EA042669B1 - MODIFIED RNAi AGENTS - Google Patents
MODIFIED RNAi AGENTS Download PDFInfo
- Publication number
- EA042669B1 EA042669B1 EA201490993 EA042669B1 EA 042669 B1 EA042669 B1 EA 042669B1 EA 201490993 EA201490993 EA 201490993 EA 042669 B1 EA042669 B1 EA 042669B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nucleotides
- strand
- double
- nucleotide
- rnai agent
- Prior art date
Links
Description
Родственная заявкаRelated application
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/561710, поданной 18 ноября 2011 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.The present application claims priority to US Provisional Application No. 61/561,710, filed Nov. 18, 2011, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Изобретение относится к дуплексным средствам РНКи, имеющим определенные мотивы, которые эффективны для ингибирования экспрессии гена-мишени, а также к композициям РНКи, подходящим для терапевтического использования. Кроме того, изобретение относится к способам ингибирования экспрессии гена-мишени путем введения таких дуплексных средств РНКи, например, для лечения различных заболеваний.The invention relates to RNAi duplex agents having specific motifs that are effective in inhibiting target gene expression, as well as to RNAi compositions suitable for therapeutic use. In addition, the invention relates to methods for inhibiting target gene expression by administering such RNAi duplex agents, for example, for the treatment of various diseases.
Уровень техникиState of the art
РНК-интерференция или РНКи является термином, изначально введенным Fire и его сотрудниками для описания наблюдения, при котором двухцепочечная РНКи (дцРНК) может блокировать экспрессию гена (Fire et al. (1998), Nature, 391, 806-811; Elbashir et al. (2001), Genes Dev., 15, 188-200). Короткая дцРНК направляет ген-специфический пост-транскрипционный сайленсинг у многих организмов, включая позвоночных, и является новым инструментом для исследования функции генов. РНКи опосредуется РНК-индуцированным сайленсинговым комплексом (RISC), специфической для последовательности многокомпонентной нуклеазой, которая разрушает матричные РНК, гомологичные последовательности, запускающей сайленсинг. Известно, что RISC содержит короткие РНК (приблизительно из 22 нуклеотидов), полученные из двухцепочечной РНК, запускающей сайленсинг, но белковые компоненты такой активности остаются неизвестными.RNA interference or RNAi is a term originally coined by Fire and coworkers to describe the observation that double-stranded RNAi (dsRNA) can block gene expression (Fire et al. (1998), Nature, 391, 806-811; Elbashir et al. (2001), Genes Dev., 15, 188-200). The short dsRNA directs gene-specific post-transcriptional silencing in many organisms, including vertebrates, and is a novel tool for studying gene function. RNAi is mediated by the RNA-induced silencing complex (RISC), a sequence-specific multicomponent nuclease that degrades messenger RNAs homologous to the silencing-triggering sequence. It is known that RISC contains short RNAs (of approximately 22 nucleotides) derived from double-stranded RNA that trigger silencing, but the protein components of this activity remain unknown.
Молекулы двухцепочечных РНК (дцРНК) с эффективными ген-сайленсинговыми свойствами необходимы для разработки лекарственных средств на основе РНК-интерференции (РНКи). Начальной стадией РНКи является активация РНК-индуцированного сайленсингового комплекса (RISC), для которой требуется разрушение смысловой цепи дцРНК-дуплекса. Известно, что смысловая цепь действует как первый субстрат RISC, который расщепляется аргонаутом 2 в середине дуплексного участка. Сразу же после того, как расщепленные 5'-концевые и 3'-концевые фрагменты смысловой цепи удалятся из эндонуклеазы Ago2, RISC становится активированным антисмысловой цепью (Rand et al. (2005), Cell, 123, 621).Double-stranded RNA (dsRNA) molecules with effective gene-silencing properties are needed for drug development based on RNA interference (RNAi). The initial stage of RNAi is the activation of the RNA-induced silencing complex (RISC), which requires the destruction of the sense strand of the dsRNA duplex. The sense strand is known to act as the first RISC substrate to be cleaved by argonaut 2 in the middle of the duplex region. Immediately after the cleaved 5' and 3' sense strand fragments are cleared from the Ago2 endonuclease, RISC becomes activated by the antisense strand (Rand et al. (2005), Cell, 123, 621).
Полагают, что при ингибировании расщепления смысловой цепи эндонуклеотическое расщепление мРНК-мишени ослабляется (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314; Rand et al. (2005), Cell, 123, 621; Schwarz et al. (2004), Curr. Biol., 14, 787). Leuschner et al. показали, что введение 2'-О-Ме-рибозы в сайт расщепления Ago2 в смысловой цепи ингибирует РНКи в клетках HeLa (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314). Подобный эффект наблюдают с фосфоротиоатными модификациями, что указывает на то, что для эффективной РНКи у млекопитающих также требуется расщепление смысловой цепи.It is believed that upon inhibition of sense strand cleavage, endonucleotic cleavage of the target mRNA is attenuated (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314; Rand et al. (2005), Cell, 123, 621; Schwarz et al. ( 2004), Curr. Biol., 14, 787). Leuschner et al. showed that the introduction of 2'-O-Meribose at the Ago2 cleavage site in the sense strand inhibits RNAi in HeLa cells (Leuschner et al. (2006), EMBO Rep., 7, 314). A similar effect is observed with phosphorothioate modifications, indicating that effective RNAi in mammals also requires sense strand cleavage.
Morrissey et al. в сайте расщепления Ago2 среди других сайтов и модификаций также использовали миРНК-дуплекс, содержащий остатки, модифицированные 2'-F, и получили совместимый сайленсинг, сравнимый с немодифицированными миРНК (Morrissey et al. (2005), Hepatology, 41, 1349). Однако модификация по Morrissey не является мотив-специфической, например, одна модификация индуцирует модификации 2'-F на всех пиримидинах как на смысловой, так и на антисмысловой цепях до тех пор, пока пиримидиновый остаток присутствует, без какой-либо селективности; и следовательно, на основании таких указаний является неопределенным, может ли модификация специфического мотива в сайте расщепления смысловой цепи оказывать фактическое действие на активность сайленсинга генов. Muhonen et al. использовали миРНК-дуплекс, содержащий два модифицированных 2'-F остатка в сайте расщепления Ago2 на смысловой или антисмысловой цепи и нашли это допустимым (Muhonen et al. (2007), Chemistry & Biodiversity, 4, 858-873). Однако модификация по Muhonen также является специфической для последовательности, например, для каждой определенной цепи Muhonen модифицирует только или все пиримидины или все пурины без какой-либо селективности.Morrissey et al. at the Ago2 cleavage site, among other sites and modifications, an siRNA duplex containing residues modified with 2'-F was also used and consistent silencing comparable to unmodified siRNAs was obtained (Morrissey et al. (2005), Hepatology, 41, 1349). However, the Morrissey modification is not motif-specific, for example, one modification induces 2'-F modifications on all pyrimidines on both sense and antisense strands as long as a pyrimidine residue is present, without any selectivity; and therefore, based on such indications, it is uncertain whether modification of a specific motif at the sense strand cleavage site can actually have an effect on gene silencing activity. Muhonen et al. used an siRNA duplex containing two modified 2'-F residues at the Ago2 cleavage site on the sense or antisense strand and found this to be acceptable (Muhonen et al. (2007), Chemistry & Biodiversity, 4, 858-873). However, the Muhonen modification is also sequence specific, for example, for any given chain, Muhonen modifies only or all pyrimidines or all purines without any selectivity.
Choung et al. использовали миРНК-дуплекс, содержащий альтернативные модификации, за счет 2'-OMe или различных комбинаций 2'-F, 2'-OMe и фосфоротиоатных модификаций для стабилизации миРНК в сыворотке к Surl0058 (Choung et al. (2006), Biochemical and Biophysical Research Communications, 342, 919-927). Choung предполагал, что остатки в сайте расщепления антисмысловой цепи не должны модифицироваться 2'-Оме, для того чтобы повысить устойчивость миРНК.Choung et al. used an siRNA duplex containing alternative modifications at the expense of 2'-OMe or various combinations of 2'-F, 2'-OMe and phosphorothioate modifications to stabilize serum siRNA to Surl0058 (Choung et al. (2006), Biochemical and Biophysical Research Communications, 342, 919-927). Choung suggested that residues at the antisense strand cleavage site should not be modified with 2'-ome in order to increase the stability of the siRNA.
Таким образом, существует потребность в иРНК-дуплексных средствах для улучшения эффективности сайленсинга генов миРНК-средств генной терапии. Настоящее изобретение направлено на решение такой потребности.Thus, there is a need for mRNA duplex agents to improve the gene silencing efficiency of miRNA gene therapy agents. The present invention addresses such a need.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Настоящее изобретение относится к эффективным нуклеотидам или химическим мотивам для средств дцРНК, необязательно конъюгированных по меньшей мере с одним лигандом, которые являются эффективными для ингибирования экспрессии гена-мишени, а также к композициям РНКи, подходящим для терапевтического применения.The present invention relates to effective nucleotides or chemical motifs for dsRNA agents, optionally conjugated to at least one ligand, that are effective to inhibit target gene expression, as well as RNAi compositions suitable for therapeutic use.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что введение одного или нескольких мотивов изThe inventors unexpectedly found that the introduction of one or more motifs from
- 1 042669 трех идентичных модификаций в три последовательных нуклеотида в сайте расщепления средства дцРНК или возле него, где средство дцРНК состоит из модифицированных смысловой и антисмысловой цепей, усиливает активность генного сайленсинга дцРНК-средством.- 1 042669 three identical modifications of three consecutive nucleotides at or near the cleavage site of the dsRNA agent, where the dsRNA agent consists of modified sense and antisense strands, enhances the gene silencing activity of the dsRNA agent.
В одном из аспектов изобретение относится к двухцепочечному средству РНКи (дцРНК), способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. ДцРНК-дуплекс представлен формулой (III) смысловая: 5' np-Na-(XXX)1-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'- (X'X'X' )k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')1-Na'-nq' 5' (III)In one aspect, the invention relates to a double-stranded RNAi (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, where each strand has 14 to 30 nucleotides. The dsRNA duplex is represented by formula (III) sense: 5' np-N a -(XXX) 1 -N b -YYY-Nb-(ZZZ) j -N a -n q 3' antisense: 3' n p '-N a '- (X'X'X' ) k -N b '-Y'Y'Y'-N b '-(Z'Z'Z') 1 -N a '-n q '5' (III)
В формуле (III) каждый i, j, k и l независимо равен 0 или 1;In formula (III), i, j, k, and l are each independently 0 or 1;
каждый р и q независимо равен 0-6;p and q are each independently 0-6;
n представляет собой нуклеотид;n is a nucleotide;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, или их комбинации, где каждая последовательность содержит по меньшей мере два различно модифицированных нуклеотида;each N a and N a ' independently represents an oligonucleotide sequence containing 0-25 nucleotides that are either modified or unmodified, or combinations thereof, where each sequence contains at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, или их комбинации;each N b and N b ' independently represents an oligonucleotide sequence containing 0-10 nucleotides, which are either modified or unmodified, or combinations thereof;
каждый np и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность, содержащую 0-6 нуклеотидов; и каждый XXX, YYY, ZZZ, Х'Х'Х', ΎΎΎ' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах;each np and nq is independently an overhanging nucleotide sequence of 0-6 nucleotides; and each XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', ΎΎΎ' and Z'Z'Z' independently represents one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides;
где модификации в Nb отличаются от модификаций в Ύ и модификации в Nb' отличаются от модификаций в Ύ'.where modifications in N b differ from modifications in Ύ and modifications in N b ' differ from modifications in Ύ'.
По меньшей мере один из нуклеотидов Ύ образует пару оснований со своими комплементарными нуклеотидами Ύ', где модификация в нуклеотиде Ύ отличается от модификации в нуклеотиде Ύ'.At least one of the Ύ nucleotides forms a base pair with its complementary Ύ' nucleotides, where the modification at the Ύ nucleotide is different from the modification at the Ύ' nucleotide.
Каждый np и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность, содержащую 0-6 нуклеотидов;Each n p and n q is independently an overhanging nucleotide sequence of 0-6 nucleotides;
каждый n и n' представляет собой выступающий нуклеотид; и каждый р и q независимо равен 0-6.each n and n' is an overhanging nucleotide; and each p and q are independently 0-6.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов находится в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов встречается в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом. Модификация в мотиве, находящемся в сайте расщепления или вблизи него в смысловой цепи, отличается от модификации в мотиве, находящемся в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи.In another aspect, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, where each strand has 14-30 nucleotides. The sense strand contains at least two motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs is located on another part of the strand that is separated from the motif at the cleavage site by at least one nucleotide. The antisense strand contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs occurs on another portion of the strand that is separated from the motif at or near the cleavage site by at least one nucleotide. A modification in a motif located at or near a cleavage site in the sense strand is different from a modification in a motif located at or near a cleavage site in the antisense strand.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-F на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления или вблизи него в цепи. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-О-метил на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него.In another aspect, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, where each strand has 14 to 30 nucleotides. The sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs occurs at or near a cleavage site in the strand. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at or near the cleavage site.
В другом аспекте изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет от 14 до 30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-F на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-О-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.In another aspect, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14 to 30 nucleotides. The sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides at positions 9, 10, 11 from the 5' end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.
В другом аспекте изобретение относится к способу доставки дцРНК к специфической мишени у индивида путем подкожного или внутривенного введения.In another aspect, the invention relates to a method for delivering dsRNA to a specific target in an individual by subcutaneous or intravenous administration.
Подробное описаниеDetailed description
Благодаря введению одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций в трех по- 2 042669 следовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь средства дцРНК, в частности в сайт расщепления или вблизи него можно получить отличный результат. Смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК по-другому может быть модифицирована полностью.By introducing one or more motifs of three identical modifications at three consecutive nucleotides into the sense strand and/or antisense strand of the dsRNA agent, in particular at or near the cleavage site, an excellent result can be obtained. The sense strand and the antisense strand of the dsRNA agent may otherwise be completely modified.
Введение таких мотивов прерывает набор модификаций, если он имеется, смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Средство дцРНК необязательно конъюгирует с лигандом производным GalNAc, например, на смысловой цепи. Полученные средства дцРНК проявляют превосходную активность в отношении генного сайленсинга.The introduction of such motifs interrupts the set of modifications, if any, of the sense strand and/or the antisense strand. The dsRNA agent is optionally conjugated to a GalNAc derivative ligand, for example, on the sense strand. The resulting dsRNA tools exhibit excellent gene silencing activity.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что присутствие одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одной цепи средства дцРНК превосходно усиливает активность в отношении генного сайленсинга дцРНК-средства.The inventors surprisingly found that the presence of one or more motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides at or near the cleavage site of at least one strand of the dsRNA agent excellently enhances the gene silencing activity of the dsRNA agent.
Соответственно изобретение относится к двухцепочечному средству РНКи (дцРНК), способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь. Длина каждой цепи средства дцРНК может изменяться от 12 до 30 нуклеотидов. Например, длина каждой цепи может быть 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 или 21-23 нуклеотида.Accordingly, the invention relates to a double-stranded RNAi agent (dsRNA) capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand. The length of each dsRNA agent chain can vary from 12 to 30 nucleotides. For example, the length of each chain can be 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 or 21-23 nucleotides.
Смысловая цепь и антисмысловая цепь, как правило, образуют дцРНК-дуплекс. Длина дуплексного участка средства дцРНК может составлять 12-30 пар нуклеотидов. Например, длина дуплексного участка может составлять 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 или 21-23 пары нуклеотидов. В другом примере дуплексный участок выбран из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и 27.The sense strand and the antisense strand typically form a dsRNA duplex. The length of the duplex region of the dsRNA agent can be 12-30 base pairs. For example, the length of the duplex section can be 14-30, 17-30, 25-30, 27-30, 17-23, 17-21, 17-19, 19-25, 19-23, 19-21, 21-25 or 21-23 base pairs. In another example, the duplex region is selected from 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, and 27.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению может содержать один или несколько выступающих участков и/или кэппирующих групп средства дцРНК на 3'-конце или 5'-конце или на обоих концах цепи. Длина выступающего участка может быть 1-6 нуклеотидов, например 2-6, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 или 1-2 нуклеотида. Выступы могут быть результатом того, что одна цепь длиннее другой, или результатом того, что две цепи одинаковой длины располагаются неравномерно. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с мРНК-мишенью, или он может быть комплементарен последовательностям гена, являющихся мишенями, или может представлять собой другую последовательность. Первая и вторая цепи также могут соединяться, например, дополнительными основаниями с образованием шпильки или другими не являющимися основаниями линкерами.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention may contain one or more overhangs and/or capping groups of the dsRNA agent at the 3' end or 5' end, or both ends of the strand. The length of the overhang can be 1-6 nucleotides, such as 2-6, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 or 1-2 nucleotides. The protrusions can be the result of one chain being longer than the other, or the result of two chains of the same length being unevenly spaced. The protrusion may mismatch with the target mRNA, or it may be complementary to the target gene sequences, or may be a different sequence. The first and second strands may also be connected, for example, by additional bases to form a hairpin or other non-base linkers.
В одном из вариантов осуществления каждый нуклеотид в выступающем участке средства дцРНК по изобретению может независимо представлять собой модифицированные или немодифицированные нуклеотиды, включая, но ими не ограничиваясь, модифицированные до 2'-сахара, например, 2-F-, 2'-О-метилтимидина(Т), 2'-O-метоксиэтил-5-метилуреида (Тео), 2'-О-метоксиэтиладенозина (Аео), 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидина (m5Сео) и любую их комбинацию. Например, ТТ может представлять собой выступающую последовательность на любом конце любой цепи. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с мРНК-мишенью, или он может быть комплементарен последовательностям гена, являющихся мишенями, или может представлять собой другую последовательность.In one embodiment, each nucleotide in the overhang of the dsRNA agent of the invention may independently be modified or unmodified nucleotides, including, but not limited to, modified to a 2'-sugar, e.g., 2-F-,2'-O-methylthymidine (T), 2'-O-methoxyethyl-5-methylureide (Theo), 2'-O-methoxyethyladenosine (Aeo), 2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine (m5Ceo), and any combination thereof. For example, a TT may be an overhang at either end of any strand. The protrusion may mismatch with the target mRNA, or it may be complementary to the target gene sequences, or may be a different sequence.
Выступы 5' или 3' в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях средства дцРНК по изобретению могут быть фосфорилированы. В некоторых вариантах осуществления выступающий участок содержит два нуклеотида с фосфоротиоатом между двумя нуклеотидами, где два нуклеотида могут быть одинаковыми или различными. В одном из вариантов осуществления выступ присутствует на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В одном из вариантов осуществления такой 3'-выступ присутствует в антисмысловой цепи. В одном из вариантов осуществления такой 3'-выступ присутствует в смысловой цепи.The 5' or 3' overhangs in the sense strand, the antisense strand, or both strands of the dsRNA agent of the invention may be phosphorylated. In some embodiments, the overhang contains two nucleotides with a phosphorothioate between the two nucleotides, where the two nucleotides may be the same or different. In one embodiment, the overhang is present at the 3' end of the sense strand, the antisense strand, or both. In one embodiment, such a 3' overhang is present in the antisense strand. In one embodiment, such a 3' overhang is present in the sense strand.
Средство дцРНК по изобретению содержит только один выступ, который может усиливать интерферирующую активность дцРНК, не влияя на его общую стабильность. Например, однонитевой выступ располагается на 3'-конце смысловой цепи или, с другой стороны, на 3'-конце антисмысловой цепи. Также дцРНК может иметь тупой конец, расположенный на 5'-конце антисмысловой цепи (или на 3'-конце смысловой цепи) или наоборот. Как правило, антисмысловая цепь дцРНК имеет нуклеотидный выступ на 3'-конце и 5'-конец является тупым. Без связи с какой-либо теорией асимметричный тупой конец на 5'-конце антисмысловой цепи и 3'-концевой выступ антисмысловой цепи благоприятствуют загрузке руководящей цепи в процесс RISC.The dsRNA agent of the invention contains only one protrusion, which can enhance the interfering activity of dsRNA without affecting its overall stability. For example, the single-stranded overhang is located at the 3' end of the sense strand, or alternatively at the 3' end of the antisense strand. The dsRNA can also have a blunt end located at the 5' end of the antisense strand (or at the 3' end of the sense strand) or vice versa. Typically, the antisense dsRNA strand has a nucleotide overhang at the 3' end and the 5' end is blunt. Without wishing to be bound by any theory, the asymmetric blunt end at the 5' end of the antisense strand and the 3' overhang of the antisense strand favor loading the guide strand into the RISC process.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению также может иметь два тупых конца по обоим концам дцРНК-дуплекса.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention may also have two blunt ends at both ends of the dsRNA duplex.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 19 нк (nt), где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 7, 8, 9 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention is a 19 nc (nt) double-ended bluntmer, where the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides at positions 7, 8, 9 from 5' - end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 20 нк, где смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-FIn one embodiment, the dsRNA agent of the invention is a 20 nc double-ended bluntmer, where the sense strand contains at least one of the three 2'-F motifs.
- 3 042669 модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 8, 9, 10 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.- 3,042,669 modifications on three consecutive nucleotides at positions 8, 9, 10 from the 5' end. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению представляет собой двухконцевой bluntmer длиной 21 нк, при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention is a 21 nc double-ended bluntmer, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides at positions 9, 10, 11 from the 5' end . The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь длиной 21 нуклеотид (нк) и антисмысловую длиной 23 нуклеотида (нк), при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца; антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца, при этом один конец дцРНК затуплен, в то время как другой конец включает выступ в 2 нк. Предпочтительно выступ в 2 нк находится на 3'-конце антисмысловой цепи. Необязательно дцРНК также содержит лиганд (предпочтительно, GalNAc3).In one embodiment, the dsRNA agent of the invention contains a 21 nucleotide (nc) sense strand and a 23 nucleotide (nc) antisense strand, wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides at positions 9, 10, 11 from the 5'end; the antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end, with one end of the dsRNA blunt while the other end includes a protrusion at 2 nc. Preferably, the 2 nc overhang is located at the 3' end of the antisense strand. Optionally, the dsRNA also contains a ligand (preferably GalNAc 3 ).
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую и антисмысловую цепи, при этом длина смысловой цепь составляет 25-30 нуклеотидных остатков, при этом, начиная с 5'-концевого нуклеотида (положение 1), положения 1-23 указанной первой цепи содержат по меньшей мере 8 рибонуклеотидов; длина антисмысловой цепи составляет 36-66 нуклеотидных остатков, и, начиная с 3'-концевого нуклеотида, содержат по меньшей мере 8 рибонуклеотидов в положениях, парных положениям 1-23 смысловой цепи, с образованием дуплекса; при этом по меньшей мере 3'-концевой нуклеотид антисмысловой цепи не спаривается со смысловой цепью и до 6 последовательных 3'концевых нуклеотидов не спарены со смысловой цепью, посредством чего образуется 3'-однонитевой выступ из 1-6 нуклеотидов; при этом 5'-конец антисмысловой цепи содержит 10-30 последовательных нуклеотидов, которые не спарены со смысловой цепью, посредством чего образуется однонитевой 5'выступ из 10-30 нуклеотидов; где по меньшей мере 5'-концевые и 3'-концевые нуклеотиды смысловой цепи являются основаниями, спаренными с нуклеотидами антисмысловой цепи, когда смысловая и антисмысловая цепи выравнены для максимальной комплементарности, посредством чего образуется по существу дуплексный участок между смысловой и антисмысловой цепями; и антисмысловая цепь является достаточно комплементарной РНК-мишени вдоль по меньшей мере 19 рибонуклеотидов длины антисмысловой цепи для уменьшения экспрессии гена-мишени, когда указанную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводят в клетку млекопитающего; и при этом смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления или вблизи него.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises a sense and an antisense strand, wherein the sense strand is 25-30 nucleotide residues long, starting from the 5'-terminal nucleotide (position 1), positions 1-23 of said first strand contain at least 8 ribonucleotides; the length of the antisense strand is 36-66 nucleotide residues, and, starting from the 3'-terminal nucleotide, contain at least 8 ribonucleotides in positions paired with positions 1-23 of the sense strand, forming a duplex; wherein at least the 3'-terminal nucleotide of the antisense strand is not paired with the sense strand and up to 6 consecutive 3'-terminal nucleotides are not paired with the sense strand, whereby a 3'-single-stranded overhang of 1-6 nucleotides is formed; wherein the 5' end of the antisense strand contains 10-30 consecutive nucleotides that are not paired with the sense strand, whereby a single-stranded 5' overhang of 10-30 nucleotides is formed; where at least the 5'-terminal and 3'-terminal nucleotides of the sense strand are base paired with nucleotides of the antisense strand when the sense and antisense strands are aligned for maximum complementarity, whereby a substantially duplex region is formed between the sense and antisense strands; and the antisense strand is sufficiently complementary to the target RNA along at least 19 ribonucleotides of the length of the antisense strand to reduce expression of the target gene when said double-stranded nucleic acid is introduced into a mammalian cell; and wherein the sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is at or near the cleavage site. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides at or near the cleavage site.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую и антисмысловую цепи, где указанное средство дцРНК содержит первую цепь длиной по меньшей мере 25 и максимально 29 нуклеотидов и вторую цепь длиной максимально 30 нуклеотидов по меньшей мере с одним мотивом из трех модификаций 2'-O-метил на трех последовательных нуклеотидах в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца; при этом указанный 3'-конец указанной первой цепи и указанный 5'-конец указанной второй цепи образуют тупой конец и указанная вторая цепь по своему 3'-концу на 1-4 нуклеотида длиннее, чем первая цепь, при этом дуплексный участок, который имеет по меньшей мере длину 25 нуклеотидов, и указанная вторая цепь достаточно комплементарна к мРНК-мишени вдоль по меньшей мере 19 нк длины указанной второй цепи для уменьшения экспрессии гена-мишени, когда указанное средство дцРНК вводят в клетку млекопитающего; и при этом дайсерное расщепление указанной дцРНК преимущественно приводит к миРНК, содержащей указанный 3'-конец указанной второй цепи, посредством чего уменьшается экспрессия гена-мишени у млекопитающего. Необязательно указанное средство дцРНК также содержит лиганд.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises sense and antisense strands, wherein said dsRNA agent comprises a first strand of at least 25 and a maximum of 29 nucleotides and a second strand of at least 30 nucleotides with at least one motif of three 2'- O-methyl on three consecutive nucleotides at positions 11, 12, 13 from the 5' end; wherein said 3'-end of said first chain and said 5'-end of said second chain form a blunt end and said second chain is 1-4 nucleotides longer at its 3'-end than the first chain, wherein the duplex region, which has at least 25 nucleotides in length and said second strand is sufficiently complementary to the target mRNA along at least 19 nc of the length of said second strand to reduce expression of the target gene when said dsRNA agent is introduced into a mammalian cell; and wherein dicer cleavage of said dsRNA advantageously results in an siRNA containing said 3' end of said second strand, whereby expression of the target gene in the mammal is reduced. Optionally, said dsRNA agent also contains a ligand.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК также может содержать по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него в смысловой цепи.In one embodiment, the sense strand of the dsRNA agent may also contain at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where one of the motifs is at or near a cleavage site in the sense strand.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь средства дцРНК также может содержать по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один из мотивов находится в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи.In one embodiment, the antisense strand of the dsRNA agent may also contain at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where one of the motifs is at or near a cleavage site in the antisense strand.
В случае средства дцРНК, имеющего дуплексный участок длиной 17-23 нк, сайт расщепления антисмысловой цепи, как правило, находится возле положений 10, 11 и 12 от 5'-конца. Таким образом, мотивы из трех идентичных модификаций могут находиться в положениях 9, 10, 11; положениях 10, 11, 12; положениях 11, 12, 13; положениях 122, 13, 14 или положениях 13, 14, 15 антисмысловой цепи, причем исчисление начинается от 1-го нуклеотида от 5'-конца антисмысловой цепи или исчисление начинается от 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи. Сайт расщепленияIn the case of a dsRNA agent having a 17-23 nc duplex region, the antisense strand cleavage site is typically located near positions 10, 11 and 12 from the 5' end. Thus, motifs from three identical modifications can be in positions 9, 10, 11; provisions 10, 11, 12; provisions 11, 12, 13; positions 122, 13, 14 or positions 13, 14, 15 of the antisense strand, and the count starts from the 1st nucleotide from the 5' end of the antisense strand or the count starts from the 1st paired nucleotide in the duplex region from the 5' end of the antisense strand . Cleavage site
- 4 042669 в антисмысловой цепи также может изменяться в соответствии с длиной дуплексного участка дцРНК от- 4 042669 in the antisense strand can also vary according to the length of the dsRNA duplex region from
5'-конца.5' end.
Смысловая цепь средства дцРНК содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления цепи; и антисмысловая цепь может иметь по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в сайте расщепления цепи или вблизи него. Когда смысловая цепь и антисмысловая цепь образуют дцРНК-дуплекс, смысловую цепь и антисмысловую цепь можно выровнять так, что один мотив из трех последовательных нуклеотидов в смысловой цепи и один мотив из трех последовательных нуклеотидов в антисмысловой цепи имеют по меньшей мере однонуклеотидное перекрывание, т.е. по меньшей мере один из трех нуклеотидов мотива в смысловой цепи образует пару оснований по меньшей мере с одним из трех нуклеотидов мотива в антисмысловой цепи. С другой стороны, могут перекрываться по меньшей мере два нуклеотида из мотивов из обеих цепей или могут перекрываться все три нуклеотида.The sense strand of the dsRNA agent contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides at the strand cleavage site; and the antisense strand may have at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides at or near the strand cleavage site. When the sense strand and the antisense strand form a dsRNA duplex, the sense strand and the antisense strand can be aligned so that one motif of three consecutive nucleotides in the sense strand and one motif of three consecutive nucleotides in the antisense strand have at least one nucleotide overlap, i.e. . at least one of the three motif nucleotides in the sense strand base pairs with at least one of the three motif nucleotides in the antisense strand. On the other hand, at least two nucleotides of motifs from both strands may overlap, or all three nucleotides may overlap.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК содержит более одного мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах. Первый мотив должен находиться в сайте расщепления цепи или вблизи него, и другие мотивы могут представлять собой wing-фланговые модификации. Термин фланговая модификация в описании относится к мотиву, находящемуся в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него той же цепи. Фланговая модификация расположена либо рядом с первым мотивом, либо отделена от него по меньшей мере одним или несколькими нуклеотидами. Если мотивы расположены непосредственно рядом друг с другом, то химические группы мотивов являются различными для каждого, и если мотивы разделены одним или несколькими нуклеотидами, то химические группы мотивов могут быть одинаковыми или различаться. Могут присутствовать две или больше фланговых модификаций. Например, если присутствуют две фланговые модификации, то обе фланговые модификации могут встречаться на одном конце дуплексного участка относительно первого мотива, который находится в сайте расщепления или вблизи него, или каждая из фланговых модификаций может встречаться с любой стороны первого мотива.In one embodiment, the sense strand of the dsRNA agent contains more than one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides. The first motif must be at or near the chain cleavage site, and other motifs may be wing-flank modifications. The term flank modification as used herein refers to a motif located in a different part of the strand that is separated from the motif at or near a cleavage site in the same strand. The flank modification is located either next to the first motif or separated from it by at least one or more nucleotides. If the motifs are located directly next to each other, then the chemical groups of the motifs are different for each, and if the motifs are separated by one or more nucleotides, then the chemical groups of the motifs may be the same or different. Two or more flank modifications may be present. For example, if two flanking modifications are present, then both flanking modifications may occur at one end of the duplex region relative to the first motif that is at or near the cleavage site, or each of the flanking modifications may occur on either side of the first motif.
