EA042669B1 - МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СРЕДСТВА РНКи - Google Patents
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СРЕДСТВА РНКи Download PDFInfo
- Publication number
- EA042669B1 EA042669B1 EA201490993 EA042669B1 EA 042669 B1 EA042669 B1 EA 042669B1 EA 201490993 EA201490993 EA 201490993 EA 042669 B1 EA042669 B1 EA 042669B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nucleotides
- strand
- double
- nucleotide
- rnai agent
- Prior art date
Links
Description
Родственная заявка
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/561710, поданной 18 ноября 2011 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к дуплексным средствам РНКи, имеющим определенные мотивы, которые эффективны для ингибирования экспрессии гена-мишени, а также к композициям РНКи, подходящим для терапевтического использования. Кроме того, изобретение относится к способам ингибирования экспрессии гена-мишени путем введения таких дуплексных средств РНКи, например, для лечения различных заболеваний.
Уровень техники
РНК-интерференция или РНКи является термином, изначально введенным Fire и его сотрудниками для описания наблюдения, при котором двухцепочечная РНКи (дцРНК) может блокировать экспрессию гена (Fire et al. (1998), Nature, 391, 806-811; Elbashir et al. (2001), Genes Dev., 15, 188-200). Короткая дцРНК направляет ген-специфический пост-транскрипционный сайленсинг у многих организмов, включая позвоночных, и является новым инструментом для исследования функции генов. РНКи опосредуется РНК-индуцированным сайленсинговым комплексом (RISC), специфической для последовательности многокомпонентной нуклеазой, которая разрушает матричные РНК, гомологичные последовательности, запускающей сайленсинг. Известно, что RISC содержит короткие РНК (приблизительно из 22 нуклеотидов), полученные из двухцепочечной РНК, запускающей сайленсинг, но белковые компоненты такой активности остаются неизвестными.
Молекулы двухцепочечных РНК (дцРНК) с эффективными ген-сайленсинговыми свойствами необходимы для разработки лекарственных средств на основе РНК-интерференции (РНКи). Начальной стадией РНКи является активация РНК-индуцированного сайленсингового комплекса (RISC), для которой требуется разрушение смысловой цепи дцРНК-дуплекса. Известно, что смысловая цепь действует как первый субстрат RISC, который расщепляется аргонаутом 2 в середине дуплексного участка. Сразу же после того, как расщепленные 5'-концевые и 3'-концевые фрагменты смысловой цепи удалятся из эндонуклеазы Ago2, RISC становится активированным антисмысловой цепью (Rand et al. (2005), Cell, 123, 621).
Полагают, что при ингибировании расщепления смысловой цепи эндонуклеотическое расщепление мРНК-мишени ослабляется (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314; Rand et al. (2005), Cell, 123, 621; Schwarz et al. (2004), Curr. Biol., 14, 787). Leuschner et al. показали, что введение 2'-О-Ме-рибозы в сайт расщепления Ago2 в смысловой цепи ингибирует РНКи в клетках HeLa (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314). Подобный эффект наблюдают с фосфоротиоатными модификациями, что указывает на то, что для эффективной РНКи у млекопитающих также требуется расщепление смысловой цепи.
Morrissey et al. в сайте расщепления Ago2 среди других сайтов и модификаций также использовали миРНК-дуплекс, содержащий остатки, модифицированные 2'-F, и получили совместимый сайленсинг, сравнимый с немодифицированными миРНК (Morrissey et al. (2005), Hepatology, 41, 1349). Однако модификация по Morrissey не является мотив-специфической, например, одна модификация индуцирует модификации 2'-F на всех пиримидинах как на смысловой, так и на антисмысловой цепях до тех пор, пока пиримидиновый остаток присутствует, без какой-либо селективности; и следовательно, на основании таких указаний является неопределенным, может ли модификация специфического мотива в сайте расщепления смысловой цепи оказывать фактическое действие на активность сайленсинга генов. Muhonen et al. использовали миРНК-дуплекс, содержащий два модифицированных 2'-F остатка в сайте расщепления Ago2 на смысловой или антисмысловой цепи и нашли это допустимым (Muhonen et al. (2007), Chemistry & Biodiversity, 4, 858-873). Однако модификация по Muhonen также является специфической для последовательности, например, для каждой определенной цепи Muhonen модифицирует только или все пиримидины или все пурины без какой-либо селективности.
Choung et al. использовали миРНК-дуплекс, содержащий альтернативные модификации, за счет 2'-OMe или различных комбинаций 2'-F, 2'-OMe и фосфоротиоатных модификаций для стабилизации миРНК в сыворотке к Surl0058 (Choung et al. (2006), Biochemical and Biophysical Research Communications, 342, 919-927). Choung предполагал, что остатки в сайте расщепления антисмысловой цепи не должны модифицироваться 2'-Оме, для того чтобы повысить устойчивость миРНК.
Таким образом, существует потребность в иРНК-дуплексных средствах для улучшения эффективности сайленсинга генов миРНК-средств генной терапии. Настоящее изобретение направлено на решение такой потребности.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к эффективным нуклеотидам или химическим мотивам для средств дцРНК, необязательно конъюгированных по меньшей мере с одним лигандом, которые являются эффективными для ингибирования экспрессии гена-мишени, а также к композициям РНКи, подходящим для терапевтического применения.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что введение одного или нескольких мотивов из
- 1 042669 трех идентичных модификаций в три последовательных нуклеотида в сайте расщепления средства дцРНК или возле него, где средство дцРНК состоит из модифицированных смысловой и антисмысловой цепей, усиливает активность генного сайленсинга дцРНК-средством.
В одном из аспектов изобретение относится к двухцепочечному средству РНКи (дцРНК), способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. ДцРНК-дуплекс представлен формулой (III) смысловая: 5' np-Na-(XXX)1-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'- (X'X'X' )k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')1-Na'-nq' 5' (III)
В формуле (III) каждый i, j, k и l независимо равен 0 или 1;
каждый р и q независимо равен 0-6;
n представляет собой нуклеотид;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, или их комбинации, где каждая последовательность содержит по меньшей мере два различно модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, или их комбинации;
каждый np и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность, содержащую 0-6 нуклеотидов; и каждый XXX, YYY, ZZZ, Х'Х'Х', ΎΎΎ' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах;
где модификации в Nb отличаются от модификаций в Ύ и модификации в Nb' отличаются от модификаций в Ύ'.
По меньшей мере один из нуклеотидов Ύ образует пару оснований со своими комплементарными нуклеотидами Ύ', где модификация в нуклеотиде Ύ отличается от модификации в нуклеотиде Ύ'.
Каждый np и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность, содержащую 0-6 нуклеотидов;
каждый n и n' представляет собой выступающий нуклеотид; и каждый р и q независимо равен 0-6.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов находится в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов встречается в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом. Модификация в мотиве, находящемся в сайте расщепления или вблизи него в смысловой цепи, отличается от модификации в мотиве, находящемся в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-F на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления или вблизи него в цепи. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-О-метил на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-F на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-О-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В другом аспекте изобретение относится к способу доставки дцРНК к специфической мишени у индивида путем подкожного или внутривенного введения.
Подробное описание
Благодаря введению одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций в трех по- 2 042669 следовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь средства дцРНК, в частности в сайт расщепления или вблизи него можно получить отличный результат. Смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК по-другому может быть модифицирована полностью.
Введение таких мотивов прерывает набор модификаций, если он имеется, смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Средство дцРНК необязательно конъюгирует с лигандом производным GalNAc, например, на смысловой цепи. Полученные средства дцРНК проявляют превосходную активность в отношении генного сайленсинга.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что присутствие одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одной цепи средства дцРНК превосходно усиливает активность в отношении генного сайленсинга дцРНК-средства.
Соответственно изобретение относится к двухцепочечному средству РНКи (дцРНК), способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь. Длина каждой цепи средства дцРНК может изменяться от 12 до 30 нуклеотидов. Например, длина каждой цепи может быть 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 или 21-23 нуклеотида.
Смысловая цепь и антисмысловая цепь, как правило, образуют дцРНК-дуплекс. Длина дуплексного участка средства дцРНК может составлять 12-30 пар нуклеотидов. Например, длина дуплексного участка может составлять 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 или 21-23 пары нуклеотидов. В другом примере дуплексный участок выбран из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и 27.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению может содержать один или несколько выступающих участков и/или кэппирующих групп средства дцРНК на 3'-конце или 5'-конце или на обоих концах цепи. Длина выступающего участка может быть 1-6 нуклеотидов, например 2-6, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 или 1-2 нуклеотида. Выступы могут быть результатом того, что одна цепь длиннее другой, или результатом того, что две цепи одинаковой длины располагаются неравномерно. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с мРНК-мишенью, или он может быть комплементарен последовательностям гена, являющихся мишенями, или может представлять собой другую последовательность. Первая и вторая цепи также могут соединяться, например, дополнительными основаниями с образованием шпильки или другими не являющимися основаниями линкерами.
В одном из вариантов осуществления каждый нуклеотид в выступающем участке средства дцРНК по изобретению может независимо представлять собой модифицированные или немодифицированные нуклеотиды, включая, но ими не ограничиваясь, модифицированные до 2'-сахара, например, 2-F-, 2'-О-метилтимидина(Т), 2'-O-метоксиэтил-5-метилуреида (Тео), 2'-О-метоксиэтиладенозина (Аео), 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидина (m5Сео) и любую их комбинацию. Например, ТТ может представлять собой выступающую последовательность на любом конце любой цепи. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с мРНК-мишенью, или он может быть комплементарен последовательностям гена, являющихся мишенями, или может представлять собой другую последовательность.
Выступы 5' или 3' в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях средства дцРНК по изобретению могут быть фосфорилированы. В некоторых вариантах осуществления выступающий участок содержит два нуклеотида с фосфоротиоатом между двумя нуклеотидами, где два нуклеотида могут быть одинаковыми или различными. В одном из вариантов осуществления выступ присутствует на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В одном из вариантов осуществления такой 3'-выступ присутствует в антисмысловой цепи. В одном из вариантов осуществления такой 3'-выступ присутствует в смысловой цепи.
Средство дцРНК по изобретению содержит только один выступ, который может усиливать интерферирующую активность дцРНК, не влияя на его общую стабильность. Например, однонитевой выступ располагается на 3'-конце смысловой цепи или, с другой стороны, на 3'-конце антисмысловой цепи. Также дцРНК может иметь тупой конец, расположенный на 5'-конце антисмысловой цепи (или на 3'-конце смысловой цепи) или наоборот. Как правило, антисмысловая цепь дцРНК имеет нуклеотидный выступ на 3'-конце и 5'-конец является тупым. Без связи с какой-либо теорией асимметричный тупой конец на 5'-конце антисмысловой цепи и 3'-концевой выступ антисмысловой цепи благоприятствуют загрузке руководящей цепи в процесс RISC.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению также может иметь два тупых конца по обоим концам дцРНК-дуплекса.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 19 нк (nt), где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 7, 8, 9 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 20 нк, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F
- 3 042669 модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 8, 9, 10 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 21 нк, при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь длиной 21 нуклеотид (нк) и антисмысловую длиной 23 нуклеотида (нк), при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца; антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца, при этом один конец дцРНК затуплен, в то время как другой конец включает выступ в 2 нк. Предпочтительно выступ в 2 нк находится на 3'-конце антисмысловой цепи. Необязательно дцРНК также содержит лиганд (предпочтительно, GalNAc3).
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую и антисмысловую цепи, при этом длина смысловой цепь составляет 25-30 нуклеотидных остатков, при этом, начиная с 5'-концевого нуклеотида (положение 1), положения 1-23 указанной первой цепи содержат по меньшей мере 8 рибонуклеотидов; длина антисмысловой цепи составляет 36-66 нуклеотидных остатков, и, начиная с 3'-концевого нуклеотида, содержат по меньшей мере 8 рибонуклеотидов в положениях, парных положениям 1-23 смысловой цепи, с образованием дуплекса; при этом по меньшей мере 3'-концевой нуклеотид антисмысловой цепи не спаривается со смысловой цепью и до 6 последовательных 3'концевых нуклеотидов не спарены со смысловой цепью, посредством чего образуется 3'-однонитевой выступ из 1-6 нуклеотидов; при этом 5'-конец антисмысловой цепи содержит 10-30 последовательных нуклеотидов, которые не спарены со смысловой цепью, посредством чего образуется однонитевой 5'выступ из 10-30 нуклеотидов; где по меньшей мере 5'-концевые и 3'-концевые нуклеотиды смысловой цепи являются основаниями, спаренными с нуклеотидами антисмысловой цепи, когда смысловая и антисмысловая цепи выравнены для максимальной комплементарности, посредством чего образуется по существу дуплексный участок между смысловой и антисмысловой цепями; и антисмысловая цепь является достаточно комплементарной РНК-мишени вдоль по меньшей мере 19 рибонуклеотидов длины антисмысловой цепи для уменьшения экспрессии гена-мишени, когда указанную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводят в клетку млекопитающего; и при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую и антисмысловую цепи, где указанное средство дцРНК содержит первую цепь длиной по меньшей мере 25 и максимально 29 нуклеотидов и вторую цепь длиной максимально 30 нуклеотидов по меньшей мере с одним мотивом из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца; при этом указанный 3'-конец указанной первой цепи и указанный 5'-конец указанной второй цепи образуют тупой конец и указанная вторая цепь по своему 3'-концу на 1-4 нуклеотида длиннее, чем первая цепь, при этом дуплексный участок, который имеет по меньшей мере длину 25 нуклеотидов, и указанная вторая цепь достаточно комплементарна к мРНК-мишени вдоль по меньшей мере 19 нк длины указанной второй цепи для уменьшения экспрессии гена-мишени, когда указанное средство дцРНК вводят в клетку млекопитающего; и при этом дайсерное расщепление указанной дцРНК преимущественно приводит к миРНК, содержащей указанный 3'-конец указанной второй цепи, посредством чего уменьшается экспрессия гена-мишени у млекопитающего. Необязательно указанное средство дцРНК также содержит лиганд.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК также может содержать по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него в смысловой цепи.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь средства дцРНК также может содержать по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи.
В случае средства дцРНК, имеющего дуплексный участок длиной 17-23 нк, сайт расщепления антисмысловой цепи, как правило, находится возле положений 10, 11 и 12 от 5'-конца. Таким образом, мотивы из трех идентичных модификаций могут находиться в положениях 9, 10, 11; положениях 10, 11, 12; положениях 11, 12, 13; положениях 122, 13, 14 или положениях 13, 14, 15 антисмысловой цепи, причем исчисление начинается от 1-го нуклеотида от 5'-конца антисмысловой цепи или исчисление начинается от 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи. Сайт расщепления
- 4 042669 в антисмысловой цепи также может изменяться в соответствии с длиной дуплексного участка дцРНК от
5'-конца.
Смысловая цепь средства дцРНК содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления цепи; и антисмысловая цепь может иметь по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления цепи или вблизи него. Когда смысловая цепь и антисмысловая цепь образуют дцРНК-дуплекс, смысловую цепь и антисмысловую цепь можно выровнять так, что один мотив из трех последовательных нуклеотидов в смысловой цепи и один мотив из трех последовательных нуклеотидов в антисмысловой цепи имеют по меньшей мере однонуклеотидное перекрывание, т.е. по меньшей мере один из трех нуклеотидов мотива в смысловой цепи образует пару оснований по меньшей мере с одним из трех нуклеотидов мотива в антисмысловой цепи. С другой стороны, могут перекрываться по меньшей мере два нуклеотида из мотивов из обеих цепей или могут перекрываться все три нуклеотида.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК содержит более одного мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах. Первый мотив должен находиться в сайте расщепления цепи или вблизи него, и другие мотивы могут представлять собой wing-фланговые модификации. Термин фланговая модификация в описании относится к мотиву, находящемуся в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него той же цепи. Фланговая модификация расположена либо рядом с первым мотивом, либо отделена от него по меньшей мере одним или несколькими нуклеотидами. Если мотивы расположены непосредственно рядом друг с другом, то химические группы мотивов являются различными для каждого, и если мотивы разделены одним или несколькими нуклеотидами, то химические группы мотивов могут быть одинаковыми или различаться. Могут присутствовать две или больше фланговых модификаций. Например, если присутствуют две фланговые модификации, то обе фланговые модификации могут встречаться на одном конце дуплексного участка относительно первого мотива, который находится в сайте расщепления или вблизи него, или каждая из фланговых модификаций может встречаться с любой стороны первого мотива.
Аналогично смысловой цепи антисмысловая цепь средства дцРНК содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления цепи или вблизи него. Такая антисмысловая цепь также может содержать одну или несколько фланговых модификаций при выравнивании аналогично фланговым модификациям, которые присутствуют в смысловой цепи.
В одном из вариантов осуществления фланговая модификация в смысловой цепи антисмысловой цепи или обеих цепях средства дцРНК, как правило, не содержит один первый или два концевых нуклеотида в 3'-конце, 5'-конце или обоих концах цепи.
В другом варианте осуществления фланговая модификация в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях, как правило, не содержит один первый или два спаренных нуклеотида в дуплексном участке в 3'-конце, 5'-конце или обоих концах цепи.
Если смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК содержат каждая по меньшей мере одну фланговую модификацию, фланговые модификации могут выпадать на один и тот же конец дуплексного участка и перекрывать один, два или три нуклеотида.
Если смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК содержат каждая по меньшей мере две фланговые модификации, смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть выровнены таким образом, что две фланговые модификации, каждая с одной цепи, выпадают на один конец дуплексного участка, перекрываясь одним, двумя или тремя нуклеотидами; две модификации, каждая с одной цепи, выпадают на другой конец дуплексного участка, перекрываясь одним, двумя или тремя нуклеотидами.
В одном из вариантов осуществления может быть модифицирован каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи средства дцРНК, включая нуклеотиды, которые являются частью мотивов. Каждый нуклеотид может быть модифицирован одной и той же или разными модификациями, которые могут включать одно или несколько изменений одного или двух несвязывающих фосфатных атомов кислорода и/или одного или нескольких связывающих фосфатных атомов кислорода; изменение составной части сахара рибозы, например, 2'-гидроксила в сахаре рибозе; массовую замену фосфатной части дефосфо-линкерами; модификацию или замену природного основания и замену или модификацию рибозофосфатной основной цепи.
Так как нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры, состоящие из звеньев, то большое число модификаций происходит в положении, которое в нуклеиновой кислоте повторяется, например модификация основания, или фосфатной части, или несвязывающего О фосфатной части. В некоторых случаях модификация будет встречаться во всех зависимых положениях нуклеиновой кислоты, но во многих случаях это происходить не будет. Как пример, модификация может иметь место только в 3'- или 5'-концевом положении, может происходить только в концевом участке, например, в положении на концевом нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи. Модификация может иметь место в двухнитевом участке, однонитевом участке или в обоих участках. Модификация может иметь место только в двухнитевом участке РНК или может иметь место только в однонитевом участке РНК. Напри- 5 042669 мер, фосфоротиоатная модификация в положении несвязывающего О может иметь место только в одном или обоих концах, может иметь место только в концевом участке, например в положении в терминальном нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи, или может иметь место в двухнитевом и однонитевом участках, в частности, на концах. 5'-Конец может быть фосфорилирован.
Возможно, например, для усиления устойчивости введение определенных оснований в выступы или включение модифицированных нуклеотидов или заменителей нуклеотидов в однонитевые выступы, например в 5'- или 3'-выступ или в оба выступа. Например, может быть желательно введение в выступы пуриновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления все или некоторые основания в 3'- или 5'-выступе могут быть модифицированы, например, модификацией, описанной в настоящем описании. Модификации могут включать, например, использование модификаций в положении 2' сахара рибозы, которые известны в данной области, например использование 2'-дезокси-2'-фтор(2'-Р)- или 2'-О-метилмодифицированных дезоксирибонуклеотидов вместо рибозосахара нуклеотидного основания, и модификации в фосфатной группе, например фосфотиоатные модификации. Выступы могут быть гомологичны с последовательностью-мишенью.
В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-дезокси или 2'-фтором. Цепи могут содержать более одной модификации. В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором.
Как правило, в смысловой цепи и антисмысловой цепи присутствуют по меньшей мере две различные модификации. Такие две модификации могут представлять собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации или другие модификации.
В одном из вариантов осуществления каждая смысловая цепь и антисмысловая цепь содержит два различным образом модифицированных нуклеотида, выбранных из 2'-O-метил- или 2'-фтормодифицированного.
В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-О-метилнуклеотидом, 2'-дезоксифторнуклеотидом, 2'-O-N-метилацетамидо(2'O-NMA)нуклеотидом, 2' -O-диметиламиноэтоксиэтил(2'-O-DMAEOE)нуклеотидом, 2'-O-аминопропил(2'О-АР)нуклеотидом или 2'-ara-F-нуклеотидом.
В одном из вариантов осуществления Na и/или Nb содержит чередующиеся модификации. Термины чередующийся мотив или чередующаяся структура, как используется в настоящем описании, относятся к мотиву, имеющему одну или больше модификаций, где каждая модификация находится в чередующихся нуклеотидах одной цепи. Чередующимся нуклеотидом может называться каждый второй или один из каждых трех нуклеотидов или подобная структура. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации для нуклеотида, чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ..., АААВАААВАААВ..., АААВВВАААВВВ... или ABCABCABCABC... и т.п.
В одном из вариантов осуществления Na' и/или Nb' содержит чередующиеся модификации. Термины чередующийся мотив или чередующаяся структура, как используется в настоящем описании, относятся к мотиву, имеющему одну или больше модификаций, где каждая модификация находится в чередующихся нуклеотидах одной цепи. Чередующимся нуклеотидом может называться каждый второй или один из каждых трех нуклеотидов или подобная структура. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации для нуклеотида, чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ..., АААВАААВАААВ..., АААВВВАААВВВ... или ABCABCABCABC... и т.п.
Тип модификаций, содержащихся в чередующемся мотиве, может быть одним и тем же или отличаться. Например, если А, В, С и D представляют собой каждый один тип модификации нуклеотида, чередующаяся структура, т.е. модификации в каждом другом нуклеотиде, могут быть одними и теми же, но каждая цепь из смысловой цепи или антисмысловой цепи может быть выбрана из нескольких возможных модификаций в пределах чередующегося мотива, например АВАВАВ..., АСАСАС..., BDBDBD... или CDCDCD... и т.п.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит структуру модификаций чередующегося мотива в смысловой цепи, которая смещена относительно структуры модификации чередующегося мотива в антисмысловой цепи. Смещение может быть таким, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой цепи соответствует иначе модифицированной группе нуклеотидов антисмысловой цепи и наоборот. Например, если смысловая цепь спарена с антисмысловой цепью в дцРНК-дуплексе, чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с АВАВАВ от 5'-3' цепи и чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВАВАВА от 3'-5' цепи в пределах дуплексного участка. Как другой пример чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с ААВВААВВ от 5'-3' цепи и чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВВААВВАА от 3'-5' цепи в пределах дуплексного участка, так что существует полное или частичное смещение структур модификации между смысловой цепью и антисмысловой цепью.
- 6 042669
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит структуру чередующегося мотива 2'-O-метилмодификации и 2'Ш-модификации в смысловой цепи, изначально имеющую смещение относительно структуры чередующегося мотива 2'-О-метилмодификации и 2'Ш-модификации в антисмысловой цепи, т.е. 2'-О-метилмодифицированный нуклеотид в смысловой цепи образует пару оснований с 2'Ш-модифицированным нуклеотидом антисмысловой цепи и наоборот. Положение 1 смысловой цепи может начинаться с 2'-F-модификации, и положение 1 антисмысловой цепи может начинаться с 2'-O-метилмодификации.
Введение одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь прерывает начальную структуру модификации, присутствующую в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Такое нарушение структуры модификации смысловой цепи и/или антисмысловой цепи путем введения одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь неожиданно усиливает активность сайленсинга гена в отношении генамишени.
В одном из вариантов осуществления, если мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах вводят в любую из цепей, модификация нуклеотида, следующего за мотивом, является иной модификацией, чем модификация мотива. Например, часть последовательности, содержащей мотив, представляет собой ...NaYYYNb..., где Y представляет собой модификацию мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах и Na и Nb представляют собой модификацию для нуклеотида, следующего за мотивом YYY, которая является иной, чем модификация Y и где Na и Nb могут быть одинаковыми или различными модификациями. С другой стороны, Na и/или Nb могут присутствовать или отсутствовать, когда присутствует фланговая модификация.
Средство дцРНК по изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь. Модификация фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи может быть у любого нуклеотида смысловой цепи или антисмысловой цепи или обеих цепей в любом положении цепи. Например, модификация межнуклеотидной связи может быть у любого нуклеотида смысловой цепи и/или антисмысловой цепи; каждая модификация межнуклеотидной связи может встречаться в чередующейся структуре в смысловой цепи или антисмысловой цепи; или смысловая цепь или антисмысловая цепь содержат обе модификации межнуклеотидной связи в чередующейся структуре. Чередующаяся структура модификации межнуклеотидной связи в смысловой цепи может быть такая же, как в антисмысловой цепи, или отличаться от нее, и чередующаяся структура модификации межнуклеотидной связи в смысловой цепи может иметь смещение относительно чередующейся структуры модификации межнуклеотидной связи в антисмысловой цепи.
В одном из вариантов осуществления дцРНК содержит модификацию фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в выступающем участке. Например, выступающий участок содержит два нуклеотида, имеющих фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь между двумя нуклеотидами. Модификации межнуклеотидной связи могут быть получены для соединения нуклеотидов выступа с концевыми спаренными нуклеотидами в дуплексном участке. Например, по меньшей мере 2, 3, 4 или все нуклеотиды выступа могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь и необязательно могут существовать дополнительные фосфоротиоатные или метилфосфонатные межнуклеотидные связи, соединяющие нуклеотид выступа со спаренным нуклеотидом, который следует за нуклеотидом выступа. Например, могут существовать по меньшей мере две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами, из которых два из трех нуклеотидов являются нуклеотидами выступа, и третий представляет собой спаренный нуклеотид, следующий за нуклеотидом выступа. Предпочтительно такие концевые три нуклеотида могут находиться в 3'-конце антисмысловой цепи.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь дцРНК содержит 1-10 блоков из двух-десяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная смысловая цепь спарена с антисмысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из двух фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
- 7 042669
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из трех фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из четырех фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из пяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из шести фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из семи фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из восьми фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5 или 6 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из девяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3 или 4 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну или несколько модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 концевых положений смысловой и/или антисмысловой цепи. Например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь на одном конце или на обоих концах смысловой и/или антисмысловой цепи.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну или несколько модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 внутреннего участка дуплекса каждой из смысловой и/или антисмысловой цепи. Например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь в положении 8-16 дуплексного участка при исчислении от 5'-конца смысловой цепи; дцРНК также может необязательно содержать одну или больше модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 концевых положений.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну-пять модифи- 8 042669 каций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну-пять модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца) и одну-пять модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну-пять в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца) и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 и одну в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 20 и 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию
- 9 042669 фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 20 и 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 21 и 22 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 и 22 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 22 и 2 3 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 23 и 23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит ошибочное(ые) спаривание(я) с мишенью в пределах дуплекса или их комбинации. Ошибочное спаривание может иметь место в выступающем участке дуплексного участка. Пара оснований может быть классифицирована на основании их склонности промотировать диссоциацию или плавление (например, из-за свободной энергии ассоциации или диссоциации определенного спаривания, самым простым подходом является проверка пар на основании отдельной пары оснований, хотя также можно использовать анализ ближайшего соседа или подобный анализ). В смысле промотирования диссоциации A:U преобладает над G:C, G:U преобладает над G:C и Т:С преобладает над G:C (1=инозин). Ошибочные спаривания, например неканонические или иные, чем канонические спаривания, предпочтительны перед каноническими (А:Т, A:U, G:C) спариваниями; и спаривания, которые включают универсальное основание, предпочтительны перед каноническими спариваниями.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит по меньшей мере одну из первых 1, 2, 3, 4 или 5 пару оснований в дуплексных участках от 5'-конца антисмысловой цепи, которые могут быть выбраны независимо из группы A:U, G:U, I:C, и ошибочные пары, например неканонические или иные, чем канонические, спаривания или спаривания, которые содержат универсальное основание, для промотирования диссоциации антисмысловой цепи в 5'-конце дуплекса.
В одном из вариантов осуществления нуклеотид в положении 1 в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи выбирают из группы, состоящей из A, dA, dU, U и dT. С другой стороны, по меньшей мере одна из первых пар оснований 1, 2 или 3 в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи представляет собой пару оснований AU. Например, первой парой оснований в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи является пара оснований AU.
В одном из вариантов осуществления последовательность смысловой цепи может быть представлена формулой (I)
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I), где i и j каждый независимо равен 0 или 1;
р и q каждый независимо равен 0-6;
каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;
каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый np и nq независимо представляет собой нуклеотид выступа;
при этом Nb и Y не имеют одну и ту же модификацию; и
XXX, YYY и ZZZ каждый независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
- 10 042669
Предпочтительно YYY представляет собой все 2'-F-модифицированные нуклеотиды.
