуцированный волчаночный нефрит.MIFNa-induced lupus nephritis.
Модель интерферона-альфа (ИФНа)-индуцированного волчаночного нефрита представляет собой мышиную модель системной красной волчанки (СКВ), в которой ИФНа используется для синхронизации начала и ускорения прогрессирования заболевания при скрещивании с новозеландским черным и новозеландским белым (NZB/W) мышами. Мышиная модель NZB/W является классической моделью спонтанного волчаночного нефрита. Прогрессирование заболевания у этих мышей может быть ускорено с помощью экзогенного введения ИФНа с использованием аденовирусных векторов. Эта модель волчаночного нефрита используется для демонстрации активности антител-агонистов BTLA по данному изобретению.The interferon-alpha (IFNa)-induced lupus nephritis model is a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE) in which IFNa is used to synchronize the onset and accelerate disease progression when crossed with New Zealand black and New Zealand white (NZB/W) mice. The NZB/W mouse model is a classic model of spontaneous lupus nephritis. Disease progression in these mice can be accelerated by exogenous administration of IFN using adenoviral vectors. This lupus nephritis model is used to demonstrate the activity of the BTLA agonist antibodies of the present invention.
За один день до начала исследования одиннадцатинедельных самок мышей NZB/W сортируют случайным образом в зависимости от массы тела. Мышей распределяют по следующим группам лечения:One day before the start of the study, eleven-week-old female NZB/W mice were randomly sorted based on body weight. Mice are assigned to the following treatment groups:
(1) аденоассоциированный вирус LacZ (AAV+10 мг/кг РАА изотипического контроля человеческого IgG4 (РАА представляет собой мутации S228P, F234A и L235A);(1) adeno-associated virus LacZ (AAV+10 mg/kg PAA isotype control human IgG4 (PAA represents mutations S228P, F234A and L235A);
(2) ИФНа AAV+10 мг/кг РАА изотипического контроля человеческого IgG4;(2) IFNa AAV + 10 mg/kg PAA isotype control human IgG4;
(3) ИФНа AAV+3 мг/кг 22В3 антитела;(3) IFNa AAV + 3 mg/kg 22B3 antibodies;
(4) ИФНа AAV+10 мг/кг 22В3 антитела; или (5) ИФНа AAV+50 мг/кг циклофосфамида.(4) IFNa AAV + 10 mg/kg 22B3 antibodies; or (5) IFNa AAV + 50 mg/kg cyclophosphamide.
В день начала исследования (день 0) мышам вводят один раз 1011 копий генома (GC) AAV, экспрессирующего ген LacZ (не больного), или мышиный ИФНа (больного) в ФСБ внутривенно. В группах 1-4 мыши получали изотипический контроль или антитела к антителу 22В3 в ФСБ подкожно один раз в неделю, начиная с дня 0. В группе 5 мыши получали циклофосфамид в ФСБ внутрибрюшинно каждые 10 дней. Образцы мочи отбирают у мышей каждые 2 недели до окончания исследования через 6 недель после начала лечения. ИФА для мышиного микроальбумина Kamiya Biomedical™ используют для количественного определения уровня альбумина в моче. Креатинин мочи измеряется с помощью ферментативного анализа креатинина (Roche Diagnostics). Альбуминурия, биомаркер почечной функции, определяется как более чем 300 мкг альбумина на мг креатинина, обнаруженного в моче.On the day the study began (day 0), mice were injected once with 10 11 genome copies (GC) of AAV expressing the LacZ gene (non-patient) or mouse IFNa (patient) in PBS intravenously. In groups 1-4, mice received isotype control or anti-22B3 antibodies in PBS subcutaneously once a week, starting on day 0. In group 5, mice received cyclophosphamide in PBS intraperitoneally every 10 days. Urine samples were collected from mice every 2 weeks until the end of the study 6 weeks after the start of treatment. The Kamiya Biomedical™ Mouse Microalbumin ELISA is used to quantify albumin levels in urine. Urine creatinine is measured using the enzymatic creatinine assay (Roche Diagnostics). Albuminuria, a biomarker of renal function, is defined as more than 300 mcg of albumin per mg of creatinine found in urine.