Аналогично смысловой цепи антисмысловая цепь средства дцРНК содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления цепи или вблизи него. Такая антисмысловая цепь также может содержать одну или несколько фланговых модификаций при выравнивании аналогично фланговым модификациям, которые присутствуют в смысловой цепи.Similar to the sense strand, the antisense strand of the dsRNA agent contains at least two motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at or near the strand cleavage site. Such an antisense strand may also contain one or more flank modifications in alignment similar to the flank modifications that are present in the sense strand.
В одном из вариантов осуществления фланговая модификация в смысловой цепи антисмысловой цепи или обеих цепях средства дцРНК, как правило, не содержит один первый или два концевых нуклеотида в 3'-конце, 5'-конце или обоих концах цепи.In one embodiment, the flank modification in the sense strand of the antisense strand, or both strands of the dsRNA agent, typically does not contain one or two terminal nucleotides at the 3' end, 5' end, or both ends of the strand.
В другом варианте осуществления фланговая модификация в смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях, как правило, не содержит один первый или два спаренных нуклеотида в дуплексном участке в 3'-конце, 5'-конце или обоих концах цепи.In another embodiment, the flank modification in the sense strand, the antisense strand, or both, typically does not contain one or two paired nucleotides in the duplex region at the 3' end, 5' end, or both ends of the strand.
Если смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК содержат каждая по меньшей мере одну фланговую модификацию, фланговые модификации могут выпадать на один и тот же конец дуплексного участка и перекрывать один, два или три нуклеотида.If the sense strand and the antisense strand of the dsRNA agent each contain at least one flank modification, the flank modifications may fall on the same end of the duplex region and overlap one, two, or three nucleotides.
Если смысловая цепь и антисмысловая цепь средства дцРНК содержат каждая по меньшей мере две фланговые модификации, смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть выровнены таким образом, что две фланговые модификации, каждая с одной цепи, выпадают на один конец дуплексного участка, перекрываясь одним, двумя или тремя нуклеотидами; две модификации, каждая с одной цепи, выпадают на другой конец дуплексного участка, перекрываясь одним, двумя или тремя нуклеотидами.If the sense strand and antisense strand of the dsRNA agent each contain at least two flank modifications, the sense strand and antisense strand can be aligned such that two flank modifications, each from the same strand, fall on one end of the duplex region, overlapping with one, two, or three nucleotides; two modifications, each from one strand, fall to the other end of the duplex region, overlapping by one, two, or three nucleotides.
В одном из вариантов осуществления может быть модифицирован каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи средства дцРНК, включая нуклеотиды, которые являются частью мотивов. Каждый нуклеотид может быть модифицирован одной и той же или разными модификациями, которые могут включать одно или несколько изменений одного или двух несвязывающих фосфатных атомов кислорода и/или одного или нескольких связывающих фосфатных атомов кислорода; изменение составной части сахара рибозы, например, 2'-гидроксила в сахаре рибозе; массовую замену фосфатной части дефосфо-линкерами; модификацию или замену природного основания и замену или модификацию рибозофосфатной основной цепи.In one embodiment, each nucleotide in the sense strand and antisense strand of the dsRNA agent can be modified, including nucleotides that are part of the motifs. Each nucleotide may be modified with the same or different modifications, which may include one or more changes to one or two non-binding phosphate oxygens and/or one or more binding phosphate oxygens; changing the constituent of the ribose sugar, for example, the 2'-hydroxyl in the ribose sugar; mass replacement of the phosphate part with dephospho-linkers; modification or replacement of the natural base; and replacement or modification of the ribose phosphate backbone.
Так как нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры, состоящие из звеньев, то большое число модификаций происходит в положении, которое в нуклеиновой кислоте повторяется, например модификация основания, или фосфатной части, или несвязывающего О фосфатной части. В некоторых случаях модификация будет встречаться во всех зависимых положениях нуклеиновой кислоты, но во многих случаях это происходить не будет. Как пример, модификация может иметь место только в 3'- или 5'-концевом положении, может происходить только в концевом участке, например, в положении на концевом нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи. Модификация может иметь место в двухнитевом участке, однонитевом участке или в обоих участках. Модификация может иметь место только в двухнитевом участке РНК или может иметь место только в однонитевом участке РНК. Напри- 5 042669 мер, фосфоротиоатная модификация в положении несвязывающего О может иметь место только в одном или обоих концах, может иметь место только в концевом участке, например в положении в терминальном нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи, или может иметь место в двухнитевом и однонитевом участках, в частности, на концах. 5'-Конец может быть фосфорилирован.Since nucleic acids are polymers made up of units, a large number of modifications occur at the position that is repeated in the nucleic acid, such as modification of the base, or the phosphate moiety, or the non-binding O phosphate moiety. In some cases, the modification will occur at all dependent positions in the nucleic acid, but in many cases it will not. As an example, the modification may only take place at the 3' or 5' end position, may only occur at the terminal site, for example, at a position on the terminal nucleotide, or at the last 2, 3, 4, 5, or 10 nucleotides of the chain. The modification may take place in the double strand section, the single strand section, or both sections. The modification may only take place in a double-stranded RNA region, or it may only take place in a single-stranded RNA region. For example, a phosphorothioate modification at the non-binding O position may occur only at one or both ends, may occur only at the terminal site, for example, at a position in the terminal nucleotide or in the last 2, 3, 4, 5, or 10 nucleotides of the chain , or may occur in the double and single strand sections, in particular at the ends. The 5' end may be phosphorylated.
Возможно, например, для усиления устойчивости введение определенных оснований в выступы или включение модифицированных нуклеотидов или заменителей нуклеотидов в однонитевые выступы, например в 5'- или 3'-выступ или в оба выступа. Например, может быть желательно введение в выступы пуриновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления все или некоторые основания в 3'- или 5'-выступе могут быть модифицированы, например, модификацией, описанной в настоящем описании. Модификации могут включать, например, использование модификаций в положении 2' сахара рибозы, которые известны в данной области, например использование 2'-дезокси-2'-фтор(2'-Р)- или 2'-О-метилмодифицированных дезоксирибонуклеотидов вместо рибозосахара нуклеотидного основания, и модификации в фосфатной группе, например фосфотиоатные модификации. Выступы могут быть гомологичны с последовательностью-мишенью.It is possible, for example, to enhance stability by introducing certain bases into the overhangs or incorporating modified nucleotides or nucleotide substitutes into single-stranded overhangs, for example into the 5' or 3' overhang or both. For example, it may be desirable to introduce purine nucleotides into overhangs. In some embodiments, all or some of the bases in the 3' or 5' overhang may be modified, for example, by the modification described herein. Modifications may include, for example, the use of modifications at the 2' position of the ribose sugar, which are known in the art, such as the use of 2'-deoxy-2'-fluoro(2'-P)- or 2'-O-methyl-modified deoxyribonucleotides instead of the nucleotide ribose sugar bases, and modifications to the phosphate group, such as phosphothioate modifications. The projections may be homologous to the target sequence.
В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-дезокси или 2'-фтором. Цепи могут содержать более одной модификации. В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором.In one embodiment, each residue of the sense strand and antisense strand is independently modified with LNA, HNA, CeNA, 2'-methoxyethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-allyl, 2'-C-allyl, 2'-deoxy or 2'-fluorine. Chains can contain more than one modification. In one embodiment, each residue of the sense strand and antisense strand is independently modified with 2'-O-methyl or 2'-fluoro.
Как правило, в смысловой цепи и антисмысловой цепи присутствуют по меньшей мере две различные модификации. Такие две модификации могут представлять собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации или другие модификации.Typically, at least two different modifications are present in the sense strand and the antisense strand. These two modifications may be 2'-O-methyl or 2'-fluoro modifications or other modifications.
В одном из вариантов осуществления каждая смысловая цепь и антисмысловая цепь содержит два различным образом модифицированных нуклеотида, выбранных из 2'-O-метил- или 2'-фтормодифицированного.In one embodiment, each sense strand and antisense strand contains two differently modified nucleotides selected from 2'-O-methyl or 2'-fluoro modified.
В одном из вариантов осуществления каждый остаток смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо модифицирован 2'-О-метилнуклеотидом, 2'-дезоксифторнуклеотидом, 2'-O-N-метилацетамидо(2'O-NMA)нуклеотидом, 2' -O-диметиламиноэтоксиэтил(2'-O-DMAEOE)нуклеотидом, 2'-O-аминопропил(2'О-АР)нуклеотидом или 2'-ara-F-нуклеотидом.In one embodiment, each residue of the sense strand and antisense strand is independently modified with 2'-O-methylnucleotide, 2'-deoxyfluoronucleotide, 2'-O-N-methylacetamido(2'O-NMA)nucleotide, 2'-O-dimethylaminoethoxyethyl(2' -O-DMAEOE) nucleotide, 2'-O-aminopropyl (2'O-AP) nucleotide or 2'-ara-F-nucleotide.
В одном из вариантов осуществления Na и/или Nb содержит чередующиеся модификации. Термины чередующийся мотив или чередующаяся структура, как используется в настоящем описании, относятся к мотиву, имеющему одну или больше модификаций, где каждая модификация находится в чередующихся нуклеотидах одной цепи. Чередующимся нуклеотидом может называться каждый второй или один из каждых трех нуклеотидов или подобная структура. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации для нуклеотида, чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ..., АААВАААВАААВ..., АААВВВАААВВВ... или ABCABCABCABC... и т.п.In one embodiment, Na and/or N b contains alternating modifications. The terms alternating motif or alternating pattern, as used herein, refers to a motif having one or more modifications, where each modification is in alternating nucleotides of the same strand. An alternating nucleotide can be referred to as every second or one of every three nucleotides, or a similar structure. For example, if A, B, and C each represent one type of modification for a nucleotide, the alternating motif could be ABABAABABA..., AABBAABBAABB..., AABAAABAAABA..., AAAAAAAAAAAA..., AAABBBAAAABB... or ABCABCABCABC. .. and so on.
В одном из вариантов осуществления Na' и/или Nb' содержит чередующиеся модификации. Термины чередующийся мотив или чередующаяся структура, как используется в настоящем описании, относятся к мотиву, имеющему одну или больше модификаций, где каждая модификация находится в чередующихся нуклеотидах одной цепи. Чередующимся нуклеотидом может называться каждый второй или один из каждых трех нуклеотидов или подобная структура. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации для нуклеотида, чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ..., АААВАААВАААВ..., АААВВВАААВВВ... или ABCABCABCABC... и т.п.In one embodiment, Na' and/or N b ' contains alternating modifications. The terms alternating motif or alternating pattern, as used herein, refers to a motif having one or more modifications, where each modification is in alternating nucleotides of the same strand. An alternating nucleotide can be referred to as every second or one of every three nucleotides, or a similar structure. For example, if A, B, and C each represent one type of modification for a nucleotide, the alternating motif could be ABABAABABA..., AABBAABBAABB..., AABAAABAAABA..., AAAAAAAAAAAA..., AAABBBAAAABB... or ABCABCABCABC. .. and so on.
Тип модификаций, содержащихся в чередующемся мотиве, может быть одним и тем же или отличаться. Например, если А, В, С и D представляют собой каждый один тип модификации нуклеотида, чередующаяся структура, т.е. модификации в каждом другом нуклеотиде, могут быть одними и теми же, но каждая цепь из смысловой цепи или антисмысловой цепи может быть выбрана из нескольких возможных модификаций в пределах чередующегося мотива, например АВАВАВ..., АСАСАС..., BDBDBD... или CDCDCD... и т.п.The type of modifications contained in an alternating motif may be the same or different. For example, if A, B, C, and D are each one type of nucleotide modification, the alternating structure, i.e. the modifications at every other nucleotide may be the same, but each strand of the sense strand or antisense strand may be selected from several possible modifications within the alternating motif, e.g. ABABAB..., ACACAC..., BDBDBD... or CDCDCD... etc.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит структуру модификаций чередующегося мотива в смысловой цепи, которая смещена относительно структуры модификации чередующегося мотива в антисмысловой цепи. Смещение может быть таким, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой цепи соответствует иначе модифицированной группе нуклеотидов антисмысловой цепи и наоборот. Например, если смысловая цепь спарена с антисмысловой цепью в дцРНК-дуплексе, чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с АВАВАВ от 5'-3' цепи и чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВАВАВА от 3'-5' цепи в пределах дуплексного участка. Как другой пример чередующийся мотив в смысловой цепи может начинаться с ААВВААВВ от 5'-3' цепи и чередующийся мотив в антисмысловой цепи может начинаться с ВВААВВАА от 3'-5' цепи в пределах дуплексного участка, так что существует полное или частичное смещение структур модификации между смысловой цепью и антисмысловой цепью.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises a pattern of alternating motif modifications in the sense strand that is offset from the pattern of alternating motif modifications in the antisense strand. The offset may be such that the modified nucleotide group of the sense strand corresponds to the otherwise modified nucleotide group of the antisense strand, and vice versa. For example, if a sense strand is paired with an antisense strand in a dsRNA duplex, an alternating motif in the sense strand may start with ABABAB from the 5'-3' strand and an alternating motif in the antisense strand may start with BABABA from the 3'-5' strand within the duplex. site. As another example, an alternating motif in the sense strand may start with AABBAABB from the 5'-3' strand, and an alternating motif in the antisense strand may begin with BBAABBAA from the 3'-5' strand within the duplex region, so that there is complete or partial displacement of the modification structures between the sense strand and the antisense strand.
- 6 042669- 6 042669
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит структуру чередующегося мотива 2'-O-метилмодификации и 2'Ш-модификации в смысловой цепи, изначально имеющую смещение относительно структуры чередующегося мотива 2'-О-метилмодификации и 2'Ш-модификации в антисмысловой цепи, т.е. 2'-О-метилмодифицированный нуклеотид в смысловой цепи образует пару оснований с 2'Ш-модифицированным нуклеотидом антисмысловой цепи и наоборот. Положение 1 смысловой цепи может начинаться с 2'-F-модификации, и положение 1 антисмысловой цепи может начинаться с 2'-O-метилмодификации.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises a 2'-O-methyl modification and 2'III modification alternating motif structure in the sense strand, initially having an offset relative to the 2'-O-methyl modification and 2'III modification alternating motif structure in the antisense strand. chains, i.e. The 2'-O-methyl-modified nucleotide in the sense strand forms a base pair with the 2'-III-modified nucleotide in the antisense strand and vice versa. Position 1 of the sense strand may begin with the 2'-F modification, and position 1 of the antisense strand may begin with the 2'-O-methyl modification.
Введение одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь прерывает начальную структуру модификации, присутствующую в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи. Такое нарушение структуры модификации смысловой цепи и/или антисмысловой цепи путем введения одного или нескольких мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах в смысловую цепь и/или антисмысловую цепь неожиданно усиливает активность сайленсинга гена в отношении генамишени.The introduction of one or more motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides in the sense strand and/or antisense strand interrupts the initial structure of the modification present in the sense strand and/or antisense strand. Such disruption of the design of the modification of the sense strand and/or antisense strand by introducing one or more motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides in the sense strand and/or antisense strand surprisingly enhances gene silencing activity against the target gene.
В одном из вариантов осуществления, если мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах вводят в любую из цепей, модификация нуклеотида, следующего за мотивом, является иной модификацией, чем модификация мотива. Например, часть последовательности, содержащей мотив, представляет собой ...NaYYYNb..., где Y представляет собой модификацию мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах и Na и Nb представляют собой модификацию для нуклеотида, следующего за мотивом YYY, которая является иной, чем модификация Y и где Na и Nb могут быть одинаковыми или различными модификациями. С другой стороны, Na и/или Nb могут присутствовать или отсутствовать, когда присутствует фланговая модификация.In one embodiment, if a motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides is introduced into any of the strands, the modification of the nucleotide following the motif is a different modification than the motif modification. For example, the part of the sequence containing the motif is ...N a YYYN b ..., where Y is the motif modification of three identical modifications on three consecutive nucleotides and N a and N b are the modification for the nucleotide following the motif YYY, which is a different modification than Y and where N a and N b may be the same or different modifications. On the other hand, N a and/or N b may or may not be present when a flank modification is present.
Средство дцРНК по изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь. Модификация фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи может быть у любого нуклеотида смысловой цепи или антисмысловой цепи или обеих цепей в любом положении цепи. Например, модификация межнуклеотидной связи может быть у любого нуклеотида смысловой цепи и/или антисмысловой цепи; каждая модификация межнуклеотидной связи может встречаться в чередующейся структуре в смысловой цепи или антисмысловой цепи; или смысловая цепь или антисмысловая цепь содержат обе модификации межнуклеотидной связи в чередующейся структуре. Чередующаяся структура модификации межнуклеотидной связи в смысловой цепи может быть такая же, как в антисмысловой цепи, или отличаться от нее, и чередующаяся структура модификации межнуклеотидной связи в смысловой цепи может иметь смещение относительно чередующейся структуры модификации межнуклеотидной связи в антисмысловой цепи.The dsRNA agent of the invention may further comprise at least one phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond. The modification of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage can be at any nucleotide of the sense strand or the antisense strand, or both strands, at any position in the strand. For example, an internucleotide bond modification can be at any nucleotide of the sense strand and/or antisense strand; each internucleotide bond modification may occur in an alternating pattern in the sense strand or antisense strand; or the sense strand or the antisense strand contains both modifications of the internucleotide bond in an alternating pattern. The internucleotide bond modification alternating pattern in the sense strand may be the same as or different from the antisense strand, and the internucleotide bond modification alternating pattern in the sense strand may be offset from the internucleotide bond modification alternating pattern in the antisense strand.
В одном из вариантов осуществления дцРНК содержит модификацию фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в выступающем участке. Например, выступающий участок содержит два нуклеотида, имеющих фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь между двумя нуклеотидами. Модификации межнуклеотидной связи могут быть получены для соединения нуклеотидов выступа с концевыми спаренными нуклеотидами в дуплексном участке. Например, по меньшей мере 2, 3, 4 или все нуклеотиды выступа могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь и необязательно могут существовать дополнительные фосфоротиоатные или метилфосфонатные межнуклеотидные связи, соединяющие нуклеотид выступа со спаренным нуклеотидом, который следует за нуклеотидом выступа. Например, могут существовать по меньшей мере две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами, из которых два из трех нуклеотидов являются нуклеотидами выступа, и третий представляет собой спаренный нуклеотид, следующий за нуклеотидом выступа. Предпочтительно такие концевые три нуклеотида могут находиться в 3'-конце антисмысловой цепи.In one embodiment, the dsRNA contains a modification of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond in the overhang. For example, the overhang contains two nucleotides having a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond between the two nucleotides. Internucleotide bond modifications can be made to join overhang nucleotides to terminal paired nucleotides in a duplex region. For example, at least 2, 3, 4, or all of the overhang nucleotides may be linked via a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond, and optionally, additional phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds may exist connecting the overhang nucleotide to the paired nucleotide that follows the overhang nucleotide. For example, there may be at least two phosphorothioate internucleotide bonds between the terminal three nucleotides, of which two of the three nucleotides are overhang nucleotides and the third is a paired nucleotide following the overhang nucleotide. Preferably, such terminal three nucleotides may be at the 3' end of the antisense strand.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь дцРНК содержит 1-10 блоков из двух-десяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная смысловая цепь спарена с антисмысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA sense strand contains 1-10 blocks of two to ten phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 phosphate internucleotide bonds, wherein one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and the specified sense strand is paired with an antisense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из двух фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the antisense dsRNA strand contains two blocks of two phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 phosphate internucleotide bonds, wherein one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and said antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
- 7 042669- 7 042669
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из трех фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of three phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16 phosphate internucleotide bonds, where one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and the specified antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из четырех фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the antisense dsRNA strand contains two blocks of four phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 phosphate internucleotide bonds , where one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and the specified antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из пяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of five phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 phosphate internucleotide bonds, with one of phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds located at any position in the oligonucleotide sequence and said antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из шести фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фосфатными межнуклеотидными связями, при этом одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of six phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 phosphate internucleotide bonds, with one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and the specified antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate bond.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из семи фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of seven phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 phosphate internucleotide bonds, where one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and said antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate linkage.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из восьми фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3, 4, 5 или 6 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of eight phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3, 4, 5, or 6 phosphate internucleotide bonds, where one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and said antisense strand is paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate linkage.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит два блока из девяти фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей, разделенных 1, 2, 3 или 4 фосфатными межнуклеотидными связями, где одна из фосфоротиоатных или метилфосфонатных межнуклеотидных связей располагается в любом положении в олигонуклеотидной последовательности и указанная антисмысловая цепь спарена со смысловой цепью, содержащей любую комбинацию фосфоротиоатных, метилфосфонатных и фосфатных межнуклеотидных связей, или антисмысловой цепью, содержащей любую фосфоротиоатную или метилфосфонатную или фосфатную связь.In one embodiment, the dsRNA antisense strand contains two blocks of nine phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds separated by 1, 2, 3 or 4 phosphate internucleotide bonds, where one of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bonds is located at any position in the oligonucleotide sequence and the specified antisense strand paired with a sense strand containing any combination of phosphorothioate, methylphosphonate and phosphate internucleotide bonds, or an antisense strand containing any phosphorothioate or methylphosphonate or phosphate linkage.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну или несколько модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 концевых положений смысловой и/или антисмысловой цепи. Например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь на одном конце или на обоих концах смысловой и/или антисмысловой цепи.In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one or more modifications of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond within the 1-10 terminal positions of the sense and/or antisense strand. For example, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleotides may be connected via a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at one or both ends of the sense and/or antisense strand.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну или несколько модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 внутреннего участка дуплекса каждой из смысловой и/или антисмысловой цепи. Например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов могут быть соединены через фосфоротиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь в положении 8-16 дуплексного участка при исчислении от 5'-конца смысловой цепи; дцРНК также может необязательно содержать одну или больше модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в пределах 1-10 концевых положений.In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one or more phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond modifications within 1-10 of the internal duplex region of each of the sense and/or antisense strands. For example, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleotides may be connected via a phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at position 8-16 of the duplex region, measured from the 5' end of the sense strand; The dsRNA may also optionally contain one or more phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide linkage modifications within 1-10 terminal positions.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну-пять модифи- 8 042669 каций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну-пять модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца) и одну-пять модификаций фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну-пять в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one to five modifications of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at position 1-5, one to five modifications of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at position 18-23 of the sense strand (counting from 5' -end) and one to five modifications of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at positions 1 and 2 and one to five at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца) и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1-5, one modification of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at position 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1-5 positions 1 and 2 and two modifications of the phosphorothioate or methylphosphonate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and 2 modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and 2 modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and 2 modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, one modification at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5 (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5 (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5 и одну в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two phosphorothioate internucleotide bond modifications at positions 1-5 and one at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), two phosphorothioate internucleotide bond modifications at positions 1 and 2, and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and 2 modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1-5, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 18-23 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 18-23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1-5, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2 and 2 modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 18-23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 20 и 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификациюIn one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 20 and 21 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification
- 9 042669 фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).- 9 042669 phosphorothioate internucleotide bond at position 1 and one at position 21 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 20 и 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 21 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and two modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 20 and 21 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 21 и 22 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 21 and 22 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1 and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 21 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 и 22 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 21 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and two modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 21 and 22 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и 2, две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 22 и 2 3 смысловой цепи (считая от 5'-конца), одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1 и одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 22 and 23 of the sense strand (counting from the 5' end), one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1 and one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 21 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению также содержит одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 1, одну модификацию фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 21 смысловой цепи (считая от 5'-конца), две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положениях 1 и 2 и две модификации фосфоротиоатной межнуклеотидной связи в положении 23 и 23 антисмысловой цепи (считая от 5'-конца).In one embodiment, the dsRNA of the invention also contains one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 1, one modification of the phosphorothioate internucleotide bond at position 21 of the sense strand (counting from the 5' end), two modifications of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 1 and 2, and two modification of the phosphorothioate internucleotide bond at positions 23 and 23 of the antisense strand (counting from the 5' end).
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит ошибочное(ые) спаривание(я) с мишенью в пределах дуплекса или их комбинации. Ошибочное спаривание может иметь место в выступающем участке дуплексного участка. Пара оснований может быть классифицирована на основании их склонности промотировать диссоциацию или плавление (например, из-за свободной энергии ассоциации или диссоциации определенного спаривания, самым простым подходом является проверка пар на основании отдельной пары оснований, хотя также можно использовать анализ ближайшего соседа или подобный анализ). В смысле промотирования диссоциации A:U преобладает над G:C, G:U преобладает над G:C и Т:С преобладает над G:C (1=инозин). Ошибочные спаривания, например неканонические или иные, чем канонические спаривания, предпочтительны перед каноническими (А:Т, A:U, G:C) спариваниями; и спаривания, которые включают универсальное основание, предпочтительны перед каноническими спариваниями.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises mismatch(es) with a target within a duplex, or a combination thereof. Mismatching may take place in the raised portion of the duplex portion. A base pair can be classified based on their propensity to promote dissociation or melting (e.g. due to the free energy of association or dissociation of a particular pairing, the simplest approach is to test pairs based on a single base pair, although nearest neighbor or similar analysis can also be used) . In terms of promoting dissociation, A:U dominates G:C, G:U dominates G:C, and T:C dominates G:C (1=inosine). Mismatches, such as non-canonical or other than canonical pairings, are preferred over canonical (A:T, A:U, G:C) pairings; and pairings that include a universal base are preferred over canonical pairings.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит по меньшей мере одну из первых 1, 2, 3, 4 или 5 пару оснований в дуплексных участках от 5'-конца антисмысловой цепи, которые могут быть выбраны независимо из группы A:U, G:U, I:C, и ошибочные пары, например неканонические или иные, чем канонические, спаривания или спаривания, которые содержат универсальное основание, для промотирования диссоциации антисмысловой цепи в 5'-конце дуплекса.In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises at least one of the first 1, 2, 3, 4, or 5 base pairs in the duplex regions from the 5' end of the antisense strand, which can be independently selected from the group A:U, G :U, I:C, and mismatches, such as non-canonical or other than canonical, pairings, or pairings that contain a universal base, to promote dissociation of the antisense strand at the 5' end of the duplex.
В одном из вариантов осуществления нуклеотид в положении 1 в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи выбирают из группы, состоящей из A, dA, dU, U и dT. С другой стороны, по меньшей мере одна из первых пар оснований 1, 2 или 3 в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи представляет собой пару оснований AU. Например, первой парой оснований в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой цепи является пара оснований AU.In one embodiment, the nucleotide at position 1 in the duplex region from the 5' end of the antisense strand is selected from the group consisting of A, dA, dU, U, and dT. On the other hand, at least one of the first base pairs 1, 2, or 3 in the duplex region from the 5' end of the antisense strand is an AU base pair. For example, the first base pair in the duplex region from the 5' end of the antisense strand is the AU base pair.
В одном из вариантов осуществления последовательность смысловой цепи может быть представлена формулой (I)In one embodiment, the sense strand sequence may be represented by formula (I)
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I), где i и j каждый независимо равен 0 или 1;5' np-N a -(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)jN a -nq 3' (I), where i and j are each independently 0 or 1;
р и q каждый независимо равен 0-6;p and q are each independently 0-6;
каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;each N a is independently an oligonucleotide sequence containing 0-25 modified nucleotides, each sequence containing at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;each Nb is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10 modified nucleotides;
каждый np и nq независимо представляет собой нуклеотид выступа;each np and nq is independently an overhang nucleotide;
при этом Nb и Y не имеют одну и ту же модификацию; иwhile Nb and Y do not have the same modification; And
XXX, YYY и ZZZ каждый независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.XXX, YYY and ZZZ each independently represent one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides.
- 10 042669- 10 042669
Предпочтительно YYY представляет собой все 2'-F-модифицированные нуклеотиды.Preferably YYY is all 2'-F modified nucleotides.
В одном из вариантов осуществления Na и/или Nb содержат модификации чередующейся структуры.In one embodiment, N a and/or Nb contain alternating structure modifications.
В одном из вариантов осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой цепи или вблизи него. Например, когда средство дцРНК имеет дуплексный участок длиной из 17-23 пар нуклеотидов, мотив YYY может встречаться в сайте расщепления или вблизи него (например, может встречаться в положениях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 или 11, 12, 13) смысловой цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.In one embodiment, the YYY motif is located at or near the sense strand cleavage site. For example, when a dsRNA agent has a duplex region of 17-23 bp, the YYY motif may occur at or near the cleavage site (e.g., may occur at positions 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10 , 9, 10, 11, 10, 11, 12, or 11, 12, 13) of the sense strand, with counting starting from the 1st nucleotide from the 5' end, or optionally counting starting from the 1st paired nucleotide in the duplex region from 5 '-end.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. Следовательно, смысловая цепь может быть представлена следующими формуламиIn one embodiment, i is 1 and j is 0; or i is 0 and j is 1; or both i and j are equal to 1. Therefore, the semantic chain can be represented by the following formulas
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ia),5' np-N a -YYY-Nb-ZZZ-N a -n q 3' (Ia),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ib), или5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ib), or
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ic)5'n p -N a -XXX-N b -YYY-N b -ZZZ-N a -n q 3' (Ic)
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ia), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the sense strand is represented by formula (Ia), N b is an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Each N a may be independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the sense strand is represented by formula (Ib), N b is an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Each Na may be independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Когда смысловая цепь представлена формулой (Ic), каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na может представлять собой независимо олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the sense strand is represented by formula (Ic), each Nb is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Preferably N b is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 modified nucleotides. Each N a may be independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Каждый из X, Y и Z может быть одинаковым с другим или отличаться от него.Each of X, Y, and Z can be the same as or different from the other.