В одном из вариантов осуществления Na и/или Nb содержат модификации чередующейся структуры.
В одном из вариантов осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой цепи или вблизи него. Например, когда средство дцРНК имеет дуплексный участок длиной из 17-23 пар нуклеотидов, мотив YYY может встречаться в сайте расщепления или вблизи него (например, может встречаться в положениях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 или 11, 12, 13) смысловой цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. Следовательно, смысловая цепь может быть представлена следующими формулами
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ia),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ib), или
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ic)
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ia), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ic), каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждый из X, Y и Z может быть одинаковым с другим или отличаться от него.
В одном из вариантов осуществления последовательность антисмысловой цепи дцРНК может быть представлена формулой (II)
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II), при этом k и l каждый независимо равен 0 или 1;
р и q каждый независимо равен 0-6;
каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;
каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый np' и nq' независимо представляет собой нуклеотидный выступ, содержащий 0-6 нуклеотидов;
где Nb' и Y' не имеют одну и ту же модификацию; и каждый Х'Х'Х', YYY' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив их трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
В одном из вариантов осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующейся структуры.
Мотив YYY' встречается в сайте расщепления антисмысловой цепи или вблизи него. Например, когда средство дцРНК имеет дуплексный участок длиной в 17-23 нк, мотив YYY' может встречаться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' встречается в положениях 11, 12, 13.
В одном из вариантов осуществления мотив YYY' представляет собой все 2'-ОМемодифицированные нуклеотиды.
В одном из вариантов осуществления k равен 1 и l равен 0; или k равен 0 и 1 равен 1; или оба k и l равны 1.
Следовательно, антисмысловая цепь может быть представлена следующими формулами
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-N'a-np' 3' (IIa),
5' nq'-Na'-YYY'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIb), или
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-YYY'-Nb'-X'X'X'-N'a-np' 3' (IIc)
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIa), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержа- 11 042669 щую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIb), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIc), каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb' представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеотидов.
Каждый из X', Y' и Z' может быть одинаковым с другим или отличаться от него.
Каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи может быть независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-С-аллилом или 2'-фтор. Например, каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи может быть независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором. Каждый X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-О-метилмодификацию или 2'-фтормодификацию.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК содержит мотив YYY, встречающийся в положениях 9, 10 и 11 смысловой цепи, когда дуплексный участок состоит из 21 нк, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'Л-модификацию. Смысловая цепь может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ как фланговые модификации в противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь может содержать мотив Y'Y'Y', встречающийся в положениях 11, 12 и 13 цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-О-метил-модификацию. Антисмысловая цепь может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' как фланговые модификации в противоположном конце дуплексного участка; и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
Смысловая цепь, представленная одной из приведенных выше формул (Ia), (Ib) и (Ic), образует дуплекс с антисмысловой цепью, представленной одной из приведенных выше формул (IIa), (IIb) и (IIc) соответственно.
Соответственно средство дцРНК может содержать смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представлять собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой смысловая: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')i-Na'-nq' 5' (III), где каждый i, j , k и l независимо равен 0 или 1;
каждый р и q независимо равен 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность включает по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где каждый np', np, nq' и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность; и каждый XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. В другом варианте осуществления k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и l равен 1; или оба k и l равны 1.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представляет собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой (V) смысловая: 5' Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na' 5' (V), где i, j , k и l равны каждый независимо 0 или 1;
р и q равны каждый независимо 2;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей
- 12 042669 мере два различным образом модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где каждый np' и nq независимо представляют собой выступающую нуклеотидную последовательность; и
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YYY' и Z'Z'Z' каждый независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. В другом варианте осуществления k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и 1 равен 1; или оба k и l равны 1.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представляет собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой (Va) смысловая: 5' Na-(XXX)1-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-YYY'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa' 5' (Va), где каждый i, j, k и l независимо равен 0 или 1;
каждый р и q независимо равен 2;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где np' представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность; и каждый XXX, ΎΎΎ, ZZZ, X'X'X', Ύ'Ύ'Ύ' и Z'Z'Z' независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
Примеры комбинаций смысловой цепи и антисмысловой цепи, образующих дцРНК-дуплекс, включают формулы, приведенные ниже.
5' np-NaYYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np'-Na'-YYY'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIa),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-YYY'-Na'-nq' 5' (IIIb),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-YYY'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5' (IIIc)
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIa), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIb), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIc), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый из Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующейся структуры.
Каждый из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb) и (IIIc) может быть одинаковым с другим или отличаться от него.
Когда средство дцРНК представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом Y'. С другой стороны по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y' или все три нуклеотида Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.
Понятно, что когда нуклеотиды Na образуют пары оснований с Na', нуклеотиды Nb образуют пары оснований с Nb', нуклеотиды X образуют пары оснований с X', нуклеотиды Y образуют пары оснований с Y' и нуклеотиды Z образуют пары оснований с Z'.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIa) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом Z'. С другой стороны по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z' или все три нук- 13 042669 леотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIb) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом X'. С другой стороны, по меньшей мере, два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три нуклеотида X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.
В одном из вариантов осуществления модификация в нуклеотиде Y иная, чем модификация в нуклеотиде Y', модификация в нуклеотиде Z иная, чем модификация в нуклеотиде Z', и/или модификация в нуклеотиде X иная, чем модификация в нуклеотиде X'.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК представляет собой полимер, содержащий по меньшей мере два дуплекса, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), при этом указанные дуплексы соединяются линкером. Линкер может поддаваться расщеплению или не поддаваться. Необязательно указанный полимер также содержит лиганд. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК представляет собой полимер, содержащий три, четыре, пять, шесть или больше дуплексов, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), при этом указанные дуплексы соединяются линкером. Линкер может поддаваться расщеплению или не поддаваться. Необязательно указанный полимер также содержит лиганд. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.
В одном из вариантов осуществления два средства дцРНК, представленные формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), соединяются друг с другом по 5'-концу и один или оба 3'-конца необязательно конъюгируются с лигандом. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена; или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.
Во многих публикациях описывается полимерная миРНК, и все можно использовать в отношении дцРНК по изобретению. Такие публикации включают WO 2007/091269, патент США № 7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 и WO 2011/031520, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Средство дцРНК, которое содержит конъюгации одной или нескольких углеводных частей со средством дцРНК, может оптимизировать одно или больше свойств средства дцРНК. Во многих случаях углеводная часть будет присоединяться к модифицированному звену средства дцРНК. Например, сахар рибоза одного или нескольких рибонуклеотидных звеньев средства дцРНК может быть заменен на другую часть, например неуглеводный (предпочтительно, циклический) носитель, к которому присоединяется углеводный лиганд. Рибонуклеотидное звено, в котором сахар рибоза звена заменен таким образом, в настоящем описании называют звеном с модификацией заменой рибозы (RRMS). Циклический носитель может представлять собой карбоциклическую систему, т.е. все атомы цикла являются атомами углерода, или гетероциклическую систему, т.е. один или больше атомов цикла могут представлять собой гетероатомы, например атомы азота, кислорода, серы. Циклический носитель может представлять собой моноциклическую систему или может содержать два или больше циклов, например конденсированные циклы. Циклический носитель может представлять собой полностью насыщенную циклическую систему или он может содержать одну или несколько двойных связей.
Лиганд может быть присоединен к полинуклеотиду через носитель. Носители включают (i) по меньшей мере одну точку присоединения к главной цепи, предпочтительно две точки присоединения к главной цепи, и (ii) по меньшей мере одну точку промежуточного присоединения. Используемый в настоящем описании термин точка присоединения к главной цепи относится к функциональной группе, например гидроксильной группе, или вообще доступной для связи и которая подходит для введения носителя в главную цепь, например фосфатной группе или модифицированной фосфатной группе, например серосодержащей группе главной цепи рибонуклеиновой кислоты. Термин точка промежуточного присоединения (ТАР) в некоторых вариантах осуществления относится к входящему в цикл атому циклического носителя, например атому углерода или гетероатому (отличающемуся от атома, который обеспечивает точку присоединения главной цепи), который присоединяет выбранную часть. Часть может представлять собой, например, углевод, например моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид и полисахарид. Необязательно выбранная часть соединяется с циклическим носителем посреднической связью. Таким образом, циклический носитель обычно будет включать функциональную группу, например аминогруппу, или, как правило, обеспечивающую связь, которая подходит для включения или для промежуточной связи для другой химической частицы, например лиганда, с составляющим циклом.
В варианте осуществления дцРНК по изобретению конъюгируют с лигандом через носитель, при этом носитель может представлять собой циклическую группу или ациклическую группу; предпочтительно, циклическую группу выбирают из пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, пиперидинила, пиперазинила, [1,3]диоксолана, оксазолидинила, изоксазолидинила, морфолинила, тиазолидинила, изотиазолидинила, хиноксалининла, пиридазинонила, тетрагидро- 14 042669 фурила и декалина; предпочтительно ациклическую группу выбирают из главной цепи серинола или главной цепи диэтаноламина.
Двухцепочечное средство РНК (дцРНК) по изобретению необязательно может быть конъюгировано с одним или несколькими лигандами. Лиганд может присоединяться к смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеим цепям по 3'-концу, 5'-концу или обоим концам. Например, лиганд может быть конъюгирован со смысловой цепью, в частности с 3'-концом смысловой цепи.
Лиганды.
Широкий ряд частиц можно сочетать с олигонуклеотидами по настоящему изобретению. Предпочтительными частицами являются лиганды, которые присоединяются предпочтительно ковалентно или непосредственно или косвенно через промежуточную связку.
В предпочтительных вариантах осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время жизни молекулы, в которую он включен. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд обеспечивает усиленную аффинность в отношении выбранной мишени, например молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, рецептора, например клеточного компартмента или компартмента органа, ткани, органа или части тела, при сравнении, например, с аффинностью при отсутствия такого лиганда. Лиганды, обеспечивающие усиленную аффинность в отношении выбранной мишени, также называют нацеливающими лигандами.
Некоторые лиганды могут иметь эндосомолитические свойства. Эндосомолитические лиганды промотируют лизис эндосом и/или перенос композиции по изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может представлять собой полианионный пептид или пептидомиметик, который показывает рН-зависимую мембранную активность и фузогенность. В одном из вариантов осуществления эндосомолитический лиганд проявляет свою активную конформацию при эндосомном рН. Активной конформацией является такая конформация, при которой эндосомолитический лиганд промотирует лизис эндосомы и/или перенос композиции по изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Примеры эндосомолитических лигандов включают пептид GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26:2964-2972), пептид EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118:1581-1586) и их производные (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559:56-68). В одном из вариантов осуществления эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислотную), которая будет претерпевать изменение заряда или протонирования в ответ на изменение рН. Эндосомолитический компонент может быть линейным или разветвленным.
Лиганды могут улучшать перенос, гибридизацию и свойства специфичности и также могут улучшать нуклеазоустойчивость полученного природного или модифицированного олигонуклеотида или полимерной молекулы, содержащей любую комбинацию мономеров, описанную в настоящем описании, и/или природных или модифицированных рибонуклеотидов.
Обычно лиганды могут содержать терапевтические модификаторы, например, для усиления поглощения; диагностические соединения или репортерные группы, например, для контроля за распределением; сшивающие средства и части, придающие нуклеазоустойчивость. Обычные примеры включают липиды, стероиды, витамины, сахара, белки, пептиды, полиамины и пептидомиметики.
Лиганды могут включать природное вещество, такое как белок (например, человеческий сывороточный альбумин (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), липопротеин высокой плотности (HDL) или глобулин); углевод (например, декстрин, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота, олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полилизин (PLL), поли-Lаспартамовую кислоту, поли-Е-глутамовую кислоту, сополимер стирола и малеинового ангидрида, сополимер поли(L-лактид, гликолиед), сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида (HMPA), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидомиметический поламин, дендритный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.
Лиганды также могут включать нацеливающие группы, например средство, нацеливающее на клетку или ткань, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается со специфическим типом клеток, таким как клетка почки. Нацеливающая группа может представлять собой тиротропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный активный белок А, углевод муцина, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентную галактозу, трансферрин, бифосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин В12, биотин, пептид RGD, миметик пептида RGD или аптамер. Табл. 1 показывает некоторые примеры нацеливающих лигандов и их ассоциированные рецепторы.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие вещества (например, акридины),
- 15 042669 сшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы или хелаторы (например, ЭДТК), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бисO(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, антеннапедиапептид, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, ПЭГ (например, ПЭГ-40К), MPEG, [MPEG]2, полиамины, алкилы, замещенные алкилы, меченные изотопами маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), средства, облегчающие перенос/поглощение (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплексы Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HPR или АР.
Лигандами могут быть белки, например гликопротеины, или пептиды, например молекулы со специфической аффинностью к солиганду, или антитела, например антитело, которое связывается с клеткой определенного типа, такой как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные вещества, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза, поливалентная фукоза или аптамеры. Лиганд может представлять собой, например, липополисахарид, активатор р38 МАР-киназы или активатор NF-kB.
Лиганд может представлять собой вещество, например лекарственное средство, которое может усилить поглощение средства иРНК в клетке, например, путем разрыва цитоскелета клетки, например, путем разрыва микротрубочек клетки, микронитей и/или промежуточных нитей. Лекарственное средство может представлять собой, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, ларункулин А, фаллодин, свинхолид А, инданоцин или миосервин.
Лиганд может усиливать поглощение олигонуклеотида в клетке путем активации воспалительной реакции, например. Примеры лигандов, которые могут иметь такое действие, включают фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), интерлейкин-1-бета или гамма-интерферон.
В одном из аспектов лиганд представляет собой липид или молекулу на основе липида. Такие липид или молекула на основе липида предпочтительно связывают сывороточный белок, например человеческий сывороточный альбумин (HSA). Связывающий HSA лиганд позволяет донести конъюгат до ткани-мишени, например непочечной ткани-мишени организма. Например, ткань-мишень может представлять собой ткань печени, включая паренхимные клетки печени. Другие молекулы, которые могут связывать HSA, также можно использовать в качестве лигандов. Например, можно использовать напроксен или аспирин. Липид или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгатов;
(b) повышать нацеливание или перенос в клетку-мишень или клеточную мембрану; и/или (с) использоваться для регулирования связывания с сывороточным белком, например HSA.
Лиганд на основе липида можно использовать для модуляции, например, регулирования, связывания конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA сильнее, с меньшей вероятностью будет нацеливаться на почки и поэтому менее вероятно выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA с меньшей силой, может использоваться для нацеливания конъюгата на почки.
В предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывает HSA. Предпочтительно он связывает HSA с достаточной аффинностью, так что конъюгат будет предпочтительно доставляться в непочечную ткань. Однако предпочтительно, чтобы аффинность не была настолько сильной, чтобы связывание лигандом HSA не могло быть обратимым.
В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывает HSA слабо или вовсе не связывает, так что конъюгат предпочтительно будет доставляться в почки. Другие вещества, которые нацеливают на клетки почек, также могут использоваться вместо или в дополнение к лиганду на основе липида.
В другом аспекте лиганд представляет собой частицу, например витамин, которая поглощается клеткой-мишенью, например пролиферирующейся клеткой. Это особенно применимо для лечения расстройств, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или незлокачественного типа, например раковых клеток. Примеры витаминов включают витамин А, Е и K. Другие примеры витаминов включают витамины группы В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль, или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включаются HAS, липопротеин низкой плотности (LDL) и липопротеин высокой плотности (HDL).
В другом аспекте лиганд представляет собой средство, проникающее в клетку предпочтительно спиральное проникающее в клетку средство. Предпочтительно средство является амфипатическим. При- 16 042669 мером средства является пептид tat или антеннопедия. Если средство представляет собой пептид, он может быть модифицированным, включая пептидомиметик, инвертомеры, непептидные или псевдопептидные связи и использование D-аминокислот. Спиральное средство предпочтительно представляет собой альфа-спиральное средство, которое предпочтительно имеет липофильную и липофобную фазу.
Лиганд может представлять собой пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в настоящем описании олигопептидомиметиком) представляет собой молекулу, способную складываться в определенную трехмерную структуру, схожую с природным пептидом. Часть пептида или пептидомиметика может иметь длину примерно в 5-50 аминокислот, например длину примерно в 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Пептид или пептидомиметик может представлять собой, например, пептид, проникающий в клетку, катионный пептид, амфифатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Tyr, Trp или Phe). Пептидная часть может представлять собой дендритный пептид, свернутый пептид или сшитый пептид. В другом случае пептидная часть может включать гидрофобную последовательность мембранной транслокации (MTS). Примером гидрофобного MTS-содержащего пептида является RFGF, имеющий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP. Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP), содержащий гидрофобную MTS, также может являться нацеливающей частью. Пептид может являться доставочным пептидом, который может проносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олинонуклеотиды, и белок, сквозь клеточные мембраны. Например, обнаружено, что последовательности из белка ВИЧ-Tat (GRKKRRQRRRPPQ) и белка дрозофилы антеннапедии (RQIKIWFQNRRMKWKK) способны функционировать как доставочные пептиды. Пептид или пептидомиметик может быть кодирован случайной последовательностью ДНК, так что пептид идентифицируется из библиотеки фагового дисплея, или комбинаторной библиотеки one-bead-one-compound (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Предпочтительно пептид или пептидомиметик, привязанный к средству иРНК через внедренное мономерное звено, представляет собой пептид, нацеливающий на клетку, такой как пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) или миметик RGD. Длина пептидной части может изменяться от примерно 5 аминокислот до примерно 40 аминокислот. Пептидная часть может иметь структурную модификацию с тем, чтобы повысить устойчивость или усилить непосредственные конформационные свойства. Можно использовать любые структурные модификации, описанные ниже.
Пептидную RGD часть можно использовать для нацеливания на опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или клетка рака молочной железы (Zizmann et al., Cancer Res., 62:513943, 2002). Пептид RGD может облегчить нацеливание средств иРНК на опухоли различных других тканей, включая легкие, почки, селезенку или печень (Aoki et al., Cancer Gene Therapy, 8:783-787, 2001). Предпочтительно пептид RGD будет облегчать нацеливание средств иРНК на почки. Пептид RGD может быть линейным или циклическим и может быть модифицирован, например гликозилирован или метилирован, для облегчения нацеливания на конкретные ткани. Например, гликозилированный пептид RGD может доставлять средство иРНК в опухолевую клетку, экспрессирующую α¥β3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Можно использовать пептиды, которые нацеливают маркеры, обогащенные в пролиферирующих клетках. Например, RGD-содержащие пептиды и пептидомиметики могут нацеливаться на раковые клетки, в частности клетки, которые выставляют интегрин. Таким образом, можно использовать пептиды RGD, циклические пептиды, содержащие RGD, пептиды RGD, которые включают D-аминокислоты, а также синтетические миметики RGD. Кроме RGD можно использовать другие части, которые нацеливаются на лиганд интегрин. Как правило, такие лиганды можно использовать для регулирования пролиферации клеток и ангиогенеза. Предпочтительны конъюгаты лигандов такого типа, которые нацеливаются на РЕСАМ-1, VEGF или другой раковый ген, например раковый ген, описанный в настоящем описании.
Пептид, проникающий в клетку способен проникать в клетку, например микробную клетку, такую как бактериальная клетка или клетка гриба, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептид, проникающий в микробную клетку, может представлять собой, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или церопин Р1), пептид, содержащий дисульфидную связь (например, α-дефенсин, β-дефенсин или бактенецин), или пептид, содержащий только одну или две доминирующие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин).
Пептид, проникающий в клетку, также может включать сигнал ядрышковой локализации (NLS). Например, пептид, проникающий в клетку, может представлять собой состоящий из двух частей амфипатический пептид, такой как MPG, который образован из домена слитого пептида ВИЧ-1 gp41 и NLS большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res., 31:2717-2724, 2003).
В одном из вариантов осуществления нацеливающий пептид может представлять собой амфипатический α-спиральный пептид. Примеры амфипатических α-спиральных пептидов включают, но ими не ограничиваются, цекропины, ликотоксины, парадаксины, буфорин, CPF, бомбининоподобный пептид (BLP), кателицидины, цератотоксины, пептиды S. clava, интестинальные антимикробные пептиды миксины (HFIAP), магаинины, бревининс-2, дермасептины, мелиттины, плевроцидин, пептиды Н2А, пептиды Xenopus, эскулентин-1 и caerins. Предпочтительно будет рассматриваться ряд факторов для поддер- 17 042669 жания целостности и устойчивости спирали. Например, будет использоваться максимальное число стабилизирующих спираль остатков (например, leu, ala или lys) и минимальное число остатков, дестабилизирующих спираль (например, пролина или звеньев циклических мономеров). Будет рассматриваться кэпирующий остаток (например, Gly является примером N-кэпирующего остатка), и/или можно использовать С-концевое амидирование для обеспечения добавочной Н-связи для стабилизации спирали. Образование солевых мостиков между остатками с противоположными зарядами, разделенных i±3 или i±4 положениями, может обеспечить устойчивость. Например, катионные остатки, такие как лизин, аргинин, гомоаргинин, орнитин или гистидин, могут образовывать солевые мостики с анионными остатками глутамата или аспартата.
Лиганды пептиды и пептидомиметики включают вещества, имеющие природное происхождение, или модифицированные пептиды, например, D- или L-пептиды; α, β или γ-пептиды; N-метилпептиды; азапептиды; пептиды с одной или несколькими амидными, т.е. пептидными, связями, замененными одной или несколькими мочевинными, тиомочевинными, карбаматными или сульфонилмочевинными связями; или циклические пептиды.
Нацеливающий лиганд может представлять собой любой лиганд, способный нацеливаться на специфический рецептор. Примерами являются фолат, GalNAc, галактоза, манноза, манноза-6Р, кластеры Сахаров, такие как кластер GalNAc, кластер маннозы, кластер галактозы, или апатамер. Кластер представляет собой комбинацию двух или больше звеньев сахаров. Нацеливающие лиганды также включают лиганды интегриновых рецепторов, лиганды хемокиновых рецепторов, трансферрин, биотин, лиганды серотонинивых рецепторов, PSMA, эндотелии, GCPII, соматостатин, лиганды LDL и HDL. Лиганды также могут быть на основе нуклеиновой кислоты, например, аптамер. Аптамер может быть немодифицированным или иметь любую комбинацию модификаций, раскрытых в настоящем описании.
Средства высвобождения из эндосом включают имидазолы, поли- или олигоимидазолы, PEI, пептиды, фузогенные пептиды, поликарбоксилаты, polyacations, маскированные олиго- или поликатионы или анионы, ацетали, полиацетали, кетали/поликетали, ортоэфиры, полимеры с маскированными или немаскированными катионными или анионными зарядами, дендриты с маскированными или немаскированными катионными или анионными зарядами.
РК модулятор обозначает фармакокинетический модулятор. РК модулятор включает липофильные соединения, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, средства, связывающие белки, ПЭГ, витамины и т.п. Примеры РК модуляторов включают, но ими не ограничиваются, холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.п. Также известно, что олигонуклеотиды, которые включают несколько фосфоротиоатных связей, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды в примерно 5, 10, 15 или 20 оснований, содержащие несколько фосфоротиоатных связей в главной цепи, также соответствуют настоящему изобретению в качестве лигандов (например, в качестве РК модулирующих лигандов).
Кроме того, в качестве РК модулирующих лигандов по настоящему изобретению также соответствуют аптамеры, которые связывают сывороточные компоненты (например, сывороточные белки).
Другие конъюгаты лигандов, соответствующие изобретению, описаны в заявках на патент США USSN: 10/916185, зарегистрированной 10 августа 2004 г.; USSN: 10/946873, зарегистрированной 21 сентября 2004 г.; USSN: 10/833934, зарегистрированной 3 августа 2007 г.; USSN: 11/115989, зарегистрированной 27 апреля 2005 г.; и USSN: 11/944227, зарегистрированной 21 ноября 2007 г., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Когда присутствуют два или больше лигандов, они могут иметь одинаковые свойства, все могут иметь различные свойства или некоторые лиганды имеют одинаковые свойства, в то время как другие имеют различные свойства. Например, лиганд может иметь свойства нацеливания, иметь эндосомолитическую активность или иметь РК модулирующие свойства. В предпочтительном варианте осуществления все лиганды имеют различные свойства.
Лиганды могут соединяться с олигонуклеотидами в различных точках, например в 3'-конце, 5'-конце и/или в промежуточном положении. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд присоединяется к олигонуклеотидам через промежуточную связку, например носитель, описанный в настоящем описании. Лиганд или привязанный лиганд может присутствовать в мономере, когда указанный мономер включают в растущую цепь. В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть включен через сочетание с мономером предшественником, после того как указанный мономер предшественник включен в растущую цепь. Например, мономер, имеющий, например, аминоконцевую группу (т.е. без ассоциированного лиганда), например ТАР-(СН2)nNH2, может быть включен в растущую олигонуклеотидную цепь. Затем при последующей операции, т.е. после включения мономера предшественника в цепь, лиганд, имеющий электрофильную группу, например пентафторфенилэфирную или альдегидную группу, может быть присоединен к мономеру предшественнику путем сочетания электрофильной группы лиганда с концевой нуклеоофильной группой связки мономера предшественника.
В другом примере мономер, имеющий подходящую группу для участия в реакции химии кликов,
- 18 042669 может быть включен, например, азид- или алкинконцевой связкой/линкером. При последующей операции, т.е. после включения мономера предшественника в цепь, лиганд, имеющий комплементарную химическую группу, например алкиновую или азидную, может быть присоединен к мономеру предшественнику путем сочетания алкина и азида.
В случае двухцепочечных олигонуклеотидов лиганды могут быть присоединены к одной или обеим цепям. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечное средство иРНК содержит лиганд, конъюгированный со смысловой цепью. В других вариантах осуществления двухцепочечное средство иРНК содержит лиганд, конъюгированный с антисмысловой цепью.
В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть конъюгирован с нуклеотидными основаниями, частями сахаров или межнуклеозидными связями молекул нуклеиновой кислоты. Конъюгация с пуриновыми нуклеотидными основаниями или их производными может иметь место в любом положении, включая эндоциклические и экзоциклические атомы. В некоторых вариантах осуществления положения 2, 6, 7 или 8 пуринового нуклеотидного основания присоединяются к части конъюгата. Конъюгация с пиримидиновыми нуклеотидными основаниями или их производными также может происходить в любом положении. В некоторых вариантах осуществления положения 2, 5 и 6 пиримидинового нуклеотидного основания могут быть замещены частью конъюгата. Конъюгация с частями сахаров нуклеозидов может происходить по любому атому углерода. Примеры атомов углерода части сахаров, которые могут быть присоединены к части конъюгата, включают 2', 3' и 5' атомы углерода. Положение 1' также может соединяться с частью конъюгата, такой как неосновной остаток. Межнуклеозидные связи также могут нести части конъюгата. В случае фосфоросодержащих связей (например, фосфодиэфира, фосфоротиоата, фосфородитиоата, фосфороамидата и т.п.) часть конъюгата может присоединяться непосредственно в атому фосфора или к атому О, N или S, связанному с атомом фосфора. В случае амин- или амидсодержащих межнуклеозидных связей (например, PNA) часть конъюгата может присоединяться к атому азота амина или амида или к соседнему атому углерода.
Любой подходящий в области РНК-интерференции лиганд может быть использован, хотя лиганд обычно представляет собой углевод, например моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, полисахарид.
Линкеры, которые конъюгируют лиганд с нуклеиновой кислотой, включают линкеры, обсужденные выше. Например, лиганд может представлять собой одно или несколько производных GalNAc (N-ацетилглюкозамин), присоединенных через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению конъюгирована с двухвалентным и трехвалентным линкером, включающими структуры, показанные в любой из формул (IV)-(VII)
при этом q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо равны в случае каждого появления 0-20, при этом повторяющееся звено может быть одним и тем же или другим;
каждый P2A, Р2В, Р3А, P3B, Р4А, Р4В, Р5А, Р5В, Р5С, Т2А, Т2В, Т3А, T3B, T4A, T4B, T5A, T5B, T5C независимо в случае каждого появления отсутствует или представляет собой CO, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH2, CH2NH или СН2О;
Q2A, Q2b, Q3A, Q3b, Q4A, Q4b, Q5A, Q5B, Q5C независимо в случае каждого появления отсутствуют или представляют собой алкилен, замещенный алкилен, при этом один или несколько метиленов могут прерываться или обрываться одним или несколькими О, S, S (О), SO2, N(Rn), C(R')=C(R), С=С или С(О);
Каждый R2A, R2b, R3A, R3B, R4A, R4b, R5A, R5B, R5C независимо в случае каждого появления отсутствует или представляет собой NH, О, S, СН2, С(О)О, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -С(О)-СН(Ra)-NH-, CO, о Н0А >S—S _ /S—S йО ΟΌOK. Of CH=N-O, ’ н ’ ’ 1 ’ или гетероциклил;
L2A, L2b, L3A, L3b, L4A, L4b, L5A, L5B и L5C представляют собой лиганд, т.е. каждый независимо в случае каждого появления представляет собой моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид,
- 19 042669 тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и
Ra представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь.