Следуя процедурам, в основном, как описано выше, к 4-й неделе заболеваемость альбуминурией в группе с болезнью, получавшей изотип (ИФНа AAV+hIgG4 РАА), достигла 100% и оставалась повышенной до конца исследования, в то время как мыши, не обработанные LacZ AAV (не больные), не проявляли каких-либо случаев альбуминурии. Циклофосфамид, который может быть остро нефротоксичным, вызывал кратковременное увеличение альбуминурии у больных мышей, но частота альбуминурии вFollowing procedures essentially as described above, by week 4 the incidence of albuminuria in the disease isotype-treated group (IFNa AAV+hIgG4 PAA) reached 100% and remained elevated until the end of the study, while untreated mice LacZ AAV (non-patients) did not exhibit any cases of albuminuria. Cyclophosphamide, which can be acutely nephrotoxic, caused a transient increase in albuminuria in affected mice, but the incidence of albuminuria in
- 10 043345 группе циклофосфамида была снижена до нуля к концу исследования. Антитело 22В3 в дозе 3 и 10 мг/кг было в состоянии снизить заболеваемость альбуминурией до 50 и 20% соответственно на 28-й день и на и 70% соответственно на 42-й день. Эти результаты показали, что антитело 22В3 способно сохранять почечную функцию в модели.- 10 043345 in the cyclophosphamide group was reduced to zero at the end of the study. Antibody 22B3 at a dose of 3 and 10 mg/kg was able to reduce the incidence of albuminuria to 50 and 20%, respectively, on day 28, and by 70%, respectively, on day 42. These results indicated that the 22B3 antibody was able to preserve renal function in the model.
График Каплана-Мейера (данные не показаны) процентной выживаемости во время исследования показал, что почечная недостаточность в группе лечения, получавшей изотип, приводила к смерти, начиная с 28-го дня. К концу исследования выживаемость в группе лечения, получавшей изотип, составляла 60%. Не больные и получавшие циклофосфамид группы имели 100% выживаемость. Мыши, получавшие 10 мг/кг антитела 22В3, также показали 100% выживаемость в конце исследования, тогда как мыши, получавшие 3 мг/кг, показали 80% выживаемость. Эти результаты показали, что антитело 22В3 способно предотвратить смертельные исходы, связанные с заболеванием, в этой модели.A Kaplan-Meier plot (data not shown) of percent survival during the study showed that renal failure in the isotype treatment group resulted in death beginning at day 28. At the end of the study, survival in the isotype treatment group was 60%. The non-patient and cyclophosphamide-treated groups had 100% survival. Mice treated with 10 mg/kg of 22B3 antibody also showed 100% survival at the end of the study, while mice treated with 3 mg/kg showed 80% survival. These results indicated that the 22B3 antibody was able to prevent disease-related deaths in this model.
Имиквимод-индуцированная модель псориаза.Imiquimod-induced psoriasis model.
Протестирована способность антитела по данному изобретению ограничивать тяжесть псориазоподобного дерматита, индуцированного применением агониста TLR7/8 имиквимода (IMQ). Семинедельным самкам мышей B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (инвентарный номер JAX: 002014) или мышей HVEM’/’ (описано в Wang et al., J. Clin. Invest., 115:3, 711-717, March 2005) внутрибрюшинно вводят 3 или 1 мг/кг антитела 22В3 или антитела 25F7, соответственно, в день 0, и спины мышей выбривают. Животные, которым вводили изотипический контроль hIgG4, служили в качестве контроля. В дни 1-3 мышей анестезируют ингаляционным изофлюраном (VetOne), а затем наносят 5% крем IMQ (50 мг, Fougera) на определенную область выбритой кожи. На 4-й день обработанный участок кожи иссекают и анализируют на предмет тяжести заболевания и экспрессии генов, связанных с воспалением.The ability of the antibody of this invention to limit the severity of psoriasis-like dermatitis induced by the TLR7/8 agonist imiquimod (IMQ) was tested. Seven-week-old female B6.SJL-Ptprc a Pepc b /BoyJ mice (JAX accession number: 002014) or HVEM'/' mice (described in Wang et al., J. Clin. Invest., 115:3, 711-717, March 2005) 3 or 1 mg/kg of 22B3 antibody or 25F7 antibody, respectively, were injected intraperitoneally on day 0, and the backs of the mice were shaved. Animals injected with the hIgG4 isotype control served as controls. On days 1–3, mice are anesthetized with inhaled isoflurane (VetOne) and then 5% IMQ cream (50 mg, Fougera) is applied to a defined area of shaved skin. On day 4, the treated skin area is excised and analyzed for disease severity and inflammation-related gene expression.
Следуя процедурам, в основном, как описано выше, гистологический анализ продемонстрировал утолщение эпидермального слоя с паракератозом и гиперкератозом в группах, обработанных изотипическим контролем hIgG4 или антителом 22В3 1 мг/кг. У мышей, получавших 3 мг/кг антитела 22В3 или 3 мг/кг антитела 25F7, наблюдалось значительное уменьшение толщины эпидермиса, при этом некоторые участки выглядели гистологически нормальными. Экспрессию генов в коже анализировали с помощью кПЦР с использованием iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). У мышей, получавших 3 мг/кг антитела 22В3, наблюдалось значительное снижение экспрессии ИФН типа I (ИФНа, ИФНв) и ИФНу, а также генов ИФН-ответа (Isg15, Mx1, Mx2, Oas2). Анализ цитокинов, участвующих в установлении IMQ-индуцированного дерматита, также продемонстрировал значительное снижение экспрессии ИЛ-22 и ИЛ-23 в группе лечения антителом 22В3 3 мг/кг. Эти данные демонстрируют, что антителаагонисты BTLA 22B3 и 25F7 способны уменьшать толщину эпидермиса в мышиной модели псориазоподобного дерматита.Following procedures essentially as described above, histological analysis demonstrated thickening of the epidermal layer with parakeratosis and hyperkeratosis in groups treated with hIgG4 isotype control or 1 mg/kg 22B3 antibody. Mice treated with 3 mg/kg 22B3 or 3 mg/kg 25F7 showed a significant reduction in epidermal thickness, with some areas appearing histologically normal. Skin gene expression was analyzed by qPCR using iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). In mice treated with 3 mg/kg antibody 22B3, there was a significant decrease in the expression of type I IFN (IFNa, IFNb) and IFNu, as well as IFN response genes (Isg15, Mx1, Mx2, Oas2). Analysis of cytokines involved in the establishment of IMQ-induced dermatitis also demonstrated a significant decrease in the expression of IL-22 and IL-23 in the 22B3 3 mg/kg antibody treatment group. These data demonstrate that the BTLA agonist antibodies 22B3 and 25F7 are able to reduce epidermal thickness in a mouse model of psoriasis-like dermatitis.