В одном из вариантов осуществления последовательность антисмысловой цепи дцРНК может быть представлена формулой (II)In one embodiment, the dsRNA antisense strand sequence can be represented by formula (II)
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II), при этом k и l каждый независимо равен 0 или 1;5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' ( II), wherein k and l are each independently 0 or 1;
р и q каждый независимо равен 0-6;p and q are each independently 0-6;
каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;each Na' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-25 modified nucleotides, each sequence containing at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;each N b ' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10 modified nucleotides;
каждый np' и nq' независимо представляет собой нуклеотидный выступ, содержащий 0-6 нуклеотидов;each n p ' and n q ' is independently a nucleotide overhang containing 0-6 nucleotides;
где Nb' и Y' не имеют одну и ту же модификацию; и каждый Х'Х'Х', YYY' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив их трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.where N b ' and Y' do not have the same modification; and each X'X'X', YYY' and Z'Z'Z' independently represents one motif of their three identical modifications on three consecutive nucleotides.
В одном из вариантов осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующейся структуры.In one embodiment, N a ' and/or N b ' contains alternating structure modifications.
Мотив YYY' встречается в сайте расщепления антисмысловой цепи или вблизи него. Например, когда средство дцРНК имеет дуплексный участок длиной в 17-23 нк, мотив YYY' может встречаться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' встречается в положениях 11, 12, 13.The YYY' motif occurs at or near the antisense strand cleavage site. For example, when the dsRNA agent has a 17-23 nc duplex region, the YYY' motif may occur at positions 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 or 13, 14, 15 of the antisense strand, counting starting from the 1st nucleotide from the 5' end; or optionally counting starts from the 1st paired nucleotide in the duplex region from the 5' end. Preferably the Y'Y'Y' motif occurs at positions 11, 12, 13.
В одном из вариантов осуществления мотив YYY' представляет собой все 2'-ОМемодифицированные нуклеотиды.In one embodiment, the YYY' motif is all 2'-OM modified nucleotides.
В одном из вариантов осуществления k равен 1 и l равен 0; или k равен 0 и 1 равен 1; или оба k и l равны 1.In one embodiment, k is 1 and l is 0; or k is 0 and 1 is 1; or both k and l are 1.
Следовательно, антисмысловая цепь может быть представлена следующими формуламиTherefore, the antisense strand can be represented by the following formulas
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-N'a-np' 3' (IIa),5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-N'a-np' 3' (IIa),
5' nq'-Na'-YYY'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIb), или5' n q '-N a '-YYY'-N b '-X'X'X'-n p '3' (IIb), or
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-YYY'-Nb'-X'X'X'-N'a-np' 3' (IIc)5' n q '-N a '-Z'Z'Z'-N b '-YYY'-N b '-X'X'X'-N' a -n p '3' (IIc)
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIa), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержа- 11 042669 щую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the antisense strand is represented by formula (IIa), Nb' is an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Each N a ' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15, or 2-10 modified nucleotides.
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIb), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the antisense strand is represented by formula (IIb), N b ' is an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Each N a ' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Когда антисмысловая цепь представлена формулой (IIc), каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb' представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеотидов.When the antisense strand is represented by formula (IIc), each N b ' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, or 0 modified nucleotides. Each N a ' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides. Preferably N b ' represents 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 modified nucleotides.
Каждый из X', Y' и Z' может быть одинаковым с другим или отличаться от него.Each of X', Y' and Z' may be the same as or different from the other.
Каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи может быть независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-С-аллилом или 2'-фтор. Например, каждый нуклеотид смысловой цепи и антисмысловой цепи может быть независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором. Каждый X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-О-метилмодификацию или 2'-фтормодификацию.Each nucleotide of the sense strand and antisense strand can be independently modified with LNA, HNA, CeNA, 2'-methoxyethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-allyl, 2'-C-allyl, or 2'-fluorine. For example, each nucleotide of the sense strand and antisense strand can be independently modified with 2'-O-methyl or 2'-fluoro. Each X, Y, Z, X', Y' and Z' in particular may be a 2'-O-methyl modification or a 2'-fluoro modification.
В одном из вариантов осуществления смысловая цепь средства дцРНК содержит мотив YYY, встречающийся в положениях 9, 10 и 11 смысловой цепи, когда дуплексный участок состоит из 21 нк, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'Л-модификацию. Смысловая цепь может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ как фланговые модификации в противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.In one embodiment, the sense strand of the dsRNA agent contains the YYY motif occurring at positions 9, 10, and 11 of the sense strand when the duplex region is 21 nc, with counting starting from 1 nucleotide from the 5' end, or optionally counting starting at 1st paired nucleotide in the duplex region from the 5'-end; and Y is the 2'L modification. The sense strand may additionally contain the XXX motif or ZZZ motifs as flank modifications at the opposite end of the duplex region; and each of XXX and ZZZ is independently a 2'-OMe modification or a 2'-F modification.
В одном из вариантов осуществления антисмысловая цепь может содержать мотив Y'Y'Y', встречающийся в положениях 11, 12 и 13 цепи, причем исчисление начинают с 1-го нуклеотида от 5'-конца или необязательно исчисление начинают с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-О-метил-модификацию. Антисмысловая цепь может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' как фланговые модификации в противоположном конце дуплексного участка; и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.In one embodiment, the antisense strand may contain a Y'Y'Y' motif occurring at positions 11, 12, and 13 of the strand, counting from the 1st nucleotide from the 5' end, or optionally counting from the 1st paired nucleotide in the duplex region from the 5'-end; and Y' is the 2'-O-methyl modification. The antisense strand may further contain the X'X'X' motif or Z'Z'Z' motifs as flanking modifications at the opposite end of the duplex region; and each of X'X'X' and Z'Z'Z' is independently a 2'-OMe modification or a 2'-F modification.
Смысловая цепь, представленная одной из приведенных выше формул (Ia), (Ib) и (Ic), образует дуплекс с антисмысловой цепью, представленной одной из приведенных выше формул (IIa), (IIb) и (IIc) соответственно.The sense strand represented by one of the above formulas (Ia), (Ib) and (Ic) forms a duplex with the antisense strand represented by one of the above formulas (IIa), (IIb) and (IIc), respectively.
Соответственно средство дцРНК может содержать смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представлять собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой смысловая: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')i-Na'-nq' 5' (III), где каждый i, j , k и l независимо равен 0 или 1;Accordingly, the dsRNA agent may comprise a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides, i.e. be a dsRNA duplex represented by the formula sense: 5' np-N a -(XXX) i -N b -YYY-N b -(ZZZ) j -N a -n q 3' antisense: 3'np'-N a '-(X'X'X') k -N b '-Y'Y'Y'-N b '-(Z'Z'Z') i -N a '-n q '5' (III) where i, j, k, and l are each independently 0 or 1;
каждый р и q независимо равен 0-6;p and q are each independently 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность включает по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;each N a and N a ' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-25 modified nucleotides, each sequence comprising at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;each Nb and Nb' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10 modified nucleotides;
где каждый np', np, nq' и nq независимо представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность; и каждый XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.where each np', np, nq' and nq is independently an overhanging nucleotide sequence; and each XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' and Z'Z'Z' independently represent one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. В другом варианте осуществления k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и l равен 1; или оба k и l равны 1.In one embodiment, i is 1 and j is 0; or i is 0 and j is 1; or both i and j are 1. In another embodiment, k is 1 and l is 0; k is 0 and l is 1; or both k and l are 1.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представляет собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой (V) смысловая: 5' Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na' 5' (V), где i, j , k и l равны каждый независимо 0 или 1;In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides, i. is a dsRNA duplex represented by formula (V) sense: 5' N a -(XXX) i -N b -YYY-N b -(ZZZ) j -N a -n q 3' antisense: 3'np'- N a '-(X'X'X') k -N b '-Y'Y'Y'-N b '-(Z'Z'Z') l -N a '5' (V), where i , j , k and l are each independently 0 or 1;
р и q равны каждый независимо 2;p and q are each independently 2;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшейeach N a and N a ' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-25 modified nucleotides, with each sequence containing at least
- 12 042669 мере два различным образом модифицированных нуклеотида;- 12 042669 at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;each N b and Nb' independently represents an oligonucleotide sequence containing 0-10 modified nucleotides;
где каждый np' и nq независимо представляют собой выступающую нуклеотидную последовательность; иwhere each np' and n q independently represent a protruding nucleotide sequence; And
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YYY' и Z'Z'Z' каждый независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', YYY' and Z'Z'Z' each independently represent one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides.
В одном из вариантов осуществления i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 1. В другом варианте осуществления k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и 1 равен 1; или оба k и l равны 1.In one embodiment, i is 1 and j is 0; or i is 0 and j is 1; or both i and j are 1. In another embodiment, k is 1 and l is 0; k is 0 and 1 is 1; or both k and l are 1.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов, т.е. представляет собой дцРНК-дуплекс, представленный формулой (Va) смысловая: 5' Na-(XXX)1-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na 3' антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-YYY'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa' 5' (Va), где каждый i, j, k и l независимо равен 0 или 1;In one embodiment, the dsRNA agent of the invention comprises a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides, i. is a dsRNA duplex represented by the formula (Va) sense: 5' N a -(XXX) 1 -N b -YYY-N b -(ZZZ) j -N a 3' antisense: 3'np'-N a '-(X'X'X') k -N b '-YYY'-N b '-(Z'Z'Z') r N a '5' (Va), where i, j, k and l are each independently is 0 or 1;
каждый р и q независимо равен 2;p and q are each independently 2;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два различным образом модифицированных нуклеотида;each Na and Na' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-25 modified nucleotides, each sequence containing at least two differently modified nucleotides;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;each Nb and Nb' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10 modified nucleotides;
где np' представляет собой выступающую нуклеотидную последовательность; и каждый XXX, ΎΎΎ, ZZZ, X'X'X', Ύ'Ύ'Ύ' и Z'Z'Z' независимо представляют собой один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.where np' represents the protruding nucleotide sequence; and each XXX, ΎΎΎ, ZZZ, X'X'X', Ύ'Ύ'Ύ' and Z'Z'Z' independently represent one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides.
Примеры комбинаций смысловой цепи и антисмысловой цепи, образующих дцРНК-дуплекс, включают формулы, приведенные ниже.Examples of combinations of sense strand and antisense strand that form a dsRNA duplex include the formulas below.
5' np-NaYYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'5'np-NaYYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np'-Na'-YYY'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIa),3'np'-N a '-YYY'-N b '-Z'Z'Z'-N a '-n q '5' (IIIa),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-YYY'-Na'-nq' 5' (IIIb),3' n p '-N a '-X'X'X'-N b '-YYY'-N a '-n q '5' (IIIb),
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-YYY'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5' (IIIc)5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-YYY'-Nb'-Z'Z'Z '-Na-nq' 5' (IIIc)
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIa), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the dsRNA agent is represented by formula (IIIa), each N b and N b ' is independently an oligonucleotide sequence containing 1-10, 1-7, 1-5, or 1-4 modified nucleotides. Each Na and Na' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIb), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.When the dsRNA agent is represented by formula (IIIb), each N b and Nb' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, or 0 modified nucleotides. Each Na and Na' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIc), каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый из Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующейся структуры.When the dsRNA agent is represented by formula (IIIc), each N b and N b ' is independently an oligonucleotide sequence containing 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 or 0 modified nucleotides. Each Na and Na' is independently an oligonucleotide sequence containing 2-20, 2-15 or 2-10 modified nucleotides. Each of Na, Na', N b and N b ' independently contains alternating structure modifications.
Каждый из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb) и (IIIc) может быть одинаковым с другим или отличаться от него.Each of X, Y and Z in formulas (III), (IIIa), (IIIb) and (IIIc) may be the same as or different from the other.
Когда средство дцРНК представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом Y'. С другой стороны по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y' или все три нуклеотида Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.When the dsRNA agent is represented by formula (III), (IIIa), (IIIb) or (IIIc), at least one of the Y nucleotides may base pair with one Y' nucleotide. On the other hand, at least two of the Y nucleotides form base pairs with the corresponding Y' nucleotides, or all three Y nucleotides form base pairs with the corresponding Y' nucleotides.
Понятно, что когда нуклеотиды Na образуют пары оснований с Na', нуклеотиды Nb образуют пары оснований с Nb', нуклеотиды X образуют пары оснований с X', нуклеотиды Y образуют пары оснований с Y' и нуклеотиды Z образуют пары оснований с Z'.It is clear that when Na nucleotides base pair with Na', N b nucleotides base pair with N b ', X nucleotides base pair with X', Y nucleotides base pair with Y', and Z nucleotides base pair with Z' .
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIa) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом Z'. С другой стороны по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z' или все три нук- 13 042669 леотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.When the dsRNA agent is represented by formula (IIIa) or (IIIc), at least one of the Z nucleotides may base pair with one Z' nucleotide. On the other hand, at least two of the Z nucleotides form base pairs with the corresponding Z' nucleotides, or all three Z nucleotides form base pairs with the corresponding Z' nucleotides.
Когда средство дцРНК представлено формулой (IIIb) или (IIIc) по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом X'. С другой стороны, по меньшей мере, два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три нуклеотида X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.When the dsRNA agent is represented by formula (IIIb) or (IIIc), at least one of the X nucleotides may base pair with one X' nucleotide. On the other hand, at least two of the X nucleotides form base pairs with the corresponding X' nucleotides; or all three X nucleotides form base pairs with the corresponding X' nucleotides.
В одном из вариантов осуществления модификация в нуклеотиде Y иная, чем модификация в нуклеотиде Y', модификация в нуклеотиде Z иная, чем модификация в нуклеотиде Z', и/или модификация в нуклеотиде X иная, чем модификация в нуклеотиде X'.In one embodiment, the modification at nucleotide Y is other than the modification at nucleotide Y', the modification at nucleotide Z is other than the modification at nucleotide Z', and/or the modification at nucleotide X is other than the modification at nucleotide X'.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК представляет собой полимер, содержащий по меньшей мере два дуплекса, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), при этом указанные дуплексы соединяются линкером. Линкер может поддаваться расщеплению или не поддаваться. Необязательно указанный полимер также содержит лиганд. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.In one embodiment, the dsRNA agent is a polymer containing at least two duplexes represented by formulas (III), (IIIa), (IIIb) or (IIIc), said duplexes being connected by a linker. The linker may or may not be cleavable. Optionally, said polymer also contains a ligand. Each of the dsRNAs may target the same gene or two different genes, or each of the dsRNAs may target the same gene at two different target sites.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК представляет собой полимер, содержащий три, четыре, пять, шесть или больше дуплексов, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), при этом указанные дуплексы соединяются линкером. Линкер может поддаваться расщеплению или не поддаваться. Необязательно указанный полимер также содержит лиганд. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.In one embodiment, the dsRNA agent is a polymer containing three, four, five, six or more duplexes represented by formulas (III), (IIIa), (IIIb) or (IIIc), said duplexes being connected by a linker. The linker may or may not be cleavable. Optionally, said polymer also contains a ligand. Each of the dsRNAs may target the same gene or two different genes, or each of the dsRNAs may target the same gene at two different target sites.
В одном из вариантов осуществления два средства дцРНК, представленные формулами (III), (IIIa), (IIIb) или (IIIc), соединяются друг с другом по 5'-концу и один или оба 3'-конца необязательно конъюгируются с лигандом. Каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген или на два различные гена; или каждая из дцРНК может нацеливаться на один и тот же ген на два различных сайта-мишени.In one embodiment, two dsRNA agents represented by formulas (III), (IIIa), (IIIb) or (IIIc) are joined to each other at the 5' end, and one or both of the 3' ends are optionally conjugated to a ligand. Each of the dsRNAs can target the same gene or two different genes; or each of the dsRNAs can target the same gene at two different target sites.
Во многих публикациях описывается полимерная миРНК, и все можно использовать в отношении дцРНК по изобретению. Такие публикации включают WO 2007/091269, патент США № 7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 и WO 2011/031520, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.Many publications describe polymeric siRNA, and all can be used in relation to dsRNA according to the invention. Such publications include WO 2007/091269, US Patent No. 7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 and WO 2011/031520, which are incorporated herein by reference.
Средство дцРНК, которое содержит конъюгации одной или нескольких углеводных частей со средством дцРНК, может оптимизировать одно или больше свойств средства дцРНК. Во многих случаях углеводная часть будет присоединяться к модифицированному звену средства дцРНК. Например, сахар рибоза одного или нескольких рибонуклеотидных звеньев средства дцРНК может быть заменен на другую часть, например неуглеводный (предпочтительно, циклический) носитель, к которому присоединяется углеводный лиганд. Рибонуклеотидное звено, в котором сахар рибоза звена заменен таким образом, в настоящем описании называют звеном с модификацией заменой рибозы (RRMS). Циклический носитель может представлять собой карбоциклическую систему, т.е. все атомы цикла являются атомами углерода, или гетероциклическую систему, т.е. один или больше атомов цикла могут представлять собой гетероатомы, например атомы азота, кислорода, серы. Циклический носитель может представлять собой моноциклическую систему или может содержать два или больше циклов, например конденсированные циклы. Циклический носитель может представлять собой полностью насыщенную циклическую систему или он может содержать одну или несколько двойных связей.A dsRNA agent that contains conjugations of one or more carbohydrate moieties to the dsRNA agent can optimize one or more properties of the dsRNA agent. In many cases, the carbohydrate moiety will attach to the modified unit of the dsRNA agent. For example, the ribose sugar of one or more ribonucleotide units of the dsRNA agent can be replaced with another moiety, such as a non-carbohydrate (preferably cyclic) carrier, to which a carbohydrate ligand is attached. A ribonucleotide unit in which the ribose sugar of the unit is replaced in this way is referred to herein as a ribose replacement modified unit (RRMS). The cyclic carrier may be a carbocyclic system, i. e. all ring atoms are carbon atoms, or a heterocyclic system, i.e. one or more ring atoms may be heteroatoms, eg nitrogen, oxygen, sulfur. The cyclic carrier may be a monocyclic system or may contain two or more rings, such as fused rings. The cyclic carrier may be a fully saturated ring system, or it may contain one or more double bonds.
Лиганд может быть присоединен к полинуклеотиду через носитель. Носители включают (i) по меньшей мере одну точку присоединения к главной цепи, предпочтительно две точки присоединения к главной цепи, и (ii) по меньшей мере одну точку промежуточного присоединения. Используемый в настоящем описании термин точка присоединения к главной цепи относится к функциональной группе, например гидроксильной группе, или вообще доступной для связи и которая подходит для введения носителя в главную цепь, например фосфатной группе или модифицированной фосфатной группе, например серосодержащей группе главной цепи рибонуклеиновой кислоты. Термин точка промежуточного присоединения (ТАР) в некоторых вариантах осуществления относится к входящему в цикл атому циклического носителя, например атому углерода или гетероатому (отличающемуся от атома, который обеспечивает точку присоединения главной цепи), который присоединяет выбранную часть. Часть может представлять собой, например, углевод, например моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид и полисахарид. Необязательно выбранная часть соединяется с циклическим носителем посреднической связью. Таким образом, циклический носитель обычно будет включать функциональную группу, например аминогруппу, или, как правило, обеспечивающую связь, которая подходит для включения или для промежуточной связи для другой химической частицы, например лиганда, с составляющим циклом.The ligand may be attached to the polynucleotide via a carrier. The supports include (i) at least one main chain attachment, preferably two main chain attachments, and (ii) at least one intermediate attachment. As used herein, the term main chain attachment point refers to a functional group, such as a hydroxyl group, or generally available for bonding, and which is suitable for introducing a carrier into the main chain, such as a phosphate group or a modified phosphate group, such as a sulfur-containing group of the ribonucleic acid main chain. The term intermediate attachment point (TAP) in some embodiments refers to a ringing cyclic carrier atom, such as a carbon atom or a heteroatom (other than the atom that provides the main chain attachment point) that attaches the selected moiety. The portion may be, for example, a carbohydrate, such as a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, an oligosaccharide, and a polysaccharide. Optionally, the selected part is connected to the cyclic carrier through an intermediary link. Thus, the cyclic carrier will typically include a functional group, such as an amino group, or, as a rule, provide a link that is suitable for inclusion or for an intermediate link for another chemical species, such as a ligand, with a constituent ring.
В варианте осуществления дцРНК по изобретению конъюгируют с лигандом через носитель, при этом носитель может представлять собой циклическую группу или ациклическую группу; предпочтительно, циклическую группу выбирают из пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, пиперидинила, пиперазинила, [1,3]диоксолана, оксазолидинила, изоксазолидинила, морфолинила, тиазолидинила, изотиазолидинила, хиноксалининла, пиридазинонила, тетрагидро- 14 042669 фурила и декалина; предпочтительно ациклическую группу выбирают из главной цепи серинола или главной цепи диэтаноламина.In an embodiment, the dsRNA of the invention is conjugated to a ligand via a carrier, wherein the carrier may be a cyclic group or an acyclic group; preferably, the cyclic group is selected from pyrrolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, [1,3]dioxolane, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, morpholinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, quinoxalininl, pyridazinonyl, tetrahydro- 14 042669 and decalin furyl; preferably the acyclic group is selected from the serinol backbone or the diethanolamine backbone.
Двухцепочечное средство РНК (дцРНК) по изобретению необязательно может быть конъюгировано с одним или несколькими лигандами. Лиганд может присоединяться к смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеим цепям по 3'-концу, 5'-концу или обоим концам. Например, лиганд может быть конъюгирован со смысловой цепью, в частности с 3'-концом смысловой цепи.The double-stranded RNA agent (dsRNA) of the invention may optionally be conjugated to one or more ligands. The ligand may be attached to the sense strand, the antisense strand, or both strands at the 3' end, the 5' end, or both ends. For example, the ligand may be conjugated to the sense strand, in particular the 3' end of the sense strand.
Лиганды.Ligands.
Широкий ряд частиц можно сочетать с олигонуклеотидами по настоящему изобретению. Предпочтительными частицами являются лиганды, которые присоединяются предпочтительно ковалентно или непосредственно или косвенно через промежуточную связку.A wide range of particles can be combined with the oligonucleotides of the present invention. Preferred particles are ligands which are attached, preferably covalently, either directly or indirectly via an intermediate linkage.
В предпочтительных вариантах осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время жизни молекулы, в которую он включен. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд обеспечивает усиленную аффинность в отношении выбранной мишени, например молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, рецептора, например клеточного компартмента или компартмента органа, ткани, органа или части тела, при сравнении, например, с аффинностью при отсутствия такого лиганда. Лиганды, обеспечивающие усиленную аффинность в отношении выбранной мишени, также называют нацеливающими лигандами.In preferred embodiments, the implementation of the ligand changes the distribution, targeting or lifetime of the molecule in which it is included. In preferred embodiments, the ligand provides enhanced affinity for a selected target, e.g., molecule, cell or cell type, compartment, receptor, e.g. . Ligands that provide enhanced affinity for a selected target are also referred to as targeting ligands.
Некоторые лиганды могут иметь эндосомолитические свойства. Эндосомолитические лиганды промотируют лизис эндосом и/или перенос композиции по изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может представлять собой полианионный пептид или пептидомиметик, который показывает рН-зависимую мембранную активность и фузогенность. В одном из вариантов осуществления эндосомолитический лиганд проявляет свою активную конформацию при эндосомном рН. Активной конформацией является такая конформация, при которой эндосомолитический лиганд промотирует лизис эндосомы и/или перенос композиции по изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Примеры эндосомолитических лигандов включают пептид GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26:2964-2972), пептид EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118:1581-1586) и их производные (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559:56-68). В одном из вариантов осуществления эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислотную), которая будет претерпевать изменение заряда или протонирования в ответ на изменение рН. Эндосомолитический компонент может быть линейным или разветвленным.Some ligands may have endosomolytic properties. Endosomolytic ligands promote lysis of endosomes and/or transfer of the composition of the invention or components thereof from the endosome into the cytoplasm of the cell. The endosomolytic ligand can be a polyanionic peptide or peptidomimetic that exhibits pH-dependent membrane activity and fusogenicity. In one embodiment, the endosomolytic ligand exhibits its active conformation at endosomal pH. The active conformation is one in which the endosomolytic ligand promotes lysis of the endosome and/or transfer of the composition of the invention or its components from the endosome into the cytoplasm of the cell. Examples of endosomolytic ligands include the GALA peptide (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26:2964-2972), the EALA peptide (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118:1581-1586) and derivatives thereof. (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559:56-68). In one embodiment, the endosomolytic component may contain a chemical group (eg, an amino acid) that will undergo a change in charge or protonation in response to a change in pH. The endosomolytic component may be linear or branched.
Лиганды могут улучшать перенос, гибридизацию и свойства специфичности и также могут улучшать нуклеазоустойчивость полученного природного или модифицированного олигонуклеотида или полимерной молекулы, содержащей любую комбинацию мономеров, описанную в настоящем описании, и/или природных или модифицированных рибонуклеотидов.Ligands can improve transfer, hybridization, and specificity properties, and can also improve the nuclease resistance of the resulting natural or modified oligonucleotide or polymer molecule containing any combination of the monomers described herein and/or natural or modified ribonucleotides.
Обычно лиганды могут содержать терапевтические модификаторы, например, для усиления поглощения; диагностические соединения или репортерные группы, например, для контроля за распределением; сшивающие средства и части, придающие нуклеазоустойчивость. Обычные примеры включают липиды, стероиды, витамины, сахара, белки, пептиды, полиамины и пептидомиметики.Typically, the ligands may contain therapeutic modifiers, for example to enhance absorption; diagnostic compounds or reporter groups, for example, to control distribution; cross-linking agents and portions conferring nuclease resistance. Common examples include lipids, steroids, vitamins, sugars, proteins, peptides, polyamines, and peptidomimetics.
Лиганды могут включать природное вещество, такое как белок (например, человеческий сывороточный альбумин (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), липопротеин высокой плотности (HDL) или глобулин); углевод (например, декстрин, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота, олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полилизин (PLL), поли-Lаспартамовую кислоту, поли-Е-глутамовую кислоту, сополимер стирола и малеинового ангидрида, сополимер поли(L-лактид, гликолиед), сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида (HMPA), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидомиметический поламин, дендритный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.Ligands may include a natural substance such as a protein (eg, human serum albumin (HSA), low density lipoprotein (LDL), high density lipoprotein (HDL) or globulin); a carbohydrate (eg dextrin, pullulan, chitin, chitosan, inulin, cyclodextrin or hyaluronic acid) or a lipid. The ligand may also be a recombinant or synthetic molecule such as a synthetic polymer, eg a synthetic polyamino acid, an oligonucleotide (eg an aptamer). Examples of polyamino acids include polylysine (PLL), poly-L-aspartamic acid, poly-E-glutamic acid, styrene-maleic anhydride copolymer, poly(L-lactide, glycolide) copolymer, divinyl ether-maleic anhydride copolymer, N-(2-hydroxypropyl) copolymer )methacrylamide (HMPA), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyurethane, poly(2-ethylacrylic acid), N-isopropylacrylamide polymers, or polyphosphazine. Examples of polyamines include polyethyleneimine, polylysine (PLL), spermine, spermidine, polyamine, pseudopeptide-polyamine, peptidomimetic polyamine, dendritic polyamine, arginine, amidine, protamine, cationic lipid, cationic porphyrin, polyamine quaternary salt, or alpha-helical peptide.
Лиганды также могут включать нацеливающие группы, например средство, нацеливающее на клетку или ткань, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается со специфическим типом клеток, таким как клетка почки. Нацеливающая группа может представлять собой тиротропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный активный белок А, углевод муцина, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентную галактозу, трансферрин, бифосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин В12, биотин, пептид RGD, миметик пептида RGD или аптамер. Табл. 1 показывает некоторые примеры нацеливающих лигандов и их ассоциированные рецепторы.Ligands may also include targeting groups, such as a cell or tissue targeting agent, such as a lectin, glycoprotein, lipid, or protein, such as an antibody, that binds to a specific cell type, such as a kidney cell. The targeting group can be thyrotropin, melanotropin, lectin, glycoprotein, surface active protein A, mucin carbohydrate, polyvalent lactose, polyvalent galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, polyvalent mannose, polyvalent fucose, glycosylated polyamino acids, polyvalent galactose, transferrin, bisphosphonate , polyglutamate, polyaspartate, lipid, cholesterol, steroid, bile acid, folate, vitamin B12, biotin, RGD peptide, RGD peptide mimetic, or aptamer. Tab. 1 shows some examples of targeting ligands and their associated receptors.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие вещества (например, акридины),Other examples of ligands include dyes, intercalators (eg acridines),
- 15 042669 сшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы или хелаторы (например, ЭДТК), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бисO(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, антеннапедиапептид, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, ПЭГ (например, ПЭГ-40К), MPEG, [MPEG]2, полиамины, алкилы, замещенные алкилы, меченные изотопами маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), средства, облегчающие перенос/поглощение (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплексы Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HPR или АР.- 15 042669 crosslinkers (eg psoralen, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texafirin, sapphirin), polycyclic aromatic hydrocarbons (eg phenazine, dihydrophenazine), artificial endonucleases or chelators (eg EDTA), lipophilic molecules, eg cholesterol , cholic acid, adamantanacetic acid, 1-pyrenebutyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-bisO(hexadecyl)glycerol, geranyloxyhexyl group, hexadecylglycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, palmitic acid, myristic acid, O3- (oleoyl)lithocholic acid, O3-(oleoyl)cholenic acid, dimethoxytrityl or phenoxazine and peptide conjugates (e.g. antennapediapeptide, Tat-peptide), alkylating agents, phosphate, amino, mercapto, PEG (e.g. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, polyamines, alkyls, substituted alkyls, isotopically labeled markers, enzymes, haptens (eg biotin), transport/absorption agents (eg aspirin, vitamin E, folic acid), synthetic ribonucleases (eg imidazole, bisimidazole, histamine, imidazole clusters, acridine-imidazole conjugates, Eu3+ complexes of tetraazamacrocycles), dinitrophenyl, HPR or AP.