В частности, для использования со средствами РНКи для ингибирования экспрессии гена-мишени применимы трехвалентные конъюгирующие производные GalNAc, такие как производные формулы (VII)
при этом L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают, но ими не ограничиваются, следующие соединения:
НО /0Н
НО 1 >
VV-o f
Η О - - ° - N N О
AcHN 0 Η Н
н
NHAc , NHAc
- 20 042669
Определения.
Используемые в настоящем описании термины дцРНК, миРНК и средство иРНК используются как взаимозаменяемые для средств, которые могут опосредовать сайленсинг РНК-мишени, например мРНК, например транскрипт гена, который кодирует белок. Для удобства такую мРНК в настоящем описании также относят к мРНК, которую глушат. Такой ген в настоящем описании также относят к генумишени. Как правило, РНК, которую глушат, представляет собой эндогенный ген или патогенный ген. Кроме того, РНК, иные чем мРНК, например тРНК, и вирусные РНК также могут являться мишенями.
Используемое в настоящем описании выражение опосредует РНКи относится к способности заглушать РНК-мишень специфически для последовательности. Без связи с какой-либо теорией, полагают, что сайленсинг использует механизм или процесс РНКи и руководящую РНК, например средства миРНК из 21-23 нуклеотидов.
Как используется в настоящем описании, специфически гибридизируемый и комплементарный являются терминами, которые используют для того, чтобы показать достаточную степень комплементарности, так что имеет место устойчивое и специфическое связывание между соединением по изобретению и мишенью молекулой РНК. Специфическое связывание требует достаточной степени комплементарности для того, чтобы избежать неспецифического связывания олигомерного соединения с последовательностями не-мишенями в условиях, в которых желательно специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов или терапевтического лечения или в случае анализов in vitro в условиях, в которых анализы выполняют. Последовательности не-мишени, как правило, отличаются по меньшей мере 5 нуклеотидами.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению является достаточно комплементарным к РНК-мишени, например мРНК-мишени, так что средство дцРНК глушит продуцирование белка, кодированного мРНК-мишенью. В другом варианте осуществления средство дцРНК по изобретению
- 21 042669 является точно комплементарным к РНК-мишени, например РНК-мишень и средство дцРНК-дуплекс отжигаются, например, с образованием в участке точной комплементарности гибрида, состоящего исключительно из пар оснований по Уотсону-Крику. Достаточно комплементарная РНК-мишень может включать промежуточный участок (например, по меньшей мере из 10 нуклеотидов), который точно комплементарен РНК-мишени. Более того, в некоторых вариантах осуществления средство дцРНК по изобретению специфически различает различие в один нуклеотид. В таком случае средство дцРНК опосредует РНКи только если в участке (например, в пределах 7 нуклеотидов) с различием в один нуклеотид обнаруживается точная комплементарность.
Используемый в настоящем описании термин олигонуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), например, длиной в менее 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов.
Термин гало относится к любому радикалу фтора, хлора, брома или иода. Термин алкил относится к насыщенным и ненасыщенным неароматическим углеводородным цепям, которые могут представлять собой линейные цепи или разветвленные цепи, содержащим указанное число атомов углерода (которые включают без ограничения пропил, аллил или пропаргил), в которые могут необязательно встраиваться N, О или S. Например, Q-Сю показывает, что группа может иметь от 1 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин алкокси относится к радикалу -O-алкил. Термин алкилен относится к двухвалентному алкилу (т.е. -R-). Термин алкилендиоксо относится к двухвалентным группам структуры -O-R-O-, в которых R представляет собой алкилен. Термин аминоалкил относится к алкилу, замещенному амино. Термин меркапто относятся к радикалу -SH. Термин тиоалкокси относится к радикалу -S-алкил.
Термин арил относится к моноциклической 6-углеродной или бициклической 10-углеродной ароматической системе, при этом 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил и т.п. Термин арилалкил или термин аралкил относится к алкилу, замещенному арилом. Термин арилалкокси относится к алкокси, замещенному арилом.
Термин циклоалкил, используемый в настоящем описании, включает насыщенные и частично ненасыщенные циклические углеводородные группы с 3-12 атомами углерода, например, 3-8 атомами углерода, и, например, 3-6 атомами углерода, при этом циклоалкильная группа может быть, необязательно, дополнительно замещена. Циклоалкильные группы включают без ограничения циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил и циклооктил.
Термин гетероарил относится к ароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической системе с 1-3 гетероатомами, если система моноциклическая, 1-6 гетероатомами, если система бициклическая, или 1-9 гетероатомами, если система трициклическая, указанные гетероатомы выбирают из О, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов О, N или S, если система моноциклическая, бициклическая или трициклическая соответственно), при этом 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолил, тиазолил и т.п. Термин гетероарилалкил или термин гетероаралкил относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин гетероарилалкокси относится к алкокси, замещенному гетероарилом.
Термин гетероциклил относится к неароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической системе с 1-3 гетероатомами, если система моноциклическая, 1-6 гетероатомами, если система бициклическая, или 1-9 гетероатомами, если система трициклическая, указанные гетероатомы выбирают из О, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов О, N или S, если система моноциклическая, бициклическая или трициклическая соответственно), при этом 0, 1, 2 или 3 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают тризолил, тетразолил, пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил и т.п.
Термин оксо относится к атому кислорода, который образует карбонил, когда присоединен к углероду, N-оксид, когда присоединен к азоту, и сульфоксид или сульфон, когда присоединен к сере.
Термин ацил относится к алкилкарбонильному, циклоалкилкарбонильному, арилкарбонильному, гетероциклилкарбонильному или гетероарилкарбонильному заместителю, из которых любой может быть дополнительно замещен заместителем.
Термин замещенный относится к замене одного или нескольких водородных радикалов в данной структуре радикалом определенного заместителя, включая, но ими не ограничиваясь, галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил, тиол, алкилтио, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галогеналкил, амино, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоксильную группу, остаток сульфоновой кислоты, сульфонил, остаток фосфоновой кислоты, арил, гетероарил, гетероциклил или алифатическую группу. Следует иметь в виду, что замести
- 22 042669 тель также может быть замещенным.
Расщепляемые связывающие группы.
Расщепляемая связывающая группа представляет собой группу, которая достаточно устойчива вне клетки, но которая после внедрения в клетку-мишень расщепляется с высвобождением двух частей, удерживаемых вместе линкером. В предпочтительном варианте осуществления расщепляемая связывающая группа расщепляется по меньшей мере в 10 раз или больше, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз быстрее в клетке-мишени или в первом стандартном условии (которое можно выбрать, например, как имитирующее или представляющее внутриклеточные условия), чем в крови индивида или во втором стандартном условии (которое можно выбрать, например, как имитирующее или представляющее условия в крови или сыворотке).
Расщепляемые связывающие группы чувствительны к средствам расщепления, например, рН, окислительно-восстановительному потенциалу или наличию разрушающих молекул. Как правило, средства расщепления внутри клеток преобладают или обнаруживаются на более высоких уровнях или активностях, чем в сыворотке или крови. Примеры таких разрушающих средств включают окислительновосстановительные средства, которые выбирают для определенных субстратов или которые не имеют специфичности к субстрату, включая, например, окисляющие или восстанавливающие ферменты или восстановители, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушить поддающуюся окислительно-восстановительному расщеплению связывающую группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например средства, которые дают рН пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой связывающую группу путем действия как обычная кислота, пептидазы (которые могут являться субстратспецифическими) и фосфатазы.
Расщепляемая связывающая группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчива к рН. Величина рН сыворотки человека 7,4, в то время как средний внутриклеточный рН несколько ниже, колеблясь в интервале примерно 7,1-7,3. Эндосомы имеют более кислый рН в интервале 5,5-6,0, и лизосомы имеют даже более кислый рН примерно 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется при предпочтительном рН, причем посредством этого из лиганда высвобождается катионный липид внутрь клетки или в нужный компартмент клетки.
Линкер может включать расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется определенным ферментом. Тип расщепляемой связывающей группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, которая является мишенью. Например, лиганды, нацеленные на печень, могут быть соединены с катионными липидами через линкер, который включает сложноэфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, и поэтому линкер будет расщепляться эффективнее в клетках печени, чем в клетках типов, которые не богаты эстеразами. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легкого, корковое вещество почек и яичко.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно использовать, когда типы клеток-мишеней богаты пептидазами, например клетки печени и синовиоциты.
Вообще пригодность кандидата в расщепляемую связывающую группу можно оценить путем проверки возможности разрушающего средства (или условия) расщеплять кандидата в связывающую группу. Также будет желательна проверка кандидата в расщепляемую связывающую группу также на способность сопротивляться расщеплению в крови или при контакте с другой тканью, не являющейся мишенью. Таким образом можно определить относительную чувствительность к расщеплению при первом и втором условии, где первое выбирают как показывающее расщепление в клетке-мишени, и второе выбирают как показывающее расщепление в других тканях или биологических жидкостях, например крови или сыворотке. Оценки можно осуществить в бесклеточных системах, в клетках, в клеточной культуре, в культуре органа или ткани или на интактных животных. Может быть полезно провести начальную оценку в бесклеточной среде или в условиях культивирования и подтвердить дополнительными оценками на интактных животных. В предпочтительных вариантах осуществления применимые соединения-кандидаты расщепляются по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий в клетке) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий вне клетки).
Связывающие группы, расщепляемые в условиях окисления-восстановления.
Одним из классов расщепляемых связывающих групп являются связывающие группы, расщепляемые в условиях окисления-восстановления. Примером связывающей группы, расщепляемой при восстановлении, является дисульфидная связывающая группа (-S-S-). Для того чтобы определить, является ли кандидат в расщепляемую связывающую группу подходящим для связывающей группы, расщепляемой при восстановлении или, например, подходящим для использования с определенной частью иРНК и определенным нацеливающим средством, можно рассмотреть способы, описанные в настоящем описании. Например, кандидата можно оценить путем инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем с использованием реагентов, известных в данной области, которые имитируют скорость расщепления, которую можно было бы наблюдать в клетке, например клетке-мишени. Кандидатов также можно оценить в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке. В предпоч
- 23 042669 тительном варианте осуществления соединения-кандидаты расщепляются в крови самое большее на 10%. В предпочтительных вариантах осуществления применимые соединения-кандидаты разрушаются по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий в клетке) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий вне клетки). Скорость расщепления соединений-кандидатов можно определить с использованием стандартных ферментных кинетических анализов в условиях, выбранных для имитации внутриклеточной среды, и сравнения с условиями, выбранными для имитации внеклеточной среды.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфатов.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфатов расщепляются средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примерами средств, которые расщепляют фосфатную группу в клетках, являются ферменты в клетках, такие как фосфатазы. Примерами связывающих групп на основе фосфатов являются -О-Р(О)(ORk)-О-, -О-Р(S)(ORk)-О-, -О-Р(S)(sRk)-О-, -S-P(O) (ORk)-O-, -О-Р(О) (ORk)-S-, -S-P(O) (ORk)-S-, -О-Р (S) (ORk)-S-, -S-P(S) (ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O) (Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительными являются -ОP(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным является -О-Р(О)(ОН)-О-. Таких кандидатов можно оценивать с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.
Связывающие группы, расщепляемые кислотой.
Связывающие группы, расщепляемые кислотой, представляют собой группы, которые расщепляются в кислой среде. В предпочтительных вариантах осуществления связывающие группы, расщепляемые кислотой, расщепляются в кислой среде с рН примерно 6,5 или ниже (например, примерно 6,0, 5,5, 5,0 или ниже), или средствами, такими как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке специфические органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить условия расщепления для связывающих групп, расщепляемых кислотой. Примеры связывающих групп, расщепляемых кислотой, включают, но не ограничиваются указанным, гидразоны, сложные эфиры и эфиры аминокислот. Группы, расщепляемые кислотой, могут иметь общую формулу -C=NN-, С(О)О или -ОС(О). Предпочтительным является воплощение, когда углерод, присоединенный к кислороду сложноэфирной (или алкокси) группы, представляет собой углерод арильной группы, замещенной алкильной группы или третичной алкильной группы, такой как диметилпентил или трет-бутил. Таких кандидатов можно оценивать с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.
Связывающие группы на основе сложных эфиров.
Расщепляемые связывающие группы на основе сложных эфиров расщепляются в клетках ферментами, такими как эстеразы и амидазы. Примеры расщепляемых связывающих групп на основе сложных эфиров включают, но не ограничиваются указанным, эфиры алкиленовых, алкениленовых и алкиниленовых групп. Эфирные расщепляемые связывающие группы имеют общую формулу -С(О)О- или -ОС(О)-. Таких кандидатов можно оценить с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.
Расщепляющиеся группы на основе пептидов
Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов расщепляются в клетках ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами, с образованием олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.п.) и полипептидов.
Расщепляемые группы на основе пептидов не включают аминогруппу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любым алкиленом, алкениленом или алкиниленом. Пептидная связь является особым типом амидной связи, образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептида обычно ограничивается пептидной связью (т.е. амидной связью), образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов имеют общую формулу -NHCHRaC(O)NHCRbC(O)-, где RA и RB представляют собой группы R двух соседних аминокислот. Таких кандидатов можно оценить с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше. Используемый в настоящем описании термин углевод относится к соединению, которое или само по себе является углеводом, состоящим из одного или нескольких моносахаридных звеньев, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими), с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или соединение, имеющее в качестве своей части углеводную часть, состоящую из одного или нескольких моносахаридных звеньев, причем каждое имеет по меньшей мере 6 атомов углерода (которое может быть линейным, разветвленным или циклическим), с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Характерные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие примерно 4-9 моносахаридных звеньев) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Конкретные сахариды включают C5 и высшие (предпочтительно, С5-С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара, имеющие два или три моносахаридных звена (предпочтительно, C5-C8).
- 24 042669
Альтернативные варианты осуществления.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций в три последовательных нуклеотида, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления в антисмысловой цепи или возле нее. Каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи модифицирован. Модификации в смысловой цепи и антисмысловой цепи, в каждой независимо, включают по меньшей мере две различные модификации.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления в антисмысловой цепи или вблизи него. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах. Структура модификации антисмысловой цепи смещена на один или больше нуклеотидов относительно структуры модификации смысловой цепи.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, когда по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления или вблизи него в цепи и по меньшей мере один из мотивов встречается в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления или вблизи него в цепи и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом. Модификация в мотиве, расположенном в сайте расщепления в смысловой цепи, отличается от модификации в мотиве, расположенном в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи. В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 12-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метильных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.
Смысловая цепь также может содержать один или больше мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один или больше дополнительных мотивов встречаются в другой части цепи, которая отделена от трех 2'-F модификаций в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь также может содержать один или больше мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один или больше дополнительных мотивов расположены в другой части цепи, которая отделена от трех 2'-О-метильных модификаций в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. По меньшей мере один из нуклеотидов, имеющих модификацию 2'-F, может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом, имеющим 2'-О-метильную модификацию.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению вводят в буфере.
В одном из вариантов осуществления соединения миРНК, описанные в настоящем описании, могут быть включены в препарат для введения индивиду. Композиция миРНК может находиться в различных состояниях. В некоторых примерах композиция по меньшей мере частично является кристаллической, однородно кристаллической и/или безводной (например, воды меньше 80, 50, 30, 20 или 10%). В другом примере миРНК находится в водной фазе, например в растворе, который включает воду.
Водные или кристаллические композиции можно, например, включить в среду для доставки, например, в липосому (особенно в случае водной фазы) или частицу (например, микрочастицу, что может
- 25 042669 быть подходящим для кристаллической композиции). Как правило, композицию миРНК получают способом, который совместим с предполагаемым способом введения, описанным в настоящем описании. Например, в отдельных вариантах осуществления композицию получают по меньшей мере одним из следующих способов: сушка распылением, лиофилизация, вакуумная сушка, выпаривание, сушка в псевдоожиженном слое или комбинация таких методов; или обработкой ультразвуком с липидом, сушкой вымораживанием, кондансацией и другой самосборкой.
Препарат миРНК можно получить в комбинации с другим средством, например другим терапевтическим средством или средством, который стабилизирует миРНК, например белком, который образует комплекс с миРНК с образованием иРНК. Другие средства также включают хелаторы, например ЭДТК (например, для удаления двухвалентных катионов, таких как Mg2+), соли, ингибиторы РНКаз (например, ингибитор РНКазы широкой специфичности, такой как RNAsin) и т.п.
В одном из вариантов осуществления препарат миРНК содержит другое соединение миНК, например вторую миРНК, которая опосредует РНКи в отношении второго гена и в отношении того же гена. Другой препарат может содержать по меньшей мере три, пять, десять, двадцать, пятьдесят, сто или больше различных видов миРНК. Такие миРНК могут опосредовать РНКи в отношении подобного числа различных генов.
В одном из вариантов осуществления препарат миРНК содержит по меньшей мере второе терапевтическое средство (например, средство иное, чем РНК или ДНК). Например, композиция миРНК для лечения вирусного заболевания, например ВИЧ, может содержать известное противовирусное средство (например, ингибитор протеаз или ингибитор обратной транскриптазы). В другом примере композиция миРНК для лечения рака может дополнительно содержать химиотерапевтическое средство.
Примеры препаратов обсуждаются ниже.
Липосомы.
Для простоты описания препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако следует иметь в виду, что такие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Соединение миРНК, например соединение двухцепочечная миРНК, или соединение кмиРНК (ssiRNA) (например, предшественник, например более крупное соединение миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечной миРНК, или соединения кмиРНК, или его предшественника) можно ввести в препарат для доставки в совокупности мембранных молекул, например липосоме или мицелле. Используемый в настоящем описании термин липосома относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, расположенных по меньшей мере в одном бислое, например одном бислое или нескольких бислоях. Липосомы включают униламеллярные и полиламеллярные везикулы, которые имеют оболочку, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю часть. Водная часть содержит композицию миРНК. Липофильный материал изолирует водную внутреннюю часть от водного наружного окружения, которое, как правило, не включает композицию миРНК, хотя в некоторых примерах это может иметь место. Липосомы применимы для переноса и доставки активных ингредиентов в место действия. Поскольку липосомная оболочка структурно схожа с биологическими мембранами, то когда липосомы применяют к ткани, липосомный бислой сливается с клеточными мембранами. Так как слияние липосомы и клетки продолжается, внутреннее водное содержимое, которое включает миРНК, доставляется в клетку, где миРНК может специфически связываться с РНК-мишенью и может опосредовать РНКи. В некоторых случаях липосомы также являются специфически нацеленными, например, для направления миРНК в определенные типы клеток.
Липосому, содержащую миРНК, можно получить различными способами. В одном из примеров липидный компонент липосомы растворяют в детергенте, так что образуются мицеллы с липидным компонентом. Например, липидный компонент может представлять собой амфипатический катионный липид или конъюгат липида. Детергент может иметь высокую критическую концентрацию мицелл и может быть неионогенным. Примеры детергентов включают холаты, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Затем препарат миРНК добавляют к мицеллам, которые включают липидный компонент. Катионные группы липида взаимодействуют с миРНК и конденсируются вокруг миРНК с образованием липосомы. После конденсации детергент удаляют, например, диализом и получают липосомный препарат миРНК.
При необходимости во время реакции конденсации можно добавить соединение-носитель, которое способствует конденсации, например, путем регулируемого добавления. Например, носитель может представлять собой полимер иной, чем нуклеиновая кислота (например, спермин или спермидин). Также можно регулировать рН для благоприятной конденсации.
Дополнительное описание способов получения устойчивых везикул для доставки полинуклеотидов, которые содержат комплекс полинуклеотид/катионный липид как структурный компонент доставочной везикулы, приводится, например, в WO 96/37194. Образование липосом также может включать один или несколько аспектов описанных примеров методов из Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:74137417, 1987; патент США № 4897355; патент США № 5171678; Bangham et al., M. Mol. Biol., 23:238, 1965;
- 26 042669
Olson et al., Biochem. Biophys. Acta, 557:9, 1979; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:4194, 1978; Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984; Kim et al., Biochem. Biophys. Acta, 728:339, 1983; и Fukunaga et al., Endocrinol., 115:757, 1984. Обычно используемые методы получения липидных агрегатов соответствующего размера для использования в доставочных везикулах включают ультразвуковую обработку и замораживание-оттаивание плюс экструзия (см., например, Mayer et al., Biochem. Biophys. Acta, 858:161, 1986). Когда требуются сообразно небольшие (50-200 нм) и относительно однородные агрегаты, можно использовать микрофлюидизацию (Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984). Такие способы легко адаптируются для упаковки препаратов миРНК в липосомы.
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают молекулы нуклеиновой кислоты, а не комплекс с ними. Так как молекулы нуклеиновой кислоты, так и липид заряжены подобным образом, происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее некоторые молекулы нуклеиновой кислоты захватываются водной внутренней частью таких липосом. Липосомы, которые являются рН-чувствительными, используют для доставки кодирующей ген тимидинкиназы ДНК в клеточные слои в монокультуре. В клетках-мишенях обнаружена экспрессия экзогенного гена (Zhou et al., Journal of Controlled Realease, 19 (1992), 269-274).
Один основной тип липосомной композиции включает иные фосфолипиды, чем фосфатидилхолин природного происхождения. Нейтральные липосомные композиции можно получить, например, из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции, как правило, получают из димиристоилфосфатидилглицерина, в то время как анионные фузогенные липосомы получают преимущественно из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомной композиции получают из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, соевый PC и яичный PC. Еще один тип получают из смесей фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.
Примеры других способов введения липосом в клетки in vitro приводятся в патенте США № 5283185, патенте США № 5171678, WO 94/00569, WO 93/24640, WO 91/16024, Feigner, J. Biol. Chem., 169:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther., 3:649, 1992; Gershon, Biochem., 32:7143, 1993; и Strauss, EMBO J., 11:417, 1992.
В одном из вариантов осуществления используют катионные липососмы. Катионные липосомы обладают преимуществом способности сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы хотя не способны сливаться так эффективно с плазматической мембраной, in vivo захватываются макрофагами и могут использоваться для доставки миРНК макрофагам.
Другие преимущества липосом включают следующее: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биоразлагаемыми; липосомы могут включать широкий ряд водо- и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные в их внутренних компартментах миРНК от метаболизма и деградации (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, vol. 1, p. 245). Важными соображениями при получении липосомных композиций являются поверхностный заряд липида, размер везикул и водный объем липосом.
Положительно заряженный синтетический катионный липид хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]N,N,N-триметиламмония (DOTMA) можно использовать для получения небольших липосом, которые взаимодействуют спонтанно с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липид-нуклеиновая кислота, которые способны сливаться с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры ткани, что приводит к доставке миРНК (см., например, Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:7413-7417, 1987; и патент США № 4897355 с описанием DOTMA и его использования с ДНК).
Аналог DOTMA 1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмиак)пропан (DOTAP) можно использовать в комбинации с фосфолипидом с образованием содержащих комплекс ДНК везикул. Липофектин™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) является эффективным средством для доставки высоко анионных нуклеиновых кислот в клетки живой культуры ткани, которые включают положительно заряженные DOTMA-липосомы, которые взаимодействуют спонтанно с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Когда используют достаточно положительно заряженные липосомы, суммарный заряд на полученных комплексах также является положительным. Положительно заряженные комплексы, полученные таким путем, спонтанно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты в, например, клетки культуры ткани. Другой коммерчески доступный катионный липид 1,2-бис(олеилокси)-3,3-(триметиламмиак)пропан (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianpolis, Indiana) отличается от DOTMA в том, что олеоильные части соединены сложноэфирными, а не простыми эфирными связями.
Другие описанные катионные липиды включают соединения, которые конъюгированы с различными частями, включая, например, карбоксиспермин, который конъюгируют с одним из двух типов липидов, и включает соединения, такие как диоктаолеоиламид 5-карбоксиспермилглицина (DOGS) (трансфектам™, Promega, Madison, Wisconsin) и 5-карбоксиспермиламид дипальмитоилфосфатидилэтанолами
- 27 042669 на (DPPES) (см., например, патент США № 5171678).
Другой конъюгат катионного липида включает продукт дериватизации липида холестерином (DCChoi), который вводят в липосомы в комбинации с DOPE (см. Gao X. and Huang L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280, 1991). Сообщается, что липополилизин, полученный конъюгацией полилизина с DOPE, является эффективным для трансфекции в присутствии сыворотки (Zhou X. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1065:8, 1991). Иными словами, для некоторых клеточных линий такие липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, показывают меньшую токсичность и обеспечивают более эффективную трансфекцию, чем DOTMA-содержащие композиции. Другие коммерчески доступные продукты катионные липиды включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) и липофектамин (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и wO 96/37194.
Липосомные препараты особенно подходят для местного введения, и липосомы имеют некоторые преимущества перед другими препаратами. Такие преимущества включают накопление введенного лекарственного средства в нужной мишени и возможность вводить миРНК в кожу. При некоторых осуществлениях липосомы используют для доставки миРНК в эпидермальные клетки и также для усиления пенетрации миРНК в кожные ткани, например, в кожу. Например, липосомы можно применять местно. Местная доставка в кожу лекарственных средств, полученных в виде липосом, описана в документах (см., например, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2, 405-410; и du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino R.J. and Fould-Fogerite S., Biotechniques, 6:682-690, 1988; Itani T. et al., Gene, 56:267-276, 1987; Nicolau С. et al. , Meth. Enz., 149:157-176, 1987; Straubinger R.M. and Papahadjopoulos D., Meth. Enz., 101:512-527, 1983; Wang C.Y. and Huang L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:78517855, 1987).
Неионные липосомные системы также проверяли для определения их полезности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности системы, включающие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные препараты, содержащие новасом I (простой 10-стеариловый эфир глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилена) и новасом II (простой 10-стеариловый эфир глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилена) использовали для доставки лекарственного средства в дерму кожи мыши. Такие препараты с миРНК применимы для лечения дерматологического расстройства.
Липосомы, которые включают миРНК, могут быть получены как поддающиеся высокой деформации. Такая способность к деформации может позволить липосомам проникать сквозь пору, которая меньше, чем средний радиус липосомы. Например, трансферсомы представляют собой тип липосом, поддающихся деформации. Трансферсомы можно получить, добавляя активаторы поля поверхности, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы, которые включают миРНК, могут быть доставлены, например, подкожно, путем инъекции, для того, чтобы доставить миРНК в кератиноциты в коже. Для того чтобы пройти интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через ряд тонких пор, каждая диаметром менее 50 нм, под влиянием подходящего трансдермального градиента. Кроме того, из-за свойств липидов такие трансферсомы могут быть самооптимизирующимися (адаптивными к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися и обычно могут достигать своих мишеней без фрагментации, а также часто самозаряжающимися.
Другие препараты, подходящие для настоящего изобретения, описаны в предварительных заявках на патент США, регистрационные № 61/018616, зарегистрирована 2 января 2008 г., 61/018611, зарегистрирована 2 января 2008 г., 61/039748, зарегистрирована 26 марта 2008 г., 61/047087, зарегистрирована 22 апреля 2008 г., и 61/051528, зарегистрирована 8 мая 2008 г. В заявке РСТ № PCT/US2007/080331, зарегистрированной 3 октября 2007 г., также описываются препараты, подходящие для настоящего изобретения.
Поверхностно-активные вещества.
Для простоты описания препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако следует иметь в виду, что такие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в композициях, таких как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы (см. выше). Композиции миРНК (или предшественника, например более крупной дцРНК, которая может быть процессирована до миРНК, или ДНК, которая кодирует миРНК или предшественника) могут включать поверхностно-активное вещество. В одном из вариантов осуществления миРНК находится в препарате в виде эмульсии, которая включает поверхностно-активное вещество. Самым общим способом классификации и оценки свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ как природных, так и синтетических является использование гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ). Характер гидрофильной группы дает наиболее применимое средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, используемых в препаратах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не является ионизированной, оно классифициру
- 28 042669 ется как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических продуктах и применимы в широком интервале значений рН. Обычно значения их ГЛБ колеблются от 2 до примерно 18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры также включены в такой класс. Полиоксиэтилированные поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными членами класса неионогенных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицруется как анионогенное. Анионогенные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты и фосфаты. Наиболее значительными членами класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицруется как катионогенное. Катионогенные поверхностно-активные вещества включают четвертичные аммониевые соли и этоксилированные амины. Четвертичные аммониевые соли являются наиболее применимыми членами этого класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества имеет способность нести положительный или отрицательный заряд, поверхностно-активное вещество классифицруется как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.
Использование поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, препаратах и эмульсиях рассматривается Rieger в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285.
