EA042321B1 - GROUP B ADENOVIRUS ENCODING AN ANTIBODY TO THE TCR COMPLEX OR A FRAGMENT OF THE SPECIFIED ANTIBODY - Google Patents

GROUP B ADENOVIRUS ENCODING AN ANTIBODY TO THE TCR COMPLEX OR A FRAGMENT OF THE SPECIFIED ANTIBODY Download PDF

Info

Publication number
EA042321B1
EA042321B1 EA201891021 EA042321B1 EA 042321 B1 EA042321 B1 EA 042321B1 EA 201891021 EA201891021 EA 201891021 EA 042321 B1 EA042321 B1 EA 042321B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cells
virus
viral vector
replicating oncolytic
Prior art date
Application number
EA201891021
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Брайан Роберт ЧЕМПИОН
Элис Клэр Ноэль Бромли
Original Assignee
Псайоксус Терапьютикс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Псайоксус Терапьютикс Лимитед filed Critical Псайоксус Терапьютикс Лимитед
Publication of EA042321B1 publication Critical patent/EA042321B1/en

Links

Description

Настоящее изобретение относится к онколитическому вирусу, полученному из EnAd или Ad11, содержащему трансген, кодирующий по меньшей мере агонистическое антитело, специфичное к CD3 в комплексе Т-клеточного рецептора (TCR) или связывающий фрагмент указанного антитела, в частности, для экспрессии на поверхности раковой клетки, композициям, содержащим указанный вирус, и применению указанного вируса и указанной композиции для лечения рака.The present invention relates to an oncolytic virus derived from EnAd or Ad11, containing a transgene encoding at least an agonistic antibody specific for CD3 in the T-cell receptor (TCR) complex or a binding fragment of said antibody, in particular for expression on the surface of a cancer cell , compositions containing said virus, and the use of said virus and said composition for the treatment of cancer.

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании GB1522334.0, GB1607463.5, GB1617207.4 и GB1617206.6, описание каждой из которых полностью включено в настоящую заявку.The present application claims priority based on GB1522334.0, GB1607463.5, GB1617207.4 and GB1617206.6, the description of each of which is incorporated herein in its entirety.

Уровень техникиState of the art

Рак все еще является огромным социальным грузом для общества с точки зрения тяжести заболевания и страданий, испытываемых пациентами и близкими им людьми, а также с точки зрения высоких финансовых расходов на лечение, уход за пациентами и их поддержку. В настоящее время считают, что иммунные системы здоровых индивидов постоянно устраняют раковые клетки. При этом, у страдающих раком пациентов один или более механизмов защиты, вовлеченных в такой клиренс, супрессирован или полностью выключен.Cancer is still a huge social burden for society in terms of the severity of the disease and the suffering experienced by patients and those close to them, as well as the high financial costs of treatment, patient care and support. It is now believed that the immune systems of healthy individuals constantly eliminate cancer cells. However, in cancer patients, one or more of the defense mechanisms involved in such clearance is suppressed or completely turned off.

В настоящее время известно, что опухоли изменяют свое микроокружение, чтобы оно более благоприятствовало их расту. Это происходит посредством высвобождения опухолью внеклеточных сигналов, которые, например, вызывают ангиогенез опухоли и/или индуцируют локальное подавление иммунного ответа или иммунологическую толерантность.It is now known that tumors change their microenvironment to be more conducive to their growth. This occurs through the release of extracellular signals by the tumor, which, for example, induce tumor angiogenesis and/or induce local suppression of the immune response or immunological tolerance.

Комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) на Т-клетках распознает определенный антиген, в частности, когда указанный антиген находится в виде пептида, презентированного на молекуле главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности клетки. Комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) содержит связывающий антиген гетеродимер альфа и бета или гамма и дельта цепей, вместе с белками семейства иммуноглобулинов - эпсилон, дельта, гамма и зета цепями CD3. Эпсилон, дельта и гамма цепи CD3 на поверхности играют важные роли в сборке комплекса TCR и стабильной экспрессии на поверхности клетки. Гомодимер цепей зета почти полностью внутриклеточный и действует как ключевая сигнальная молекула комплекса, когда комплекс TCR перекрестно связывается физиологически комплексами антиген-МНС на поверхностях клеток или фармакологическими средствами, например, антителами к комплексу TCR, такими как антитело к CD3 (включая связывающий фрагмент указанного антитела).The T cell receptor (TCR) complex on T cells recognizes a specific antigen, in particular when said antigen is in the form of a peptide presented on a major histocompatibility complex (MHC) molecule on the cell surface. The T cell receptor (TCR) complex contains an antigen-binding heterodimer of alpha and beta or gamma and delta chains, together with the immunoglobulin family proteins of the CD3 epsilon, delta, gamma and zeta chains. The epsilon, delta, and gamma chains of CD3 on the surface play important roles in the assembly of the TCR complex and stable expression on the cell surface. The zeta chain homodimer is almost entirely intracellular and acts as a key signaling molecule of the complex when the TCR complex is cross-linked physiologically by antigen-MHC complexes on cell surfaces or by pharmacological agents, e.g. antibodies to the TCR complex, such as an anti-CD3 antibody (including the binding fragment of said antibody) .

Результаты многих различных доклинических и клинических исследований однозначно показали, что микроокружение внутри опухолей может подавлять развитие и активность противоопухолевых иммунных ответов, при этом было показано, что потенциально в этот процесс вовлечен большой спектр механизмов. В частности, иммуносупрессорные механизмы, в конечном счете, предотвращают опосредование Т-клеточными ответами уничтожения опухолевых клеток. Супрессорные механизмы могут включать предотвращение проникновения Т-клеток в опухолевые ткани, ингибирование активации или активности Т-клеток, которые все же проникли в опухоль, и модуляцию белков опухолевой клетки, которые снижают способность Т-клеток распознавать или отвечать на них. Значение таких иммуносупрессорных путей для обеспечения прогрессирования опухоли, в частности, было проиллюстрировано клинической эффективностью, которую продемонстрировали антитела к рецепторам в двух таких супрессорных путях - CTLA4 и PD-1/PDL1, что привело к разрешению их продажи на рынке для лечения меланомы и других видов раков.The results of many different preclinical and clinical studies have unequivocally shown that the microenvironment within tumors can suppress the development and activity of antitumor immune responses, and it has been shown that a wide range of mechanisms are potentially involved in this process. In particular, immunosuppressive mechanisms ultimately prevent T cell responses from mediating tumor cell killing. Suppressor mechanisms may include preventing T cells from entering tumor tissues, inhibiting the activation or activity of T cells that have entered the tumor, and modulating tumor cell proteins that reduce the ability of T cells to recognize or respond to them. The importance of such immunosuppressive pathways in promoting tumor progression has been particularly illustrated by the clinical efficacy demonstrated by antibodies to receptors in two of these suppressor pathways, CTLA4 and PD-1/PDL1, leading to their market authorization for the treatment of melanoma and other types. crayfish.

Несмотря на то, что для получения активированных цитолитических Т-клеток, например, для лечения таких видов рака как рак носоглотки, был предложен адоптивный перенос Т-клеток, стимулированных in vitro, такая терапия может быть трудной, дорогостоящей и неудобной. Более того, иногда данные методики лечения эффективны только в отношении определенных подгрупп пациентов.Although adoptive transfer of in vitro stimulated T cells has been proposed for the production of activated cytolytic T cells, for example for the treatment of cancers such as nasopharyngeal cancer, such therapy can be difficult, expensive and inconvenient. Moreover, sometimes these treatments are effective only in certain subgroups of patients.

Некоторые клинические испытания проводили с раковыми антигенами, например, MAGE, в форме вакцины, содержащей раковый антиген и адъювант, такой как монофосфорил А и CpG. Тем не менее, данные подходы вопреки ожиданиям не смогли обеспечить достижение высоких результатов в клинической практике. Таким образом, фактическая стимуляция или активация в условиях in vivo Т-клеток, направленных на раковые клетки, для лечения рака по факту не применяется на практике в настоящее время.Some clinical trials have been performed with cancer antigens, such as MAGE, in the form of a vaccine containing the cancer antigen and an adjuvant such as monophosphoryl A and CpG. However, these approaches, contrary to expectations, failed to achieve high results in clinical practice. Thus, the actual in vivo stimulation or activation of T cells directed to cancer cells for cancer treatment is not actually practiced at present.

Авторы настоящего изобретения получили результаты, показывающие, что иммунная система более эффективно справляется с раковыми клетками, на поверхности которых обеспечили экспрессию по меньшей мере агонистического антитела к TCR или его связывающего фрагмента, чем с немодифицированными раковыми клетками, которые не экспрессируют указанный белок на своей поверхности.The present inventors have obtained results showing that the immune system copes more effectively with cancer cells, on the surface of which the expression of at least an anti-TCR agonist antibody or binding fragment thereof is provided, than with unmodified cancer cells that do not express the specified protein on their surface.

Без связи с какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что если обеспечить в раковой клетке экспрессирю по меньшей мере агонистического антитела к TCR, то это направит или стимулирует иммунную систему пациента, на борьбу с раком, например, такое антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела может привлекать и/или активировать Тклетки. Такая активация Т-клеток, которые будут физиологически распознавать опухолеспецифические антигены, включая персонифицированные неоантигены, также может приводить к образованию потомства эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти, которые могут мигрировать в участки той же опухоли или другие очаги опухоли (например, метастазы), не экспрессирующие агонистическое анти- 1 042321 тело к TCR или его фрагмент. Таким образом, данная терапия потенциально может вызвать длительный иммунный ответ по отношению к раковым клеткам за счет активированных Т-клеток, экспрессирующих их физиологический опухолеспецифический антиген, чтобы системно бороться с раком у пациента.Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed by the present inventors that if a cancer cell is provided to express at least an anti-TCR agonist antibody, it will direct or stimulate the patient's immune system to fight the cancer, such as an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody may recruit and/or activate T cells. Such activation of T cells, which will physiologically recognize tumor-specific antigens, including personalized neoantigens, can also lead to the generation of effector and memory T cell progeny, which can migrate to areas of the same tumor or other tumor foci (e.g., metastases) that do not express an anti-TCR agonist body or a fragment thereof. Thus, this therapy has the potential to induce a long-term immune response against cancer cells through activated T cells expressing their physiological tumor-specific antigen in order to systematically fight cancer in the patient.

Ясно, что способы терапии рака, которые задействуют собственные иммунные ответы организма для борьбы с раком, будут обладать значительными преимуществами. Более того, данная терапия направлена только на раковые клетки, и, следовательно, побочные эффекты и токсичность, вероятно, будут гораздо меньше, чем в случае традиционных методы лечения, таких как химиотерапия.It is clear that cancer therapies that use the body's own immune responses to fight cancer will have significant advantages. What's more, this therapy only targets cancer cells, and therefore side effects and toxicity are likely to be much less than traditional therapies such as chemotherapy.

Можно получить раковую клетку, экспрессирующую антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела, путем инфицирования указанной раковой клетки способным реплицироваться онколитическим вирусом или неспособным реплицироваться онколитическим вирусным вектором, кодирующим антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела.It is possible to obtain a cancer cell expressing an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody by infecting said cancer cell with a replicable oncolytic virus or a non-replicating oncolytic viral vector encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В настоящем изобретении предложено следующее.The present invention provides the following.

1) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В, выбранный из группы, состоящей из Ad11 и энаденотуцирева, при этом указанный вирус кодирует антитело или связывающий фрагмент указанного антитела для экспрессии на поверхности раковой клетки, при этом указанное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к белку CD3 комплекса Т-клеточного рецептора (TCR), и при этом указанный вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.1) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic group B adenovirus selected from the group consisting of Ad11 and enadenotucyreve, wherein said virus encodes an antibody or binding fragment of said antibody for expression on the surface of a cancer cell, wherein said antibody or binding fragment said antibody is specific for the T-cell receptor (TCR) complex CD3 protein, and said virus does not encode the B7 protein or active fragment thereof.

2) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В согласно п.1, отличающийся тем, что указанный вирус представляет собой Ad11.2) A replicating oncolytic viral vector or a replicating group B oncolytic adenovirus according to claim 1, characterized in that said virus is Ad11.

3) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный вирус способен реплицироваться.3) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 1 or 2, characterized in that said virus is replicable.

4) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный вирус неспособен реплицироваться.4) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 1 or 2, characterized in that said virus is unable to replicate.

5) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанное кодируемое антитело дополнительно содержит трансмембранный домен или GPI-якорь.5) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said encoded antibody further comprises a transmembrane domain or GPI anchor.

6) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.5, отличающийся тем, что указанный трансмембранный домен выбран из последовательности, представленной в SEQ ID NO: с 10 по 14.6) An oncolytic viral vector that is unable to replicate or a replicable oncolytic virus according to claim 5, characterized in that said transmembrane domain is selected from the sequence shown in SEQ ID NOs: 10 to 14.

7) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный онколитический аденовирус представляет собой EnAd.7) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said oncolytic adenovirus is an EnAd.

8) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанное антитело или связывающий фрагмент выбраны из группы, включающей полноразмерное антитело, Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, однодоменные антитела, scFv, би-, три- или тетравалентные антитела, бис-scFv, диатела, триател, тетрател, хуматела (Humabody), дисульфидностабилизированные формы любого из указанных антител и их связывающие эпитоп фрагменты.8) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 1 to 7, characterized in that said antibody or binding fragment is selected from the group consisting of a full-length antibody, Fab, modified Fab, Fab', modified Fab', F(ab') 2 , Fv, single domain antibodies, scFv, bi-, tri- or tetravalent antibodies, bis-scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, humatela (Humabody), disulfide-stabilized forms of any of these antibodies and their epitope-binding fragments.

9) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно пп.1-8, отличающийся тем, что указанный связывающий фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fv.9) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claims 1 to 8, characterized in that said antibody binding fragment is a single chain Fv.

10) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный онколитический вирус кодирует по меньшей мере один дополнительный трансген.10) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 1 to 9, characterized in that said oncolytic virus encodes at least one additional transgene.

11) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.10, отличающийся тем, что указанный онколитический вирус кодирует по меньшей мере два дополнительных трансгена.11) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 10, characterized in that said oncolytic virus encodes at least two additional transgenes.

12) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.10 или 11, отличающийся тем, что указанный(-е) дополнительный(-е) трансген(ы) кодируют(-ет) белок, независимо выбранный из группы, включающей цитокин, хемокин, молекулу антагонистического антитела или связывающий фрагмент указанного антитела, молекулу агонистического антитела или связывающий фрагмент указанного антитела, иммуномодулятор и их комбинации.12) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 10 or 11, characterized in that said additional transgene(s) encode(s) a protein independently selected from the group consisting of a cytokine, a chemokine, an antagonistic antibody molecule or a binding fragment of said antibody, an agonistic antibody molecule or a binding fragment of said antibody, an immunomodulator, and combinations thereof.

13) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.12, отличающийся тем, что по меньшей мере один дополнительный трансген кодирует молекулу антитела или связывающий фрагмент указанного антитела (напри-13) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 12, characterized in that at least one additional transgene encodes an antibody molecule or a binding fragment of said antibody (e.g.

- 2 042321 мер, который может находиться в экспрессируемой на поверхности форме и/или в секретируемой форме).- 2 042321 mer, which may be in a surface-expressed form and/or in a secreted form).

14) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.13, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела представляет собой ингибитор.14) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 13, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody is an inhibitor.

15) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.14, отличающийся тем, что указанный ингибитор представляет собой ингибитор фактора ангиогенеза или ингибитор деактивирующего Т-клетки фактора.15) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 14, wherein said inhibitor is an angiogenesis factor inhibitor or a T cell deactivating factor inhibitor.

16) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.13-15, отличающийся тем, что молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела представляет собой агонист.16) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 13 to 15, characterized in that the antibody molecule or binding fragment of said antibody is an agonist.

17) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.16, отличающийся тем, что указанный агонист независимо выбран из группы, включающей антитела к CD40, лиганд CD40 (также известный как CD154), GITR, OX40, CD27, 4-1bB и их комбинации, например, CD40, GITR, OX40, CD27 и 4-1ВВ.17) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 16, wherein said agonist is independently selected from the group consisting of anti-CD40 antibodies, CD40 ligand (also known as CD154), GITR, OX40, CD27, 4- 1bB and combinations thereof, eg CD40, GITR, OX40, CD27 and 4-1BB.

18) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.17, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к CD40L.18) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 17, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a binding domain specific for CD40L.

19) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.17 или 18, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к CD40.19) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 17 or 18, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a CD40-specific binding domain.

20) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.17-19, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к GITR.20) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 17 to 19, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a GITR-specific binding domain.

21) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.17-20, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к ОХ40.21) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 17 to 20, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a binding domain specific for OX40.

22) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.17-21, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к CD27.22) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 17 to 21, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a CD27-specific binding domain.

23) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.17-22, отличающийся тем, что указанная молекула антитела или связывающий фрагмент указанного антитела содержит связывающий домен, специфичный к 41BB.23) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 17 to 22, characterized in that said antibody molecule or binding fragment of said antibody contains a binding domain specific for 41BB.

24) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.12-23, отличающийся тем, что иммуномодулятор представляет собой связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки, независимо выбранный из группы, включающей CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, В7-Н4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT или CD160, например, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b и галектин-3, FLT-3, лиганд FLT-3, TLR, лиганды TLR, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, лиганд GITR, IFN-a2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, рецептор TSLP, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 и CD304, OX40, лиганд ОХ40, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганд CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, лиганд ICOS и их комбинации.24) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 12-23, characterized in that the immunomodulator is a membrane-bound protein ligand for immune cell surface receptors independently selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT or CD160, e.g. CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b and galectin-3, FLT-3, FLT ligand -3, TLR, TLR ligands, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR ligand , IFN-a2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP receptor, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 and CD304, OX40, OX40 ligand, CD27, CD28, CD30 , CD40, CD40 ligand, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, ICOS ligand, and combinations thereof.

25) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.24, отличающийся тем, что связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CTLA-4.25) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 24, characterized in that the membrane bound protein ligand for a receptor on the immune cell surface is or binds to CTLA-4.

26) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.24 или 25, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с PD-1.26) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 24 or 25, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to PD-1.

27) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-26, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с PD-L1.27) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 26, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to PD-L1.

28) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-27, отличающийся тем, что указанный связан-28) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 27, characterized in that said associated

- 3 042321 ный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с PD-L2.The membrane-bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to PD-L2.

29) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-28, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с VISTA.29) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 28, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to VISTA.

30) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-29, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с В7-НЗ.30) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 29, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to B7-H3.

31) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-30, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с В7-Н4.31) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 30, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to B7-H4.

32) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-31, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с HVEM.32) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 31, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to HVEM.

33) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-32, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с ILT-2.33) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 32, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to ILT-2.

34) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-33, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с ILT-3.34) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 33, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to ILT-3.

35) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-34, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с ILT-4.35) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 34, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to ILT-4.

36) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-35, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с TIM-3.36) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 35, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to TIM-3.

37) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-36, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с LAG-3.37) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 36, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to LAG-3.

38) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-37, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с BTLA.38) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 37, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to BTLA.

39) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-38, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с LIGHT.39) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 38, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to LIGHT.

40) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-39, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD160.40) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 39, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD160.

41) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-40, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD16.41) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 40, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD16.

42) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-41, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD25.42) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 41, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD25.

43) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-42, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD33.43) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 42, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD33.

- 4 042321- 4 042321

44) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-43, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD332.44) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 43, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD332.

45) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-44, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD127.45) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 44, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD127.

46) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-45, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD31.46) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 45, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD31.

47) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-46, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD43.47) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 46, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD43.

48) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-47, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD44.48) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 47, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD44.

49) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-48, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD162.49) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 48, wherein said membrane bound protein ligand for immune cell surface receptors is or binds to CD162.

50) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-49, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD301a.50) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 49, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD301a.

51) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-50, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD301b.51) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 50, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD301b.

52) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-51, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с галектином-3.52) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 51, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to galectin-3.

53) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-52, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с FLT-3.53) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 52, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to FLT-3.

54) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-53, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой лиганд FLT-3.54) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 53, wherein said membrane-bound protein ligand for an immune cell surface receptor is an FLT-3 ligand.

55) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-54, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой TLR.55) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 54, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is a TLR.

56) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-55, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой TLR-лиганд.56) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 55, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is a TLR ligand.

57) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-56, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CCR7.57) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 56, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CCR7.

58) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-57, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD1a.58) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 57, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD1a.

59) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-58, отличающийся тем, что указанный связан-59) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 58, characterized in that said associated

- 5 042321 ный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD1c.- 5 042321 The membrane-bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD1c.

60) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-59, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD11b.60) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 59, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD11b.

61) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-60, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD11c.61) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 60, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD11c.

62) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-61, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой CD80.62) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 61, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is CD80.

63) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-62, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD83.63) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 62, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD83.

64) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-63, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой CD86.64) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 63, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is CD86.

65) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-64, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD123.65) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 64, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD123.

66) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-65, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD172а.66) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 65, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD172a.

67) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-66, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD205.67) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 66, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD205.

68) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-67, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD207.68) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 67, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD207.

69) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-68, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD209.69) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 68, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD209.

70) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-69, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD273.70) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 69, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD273.

71) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-70, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD281.71) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 70, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD281.

72) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-71, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD283.72) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 71, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD283.

73) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-72, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD286.73) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 72, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD286.

74) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-73, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD289.74) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 73, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD289.

- 6 042321- 6 042321

75) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-74, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD287.75) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 74, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD287.

76) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-75, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CXCR4.76) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 75, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CXCR4.

77) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-76, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с лигандом GITR.77) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 76, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to a GITR ligand.

78) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-77, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки связывается с IFN-a2.78) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 77, characterized in that said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell binds to IFN-a2.

79) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-78, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой IL-12.79) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 78, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is IL-12.

80) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-79, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой IL-23.80) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 79, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is IL-23.

81) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-80, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки связывается с ILT1.81) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 80, characterized in that said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell binds to ILT1.

82) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-81, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки связывается с ILT5.82) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 81, characterized in that said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell binds to ILT5.

83) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-82, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки связывается с ILT7.83) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 82, characterized in that said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor binds to ILT7.

84) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-83, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки связывается с рецептором TSLP.84) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 83, characterized in that said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell binds to a TSLP receptor.

85) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-84, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD141.85) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 84, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD141.

86) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-85, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD303.86) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 85, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD303.

87) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-86, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CADM1.87) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 86, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CADM1.

88) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-87, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CLEC9a.88) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 87, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CLEC9a.

89) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-88, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с XCR1.89) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 88, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to XCR1.

90) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-89, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD304.90) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 89, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD304.

91) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-90, отличающийся тем, что указанный связан-91) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24-90, characterized in that said associated

- 7 042321 ный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с ОХ40.The membrane-bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to OX40.

92) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-91, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с лигандом ОХ40.92) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 91, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to an OX40 ligand.

93) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-92, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD27.93) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 92, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD27.

94) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-93, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD28.94) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 93, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD28.

95) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-94, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD30.95) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 94, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD30.

96) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-95, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD40.96) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 95, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to CD40.

97) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-96, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с лигандом CD40.97) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 96, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to a CD40 ligand.

98) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-97, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD70.98) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 97, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD70.

99) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-98, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с CD137.99) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 98, wherein said membrane bound protein ligand for an immune cell surface receptor is or binds to CD137.

100) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-99, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с GITR.100) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 99, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to a GITR.

101) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-100, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с 4-1ВВ.101) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24-100, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to 4-1BB.

102) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-101, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецептора на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с ICOS.102) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24-101, wherein said membrane bound protein ligand for a receptor on the surface of an immune cell is or binds to ICOS.

103) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.24-102, отличающийся тем, что указанный связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки представляет собой или связывается с лигандом ICOS.103) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 24 to 102, wherein said membrane bound protein ligand for immune cell surface receptors is or binds to an ICOS ligand.

104) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.10-103, отличающийся тем, что по меньшей мере один дополнительный трансген кодирует цитокин (включая секретируемые и/или связанные с мембраной клетки молекулы).104) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 10 to 103, characterized in that at least one additional transgene encodes a cytokine (including secreted and/or cell membrane bound molecules).

105) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.11-104, отличающийся тем, что второй дополнительный трансген кодирует цитокин (включая секретируемые и/или связанные с мембраной клетки молекулы).105) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 11-104, characterized in that the second additional transgene encodes a cytokine (including secreted and/or cell-bound membrane-bound molecules).

106) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.104 или 105, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из суперсемейства TNF-альфа (TNFSF включает TNF-альфа, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, лиганд 4-1ВВ, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL,106) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 104 or 105, characterized in that said encoded cytokine is independently selected from the TNF-alpha superfamily (TNFSF includes TNF-alpha, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, ligand 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL,

- 8 042321- 8 042321

BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, лиганд GITR, EDA-A, EDA-A2), супер семейства TGF-бета, семейства IL-1 (т.е. IL-1 и IL-18), семейства IL-2, семейства IL-10, семейства IL-17, семейства интерферона.BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand, EDA-A, EDA-A2), TGF-beta super family, IL-1 family (i.e. IL-1 and IL-18 ), the IL-2 family, the IL-10 family, the IL-17 family, the interferon family.

107) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.106, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой TNF-альфа.107) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 106, wherein said cytokine is TNF-alpha.

108) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.106 или 107, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой TNF-C.108) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 106 or 107, characterized in that said cytokine is TNF-C.

109) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-108, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой OX40L.109) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 108, characterized in that said cytokine is OX40L.

110) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-109, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой CD154.110) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106-109, characterized in that said cytokine is CD154.

111) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-110, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой FasL.111) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 110, wherein said cytokine is FasL.

112) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-111, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой LIGHT.112) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 111, wherein said cytokine is LIGHT.

113) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-112, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой TL1A.113) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 112, characterized in that said cytokine is TL1A.

114) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-113, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой CD70.114) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 113, characterized in that said cytokine is CD70.

115) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-114, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой Siva.115) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 114, wherein said cytokine is Siva.

116) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-115, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой CD153.116) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 115, characterized in that said cytokine is CD153.

117) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-116, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой лиганд 4-1BB.117) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106-116, wherein said cytokine is a 4-1BB ligand.

118) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-117, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой TRAIL.118) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 117, wherein said cytokine is TRAIL.

119) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-118, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой RANKL.119) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 118, wherein said cytokine is RANKL.

120) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-119, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой TWEAK.120) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106-119, wherein said cytokine is TWEAK.

121) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-120, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой APRIL.121) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 120, wherein said cytokine is APRIL.

122) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-121, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой BAFF.122) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 121, wherein said cytokine is a BAFF.

123) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-122, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой CAMLG.123) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 122, wherein said cytokine is CAMLG.

124) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-123, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой NGF.124) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106-123, characterized in that said cytokine is an NGF.

125) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-124, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой BDNF.125) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 124, wherein said cytokine is BDNF.

126) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-125, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой NT-3.126) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 125, wherein said cytokine is NT-3.

- 9 042321- 9 042321

127) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-126, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой лиганд GITR.127) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 126, wherein said cytokine is a GITR ligand.

128) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-127, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой EDA-A.128) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 127, wherein said cytokine is EDA-A.

129) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-128, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой EDA-A2.129) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 128, wherein said cytokine is EDA-A2.

130) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-129, отличающийся тем, что указанный цитокин принадлежит суперсемейству TGF-бета.130) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 129, wherein said cytokine belongs to the TGF-beta superfamily.

131) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-130, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-1.131) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 130, characterized in that said cytokine is IL-1.

132) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-131, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-8.132) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 131, wherein said cytokine is IL-8.

133) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-132, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-2.133) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 132, wherein said cytokine is IL-2.

134) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-133, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-10.134) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 133, wherein said cytokine is IL-10.

135) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-134, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-17.135) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 134, wherein said cytokine is IL-17.

136) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106-135, отличающийся тем, что указанный цитокин принадлежит семейству интерферона.136) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106 to 135, characterized in that said cytokine belongs to the interferon family.

137) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.106, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из TNF-альфа, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, интерферона, LIGHT, TL1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 и EDA-A2.137) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 106, wherein said encoded cytokine is independently selected from TNF-alpha, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, interferon, LIGHT , TL1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 and EDA-A2.

138) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно пп.106-137, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из TNF-C, OX40L, CD154, FasL, CD70, CD153, лиганда 4-1BB и EDA-A.138) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claims 106-137, characterized in that said encoded cytokine is independently selected from TNF-C, OX40L, CD154, FasL, CD70, CD153, ligand 4-1BB, and EDA- A.

139) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.106, 137 или 138, отличающийся тем, что указанный цитокин независимо выбран из группы, включающей IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, лиганд Flt3, GM-CSF, IL-15 и IL-12.139) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 106, 137 or 138, characterized in that said cytokine is independently selected from the group consisting of IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma , Flt3 ligand, GM-CSF, IL-15 and IL-12.

140) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п. 139, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-2.140) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 139, characterized in that said cytokine is IL-2.

141) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.139 или 140, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IFN-альфа.141) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 139 or 140, characterized in that said cytokine is IFN-alpha.

142) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-141, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IFN-бета.142) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 141, wherein said cytokine is IFN-beta.

143) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-142, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IFN-гамма.143) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 142, characterized in that said cytokine is IFN-gamma.

144) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-143, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой лиганд Flt3.144) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 143, characterized in that said cytokine is a Flt3 ligand.

145) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-144, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой GM-CSF.145) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 144, wherein said cytokine is GM-CSF.

146) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-145, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-15.146) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 145, wherein said cytokine is IL-15.

- 10 042321- 10 042321

147) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.139-146, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой IL-12.147) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 139 to 146, wherein said cytokine is IL-12.

148) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.10-147, отличающийся тем, что по меньшей мере один дополнительный трансген кодирует хемокин.148) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 10 to 147, characterized in that at least one additional transgene encodes a chemokine.

149) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.148, отличающийся тем, что указанный хемокин независимо выбран из группы, включающей MIP-1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 и CCL21.149) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 148, wherein said chemokine is independently selected from the group consisting of MIP-1-alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9 , CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 and CCL21.

150) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.149, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой MIP-1-альфа.150) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 149, wherein said encoded chemokine is MIP-1 alpha.

151) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.149 или 150, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой RANTES.151) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 149 or 150, characterized in that said encoded chemokine is RANTES.

152) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-151, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой IL-8.152) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 151, wherein said encoded chemokine is IL-8.

153) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-152, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL5.153) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 152, wherein said encoded chemokine is CCL5.

154) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-153, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL17.154) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-153, characterized in that said encoded chemokine is CCL17.

155) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-154, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL20.155) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-154, characterized in that said encoded chemokine is CCL20.

156) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-155, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL22.156) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-155, characterized in that said encoded chemokine is CCL22.

157) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-156, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CXCL9.157) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 156, wherein said encoded chemokine is CXCL9.

158) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-157, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CXCL10.158) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-157, characterized in that said encoded chemokine is CXCL10.

159) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-158, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CXCL11.159) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-158, characterized in that said encoded chemokine is CXCL11.

160) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-159, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CXCL12.160) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 159, characterized in that said encoded chemokine is CXCL12.

161) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-160, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CXCL13.161) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 160, wherein said encoded chemokine is CXCL13.

162) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-161, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL2.162) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 161, wherein said encoded chemokine is CCL2.

163) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-162, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL19.163) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149-162, wherein said encoded chemokine is CCL19.

164) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.149-163, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой CCL21.164) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 149 to 163, wherein said encoded chemokine is CCL21.

165) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно п.149 или 150, отличающийся тем, что указанный вирус содержит трансгены, кодирующие комбинацию цитокина и хемокина, выбранную из i) MIP-1a и Flt3, и ii) MIP-1a и IFNa.165) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to claim 149 or 150, characterized in that said virus contains transgenes encoding a cytokine and chemokine combination selected from i) MIP-1a and Flt3, and ii) MIP-1a and IFNA.

166) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус согласно любому из пп.1-166, отличающийся тем, что указанное антитело к166) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus according to any one of claims 1 to 166, characterized in that said antibody to

- 11 042321- 11 042321

CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела содержит по меньшей мере связывающий домен, содержащий области VH и VL из муромонаба-CD3 (muromonab-CD3, OKT3), отеликсизумаба (otelixizumab), теплизумаба (teplizumab) или визилизумаба (visilizumab).CD3 or a binding fragment of the specified antibody contains at least a binding domain containing VH and VL regions from muromonab-CD3 (muromonab-CD3, OKT3), otelixizumab (otelixizumab), teplizumab (teplizumab) or visilizumab (visilizumab).

167) Способ лечения имеющего рак пациента (например, путем стимуляции in vivo Т-клеток, например, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы нацелить их на раковые клетки), включающий этап:167) A method of treating a patient with cancer (for example, by in vivo stimulation of T cells, for example, T cells in the environment of a cancer cell, to target them to cancer cells), including the step of:

введения терапевтически эффективного количества неспособного реплицироваться онколитического вирусного вектора или способного реплицироваться онколитического аденовируса группы В, выбранного из группы, состоящей из Ad11 и энаденотуцирева, при этом указанный вирус кодирует антитело или связывающий фрагмент указанного антитела для экспрессии на поверхности раковой клетки, при этом указанное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к белку CD3 комплекса Т-клеточного рецептора (TCR), при этом указанный вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент, при этом указанный вирус или вирусный вектор селективно инфицирует указанные раковые клетки и экспрессирует на их поверхности указанное кодируемое антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела, как определено в любом из пп.1-166.administering a therapeutically effective amount of a replicating oncolytic viral vector or a replicating group B oncolytic adenovirus selected from the group consisting of Ad11 and enadenotucyrev, said virus encoding an antibody or a binding fragment of said antibody for expression on the surface of a cancer cell, said antibody or the binding fragment of the specified antibody is specific to the CD3 protein of the T-cell receptor (TCR) complex, while the specified virus does not encode the B7 protein or its active fragment, while the specified virus or viral vector selectively infects the specified cancer cells and expresses the specified encoded antibody on their surface to CD3 or a binding fragment of said antibody, as defined in any one of claims 1-166.

168) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В, выбранный из группы, состоящей из Ad11 и энаденотуцирева, при этом указанный вирус кодирует антитело или связывающий фрагмент указанного антитела для экспрессии на поверхности раковой клетки, при этом указанное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к белку CD3 комплекса Т-клеточного рецептора (TCR), при этом указанный вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент, как определено в любом из пп.1-166, для применения для лечения.168) A replicating oncolytic viral vector or a replicating group B oncolytic adenovirus selected from the group consisting of Ad11 and enadenotucyrev, wherein said virus encodes an antibody or binding fragment of said antibody for expression on the surface of a cancer cell, wherein said antibody or binding fragment said antibody is specific for the T cell receptor (TCR) complex CD3 protein, wherein said virus does not encode a B7 protein or active fragment thereof, as defined in any one of claims 1-166, for use in treatment.

169) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В согласно п.168, для применения при лечении рака.169) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating group B oncolytic adenovirus according to claim 168, for use in the treatment of cancer.

170) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В согласно п.169, отличающийся тем, что лечение проводят путем стимуляции in vivo Т-клеток, например, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы направить их на раковую клетку.170) A replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic adenovirus of group B according to claim 169, characterized in that the treatment is carried out by in vivo stimulation of T cells, for example, T cells in the environment of a cancer cell, to direct them to a cancer cell.

171) Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В, выбранный из группы, состоящей из Ad11 и энаденотуцирева, при этом указанный вирус кодирует антитело или связывающий фрагмент указанного антитела для экспрессии на поверхности раковой клетки, при этом указанное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к белку CD3 комплекса Т-клеточного рецептора (TCR), при этом указанный вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент, как определено в любом из пп.1-116, для применения для производства лекарственного средства.171) A non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic group B adenovirus selected from the group consisting of Ad11 and enadenotucyreve, wherein said virus encodes an antibody or binding fragment of said antibody for expression on the surface of a cancer cell, wherein said antibody or binding fragment said antibody is specific for the CD3 protein of the T cell receptor (TCR) complex, wherein said virus does not encode the B7 protein or active fragment thereof, as defined in any one of claims 1-116, for use in the manufacture of a medicament.

В одном варианте реализации один или более трансгенов, кодируемых вирусом согласно настоящему описанию, находятся под контролем эндогенного промотора, в частности, главного позднего промотора.In one embodiment, the implementation of one or more transgenes encoded by the virus according to the present description, are under the control of an endogenous promoter, in particular, the main late promoter.