Лигандами могут быть белки, например гликопротеины, или пептиды, например молекулы со специфической аффинностью к солиганду, или антитела, например антитело, которое связывается с клеткой определенного типа, такой как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные вещества, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза, поливалентная фукоза или аптамеры. Лиганд может представлять собой, например, липополисахарид, активатор р38 МАР-киназы или активатор NF-kB.Ligands can be proteins, such as glycoproteins, or peptides, such as molecules with a specific affinity for a coligand, or antibodies, such as an antibody that binds to a specific cell type, such as a cancer cell, endothelial cell, or bone cell. Ligands can also include hormones and hormone receptors. They may also include non-peptidic substances such as lipids, lectins, carbohydrates, vitamins, cofactors, polyvalent lactose, polyvalent galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, polyvalent mannose, polyvalent fucose, or aptamers. The ligand may be, for example, a lipopolysaccharide, a p38 MAP kinase activator, or an NF-kB activator.
Лиганд может представлять собой вещество, например лекарственное средство, которое может усилить поглощение средства иРНК в клетке, например, путем разрыва цитоскелета клетки, например, путем разрыва микротрубочек клетки, микронитей и/или промежуточных нитей. Лекарственное средство может представлять собой, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, ларункулин А, фаллодин, свинхолид А, инданоцин или миосервин.The ligand may be a substance, eg a drug, which can enhance the uptake of the mRNA agent into a cell, eg by disrupting the cell's cytoskeleton, eg by disrupting the cell's microtubules, microfilaments and/or intermediate strands. The drug may be, for example, a taxon, vincristine, vinblastine, cytochalasin, nocodazole, japlakinolide, larunculin A, phallodin, swincholide A, indanocin or myoservin.
Лиганд может усиливать поглощение олигонуклеотида в клетке путем активации воспалительной реакции, например. Примеры лигандов, которые могут иметь такое действие, включают фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), интерлейкин-1-бета или гамма-интерферон.The ligand can enhance the uptake of the oligonucleotide into the cell by activating an inflammatory response, for example. Examples of ligands that can have this effect include tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), interleukin-1-beta, or interferon gamma.
В одном из аспектов лиганд представляет собой липид или молекулу на основе липида. Такие липид или молекула на основе липида предпочтительно связывают сывороточный белок, например человеческий сывороточный альбумин (HSA). Связывающий HSA лиганд позволяет донести конъюгат до ткани-мишени, например непочечной ткани-мишени организма. Например, ткань-мишень может представлять собой ткань печени, включая паренхимные клетки печени. Другие молекулы, которые могут связывать HSA, также можно использовать в качестве лигандов. Например, можно использовать напроксен или аспирин. Липид или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгатов;In one aspect, the ligand is a lipid or lipid-based molecule. Such a lipid or lipid-based molecule preferably binds a serum protein, such as human serum albumin (HSA). The HSA binding ligand allows the conjugate to be delivered to a target tissue, such as a non-renal target tissue of the body. For example, the target tissue may be liver tissue, including parenchymal liver cells. Other molecules that can bind HSA can also be used as ligands. For example, naproxen or aspirin can be used. The lipid or lipid-based ligand can (a) increase resistance to degradation of conjugates;
(b) повышать нацеливание или перенос в клетку-мишень или клеточную мембрану; и/или (с) использоваться для регулирования связывания с сывороточным белком, например HSA.(b) increase targeting or transport to a target cell or cell membrane; and/or (c) be used to regulate serum protein binding, eg HSA.
Лиганд на основе липида можно использовать для модуляции, например, регулирования, связывания конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA сильнее, с меньшей вероятностью будет нацеливаться на почки и поэтому менее вероятно выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липида, который связывается с HSA с меньшей силой, может использоваться для нацеливания конъюгата на почки.A lipid-based ligand can be used to modulate, for example, regulate, the binding of a conjugate to a target tissue. For example, a lipid or lipid-based ligand that binds more strongly to HSA is less likely to be targeted to the kidneys and therefore less likely to be excreted from the body. A lipid or lipid-based ligand that binds to HSA with less force can be used to target the conjugate to the kidneys.
В предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывает HSA. Предпочтительно он связывает HSA с достаточной аффинностью, так что конъюгат будет предпочтительно доставляться в непочечную ткань. Однако предпочтительно, чтобы аффинность не была настолько сильной, чтобы связывание лигандом HSA не могло быть обратимым.In a preferred embodiment, the lipid-based ligand binds HSA. Preferably it binds HSA with sufficient affinity such that the conjugate will preferentially be delivered to non-renal tissue. However, it is preferred that the affinity is not so strong that the HSA ligand binding cannot be reversible.
В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывает HSA слабо или вовсе не связывает, так что конъюгат предпочтительно будет доставляться в почки. Другие вещества, которые нацеливают на клетки почек, также могут использоваться вместо или в дополнение к лиганду на основе липида.In another preferred embodiment, the lipid-based ligand binds little or no HSA, such that the conjugate will preferably be delivered to the kidneys. Other substances that target kidney cells can also be used instead of or in addition to the lipid based ligand.
В другом аспекте лиганд представляет собой частицу, например витамин, которая поглощается клеткой-мишенью, например пролиферирующейся клеткой. Это особенно применимо для лечения расстройств, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или незлокачественного типа, например раковых клеток. Примеры витаминов включают витамин А, Е и K. Другие примеры витаминов включают витамины группы В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль, или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включаются HAS, липопротеин низкой плотности (LDL) и липопротеин высокой плотности (HDL).In another aspect, the ligand is a particle, such as a vitamin, that is taken up by a target cell, such as a proliferating cell. This is particularly applicable to the treatment of disorders characterized by undesired cell proliferation, eg of a malignant or non-cancerous type, such as cancer cells. Examples of vitamins include vitamin A, E, and K. Other examples of vitamins include B vitamins such as folic acid, B12, riboflavin, biotin, pyridoxal, or other vitamins or nutrients taken up by cancer cells. Also included are HAS, low density lipoprotein (LDL), and high density lipoprotein (HDL).
В другом аспекте лиганд представляет собой средство, проникающее в клетку предпочтительно спиральное проникающее в клетку средство. Предпочтительно средство является амфипатическим. При- 16 042669 мером средства является пептид tat или антеннопедия. Если средство представляет собой пептид, он может быть модифицированным, включая пептидомиметик, инвертомеры, непептидные или псевдопептидные связи и использование D-аминокислот. Спиральное средство предпочтительно представляет собой альфа-спиральное средство, которое предпочтительно имеет липофильную и липофобную фазу.In another aspect, the ligand is a cell-penetrating agent, preferably a helical cell-penetrating agent. Preferably the agent is amphipathic. An example of an agent is the tat peptide or antennopedia. If the agent is a peptide, it may be modified, including a peptidomimetic, invertomers, non-peptide or pseudo-peptide bonds, and the use of D-amino acids. The helical agent is preferably an alpha helical agent which preferably has a lipophilic and lipophobic phase.
Лиганд может представлять собой пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в настоящем описании олигопептидомиметиком) представляет собой молекулу, способную складываться в определенную трехмерную структуру, схожую с природным пептидом. Часть пептида или пептидомиметика может иметь длину примерно в 5-50 аминокислот, например длину примерно в 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Пептид или пептидомиметик может представлять собой, например, пептид, проникающий в клетку, катионный пептид, амфифатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Tyr, Trp или Phe). Пептидная часть может представлять собой дендритный пептид, свернутый пептид или сшитый пептид. В другом случае пептидная часть может включать гидрофобную последовательность мембранной транслокации (MTS). Примером гидрофобного MTS-содержащего пептида является RFGF, имеющий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP. Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP), содержащий гидрофобную MTS, также может являться нацеливающей частью. Пептид может являться доставочным пептидом, который может проносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олинонуклеотиды, и белок, сквозь клеточные мембраны. Например, обнаружено, что последовательности из белка ВИЧ-Tat (GRKKRRQRRRPPQ) и белка дрозофилы антеннапедии (RQIKIWFQNRRMKWKK) способны функционировать как доставочные пептиды. Пептид или пептидомиметик может быть кодирован случайной последовательностью ДНК, так что пептид идентифицируется из библиотеки фагового дисплея, или комбинаторной библиотеки one-bead-one-compound (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Предпочтительно пептид или пептидомиметик, привязанный к средству иРНК через внедренное мономерное звено, представляет собой пептид, нацеливающий на клетку, такой как пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) или миметик RGD. Длина пептидной части может изменяться от примерно 5 аминокислот до примерно 40 аминокислот. Пептидная часть может иметь структурную модификацию с тем, чтобы повысить устойчивость или усилить непосредственные конформационные свойства. Можно использовать любые структурные модификации, описанные ниже.The ligand may be a peptide or a peptidomimetic. A peptidomimetic (also referred to herein as an oligopeptidomimetic) is a molecule capable of folding into a specific three-dimensional structure similar to a natural peptide. The peptide or peptidomimetic portion may be about 5-50 amino acids long, such as about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 amino acids long. The peptide or peptidomimetic may be, for example, a cell-penetrating peptide, a cationic peptide, an amphiphatic peptide, or a hydrophobic peptide (eg, consisting mainly of Tyr, Trp or Phe). The peptide portion may be a dendritic peptide, a folded peptide, or a cross-linked peptide. Alternatively, the peptide portion may include a hydrophobic membrane translocation sequence (MTS). An example of a hydrophobic MTS-containing peptide is RFGF having the amino acid sequence AAVALLPAVLLALLAP. An RFGF analog (eg, the amino acid sequence AALLPVLLAAP) containing a hydrophobic MTS may also be a targeting moiety. The peptide may be a delivery peptide that can carry large polar molecules, including peptides, olinonucleotides, and protein, across cell membranes. For example, sequences from the HIV-Tat protein (GRKKRRQRRRPPQ) and Drosophila antennapedia protein (RQIKIWFQNRRMKWKK) were found to be able to function as delivery peptides. The peptide or peptidomimetic can be encoded by a random DNA sequence such that the peptide is identified from a phage display library, or a one-bead-one-compound (OBOC) combinatorial library (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferably, the peptide or peptidomimetic linked to the mRNA agent via an inserted monomeric unit is a cell-targeting peptide, such as an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide or an RGD mimetic. The length of the peptide portion can vary from about 5 amino acids to about 40 amino acids. The peptide portion may have a structural modification in order to increase stability or enhance the immediate conformational properties. You can use any structural modifications described below.
Пептидную RGD часть можно использовать для нацеливания на опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или клетка рака молочной железы (Zizmann et al., Cancer Res., 62:513943, 2002). Пептид RGD может облегчить нацеливание средств иРНК на опухоли различных других тканей, включая легкие, почки, селезенку или печень (Aoki et al., Cancer Gene Therapy, 8:783-787, 2001). Предпочтительно пептид RGD будет облегчать нацеливание средств иРНК на почки. Пептид RGD может быть линейным или циклическим и может быть модифицирован, например гликозилирован или метилирован, для облегчения нацеливания на конкретные ткани. Например, гликозилированный пептид RGD может доставлять средство иРНК в опухолевую клетку, экспрессирующую α¥β3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Можно использовать пептиды, которые нацеливают маркеры, обогащенные в пролиферирующих клетках. Например, RGD-содержащие пептиды и пептидомиметики могут нацеливаться на раковые клетки, в частности клетки, которые выставляют интегрин. Таким образом, можно использовать пептиды RGD, циклические пептиды, содержащие RGD, пептиды RGD, которые включают D-аминокислоты, а также синтетические миметики RGD. Кроме RGD можно использовать другие части, которые нацеливаются на лиганд интегрин. Как правило, такие лиганды можно использовать для регулирования пролиферации клеток и ангиогенеза. Предпочтительны конъюгаты лигандов такого типа, которые нацеливаются на РЕСАМ-1, VEGF или другой раковый ген, например раковый ген, описанный в настоящем описании.The RGD peptide moiety can be used to target a tumor cell such as an endothelial tumor cell or a breast cancer cell (Zizmann et al., Cancer Res., 62:513943, 2002). The RGD peptide can facilitate targeting of mRNA agents to tumors of various other tissues, including lung, kidney, spleen, or liver (Aoki et al., Cancer Gene Therapy, 8:783-787, 2001). Preferably, the RGD peptide will facilitate targeting of mRNA agents to the kidneys. The RGD peptide may be linear or cyclic and may be modified, such as glycosylated or methylated, to facilitate targeting to specific tissues. For example, a glycosylated RGD peptide can deliver an mRNA agent to a tumor cell expressing α ¥ β 3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). You can use peptides that target markers enriched in proliferating cells. For example, RGD-containing peptides and peptidomimetics can target cancer cells, in particular cells that expose integrin. Thus, RGD peptides, RGD-containing cyclic peptides, RGD peptides that include D-amino acids, as well as synthetic RGD mimetics can be used. In addition to RGD, other moieties that target the integrin ligand can be used. Typically, such ligands can be used to regulate cell proliferation and angiogenesis. Ligand conjugates of the type that target PECAM-1, VEGF, or another cancer gene, such as the cancer gene described herein, are preferred.
Пептид, проникающий в клетку способен проникать в клетку, например микробную клетку, такую как бактериальная клетка или клетка гриба, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептид, проникающий в микробную клетку, может представлять собой, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или церопин Р1), пептид, содержащий дисульфидную связь (например, α-дефенсин, β-дефенсин или бактенецин), или пептид, содержащий только одну или две доминирующие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин).The cell penetrating peptide is capable of penetrating a cell, for example a microbial cell such as a bacterial cell or a fungal cell, or a mammalian cell such as a human cell. The microbial cell penetrating peptide can be, for example, an α-helical linear peptide (eg LL-37 or ceropin P1), a peptide containing a disulfide bond (eg α-defensin, β-defensin or bactenecin), or a peptide containing only one or two dominant amino acids (for example, PR-39 or indolicidin).
Пептид, проникающий в клетку, также может включать сигнал ядрышковой локализации (NLS). Например, пептид, проникающий в клетку, может представлять собой состоящий из двух частей амфипатический пептид, такой как MPG, который образован из домена слитого пептида ВИЧ-1 gp41 и NLS большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res., 31:2717-2724, 2003).A cell-penetrating peptide may also include a nucleolar localization signal (NLS). For example, the cell-penetrating peptide can be a two-part amphipathic peptide, such as MPG, which is formed from the HIV-1 gp41 fusion peptide domain and the NLS of the SV40 large T antigen (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
В одном из вариантов осуществления нацеливающий пептид может представлять собой амфипатический α-спиральный пептид. Примеры амфипатических α-спиральных пептидов включают, но ими не ограничиваются, цекропины, ликотоксины, парадаксины, буфорин, CPF, бомбининоподобный пептид (BLP), кателицидины, цератотоксины, пептиды S. clava, интестинальные антимикробные пептиды миксины (HFIAP), магаинины, бревининс-2, дермасептины, мелиттины, плевроцидин, пептиды Н2А, пептиды Xenopus, эскулентин-1 и caerins. Предпочтительно будет рассматриваться ряд факторов для поддер- 17 042669 жания целостности и устойчивости спирали. Например, будет использоваться максимальное число стабилизирующих спираль остатков (например, leu, ala или lys) и минимальное число остатков, дестабилизирующих спираль (например, пролина или звеньев циклических мономеров). Будет рассматриваться кэпирующий остаток (например, Gly является примером N-кэпирующего остатка), и/или можно использовать С-концевое амидирование для обеспечения добавочной Н-связи для стабилизации спирали. Образование солевых мостиков между остатками с противоположными зарядами, разделенных i±3 или i±4 положениями, может обеспечить устойчивость. Например, катионные остатки, такие как лизин, аргинин, гомоаргинин, орнитин или гистидин, могут образовывать солевые мостики с анионными остатками глутамата или аспартата.In one embodiment, the targeting peptide may be an amphipathic α-helical peptide. Examples of amphipathic α-helical peptides include, but are not limited to, cecropins, lycotoxins, paradaxins, buforin, CPF, bombinin-like peptide (BLP), cathelicidins, ceratotoxins, S. clava peptides, myxin intestinal antimicrobial peptides (HFIAP), magainins, brevinins- 2, dermaseptins, melittins, pleurocidin, H 2 A peptides, Xenopus peptides, esculentin-1 and caerins. Preferably, a number of factors will be considered to maintain the integrity and stability of the helix. For example, the maximum number of helix-stabilizing residues (eg, leu, ala, or lys) and the minimum number of helix-destabilizing residues (eg, proline or cyclic monomer units) will be used. A capping residue will be considered (eg, Gly is an example of an N-capping residue), and/or C-terminal amidation may be used to provide an additional H-bond to stabilize the helix. The formation of salt bridges between residues with opposite charges separated by i±3 or i±4 positions can provide stability. For example, cationic residues such as lysine, arginine, homoarginine, ornithine, or histidine can form salt bridges with anionic glutamate or aspartate residues.
Лиганды пептиды и пептидомиметики включают вещества, имеющие природное происхождение, или модифицированные пептиды, например, D- или L-пептиды; α, β или γ-пептиды; N-метилпептиды; азапептиды; пептиды с одной или несколькими амидными, т.е. пептидными, связями, замененными одной или несколькими мочевинными, тиомочевинными, карбаматными или сульфонилмочевинными связями; или циклические пептиды.Peptide ligands and peptidomimetics include naturally occurring or modified peptides such as D- or L-peptides; α, β or γ-peptides; N-methylpeptides; azapeptides; peptides with one or more amide, i.e. peptide bonds replaced by one or more urea, thiourea, carbamate or sulfonylurea bonds; or cyclic peptides.
Нацеливающий лиганд может представлять собой любой лиганд, способный нацеливаться на специфический рецептор. Примерами являются фолат, GalNAc, галактоза, манноза, манноза-6Р, кластеры Сахаров, такие как кластер GalNAc, кластер маннозы, кластер галактозы, или апатамер. Кластер представляет собой комбинацию двух или больше звеньев сахаров. Нацеливающие лиганды также включают лиганды интегриновых рецепторов, лиганды хемокиновых рецепторов, трансферрин, биотин, лиганды серотонинивых рецепторов, PSMA, эндотелии, GCPII, соматостатин, лиганды LDL и HDL. Лиганды также могут быть на основе нуклеиновой кислоты, например, аптамер. Аптамер может быть немодифицированным или иметь любую комбинацию модификаций, раскрытых в настоящем описании.The targeting ligand can be any ligand capable of targeting a specific receptor. Examples are folate, GalNAc, galactose, mannose, mannose-6P, sugar clusters such as GalNAc cluster, mannose cluster, galactose cluster, or apatamer. A cluster is a combination of two or more sugar units. Targeting ligands also include integrin receptor ligands, chemokine receptor ligands, transferrin, biotin, serotonin receptor ligands, PSMA, endothelium, GCPII, somatostatin, LDL and HDL ligands. The ligands can also be based on a nucleic acid, such as an aptamer. The aptamer may be unmodified or have any combination of the modifications disclosed herein.
Средства высвобождения из эндосом включают имидазолы, поли- или олигоимидазолы, PEI, пептиды, фузогенные пептиды, поликарбоксилаты, polyacations, маскированные олиго- или поликатионы или анионы, ацетали, полиацетали, кетали/поликетали, ортоэфиры, полимеры с маскированными или немаскированными катионными или анионными зарядами, дендриты с маскированными или немаскированными катионными или анионными зарядами.Endosome release agents include imidazoles, poly- or oligoimidazoles, PEI, peptides, fusogenic peptides, polycarboxylates, polyacations, masked oligo- or polycations or anions, acetals, polyacetals, ketals/polyketals, orthoesters, polymers with masked or unmasked cationic or anionic charges , dendrites with masked or unmasked cationic or anionic charges.
РК модулятор обозначает фармакокинетический модулятор. РК модулятор включает липофильные соединения, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, средства, связывающие белки, ПЭГ, витамины и т.п. Примеры РК модуляторов включают, но ими не ограничиваются, холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.п. Также известно, что олигонуклеотиды, которые включают несколько фосфоротиоатных связей, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды в примерно 5, 10, 15 или 20 оснований, содержащие несколько фосфоротиоатных связей в главной цепи, также соответствуют настоящему изобретению в качестве лигандов (например, в качестве РК модулирующих лигандов).PK modulator refers to a pharmacokinetic modulator. The PK modulator includes lipophilic compounds, bile acids, steroids, phospholipid analogs, peptides, protein binders, PEGs, vitamins, and the like. Examples of PK modulators include, but are not limited to, cholesterol, fatty acids, cholic acid, lithocholic acid, dialkylglycerides, diacylglycerides, phospholipids, sphingolipids, naproxen, ibuprofen, vitamin E, biotin, and the like. It is also known that oligonucleotides that include multiple phosphorothioate linkages bind to whey protein, thus short oligonucleotides, e.g., oligonucleotides of about 5, 10, 15, or 20 bases, containing multiple phosphorothioate linkages in the backbone are also in accordance with the present invention in as ligands (eg, as PK modulating ligands).
Кроме того, в качестве РК модулирующих лигандов по настоящему изобретению также соответствуют аптамеры, которые связывают сывороточные компоненты (например, сывороточные белки).In addition, aptamers that bind serum components (eg, serum proteins) are also suitable as PK modulating ligands of the present invention.
Другие конъюгаты лигандов, соответствующие изобретению, описаны в заявках на патент США USSN: 10/916185, зарегистрированной 10 августа 2004 г.; USSN: 10/946873, зарегистрированной 21 сентября 2004 г.; USSN: 10/833934, зарегистрированной 3 августа 2007 г.; USSN: 11/115989, зарегистрированной 27 апреля 2005 г.; и USSN: 11/944227, зарегистрированной 21 ноября 2007 г., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.Other ligand conjugates corresponding to the invention are described in US patent applications USSN: 10/916185, registered August 10, 2004; USSN: 10/946873, registered September 21, 2004; USSN: 10/833934, registered August 3, 2007; USSN: 11/115989, registered April 27, 2005; and USSN: 11/944227, registered Nov. 21, 2007, which are incorporated herein by reference.
Когда присутствуют два или больше лигандов, они могут иметь одинаковые свойства, все могут иметь различные свойства или некоторые лиганды имеют одинаковые свойства, в то время как другие имеют различные свойства. Например, лиганд может иметь свойства нацеливания, иметь эндосомолитическую активность или иметь РК модулирующие свойства. В предпочтительном варианте осуществления все лиганды имеют различные свойства.When two or more ligands are present, they may have the same properties, all may have different properties, or some ligands may have the same properties while others may have different properties. For example, the ligand may have targeting properties, have endosomolytic activity, or have PK modulating properties. In a preferred embodiment, all ligands have different properties.
Лиганды могут соединяться с олигонуклеотидами в различных точках, например в 3'-конце, 5'-конце и/или в промежуточном положении. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд присоединяется к олигонуклеотидам через промежуточную связку, например носитель, описанный в настоящем описании. Лиганд или привязанный лиганд может присутствовать в мономере, когда указанный мономер включают в растущую цепь. В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть включен через сочетание с мономером предшественником, после того как указанный мономер предшественник включен в растущую цепь. Например, мономер, имеющий, например, аминоконцевую группу (т.е. без ассоциированного лиганда), например ТАР-(СН2)nNH2, может быть включен в растущую олигонуклеотидную цепь. Затем при последующей операции, т.е. после включения мономера предшественника в цепь, лиганд, имеющий электрофильную группу, например пентафторфенилэфирную или альдегидную группу, может быть присоединен к мономеру предшественнику путем сочетания электрофильной группы лиганда с концевой нуклеоофильной группой связки мономера предшественника.Ligands can be linked to oligonucleotides at various points, for example at the 3' end, 5' end and/or intermediate position. In preferred embodiments, the ligand is attached to the oligonucleotides via an intermediate linkage, such as the carrier described herein. The ligand or tethered ligand may be present in the monomer when said monomer is included in the growing chain. In some embodiments, a ligand may be incorporated via coupling with a precursor monomer after said precursor monomer has been incorporated into the growing chain. For example, a monomer having, for example, an amino terminal group (ie, no associated ligand), such as TAP-(CH2) n NH2, can be included in the growing oligonucleotide chain. Then, during the subsequent operation, i.e. after incorporating the precursor monomer into the chain, a ligand having an electrophilic group such as a pentafluorophenyl ether or an aldehyde group can be attached to the precursor monomer by coupling the electrophilic group of the ligand to the terminal nucleophilic group of the linkage of the precursor monomer.
В другом примере мономер, имеющий подходящую группу для участия в реакции химии кликов,In another example, a monomer having a suitable group to participate in a click chemistry reaction,
- 18 042669 может быть включен, например, азид- или алкинконцевой связкой/линкером. При последующей операции, т.е. после включения мономера предшественника в цепь, лиганд, имеющий комплементарную химическую группу, например алкиновую или азидную, может быть присоединен к мономеру предшественнику путем сочетания алкина и азида.- 18 042669 can be included, for example, azide - or alkyne-terminal ligament/linker. During the subsequent operation, i.e. after incorporating the precursor monomer into the chain, a ligand having a complementary chemical group, such as alkyne or azide, can be attached to the precursor monomer by a combination of an alkyne and an azide.
В случае двухцепочечных олигонуклеотидов лиганды могут быть присоединены к одной или обеим цепям. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечное средство иРНК содержит лиганд, конъюгированный со смысловой цепью. В других вариантах осуществления двухцепочечное средство иРНК содержит лиганд, конъюгированный с антисмысловой цепью.In the case of double stranded oligonucleotides, the ligands may be attached to one or both strands. In some embodiments, the double-stranded mRNA agent contains a ligand conjugated to the sense strand. In other embodiments, the double-stranded mRNA agent comprises a ligand conjugated to an antisense strand.
В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть конъюгирован с нуклеотидными основаниями, частями сахаров или межнуклеозидными связями молекул нуклеиновой кислоты. Конъюгация с пуриновыми нуклеотидными основаниями или их производными может иметь место в любом положении, включая эндоциклические и экзоциклические атомы. В некоторых вариантах осуществления положения 2, 6, 7 или 8 пуринового нуклеотидного основания присоединяются к части конъюгата. Конъюгация с пиримидиновыми нуклеотидными основаниями или их производными также может происходить в любом положении. В некоторых вариантах осуществления положения 2, 5 и 6 пиримидинового нуклеотидного основания могут быть замещены частью конъюгата. Конъюгация с частями сахаров нуклеозидов может происходить по любому атому углерода. Примеры атомов углерода части сахаров, которые могут быть присоединены к части конъюгата, включают 2', 3' и 5' атомы углерода. Положение 1' также может соединяться с частью конъюгата, такой как неосновной остаток. Межнуклеозидные связи также могут нести части конъюгата. В случае фосфоросодержащих связей (например, фосфодиэфира, фосфоротиоата, фосфородитиоата, фосфороамидата и т.п.) часть конъюгата может присоединяться непосредственно в атому фосфора или к атому О, N или S, связанному с атомом фосфора. В случае амин- или амидсодержащих межнуклеозидных связей (например, PNA) часть конъюгата может присоединяться к атому азота амина или амида или к соседнему атому углерода.In some embodiments, the ligand may be conjugated to nucleotide bases, sugar moieties, or internucleoside bonds of nucleic acid molecules. Conjugation to purine nucleotide bases or derivatives thereof can take place at any position, including endocyclic and exocyclic atoms. In some embodiments, positions 2, 6, 7, or 8 of the purine nucleotide base are attached to the conjugate portion. Conjugation to pyrimidine nucleotide bases or derivatives thereof can also occur at any position. In some embodiments, positions 2, 5, and 6 of the pyrimidine nucleotide base may be replaced by a portion of the conjugate. Conjugation to the sugar moieties of nucleosides can occur at any carbon atom. Examples of the carbon atoms of the sugar portion that may be attached to the conjugate portion include 2', 3' and 5' carbon atoms. The 1' position can also be linked to a portion of the conjugate, such as a minor residue. Internucleoside bonds can also carry parts of the conjugate. In the case of phosphorus-containing bonds (eg, phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, etc.), part of the conjugate may be attached directly to the phosphorus atom or to the O, N or S atom associated with the phosphorus atom. In the case of amine- or amide-containing internucleoside bonds (eg, PNA), part of the conjugate may be attached to the nitrogen atom of the amine or amide, or to an adjacent carbon atom.
Любой подходящий в области РНК-интерференции лиганд может быть использован, хотя лиганд обычно представляет собой углевод, например моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, полисахарид.Any suitable ligand in the field of RNA interference can be used, although the ligand is usually a carbohydrate, eg a monosaccharide (such as GalNAc), a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, a polysaccharide.
Линкеры, которые конъюгируют лиганд с нуклеиновой кислотой, включают линкеры, обсужденные выше. Например, лиганд может представлять собой одно или несколько производных GalNAc (N-ацетилглюкозамин), присоединенных через двухвалентный или трехвалентный разветвленный линкер.Linkers that conjugate a ligand to a nucleic acid include the linkers discussed above. For example, the ligand may be one or more GalNAc (N-acetylglucosamine) derivatives attached via a divalent or trivalent branched linker.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению конъюгирована с двухвалентным и трехвалентным линкером, включающими структуры, показанные в любой из формул (IV)-(VII)In one embodiment, the dsRNA of the invention is conjugated to a divalent and trivalent linker comprising the structures shown in any of formulas (IV)-(VII)
при этом q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо равны в случае каждого появления 0-20, при этом повторяющееся звено может быть одним и тем же или другим;while q 2A , q 2B , q 3A , q 3B , q 4A , q 4B , q 5A , q 5B and q 5C are independently equal in the case of each occurrence of 0-20, while the repeating link may be the same or different ;
каждый P2A, Р2В, Р3А, P3B, Р4А, Р4В, Р5А, Р5В, Р5С, Т2А, Т2В, Т3А, T3B, T4A, T4B, T5A, T5B, T5C независимо в случае каждого появления отсутствует или представляет собой CO, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH2, CH2NH или СН2О;each P 2A , R 2B , R 3A , P 3B , R 4A , R 4B , R 5A , R 5B , R 5C , T 2A , T 2B , T 3A , T 3B , T 4A , T 4B , T 5A , T 5B , T 5C independently for each occurrence is absent or is CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH 2 , CH2NH or CH 2 O;
Q2A, Q2b, Q3A, Q3b, Q4A, Q4b, Q5A, Q5B, Q5C независимо в случае каждого появления отсутствуют или представляют собой алкилен, замещенный алкилен, при этом один или несколько метиленов могут прерываться или обрываться одним или несколькими О, S, S (О), SO2, N(Rn), C(R')=C(R), С=С или С(О);Q 2A , Q 2b , Q 3A , Q 3b , Q 4A , Q 4b , Q 5A , Q 5B , Q 5C independently in each occurrence are absent or represent alkylene, substituted alkylene, while one or more methylenes may be interrupted or terminated one or more O, S, S(O), SO 2 , N(R n ), C(R')=C(R), C=C or C(O);
Каждый R2A, R2b, R3A, R3B, R4A, R4b, R5A, R5B, R5C независимо в случае каждого появления отсутствует или представляет собой NH, О, S, СН2, С(О)О, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -С(О)-СН(Ra)-NH-, CO, о Н0А >S—S _ /S—S йО ΟΌOK. Of CH=N-O, ’ н ’ ’ 1 ’ или гетероциклил;Each R 2A , R 2b , R 3A , R 3B , R 4A , R 4b , R 5A , R 5B , R 5C independently in each occurrence is absent or represents NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R a )C(O), -C(O)-CH(R a )-NH-, CO, o H0 A >S-S _ /S-S o O ΟΌOK. Of CH=NO, ' n '' 1 ' or heterocyclyl;
L2A, L2b, L3A, L3b, L4A, L4b, L5A, L5B и L5C представляют собой лиганд, т.е. каждый независимо в случае каждого появления представляет собой моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид,L 2A , L 2b , L 3A , L 3b , L 4A , L 4b , L 5A , L 5B and L 5C are a ligand, i.e. each independently at each occurrence is a monosaccharide (such as GalNAc), a disaccharide, a trisaccharide,
- 19 042669 тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и- 19 042669 tetrasaccharide, oligosaccharide or polysaccharide; And
Ra представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь.R a is H or an amino acid side chain.