Определение эпитопа.Epitope determination.
Функциональные эпитопы антител-агонистов BTLA по данному изобретению определяют с помощью ИФА, а структурные эпитопы определяют с помощью рентгеновской кристаллографии.Functional epitopes of the BTLA agonist antibodies of this invention are determined by ELISA, and structural epitopes are determined by X-ray crystallography.
Методы.Methods.
ИФА: функциональный эпитоп.ELISA: functional epitope.
Следующий набор поверхностных мутаций BTLA был введен индивидуально в человеческий белок BTLA, слитый с (человеческим) Fc: D35R, Q37R, Y39E, R42D, Q43A, E45R, S47H, L49R, D52R, E55R, E57R, D84R, N65R, Н68А, V80R, K81E, E83R, S88H, K90H, Е91Н, I95R, Е103Н, L106R, N108R, R114V, S121Y, N122R, Е125Н, Н127Е, T130R, Y132R и Т134Н.The following set of BTLA surface mutations were introduced individually into the human BTLA protein fused to a (human) Fc: D35R, Q37R, Y39E, R42D, Q43A, E45R, S47H, L49R, D52R, E55R, E57R, D84R, N65R, H68A, V80R, K81E, E83R, S88H, K90H, E91H, I95R, E103H, L106R, N108R, R114V, S121Y, N122R, E125H, H127E, T130R, Y132R and T134H.
Связывание 22В3 и 23С8 определяли с использованием ИФА, в котором антитело для картирования эпитопа захватывали иммобилизованным антителом против кролика и после промывки каждого мутанта BTLA инкубировали в виде 4-точечной 4-кратной серии разведений с захваченным антителом и детектировали с ферментом связанным с античеловеческим Fc реагентом. Полученный сигнал сравнивали среди антител и контрольных антител. Функциональный эпитоп обычно указывал на себя резким снижением сигнала для одного или двух мутантов. Для антитела 25F7 проводили сэндвич-ИФА, в котором гуманизированный 22В3 был иммобилизован, мутанты BTLA были захвачены и связаны кроличьим 25F7. Это дало намного более сильный сигнал, и эпитоп 25F7 мог быть идентифицирован после удаления эпитопа 22В3.Binding of 22B3 and 23C8 was determined using an ELISA in which the epitope mapping antibody was captured with immobilized anti-rabbit antibody and, after washing each mutant with BTLA, incubated as a 4-point 4-fold dilution series with the captured antibody and detected with enzyme-linked anti-human Fc reagent. The resulting signal was compared among antibodies and control antibodies. A functional epitope was usually indicated by a sharp decrease in signal for one or two mutants. For the 25F7 antibody, a sandwich ELISA was performed in which humanized 22B3 was immobilized and BTLA mutants were captured and bound by rabbit 25F7. This gave a much stronger signal and the 25F7 epitope could be identified after removal of the 22B3 epitope.
Рентгеновская кристаллография: структурный эпитоп.X-ray crystallography: structural epitope.
Чтобы определить взаимодействующие интерфейсы и, следовательно, физический эпитоп на BTLA различных антител, человеческий BTLA совместно кристаллизовали с Fab-частью антитела по данному изобретению и определяли кристаллическую структуру. Из полученной кристаллической структуры остатки BTLA в пределах 4,5 А от любого атома антитела были подсчитаны как часть эпитопа (с использованием программного обеспечения Pymol для визуализации). 4,5 А измеряется от центра атома до центра атома. Любой остаток по меньшей мере с одним атомом, который на 4,5 А близок к любому атому в антителе, является частью эпитопа.To determine the interacting interfaces and therefore the physical epitope on the BTLA of various antibodies, human BTLA was co-crystallized with the Fab portion of the antibody of the present invention and the crystal structure was determined. From the resulting crystal structure, BTLA residues within 4.5 A of any antibody atom were counted as part of the epitope (using Pymol visualization software). 4.5 A is measured from the center of the atom to the center of the atom. Any residue with at least one atom that is 4.5 A close to any atom in the antibody is part of an epitope.