В одном варианте реализации один или более трансгенов, кодируемых вирусом согласно настоящему описанию, находятся под контролем экзогенного промотора, такого как промотор CMV.In one embodiment, one or more of the transgenes encoded by a virus as described herein are under the control of an exogenous promoter, such as the CMV promoter.

В одном варианте реализации предложен вирус (неспособный реплицироваться или способный реплицироваться вирус, содержащий кассету трансгенов, описанную в данной заявке, включая описанную как часть полноразмерной последовательности вируса).In one embodiment, the implementation of the proposed virus (unable to replicate or able to replicate the virus containing the transgene cassette described in this application, including described as part of the full sequence of the virus).

В одном варианте реализации белок или пептид, кодируемый вирусом согласно настоящему описанию для экспрессии на поверхности раковой клетки, представляет собой иммуногенный белок, например, не относящийся к человеку белок.In one embodiment, the protein or peptide encoded by a virus as described herein for expression on the surface of a cancer cell is an immunogenic protein, eg, a non-human protein.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения имеющего рак пациента путем стимуляции in vivo Т-клеток, чтобы направить их на раковые клетки, путем введения терапевтически эффективного количества неспособного реплицироваться онколитического вирусного вектора или способного реплицироваться онколитического вируса, кодирующего антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности указанных раковых клеток.In one aspect, the present invention provides a method of treating a cancer patient by stimulating in vivo T cells to target cancer cells by administering a therapeutically effective amount of a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibodies (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of said cancer cells.

Таким образом, предложен способ лечения страдающего раком пациента путем стимуляции in vivo Т-клеток, например, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы направить их на раковые клетки, путем: введения терапевтически эффективного количества неспособного реплицироваться онколитического вирусного вектора или способного реплицироваться онколитического вируса, кодирующего антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), при этом указанный вирус или вирусный вектор селективно инфицирует указанные раковые клетки и экспрессирует на поверхности клетки указанное кодируемое антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела.Thus, there is provided a method of treating a patient suffering from cancer by stimulating in vivo T cells, e.g., T cells in the environment of a cancer cell, to target the cancer cells by: administering a therapeutically effective amount of a replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody), wherein said virus or viral vector selectively infects said cancer cells and expresses said encoded anti-TCR antibody or binding fragment of said antibody on the cell surface .

Также предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способныйAlso provided is an oncolytic viral vector incapable of replication or capable of

- 12 042321 реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковых клеток, для применения для лечения имеющего рак пациента путем стимуляции in vivo Т-клеток, в частности, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы направить их на указанные раковые клетки. Описанный в данной заявке вирус или вирусный вектор селективно инфицирует указанные раковые клетки и экспрессирует на их поверхности указанное кодируемое антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела).- 12 042321 replicate an oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of cancer cells, for use in the treatment of a cancer patient by in vivo stimulation of T cells, in particular, T cells in the environment of a cancer cell to direct them to said cancer cells. The virus or viral vector described herein selectively infects said cancer cells and expresses on their surface said encoded anti-TCR antibody or binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or binding fragment of said antibody).

В одном варианте реализации предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковых клеток, для применения для производства лекарственного средства для лечения рака путем стимуляции in vivo Т-клеток, в частности, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы направить их на указанные раковые клетки.In one embodiment, a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of cancer cells is provided, for use in the manufacture of a drug. for the treatment of cancer by in vivo stimulation of T cells, in particular T cells in the environment of a cancer cell, to direct them to said cancer cells.

Во втором независимом варианте реализации предложен способ лечения страдающего раком пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества неспособного реплицироваться онколитического вирусного вектора или способного реплицироваться онколитического вируса, кодирующего антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковой клетки, например, при условии, что если указанный вирус представляет собой способный реплицироваться онколитический аденовирус, то: содержащийся в нем трансген или трансгены находятся под контролем экзогенного промотора, и/или вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.In a second independent embodiment, a method of treating a patient with cancer is provided, comprising administering a therapeutically effective amount of a replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) to expression on the surface of a cancer cell, for example, provided that if said virus is a replicating oncolytic adenovirus, then: the transgene or transgenes it contains are under the control of an exogenous promoter, and/or the virus does not encode the B7 protein or its active fragment.

Таким образом, предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковой клетки, для применения при лечении рака, например, при условии, что если указанный вирус представляет собой способный реплицироваться онколитический аденовирус, то: трансген или трансгены в нем находятся под контролем экзогенного промотора, и/или вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.Thus, a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of a cancer cell is provided, for use in the treatment of cancer, for example provided that if said virus is a replicating oncolytic adenovirus, then: the transgene or transgenes in it are under the control of an exogenous promoter, and/or the virus does not encode the B7 protein or its active fragment.

В одном варианте реализации предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковой клетки, для производства лекарственного средства для лечения рака, например, при условии, что если указанный вирус представляет собой способный реплицироваться онколитический аденовирус, то содержащийся в нем трансген или трансгены находятся под контролем экзогенного промотора, и/или вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.In one embodiment, a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of a cancer cell is provided, for the manufacture of a therapeutic drug. cancer, for example, provided that if said virus is a replicating oncolytic adenovirus, then the transgene or transgenes it contains are under the control of an exogenous promoter, and/or the virus does not encode the B7 protein or its active fragment.

В независимом аспекте предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковой клетки.In an independent aspect, a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus is provided that encodes an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of a cancer cell.

Таким образом, в третьем аспекте предложен неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор или способный реплицироваться онколитический вирус, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) для экспрессии на поверхности раковой клетки, например, при условии, что если указанный вирус представляет собой способный реплицироваться онколитический аденовирус, то: содержащийся в нем трансген или трансгены находятся под контролем экзогенного промотора, и/или вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.Thus, a third aspect provides a non-replicating oncolytic viral vector or a replicating oncolytic virus encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) for expression on the surface of a cancer cell, e.g., provided that if said virus is an oncolytic adenovirus capable of replicating, then: the transgene or transgenes it contains are under the control of an exogenous promoter, and/or the virus does not encode the B7 protein or its active fragment.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию указанный вирус способен реплицироваться. В одном варианте реализации согласно настоящему описанию вирус представляет собой неспособный реплицироваться онколитический аденовирус.In one embodiment, as described herein, said virus is capable of replicating. In one embodiment, as described herein, the virus is a replicating oncolytic adenovirus.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию из вирусного вектора, который неспособен реплицироваться, например, удален частично или полностью ген, необходимый для репликации вируса, такой как область E1 в аденовирусах.In one embodiment according to the present disclosure, a viral vector that is unable to replicate, for example, has been partially or completely removed from a gene necessary for viral replication, such as the E1 region in adenoviruses.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию вирус или вирусный вектор аттенуирован.In one embodiment, according to the present description, the virus or viral vector is attenuated.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию онколитический вирус или вирусный вектор выбран из аденовируса (такого как Ad5, Ad3, Ad11, Ad11/Ad3 и Ad5/3), вируса простого герпеса (такого как HSV-1), реовируса, вируса коровьей оспы, вируса долины Сенека, вируса Коксаки, вируса Мараба, вируса кори, вируса везикулярного стоматита и вируса ньюкаслской болезни, включая их мутированные версии, варианты или производные, содержащие трансген.In one embodiment according to the present description, the oncolytic virus or viral vector is selected from adenovirus (such as Ad5, Ad3, Ad11, Ad11/Ad3 and Ad5/3), herpes simplex virus (such as HSV-1), reovirus, vaccinia virus, Seneca Valley virus, Coxsackie virus, Marab virus, measles virus, vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus, including their mutated versions, variants or derivatives containing the transgene.

В одном варианте реализации вирус или вирусный вектор выбран из группы, включающей онкорин (H101), талимоген, реолизин, пексастимоген девацирепвек (JX-594), каватак, сепрегвир, CGTG-102, MV- 13 042321In one embodiment, the virus or viral vector is selected from the group consisting of oncorin (H101), thalimogen, rheolysin, pexastimogen devacirepvec (JX-594), kavatak, sepregvir, CGTG-102, MV-13 042321

NIS, PV701, CL-ONC1, CG0070 и энаденотуцирев (EnAd), включая их мутированные версии, варианты или производные, содержащие трансген.NIS, PV701, CL-ONC1, CG0070 and enadenotucirev (EnAd), including their mutated versions, variants or derivatives containing the transgene.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию указанный онколитический вирус представляет собой аденовирус, например, вирус группы В, такой как Ad11, в частности, EnAd.In one embodiment according to the present disclosure, said oncolytic virus is an adenovirus, eg a group B virus such as Ad11, in particular EnAd.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию онколитический вирус не является аденовирусом, например, не является аденовирусом группы В, например, не является Ad11, в частности, не является EnAd.In one embodiment according to the present disclosure, the oncolytic virus is not an adenovirus, eg is not a group B adenovirus, eg is not an Ad11, in particular is not an EnAd.

В одном варианте реализации антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к белкам TCR альфа, бета, гамма или дельта, которые непосредственно участвуют в связывании антигена, или к их комбинации, например, антитело к бета-цепи TCR.In one embodiment, the anti-TCR antibody, or the binding fragment of said antibody, is specific for the alpha, beta, gamma, or delta TCR proteins directly involved in antigen binding, or a combination thereof, e.g., an anti-TCR beta chain antibody.

В одном варианте реализации антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела специфичны к CD3 дельта, эпсилон, гамма или к их комбинации, в частности, специфичны к CD3 эпсилон.In one embodiment, the anti-TCR antibody or binding fragment of said antibody is specific for CD3 delta, epsilon, gamma, or a combination thereof, in particular specific for CD3 epsilon.

В одном варианте реализации связывающий домен содержит VH и VL из антитела муромонабаCD3 (также известного как OKT3), отеликсизумаба (также известного как TRX4), теплизумаба (также известного как hOKT3y1 (Ala-Ala)) или визилизумаба.In one embodiment, the binding domain comprises VH and VL from the antibody muromonabCD3 (also known as OKT3), telixumab (also known as TRX4), teplizumab (also known as hOKT3y1 (Ala-Ala)) or vizilizumab.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию, когда способный реплицироваться вирус представляет собой аденовирус, связывающий домен агонистического антитела к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела не содержит VH и VL из антитела муромонаба-CD3 (также известного как OKT3), отеликсизумаба (также известного как TRX4), теплизумаба (также известного как hOKT3y1(Ala-Ala)) или визилизумаба.In one embodiment according to the present disclosure, when the replicable virus is an adenovirus, the binding domain of an anti-TCR agonist antibody, or the binding fragment of said antibody does not contain the VH and VL of the muromonab-CD3 antibody (also known as OKT3), hotels of xizumab (also known as TRX4 ), teplizumab (also known as hOKT3y1(Ala-Ala)) or vizilizumab.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию онколитический вирус или вирусный вектор кодирует дополнительный трансген, например, дополнительный трансген, кодирующий белок, выбранный из группы, включающей цитокин, хемокин, молекулу антагонистического антитела или ее фрагмент, молекулу агонистического антитела или ее фрагмент, фермент, иммуномодулятор и их комбинации.In one embodiment according to the present disclosure, the oncolytic virus or viral vector encodes an additional transgene, e.g., an additional transgene encoding a protein selected from the group consisting of a cytokine, a chemokine, an antagonist antibody molecule or fragment thereof, an agonist antibody molecule or fragment thereof, an enzyme, an immunomodulator and their combinations.

В одном варианте реализации дополнительный трансген кодирует антитело или связывающий фрагмент указанного антитела.In one embodiment, the additional transgene encodes an antibody or a binding fragment of said antibody.

Связывающий фрагмент антитела, который может кодироваться онколитическим вирусом или вирусным вектором согласно настоящему описанию, в одном варианте реализации независимо выбран из Fab, модифицированного Fab, Fab', модифицированного Fab', F(ab')2, Fv, однодоменных антител, scFv, би-, три- или тетравалентных антител, бис-scFv, диател, триател, тетрател, стабилизированных дисульфидом форм любого из указанных антител и их связывающих эпитоп фрагментов, в частности, scFv.The antibody binding fragment, which may be encoded by an oncolytic virus or a viral vector as described herein, is in one embodiment independently selected from Fab, Fab modified, Fab', Fab' modified, F(ab') 2 , Fv, single domain antibodies, scFv, bi -, tri - or tetravalent antibodies, bis-scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, stabilized disulfide forms of any of these antibodies and their epitope-binding fragments, in particular scFv.

В одном варианте реализации кодируемое антитело представляет собой полноразмерное антитело.In one embodiment, the encoded antibody is a full length antibody.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию дополнительный трансген кодирует антитело или связывающий фрагмент, который активирует Т-клетки, например, представляет собой агонист, который стимулирует передачу сигналов Т-клеток, такой как антитело или связывающий фрагмент антитела, специфичного к CD28, в частности, агонист, специфичного к CD28.In one embodiment according to the present description, the additional transgene encodes an antibody or binding fragment that activates T cells, for example, is an agonist that stimulates T cell signaling, such as an antibody or binding fragment of an antibody specific for CD28, in particular, agonist specific to CD28.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию кодируемый цитокин выбран из группы, включающей IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, лиганд Flt3, GM-CSF, IL-15, IL-12 и комбинации перечисленных цитокинов.In one embodiment, as described herein, the encoded cytokine is selected from the group consisting of IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, Flt3 ligand, GM-CSF, IL-15, IL-12, and combinations of these cytokines.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию дополнительный трансген кодирует секретируемый или связанный с мембраной цитокин.In one embodiment, as described herein, the additional transgene encodes a secreted or membrane bound cytokine.

Термин цитокин, используемый в данной заявке, означает низкомолекулярные белки, которые могут регулировать природу, интенсивность и продолжительность иммунного ответа путем связывания со специфичными рецепторами на целевых клетках и оказания различного влияния на лимфоциты и/или другие клетки. В данной заявке термин цитокин включает секретируемые варианты лигандов или рецепторов поверхности клетки, включая слитые белки (например, молекулы, слитые с Fc-доменом иммуноглобулина).The term cytokine used in this application means small molecular weight proteins that can regulate the nature, intensity and duration of the immune response by binding to specific receptors on target cells and exerting various effects on lymphocytes and/or other cells. In this application, the term cytokine includes secreted variants of cell surface ligands or receptors, including fusion proteins (eg, molecules fused to the Fc domain of an immunoglobulin).

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию указанный кодируемый цитокин выбран из суперсемейства TNF-альфа (TNFRSF включает TNF-альфа, TNF-C, OX40L, Cd154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, лиганд 4-1ВВ, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, лиганд GITR, EDA-A, EDA-A2), суперсемейства TGF-бета, семейства IL-1 (т.е. IL-1 и IL-8), семейства IL-2, семейства IL-10, семейства IL-17, семейства интерферона.In one embodiment according to the present disclosure, said encoded cytokine is selected from the TNF-alpha superfamily (TNFRSF includes TNF-alpha, TNF-C, OX40L, Cd154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, ligand 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR Ligand, EDA-A, EDA-A2), TGF-beta superfamily, IL-1 family (i.e. IL- 1 and IL-8), IL-2 family, IL-10 family, IL-17 family, interferon family.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию хемокин выбран из группы, включающей MIP-1-альфа, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21 и комбинации перечисленных хемокинов.In one embodiment according to the present description, the chemokine is selected from the group including MIP-1-alpha, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21 and combinations of these chemokines .

В одном варианте реализации указанные дополнительные трансгены кодируют первое антитело или связывающий фрагмент указанного антитела и второе антитело или связывающий фрагмент указанного антитела, называемые в данной заявке комбинацией антитело/антитело.In one embodiment, said additional transgenes encode a first antibody or binding fragment of said antibody and a second antibody or binding fragment of said antibody, referred to herein as an antibody/antibody combination.

В одном варианте реализации дополнительный трансген или трансгены кодируют антитело илиIn one embodiment, the additional transgene or transgenes encode an antibody or

- 14 042321 связывающий фрагмент указанного антитела и цитокин, называемые в данной заявке комбинацией антитело/цитокин.- 14 042321 binding fragment of the specified antibody and cytokine, referred to in this application as a combination of antibody/cytokine.

В одном варианте реализации дополнительный трансген или трансгены кодируют первый цитокин и второй цитокин, называемые в данной заявке комбинацией цитокин/цитокин.In one embodiment, the additional transgene or transgenes encode a first cytokine and a second cytokine, referred to herein as a cytokine/cytokine combination.

В одном варианте реализации дополнительный трансген или трансгены кодируют первый хемокин и второй хемокин, называемые в данной заявке комбинацией хемокин/хемокин.In one embodiment, the additional transgene or transgenes encode a first chemokine and a second chemokine, referred to herein as a chemokine/chemokine combination.

В одном варианте реализации дополнительный трансген или трансгены кодируют хемокин и цитокин, называемые в данной заявке комбинацией цитокин/хемокин.In one embodiment, the additional transgene or transgenes encode a chemokine and a cytokine, referred to herein as a cytokine/chemokine combination.

Если присутствует множество трансгенов, то один, как правило, будет кодировать одну молекулу, такую как цитокин или антитело и т.д., и отличный ген будет кодировать другую молекулу, например хемокин или антитело и т.д.If multiple transgenes are present, one will typically encode one molecule such as a cytokine or antibody, etc., and a different gene will encode another molecule, such as a chemokine or antibody, etc.

В одном варианте реализации согласно настоящему описанию онколитический вирус или вирусный вектор кодирует комбинацию цитокин/хемокин, например, MIP-1a и Flt3 или MIP-1a и IFNa.In one embodiment, as described herein, the oncolytic virus or viral vector encodes a cytokine/chemokine combination such as MIP-1a and Flt3 or MIP-1a and IFNa.

В одном варианте реализации антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела содержит по меньшей мере связывающий домен, содержащий области VH и VL из муромонαба-CD3 (OKT3), вариабельные области которого представлены в последовательностях SEQ ID NO: 1 и 2 и вариант одноцепочечного Fv которого представлен в последовательности SEQ ID NO: 3, отеликсизумаба, теплизумаба (вариабельные области которого представлены в последовательностях SEQ ID NO: 6 и 7) или визилизумаба.In one embodiment, an anti-TCR antibody, or a binding fragment of said antibody, comprises at least a binding domain comprising the VH and VL regions of muromonαba-CD3 (OKT3), the variable regions of which are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and a single chain Fv variant of which presented in the sequence of SEQ ID NO: 3, hotels of xizumab, teplizumab (whose variable regions are presented in the sequences of SEQ ID NO: 6 and 7) or vizilizumab.

В одном варианте реализации трансген, кодируемый вирусом, например, антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), содержит трансмембранный домен или GPI-якорь.In one embodiment, a virally encoded transgene, for example, an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody), contains a transmembrane domain or GPI anchor.

В одном варианте реализации антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела экспрессируется только на поверхности, то есть не экспрессируется в виде секретируемого белка.In one embodiment, the anti-CD3 antibody or binding fragment of said antibody is only surface-expressed, ie not expressed as a secreted protein.

В одном варианте реализации комбинацию трансмембранного домена и сигнальной последовательности секреции используют для экспрессии белка, кодируемого вирусом (например, описанным в данной заявке), на поверхности инфицированной раковой клетки. Авторы настоящего изобретения показали, что кодируемые белки экспрессируются только на клетках, которые позволяют инфицирование вирусом, т.е. на раковых клетках.In one embodiment, a combination of a transmembrane domain and a secretion signal sequence is used to express a protein encoded by a virus (eg, as described herein) on the surface of an infected cancer cell. The authors of the present invention have shown that the encoded proteins are expressed only on cells that allow infection with the virus, ie. on cancer cells.

В одном варианте реализации фрагмент, используемый для экспрессии белка на поверхности инфицированной раковой клетки (такой как трансмембранный (ТМ) фрагмент), выбран из группы, включающей последовательности ТМ домена (минимальные участки), приведенные в SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 или 14.In one embodiment, the fragment used to express a protein on the surface of an infected cancer cell (such as a transmembrane (TM) fragment) is selected from the group consisting of the TM domain sequences (minimum regions) shown in SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13 or 14.

SEQ ID NO: SEQID NO: Название Name ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SUBSEQUENCE 10 10 PDGFR, рецептор А PDGFR, receptor A AVLVLLVIVIISLIVLVVIW AVLVLLVIVIISLIVLVVIW и And PDGFR, рецептор В PDGFR, receptor B VVISAILALVVLTIISLIILI VVISAILALVVLTIISLIILI 12 12 ИНСУЛИНОПОДОБНЫЙ ФАКТОР РОСТА 1 INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 IIIGPPLIF VFLF S V VIGSIYLFL IIIGPPLIF VFLF S V VIGSIYLFL 13 13 IL6-R IL6-R S S S VPLPTFL VAGGSL AFGTLLCIAIVL S S S VPLPTFL VAGGSL AFGTLLCIAIVL 14 14 CD28 CD28 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIFWV

В одном варианте реализации трансмембранный домен получен из белка В7.In one embodiment, the transmembrane domain is derived from the B7 protein.

В одном варианте реализации онколитический вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию, в частности, способный реплицироваться аденовирус, такой как Ad11 или EnAd, не кодирует ни белок В7, ни его активный фрагмент.In one embodiment, an oncolytic virus or viral vector according to the present disclosure, in particular a replicable adenovirus such as Ad11 or EnAd, does not encode for either the B7 protein or its active fragment.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг. 1 показано изображение Т-клеточного рецептора (пример с альфа-бета цепями распознавания антигена).In FIG. 1 shows an image of a T-cell receptor (example with alpha-beta antigen recognition chains).

На фиг. 2 показано схематическое изображение кассет трансгенов для вирусов, экспрессирующих CD80 человека (фиг. 2А), коэкспрессирующих IFNa человека и CD80 человека (фиг. 2В), коэкспрессирующих scFv OKT3 и CD80 человека (фиг. 2С), коэкспрессирующих Flt3L человека, MIP-1a человека и IFNa человека (фиг. 2D), коэкспрессирующих Flt3L человека, MIP-1a человека и CD80 человека (фиг. 2Е), коэкспрессирующих IFNa человека, MIP-1a человека и CD80 человека (фиг. 2F), и схематическое изображение открытой рамки считывания (ОРС) или scFv OKT3 (фиг. 2G).In FIG. 2 shows a schematic representation of transgene cassettes for viruses expressing human CD80 (Fig. 2A), co-expressing human IFNa and human CD80 (Fig. 2B), co-expressing human scFv OKT3 and CD80 (Fig. 2C), co-expressing human Flt3L, human MIP-1a and human IFNa (Fig. 2D), co-expressing human Flt3L, human MIP-1a, and human CD80 (Fig. 2E), co-expressing human IFNa, human MIP-1a, and human CD80 (Fig. 2F), and a schematic representation of the open reading frame ( ORF) or scFv OKT3 (Fig. 2G).

На фиг. 3 показано схематическое изображение кассет трансгенов NG-348A (фиг. 3А), NG-420 (фиг. 3В) и NG-420A (фиг. 3С).In FIG. 3 shows a schematic representation of the NG-348A (FIG. 3A), NG-420 (FIG. 3B), and NG-420A (FIG. 3C) transgene cassettes.

На фиг. 4 показан высокий уровень экспрессии CD80 через 48 ч на поверхности опухолевых клеток А549, инфицированных либо вирусом NG-347, либо вирусом NG-348, но низкий уровень или отсутствие экспрессии CD80 после инфекции EnAd.In FIG. 4 shows high CD80 expression at 48 hours on the surface of A549 tumor cells infected with either NG-347 or NG-348 virus, but low or no CD80 expression after EnAd infection.

На фиг. 5 показан высокий уровень экспрессии CD80 через 48 ч на поверхности опухолевых клетокIn FIG. 5 shows a high level of CD80 expression after 48 hours on the surface of tumor cells.

- 15 042321- 15 042321

DLD-1, инфицированных вирусами NG-348, но низкий уровень или отсутствие экспрессии CD80 после инфекции EnAd.DLD-1 infected with NG-348 viruses but low or no CD80 expression after EnAd infection.

На фиг. 6 показана экспрессия CD80 на EpCam+ клетках А549, инфицированных NG-348 и совместно культивированных с CD3+ Т-клетками человека, но не в случае инфицирования EnAd.In FIG. 6 shows CD80 expression on EpCam+ A549 cells infected with NG-348 and co-cultured with human CD3+ T cells, but not when infected with EnAd.

На фиг. 7. Показана повышенная экспрессия CD25 на CD3+ Т-клетках человека после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но не в случае инфицирования EnAd (фиг. 7А), при этом как процент CD25+ клеток (фиг. 7В), так и уровень экспрессии CD25 на клетке (фиг. 7С) был повышен.In FIG. 7. Increased expression of CD25 on human CD3+ T cells after co-cultivation with NG-348 infected A549 cells, but not with EnAd infection (FIG. 7A), with both the percentage of CD25+ cells (FIG. 7B) and the level expression of CD25 on the cell (Fig. 7C) was increased.

На фиг. 8 показана повышенная экспрессия CD25 как на CD4+, так и на CD4- (главным образом, CD8) субпопуляциях CD3+ Т-клеток человека после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но не в случае инфицирования EnAd.In FIG. 8 shows increased expression of CD25 on both CD4+ and CD4 - (primarily CD8) human CD3+ T cell subpopulations after co-culture with NG-348 infected A549 cells, but not with EnAd infection.

На фиг. 9 показан низкий уровень экспрессии HLA-DR на CD3+ Т-клетках человека после совместного культивирования с клетками А549, инфицированными NG-348 или EnAd.In FIG. 9 shows low level of HLA-DR expression on human CD3+ T cells after co-culture with A549 cells infected with NG-348 or EnAd.

На фиг. 10 показана индукция экспрессии CD107а на поверхности живых CD3+ T-клеток после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но не в случае инфицирования EnAd.In FIG. 10 shows induction of CD107a expression on the surface of live CD3+ T cells after co-culture with NG-348 infected A549 cells, but not with EnAd infection.

На фиг. 11 показана индукция экспрессии CD107а на поверхности обеих CD4+ и CD4’субпопуляций CD3+ Т-клеток после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но не в случае инфицирования EnAd.In FIG. 11 shows the induction of CD107a expression on the surface of both CD4+ and CD4' CD3+ T cell subpopulations after co-cultivation with NG-348 infected A549 cells, but not in the case of EnAd infection.

На фиг. 12 показана индукция продукции IL-2 (фиг. 12А) и IFNy (фиг. 12В) CD3+ Т-клетками после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но отсутствие IL-2 и лишь низкие уровни IFNy в случае инфицирования EnAd.In FIG. 12 shows induction of IL-2 (FIG. 12A) and IFNy (FIG. 12B) production by CD3+ T cells after co-cultivation with NG-348 infected A549 cells, but no IL-2 and only low levels of IFNy with EnAd infection.

На фиг. 13 показана индукция продукции IFNy как CD4+ (фиг. 13А), так и CD8+ (фиг. 13В) CD3+ Тклетками после совместного культивирования с инфицированными NG-348 клетками А549, но отсутствие (CD4+ клетки) или низкая продукция (CD8+ клетки) IFNy в случае инфицирования EnAd.In FIG. 13 shows the induction of IFNy production by both CD4+ (FIG. 13A) and CD8+ (FIG. 13B) CD3+ T cells after co-culture with NG-348 infected A549 cells, but no (CD4+ cells) or low production (CD8+ cells) of IFNy in case of EnAd infections.

На фиг. 14 показана репликация генома и экспрессия гена гексона (уровни мРНК) для EnAd, NG347 и NG-348 в клетках фибробластов MRC-5 по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 14 shows genome replication and hexon gene expression (mRNA levels) for EnAd, NG347 and NG-348 in MRC-5 fibroblast cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 15 показана экспрессия трансгенной мРНК CD80 и scFv к CD3 и трансгенного белка CD80 (проточная цитометрия) для вируса NG-348 в клетках фибробластов MRC-5 по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 15 shows expression of anti-CD3 CD80 and scFv transgenic mRNA and NG-348 transgenic protein CD80 (flow cytometry) in MRC-5 fibroblast cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 16 показана трансгенная мРНК CD80 и трансгенный белок CD80 для вируса NG-347 в клетках фибробластов MRC-5 по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 16 shows transgenic CD80 mRNA and transgenic CD80 protein for NG-347 virus in MRC-5 fibroblast cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 17 показаны уровни мРНК и секретируемых белков MIP-1a и IFNa, образованных вирусом NG-347 в клетках фибробластов MRC-5 по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 17 shows mRNA levels and secreted proteins MIP-1a and IFNa produced by NG-347 virus in MRC-5 fibroblast cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 18 показана репликация генома и экспрессия гена гексона (уровни мРНК) для EnAd, NG347 и NG-348 в очищенных культурах Т-клеток человека.In FIG. 18 shows genome replication and hexon gene expression (mRNA levels) for EnAd, NG347 and NG-348 in purified human T cell cultures.

На фиг. 19 показана экспрессия трансгенной мРНК и белка CD80 и scFv к CD3 (проточная цитометрия) для вируса NG-348 в Т-клетках человека по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 19 shows expression of transgenic mRNA and anti-CD3 CD80 and scFv protein (flow cytometry) for NG-348 virus in human T cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 20 показана трансгенная мРНК CD80 и трансгенный белок CD80 для вируса NG-347 в очищенных Т-клетках человека по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 20 shows transgenic CD80 mRNA and transgenic CD80 protein for NG-347 virus in purified human T cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 21 показана трансгенная мРНК IFNa и MIP-1a, полученная с помощью вируса NG-347 в Тклетках по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 21 shows transgenic IFNa and MIP-1a mRNA generated by NG-347 virus in T cells compared to A549 tumor cells.

На фиг. 22 показана репликация генома NG-347 и NG-348 и экспрессия гена гексона мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) человека по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 22 shows NG-347 and NG-348 genome replication and hexon gene expression by human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) compared to A549 tumor cells.

На фиг. 23 показана мРНК CD80 и scFv к CD3, образованная вирусом NG-348 в МКПК по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 23 shows CD80 and anti-CD3 scFv mRNA generated by NG-348 virus in PBMC compared to A549 tumor cells.

На фиг. 24 показана мРНК CD80, IFNa и MIP-1a, образованная вирусом NG-347 в МКПК по сравнению с опухолевыми клетками А549.In FIG. 24 shows CD80, IFNa and MIP-1a mRNA produced by NG-347 virus in PBMCs compared to A549 tumor cells.

На фиг. 25 показана сходная активация дендритных клеток человека вирусными частицами EnAd, NG-347 и NG-348, которую измерили по снижению экспрессии CD14 и повышению экспрессии CD80 на поверхности клеток.In FIG. 25 shows similar activation of human dendritic cells by EnAd, NG-347 and NG-348 virus particles as measured by decreased CD14 expression and increased CD80 expression on the cell surface.

На фиг. 26 показана сходная опосредованная частицами секреция белков MIP-1a и IFNa из МКПК, культивированных с NG-348 (А) или NG-347 (В) по сравнению с EnAd.In FIG. 26 shows similar particle-mediated secretion of MIP-1a and IFNa proteins from PBMCs cultured with NG-348 (A) or NG-347 (B) compared to EnAd.

На фиг. 27 показана репликация генома NG-347 или NG-348 в совместных культурах Т-клеток или МКПК с клетками фибробластов MRC-5 по сравнению с совместными культурами с опухолевыми клетками А549.In FIG. 27 shows NG-347 or NG-348 genome replication in co-cultures of T cells or PBMCs with MRC-5 fibroblast cells compared to co-cultures with A549 tumor cells.

На фиг. 28 показан INFy, секретируемый МКПК или Т-клетками, совместно культивированными с клетками фибробластов MRC-5 по сравнению с опухолевыми клетками А549 и обработанными вирусом EnAd или NG-348.In FIG. 28 shows INFy secreted by PBMCs or T cells co-cultured with MRC-5 fibroblast cells compared to A549 tumor cells treated with EnAd or NG-348 virus.

На фиг. 29 показаны MIP1a и IFNa, секретируемые дендритными клетками человека, обработанными вирусными частицами EnAd, NG-347 или NG-348.In FIG. 29 shows MIP1a and IFNa secreted by human dendritic cells treated with EnAd, NG-347 or NG-348 viral particles.

- 16 042321- 16 042321

На фиг. 30 показана активация репортерного гена NF-кВ И IFN в репортерных Т-клетках JurkatDual, совместно культивированных с инфицированными EnAd, NG-347 или NG-348 опухолевыми клеткамиIn FIG. 30 shows NF-kB and IFN reporter gene activation in JurkatDual reporter T cells co-cultured with EnAd, NG-347 or NG-348 infected tumor cells.

А549.A549.

На фиг. 31 показана репортерная активность NF-кВ-люциферазы, продуцированная репортерными Т-клетками JurkatDual, совместно культивированными с обработанными EnAd, NG-347, NG-348 или NG420 опухолевыми клетками А549 НСТ-116, DLD и НТ29.In FIG. 31 shows NF-κB luciferase reporter activity produced by JurkatDual reporter T cells co-cultured with EnAd, NG-347, NG-348 or NG420 treated A549 HCT-116, DLD and HT29 tumor cells.

На фиг. 32 показана репортерная активность NF-кВ-люциферазы, продуцированная клетками JurkatDual, совместно культивированными с любыми из опухолевых клеток А549 или НТ29, инфицированных вирусом NG-348 и вирусом NG-420, как функция от добавленных вирусных частиц.In FIG. 32 shows NF-κB luciferase reporter activity produced by JurkatDual cells co-cultured with any of the A549 or HT29 tumor cells infected with NG-348 virus and NG-420 virus as a function of added viral particles.

На фиг. 33 показана фармакокинетика вируса EnAd и NG-348 в крови; уровни цитокинов в крови после воздействия вируса EnAd или NG-348; биораспределение по тканям вирусов EnAd или NG-348 через 6 или 24 ч после внутривенного (в/в) введения мышам CD1.In FIG. 33 shows the pharmacokinetics of EnAd and NG-348 virus in blood; levels of cytokines in the blood following exposure to the EnAd or NG-348 virus; tissue biodistribution of EnAd or NG-348 viruses 6 or 24 hours after intravenous (IV) administration to CD1 mice.

На фиг. 34 показана фармакокинетика в крови вирусов EnAd, NG-347 и NG-348 после в/в введения мышам CB17-SCID, несущим подкожный ксенотрансплантат опухоли НСТ-116.In FIG. 34 shows blood pharmacokinetics of EnAd, NG-347, and NG-348 viruses following iv administration to CB17-SCID mice bearing subcutaneous HCT-116 tumor xenograft.

На фиг. 35 показано распределение по тканям вирусов EnAd, NG-347 и NG-348 через 6 ч после внутривенного введения дозы несущим опухоль мышам CB17-SCID, и геномы вируса в ксенотрансплантатах опухоли НСТ-116 в день 7 и дни 14-21 после внутривенного или внутриопухолевого введения дозы EnAd, NG-347 и NG-348.In FIG. 35 shows the tissue distribution of EnAd, NG-347, and NG-348 viruses 6 h post-dose in tumor-bearing CB17-SCID mice, and virus genomes in HCT-116 tumor xenografts at day 7 and days 14-21 after intravenous or intratumoral dose administration of EnAd, NG-347 and NG-348.

На фиг. 36 показана мРНК гексона вируса, продуцированная в ксенотрансплантатах опухоли НСТ116 вирусами EnAd, NG-347 или NG-348 в день 7 или через 14 - 21 день после внутривенного или внутриопухолевого введения дозы.In FIG. 36 shows viral hexon mRNA produced in HCT116 tumor xenografts by EnAd, NG-347, or NG-348 viruses on day 7 or 14 to 21 days after intravenous or intratumoral dosing.

На фиг. 37 показаны уровни мРНК гексона и трансгена CD80 в ксенотрансплантатах опухоли НСТ116 через 7 или 21 день после внутривенного введения дозы вируса NG-348.In FIG. 37 shows mRNA levels of hexon and CD80 transgene in HCT116 tumor xenografts 7 or 21 days after intravenous dosing of NG-348 virus.

На фиг. 38 показаны уровни мРНК трансгенов, кодирующих scFv к CD3 и CD80, в ксенотрансплантатах опухоли НСТ-116 через 7 или 14-21 день после в/в введения дозы вируса NG-348.In FIG. 38 shows mRNA levels of anti-CD3 and CD80 scFv transgenes in HCT-116 tumor xenografts 7 or 14-21 days after iv dose of NG-348 virus.