В частности, для использования со средствами РНКи для ингибирования экспрессии гена-мишени применимы трехвалентные конъюгирующие производные GalNAc, такие как производные формулы (VII)In particular, trivalent GalNAc conjugating derivatives such as those of formula (VII) are useful for use with RNAi agents for inhibiting target gene expression.
при этом L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.wherein L 5A , L 5B and L 5C are a monosaccharide such as a GalNAc derivative.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают, но ими не ограничиваются, следующие соединения:Examples of suitable divalent and trivalent branched linker groups conjugating GalNAc derivatives include, but are not limited to, the following compounds:
НО /0Н NO / 0N
НО 1 >NO 1 >
VV-o fVV-o f
Η О - - ° - N N ОΗ O - - ° - N N O
AcHN 0 Η НAcHN 0 Η H
нn
NHAc , NHAcNHAc, NHAc
- 20 042669- 20 042669
Определения.Definitions.
Используемые в настоящем описании термины дцРНК, миРНК и средство иРНК используются как взаимозаменяемые для средств, которые могут опосредовать сайленсинг РНК-мишени, например мРНК, например транскрипт гена, который кодирует белок. Для удобства такую мРНК в настоящем описании также относят к мРНК, которую глушат. Такой ген в настоящем описании также относят к генумишени. Как правило, РНК, которую глушат, представляет собой эндогенный ген или патогенный ген. Кроме того, РНК, иные чем мРНК, например тРНК, и вирусные РНК также могут являться мишенями.As used herein, the terms dsRNA, siRNA, and mRNA agent are used interchangeably for agents that can mediate the silencing of a target RNA, such as an mRNA, such as a gene transcript that encodes a protein. For convenience, such mRNA is also referred to herein as silencing mRNA. Such a gene is also referred to herein as a genotarget. Typically, the RNA that is silenced is an endogenous gene or a pathogenic gene. In addition, RNAs other than mRNAs, such as tRNAs, and viral RNAs can also be targets.
Используемое в настоящем описании выражение опосредует РНКи относится к способности заглушать РНК-мишень специфически для последовательности. Без связи с какой-либо теорией, полагают, что сайленсинг использует механизм или процесс РНКи и руководящую РНК, например средства миРНК из 21-23 нуклеотидов.As used herein, the expression mediates RNAi refers to the ability to silence a target RNA sequence-specifically. Without wishing to be bound by any theory, it is believed that silencing uses an RNAi mechanism or process and a guide RNA, such as a 21-23 nt siRNA means.
Как используется в настоящем описании, специфически гибридизируемый и комплементарный являются терминами, которые используют для того, чтобы показать достаточную степень комплементарности, так что имеет место устойчивое и специфическое связывание между соединением по изобретению и мишенью молекулой РНК. Специфическое связывание требует достаточной степени комплементарности для того, чтобы избежать неспецифического связывания олигомерного соединения с последовательностями не-мишенями в условиях, в которых желательно специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов или терапевтического лечения или в случае анализов in vitro в условиях, в которых анализы выполняют. Последовательности не-мишени, как правило, отличаются по меньшей мере 5 нуклеотидами.As used herein, specifically hybridizable and complementary are terms that are used to indicate a sufficient degree of complementarity such that there is a stable and specific binding between a compound of the invention and a target RNA molecule. Specific binding requires a sufficient degree of complementarity to avoid non-specific binding of the oligomeric compound to non-target sequences under conditions where specific binding is desired, ie. under physiological conditions in the case of assays or therapeutic treatment, or in the case of in vitro assays, under the conditions under which the assays are performed. Non-target sequences typically differ by at least 5 nucleotides.
В одном из вариантов осуществления средство дцРНК по изобретению является достаточно комплементарным к РНК-мишени, например мРНК-мишени, так что средство дцРНК глушит продуцирование белка, кодированного мРНК-мишенью. В другом варианте осуществления средство дцРНК по изобретениюIn one embodiment, the dsRNA agent of the invention is sufficiently complementary to the target RNA, eg the target mRNA, such that the dsRNA agent mutes the production of the protein encoded by the target mRNA. In another embodiment, the dsRNA agent of the invention
- 21 042669 является точно комплементарным к РНК-мишени, например РНК-мишень и средство дцРНК-дуплекс отжигаются, например, с образованием в участке точной комплементарности гибрида, состоящего исключительно из пар оснований по Уотсону-Крику. Достаточно комплементарная РНК-мишень может включать промежуточный участок (например, по меньшей мере из 10 нуклеотидов), который точно комплементарен РНК-мишени. Более того, в некоторых вариантах осуществления средство дцРНК по изобретению специфически различает различие в один нуклеотид. В таком случае средство дцРНК опосредует РНКи только если в участке (например, в пределах 7 нуклеотидов) с различием в один нуклеотид обнаруживается точная комплементарность.- 21 042669 is exactly complementary to the target RNA, eg the target RNA and the dsRNA duplex agent are annealed, eg to form an all Watson-Crick base-pair hybrid in the exact complementarity region. Sufficiently complementary target RNA may include an intermediate region (eg, at least 10 nucleotides) that is exactly complementary to the target RNA. Moreover, in some embodiments, the dsRNA tool of the invention specifically discriminates a single nucleotide difference. In such a case, the dsRNA agent mediates RNAi only if exact complementarity is found in a region (eg, within 7 nucleotides) with a difference of one nucleotide.
Используемый в настоящем описании термин олигонуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), например, длиной в менее 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов.As used herein, the term oligonucleotide refers to a nucleic acid molecule (RNA or DNA), for example less than 100, 200, 300 or 400 nucleotides in length.
Термин гало относится к любому радикалу фтора, хлора, брома или иода. Термин алкил относится к насыщенным и ненасыщенным неароматическим углеводородным цепям, которые могут представлять собой линейные цепи или разветвленные цепи, содержащим указанное число атомов углерода (которые включают без ограничения пропил, аллил или пропаргил), в которые могут необязательно встраиваться N, О или S. Например, Q-Сю показывает, что группа может иметь от 1 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин алкокси относится к радикалу -O-алкил. Термин алкилен относится к двухвалентному алкилу (т.е. -R-). Термин алкилендиоксо относится к двухвалентным группам структуры -O-R-O-, в которых R представляет собой алкилен. Термин аминоалкил относится к алкилу, замещенному амино. Термин меркапто относятся к радикалу -SH. Термин тиоалкокси относится к радикалу -S-алкил.The term halo refers to any fluorine, chlorine, bromine or iodine radical. The term alkyl refers to saturated and unsaturated non-aromatic hydrocarbon chains, which may be straight chains or branched chains containing the specified number of carbon atoms (which include, but is not limited to, propyl, allyl, or propargyl), into which N, O, or S may optionally be inserted. For example , Q-Cu indicates that the group can have from 1 to 10 (inclusive) carbon atoms. The term alkoxy refers to the -O-alkyl radical. The term alkylene refers to divalent alkyl (ie -R-). The term alkylenedioxo refers to divalent groups of structure -O-R-O-, in which R is alkylene. The term aminoalkyl refers to alkyl substituted with amino. The term mercapto refers to the -SH radical. The term thioalkoxy refers to the -S-alkyl radical.
Термин арил относится к моноциклической 6-углеродной или бициклической 10-углеродной ароматической системе, при этом 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил и т.п. Термин арилалкил или термин аралкил относится к алкилу, замещенному арилом. Термин арилалкокси относится к алкокси, замещенному арилом.The term aryl refers to a monocyclic 6-carbon or bicyclic 10-carbon aromatic system, wherein 0, 1, 2, 3, or 4 atoms of each ring may be substituted with a substituent. Examples of aryl groups include phenyl, naphthyl, and the like. The term arylalkyl or the term aralkyl refers to alkyl substituted with aryl. The term arylalkoxy refers to alkoxy substituted with aryl.
Термин циклоалкил, используемый в настоящем описании, включает насыщенные и частично ненасыщенные циклические углеводородные группы с 3-12 атомами углерода, например, 3-8 атомами углерода, и, например, 3-6 атомами углерода, при этом циклоалкильная группа может быть, необязательно, дополнительно замещена. Циклоалкильные группы включают без ограничения циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил и циклооктил.The term cycloalkyl as used herein includes saturated and partially unsaturated cyclic hydrocarbon groups with 3-12 carbon atoms, such as 3-8 carbon atoms, and, for example, 3-6 carbon atoms, while the cycloalkyl group may optionally be additionally replaced. Cycloalkyl groups include, without limitation, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclopentenyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cycloheptyl, and cyclooctyl.
Термин гетероарил относится к ароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической системе с 1-3 гетероатомами, если система моноциклическая, 1-6 гетероатомами, если система бициклическая, или 1-9 гетероатомами, если система трициклическая, указанные гетероатомы выбирают из О, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов О, N или S, если система моноциклическая, бициклическая или трициклическая соответственно), при этом 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолил, тиазолил и т.п. Термин гетероарилалкил или термин гетероаралкил относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин гетероарилалкокси относится к алкокси, замещенному гетероарилом.The term heteroaryl refers to an aromatic 5-8 membered monocyclic, 8-12 membered bicyclic, or 11-14 membered tricyclic system with 1-3 heteroatoms if the system is monocyclic, 1-6 heteroatoms if the system is bicyclic, or 1-9 heteroatoms , if the system is tricyclic, these heteroatoms are selected from O, N or S (for example, carbon atoms and 1-3, 1-6 or 1-9 heteroatoms O, N or S, if the system is monocyclic, bicyclic or tricyclic, respectively), while 0, 1, 2, 3 or 4 atoms of each ring may be substituted with a substituent. Examples of heteroaryl groups include pyridyl, furyl or furanyl, imidazolyl, benzimidazolyl, pyrimidinyl, thiophenyl or thienyl, quinolinyl, indolyl, thiazolyl, and the like. The term heteroarylalkyl or the term heteroaralkyl refers to alkyl substituted with heteroaryl. The term heteroarylalkoxy refers to alkoxy substituted with heteroaryl.
Термин гетероциклил относится к неароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической системе с 1-3 гетероатомами, если система моноциклическая, 1-6 гетероатомами, если система бициклическая, или 1-9 гетероатомами, если система трициклическая, указанные гетероатомы выбирают из О, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов О, N или S, если система моноциклическая, бициклическая или трициклическая соответственно), при этом 0, 1, 2 или 3 атома каждого цикла могут быть замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают тризолил, тетразолил, пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил и т.п.The term heterocyclyl refers to a non-aromatic 5-8 membered monocyclic, 8-12 membered bicyclic, or 11-14 membered tricyclic system with 1-3 heteroatoms if the system is monocyclic, 1-6 heteroatoms if the system is bicyclic, or 1-9 heteroatoms , if the system is tricyclic, these heteroatoms are selected from O, N or S (for example, carbon atoms and 1-3, 1-6 or 1-9 heteroatoms O, N or S, if the system is monocyclic, bicyclic or tricyclic, respectively), while 0, 1, 2 or 3 atoms of each ring may be substituted with a substituent. Examples of heterocyclyl groups include trizolyl, tetrazolyl, piperazinyl, pyrrolidinyl, dioxanyl, morpholinyl, tetrahydrofuranyl, and the like.
Термин оксо относится к атому кислорода, который образует карбонил, когда присоединен к углероду, N-оксид, когда присоединен к азоту, и сульфоксид или сульфон, когда присоединен к сере.The term oxo refers to the oxygen atom that forms a carbonyl when attached to carbon, an N-oxide when attached to nitrogen, and a sulfoxide or sulfone when attached to sulfur.
Термин ацил относится к алкилкарбонильному, циклоалкилкарбонильному, арилкарбонильному, гетероциклилкарбонильному или гетероарилкарбонильному заместителю, из которых любой может быть дополнительно замещен заместителем.The term acyl refers to an alkylcarbonyl, cycloalkylcarbonyl, arylcarbonyl, heterocyclylcarbonyl or heteroarylcarbonyl substituent, any of which may be further substituted with a substituent.
Термин замещенный относится к замене одного или нескольких водородных радикалов в данной структуре радикалом определенного заместителя, включая, но ими не ограничиваясь, галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил, тиол, алкилтио, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галогеналкил, амино, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоксильную группу, остаток сульфоновой кислоты, сульфонил, остаток фосфоновой кислоты, арил, гетероарил, гетероциклил или алифатическую группу. Следует иметь в виду, что заместиThe term substituted refers to the replacement of one or more hydrogen radicals in a given structure by a radical of a specific substituent, including, but not limited to, halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heterocyclyl, thiol, alkylthio, arylthio, alkylthioalkyl, arylthioalkyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonylalkyl, arylsulfonylalkyl, alkoxy, aryloxy, aralkoxy, aminocarbonyl, alkylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, haloalkyl, amino, trifluoromethyl, cyano, nitro, alkylamino, arylamino, alkylaminoalkyl, arylaminoalkyl, aminoalkylamino, bonhydroxy, alkoxycarboxyalkyl, carboxylamino, alkyl, alkoxy an aralkoxycarbonyl, a carboxyl group, a sulfonic acid residue, a sulfonyl, a phosphonic acid residue, an aryl, a heteroaryl, a heterocyclyl, or an aliphatic group. It should be borne in mind that replace
- 22 042669 тель также может быть замещенным.- 22 042669 body can also be substituted.
Расщепляемые связывающие группы.Split linking groups.
Расщепляемая связывающая группа представляет собой группу, которая достаточно устойчива вне клетки, но которая после внедрения в клетку-мишень расщепляется с высвобождением двух частей, удерживаемых вместе линкером. В предпочтительном варианте осуществления расщепляемая связывающая группа расщепляется по меньшей мере в 10 раз или больше, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз быстрее в клетке-мишени или в первом стандартном условии (которое можно выбрать, например, как имитирующее или представляющее внутриклеточные условия), чем в крови индивида или во втором стандартном условии (которое можно выбрать, например, как имитирующее или представляющее условия в крови или сыворотке).A cleavable linking group is a group that is sufficiently stable outside the cell, but which, upon introduction into the target cell, is cleaved to release two moieties held together by the linker. In a preferred embodiment, the cleavable linking group is cleaved at least 10 times or more, preferably at least 100 times faster in the target cell or in the first standard condition (which can be chosen to mimic or represent intracellular conditions, for example) than in the individual's blood, or in a second standard condition (which may be selected, for example, to mimic or represent conditions in blood or serum).
Расщепляемые связывающие группы чувствительны к средствам расщепления, например, рН, окислительно-восстановительному потенциалу или наличию разрушающих молекул. Как правило, средства расщепления внутри клеток преобладают или обнаруживаются на более высоких уровнях или активностях, чем в сыворотке или крови. Примеры таких разрушающих средств включают окислительновосстановительные средства, которые выбирают для определенных субстратов или которые не имеют специфичности к субстрату, включая, например, окисляющие или восстанавливающие ферменты или восстановители, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушить поддающуюся окислительно-восстановительному расщеплению связывающую группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например средства, которые дают рН пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой связывающую группу путем действия как обычная кислота, пептидазы (которые могут являться субстратспецифическими) и фосфатазы.Cleavable linking groups are sensitive to cleavage agents, such as pH, redox potential, or the presence of destructive molecules. As a rule, cleavage agents within cells predominate or are found at higher levels or activities than in serum or blood. Examples of such disruptive agents include redox agents that are selected for particular substrates or that are not substrate specific, including, for example, oxidizing or reducing enzymes or reducing agents, such as mercaptans, present in cells that can degrade the redox-cleavable linking group. by recovery; esterases; endosomes or agents that can create an acidic environment, such as agents that give a pH of five or less; enzymes that can hydrolyze or degrade an acid-cleavable linking group by acting like normal acid, peptidases (which may be substrate-specific) and phosphatases.
Расщепляемая связывающая группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчива к рН. Величина рН сыворотки человека 7,4, в то время как средний внутриклеточный рН несколько ниже, колеблясь в интервале примерно 7,1-7,3. Эндосомы имеют более кислый рН в интервале 5,5-6,0, и лизосомы имеют даже более кислый рН примерно 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется при предпочтительном рН, причем посредством этого из лиганда высвобождается катионный липид внутрь клетки или в нужный компартмент клетки.A cleavable linking group, such as a disulfide bond, may be pH sensitive. The pH value of human serum is 7.4, while the average intracellular pH is slightly lower, fluctuating in the range of about 7.1-7.3. Endosomes have a more acidic pH in the range of 5.5-6.0, and lysosomes have an even more acidic pH of about 5.0. Some linkers will have a cleavable linking group that cleaves at a preferred pH, thereby releasing the cationic lipid from the ligand into the interior of the cell or into the desired compartment of the cell.
Линкер может включать расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется определенным ферментом. Тип расщепляемой связывающей группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, которая является мишенью. Например, лиганды, нацеленные на печень, могут быть соединены с катионными липидами через линкер, который включает сложноэфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, и поэтому линкер будет расщепляться эффективнее в клетках печени, чем в клетках типов, которые не богаты эстеразами. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легкого, корковое вещество почек и яичко.The linker may include a cleavable linking group that is cleavable by a specific enzyme. The type of cleavable linking group included in the linker may depend on the target cell. For example, liver-targeting ligands can be linked to cationic lipids via a linker that includes an ester group. Liver cells are rich in esterases and therefore the linker will be cleaved more efficiently in liver cells than in cell types that are not rich in esterases. Other cell types rich in esterases include lung cells, renal cortex, and testes.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно использовать, когда типы клеток-мишеней богаты пептидазами, например клетки печени и синовиоциты.Linkers that contain peptide bonds can be used when target cell types are rich in peptidases, such as liver cells and synoviocytes.
Вообще пригодность кандидата в расщепляемую связывающую группу можно оценить путем проверки возможности разрушающего средства (или условия) расщеплять кандидата в связывающую группу. Также будет желательна проверка кандидата в расщепляемую связывающую группу также на способность сопротивляться расщеплению в крови или при контакте с другой тканью, не являющейся мишенью. Таким образом можно определить относительную чувствительность к расщеплению при первом и втором условии, где первое выбирают как показывающее расщепление в клетке-мишени, и второе выбирают как показывающее расщепление в других тканях или биологических жидкостях, например крови или сыворотке. Оценки можно осуществить в бесклеточных системах, в клетках, в клеточной культуре, в культуре органа или ткани или на интактных животных. Может быть полезно провести начальную оценку в бесклеточной среде или в условиях культивирования и подтвердить дополнительными оценками на интактных животных. В предпочтительных вариантах осуществления применимые соединения-кандидаты расщепляются по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий в клетке) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий вне клетки).In general, the suitability of a cleavable linking group candidate can be assessed by testing the ability of a disruptive agent (or condition) to cleave the linking group candidate. It would also be desirable to test the cleavable linking group candidate also for its ability to resist cleavage in the blood or upon contact with other non-target tissue. In this way, the relative sensitivity to cleavage under the first and second condition can be determined, where the first is chosen to indicate cleavage in the target cell and the second is chosen to indicate cleavage in other tissues or body fluids, eg blood or serum. Assessments can be made in cell-free systems, in cells, in cell culture, in organ or tissue culture, or in intact animals. It may be useful to conduct an initial assessment in cell-free or culture conditions and confirm with additional assessments in intact animals. In preferred embodiments, candidate candidate compounds are cleaved at least 2, 4, 10, or 100 times faster in a cell (or under in vitro conditions selected to mimic cellular conditions) compared to blood or serum (or under in vitro conditions). , chosen to simulate conditions outside the cell).
Связывающие группы, расщепляемые в условиях окисления-восстановления.Linking groups cleavable under redox conditions.
Одним из классов расщепляемых связывающих групп являются связывающие группы, расщепляемые в условиях окисления-восстановления. Примером связывающей группы, расщепляемой при восстановлении, является дисульфидная связывающая группа (-S-S-). Для того чтобы определить, является ли кандидат в расщепляемую связывающую группу подходящим для связывающей группы, расщепляемой при восстановлении или, например, подходящим для использования с определенной частью иРНК и определенным нацеливающим средством, можно рассмотреть способы, описанные в настоящем описании. Например, кандидата можно оценить путем инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем с использованием реагентов, известных в данной области, которые имитируют скорость расщепления, которую можно было бы наблюдать в клетке, например клетке-мишени. Кандидатов также можно оценить в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке. В предпочOne class of cleavable linking groups are linking groups that are cleavable under redox conditions. An example of a linking group cleavable upon reduction is a disulfide linking group (-S-S-). In order to determine whether a candidate cleavable linking group is suitable for a linking group that is cleavable upon reduction, or, for example, suitable for use with a certain part of the mRNA and a certain targeting agent, one can consider the methods described in the present description. For example, a candidate can be assessed by incubation with dithiothreitol (DTT) or other reducing agent using reagents known in the art that mimic the rate of degradation that would be observed in a cell, eg a target cell. Candidates can also be evaluated under conditions that are chosen to mimic conditions in blood or serum. In preferred
- 23 042669 тительном варианте осуществления соединения-кандидаты расщепляются в крови самое большее на 10%. В предпочтительных вариантах осуществления применимые соединения-кандидаты разрушаются по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий в клетке) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных для имитации условий вне клетки). Скорость расщепления соединений-кандидатов можно определить с использованием стандартных ферментных кинетических анализов в условиях, выбранных для имитации внутриклеточной среды, и сравнения с условиями, выбранными для имитации внеклеточной среды.- 23 042669 In a potent embodiment, the candidate compounds are cleaved in the blood by at most 10%. In preferred embodiments, candidate candidate compounds are degraded at least 2, 4, 10, or 100 times faster in the cell (or under in vitro conditions selected to mimic cellular conditions) compared to blood (or under in vitro conditions selected to mimic conditions outside the cell). The rate of degradation of candidate compounds can be determined using standard enzymatic kinetic assays under conditions chosen to mimic the intracellular environment and compared to conditions chosen to mimic the extracellular environment.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфатов.Cleavable linking groups based on phosphates.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфатов расщепляются средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примерами средств, которые расщепляют фосфатную группу в клетках, являются ферменты в клетках, такие как фосфатазы. Примерами связывающих групп на основе фосфатов являются -О-Р(О)(ORk)-О-, -О-Р(S)(ORk)-О-, -О-Р(S)(sRk)-О-, -S-P(O) (ORk)-O-, -О-Р(О) (ORk)-S-, -S-P(O) (ORk)-S-, -О-Р (S) (ORk)-S-, -S-P(S) (ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O) (Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительными являются -ОP(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным является -О-Р(О)(ОН)-О-. Таких кандидатов можно оценивать с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.Cleavable phosphate-based linking groups are cleaved by agents that destroy or hydrolyze the phosphate group. Examples of agents that cleave the phosphate group in cells are enzymes in cells such as phosphatases. Examples of phosphate-based linking groups are -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(sRk)-O-, - S-P(O) (ORk)-O-, -O-P(O) (ORk)-S-, -S-P(O) (ORk)-S-, -O-P (S) (ORk)-S- , -S-P(S) (ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, - S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O) (Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Preferred are -OP(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P (O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O )(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Preferred is -O-P(O)(OH)-O-. Such candidates may be evaluated using methods similar to those described above.
Связывающие группы, расщепляемые кислотой.Linking groups cleavable by acid.
Связывающие группы, расщепляемые кислотой, представляют собой группы, которые расщепляются в кислой среде. В предпочтительных вариантах осуществления связывающие группы, расщепляемые кислотой, расщепляются в кислой среде с рН примерно 6,5 или ниже (например, примерно 6,0, 5,5, 5,0 или ниже), или средствами, такими как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке специфические органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить условия расщепления для связывающих групп, расщепляемых кислотой. Примеры связывающих групп, расщепляемых кислотой, включают, но не ограничиваются указанным, гидразоны, сложные эфиры и эфиры аминокислот. Группы, расщепляемые кислотой, могут иметь общую формулу -C=NN-, С(О)О или -ОС(О). Предпочтительным является воплощение, когда углерод, присоединенный к кислороду сложноэфирной (или алкокси) группы, представляет собой углерод арильной группы, замещенной алкильной группы или третичной алкильной группы, такой как диметилпентил или трет-бутил. Таких кандидатов можно оценивать с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.Acid-cleavable linking groups are groups that are cleavable in an acidic environment. In preferred embodiments, acid-cleavable linking groups are cleaved in an acidic environment at a pH of about 6.5 or less (e.g., about 6.0, 5.5, 5.0 or less), or by means such as enzymes that can act like a normal acid. In the cell, specific low pH organelles such as endosomes and lysosomes can provide cleavage conditions for acid-cleavable linking groups. Examples of acid-cleavable linking groups include, but are not limited to, hydrazones, esters, and amino acid esters. Acid cleavable groups may have the general formula -C=NN-, C(O)O or -OC(O). It is preferred that the carbon attached to the oxygen of the ester (or alkoxy) group is an aryl, substituted alkyl or tertiary alkyl group such as dimethylpentyl or t-butyl. Such candidates may be evaluated using methods similar to those described above.
Связывающие группы на основе сложных эфиров.Linking groups based on esters.
Расщепляемые связывающие группы на основе сложных эфиров расщепляются в клетках ферментами, такими как эстеразы и амидазы. Примеры расщепляемых связывающих групп на основе сложных эфиров включают, но не ограничиваются указанным, эфиры алкиленовых, алкениленовых и алкиниленовых групп. Эфирные расщепляемые связывающие группы имеют общую формулу -С(О)О- или -ОС(О)-. Таких кандидатов можно оценить с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше.Cleavable ester linking groups are cleaved in cells by enzymes such as esterases and amidases. Examples of cleavable ester linking groups include, but are not limited to, esters of alkylene, alkenylene, and alkynylene groups. Ether cleavable linking groups have the general formula -C(O)O- or -OC(O)-. Such candidates can be evaluated using methods similar to those described above.
Расщепляющиеся группы на основе пептидовCleavable groups based on peptides
Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов расщепляются в клетках ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами, с образованием олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.п.) и полипептидов.Cleavable peptide-based linking groups are cleaved in cells by enzymes such as peptidases and proteases. Peptide-based cleavable linking groups are peptide bonds formed between amino acids to form oligopeptides (eg, dipeptides, tripeptides, etc.) and polypeptides.
Расщепляемые группы на основе пептидов не включают аминогруппу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любым алкиленом, алкениленом или алкиниленом. Пептидная связь является особым типом амидной связи, образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептида обычно ограничивается пептидной связью (т.е. амидной связью), образованной между аминокислотами с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов имеют общую формулу -NHCHRaC(O)NHCRbC(O)-, где RA и RB представляют собой группы R двух соседних аминокислот. Таких кандидатов можно оценить с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше. Используемый в настоящем описании термин углевод относится к соединению, которое или само по себе является углеводом, состоящим из одного или нескольких моносахаридных звеньев, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими), с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или соединение, имеющее в качестве своей части углеводную часть, состоящую из одного или нескольких моносахаридных звеньев, причем каждое имеет по меньшей мере 6 атомов углерода (которое может быть линейным, разветвленным или циклическим), с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Характерные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие примерно 4-9 моносахаридных звеньев) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Конкретные сахариды включают C5 и высшие (предпочтительно, С5-С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара, имеющие два или три моносахаридных звена (предпочтительно, C5-C8).Cleavable groups based on peptides do not include an amino group (-C(O)NH-). The amide group may be formed between any alkylene, alkenylene or alkynylene. A peptide bond is a special type of amide bond formed between amino acids to form peptides and proteins. A peptide-based cleavable group is generally limited to the peptide bond (ie, amide bond) formed between amino acids to form peptides and proteins, and does not include the entire amide functional group. Peptide-based cleavable linking groups have the general formula -NHCHR a C(O)NHCR b C(O)-, where R A and R B are the R groups of two adjacent amino acids. Such candidates can be evaluated using methods similar to those described above. As used herein, the term carbohydrate refers to a compound which, either by itself, is a carbohydrate consisting of one or more monosaccharide units having at least 6 carbon atoms (which may be linear, branched, or cyclic), with an oxygen, nitrogen, or sulfur associated with each carbon atom; or a compound having as its part a carbohydrate moiety consisting of one or more monosaccharide units, each having at least 6 carbon atoms (which may be linear, branched or cyclic), with an oxygen, nitrogen or sulfur atom associated with each a carbon atom. Representative carbohydrates include sugars (mono-, di-, tri-, and oligosaccharides containing about 4-9 monosaccharide units) and polysaccharides such as starches, glycogen, cellulose, and polysaccharide gums. Specific saccharides include C 5 and higher (preferably C5-C8) sugars; di- and trisaccharides include sugars having two or three monosaccharide units (preferably C 5 -C 8 ).