Мицеллы и другие мембранные препараты.
Для простоты описания мицеллярные и другие препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако понятно, что такие мицеллярные и другие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Композиция соединения миРНК, например соединения двухцепочечной миРНК, или соединения кмиРНК (ssiRNA) (например, предшественника, например, более крупного соединения миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечную миРНК, или соединения кмиРНК, или его предшественника) может быть предоставлена в мицеллярном препарате. В настоящем описании мицеллы определяются как определенный тип скопления молекул, в котором амфипатические молекулы располагаются в сферической структуре, так что все гидрофобные части молекул направлены внутрь, оставляя гидрофильные части в контакте с окружающей водной фазой. Существует обратное расположение, если окружающая среда является гидрофобной.
Смешанный мицеллярный препарат, подходящий для доставки через кожные мембраны, можно получить путем смешивания водного раствора композиции миРНК, (C8-C1o)алкилсульфата щелочного металла и мицеллообразующего соединения. Примеры мицеллообразующих соединений включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, экстракт ромашки, огуречный экстракт, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло энотеры, ментол, тригидроксиоксохолонилглицин и его фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, простые полиоксиэтиленэфиры и их аналоги, простые полидоканолалкилэфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Мицеллообразующие соединения могут быть добавлены одновременно или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы будут образовываться по существу при любом виде смешивания ингредиентов, но при энергичном перемешивании обеспечиваются мицеллы меньшего размера.
В одном из способов получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию миРНК и, по меньшей мере, алкилсульфат щелочного металла. Затем первую мицеллярную композицию смешивают по меньшей мере с тремя мицеллообразующими соединениями для образования смешанной мицеллярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают, смешивая при энергичном перемешивании композицию миРНК, алкилсульфат щелочного металла и по меньшей мере одно из мицеллообразующих соединений и затем добавляя остальные мицеллообразующие соединения.
В смешанную мицеллярную композицию можно добавлять фенол и/или м-крезол для стабилизации препарата и защиты от роста бактерий. С другой стороны, фенол и/или м-крезол можно добавлять с мицеллообразующими ингредиентами. Изотоническое средство, такое как глицерин, можно добавлять по
- 29 042669 сле образования смешанной мицеллярной композиции.
Для доставки мицеллярной композиции в виде спрея препарат может быть помещен в аэрозольный дозатор, и в дозатор загружают пропеллент. Пропеллент, который находится под давлением, в дозаторе находится в жидкой форме. Соотношения ингредиентов регулируют таким образом, чтобы водная и пропеллентная фазы становились одной фазой, т.е. чтобы была одна фаза. Если существуют две фазы, необходимо встряхивать дозатор перед распылением порции содержимого, например, через мерный клапан. Распыляемая доза фармацевтического средства выталкивается из мерного клапана мелкими брызгами.
Пропелленты могут включать водородсодержащие хлорфторуглероды, водородсодержащие фторуглероды, диметиловый эфир и диэтиловый эфир. В некоторых вариантах осуществления может быть использован HFA 134а (1,1,1,2-тетрафторэтан).
Конкретные концентрации необходимых ингредиентов могут быть определены относительно простым опытным путем. Для всасывания в полости рта дозировку обычно желательно повысить, например, по меньшей мере в два или три раза по сравнению с дозировкой для инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.
Частицы.
Для простоты описания частицы, препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако можно понять, что такие частицы, препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. В другом варианте осуществления препараты соединения миРНК, например соединения двухцепочечной миРНК или соединения кмиРНК (например, предшественника, например более крупного соединения миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечную миРНК, или соединение кмиРНК, или его предшественника) могут быть включены в частицу, например микрочастицу. Микрочастицы можно получить распылительной сушкой, но также можно получить другими способами, включая лиофилизацию, выпаривание, сушку в псевдоожиженном слое, вакуумную сушку, или комбинацией таких методов.
Фармацевтические композиции.
Средства миРНК по изобретению могут быть введены в композиции для фармацевтического применения. Фармацевтически приемлемые композиции содержат терапевтически эффективное количество одного или нескольких средств дцРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, взятые одни или в композиции с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями (добавками), эксципиентами и/или разбавителями.
Фармацевтические композиции могут быть составлены специально для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для следующего:
(1) перорального введения, например формы для вливания (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, имеющие целью трансбуккальное, сублингвальное и системное всасывание, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык;
(2) парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидермальной инъекции, например, в виде стерильного раствора, или суспензии, или препарата с отсроченным высвобождением;
(3) местного введения, например, в виде крема, мази, или пэтча с регулируемым высвобождением, или спрея, наносимого на кожу;
(4) интравагинального или интраректального введения, например, в виде пессария, крема или пенки;
(5) сублингвального введения;
(6) внутриглазного введения;
(7) трансдермального введения; или (8) назального введения.
Доставка с использованием подкожного или внутривенного способа может быть особенно предпочтительной.
Выражение терапевтически эффективное количество, используемое в настоящем описании, обозначает количество соединения, материала или композиции, включающих соединение по изобретению, которое является эффективным, для того чтобы вызывать некоторый желательный терапевтический эффект в, по меньшей мере, субпопуляции клеток у животного при разумном соотношении польза/опасность, приемлемом для любого лечения лекарственными препаратами.
Выражение фармацевтически приемлемый используется в настоящем описании как относящееся к таким соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в пределах разумной медицинской оценки подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, при разумном соотношении польза/опасность.
Выражение фармацевтически приемлемый носитель, используемое в настоящем описании, обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или среду, такую как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, вспомогательное вещество при получении (например, смазываю
- 30 042669 щее вещество, тальк, стеараты магния, кальция или цинка или стеариновая кислота) или инкапсулирующий растворитель материал, вовлеченные в перемещение или перенос соединения в организме индивида из одного органа или части организма в другой орган или часть организма. Каждый носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и не наносить вред пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза;
(2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал;
(3) целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы;
(4) измельченный трагакант;
(5) солод;
(6) желатин;
(7) смазывающие вещества, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк;
(8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев;
(9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, сезамовое масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло;
(10) гликоли, такие как пропиленгликоль;
(11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль;
(12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат;
(13) агар;
(14) буферирующие вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия;
(15) альгиновую кислоту;
(16) апирогенную воду;
(17) изотоничный солевой раствор;
(18) раствор Рингера;
(19) этиловый спирт;
(20) рН-буферные растворы;
(21) сложные полиэфиры, поликарбонат и/или полиангидриды;
(22) наполнители, такие как полипептиды и аминокислоты;
(23) сывороточный компонент, такой как сывороточный альбумин, HDL и LDL; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических препаратах.
Препараты могут быть представлены для удобства в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любыми способами, известными в области фармации. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения единой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от реципиента, которого лечат и определенного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения единой лекарственной формы, как правило, будет таким количеством соединения, которое вызывает терапевтический эффект. Как правило, в одной сотне процентов такое количество будет изменяться от примерно 0,1% до примерно 99% активного ингредиента, предпочтительно от примерно 5% до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 10% до примерно 30%.
В некоторых вариантах осуществления препарат по настоящему изобретению содержит эксципиент, выбранный из группы, состоящей из циклодекстринов, целлюлоз, липосом, мицеллообразующих средств, например желчных кислот, и полимерных носителей, например сложных полиэфиров и полиангидридов, и соединение по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанный препарат придает пероральную биодоступность соединению по настоящему изобретению.
Препарат средства миРНК может содержать комбинацию с другим средством, например другими терапевтическим средством или веществом, которое стабилизирует иРНК, например белком, который образует комплекс с иРНК с образованием iRNP. Кроме того, другие средства включают хелаторы, например ЭДТК (например, для удаления двухвалентных катионов, таких как Mg2+), соли, ингибиторы РНКаз (например, ингибитор РНКазы широкой специфичности, такой как RNAsin) и т.п.
Способы получения таких препаратов или композиций включают стадию приведения соединения по настоящему изобретению в сочетание с носителем и необязательно одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Как правило, препараты получают путем равномерного приведения соединения по настоящему изобретению в тесный контакт с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или теми и другими и последующим при необходимости формованием продукта.
В некоторых случаях, для того чтобы пролонгировать действие лекарственного средства, желательно замедлить поглощение лекарственного средства из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно выполнить за счет использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, имеющего плохую растворимость в воде. Тогда скорость абсорбции лекарственного средства зависит от скорости растворения в воде, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. С другой стороны, замедленную абсорбцию парентерально введенного лекарственного
- 31 042669 средства можно получить, растворяя или суспендируя лекарственное средство в масляной среде.
Соединения по изобретению могут быть включены в составы для введения любым удобным путем для использования в медицине или ветеринарии по аналогии с другими фармацевтическими препаратами.
Термин лечение предназначен для обозначения также профилактики, лечения и исцеления. Пациентом, получающим такое лечение, является любое животное, нуждающееся в этом, включая приматов, в частности человека, и других млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, свиньи и овцы, и домашнюю птицу и всех домашних животных.
Двухцепочечные средства РНКи получают в клетке in vivo, например, из экзогенных ДНК-матриц, которые доставляются в клетку. Например, ДНК-матрицы могут быть встроены в векторы и использованы в качестве векторов генной терапии. Векторы генной терапии могут быть доставлены индивиду, например, внутривенной инъекцией, местным введением (патент США № 5328470) или стереотаксической инъекцией (см., например, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать вектор генной терапии в приемлемом разбавителе или может включать матрицу медленного высвобождения, в которую вставлена доставочная среда для гена. ДНК-матрицы, например, могут включать две единицы транскрипции, из которых одна продуцирует транскрипт, который включает верхнюю цепь средства дцРНК, и другая продуцирует транскрипт, который включает нижнюю цепь средства дцРНК. Когда матрицы транскрибируют, средство дцРНК продуцируется и процессируется в фрагменты средства миРНК, которые опосредуют сайленсинг гена.
Пути доставки.
Композиция, которая включает иРНК, может быть доставлена индивиду различными путями. Примеры путей включают внутривенный, подкожный, местный, ректальный, анальный, вагинальный, назальный, легочный, глазной.
Молекулы иРНК по изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции, как правило, содержат один или несколько видов иРНК и фармацевтически приемлемый носитель. Используемая в настоящем описании формулировка фармацевтически приемлемый носитель предназначена для включения любого и всех растворителей, диспергирующих сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, средств изотоничности и средств, замедляющих абсорбцию, и т.п., совместимых с фармацевтическим введением. Использование таких сред и средств с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области. Их использование в композиции предполагается за исключением случая, когда любая обычная среда или средство несовместимы с активным соединением. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить рядом способов в зависимости от того, желательно локальное или системное лечение, и участка, который обрабатывают. Введение может быть местным (включая офтальмическое, вагинальное, ректальное, интраназальное, трансдермальное), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает капельное внутривенное вливание, подкожную, интраперитонеальную или внутримышечную инъекцию или интратекальное или интравентрикулярное введение.
Путь и место введения могут быть выбраны для усиления нацеливания. Например, для того чтобы попасть в мышечные клетки, логичным выбором может быть внутримышечная инъекция в мышцы, представляющие интерес. В клетки легких можно попасть путем введения иРНК в аэрозольной форме. В сосудистые эндотелиальные клетки можно попасть с помощью покрытия с иРНК на катетере и механическим введением ДНК.
Дозировка.
В одном из аспектов особенностью изобретения является способ введения индивиду (например, человеку) средства дцРНК, например средства миРНК. Способ включает введение стандартной дозы средства дцРНК, например средства миРНК, например двухцепочечного средства миРНК, которая (а) имеет двухцепочечную часть длиной в 14-30 нуклеотидов (нк), например 21-23 нк, (b) комплементарна РНКмишени (например, эндогенной или патогенной РНК-мишени) и необязательно (с) включает по меньшей мере один 3'-выступ длиной в 1-5 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления стандартная доза составляет менее 10 мг/кг массы тела или менее 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005 или 0,00001 мг/кг массы тела и менее 200 нмоль средства РНК (например, примерно 4,4х1016 копий) на кг массы тела или менее 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075 или 0,00015 нмоль средства РНК на кг массы тела.
Определенное количество может представлять собой количество, эффективное для лечения или профилактики заболевания или расстройства, например заболевания или расстройства, связанного с РНК-мишенью. Стандартную дозу можно ввести, например, инъекцией (например, внутривенной, подкожной или внутримышечной), ингаляционной дозой или местным введением. В некоторых вариантах осуществления дозировки могут составлять менее 10, 5, 2, 1 или 0,1 мг/кг массы тела.
В некоторых вариантах осуществления стандартную дозу вводят реже одного раза в сутки, например реже чем каждые 2, 4, 8 или 30 дней. В другом варианте осуществления стандартную дозу вводят
- 32 042669 нерегулярно. Например, стандартная доза может быть введена однократно.
В одном из вариантов осуществления эффективную дозу вводят с другими традиционными терапевтическими способами. В одном из вариантов осуществления индивид имеет вирусную инфекцию и средством является противовирусное средство, иное, чем средство дцРНК, например иное, чем средство миРНК. В другом варианте осуществления индивид имеет атеросклероз и эффективную дозу средства дцРНК, например средства миРНК, вводят в комбинации, например, после, хирургического вмешательства, например ангиопластики.
В одном из вариантов осуществления индивиду вводят начальную дозу и одну или несколько поддерживающих доз средства дцРНК, например средства миРНК (например, предшественника, например средства более крупной дцРНК, которая может быть процессирована в средство миРНК, или ДНК, которая кодирует средство дцРНК, например средство миРНК, или его предшественника). Поддерживающая доза или дозы могут быть такими же или меньше, чем начальная доза, например наполовину меньше начальной дозы. Схема поддерживающего лечения может включать лечение индивида дозой или дозами, колеблющимися от 0,01 до 15 мг/кг массы тела в сутки, например 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 или 0,00001 мг на кг массы тела в сутки. Поддерживающие дозы вводят, например, не чаще чем один раз каждые 2, 5, 10 или 30 дней. Кроме того, схема лечения может длиться в течение периода времени, который будет изменяться в зависимости от характера определенного заболевания, его тяжести и общего состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления дозировка может доставляться не более одного раза в сутки, например не более одного раза в 24, 36 или 48 или более часов, например не более одного раза каждые 5 или 8 дней. После лечения пациента можно проконтролировать изменения в его состоянии и блегчение симптомов болезненного состояния. Дозировка соединения может быть или увеличена, в случае когда пациент не реагирует в достаточной степени на текущие уровни дозировки, или доза может быть уменьшена, если наблюдается облегчение симптомов болезненного состояния, если болезненное состояние не устраняется или если наблюдают побочное действие.
Эффективную дозу можно ввести в однократной дозе или в двух или более дозах, как желательно или считается соответствующим в конкретных обстоятельствах. Если желательно облегчить повторные или частые инфузии, может быть целесообразна имплантация доставочного устройства, например насоса, временного стента (например, внутривенного, интраперитонеального, интрацистернального или интракапсулярного) или резервуара.
В одном из вариантов осуществления композиция включает несколько видов средства дцРНК. В другом варианте осуществления вид средства дцРНК имеет последовательности, которые не перекрываются и не соседствуют с другими видами в отношении последовательности-мишени, встречающейся в природе. В другом варианте осуществления несколько видов средства дцРНК специфичны для различных природных генов-мишеней. В другом варианте осуществления средство дцРНК является аллельспецифическим.
Средства дцРНК по изобретению, описанные в настоящем описании, можно вводить млекопитающим, в частности крупным млекопитающим, таким как приматы, не принадлежащие к человеку, или человеку, различными путями.
В одном из вариантов осуществления введение композиции средства дцРНК, например средства миРНК, представляет парентеральное введение, например внутривенное (например, в виде болюса или в виде диффундирующей инфузии), интрадермальное, интраперитонеальное, внутримышечное, интратекальное, интравентрикулярное, интракраниальное, подкожное, трансмукозное, трансбуккальное, сублингвальное, эндоскопическое, ректальное, пероральное, вагинальное, местное, легочное, интраназальное, уретральное или глазное. Введение может быть проведено индивидом или другим человеком, например медицинским работником. Лекарственный препарат может предоставляться в отмеренных дозах или в устройстве, которое доставляет отмеренную дозу. Выбираемые типы доставки подробнее обсуждаются ниже.
Изобретение относится к способам, композициям и наборам для ректального введения или доставки средств дцРНК, описанных в настоящем описании.
Способы ингибирования экспрессии гена-мишени.
Варианты осуществления изобретения также относятся к способам ингибирования экспрессии генамишени. Способ включает стадию введения средств дцРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии гена-мишени.
Другой аспект изобретения относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему предоставление указанной клетке средства дцРНК по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления ген-мишень выбирают из группы, состоящей из фактора VII, Eg5, PCSK9, ТРХ2, ароВ, SAA, TTR, RSV, гена PDGF-бета, гена Erb-B, гена Src, гена CRK, гена CRB2, гена RAS, гена МЕКК, гена JNK, гена RAF, гена Erc1/2, гена PCNA(p21), гена MYB, гена JUN, гена FOS, гена BCL-2, гепцидена, активированного белка С, гена циклина D, гена VEGF, гена EGFR, гена циклина А, гена циклина Е, гена WNT-1, гена бета-катенина, гена с-МЕТ, гена РКС, гена NFKB, гена STAT3, гена сурвивина, гена Her2/Neu, гена топоизомеразы I, гена топоизомеразы II альфа, мутаций в гене р73, мутаций в гене р21 (WAFI/CIPI), мутаций в гене p27(KIP1), мутаций в гене PPMID, мутаций в гене RAS, мутаций в гене
- 33 042669 кавеолина I, мутаций в гене MIB I, мутаций в гене MTAI, мутаций в гене М68, мутаций в опухолевых генах-супрессорах и мутаций в опухолевом гене-супрессоре р53.
Изобретение дополнительно поясняется приведенными далее примерами, которые не следует рассматривать как ограничительные. Все ссылки, находящиеся на рассмотрении заявки на патент и опубликованные патенты, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Примеры
Пример 1. Скрининг миРНК-дуплексов in vitro.
Клеточная культура и трансфекции.
Клетки человека Нер3В или клетки крысы H.II.4.E (АТСС, Manassas, VA) выращивают почти до слияния при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в RPMI (АТСС) с добавлением 10% FBS, стрептомицина и глутамина (АТСС) и затем извлекают из чашки трипсинизацией. Трансфекцию выполняют, добавляя к 5 мкл миРНК-дуплексов на лунку в 96-луночном планшете 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13788-150), и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем к смеси миРНК добавляют 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей ~2х104 клеток Нер3В. Клетки инкубируют или 24 или 120 ч и затем очищают РНК. Эксперименты с однократной дозой выполняют при конечной концентрации дуплексов 10 и 0,1 нМ, и эксперименты по зависимости реакции от дозы выполняют с использованием 8, 4-кратных серийных разведений с максимальной дозой дуплексов в конечной концентрации 10 нМ.
Изоляция полной РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA (Invitrogen, part #: 610-12).
Клетки собирают и лизируют в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивают 5 мин при 850 об/мин с использованием термосмесителя Эппендорфа (скорость перемешивания одна и та же на протяжении процесса). В лунки планшета с круглодонными лунками добавляют смесь 10 мкл магнитных гранул и 80 мкл буфера для лизиса/связывания и перемешивают в течение 1 мин. Магнитные гранулы закрепляют с использованием магнитной подставки и супернатант удаляют, не затрагивая гранулы. После удаления супернатанта к оставшимся гранулам добавляют лизированные клетки и перемешивают в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывают 2 раза 150 мкл буфера для промывки А и перемешивают в течение 1 мин. Гранулы снова закрепляют и удаляют супернатант. Затем гранулы промывают 150 мкл буфера для промывки В, закрепляют и удаляют супернатант. Затем гранулы промывают 150 мкл буфера для элюирования, закрепляют и удаляют супернатант. Гранулы оставляют сушиться на 2 мин. После сушки добавляют 50 мкл буфера для элюирования и перемешивают в течение 5 мин при 70°С. Гранулы закрепляют магнитом в течение 5 мин. Извлекают 40 мкл супернатанта и добавляют в другой 96-луночный планшет.
Синтез кДНК с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, кат. № 4368813).
К 5 мкл полной РНК добавляют основную смесь из 1 мкл 10Х буфера, 0,4 мкл 25Х dNTP, 1 мкл случайных праймеров, 0,5 мкл обратной транскриптазы, 0,5 мкл ингибитора РНКазы и 1,6 мкл Н2О на реакцию. Генерируют кДНК с использованием термоячейки Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, CA) через следующие стадии: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, 4°С выдержка.
ПЦР в реальном времени.
К основной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Applied Biosystems, кат. № 4236317E (человека), кат. № 4308313 (грызуна)), 0,5 мкл зонда TTR TaqMan (Applied Biosystems, кат. № HS00174914_m1 (человека), кат. № Rn00562124_m1 (крысы)) и 5 мкл основной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, кат. № 04887301001), на лунку в 384-луночном планшете (Roche, кат. № 04887301001) добавляют 2 мкл кДНК. ПЦР в реальном времени проводят в аппарате для ПЦР в реальном времени Roche LC 480 (Roche). Каждый дуплекс испытывают при по меньшей мере двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию анализируют двукратно, если не указано иное.
Для того чтобы вычислить относительное кратное изменение, данные в реальном времени анализируют с использованием метода AACt и нормализуют к анализам, выполненным с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или мнимотрансфицированными клетками. IC50 вычисляют с использованием 4-параметрической модели соответствия с использованием XLFit и нормализуют к клеткам, трансфицированным AD-1955, или наивным клеткам в одном и том же интервале доз или к их собственной наименьшей дозе. IC50 вычисляют для каждой отдельной трансфекции, а также в комбинации, где одна IC50 соответствует данным из обеих трансфекций.
Результаты по сайленсингу гена примера миРНК-дуплекса с различными модификациями мотивов по изобретению приводятся в таблице ниже.
Пример 2. Синтез РНК и отжиг дуплексов.
1. Синтез олигонуклеотидов.
Все олигонуклеотиды синтезируют в синтезаторе AKTAoligopilot или синтезаторе ABI 394. Для синтеза олигонуклеотидов используют, если не указано иное, коммерчески доступный твердый носитель из пористого стекла с определенным размером пор (dT-CPG, 500А, Prime Synthesis) и фосфорамидиты
- 34 042669
РНК со стандартными защитными группами 5'-О-диметокситритил-N6-бензоил-2'-третбутилдиметилсилиладенозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритилN4-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилилцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-Oдиметокситритил-N2-изобутирил-2'-трет-бутилдиметилсилилгуанозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2цианоэтилфосфорамидит и 5'Ό-диметокситритил-2'-трет-бутилдиметилсилилуридин-3'-O-N,N'диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Р-Фосфорамидиты 5'-Oдиметокситритил-N4-ацетил-2'-фторцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-Oдиметокситритил-2'-фторуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит закупают у Promega. Все фосфорамидиты используют в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN) за исключением гуанозина, который используют в концентрации 0,2 М в смеси 10% ТГФ/ANC (об./об.). Используют время присоединения/рециклинга 16 мин. Активатором является 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals) для РО-окисления используют смесь иод/вода/пиридин, и для PS-окисления используют PADS (2%) в смеси 2,6-лутидин/ACN (1:1, об./об.).
Лигандконъюгированные цепи синтезируют с использованием твердого носителя, содержащего соответствующий лиганд. Например, введения углеводной части/лиганда (в случае, например, GalNAc) в 3'-конец последовательности достигают, начиная синтез с помощью соответствующего углеводного твердого носителя. Подобным образом холестериновую часть вводят в 3'-конец, начиная синтез на холестериновом носителе. Как правило, лигандная часть привязывается к транс-4-гидроксипролинолу через связку, выбранную так, как описано в предыдущих примерах, и получают часть гидроксипролиноллиганд. Затем часть гидроксипролинол-лиганд соединяют с твердым носителем через сукцинатный линкер или превращают в фосфорамидит в стандартных условиях фосфорилирования и получают нужные строительные блоки углеводного конъюгата. Меченые флуорофором миРНК синтезируют из соответствующего фосфорамидита или твердого носителя, закупленных у Biosearch Technologies. Олеиллитохолический (GalNAc)3 полимерный носитель готовят на фирме при нагрузке 38,6 мкмоль/г. Маннозный (Man)3 полимерный носитель также готовят на фирме при нагрузке 42,0 мкмоль/г.
Конъюгации выбранного лиганда с нужным положением, например 5'-концом последовательности, достигают, присоединяя соответствующий фосфорамидит к растущей цепи в стандартных условиях фосфорамидитного сочетания, если не указано иное. На протяжении 15 мин сочетание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора 5-(этилтио)-1Н-тетразола связывает его с олигонуклеотидом. Окисление интернуклеозидного фосфита до фосфата осуществляют с использованием стандартной йодной воды, как сообщается в (1), или путем обработки смесью третбутилгидроксипероксид/ацетонитрил/вода (10:87:3) с 10-минутным временем выдержки для окисления конъюгированного олигонуклеотида. Фосфоротиоат вводят окислением фосфита до Фосфоротиоата с использованием реагента переносчика серы, такого как DDTT (закупают у AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестеринфосфорамидит синтезируют на фирме и используют в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время сочетания для холестеринфосфорамидита составляет 16 мин.
2. Удаление защитной группы-I (удаление защитной группы нуклеотидного основания).
По завершении синтеза носитель переносят в 100-мл стеклянный флакон (VWR). Олигонуклеотид отщепляют от носителя с одновременным удалением защитной группы основания и фосфатных групп с помощью 80 мл смеси этанола с аммиаком [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 ч при 55°С. Флакон недолго охлаждают на льду и затем этанолоаммиачную смесь фильтруют в другой 250-миллилитровый флакон. CPG промывают смесью этанол/вода (1:1, об./об.) 2x40 мл. Затем объем смеси уменьшают до ~30 мл роторным испарением. Затем смесь замораживают на сухом льду и сушат в вакууме на speed vac.
3. Удаление защитной группы-II (удаление группы 2'-TBDMS).
Высушенный остаток ресуспендируют в 26 мл смеси триэтиламина, тригидрофторида триэтиламина (TEA.3HF) или пиридин-HF и ДМСО (3:4:6) и греют при 60°С в течение 90 мин для удаления третбутилдиметилсилильных (TBDMS) групп в положении 2'. Затем реакцию гасят 50 мл 20 мМ раствора ацетата натрия, доводят рН до 6,5 и хранят в замороженном состоянии до очистки.
4. Анализ.
Олигонуклеотиды перед очисткой анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), и выбор буфера и колонки зависит от характера последовательности и или конъюгированного лиганда.
5. Очистка ВЭЖХ.
Олигонуклеотиды, конъюгированные с лигандами, очищают препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищают анионообменной ВЭЖХ на колонке с гелем TSK, которую набивают на фирме. Буферами являются 20 мМ раствор фосфата натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ раствор фосфата натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN, 1 M NaBr (буфер В). Фракции, содержащие полноразмерные олигонуклеотиды, собирают вместе, обессоливают и лиофилизуют. Приблизительной 0,15 OD обессоленные олигонуклеотиды разводят в воде до 150 мкл и затем пипеткой вносят в специальные сосуды для анализа CGE и ЖХ/МС. Соединения в заключение анализируют ЖХESMC и CGE.
6. Получение миРНК.
- 35 042669
Для получения миРНК эквимолярные количества смысловой и антисмысловой цепи греют в IxPBS при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждают до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждают методом ВЭЖХ.