На фиг. 39 показаны уровни мРНК трансгенов MIP-1a и IFNa в ксенотрансплантатах опухоли НСТ116 через 7 или 14-21 день после внутривенного введения дозы вируса NG-347.In FIG. 39 shows the mRNA levels of the MIP-1a and IFNa transgenes in HCT116 tumor xenografts 7 or 14-21 days after an intravenous dose of NG-347 virus.

На фиг. 40 показана экспрессия белка CD80 в ксенотрансплантатах опухоли НСТ-116 через 7 и 21 день после внутривенного введения дозы вируса NG-348; и показана экспрессия белка MIP-1a и CD80 в опухолях НСТ-116 после внутривенного введения дозы вируса NG-347.In FIG. 40 shows CD80 protein expression in HCT-116 tumor xenografts 7 and 21 days after intravenous dosing of NG-348 virus; and shows MIP-1a and CD80 protein expression in HCT-116 tumors after intravenous dosing with NG-347 virus.

На фиг. 41 показана повышенная экспрессия CD69 на большем количестве CD3+ Т-клеток человека после совместного культивирования с инфицированными NG-347 клетками А549, чем в случае инфицирования EnAd.In FIG. 41 shows increased expression of CD69 on more human CD3+ T cells after co-culture with NG-347 infected A549 cells than with EnAd infection.

На фиг. 42 показана индукция продукции IFNy CD3+ Т-клетками человека после совместного культивирования с инфицированными NG-347 клетками А549, но не в случае инфицирования EnAd.In FIG. 42 shows the induction of IFNy production by human CD3+ T cells after co-culture with NG-347 infected A549 cells, but not in the case of EnAd infection.

На фиг. 43 показана сравнимая онколитическая эффективность (фиг. 43) и инфицирующая способность (фиг. 43, таблица) EnAd и вирусов NG-348 в анализе цитотоксичности НТ-29.In FIG. 43 shows the comparable oncolytic potency (FIG. 43) and infectivity (FIG. 43, table) of EnAd and NG-348 viruses in the HT-29 cytotoxicity assay.

На фиг. 44 показан сигнальный путь суперсемейства TNF, взятый из Nature Reviews Immunology 3, 745-756 (сентябрь 2003 г.).In FIG. 44 shows the TNF superfamily signaling pathway taken from Nature Reviews Immunology 3, 745-756 (September 2003).

На фиг. 45-53 показаны различные последовательности аминокислот и полинуклеотидные последовательности.In FIG. 45-53 show various amino acid and polynucleotide sequences.

Краткое описание перечня последовательностейBrief description of the sequence listing

В настоящей заявке содержится 119 последовательностей, представленных в сопроводительном перечне последовательностей.The present application contains 119 sequences presented in the accompanying sequence listing.

SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот области VH антитела OKT3.SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence of the VH region of the OKT3 antibody.

SEQ ID NO: 2. Последовательность аминокислот области VH антитела OKT3.SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence of the VH region of the OKT3 antibody.

SEQ ID NO: 3. Последовательность аминокислот конструкции scFv содержит VH и VL OKT3.SEQ ID NO: 3. The amino acid sequence of the scFv construct contains VH and VL OKT3.

SEQ ID NO: 4. Последовательность аминокислот заякоренного в мембрану варианта scFv с последовательностью SEQ ID NO: 3.SEQ ID NO: 4. Amino acid sequence of the membrane-anchored scFv variant of SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

SEQ ID NOSEQID NO

5. Последовательность аминокислот, представленная в SEQ ID NO: 4, с меткой V5.5. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, labeled V5.

6. Последовательность аминокислот VH теплизумаба.6. Amino acid sequence of the VH of teplizumab.

7. Последовательность аминокислот VL теплизумаба.7. Amino acid sequence of Teplizumab VL.

8. Последовательность аминокислот тяжелой цепи теплизумаба.8. Amino acid sequence of the heavy chain of teplizumab.

9. Последовательность аминокислот легкой цепи теплизумаба.9. Amino acid sequence of the light chain of teplizumab.

10. Последовательность аминокислот PDGFR, рецептора А.10. Amino acid sequence of PDGFR, receptor A.

11. Последовательность аминокислот PDGFR, рецептора В.11. Amino acid sequence of PDGFR, B receptor.

12. Последовательность аминокислот инсулиноподобного фактора роста 1.12. Amino acid sequence of insulin-like growth factor 1.

13. Последовательность аминокислот IL-6R.13. Amino acid sequence of IL-6R.

14. Последовательность аминокислот CD28.14. The amino acid sequence of CD28.

15. Последовательность аминокислот ТМ домена PDGFR.15. Amino acid sequence of the TM domain of PDGFR.

16. Последовательность аминокислот метки c-myc.16. Amino acid sequence of c-myc tag.

- 17 042321- 17 042321

SEQ ID NO: 17. Последовательность аминокислот метки c-myc со спейсерами.SEQ ID NO: 17. Amino acid sequence of c-myc tag with spacers.

SEQ ID NO: 18. Последовательность аминокислот ТМ домена PDGFR с N-концевой меткой cmyc. SEQ ID NO: 19 Последовательность аминокислот лидерной последовательности VH человекаSEQ ID NO: 18. Amino acid sequence of PDGFR domain TM with cmyc N-terminal tag. SEQ ID NO: 19 Amino acid sequence of human VH leader sequence

HuVH.HuVH.

SEQ ID NO: 20. Последовательность аминокислот линкера.SEQ ID NO: 20. Amino acid sequence of the linker.

SEQ ID NO: 21. Полинуклеотидная последовательность генома EnAd.SEQ ID NO: 21. EnAd genome polynucleotide sequence.

SEQ ID NO: с 22 по 30. Последовательность аминокислот шарнирного линкера.SEQ ID NOs: 22 to 30. Amino acid sequence of the hinge linker.

SEQ ID NO: с 31 по 70. Последовательность аминокислот гибкого линкера.SEQ ID NOs: 31 to 70. Flexible linker amino acid sequence.

SEQ ID NO: с 71 по 86. Последовательность аминокислот линкера.SEQ ID NO: 71 to 86. Amino acid sequence of the linker.

SEQ ID NO: 87. Полинуклеотидная последовательность области Е2В генома EnAd (BP 10355-5068).SEQ ID NO: 87. Polynucleotide sequence of the E2B region of the EnAd genome (BP 10355-5068).

SEQ ID NO: 88. Полинуклеотидная последовательность некодирующей области, подходящей для включения в ВХ.SEQ ID NO: 88. Polynucleotide sequence of a non-coding region suitable for inclusion in BX.

SEQ ID NO: 89. Полинуклеотидная последовательность некодирующей области, подходящей для включения в BY.SEQ ID NO: 89. Polynucleotide sequence of a non-coding region suitable for inclusion in BY.

SEQ ID NO: 90 и 91. Полинуклеотидная последовательность акцептора сплайсинга.SEQ ID NOs: 90 and 91. Splice acceptor polynucleotide sequence.

SEQ ID NO: 92. Полинуклеотидная последовательность, содержащая инициирующий кодон.SEQ ID NO: 92. Polynucleotide sequence containing an initiation codon.

SEQ ID NO: 93. Полинуклеотидная последовательность IRES.SEQ ID NO: 93. IRES polynucleotide sequence.

SEQ ID NO: 94. Последовательность аминокислот самоотщепляющегося с высокой эффективностью пептида Р2А.SEQ ID NO: 94. Amino acid sequence of high efficiency self-cleaving peptide P2A.

SEQ ID NO: 95. Последовательность аминокислот самоотщепляющегося с высокой эффективностью пептида F2A.SEQ ID NO: 95. Amino acid sequence of high efficiency self-cleaving peptide F2A.

SEQ ID NO: 96. Последовательность аминокислот самоотщепляющегося с высокой эффективностью пептида Е2А.SEQ ID NO: 96. Amino acid sequence of high efficiency self-cleaving peptide E2A.

SEQ ID NO: 97. Последовательность аминокислот самоотщепляющегося с высокой эффективностью пептида Т2А.SEQ ID NO: 97. Amino acid sequence of the high efficiency self-cleaving peptide T2A.

SEQ ID NO: 98. Последовательность аминокислот CD80 человека.SEQ ID NO: 98. Amino acid sequence of human CD80.

SEQ ID NO: 99. Полинуклеотидная последовательность полиаденилирования (последовательность позднего поли(А) SV40).SEQ ID NO: 99. Polyadenylation polynucleotide sequence (SV40 late poly(A) sequence).

SEQ ID NO: 100. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-348.SEQ ID NO: 100. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-348 virus.

SEQ ID NO: 101. Последовательность аминокислот метки V5.SEQ ID NO: 101. Amino acid sequence of tag V5.

SEQ ID NO: 102. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-348A.SEQ ID NO: 102. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-348A virus.

SEQ ID NO: 103. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-420.SEQ ID NO: 103. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-420 virus.

SEQ ID NO: 104. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-420A.SEQ ID NO: 104. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-420A virus.

SEQ ID NO: 105. Последовательность аминокислот интерферон-а человека.SEQ ID NO: 105. Amino acid sequence of human interferon-a.

SEQ ID NO: 106. Последовательность аминокислот растворимого лиганда Flt3 человека.SEQ ID NO: 106. Amino acid sequence of soluble human Flt3 ligand.

SEQ ID NO: 107. Последовательность аминокислот воспалительного белка макрофагов человека 1а (изоформа LD78b).SEQ ID NO: 107. Amino acid sequence of human macrophage inflammatory protein 1a (LD78b isoform).

SEQ ID NO: 108. Последовательность аминокислот заякоренной в мембрану формы одноцепочечного Fv CD3 человека.SEQ ID NO: 108. Amino acid sequence of the membrane-anchored form of human single-chain Fv CD3.

SEQ ID NO: 109. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-330.SEQ ID NO: 109. Polynucleotide sequence of the NG-330 virus genome.

SEQ ID NO: 110. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-343.SEQ ID NO: 110. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-343 virus.

SEQ ID NO: 111. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-345.SEQ ID NO: 111. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-345 virus.

SEQ ID NO: 112. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-346.SEQ ID NO: 112. Polynucleotide sequence of the NG-346 virus genome.

SEQ ID NO: 113. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-347.SEQ ID NO: 113. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-347 virus.

SEQ ID NO: 114. Полинуклеотидная последовательность области E3 из EnAd.SEQ ID NO: 114. Polynucleotide sequence of the E3 region from EnAd.

SEQ ID NO: 115. Полинуклеотидная последовательность некодирующей области, подходящей для включения в BY.SEQ ID NO: 115. Polynucleotide sequence of a non-coding region suitable for inclusion in BY.

SEQ ID NO: 116. Полинуклеотидная последовательность генома вируса NG-348.SEQ ID NO: 116. Polynucleotide sequence of the genome of the NG-348 virus.

SEQ ID NO:117. Полинуклеотидная последовательность связанного с мембраной OKT3-scFv.SEQ ID NO:117. Polynucleotide sequence of membrane-bound OKT3-scFv.

SEQ ID NO: 118. Полинуклеотидная последовательность кассеты трансгенов из NG-348.SEQ ID NO: 118. Polynucleotide sequence of the transgene cassette from NG-348.

SEQ ID NO:119. Полинуклеотидная последовательность полностью синтетического генома EnAd с включенным сайтом клонирования для встраивания кассеты трансгенов, как в плазмиде pEnAd2.4.SEQ ID NO:119. The polynucleotide sequence of the fully synthetic EnAd genome with the included cloning site for insertion of the transgene cassette, as in the plasmid pEnAd2.4.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Т-клетки в окружении рака включают Т-клетки внутри опухоли и Т-клетки вблизи опухоли, например, Т-клетки снаружи опухоли, но способные сцепляться с опухолью или раковой клеткой, в частности, физически сцепляться с опухолью или раковой клеткой.T cells in a cancer environment include T cells within the tumor and T cells near the tumor, for example T cells outside the tumor but capable of bonding to the tumor or cancer cell, in particular physically bonding to the tumor or cancer cell.

Существуют доказательства, позволяющие предположить, что Т-клетки проникают в опухоли, и после того, как они оказались внутри, они инактивируются. Преимуществом способа согласно настоящему описанию является способность активировать Т-клетки внутри опухоли. В одном варианте реализации Т-клетки внутри опухоли активируются онколитическим вирусом или вирусным вектором соглас но настоящему описанию.There is evidence to suggest that T cells enter tumors and once inside they are inactivated. The advantage of the method according to the present description is the ability to activate T cells inside the tumor. In one embodiment, T cells within a tumor are activated with an oncolytic virus or viral vector as described herein.

В одном варианте реализации последовательность трансмембранного соединения или якоря, ис- 18 042321 пользуемая в настоящем описании, содержит ТМ домен PDGFR (например, ala513-arg561), такой как представленный в последовательности SEQ ID NO: 15.In one embodiment, the transmembrane junction or anchor sequence used herein contains the TM domain of a PDGFR (e.g., ala513-arg561), such as that shown in SEQ ID NO: 15.

В одном варианте реализации последовательность соединения или якоря, используемая в настоящем описании, содержит метку, присоединенную к рецептору PDGF или его фрагменту, такому как ТМ домен PDGFR. Подходящие метки включают His-метки, Flag-метки, метку c-myc и тому подобные метки. В частности, используемое соединение или якорь может включать метку c-myc, например, с последовательностью SEQ ID NO: 16 EQKLISEEDL, за которой следует ТМ домен PDGFR, для ala513-arg561, такой как представленный в последовательности SEQ ID NO: 15.In one embodiment, the connection or anchor sequence used herein contains a label attached to the PDGF receptor or fragment thereof, such as the TM domain of PDGFR. Suitable tags include His tags, Flag tags, c-myc tag, and the like. In particular, the compound or anchor used may include a c-myc tag, such as SEQ ID NO: 16 EQKLISEEDL followed by a PDGFR TM domain, for ala513-arg561, such as shown in SEQ ID NO: 15.

В одном варианте реализации метка c-myc содержит спейсер или аминокислоты спейсера на 3'и/или 5'-конце, например, представленный в последовательности SEQ ID NO: 17 gsEQKLISEEDLn.In one embodiment, the c-myc tag contains a spacer or spacer amino acids at the 3' and/or 5' end, such as those shown in SEQ ID NO: 17 gsEQKLISEEDLn.

В одном варианте реализации используемая последовательность соединения или якоря представлена в последовательности SEQ ID NO: 18.In one embodiment, the connection or anchor sequence used is shown in SEQ ID NO: 18.

Как правило, белок/полипептид, к которому присоединена последовательность соединения или якорь, не содержит стоп-кодон.Typically, the protein/polypeptide to which the compound sequence or anchor is attached does not contain a stop codon.

В одном варианте реализации лидерная последовательность для белка, который будут экспрессировать на поверхности раковой клетки, принадлежит человеку, например, лидерная последовательность VH человека (HuVH) (SEQ ID NO: 19).In one embodiment, the leader sequence for the protein to be expressed on the surface of the cancer cell is human, eg the human VH (HuVH) leader sequence (SEQ ID NO: 19).

В одном варианте реализации структура кассеты ОРС такая, как описано далееIn one embodiment, the structure of the OCR cassette is as described below

LS-POLY-TAG-TMD где LS представляет собой лидерную последовательность, например, лидерную последовательность человека;LS-POLY-TAG-TMD where LS is a leader sequence, eg a human leader;

POLY представляет собой полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид или белки, в частности, описанные в данной заявке;POLY is a polynucleotide encoding a polypeptide or proteins of interest, in particular those described in this application;

TAG представляет собой метку, например, описанную в данной заявке, такую как c-myc, в частности, описанную в данной заявке;TAG is a label, for example, described in this application, such as c-myc, in particular, described in this application;

TMD представляет собой ТМ домен, например, ТМ домен PDGFR, также описанный в данной заявке.TMD is a TM domain, for example, the TM domain of PDGFR, also described in this application.

Если указанный полипептид представляет собой scFv, то ОРС может быть такой, как описано далее LS-VAR1-LINK-VAR2-TAG-TMD где LS представляет собой лидерную последовательность, например, лидерную последовательность человека;If said polypeptide is a scFv, then the ORF may be as follows: LS-VAR1-LINK-VAR2-TAG-TMD where LS is a leader sequence, eg, a human leader sequence;

VAR1 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область, такую как область VH; LINK представляет собой линкер, например, описанный в данной заявке, такой как линкер на основе единиц G4S, в частности, с последовательностью SEQ ID NO: 20VAR1 is a polynucleotide encoding a variable region such as the VH region; LINK is a linker, for example, as described in this application, such as a linker based on G 4 S units, in particular with the sequence of SEQ ID NO: 20

GGGGSGGGGSGGGGS;GGGGSGGGGSGGGGS;

VAR2 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область, такую как область VL;VAR2 is a polynucleotide encoding a variable region such as the VL region;

TAG представляет собой метку, например, описанную в данной заявке, такую как c-myc, в частности, с последовательностью, описанной в данной заявке;TAG is a label, for example, described in this application, such as c-myc, in particular, with the sequence described in this application;

TMD представляет собой ТМ домен, например, ТМ домен PDGFR, например, с последовательностью, описанной в данной заявке.TMD is a TM domain, for example, the TM domain of PDGFR, for example, with the sequence described in this application.

В объем настоящего описания также входят варианты реализации, в частности, конкретно описанные в данной заявке, которые содержат метку на N- или С-концах полипептидных цепей, так что она находится внутри или снаружи мембраны. Таким образом, С-концевая метка, расположенная внутри мембраны, предпочтительна, так как она, вероятно, не препятствует связыванию или функционированию полипептида.The scope of the present description also includes implementation options, in particular, specifically described in this application, which contain a label at the N - or C-terminus of the polypeptide chains, so that it is inside or outside the membrane. Thus, an intra-membrane C-terminal tag is preferred as it is not likely to interfere with polypeptide binding or function.

Альтернативные способы применения трансмембранных доменов для экспрессии белков на поверхности инфицированной раковой клетки включают подходы с применением гликофосфолипидного якоря (также называемого GPI-якорем), присоединенного к С-концевой аминокислоте внеклеточного белка или его фрагмента (Low и др. 1986, Cross 1987, Low и Saltiel 1988, Ferguson и William 1988). Известные гликофосфолипидные якори включают таковые из Thy-1, N-CAM и DAF.Alternative methods of using transmembrane domains to express proteins on the surface of an infected cancer cell include approaches using a glycophospholipid anchor (also called a GPI anchor) attached to the C-terminal amino acid of an extracellular protein or fragment thereof (Low et al. 1986, Cross 1987, Low and Saltiel 1988, Ferguson and William 1988). Known glycophospholipid anchors include those of Thy-1, N-CAM and DAF.

В одном варианте реализации комбинацию трансмембранного домена и сигнальной последовательности секреции используют для экспрессии белка, кодируемого вирусом (например, описанным в данной заявке), на поверхности инфицированной раковой клетки. Авторы настоящего изобретения показали, что кодируемые белки экспрессируются только на клетках, которые позволяют инфицирование онколитическим вирусом, т.е., на раковых клетках.In one embodiment, a combination of a transmembrane domain and a secretion signal sequence is used to express a protein encoded by a virus (eg, as described herein) on the surface of an infected cancer cell. The present inventors have shown that the encoded proteins are only expressed on cells that allow infection with an oncolytic virus, ie cancer cells.

В одном варианте реализации фрагмент, используемый для экспрессии белка на поверхности инфицированной раковой клетки (такой как трансмембранный фрагмент), выбран из группы, включающей последовательности ТМ домена (минимальные участки), приведенные в последовательностях SEQ ID NO: с 10 по 15 (или с 10 по 14).In one embodiment, the fragment used to express a protein on the surface of an infected cancer cell (such as a transmembrane fragment) is selected from the group consisting of the TM domain sequences (minimum regions) shown in SEQ ID NOs: 10 to 15 (or 10 by 14).

- 19 042321- 19 042321

В одном варианте реализации трансмембранный домен из CD80 или CD86 используют для экспрессии белка на поверхности раковой клетки.In one embodiment, a transmembrane domain from CD80 or CD86 is used to express a protein on the surface of a cancer cell.

В одном варианте реализации фрагмент, используемый для экспрессии белка на поверхности инфицированной раковой клетки (такой как трансмембранный фрагмент), выбран из приблизительно от 20 до 25 гидрофобных аминокислот, которые образуют трансмембранную альфа-спираль, например, из белков, включающих рецептор PDGF, рецептор инсулиноподобного фактора роста, рецептор IL-6, CD28, гликофорин, рецептор LDL, белок гемагглютинин (НА) вируса гриппа, рецептор инсулина, рецептор асиалогликопротеина, рецептор трансферрина.In one embodiment, the fragment used to express a protein on the surface of an infected cancer cell (such as a transmembrane fragment) is selected from about 20 to 25 hydrophobic amino acids that form a transmembrane alpha helix, for example, from proteins including the PDGF receptor, the insulin-like receptor growth factor, IL-6 receptor, CD28, glycophorin, LDL receptor, influenza virus hemagglutinin (HA) protein, insulin receptor, asialoglycoprotein receptor, transferrin receptor.

В одном варианте реализации используемый трансмембранный домен получен из сопряженного с G-белком рецептора или антигена S из вируса гепатита В.In one embodiment, the transmembrane domain used is derived from a G protein-coupled receptor or S antigen from the hepatitis B virus.

В одном варианте реализации слитый белок, содержащий полноразмерный внеклеточный домен белка В7 или его фрагмента, а также трансмембранный домен, полученный из белка, отличного от В7, устроен таким образом, что белок В7 расположен на конце слитого белка, удаленном от поверхности раковой клетки, то есть, снаружи раковой клетки, обращенный во внеклеточное пространство.In one embodiment, a fusion protein containing the full-length extracellular domain of the B7 protein or fragment thereof, as well as a transmembrane domain derived from a protein other than B7, is arranged in such a way that the B7 protein is located at the end of the fusion protein remote from the surface of the cancer cell, then is, outside the cancer cell, facing the extracellular space.

Наличие последовательности ДНК, кодирующей В7 или его активный фрагмент, под контролем эндогенного промотора также является преимуществом, так как белок экспрессируется в соответствии с жизненным циклом вируса, в противоположность конститутивной экспрессии. В данной ситуации непрерывная экспрессия под контролем экзогенного промотора, например, сильного промотора, такого как промотор CMV, может продуцировать больше белка В7, чем это необходимо для терапевтического действия, и приводить к побочным эффектам.The presence of a DNA sequence encoding B7 or its active fragment under the control of an endogenous promoter is also an advantage, since the protein is expressed in accordance with the life cycle of the virus, as opposed to constitutive expression. In this situation, continuous expression under the control of an exogenous promoter, for example a strong promoter such as the CMV promoter, can produce more B7 protein than is necessary for therapeutic action and lead to side effects.

В одном варианте реализации онколитический вирус согласно настоящему описанию представляет собой аденовирус, например, аденовирус группы В. В одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию представляет собой химерный вирус, например, EnAd. В одном варианте реализации аденовирус способен реплицироваться.In one embodiment, the oncolytic virus as described herein is an adenovirus, eg, group B adenovirus. In one embodiment, the virus as described herein is a chimeric virus, eg, EnAd. In one embodiment, the adenovirus is capable of replicating.

В одном варианте реализации онколитический вирус способен реплицироваться, например, обладает способностью реплицироваться.In one embodiment, the oncolytic virus is capable of replicating, eg, has the ability to replicate.

Термин способный реплицироваться, используемый в данной заявке, относится к вирусу, который может реплицироваться в клетке-хозяине. В одном варианте реализации в объем термина способный реплицироваться входят способные к репликации и селективно реплицирующиеся вирусы.The term replicable as used in this application refers to a virus that can replicate in a host cell. In one embodiment, the scope of the term replicable includes both replicable and selectively replicating viruses.

Предполагается, что термин способный реплицироваться, используемый в данной заявке означает онколитический вирус, который способен реплицироваться в клетке человека, такой как раковая клетка, без какой-либо дополнительной комплементации, которая необходима вирусам дикого типа, например, не полагаясь на неполноценный клеточный аппарат.The term replicable as used herein is intended to mean an oncolytic virus that is capable of replicating in a human cell, such as a cancer cell, without any additional complementation required by wild-type viruses, such as relying on a defective cellular machinery.

Предполагается, что термин селективно реплицируемый или селективная репликация, используемый в данной заявке, означает онколитический вирус, который способен реплицироваться в раковых клетках, используя элемент, который специфичен для указанных раковых клеток или экспрессия которого в них повышена, например, неполноценный клеточный аппарат, например, с мутацией в p53, что позволяет некоторую степень селективности над здоровыми/нормальными клетками.The term selectively replicating or selective replication as used herein is intended to mean an oncolytic virus that is capable of replicating in cancer cells using an element that is specific to or overexpressed in said cancer cells, e.g., a defective cellular apparatus, e.g. with a mutation in p53 that allows some degree of selectivity over healthy/normal cells.

Способный реплицироваться онколитический вирус представляет собой способный реплицироваться вирус, который преимущественно инфицирует раковые клетки. То есть, они селективны по отношению к опухоли в том, что предпочтительнее инфицируют опухолевые клетки, чем неопухолевые клетки. EnAd представляет собой пример способного реплицироваться вируса.A replicable oncolytic virus is a replicable virus that preferentially infects cancer cells. That is, they are tumor selective in that they infect tumor cells rather than non-tumor cells. EnAd is an example of a virus that can replicate.

В одном варианте реализации указанный вирус неспособен реплицироваться и предложен в виде вирусного вектора. Для вирусных векторов требуется пакующая клетка или помощник, который предоставит комплементарный ген, чтобы позволить репликацию.In one embodiment, said virus is unable to replicate and is provided as a viral vector. Viral vectors require a packaging cell or helper to provide a complementary gene to allow replication.

Неспособный реплицироваться онколитический вирусный вектор, используемый в данной заявке, относится к неспособному реплицироваться вирусу, который предпочтительно инфицирует раковые клетки. То есть, они селективны по отношению к опухоли, инфицируя предпочтительнее опухолевые клетки, чем неопухолевые клетки, например, вирусный вектор получают из способного реплицироваться онколитического вируса путем делеции гена, необходимого для репликации.The replication-incapable oncolytic viral vector used herein refers to a replication-incapable virus that preferentially infects cancer cells. That is, they are tumor selective, infecting tumor cells rather than non-tumor cells, for example, a viral vector is obtained from a replicable oncolytic virus by deleting a gene necessary for replication.

В одном варианте реализации неспособные реплицироваться онколитические вирусные векторы согласно настоящему описанию.In one embodiment, replication-incapable oncolytic viral vectors as described herein.

В одном варианте реализации ген, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) расположен между стоп-кодоном и сайтом распознавания поли(А) гена L5 аденовируса и стоп-кодоном и сайтом распознавания поли(А) гена Е4.In one embodiment, a gene encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) is located between the stop codon and poly(A) recognition site of the adenovirus L5 gene and the stop codon and poly(A) recognition site. (A) E4 gene.

В одном варианте реализации ген, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела) расположен между парами оснований приблизительно 29356 и приблизительно 29357 генома EnAd, например, как показано в последовательности SEQ ID NO: 21, или в положении, эквивалентном указанному. Для специалиста должно быть очевидно, что абсолютное числовое значение положения может изменяться в зависимости от способа нумерации.In one embodiment, the gene encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) is located between base pairs approximately 29356 and approximately 29357 of the EnAd genome, for example, as shown in the sequence of SEQ ID NO: 21 , or in a position equivalent to that specified. It should be obvious to one skilled in the art that the absolute numerical value of the position may vary depending on the numbering method.

- 20 042321- 20 042321

Компонент, представляющий собой антитело к CD3, способствует стимуляции Т-клеток in vivo, например, Т-клеток в окружении раковой клетки, чтобы нацелить их на раковые клетки.The anti-CD3 antibody component promotes in vivo stimulation of T cells, such as T cells in the environment of a cancer cell, to target them to the cancer cells.

Термин иммуномодулятор, используемый в данной заявке, означает модулятор иммунного ответа. Функция иммуномодуляторов состоит в регулировке иммунного ответа до желательного уровня, как при иммунопотенциировании, подавлении иммунитета или индукции иммунологической толерантности.The term immunomodulator as used in this application means an immune response modulator. The function of immunomodulators is to regulate the immune response to a desired level, as in immunopotentiation, immune suppression, or the induction of immunological tolerance.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела (в частности, ингибиторное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела), специфичного к мишени, выбранной из группы, включающей CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT или CD160, например, CTLA-4, PD-1, PD-L1 и PD-L2.In one embodiment, the immunomodulator is an antibody or a binding fragment of an antibody (in particular, an inhibitory antibody or a binding fragment of said antibody) specific to a target selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT or CD160, such as CTLA-4, PD-1, PD- L1 and PD-L2.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела (в частности, ингибиторное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела), специфичного к мишени, выбранной из группы, включающей CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b и галектин-3.In one embodiment, the immunomodulator is an antibody or a binding fragment of an antibody (in particular, an inhibitory antibody or a binding fragment of said antibody) specific to a target selected from the group consisting of CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b and galectin-3.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела, специфичного к мишени, выбранной из группы, включающей: FLT-3, лиганд FLT-3, TLR, лиганды TLR, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, лиганд GITR, IFN-a2, IL-12, IL23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, рецептор TSLP, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 и CD304.In one embodiment, the immunomodulator is an antibody or binding fragment of an antibody specific to a target selected from the group consisting of: FLT-3, FLT-3 ligand, TLR, TLR ligands, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83 , CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR ligand, IFN-a2, IL-12, IL23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP receptor, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 and CD304.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела, специфичного к мишени, выбранной из группы, включающей ОХ40, лиганд ОХ40, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганд CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS и лиганд ICOS, например, CD40 и лиганд CD40.In one embodiment, the immunomodulator is an antibody or binding fragment of an antibody specific for a target selected from the group consisting of OX40, OX40 ligand, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 ligand, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, and an ICOS ligand, such as CD40; and a CD40 ligand.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки, выбранный из группы, включающей CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, В7-Н4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT или CD160, например, CTLA-4, PD-1, PD-L1 и PD-L2.In one embodiment, the immunomodulator is a membrane-bound protein ligand for immune cell surface receptors selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT or CD160 such as CTLA-4, PD-1, PD-L1 and PD-L2.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки, выбранный из группы, включающей CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b и галектин-3.In one embodiment, the immunomodulator is a membrane-bound protein ligand for immune cell surface receptors selected from the group consisting of CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b, and galectin-3.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки, выбранный из группы, включающей: FLT-3, лиганд FLT-3, TLR, лиганды TLR, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, лиганд GITR, IFN-a2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, рецептор TSLP, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 и CD304.In one embodiment, the immunomodulator is a membrane bound protein ligand for immune cell surface receptors selected from the group consisting of: FLT-3, FLT-3 ligand, TLR, TLR ligands, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80 , CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR ligand, IFN-a2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP receptor, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 and CD304.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой связанный с мембраной белковый лиганд для поверхности иммунной клетки, выбранный из группы, включающей ОХ40, лиганд ОХ40, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганд CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS и лиганд ICOS, например, CD40 и лиганд CD40.In one embodiment, the immunomodulator is a membrane-bound immune cell surface protein ligand selected from the group consisting of OX40, OX40 ligand, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 ligand, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, and an ICOS ligand, such as CD40; and a CD40 ligand.

В одном варианте реализации иммуномодулятор представляет собой антитело или связывающий фрагмент антитела, специфичного к мишени, выбранной из группы, включающей IL-1a, IL-1e, IL-6, IL9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, интерлейкин-2 (IL-2), IL4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNa, IFNe, IFNy, TNFa, TGFe, лимфотоксин a (LTA) и GM-CSF.In one embodiment, the immunomodulator is an antibody or binding fragment of an antibody specific for a target selected from the group consisting of IL-1a, IL-1e, IL-6, IL9, IL-12, IL-13, IL-17, IL- 18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, interleukin-2 (IL-2), IL4, IL-5, IL -7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNa, IFNe, IFNy, TNFa, TGFe, lymphotoxin a (LTA), and GM-CSF.

В одном варианте реализации онколитический аденовирус согласно настоящему описанию отвечает формуле (I)In one embodiment, an oncolytic adenovirus as described herein is of formula (I)

5’ITR-B1-BA-B2-Bx-Bb-By-B3-3’ITR (I) где В1 представляет собой связь или включает: Е1А, Е1В или Е1А-Е1В;5'ITR-B 1 -B A -B2-B x -B b -B y -B3-3'ITR (I) where B1 is a bond or includes: E1A, E1B or E1A-E1B;

BA представляет собой E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;B A is E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;

B2 представляет собой связь или включает E3 или трансген, например, под контролем эндогенного или экзогенного промотора;B 2 is a bond or includes an E3 or a transgene, eg under the control of an endogenous or exogenous promoter;

BX представляет собой связь или последовательность ДНК содержащую: сайт рестрикции, один или более трансгенов или и то, и другое;BX is a DNA bond or sequence containing: a restriction site, one or more transgenes, or both;

BB включает L5;BB includes L5;

BY включает трансген, кодирующий белок В7 или его активный фрагмент; иBY includes a transgene encoding the B7 protein or its active fragment; And

B3 представляет собой связь или включает Е4.B 3 is a bond or includes E4.

В одном варианте реализации онколитический вирус отвечает формуле (Ia):In one embodiment, the oncolytic virus is of formula (Ia):

5’ITR-B! -В Α-Β2-ΒΒ-Β γ-Β3-3 ’ITR (la) где В1 представляет собой связь или включает: Е1А, Е1В или Е1А-Е1В;5'ITR-B! -B Α -Β 2 -Β Β -Β γ-Β 3 -3 'ITR (la) where B1 is a bond or includes: E1A, E1B or E1A-E1B;

- 21 042321- 21 042321

BA представляет собой E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;BA is E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;

B2 представляет собой связь или включает E3;B 2 is a bond or includes E3;

BB включает L5;B B includes L5;

BY включает трансген, кодирующий белок В7 или его активный фрагмент; иBY includes a transgene encoding the B7 protein or its active fragment; And

B3 представляет собой связь или включает Е4.B 3 is a bond or includes E4.

В одном варианте реализации геном вируса в конструкциях формул (I) и/или (Ia) получен из Ad11 или EnAd, в частности, из EnAd.In one embodiment, the genome of the virus in the constructs of formulas (I) and/or (Ia) is derived from Ad11 or EnAd, in particular from EnAd.

В одном варианте реализации трансген, кодирующий антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), находится под контролем эндогенного промотора, например, главного позднего промотора.In one embodiment, the transgene encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) is under the control of an endogenous promoter, such as a major late promoter.

В одном варианте реализации BY включает кассету трансгенов, указанная кассета содержит трансген, кодирующий белок В7 или его фрагмент, и регуляторный элемент, такой как комбинация регуляторных элементов.In one embodiment, the BY includes a transgene cassette, said cassette containing a transgene encoding a B7 protein or fragment thereof, and a regulatory element, such as a combination of regulatory elements.

В одном варианте реализации регуляторный элемент представляет собой акцепторную последовательность сплайсинга.In one embodiment, the regulatory element is a splicing acceptor sequence.

В одном варианте реализации регуляторный элемент представляет собой последовательность Козак.In one embodiment, the regulatory element is a Kozak sequence.

В одном варианте реализации, например, когда трансген кодирует полицистронную молекулу РНК, регуляторный элемент представляет собой последовательность IRES.In one embodiment, for example, when the transgene encodes a polycistronic RNA molecule, the regulatory element is an IRES sequence.

В одном варианте реализации регуляторная последовательность представляет собой самоотщепляющуюся с высокой эффективностью последовательность пептида, такого как Р2А, Т2А, F2A, Е2А.In one embodiment, the regulatory sequence is a highly efficient self-cleaving peptide sequence, such as P2A, T2A, F2A, E2A.

В одном варианте реализации регуляторная последовательность представляет собой поли(А)-хвост.In one embodiment, the regulatory sequence is a poly(A) tail.

В одном варианте реализации присутствуют по меньшей мере две регуляторные последовательности, например, акцепторный сайт сплайсинга и последовательность Козак или акцепторный сайт сплайсинга и поли(А)-хвост, или акцепторный сайт сплайсинга и последовательность IRES, или акцепторный сайт сплайсинга и последовательность Р2А.In one embodiment, at least two regulatory sequences are present, e.g., a splice acceptor site and a Kozak sequence, or a splice acceptor site and a poly(A) tail, or a splice acceptor site and an IRES sequence, or a splice acceptor site and a P2A sequence.