- 24 042669- 24 042669
Альтернативные варианты осуществления.Alternative embodiments.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций в три последовательных нуклеотида, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления в антисмысловой цепи или возле нее. Каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи модифицирован. Модификации в смысловой цепи и антисмысловой цепи, в каждой независимо, включают по меньшей мере две различные модификации.In another embodiment, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides. The sense strand contains at least one motif of three identical modifications of three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs occurs at or near a cleavage site in the antisense strand. Each nucleotide in the sense strand and antisense strand is modified. The modifications in the sense strand and the antisense strand, each independently, include at least two different modifications.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления в антисмысловой цепи или вблизи него. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах. Структура модификации антисмысловой цепи смещена на один или больше нуклеотидов относительно структуры модификации смысловой цепи.In another embodiment, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides. The sense strand contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs occurs at or near a cleavage site in the antisense strand. The antisense strand contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides. The structure of the modification of the antisense strand is shifted by one or more nucleotides relative to the structure of the modification of the sense strand.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, когда по меньшей мере один из мотивов встречается в сайте расщепления или вблизи него в цепи и по меньшей мере один из мотивов встречается в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления или вблизи него в цепи и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом.In another embodiment, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides. A sense strand contains at least two motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides when at least one of the motifs occurs at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs occurs in another part of the strand that is separated from the motif at the cleavage site by at least one nucleotide. The antisense strand contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs is located on another portion of the strand that is separated from the motif at or near the cleavage site by at least one nucleotide.
В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 14-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере два мотива из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи или вблизи него и по меньшей мере один из мотивов расположен в другой части цепи, которая отделена от мотива в сайте расщепления или вблизи него по меньшей мере одним нуклеотидом. Модификация в мотиве, расположенном в сайте расщепления в смысловой цепи, отличается от модификации в мотиве, расположенном в сайте расщепления или вблизи него в антисмысловой цепи. В другом варианте осуществления изобретение относится к средству дцРНК, способному ингибировать экспрессию гена-мишени. Средство дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждая цепь имеет 12-30 нуклеотидов. Смысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где по меньшей мере один из мотивов расположен в сайте расщепления в цепи. Антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метильных модификаций на трех последовательных нуклеотидах.In another embodiment, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 14-30 nucleotides. The sense strand contains at least two motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs is located on another part of the strand that is separated from the motif at the cleavage site by at least one nucleotide. The antisense strand contains at least one motif of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at or near a cleavage site in the strand and at least one of the motifs is located on another portion of the strand that is separated from the motif at or near the cleavage site by at least one nucleotide. A modification in a motif located at a cleavage site in the sense strand is different from a modification in a motif located at or near the cleavage site in the antisense strand. In another embodiment, the invention relates to a dsRNA agent capable of inhibiting the expression of a target gene. The dsRNA tool contains a sense strand and an antisense strand, with each strand having 12-30 nucleotides. The sense strand contains at least one motif of three 2'-F modifications on three consecutive nucleotides, where at least one of the motifs is located at a cleavage site in the strand. The antisense strand contains at least one motif of three 2'-O-methyl modifications on three consecutive nucleotides.
Смысловая цепь также может содержать один или больше мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один или больше дополнительных мотивов встречаются в другой части цепи, которая отделена от трех 2'-F модификаций в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. Антисмысловая цепь также может содержать один или больше мотивов из трех идентичных модификаций на трех последовательных нуклеотидах, где один или больше дополнительных мотивов расположены в другой части цепи, которая отделена от трех 2'-О-метильных модификаций в сайте расщепления по меньшей мере одним нуклеотидом. По меньшей мере один из нуклеотидов, имеющих модификацию 2'-F, может образовывать пару оснований с одним нуклеотидом, имеющим 2'-О-метильную модификацию.The sense strand may also contain one or more motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where one or more additional motifs occur on another portion of the strand that is separated from the three 2'-F modifications at the cleavage site by at least one nucleotide. The antisense strand may also contain one or more motifs of three identical modifications on three consecutive nucleotides, where one or more additional motifs are located on another portion of the strand that is separated from the three 2'-O-methyl modifications at the cleavage site by at least one nucleotide. At least one of the nucleotides having the 2'-F modification can form a base pair with one nucleotide having the 2'-O-methyl modification.
В одном из вариантов осуществления дцРНК по изобретению вводят в буфере.In one embodiment, the dsRNA of the invention is administered in a buffer.
В одном из вариантов осуществления соединения миРНК, описанные в настоящем описании, могут быть включены в препарат для введения индивиду. Композиция миРНК может находиться в различных состояниях. В некоторых примерах композиция по меньшей мере частично является кристаллической, однородно кристаллической и/или безводной (например, воды меньше 80, 50, 30, 20 или 10%). В другом примере миРНК находится в водной фазе, например в растворе, который включает воду.In one embodiment, the siRNA compounds described herein may be formulated for administration to an individual. The siRNA composition can be in different states. In some examples, the composition is at least partially crystalline, uniformly crystalline, and/or anhydrous (eg, less than 80%, 50%, 30%, 20%, or 10% water). In another example, the siRNA is in an aqueous phase, such as in a solution that includes water.
Водные или кристаллические композиции можно, например, включить в среду для доставки, например, в липосому (особенно в случае водной фазы) или частицу (например, микрочастицу, что можетAqueous or crystalline compositions can, for example, be incorporated into a delivery medium, such as a liposome (especially in the case of an aqueous phase) or a particle (e.g., a microparticle, which can
- 25 042669 быть подходящим для кристаллической композиции). Как правило, композицию миРНК получают способом, который совместим с предполагаемым способом введения, описанным в настоящем описании. Например, в отдельных вариантах осуществления композицию получают по меньшей мере одним из следующих способов: сушка распылением, лиофилизация, вакуумная сушка, выпаривание, сушка в псевдоожиженном слое или комбинация таких методов; или обработкой ультразвуком с липидом, сушкой вымораживанием, кондансацией и другой самосборкой.- 25 042669 be suitable for the crystalline composition). Typically, an siRNA composition is prepared in a manner that is compatible with the intended route of administration described herein. For example, in certain embodiments, the implementation of the composition receive at least one of the following methods: spray drying, lyophilization, vacuum drying, evaporation, drying in a fluidized bed, or a combination of such methods; or sonication with lipid, freeze-drying, condensation, and other self-assembly.
Препарат миРНК можно получить в комбинации с другим средством, например другим терапевтическим средством или средством, который стабилизирует миРНК, например белком, который образует комплекс с миРНК с образованием иРНК. Другие средства также включают хелаторы, например ЭДТК (например, для удаления двухвалентных катионов, таких как Mg2+), соли, ингибиторы РНКаз (например, ингибитор РНКазы широкой специфичности, такой как RNAsin) и т.п.An siRNA preparation can be made in combination with another agent, such as another therapeutic agent, or an agent that stabilizes the siRNA, such as a protein that complexes with the siRNA to form an mRNA. Other agents also include chelators such as EDTA (eg to remove divalent cations such as Mg 2+ ), salts, RNase inhibitors (eg a broad specificity RNase inhibitor such as RNAsin), and the like.
В одном из вариантов осуществления препарат миРНК содержит другое соединение миНК, например вторую миРНК, которая опосредует РНКи в отношении второго гена и в отношении того же гена. Другой препарат может содержать по меньшей мере три, пять, десять, двадцать, пятьдесят, сто или больше различных видов миРНК. Такие миРНК могут опосредовать РНКи в отношении подобного числа различных генов.In one embodiment, the siRNA preparation contains another siRNA compound, such as a second siRNA, that mediates RNAi for a second gene and for the same gene. Another preparation may contain at least three, five, ten, twenty, fifty, one hundred or more different types of siRNA. Such miRNAs can mediate RNAi for a similar number of different genes.
В одном из вариантов осуществления препарат миРНК содержит по меньшей мере второе терапевтическое средство (например, средство иное, чем РНК или ДНК). Например, композиция миРНК для лечения вирусного заболевания, например ВИЧ, может содержать известное противовирусное средство (например, ингибитор протеаз или ингибитор обратной транскриптазы). В другом примере композиция миРНК для лечения рака может дополнительно содержать химиотерапевтическое средство.In one embodiment, the siRNA preparation contains at least a second therapeutic agent (eg, an agent other than RNA or DNA). For example, an siRNA composition for treating a viral disease, such as HIV, may contain a known antiviral agent (eg, a protease inhibitor or a reverse transcriptase inhibitor). In another example, an siRNA composition for cancer treatment may further comprise a chemotherapeutic agent.
Примеры препаратов обсуждаются ниже.Examples of formulations are discussed below.
Липосомы.Liposomes.
Для простоты описания препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако следует иметь в виду, что такие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Соединение миРНК, например соединение двухцепочечная миРНК, или соединение кмиРНК (ssiRNA) (например, предшественник, например более крупное соединение миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечной миРНК, или соединения кмиРНК, или его предшественника) можно ввести в препарат для доставки в совокупности мембранных молекул, например липосоме или мицелле. Используемый в настоящем описании термин липосома относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, расположенных по меньшей мере в одном бислое, например одном бислое или нескольких бислоях. Липосомы включают униламеллярные и полиламеллярные везикулы, которые имеют оболочку, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю часть. Водная часть содержит композицию миРНК. Липофильный материал изолирует водную внутреннюю часть от водного наружного окружения, которое, как правило, не включает композицию миРНК, хотя в некоторых примерах это может иметь место. Липосомы применимы для переноса и доставки активных ингредиентов в место действия. Поскольку липосомная оболочка структурно схожа с биологическими мембранами, то когда липосомы применяют к ткани, липосомный бислой сливается с клеточными мембранами. Так как слияние липосомы и клетки продолжается, внутреннее водное содержимое, которое включает миРНК, доставляется в клетку, где миРНК может специфически связываться с РНК-мишенью и может опосредовать РНКи. В некоторых случаях липосомы также являются специфически нацеленными, например, для направления миРНК в определенные типы клеток.For ease of description, the preparations, compositions, and methods in this section are mostly discussed in relation to unmodified siRNA compounds. However, it should be appreciated that such formulations, compositions, and methods may be carried out with other siRNA compounds, such as modified siRNAs, and such practices are within the scope of the invention. An siRNA compound, such as a double-stranded siRNA compound, or a csiRNA compound (ssiRNA) (e.g., a precursor, such as a larger siRNA compound that can be processed to a csiRNA compound, or a DNA that encodes an siRNA compound, such as a double-stranded siRNA or csiRNA compound, or its precursor) can be formulated to be delivered in an aggregate of membrane molecules, such as a liposome or micelle. As used herein, the term liposome refers to a vesicle composed of amphiphilic lipids arranged in at least one bilayer, such as one or more bilayers. Liposomes include unilamellar and polylamellar vesicles, which have a shell formed from a lipophilic material and an aqueous interior. The aqueous portion contains the siRNA composition. The lipophilic material isolates the aqueous interior from the aqueous exterior, which generally does not include the composition of the siRNA, although this may be the case in some instances. Liposomes are useful for carrying and delivering active ingredients to the site of action. Because the liposomal envelope is structurally similar to biological membranes, when liposomes are applied to tissue, the liposome bilayer fuses with cell membranes. As the liposome-cell fusion continues, the internal water content, which includes the siRNA, is delivered to the cell, where the siRNA can specifically bind to the target RNA and can mediate RNAi. In some cases, liposomes are also specifically targeted, for example to target siRNAs to certain cell types.
Липосому, содержащую миРНК, можно получить различными способами. В одном из примеров липидный компонент липосомы растворяют в детергенте, так что образуются мицеллы с липидным компонентом. Например, липидный компонент может представлять собой амфипатический катионный липид или конъюгат липида. Детергент может иметь высокую критическую концентрацию мицелл и может быть неионогенным. Примеры детергентов включают холаты, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Затем препарат миРНК добавляют к мицеллам, которые включают липидный компонент. Катионные группы липида взаимодействуют с миРНК и конденсируются вокруг миРНК с образованием липосомы. После конденсации детергент удаляют, например, диализом и получают липосомный препарат миРНК.The siRNA-containing liposome can be obtained in various ways. In one example, the lipid component of the liposome is dissolved in a detergent such that micelles are formed with the lipid component. For example, the lipid component may be an amphipathic cationic lipid or a lipid conjugate. The detergent may have a high critical micelle concentration and may be non-ionic. Examples of detergents include cholates, CHAPS, octylglucoside, deoxycholate, and lauroylsarcosine. The siRNA preparation is then added to micelles that include a lipid component. The cationic groups of the lipid interact with the siRNA and condense around the siRNA to form a liposome. After condensation, the detergent is removed, for example by dialysis, and a siRNA liposomal preparation is obtained.
При необходимости во время реакции конденсации можно добавить соединение-носитель, которое способствует конденсации, например, путем регулируемого добавления. Например, носитель может представлять собой полимер иной, чем нуклеиновая кислота (например, спермин или спермидин). Также можно регулировать рН для благоприятной конденсации.If necessary, a carrier compound can be added during the condensation reaction which promotes condensation, for example by controlled addition. For example, the carrier may be a polymer other than a nucleic acid (eg, spermine or spermidine). You can also adjust the pH for favorable condensation.
Дополнительное описание способов получения устойчивых везикул для доставки полинуклеотидов, которые содержат комплекс полинуклеотид/катионный липид как структурный компонент доставочной везикулы, приводится, например, в WO 96/37194. Образование липосом также может включать один или несколько аспектов описанных примеров методов из Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:74137417, 1987; патент США № 4897355; патент США № 5171678; Bangham et al., M. Mol. Biol., 23:238, 1965;Further description of methods for producing stable polynucleotide delivery vesicles that contain a polynucleotide/cationic lipid complex as a structural component of the delivery vesicle is given, for example, in WO 96/37194. The formation of liposomes may also include one or more aspects of the described exemplary methods from Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:74137417, 1987; US patent No. 4897355; US patent No. 5171678; Bangham et al., M. Mol. Biol., 23:238, 1965;
- 26 042669- 26 042669
Olson et al., Biochem. Biophys. Acta, 557:9, 1979; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:4194, 1978; Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984; Kim et al., Biochem. Biophys. Acta, 728:339, 1983; и Fukunaga et al., Endocrinol., 115:757, 1984. Обычно используемые методы получения липидных агрегатов соответствующего размера для использования в доставочных везикулах включают ультразвуковую обработку и замораживание-оттаивание плюс экструзия (см., например, Mayer et al., Biochem. Biophys. Acta, 858:161, 1986). Когда требуются сообразно небольшие (50-200 нм) и относительно однородные агрегаты, можно использовать микрофлюидизацию (Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984). Такие способы легко адаптируются для упаковки препаратов миРНК в липосомы.Olson et al., Biochem. Biophys. Acta, 557:9, 1979; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4194, 1978; Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984; Kim et al., Biochem. Biophys. Acta, 728:339, 1983; and Fukunaga et al., Endocrinol., 115:757, 1984. Commonly used methods to obtain appropriately sized lipid aggregates for use in delivery vesicles include sonication and freeze-thaw plus extrusion (see, for example, Mayer et al., Biochem. Biophys Acta 858:161 (1986). When suitably small (50-200 nm) and relatively uniform aggregates are required, microfluidization can be used (Mayhew et al., Biochem. Biophys. Acta, 775:169, 1984). Such methods are readily adaptable for packaging siRNA preparations into liposomes.
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают молекулы нуклеиновой кислоты, а не комплекс с ними. Так как молекулы нуклеиновой кислоты, так и липид заряжены подобным образом, происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее некоторые молекулы нуклеиновой кислоты захватываются водной внутренней частью таких липосом. Липосомы, которые являются рН-чувствительными, используют для доставки кодирующей ген тимидинкиназы ДНК в клеточные слои в монокультуре. В клетках-мишенях обнаружена экспрессия экзогенного гена (Zhou et al., Journal of Controlled Realease, 19 (1992), 269-274).Liposomes that are pH sensitive or negatively charged trap nucleic acid molecules rather than complex with them. Since the nucleic acid molecules and the lipid are similarly charged, repulsion occurs rather than complex formation. However, some nucleic acid molecules are captured by the aqueous interior of such liposomes. Liposomes that are pH sensitive are used to deliver the DNA encoding the thymidine kinase gene to cell layers in monoculture. Exogenous gene expression was found in target cells (Zhou et al., Journal of Controlled Realease, 19 (1992), 269-274).
Один основной тип липосомной композиции включает иные фосфолипиды, чем фосфатидилхолин природного происхождения. Нейтральные липосомные композиции можно получить, например, из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции, как правило, получают из димиристоилфосфатидилглицерина, в то время как анионные фузогенные липосомы получают преимущественно из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомной композиции получают из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, соевый PC и яичный PC. Еще один тип получают из смесей фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.One main type of liposome composition includes phospholipids other than naturally occurring phosphatidylcholine. Neutral liposome formulations can be prepared, for example, from dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) or dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC). Anionic liposomal formulations are typically prepared from dimyristoylphosphatidylglycerol, while anionic fusogenic liposomes are predominantly prepared from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE). Another type of liposome composition is derived from phosphatidylcholine (PC), such as, for example, soy PC and egg PC. Another type is obtained from mixtures of phospholipid and/or phosphatidylcholine and/or cholesterol.
Примеры других способов введения липосом в клетки in vitro приводятся в патенте США № 5283185, патенте США № 5171678, WO 94/00569, WO 93/24640, WO 91/16024, Feigner, J. Biol. Chem., 169:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther., 3:649, 1992; Gershon, Biochem., 32:7143, 1993; и Strauss, EMBO J., 11:417, 1992.Examples of other methods for introducing liposomes into cells in vitro are given in US patent No. 5283185, US patent No. 5171678, WO 94/00569, WO 93/24640, WO 91/16024, Feigner, J. Biol. Chem. 169:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther., 3:649, 1992; Gershon, Biochem., 32:7143, 1993; and Strauss, EMBO J., 11:417, 1992.
В одном из вариантов осуществления используют катионные липососмы. Катионные липосомы обладают преимуществом способности сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы хотя не способны сливаться так эффективно с плазматической мембраной, in vivo захватываются макрофагами и могут использоваться для доставки миРНК макрофагам.In one embodiment, cationic liposomes are used. Cationic liposomes have the advantage of being able to fuse with the cell membrane. Non-cationic liposomes, although not able to fuse as efficiently with the plasma membrane, are taken up by macrophages in vivo and can be used to deliver siRNA to macrophages.
Другие преимущества липосом включают следующее: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биоразлагаемыми; липосомы могут включать широкий ряд водо- и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные в их внутренних компартментах миРНК от метаболизма и деградации (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, vol. 1, p. 245). Важными соображениями при получении липосомных композиций являются поверхностный заряд липида, размер везикул и водный объем липосом.Other advantages of liposomes include the following: liposomes derived from natural phospholipids are biocompatible and biodegradable; liposomes can include a wide variety of water- and fat-soluble drugs; liposomes can protect siRNAs encapsulated in their internal compartments from metabolism and degradation (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, vol. 1, p. 245). Important considerations in the preparation of liposome compositions are the surface charge of the lipid, the size of the vesicles, and the water volume of the liposomes.
Положительно заряженный синтетический катионный липид хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]N,N,N-триметиламмония (DOTMA) можно использовать для получения небольших липосом, которые взаимодействуют спонтанно с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липид-нуклеиновая кислота, которые способны сливаться с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры ткани, что приводит к доставке миРНК (см., например, Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:7413-7417, 1987; и патент США № 4897355 с описанием DOTMA и его использования с ДНК).The positively charged synthetic cationic lipid N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) can be used to prepare small liposomes that interact spontaneously with nucleic acid to form lipid-nucleic acid complexes that are able to fuse with negatively charged cell membrane lipids of tissue culture cells resulting in siRNA delivery (see, e.g., Feigner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:7413-7417, 1987; and US Pat. No. 4,897,355 describing DOTMA and its use with DNA).
Аналог DOTMA 1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмиак)пропан (DOTAP) можно использовать в комбинации с фосфолипидом с образованием содержащих комплекс ДНК везикул. Липофектин™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) является эффективным средством для доставки высоко анионных нуклеиновых кислот в клетки живой культуры ткани, которые включают положительно заряженные DOTMA-липосомы, которые взаимодействуют спонтанно с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Когда используют достаточно положительно заряженные липосомы, суммарный заряд на полученных комплексах также является положительным. Положительно заряженные комплексы, полученные таким путем, спонтанно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты в, например, клетки культуры ткани. Другой коммерчески доступный катионный липид 1,2-бис(олеилокси)-3,3-(триметиламмиак)пропан (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianpolis, Indiana) отличается от DOTMA в том, что олеоильные части соединены сложноэфирными, а не простыми эфирными связями.The DOTMA analog 1,2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonia)propane (DOTAP) can be used in combination with a phospholipid to form complexed DNA vesicles. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) is an effective agent for delivering highly anionic nucleic acids into living tissue culture cells that include positively charged DOTMA liposomes that interact spontaneously with negatively charged polynucleotides to form complexes. When sufficiently positively charged liposomes are used, the net charge on the resulting complexes is also positive. The positively charged complexes produced in this way spontaneously attach to negatively charged cell surfaces, fuse with the plasma membrane, and efficiently deliver functional nucleic acids to, for example, tissue culture cells. Another commercially available cationic lipid, 1,2-bis(oleyloxy)-3,3-(trimethylammonia)propane (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianpolis, Ind.) differs from DOTMA in that the oleoyl moieties are linked by ester rather than ether linkages. .
Другие описанные катионные липиды включают соединения, которые конъюгированы с различными частями, включая, например, карбоксиспермин, который конъюгируют с одним из двух типов липидов, и включает соединения, такие как диоктаолеоиламид 5-карбоксиспермилглицина (DOGS) (трансфектам™, Promega, Madison, Wisconsin) и 5-карбоксиспермиламид дипальмитоилфосфатидилэтаноламиOther cationic lipids described include compounds that are conjugated to various moieties, including, for example, carboxyspermine, which is conjugated to one of two types of lipids, and includes compounds such as 5-carboxyspermylglycine dioctoleoilamide (DOGS) (transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin ) and 5-carboxyspermylamide with dipalmitoylphosphatidylethanols
- 27 042669 на (DPPES) (см., например, патент США № 5171678).- 27 042669 to (DPPES) (see, for example, US patent No. 5171678).
Другой конъюгат катионного липида включает продукт дериватизации липида холестерином (DCChoi), который вводят в липосомы в комбинации с DOPE (см. Gao X. and Huang L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280, 1991). Сообщается, что липополилизин, полученный конъюгацией полилизина с DOPE, является эффективным для трансфекции в присутствии сыворотки (Zhou X. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1065:8, 1991). Иными словами, для некоторых клеточных линий такие липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, показывают меньшую токсичность и обеспечивают более эффективную трансфекцию, чем DOTMA-содержащие композиции. Другие коммерчески доступные продукты катионные липиды включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) и липофектамин (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и wO 96/37194.Another cationic lipid conjugate includes a cholesterol lipid derivatization product (DCChoi) which is formulated into liposomes in combination with DOPE (see Gao X. and Huang L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280, 1991). Lipopolylysin obtained by conjugation of polylysine with DOPE is reported to be effective for transfection in the presence of serum (Zhou X. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1065:8, 1991). In other words, for some cell lines, such liposomes containing conjugated cationic lipids show less toxicity and provide more efficient transfection than DOTMA-containing compositions. Other commercially available cationic lipid products include DMRIE and DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) and Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Other cationic lipids suitable for delivery of oligonucleotides are described in WO 98/39359 and wO 96/37194.
Липосомные препараты особенно подходят для местного введения, и липосомы имеют некоторые преимущества перед другими препаратами. Такие преимущества включают накопление введенного лекарственного средства в нужной мишени и возможность вводить миРНК в кожу. При некоторых осуществлениях липосомы используют для доставки миРНК в эпидермальные клетки и также для усиления пенетрации миРНК в кожные ткани, например, в кожу. Например, липосомы можно применять местно. Местная доставка в кожу лекарственных средств, полученных в виде липосом, описана в документах (см., например, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2, 405-410; и du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino R.J. and Fould-Fogerite S., Biotechniques, 6:682-690, 1988; Itani T. et al., Gene, 56:267-276, 1987; Nicolau С. et al. , Meth. Enz., 149:157-176, 1987; Straubinger R.M. and Papahadjopoulos D., Meth. Enz., 101:512-527, 1983; Wang C.Y. and Huang L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:78517855, 1987).Liposomal preparations are particularly suitable for topical administration, and liposomes have some advantages over other preparations. Such advantages include the accumulation of the injected drug in the desired target and the ability to introduce siRNA into the skin. In some embodiments, liposomes are used to deliver siRNA to epidermal cells and also to enhance siRNA penetration into skin tissues, such as skin. For example, liposomes can be applied topically. Topical delivery to the skin of drugs prepared as liposomes has been documented (see, for example, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2, 405-410; and du Plessis et al., Antiviral Research , 18, 1992, 259-265; Mannino R. J. and Fould-Fogerite S., Biotechniques, 6:682-690, 1988; Itani T. et al., Gene, 56:267-276, 1987; Nicolau C. et al. , Meth. Enz., 149:157-176, 1987; Straubinger R. M. and Papahadjopoulos D., Meth. Enz., 101:512-527, 1983; Wang C. Y. and Huang L., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84:78517855, 1987).
Неионные липосомные системы также проверяли для определения их полезности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности системы, включающие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные препараты, содержащие новасом I (простой 10-стеариловый эфир глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилена) и новасом II (простой 10-стеариловый эфир глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилена) использовали для доставки лекарственного средства в дерму кожи мыши. Такие препараты с миРНК применимы для лечения дерматологического расстройства.Non-ionic liposome systems have also been tested to determine their usefulness for drug delivery to the skin, in particular systems comprising a non-ionic surfactant and cholesterol. Non-ionic liposome preparations containing novas I (glyceryl dilaurate/cholesterol/polyoxyethylene 10-stearyl ether) and novas II (glyceryl distearate/cholesterol/polyoxyethylene 10-stearyl ether) were used to deliver the drug to the mouse skin dermis. Such siRNA preparations are useful in the treatment of a dermatological disorder.
Липосомы, которые включают миРНК, могут быть получены как поддающиеся высокой деформации. Такая способность к деформации может позволить липосомам проникать сквозь пору, которая меньше, чем средний радиус липосомы. Например, трансферсомы представляют собой тип липосом, поддающихся деформации. Трансферсомы можно получить, добавляя активаторы поля поверхности, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы, которые включают миРНК, могут быть доставлены, например, подкожно, путем инъекции, для того, чтобы доставить миРНК в кератиноциты в коже. Для того чтобы пройти интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через ряд тонких пор, каждая диаметром менее 50 нм, под влиянием подходящего трансдермального градиента. Кроме того, из-за свойств липидов такие трансферсомы могут быть самооптимизирующимися (адаптивными к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися и обычно могут достигать своих мишеней без фрагментации, а также часто самозаряжающимися.Liposomes that include siRNA can be obtained as highly deformable. Such deformability may allow liposomes to penetrate through a pore that is smaller than the average radius of the liposome. For example, transfersomes are a type of liposomes that can be deformed. Transfersomes can be prepared by adding surface field activators, typically surfactants, to a standard liposomal formulation. Transfersomes that include siRNAs can be delivered, for example, subcutaneously, by injection, in order to deliver siRNAs to keratinocytes in the skin. In order to pass through intact mammalian skin, lipid vesicles must pass through a series of fine pores, each less than 50 nm in diameter, under the influence of a suitable transdermal gradient. In addition, due to the properties of lipids, such transfersomes can be self-optimizing (adaptive to the shape of the pores, for example, in the skin), self-healing and can usually reach their targets without fragmentation, and often self-charging.
Другие препараты, подходящие для настоящего изобретения, описаны в предварительных заявках на патент США, регистрационные № 61/018616, зарегистрирована 2 января 2008 г., 61/018611, зарегистрирована 2 января 2008 г., 61/039748, зарегистрирована 26 марта 2008 г., 61/047087, зарегистрирована 22 апреля 2008 г., и 61/051528, зарегистрирована 8 мая 2008 г. В заявке РСТ № PCT/US2007/080331, зарегистрированной 3 октября 2007 г., также описываются препараты, подходящие для настоящего изобретения.Other formulations suitable for the present invention are described in U.S. Provisional Applications Ser. , 61/047087, filed April 22, 2008, and 61/051528, filed May 8, 2008. PCT Application No. PCT/US2007/080331, filed October 3, 2007, also describes formulations suitable for the present invention.
Поверхностно-активные вещества.Surfactants.
Для простоты описания препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако следует иметь в виду, что такие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в композициях, таких как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы (см. выше). Композиции миРНК (или предшественника, например более крупной дцРНК, которая может быть процессирована до миРНК, или ДНК, которая кодирует миРНК или предшественника) могут включать поверхностно-активное вещество. В одном из вариантов осуществления миРНК находится в препарате в виде эмульсии, которая включает поверхностно-активное вещество. Самым общим способом классификации и оценки свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ как природных, так и синтетических является использование гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ). Характер гидрофильной группы дает наиболее применимое средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, используемых в препаратах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).For ease of description, the preparations, compositions, and methods in this section are mostly discussed in relation to unmodified siRNA compounds. However, it should be appreciated that such formulations, compositions, and methods may be carried out with other siRNA compounds, such as modified siRNAs, and such practices are within the scope of the invention. Surfactants find wide use in formulations such as emulsions (including microemulsions) and liposomes (see above). The siRNA (or precursor, eg, larger dsRNA that can be processed into an siRNA, or DNA that encodes the siRNA or precursor) compositions may include a surfactant. In one embodiment, the siRNA is in an emulsion formulation that includes a surfactant. The most common way to classify and evaluate the properties of many different types of surfactants, both natural and synthetic, is to use the hydrophilic-lipophilic balance (HLB). The nature of the hydrophilic group provides the most useful means of categorizing the various surfactants used in formulations (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не является ионизированной, оно классифицируIf the surfactant molecule is not ionized, it is classified
- 28 042669 ется как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических продуктах и применимы в широком интервале значений рН. Обычно значения их ГЛБ колеблются от 2 до примерно 18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры также включены в такой класс. Полиоксиэтилированные поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными членами класса неионогенных поверхностно-активных веществ.- 28 042669 is available as a non-ionic surfactant. Nonionic surfactants find wide use in pharmaceutical products and are applicable over a wide pH range. Typically their HLB values range from 2 to about 18 depending on their structure. Nonionic surfactants include nonionic esters such as ethylene glycol esters, propylene glycol esters, glyceryl esters, polyglyceryl esters, sorbitan esters, sucrose esters, and ethoxylated esters. Nonionic alkanolamides and ethers such as fatty alcohol ethoxylates, propoxylated alcohols and ethoxylated/propoxylated block copolymers are also included in this class. Polyoxyethylene surfactants are the most common members of the nonionic surfactant class.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицруется как анионогенное. Анионогенные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты и фосфаты. Наиболее значительными членами класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.If a surfactant molecule carries a negative charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as anionic. Anionic surfactants include carboxylates such as soaps, acyl lactylates, amino acid acylamides, sulfuric acid esters such as alkyl sulfates and ethoxylated alkyl sulfates, sulfonates such as alkyl benzene sulfonates, acyl isethionates, acyl taurates and sulfosuccinates, and phosphates. The most significant members of the class of anionic surfactants are alkyl sulfates and soaps.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицруется как катионогенное. Катионогенные поверхностно-активные вещества включают четвертичные аммониевые соли и этоксилированные амины. Четвертичные аммониевые соли являются наиболее применимыми членами этого класса.If a surfactant molecule carries a positive charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as cationic. Cationic surfactants include quaternary ammonium salts and ethoxylated amines. Quaternary ammonium salts are the most useful members of this class.