Таблица 1
Модифицированный дуплекс ANGPTL3
Дуплекс ID | SID | Смысловая цепь (S) | AS ID | Антисмысловая цепь (AS) | % мРНК оставшейся конц. миРНК | IC50 (НМ) | ||
1 нМ | 0.1 нМ | 0.01 нМ | ||||||
D1000 | S1000 | Af и Gf и Af a Cf cAf Af Gf aGf и Af и Uf cCf a su | AS 1000 | AfUfgGfaAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.1 | 0.47 | 0.006 |
D1001 | S1001 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS 1001 | aUfsgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.10 | 0.49 | 0.0065 |
D1002 | S1002 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1002 | aUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgsUfuAfcAfusGfsa | 0.04 | 0.10 | 0.46 | 0.0068 |
D1003 | S1003 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1003 | aUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfsuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.12 | 0.56 | 0.0073 |
D1004 | S1004 | aUGuaACccAGagUAuuCCasu | AS 1004 | AUggAAuaCUcuUGguUAcaUsGsa | 0.07 | 0.13 | 0.44 | 0.008 |
D1005 | S1005 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1005 | aUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgsUfsuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.11 | 0.53 | 0.0093 |
D1006 | S1006 | AfuGfuAfAfccAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1006 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfGfuuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.16 | 0.55 | 0.0095 |
D1007 | S1007 | AfuGfuAfAfCfcAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1007 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfguuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.14 | 0.48 | 0.0098 |
D1008 | S1008 | auguaaccaadGadGudAudAcdGasu | AS 1008 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.07 | 0.11 | 0.33 | 0.010 |
D1009 | S1009 | UfgGfGfAfuUfuCfAfUfgUfaAfcCfAfAfgsAf | AS 1009 | uCfuugGfuUfaCfaugAfaAfuccCfasUfsc | 0.03 | 0.14 | 0.56 | 0.0101 |
D1010 | S1010 | UfgGfgauUfuCfAfUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS1010 | uCfuUfgGfuUfaCfaugAfaAfUfCfcCfasUfsc | 0.03 | 0.14 | 0.65 | 0.0101 |
D1O11 | S1O11 | aUfGfuAfAfccAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1011 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfGfuuAfcaUfsgsa | 0.06 | 0.10 | 0.55 | 0.011 |
D1012 | S1012 | UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgsAf | AS1012 | uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.04 | 0.13 | 0.54 | 0.0114 |
D1013 | S1013 | auguaaccaadGadGudAudAcdGasu | AS1013 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfugdGudTadCadTsgsa | 0.11 | 0.19 | 0.49 | 0.011 |
D1014 | S1014 | AfuGfuaaCfcAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1014 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.04 | 0.16 | 0.59 | 0.013 |
D1015 | S1015 | AfuguAfaccAfaGfdAGfdTAdTudCcdAsu | AS1015 | dAUdGgdAadTAfdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.07 | 0.15 | 0.51 | 0.013 |
D1016 | S1016 | auGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1016 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.05 | 0.14 | 0.64 | 0.013 |
D1017 | S1017 | UfGfggAfuUfuCfAfUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS1017 | uCfuUfgGfuuaCfaugAfaAfuCfCfcasUfsc | 0.09 | 0.41 | 0.74 | 0.0133 |
D1018 | S1018 | AfuguAfaCfcAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1018 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.03 | 0.14 | 0.61 | 0.014 |
D1019 | S1019 | AfuGfuAfaccAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1019 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.02 | 0.2 | 0.7 | 0.014 |
D1020 | S1020 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1020 | asUfsgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.04 | 0.16 | 0.67 | 0.0156 |
D1021 | S1021 | aUfguAfAfccAfAfgagUfaUfuCfcasUf | AS 1021 | aUfGfgAfaUfaCfUfCfuuGfGfuuAfCfaUfsgsa | 0.11 | 0.24 | 0.64 | 0.016 |
D1022 | S1022 | dTdGggdAdTuudCdAugdTdAacdCdAagsdA | AS1022 | udCdTugdGdTuadCdAugdAdAaudCdCcasdTsc | 0.08 | 0.27 | 0.64 | 0.0161 |
D1023 | S1023 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1023 | aUfgsGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.19 | 0.63 | 0.0163 |
D1024 | S1024 | UfgGfgAfuUfuCfAfUfguaAfcCfaAfgsAf | AS1024 | uCfuUfgGfuUfAfCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.05 | 0.25 | 0.69 | 0.0164 |
D1025 | S1025 | UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS1025 | uCfuUfgGfuuaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.04 | 0.18 | 0.75 | 0.0166 |
D1026 | S1026 | UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS1026 | uCf и UfgGf и UfaCfa ugAfa Af uCfcCfasUfsc | 0.04 | 0.19 | 0.66 | 0.0178 |
D1027 | S1027 | UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaAfccaAfgsAf | AS1027 | uCfuUfGfGfuUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.04 | 0.19 | 0.69 | 0.018 |
D1028 | S1028 | dAdTgudAdAccdAdAgadGdTaudTdCcasdT | AS1028 | adTdGgadAdTacdTdCuudGdGuudAdCausdGsa | 0.15 | 0.29 | 0.72 | 0.018 |
D1029 | S1029 | AdTGdTAdACdCAdAGdAGdTAdTUdCCdAsU | AS 1029 | dAUdGGdAAdTAdCUdCUdTGdGUdTAdCAdTsGsdA | 0.1 | 0.27 | 0.61 | 0.018 |
D1030 | S1030 | UfgGfGfAfuuuCfAfUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS1030 | uCf и UfgGf и UfaCfa ugAfAfAf uccCfasUfsc | 0.04 | 0.21 | 0.64 | 0.0187 |
D1031 | S1031 | AfuGfuAfAfccAfAfGfAfGfuAfuuccAfsu | AS1031 | AfUfGfGfAfAfuAfCfUfCfUfuGfGfuuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.15 | 0.62 | 0.019 |
D1032 | S1032 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1032 | asUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfsuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.34 | 0.78 | 0.021 |
D1O33 | S1O33 | UfgGfgAfuUfuCfaUfGfUfaacCfaAfgsAf | AS1033 | uCfuUfgGfUfUfacaUfgAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.06 | 0.26 | 0.57 | 0.0212 |
D1034 | S1034 | AfuGfuAfAfccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1034 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfGfuuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.39 | 0.82 | 0.0216 |
D1035 | S1035 | UfgGfgAfuuuCfAfUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS1035 | uCfuUfgGfuUfaCfaugAfAfAfuCfcCfasUfsc | 0.04 | 0.16 | 0.56 | 0.0222 |
D1036 | S1036 | UfgGfGfAfuUfuCfaUfgUfaAfcCfAfAfgsAf | AS1036 | uCfuugGfuUfaCfaUfgAfaAfuccCfasUfsc | 0.06 | 0.31 | 0.78 | 0.0234 |
D1037 | S1037 | UfgGfGfAfuUfuCfAfUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS1037 | uCf и UfgGf и UfaCfa ugAfa Af uccCfasUfsc | 0.03 | 0.14 | 0.62 | 0.0235 |
D1038 | S1038 | UfGfggAfUfuuCfAfugUfAfacCfAfagsAf | AS1038 | uCfUfugGfUfuaCfAfugAfAfauCfCfcasUfsc | 0.09 | 0.39 | 0.78 | 0.0239 |
D1039 | S1039 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS 1039 | aUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.14 | 0.59 | 0.025 |
D1040 | S1040 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuUfccasUf | AS1040 | aUfGfGfaAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.13 | 0.56 | 0.025 |
D1041 | S1041 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1041 | asUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.27 | 0.79 | 0.0252 |
D1042 | S1042 | UfgGfgAfuuuCfAfUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS1042 | uCf и UfgGf и uaCfa UgAfAfAf uCfcCfasUfsc | 0.05 | 0.27 | 0.67 | 0.0259 |
D1043 | S1043 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuauUfcCfasUf | AS1043 | aUfgGfaAfUfAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.02 | 0.16 | 0.63 | 0.027 |
D1044 | S1044 | AfsuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuucCfasUf | AS1044 | asUfgGfAfAfuAfcUfcuuGfgsUfsuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.30 | 0.81 | 0.0271 |
D1045 | S1045 | aUfguAfAfccAfAfgaGfGfauUfCfcasUf | AS1045 | aUfGfgaAfUfacUfCfuuGfGfuuAfCfaUfsgsa | 0.12 | 0.29 | 0.8 | 0.028 |
D1046 | S1046 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaguAfuUfcCfasUf | AS1046 | aUfgGfaAfuAfCfUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.03 | 0.15 | 0.59 | 0.030 |
D1047 | S1047 | UfgGfGfAfuUfuCfaUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS 1047 | uCf и UfgGf и uaCfa UfgAfa Af uccCfasUfsc | 0.08 | 0.44 | 0.83 | 0.0324 |
D1048 | S1048 | AfuGfuAfaCfcAfAfGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1048 | aUfgGfaAfuAfcUfcuuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.07 | 0.23 | 0.67 | 0.036 |
D1049 | S1049 | AfuGfuAfAfccAfAfGfAfGfuAfuuccAfsu | AS1049 | AfUfGfGfAfAfuAfCfUfCfUfUfGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.08 | 0.23 | 0.73 | 0.037 |
- 36 042669
D1O5O | S1050 | UfgGfgAf u uuCfa UfgUfaAfcCfAf AfgsAf | AS 1050 | uCfuugGfuUfaCfaUfgAfAfAfuCfcCfasUfsc | 0.06 | 0.29 | 0.78 | 0.0372 |
D1O51 | S1051 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS 1051 | aUfgGfaAfudAcdTcdTudGgdTuAfcAfusgsa | 0.12 | 0.41 | 0.86 | 0.040 |
D1O52 | S1052 | AfuguAfaccAfaGfdAGfdTAdTUdCcdAsu | AS1052 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.22 | 0.72 | 0.042 |
D1O53 | S1053 | AfuguAfaccAfaGfdAGfdTAdTUdCcdAsu | AS1053 | dAUdGGdAAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.09 | 0.31 | 0.69 | 0.044 |
D1054 | S1054 | AfuGfuAfaCfcAfaGfadGdTAfuUfcdCdAsUf | AS 1054 | adTdGGfaAfudAdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.45 | 0.75 | 0.047 |
D1O55 | S1055 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTAdTUdCcdAsu | AS1055 | dAUdGGdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.26 | 0.7 | 0.049 |
D1056 | S1056 | AuGuAaCcAaGaGuAuUcCasU | AS1056 | □UgGaAuAcUcUuGgUuAcAusGsa | 0.08 | 0.24 | 0.65 | 0.050 |
D1O57 | S1057 | AfuguAfaccAfagaGfuauUfccasUf | AS1057 | aUfGfGfaAfUfAfcUfCfUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.14 | 0.42 | 0.62 | 0.051 |
D1058 | S1058 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS 1058 | aUfgGfaAfudAcdTcdTudGgdTuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.36 | 0.86 | 0.053 |
D1059 | S1059 | AfuguAfaccAfaGfdAGfdTAdTUdCcdAsu | AS1059 | dAUdGGdAadTAfdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.27 | 0.7 | 0.054 |
D1060 | S1060 | adTgudAdAccdAdAgagdTadTudCcasdT | AS1060 | adTdGgdAadTadCdTdCuudGdGuudAdCadTsgsa | 0.11 | 0.37 | 0.66 | 0.056 |
D1061 | S1061 | AfuGfuAfaCfcAfaGfdAdGuAfuUfcdCdAsUf | AS1061 | adTdGGfaAfuAfdCdTcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.31 | 0.77 | 0.059 |
D1062 | S1062 | AfuguAfaccAfaGfdAGfdTAdTudCcdAsu | AS1062 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.27 | 0.65 | 0.059 |
D1063 | S1063 | adTdGuadAdCccdAdGagdTdAuudCdCasu | AS1063 | dAdTggdAdAuadCdTcudTdGgudTdAcadTsdGsa | 0.12 | 0.44 | 0.82 | 0.064 |
D1064 | S1064 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfdTdAuUfcdCdAsUf | AS1064 | adTdGGfaAfdTdAcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.32 | 0.83 | 0.064 |
D1065 | S1065 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTAdTudCcdAsu | AS1065 | dAUdGgdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.34 | 0.72 | 0.066 |
D1066 | S1066 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfudAdTUfcdCdAsUf | AS1066 | adTdGGfadAdTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.33 | 0.72 | 0.067 |
D1067 | S1067 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTAdTUdCcdAsu | AS1067 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.37 | 0.62 | 0.070 |
D1068 | S1068 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTAdTUdCcdAsu | AS1068 | dAUdGGdAAuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.16 | 0.33 | 0.64 | 0.072 |
D1069 | S1069 | aUfGfuaAfCfccAfGfagUfAfuuCfCfasu | AS1069 | AfUfggAfAfuaCfUfcuUfGfguUfAfcaUfsGfsa | 0.14 | 0.43 | 0.73 | 0.074 |
D1O7O | S1070 | AfuGfuAfaCfCfAfaGfaguAfuUfcCfasUf | AS 1070 | aUfgGfaAfuAfCfUfcUfuggUfuAfcAfusGfsa | 0.08 | 0.42 | 0.94 | 0.075 |
D1O71 | S1071 | UfgGfgAfuuuCfaUfgUfaAfcCfaAfgsAf | AS 1071 | u Cf u UfgGf u UfaCfa UfgAf Af Af u Cf cCf a sUf sc | 0.14 | 0.28 | 0.83 | 0.0797 |
D1O72 | S1072 | AfuGfuAfaCfcAfaGfAfGfuauUfcCfasUf | AS1072 | aUfgGfaAfUfAfcucUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.26 | 0.8 | 0.082 |
D1O73 | S1073 | AfuGfuAfaCfcAfaGfadGdTdAdTUfcCfasUf | AS1073 | aUfgGfadAdTdAdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.41 | 0.73 | 0.083 |
D1074 | S1074 | AfUfguAfAfccAfAfgaGfUfauUfCfcasUf | AS1074 | aUfGfgaAfUfacUfCfuuGfGfuuAfCfausGfsa | 0.14 | 0.44 | 0.75 | 0.086 |
D1O75 | S1075 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1075 | aUfgGfdAdAdTdAcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.41 | 0.72 | 0.088 |
D1076 | S1076 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfudAdTdTdCCfasUf | AS1076 | aUfgdGdAdAdTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.45 | 0.86 | 0.088 |
D1O77 | S1077 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasu | AS1077 | AfUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.08 | 0.46 | 0.95 | 0.092 |
D1078 | S1078 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1078 | dAUdGGdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.32 | 0.76 | 0.093 |
D1079 | S1079 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTadTudCcdAsu | AS 1079 | dAudGgdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.38 | 0.76 | 0.095 |
D1080 | S1080 | Af u Gf u Af a Cfc Af a Gf Af Gf u Af u ucCf a sUf | AS 1080 | aUfgGfAfAfuAfcucUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.42 | 0.86 | 0.099 |
D1081 | S1081 | Af u Gf u Af a Cf cAf a Gf a Gf u Af u Ufd CdCd AsdT | AS 1081 | dAdTdGdGaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.17 | 0.47 | 0.9 | 0.105 |
D1082 | S1082 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS 1082 | aUfgGfaAfudACfudCUfudGGfudTAfcAfusgsa | 0.12 | 0.44 | 0.83 | 0.106 |
D1083 | S1083 | Af u Gf u Af a Cf cAf a Gf a Gf u Af u UfcCf a sUf | AS1083 | adTdGGfaAfdTdAcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.34 | 0.74 | 0.109 |
D1084 | S1084 | AfuGfuAfAfCfcAfaGfaGfuauUfcCfasUf | AS 1084 | aUfgGfaAfUfAfcUfcUfuGfguuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.45 | 0.93 | 0.117 |
D1085 | S1085 | AfuGfUfAfaCfcAfaGfaGfuauUfcCfasUf | AS1085 | aUfgGfaAfUfAfcUfcUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.07 | 0.42 | 0.78 | 0.120 |
D1086 | S1086 | aUfguAfAfccAfAfgaGfuAfuUfcCfasUf | AS 1086 | aUfgGfaAfuAfcUfCfuuGfGfuuAfCfaUfsgsa | 0.17 | 0.45 | 0.83 | 0.1197 |
D1087 | S1087 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfUfAfuUfcCfasu | AS 1087 | AfUfgGfaAfuacUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.3 | 0.7 | 0.120 |
D1088 | S1088 | Af u Gf u Af a Cf cAf a Gf a Gf u Af u UfcCf a sUf | AS 1088 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusgsa | 0.11 | 0.46 | 0.8 | 0.120 |
D1089 | S1089 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS 1089 | aUfgGfaAfuacUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.49 | 0.85 | 0.122 |
D1090 | S1090 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuauUfcCfasUf | AS 1090 | aUfgGfaAfUfAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.41 | 0.85 | 0.125 |
D1091 | S1091 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTAdTudCcdAsu | AS 1091 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.38 | 0.77 | 0.125 |
D1092 | S1092 | Af u Gf u Af a Cf cAf a Gf Af Gf u Af u UfcCf a su | AS1092 | AfUfgGfaAfuAfcucUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.31 | 0.93 | 0.126 |
D1093 | S1093 | a u Gf u Af a Cf cAf a Gf Af Gf u Af u UfcCf a sUf | AS1093 | aUfgGfaAfuAfcucUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.06 | 0.33 | 0.9 | 0.135 |
D1094 | S1094 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfUfAfuUfccasUf | AS 1094 | aUfGfGfaAfuacUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.07 | 0.39 | 0.85 | 0.142 |
D1095 | S1095 | AfuGfuAfaCfcAfaGfAfGfuAfuUfcCfasUf | AS1095 | a UfgGfa Af u Afc u c Uf u GfgUf u Afc Af u sGf sa | 0.09 | 0.39 | 0.76 | 0.146 |
D1096 | S1096 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfUfAfuucCfasUf | AS1096 | aUfgGfAfAfuacUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.38 | 0.85 | 0.147 |
D1097 | S1097 | AfuGfUfAfaCfcAfaGfaGfuAfuucCfasUf | AS1097 | aUfgGfAfAfuAfcUfcUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.12 | 0.47 | 0.87 | 0.147 |
D1098 | S1098 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfUfUfccasUf | AS1098 | aUfGfGfaauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.42 | 0.85 | 0.151 |
D1099 | S1099 | Af u Gf u Af a Cf cAf a Gf a Gf u Af u UfcCf a sUf | AS 1099 | dAUdGGdAadTAfdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.41 | 0.85 | 0.152 |
DI 100 | S1100 | AfuguAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS 1100 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.48 | 0.72 | 0.152 |
D1101 | S1101 | AfuGfuAfaCfcAfaGfAfGfuAfuUfccasUf | AS1101 | aUfGfGfaAfuAfcucUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.38 | 0.94 | 0.158 |
D1102 | S1102 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS 1102 | aUfgGfaAfuAfdCuCfdTuGfdGuUfacAfusGfsa | 0.21 | 0.45 | 0.89 | 0.162 |
D1103 | S1103 | AfuGfuaaCfCfAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1103 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuggUfUfAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.49 | 0.95 | 0.163 |
- 37 042669
D1104 | S1104 | AfuGfuAfaccAfaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1104 | aUfgGfaAfuacUfcUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.36 | 0.92 | 0.163 |
D11O5 | S1105 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuucCfasUf | AS 1105 | aUfgGfAfAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.45 | 0.84 | 0.167 |
D1106 | S1106 | AfuGfuaaCfcAfaGfAfGfuAfuUfcCfasUf | AS 1106 | aUfgGfaAfuAfcucUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.43 | 0.91 | 0.170 |
D11O7 | S1107 | AfuGfuAfaccAfaGfAfGfuAfuUfcCfasUf | AS1107 | aUfgGfaAfuAfcucUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.46 | 1 | 0.171 |
DI 108 | S1108 | AfuguAfaccAfaGfaGfdTadTudCcdAsu | AS 1108 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.39 | 0.71 | 0.176 |
DI 109 | S1109 | AfuGfUfAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfccasUf | AS1109 | aUfGfGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.1 | 0.43 | 0.9 | 0.180 |
D1110 | S1110 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaguAfUfUfcCfasUf | AS1110 | aUfgGfaauAfCfUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.06 | 0.42 | 0.88 | 0.182 |
Dllll | Sllll | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1111 | dAUdGGdAAuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.18 | 0.49 | 0.79 | 0.183 |
D1112 | S1112 | AfuGfUfAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1112 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuacAfusGfsa | 0.14 | 0.48 | 0.85 | 0.195 |
D1113 | S1113 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaguAfuUfcCfasUf | AS1113 | aUfgGfaAfuAfCfUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.41 | 0.85 | 0.201 |
D1114 | S1114 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1114 | aUfgGfaAfuacUfcUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.05 | 0.44 | 0.94 | 0.201 |
D1115 | S1115 | AfuguAfaCfcAfaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1115 | aUfgGfaAfuacUfcUfuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.08 | 0.41 | 0.96 | 0.204 |
D1116 | S1116 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1116 | adTdGGfadAdTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.47 | 0.79 | 0.208 |
D1117 | S1117 | AfuGfuaaCfcAfaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1117 | aUfgGfaAfuacUfcUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.08 | 0.42 | 0.92 | 0.224 |
D1118 | S1118 | auguaaccaagaguauuccasu | AS1118 | AfUfGfGfAfAfUfAfCfUfCfUfUfGfGfUfUfAfCfAfUfsgsa | 0.19 | 0.5 | 0.87 | 0.303 |
D1119 | S1119 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1119 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.55 | 0.89 | |
D1120 | S1120 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1120 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.19 | 0.63 | 0.72 | |
D1121 | S1121 | AfuGfuAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1121 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.61 | 0.91 | |
D1122 | S1122 | AfUfGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfccasUf | AS1122 | aUfGfGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcausGfsa | 0.14 | 0.54 | 0.95 | |
D1123 | S1123 | auGfuAfAfCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1123 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfguuAfcAfUfsGfsa | 0.13 | 0.61 | 0.97 | |
D1124 | S1124 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1124 | aUfgGfaauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.56 | 0.94 | |
D1125 | S1125 | AfuGfuAfaCfcaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1125 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.21 | 0.74 | 0.95 | |
D1126 | S1126 | AfUfGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuucCfasUf | AS1126 | aUfgGfAfAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcausGfsa | 0.2 | 0.69 | 0.91 | |
D1127 | S1127 | AfuguAfAfCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1127 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfguuAfCfAfusGfsa | 0.17 | 0.7 | 0.96 | |
D1128 | S1128 | AfUfGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1128 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcausGfsa | 0.19 | 0.62 | 0.85 | |
D1129 | S1129 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | AS1129 | aUfggaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.23 | 0.76 | 0.98 | |
D1130 | S1130 | AfuGfuAfaCfcAfagaGfuAfuUfcCfasUf | AS1130 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.21 | 0.64 | 0.9 | |
D1131 | S1131 | AfuGfuAfAfCfcaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1131 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfUfGfguuAfcAfusGfsa | 0.17 | 0.7 | 1.01 | |
D1132 | S1132 | AfuGfUfAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI132 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.17 | 0.58 | 0.87 | |
D1133 | S1133 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | ASI133 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.33 | 0.89 | 1.05 | |
D1134 | S1134 | AfUfGfuAfaCfcAfaGfaguAfuUfcCfasUf | ASI134 | aUfgGfaAfuAfCfUfcUfuGfgUfuAfcausGfsa | 0.16 | 0.64 | 0.96 | |
D1135 | S1135 | AfuGfUfAfaCfcAfaGfaguAfuUfcCfasUf | AS1135 | aUfgGfaAfuAfCfUfcUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.12 | 0.53 | 0.96 | |
D1136 | S1136 | AfuGfuAfAfCfcAfagaGfuAfuUfcCfasUf | AS1136 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfguuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.58 | 0.98 | |
D1137 | S1137 | AfuGfuAfAfCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI137 | a UfgGf a Af u Af c Uf cU f u Gfgu u Afc Af u sGf sa | 0.16 | 0.6 | 0.91 | |
D1138 | S1138 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI138 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsAf | 0.1 | 0.54 | 0.91 | |
D1139 | S1139 | AfUfGfuAfaCfcAfagaGfuAfuUfcCfasUf | ASI139 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfgUfuAfcausGfsa | 0.24 | 0.68 | 0.98 | |
D1140 | S1140 | AfuGfUfAfaCfcAfagaGfuAfuUfcCfasUf | ASI140 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfgUfuacAfusGfsa | 0.13 | 0.75 | 0.9 | |
D1141 | S1141 | AfuGfuAfAfCfcAfaGfaguAfuUfcCfasUf | ASI141 | aUfgGfaAfuAfCfUfcUfuGfguuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.52 | 1.05 | |
D1142 | S1142 | AfuGfuAfaCfCfAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI142 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuggUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.66 | 0.89 | |
D1143 | S1143 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI143 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.12 | 0.51 | 0.89 | |
D1144 | S1144 | AfUfGfuAfaCfcaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI144 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfUfGfgUfuAfcausGfsa | 0.25 | 0.71 | 0.95 | |
D1145 | S1145 | AfuGfUfAfaCfcaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI145 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfUfGfgUfuacAfusGfsa | 0.17 | 0.74 | 0.98 | |
D1146 | S1146 | AfuguAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI146 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.11 | 0.51 | 0.86 | |
D1147 | S1147 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfccasUf | ASI147 | aUfGfGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.1 | 0.52 | 0.83 | |
DI 148 | SI 148 | AfUfGfuAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI148 | a UfgGfaAf u AfcUfcUf uGfGfUfu Afca usGfsa | 0.14 | 0.63 | 0.98 | |
DI 149 | SI 149 | AfuGfuAfAfCfcAfaGfaGfuAfuucCfasUf | ASI149 | aUfgGfAfAfuAfcUfcUfuGfguuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.58 | 0.88 | |
D1150 | S1150 | AfuGfuaaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI150 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.62 | 0.94 | |
D1151 | S1151 | AfUfGfuaaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1151 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfUfAfcausGfsa | 0.18 | 0.73 | 0.94 | |
D1152 | S1152 | auGfUfAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI152 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuacAfUfsGfsa | 0.13 | 0.53 | 0.97 | |
D1153 | S1153 | AfuGfuAfAfCfcAfaGfaGfuAfuUfccasUf | ASI153 | aUfGfGfaAfuAfcUfcUfuGfguuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.53 | 0.98 | |
D1154 | S1154 | UfgGfgAfuUfuCfaUfgUfaAfcCfaAfgsAf | ASI154 | uCfuUfgGfuUfaCfaUfgAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.09 | 0.5 | 0.78 | |
D1155 | S1155 | UfgGfGf Afu u uCfa UfgUf Af AfcCfa AfgsAf | ASI155 | uCfuUfgGfuuaCfaUfgAfAfAfuccCfasUfsc | 0.13 | 0.62 | 0.89 | |
D1156 | S1156 | UfgGfgAfuuuCfaUfGfUfaAfcCfaAfgsAf | AS1156 | uCfuUfgGfuUfacaUfgAfAfAfuCfcCfasUfsc | 0.12 | 0.65 | 0.85 | |
D1157 | S1157 | UfgGfgAfuUfuCfaUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | ASI157 | uCfuUfgGfuuaCfaUfgAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.11 | 0.54 | 0.85 |
- 38 042669
D1158 | S1158 | UfgGfgAfuuuCfaUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS1158 | uCfuUfgGfuuaCfaUfgAfAfAfuCfcCfasUfsc | 0.13 | 0.53 | 0.8 | |
D1159 | S1159 | UfGfggAfUfuUfcAfuGfuAfAfccAfAfgsAf | AS1159 | uCfuuGfGfuuAfcAfuGaAfauCfCfcasUfsc | 0.59 | 0.89 | 0.81 | |
DI 160 | S1160 | UfGfggAfUfuuCfaUfgUfAfAfcCfaAfgsAf | AS1160 | u Cf u UfgGf u u a Cf a UfgAf Af a uCfCfca sUf sc | 0.16 | 0.72 | 0.9 | |
D1161 | S1161 | UfgGfgAfuUfucaUfGfUfaAfcCfaAfgsAf | AS1161 | uCfuUfgGfuUfacaUfGfAfaAfuCfcCfasUfsc | 0.27 | 0.69 | 0.86 | |
D1162 | S1162 | AfuGfuAfaCfcaaGfaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1162 | aUfgGfaAfuacUfcUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.6 | 0.95 | |
D1163 | S1163 | AfuGfuAfaccAfaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1163 | aUfgGfaauAfcUfcUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.05 | 0.56 | 1.02 | |
DI 164 | S1164 | AfuGfuAfaCfcAfagaGfUfAfuUfcCfasUf | AS1164 | aUfgGfaAfuacUfCfUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.55 | 1 | |
D1165 | S1165 | AfuGfuAfaCfcaaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1165 | aUfgGfaauAfcUfcUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.09 | 0.6 | 0.97 | |
D1166 | S1166 | AfuguAfaCfCfAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1166 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuggUfuAfCfAfusGfsa | 0.15 | 0.59 | 0.91 | |
D1167 | S1167 | AfuGfuAfaCfcAfagaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1167 | aUfgGfaauAfcUfCfUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.59 | 1 | |
DI 168 | S1168 | AfuGfuAfaCfCfAfagaGfuAfuUfcCfasUf | AS1168 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuggUfuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.57 | 0.94 | |
DI 169 | S1169 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1169 | aUfgGfaauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.08 | 0.5 | 0.9 | |
D1170 | S1170 | AfuguAfaCfcAfaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1170 | aUfgGfaauAfcUfcUfuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.06 | 0.53 | 0.91 | |
D1171 | S1171 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | AS1171 | aUfggaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.07 | 0.56 | 0.89 | |
D1172 | S1172 | AfuGfuAfaCfCfAfaGfaGfuAfuucCfasUf | AS1172 | aUfgGfAfAfuAfcUfcUfuggUfuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.59 | 0.98 | |
D1173 | S1173 | AfuGfuAfaCfcaaGfAfGfuAfuUfcCfasUf | AS1173 | aUfgGfaAfuAfcucUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.2 | 0.65 | 1.03 | |
D1174 | S1174 | AfuGfuaaCfcAfaGfaGfuAfUfUfcCfasUf | AS1174 | aUfgGfaauAfcUfcUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.07 | 0.51 | 0.95 | |
D1175 | S1175 | AfuguAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | AS1175 | aUfggaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.2 | 0.53 | 0.76 | |
D1176 | S1176 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | AS1176 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.74 | 0.98 | 0.81 | |
D1177 | S1177 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuucCfAfsUf | AS1177 | augGfAfAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.43 | 0.64 | 0.88 | |
D1178 | S1178 | auguaaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1178 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.17 | 0.49 | 0.81 | |
D1179 | S1179 | AfuGfuaaCfcAfaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | AS1179 | aUfggaAfuAfcUfcUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.22 | 0.65 | 0.73 | |
DI 180 | SI 180 | AfuguAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | AS1180 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfUfsGfsa | 0.6 | 1.09 | 0.8 | |
D1181 | S1181 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfccasu | AS1181 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.3 | 0.78 | 0.78 | |
DI 182 | S1182 | auguaaccaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1182 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.35 | 0.73 | 0.84 | |
DI 183 | S1183 | AfuGfuAfaccAfaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | AS1183 | aUfggaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.19 | 0.6 | 0.94 | |
DI 184 | SI 184 | AfuGfuaaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | AS1184 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfCfAfusGfsa | 0.61 | 1.08 | 0.8 | |
DI 185 | S1185 | auGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuuccasu | ASI185 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.52 | 0.72 | |
DI 186 | S1186 | auguaaccaagaGfuAfuUfcCfasUf | ASI186 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.2 | 0.53 | 0.74 | |
DI 187 | S1187 | AfuGfuAfaCfcaaGfaGfuAfuUfCfCfasUf | ASI187 | aUfggaAfuAfcUfcUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.34 | 0.66 | 0.85 | |
DI 188 | SI 188 | AfuGfuAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | ASI188 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfUfAfcAfusGfsa | 0.61 | 0.98 | 1.02 | |
DI 189 | SI 189 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuuccasu | ASI189 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.3 | 0.73 | 0.85 | |
DI 190 | S1190 | auguaaccaagaguauuccasu | ASI190 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.28 | 0.69 | 0.78 | |
D1191 | S1191 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1191 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfugdGudTadCadTsgsa | 0.33 | 0.88 | 0.64 | |
D1192 | S1192 | AfuGfuAfaCfcAfagaGfuAfuUfCfCfasUf | ASI192 | aUfggaAfuAfcUfCfUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.31 | 0.64 | 0.83 | |
D1193 | S1193 | AfuGfuAfaCfcaaGfaGfuAfuUfcCfAfsUf | ASI193 | augGfaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfcAfusGfsa | 0.64 | 0.82 | 0.92 | |
DI 194 | S1194 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuauuccasu | ASI194 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.21 | 0.62 | 0.77 | |
D1195 | S1195 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | ASI195 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.17 | 0.7 | 0.95 | |
D1196 | S1196 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaguAfuUfCfCfasUf | ASI196 | aUfggaAfuAfCfUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.19 | 0.71 | 0.65 | |
D1197 | S1197 | AfuGfuAfaCfcAfagaGfuAfuUfcCfAfsUf | ASI197 | augGfaAfuAfcUfcUfUfGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.64 | 0.82 | 0.93 | |
DI 198 | S1198 | auguAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfccasu | ASI198 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.19 | 0.65 | 0.72 | |
DI 199 | S1199 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuauUfCfCfasUf | ASI199 | aUfggaAfUfAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.52 | 0.64 | |
D1200 | S1200 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaguAfuUfcCfAfsUf | AS1200 | augGfaAfuAfcUfCfUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.48 | 0.74 | 0.92 | |
D1201 | S1201 | auguAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasu | AS1201 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.17 | 0.71 | 0.77 | |
D1202 | S1202 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuauUfcCfAfsUf | AS1202 | augGfaAfuAfCfUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.43 | 0.69 | 0.85 | |