Две структуры 22В3 были определены в комплексе с BTLA человека. В первой использовалось исходное кроличье антитело 22В3 Fab, меченное гистидином и очищенное мутантом S47H (стабилизиTwo structures of 22B3 have been determined in complex with human BTLA. The first used the original rabbit antibody 22B3 Fab, labeled with histidine and purified by the S47H mutant (stabilized
- 11 043345 рующая мутация) человеческого BTLA, экспрессированного в виде слияния Fc, а затем расщепленного и очищенного. Эти два белка были смешаны в приблизительно эквимолярном соотношении и скринированы на коммерчески доступных экранах для кристаллизации. Кристаллы были получены и дифракционные данные были собраны в Advanced Photon Source. Эти данные были уменьшены и решены путем молекулярной замены и уточнены, чтобы получить структуру комплекса с высоким разрешением между 22В3 и BTLA. Второй комплекс находился между аффинно-зрелой версией (с мутациями НС I56Q/T57H/G98A и LC S95H) гуманизированного 22В3 (Fab-часть) и BTLA человека. Они были совместно экспрессированы, очищены как комплекс и подвергнуты аналогичному скринингу. Полученная структура и эпитоп были аналогичны первой структуре.- 11 043345 disruptive mutation) human BTLA expressed as an Fc fusion and then cleaved and purified. The two proteins were mixed in approximately equimolar ratios and screened on commercially available crystallization screens. Crystals were obtained and diffraction data were collected at the Advanced Photon Source. These data were reduced and solved by molecular replacement and refined to obtain a high-resolution structure of the complex between 22B3 and BTLA. The second complex was located between the affinity-mature version (with mutations HC I56Q/T57H/G98A and LC S95H) of humanized 22B3 (Fab part) and human BTLA. They were coexpressed, purified as a complex, and similarly screened. The resulting structure and epitope were similar to the first structure.
Структура 23С8 в комплексе была получена так же, как и первый комплекс 22В3, а именно путем очистки His-меченого исходного Fab кролика, смешивания с мономерным S47H человеческого BTLA и кристаллизации.The structure of 23C8 in the complex was obtained in the same way as the first complex 22B3, namely by purifying the His-tagged rabbit Fab parent, mixing with monomeric S47H human BTLA and crystallization.
Структура 25F7 в комплексе с BTLA человека была получена в соответствии со вторым комплексом 22В3, а именно путем совместной экспрессии, совместной очистки и кристаллизации. Был использован двойной мутант гуманизированного 25F7 с улучшенным связыванием с человеческим BTLA (гуманизированный 25F7, используемый для определения эпитопа, имеет мутации в НС S30W/LC E27R).The structure of 25F7 in complex with human BTLA was obtained according to the second complex 22B3, namely by coexpression, copurification and crystallization. A double mutant of humanized 25F7 with improved binding to human BTLA was used (the humanized 25F7 used for epitope determination has mutations in the S30W/LC E27R HC).
Результаты.Results.
Антитело 22В3. Среди ряда поверхностных мутантов BTLA, R42D и Н127Е оказали значительное негативное влияние на связывание с антителом 22В3 кролика (содержащее те же CDR, что и 22В3, но с каркасом кролика). Функциональный эпитоп содержит Arg в положении 42 и His в положении 127 BTLA человека (SEQ ID NO: 31). Остатки BTLA, которые находятся в пределах 4,5 А от 22В3 в комплексе кристаллической структуры между BTLA человека и Fab 22B3 кролика, и являются структурным эпитопом, представляют собой следующие остатки SEQ ID NO: 31. Asp в положении 35, Gln в положении 37 до Arg в положении 42, Leu в положении 74, Gly в положении 76 до Cys в положении 79, Arg в положении 114, Phe в положении 119, Gln в положении 120 и Asn в положении 122 до Ser в положении 128. Остатки BTLA, которые находятся в пределах 4,5 А от 22В3 в комплексе кристаллической структуры между BTLA человека и вариантом 22В3 человека (НС I56Q/T57H/G98A LC S95H), представляют собой Asp в положении 35, Gln в положении 37 и Arg в положении 42, Leu в положении 74, Gly в положении 76 и Cys в положении 79, Arg в положении 114, Phe в положении 119, Gln в положении 120, Asn в положении 122, и Ile в положении 124 до Ser в положении 128 SEQ ID NO: 31.Antibody 22B3. Among a number of surface mutants, BTLA, R42D and H127E had a significant negative effect on binding to the rabbit 22B3 antibody (containing the same CDRs as 22B3, but with a rabbit scaffold). The functional epitope contains Arg at position 42 and His at position 127 of human BTLA (SEQ ID NO: 31). The BTLA residues that are within 4.5 A of 22B3 in the crystal structure complex between human BTLA and rabbit Fab 22B3 and are the structural epitope are the following residues SEQ ID NO: 31. Asp at position 35, Gln at position 37 to Arg at position 42, Leu at position 74, Gly at position 76 to Cys at position 79, Arg at position 114, Phe at position 119, Gln at position 120 and Asn at position 122 to Ser at position 128. BTLA residues that are within 4.5 A of 22B3 in the crystal structure complex between human BTLA and human 22B3 variant (HC I56Q/T57H/G98A LC S95H), are Asp at position 35, Gln at position 37 and Arg at position 42, Leu at position 74, Gly at position 76 and Cys at position 79, Arg at position 114, Phe at position 119, Gln at position 120, Asn at position 122, and Ile at position 124 to Ser at position 128 SEQ ID NO: 31.