В одном варианте реализации присутствуют по меньшей мере три регуляторные последовательности, например, акцепторная последовательность сплайсинга, последовательность Козак и поли(А)-хвост, или акцепторная последовательность сплайсинга, последовательность IRES или 2А и поли(А)-хвост; или акцепторная последовательность сплайсинга, последовательность Козак и последовательность IRES или 2А.In one embodiment, at least three regulatory sequences are present, for example, a splicing acceptor sequence, a Kozak sequence and a poly(A) tail, or a splicing acceptor sequence, an IRES or 2A sequence and a poly(A) tail; or a splicing acceptor sequence, a Kozak sequence, and an IRES sequence, or 2A.

В одном варианте реализации присутствуют по меньшей мере четыре регуляторные последовательности, например, акцепторная последовательность сплайсинга, последовательность Козак, последовательность IRES или 2А и поли(А)-хвост, в частности, от L5 до Е4 в следующем порядке: акцепторная последовательность сплайсинга, последовательность Козак, последовательность IRES или 2А и поли(А)хвост.In one embodiment, at least four regulatory sequences are present, e.g., splice acceptor sequence, Kozak sequence, IRES or 2A sequence, and poly(A) tail, specifically from L5 to E4 in the following order: splice acceptor sequence, Kozak sequence , IRES sequence or 2A and poly(A) tail.

В одном варианте реализации трансген кодирует полицистронную молекулу РНК, содержащую обе регуляторные последовательности IRES и 2А.In one embodiment, the transgene encodes a polycistronic RNA molecule containing both the IRES and 2A regulatory sequences.

В одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует белок В7, независимо выбранный из В7-1, В7-2, B7-DC, В7-Н1, В7-Н2, В7-НЗ, В7-Н4, В7-Н5, В7-Н6, В7-Н7, его активных фрагментов и комбинаций перечисленных белков. В одном варианте реализации белок В7 представляет собой В7-1 (CD80), В7-2 (CD86) или активный фрагмент любого из указанных белков и комбинации перечисленных белков, в частности, В7-1 или его активный фрагмент.In one embodiment, the non-adenoviral virus encodes a B7 protein independently selected from B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7- H6, B7-H7, its active fragments and combinations of the listed proteins. In one embodiment, the B7 protein is B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) or an active fragment of any of these proteins and a combination of these proteins, in particular B7-1 or an active fragment thereof.

В одном варианте реализации фрагмент В7 включает или состоит из трансмембранного домена из белка В7, в частности, описанного в данной заявке, такого как В7-1. Считают, что данный домен способствует экспрессии на поверхности клетки.In one embodiment, the B7 fragment comprises or consists of a transmembrane domain from the B7 protein, specifically as described herein, such as B7-1. This domain is believed to promote expression on the cell surface.

В одном варианте реализации цитоплазматический домен белка В7 присутствует. В одном варианте реализации цитоплазматический домен отсутствует. Отсутствие цитоплазматического домена может уменьшать или исключать внутриклеточную передачу сигналов раковой клетки, что рассматривается в одном или более вариантах реализации, обсуждаемых ниже.In one embodiment, the cytoplasmic domain of the B7 protein is present. In one embodiment, the cytoplasmic domain is absent. The absence of a cytoplasmic domain may reduce or eliminate intracellular signaling of the cancer cell, as contemplated in one or more embodiments discussed below.

Элементы во фрагменте или полноразмерном белке В7 могут быть из того же или отличных белков В7. Таким образом, в одном варианте реализации фрагмент или белок В7 химерный.Elements in a fragment or full-length B7 protein may be from the same or different B7 proteins. Thus, in one embodiment, the B7 fragment or protein is chimeric.

В одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию кодирует множество белков для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки, например, не относящийся к аденовирусам вирус кодирует по меньшей мере один белок В7 или его активный фрагмент, например, кодирует два, три, четыре или более различных белков, в частности, два или три белка кодируются вирусом для экспрессии на поверхности раковой клетки или секреции во внеклеточное пространство.In one embodiment, a virus as described herein encodes a plurality of proteins for expression on the surface of an infected cancer cell, e.g., a non-adenoviral virus encodes at least one B7 protein or active fragment thereof, e.g., encodes two, three, four or more different proteins in particular, two or three proteins are encoded by the virus for expression on the surface of the cancer cell or secretion into the extracellular space.

В одном варианте реализации не относящимся к аденовирусам вирусом согласно настоящему описанию кодирует белок В7 или его активный фрагмент для экспрессии на поверхности раковой клетки, и указанный вирус также кодирует растворимая форма, которая высвобождается или секретируется из клетки, того же белка В7 или отличного белка В7 (включая их активные фрагменты).In one embodiment, the non-adenoviral virus of the present disclosure encodes a B7 protein, or active fragment thereof, for expression on the surface of a cancer cell, and said virus also encodes a soluble form that is released or secreted from the cell of the same B7 protein or a different B7 protein ( including their active fragments).

В одном варианте реализации не относящий к аденовирусам вирус согласно настоящему описанию кодирует по меньшей мере два различных белка В7 или их активных фрагмента.In one embodiment, the non-adenoviral virus of the present disclosure encodes at least two different B7 proteins or active fragments thereof.

- 22 042321- 22 042321

В одном варианте реализации может кодироваться множество белков для экспрессии в виде отдельных белков, которые независимо процессируются и экспрессируются в мембране раковой клетки. Независимость белков на поверхности раковой клетки может внести положительный вклад в активацию иммунной системы. Без привязки к какой-либо конкретной теории, упаковка липидов может влиять на текучесть (т.е., вязкость) липидного бислоя в мембране раковой клетки. Вязкость мембраны может влиять на вращение и ориентацию белков и других биомолекул внутри мембраны, что влияет на функции данных молекул. Таким образом, когда белки, кодируемые вирусом, расположены в виде одиночных и отдельных белков внутри мембраны инфицированной раковой клетки, текучесть липидного бислоя позволяет независимое движение молекул, что может быть особенно подходящим форматом, аналогичным природному формату, что приводит к биологическому функционированию.In one embodiment, a plurality of proteins may be encoded for expression as separate proteins that are independently processed and expressed in the membrane of the cancer cell. The independence of proteins on the surface of a cancer cell can positively contribute to the activation of the immune system. Without being bound by any particular theory, lipid packaging can affect the fluidity (ie, viscosity) of the lipid bilayer in the cancer cell membrane. Membrane viscosity can affect the rotation and orientation of proteins and other biomolecules within the membrane, which affects the function of these molecules. Thus, when the proteins encoded by the virus are located as single and separate proteins within the membrane of an infected cancer cell, the fluidity of the lipid bilayer allows independent movement of the molecules, which may be a particularly suitable format, similar to the natural format, resulting in biological functioning.

В одном варианте реализации независимо процессированные и экспрессированные белки находятся (заякорены) в различных положениях, таких как физически отдельные положения, в мембране раковой клетки.In one embodiment, the independently processed and expressed proteins are (anchored) at different positions, such as physically separate positions, in the cancer cell membrane.

В одном варианте реализации один или более белков (например, все белки), кодируемых вирусом и экспрессируемых на поверхности инфицированной раковой клетки, не являются слитыми белками.In one embodiment, one or more proteins (eg, all proteins) encoded by the virus and expressed on the surface of the infected cancer cell are not fusion proteins.

Таким образом, в одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию содержит последовательности ДНК, кодирующие указанное множество белков для экспрессии, например, на поверхности инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the implementation of the virus according to the present description contains DNA sequences encoding the specified set of proteins for expression, for example, on the surface of an infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию содержит два или более трансгенов в одном и том же или различных положениях в геноме вируса. При расположении в одном и том же положении в геноме вируса, указанное множество белков все же будет экспрессироваться независимо на поверхности раковой клетки.Thus, in one embodiment, the virus according to the present description contains two or more transgenes in the same or different positions in the genome of the virus. When located in the same position in the genome of the virus, the specified set of proteins will still be expressed independently on the surface of the cancer cell.

В одном варианте реализации указанное множество белков (включая слитые белки) кодируются в различных положениях в геноме вируса, например, в E3, BX и/или BY и экспрессируются отдельно на поверхности инфицированной раковой клетки.In one embodiment, said plurality of proteins (including fusion proteins) are encoded at different positions in the viral genome, eg, E3, BX, and/or BY, and expressed separately on the surface of an infected cancer cell.

В одном варианте реализации указанное множество белков (включая слитые белки) кодируются в одном и том же положении в геноме вируса и экспрессируются вместе на поверхности инфицированной раковой клетки, например, когда кодируемые белки предусмотрены в виде слитого белка, при этом указанный слитый белок содержит белок В7 или его активный фрагмент.In one embodiment, said plurality of proteins (including fusion proteins) are encoded at the same position in the viral genome and expressed together on the surface of an infected cancer cell, for example, when the encoded proteins are provided as a fusion protein, said fusion protein comprising the B7 protein or its active fragment.

В одном варианте реализации белок В7 в указанном слитом белке представляет собой полноразмерный белок, в частности, белок, описанный в данной заявке, такой как В7-1 и/или В7-2, слитый или связанный с другим интересующим белком или его активным фрагментом. В одном варианте реализации слитый белок содержит трансмембранный домен из белка В7. В одном варианте реализации В7 представляет собой активный фрагмент за исключением трансмембранного домена. В последнем варианте реализации можно использовать трансмембранный домен, отличный от полученного из белка В7, чтобы гарантировать, что слитый белок будет представлен на поверхности инфицированной раковой клетки.In one embodiment, the B7 protein in said fusion protein is a full-length protein, in particular a protein as described herein, such as B7-1 and/or B7-2, fused to or linked to another protein of interest or an active fragment thereof. In one embodiment, the fusion protein contains a transmembrane domain from the B7 protein. In one embodiment, B7 is an active fragment excluding the transmembrane domain. In the latter embodiment, a transmembrane domain other than that derived from the B7 protein can be used to ensure that the fusion protein is presented on the surface of the infected cancer cell.

В одном варианте реализации множество белков кодируются в одном и том же положении в вирусе и экспрессируются вместе в виде слитых белков на поверхности инфицированной раковой клетки.In one embodiment, multiple proteins are encoded at the same position in the virus and expressed together as fusion proteins on the surface of an infected cancer cell.

Когда положение в вирусе одно и то же, то указанные гены, например, могут быть связаны с помощью последовательности IRES или пептида 2А.When the position in the virus is the same, then these genes, for example, can be linked using an IRES sequence or a 2A peptide.

В одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию содержит второй трансген и необязательно третий трансген (т.е. один или более из указанного множества белков, например, кодирующих полипептид, выбранный из группы, включающей цитокин, хемокин, лиганд, молекулу антагонистического антитела и молекулу агонистического антитела).In one embodiment, the virus according to the present description contains a second transgene and optionally a third transgene (i.e., one or more of the specified set of proteins, for example, encoding a polypeptide selected from the group including a cytokine, a chemokine, a ligand, an antagonistic antibody molecule, and an agonistic molecule antibodies).

В одном варианте реализации дополнительный белок или белки независимо выбраны из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или белковый лиганд, который связывает CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1ВВ, GITR, OX40, CD27, CD40 и комбинации перечисленных белков, в формах, подходящих для экспрессии на поверхности раковой клетки.In one embodiment, the additional protein or proteins are independently selected from the group consisting of an antibody, antibody fragment, or protein ligand that binds CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, and combinations of these proteins, in the forms suitable for expression on the surface of a cancer cell.

В одном варианте реализации, когда первый трансген специфичен к альфа- и/или бета-цепи TCR, дополнительный белок представляет собой антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела, например, независимо выбранный из муромонаба-CD3 (также известного как OKT3), отеликсизумаба (также известного как TRX4), теплизумаба (также известного как hOKT3y1(Ala-Ala)) или визилизумаба.In one embodiment, when the first transgene is specific for the TCR alpha and/or beta chain, the additional protein is an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody, e.g., independently selected from muromonab-CD3 (also known as OKT3), oxizumab hotels ( also known as TRX4), teplizumab (also known as hOKT3y1(Ala-Ala)) or vizilizumab.

В одном варианте реализации антитело к TCR находится в форме фрагмента антитела (такого как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), например, в форме scFv, который является частью слитого белка с трансмембранным участком другого белка, например, трансмембранным доменом из рецептора PDGF или из экспрессируемой на поверхности клетки формы IgG.In one embodiment, the anti-TCR antibody is in the form of an antibody fragment (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody), such as an scFv that is part of a fusion protein with a transmembrane region of another protein, such as the transmembrane domain from the PDGF receptor or from the IgG form expressed on the cell surface.

В одном варианте реализации ингибирующее антитело (антагонистическое антитело) независимо выбрано из группы, включающей ингибитор фактора ангиогенеза, такой как молекула антитела к VEGF, и ингибитор деактивирующих Т-клетки факторов, такой как молекула антитела к CTLA-4, к PD1 или к PDL1. В одном варианте реализации молекула антитела представляет собой агонист, независимо выбранный из группы, включающей антитела к CD40, GITR, OX40, CD27 и 4-1BB.In one embodiment, the inhibitory antibody (antagonist antibody) is independently selected from the group consisting of an angiogenesis factor inhibitor, such as an anti-VEGF antibody molecule, and an inhibitor of T cell deactivating factors, such as an anti-CTLA-4, anti-PD1, or anti-PDL1 antibody molecule. In one embodiment, the antibody molecule is an agonist independently selected from the group consisting of antibodies to CD40, GITR, OX40, CD27, and 4-1BB.

- 23 042321- 23 042321

В одном варианте реализации дополнительный трансген кодирует цитокин, или его растворимый вариант, выбранный из группы, включающей IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, IL-15, IL12 и лиганд fins-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L). Преимущество состоит в том, что один или более из данной группы белков, экспрессируемых вирусом, в частности, в виде свободного белка, секретируемого из раковой клетки, могут быть особенно подходящими для стимуляции иммунного ответа in vivo на раковую клетку.In one embodiment, the additional transgene encodes a cytokine, or a soluble variant thereof, selected from the group consisting of IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, IL-15, IL12, and a fins-like tyrosine kinase ligand. 3 (FLT3L). Advantageously, one or more of this group of proteins expressed by the virus, in particular as a free protein secreted from the cancer cell, may be particularly suitable for stimulating an in vivo immune response against the cancer cell.

В одном варианте реализации указанный дополнительный трансген кодирует хемокин, выбранный из группы, включающей MIP1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 и CCL21. Преимущество состоит в том, что один или более из данной группы белков экспрессируются вирусом в виде свободного белка, который может секретироваться из раковой клетки, и могут быть особенно подходящими для привлечения иммунных клеток и стимуляции иммунного ответа на раковую клетку in vivo.In one embodiment, said additional transgene encodes a chemokine selected from the group consisting of MIP1 alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, and CCL21. Advantageously, one or more of this group of proteins are expressed by the virus as a free protein that can be secreted from the cancer cell and may be particularly suitable for attracting immune cells and stimulating an immune response to the cancer cell in vivo.

В одном варианте реализации указанный дополнительный трансген кодирует лиганд, специфичный к рецептору хемокинов, выбранному из группы, включающей CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 и CRTH2.In one embodiment, said additional transgene encodes a ligand specific for a chemokine receptor selected from the group consisting of CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5, and CRTH2.

В одном варианте реализации дополнительно к по меньшей мере антителу к TCR или его связывающему фрагменту (такому как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), экспрессируемому на поверхности инфицированной раковой клетки, одна или более молекул также экспрессируются на поверхности и/или секретируются.In one embodiment, in addition to at least an anti-TCR antibody or binding fragment thereof (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) expressed on the surface of an infected cancer cell, one or more molecules are also surface expressed and/or secreted.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes for B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело к TCR (агонист, такой как агонист CD3) или фрагмент антитела (такой как scFv) также для экспрессии на поверхности раковой клетки, в частности, когда указанные белки экспрессируются в виде отдельных белков на поверхности клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2 or an active fragment of any of the listed proteins or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell and an anti-TCR antibody (an agonist such as a CD3 agonist), or an antibody fragment (such as scFv) also for expression on the surface of a cancer cell, in particular when said proteins are expressed as individual proteins on the cell surface.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело к VEGF (антагонист) также для экспрессии на поверхности раковой клетки или для высвобождения из раковой клетки, например, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof, for expression on the surface of an infected cancer cell, and an anti-VEGF antibody (antagonist) also for expression on the surface of a cancer cell. cells or for release from the cancer cell, for example by secretion or after lysis/death of the infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело, фрагмент антитела или белковый лиганд, который связывает CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1ВВ, GITR, OX40, CD27, CD40 также для экспрессии на поверхности раковой клетки или для высвобождения из раковой клетки, например, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenovirus virus encodes B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof, for expression on the surface of an infected cancer cell, and an antibody, antibody fragment, or protein ligand that binds CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40 also for expression on the surface of the cancer cell or for release from the cancer cell, eg by secretion or after lysis/death of the infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и цитокин, выбранный из IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFNгамма, GM-CSF, IL-15, IL-12 и FLT3L, например, для высвобождения из раковой клетки, в частности, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenovirus virus encodes B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell, and a cytokine selected from IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, IL-15, IL-12 and FLT3L, for example, for release from the cancer cell, in particular by secretion or after lysis/death of the infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и хемокин, выбранный из MIP1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, например, для высвобождения из раковой клетки, в частности, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell, and a chemokine selected from MIP1-alpha, RANTES, IL- 8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, for example, for release from a cancer cell, in particular by secretion or after lysis/death of an infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело к TCR (агонист, такой как агонист CD3) или фрагмент антитела (такой как scFv) также для экспрессии на поверхности раковой клетки (в частности, когда указанные белки экспрессируются в виде отдельных белков на поверхности клетки) и дополнительно кодирует цитокин или хемокин, выбранный из IL-2, IFN-альфа, IFN-гамма, GM-CSF, IL-15, IL-12, FLT3L, MIP1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, например, для высвобождения из раковой клетки, в частности, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2 or an active fragment of any of the listed proteins or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell and an anti-TCR antibody (an agonist such as a CD3 agonist), or an antibody fragment (such as scFv) also for expression on the surface of a cancer cell (particularly when said proteins are expressed as separate proteins on the cell surface) and further encodes a cytokine or chemokine selected from IL-2, IFN-alpha, IFN-gamma , GM-CSF, IL-15, IL-12, FLT3L, MIP1-alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, e.g. , for release from the cancer cell, in particular by secretion or after lysis/death of the infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело к TCR (агонист) или фрагмент антитела (такой как scFv) также для экспрессии на поверхности раковой клетки (в частности, когда указанные белки экспрессируются в виде отдельных белков на поверхности клетки), и дополнительно кодирует антитело,Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2 or an active fragment of any of the listed proteins or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell and an anti-TCR antibody (agonist) or antibody fragment (such as scFv) also for expression on the surface of a cancer cell (in particular, when these proteins are expressed as separate proteins on the cell surface), and additionally encodes an antibody,

- 24 042321 фрагмент антитела или белковый лиганд, который связывает CD28, CD80, CD86, 4-1ВВ, GITR, OX40,- 24 042321 antibody fragment or protein ligand that binds CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40,

CD27, CD40, или антитело к VEGF (антагонист) также для экспрессии на поверхности раковой клетки или для высвобождения из раковой клетки, например, путем секреции или после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.CD27, CD40, or anti-VEGF antibody (antagonist), also for expression on the surface of the cancer cell or for release from the cancer cell, eg by secretion or after lysis/death of the infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и два различных цитокина или хемокина, выбранных из IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, IL-15 и IL-12, FLT3L, MIP1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, например, для высвобождения из раковой клетки, в частности, путем секреции после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2, or an active fragment of any of the listed proteins, or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell, and two different cytokines or chemokines selected from IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, IL-15 and IL-12, FLT3L, MIP1-alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, for example, for release from a cancer cell, in particular by secretion after lysis/death of an infected cancer cell.

Таким образом, в одном варианте реализации не относящийся к аденовирусам вирус кодирует В7-1, В7-2 или активный фрагмент любого из перечисленных белков или их комбинацию для экспрессии на поверхности инфицированной раковой клетки и антитело к TCR (агонист, такой как агонист CD3) или фрагмент антитела (такой как scFv) также для экспрессии на поверхности раковой клетки (в частности, когда указанные белки экспрессируются в виде отдельных белков на поверхности клетки) и дополнительно кодирует цитокин, выбранный из IL-2, IFN-альфа, IFN-гамма, GM-CSF, IL-15 и IL-12, и/или хемокин, выбранный из RANTES (CCL5), MIP-1a (LD78a (CCL3) или изоформ LD78e (CCL3L1)), MIP1e, который может высвободиться из раковой клетки, в частности, путем секреции перед и после лизиса/гибели инфицированной раковой клетки.Thus, in one embodiment, the non-adenoviral virus encodes B7-1, B7-2 or an active fragment of any of the listed proteins or a combination thereof for expression on the surface of an infected cancer cell and an anti-TCR antibody (an agonist such as a CD3 agonist), or an antibody fragment (such as scFv) also for expression on the surface of a cancer cell (particularly when said proteins are expressed as separate proteins on the cell surface) and further encodes a cytokine selected from IL-2, IFN-alpha, IFN-gamma, GM -CSF, IL-15 and IL-12, and/or a chemokine selected from RANTES (CCL5), MIP-1a (LD78a (CCL3) or LD78e (CCL3L1) isoforms), MIP1e, which can be released from the cancer cell, in particular , by secretion before and after lysis/death of the infected cancer cell.

В одном варианте реализации, который, в частности, можно комбинировать с любым из описанных выше вариантов реализации, указанный вирус дополнительно кодирует антитело к PD-1 (антагонист).In one embodiment, which in particular can be combined with any of the embodiments described above, said virus further encodes an anti-PD-1 antibody (antagonist).

В одном варианте реализации белок или белки, кодируемые в кассете трансгенов для экспрессии на мембране клетки, также могут содержать пептидный линкер или спейсер между трансмембранным доменом и внеклеточным лигандом, связывающим домен. Такие линкеры или спейсеры могут повышать гибкость экспрессируемого на поверхности клетки белка, что повышает способность белка взаимодействовать с молекулой-мишенью на соседней клетке. Такие линкеры или спейсеры также могут быть сконструированы или выбраны таким образом, чтобы они вызывали димеризацию или тримеризацию белков на поверхности клетки посредством образования дисульфидной связи или белок-белковых взаимодействий. Например, можно использовать шарнирные области молекул иммуноглобулинов или CD8, чтобы увеличить как гибкость, так и димеризацию.In one embodiment, the protein or proteins encoded in the transgene cassette for expression on the cell membrane may also contain a peptide linker or spacer between the transmembrane domain and the extracellular ligand that binds the domain. Such linkers or spacers can increase the flexibility of a protein expressed on the cell surface, which increases the ability of the protein to interact with a target molecule on an adjacent cell. Such linkers or spacers can also be designed or selected to cause dimerization or trimerization of proteins on the cell surface through disulfide bond formation or protein-protein interactions. For example, hinge regions of immunoglobulin or CD8 molecules can be used to increase both flexibility and dimerization.

В одном варианте реализации белок или белки, кодируемые в кассете трансгенов, также могут содержать пептидную метку. Указанная пептидная метка может включать метки c-myc, полигистидин, V5 или FLAG и может быть расположена на N-конце или С-конце полипептида, либо внутри клетки, либо вне клетки, или может кодироваться внутри белка, например, во внеклеточной петле или между трансмембранным доменом и внеклеточным доменом. Пептидные метки можно применять в качестве спейсеров или линкеров между различными белковыми доменами, например, трансмембранным и внеклеточным доменом, и применять для детектирования или очистки белка.In one embodiment, the protein or proteins encoded in the transgene cassette may also contain a peptide tag. Said peptide tag may include c-myc, polyhistidine, V5, or FLAG tags and may be located at the N-terminus or C-terminus of the polypeptide, either intracellularly or extracellularly, or may be encoded within the protein, for example, in an extracellular loop or between transmembrane domain and extracellular domain. Peptide labels can be used as spacers or linkers between different protein domains, such as transmembrane and extracellular domain, and used for protein detection or purification.

В одном варианте реализации один или более дополнительных трансгенов (отличных от гена, кодирующего белок В7 или его фрагмент) находятся под контролем экзогенного или эндогенного промотора, например, эндогенного промотора. В одном варианте реализации трансген в области E3 (В2) находится под контролем экзогенного промотора.In one embodiment, one or more additional transgenes (other than the gene encoding the B7 protein or fragment thereof) are under the control of an exogenous or endogenous promoter, such as an endogenous promoter. In one embodiment, the transgene in the E3 (B 2 ) region is under the control of an exogenous promoter.

В одном варианте реализации один или более генов дополнительных трансгенов находятся между областью E3 и белком фибриллы L5 в геноме аденовируса, например, в положении BX в конструкции формулы (I), в частности, под контролем экзогенного промотора. В одном варианте реализации трансген в BX находится под контролем экзогенного промотора.In one embodiment, the one or more additional transgene genes are located between the E3 region and the L5 fibril protein in the adenovirus genome, for example at position B X in the construct of formula (I), in particular under the control of an exogenous promoter. In one embodiment, the transgene in BX is under the control of an exogenous promoter.

В одном варианте реализации один или более генов дополнительных трансгенов находятся между областью Е4 и белком фибриллы L5 в геноме аденовируса, например, в положении BY в конструкции формулы (I) или (Ia), в частности, под контролем эндогенного промотора, такого как главный поздний промотор. Он может быть дополнительным к гену, кодирующему антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), кодируемому в области BY.In one embodiment, one or more additional transgene genes are located between the E4 region and the L5 fibril protein in the adenovirus genome, e.g., at position BY in a construct of formula (I) or (Ia), in particular, under the control of an endogenous promoter, such as a major late promoter. It may be complementary to a gene encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) encoded in the B Y region.

В одном варианте реализации предложена композиция, содержащая онколитический вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию, например, фармацевтическая композиция, в частности, содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, такое как разбавитель или носитель.In one embodiment, a composition is provided comprising an oncolytic virus or viral vector as described herein, eg a pharmaceutical composition, in particular comprising a pharmaceutically acceptable excipient such as a diluent or carrier.

В одном варианте реализации предложен онколитический вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию или композиция, содержащая его, для применения для лечения, в частности, для применения для лечения рака.In one embodiment, an oncolytic virus or viral vector as described herein, or a composition containing the same, is provided for use in treatment, in particular for use in the treatment of cancer.

В одном варианте реализации предложен способ лечения нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества онколитического вируса или вирусного вектора согласно настоящему описанию или композиции, такой как фармацевтическая композиция, содержащая его.In one embodiment, a method of treating a patient in need thereof is provided, comprising administering a therapeutically effective amount of an oncolytic virus or viral vector as described herein, or a composition, such as a pharmaceutical composition, containing the same.

- 25 042321- 25 042321

В одном варианте реализации предложено применение онколитического вируса или вирусного вектора согласно настоящему описанию или содержащей его композиции для производства лекарственного средства для лечения рака, в частности, карцином, например, колоректального рака, рака легкого, мочевого пузыря, почки, поджелудочной железы, печени, головы и шеи, груди или яичников.In one embodiment, the implementation of the proposed use of an oncolytic virus or a viral vector according to the present description or a composition containing it for the manufacture of a drug for the treatment of cancer, in particular, carcinomas, for example, colorectal cancer, lung cancer, bladder, kidney, pancreas, liver, head and neck, chest, or ovaries.

В одном варианте реализации предложен полинуклеотид, содержащий геномную последовательность по меньшей мере 50% вируса согласно настоящему описанию (например, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) и содержащий последовательность, кодирующую антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), например, последовательность, описанную в данной заявке. В одном варианте реализации полинуклеотидная последовательность находится в форме плазмиды.In one embodiment, a polynucleotide is provided that contains the genomic sequence of at least 50% of a virus as described herein (e.g., 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%) and containing a sequence encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody), for example, the sequence described in this application. In one embodiment, the polynucleotide sequence is in the form of a plasmid.

В одном варианте реализации предложена клетка-хозяин, например, клетка млекопитающего, такая как клетка НЕК293 или ее производное, содержащая онколитический вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию или полинуклеотидную последовательность согласно настоящему описанию.In one embodiment, a host cell, such as a mammalian cell such as a HEK293 cell or derivative thereof, is provided, comprising an oncolytic virus or viral vector as described herein, or a polynucleotide sequence as described herein.

В одном варианте реализации предложен процесс получения онколитического вируса или вирусного вектора согласно настоящему описанию, включающий этап встраивания полинуклеотида, кодирующего антитело к TCR или связывающий фрагмент указанного антитела (такое как антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела), в онколитический вирус или вирусный вектор.In one embodiment, a process for producing an oncolytic virus or viral vector according to the present disclosure is provided, comprising the step of integrating a polynucleotide encoding an anti-TCR antibody or a binding fragment of said antibody (such as an anti-CD3 antibody or a binding fragment of said antibody) into an oncolytic virus or viral vector.

В одном варианте реализации предложен процесс репликации вируса или вирусного вектора согласно настоящему описанию, включающий этап культивирования клетки-хозяина в присутствии вируса при условиях, подходящих для репликации. Как правило, указанный способ будет включать дополнительный этап сбора вируса, например, из супернатанта или после лизиса клеток-хозяев.In one embodiment, a process for replicating a virus or viral vector as described herein is provided, comprising the step of culturing a host cell in the presence of a virus under conditions suitable for replication. Typically, this method will include an additional step of collecting the virus, for example, from the supernatant or after lysis of the host cells.

Термин трансген, используемый в данной заявке, относится к гену, который встроили в геномную последовательность вируса или вирусного вектора, при этом указанный ген неестественный для вируса (экзогенный) или обычно не находится в данном конкретном положении в вирусе. Примеры трансгенов приведены в данной заявке. Термин трансген, используемый в данной заявке, также включает функциональный фрагмент гена, который является частью гена, который при встраивании подходит для осуществления функции или большей части функции полноразмерного гена, например, 50% функции или более.The term transgene as used in this application refers to a gene that has been inserted into the genomic sequence of a virus or viral vector, said gene being non-natural to the virus (exogenous) or not normally located at that particular position in the virus. Examples of transgenes are given in this application. The term transgene as used in this application also includes a functional gene fragment that is a part of a gene that, when inserted, is suitable for performing the function or most of the function of a full-length gene, for example, 50% of the function or more.

Термины трансген и кодирующая последовательность в данной заявке используют взаимозаменяемо в контексте вставок в вирусный геном, если в контексте не указано противоположное. Термин кодирующая последовательность, используемый в данной заявке, означает, например, последовательность ДНК, кодирующую функциональную РНК, пептид, полипептид или белок. Обычно кодирующая последовательность представляет собой кДНК трансгена, которая кодирует интересующую функциональную РНК, пептид, полипептид или белок. Интересующая функциональная РНК, пептиды, полипептид и белки описаны ниже.The terms transgene and coding sequence are used interchangeably in this application in the context of insertions into the viral genome, unless the context indicates otherwise. The term coding sequence as used in this application means, for example, a DNA sequence encoding a functional RNA, peptide, polypeptide or protein. Typically, the coding sequence is a transgene cDNA that encodes a functional RNA, peptide, polypeptide, or protein of interest. Functional RNA, peptides, polypeptide and proteins of interest are described below.

В одном варианте реализации термин трансген, используемый в данной заявке, относится к фрагменту ДНК, включающему ген или последовательность кДНК, которая была выделена из одного организма и встроена в отличный организм, т.е., вирус согласно настоящему описанию. В одном варианте реализации данный ненативный фрагмент ДНК, как правило, будет сохранять способность продуцировать функциональную РНК, пептид, полипептид или белок. Используемые трансгены могут, например, кодировать химерный белок или слитый белок.In one embodiment, the term transgene as used herein refers to a DNA fragment comprising a gene or cDNA sequence that has been isolated from one organism and inserted into a different organism, i.e., a virus as described herein. In one embodiment, a given non-native DNA fragment will typically retain the ability to produce a functional RNA, peptide, polypeptide, or protein. The transgenes used may, for example, encode a chimeric protein or a fusion protein.

Ясно, что геном вируса содержит кодирующие последовательности ДНК. Эндогенные (встречающиеся в природе) гены в геномной последовательности вируса не считают трансгенами в контексте настоящей заявки, если только они не были модифицированы с помощью рекомбинантных методик таким образом, что они находятся в неестественном положении или в неестественном окружении.It is clear that the genome of the virus contains DNA coding sequences. Endogenous (naturally occurring) genes in the genomic sequence of a virus are not considered transgenes in the context of this application, unless they have been modified using recombinant techniques so that they are in an unnatural position or in an unnatural environment.

Таким образом, в одном варианте реализации встроенный трансген кодирует человеческий или гуманизированный белок, полипептид или пептид.Thus, in one embodiment, the inserted transgene encodes a human or humanized protein, polypeptide, or peptide.

Термин слитый белок, используемый в данной заявке, относится по меньшей мере к двум белкам или фрагментам или к комбинации по меньшей мере одного белка и по меньшей мере одного фрагмента, слитых напрямую или присоединенных друг к другу, например, посредством линкера. В одном варианте реализации слитые белки согласно настоящему описанию не содержат белок В7 или его активный фрагмент. Слитые белки, содержащие фрагменты или белок В7 и дополнительные белки, в данной заявке не называют химерными белками. Только белки, содержащие фрагменты из различных белков В7 в данной заявке называют химерными белками.The term fusion protein as used in this application refers to at least two proteins or fragments, or a combination of at least one protein and at least one fragment, fused directly or attached to each other, for example, via a linker. In one embodiment, the fusion proteins as described herein do not contain the B7 protein or active fragment thereof. Fusion proteins containing fragments or protein B7 and additional proteins, in this application are not called chimeric proteins. Only proteins containing fragments from different B7 proteins are referred to in this application as chimeric proteins.

Активность данного фрагмента белка можно проанализировать в соответствующем анализе in vitro, например, используя полноразмерный белок в качестве препарата сравнения.The activity of a given protein fragment can be analyzed in an appropriate in vitro assay, for example using the full-length protein as a comparator.

Термин химерный фрагмент, используемый в данной заявке, относится к фрагменту, содержащему последовательность из двух или более белков различного происхождения.The term chimeric fragment as used in this application refers to a fragment containing a sequence of two or more proteins of different origin.

Белки В7 включают В7-1 (также известный как CD80, номер в uniprot P33681), В7-2 (также известный как CD86, номер в uniprot P42081). Данные белки связывают CD28 и CTLA-4.B7 proteins include B7-1 (also known as CD80, uniprot number P33681), B7-2 (also known as CD86, uniprot number P42081). These proteins bind CD28 and CTLA-4.

В одном варианте реализации CD80 соответствует следующей последовательности:In one embodiment, CD80 corresponds to the following sequence:

- 26 042321- 26 042321

MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNV SVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGT YECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSW LENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTT KQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPVMGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNV SVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGT YECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSW LENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTT KQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

Другие белки В7 включают B7-DC (также известный как PDCD1LG2 и PD-L2, номер в uniprot Q9BQ51), В7-Н1 (также известный как PD-L1 и CD274, номер в uniprot Q9NZQ7). Оба данных белка связывают PD-1.Other B7 proteins include B7-DC (also known as PDCD1LG2 and PD-L2, uniprot number Q9BQ51), B7-H1 (also known as PD-L1 and CD274, uniprot number Q9NZQ7). Both of these proteins bind PD-1.