D1203 | S1203 | auguaaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1203 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.61 | 0.76 | |
D1204 | S1204 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1204 | adTdGGfaAfudAdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.56 | 0.89 | |
D1205 | S1205 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfdTdAdTdTcCfasUf | AS1205 | aUfgGfdAdAdTdAcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.13 | 0.57 | 0.9 | |
D1206 | S1206 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1206 | adTdGdGdAAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.29 | 0.73 | 0.89 | |
D1207 | S1207 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1207 | adTdGGfaAfuAfdCdTcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.56 | 0.78 | |
D1208 | S1208 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1208 | aUfdGdGdAdAuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.22 | 0.67 | 0.89 | |
D1209 | S1209 | AfuguAfaccAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1209 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.14 | 0.55 | 0.78 | |
D1210 | S1210 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1210 | aUfgdGdAdAdTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.5 | 0.84 | |
D1211 | S1211 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1211 | aUfgGfadAdTdAdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.14 | 0.59 | 0.72 |
- 39 042669
D1212 | 51212 | auguaaccaaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1212 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfugdGudTadCadTsgsa | 0.21 | 0.74 | 0.77 | |
D1213 | 51213 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfudTdCdCdAsUf | AS1213 | adTdGdGdAAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.15 | 0.53 | 0.91 | |
D1214 | 51214 | aUfgUfaAfcCfaAfgAfgUfaUfuCfcAfsu | AS1214 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.12 | 0.71 | 0.87 | |
D1215 | 51215 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfdTdTdCdCasUf | AS1215 | aUfdGdGdAdAuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.18 | 0.67 | 0.97 | |
D1216 | 51216 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1216 | aUfgGfaAfuacucuuggUfuAfcAfusgsa | 0.36 | 0.87 | 1.07 | |
D1217 | 51217 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1217 | a UfgGfa Af u AfCfUfCf UfuGfGf u uAfcAf usgsa | 0.37 | 0.73 | 1.03 | |
D1218 | 51218 | AfUfguAfAfccAfAfgaGfUfauUfCfcasUf | AS1218 | aUfGfgaAfUfacUfCfuuGfGfuuAfCfausGfsa | 0.23 | 0.42 | 0.84 | |
D1219 | 51219 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1219 | aUfgGfaAfuaCfUfcUfUfgGfuuAfcAfusgsa | 0.43 | 0.71 | 1.03 | |
D122O | S122O | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS122O | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfGfuuAfcAfusgsa | 0.37 | 0.63 | 0.99 | |
D1221 | S1221 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1221 | aUfgGfaAfuAfcUfCfUfuGfGfuUfacAfusgsa | 0.29 | 0.84 | 0.88 | |
D1222 | S1222 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1222 | a UfgGf a Af u a Cf u Cf u UfgGf u uAfcAf u sgsa | 0.31 | 0.8 | 0.99 | |
D1223 | S1223 | a u Gf u Af Afcc Af a Gf agUf a Uf UfcCf a sUf | AS1223 | a UfgGfa a Ufa CfUf c Uf u Gf Gfu uAfcAfAf sgsa | 0.09 | 0.52 | 0.82 | |
D1224 | S1224 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1224 | aUfgGfaAfuadCudCudTgdGuuAfcAfusgsa | 0.22 | 0.79 | 1 | |
D1225 | S1225 | auGfuaAfccAfagAfguAfuuCfcasUf | AS1225 | a UfGfgAf Af u Af Cf u Cf Uf u Gf Gf u UfAfc Af UfsGf sa | 0.31 | 0.76 | 0.84 | |
D1226 | S1226 | AfuGfuAfaccaagaguAfuUfcCfasUf | AS1226 | aUfgGfaAfuadCUfcdTUfgdGuuAfcAfusgsa | 0.26 | 0.64 | 0.87 | |
D1227 | S1227 | augUfaacCfaagAfguaUfuccAfsu | AS1227 | aUfgGfAfaUfAfCfuCfUfUfgGfUfUfaCfAfUfsGfsa | 0.33 | 0.79 | 0.81 | |
D1228 | S1228 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1228 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.464 | 0.932 | 0.978 | |
D1229 | S1229 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1229 | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.453 | 1.047 | 1.178 | |
D123O | S123O | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS123O | aUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.831 | 0.967 | 1.151 | |
D1231 | S1231 | a u Gf u Af Af CfcAf a GfaGf u Af u UfcCf a su | AS1231 | AfUfgGfaAfuAfcUfcUfuGfguuAfcAfUfsGfsa | 0.09 | 0.5 | 1.07 | |
D1232 | S1232 | Af u Gf u Afa CfCfAf a Gfa Gf u Af u UfcCf a su | AS1232 | AfUfgGfaAfuAfcUfcUfuggUfuAfcAfusGfsa | 0.11 | 0.54 | 1.1 | |
D1233 | S1233 | Af u Gf u Af a CfcAfa Gfa Gf u Af u Uf CfCf a su | AS1233 | AfUfggaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.19 | 0.61 | 0.74 | |
D1234 | S1234 | aUfgUfaAfcCfaAfgAfgUfaUfuCfcAfsu | AS1234 | Af u GfgAfa Ufa Cf u Cf u UfgGf u UfaCf a Uf sgsAf | 0.22 | 0.61 | 0.98 | |
D1235 | S1235 | aUfgUfaAfcCfaAfgAfgUfaUfuCfcAfsu | AS1235 | Af u GfgAfa Ufa Cfu Cfu UfgGf u UfaCf a Uf sgsAf | 0.27 | 0.69 | 0.92 | |
D1236 | S1236 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1236 | AfuGfgAfaUfaCfuCfuUfgGfuUfaCfaUfsgsAf | 0.54 | 1.08 | 0.8 | |
D1237 | S1237 | augUfaAfccaAfgAfguaUfuCfcasu | AS1237 | AfUfGfgAfaUfAfCfuCfuUfGfGfuUfaCfAfUfsgsa | 0.29 | 0.61 | 0.79 | |
D1238 | S1238 | AfugUfaAfccaAfgAfguaUfuCfcasu | AS1238 | AfUfGfgAfaUfAfCfuCfuUfGfGfuUfaCfAfusgsa | 0.31 | 0.6 | 0.88 | |
D1239 | S1239 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1239 | dAUdGGdAauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.2 | 0.67 | 0.85 | |
D1240 | S1240 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1240 | dAUdGgdAauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.23 | 0.58 | 0.68 | |
D1241 | S1241 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1241 | dAudGgdAauAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.25 | 0.65 | 0.78 | |
D1242 | S1242 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1242 | dAUdGgdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.18 | 0.64 | 0.84 | |
D1243 | S1243 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1243 | dAUdGGdAAfuAfcUfcUfuGfGfUfuAfCfAfusGfsa | 0.19 | 0.72 | 0.87 | |
D1244 | S1244 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1244 | dAUdGgdAadTAfdCUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.55 | 0.8 | |
D1245 | S1245 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1245 | dAUdGGdAAuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.22 | 0.51 | 0.9 | |
D1246 | S1246 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1246 | dAudGgdAadTAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.27 | 0.78 | 0.66 | |
D1247 | S1247 | AfuGfuAfaCfcAfaGfaGfuAfuUfcCfasUf | AS1247 | dAdTdGdGaAfuAfcUfcUfuGfgUfuAfcAfusGfsa | 0.16 | 0.57 | 0.97 | |
D1248 | S1248 | AfacaAfuguUfcUfuGfdCUdCudAudAsa | AS1248 | dTUdAudAgdAGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.09 | 0.36 | 0.0047 |
D1249 | S1249 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasa | AS1249 | UfUfaUfaGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.10 | 0.47 | 0.005 |
D125O | S125O | Afa Cf aGf u Gf u Ufc Ufugc Uf c UfAf Uf a sAf | AS125O | uUfauaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.55 | 0.005 |
D1251 | S1251 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcucUfAfUfasAf | AS1251 | uUfauaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.49 | 0.006 |
D1252 | 51252 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1252 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.006 | |||
D1253 | S1253 | Afa Cf aGf u Gf u Uf c Uf ugcUf Cf Uf a Uf a sAf | AS1253 | uUfaUfagaGfCfAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.05 | 0.12 | 0.43 | 0.006 |
D1254 | S1254 | AfaCfaGfuGfuUfCfUfuGfcUfcUfaUfasa | AS1254 | UfUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.39 | 0.006 |
D1255 | S1255 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasa | AS1255 | UfUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.17 | 0.48 | 0.007 |
D1256 | S1256 | AfaCfaGfuGfuUfcUfUfGfcUfcUfaUfasa | AS1256 | UfUfaUfaGfaGfcaaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.14 | 0.40 | 0.007 |
D1257 | S1257 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1257 | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsUf | 0.07 | 0.12 | 0.40 | 0.007 |
D1258 | S1258 | Afa Cfagu Gfu UfCf Uf uGfc Ufc Ufa Ufa sAf | AS1258 | uUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.13 | 0.41 | 0.007 |
D1259 | S1259 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1259 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.05 | 0.11 | 0.35 | 0.008 |
D1260 | S1260 | AfacaGfuGfuUfCfUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1260 | uUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.06 | 0.12 | 0.40 | 0.008 |
D1261 | S1261 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1261 | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.42 | 0.008 |
D1262 | S1262 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1262 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.37 | 0.008 |
D1263 | S1263 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1263 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.008 | |||
D1264 | S1264 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfauasAf | AS1264 | uUfAfUfaGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.12 | 0.50 | 0.008 |
D1265 | S1265 | AfaCfaGfuguUfCfUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1265 | uUfaUfaGfaGfcAfagaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.12 | 0.13 | 0.48 | 0.009 |
- 40 042669
D1266 | S1266 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1266 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.51 | 0.009 |
D1267 | S1267 | AfacaAfuguUfcUfuGfdCudCudAudAsa | AS1267 | dTudAudAgdAGfcAfaGfaAfcAfcAfgUfusUfsu | 0.06 | 0.14 | 0.48 | 0.0088 |
D1268 | S1268 | AfaCfaGfuGfuUfCfUfuGfcucUfaUfasAf | AS1268 | uUfaUfaGfAfGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.05 | 0.09 | 0.35 | 0.009 |
D1269 | S1269 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1269 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.009 | |||
D127O | S127O | aaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS127O | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfUfsUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.49 | 0.009 |
D1271 | S1271 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1271 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.10 | 0.36 | 0.009 |
D1272 | S1272 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1272 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.009 | |||
D1273 | S1273 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1273 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsUf | 0.06 | 0.13 | 0.51 | 0.009 |
D1274 | S1274 | Af a Cf aGf u Gf u UfCf Uf uGfc Ufcu a Uf a sAf | AS1274 | uUfaUfAfGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.12 | 0.46 | 0.010 |
D1275 | S1275 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1275 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.010 | |||
D1276 | S1276 | AfaCfaGfuGfuUfCfUfuGfcUfcUfauasAf | AS1276 | uUfAfUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.14 | 0.47 | 0.010 |
D1277 | S1277 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1277 | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.50 | 0.010 |
D1278 | S1278 | AfaCfaGfuGfuUfCfUfugcUfcUfaUfasAf | AS1278 | uUfaUfaGfaGfCfAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.43 | 0.010 |
D1279 | S1279 | cAGuGuucuuGcucuAuAAdTdT | AS1279 | UuAuAGAGcAAGAAcACUGdTdT | 0.010 | |||
D128O | S1280 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasa | AS1280 | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.06 | 0.14 | 0.45 | 0.010 |
D1281 | S1281 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasa | AS1281 | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.07 | 0.18 | 0.46 | 0.011 |
D1282 | S1282 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1282 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.55 | 0.011 |
D1283 | S1283 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1283 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.07 | 0.12 | 0.45 | 0.011 |
D1284 | S1284 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1284 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.48 | 0.011 |
D1285 | S1285 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1285 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.06 | 0.11 | 0.40 | 0.011 |
D1286 | S1286 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1286 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.06 | 0.16 | 0.47 | 0.011 |
D1287 | S1287 | AfaCfaGfuGfuUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS1287 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.07 | 0.19 | 0.46 | 0.012 |
D1288 | S1288 | AfaCfaGfuGfuUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS1288 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.17 | 0.46 | 0.012 |
D1289 | S1289 | AfaCfaGfuGfuUfcUfUfGfcucUfaUfasAf | AS1289 | uUfaUfaGfAfGfcaaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.05 | 0.09 | 0.31 | 0.012 |
D129O | S1290 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasa | AS129O | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.06 | 0.16 | 0.49 | 0.013 |
D1291 | S1291 | AfaCfaGfuGfuUfCfUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1291 | uUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsUf | 0.06 | 0.11 | 0.32 | 0.013 |
D1292 | S1292 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS1292 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.06 | 0.14 | 0.44 | 0.013 |
D1293 | S1293 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasa | AS1293 | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.16 | 0.39 | 0.013 |
D1294 | S1294 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1294 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.07 | 0.18 | 0.41 | 0.014 |
D1295 | S1295 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1295 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.18 | 0.47 | 0.014 |
D1296 | S1296 | adAdCagdTdGuudCdTugdCdTcudAdTasa | AS1296 | dTdTaudAdGagdCdAagdAdAcadCdTgudTsdTsu | 0.12 | 0.21 | 0.68 | 0.0146 |
D1297 | S1297 | AfacaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1297 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcacUfGfUfusUfsu | 0.06 | 0.15 | 0.50 | 0.016 |
D1298 | S1298 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1298 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.17 | 0.50 | 0.016 |
D1299 | S1299 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1299 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfCfUfgUfususu | 0.07 | 0.16 | 0.50 | 0.018 |
D13OO | S13OO | AfaCfaGfuGfuUfcUfUfGfcUfcUfauasAf | AS13OO | uUfAfUfaGfaGfcaaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.12 | 0.43 | 0.020 |
D13O1 | S13O1 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS13O1 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.17 | 0.45 | 0.021 |
D13O2 | S13O2 | AfaCfaGfuguUfcUfUfGfcUfcUfaUfasAf | AS13O2 | uUfaUfaGfaGfcaaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.14 | 0.49 | 0.021 |
D13O3 | S13O3 | AfAfCfaguGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS13O3 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfCfUfguusUfsu | 0.07 | 0.24 | 0.51 | 0.022 |
D1304 | S1304 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1304 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcAfcUfgUfususu | 0.09 | 0.27 | 0.47 | 0.033 |
D13O5 | S13O5 | aadCdAgudGdTucdTdTgcdTdCuadTdAsa | AS13O5 | udTadTdAgadGdCaadGdAacdAdCugdTdTsusu | 0.19 | 0.36 | 0.86 | 0.045 |
D1306 | S1306 | AfacaGfuguUfcUfuGfdCUdCUdAudAsa | AS1306 | dTUdAUdAGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfGfUfusUfsu | 0.08 | 0.22 | 0.61 | |
D13O7 | S13O7 | AfacaGfuguUfcUfdTGfdCUdCUdAudAsa | AS13O7 | dTUdAUdAGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfGfUfusUfsu | 0.13 | 0.39 | 0.84 | |
D1308 | S1308 | AfacaGfuguUfcUfuGfdCUdCUdAudAsa | AS1308 | dTUdAUdAgdAGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.09 | 0.13 | 0.48 | |
D1309 | S1309 | AfacaGfuguUfcUfdTGfdCUdCUdAudAsa | AS1309 | dTUdAUdAgdAGfdCAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.13 | 0.58 | |
D1310 | S131O | AfacaAfuguUfcUfdTGfdCUdCudAudAsa | AS131O | dTUdAudAgdAGfdCAfaGfaAfcAfcAfgUfusUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.55 | |
D1311 | S1311 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfcUfcUfdAdTdAsdA | AS1311 | dTdTdAdTaGfaGfcAfaGfaAfcAfcAfgUfusUfsu | 0.10 | 0.30 | 0.66 | |
D1312 | S1312 | AfacaGfuguUfcUfuGfdCUdCUdAudAsa | AS1312 | dTUdAUdAgdAGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.09 | 0.13 | 0.48 | |
D1313 | S1313 | AfAfCfaGfuGfuucUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1313 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcAfcUfguusUfsu | 0.14 | 0.38 | 0.74 | |
D1314 | S1314 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1314 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.19 | 0.54 | |
D1315 | 51315 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1315 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.55 | |
D1316 | S1316 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1316 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.07 | 0.16 | 0.53 | |
D1317 | S1317 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1317 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfGfUfususu | 0.07 | 0.16 | 0.55 | |
D1318 | S1318 | AfAfCfaGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1318 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfguusUfsu | 0.10 | 0.32 | 0.61 | |
D1319 | S1319 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1319 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.08 | 0.16 | 0.53 |
- 41 042669
D132O | S132O | Af a CfaGf u Gf u Uf cUf u Gf cUf c Ufa Ufa sAf | AS132O | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.08 | 0.16 | 0.61 | |
D1321 | S1321 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1321 | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.14 | 0.58 | |
D1322 | S1322 | Afa CfaGf u Gfu Ufcu u GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1322 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.15 | 0.49 | 0.84 | |
D1323 | S1323 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1323 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.07 | 0.20 | 0.62 | |
D1324 | S1324 | Af Af CfaGf u Gf u Uf cUf u GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1324 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.08 | 0.25 | 0.78 | |
D1325 | S1325 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1325 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.08 | 0.18 | 0.80 | |
D1326 | S1326 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1326 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.21 | 0.66 | |
D1327 | S1327 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1327 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.10 | 0.31 | 0.70 | |
D1328 | S1328 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1328 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.55 | |
D1329 | S1329 | Afa CfAf Gf u GfuUfcUfu GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1329 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.08 | 0.19 | 0.71 | |
D133O | S133O | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS133O | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.09 | 0.27 | 0.76 | |
D1331 | S1331 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1331 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.21 | 0.65 | |
D1332 | S1332 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1332 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.07 | 0.17 | 0.53 | |
D1333 | S1333 | AfaCfaGfUfGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1333 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.25 | 0.73 | |
D1334 | S1334 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1334 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.18 | 0.54 | |
D1335 | S1335 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfcUfcUfaUfasAf | AS1335 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcUfgUfususu | 0.14 | 0.38 | 0.57 | |
D1336 | S1336 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1336 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.16 | 0.50 | 0.96 | |
D1337 | S1337 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1337 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.19 | 0.54 | |
D1338 | S1338 | AfAfCfaGfuGfuUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS1338 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.08 | 0.20 | 0.69 | |
D1339 | S1339 | Afa CfaGf u Gfu UfCfUfu GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1339 | uUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.16 | 0.55 | |
D1340 | S1340 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1340 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.17 | 0.57 | |
D1341 | S1341 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1341 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfgUfususu | 0.08 | 0.22 | 0.63 | |
D1342 | S1342 | Af Af CfaGf u Gfu Ufcu u GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1342 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcUfguusUfsu | 0.21 | 0.56 | 0.86 | |
D1343 | S1343 | AfacaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1343 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaacAfcUfGfUfusUfsu | 0.14 | 0.37 | 0.73 | |
D1344 | S1344 | AfaCfaGfuGfuucUfUfGfcUfcUfaUfasAf | AS1344 | uUfaUfaGfaGfcaaGfAfAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.20 | 0.66 | |
D1345 | S1345 | Afa CfAf Gf u Gfu Ufcu u GfcUfc Ufa Ufa sAf | AS1345 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcugUfusUfsu | 0.12 | 0.34 | 0.73 | |
D1346 | S1346 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcUfauasAf | AS1346 | uUfAfUfaGfaGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.16 | 0.42 | 0.90 | |
D1347 | S1347 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1347 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsUf | 0.17 | 0.43 | 0.85 | |
D1348 | S1348 | AfaCfAfGfuGfuucUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1348 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcAfcugUfusUfsu | 0.08 | 0.21 | 0.58 | |
D1349 | S1349 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcuaUfasAf | AS1349 | uUfaUfAfGfaGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.21 | 0.39 | 0.88 | |
D135O | S135O | AfaCfaguGfuUfcUfUfGfcUfcUfaUfasAf | AS135O | uUfaUfaGfaGfcaaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.52 | |
D1351 | S1351 | AfaCfAfGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1351 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcugUfusUfsu | 0.08 | 0.21 | 0.58 | |
D1352 | S1352 | AfaCfaGfUfGfuUfcuuGfcUfcUfaUfasAf | AS1352 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcacUfgUfusUfsu | 0.18 | 0.49 | 0.84 | |
D1353 | S1353 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcucUfaUfasAf | AS1353 | uUfaUfaGfAfGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.11 | 0.25 | 0.68 | |
D1354 | S1354 | AfacaGfuGfuUfcUfUfGfcUfcUfaUfasAf | AS1354 | uUfaUfaGfaGfcaaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.52 | |
D1355 | S1355 | AfaCfaGfUfGfuucUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1355 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcacUfgUfusUfsu | 0.10 | 0.26 | 0.63 | |
D1356 | S1356 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfugcUfcUfaUfasAf | AS1356 | uUfaUfaGfaGfCfAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.16 | 0.33 | 0.79 | |
D1357 | S1357 | AfaCfAfGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1357 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsUf | 0.09 | 0.19 | 0.51 | |
D1358 | S1358 | AfaCfaGfuGfUfUfcuuGfcUfcUfaUfasAf | AS1358 | uUfaUfaGfaGfcAfAfGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.22 | 0.48 | 0.71 | |
D1359 | S1359 | AfaCfaGfuGfuUfcUfUfGfcUfcUfaUfasAf | AS1359 | uUfaUfaGfaGfcaaGfaAfcAfcUfgUfusUfsUf | 0.10 | 0.17 | 0.61 | |
D1360 | S1360 | AfaCfaguGfUfUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1360 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaacAfCfUfgUfusUfsu | 0.14 | 0.40 | 0.87 | |
D1361 | S1361 | AfaCfaGfuGfuUfcUfUfGfcUfcuaUfasAf | AS1361 | uUfaUfAfGfaGfcaaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.52 | |
D1362 | S1362 | aaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1362 | u Ufa Ufa Gf agcAf a Gf a Af cAfc UfgUf Uf sUfsu | 0.10 | 0.28 | 0.81 | |
D1363 | S1363 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1363 | u Ufa u a GfaGfc Af a Gf Af Afc Af c UfgUf u sUfsu | 0.06 | 0.16 | 0.68 | |
D1364 | S1364 | AfaCfaGfuGfuUfcUfugcUfcUfaUfAfsAf | AS1364 | uuaUfaGfaGfCfAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.09 | 0.26 | 0.67 | |
D1365 | S1365 | aacaguguucuugcucuauasa | AS1365 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.20 | 0.59 | 0.95 | |
D1366 | S1366 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfauasAf | AS1366 | uUfAfUfaGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.53 | |
D1367 | S1367 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1367 | u Ufa Ufa Gf age Afa Gf a Af cAf c UfgUf u s UfsUf | 0.08 | 0.16 | 0.53 | |
D1368 | S1368 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1368 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.54 | |
D1369 | S1369 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1369 | uuaUfaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.23 | 0.56 | 0.89 | |
D137O | S137O | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcuaUfasAf | AS137O | uUfaUfAfGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.12 | 0.55 | |
D1371 | S1371 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcuaUfasAf | AS1371 | uUfaUfAfGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.18 | 0.58 | |
D1372 | S1372 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1372 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.15 | 0.56 | |
D1373 | S1373 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1373 | uuaUfaGfaGfcAfaGfAfAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.21 | 0.51 | 0.89 |
- 42 042669
D1374 | S1374 | AfacaGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfasAf | AS1374 | u Ufa UfaGfaGfcAfaGfa AfCfAfc UfGf Uf usUfsu | 0.08 | 0.21 | 0.64 | |
D1375 | S1375 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1375 | uUfaUfaGfagcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.15 | 0.40 | 0.94 | |
D1376 | S1376 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1376 | uUfaUfaGfagcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.13 | 0.40 | 0.96 | |
D1377 | S1377 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfCfUfauasAf | AS1377 | uUfAfUfagaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.17 | 0.64 | |
D1378 | S1378 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1378 | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.18 | 0.50 | 0.97 | |
D1379 | S1379 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1379 | uUfaUfaGfagcAfaGfAfAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.24 | 0.79 | |
D1380 | S1380 | aaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1380 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfUfsUfsu | 0.07 | 0.14 | 0.58 | |
D1381 | S1381 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1381 | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.11 | 0.34 | 0.96 | |
D1382 | S1382 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1382 | uUfaUfaGfagcAfaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.18 | 0.69 | |
D1383 | S1383 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1383 | uUfaUfagaGfcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.14 | 0.38 | 0.85 | |
D1384 | S1384 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1384 | uUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsUf | 0.07 | 0.16 | 0.54 | |
D1385 | S1385 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1385 | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.08 | 0.20 | 0.75 | |
D1386 | S1386 | aacaguguucUfuGfcUcUaudAsa | AS1386 | uUfdAUdAGfaGfcAfaGfaadCadCudGdTdTsusu | 0.25 | 0.56 | 0.90 | |
D1387 | S1387 | AfaCfaguGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1387 | uUfaUfaGfagcAfaGfaAfcAfCfUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.19 | 0.70 | |
D1388 | S1388 | AfaCfaGfuGfuucUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1388 | uUfaUfagaGfcAfaGfAfAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.14 | 0.60 | |
D1389 | S1389 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcuaUfAfsAf | AS1389 | uuaUfAfGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.08 | 0.19 | 0.62 | |
D1390 | S1390 | aaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1390 | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfUfsUfsu | 0.08 | 0.27 | 0.76 | |
D1391 | S1391 | aacaguguucdTudGcdTcdTadTasa | AS1391 | uUfdAUdAGfaGfcAfaGfaadCadCudGudTsusu | 0.18 | 0.36 | 0.81 | |
D1392 | S1392 | AfacaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasAf | AS1392 | uUfaUfaGfagcAfaGfaAfcAfcUfGfUfusUfsu | 0.07 | 0.17 | 0.55 | |
D1393 | S1393 | AfaCfaGfuguUfcUfuGfcUfCfUfaUfasAf | AS1393 | uUfaUfagaGfcAfaGfaAfCfAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.15 | 0.57 | |
D1394 | S1394 | AfaCfaGfuGfuUfcuuGfcUfcUfAfUfasAf | AS1394 | uUfauaGfaGfcAfAfGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.26 | 0.68 | 1.06 | |
D1395 | S1395 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcucUfaUfAfsAf | AS1395 | uuaUfaGfAfGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.18 | 0.58 | |
D1396 | S1396 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfcUfcUfaUfAfsAf | AS1396 | uuaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsUf | 0.09 | 0.27 | 0.73 | |
D1397 | S1397 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfcdAdCdTdAUfasAf | AS1397 | uUfadTdAdGdAGfcAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.20 | 0.51 | 0.73 | |
D1398 | S1398 | AfacaGfuguUfcuuGfcucUfauasAf | AS1398 | uUfAfUfaGfAfGfcAfAfGfaAfCfAfcUfGfUfusUfsu | 0.13 | 0.34 | 0.86 | |
D1399 | S1399 | dAacadGugudTcuudGcucdTauasdA | AS1399 | udTdAdTadGdAdGcdAdAdGadAdCdAcdTdGdTusdTsu | 0.24 | 0.42 | 0.82 | |
D1400 | S1400 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfdCdAdCdTaUfasAf | AS1400 | uUfaUfdAdGdAdGcAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.49 | 0.85 | 0.78 | |
D1401 | S1401 | AfaCfaAfuGfuUfcUfudGdCdAdCUfaUfasAf | AS1401 | uUfaUfadGdAdGdCAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.67 | 0.83 | 0.85 | |
D1402 | S1402 | aaCfAfguGfUfucUfUfgcUfCfuaUfAfsa | AS1402 | uUfaUfAfgaGfCfaaGfAfacAfCfugUfUfsusu | 0.18 | 0.47 | 0.80 | |
D1403 | S1403 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfcdAdCUfadTdAsAf | AS 1403 | udTdAUfadGdAGfcAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.73 | 0.89 | 0.77 | |
D1404 | S1404 | aacAgugUucuUgcuCuauAsa | AS1404 | uUaUAgAGCaAGAaCACuGUUsusu | 0.12 | 0.39 | 0.79 | |
D1405 | S1405 | AacaGuguUcuuGcucUauasA | AS 1405 | uUAUaGAGcAAGaACAcUGUusUsu | 0.12 | 0.37 | 0.77 | |
D1406 | S1406 | AfaCfaAfuGfuUfcUfudGdCAfcUfadTdAsAf | AS 1406 | udTdAUfaGfadGdCAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.59 | 0.93 | 0.89 | |
D1407 | S1407 | aACagUGuuCUugCUcuAUasa | AS1407 | UUauAGagCAagAAcaCUguUsUsu | 0.09 | 0.16 | 0.55 | |
D1408 | S1408 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfcAfcdTdAdTdAsAf | AS1408 | udTdAdTdAGfaGfcAfaGfaAfcAfcAfgUfusUfsu | 0.22 | 0.64 | 0.86 | |
D1409 | S1409 | aaCAguGUucUUgcUCuaUAsa | AS1409 | uUaUAgaGCaaGAacACugUUsusu | 0.13 | 0.31 | 0.76 | |
D1410 | S1410 | AfaCfaAfuGfuUfcUfuGfcAfdCdTdAdTdAsAf | AS1410 | udTdAdTdAdGaGfcAfaGfaGfcAfcAfgUfusUfsu | 0.77 | 0.94 | 0.93 | |
D1411 | S1411 | aacAfgugUfucuUfgcuCfuauAfsa | AS1411 | uUfaUfAfgAfGfCfaAfGfAfaCfAfCfuGfUfUfsusu | 0.23 | 0.53 | 1.04 | |
D1412 | S1412 | aacdAgugdTucudTgcudCuaudAsa | AS1412 | udTadTdAgdAdGdCadAdGdAadCdAdCudGdTdTsusu | 0.30 | 0.64 | 0.90 | |
D1413 | S1413 | Afa Cf a Gf u Gf u Uf c Uf u Gf c Ufc Ufa Uf a sa | AS1413 | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.09 | 0.19 | 0.63 | |
D1414 | S1414 | AfaCfaGfuGfUfUfcUfuGfcUfcUfaUfasa | AS1414 | UfUfaUfaGfaGfcAfaGfaacAfcUfgUfusUfsu | 0.11 | 0.28 | 0.66 | |
D1415 | S1415 | AfaCfaGfuGfuUfcUfuGfCfUfcUfaUfasa | AS1415 | UfUfaUfaGfagcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.06 | 0.13 | 0.53 | |
D1416 | S1416 | aacaguguucuugcucuauasa | AS1416 | UfUfAfUfAfGfAfGfCfAfAfGfAfAfCfAfCfUfGfUfUfsusu | 0.20 | 0.53 | 0.99 | |
D1417 | S1417 | Afa Cf a Gf u Gf u Uf c Uf u Gfc Ufc UfAf Uf a sa | AS1417 | UfUfauaGfaGfcAfaGfaAfcAfcUfgUfusUfsu | 0.07 | 0.17 | 0.53 | |
D1418 | S1418 | aAfCfagUfGfuuCfUfugCfUfcuAfUfasa | AS1418 | UfUfauAfGfagCfAfagAfAfcaCfUfguUfsUfsu | 0.08 | 0.20 | 0.70 | |
D1419 | S1419 | Afa Cf Af Gf u Gf u Uf c Uf u Gf c Uf c Ufa Uf a sAf | AS1419 | uUfaUfaGfaGfcAfaGfaAfcAfcugUfusUfsUf | 0.08 | 0.20 | 0.70 |
Пример 3. Активность сайленсинга in vitro с различными химическими модификациями на TTR миРНК.