В аналогичном исследовании структурным эпитопом для связывания HVEM с BTLA были следующие аминокислоты BTLA: Gln в положении 37 до Arg в положении 42, Leu в положении 74, Gly в положении 76, Thr в положении 77, Ser в положении 112, Arg в положении 114, Asn в положении 118, Ser в положении 121 до Ser в положении 128, и Thr в положении 130. Структурное сходство между антителом 22В3 и HVEM оценивали путем наложения кристаллической структуры антитело:ВТЕА на кристаллическую структуру HVEM:BTLA, выравнивая молекулы BTLA. Среднеквадратичное отклонение остова в участке HVEM, содержащем аминокислотные остатки 69-72 и соответствующем участке антитела, было определено как 1,4 А.In a similar study, the structural epitope for HVEM binding to BTLA was the following BTLA amino acids: Gln at position 37 to Arg at position 42, Leu at position 74, Gly at position 76, Thr at position 77, Ser at position 112, Arg at position 114, Asn at position 118, Ser at position 121 to Ser at position 128, and Thr at position 130. Structural similarity between antibody 22B3 and HVEM was assessed by superimposing the antibody:BTEA crystal structure onto the HVEM:BTLA crystal structure, aligning the BTLA molecules. The standard deviation of the backbone in the HVEM region containing amino acid residues 69-72 and the corresponding region of the antibody was determined to be 1.4 A.
Антитело 23С8. D52R блокирует связывание 23С8 кролика (содержащего тот же HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 и LCDR2, что и 23С8, имеющий LCDR3 QCTYGGVVGSTSDDNP и имеющий каркас кролика) с человеческим BTLA в ИФА. Функциональный эпитоп содержит Asp в положении 52 BTLA человека (SEQ ID NO: 31). Остатки BTLA, которые находятся в пределах 4,5 А от 23С8 в комплексе кристаллической структуры между BTLA человека (S47H) и Fab 23C8 кролика, и является структурным эпитопом, представляют собой His в положении 46 до Glu в положении 55, Glu в положении 103, Pro в положении 104, Leu в положении 106, Pro в положении 107, Thr в положении 134 до Ala в положении 139 SEQ ID NO: 31. Антитело 23С8 не имитирует связывание HVEM.Antibody 23C8. D52R blocks the binding of rabbit 23C8 (containing the same HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 and LCDR2 as 23C8, which has LCDR3 QCTYGGVVGSTSDDNP and has a rabbit scaffold) to human BTLA in an ELISA. The functional epitope contains Asp at position 52 of human BTLA (SEQ ID NO: 31). The BTLA residues that are within 4.5 A of 23C8 in the crystal structure complex between human BTLA (S47H) and rabbit Fab 23C8, and is the structural epitope, are His at position 46 to Glu at position 55, Glu at position 103, Pro at position 104, Leu at position 106, Pro at position 107, Thr at position 134 to Ala at position 139 SEQ ID NO: 31. Antibody 23C8 does not mimic HVEM binding.
Антитело 25F7. Среди ряда поверхностных мутантов BTLA, H68A и K61E оказали значительное негативное влияние на связывание с антителом 25F7 кролика (содержащее те же CDR, что и 25F7, но с каркасом кролика). Функциональный эпитоп содержит His в положении 68 и Lys в положении 81 BTLA человека (SEQ ID NO: 31). Остатки BTLA, которые находятся в пределах 4,5 А от 25F7 в комплексе кристаллической структуры между BTLA человека и вариантом Fab гуманизированного 25F7 (НС S30W, LC E27R), и является структурным эпитопом, представляют собой Tyr в положении 62, Ala в положении 64 до His в положении 68, Arg в положении 85 до Glu в положении 91, Phe в положении 98 и Asn в положении 118 SEQ ID NO: 31. Антитело 25F7 не имитирует связывание HVEM.Antibody 25F7. Among a number of surface mutants, BTLA, H68A and K61E had a significant negative effect on binding to the rabbit 25F7 antibody (containing the same CDRs as 25F7, but with a rabbit scaffold). The functional epitope contains His at position 68 and Lys at position 81 of human BTLA (SEQ ID NO: 31). The BTLA residues that are within 4.5 A of 25F7 in the crystal structure complex between human BTLA and the humanized 25F7 Fab variant (HC S30W, LC E27R), and is the structural epitope, are Tyr at position 62, Ala at position 64 to His at position 68, Arg at position 85 to Glu at position 91, Phe at position 98, and Asn at position 118 SEQ ID NO: 31. Antibody 25F7 does not mimic HVEM binding.