Если молекула поверхностно-активного вещества имеет способность нести положительный или отрицательный заряд, поверхностно-активное вещество классифицруется как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.If the surfactant molecule has the ability to carry a positive or negative charge, the surfactant is classified as amphoteric. Amphoteric surfactants include acrylic acid derivatives, substituted alkyl amides, N-alkyl betaines, and phosphatides.
Использование поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, препаратах и эмульсиях рассматривается Rieger в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285.The use of surfactants in drug products, preparations and emulsions is reviewed by Rieger in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285.
Мицеллы и другие мембранные препараты.Micelles and other membrane preparations.
Для простоты описания мицеллярные и другие препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако понятно, что такие мицеллярные и другие препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. Композиция соединения миРНК, например соединения двухцепочечной миРНК, или соединения кмиРНК (ssiRNA) (например, предшественника, например, более крупного соединения миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечную миРНК, или соединения кмиРНК, или его предшественника) может быть предоставлена в мицеллярном препарате. В настоящем описании мицеллы определяются как определенный тип скопления молекул, в котором амфипатические молекулы располагаются в сферической структуре, так что все гидрофобные части молекул направлены внутрь, оставляя гидрофильные части в контакте с окружающей водной фазой. Существует обратное расположение, если окружающая среда является гидрофобной.For ease of description, micellar and other preparations, compositions and methods in this section are mostly discussed in relation to unmodified siRNA compounds. However, it is understood that such micellar and other preparations, compositions and methods can be carried out with other siRNA compounds, such as modified siRNAs, and such practice is within the scope of the invention. Composition of an siRNA compound, e.g., a double-stranded siRNA compound, or a csiRNA compound (ssiRNA) (e.g., a precursor, e.g., a larger siRNA compound that can be processed to a csiRNA compound, or a DNA that encodes an siRNA compound, such as a double-stranded siRNA, or csiRNA compound , or its predecessor) can be provided in a micellar preparation. As used herein, micelles are defined as a particular type of aggregation of molecules in which amphipathic molecules are arranged in a spherical structure such that all hydrophobic portions of the molecules are directed inwards, leaving the hydrophilic portions in contact with the surrounding aqueous phase. There is a reverse arrangement if the environment is hydrophobic.
Смешанный мицеллярный препарат, подходящий для доставки через кожные мембраны, можно получить путем смешивания водного раствора композиции миРНК, (C8-C1o)алкилсульфата щелочного металла и мицеллообразующего соединения. Примеры мицеллообразующих соединений включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, экстракт ромашки, огуречный экстракт, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло энотеры, ментол, тригидроксиоксохолонилглицин и его фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, простые полиоксиэтиленэфиры и их аналоги, простые полидоканолалкилэфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Мицеллообразующие соединения могут быть добавлены одновременно или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы будут образовываться по существу при любом виде смешивания ингредиентов, но при энергичном перемешивании обеспечиваются мицеллы меньшего размера.A mixed micelle preparation suitable for delivery across skin membranes can be prepared by mixing an aqueous solution of an siRNA composition, an alkali metal (C 8 -C 1 o)alkyl sulfate, and a micelle-forming compound. Examples of micelle forming compounds include lecithin, hyaluronic acid, pharmaceutically acceptable salts of hyaluronic acid, glycolic acid, lactic acid, chamomile extract, cucumber extract, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, monoolein, monooleates, monolaurates, borage oil, evening primrose oil, menthol, trihydroxyoxocholonylglycine and its pharmaceutically acceptable salts, glycerol, polyglycerol, lysine, polylysine, triolein, polyoxyethylene ethers and analogs thereof, polydocanol alkyl ethers and analogs thereof, chenodeoxycholate, deoxycholate and mixtures thereof. The micelle-forming compounds may be added simultaneously or after the addition of the alkali metal alkyl sulfate. Mixed micelles will form with essentially any kind of mixing of the ingredients, but with vigorous agitation, smaller micelles are provided.
В одном из способов получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию миРНК и, по меньшей мере, алкилсульфат щелочного металла. Затем первую мицеллярную композицию смешивают по меньшей мере с тремя мицеллообразующими соединениями для образования смешанной мицеллярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают, смешивая при энергичном перемешивании композицию миРНК, алкилсульфат щелочного металла и по меньшей мере одно из мицеллообразующих соединений и затем добавляя остальные мицеллообразующие соединения.In one method, a first micellar composition is prepared that contains an siRNA composition and at least an alkali metal alkyl sulfate. The first micellar composition is then mixed with at least three micelle-forming compounds to form a mixed micellar composition. In another method, a micellar composition is prepared by mixing the siRNA composition, alkali metal alkyl sulfate and at least one of the micelle forming compounds with vigorous stirring and then adding the remaining micelle forming compounds.
В смешанную мицеллярную композицию можно добавлять фенол и/или м-крезол для стабилизации препарата и защиты от роста бактерий. С другой стороны, фенол и/или м-крезол можно добавлять с мицеллообразующими ингредиентами. Изотоническое средство, такое как глицерин, можно добавлять поPhenol and/or m-cresol can be added to the mixed micellar composition to stabilize the formulation and protect against bacterial growth. On the other hand, phenol and/or m-cresol can be added with micellar ingredients. An isotonic agent such as glycerin may be added at
- 29 042669 сле образования смешанной мицеллярной композиции.- 29 042669 after the formation of a mixed micellar composition.
Для доставки мицеллярной композиции в виде спрея препарат может быть помещен в аэрозольный дозатор, и в дозатор загружают пропеллент. Пропеллент, который находится под давлением, в дозаторе находится в жидкой форме. Соотношения ингредиентов регулируют таким образом, чтобы водная и пропеллентная фазы становились одной фазой, т.е. чтобы была одна фаза. Если существуют две фазы, необходимо встряхивать дозатор перед распылением порции содержимого, например, через мерный клапан. Распыляемая доза фармацевтического средства выталкивается из мерного клапана мелкими брызгами.To deliver the micellar composition as a spray, the formulation may be placed in an aerosol dispenser and the propellant loaded into the dispenser. The pressurized propellant in the dispenser is in liquid form. The ratios of the ingredients are adjusted so that the aqueous and propellant phases become one phase, i.e. to have one phase. If there are two phases, it is necessary to shake the dispenser before spraying a portion of the contents, for example, through a metering valve. The nebulized dose of the pharmaceutical agent is pushed out of the metering valve in fine sprays.
Пропелленты могут включать водородсодержащие хлорфторуглероды, водородсодержащие фторуглероды, диметиловый эфир и диэтиловый эфир. В некоторых вариантах осуществления может быть использован HFA 134а (1,1,1,2-тетрафторэтан).Propellants may include hydrogen-containing chlorofluorocarbons, hydrogen-containing fluorocarbons, dimethyl ether, and diethyl ether. In some embodiments, HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroethane) may be used.
Конкретные концентрации необходимых ингредиентов могут быть определены относительно простым опытным путем. Для всасывания в полости рта дозировку обычно желательно повысить, например, по меньшей мере в два или три раза по сравнению с дозировкой для инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.Specific concentrations of the required ingredients can be determined by relatively simple experience. For oral absorption, it is generally desirable to increase the dosage, for example, at least two or three times the dosage for injection or administration through the gastrointestinal tract.
Частицы.Particles.
Для простоты описания частицы, препараты, композиции и способы в данном разделе большей частью обсуждаются в отношении немодифицированных соединений миРНК. Однако можно понять, что такие частицы, препараты, композиции и способы могут быть осуществлены с другими соединениями миРНК, например модифицированными миРНК, и такая практика входит в изобретение. В другом варианте осуществления препараты соединения миРНК, например соединения двухцепочечной миРНК или соединения кмиРНК (например, предшественника, например более крупного соединения миРНК, которое может быть процессировано до соединения кмиРНК, или ДНК, которая кодирует соединение миРНК, например двухцепочечную миРНК, или соединение кмиРНК, или его предшественника) могут быть включены в частицу, например микрочастицу. Микрочастицы можно получить распылительной сушкой, но также можно получить другими способами, включая лиофилизацию, выпаривание, сушку в псевдоожиженном слое, вакуумную сушку, или комбинацией таких методов.For ease of description, the particles, preparations, compositions, and methods in this section are mostly discussed in relation to unmodified siRNA compounds. However, it can be understood that such particles, preparations, compositions and methods can be carried out with other siRNA compounds, such as modified siRNAs, and such practice is within the scope of the invention. In another embodiment, preparations of an siRNA compound, such as a double-stranded siRNA compound or a csiRNA compound (e.g., a precursor, such as a larger siRNA compound that can be processed to a csiRNA compound, or a DNA that encodes an siRNA compound, such as a double-stranded siRNA compound, or a csiRNA compound, or its predecessor) may be included in a particle, such as a microparticle. Microparticles can be obtained by spray drying, but can also be obtained by other methods, including lyophilization, evaporation, fluid bed drying, vacuum drying, or a combination of such methods.
Фармацевтические композиции.pharmaceutical compositions.
Средства миРНК по изобретению могут быть введены в композиции для фармацевтического применения. Фармацевтически приемлемые композиции содержат терапевтически эффективное количество одного или нескольких средств дцРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, взятые одни или в композиции с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями (добавками), эксципиентами и/или разбавителями.The siRNA agents of the invention may be formulated for pharmaceutical use. Pharmaceutically acceptable compositions comprise a therapeutically effective amount of one or more dsRNA agents according to any of the preceding embodiments, taken alone or in composition with one or more pharmaceutically acceptable carriers (additives), excipients and/or diluents.
Фармацевтические композиции могут быть составлены специально для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для следующего:Pharmaceutical compositions may be formulated specifically for administration in solid or liquid form, including forms adapted for the following:
(1) перорального введения, например формы для вливания (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, имеющие целью трансбуккальное, сублингвальное и системное всасывание, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык;(1) oral administration, eg infusion forms (aqueous or non-aqueous solutions or suspensions), tablets, eg intended for buccal, sublingual and systemic absorption, boluses, powders, granules, pastes for application to the tongue;
(2) парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидермальной инъекции, например, в виде стерильного раствора, или суспензии, или препарата с отсроченным высвобождением;(2) parenteral administration, for example, by subcutaneous, intramuscular, intravenous or epidermal injection, for example, in the form of a sterile solution or suspension or delayed release formulation;
(3) местного введения, например, в виде крема, мази, или пэтча с регулируемым высвобождением, или спрея, наносимого на кожу;(3) topical administration, for example, in the form of a cream, ointment, or controlled release patch or spray applied to the skin;
(4) интравагинального или интраректального введения, например, в виде пессария, крема или пенки;(4) intravaginal or intrarectal administration, for example, in the form of a pessary, cream or foam;
(5) сублингвального введения;(5) sublingual administration;
(6) внутриглазного введения;(6) intraocular administration;
(7) трансдермального введения; или (8) назального введения.(7) transdermal administration; or (8) nasal administration.
Доставка с использованием подкожного или внутривенного способа может быть особенно предпочтительной.Delivery using the subcutaneous or intravenous route may be particularly preferred.
Выражение терапевтически эффективное количество, используемое в настоящем описании, обозначает количество соединения, материала или композиции, включающих соединение по изобретению, которое является эффективным, для того чтобы вызывать некоторый желательный терапевтический эффект в, по меньшей мере, субпопуляции клеток у животного при разумном соотношении польза/опасность, приемлемом для любого лечения лекарственными препаратами.The term "therapeutically effective amount" as used herein means the amount of a compound, material or composition comprising a compound of the invention that is effective to produce some desired therapeutic effect in at least a subset of cells in an animal at a reasonable benefit/benefit ratio. hazard acceptable for any drug treatment.
Выражение фармацевтически приемлемый используется в настоящем описании как относящееся к таким соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в пределах разумной медицинской оценки подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, при разумном соотношении польза/опасность.The expression pharmaceutically acceptable is used herein to refer to those compounds, materials, compositions and/or dosage forms which, within reasonable medical judgment, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reaction or other problem, or complications, with a reasonable benefit / danger ratio.
Выражение фармацевтически приемлемый носитель, используемое в настоящем описании, обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или среду, такую как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, вспомогательное вещество при получении (например, смазываюThe term "pharmaceutically acceptable carrier" as used herein means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle such as a liquid or solid excipient, diluent, excipient, preparation aid (e.g., lubricating
- 30 042669 щее вещество, тальк, стеараты магния, кальция или цинка или стеариновая кислота) или инкапсулирующий растворитель материал, вовлеченные в перемещение или перенос соединения в организме индивида из одного органа или части организма в другой орган или часть организма. Каждый носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и не наносить вред пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза;- 30 042669 general substance, talc, magnesium, calcium or zinc stearates or stearic acid) or solvent encapsulating material involved in the movement or transfer of the compound in the body of an individual from one organ or part of the body to another organ or part of the body. Each carrier must be acceptable in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation and not harmful to the patient. Some examples of materials that can serve as pharmaceutically acceptable carriers include (1) sugars such as lactose, glucose and sucrose;
(2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал;(2) starches such as corn starch and potato starch;
(3) целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы;(3) cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate;
(4) измельченный трагакант;(4) crushed tragacanth;
(5) солод;(5) malt;
(6) желатин;(6) gelatin;
(7) смазывающие вещества, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк;(7) lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and talc;
(8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев;(8) excipients such as cocoa butter and suppository waxes;
(9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, сезамовое масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло;(9) oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil;
(10) гликоли, такие как пропиленгликоль;(10) glycols such as propylene glycol;
(11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль;(11) polyols such as glycerol, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol;
(12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат;(12) esters such as ethyl oleate and ethyl laurate;
(13) агар;(13) agar;
(14) буферирующие вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия;(14) buffering agents such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide;
(15) альгиновую кислоту;(15) alginic acid;
(16) апирогенную воду;(16) pyrogen-free water;
(17) изотоничный солевой раствор;(17) isotonic saline solution;
(18) раствор Рингера;(18) Ringer's solution;
(19) этиловый спирт;(19) ethyl alcohol;
(20) рН-буферные растворы;(20) pH buffer solutions;
(21) сложные полиэфиры, поликарбонат и/или полиангидриды;(21) polyesters, polycarbonate and/or polyanhydrides;
(22) наполнители, такие как полипептиды и аминокислоты;(22) excipients such as polypeptides and amino acids;
(23) сывороточный компонент, такой как сывороточный альбумин, HDL и LDL; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических препаратах.(23) a serum component such as serum albumin, HDL and LDL; and (22) other non-toxic compatible substances used in pharmaceutical preparations.
Препараты могут быть представлены для удобства в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любыми способами, известными в области фармации. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения единой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от реципиента, которого лечат и определенного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения единой лекарственной формы, как правило, будет таким количеством соединения, которое вызывает терапевтический эффект. Как правило, в одной сотне процентов такое количество будет изменяться от примерно 0,1% до примерно 99% активного ингредиента, предпочтительно от примерно 5% до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 10% до примерно 30%.The formulations may, for convenience, be presented in unit dosage form and may be prepared by any means known in the art of pharmacy. The amount of active ingredient that can be combined with the carrier material to form a single dosage form will vary depending on the recipient being treated and the particular route of administration. The amount of active ingredient that can be combined with the carrier material to form a single dosage form will generally be that amount of the compound that produces a therapeutic effect. Typically, in one hundred percent, such an amount will vary from about 0.1% to about 99% active ingredient, preferably from about 5% to about 70%, most preferably from about 10% to about 30%.
В некоторых вариантах осуществления препарат по настоящему изобретению содержит эксципиент, выбранный из группы, состоящей из циклодекстринов, целлюлоз, липосом, мицеллообразующих средств, например желчных кислот, и полимерных носителей, например сложных полиэфиров и полиангидридов, и соединение по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанный препарат придает пероральную биодоступность соединению по настоящему изобретению.In some embodiments, the formulation of the present invention comprises an excipient selected from the group consisting of cyclodextrins, celluloses, liposomes, micelle forming agents, such as bile acids, and polymeric carriers, such as polyesters and polyanhydrides, and a compound of the present invention. In some embodiments, the above formulation imparts oral bioavailability to a compound of the present invention.
Препарат средства миРНК может содержать комбинацию с другим средством, например другими терапевтическим средством или веществом, которое стабилизирует иРНК, например белком, который образует комплекс с иРНК с образованием iRNP. Кроме того, другие средства включают хелаторы, например ЭДТК (например, для удаления двухвалентных катионов, таких как Mg2+), соли, ингибиторы РНКаз (например, ингибитор РНКазы широкой специфичности, такой как RNAsin) и т.п.An siRNA agent preparation may comprise a combination with another agent, such as another therapeutic agent, or a substance that stabilizes the mRNA, such as a protein that forms a complex with the mRNA to form an iRNP. In addition, other agents include chelators such as EDTA (eg, to remove divalent cations such as Mg 2+ ), salts, RNase inhibitors (eg, a broad specificity RNase inhibitor such as RNAsin), and the like.
Способы получения таких препаратов или композиций включают стадию приведения соединения по настоящему изобретению в сочетание с носителем и необязательно одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Как правило, препараты получают путем равномерного приведения соединения по настоящему изобретению в тесный контакт с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или теми и другими и последующим при необходимости формованием продукта.Methods for preparing such preparations or compositions include the step of bringing a compound of the present invention into association with a carrier and optionally one or more accessory ingredients. Typically, formulations are prepared by uniformly bringing a compound of the present invention into intimate contact with liquid carriers or finely divided solid carriers, or both, and then shaping the product if necessary.
В некоторых случаях, для того чтобы пролонгировать действие лекарственного средства, желательно замедлить поглощение лекарственного средства из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно выполнить за счет использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, имеющего плохую растворимость в воде. Тогда скорость абсорбции лекарственного средства зависит от скорости растворения в воде, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. С другой стороны, замедленную абсорбцию парентерально введенного лекарственногоIn some cases, in order to prolong the effect of a drug, it is desirable to slow the absorption of the drug from subcutaneous or intramuscular injection. This can be done by using a liquid suspension of crystalline or amorphous material having poor water solubility. Then the rate of absorption of the drug depends on the rate of dissolution in water, which, in turn, may depend on the size of the crystals and the crystalline form. On the other hand, delayed absorption of a parenterally administered drug
- 31 042669 средства можно получить, растворяя или суспендируя лекарственное средство в масляной среде.- 31 042669 funds can be obtained by dissolving or suspending the drug in an oil medium.
Соединения по изобретению могут быть включены в составы для введения любым удобным путем для использования в медицине или ветеринарии по аналогии с другими фармацевтическими препаратами.The compounds of the invention may be formulated for administration by any convenient route for human or veterinary use in analogy to other pharmaceutical preparations.
Термин лечение предназначен для обозначения также профилактики, лечения и исцеления. Пациентом, получающим такое лечение, является любое животное, нуждающееся в этом, включая приматов, в частности человека, и других млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, свиньи и овцы, и домашнюю птицу и всех домашних животных.The term treatment is intended to mean also prevention, treatment and healing. The patient receiving such treatment is any animal in need thereof, including primates, in particular humans, and other mammals such as horses, cattle, pigs and sheep, and poultry and all domestic animals.
Двухцепочечные средства РНКи получают в клетке in vivo, например, из экзогенных ДНК-матриц, которые доставляются в клетку. Например, ДНК-матрицы могут быть встроены в векторы и использованы в качестве векторов генной терапии. Векторы генной терапии могут быть доставлены индивиду, например, внутривенной инъекцией, местным введением (патент США № 5328470) или стереотаксической инъекцией (см., например, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать вектор генной терапии в приемлемом разбавителе или может включать матрицу медленного высвобождения, в которую вставлена доставочная среда для гена. ДНК-матрицы, например, могут включать две единицы транскрипции, из которых одна продуцирует транскрипт, который включает верхнюю цепь средства дцРНК, и другая продуцирует транскрипт, который включает нижнюю цепь средства дцРНК. Когда матрицы транскрибируют, средство дцРНК продуцируется и процессируется в фрагменты средства миРНК, которые опосредуют сайленсинг гена.Double-stranded RNAi agents are produced in the cell in vivo, for example, from exogenous DNA templates that are delivered to the cell. For example, DNA templates can be inserted into vectors and used as gene therapy vectors. Gene therapy vectors can be delivered to the individual, for example, by intravenous injection, topical administration (US Pat. No. 5,328,470), or stereotaxic injection (see, for example, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 : 3054-3057). A pharmaceutical formulation of a gene therapy vector may include the gene therapy vector in a suitable diluent, or may include a slow release matrix into which a gene delivery medium is inserted. DNA templates, for example, may include two transcription units, of which one produces a transcript that includes the upper strand of the dsRNA agent and the other produces a transcript that includes the lower strand of the dsRNA agent. When the templates are transcribed, the dsRNA agent is produced and processed into fragments of the siRNA agent that mediate gene silencing.
Пути доставки.Shipping ways.
Композиция, которая включает иРНК, может быть доставлена индивиду различными путями. Примеры путей включают внутривенный, подкожный, местный, ректальный, анальный, вагинальный, назальный, легочный, глазной.A composition that includes an mRNA can be delivered to an individual in a variety of ways. Examples of routes include intravenous, subcutaneous, topical, rectal, anal, vaginal, nasal, pulmonary, ocular.
Молекулы иРНК по изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции, как правило, содержат один или несколько видов иРНК и фармацевтически приемлемый носитель. Используемая в настоящем описании формулировка фармацевтически приемлемый носитель предназначена для включения любого и всех растворителей, диспергирующих сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, средств изотоничности и средств, замедляющих абсорбцию, и т.п., совместимых с фармацевтическим введением. Использование таких сред и средств с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области. Их использование в композиции предполагается за исключением случая, когда любая обычная среда или средство несовместимы с активным соединением. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.The mRNA molecules of the invention may be included in pharmaceutical compositions suitable for administration. Such compositions typically contain one or more types of mRNA and a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the formulation of a pharmaceutically acceptable carrier is intended to include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonicity and absorption delaying agents, and the like, compatible with pharmaceutical administration. The use of such media and agents with pharmaceutically active substances is well known in the art. Their use in the composition is contemplated unless any conventional medium or agent is incompatible with the active compound. Additional active compounds may also be included in the compositions.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить рядом способов в зависимости от того, желательно локальное или системное лечение, и участка, который обрабатывают. Введение может быть местным (включая офтальмическое, вагинальное, ректальное, интраназальное, трансдермальное), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает капельное внутривенное вливание, подкожную, интраперитонеальную или внутримышечную инъекцию или интратекальное или интравентрикулярное введение.The compositions of the present invention can be administered in a number of ways depending on whether local or systemic treatment is desired and the site being treated. Administration may be topical (including ophthalmic, vaginal, rectal, intranasal, transdermal), oral or parenteral. Parenteral administration includes intravenous drip, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, or intrathecal or intraventricular administration.
Путь и место введения могут быть выбраны для усиления нацеливания. Например, для того чтобы попасть в мышечные клетки, логичным выбором может быть внутримышечная инъекция в мышцы, представляющие интерес. В клетки легких можно попасть путем введения иРНК в аэрозольной форме. В сосудистые эндотелиальные клетки можно попасть с помощью покрытия с иРНК на катетере и механическим введением ДНК.The route and site of administration can be chosen to enhance targeting. For example, in order to reach muscle cells, an intramuscular injection into the muscles of interest may be a logical choice. Lung cells can be accessed by injecting mRNA in aerosol form. Vascular endothelial cells can be accessed by coating with mRNA on the catheter and mechanically introducing DNA.
Дозировка.Dosage.
В одном из аспектов особенностью изобретения является способ введения индивиду (например, человеку) средства дцРНК, например средства миРНК. Способ включает введение стандартной дозы средства дцРНК, например средства миРНК, например двухцепочечного средства миРНК, которая (а) имеет двухцепочечную часть длиной в 14-30 нуклеотидов (нк), например 21-23 нк, (b) комплементарна РНКмишени (например, эндогенной или патогенной РНК-мишени) и необязательно (с) включает по меньшей мере один 3'-выступ длиной в 1-5 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления стандартная доза составляет менее 10 мг/кг массы тела или менее 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005 или 0,00001 мг/кг массы тела и менее 200 нмоль средства РНК (например, примерно 4,4х1016 копий) на кг массы тела или менее 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075 или 0,00015 нмоль средства РНК на кг массы тела.In one aspect, a feature of the invention is a method of administering to an individual (eg, a human) a dsRNA agent, such as an siRNA agent. The method includes administering a standard dose of a dsRNA agent, e.g. an siRNA agent, e.g. a double-stranded siRNA agent, which (a) has a double-stranded portion of 14-30 nucleotides (nc), e.g. 21-23 nc, (b) is complementary to the target RNA (e.g. pathogenic target RNA) and optionally (c) includes at least one 3' overhang of 1-5 nucleotides in length. In one embodiment, the unit dose is less than 10 mg/kg body weight, or less than 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, or 0 .00001 mg/kg body weight and less than 200 nmol RNA agent (e.g., about 4.4 x 10 16 copies) per kg body weight or less than 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0 .75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, or 0.00015 nmol of RNA agent per kg of body weight.
Определенное количество может представлять собой количество, эффективное для лечения или профилактики заболевания или расстройства, например заболевания или расстройства, связанного с РНК-мишенью. Стандартную дозу можно ввести, например, инъекцией (например, внутривенной, подкожной или внутримышечной), ингаляционной дозой или местным введением. В некоторых вариантах осуществления дозировки могут составлять менее 10, 5, 2, 1 или 0,1 мг/кг массы тела.The amount may be an amount effective to treat or prevent a disease or disorder, such as a disease or disorder associated with a target RNA. The unit dose can be administered, for example, by injection (eg, intravenous, subcutaneous or intramuscular), inhalation dose, or topical administration. In some embodiments, dosages may be less than 10, 5, 2, 1, or 0.1 mg/kg body weight.
В некоторых вариантах осуществления стандартную дозу вводят реже одного раза в сутки, например реже чем каждые 2, 4, 8 или 30 дней. В другом варианте осуществления стандартную дозу вводятIn some embodiments, the unit dose is administered less frequently than once a day, such as less than every 2, 4, 8, or 30 days. In another embodiment, the unit dose is administered
- 32 042669 нерегулярно. Например, стандартная доза может быть введена однократно.- 32 042669 irregularly. For example, a unit dose may be administered once.
В одном из вариантов осуществления эффективную дозу вводят с другими традиционными терапевтическими способами. В одном из вариантов осуществления индивид имеет вирусную инфекцию и средством является противовирусное средство, иное, чем средство дцРНК, например иное, чем средство миРНК. В другом варианте осуществления индивид имеет атеросклероз и эффективную дозу средства дцРНК, например средства миРНК, вводят в комбинации, например, после, хирургического вмешательства, например ангиопластики.In one embodiment, the effective dose is administered with other conventional therapeutic methods. In one embodiment, the individual has a viral infection and the agent is an antiviral agent other than a dsRNA agent, such as other than an siRNA agent. In another embodiment, the subject has atherosclerosis and an effective dose of a dsRNA agent, eg an siRNA agent, is administered in combination, eg, following a surgical procedure, eg, angioplasty.
В одном из вариантов осуществления индивиду вводят начальную дозу и одну или несколько поддерживающих доз средства дцРНК, например средства миРНК (например, предшественника, например средства более крупной дцРНК, которая может быть процессирована в средство миРНК, или ДНК, которая кодирует средство дцРНК, например средство миРНК, или его предшественника). Поддерживающая доза или дозы могут быть такими же или меньше, чем начальная доза, например наполовину меньше начальной дозы. Схема поддерживающего лечения может включать лечение индивида дозой или дозами, колеблющимися от 0,01 до 15 мг/кг массы тела в сутки, например 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 или 0,00001 мг на кг массы тела в сутки. Поддерживающие дозы вводят, например, не чаще чем один раз каждые 2, 5, 10 или 30 дней. Кроме того, схема лечения может длиться в течение периода времени, который будет изменяться в зависимости от характера определенного заболевания, его тяжести и общего состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления дозировка может доставляться не более одного раза в сутки, например не более одного раза в 24, 36 или 48 или более часов, например не более одного раза каждые 5 или 8 дней. После лечения пациента можно проконтролировать изменения в его состоянии и блегчение симптомов болезненного состояния. Дозировка соединения может быть или увеличена, в случае когда пациент не реагирует в достаточной степени на текущие уровни дозировки, или доза может быть уменьшена, если наблюдается облегчение симптомов болезненного состояния, если болезненное состояние не устраняется или если наблюдают побочное действие.In one embodiment, an individual is administered an initial dose and one or more maintenance doses of a dsRNA agent, e.g. an siRNA agent (e.g. miRNA, or its precursor). The maintenance dose or doses may be the same or less than the initial dose, eg half the initial dose. The maintenance regimen may include treating the individual with a dose or doses ranging from 0.01 to 15 mg/kg of body weight per day, for example 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 or 0.00001 mg per kg of body weight in day. Maintenance doses are administered, for example, not more frequently than once every 2, 5, 10 or 30 days. In addition, the treatment regimen may last for a period of time, which will vary depending on the nature of the particular disease, its severity and the general condition of the patient. In some embodiments, the dosage may be delivered no more than once per day, such as no more than once every 24, 36, or 48 or more hours, such as no more than once every 5 or 8 days. After treatment of the patient, changes in his condition and relief of the symptoms of the disease state can be monitored. The dosage of the compound may either be increased if the patient does not respond sufficiently to current dosage levels, or the dose may be reduced if there is improvement in the symptoms of the disease state, if the disease state persists, or if a side effect is observed.
Эффективную дозу можно ввести в однократной дозе или в двух или более дозах, как желательно или считается соответствующим в конкретных обстоятельствах. Если желательно облегчить повторные или частые инфузии, может быть целесообразна имплантация доставочного устройства, например насоса, временного стента (например, внутривенного, интраперитонеального, интрацистернального или интракапсулярного) или резервуара.An effective dose may be administered in a single dose or in two or more doses, as desired or considered appropriate in the particular circumstances. If it is desired to facilitate repeated or frequent infusions, implantation of a delivery device such as a pump, a temporary stent (eg, intravenous, intraperitoneal, intracisternal, or intracapsular) or reservoir may be beneficial.