IC50 для каждой модифицированной миРНК определяют на клетках Нер3В стандартной обратимой трансфекцией с использованием липофектамина RNAiMAX. Коротко, обратимую трансфекцию осуществляют, добавляя 5 мкл Opti-MEM к 5 мкл миРНК-дуплекса на лунку в 96-луночном планшете вместе с 10 мкл Opti-MEM плюс 0,5 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13778-150) и инкубируя при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Затем после инкубации в каждую лунку добавляют 100 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей 12000-15000 клеток Нер3В. Клетки инкубируют в течение 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2, затем лизируют и анализируют АроВ и GAPDH мРНК с помощью bDNA (Quantigene). Анализируют семь различных концентраций миРНК, колеблющихся от 10 нМ до 0,6 пМ, для определения IC50, и ApoB/GAPDH для АроВ-трансфицированных клеток нормализуют к клеткам, трансфицированным 10 нМ миРНК Luc.
- 43 042669
Аббревиатура | Нуклеотид(ы) |
Af | 2'-F-аденозин |
Cf | 2'-F-цитидин |
Gf | 2'-F-гуанозин |
Uf | 2'-F-уридин |
A | аденозин |
C | цитидин |
G | гуанозин |
U | уридин |
a | 2'-0-метиладенозин |
c | 2'-О-метилцитидин |
g | 2'-0-метилгуанозин |
u | 2'-О-метилуридин |
dT | 2'-дезокситимидин |
s | фосфоротиоатная связь |
Модифицированный дуплекс ANGPTL3
Таблица 2
Дуплекс ID | Смысловая ID | Последовательность SS | AS ID | Последовательность AS | RNAimax, НерЗЬ | ||
IOihM | 0.1 нМ | 0.025 нМ | |||||
D2000 | S2000 | UfcAfcAfa Uf u Af AfGfcUfcCf u UfcUfu Uf | A2OOO | aAfaGfaAfgGfaGfcuuAfaUfuGfuGfasAfsc | 0.036 | 0.274 | 0.233 |
D2001 | S2001 | UfuAfuUfgUfuCfCfUfcUfaGfuUfaUfuUf | A2OO1 | aAfaUfaAfcUfaGfaggAfaCfaAfuAfasAfsa | 0.044 | 0.278 | 0.247 |
D2002 | S2002 | GfcUfaUfgUfuAfGfAfcGfaUfgUfaAfaAf | A2OO2 | uUfuUfaCfaUfcGfucuAfaCfaUfaGfcsAfsa | 0.062 | 0.474 | 0.449 |
D2003 | S2003 | GfgAfcAfuGfgUfCfUfuAfaAfgAfcUfuUf | A2OO3 | a Af a Gf u Cf u Uf u Af aga Cf cAf u Gf u Cf csCf sa | 0.303 | 1.042 | 0.912 |
D2004 | S2004 | CfaAfaAfaCfuCfAfAfcAfuAfuUfuGfaUf | A2004 | a UfcAfa Afu AfuGf u ugAfgUfu Uf u UfgsAfsa | 0.102 | 0.623 | 0.499 |
D2005 | S2005 | AfcCfaGfuGfaAfAfUfcAfaAfgAfaGfaAf | A2OO5 | uUfcUfuCfuUfuGfauuUfcAfcUfgGfusUfsu | 0.124 | 0.901 | 0.756 |
D2006 | S2006 | CfaCfaAfuUfaAfGfCfuCfcUfuCfuUfuUf | A2OO6 | aAfaAfgAfaGfgAfgcuUfaAfuUfgUfgsAfsa | 0.069 | 0.269 | 0.244 |
D2007 | S2007 | CfuAfuGfuUfaGfAfCfgAfuGfuAfaAfaAf | A2OO7 | uUfuUfuAfcAfuCfgucUfaAfcAfuAfgsCfsa | 0.052 | 0.622 | 0.589 |
D2008 | S2008 | UfcAfaCfaUfaUfUfUfgAfuCfaGfuCfuUf | A2008 | aAfgAfcUfgAfuCfaaaUfaUfgUfuGfasGfsu | 0.133 | 0.798 | 0.785 |
D2009 | S2009 | AfaCfuGfaGfaAfGfAfaCfuAfcAfuAfuAf | A2OO9 | uAfuAfuGfuAfgUfucuUfcUfcAfgUfusCfsc | 0.097 | 0.671 | 0.528 |
D2010 | S2010 | AfcAfa Uf u AfaGfCfUfcCfu UfcUfu Ufu Uf | A2O1O | aAfaAfaGfaAfgGfagcUfuAfaUfuGfusGfsa | 0.145 | 0.308 | 0.293 |
D2011 | S2011 | CfuCfcAfgAfgCfCfAfaAfaUfcAfaGfaUf | A2O11 | aUfcUfuGfaUfuUfuggCfuCfuGfgAfgsAfsu | 0.122 | 0.882 | 0.938 |
D2012 | S2012 | CfgAfuGfuAfaAfAfAfuUfuUfaGfcCfaAf | A2O12 | uUfgGfcUfaAfaAfuuuUfuAfcAfuCfgsUfsc | 0.102 | 0.843 | 0.733 |
D2013 | S2013 | GfuCfuUfaAfaGfAfCfuUfuGfuCfcAfuAf | A2O13 | uAfuGfgAfcAfaAfgucUfuUfaAfgAfcsCfsa | 1.133 | 1.105 | 1.022 |
D2014 | S2014 | CfaAfcAfuAfuUfUfGfaUfcAfgUfcUfuUf | A2014 | aAfaGfaCfuGfaUfcaaAfuAfuGfuUfgsAfsg | 0.077 | 0.413 | 0.450 |
D2015 | S2015 | Af c Uf g Af gAf a G fAf Af c UfaCfaUfaUfaAf | A2O15 | uUfaUfaUfgUfaGfuucUfuCfuCfaGfusUfsc | 0.055 | 0.293 | 0.364 |
D2016 | S2016 | CfcAfgAfgCfcAf Af Afa UfcAfaGfa Ufu Uf | A2O16 | a Af a Ufc Uf u Gfa Uf u u u GfgCf u Cf u GfgsAf sg | 0.080 | 0.650 | 0.499 |
D2017 | S2017 | GfaUfgUfaAfaAfAfUfuUfuAfgCfcAfaUf | A2O17 | aUfuGfgCfuAfaAfauuUfuUfaCfaUfcsGfsu | 0.076 | 0.605 | 0.579 |
D2018 | S2018 | UfcUfuAfaAfgAfCfUfuUfgUfcCfaUfaAf | A2018 | uUfaUfgGfaCfaAfaguCfuUfuAfaGfasCfsc | 1.326 | 1.098 | 0.927 |
D2019 | S2019 | AfaCfaUfaUfuUfGfAfuCfaGfuCfuUfuUf | A2O19 | aAfaAfgAfcUfgAfucaAfaUfaUfgUfusGfsa | 0.047 | 0.560 | 0.477 |
D2020 | S2020 | CfuGfaGfaAfgAfAfCfuAfcAfuAfuAfaAf | A2O2O | uUfuAfuAfuGfuAfguuCfuUfcUfcAfgsUfsu | 0.066 | 0.690 | 0.681 |
D2021 | S2021 | Afa Uf uAfaGfcUfCfCf u UfcUfu Ufu Ufa Uf | A2O21 | aUfaAfaAfaGfaAfggaGfcUfuAfaUfusGfsu | 0.041 | 0.611 | 0.251 |
D2022 | S2022 | AfaAfuCfaAfgAfUfUfuGfcUfaUfgUfuAf | A2O22 | uAfaCfaUfaGfcAfaauCfuUfgAfuUfusUfsg | 0.053 | 0.555 | 0.516 |
D2023 | S2023 | UfuCfaGfuUfgGfGfAfcAfuGfgUfcUfuAf | A2O23 | uAfaGfaCfcAfuGfuccCfaAfcUfgAfasGfsg | 0.779 | 1.045 | 0.963 |
- 44 042669
D2024
S2024
GfgGfcCfaAfaUfUfAfaUfgAfcAfuAfuUf
A2024 aAfuAfuGfuCfaUfuaaUfuUfgGfcCfcsUfsu
1.487
0.949
0.883
D2025 | S2025 | AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf | A2025 | aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg | 0.043 | 0.432 | 0.477 |
D2026 | S2026 | AfgAfaCfuAfcAfUfAfuAfaAfcUfaCfaAf | A2026 | uUfgUfaGfuUfuAfuauGfuAfgUfuCfusUfsc | 0.324 | 1.042 | 0.905 |
D2027 | S2027 | Af u Ufa AfgCf uCfCf Uf uCf u Uf u Ufu Afu Uf | A2027 | aAfuAfaAfaAfgAfaggAfgCfuUfaAfusUfsg | 0.042 | 0.283 | 0.224 |
D2028 | S2028 | AfgAfuUfuGfcUfAfUfgUfuAfgAfcGfaUf | A2028 | aUfcGfuCfuAfaCfauaGfcAfaAfuCfusUfsg | 0.349 | 0.936 | 0.896 |
D2029 | S2029 | UfcAfgUfuGfgGfAfCfaUfgGfuCfuUfaAf | A2029 | uUfaAfgAfcCfaUfgucCfcAfaCfuGfasAfsg | 0.914 | 0.907 | 0.944 |
D2030 | S2030 | GfgCfcAfaAfuUfAfAfuGfaCfaUfaUfuUf | A2030 | aAfaUfaUfgUfcAfuuaAfuUfuGfgCfcsCfsu | 0.047 | 0.353 | 0.326 |
D2031 | S2031 | CfaUfaUfuUfgAfUfCfaGfuCfuUfuUfuAf | A2031 | uAfaAfaAfgAfcUfgauCfaAfaUfaUfgsUfsu | 0.110 | 0.867 | 0.842 |
D2032 | S2032 | UfaCfaUfaUfaAfAfCfuAfcAfaGfuCfaAf | A2032 | uUfgAfcUfuGfuAfguuUfaUfaUfgUfasGfsu | 0.200 | 0.699 | 0.656 |
D2033 | S2033 | UfuUfuAfuUfgUfUfCfcUfcUfaGfuUfaUf | A2033 | aUfaAfcUfaGfaGfgaaCfaAfuAfaAfasAfsg | 0.050 | 0.218 | 0.192 |
D2034 | S2034 | UfuGfcUfaUfgUfUfAfgAfcGfaUfgUfaAf | A2034 | uUfaCfaUfcGfuCfuaaCfaUfaGfcAfasAfsu | 0.096 | 0.792 | 0.640 |
D2035 | S2035 | CfaGfuUfgGfgAfCfAfuGfgUfcUfuAfaAf | A2035 | uUfuAfaGfaCfcAfuguCfcCfaAfcUfgsAfsa | 0.127 | 0.936 | 0.890 |
D2036 | S2036 | AfaAfuUfaAfuGfAfCfaUfaUfuUfcAfaAf | A2036 | uUfuGfaAfaUfaUfgucAfuUfaAfuUfusGfsg | 0.061 | 0.683 | 0.668 |
D2037 | S2037 | GfaUfcAfgUfcUfUfUfuUfaUfgAfuCfuAf | A2037 | uAfgAfuCfaUfaAfaaaGfaCfuGfaUfcsAfsa | 0.157 | 1.010 | 0.723 |
D2038 | S2038 | AfcAfuAfuAfaAfCfUfaCfaAfgUfcAfaAf | A2038 | uUfuGfaCfuUfgUfaguUfuAfuAfuGfusAfsg | 0.047 | 0.532 | 0.525 |
D2039 | S2039 | UfuUfaUfuGfuUfCfCfuCfuAfgUfuAfuUf | A2039 | aAfuAfaCfuAfgAfggaAfcAfaUfaAfasAfsa | 0.031 | 0.505 | 0.238 |
D2040 | S2040 | UfgCfuAfuGfuUfAfGfaCfgAfuGfuAfaAf | A2040 | uUfuAfcAfuCfgUfcuaAfcAfuAfgCfasAfsa | 0.056 | 0.484 | 0.408 |
D2041 | S2041 | GfgGfaCfaUfgGfUfCfuUfaAfaGfaCfuUf | A2041 | aAfgUfcUfuUfaAfgacCfaUfgUfcCfcsAfsa | 0.570 | 0.999 | 0.994 |
D2042 | S2042 | UfgAfcAfuAfuUfUfCfaAfaAfaCfuCfaAf | A2042 | uUfgAfgUfuUfuUfgaaAfuAfuGfuCfasUfsu | 0.065 | 0.870 | 0.728 |
D2043 | S2043 | AfuCfaGfuCfuUfUfUfuAfuGfaUfcUfaUf | A2043 | aUfaGfaUfcAfuAfaaaAfgAfcUfgAfusCfsa | 0.048 | 0.362 | 0.282 |
D2044 | S2044 | CfaUfaUfaAfaCfUfAfcAfaGfuCfaAfaAf | A2044 | uUfuUfgAfcUfuGfuagUfuUfaUfaUfgsUfsa | 0.314 | 0.904 | 0.937 |
D2045 | S2045 | CfuUfgAfaCfuCfAfAfcUfcAfaAfaCfuUf | A2045 | aAfgUfuUfuGfaGfuugAfgUfuCfaAfgsUfsg | 0.060 | 0.295 | 0.251 |
D2046 | S2046 | CfuAfcUfuCfaAfCfAfaAfaAfgUfgAfaAf | A2046 | uUfuCfaCfuUfuUfuguUfgAfaGfuAfgsAfsa | 0.052 | 0.570 | 0.599 |
D2047 | S2047 | AfaGfaGfcAfaCfUfAfaCfuAfaCfuUfaAf | A2047 | uUfaAfgUfuAfgUfuagUfuGfcUfcUfusCfsu | 0.028 | 0.369 | 0.381 |
D2048 | S2048 | AfaAfcAfaGfaUfAfAfuAfgCfaUfcAfaAf | A2048 | uUfuGfaUfgCfuAfuuaUfcUfuGfuUfusUfsu | 0.039 | 0.227 | 0.204 |
D2049 | S2049 | GfcAfuAfgUfcAfAfAfuAfaAfaGfaAfaUf | A2049 | aUfuUfcUfuUfuAfuuuGfaCfuAfuGfcsUfsg | 0.032 | 0.437 | 0.422 |
D2050 | S2050 | AfuAfuAfaAfcUfAfCfaAfgUfcAfaAfaAf | A2050 | uUfuUfuGfaCfuUfguaGfuUfuAfuAfusGfsu | 0.297 | 0.946 | 0.850 |
D2051 | S2051 | GfaAfcUfcAfaCfUfCfaAfaAfcUfuGfaAf | A2051 | uUfcAfaGfuUfuUfgagUfuGfaGfuUfcsAfsa | 0.179 | 0.929 | 0.884 |
D2052 | S2052 | UfaCfuUfcAfaCfAfAfaAfaGfuGfaAfaUf | A2052 | aUfuUfcAfcUfuUfuugUfuGfaAfgUfasGfsa | 0.091 | 0.536 | 0.524 |
D2053 | S2053 | AfgAfgCfaAfcUfAfAfcUfaAfcUfuAfaUf | A2053 | aUfuAfaGfuUfaGfuuaGfuUfgCfuCfusUfsc | 0.086 | 0.611 | 0.621 |
D2054 | S2054 | Gfa UfaAfu AfgCf AfUfcAfa AfgAfcCfu Uf | A2054 | aAfgGfuCfuUfuGfaugCfuAfuUfaUfcsUfsu | 0.058 | 0.676 | 0.591 |
D2055 | S2055 | CfaUfaGfuCfaAfAfUfaAfaAfgAfaAfuAf | A2055 | uAfuUfuCfuUfuUfauuUfgAfcUfaUfgsCfsu | 0.048 | 0.630 | 0.674 |
D2056 | S2056 | UfaUfaAfaCfuAfCfAfaGfuCfaAfaAfaUf | A2056 | aUfuUfuUfgAfcUfuguAfgUfuUfaUfasUfsg | 0.072 | 0.534 | 0.459 |
D2057 | S2057 | AfaCfuCfaAfcUfCfAfaAfaCfuUfgAfaAf | A2057 | uUfuCfaAfgUfuUfugaGfuUfgAfgUfusCfsa | 0.161 | 0.864 | 0.775 |
D2058 | S2058 | AfcUfuCfaAfcAfAfAfaAfgUfgAfaAfuAf | A2058 | u Af u Uf u Cf a Cf u Uf u u u Gf u UfgAf a Gf u sAf sg | 0.198 | 0.969 | 0.865 |
D2059 | S2059 | GfaGfcAfaCfuAfAfCfuAfaCfuUfaAfuUf | A2059 | aAfuUfaAfgUfuAfguuAfgUfuGfcUfcsUfsu | 0.031 | 0.253 | 0.210 |
D2060 | S2060 | Afa Cf cAfa Cf a Gf Cf Af u AfgU f cAfa Af u Af | A2060 | uAfuUfuGfaCfuAfugcUfgUfuGfgUfusUfsa | 0.035 | 0.561 | 0.569 |
D2061 | S2061 | AfgUfcAfaAfuAfAfAfaGfaAfaUfaGfaAf | A2061 | uUfcUfaUfuUfcUfuuuAfuUfuGfaCfusAfsu | 0.057 | 0.668 | 0.386 |
D2062 | S2062 | AfgUfcAfaAfaAfUfGfaAfgAfgGfuAfaAf | A2062 | u Ufu AfcCf uCfu Ufca u Ufu UfuGfaCf usUfsg | 0.720 | 1.017 | 0.924 |
D2063 | S2063 | CfuUfgAfaAfgCfCfUfcCfuAfgAfaGfaAf | A2063 | uUfcUfuCfuAfgGfaggCfuUfuCfaAfgsUfsu | 0.324 | 1.020 | 0.963 |
D2064 | S2064 | CfuUfcAfaCfaAfAfAfaGfuGfaAfaUfaUf | A2064 | aUfaUfuUfcAfcUfuuuUfgUfuGfaAfgsUfsa | 0.048 | 0.549 | 0.531 |
D2065 | S2065 | CfaAfcUfaAfcUfAfAfcUfuAfaUfuCfaAf | A2065 | uUfgAfaUfuAfaGfuuaGfuUfaGfuUfgsCfsu | 0.046 | 0.739 | 0.649 |
D2066 | S2066 | AfcCfaAfcAfgCfAfUfaGfuCfaAfaUfaAf | A2066 | uUfaUfuUfgAfcUfaugCfuGfuUfgGfusUfsu | 0.076 | 0.840 | 0.777 |
D2067 | S2067 | GfaAfcCfcAfcAfGfAfaAfuUfuCfuCfuAf | A2067 | uAfgAfgAfaAfuUfucuGfuGfgGfuUfcsUfsu | 0.103 | 0.916 | 0.808 |
D2068 | S2068 | GfaAfuAfuGfuCfAfCfuUfgAfaCfuCfaAf | A2068 | uUfgAfgUfuCfaAfgugAfcAfuAfuUfcsUfsu | 0.046 | 0.532 | 0.520 |
D2069 | S2069 | UfgAfaAfgCfcUfCfCfuAfgAfaGfaAfaAf | A2069 | uUfuUfcUfuCfuAfggaGfgCfuUfuCfasAfsg | 0.067 | 0.894 | 0.822 |
D2070 | S2070 | UfuCfaAfcAfaAfAfAfgUfgAfaAfuAfuUf | A2070 | aAfuAfuUfuCfaCfuuuUfuGfuUfgAfasGfsu | 0.052 | 0.557 | 0.395 |
D2071 | S2071 | AfaCfuAfaCfuAfAfCfuUfaAfuUfcAfaAf | A2071 | uUfuGfaAfuUfaAfguuAfgUfuAfgUfusGfsc | 0.025 | 0.220 | 0.232 |
D2072 | S2072 | CfcAfaCfaGfcAfUfAfgUfcAfaAfuAfaAf | A2072 | uUfuAfuUfuGfaCfuauGfcUfgUfuGfgsUfsu | 0.293 | 0.923 | 0.899 |
D2073 | S2073 | AfaCfcCfaCfaGfAfAfaUfuUfcUfcUfaUf | A2073 | aUfaGfaGfaAfaUfuucUfgUfgGfgUfusCfsu | 0.021 | 0.375 | 0.356 |
D2074 | S2074 | UfgUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAf | A2074 | uUfgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasUfsa | 0.052 | 0.402 | 0.513 |
D2075 | S2075 | GfaAfaGfcCfuCfCfUfaGfaAfgAfaAfaAf | A2075 | uUfuUfuCfuUfcUfaggAfgGfcUfuUfcsAfsa | 0.171 | 0.904 | 0.893 |
D2076 | S2076 | AfaUfaUfuUfaGfAfAfgAfgCfaAfcUfaAf | A2076 | uUfaGfuUfgCfuCfuucUfaAfaUfaUfusUfsc | 0.142 | 0.614 | 0.688 |
D2077 | S2077 | AfcUfaAfcUfaAfCfUfuAfaUfuCfaAfaAf | A2077 | u Ufu UfgAfa Ufu Afagu UfaGf u UfaGf usUfsg | 0.020 | 0.312 | 0.316 |
- 45 042669
D2078 | S2078 | CfaAfcAfgCfaUfAfGfuCfaAfaUfaAfaAf | A2078 | u Ufu Ufa Ufu UfgAfcua UfgCf uGf u UfgsGfsu | 0.026 | 0.313 | 0.393 |
D2079 | S2079 | CfcAfcAfgAfaAfUfUfuCfuCfuAfuCfuUf | A2079 | aAfgAfuAfgAfgAfaauUfuCfuGfuGfgsGfsu | 0.012 | 0.596 | 0.345 |
D2080 | S2080 | GfuCfaCfuUfgAfAfCfuCfaAfcUfcAfaAf | A2080 | uUfuGfaGfuUfgAfguuCfaAfgUfgAfcsAfsu | 0.054 | 0.503 | 0.456 |
D2081 | S2081 | CfuCfcUfaGfaAfGfAfaAfaAfaUfuCfuAf | A2081 | uAfgAfaUfuUfuUfucuUfcUfaGfgAfgsGfsc | 0.050 | 0.596 | 0.531 |
D2082 | S2082 | AfuUfuAfgAfaGfAfGfcAfaCfuAfaCfuAf | A2082 | uAfgUfuAfgUfuGfcucUfuCfuAfaAfusAfsu | 0.064 | 0.806 | 0.928 |
D2083 | S2083 | CfuAfaCfuAfaCfUfUfaAfuUfcAfaAfaUf | A2083 | aUfuUfuGfaAfuUfaagUfuAfgUfuAfgsUfsu | 0.056 | 0.844 | 0.761 |
D2084 | S2084 | CfaGfcAfuAfgUfCfAfaAfuAfaAfaGfaAf | A2084 | uUfcUfuUfuAfuUfugaCfuAfuGfcUfgsUfsu | 0.046 | 0.859 | 0.756 |
D2085 | S2085 | GfaAfaUfaAfgAfAfAfuGfuAfaAfaCfaUf | A2085 | aUfgUfuUfuAfcAfuuuCfuUfaUfuUfcsAfsu | 0.039 | 0.615 | 0.612 |
D2086 | S2086 | UfcAfcUfuGfaAfCfUfcAfaCfuCfaAfaAf | A2086 | uUfuUfgAfgUfuGfaguUfcAfaGfuGfasCfsa | 0.057 | 0.724 | 0.663 |
D2087 | S2087 | UfcUfaCfuUfcAfAfCfaAfaAfaGfuGfaAf | A2087 | uUfcAfcUfuUfuUfguuGfaAfgUfaGfasAfsu | 0.732 | 1.028 | 0.915 |
D2088 | S2088 | UfuUfaGfaAfgAfGfCfaAfcUfaAfcUfaAf | A2088 | uUfaGfuUfaGfuUfgcuCfuUfcUfaAfasUfsa | 0.061 | 0.795 | 0.785 |
D2089 | S2089 | AfaAfaCfaAfgAfUfAfaUfaGfcAfuCfaAf | A2089 | uUfgAfuGfcUfaUfuauCfuUfgUfuUfusUfsc | 0.330 | 1.017 | 0.865 |
D2090 | S2090 | AfgCfaUfaGfuCfAfAfaUfaAfaAfgAfaAf | A2090 | u Uf uCf u Uf u Ufa Ufu ugAfcUfa UfgCfusGfsu | 0.038 | 0.606 | 0.589 |
D2091 | S2091 | AfgAfcCfcAfgCfAfAfcUfcUfcAfaGfuUf | A2091 | aAfcUfuGfaGfaGfuugCfuGfgGfuCfusGfsa | 0.301 | 0.850 | 0.753 |
D2092 | S2092 | AfgUfcCfaUfgGfAfCfaUfuAfaUfuCfaAf | A2092 | u UfgAfa Ufu Afa UfgucCfa UfgGfaCf usAfsc | 0.407 | 0.791 | 0.726 |
D2093 | S2093 | Gfa UfgGfa UfcAfCf Afa AfaCfu UfcAfa Uf | A2093 | aUfuGfaAfgUfuUfuguGfaUfcCfaUfcsUfsa | 0.120 | 0.658 | 0.654 |
D2094 | S2094 | CfuAfgAfgAfaGfAfUfaUfaCfuCfcAfuAf | A2094 | uAfuGfgAfgUfaUfaucUfuCfuCfuAfgsGfsc | 0.071 | 0.610 | 0.645 |
D2095 | S2095 | AfaAfgAfcAfaCfAfAfaCfaUfuAfuAfuUf | A2095 | a Afu AfuAfa UfgUfu ugUfuGfuCfu Uf usCfsc | 0.029 | 0.306 | 0.461 |
D2096 | S2096 | CfaUfuAfuAfuUfGfAfaUfaUfuCfuUfuUf | A2096 | aAfaAfgAfaUfaUfucaAfuAfuAfaUfgsUfsu | 0.031 | 0.510 | 0.595 |
D2097 | S2097 | GfaCfcCfaGfcAfAfCfuCfuCfaAfgUfuUf | A2097 | aAfaCfuUfgAfgAfguuGfcUfgGfgUfcsUfsg | 0.075 | 0.697 | 0.845 |
D2098 | S2098 | GfgAf u Cf a Cfa AfAfAf c Uf u Cf a Af u Gf a Af | A2098 | uUfcAfuUfgAfaGfuuuUfgUfgAfuCfcsAfsu | 0.130 | 0.831 | 0.951 |
D2099 | S2099 | Gfa AfgAf uAfu AfCf UfcCfa UfaGf u Gfa Af | A2099 | uUfcAfcUfaUfgGfaguAfuAfuCfuUfcsUfsc | 0.058 | 0.828 | 0.938 |
D21OO | S21OO | GfaCfaAfcAfaAfCfAfuUfaUfaUfuGfaAf | A2100 | uUfcAfaUfaUfaAfuguUfuGfuUfgUfcsUfsu | 0.026 | 0.564 | 0.856 |
D21O1 | S21O1 | GfgGfaAfaUfcAfCfGfaAfaCfcAfaCfuAf | A2101 | uAfgUfuGfgUfuUfcguGfaUfuUfcCfcsAfsa | 0.314 | 0.948 | 1.033 |
D21O2 | S21O2 | AfcCfcAfgCfaAfCfUfcUfcAfaGfuUfuUf | A2102 | aAfaAfcUfuGfaGfaguUfgCfuGfgGfusCfsu | 0.033 | 0.448 | 0.675 |
D2103 | S2103 | GfgAfcAfuUfaAfUfUfcAfaCfaUfcGfaAf | A2103 | uUfcGfaUfgUfuGfaauUfaAfuGfuCfcsAfsu | 0.156 | 0.897 | 0.912 |
D2104 | S2104 | GfaUfcAfcAfaAfAfCfuUfcAfaUfgAfaAf | A2104 | uUfuCfaUfuGfaAfguuUfuGfuGfaUfcsCfsa | 0.056 | 0.619 | 0.769 |
D21O5 | S21O5 | AfcUfcCfaUfaGfUfGfaAfgCfaAfuCfuAf | A21O5 | uAfgAfuUfgCfuUfcacUfaUfgGfaGfusAfsu | 0.100 | 0.823 | 0.925 |
D2106 | S2106 | AfcAfaCfaAfaCfAfUfuAfuAfuUfgAfaUf | A2106 | aUfuCfaAfuAfuAfaugUfuUfgUfuGfusCfsu | 0.035 | 0.565 | 0.843 |
D2107 | S2107 | GfgAfaAfuCfaCfGfAfaAfcCfaAfcUfaUf | A2107 | a UfaGfu UfgGfu Uf ucgUfgAf u UfuCfcsCfsa | 0.076 | 0.701 | 0.890 |