Лиганд 1 программируемой гибели клеток (PD-L1) представляет собой трансмембранный белок 1 типа размером 40 кДа, который, согласно предположениям, играет основную роль в подавлении иммунной системы. Похоже, что повышение экспрессии PD-L1 может позволить раку ускользнуть от иммунной системы хозяина. При анализе 196 образцов опухоли из пациентов с почечноклеточной карциномой обнаружили, что высокий уровень экспрессии PD-L1 в опухоли был связан с повышенной агрессивностью опухоли и в 4,5 раза более высоким риском смерти. У пациентов с раком яичников с более высоким уровнем экспрессии PD-L1 прогноз был значительно неблагоприятнее, чем у пациентов с более низким уровнем экспрессии. Экспрессия PD-L1 обратно пропорционально коррелировала с количеством внутриэпителиальных CD8+ Т-лимфоцитов, позволяя предложить, что PD-L1 на опухолевых клетках может подавлять противоопухолевые CD8+ Т-клетки. Данный эффект может зависеть от типа опухоли: исследование на пациентах с немелкоклеточным раком легких показало, что более высокий уровень экспрессии белка и мРНК PD-L1 связан с повышенной локальной инфильтрацией лимфоцитов и более длительной выживаемостью. В клинических испытаниях было показано, что множество антител к PDL1 представляют интерес для лечения некоторых видов рака.Programmed cell death ligand 1 (PD-L1) is a 40 kDa type 1 transmembrane protein thought to play a major role in suppressing the immune system. It appears that upregulation of PD-L1 may allow cancer to elude the host's immune system. In an analysis of 196 tumor samples from patients with renal cell carcinoma found that high levels of PD-L1 expression in the tumor was associated with increased tumor aggressiveness and a 4.5-fold higher risk of death. Patients with higher levels of PD-L1 expression had a significantly poorer prognosis in ovarian cancer patients than those with lower levels of expression. Expression of PD-L1 was inversely correlated with the number of intraepithelial CD8+ T lymphocytes, suggesting that PD-L1 on tumor cells may suppress antitumor CD8+ T cells. This effect may depend on the type of tumor: a study in patients with non-small cell lung cancer showed that higher levels of PD-L1 protein and mRNA expression are associated with increased local lymphocyte infiltration and longer survival. Many anti-PDL1 antibodies have been shown in clinical trials to be of interest in the treatment of certain types of cancer.

В одном варианте реализации по меньшей мере цитоплазматический (внутриклеточный) домен B7DC и/или В7-Н1 удален или нефункционален. Без привязки к какой-либо конкретной теории, есть основание предположить, что удаление внутриклеточного домена снижает устойчивость раковых клеток к лизису. Blood, 1 апреля 2008 г.; 111(7)3635-3643.In one embodiment, at least the cytoplasmic (intracellular) domain of B7DC and/or B7-H1 is deleted or non-functional. Without being bound to any particular theory, there is evidence to suggest that the removal of the intracellular domain reduces the resistance of cancer cells to lysis. Blood, April 1, 2008; 111(7)3635-3643.

В одном варианте реализации используют только фрагмент трансмембранного домена B7-DC и/или В7-Н1. В одном варианте реализации следующие белки не предложены в виде полноразмерных белков: B7-DC и В7-Н1.In one embodiment, only a fragment of the B7-DC and/or B7-H1 transmembrane domain is used. In one embodiment, the following proteins are not provided as full length proteins: B7-DC and B7-H1.

Другие белки В7 включают В7-Н2 (также известный как ICOSLG, B7RP1, CD275, номер в uniprot 075144), который связывает ICOS, B7-H3 (также известный как CD276, номер в uniprot Q5ZPR3), В7-Н4 (также известный как VTCN1, номер в uniprot Q727D3), В7-Н5 (также известный как VISTA, рецептор тромбоцитов Gi24, SISP1), В7-Н6 (также известный как NCR3LG1, NR3L1), который связывает NKp30, В7-Н7 (также известный как HHLA2), который связывает CD28H.Other B7 proteins include B7-H2 (also known as ICOSLG, B7RP1, CD275, uniprot number 075144) which binds ICOS, B7-H3 (also known as CD276, uniprot number Q5ZPR3), B7-H4 (also known as VTCN1 , number in uniprot Q727D3), B7-H5 (also known as VISTA, platelet receptor Gi24, SISP1), B7-H6 (also known as NCR3LG1, NR3L1) which binds NKp30, B7-H7 (also known as HHLA2) which binds CD28H.

В одном варианте реализации фрагмент содержит только трансмембранный домен любого из В7Н2, В7-И3, В7-Н4, В7-Н5, В7-Н6 и В7-Н7.In one embodiment, the fragment contains only the transmembrane domain of any of B7H2, B7-I3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, and B7-H7.

Отдельные белки включают одиночные белки, то есть белки или их активные фрагменты, которые не являются частью слитого белка (включая химерные белки), а также слитые белки. В одном варианте реализации отдельные белки представляют собой одиночные белки (включая их активные фрагменты).Individual proteins include single proteins, that is, proteins or active fragments thereof that are not part of a fusion protein (including chimeric proteins), as well as fusion proteins. In one embodiment, the individual proteins are single proteins (including their active fragments).

Термин GPI-якорь, используемый в данной заявке, относится к гликолипиду, который можно присоединить к С-концу белка во время посттрансляционной модификации. Он состоит из фосфатидилинозитольной группы, связанной через содержащий углевод линкер (глюкозамин и манноза, связанные гликозидной связью с остатком инозитола) и через этаноламинфосфатный (EtNP) мостик с С-концевой аминокислотой зрелого белка. Указанные две жирные кислоты в гидрофобной фосфатидилинозитольной группе заякоривают белок в мембрану клетки.The term GPI anchor as used in this application refers to a glycolipid that can be attached to the C-terminus of a protein during post-translational modification. It consists of a phosphatidylinositol group linked via a carbohydrate-containing linker (glucosamine and mannose linked by a glycosidic bond to an inositol residue) and via an ethanolamine phosphate (EtNP) bridge to the C-terminal amino acid of the mature protein. These two fatty acids in the hydrophobic phosphatidylinositol group anchor the protein to the cell membrane.

Глипиированные (связанные с GPI) белки содержат сигнальный пептид, который направляет их в эндоплазматический ретикулум (ЭР). С-конец состоит из гидрофобных аминокислот, которые остаются встроенными в мембрану ЭР. Гидрофобный конец затем отщепляется и заменяется на GPI-якорь. По мере прохождения белка по секреторному пути, он переносится посредством везикул в аппарат Гольджи и, наконец, во внеклеточное пространство, где он остается присоединенным к внешней стороне мембраны клетки.Glipylated (GPI-bound) proteins contain a signal peptide that directs them to the endoplasmic reticulum (ER). The C-terminus consists of hydrophobic amino acids that remain embedded in the ER membrane. The hydrophobic end is then cleaved off and replaced with a GPI anchor. As the protein travels through the secretory pathway, it is transported via vesicles to the Golgi apparatus and finally to the extracellular space, where it remains attached to the outside of the cell membrane.

Поскольку глипиирование является единственным способом присоединения таких белков к мембране, расщепление указанной группы фосфолипазами приведет к контролируемому высвобождению белка из мембраны. Последний из упомянутых механизмов используют in vitro: т.е., мембранные белки, высвобожденные из мембран в ферментативном анализе, являются глипиированными белками.Since glypylation is the only way to attach such proteins to the membrane, cleavage of this group by phospholipases will result in a controlled release of the protein from the membrane. The last of the mentioned mechanisms is used in vitro: ie, membrane proteins released from membranes in the enzymatic assay are glypiated proteins.

Фосфолипаза С (PLC) представляет собой фермент, который, как известно, расщепляет фосфоглицериновую связь, обнаруженную в заякоренных через GPI белках. Обработка PLC приведет к высвобождению связанных через GPI белков из наружной мембраны клетки. Известно, что маркер Т-клеток Thy-1 и ацетилхолинэстераза, а также обе щелочные фосфатазы кишечника и плаценты связаны через GPI и высвобождаются при обработке PLC. Считают, что связанные через GPI белки преимущественно распо- 27 042321 ложены в липидных рафтах (скоплениях), позволяя предположить высокий уровень организации в микродоменах плазматической мембраны.Phospholipase C (PLC) is an enzyme known to cleave the phosphoglycerol bond found in GPI-anchored proteins. PLC treatment will release GPI-bound proteins from the outer membrane of the cell. The T-cell marker Thy-1 and acetylcholinesterase, as well as both intestinal and placental alkaline phosphatases, are known to be linked via GPI and released upon PLC treatment. It is believed that GPI-bound proteins are predominantly located in lipid rafts (clusters), suggesting a high level of organization in plasma membrane microdomains.

Обзор GPI-якорей, написанный Ferguson, Kinoshita и Hart, доступен в главе 11 Essentials of Glycobiology, 2-e издание.An overview of GPI anchors by Ferguson, Kinoshita, and Hart is available in Chapter 11 of Essentials of Glycobiology, 2nd Edition.

Термин вирус, используемый в данной заявке, относится к способному реплицироваться онколитическому вирусу (или аденовирусу) или неспособному реплицироваться вирусному вектору (аденовирусному вектору), если в контексте не указано противоположное.The term virus as used in this application refers to a replicating oncolytic virus (or adenovirus) or a non-replicating viral vector (adenoviral vector), unless the context indicates otherwise.

В одном варианте реализации аденовирус представляет собой аденовирус человека. Термин аденовирус, серотип или аденовирусный серотип, используемый в данной заявке, относится к любому аденовирусу, который можно отнести к любому из более 50 известных на сегодняшний день серотипов аденовируса, которые классифицированы по подгруппам А - F, и дополнительно распространяется на любой, до сих пор не обнаруженный или не классифицированный серотип аденовируса. См., например, Strauss, Adenovirus infections in humans в The Adenoviruses, Ginsberg и др., Plenum Press, Нью-Йорк, Нью-Йорк, стр. 451-596 (1984), и Shenk Adenoviridae: The Viruses and Their Replication в Fields Virology, том 2, четвертое издание, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, стр. 2265-2267 (2001), как показано далее. _____________________________________________________________In one embodiment, the adenovirus is a human adenovirus. The term adenovirus, serotype, or adenoviral serotype as used in this application refers to any adenovirus that can be assigned to any of the more than 50 adenovirus serotypes known to date, which are classified into subgroups A to F, and additionally extends to any hitherto an undetectable or unclassified adenovirus serotype. See, for example, Strauss, Adenovirus infections in humans in The Adenoviruses, Ginsberg et al., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984), and Shenk Adenoviridae: The Viruses and Their Replication in Fields Virology, Volume 2, Fourth Edition, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001), as shown below. _______________________________________________________________

Подгруппа Subgroup Серотип аденовируса Adenovirus serotype А A 12, 18, 31 12, 18, 31 В IN 3, 7, И, 14, 16, 21, 34, 35,51 3, 7, I, 14, 16, 21, 34, 35.51 С WITH 1, 2, 5, 6 1, 2, 5, 6 D D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33,36-39,42- 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33.36-39.42- Е E 4 4 F F 40,41 40.41

В одном варианте реализации аденовирус представляет собой аденовирус подгруппы В, например, независимо выбранный из группы, включающей или состоящей из: Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 и Ad51, например, Ad11, в частности, Ad11p (штамм Slobitski). В одном варианте реализации у аденовируса согласно настоящему изобретению есть капсид, такой как гексон и/или белок фибриллы из подгруппы В аденовирусов, такой как Ad11, в частности, Ad11p. В одном варианте реализации аденовирус представляет собой Ad11 или содержит белок фибриллы, и/или гексон, и/или пентон из Ad11, такой как Ad11p.In one embodiment, the adenovirus is a subgroup B adenovirus, e.g., independently selected from the group including or consisting of: Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, and Ad51, e.g., Ad11, in particular, Ad11p (strain Slobitski ). In one embodiment, the adenovirus of the present invention has a capsid such as a hexon and/or a fibril protein from adenovirus subgroup B such as Ad11, in particular Ad11p. In one embodiment, the adenovirus is Ad11 or contains a fibril protein and/or a hexon and/or pentone from Ad11, such as Ad11p.

Термин производное вируса Ad11, используемый в данной заявке, относится к вирусу с по меньшей мере капсидом из Ad11.The term Ad11 virus derivative as used in this application refers to a virus with at least an Ad11 capsid.

В одном варианте реализации он не является вирусом группы А.In one embodiment, it is not a group A virus.

Энаденотуцирев (EnAd) представляет собой химерный онколитический аденовирус, прежде известный как EnAd (WO2005/118825), с белком фибриллы, пентоном и гексоном из Ad11p, следовательно, он представляет собой вирус подгруппы В. Он содержит химерную область Е2В, которая содержит ДНК из Ad11p и Ad3. Почти вся область E3 и часть области Е4 удалена из EnAd. Следовательно, у него есть значительное пространство в геноме для размещения дополнительного генетического материала, при этом он остается жизнеспособным. Более того, так как EnAd представляет собой аденовирус подгруппы В, предсуществующий иммунитет к нему у людей реже встречается, чем, например, к Ad5. Другие примеры химерных онколитических вирусов с белком фибриллы, пентоном и гексоном Ad11 включают OvAd1 и OvAd2 (см. WO2006/060314).Enadenotucirev (EnAd) is a chimeric oncolytic adenovirus formerly known as EnAd (WO2005/118825) with fibril protein, pentone and hexon from Ad11p, hence it is a subgroup B virus. It contains an E2B chimeric region that contains DNA from Ad11p and Ad3. Almost all of the E3 region and part of the E4 region has been removed from EnAd. Therefore, it has a significant amount of space in the genome to accommodate additional genetic material, while remaining viable. Moreover, since EnAd is a subgroup B adenovirus, preexisting immunity to it is less common in humans than, for example, to Ad5. Other examples of chimeric oncolytic viruses with fibril protein, penton and Ad11 hexon include OvAd1 and OvAd2 (see WO2006/060314).

EnAd, похоже, преимущественно инфицирует опухолевые клетки, быстро реплицируется в данных клетках и вызывает лизис клеток. Это, в свою очередь, может вызвать воспалительные иммунные ответы, тем самым стимулируя организм также бороться с раком. Считают, что часть успеха EnAd связана с быстрой репликацией вируса in vivo.EnAd appears to preferentially infect tumor cells, replicate rapidly in these cells, and induce cell lysis. This, in turn, can trigger inflammatory immune responses, thereby stimulating the body to also fight cancer. It is believed that part of the success of EnAd is due to the rapid replication of the virus in vivo.

Важно отметить, что клинически было продемонстрировано, что EnAd можно вводить системно (например, путем внутривенной или интраперитонеальной инъекции или инфузии), после чего он избирательно инфицирует опухолевые клетки и экспрессирует в них белки. Данное свойство EnAd, которое могут разделять Ad11p и другие аденовирусы группы В, в частности, которые экспрессируют капсидные белки Ad11p (такие как описанные в данной заявке), позволяет экспрессировать белки на поверхности раковых клеток без необходимости непосредственного введения путем инъекции трансгенов внутрь опухоли, что невыполнимо при многих видах рака.Importantly, it has been clinically demonstrated that EnAd can be administered systemically (eg, by intravenous or intraperitoneal injection or infusion), after which it selectively infects tumor cells and expresses proteins in them. This property of EnAd, which can be shared by Ad11p and other group B adenoviruses, in particular, which express Ad11p capsid proteins (such as those described in this application), allows proteins to be expressed on the surface of cancer cells without the need for direct introduction by injection of transgenes into the tumor, which is not feasible. for many types of cancer.

Тогда как EnAd избирательно лизирует опухолевые клетки, это позволяет внедрить дополнительные полезные свойства, например, повысить терапевтическую активность вируса или уменьшить побочные эффекты вируса, вооружая его трансгенами, такими как трансген, который кодирует белок передачи сигналов в клетке, или антитело, или трансген, который кодирует молекулу, которая стимулирует белок(-ки) передачи сигналов в клетке.While EnAd selectively lyses tumor cells, this allows for the introduction of additional beneficial properties, such as increasing the therapeutic activity of the virus or reducing the side effects of the virus by arming it with transgenes, such as a transgene that encodes a signaling protein in the cell, or an antibody, or a transgene that encodes a molecule that stimulates signaling protein(s) in the cell.

Успешное вооружение вируса ДНК, кодирующей некоторые белки, которые можно экспрессиро- 28 042321 вать внутри раковой клетки, может позволить использование собственных защитных механизмов организма для более эффективной борьбы с опухолевыми клетками, например, делая указанные клетки более заметными для иммунной системы или путем доставки терапевтического гена/белка предпочтительно в целевые опухолевые клетки.Successful armament of a virus with DNA encoding some proteins that can be expressed inside a cancer cell may allow the body's own defense mechanisms to be used to fight tumor cells more effectively, for example by making said cells more visible to the immune system or by delivering a therapeutic gene. /protein preferably in the target tumor cells.

В одном варианте реализации онколитический вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию стимулирует иммунную систему пациента к борьбе с опухолью, например, антитело к CD3 стимулирует Т-клетки in vivo.In one embodiment, an oncolytic virus or viral vector as described herein stimulates the patient's immune system to fight the tumor, eg, an anti-CD3 antibody stimulates T cells in vivo.

В одном варианте реализации онколитический вирус содержит белок фибриллы, белки гексон и пентон из того же серотипа, например, Ad11, в частности, Ad11p, например, находящиеся в положениях 30812-31789, 18254-21100 и 13682-15367 геномной последовательности последнего из упомянутых, при этом положения нуклеотидов обозначены в соответствии с Genbank ID 217307399 (номер доступа: GC689208).In one embodiment, the oncolytic virus contains a fibril protein, hexon and pentone proteins from the same serotype, e.g. Ad11, in particular Ad11p, e.g. located at positions 30812-31789, 18254-21100 and 13682-15367 of the genomic sequence of the latter mentioned, while the positions of the nucleotides are indicated in accordance with Genbank ID 217307399 (accession number: GC689208).

В одном варианте реализации аденовирус представляет собой энаденотуцирев (также известный как EnAd и ранее известный как ColoAdl). Энаденотуцирев, используемый в данной заявке, относится к химерному аденовирусу с последовательностью SEQ ID NO: 21. Он представляет собой способный реплицироваться онколитический химерный аденовирус, у которого улучшены терапевтические свойства по сравнению с аденовирусами дикого типа (см. WO2005/118825). EnAd содержит химерную область Е2В, которая отличает ДНК от Ad11p и Ad3, и делеции в ЕЗ/Е4. Структурные изменения в энаденотуциреве приводят к размеру генома приблизительно на 3,5 т.п.о. меньше, чем у Ad11p, что дает дополнительное пространство для встраивания трансгенов.In one embodiment, the adenovirus is enadenotucyreve (also known as EnAd and formerly known as ColoAdl). Enadenotucirev used in this application refers to a chimeric adenovirus with the sequence of SEQ ID NO: 21. It is a replicable oncolytic chimeric adenovirus that has improved therapeutic properties compared to wild-type adenoviruses (see WO2005/118825). EnAd contains an E2B chimeric region that distinguishes DNA from Ad11p and Ad3, and deletions in E3/E4. Structural changes in enadenothucyreve result in a genome size of approximately 3.5 kb. smaller than that of Ad11p, which provides additional space for the insertion of transgenes.

Линкеры, подходящие для применения в слитых белках согласно настоящему описанию, включают: шарнирные линкерные последовательности, представленные в SEQ ID NO: с 22 по 30 (см. сопроводительный перечень последовательностей);Linkers suitable for use in fusion proteins as described herein include: hinge linker sequences set forth in SEQ ID NOs: 22 to 30 (see accompanying sequence listing);

гибкие линкерные последовательности GS, а также последовательности, представленные в SEQ ID NO: с 31 по 70 (см. сопроводительный перечень последовательностей);flexible linker sequences GS, as well as sequences presented in SEQ ID NO: 31 to 70 (see accompanying sequence listing);

линкерные последовательности, представленные в SEQ ID NO: с 73 по 86.linker sequences shown in SEQ ID NOs: 73 to 86.

Примеры жестких линкеров включают пептидные последовательностиExamples of rigid linkers include peptide sequences

GAP АР ААР АРА (SEQ ID NO: 71), PPPP (SEQ ID NO: 72) и PPP.GAP AP AAP AP (SEQ ID NO: 71), PPPP (SEQ ID NO: 72) and PPP.

Определения, относящиеся к формулам (I) и (Ia).Definitions relating to formulas (I) and (Ia).

Термин связь относится к ковалентной связи, соединяющей одну последовательность ДНК с другой последовательностью ДНК, например, соединяющей одну часть генома вируса с другой. Таким образом, если переменная в формулах (I) и (Ia) в данной заявке представляет собой связь, то признак или элемент, представленный указанной связью, отсутствует, т.е. удален.The term bond refers to a covalent bond connecting one DNA sequence to another DNA sequence, for example, connecting one part of the virus genome to another. Thus, if the variable in formulas (I) and (Ia) in this application is a bond, then the feature or element represented by said bond is absent, i. removed.

Так как структура аденовирусов, в общем, сходна, ниже элементы обсуждаются с точки зрения структурных элементов и относящейся к ним широко распространенной номенклатуры, которая известна специалисту в данной области. Когда в данной заявке ссылаются на элемент, то эта ссылка относится к последовательности ДНК, кодирующей указанный элемент, или к последовательности ДНК, кодирующей такой же структурный белок указанного элемента в аденовирусе. Последнее уместно вследствие вырожденности кода ДНК. Для оптимизации результатов может потребоваться учесть предпочтительное использование кодонов данными вирусами.Since the structure of adenoviruses is generally similar, the elements below are discussed in terms of the structural elements and their widely used nomenclature, which is known to the person skilled in the art. When an element is referred to in this application, the reference refers to a DNA sequence encoding said element, or to a DNA sequence encoding the same structural protein of said element in adenovirus. The latter is appropriate due to the degeneracy of the DNA code. To optimize the results, it may be necessary to take into account the preferred codon usage of these viruses.

Любой структурный элемент из аденовируса, используемый в вирусах согласно настоящему описанию, может включать или состоять из природной последовательности или быть подобным ей на протяжении заданной длины, составляющей по меньшей мере 95%, например, 96, 97, 98, 99 или 100%. Исходная последовательность может быть модифицирована, чтобы пренебречь 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2% или 1% генетического материала. Для специалиста очевидно, что при внесении изменений рамки считывания вируса не должны быть нарушены таким образом, что нарушится экспрессия структурных белков.Any structural element from adenovirus used in viruses according to the present description may include or consist of a natural sequence or be similar to it for a given length of at least 95%, for example, 96, 97, 98, 99 or 100%. The original sequence can be modified to ignore 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1% of the genetic material. For a specialist it is obvious that when making changes, the reading frames of the virus should not be violated in such a way that the expression of structural proteins is disturbed.

В одном варианте реализации данный элемент представляет собой полноразмерную последовательность, т.е. полноразмерный ген.In one implementation, this element is a full length sequence, i.e. full size gen.

В одном варианте реализации данный элемент меньше полной длины, и у него сохранилась такая же или соответствующая функция, как и у полноразмерной последовательности.In one implementation, this element is less than the full length, and it has retained the same or corresponding function as the full-length sequence.

В одном варианте реализации у данного элемента, который необязателен в конструкциях согласно настоящему описанию, последовательность ДНК может быть меньше, чем полноразмерная, и может быть нефункциональной, например, область E3 может быть полностью или частично удалена.In one embodiment, for a given element, which is optional in constructs as described herein, the DNA sequence may be less than full length and may be non-functional, for example, the E3 region may be completely or partially removed.

Структурные гены, кодирующие структурные или функциональные белки аденовируса, как правило, соединены некодирующими областями ДНК. Таким образом, есть некоторая гибкость в выборе места для разрезания геномной последовательности интересующего структурного элемента (особенно его некодирующих областей) с целью вставки трансгена в вирусы согласно настоящему описанию. Таким образом, для целей настоящей заявки, указанный элемент будут считать эталонным структурным элементом при условии, что он подходит для данной цели и не кодирует посторонний материал. Таким образом, при необходимости, ген будет связан с подходящими некодирующими областями, например, обнаруженными в природной структуре вируса.Structural genes encoding structural or functional proteins of adenovirus are usually connected by non-coding regions of DNA. Thus, there is some flexibility in choosing where to cut the genomic sequence of the structural element of interest (especially its non-coding regions) in order to insert the transgene into viruses as described herein. Thus, for the purposes of this application, the specified element will be considered a reference structural element, provided that it is suitable for this purpose and does not encode extraneous material. Thus, if necessary, the gene will be associated with suitable non-coding regions, such as those found in the natural structure of the virus.

Таким образом, в одном варианте реализации вставку, такую как ДНК, кодирующая сайт рестрик- 29 042321 ции и/или трансген, встраивают в некодирующую область геномной ДНК вируса, такую как интрон или межгенная последовательность. Как уже говорилось, некоторые некодирующие области аденовируса могут обладать функцией, например, участвовать в альтернативном сплайсинге, регуляции транскрипции или регуляции трансляции, и, возможно, это потребуется учесть.Thus, in one embodiment, an insert, such as a DNA encoding a restriction site and/or a transgene, is inserted into a non-coding region of the viral genomic DNA, such as an intron or an intergenic sequence. As already mentioned, some non-coding regions of the adenovirus may have a function, for example, to participate in alternative splicing, regulation of transcription or regulation of translation, and this may need to be taken into account.

Сайты, идентифицированные в данной заявке, которые ассоциированы с областью L5, подходят для размещения различных последовательностей ДНК, кодирующих сложные молекулы, такие как молекулы интерферирующих РНК (РНКи), цитокины, одноцепочечные или мультимерные белки, такие как антитела.The sites identified herein that are associated with the L5 region are suitable for hosting various DNA sequences encoding complex molecules such as interfering RNA (RNAi) molecules, cytokines, single-stranded or multimeric proteins such as antibodies.

Термин ген, используемый в данной заявке, относится к кодирующей последовательности и любым некодирующим последовательностям, ассоциированным с ней, например, интронам и ассоциированным экзонам. В одном варианте реализации ген включает или состоит только из незаменимых структурных компонентов, например, кодирующей области.The term gene as used in this application refers to a coding sequence and any non-coding sequences associated with it, such as introns and associated exons. In one embodiment, a gene includes or consists only of essential structural components, such as a coding region.

Ниже приведено обсуждение конкретных структурных элементов аденовирусов.The following is a discussion of specific structural elements of adenoviruses.

Последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) характерны для всех известных аденовирусов и были так названы благодаря их симметрии, и они представляют собой точки начала репликации хромосомы вируса. Другим свойством данных последовательностей является их способность образовывать шпильку.Inverted terminal repeat (ITR) sequences are common to all known adenoviruses and were so named because of their symmetry, and they represent the origins of replication of the viral chromosome. Another property of these sequences is their ability to form a hairpin.

Термин 5'-ITR, используемый в данной заявке, относится к части или полноразмерному ITR из 5'конца аденовируса, который сохраняет функцию ITR, когда его встраивают в подходящее положение аденовируса. В одном варианте реализации 5'-ITR включает или состоит из последовательности от приблизительно 1 п.о. до 138 п.о. в SEQ ID NO: 82 или последовательности, идентичной ей по всей длине на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, в частности, последовательности, состоящей из от приблизительно 1 п.о. до 138 п.о. в SEQ ID NO: 21.The term 5'-ITR as used in this application refers to a portion or full length ITR from the 5' end of an adenovirus that retains ITR function when inserted into a suitable position in the adenovirus. In one embodiment, the 5'-ITR comprises or consists of a sequence of about 1 bp. up to 138 bp in SEQ ID NO: 82 or a sequence identical to it throughout its length by 90, 95, 96, 97, 98 or 99%, in particular, a sequence consisting of from about 1 p. up to 138 bp in SEQ ID NO: 21.

Термин 3'-ITR, используемый в данной заявке, относится к части или полноразмерному ITR из 3'конца аденовируса, который сохраняет функцию ITR, когда его встраивают в подходящее положение аденовируса. В одном варианте реализации 3'-ITR включает или состоит из последовательности от приблизительно 32189 п.о. до 32326 п.о. в SEQ ID NO: 82 или последовательности, идентичной ей по всей длине на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, в частности, последовательности, состоящей из от приблизительно 32189 п.о. до 32326 п.о. B SEQ ID NO: 21.The term 3'-ITR as used in this application refers to a portion or full length ITR from the 3' end of an adenovirus that retains ITR function when inserted into a suitable position in the adenovirus. In one embodiment, the 3'-ITR comprises or consists of a sequence of about 32189 bp. up to 32326 b.p. in SEQ ID NO: 82 or a sequence identical to it along the entire length of 90, 95, 96, 97, 98 or 99%, in particular, a sequence consisting of from approximately 32189 p. up to 32326 b.p. B SEQ ID NO: 21.

Термин В1, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей: часть или полноразмерную последовательность Е1А из аденовируса, часть или полноразмерную область Е1В аденовируса и независимо часть или полноразмерные области Е1А и Е1В аденовируса.The term B1 as used herein refers to a DNA sequence encoding: a portion or full length of an E1A sequence from an adenovirus, a portion or a full length of an E1B region of an adenovirus, and independently a portion or full length of an E1A and E1B region of an adenovirus.

Если В1 представляет собой связь, то последовательности Е1А и Е1В будут отсутствовать в вирусе. В одном варианте реализации В1 представляет собой связь и, следовательно, вирус представляет собой вектор.If B1 is a link, then the E1A and E1B sequences will be absent from the virus. In one embodiment, B1 is a bond and therefore the virus is a vector.

В одном варианте реализации В1 дополнительно содержит трансген. В данной области известно, что в области Е1 можно разместить трансген, который можно встроить в область Е1, нарушив ее (т.е., в середину последовательности), или часть или всю область Е1 можно удалить, чтобы предоставить больше пространства для размещения генетического материала.In one embodiment, B1 further comprises a transgene. It is known in the art that a transgene can be placed in the E1 region, which can be inserted into the E1 region, disrupting it (i.e., in the middle of the sequence), or part or all of the E1 region can be deleted to provide more space for the placement of genetic material .

Термин Е1А, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей часть или полноразмерную область Е1А аденовируса. Последняя относится к полипептиду/белку Е1А. Его можно мутировать таким образом, чтобы белок, кодируемый геном Е1А, содержал такие консервативные или неконсервативные замены аминокислот, что у него наблюдается: такая же функция, как и у дикого типа (т.е. соответствующего немутированного белка); повышенная функция по сравнению с белком дикого типа; пониженная функция, например, отсутствие функции по сравнению с белком дикого типа; или новая функция по сравнению с белком дикого типа, или комбинация перечисленных вариантов в соответствующих случаях.The term E1A as used in this application refers to a DNA sequence encoding a portion or entire region of the E1A adenovirus. The latter refers to the E1A polypeptide/protein. It can be mutated so that the protein encoded by the E1A gene contains such conservative or non-conservative amino acid substitutions that it has: the same function as the wild type (ie, the corresponding unmutated protein); increased function compared to wild-type protein; reduced function, eg, no function compared to the wild-type protein; or a new function compared to the wild-type protein, or a combination of the above options, as appropriate.

Термин Е1В, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей часть или полноразмерную область Е1В аденовируса (т.е. полипептид или белок), ее можно мутировать таким образом, чтобы белок, кодируемый геном/областью Е1В, содержал такие консервативные или неконсервативные замены аминокислот, что у него наблюдается: такая же функция, как и у дикого типа (т.е. соответствующего немутированного белка); повышенная функция по сравнению с белком дикого типа; пониженная функция, например, отсутствие функции по сравнению с белком дикого типа; или новая функция по сравнению с белком дикого типа, или комбинация перечисленных вариантов в соответствующих случаях.The term E1B as used in this application refers to a DNA sequence encoding a portion or entire region of an E1B adenovirus (i.e., a polypeptide or protein) that can be mutated such that the protein encoded by the E1B gene/region contains such conservative or non-conservative amino acid substitutions that it has: the same function as the wild-type (i.e. the corresponding unmutated protein); increased function compared to wild-type protein; reduced function, eg, no function compared to the wild-type protein; or a new function compared to the wild-type protein, or a combination of the above options, as appropriate.

Таким образом, последовательность В1 может быть модифицирована или не модифицирована по сравнению с областью Е1 дикого типа, такой как Е1А и/или Е1В дикого типа. Специалист сможет легко определить, присутствуют ли Е1А и/или Е1В, или они (частично) удалены или мутированы.Thus, the B1 sequence may or may not be modified from a wild-type E1 region, such as wild-type E1A and/or E1B. The specialist will be able to easily determine whether E1A and/or E1B are present, or they are (partially) deleted or mutated.

Термин дикий тип, используемый в данной заявке, относится к известному аденовирусу. Известный аденовирус представляет собой такой аденовирус, который был идентифицирован и назван, независимо от доступности последовательности.The term wild type as used in this application refers to a known adenovirus. A known adenovirus is one that has been identified and named, regardless of sequence availability.

В одном варианте реализации В1 представляет собой последовательность от 139 п.о. до 3932 п.о. в SEQ ID NO: 21.In one embodiment, B1 is a sequence from 139 p. up to 3932 b.p. in SEQ ID NO: 21.

- 30 042321- 30 042321

Термин BA, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей области E2B-L1-L2-L3-E2A-L4, включая любые некодирующие последовательности, в соответствующих случаях (в частности, соответствующей природной последовательности из аденовируса). Как правило, данная последовательность не будет содержать трансген. В одном варианте реализации указанная последовательность по существу сходна или идентична непрерывной последовательности из известного аденовируса, например, серотипа, показанного в табл. 1, в частности, вируса группы В, например, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 или комбинации перечисленных, например, Ad3, Ad11 или комбинации перечисленных. В одном варианте реализации E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 относится к содержанию данных элементов и других структурных элементов, ассоциированных с указанной областью, например, ВА, как правило, будет включать последовательность, кодирующую белок IV2a, например, описанную далее: IV2A IV2a-E2B-Ll-L2-L3-E2A-L4.The term BA as used in this application refers to the DNA sequence encoding the E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 regions, including any non-coding sequences, as appropriate (in particular, the corresponding natural sequence from adenovirus). Typically, this sequence will not contain the transgene. In one embodiment, said sequence is substantially similar or identical to a contiguous sequence from a known adenovirus, such as the serotype shown in Table 1. 1, in particular a group B virus, e.g. Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 or a combination of the above, for example Ad3, Ad11 or a combination of the above. In one embodiment, E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 refers to the content of these elements and other structural elements associated with the specified region, for example, BA, as a rule, will include a sequence encoding an IV2a protein, for example, described below: IV2A IV2a-E2B-Ll-L2-L3-E2A-L4.

В одном варианте реализации область Е2В химерная. То есть, содержит последовательности ДНК из двух или более различных серотипов аденовируса, например, из Ad3 и Ad11, например, Ad11р. В одном варианте реализации область Е2В представляет собой последовательность от 5068 п.о. до 10355 п.о. в SEQ ID NO: 21 или последовательностью, идентичной ей на 95, 96, 97, 98 или 99% по всей длине.In one embodiment, the E2B region is chimeric. That is, it contains DNA sequences from two or more different adenovirus serotypes, eg from Ad3 and Ad11, eg Ad11p. In one embodiment, the E2B region is a sequence from 5068 bp. up to 10355 b.p. in SEQ ID NO: 21 or a sequence identical to it by 95, 96, 97, 98 or 99% over the entire length.

В одном варианте реализации Е2В в компоненте BA включает последовательности, представленные в SEQ ID NO: 87 (которая соответствует последовательности SEQ ID NO: 3, описанной в WO2005/118825).In one embodiment, the E2B in component B A includes the sequences shown in SEQ ID NO: 87 (which corresponds to the sequence of SEQ ID NO: 3 described in WO2005/118825).

В одном варианте реализации ВА представляет собой последовательность от 3933 п.о. до 27184 п.о. B SEQ ID NO: 21.In one embodiment, VA is a sequence from 3933 bp. up to 27184 b.p. B SEQ ID NO: 21.

Термин Е3, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей часть или полноразмерную область E3 аденовируса (т.е. белок/полипептид), ее можно мутировать таким образом, что белок, кодируемый геном Е3, содержит консервативные или неконсервативные замены аминокислот, так что у него наблюдается такая же функция, как и у белка дикого типа (соответствующего немутированного белка); повышенная функция по сравнению с белком дикого типа; пониженная функция, например, отсутствие функции по сравнению с белком дикого типа или новая функция по сравнению с белком дикого типа, или комбинация перечисленных вариантов, в соответствующих случаях.The term E3 as used in this application refers to a DNA sequence encoding part or full length of the E3 region of adenovirus (i.e. protein/polypeptide), it can be mutated so that the protein encoded by the E3 gene contains conservative or non-conservative amino acid substitutions, so that it has the same function as the wild-type protein (the corresponding unmutated protein); increased function compared to wild-type protein; reduced function, eg, no function compared to the wild-type protein, or new function compared to the wild-type protein, or a combination of the above, as appropriate.