- 12 043345- 12 043345
Последовательности.Sequences.
НС антитела 22ВЗ (SEQ ID NO: 1)NS antibody 22VZ (SEQ ID NO: 1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYY ASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYY ASWAKSRVTMTRDTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC антитела 22B3 (SEQ ID NO: 2)LC Antibody 22B3 (SEQ ID NO: 2)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYSSSNLDNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGECEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYSSSNLDNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHK V YACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
HCVR антитела 22B3 (SEQ ID NO: 3)HCVR Antibody 22B3 (SEQ ID NO: 3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYY ASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTL VTVSSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYY ASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTL VTVSS
LCVR антитела 22B3 (SEQ ID NO: 4)LCVR Antibody 22B3 (SEQ ID NO: 4)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQQGYS S SNLDNVFGGGTKVEIKEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYYCQQGYS S SNLDNVFGGGTKVEIK
НС антитела 23C8 (SEQ ID NO: 5)HC antibody 23C8 (SEQ ID NO: 5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYA SRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYA SRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG
LC антитела 23C8 (SEQ ID NO: 6)LC Antibody 23C8 (SEQ ID NO: 6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRF SSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF
- 13 043345- 13 043345
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGECPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKAD YEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
HCVR антитела 23C8 (SEQ ID NO: 7)HCVR antibody 23C8 (SEQ ID NO: 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYA SRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYA SRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSS
LCVR антитела 23C8 (SEQ ID NO: 8)LCVR antibody 23C8 (SEQ ID NO: 8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIKDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRF SSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIK
НС антитела 25F7 (SEQ ID NO: 9)HC antibody 25F7 (SEQ ID NO: 9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDDGTTYY ATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDDGTTYY ATWAKGRVTMTRDTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC антитела 25F7 (SEQ ID NO: 10)LC Antibody 25F7 (SEQ ID NO: 10)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS К AD YEKHK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGECDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRF SSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS TO AD YEK HK VYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
HCVR антитела 25F7 (SEQ ID NO: 11)HCVR antibody 25F7 (SEQ ID NO: 11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDDGTTYY ATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLV TVSSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDGTTYY ATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLV TVSS
LCVR антитела 25F7 (SEQ ID NO: 12)LCVR Antibody 25F7 (SEQ ID NO: 12)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIKDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRF SSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIK
HCDR1 антитела 22B3 (SEQ ID NO: 13)HCDR1 antibody 22B3 (SEQ ID NO: 13)
GFSLSSYGVSGFSLSSYGVS
HCDR1 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 14)HCDR1 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 14)
GFDISKYNIQGFDISKYNIQ
HCDR1 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 15)HCDR1 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 15)
GFSLSTYAMNGFSLSTYAMN
- 14 043345- 14 043345
HCDR2 антитела 22ВЗ (SEQ ID NO: 16)HCDR2 antibody 22ВЗ (SEQ ID NO: 16)
AISYDGITYYASWAKSAISYDGITYYASWAKS
HCDR2 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 17)HCDR2 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 17)
FINYGGSAYYASRAKGFINYGGSAYYASRAKG
HCDR2 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 18)HCDR2 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 18)
IISDDGTTYYATWAKGIISDDGTTYYATWAKG
HCDR3 антитела 22B3 (SEQ ID NO: 19)HCDR3 antibody 22B3 (SEQ ID NO: 19)
GDYYDDYVYVYALDIGDYYDDYVYVYALDI
HCDR3 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 20)HCDR3 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 20)
GLSNSDLGLSNSDL
HCDR3 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 21)HCDR3 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 21)
DAGAGGVQDYLTLDAGAGGVQDYLTL
LCDR1 антитела 22B3 (SEQ ID NO: 22)LCDR1 antibody 22B3 (SEQ ID NO: 22)
QASQSISTALAQASQSISTALA
LCDR1 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 23)LCDR1 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 23)
QASQSISSWLSQASQSISSWLS
LCDR1 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 24)LCDR1 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 24)
QASENIYNFLAQASENIYNFLA
LCDR2 антитела 22B3 (SEQ ID NO: 25)LCDR2 antibody 22B3 (SEQ ID NO: 25)
AASTLASAASTLAS
LCDR2 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 26)LCDR2 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 26)
RASTLASRASTLAS
LCDR2 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 27)LCDR2 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 27)
SASTLASSASTLAS
LCDR3 антитела 22B3 (SEQ ID NO: 28)LCDR3 antibody 22B3 (SEQ ID NO: 28)
QQGYSSSNLDNVQQGYSSSNLDNV
LCDR3 антитела 23C8 (SEQ ID NO: 29)LCDR3 antibody 23C8 (SEQ ID NO: 29)
QSTYGGVVGSTSDDNPQSTYGGVVGSTSDDNP
LCDR3 антитела 25F7 (SEQ ID NO: 30)LCDR3 antibody 25F7 (SEQ ID NO: 30)
QQGSSNSNIDNPQQGSSNSNIDNP
BTLA человека (SEQ ID NO: 31)Human BTLA (SEQ ID NO: 31)
MKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKY CANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNL IESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYRLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQMKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKY CANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNL IESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYRLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQ
- 15 043345- 15 043345
NELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNP CLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRSNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNP CLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS
BTLA мыши Balbc (SEQ ID NO: 32)Balbc mouse BTLA (SEQ ID NO: 32)