D2108 | S2108 | CfcCfaGfcAfaCfUfCfuCfaAfgUfuUfuUf | A2108 | aAfaAfaCfuUfgAfgagUfuGfcUfgGfgsUfsc | 0.057 | 0.626 | 0.884 |
D2109 | S2109 | GfaCfaUfuAfaUfUfCfaAfcAfuCfgAfaUf | A2109 | aUfuCfgAfuGfuUfgaaUfuAfaUfgUfcsCfsa | 0.160 | 0.873 | 1.012 |
D211O | S211O | AfaCfgUfgGfgAfGfAfaCfuAfcAfaAfuAf | A211O | uAfuUfuGfuAfgUfucuCfcCfaCfgUfusUfsc | 0.101 | 0.881 | 0.981 |
D2111 | S2111 | CfuCfcAfuAfgUfGfAfaGfcAfaUfcUfaAf | A2111 | uUfaGfaUfuGfcUfucaCfuAfuGfgAfgsUfsa | 0.026 | 0.435 | 0.691 |
D2112 | S2112 | CfaAfcAfaAfcAfUfUfaUfaUfuGfaAfuAf | A2112 | uAfuUfcAfaUfaUfaauGfuUfuGfuUfgsUfsc | 0.154 | 0.882 | 1.091 |
D2113 | S2113 | GfaAfaUfcAfcGfAfAfaCfcAfaCfuAfuAf | A2113 | uAfuAfgUfuGfgUfuucGfuGfaUfuUfcsCfsc | 0.045 | 0.764 | 1.004 |
D2114 | S2114 | CfuCfuCfaAfgUfUfUfuUfcAfuGfuCfuAf | A2114 | uAfgAfcAfuGfaAfaaaCfuUfgAfgAfgsUfsu | 0.105 | 0.925 | 0.988 |
D2115 | S2115 | AfcAfuUfaAfuUfCfAfaCfaUfcGfaAfuAf | A2115 | u Af u UfcGfa UfgUfuga Af u Ufa AfuGf usCfsc | 0.114 | 0.919 | 0.905 |
D2116 | S2116 | GfgGfaGfaAfcUfAfCfaAfaUfaUfgGfuUf | A2116 | aAfcCfaUfaUfuUfguaGfuUfcUfcCfcsAfsc | 0.234 | 1.023 | 0.951 |
D2117 | S2117 | UfcCfaUfaGfuGfAfAfgCfaAfuCfuAfaUf | A2117 | aUfuAfgAfuUfgCfuucAfcUfaUfgGfasGfsu | 0.033 | 0.566 | 0.778 |
D2118 | S2118 | AfaCfaAfaCfaUfUfAfuAfuUfgAfaUfaUf | A2118 | aUfaUfuCfaAfuAfuaaUfgUfuUfgUfusGfsu | 0.031 | 0.535 | 0.785 |
D2119 | S2119 | UfgGfcAfaUfgUfCfCfcCfaAfuGfcAfaUf | A2119 | aUfuGfcAfuUfgGfggaCfaUfuGfcCfasGfsu | 0.065 | 0.815 | 0.967 |
D212O | S212O | UfcAfgGfuAfgUfCfCfaUfgGfaCfaUfuAf | A212O | uAfaUfgUfcCfaUfggaCfuAfcCfuGfasUfsa | 0.223 | 0.825 | 0.924 |
D2121 | S2121 | UfuAfaUfuCfaAfCfAfuCfgAfaUfaGfaUf | A2121 | aUfcUfaUfuCfgAfuguUfgAfaUfuAfasUfsg | 0.083 | 0.781 | 0.915 |
D2122 | S2122 | GfgAfgAfaCfuAfCfAfaAfuAfuGfgUfuUf | A2122 | aAfaCfcAfuAfuUfuguAfgUfuCfuCfcsCfsa | 0.079 | 0.680 | 0.767 |
D2123 | S2123 | CfcAfuAfgUfgAfAfGfcAfaUfcUfaAfuUf | A2123 | aAfuUfaGfaUfuGfcuuCfaCfuAfuGfgsAfsg | 0.026 | 0.537 | 0.793 |
D2124 | S2124 | AfcAfa AfcAfu UfAfUfa Uf uGfa Af u Afu Uf | A2124 | aAfuAfuUfcAfaUfauaAfuGfuUfuGfusUfsg | 0.044 | 0.680 | 0.828 |
D2125 | S2125 | AfaUfgCfaAfuCfCfCfgGfaAfaAfcAfaAf | A2125 | u UfuGfu Uf u UfcCfgggAfu UfgCfa Uf usGfsg | 0.349 | 0.971 | 1.005 |
D2126 | S2126 | Cf a GfgUf a Gf u Cf Cf Af u GfgAf c Afu Ufa Af | A2126 | uUfaAfuGfuCfcAfuggAfcUfaCfcUfgsAfsu | 0.070 | 0.548 | 0.546 |
D2127 | S2127 | UfuCfaAfcAfuCfGfAfaUfaGfaUfgGfaUf | A2127 | aUfcCfaUfcUfaUfucgAfuGfuUfgAfasUfsu | 0.225 | 0.958 | 0.967 |
D2128 | S2128 | GfuUfgGfgCfcUfAfGfaGfaAfgAfuAfuAf | A2128 | uAfuAfuCfuUfcUfcuaGfgCfcCfaAfcsCfsa | 0.765 | 0.969 | 0.922 |
D2129 | S2129 | CfaUfaGfuGfaAfGfCfaAfuCfuAfaUfuAf | A2129 | uAfaUfuAfgAfuUfgcuUfcAfcUfaUfgsGfsa | 0.028 | 0.583 | 0.777 |
D213O | S213O | AfaCfaUfuAfuAfUfUfgAfaUfaUfuCfuUf | A213O | aAfgAfaUfaUfuCfaauAfuAfaUfgUfusUfsg | 0.249 | 0.916 | 0.981 |
D2131 | S2131 | GfcAfaUfcCfcGfGfAfaAfaCfaAfaGfaUf | A2131 | aUfcUfuUfgUfuUfuccGfgGfaUfuGfcsAfsu | 0.435 | 1.002 | 1.019 |
- 46 042669
D2132 | S2132 | GfgUfaGfuCfcAfUfGfgAfcAfuUfaAfuUf | A2132 | aAfuUfaAfuGfuCfcauGfgAfcUfaCfcsUfsg | 0.427 | 0.988 | 0.918 |
D2133 | S2133 | AfuCfgAfaUfaGfAfUfgGfaUfcAfcAfaAf | A2133 | uUfuGfuGfaUfcCfaucUfaUfuCfgAfusGfsu | 0.170 | 0.706 | 0.890 |
D2134 | S2134 | CfcUfaGfaGfaAfGfAfuAfuAfcUfcCfaUf | A2134 | aUfgGfaGfuAfuAfucuUfcUfcUfaGfgsCfsc | 0.033 | 0.543 | 0.733 |
D2135 | S2135 | GfuUfgGfaAfgAfCfUfgGfaAfaGfaCfaAf | A2135 | uUfgUfcUfuUfcCfaguCfuUfcCfaAfcsUfsc | 0.137 | 0.975 | 0.944 |
D2136 | S2136 | AfcAf u Ufa Ufa Uf UfGfa Af u Af u UfcUfu Uf | A2136 | aAfaGfaAfuAfuUfcaaUfaUfaAfuGfusUfsu | 0.114 | 0.882 | 0.940 |
D2137 | S2137 | CfaAfuCfcCfgGfAfAfaAfcAfaAfgAfuUf | A2137 | aAfuCfuUfuGfuUfuucCfgGfgAfuUfgsCfsa | 0.155 | 0.755 | 0.686 |
D2138 | S2138 | CfuAfcUfuGfgGfAfUfcAfcAfaAfgCfaAf | A2138 | uUfgCfuUfuGfuGfaucCfcAfaGfuAfgsAfsa | 0.196 | 0.825 | 0.658 |
D2139 | S2139 | AfcAfaCfcUfaAfAfUfgGfuAfaAfuAfuAf | A2139 | uAfuAfuUfuAfcCfauuUfaGfgUfuGfusUfsu | 0.133 | 0.704 | 0.671 |
D2140 | S2140 | AfuCfcAfuCfcAfAfCfaGfaUfuCfaGfaAf | A2140 | uUfcUfgAfaUfcUfguuGfgAfuGfgAfusCfsa | 0.184 | 0.775 | 0.658 |
D2141 | S2141 | AfaCfuGfaGfgCfAfAfaUfuUfaAfaAfgAf | A2141 | uCf u Uf u UfaAfa Uf u ugCfcUfcAfgUf usCfsa | 0.076 | 0.682 | 0.777 |
D2142 | S2142 | AfgAfgUfaUfgUfGfUfaAfaAfaUfcUfgUf | A2142 | aCfaGfaUfuUfuUfacaCfaUfaCfuCfusGfsu | 0.448 | 0.659 | 0.761 |
D2143 | S2143 | AfaUfcCfcGfgAfAfAfaCfaAfaGfaUfuUf | A2143 | aAfaUfcUfuUfgUfuuuCfcGfgGfaUfusGfsc | 0.097 | 0.844 | 0.924 |
D2144 | S2144 | UfaCfuUfgGfgAfUfCfaCfaAfaGfcAfaAf | A2144 | uUfuGfcUfuUfgUfgauCfcCfaAfgUfasGfsa | 0.084 | 0.875 | 0.947 |
D2145 | S2145 | CfaAfcCfuAfaAfUfGfgUfaAfaUfaUfaAf | A2145 | uUfaUfaUfuUfaCfcauUfuAfgGfuUfgsUfsu | 0.104 | 0.811 | 0.814 |
D2146 | S2146 | UfuGfaAfuGfaAfCfUfgAfgGfcAfaAfuUf | A2146 | aAfuUfuGfcCfuCfaguUfcAfuUfcAfasAfsg | 0.046 | 0.549 | 0.680 |
D2147 | S2147 | AfcUfgAfgGfcAfAfAfuUfuAfaAfaGfgAf | A2147 | uCfcUfuUfuAfaAfuuuGfcCfuCfaGfusUfsc | 0.079 | 0.890 | 1.005 |
D2148 | S2148 | GfaGfuAfuGfuGfUfAfaAfaAfuCfuGfuAf | A2148 | uAfcAfgAfuUfuUfuacAfcAfuAfcUfcsUfsg | 0.497 | 0.676 | 0.783 |
D2149 | S2149 | AfcUfuGfgGfaUfCfAfcAfaAfgCfaAfaAf | A2149 | u Ufu UfgCfu Uf uGf uga UfcCfcAfaGf usAfsg | 0.049 | 0.699 | 0.907 |
D2150 | S2150 | AfuGfgUfaAfaUfAfUfaAfcAfaAfcCfaAf | A2150 | uUfgGfuUfuGfuUfauaUfuUfaCfcAfusUfsu | 0.093 | 0.928 | 0.941 |
D2151 | S2151 | UfgAfaUfgAfaCfUfGfaGfgCfaAfaUfuUf | A2151 | aAfaUfuUfgCfcUfcagUfuCfaUfuCfasAfsa | 0.201 | 0.736 | 0.885 |
D2152 | S2152 | CfuGfaGfgCfaAfAfUfuUfaAfaAfgGfcAf | A2152 | uGfcCfuUfuUfaAfauuUfgCfcUfcAfgsUfsu | 0.071 | 0.938 | 0.872 |
D2153 | S2153 | AfgUfaUfgUfgUfAfAfaAfaUfcUfgUfaAf | A2153 | uUfaCfaGfaUfuUfuuaCfaCfaUfaCfusCfsu | 0.504 | 0.816 | 0.689 |
D2154 | S2154 | GfaAfaAfcAfaAfGfAfuUfuGfgUfgUfuUf | A2154 | aAfaCfaCfcAfaAfucuUfuGfuUfuUfcsCfsg | 0.061 | 0.723 | 0.922 |
D2155 | S2155 | AfgUfgUfgGfaGfAfAfaAfcAfaCfcUfaAf | A2155 | uUfaGfgUfuGfuUfuucUfcCfaCfaCfusCfsa | 0.071 | 0.689 | 0.869 |
D2156 | S2156 | GfuCfuCfaAfaAfUfGfgAfaGfgUfuAfuAf | A2156 | uAfuAfaCfcUfuCfcauUfuUfgAfgAfcsUfsu | 0.133 | 0.643 | 0.974 |
D2157 | S2157 | GfaAfuGfaAfcUfGfAfgGfcAfaAfuUfuAf | A2157 | uAfaAfuUfuGfcCfucaGfuUfcAfuUfcsAfsa | 0.204 | 0.751 | 1.008 |
D2158 | S2158 | UfgAfgGfcAfaAfUfUfuAfaAfaGfgCfaAf | A2158 | uUfgCfcUfuUfuAfaauUfuGfcCfuCfasGfsu | 0.089 | 0.820 | 0.937 |
D2159 | S2159 | GfuAfuGfuGfuAfAfAfaAfuCfuGfuAfaUf | A2159 | aUfuAfcAfgAfuUfuuuAfcAfcAfuAfcsUfsc | 0.535 | 0.697 | 0.788 |
D2160 | S2160 | AfaAfaCfaAfaGfAfUfuUfgGfuGfuUfuUf | A2160 | aAfaAfcAfcCfaAfaucUfuUfgUfuUfusCfsc | 0.297 | 0.954 | 1.004 |
D2161 | S2161 | GfuGfuGfgAfgAfAfAfaCfaAfcCfuAfaAf | A2161 | uUfuAfgGfuUfgUfuuuCfuCfcAfcAfcsUfsc | 0.178 | 0.872 | 0.918 |
D2162 | S2162 | AfuGfgAfaGfgUfUfAfuAfcUfcUfaUfaAf | A2162 | uUfaUfaGfaGfuAfuaaCfcUfuCfcAfusUfsu | 0.026 | 0.489 | 0.890 |
D2163 | S2163 | AfaUfgAfaCfuGfAfGfgCfaAfaUfuUfaAf | A2163 | uUfaAfaUfuUfgCfcucAfgUfuCfaUfusCfsa | 0.111 | 0.789 | 0.859 |
D2164 | S2164 | GfaGfgCfaAfaUfUfUfaAfaAfgGfcAfaUf | A2164 | a UfuGfcCf u Ufu Ufaaa Uf u UfgCfcUfcsAfsg | 0.241 | 0.956 | 0.869 |
D2165 | S2165 | UfaUfgUfgUfaAfAfAfaUfcUfgUfaAfuAf | A2165 | uAfuUfaCfaGfaUfuuuUfaCfaCfaUfasCfsu | 0.571 | 0.762 | 0.931 |
D2166 | S2166 | AfcAfaAfgAfuUfUfGfgUfgUfuUfuCfuAf | A2166 | uAfgAfaAfaCfaCfcaaAfuCfuUfuGfusUfsu | 0.106 | 0.981 | 0.924 |
D2167 | S2167 | UfgUfgGfaGfaAfAfAfcAfaCfcUfaAfaUf | A2167 | aUfuUfaGfgUfuGfuuuUfcUfcCfaCfasCfsu | 0.064 | 0.765 | 0.902 |
D2168 | S2168 | UfgGfaAfgGfuUfAfUfaCfuCfuAfuAfaAf | A2168 | uUfuAfuAfgAfgUfauaAfcCfuUfcCfasUfsu | 0.029 | 0.675 | 0.859 |
D2169 | S2169 | AfuGfaAfcUfgAfGfGfcAfaAfuUfuAfaAf | A2169 | uUfuAfaAfuUfuGfccuCfaGfuUfcAfusUfsc | 0.054 | 0.733 | 0.843 |
D2170 | S2170 | AfgGfcAfaAfuUfUfAfaAfaGfgCfaAfuAf | A2170 | uAfuUfgCfcUfuUfuaaAfuUfuGfcCfusCfsa | 0.075 | 0.754 | 0.881 |
D2171 | S2171 | AfaGfa Ufu UfgGfUfGf u Uf u UfcUfaCfu Uf | A2171 | aAfgUfaGfaAfaAfcacCfaAfaUfcUfusUfsg | 0.303 | 1.065 | 0.977 |
D2172 | S2172 | AfaAfcAfaCfcUfAfAfaUfgGfuAfaAfuAf | A2172 | uAfuUfuAfcCfaUfuuaGfgUfuGfuUfusUfsc | 0.101 | 0.855 | 0.880 |
D2173 | S2173 | AfuAfcUfcUfaUfAfAfaAfuCfaAfcCfaAf | A2173 | u UfgGf u UfgAf u Ufu ua UfaGfaGf u Af usAfsa | 0.107 | 0.961 | 0.960 |
D2174 | S2174 | UfgAfaCfuGfaGfGfCfaAfaUfuUfaAfaAf | A2174 | uUfuUfaAfaUfuUfgccUfcAfgUfuCfasUfsu | 0.078 | 0.714 | 0.878 |
D2175 | S2175 | GfgCfa Afa Uf u Uf AfAfa AfgGfcAfa Ufa Af | A2175 | uUfaUfuGfcCfuUfuuaAfaUfuUfgCfcsUfsc | 0.054 | 0.767 | 0.918 |
D2176 | S2176 | UfuUfuCfuAfcUfUfGfgGfaUfcAfcAfaAf | A2176 | uUfuGfuGfaUfcCfcaaGfuAfgAfaAfasCfsa | 0.915 | 1.030 | 0.916 |
D2177 | S2177 | AfaCfaAfcCfuAfAfAfuGfgUfaAfaUfaUf | A2177 | aUfaUfuUfaCfcAfuuuAfgGfuUfgUfusUfsu | 0.042 | 0.260 | 0.448 |
D2178 | S2178 | UfaCfuCfuAfuAfAfAfaUfcAfaCfcAfaAf | A2178 | uUfuGfgUfuGfaUfuuuAfuAfgAfgUfasUfsa | 0.063 | 0.897 | 0.869 |
D2179 | S2179 | GfaAfcUfgAfgGfCfAfaAfuUfuAfaAfaAf | A2179 | uUfuUfuAfaAfuUfugcCfuCfaGfuUfcsAfsu | 0.178 | 0.858 | 0.869 |
D2180 | S2180 | CfaGfaGfuAfuGfUfGfuAfaAfaAfuCfuUf | A2180 | aAfgAfuUfuUfuAfcacAfuAfcUfcUfgsUfsg | 0.436 | 0.677 | 0.813 |
Пример 4. Активность сайленсинга in vitro с различными химическими модификациями на ANGPTL3 миРНК.
Клеточная культура и трансфекции.
Клетки Нер3В (АТСС, Manassas, VA) выращивают почти до слияния при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в RPMI (АТСС) с добавлением 10% FBS, стрептомицина и глутамина (АТСС) и затем извлекают из чашки трипсинизацией. Трансфекцию выполняют, добавляя к 5 мкл миРНК-дуплексов на лунку в 96-луночном планшете 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13788-150), и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем к смеси миРНК добавляют 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей ~2х104 клеток Нер3В. Клетки инкубируют или 24 или 120 ч и затем очищают РНК. Эксперименты с однократной дозой выполняют при конечной концентрации дуплексов 10 и 0,1 нМ, и эксперименты по зависимости реакции от дозы выполняют с использованием конечной концентрации дуплексов 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 и 0,00001 нМ, если не указано иное.
Синтез кДНК с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, кат. № 4368813).
К 10 мкл полной РНК добавляют основную смесь из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реак-
Claims (22)
1. Двухцепочечное средство РНКи, способное ингибировать экспрессию гена-мишени, содержащее смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов, где дуплекс представлен формулой (III) смысловая: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')i-Na'-nq' 5' (III), гд е каждый i, j, k и l независимо равен 0 или 1;
ка ждый р и q независимо равен 0-6;
ка ждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20 модифицированных нуклеотидов, где каждая последовательность содержит по меньшей мере два различно модифицированных нуклеотида, каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый Dp, np', nq и nq' независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность, содержащую 0-6 нуклеотидов; и каждый XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах; и гд е модификация в Nb отличается от модификации в Y, и модификация в Nb' отличается от модификации в Y';
где мотив ΎΎΎ' находится в положениях 11, 12 и 13, отсчитывая с первой пары нуклеотидов в области дуплекса с 5'-конца антисмысловой цепи; и гд е Ύ' представляет собой 2'-F и Ύ' представляет собой 2'-ОМе, где каждый нуклеотид Ύ образует пару оснований с нуклеотидом Ύ';
где антисмысловая цепь содержит два блока из двух фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 фосфатными межнуклеотидными связями.
2. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где i равен 1, j равен 1 или оба i и j равны 1.
3. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где k равен 1, l равен 1 или оба k и l равны 1.
4. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где длина дуплексного участка составляет 17-30 пар нук
- 48 042669 леотидов.
5. Двухцепочечное средство РНКи по п.4, где длина дуплексного участка составляет 17-19 пар нуклеотидов.
6. Двухцепочечное средство РНКи по п.4, где длина дуплексного участка составляет 27-30 пар нуклеотидов.
7. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где каждая цепь имеет 17-30 нуклеотидов.
8. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где модификации в нуклеотидах выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтила, 2'-О-алкила, 2'-О-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси и их комбинаций.
9. Двухцепочечное средство РНКи по п.8, где нуклеотиды модифицированы либо 2'-ОСН3, либо 2'-F.
10. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, дополнительно содержащее по меньшей мере один ли ганд.
11. Двухцепочечное средство РНКи по п.10, где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных через бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер.
12. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где модификации в нуклеотидах выбраны из группы, состоящей из 2'-О-метилнуклеотида, 2'-дезоксифторнуклеотида, 2'-О-И-метилацетамидо (2'-O-NMA) нуклеотида, 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил (2'-O-DMAEOE) нуклеотида, 2'-О-аминопропил (2'-О-АР) нуклеотида, 2'-ara-F и их комбинаций.
13. Двухцепочечное средство РНКи по π. 11, где лиганд присоединен к 3'-концу смысловой цепи.
14. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где пара оснований в положении 1 5'-конца дуплекса представляет собой пару оснований AU.
15. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где каждая цепь имеет 17-23 нуклеотида.
16. Двухцепочечное средство РНКи по п.1, где формула (III) представлена как смысловая цепь: 5' Na-(XXX),-Nb-YYY-Nb- (ZZZ)rNa 3' антисмысловая цепь: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-YYY'-Nb'-(Z'Z'Z')i-Na' 5'
17. Двухцепочечное средство РНКи по п.16, где каждая модификация нуклеотида независимо выбрана из группы, состоящей из 2'-фтор и 2'-О-метила.
18. Двухцепочечное средство РНКи по п.16, дополнительно содержащее по меньшей мере один ли ганд.
19. Двухцепочечное средство РНКи по п.18, где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер.
20. Двухцепочечное средство РНКи по п.19, где лиганд присоединен к 3'-концу смысловой цепи.
21. Двухцепочечное средство РНКи по п.16, где каждая цепь имеет 17-30 нуклеотидов.
22. Двухцепочечное средство РНКи по п.16, где каждая цепь имеет 17-23 нуклеотида.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/561,710 | 2011-11-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA042669B1 true EA042669B1 (ru) | 2023-03-09 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11406716B2 (en) | Modified RNAi agents | |
EP2880162B1 (en) | Modified rnai agents | |
US10119136B2 (en) | RNAi agents modified at the 4′-C position | |
CA3118537A1 (en) | Modified double stranded oligonucleotides | |
CA3205809A1 (en) | Modified double stranded oligonucleotides | |
EA042669B1 (ru) | МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СРЕДСТВА РНКи |