В одном варианте реализации область E3 получена из серотипа аденовируса, приведенного в таблице 1, или из комбинации перечисленных серотипов, в частности, из серотипа группы В, например, из Ad3, Ad7, Ad11 (в частности, Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 или из комбинации перечисленных, например, из Ad3, Ad11 (в частности, Ad11p) или из комбинации перечисленных.In one embodiment, the E3 region is derived from an adenovirus serotype shown in Table 1, or from a combination of these serotypes, in particular from a group B serotype, for example, from Ad3, Ad7, Ad11 (particularly Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21 , Ad34, Ad35, Ad51 or from a combination of the above, for example, from Ad3, Ad11 (in particular Ad11p) or from a combination of the above.

В одном варианте реализации область E3 частично удалена, например, удалена на 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5%.In one embodiment, the E3 region is partially removed, e.g., 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 %.

В одном варианте реализации В2 представляет собой связь, при этом ДНК, кодирующая область E3, отсутствует.In one embodiment, B 2 is a bond with no DNA encoding the E3 region.

В одном варианте реализации ДНК, кодирующую область E3, можно заменить или прервать трансгеном. В данной заявке формулировка область E3 заменена на трансген включает замену на трансген части или всей области E3.In one embodiment, the DNA encoding the E3 region can be replaced or interrupted by a transgene. In this application, the formulation of the E3 region replaced by a transgene includes the replacement of part or all of the E3 region with a transgene.

В одном варианте реализации область В2 включает последовательность от 27185 п.о. до 28165 п.о. в SEQ ID NO: 21.In one embodiment, the region In 2 includes a sequence of 27185 p. up to 28165 b.p. in SEQ ID NO: 21.

В одном варианте реализации В2 состоит из последовательности от 27185 п.о. до 28165 п.о. в SEQ ID NO: 21.In one embodiment, B 2 consists of a sequence of 27185 p. up to 28165 b.p. in SEQ ID NO: 21.

BX, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК вблизи 5'-конца гена L5 в ВВ. Термин вблизи или проксимально 5'-концу гена L5, используемый в данной заявке, относится к: прилеганию (контактированию) к 5'-концу гена L5 или некодирующей области, неотъемлемо связанной с ним, т.е., примыканию или контактированию с 5'-концом гена L5 или некодирующей областью, неотъемлемо связанной с ним. В качестве альтернативы, вблизи или проксимально может относиться к близкому расположению к гену L5, так что между областью ВХ и 5'-концом гена L5 отсутствуют кодирующие последовательности.BX as used in this application refers to the DNA sequence near the 5' end of the L5 gene in B B . The term near or proximal to the 5' end of the L5 gene, as used in this application, refers to: adjacent (contacting) the 5' end of the L5 gene or a non-coding region inherently associated with it, i.e., adjacent or contacting the 5' -the end of the L5 gene or a non-coding region inherently associated with it. Alternatively, near or proximal can refer to proximity to the L5 gene such that there are no coding sequences between the BX region and the 5' end of the L5 gene.

Таким образом, в одном варианте реализации BX непосредственно присоединен к основанию L5, которое представляет собой, например, начало кодирующей последовательности гена L5.Thus, in one embodiment, B X is directly attached to the base of L5, which is, for example, the beginning of the coding sequence of the L5 gene.

Таким образом, в одном варианте реализации BX непосредственно присоединен к основанию L5, которое представляет собой, например, начало некодирующей последовательности, или присоединен непосредственно к некодирующей области, которая естественным образом связана с L5. Термин некодирующая область, естественным образом связанная с L5, используемый в данной заявке, относится к части всех некодирующих областей, которые являются частью гена L5 или контактируют с ним, но не являются частью другого гена.Thus, in one embodiment, BX is directly attached to the base of L5, which is, for example, the start of a non-coding sequence, or is attached directly to a non-coding region that is naturally associated with L5. The term non-coding region naturally associated with L5 as used herein refers to the portion of all non-coding regions that are part of or in contact with the L5 gene but are not part of another gene.

В одном варианте реализации BX включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 88. Данная последовательность представляет собой искусственную некодирующую последовательность, в которую может быть вставлена последовательность ДНК, например, содержащая трансген (или кассету трансгенов), сайт рестрикции или их комбинацию. Данная последовательность предпочтительна, так какIn one embodiment, BX includes the sequence shown in SEQ ID NO: 88. This sequence is an artificial non-coding sequence into which a DNA sequence can be inserted, for example, containing a transgene (or transgene cassette), a restriction site, or a combination thereof. This sequence is preferred because

- 31 042321 она действует как буфер в том смысле, что позволяет некоторую гибкость в отношении точного расположения трансгена, при этом минимизируя разрушительное действие на стабильность и жизнеспособность вируса.- 31 042321 it acts as a buffer in the sense that it allows some flexibility in the exact location of the transgene, while minimizing the disruptive effect on the stability and viability of the virus.

Вставку(-и) можно располагать в любом месте внутри SEQ ID NO: 82 от 5'-конца до 3'-конца или в любой точке между 1-201 п.о., например, между парами основанийThe insert(s) can be positioned anywhere within SEQ ID NO: 82 from the 5' end to the 3' end, or anywhere between 1-201 bp, such as between base pairs

1/2, 2/3,1/2, 2/3,

3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33,3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/ 16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33,

33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47,33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/ 46, 46/47,

47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61,47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/ 60, 60/61,

61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75,61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/ 74, 74/75,

75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89,75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/ 88, 88/89,

89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112,89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/ 102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112,

112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122,112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122,

122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132,122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132,

132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142,132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142,

142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153,142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153,

153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163,153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163,

163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173,163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173,

173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183,173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183,

183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194,183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194,

194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 или 200/201.194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 or 200/201.

В одном варианте реализации BX включает SEQ ID NO: 21, при этом последовательность ДНК встраивают между 27 п.о. и 28 п.о. или в место, соответствующее месту между положениями 28192 п.о. и 28193 п.о. в SEQ ID NO: 21.In one embodiment, B X includes SEQ ID NO: 21, wherein the DNA sequence is inserted between 27 bp. and 28 b.p. or in a place corresponding to the place between the provisions of 28192 p. and 28193 b.p. in SEQ ID NO: 21.

В одном варианте реализации BX представляет собой последовательность от 28166 п.о. до 28366 п.о. в SEQ ID NO: 21. В одном варианте реализации BX представляет собой связь.In one embodiment, B X is a sequence from 28166 p. up to 28366 b.p. in SEQ ID NO: 21. In one embodiment, B X is a bond.

BB, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей область L5. В данной заявке область L5 относится к последовательности ДНК, содержащей ген, кодирующий полипептид/белок фибриллы, в соответствующем контексте. Ген/область фибриллы кодирует белок, фибриллы который представляет собой основной компонент капсида аденовирусов. Функция белка фибриллы состоит в распознавании рецептора и вносит вклад в способность аденовируса избирательно связывать и инфицировать клетки.BB used in this application refers to the DNA sequence encoding the L5 region. In this application, the L5 region refers to a DNA sequence containing a gene encoding a polypeptide/fibril protein, in the appropriate context. The fibril gene/region encodes a fibril protein which is the main component of the adenovirus capsid. The function of the fibril protein is to recognize the receptor and contribute to the ability of the adenovirus to selectively bind and infect cells.

В вирусах согласно настоящему описанию белок фибриллы может быть из любого серотипа аденовируса, и известны аденовирусы, которые становятся химерными в результате замены белка фибриллы на таковой из отличного серотипа. В одном варианте реализации белок фибриллы получен из вируса группы В, в частности, Ad11, такого как Ad11р.In the viruses of the present disclosure, the fibril protein may be from any adenovirus serotype, and adenoviruses are known to become chimeric by replacing a fibril protein with one from a different serotype. In one embodiment, the fibril protein is derived from a group B virus, specifically Ad11, such as Ad11p.

Последовательность ДНК по отношению к BY, используемая в данной заявке, относится к последовательности ДНК вблизи 3'-конца гена L5 BB. Термин вблизи или проксимально к 3'-концу гена L5, используемый в данной заявке, относится к: прилеганию (контактированию) к 3'-концу гена L5 или некодирующей области, неотъемлемо связанной с ним, т.е., примыканию или контактированию с 3'- концом гена L5 или некодирующей областью, неотъемлемо связанной с ним (т.е. полноразмерной или частью некодирующей последовательности, эндогенной для L5). В качестве альтернативы, вблизи или проксимально может относиться к близкому расположению к гену L5, так что между областью BY и 3'- концом гена L5 отсутствуют кодирующие последовательности.The DNA sequence in relation to BY used in this application refers to the DNA sequence near the 3'-end of the gene L5 B B . The term near or proximal to the 3' end of the L5 gene, as used in this application, refers to: adjacent (contacting) to the 3' end of the L5 gene or a non-coding region inherently associated with it, i.e., adjacent or contacting with 3 '- the end of the L5 gene or a non-coding region inherently associated with it (ie, full-length or part of a non-coding sequence endogenous to L5). Alternatively, near or proximally may refer to proximity to the L5 gene such that there are no coding sequences between the BY region and the 3' end of the L5 gene.

Таким образом, в одном варианте реализации BY непосредственно присоединен к основанию L5, которое представляет собой конец кодирующей последовательности.Thus, in one embodiment, B Y is directly attached to the L5 base, which is the end of the coding sequence.

Таким образом, в одном варианте реализации BY непосредственно присоединен к основанию L5, которое представляет собой конец некодирующей последовательности, или непосредственно присоединен к некодирующей области, которая естественным образом связана с L5.Thus, in one embodiment, B Y is directly attached to the base of L5, which is the end of the non-coding sequence, or directly attached to the non-coding region, which is naturally associated with L5.

Термины по существу и по природе используют взаимозаменяемо в данной заявке. В одном варианте реализации BY включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89. Данная последовательность представляет собой некодирующую последовательность, где последовательность ДНК, например, содержит трансген (или кассету трансгенов), сайт рестрикции, или может быть встроена их ком- 32 042321 бинация. Данная последовательность предпочтительна, так как она действует как буфер в том смысле, что позволяет некоторую гибкость в отношении точного расположения трансгена, при этом минимизируя разрушительное действие на стабильность и жизнеспособность вируса.The terms essentially and in nature are used interchangeably in this application. In one embodiment, B Y includes the sequence shown in SEQ ID NO: 89. This sequence is a non-coding sequence, where the DNA sequence, for example, contains a transgene (or a transgene cassette), a restriction site, or can be inserted into their combination. bination. This sequence is preferred because it acts as a buffer in that it allows some flexibility in the exact location of the transgene while minimizing disruption to virus stability and viability.

Вставку(-и) можно располагать в любом месте внутри SEQ ID NO: 88 от 5'-конца до 3'-конца или в любой точке между п.о. 1 - 35, например, между парами оснований 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 или 34/35.The insert(s) can be positioned anywhere within SEQ ID NO: 88 from the 5'end to the 3'end or at any point between p. 1 - 35, e.g. between base pairs 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11 /12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24 , 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 or 34/35.

В одном варианте реализации BY включает SEQ ID NO: 89, при этом последовательность ДНК встраивают между положениями 12 и 13 п.о. или в место, соответствующее 29356 п.о. и 29357 п.о. в последовательности SEQ ID NO: 21. В одном варианте реализации вставка представляет собой вставку сайта рестрикции. В одном варианте реализации вставка сайта рестрикции содержит один или два сайта рестрикции. В одном варианте реализации сайт рестрикции представляет собой вставку сайта рестрикции размером 19 п.о., содержащую 2 сайта рестрикции. В одном варианте реализации вставка сайта рестрикции представляет собой вставку сайта рестрикции размером 9 п.о., содержащую 1 сайт рестрикции. В одном варианте реализации вставка сайта рестрикции содержит один или два сайта рестрикции и по меньшей мере один трансген, например, один, или два, или три трансгена, например, один или два трансгена. В одном варианте реализации сайт рестрикции представляет собой вставку сайта рестрикции размером 19 п.о., содержащую 2 сайта рестрикции и по меньшей мере один трансген, например, один или два трансгена. В одном варианте реализации вставка сайта рестрикции представляет собой вставку сайта рестрикции размером 9 п.о., содержащую 1 сайт рестрикции и по меньшей мере один трансген, например, один или два трансгена. В одном варианте реализации между двумя сайтами рестрикции размещены один или более трансгенов, например, два трансгена (например, в кассете трансгенов). В одном варианте реализации, когда BY содержит два сайта рестрикции, то указанные сайты рестрикции отличаются друг от друга. В одном варианте реализации указанный один или более сайтов рестрикции в BY не встречаются в природе (например, уникальный) в конкретном геноме аденовируса, в который они были встроены. В одном варианте реализации указанный один или более сайтов рестрикции в BY отличаются от других сайтов рестрикции, расположенных в других местах в геноме аденовируса, например, отличаются от встречающихся в природе сайтов рестрикции или сайтов рестрикции, внедренных в другие участки генома, такие как ВХ. Таким образом, в одном варианте реализации сайт или сайты рестрикции позволяют специфично разрезать ДНК на данном участке.In one embodiment, the BY includes SEQ ID NO: 89, wherein the DNA sequence is inserted between positions 12 and 13 bp. or to the place corresponding to 29356 p. and 29357 b.p. in SEQ ID NO: 21. In one embodiment, the insert is a restriction site insert. In one embodiment, the restriction site insert contains one or two restriction sites. In one embodiment, the restriction site is a 19 bp restriction site insert containing 2 restriction sites. In one embodiment, the restriction site insert is a 9 bp restriction site insert containing 1 restriction site. In one embodiment, the restriction site insert contains one or two restriction sites and at least one transgene, such as one or two or three transgenes, such as one or two transgenes. In one embodiment, the restriction site is a 19 bp restriction site insert containing 2 restriction sites and at least one transgene, eg one or two transgenes. In one embodiment, the restriction site insert is a 9 bp restriction site insert containing 1 restriction site and at least one transgene, eg one or two transgenes. In one embodiment, one or more transgenes, such as two transgenes, are placed between two restriction sites (eg, in a transgene cassette). In one implementation, when BY contains two restriction sites, then these restriction sites are different from each other. In one embodiment, said one or more restriction sites in the BY do not naturally occur (eg, unique) in the particular adenovirus genome into which they have been inserted. In one embodiment, said one or more restriction sites in the BY are different from other restriction sites located elsewhere in the adenovirus genome, for example, different from naturally occurring restriction sites or restriction sites introduced elsewhere in the genome, such as BX. Thus, in one embodiment, the restriction site or sites allow specific cutting of DNA at a given site.

В одном варианте реализации BY представляет собой последовательность от 29345 п.о. до 29379 п.о. в SEQ ID NO: 21. В одном варианте реализации BY представляет собой связь.In one embodiment, BY is a sequence from 29345 bp. up to 29379 b.p. in SEQ ID NO: 21. In one embodiment, BY is a bond.

В одном варианте реализации вставка находится после 12 п.о. в последовательности SEQ ID NO: 89.In one embodiment, the insert is after 12 bp. in the sequence of SEQ ID NO: 89.

В одном варианте реализации вставка находится приблизительно в положении 29356 п.о. в SEQ ID NO:21.In one embodiment, the insert is located at approximately 29356 bp. in SEQ ID NO:21.

В одном варианте реализации вставка представляет собой кассету трансгенов, содержащую один или более трансгенов, например, 1, 2 или 3, например, 1 или 2 трансгена.In one embodiment, the insert is a transgene cassette containing one or more transgenes, eg 1, 2 or 3, eg 1 or 2 transgenes.

Термин Е4, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей часть или полноразмерную область Е4 аденовируса (т.е. область полипептида/белка), которую можно мутировать таким образом, что белок, кодируемый геном Е4, содержит консервативные или неконсервативные замены аминокислот и проявляет такую же функцию, как и белок дикого типа (соответствующий немутированный белок); повышенную функцию по сравнению с белком дикого типа; пониженную функцию, например, отсутствие функции по сравнению с белком дикого типа, или новую функцию по сравнению с белком дикого типа, или комбинацию перечисленных вариантов в соответствующих случаях.The term E4 as used in this application refers to a DNA sequence encoding part or all of an adenovirus E4 region (i.e. a polypeptide/protein region) that can be mutated such that the protein encoded by the E4 gene contains conservative or non-conservative amino acid substitutions. and exhibits the same function as the wild-type protein (corresponding unmutated protein); increased function compared to wild-type protein; reduced function, for example, no function compared to the wild-type protein, or new function compared to the wild-type protein, or a combination of these options, as appropriate.

В одном варианте реализации область Е4 частично удалена, например, удалена на 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%. В одном варианте реализации область Е4 представляет собой последовательность от 32188 п.о. до 29380 п.о. в SEQ ID NO: 21.In one embodiment, the E4 region is partially removed, such as 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, or 5 %. In one embodiment, the E4 region is a sequence from 32188 bp. up to 29380 b.p. in SEQ ID NO: 21.

В одном варианте реализации Е4 присутствует за исключением удаленной области E4orf4.In one embodiment, E4 is present except for the deleted area E4orf4.

В одном варианте реализации B3 представляет собой связь, т.е., когда Е4 отсутствует.In one embodiment, B 3 is a bond, ie when E4 is absent.

В одном варианте реализации последовательность B3 состоит из 32188 п.о. - 29380 п.о. в SEQ ID NO:21.In one embodiment, the B 3 sequence consists of 32188 bp. - 29380 b.p. in SEQ ID NO:21.

В данной заявке диапазоны чисел включают конечные точки.In this application, the ranges of numbers include endpoints.

Для специалиста должно быть очевидно, что элементы в формулах в данной заявке, таких как формулы (I), (Ia), непрерывны и могут содержать некодирующие последовательности ДНК, а также гены и кодирующие последовательности ДНК (структурные особенности), упомянутые в данной заявке. В одном или более вариантах реализации формулы согласно настоящему описанию предназначены для описания встречающейся в природе последовательности в геноме аденовируса. В данном контексте специалисту будет ясно, что в формуле указывают основные элементы, описывающие соответствующую часть генома, и она не предназначена для исчерпывающего описания геномного участка ДНК.It should be obvious to a person skilled in the art that the elements in the formulas in this application, such as formulas (I), (Ia), are continuous and may contain non-coding DNA sequences, as well as genes and DNA coding sequences (structural features) mentioned in this application. In one or more embodiments, formulas as described herein are intended to describe a naturally occurring sequence within the adenovirus genome. In this context, the specialist will be clear that the formula indicates the main elements that describe the relevant part of the genome, and it is not intended to exhaustively describe the genomic DNA region.

Каждый из E1A, E1B, E3 и Е4, используемый в данной заявке, независимо относится к дикому типу и его эквивалентам, мутированным формам или формам, содержащим частичные делеции, каждого уча- 33 042321 стка, описанного в данной заявке, в частности, к последовательности дикого типа известного аденовируса.Each of the E1A, E1B, E3 and E4 used in this application independently refers to the wild type and its equivalents, mutated forms or forms containing partial deletions, each region described in this application, in particular, to the sequence wild-type known adenovirus.

Термин вставка, используемый в данной заявке, относится к последовательности ДНК, которую встраивают либо в 5'-конец, либо в 3'-конец, либо внутрь данного исходного фрагмента последовательности ДНК, так что она прерывает исходную последовательность. Последняя представляет собой исходную последовательность, используемую в качестве исходной точки, относительно которой расположена вставка. В контексте настоящего описания вставки, как правило, встречаются внутри либо SEQ ID NO: 88, либо SEQ ID NO: 89. Вставка может представлять собой либо вставку сайта рестрикции, либо вставку кассеты трансгенов, либо вставку обоих. Когда последовательность прерывается, вирус будет все еще содержать исходную последовательность, но, как правило, она будет представлена в виде двух фрагментов, между которыми находится вставка.The term insert as used in this application refers to a DNA sequence that is inserted either at the 5' end, or at the 3' end, or within a given parent DNA sequence fragment such that it interrupts the parent sequence. The latter is the source sequence used as the starting point relative to which the insert is located. As used herein, inserts typically occur within either SEQ ID NO: 88 or SEQ ID NO: 89. An insert can be either a restriction site insert, a transgene cassette insert, or both. When the sequence is interrupted, the virus will still contain the original sequence, but typically it will be presented as two fragments with an insert between them.

В одном варианте реализации трансген или кассета трансгенов не содержит ненаправленно встраиваемый транспозон, такой как транспозон TN7 или его часть. Термин транспозон Tn7, используемый в данной заявке, относится к ненаправленно встраиваемому транспозону, описанному в WO2008/080003.In one embodiment, the transgene or transgene cassette does not contain a non-directional insertion transposon, such as a TN7 transposon, or a portion thereof. The term Tn7 transposon as used in this application refers to the non-directional insertion transposon described in WO2008/080003.

В одном варианте реализации трансген или кассета трансгенов дополнительно содержит регуляторный элемент или последовательность.In one embodiment, the transgene or transgene cassette further comprises a regulatory element or sequence.

Другие регуляторные последовательности.Other regulatory sequences.

Термин регулятор экспрессии генов (или регулятор/регуляторный элемент), используемый в данной заявке, относится к генетическому элементу, такому как промотор, энхансер или акцепторная последовательность сплайсинга, который играет роль в экспрессии генов, обычно путем инициирования или повышения транскрипции или трансляции.The term gene expression regulator (or regulator/regulatory element) as used herein refers to a genetic element, such as a promoter, enhancer, or splicing acceptor sequence, that plays a role in gene expression, usually by initiating or increasing transcription or translation.

Термин акцепторная последовательность сплайсинга, акцепторный сайт сплайсинга или сайт сплайсинга, используемый в данной заявке, относится к регуляторной последовательности, определяющей, когда молекулу мРНК будут узнавать малые ядерные рибонуклеопротеины комплекса сплайсосомы. После сборки сплайсосома катализирует сплайсинг между акцепторным сайтом сплайсинга молекулы мРНК и расположенным против хода транскрипции донорным сайтом сплайсинга с получением зрелой молекулы мРНК, которую можно подвергнуть трансляции с получением единого полипептида или белка.The term splice acceptor sequence, splice acceptor site or splice site as used herein refers to a regulatory sequence that determines when an mRNA molecule will be recognized by the small nuclear ribonucleoproteins of the spliceosome complex. Once assembled, the spliceosome catalyses splicing between the mRNA molecule's splice acceptor site and the upstream splice donor site to produce a mature mRNA molecule that can be translated into a single polypeptide or protein.

В настоящем изобретении можно использовать акцепторные последовательности сплайсинга различных размеров, и их можно описать как короткий акцепторный сайт сплайсинга (малый), акцепторный сайт сплайсинга (средний) и разветвленный акцепторный сайт сплайсинга (большой).Splice acceptors of various sizes can be used in the present invention and can be described as a short splice acceptor (small), a splice acceptor (medium), and a branched splice acceptor (large).

Термин SSA, используемый в данной заявке, означает короткий акцептор сплайсинга, обычно содержащий только сайт сплайсинга, например, из 4 п.о. Термин SA, используемый в данной заявке, означает акцептор сплайсинга, обычно содержащий короткий акцептор сплайсинга и полипиримидиновый тракт, например, из 16 п.о. Термин bSA, используемый в данной заявке, означает разветвленный акцептор сплайсинга, обычно содержащий короткий акцептор сплайсинга, полипиримидиновый тракт и точку ветвления, например, 26 п.о.The term SSA, as used in this application, means a short splicing acceptor, usually containing only a splicing site, for example, from 4 p. The term SA as used in this application means a splicing acceptor, usually containing a short splicing acceptor and a polypyrimidine tract, for example, of 16 bp. The term bSA as used in this application means a branched splicing acceptor, usually containing a short splicing acceptor, a polypyrimidine tract and a branch point, for example, 26 p.

В одном варианте реализации акцептор сплайсинга, используемый в конструкциях согласно настоящему описанию, представляет собой CAGG или SEQ ID NO: 90 или 91. В одном варианте реализации последовательность нуклеотидов SSA представляет собой CAGG. В одном варианте реализации последовательность нуклеотидов SA представляет собой SEQ ID NO: 90. В одном варианте реализации последовательность нуклеотидов SA представляет собой последовательность SEQ ID NO: 91.In one embodiment, the splicing acceptor used in constructs as described herein is CAGG or SEQ ID NO: 90 or 91. In one embodiment, the nucleotide sequence of SSA is CAGG. In one embodiment, the SA nucleotide sequence is SEQ ID NO: 90. In one embodiment, the SA nucleotide sequence is SEQ ID NO: 91.

В одном варианте реализации за сайтом сплайсинга непосредственно находится (т.е. следует в направлении от 5' к 3') консенсусная последовательность Козак, содержащая CCACC. В одном варианте реализации между сайтом сплайсинга и последовательностью Козак находится 100 п.о. или менее. В одном варианте реализации последовательность Козак представляет собой последовательность нуклеотидов CCACC.In one embodiment, the splicing site is immediately followed by (ie, following in the 5' to 3' direction) a Kozak consensus sequence containing CCACC. In one embodiment, there is 100 bp between the splicing site and the Kozak sequence. or less. In one embodiment, the Kozak sequence is the nucleotide sequence CCACC.

Обычно при нахождении под контролем эндогенного или экзогенного промотора (такого как эндогенный промотор), за кодирующей последовательностью будет непосредственно находиться последовательность Козак. На начало кодирующей области указывает инициирующий кодон (AUG), например, в контексте последовательности (gcc)gccRccAUGg [SEQ ID NO: 92] начало начал кодирующих последовательностей представлено основаниями, выделенными жирным шрифтом. Строчные буквы обозначают обычные основания в данном положении (которые, тем не менее, могут варьироваться), а заглавные буквы указывают на высоко консервативные основания, т.е., последовательность AUGG' постоянна или очень редко изменяется, если вообще изменяется; 'R' указывает на то, что в данном положении обычно наблюдают пурин (аденин или гуанин), а значимость последовательности в скобках (gcc) не ясна. Таким образом, в одном варианте реализации инициирующий кодон AUG включен в последовательность Козак.Typically, when under the control of an endogenous or exogenous promoter (such as an endogenous promoter), the coding sequence will immediately be followed by a Kozak sequence. The beginning of the coding region is indicated by an initiation codon (AUG), for example, in the context of the sequence (gcc)gccRccAUGg [SEQ ID NO: 92], the beginning of the beginnings of coding sequences is represented by bases in bold. Lowercase letters indicate the usual bases at a given position (which may nevertheless vary), and capital letters indicate highly conserved bases, ie, the AUGG' sequence is constant or changes very rarely, if at all; 'R' indicates that a purine (adenine or guanine) is commonly seen at this position, and the significance of the sequence in brackets (gcc) is not clear. Thus, in one embodiment, the start codon AUG is included in the Kozak sequence.

Формулировка внутренняя последовательность ДНК посадки рибосомы, используемая в данной заявке, относится к последовательности ДНК, кодирующей внутреннюю последовательность посадки рибосомы (IRES). Термин IRES, используемый в данной заявке, означает последовательность нуклеотидов, которая позволяет начать трансляцию последовательности информационной РНК (мРНК), включая инициацию, начинающуюся внутри последовательности мРНК. Это особенно полезно, когда кассетаThe wording internal ribosome entry DNA sequence used in this application refers to a DNA sequence encoding an internal ribosome entry sequence (IRES). The term IRES as used in this application means a nucleotide sequence that allows translation of a messenger RNA (mRNA) sequence to begin, including initiation starting within an mRNA sequence. This is especially useful when the cassette

- 34 042321 кодирует полицистронную мРНК. Применение IRES позволяет транслировать полицистронную мРНК во множество отдельных белков или пептидов. В одном варианте реализации последовательность нуклеотидов внутренней последовательности ДНК посадки рибосомы представлена в SEQ ID NO: 93. В одном варианте реализации конкретный IRES используют лишь однократно в геноме. Это может быть полезно с точки зрения стабильности генома.- 34 042321 encodes polycistronic mRNA. The use of IRES allows the translation of polycistronic mRNA into many individual proteins or peptides. In one embodiment, the nucleotide sequence of the internal ribosome entry DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 93. In one embodiment, a particular IRES is used only once in the genome. This may be useful in terms of genome stability.

Самоотщепляющийся с высокой эффективностью пептид 2А или пептид 2А, используемый в данной заявке, относится к пептиду, который эффективно отщепляется после трансляции. Подходящие пептиды 2А включают Р2А, F2A, Е2А и Т2А. Авторы настоящего изобретения заметили, что после того как определенная последовательность ДНК, кодирующая данный пептид 2А, использовалась один раз, ту же самую последовательность ДНК нельзя использовать второй раз. Тем не менее, можно использовать вырожденность кода ДНК, чтобы получить последовательность ДНК, которая транслируется в такой же пептид 2А. Применение пептидов 2А особенно полезно, когда кассета кодирует полицистронную мРНК. Применение пептидов 2А приводит к трансляции единой полипептидной цепи, которую модифицируют посттрансляционно с получением множества отдельных белков или пептидов.Highly efficient self-cleaving peptide 2A or peptide 2A used in this application refers to a peptide that is efficiently cleaved after translation. Suitable 2A peptides include P2A, F2A, E2A and T2A. The present inventors have observed that once a certain DNA sequence encoding a given 2A peptide has been used once, the same DNA sequence cannot be used a second time. However, it is possible to exploit the degeneracy of the DNA code to obtain a DNA sequence that is translated into the same 2A peptide. The use of 2A peptides is particularly useful when the cassette encodes a polycistronic mRNA. The use of 2A peptides results in the translation of a single polypeptide chain, which is post-translationally modified to produce multiple individual proteins or peptides.

В одном варианте реализации последовательность аминокислот используемого кодируемого пептида Р2А представлена в SEQ ID NO: 94. В одном варианте реализации последовательность аминокислот используемого кодируемого пептида F2A представлена в SEQ ID NO: 95. В одном варианте реализации последовательность аминокислот используемого кодируемого пептида Е2А представлена в SEQ ID NO: 96. В одном варианте реализации последовательность аминокислот используемого кодируемого пептида Т2А представлена в SEQ ID NO: 97.In one embodiment, the amino acid sequence of the encoded P2A peptide used is shown in SEQ ID NO: 94. In one embodiment, the amino acid sequence of the encoded F2A peptide used is shown in SEQ ID NO: 95. NO: 96. In one embodiment, the amino acid sequence of the encoded T2A peptide used is shown in SEQ ID NO: 97.

В одном варианте реализации одна мРНК или каждая мРНК, кодируемая трансгеном, содержит последовательность сигнала полиаденилирования, например, как правило, на конце последовательности мРНК. Таким образом, в одном варианте реализации трансген или кассета трансгенов содержит по меньшей мере одну последовательность, кодирующую последовательность сигнала полиаденилирования.In one embodiment, one mRNA or each mRNA encoded by the transgene contains a polyadenylation signal sequence, eg, typically at the end of the mRNA sequence. Thus, in one embodiment, the transgene or transgene cassette contains at least one sequence encoding a polyadenylation signal sequence.

Термины поли(А), сигнал полиаденилирования или последовательность полиаденилирования, используемые в данной заявке, означают последовательность ДНК, обычно содержащую последовательность ААТААА, которую после транскрипции может узнавать мультибелковый комплекс, который отщепляет и полиаденилирует образующуюся молекулу мРНК.The terms poly(A), polyadenylation signal or polyadenylation sequence as used in this application means a DNA sequence, usually containing the AATAAA sequence, which, after transcription, can be recognized by a multiprotein complex that cleaves and polyadenylates the resulting mRNA molecule.

В одном варианте реализации указанная конструкция не содержит последовательность полиаденилирования. В одном варианте реализации регулятор экспрессии генов представляет собой акцепторную последовательность сплайсинга.In one embodiment, said construct does not contain a polyadenylation sequence. In one embodiment, the gene expression regulator is a splicing acceptor sequence.

В одном варианте реализации последовательность, кодирующая белок/полипептид/пептид, такой как антитело или фрагмент антитела, дополнительно содержит сигнал полиаденилирования.In one embodiment, the protein/polypeptide/peptide coding sequence, such as an antibody or antibody fragment, further comprises a polyadenylation signal.

В одном варианте реализации предложен вирус или конструкция с последовательностью, описанной в данной заявке.In one embodiment, the proposed virus or construct with the sequence described in this application.

Антитела.Antibodies.

Термин молекула антитела, используемый в данной заявке, включает любую конструкцию, содержащую полноразмерное антитело или связывающий фрагмент указанного антитела, полиспецифические форматы антител. Таким образом, молекулы антитела согласно настоящему изобретению включают полноразмерную молекулу антитела, содержащую полноразмерные тяжелые и легкие цепи, или фрагмент антитела, и могут представлять собой, но не ограничены перечисленными: Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, однодоменные антитела (например, VH, или VL, или VHH), scFv, би-, три- или тетравалентные антитела, бис-scFv, диатела, триатела, тетратела и связывающие эпитоп фрагменты любой из описанных выше молекул (см., например, Holliger и Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair и Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Способы получения и производства данных фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Verma и др., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Другие фрагменты антител для применения в настоящем изобретении включают фрагменты Fab и Fab', описанные в международных заявках на патент WO2005/003169, WO2005/003170 и WO2005/003171. У поливалентных антител может быть множество специфичностей, например, они могут быть биспецифическими или моноспецифическими (см., например, WO 92/22853 и WO05/113605). Биспецифическим и полиспецифическим вариантам антител в данном примере уделяют особое внимание, поскольку цель состоит в нейтрализации двух независимых белков-мишеней.The term antibody molecule as used in this application includes any construct containing a full length antibody or a binding fragment of said antibody, polyspecific antibody formats. Thus, antibody molecules of the present invention comprise a full-length antibody molecule containing full-length heavy and light chains, or an antibody fragment, and may be, but are not limited to, Fab modified Fab, Fab' modified Fab', F(ab' ) 2 , Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, single domain antibodies (e.g. VH or VL or VHH), scFv, bi-, tri- or tetravalent antibodies, bis-scFv, diabodies, tribodies, tetrabodies and epitope binding fragments of any of the molecules described above (see, for example, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) . Methods for obtaining and producing these antibody fragments are well known in the art (see, for example, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Other antibody fragments for use in the present invention include the Fab and Fab' fragments described in international patent applications WO2005/003169, WO2005/003170 and WO2005/003171. Polyvalent antibodies can have many specificities, for example they can be bispecific or monospecific (see, for example, WO 92/22853 and WO05/113605). Bispecific and multispecific antibody variants are given particular attention in this example because the goal is to neutralize two independent target proteins.

Если в контексте не указано противоположное, антитело, как правило, будет относиться к полноразмерному антителу.Unless the context indicates otherwise, an antibody will generally refer to a full-length antibody.

Термин связывающий фрагмент антитела, используемый в данной заявке, относится к меньшему чем полноразмерное антитело фрагменту, который сохраняет специфичность к целевому антигену. Связывающие фрагменты антител могут включать Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, однодоменные антитела (например, VH, или VL, или VHH), scFv, ds-scFv.The term antibody binding fragment as used herein refers to a fragment smaller than a full length antibody that retains specificity for the target antigen. Antibody binding fragments may include Fab, Fab', Fab' modified, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, single domain antibodies (e.g. VH or VL or VHH), scFv, ds-scFv .

В одном варианте реализации антитела или связывающие фрагменты антител, используемые в технологии согласно настоящему описанию, являются моноклональными.In one embodiment, the antibodies or antibody binding fragments used in the technology of the present disclosure are monoclonal.

- 35 042321- 35 042321

Моноклональные антитела для применения в настоящем изобретении можно получить с помощью любого способа, известного в данной области, такого как гибридомная технология (Kohler и Milstein,Monoclonal antibodies for use in the present invention can be obtained using any method known in this field, such as hybridoma technology (Kohler and Milstein,

1975, Nature, 256:495-497), триомная технология, гибридомная технология с использованием В-клеток человека (Kozbor и др., 1983, Immunology Today, 4:72) и EBV-гибридомная технология (Cole и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, стр. 77 - 96, Alan R Liss, Inc., 1985).1975, Nature, 256:495-497), trioma technology, hybridoma technology using human B cells (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72), and EBV hybridoma technology (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Антитела для применения в настоящем изобретении также можно получить, применяя способы с применением антител из одного лимфоцита, путем клонирования и экспрессии кДНК вариабельных областей иммуноглобулинов, полученных из отдельных лимфоцитов, прошедших селекцию по продукции специфических антител, например, с помощью способов, описанных в Babcook, J. и др., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 и международной заявке на патент номер WO2004/106377.Antibodies for use in the present invention can also be generated using single-lymphocyte antibody methods, by cloning and expressing cDNA of immunoglobulin variable regions derived from single lymphocytes that have been selected for the production of specific antibodies, for example, using the methods described in Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. sci. USA 93(15): 7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 and international patent application number WO2004/106377.