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECEVQLNIKRNSKHSAWTGELFK IECPVKYCVHRPNVTWCKHNGTIWVPLEVGPQLYTSWEENRSVPVFVLHFKPIHLSDNGSY SCSTNFNSQVINSHSVTIHVRERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTL LPLGALLLLLACVCLLCFLKRIQGKEKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDN DPWSSMQDESELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRSMKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECEVQLNIKRNSKHSAWTGELFK IECPVKYCVHRPNVTWCKHNGTIWVPLEVGPQLYTSWEENRSVPVFVLHFKPIHLSDNGSY SCSTNFNSQVINSHSVTIHVRERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTL LPLGALLLLLACVCLLCFLKRIQ GKEKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDN DPWSSMQDESELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRS
BTLA мыши C57BL6 (SEQ ID NO: 33)BTLA mouse C57BL6 (SEQ ID NO: 33)
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECPVQLTITRNSKQSARTGELFKI QCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLYTSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYS CSTNFNSQVINSHSVTIHVTERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTLL PLGALLLLLACVCLLCFLKRIQGKMKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECPVQLTITRNSKQSARTGELFKI QCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLYTSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYS CSTNFNSQVINSHSVTIHVTERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTLL PLGALLLLLACVCLLCFLK RIQGK
EKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDNDPWSSMQDESELTISLQSERNNQGI VYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRSEKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDNDPWSSMQDESELTISLQSERNNQGI VYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRS
BTLA обезьяны циномолгус (SEQ ID NO: 34)Cynomolgus monkey BTLA (SEQ ID NO: 34)
MKTLPAMLGSGRLFWVVFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSYHSIFAGDPFKLECPVK YCAHRPQVTWCKLNGTTCVKLEGRHTSWKQEKNLSFFILHFEPVLPSDNGSYRCSANFLSA IIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCFLRRHQGKQ NELSDTTGREITLVDVPFKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNEPDFCFRMQEGSEVYSNPC LEENKPGIIYASLNHSIIGLNSRQARNVKEAPTEYASICVRSMKTLPAMLGSGRLFWVVFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSYHSIFAGDPFKLECPVK YCAHRPQVTWCKLNGTTCVKLEGRHTSWKQEKNLSFFILHFEPVLPSDNGSYRCSANFLSA IIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCFLRRHQGKQ NELSDTTGREITLV DVPFKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNEPDFCFRMQEGSEVYSNPC LEENKPGIIYASLNHSIIGLNSRQARNVKEAPTEYASICVRS
Иллюстративная ДНК для экспрессии тяжелой цепи антитела 22ВЗ с SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 35) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccctcagtagct atggagtgagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagccattagttatgatggtattacatactacgcgagctggg cgaaaagcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgta ttactgtgcgagaggggactactacgatgattatgtttatgtttatgctttagacatctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttcta ccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttc cccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtgg acaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaa aacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaac tggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaa agccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctExemplary DNA for Antibody Heavy Chain Expression 22B3 with SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 35) gagccattagttatgatggtattacatactacgcgagctggg cgaaaagcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgta ttactgtgcgagaggggactactacgatgattatgtttatgtttatgcttagacatctggggccaggcaccctgg tcaccgtctcctcagcttcta ccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttc cccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactct actcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtgg acaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaa aacccaaggacactctcatgat ctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaac tggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcac cgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagta caagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaa agccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct
- 16 043345 ggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg gactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatg aggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt- 16 043345 ggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg gactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatg a ggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
Иллюстративная ДНК для экспрессии легкой цепи антитела 22ВЗ с SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 36)Exemplary DNA for 22B3 Antibody Light Chain Expression of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 36)
Gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccaggccagtcagagcattagtactgc attagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgctgcatccactctggcatctggcatcccagacaggttcagtg gcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcaacagggttatagtagtagta atcttgataatgttttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagt tgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcg ggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgcGaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccaggccagtcagagcattagtactgc attagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgctgcatccactctggcatctggcatcccagacaggttcagtg gcagtgggtctgggacagacttcactct caccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcaacagggttatagtagtagta atcttgataatgttttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagt tgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact tctatcccagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcg ggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaagggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagag cttcaacaggggagagtgc
Иллюстративная ДНК для экспрессии тяжелой цепи антитела 23С8 с SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 37) gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcgacatcagtaagt acaacatccaatgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggcttcattaattatggtggtagcgcatactacgcgagccggg cgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtatta ctgtgctagaggactaagtaatagcgacctctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttcccg ctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatg gtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctc ccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa cggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagag ccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcga catcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcta cagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacac agaagagcctctccctgtctctgggtExemplary DNA for expression of antibody heavy chain 23C8 with SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 37) tcattaattatggtggtagcgcatactacgcgagccggg cgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtatta ctgtgctagaggactaagtaatagcgacctctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcgg tcttcccg ctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccag cagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatg gtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctc ccggacccctgaggtcacgtgcgtggt ggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaa cggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgt cctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagag ccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcga catcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg ctccttcttcctcta cagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacac agaagagcctctccctgtctctgggt