В одном из вариантов осуществления композиция включает несколько видов средства дцРНК. В другом варианте осуществления вид средства дцРНК имеет последовательности, которые не перекрываются и не соседствуют с другими видами в отношении последовательности-мишени, встречающейся в природе. В другом варианте осуществления несколько видов средства дцРНК специфичны для различных природных генов-мишеней. В другом варианте осуществления средство дцРНК является аллельспецифическим.In one embodiment, the composition includes several types of dsRNA agent. In another embodiment, a species of dsRNA agent has sequences that do not overlap or coexist with other species with respect to a naturally occurring target sequence. In another embodiment, several types of dsRNA agent are specific for different natural target genes. In another embodiment, the dsRNA agent is allele specific.
Средства дцРНК по изобретению, описанные в настоящем описании, можно вводить млекопитающим, в частности крупным млекопитающим, таким как приматы, не принадлежащие к человеку, или человеку, различными путями.The dsRNA agents of the invention described herein can be administered to mammals, in particular large mammals such as non-human or human primates, in a variety of ways.
В одном из вариантов осуществления введение композиции средства дцРНК, например средства миРНК, представляет парентеральное введение, например внутривенное (например, в виде болюса или в виде диффундирующей инфузии), интрадермальное, интраперитонеальное, внутримышечное, интратекальное, интравентрикулярное, интракраниальное, подкожное, трансмукозное, трансбуккальное, сублингвальное, эндоскопическое, ректальное, пероральное, вагинальное, местное, легочное, интраназальное, уретральное или глазное. Введение может быть проведено индивидом или другим человеком, например медицинским работником. Лекарственный препарат может предоставляться в отмеренных дозах или в устройстве, которое доставляет отмеренную дозу. Выбираемые типы доставки подробнее обсуждаются ниже.In one embodiment, administration of a composition of a dsRNA agent, such as an siRNA agent, is parenteral, such as intravenous (eg, bolus or diffusible infusion), intradermal, intraperitoneal, intramuscular, intrathecal, intraventricular, intracranial, subcutaneous, transmucosal, buccal , sublingual, endoscopic, rectal, oral, vaginal, topical, pulmonary, intranasal, urethral, or ophthalmic. The introduction can be carried out by an individual or another person, such as a medical professional. The drug may be provided in metered doses or in a device that delivers a metered dose. Selected delivery types are discussed in more detail below.
Изобретение относится к способам, композициям и наборам для ректального введения или доставки средств дцРНК, описанных в настоящем описании.The invention relates to methods, compositions and kits for rectal administration or delivery of dsRNA agents described in the present description.
Способы ингибирования экспрессии гена-мишени.Methods for inhibiting target gene expression.
Варианты осуществления изобретения также относятся к способам ингибирования экспрессии генамишени. Способ включает стадию введения средств дцРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии гена-мишени.Embodiments of the invention also relate to methods for inhibiting target gene expression. The method includes the step of administering the dsRNA agents of any of the preceding embodiments in an amount sufficient to inhibit expression of the target gene.
Другой аспект изобретения относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему предоставление указанной клетке средства дцРНК по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления ген-мишень выбирают из группы, состоящей из фактора VII, Eg5, PCSK9, ТРХ2, ароВ, SAA, TTR, RSV, гена PDGF-бета, гена Erb-B, гена Src, гена CRK, гена CRB2, гена RAS, гена МЕКК, гена JNK, гена RAF, гена Erc1/2, гена PCNA(p21), гена MYB, гена JUN, гена FOS, гена BCL-2, гепцидена, активированного белка С, гена циклина D, гена VEGF, гена EGFR, гена циклина А, гена циклина Е, гена WNT-1, гена бета-катенина, гена с-МЕТ, гена РКС, гена NFKB, гена STAT3, гена сурвивина, гена Her2/Neu, гена топоизомеразы I, гена топоизомеразы II альфа, мутаций в гене р73, мутаций в гене р21 (WAFI/CIPI), мутаций в гене p27(KIP1), мутаций в гене PPMID, мутаций в гене RAS, мутаций в генеAnother aspect of the invention relates to a method for modulating the expression of a target gene in a cell, comprising providing said cell with a dsRNA agent of the present invention. In one embodiment, the target gene is selected from the group consisting of factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF-beta gene, Erb-B gene, Src gene, CRK gene, CRB2 gene, RAS gene, MEKK gene, JNK gene, RAF gene, Erc1/2 gene, PCNA(p21) gene, MYB gene, JUN gene, FOS gene, BCL-2 gene, hepciden, activated protein C, cyclin D gene, VEGF gene, EGFR gene, cyclin A gene, cyclin E gene, WNT-1 gene, beta-catenin gene, c-MET gene, PKC gene, NFKB gene, STAT3 gene, survivin gene, Her2/Neu gene, topoisomerase I gene, topoisomerase II gene alpha, mutations in the p73 gene, mutations in the p21 gene (WAFI/CIPI), mutations in the p27 gene (KIP1), mutations in the PPMID gene, mutations in the RAS gene, mutations in the gene
- 33 042669 кавеолина I, мутаций в гене MIB I, мутаций в гене MTAI, мутаций в гене М68, мутаций в опухолевых генах-супрессорах и мутаций в опухолевом гене-супрессоре р53.- 33 042669 caveolin I, mutations in the MIB I gene, mutations in the MTAI gene, mutations in the M68 gene, mutations in tumor suppressor genes and mutations in the p53 tumor suppressor gene.
Изобретение дополнительно поясняется приведенными далее примерами, которые не следует рассматривать как ограничительные. Все ссылки, находящиеся на рассмотрении заявки на патент и опубликованные патенты, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок.The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. All references, pending patent applications and published patents cited in the present description, are incorporated into the present description by reference.
ПримерыExamples
Пример 1. Скрининг миРНК-дуплексов in vitro.Example 1 Screening for miRNA duplexes in vitro.
Клеточная культура и трансфекции.Cell culture and transfections.
Клетки человека Нер3В или клетки крысы H.II.4.E (АТСС, Manassas, VA) выращивают почти до слияния при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в RPMI (АТСС) с добавлением 10% FBS, стрептомицина и глутамина (АТСС) и затем извлекают из чашки трипсинизацией. Трансфекцию выполняют, добавляя к 5 мкл миРНК-дуплексов на лунку в 96-луночном планшете 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13788-150), и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем к смеси миРНК добавляют 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей ~2х104 клеток Нер3В. Клетки инкубируют или 24 или 120 ч и затем очищают РНК. Эксперименты с однократной дозой выполняют при конечной концентрации дуплексов 10 и 0,1 нМ, и эксперименты по зависимости реакции от дозы выполняют с использованием 8, 4-кратных серийных разведений с максимальной дозой дуплексов в конечной концентрации 10 нМ.Human Hep3B cells or rat H.II.4.E cells (ATCC, Manassas, VA) are grown to near confluence at 37°C in 5% CO2 in RPMI (ATCC) supplemented with 10% FBS, streptomycin and glutamine (ATCC ) and then removed from the plate by trypsinization. Transfection is performed by adding 14.8 µl of Opti-MEM plus 0.2 µl of Lipofectamine RNAiMax per well (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. no. 13788-150) to 5 µl of siRNA duplexes per well in a 96-well plate, and incubated at room temperature for 15 min. Then, 80 µl of complete growth medium without antibiotics containing ~2x10 4 Hep3B cells is added to the siRNA mixture. Cells are incubated for either 24 or 120 hours and then the RNA is purified. Single dose experiments are performed at a final concentration of duplexes of 10 and 0.1 nM, and dose-response experiments are performed using 8.4-fold serial dilutions with a maximum dose of duplexes at a final concentration of 10 nM.
Изоляция полной РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA (Invitrogen, part #: 610-12).Total RNA isolation using the DYNABEADS mRNA kit (Invitrogen, part #: 610-12).
Клетки собирают и лизируют в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивают 5 мин при 850 об/мин с использованием термосмесителя Эппендорфа (скорость перемешивания одна и та же на протяжении процесса). В лунки планшета с круглодонными лунками добавляют смесь 10 мкл магнитных гранул и 80 мкл буфера для лизиса/связывания и перемешивают в течение 1 мин. Магнитные гранулы закрепляют с использованием магнитной подставки и супернатант удаляют, не затрагивая гранулы. После удаления супернатанта к оставшимся гранулам добавляют лизированные клетки и перемешивают в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывают 2 раза 150 мкл буфера для промывки А и перемешивают в течение 1 мин. Гранулы снова закрепляют и удаляют супернатант. Затем гранулы промывают 150 мкл буфера для промывки В, закрепляют и удаляют супернатант. Затем гранулы промывают 150 мкл буфера для элюирования, закрепляют и удаляют супернатант. Гранулы оставляют сушиться на 2 мин. После сушки добавляют 50 мкл буфера для элюирования и перемешивают в течение 5 мин при 70°С. Гранулы закрепляют магнитом в течение 5 мин. Извлекают 40 мкл супернатанта и добавляют в другой 96-луночный планшет.Cells are harvested and lysed in 150 μl of lysis/binding buffer, then stirred for 5 min at 850 rpm using an Eppendorf thermomixer (mixing speed is the same throughout the process). A mixture of 10 µl of magnetic beads and 80 µl of lysis/binding buffer is added to the wells of a round bottom well plate and mixed for 1 minute. The magnetic beads are fixed using a magnetic stand and the supernatant is removed without affecting the beads. After removal of the supernatant, lysed cells are added to the remaining beads and mixed for 5 minutes. After removal of the supernatant, the magnetic beads are washed 2 times with 150 µl of wash buffer A and mixed for 1 min. The beads are fixed again and the supernatant removed. The beads are then washed with 150 µl of wash buffer B, fixed and the supernatant discarded. The beads are then washed with 150 µl of elution buffer, fixed and the supernatant discarded. The granules are left to dry for 2 minutes. After drying, 50 µl of elution buffer is added and stirred for 5 min at 70°C. The granules are fixed with a magnet for 5 minutes. Remove 40 µl of the supernatant and add to another 96-well plate.
Синтез кДНК с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, кат. № 4368813).Synthesis of cDNA using ABI High Throughput cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat # 4368813).
К 5 мкл полной РНК добавляют основную смесь из 1 мкл 10Х буфера, 0,4 мкл 25Х dNTP, 1 мкл случайных праймеров, 0,5 мкл обратной транскриптазы, 0,5 мкл ингибитора РНКазы и 1,6 мкл Н2О на реакцию. Генерируют кДНК с использованием термоячейки Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, CA) через следующие стадии: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, 4°С выдержка.To 5 µl total RNA is added a master mix of 1 µl 10X buffer, 0.4 µl 25X dNTP, 1 µl random primers, 0.5 µl reverse transcriptase, 0.5 µl RNase inhibitor and 1.6 µl H 2 O per reaction. cDNA was generated using a Bio-Rad C-1000 or S-1000 thermal cell (Hercules, CA) through the following steps: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, 4°C hold.
ПЦР в реальном времени.PCR in real time.
К основной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Applied Biosystems, кат. № 4236317E (человека), кат. № 4308313 (грызуна)), 0,5 мкл зонда TTR TaqMan (Applied Biosystems, кат. № HS00174914_m1 (человека), кат. № Rn00562124_m1 (крысы)) и 5 мкл основной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, кат. № 04887301001), на лунку в 384-луночном планшете (Roche, кат. № 04887301001) добавляют 2 мкл кДНК. ПЦР в реальном времени проводят в аппарате для ПЦР в реальном времени Roche LC 480 (Roche). Каждый дуплекс испытывают при по меньшей мере двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию анализируют двукратно, если не указано иное.To a master mix containing 0.5 µl GAPDH TaqMan probe (Applied Biosystems, cat. no. 4236317E (human), cat. no. 4308313 (rodent)), 0.5 µl TTR TaqMan probe (Applied Biosystems, cat. no. HS00174914_m1 (human ), cat.# Rn00562124_m1 (rats)) and 5 µl of Lightcycler 480 Probe Master Mix (Roche, cat. no. 04887301001), 2 µl of cDNA are added per well in a 384-well plate (Roche, cat. no. 04887301001). Real-time PCR was performed on a Roche LC 480 real-time PCR machine (Roche). Each duplex was tested in at least two independent transfections and each transfection was analyzed in duplicate unless otherwise noted.
Для того чтобы вычислить относительное кратное изменение, данные в реальном времени анализируют с использованием метода AACt и нормализуют к анализам, выполненным с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или мнимотрансфицированными клетками. IC50 вычисляют с использованием 4-параметрической модели соответствия с использованием XLFit и нормализуют к клеткам, трансфицированным AD-1955, или наивным клеткам в одном и том же интервале доз или к их собственной наименьшей дозе. IC50 вычисляют для каждой отдельной трансфекции, а также в комбинации, где одна IC50 соответствует данным из обеих трансфекций.In order to calculate the relative fold change, real-time data are analyzed using the AACt method and normalized to analyzes performed with cells transfected with 10 nM AD-1955 or sham-transfected cells. IC 50 is calculated using a 4-parameter fit model using XLFit and normalized to cells transfected with AD-1955 or naive cells at the same dose range or their own lowest dose. IC 50 is calculated for each individual transfection, as well as in combination, where one IC 50 corresponds to data from both transfections.
Результаты по сайленсингу гена примера миРНК-дуплекса с различными модификациями мотивов по изобретению приводятся в таблице ниже.The results of gene silencing of an example miRNA duplex with various motif modifications according to the invention are shown in the table below.
Пример 2. Синтез РНК и отжиг дуплексов.Example 2. Synthesis of RNA and annealing of duplexes.
1. Синтез олигонуклеотидов.1. Synthesis of oligonucleotides.
Все олигонуклеотиды синтезируют в синтезаторе AKTAoligopilot или синтезаторе ABI 394. Для синтеза олигонуклеотидов используют, если не указано иное, коммерчески доступный твердый носитель из пористого стекла с определенным размером пор (dT-CPG, 500А, Prime Synthesis) и фосфорамидитыAll oligonucleotides are synthesized on an AKTAoligopilot synthesizer or an ABI 394 synthesizer. Oligonucleotides are synthesized using, unless otherwise indicated, a commercially available porous glass solid support with defined pore size (dT-CPG, 500A, Prime Synthesis) and phosphoramidites
- 34 042669- 34 042669
РНК со стандартными защитными группами 5'-О-диметокситритил-N6-бензоил-2'-третбутилдиметилсилиладенозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритилN4-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилилцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-Oдиметокситритил-N2-изобутирил-2'-трет-бутилдиметилсилилгуанозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2цианоэтилфосфорамидит и 5'Ό-диметокситритил-2'-трет-бутилдиметилсилилуридин-3'-O-N,N'диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Р-Фосфорамидиты 5'-Oдиметокситритил-N4-ацетил-2'-фторцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-Oдиметокситритил-2'-фторуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит закупают у Promega. Все фосфорамидиты используют в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN) за исключением гуанозина, который используют в концентрации 0,2 М в смеси 10% ТГФ/ANC (об./об.). Используют время присоединения/рециклинга 16 мин. Активатором является 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals) для РО-окисления используют смесь иод/вода/пиридин, и для PS-окисления используют PADS (2%) в смеси 2,6-лутидин/ACN (1:1, об./об.).RNA with standard protective groups -3'-O-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite, 5'-Odimethoxytrityl-N2-isobutyryl-2'-tert-butyldimethylsilylguanosine-3'-O-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite and 5'Ό-dimethoxytrityl-2 '-tert-butyldimethylsilyluridin-3'-O-N,N'diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-P-Phosphoramidites 5'-Odimethoxytrityl-N4-acetyl-2'-fluorocytidine-3'-O-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite and 5'-Odimethoxytrityl-2'-fluorouridine-3'-O-N,N '-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite is purchased from Promega. All phosphoramidites are used at 0.2M in acetonitrile (CH3CN) except for guanosine, which is used at 0.2M in 10% THF/ANC (v/v). An addition/recycling time of 16 minutes was used. The activator is 5-ethylthiotetrazole (0.75 M, American International Chemicals) for PO oxidation using iodine/water/pyridine and for PS oxidation using PADS (2%) in 2,6-lutidine/ACN (1: 1, v/v).
Лигандконъюгированные цепи синтезируют с использованием твердого носителя, содержащего соответствующий лиганд. Например, введения углеводной части/лиганда (в случае, например, GalNAc) в 3'-конец последовательности достигают, начиная синтез с помощью соответствующего углеводного твердого носителя. Подобным образом холестериновую часть вводят в 3'-конец, начиная синтез на холестериновом носителе. Как правило, лигандная часть привязывается к транс-4-гидроксипролинолу через связку, выбранную так, как описано в предыдущих примерах, и получают часть гидроксипролиноллиганд. Затем часть гидроксипролинол-лиганд соединяют с твердым носителем через сукцинатный линкер или превращают в фосфорамидит в стандартных условиях фосфорилирования и получают нужные строительные блоки углеводного конъюгата. Меченые флуорофором миРНК синтезируют из соответствующего фосфорамидита или твердого носителя, закупленных у Biosearch Technologies. Олеиллитохолический (GalNAc)3 полимерный носитель готовят на фирме при нагрузке 38,6 мкмоль/г. Маннозный (Man)3 полимерный носитель также готовят на фирме при нагрузке 42,0 мкмоль/г.Ligand-conjugated chains are synthesized using a solid support containing the appropriate ligand. For example, insertion of a carbohydrate moiety/ligand (in the case of, for example, GalNAc) at the 3' end of the sequence is achieved by starting the synthesis with an appropriate carbohydrate solid support. Similarly, the cholesterol moiety is introduced at the 3' end, starting the synthesis on the cholesterol carrier. Typically, the ligand moiety is coupled to trans-4-hydroxyprolinol via a linkage chosen as described in the previous examples to give the hydroxyprolinol ligand moiety. The hydroxyprolinol ligand portion is then coupled to a solid support via a succinate linker or converted to phosphoramidite under standard phosphorylation conditions to provide the desired carbohydrate conjugate building blocks. Fluorophore labeled siRNAs are synthesized from the appropriate phosphoramidite or solid support purchased from Biosearch Technologies. The oleyllithocholic (GalNAc) 3 polymer carrier was prepared in-house at a loading of 38.6 µmol/g. A mannose (Man) 3 polymer carrier is also prepared in-house at a loading of 42.0 µmol/g.
Конъюгации выбранного лиганда с нужным положением, например 5'-концом последовательности, достигают, присоединяя соответствующий фосфорамидит к растущей цепи в стандартных условиях фосфорамидитного сочетания, если не указано иное. На протяжении 15 мин сочетание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора 5-(этилтио)-1Н-тетразола связывает его с олигонуклеотидом. Окисление интернуклеозидного фосфита до фосфата осуществляют с использованием стандартной йодной воды, как сообщается в (1), или путем обработки смесью третбутилгидроксипероксид/ацетонитрил/вода (10:87:3) с 10-минутным временем выдержки для окисления конъюгированного олигонуклеотида. Фосфоротиоат вводят окислением фосфита до Фосфоротиоата с использованием реагента переносчика серы, такого как DDTT (закупают у AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестеринфосфорамидит синтезируют на фирме и используют в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время сочетания для холестеринфосфорамидита составляет 16 мин.Conjugation of the selected ligand to the desired position, eg the 5' end of the sequence, is achieved by attaching the appropriate phosphoramidite to the growing strand under standard phosphoramidite coupling conditions, unless otherwise indicated. Over 15 min, the combination of a 0.1 M solution of phosphoramidite in anhydrous CH 3 CN in the presence of the activator 5-(ethylthio)-1H-tetrazole binds it to the oligonucleotide. Oxidation of the internucleoside phosphite to phosphate is carried out using standard iodine water as reported in (1) or by treatment with tert-butylhydroxyperoxide/acetonitrile/water (10:87:3) with a 10 minute holding time to oxidize the conjugated oligonucleotide. Phosphorothioate is introduced by oxidizing phosphite to Phosphorothioate using a sulfur transfer agent such as DDTT (purchased from AM Chemicals), PADS and/or Bocage's reagent. Cholesterolphosphoramidite is synthesized by the company and used at a concentration of 0.1 M in dichloromethane. The coupling time for cholesterolphosphoramidite is 16 minutes.
2. Удаление защитной группы-I (удаление защитной группы нуклеотидного основания).2. Removal of the protective group-I (deprotection of the nucleotide base).
По завершении синтеза носитель переносят в 100-мл стеклянный флакон (VWR). Олигонуклеотид отщепляют от носителя с одновременным удалением защитной группы основания и фосфатных групп с помощью 80 мл смеси этанола с аммиаком [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 ч при 55°С. Флакон недолго охлаждают на льду и затем этанолоаммиачную смесь фильтруют в другой 250-миллилитровый флакон. CPG промывают смесью этанол/вода (1:1, об./об.) 2x40 мл. Затем объем смеси уменьшают до ~30 мл роторным испарением. Затем смесь замораживают на сухом льду и сушат в вакууме на speed vac.Upon completion of the synthesis, the carrier is transferred to a 100 ml glass vial (VWR). The oligonucleotide is cleaved from the carrier while removing the base protecting group and phosphate groups with 80 ml of a mixture of ethanol and ammonia [ammonia:ethanol (3:1)] for 6.5 h at 55°C. The vial is cooled briefly on ice and then the ethanol-ammonia mixture is filtered into another 250 ml vial. The CPG is washed with ethanol/water (1:1, v/v) 2x40 ml. The volume of the mixture is then reduced to ~30 ml by rotary evaporation. The mixture is then frozen on dry ice and dried under vacuum at speed vac.
3. Удаление защитной группы-II (удаление группы 2'-TBDMS).3. Removal of the protective group-II (deletion of the 2'-TBDMS group).
Высушенный остаток ресуспендируют в 26 мл смеси триэтиламина, тригидрофторида триэтиламина (TEA.3HF) или пиридин-HF и ДМСО (3:4:6) и греют при 60°С в течение 90 мин для удаления третбутилдиметилсилильных (TBDMS) групп в положении 2'. Затем реакцию гасят 50 мл 20 мМ раствора ацетата натрия, доводят рН до 6,5 и хранят в замороженном состоянии до очистки.The dried residue is taken up in 26 ml of a mixture of triethylamine, triethylamine trihydrofluoride (TEA.3HF) or pyridine-HF and DMSO (3:4:6) and heated at 60°C for 90 min to remove the tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) groups at the 2' position . The reaction is then quenched with 50 ml of 20 mM sodium acetate solution, adjusted to pH 6.5 and stored frozen until purified.
4. Анализ.4. Analysis.
Олигонуклеотиды перед очисткой анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), и выбор буфера и колонки зависит от характера последовательности и или конъюгированного лиганда.Oligonucleotides are analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) before purification, and the choice of buffer and column depends on the nature of the sequence and or conjugated ligand.
5. Очистка ВЭЖХ.5. Purification by HPLC.
Олигонуклеотиды, конъюгированные с лигандами, очищают препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищают анионообменной ВЭЖХ на колонке с гелем TSK, которую набивают на фирме. Буферами являются 20 мМ раствор фосфата натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ раствор фосфата натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN, 1 M NaBr (буфер В). Фракции, содержащие полноразмерные олигонуклеотиды, собирают вместе, обессоливают и лиофилизуют. Приблизительной 0,15 OD обессоленные олигонуклеотиды разводят в воде до 150 мкл и затем пипеткой вносят в специальные сосуды для анализа CGE и ЖХ/МС. Соединения в заключение анализируют ЖХESMC и CGE.The ligand-conjugated oligonucleotides are purified by reverse phase preparative HPLC. Unconjugated oligonucleotides are purified by anion exchange HPLC on a commercially packed TSK gel column. The buffers are 20 mM sodium phosphate (pH 8.5) in 10% CH3CN (buffer A) and 20 mM sodium phosphate (pH 8.5) in 10% CH3CN, 1 M NaBr (buffer B). Fractions containing full length oligonucleotides are pooled, desalted and lyophilized. Approximately 0.15 OD desalted oligonucleotides are diluted in water to 150 μl and then pipetted into special vessels for CGE and LC/MS analysis. Compounds are finally analyzed by LCESMC and CGE.
6. Получение миРНК.6. Obtaining siRNA.
- 35 042669- 35 042669
Для получения миРНК эквимолярные количества смысловой и антисмысловой цепи греют в IxPBS при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждают до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждают методом ВЭЖХ.To obtain siRNA, equimolar amounts of sense and antisense strand are heated in IxPBS at 95°C for 5 min and slowly cooled to room temperature. The integrity of the duplex is confirmed by HPLC.
Таблица 1Table 1
Модифицированный дуплекс ANGPTL3Modified duplex ANGPTL3
- 36 042669- 36 042669
- 37 042669- 37 042669
- 38 042669- 38 042669
- 39 042669- 39 042669
- 40 042669- 40 042669
- 41 042669- 41 042669
- 42 042669- 42 042669
Пример 3. Активность сайленсинга in vitro с различными химическими модификациями на TTR миРНК.Example 3 In vitro silencing activity with various chemical modifications on siRNA TTR.
IC50 для каждой модифицированной миРНК определяют на клетках Нер3В стандартной обратимой трансфекцией с использованием липофектамина RNAiMAX. Коротко, обратимую трансфекцию осуществляют, добавляя 5 мкл Opti-MEM к 5 мкл миРНК-дуплекса на лунку в 96-луночном планшете вместе с 10 мкл Opti-MEM плюс 0,5 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13778-150) и инкубируя при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Затем после инкубации в каждую лунку добавляют 100 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей 12000-15000 клеток Нер3В. Клетки инкубируют в течение 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2, затем лизируют и анализируют АроВ и GAPDH мРНК с помощью bDNA (Quantigene). Анализируют семь различных концентраций миРНК, колеблющихся от 10 нМ до 0,6 пМ, для определения IC50, и ApoB/GAPDH для АроВ-трансфицированных клеток нормализуют к клеткам, трансфицированным 10 нМ миРНК Luc.The IC 50 for each modified siRNA is determined on Hep3B cells by standard reversible transfection using Lipofectamine RNAiMAX. Briefly, reversible transfection is performed by adding 5 µl of Opti-MEM to 5 µl of siRNA duplex per well in a 96-well plate along with 10 µl of Opti-MEM plus 0.5 µl of Lipofectamine RNAiMax per well (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. 13778-150) and incubating at room temperature for 15-20 minutes. Then, after incubation, 100 µl of complete growth medium without antibiotics containing 12,000-15,000 Hep3B cells is added to each well. Cells are incubated for 24 hours at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere, then lysed and ApoB and GAPDH mRNA analyzed with bDNA (Quantigene). Analyze seven different concentrations of siRNA, ranging from 10 nm to 0.6 pM, to determine the IC 50 and ApoB/GAPDH for ApoB-transfected cells normalized to cells transfected with 10 nm siRNA Luc.
- 43 042669- 43 042669
Модифицированный дуплекс ANGPTL3Modified duplex ANGPTL3
Таблица 2table 2
- 44 042669- 44 042669
D2024D2024
S2024S2024
GfgGfcCfaAfaUfUfAfaUfgAfcAfuAfuUfGfgGfcCfaAfaUfUfAfaUfgAfcAfuAfuUf
A2024 aAfuAfuGfuCfaUfuaaUfuUfgGfcCfcsUfsuA2024 aAfuAfuGfuCfaUfuaaUfuUfgGfcCfcsUfsu
1.4871.487
0.9490.949
0.8830.883
- 45 042669- 45 042669
- 46 042669- 46 042669
Пример 4. Активность сайленсинга in vitro с различными химическими модификациями на ANGPTL3 миРНК.Example 4 In vitro silencing activity with various chemical modifications on ANGPTL3 siRNA.
Клеточная культура и трансфекции.Cell culture and transfections.
Клетки Нер3В (АТСС, Manassas, VA) выращивают почти до слияния при 37°С в атмосфере с 5% CO2 в RPMI (АТСС) с добавлением 10% FBS, стрептомицина и глутамина (АТСС) и затем извлекают из чашки трипсинизацией. Трансфекцию выполняют, добавляя к 5 мкл миРНК-дуплексов на лунку в 96-луночном планшете 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad, CA, кат. № 13788-150), и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем к смеси миРНК добавляют 80 мкл полной среды для выращивания без антибиотиков, содержащей ~2х104 клеток Нер3В. Клетки инкубируют или 24 или 120 ч и затем очищают РНК. Эксперименты с однократной дозой выполняют при конечной концентрации дуплексов 10 и 0,1 нМ, и эксперименты по зависимости реакции от дозы выполняют с использованием конечной концентрации дуплексов 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 и 0,00001 нМ, если не указано иное.Hep3B cells (ATCC, Manassas, VA) are grown to near confluence at 37° C. in 5% CO2 in RPMI (ATCC) supplemented with 10% FBS, streptomycin and glutamine (ATCC) and then removed from the dish by trypsinization. Transfection is performed by adding 14.8 µl of Opti-MEM plus 0.2 µl of Lipofectamine RNAiMax per well (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. no. 13788-150) to 5 µl of siRNA duplexes per well in a 96-well plate, and incubated at room temperature for 15 min. Then, 80 µl of complete growth medium without antibiotics containing ~2x10 4 Hep3B cells is added to the siRNA mixture. Cells are incubated for either 24 or 120 hours and then the RNA is purified. Single dose experiments are performed at a final concentration of duplexes of 10 and 0.1 nM, and dose-response experiments are performed using a final concentration of duplexes of 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 , 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, and 0.00001 nM unless otherwise noted.
Синтез кДНК с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, кат. № 4368813).Synthesis of cDNA using ABI High Throughput cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat # 4368813).
К 10 мкл полной РНК добавляют основную смесь из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реак-To 10 µl total RNA is added a master mix of 2 µl 10X buffer, 0.8 µl 25X dNTP, 2 µl random primers, 1 µl reverse transcriptase, 1 µl RNase inhibitor and 3.2 µl H 2 O per reaction.
Claims (22)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/561,710 | 2011-11-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA042669B1 true EA042669B1 (en) | 2023-03-09 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11406716B2 (en) | Modified RNAi agents | |
EP2880162B1 (en) | Modified rnai agents | |
US10119136B2 (en) | RNAi agents modified at the 4′-C position | |
EP2780353B1 (en) | Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases | |
US20210388356A1 (en) | Modified double stranded oligonucleotide | |
CA3205809A1 (en) | Modified double stranded oligonucleotides | |
EA042669B1 (en) | MODIFIED RNAi AGENTS |