Связывающие домены, используемые в молекулах антител согласно настоящему описанию, могут быть гуманизированными.Binding domains used in antibody molecules as described herein may be humanized.

Гуманизированные антитела (которые включают антитела с привитыми CDR) представляют собой молекулы антител, содержащие один или более определяющих комплементарность участков (гипервариабельных участков, CDR) из не относящихся к человеку видов и каркасную область из молекулы иммуноглобулина человека (см., например, US 5585089; WO91/09967). Должно быть очевидно, что может потребоваться перенос только определяющих специфичность остатков CDR вместо полноразмерного CDR (см., например, Kashmiri и др., 2005, Methods, 36, 25-34). Гуманизированные антитела необязательно могут дополнительно содержать один или более каркасных остатков, полученных из не относящегося к человеку вида, из которого были получены указанные CDR.Humanized antibodies (which include CDR-grafted antibodies) are antibody molecules containing one or more complementarity-determining regions (hypervariable regions, CDRs) from a non-human species and a framework region from a human immunoglobulin molecule (see, for example, US 5,585,089; WO91/09967). It should be obvious that only the specificity-determining CDR residues may need to be transferred instead of the full-length CDR (see, for example, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Humanized antibodies may optionally further comprise one or more framework residues derived from the non-human species from which said CDRs were derived.

Для прививки CDR или определяющих специфичность остатков можно использовать любую подходящую акцепторную каркасную последовательность вариабельной области, с учетом класса/типа донорного антитела, из которого получены CDR, включая каркасные области мыши, примата и человека. Соответственно, гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению содержит вариабельный домен, содержащий акцепторные каркасные области из человека, а также один или более из CDR, предложенных в данной заявке.Any suitable variable region acceptor framework sequence can be used to graft the CDRs or specificity-defining residues, taking into account the class/type of donor antibody from which the CDRs are derived, including murine, primate, and human frameworks. Accordingly, a humanized antibody of the present invention contains a variable domain containing acceptor framework regions from a human, as well as one or more of the CDRs proposed in this application.

Примеры каркасов человека, которые можно применять в настоящем изобретении, представляют собой KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (Kabat и др., выше). Например, KOL и NEWM можно применять для тяжелой цепи, REI можно применять для легкой цепи и EU, LAY и РОМ можно применять как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи. В качестве альтернативы можно применять зародышевые последовательности человека, которые доступны по ссылке: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/.Examples of human scaffolds that can be used in the present invention are KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, and POM (Kabat et al., supra). For example, KOL and NEWM can be used for the heavy chain, REI can be used for the light chain, and EU, LAY and POM can be used for both the heavy chain and the light chain. Alternatively, human germline sequences can be used, which are available at: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/.

В гуманизированном антителе согласно настоящему изобретению акцепторные тяжелые и легкие цепи не обязательно должны быть получены из одного и того же антитела и, при необходимости, могут содержать составные цепи, содержащие каркасные области, полученные из отличных цепей.In a humanized antibody of the present invention, the acceptor heavy and light chains do not have to be derived from the same antibody and, if necessary, may contain multiple chains containing framework regions derived from different chains.

Также в гуманизированном антителе согласно настоящему изобретению каркасные области не обязательно должны быть с такой же последовательностью, как у таковых в акцепторном антителе. Например, редкие остатки можно заменить на более часто встречающиеся остатки для данного класса или типа акцепторной цепи. В качестве альтернативы, выбранные остатки в акцепторных каркасных областях можно заменить таким образом, чтобы они соответствовали остатку, находящемуся в том же положении в донорном антителе (см. Reichmann и др., 1998, Nature, 332, 323-324). Такие изменения следует свести к минимуму, необходимому для восстановления аффинности донорного антитела. Протокол выбора остатков в акцепторных каркасных областях, которые может потребоваться изменить, представлен в WO 91/09967.Also, in a humanized antibody of the present invention, the framework regions need not be in the same sequence as those in the acceptor antibody. For example, rare residues can be replaced by more frequent residues for a given class or type of acceptor chain. Alternatively, selected residues in the acceptor framework regions can be changed to match the residue found in the same position in the donor antibody (see Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Such changes should be kept to the minimum necessary to restore the affinity of the donor antibody. A protocol for selecting residues in acceptor frameworks that may need to be modified is provided in WO 91/09967.

Домены константной области молекулы антитела согласно настоящему изобретению, если они присутствуют, можно выбрать с учетом предполагаемой функции молекулы антитела и, в частности, эффекторных функций, которые могут потребоваться. Например, домены константной области могут представлять собой домены IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, можно применять домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3, когда молекула антитела предназначена для применения в терапии, и требуются эффекторные функции антитела. В качестве альтернативы, можно применять изотипы IgG2 и IgG4, когда молекула антитела предназначена для терапевтических целей, и эффекторные функции антитела не требуются, например, просто для нейтрализации или агонизма антигена. Должно быть очевидно, что варианты последовательностей данных доменов константной области также можно применять. Например, можно применять молекулы IgG4, в которых серин в положении 241 был заменен на пролин, как описано в Angal и др., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Для специалиста в данной области также должно быть очевидно, что антитела могут подвергаться различным посттрансляционным модификациям. Тип и масштабы данных модификаций часто зависят от линии клеток-хозяев, используемой для экспрессии антитела, а также от условий культивирования. Такие модификации могут включать изменения в гликозилировании, окисление метионина, образование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезаминирование аспарагина. Частой модификацией является утрата карбоксиконцевого основного остатка (такого как лизин или аргинин) в результате действия карбоксипептидаз (что описано у Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).The domains of the constant region of an antibody molecule of the present invention, if present, can be selected based on the intended function of the antibody molecule, and in particular the effector functions that may be required. For example, constant region domains can be human IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM domains. In particular, human IgG constant region domains, especially the IgG1 and IgG3 isotypes, can be used when the antibody molecule is intended for use in therapy and antibody effector functions are required. Alternatively, the IgG2 and IgG4 isotypes can be used when the antibody molecule is for therapeutic purposes and the effector functions of the antibody are not required, for example, simply to neutralize or agonize the antigen. It should be obvious that sequence variants of these constant region domains can also be used. For example, IgG4 molecules in which the serine at position 241 has been replaced by a proline can be used, as described in Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108. It should also be apparent to a person skilled in the art that antibodies can be subject to various post-translational modifications. The type and extent of these modifications often depend on the host cell line used to express the antibody, as well as the culture conditions. Such modifications may include changes in glycosylation, methionine oxidation, diketopiperazine formation, aspartate isomerization, and asparagine deamination. A frequent modification is the loss of a carboxy-terminal basic residue (such as lysine or arginine) by the action of carboxypeptidases (as described in Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

- 36 042321- 36 042321

Составы.Compositions.

В объем настоящего описания также входит фармацевтический состав вируса, описанного в данной заявке.The scope of the present description also includes the pharmaceutical composition of the virus described in this application.

В одном варианте реализации предложен жидкий состав для парентерального применения, например, для инфузии или инъекции, способного реплицироваться онколитического вируса или неспособного реплицироваться вирусного вектора согласно настоящему описанию, при этом состав содержит дозу в диапазоне от 1х1010 до 1х1014 вирусных частиц на объем дозы.In one embodiment, a liquid formulation is provided for parenteral use, e.g., for infusion or injection, of a replicating oncolytic virus or an incapable of replicating viral vector as described herein, wherein the formulation contains a dose in the range of 1 x 10 10 to 1 x 10 14 viral particles per dose volume.

Термин состав для парентерального применения означает состав, разработанный для доставки не через желудочно-кишечный тракт. Обычные пути парентеральной доставки включают инъекцию, имплантацию или инфузию. В одном варианте реализации состав предложен в форме для болюсной доставки.The term parenteral formulation means a formulation designed for delivery other than through the gastrointestinal tract. Common routes of parenteral delivery include injection, implantation or infusion. In one embodiment, the formulation is provided in a bolus delivery form.

В одном варианте реализации состав для парентерального применения находится в форме для инъекции. Инъекция включает внутривенную, подкожную, внутриопухолевую или внутримышечную инъекцию. Термин инъекция, используемый в данной заявке, означает введение жидкости в организм через шприц. В одном варианте реализации способ согласно настоящему описанию не включает внутриопухолевую инъекцию.In one embodiment, the parenteral composition is in the form of an injection. Injection includes intravenous, subcutaneous, intratumoral or intramuscular injection. The term injection, as used in this application, means the introduction of liquid into the body through a syringe. In one embodiment, the implementation of the method according to the present description does not include intratumoral injection.

В одном варианте реализации состав для парентерального применения находится в форме для инфузии.In one embodiment, the parenteral formulation is in an infusion form.

Термин инфузия, используемый в данной заявке, означает введение жидкости с низкой скоростью с помощью капельницы, инфузионного насоса, шприцевой помпы или эквивалентного устройства. В одном варианте реализации инфузию вводят в течение периода времени в диапазоне от 1,5 мин до 120 мин, например, в течение приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 или 115 мин.The term infusion as used in this application means the administration of fluid at a low rate using a dropper, infusion pump, syringe pump, or equivalent device. In one embodiment, the infusion is administered over a period of time ranging from 1.5 minutes to 120 minutes, such as for about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, or 115 min.

В одном варианте реализации одну дозу состава менее 100 мл, например, 30 мл, например, вводят с помощью шприцевой помпы.In one embodiment, the implementation of a single dose of the composition of less than 100 ml, for example, 30 ml, for example, is administered using a syringe pump.

В одном варианте реализации инъекцию вводят в виде медленной инъекции, например, в течение периода времени от 1,5 до 30 мин.In one embodiment, the injection is administered as a slow injection, for example over a period of 1.5 to 30 minutes.

В одном варианте реализации состав предназначен для внутривенного (в/в) введения. Данный путь особенно эффективен для доставки онколитического вируса, так как он позволяет быстрый доступ к большинству органов и тканей, и особенно полезен для лечения метастазов, например, закрепившихся метастазов, особенно расположенных в сильно васкуляризованных областях, таких как печень и легкие.In one embodiment, the formulation is for intravenous (IV) administration. This route is particularly effective for oncolytic virus delivery as it allows rapid access to most organs and tissues, and is particularly useful for the treatment of metastases, such as established metastases, especially those located in highly vascularized areas such as the liver and lungs.

Терапевтические составы, как правило, будут стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может находиться в форме раствора, микроэмульсии, липосом или другого состава для парентерального применения, подходящего для введения человеку, и может находиться в форме предварительно наполненного устройства, такого как шприц или пробирка, в частности, в виде разовой дозы.Therapeutic formulations will typically be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The composition may be in the form of a solution, microemulsion, liposomes, or other parenteral formulation suitable for human administration, and may be in the form of a pre-filled device such as a syringe or vial, particularly as a single dose.

Состав, как правило, будет содержать фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, например, нетоксичный изотонический носитель, который совместим с вирусом и в котором вирус стабилен в течение необходимого периода времени.The composition will typically contain a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, such as a non-toxic isotonic carrier, which is compatible with the virus and in which the virus is stable for the required period of time.

Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобные полиолы), и подходящие их смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения диспергирующего агента или поверхностно-активного вещества, такого как лецитин или неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80 или 40. В дисперсиях поддержанию необходимого размера частиц может способствовать присутствие поверхностно-активного вещества. Примеры изотонических агентов включают сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия в композиции.The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyol (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, and the like polyols), and suitable mixtures thereof. Appropriate fluidity can be maintained, for example, by the use of a dispersing agent or a surfactant such as lecithin or a non-ionic surfactant such as polysorbate 80 or 40. In dispersions, the presence of a surfactant can help maintain the desired particle size. Examples of isotonic agents include sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride in the composition.

В одном варианте реализации используемые составы для парентерального применения могут содержать один или более из следующих компонентов: буфер, например, 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновую кислоту, фосфатный буфер и/или буфер Трис, сахар, например, декстрозу, маннозу, сахарозу или аналогичный сахар, соль, такую как хлорид натрия, хлорид магния или хлорид калия, детергент, такой как неионное поверхностно-активное вещество, такое как бридж, PS-80, PS-40 или аналогичное вещество. Состав также может содержать консервант, такой как ЭДТА, или этанол, или комбинацию ЭДТА и этанола, которые, как считают, предотвращают один или более возможных путей деградации.In one embodiment, the parenteral formulations used may contain one or more of the following: a buffer, e.g., 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, a phosphate buffer and/or a Tris buffer, a sugar, e.g., dextrose, mannose, sucrose or a similar sugar, a salt such as sodium chloride, magnesium chloride or potassium chloride, a detergent such as a non-ionic surfactant such as bridge, PS-80, PS-40 or the like. The formulation may also contain a preservative, such as EDTA or ethanol, or a combination of EDTA and ethanol, which is believed to prevent one or more possible degradation pathways.

В одном варианте реализации состав будет содержать очищенный онколитический вирус согласно настоящему описанию, например, от 1х1010 до 1х1014 вирусных частиц на дозу, например, от 1х1010 до 1х1012 вирусных частиц на дозу. В одном варианте реализации концентрация вируса в составе находится в диапазоне от 2х108 до 2х1014 вч/мл, например, составляет 2х1012 вч/мл.In one embodiment, the formulation will contain a purified oncolytic virus as described herein, eg, 1x10 10 to 1x10 14 virus particles per dose, eg, 1x10 10 to 1x10 12 virus particles per dose. In one embodiment, the concentration of virus in the formulation is in the range of 2x10 8 to 2x10 14 vp/ml, eg 2x10 12 vp/ml.

В одном варианте реализации состав для парентерального применения содержит глицерин.In one embodiment, the parenteral formulation contains glycerin.

В одном варианте реализации состав содержит онколитический аденовирус, описанный в данной заявке, HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту), глицерин и буфер.In one embodiment, the composition contains the oncolytic adenovirus described in this application, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), glycerin and buffer.

- 37 042321- 37 042321

В одном варианте реализации состав для парентерального применения состоит из вируса согласно настоящему описанию, HEPES, например, 5 мМ, глицерина, например, 5-20%-ного (в объемном отношении), соляной кислоты, например, для подведения pH до диапазона 7-8, и воды для инъекций.In one embodiment, the parenteral formulation consists of a virus as described herein, HEPES, e.g., 5 mM, glycerol, e.g., 5-20% (v/v), hydrochloric acid, e.g. 8, and water for injection.

В одном варианте реализации 0,7 мл вируса согласно настоящему описанию при концентрацииIn one embodiment, 0.7 ml of virus as described herein at a concentration

2х1012 вч/мл включают в состав с 5 мМ HEPES, 20% глицерином при конечном pH 7,8.2x10 12 vp/ml is formulated with 5 mM HEPES, 20% glycerol at a final pH of 7.8.

Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Нью-Джерси 1991).A comprehensive discussion of pharmaceutically acceptable carriers is available from Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, New Jersey 1991).

В одном варианте реализации состав предусмотрен в виде состава для топического введения, включая ингаляцию.In one embodiment, the formulation is provided as a formulation for topical administration, including inhalation.

Подходящие ингалируемые препараты включают ингалируемые порошки, дозированные аэрозоли, содержащие пропеллентные газы, или ингалируемые растворы, свободные от пропеллентных газов. Ингалируемые порошки согласно настоящему описанию, как правило, будут содержать вирус, описанный в данной заявке, с физиологически приемлемым вспомогательным веществом.Suitable inhalants include inhalable powders, metered dose aerosols containing propellant gases, or inhalable solutions free of propellant gases. Inhalable powders as described herein will generally contain the virus described herein with a physiologically acceptable excipient.

Данные ингалируемые порошки могут содержать моносахариды (например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) или их смеси друг с другом. Моно- или дисахариды, лактозу или глюкозу, подходящим образом используют в частности, но не исключительно, в форме их гидратов.These inhalable powders may contain monosaccharides (eg glucose or arabinose), disaccharides (eg lactose, sucrose, maltose), oligo- and polysaccharides (eg dextrans), polyalcohols (eg sorbitol, mannitol, xylitol), salts (eg sodium chloride, calcium carbonate) or mixtures thereof with each other. Mono- or disaccharides, lactose or glucose, are suitably used in particular, but not exclusively, in the form of their hydrates.

Для депонирования в легком требуется размер частиц менее 10 микрон, например, 1-9 микрон, например, от 0,1 до 5 мкм, в частности, от 1 до 5 мкм. Размер частиц, несущих вирус, имеет первостепенное значение, и, следовательно, в одном варианте реализации вирус согласно настоящему описанию можно адсорбировать или абсорбировать на частице, такой как частица лактозы данного размера.Deposition in the lung requires a particle size of less than 10 microns, eg 1-9 microns, eg 0.1 to 5 µm, in particular 1 to 5 µm. The size of the particles that carry the virus is of paramount importance, and therefore, in one embodiment, the implementation of the virus according to the present description can be adsorbed or absorbed on a particle, such as a lactose particle of this size.

Пропеллентные газы, которые можно применять для получения аэрозолей для ингаляций, известны в данной области. Подходящие пропеллентные газы выбирают из углеводородов, таких как н-пропан, нбутан или изобутан, и галогенированных углеводородов, таких как хлорированные и/или фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Упомяутые выше пропеллентные газы можно применять отдельно или в виде смесей друг с другом.Propellant gases that can be used to produce inhalation aerosols are known in the art. Suitable propellant gases are selected from hydrocarbons such as n-propane, n-butane or isobutane and halogenated hydrocarbons such as chlorinated and/or fluorinated derivatives of methane, ethane, propane, butane, cyclopropane or cyclobutane. The propellant gases mentioned above can be used alone or in mixtures with each other.

Особенно подходящие пропеллентные газы представляют собой производные галогенированных алканов, выбранные из TG11, TG12, TG134а и TG227. Из упомянутых выше галогенированных углеводородов особенно подходят TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан) и их смеси.Particularly suitable propellant gases are halogenated alkanes selected from TG11, TG12, TG134a and TG227. Of the halogenated hydrocarbons mentioned above, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroethane) and TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropane) and mixtures thereof are particularly suitable.

Содержащие пропеллентный газ аэрозоли для ингаляций также могут содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы, поверхностно-активные агенты (поверхностно-активные вещества), антиоксиданты, смазывающие вещества и средства для подведения pH. Все данные ингредиенты известны в данной области.Propellant gas inhalation aerosols may also contain other ingredients such as cosolvents, stabilizers, surface active agents (surfactants), antioxidants, lubricants, and pH adjusters. All of these ingredients are known in the art.

Содержащие пропеллентный газ аэрозоли для ингаляций согласно настоящему изобретению могут содержать до 5% по массе активного вещества. Аэрозоли согласно настоящему изобретению содержат, например, от 0,002 до 5% по массе, от 0,01 до 3% по массе, от 0,015 до 2% по массе, от 0,1 до 2% по массе, от 0,5 до 2% по массе или от 0,5 до 1% по массе активного ингредиента.Propellant gas-containing inhalation aerosols according to the present invention may contain up to 5% by weight of the active substance. Aerosols according to the present invention contain, for example, from 0.002 to 5% by weight, from 0.01 to 3% by weight, from 0.015 to 2% by weight, from 0.1 to 2% by weight, from 0.5 to 2 % by weight or from 0.5 to 1% by weight of the active ingredient.

В качестве альтернативы топическое введение в легкое также можно осуществлять путем введения жидкого раствора или суспензионного состава, например, используя такое устройство как небулайзер, например, небулайзер, соединенный с компрессором (например, небулайзер Pari LC-Jet Plus(R), соединенный с компрессором Pari Master(R) производства Pari Respiratory Equipment, Inc., Ричмонд, Виргиния).Alternatively, topical administration to the lung can also be done by administering a liquid solution or suspension formulation, for example, using a device such as a nebulizer, such as a nebulizer connected to a compressor (for example, a Pari LC-Jet Plus(R) nebulizer connected to a Pari compressor). Master(R) manufactured by Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia).

Вирус согласно настоящему изобретению можно доставлять диспергированным в растворителе, например, в виде раствора или суспензии, например, как уже описано выше для составов для парентерального применения. Его можно суспендировать в подходящем физиологическом растворе, например, солевом растворе или другом фармакологически приемлемом растворителе или буферном растворе. Буферные растворы, известные в данной области, могут содержать от 0,05 до 0,15 мг динатрия эдетата, от 8,0 до 9,0 мг NaCl, от 0,15 до 0,25 мг полисорбата, от 0,25 до 0,30 мг безводной лимонной кислоты и от 0,45 до 0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды, чтобы добиться pH приблизительно от 4,0 до 5,0.The virus according to the present invention can be delivered dispersed in a solvent, for example, in the form of a solution or suspension, for example, as already described above for formulations for parenteral use. It can be suspended in a suitable saline solution, such as saline or other pharmacologically acceptable solvent or buffer solution. Buffer solutions known in the art may contain 0.05 to 0.15 mg disodium edetate, 8.0 to 9.0 mg NaCl, 0.15 to 0.25 mg polysorbate, 0.25 to 0 .30 mg of anhydrous citric acid and 0.45 to 0.55 mg of sodium citrate per ml of water to achieve a pH of approximately 4.0 to 5.0.

Терапевтические суспензии или суспензионные составы также могут содержать одно или более вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества хорошо известны в данной области и включают буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЭДТА, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии можно инкапсулировать в липосомы или биоразлагаемые микросферы. Состав, как правило, будет предложен в по существу стерильной форме, полученной с помощью стерильных процессов производства.Therapeutic suspensions or suspension formulations may also contain one or more excipients. Excipients are well known in the art and include buffers (eg citrate buffer, phosphate buffer, acetate buffer and bicarbonate buffer), amino acids, urea, alcohols, ascorbic acid, phospholipids, proteins (eg serum albumin), EDTA, sodium chloride, liposomes, mannitol, sorbitol and glycerin. Solutions or suspensions can be encapsulated in liposomes or biodegradable microspheres. The formulation will typically be provided in a substantially sterile form obtained through sterile manufacturing processes.

Это может включать получение и стерилизацию путем фильтрации буферного растворителя/раствора, используемого для состава, асептическое суспендирование антитела в стерильном буферном растворителе/растворе, и распределение состава по стерильным резервуарам с помощью способов, известных средним специалистам в данной области.This may include obtaining and sterilizing by filtering the buffer solvent/solution used for the formulation, aseptically suspending the antibody in a sterile buffer solvent/solution, and dispensing the formulation into sterile containers using methods known to those of ordinary skill in the art.

- 38 042321- 38 042321

Распыляемый состав согласно настоящему описанию можно предложить, например, в виде отдельных единиц доз (например, запечатанных пластиковых контейнеров или пробирок), упакованных в оболочку из фольги. Каждая пробирка содержит разовую дозу в объеме, например, 2 мл буферного растворителя/раствора.The spray composition according to the present description can be provided, for example, in the form of individual dose units (eg, sealed plastic containers or test tubes) packaged in a foil sheath. Each tube contains a single dose volume of, for example, 2 ml of buffer solvent/solution.

Лечение.Treatment.

В дополнительном аспекте в объем настоящего описания входит вирус или вирусный вектор, или содержащая его композиция, описанная в данной заявке, для применения для лечения, в частности, для лечения рака.In an additional aspect, the scope of the present description includes a virus or a viral vector, or a composition containing it, described in this application, for use in treatment, in particular for the treatment of cancer.

В одном варианте реализации способ лечения предназначен для применения для лечения опухоли.In one embodiment, the method of treatment is for use in treating a tumor.

Подразумевают, что термин опухоль, используемый в данной заявке, относится к аномальной массе ткани, которая возникает в результате избыточного деления клеток, которое не контролируется и прогрессирует, также называемой новообразованием. Опухоли могут быть либо доброкачественными (нераковыми), либо злокачественными. В объем термина опухоль входят все формы рака и метастазы.The term tumor as used in this application is intended to refer to an abnormal mass of tissue that results from excessive cell division that is uncontrolled and progressive, also referred to as a neoplasm. Tumors can be either benign (non-cancerous) or malignant. The scope of the term tumor includes all forms of cancer and metastases.

В одном варианте реализации опухоль представляет собой солидную опухоль. Солидная опухоль может быть локализованной или метастазирующей.In one embodiment, the tumor is a solid tumor. A solid tumor may be localized or metastatic.

В одном варианте реализации опухоль эпителиального происхождения.In one embodiment, the tumor is of epithelial origin.

В одном варианте реализации опухоль представляет собой злокачественное новообразование, такое как колоректальный рак, гепатома, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак щитовидной железы, рак почки, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи или рак легких.In one embodiment, the tumor is a malignancy such as colorectal cancer, hepatoma, prostate cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, kidney cancer, bladder cancer, head and neck cancer, or lung cancer. .

В одном варианте реализации опухоль представляет собой колоректальное злокачественное новообразование.In one embodiment, the tumor is a colorectal cancer.

Термин злокачественное новообразование, используемый в данной заявке, означает раковые клетки.The term malignant neoplasm, as used in this application, means cancer cells.

В одном варианте реализации онколитический вирус или вирусный вектор применяют для лечения или предотвращения метастазов.In one embodiment, the oncolytic virus or viral vector is used to treat or prevent metastases.

В одном варианте реализации способ или состав, описанный в данной заявке, применяют для лечения лекарственно-устойчивых видов рака.In one embodiment, the implementation of the method or composition described in this application is used to treat drug-resistant cancers.

В одном варианте реализации вирус или вирусный вектор вводят в комбинации с проведением дополнительного лечения или терапии рака.In one embodiment, the virus or viral vector is administered in combination with an additional cancer treatment or therapy.

В одном варианте реализации предложен вирус, вирусный вектор или состав согласно настоящему описанию для применения для производства лекарственного средства для лечения рака, например, описанного выше рака.In one embodiment, the implementation provides a virus, viral vector or composition according to the present description for use in the manufacture of drugs for the treatment of cancer, such as described above cancer.

В дополнительном аспекте предложен способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества вируса или состава согласно настоящему описанию нуждающемуся в этом пациенту, например пациенту - человеку.In a further aspect, a method of treating cancer is provided, comprising administering a therapeutically effective amount of a virus or a formulation as described herein to a patient in need thereof, eg, a human patient.

В одном варианте реализации онколитический вирус или состав в данной заявке вводят в комбинации с другой терапией.In one embodiment, the oncolytic virus or formulation herein is administered in combination with another therapy.

Предполагается, что в объем термина в комбинации, используемого в данной заявке, входит введение онколитического вируса или вирусного вектора перед, одновременно и/или после лечения или терапии рака.The scope of the term in combination as used herein is intended to include administration of an oncolytic virus or viral vector before, concurrently and/or after cancer treatment or therapy.

Терапия рака включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, целевую (таргетную) терапию и/или химиотерапию.Cancer therapy includes surgery, radiation therapy, targeted therapy and/or chemotherapy.

Термин лечение рака, используемый в данной заявке, относится к лечению терапевтическим соединением или биологическим агентом, например антителом, предназначенным для лечения и/или поддерживающей терапии рака.The term cancer treatment as used herein refers to treatment with a therapeutic compound or biological agent, such as an antibody, for the treatment and/or maintenance therapy of cancer.

В одном варианте реализации лечение рака выбрано из любой другой противораковой терапии, включая химиотерапевтический агент, таргетный противораковый агент, радиотерапию, радиоизотопную терапию или любую комбинацию перечисленного.In one embodiment, the cancer treatment is selected from any other anti-cancer therapy, including a chemotherapeutic agent, a targeted anti-cancer agent, radiotherapy, radioisotope therapy, or any combination thereof.

В одном варианте реализации вирус или вирусный вектор согласно настоящему описанию можно применять в качестве предварительного лечения перед терапией, такой как хирургическое вмешательство (неоадъювантной терапии), чтобы уменьшить размеры опухоли, для лечения метастазов и/или предотвращения метастазирования или образования дополнительных метастазов. Онколитический вирус или вирусный вектор можно применять после терапии, такой как хирургическое вмешательство (адъювантная терапия), для лечения метастазов и/или предотвращения метастазирования или образования дополнительных метастазов.In one embodiment, a virus or viral vector as described herein may be used as a pre-treatment prior to therapy such as surgery (neoadjuvant therapy) to shrink a tumor, to treat metastases and/or prevent metastasis or formation of additional metastases. The oncolytic virus or viral vector can be used after therapy, such as surgery (adjuvant therapy), to treat metastases and/or prevent metastasis or the formation of additional metastases.

Термин одновременно, используемый в данной заявке, представляет собой введение дополнительного лекарственного средства от рака в то же время или приблизительно в то же время, что и введение композиции онколитического вируса или вирусного вектора. Указанное лекарственное средство может содержаться внутри той же композиции, или его можно вводить в виде отдельной композиции.The term concurrently used in this application is the administration of an additional cancer drug at the same time or approximately the same time as the administration of the oncolytic virus composition or viral vector. Said drug may be contained within the same composition, or it may be administered as a separate composition.

В одном варианте реализации вирус или вирусный вектор вводят в комбинации с введением химиотерапевтического агента.In one embodiment, the virus or viral vector is administered in combination with the administration of a chemotherapeutic agent.

- 39 042321- 39 042321

Подразумевают, что химиотерапевтический агент, используемый в данной заявке, относится к специфическим противоопухолевым химическим агентам или лекарственным средствам, которые избирательно разрушают злокачественные клетки и ткани. Например, алкилирующие агенты, антиметаболиты, антрациклины, растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомеразы и другие противоопухолевые агенты. Другие примеры химиотерапии включают доксорубицин, 5-фторурацил (5-FU), паклитаксел, капецитабин, иринотекан и платины, такие как цисплатин и оксалиплатин. Предпочтительную дозу может выбрать практикующий врач на основании природы рака, от которого лечат.The chemotherapeutic agent used in this application is intended to refer to specific antitumor chemicals or drugs that selectively destroy malignant cells and tissues. For example, alkylating agents, antimetabolites, anthracyclines, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, and other anticancer agents. Other examples of chemotherapy include doxorubicin, 5-fluorouracil (5-FU), paclitaxel, capecitabine, irinotecan, and platins such as cisplatin and oxaliplatin. The preferred dosage may be selected by the practitioner based on the nature of the cancer being treated.

В одном варианте реализации терапевтический агент представляет собой ганцикловир, который может помочь контролировать иммунные ответы и/или васкуляризацию опухоли.In one embodiment, the therapeutic agent is ganciclovir, which may help control immune responses and/or tumor vascularization.

В одном варианте реализации терапевтический агент представляет собой ингибитор контрольных точек иммунного ответа, такой как ингибитор PD-1, ингибитор PD-L1, в частности, при этом ингибитор представляет собой моноклональное антитело или фрагмент антитела.In one embodiment, the therapeutic agent is an immune checkpoint inhibitor, such as a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor, in particular, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody or an antibody fragment.

В одном варианте реализации один или более методов лечения, используемых в способе в данной заявке, метрономные, что означает непрерывное или частое лечение низкими дозами противораковых лекарственных средств, которые часто дают одновременно с другими способами терапии.In one embodiment, one or more of the treatments used in the method herein are metronomic, which means continuous or frequent treatment with low doses of anti-cancer drugs that are often given concomitantly with other therapies.

Онколитические аденовирусы подгруппы В, в частности, Ad11 и полученные из них, такие как EnAd, могут быть особенно синергичны с химиотерапевтическими средствами, так как, похоже, их механизм действия по большей части не зависит от апоптоза, и они уничтожают раковые клетки преимущественно посредством некролитического механизма. Более того, подавление иммунитета, которое происходит во время химиотерапии, может позволить онколитическому вирусу действовать с большей эффективностью.Subgroup B oncolytic adenoviruses, in particular Ad11 and derived from them such as EnAd, may be particularly synergistic with chemotherapeutic agents, as their mechanism of action appears to be largely independent of apoptosis and they kill cancer cells predominantly through necrolytic mechanism. Moreover, the immune suppression that occurs during chemotherapy may allow the oncolytic virus to act more effectively.

Терапевтическая доза, используемая в данной заявке, относится к количеству вируса или вирусного вектора, которое подходит для достижения предполагаемого терапевтического эффекта при применении в подходящей схеме лечения, например, снижает выраженность симптомов или состояний заболевания. Дозу можно считать терапевтической дозой для лечения рака или метастазов, если количество вирусных частиц может быть достаточным, чтобы привести к следующему: опухоль или метастатический рост замедляется или останавливается, или обнаруживают уменьшение размера опухоли или метастазов, и/или увеличивается продолжительность жизни пациента. Подходящие терапевтические дозы, как правило, приводят к равновесию между терапевтическим эффектом и переносимой токсичностью, например, когда побочный эффект и токсичность переносимы с учетом пользы, достигаемой терапией.The therapeutic dose used in this application refers to the amount of virus or viral vector that is suitable to achieve the intended therapeutic effect when used in a suitable treatment regimen, for example, reduces the severity of symptoms or conditions of the disease. A dose may be considered a therapeutic dose for the treatment of cancer or metastases if the amount of viral particles can be sufficient to result in the following: tumor or metastatic growth is slowed down or stopped, or a decrease in the size of the tumor or metastases is detected, and/or the life expectancy of the patient is increased. Appropriate therapeutic doses generally result in a balance between therapeutic effect and tolerable toxicity, eg when the side effect and toxicity are tolerable given the benefit achieved by the therapy.

В одном варианте реализации предложено системное введение множества доз парентерального состава онколитического аденовируса согласно настоящему описанию в одном цикле лечения, например, при котором суммарная доза, которую дают при каждом введении, находится в диапазоне от 1х1010 до 1х1014 вирусных частиц на дозу.In one embodiment, systemic administration of multiple doses of an oncolytic adenovirus parenteral formulation as described herein in a single treatment cycle is provided, e.g., wherein the total dose given with each administration is in the range of 1 x 10 10 to 1 x 10 14 viral particles per dose.

В одном варианте реализации одну или более доз (например, каждую дозу) вируса или вирусного вектора вводят таким образом, что скорость доставки вирусных частиц находится в диапазоне от 2х1010 частиц в минуту до 2х1012 частиц в минуту.In one embodiment, one or more doses (eg, each dose) of the virus or viral vector is administered such that the delivery rate of viral particles is in the range of 2 x 10 10 particles per minute to 2 x 10 12 particles per minute.

В одном варианте реализации вирус или терапевтическую конструкцию согласно настоящему описанию (включая состав, содержащий их) вводят еженедельно, например, в неделю 1 дозу вводят в дни 1, 3, 5, а затем вводят одну дозу каждую последующую неделю.In one embodiment, a virus or therapeutic construct as described herein (including a formulation containing them) is administered weekly, eg, week 1 dose is administered on days 1, 3, 5 and then one dose is administered every subsequent week.

В одном варианте реализации вирус или терапевтическую конструкцию согласно настоящему описанию (включая состав, содержащий их) вводят два раза в неделю или три раза в неделю, например, вводят в неделю 1 в дни 1, 3 и 5 и в неделю 2 или 3 также вводят в дни 1, 3 и 5. Данную схему применения можно повторять столько раз, сколько необходимо.In one embodiment, a virus or therapeutic construct as described herein (including a formulation containing them) is administered twice a week or three times a week, e.g., administered on week 1 on days 1, 3, and 5 and also administered on week 2 or 3 on days 1, 3 and 5. This regimen can be repeated as many times as needed.

В одном варианте реализации вирус или терапевтическую конструкцию согласно настоящему описанию (включая состав, содержащий их) вводят ежемесячно.In one embodiment, a virus or therapeutic construct as described herein (including a formulation containing them) is administered monthly.

В одном варианте реализации вирусы, вирусные векторы и конструкции согласно настоящему описанию получают с помощью рекомбинантных методик. Для специалиста должно быть очевидно, что геном вооруженного вируса или вирусного вектора можно получить с помощью других технических средств, включая синтез полноразмерного генома или плазмиды, содержащей часть генома. Для специалиста должно быть очевидно, что в случае синтеза генома участок вставки может не содержать нуклеотиды сайтов рестрикции, так как последние представляют собой артефакты после вставки генов с применением способов клонирования.In one embodiment, the implementation of viruses, viral vectors and constructs according to the present description is obtained using recombinant techniques. It should be obvious to those skilled in the art that the genome of an armed virus or viral vector can be obtained by other technical means, including the synthesis of a full-length genome or a plasmid containing a portion of the genome. It should be obvious to a person skilled in the art that in the case of genome synthesis, the insertion site may not contain restriction site nucleotides, since the latter are artifacts after gene insertion using cloning methods.