Иллюстративная ДНК для экспрессии легкой цепи антитела 23С8 с SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 38)Exemplary DNA for 23C8 Antibody Light Chain Expression of SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 38)
- 17 043345 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagcattagtagttg gttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagtg gaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaatccacttatggtggtgttgttg gcagtactagtgatgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatct gatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgc cctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gc- 17 043345 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagcattagtagttg gttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagtg gaagt ggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaatccacttatggtggtgttgttg gcagtactagtgatgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatct gatgagcagttgaa atctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgc cctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaagggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgc gaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gc
Иллюстративная ДНК для экспрессии тяжелой цепи антитела 25F7 с SEQ ID NO: 9 (SEQExemplary 25F7 Antibody Heavy Chain Expression DNA of SEQ ID NO: 9 (SEQ
ID NO: 39) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccctcagtacct atgcaatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatcattagtgatgatggtaccacatactacgcgacctggg cgaaaggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgta ttactgtgcgagagatgctggtgctggtggtgtccaagactacttaaccttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaa gggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccg aaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaag agagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaaccc aaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtac gtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct gcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagcca aagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa aggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctc tgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtID NO: 39) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccctcagtacct atgcaatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatcattagtgatgatggtaccacatactacgcgacctggg cgaaaggcaga gtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgta ttactgtgcgagagatgctggtgctggtggtgtccaagactacttaaccttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaa gggcccatcggtcttcccgctagcgccct gctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccg aaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctac acctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaag agagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaaccc aaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagacc ccgaggtccagttcaactggtac gtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct gcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaa agcca aagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa aggcttctctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaggcta accgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctc tgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
Иллюстративная ДНК для экспрессии легкой цепи антитела 25F7 с SEQ ID NO: 10 (SEQExemplary 25F7 Antibody Light Chain Expression DNA of SEQ ID NO: 10 (SEQ
ID NO: 40)ID NO: 40)
Gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgccaggccagtgagaatatttacaact ttttggcctggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactctgcatccactctggcatctggggtccctgaccgattcagtg gcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacagggttctagtaatagta atattgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagt tgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcg ggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgcGacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgccaggccagtgagaatatttacaact ttttggcctggtaccagcagaaaccagcagcctcctaagctgctcatttactctgcatccactctggcatctggggtccctgaccgattcagtg gcagcgggtctgggacagatttcactctca ccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacagggttctagtaatagta atattgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagt tgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact tctatcccagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcg ggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaagggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagag cttcaacaggggagagtgc
HVEM человека (SEQ ID NO: 41)Human HVEM (SEQ ID NO: 41)
MEPPGDWGPPPWRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPGY RVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGC SPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQ TKC SWLVTKAGAGTS S SHWVWWFLSGSLVIVIVC STVGLIICVKRRKPRGD VVKVIVS VQR KRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNHMEPPGDWGPPPWRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPGY RVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGC SPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQ TKC SWLVTKAGAGTS S SHW VWWFLSGSLVIVIVC STVGLIICVKRRKPRGD VVKVIVS VQR KRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH
Claims (27)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/508,510 | 2017-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043345B1 true EA043345B1 (en) | 2023-05-16 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11396545B2 (en) | BTLA agonist antibodies and uses thereof | |
| US10493148B2 (en) | PD-1 agonist antibodies and uses thereof | |
| JP6830533B2 (en) | Anti-IL-33 antibody and its use | |
| KR101584416B1 (en) | Antibodies against human tweak and uses thereof | |
| US20220251198A1 (en) | Cd200r agonist antibodies and uses thereof | |
| KR20170106476A (en) | Treatment of Autoimmune Disease with CD154 Antibody | |
| KR20230004659A (en) | Anti-Human Nerve Growth Factor Antibodies | |
| KR20220084152A (en) | TREM2 Antibodies and Uses Thereof | |
| EA043345B1 (en) | BTLA AGONIST ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION | |
| JP2023549150A (en) | Anti-human thymic stromal lymphopoietic factor antibody and its production method and use |