В одном варианте реализации геном вооруженного вируса или вирусного вектора получен полностью синтетическим путем.In one embodiment, the genome of the armed virus or viral vector is completely synthetically generated.

Описание в данной заявке дополнительно распространяется на вирус формулы (I) или его субформулы, который получен или который можно получить путем встраивания трансгена или кассеты трансгенов.The description in this application further extends to a virus of formula (I) or subformulas thereof, which is obtained or which can be obtained by inserting a transgene or transgene cassette.

Термин является, используемый в данной заявке, означает включающий.The term is, used in this application, means including.

В контексте данного описания включающий следует истолковывать как содержащий в себе.In the context of this description, including should be construed as containing in itself.

Предполагается, что варианты реализации настоящего изобретения, включающие некоторые свой- 40 042321 ства/элементы, также распространяются на альтернативные варианты реализации, состоящие или состоящие по существу из соответствующих элементов/свойств.It is intended that embodiments of the present invention that include certain properties/elements also extend to alternative implementations consisting or consisting essentially of the corresponding elements/properties.

Когда это технически возможно, варианты реализации настоящего изобретения можно комбинировать. Технические руководства, такие как патенты и заявки на патент, включены в данную заявку посредством ссылки.When technically possible, embodiments of the present invention can be combined. Technical guidelines such as patents and patent applications are incorporated into this application by reference.

Любые варианты реализации, конкретно и явно перечисленные в данной заявке, могут лежать в основе отказа, либо отдельно, либо в комбинации с одним или более дополнительными вариантами реализации.Any implementation options specifically and explicitly listed in this application may underlie the disclaimer, either alone or in combination with one or more additional implementation options.

Настоящее изобретение дополнительно описано исключительно путем иллюстрирования в следующих примерах.The present invention is further described solely by way of illustration in the following examples.

ПримерыExamples

Пример 1. Получение вирусов EnAd, экспрессирующих активирующий Т-клетки антиген CD80 и заякоренный в мембрану одноцепочечный фрагмент Fv антитела к цепи ε комплекса CD3 человека (CD3ε).Example 1 Generation of EnAd Viruses Expressing the T Cell Activating CD80 Antigen and a Membrane Anchored Single Chain Fv Fragment of an Anti-Human CD3 Complex ε Chain Antibody (CD3ε).

Плазмиду pEnAd2.4 использовали для получения плазмид pNG-348 путем вставки напрямую кассеты, кодирующей активирующий Т-клетки антиген CD80 человека (SEQ ID NO: 98) и заякоренную в мембрану химерную форму одноцепочечного Fv к CD3e человека (SEQ ID NO: 4). Кассета pNG-348 содержит: 5' короткую акцепторную последовательность сплайсинга (CAGG); кДНК заякоренного в мембрану ScFv к CD3ε человека; самоотщепляющуюся с высокой эффективностью последовательность пептида Р2А (SEQ ID NO: 94); последовательность кДНК CD80 человека и 3' последовательность полиаденилирования (SEQ ID NO: 99). Схематическое изображение встроенной кассеты трансгенов показано на фиг. 2С. Конструкцию плазмиды подтверждали с помощью секвенирования ДНК. Получение и определение характеристик вируса.Plasmid pEnAd2.4 was used to generate plasmids pNG-348 by directly inserting a cassette encoding human CD80 T-cell activating antigen (SEQ ID NO: 98) and a membrane-anchored chimeric form of anti-human CD3e single-chain Fv (SEQ ID NO: 4). The pNG-348 cassette contains: 5' short splicing acceptor sequence (CAGG); cDNA of human CD3ε membrane-anchored ScFv; a high efficiency self-cleaving peptide sequence of P2A (SEQ ID NO: 94); a human CD80 cDNA sequence; and a 3' polyadenylation sequence (SEQ ID NO: 99). A schematic representation of the inserted transgene cassette is shown in FIG. 2C. The plasmid design was confirmed by DNA sequencing. Obtaining and characterizing the virus.

Плазмиду pNG-348 линеаризовали путем рестрикционного расщепления ферментом AscI с получением генома вируса NG-348 (SEQ ID NO: 100). Вирус NG-348 амплифицировали и очищали согласно способам, приведенным ниже.Plasmid pNG-348 was linearized by restriction digestion with the enzyme AscI to obtain the genome of the virus NG-348 (SEQ ID NO: 100). The NG-348 virus was amplified and purified according to the methods below.

Расщепленную ДНК очищали путем экстракции фенолом/хлороформом и преципитировали в течение 16 ч при -20°С в 300 мкл >95% этанола достаточной для молекулярной биологии чистоты и 10 мкл 3 М ацетата натрия. Преципитированную ДНК осаждали путем центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 мин и промывали в 500 мкл 70% этанола перед повторным центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин. Осадок чистой ДНК сушили на воздухе, ресуспендировали в 500 мкл OptiMEM, содержащей 15 мкл реагента для трансфекции липофектамина и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь для трансфекции затем добавляли по каплям во флакон Т-25, содержащий клетки 293, выращенные до 70% конфлюентности. После инкубации клеток со смесью для трансфекции в течение 2 ч при 37°С, 5% CO2, к клеткам добавляли 4 мл среды для клеток (DMEM с высоким содержанием глюкозы с глутамином, дополненной 2% эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС)) и флаконы инкубировали при 37°С, 5% CO2.The digested DNA was purified by phenol/chloroform extraction and precipitated for 16 h at -20° C. in 300 μl of >95% molecular biology grade ethanol and 10 μl of 3M sodium acetate. Precipitated DNA was pelleted by centrifugation at 14,000 rpm for 5 min and washed in 500 µl of 70% ethanol before centrifugation again at 14,000 rpm for 5 min. The pure DNA pellet was air dried, resuspended in 500 µl OptiMEM containing 15 µl Lipofectamine transfection reagent, and incubated for 30 min at room temperature. The transfection mix was then added dropwise to a T-25 flask containing 293 cells grown to 70% confluency. After cells were incubated with the transfection mix for 2 h at 37°C, 5% CO 2 , 4 ml of cell medium (DMEM high glucose with glutamine supplemented with 2% fetal bovine serum (EBS)) and flasks were added to the cells. incubated at 37°C, 5% CO2.

Трансфицированные клетки 293 контролировали каждые 24 ч и добавляли в них дополнительную среду каждые 48 - 72 ч. Продукцию вируса контролировали по наблюдаемому значительному цитопатическому действию (ЦПД) в монослое клеток. После обнаружения обширного ЦПД собирали вирус из клеток 293 с помощью трех циклов замораживания-оттаивания. Собранные вирусы использовали для повторного инфицирования клеток 293, чтобы амплифицировать исходные растворы вируса. Жизнеспособность полученного во время амплификации вируса подтверждали по наблюдению значительного ЦПД в монослое клеток. После обнаружения ЦПД собирали вирус из клеток 293 с помощью трех циклов замораживания-оттаивания. Амплифицированный исходный раствор использовали для дополнительной амплификации перед очисткой вируса путем двукратного разделения в градиенте хлорида цезия для получения исходного раствора вируса NG-330.Transfected 293 cells were monitored every 24 hours and supplemented with additional medium every 48-72 hours. Virus production was monitored by the observed significant cytopathic effect (CPE) in the cell monolayer. After extensive CPE was detected, virus was harvested from 293 cells using three freeze-thaw cycles. The collected viruses were used to re-infect 293 cells to amplify stock virus solutions. The viability of the virus obtained during amplification was confirmed by the observation of significant CPE in the cell monolayer. After detection of CPE, virus was harvested from 293 cells using three freeze-thaw cycles. The amplified stock solution was used for additional amplification prior to virus purification by two-fold cesium chloride gradient separation to obtain a stock solution of NG-330 virus.

Пример 2. Получение вирусов EnAd, экспрессирующих активирующий Т-клетки антиген CD80 и заякоренный в мембрану одноцепочечный фрагмент Fv антитела к цепи ε комплекса CD3 человека (CD3ε).Example 2 Production of EnAd Viruses Expressing the T Cell Activating Antigen CD80 and a Membrane Anchored Single Chain Fv Fragment of an Anti-Human CD3 Complex ε Chain Antibody (CD3ε).

Плазмиду pEnAd2.4 использовали для получения плазмид pNG-348A путем вставки напрямую кассеты, кодирующей активирующий Т-клетки антиген CD80 человека (SEQ ID NO: 98) и заякоренную в мембрану химерную форму одноцепочечного Fv к CD3ε человека с С-концевой меткой V5 (SEQ ID NO: 5). Кассета pNG-348 содержит: 5' короткую акцепторную последовательность сплайсинга (CAGG); кДНК заякоренного в мембрану ScFv к CD3ε человека; С-концевую метку V5 (SEQ ID NO: 101); самоотщепляющуюся с высокой эффективностью последовательность пептида Р2А (SEQ ID NO: 94); последовательность кДНК CD80 человека и 3' последовательность полиаденилирования (SEQ ID NO: 99). Схематическое изображение кассет трансгенов NG-348A показано на фиг. 26А. Конструкцию плазмиды подтверждали с помощью секвенирования ДНК. Получение и определение характеристик вируса.Plasmid pEnAd2.4 was used to generate plasmids pNG-348A by directly inserting a cassette encoding human CD80 T-cell activating antigen (SEQ ID NO: 98) and a membrane-anchored chimeric form of anti-human CD3ε single-stranded Fv with a V5 C-terminal tag (SEQ ID NO: 5). The pNG-348 cassette contains: 5' short splicing acceptor sequence (CAGG); cDNA of human CD3ε membrane-anchored ScFv; C-terminal tag V5 (SEQ ID NO: 101); a high efficiency self-cleaving peptide sequence of P2A (SEQ ID NO: 94); a human CD80 cDNA sequence; and a 3' polyadenylation sequence (SEQ ID NO: 99). A schematic representation of the NG-348A transgene cassettes is shown in FIG. 26A. The plasmid design was confirmed by DNA sequencing. Obtaining and characterizing the virus.

Плазмиду pNG-348A линеаризовали путем рестрикционного расщепления ферментом AscI с получением генома вируса NG-348A (SEQ ID NO: 102). Вирус NG-348A амплифицировали и очищали в соответствии со способами, подробно описанными в примере 1.Plasmid pNG-348A was linearized by restriction digestion with the enzyme AscI to obtain the genome of the virus NG-348A (SEQ ID NO: 102). The NG-348A virus was amplified and purified according to the methods detailed in Example 1.

- 41 042321- 41 042321

Пример 3. Получение вирусов EnAd, экспрессирующих заякоренный в мембрану одноцепочечный фрагмент Fv антитела к цепи ε комплекса CD3 человека (CD3ε).Example 3 Production of EnAd Viruses Expressing a Membrane Anchored Single Chain Fv Fragment of an Anti-Chain ε Anti-human CD3 Complex (CD3ε) Antibody.

Плазмиду pEnAd2.4 использовали для получения плазмид pNG-420 и pNG-420A путем вставки напрямую кассет, кодирующих заякоренную в мембрану химерную форму одноцепочечного Fv к CD3ε человека с С-концевой меткой V5 (SEQ ID NO: 5) или без метки V5 (SEQ ID NO: 4). Кассета pNG-420 содержит: 5' короткую акцепторную последовательность сплайсинга (CAGG); кДНК заякоренного в мембрану ScFv к CD3ε человека и 3' последовательность полиаденилирования (SEQ ID NO: 99). Кассета pNG-420A содержит: 5' короткую акцепторную последовательность сплайсинга (CAGG); кДНК заякоренного в мембрану ScFv к CD3ε человека; С-концевую метку V5 (SEQ ID NO: 101) и 3' последовательность полиаденилирования (SEQ ID NO: 99). Схематические изображения кассет трансгенов NG-420 и NG-420A показаны на фиг. 3В и 3С. Конструирование каждой плазмиды подтверждали с помощью секвенирования ДНК.Plasmid pEnAd2.4 was used to generate plasmids pNG-420 and pNG-420A by directly inserting cassettes encoding a membrane-anchored chimeric form of single-chain anti-human CD3ε Fv with or without a V5 (SEQ ID NO: 5) C-terminal tag or no V5 tag (SEQ ID NO: 4). The pNG-420 cassette contains: 5' short splicing acceptor sequence (CAGG); cDNA of membrane-anchored ScFv to human CD3ε and 3' polyadenylation sequence (SEQ ID NO: 99). The pNG-420A cassette contains: 5' short splicing acceptor sequence (CAGG); cDNA of human CD3ε membrane-anchored ScFv; V5 C-terminal tag (SEQ ID NO: 101) and 3' polyadenylation sequence (SEQ ID NO: 99). Schematic representations of the NG-420 and NG-420A transgene cassettes are shown in FIG. 3B and 3C. The construction of each plasmid was confirmed by DNA sequencing.

Получение и определение характеристик вируса.Obtaining and characterizing the virus.

Плазмиды pNG-420 и pNG-420A линеаризовали путем рестрикционного расщепления ферментом AscI с получением геномов вирусов NG-420 (SEQ ID NO: 103) и NG-420A (SEQ ID NO: 104). Вирусы NG-420 и NG-420A амплифицировали и очищали в соответствии со способами, подробно описанными в примере 1.Plasmids pNG-420 and pNG-420A were linearized by restriction digestion with AscI to obtain the genomes of the viruses NG-420 (SEQ ID NO: 103) and NG-420A (SEQ ID NO: 104). NG-420 and NG-420A viruses were amplified and purified according to the methods detailed in Example 1.

Пример 4. Онколитическая активность и инфицирующая способность вирусов NG-347 и NG-348 в клетках карциномы толстого кишечника.Example 4 Oncolytic activity and infectivity of NG-347 and NG-348 viruses in colon carcinoma cells.

Онколитическая эффективность вируса.Oncolytic efficacy of the virus.

Клетки карциномы толстого кишечника НТ-29 высевали в 96-луночные планшеты при плотности клеток, равной 2,5x104 клеток/лунку. Планшеты инкубировали в течение 4 часов, 37°С, 5% CO2, перед инфицированием клеток вирусными частицами EnAd, NG-347 или NG-348 при плотности инфекции в диапазоне 100-0,39 вирусных частиц на клетку (вч/к). Жизнеспособность клеток НТ-29 оценивали, применяя реагент Cell Titre 96 MTS (Promega: G3581) через 72 ч после инфекции. Количественный анализ % выживаемости клеток при каждой плотности инфекции продемонстрировал, что онколитическая эффективность NG-348 была сравнима с таковой для EnAd (фиг. 43). Инфицирующая способность вирусных частиц.HT-29 colon carcinoma cells were seeded in 96-well plates at a cell density of 2.5 x 104 cells/well. Plates were incubated for 4 hours, 37° C., 5% CO2, before infection of cells with EnAd, NG-347 or NG-348 virus particles at an infection density in the range of 100-0.39 virus particles per cell (vp/c). Viability of HT-29 cells was assessed using Cell Titre 96 MTS reagent (Promega: G3581) 72 hours after infection. Quantitative analysis of % cell survival at each density of infection demonstrated that the oncolytic efficacy of NG-348 was comparable to that of EnAd (FIG. 43). Infectious ability of viral particles.

Клетки карциномы толстого кишечника НТ-29 высевали в 12-луночные планшеты при плотности клеток, равной 4x105 клеток/лунку. Планшеты инкубировали в течение 24 часов, 37°С, 5% CO2, перед инфицированием клеток вирусными частицами EnAd, NG-347 или NG-348 при плотности инфекции в диапазоне 1,6x107-2x106 вч/мл. Инфицирование клеток НТ-29 детектировали путем окрашивания антителом вирусного белка гексона. Окрашенные клетки подсчитывали путем подсчета вручную 6 полей зрения на лунку, по 6 повторным лункам для каждого исследуемого разведения. Отношение частиц к инфицирующей способности (Ч:И) рассчитывали для каждого вируса из данного титра вируса и продемонстрировали, что отношения инфицирующей способности NG-348 было сходно с таковым для эталонных контролей EnAd (фиг. 43, таблица).HT-29 colon carcinoma cells were seeded in 12-well plates at a cell density of 4x105 cells/well. The plates were incubated for 24 hours, 37°C, 5% CO2, before infection of the cells with EnAd, NG-347 or NG-348 virus particles at an infection density in the range of 1.6x107-2x106 vp/ml. Infection of HT-29 cells was detected by antibody staining of the hexon viral protein. Stained cells were counted by manually counting 6 fields of view per well, 6 replicate wells for each test dilution. Particle to infectivity ratio (P:I) was calculated for each virus from a given virus titer and demonstrated that the infectivity ratio of NG-348 was similar to that of the EnAd reference controls (FIG. 43, table).

Пример 5. Экспрессия активирующего Т-клетки антигена CD80 на поверхности клеток из линий клеток карциномы, инфицированных NG-347 и NG-348.Example 5 Expression of the T cell activating CD80 antigen on the surface of cells from carcinoma cell lines infected with NG-347 and NG-348.

Экспрессию трансгена CD80 (которую оценивали с помощью проточной цитометрии) сравнивали в обработанной NG-348 и EnAd линии клеток карциномы толстого кишечника DLD-1 или линии клеток карциномы легкого А549. Линии клеток карциномы А549 или DLD-1 высевали в 12-луночные планшеты при плотности клеток, равной 7,5x105 клеток/лунку. Планшеты инкубировали в течение 18 ч, 37°С, 5% CO2, перед инфицированием клеток 10 вирусными частицами на клетку (вч/к) либо EnAd, либо NG-348, или оставляли неинфицированными. Сравнивали экспрессию белка CD80 на поверхности клеток А549 или DLD-1 через 24, 48, 72 или 96 ч после инфицирования. В каждый момент времени клетки собирали и окрашивали в соответствии со способами, подробно описанными ниже.CD80 transgene expression (as assessed by flow cytometry) was compared in NG-348 and EnAd-treated colon carcinoma cell line DLD-1 or lung carcinoma cell line A549. A549 or DLD-1 carcinoma cell lines were seeded in 12-well plates at a cell density of 7.5 x 105 cells/well. The plates were incubated for 18 h, 37° C., 5% CO 2 before infection of the cells with 10 viral particles per cell (hs/c) of either EnAd or NG-348, or left uninfected. The expression of CD80 protein on the surface of A549 or DLD-1 cells was compared 24, 48, 72, or 96 hours after infection. At each time point, cells were harvested and stained according to the methods detailed below.

Для выявления экспрессии CD80 на поверхности клеток, клетки затем инкубировали при 5°С в течение 1 ч с буфером, либо с антителом мыши изотипического контроля, конъюгированным с Cy5, либо с антителом к CD80 человека, конъюгированным с Cy5 (клон 2D10). Все образцы также одновременно окрашивали красителем Zombie Aqua, чтобы отличить жизнеспособные клетки. Образцы промывали трижды 1% БСА/ФБР перед проведением анализа с помощью проточной цитометрии (FACS, Attune) для выявления жизнеспособных клеток и экспрессии белка CD80 на поверхности клеток. В соответствии с результатами экспрессии IFNa, экспрессию CD80 смогли обнаружить только на клетках НТ-29, при этом не обнаружили его экспрессию на обеих линиях клеток фибробластов или эпителия бронхов.To detect CD80 expression on the cell surface, the cells were then incubated at 5°C for 1 h with buffer, either Cy5-conjugated mouse isotype control antibody or Cy5-conjugated anti-human CD80 antibody (clone 2D10). All samples were also simultaneously stained with Zombie Aqua to distinguish between viable cells. Samples were washed three times with 1% BSA/PBS before being analyzed by flow cytometry (FACS, Attune) to detect viable cells and CD80 protein expression on the cell surface. In accordance with the results of IFNa expression, CD80 expression could only be detected on HT-29 cells, while its expression was not detected on both fibroblast or bronchial epithelial cell lines.

Анализировали жизнеспособность клеток и экспрессию белка CD80 на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии. Анализ экспрессии CD80 через 72 ч после инфекции клеток А549 показал, что CD80 можно было обнаружить на поверхности >95% обработанных NG-348 клеток (фиг. 4А и 4В). Через 96 ч после инфекции, вирус лизировал большую часть клеток А549, следовательно, анализ методом сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) не проводили. Для клеток DLD-1 экспрессию можно было обнаружить на >50% клеток через 96 ч после обработки NG-348 (фиг. 5А и 5В). Окрашивание не обнаруживали на EnAd или необработанных контролях.Cell viability and CD80 protein expression on the cell surface were analyzed by flow cytometry. Analysis of CD80 expression 72 hours after infection of A549 cells showed that CD80 could be detected on the surface of >95% of NG-348 treated cells (FIGS. 4A and 4B). At 96 h post-infection, most of the A549 cells were virus-lysed, therefore, fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis was not performed. For DLD-1 cells, expression could be detected on >50% of the cells 96 hours after NG-348 treatment (FIGS. 5A and 5B). Staining was not detected on EnAd or untreated controls.

- 42 042321- 42 042321

Пример 6. Активация и дегрануляция Т-клеток, опосредованная инфицированными NG-348 линиями клеток карциномы.Example 6 T cell activation and degranulation mediated by NG-348 infected carcinoma cell lines.

Клетки карциномы легкого А549, либо инфицированные вирусными частицами NG-348 или EnAd, либо оставленные неинфицированными, совместно культивировали с Т-клетками, выделенными из МКПК человека, полученных от доноров. Селективность экспрессии кодируемого вирусом NG-348 CD80 оценивали на поверхности как А549, так и Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Активацию Тклеток оценивали путем анализа маркеров активации на поверхности клеток (с помощью проточной цитометрии), экспрессии CD107а на поверхности клеток как маркера дегрануляции (с помощью проточной цитометрии) и секреции стимулирующих цитокинов IL-2 и IFNy (с помощью ELISA).A549 lung carcinoma cells, either infected with NG-348 or EnAd virus particles or left uninfected, were co-cultured with T cells isolated from donor-derived human PBMCs. The selectivity of expression of NG-348 virus-encoded CD80 was assessed on the surface of both A549 and T cells using flow cytometry. T cell activation was assessed by analysis of cell surface activation markers (by flow cytometry), cell surface expression of CD107a as a marker of degranulation (by flow cytometry), and secretion of stimulatory cytokines IL-2 and IFNy (by ELISA).

Клетки А549 высевали в 12-луночные планшеты при плотности 5x105 клеток/лунку. Планшеты инкубировали в течение 18 ч, 37°С, 5% CO2, перед тем как клетки либо инфицировали 10 вирусными частицами на клетку (вч/к) EnAd или NG-348, либо оставляли неинфицированными. Через 48 ч после инфицирования, CD3+ Т-клетки, выделенные путем негативной селекции из МКПК (MACS), добавляли в монослои клеток А549 при соотношении 8 Т-клеток:1 опухолевую клетку. Совместное культивирование проводили в течение 16 ч, после чего собирали супернатанты клеток для анализа ELISA, а опухолевые клетки и Т-клетки собирали для анализа методом проточной цитометрии.A549 cells were seeded in 12-well plates at a density of 5x105 cells/well. The plates were incubated for 18 h, 37° C., 5% CO 2 before the cells were either infected with 10 viral particles per cell (vs/c) EnAd or NG-348 or left uninfected. 48 hours after infection, CD3+ T cells isolated by negative PBMC selection (MACS) were added to monolayers of A549 cells at a ratio of 8 T cells:1 tumor cell. Co-culture was performed for 16 hours, after which cell supernatants were collected for ELISA analysis, and tumor cells and T cells were collected for analysis by flow cytometry.

Культуральные среды, содержащие неприкрепившиеся (неадгерентные) клетки, удаляли из лунок с совместной культурой и центрифугировали (300xg). Супернатант аккуратно удаляли, разбавляли 1 к 2 в ФБР с 5% БСА и хранили для анализа ELISA. Монослои прикрепившихся клеток однократно промывали ФБР, а затем отделяли от поверхности, применяя трипсин. Трипсин инактивировали, применяя полную среду, и указанные клетки добавляли в осадки клеток, которые были собраны из культуральных супернатантов. Клетки центрифугировали (300xg), супернатант отбрасывали и осадок клеток промывали 200 мкл ФБР. Клетки снова центрифугировали, затем ресуспендировали в 50 мкл буфера для FACS (5% БСА в ФБР), содержащего Live/Dead Aqua (Life tech), в течение 15 мин при комнатной температуре. Клетки однократно промывали буфером для FACS перед окрашиванием панелью конъюгированных напрямую антител: антителом к CD3, конъюгированным с BV605; антителом к CD25, конъюгированным с BV421; антителом к CD107а, конъюгированным с FITC; антителом к EpCam, конъюгированным с РЕ, или антителом к CD4, конъюгированным с РЕ; и либо антителом к CD80, конъюгированным с РЕ/Cy, либо антителом к HLA-DR, конъюгированным с РЕ/Су5. Образец клеток из каждого условия совместного культивирования также окрашивали соответствующими антителами изотипического контроля. Все окрашивания проводили в буфере для FACS в общем объеме 50 мкл/лунку в течение 15 мин, 4°С. Клетки затем промывали буфером для FACS (200 мкл) перед ресуспендированием в 200 мкл буфера для FACS и анализом с помощью проточной цитометрии (Attune). Селективная экспрессия CD80.Culture media containing non-adherent (non-adherent) cells were removed from the co-culture wells and centrifuged (300xg). The supernatant was carefully removed, diluted 1:2 in PBS with 5% BSA, and stored for ELISA analysis. Monolayers of adherent cells were washed once with PBS and then separated from the surface using trypsin. Trypsin was inactivated using complete medium and these cells were added to cell pellets that were collected from culture supernatants. The cells were centrifuged (300xg), the supernatant was discarded and the cell pellet was washed with 200 μl of PBS. Cells were centrifuged again, then resuspended in 50 µl of FACS buffer (5% BSA in PBS) containing Live/Dead Aqua (Life tech) for 15 min at room temperature. Cells were washed once with FACS buffer before staining with a panel of directly conjugated antibodies: anti-CD3 antibody conjugated to BV605; an anti-CD25 antibody conjugated to BV421; an anti-CD107a antibody conjugated with FITC; an anti-EpCam antibody conjugated to PE or an anti-CD4 antibody conjugated to PE; and either an anti-CD80 antibody conjugated to PE/Cy or an anti-HLA-DR antibody conjugated to PE/Cy5. A cell sample from each co-cultivation condition was also stained with the corresponding isotype control antibodies. All stains were performed in FACS buffer in a total volume of 50 μl/well for 15 min, 4°C. Cells were then washed with FACS buffer (200 μl) before being resuspended in 200 μl of FACS buffer and analyzed by flow cytometry (Attune). Selective expression of CD80.

Аналогично результатам, показанным в примере 14, экспрессию CD80 можно было обнаружить на поверхности >80% инфицированных NG-348 EpCam+ клеток А549, но не инфицированных EnAd или неинфицированных контрольных клеток (фиг. 6). Напротив, не смогли обнаружить экспрессию CD80 на поверхности CD3+ Т-клеток, что указывало на то, что по меньшей мере при данных условиях эксперимента экспрессия трансгена наблюдается селективно в опухолевых клетках из совместной культуры.Similar to the results shown in Example 14, CD80 expression could be detected on the surface of >80% of NG-348 EpCam+ infected A549 cells, but not EnAd infected or uninfected control cells (FIG. 6). In contrast, they could not detect CD80 expression on the surface of CD3+ T cells, indicating that, at least under these experimental conditions, transgene expression is observed selectively in co-cultured tumor cells.

Повышение экспрессии маркеров активации Т-клеток.Increased expression of T-cell activation markers.

В анализе методом проточной цитометрии активацию Т-клеток оценивали по экспрессии маркеров активации Т-клеток CD25 и HLA-DR на живых CD3+ отдельных клетках. Полученные результаты показали, что как количество Т-клеток, экспрессирующих CD25 (фиг. 7А и 7В), так и средний уровень экспрессии CD25 на поверхности Т-клеток (фиг. 7С) был значительно выше для Т-клеток, культивированных с инфицированными NG-348 клетками А549, чем с инфицированными EnAd или неинфицированными контролями. В частности, не наблюдали различия в статусе активации Т-клеток при сравнении необработанных контролен с EnAd (26,9±3,4% и 25,3±3,5% Т-клеток, экспрессирующих CD25, соответственно), тогда как экспрессия CD25 была повышена на большинстве клеток, совместно культивированных с NG-348 (83,2±1,5%). Экспрессию CD25 также анализировали на субпопуляциях CD4 и CD8 Тклеток путем установки дискриминационного окна для CD3+ Т-клеток на основании экспрессии на них CD4. Данные анализы показали, что экспрессия CD25 значительно повышена как на CD4+, так и на CD4 субпопуляциях Т-клеток в обработанных NG-348 совместных культурах по сравнению с EnAd и неинфицированными контролями (фиг. 8).In flow cytometry analysis, T cell activation was assessed by expression of T cell activation markers CD25 and HLA-DR on live CD3+ single cells. The results showed that both the number of CD25-expressing T cells (FIGS. 7A and 7B) and the average level of CD25 expression on the T cell surface (FIG. 7C) were significantly higher for T cells cultured with infected NG- 348 A549 cells than with EnAd infected or uninfected controls. In particular, no difference was observed in the activation status of T cells when untreated controls were compared with EnAd (26.9±3.4% and 25.3±3.5% of CD25-expressing T cells, respectively), whereas CD25 expression was increased in the majority of cells co-cultured with NG-348 (83.2±1.5%). CD25 expression was also analyzed on subpopulations of CD4 and CD8 T cells by setting a discrimination window for CD3+ T cells based on their expression of CD4. These analyzes showed that CD25 expression is significantly upregulated on both CD4+ and CD4. T cell subsets in NG-348 treated co-cultures compared to EnAd and uninfected controls (Figure 8).

В противоположность CD25, количество клеток, экспрессирующих HLA-DR, было низким: <5% для всех исследованных условий (фиг. 9А). Причиной этому, вероятно, мог стать ранний момент времени после совместного культивирования, в который проводили анализ методом проточной цитометрии. Тем не менее, наблюдали небольшое, но значимое повышение средней интенсивности флуоресценции окрашивания HLA-DR на клетках CD3+HLA-DR+ из обработанных NG-348 совместных культур по сравнению с контролями (фиг. 9В).In contrast to CD25, the number of cells expressing HLA-DR was low: <5% for all conditions studied (Fig. 9A). The reason for this could probably be the early point in time after co-cultivation, at which the analysis was performed by flow cytometry. However, a slight but significant increase in the mean fluorescence intensity of HLA-DR staining was observed on CD3+HLA-DR+ cells from NG-348-treated co-cultures compared to controls (FIG. 9B).

Стимуляция дегрануляции Т-клеток.Stimulation of T-cell degranulation.

Анализ экспрессии CD107а на поверхности живых CD3+ Т-клеток показал значительное увеличение количества Т-клеток, которые дегранулировались, и, следовательно, окрасились CD107а, когда клеткиAnalysis of CD107a expression on the surface of live CD3+ T cells showed a significant increase in the number of T cells that degranulated and therefore stained with CD107a when the cells

- 43 042321- 43 042321

А549 инфицировали NG-348 (8,3±1,7% клеток) по сравнению либо с EnAd (0,6±0,2% клеток), либо с необработанными контролями (0,1±0,02% клеток) (фиг. 10). Аналогично повышению экспрессии CD25, на обеих субпопуляциях CD4+ и CD4- Т-клеток выявили значительно повышенную экспрессию CD107а по сравнению с контролями EnAd или А549 (фиг. 11). Секреция стимулирующих цитокинов IL-2 и IFNy.A549 was infected with NG-348 (8.3±1.7% cells) versus either EnAd (0.6±0.2% cells) or untreated controls (0.1±0.02% cells) (Fig. . 10). Similar to the increase in CD25 expression, both CD4+ and CD4 − T cell subsets showed significantly increased CD107a expression compared to EnAd or A549 controls (FIG. 11). Secretion of stimulating cytokines IL-2 and IFNy.

Для обнаружения экспрессии IL-2 или IFNy супернатанты совместной культуры разбавляли в буфере для анализа 5% БСА/ФБР (в диапазоне от 1:100 до 1:1000) и проводили анализ ELISA, применяя набор Human IL-2 Ready Set go (Affymetrix) или набор Human IFN gamma Ready Set go (Affymetrix), следуя протоколу производителя.To detect IL-2 or IFNy expression, co-culture supernatants were diluted in 5% BSA/PBS assay buffer (ranging from 1:100 to 1:1000) and analyzed by ELISA using the Human IL-2 Ready Set go (Affymetrix) or Human IFN gamma Ready Set go (Affymetrix) following the manufacturer's protocol.

Концентрации секретированных IL-2 или IFNy определяли путем интерполяции по стандартным кривым. Экспрессию IL-2 можно было обнаружить только в супернатантах совместных культур с инфицированными NG-348 клетками А549, и нельзя было обнаружить ни в EnAd, ни в необработанных контролях (фиг. 12А). Экспрессию IFNy также можно было обнаружить на очень высоких уровнях (>300 нг/мл) в супернатантах совместных культур с инфицированными NG-348 клетками А549, которая была значительно выше, чем либо в EnAd, либо необработанных контролях (фиг. 12В).Concentrations of secreted IL-2 or IFNy were determined by interpolation from standard curves. IL-2 expression could only be detected in co-culture supernatants with NG-348 infected A549 cells and could not be detected in either EnAd or untreated controls (FIG. 12A). IFNy expression could also be detected at very high levels (>300 ng/mL) in co-culture supernatants with NG-348 infected A549 cells, which was significantly higher than either EnAd or untreated controls (FIG. 12B).

Пример 7. Активацию CD4 и CD8 Т-клеток могут независимо опосредовать инфицированные NG348 линии клеток карциномы.Example 7 Activation of CD4 and CD8 T cells can be independently mediated by NG348-infected carcinoma cell lines.

Клетки карциномы легкого А549, инфицированные вирусными частицами NG-348 или EnAd или оставленные неинфицированными, совместно культивировали либо с CD4+ Т-клетками, либо с CD8+ Тклетками, выделенными из МКПК человека, полученных от доноров. Активацию Т-клеток оценивали по секреции стимулирующего IFNy в культуральные супернатанты.A549 lung carcinoma cells infected with NG-348 or EnAd virus particles or left uninfected were co-cultured with either CD4+ T cells or CD8+ T cells isolated from donor-derived human PBMCs. T cell activation was assessed by secretion of stimulating IFNy into culture supernatants.

Клетки А549 высевали и инфицировали вирусными частицами NG-348 или EnAd или оставляли неинфицированными, согласно способам, подробно описанным в примере 14. Через 48 ч после инфекции CD4+ Т-клетки или CD8+ Т-клетки, выделенные путем негативной селекции из МКПК донора, добавляли к монослою клеток А549 при соотношении 8 Т-клеток на 1 опухолевую клетку. Через 16 ч собирали супернатанты совместной культуры и оценивали в них IFNy согласно подробно описанным способам. Анализ экспрессии IFNa с помощью ELISA.A549 cells were seeded and infected with NG-348 or EnAd virus particles or left uninfected according to the methods detailed in Example 14. 48 hours after infection, CD4+ T cells or CD8+ T cells isolated by negative selection from donor PBMC were added to a monolayer of A549 cells at a ratio of 8 T cells per 1 tumor cell. After 16 hours, the co-culture supernatants were collected and their IFNy was assessed according to detailed methods. Analysis of IFNa expression by ELISA.

В супернатантах линий клеток НТ-29 или А549, инфицированных в течение 24, 48 или 72 ч 10 вч/к EnAd или NG-343 или оставленных неинфицированными, анализировали экспрессию секретируемого IFNa с помощью ELISA.In supernatants of HT-29 or A549 cell lines infected for 24, 48 or 72 h with 10 hs/k EnAd or NG-343 or left uninfected, the expression of secreted IFNa was analyzed by ELISA.

Культуральные супернатанты удаляли из каждой лунки и центрифугировали в течение 5 мин, 1200 об/мин, чтобы удалить обломки клеток. Супернатанты разбавляли в буфере для анализа 5% БСА/ФБР (1:2, или 1:50, или 1:100) и проводили анализ ELISA, применяя набор Verikine Human IFN alpha (Pb1 assay science), следуя протоколу производителя.Culture supernatants were removed from each well and centrifuged for 5 minutes at 1200 rpm to remove cell debris. Supernatants were diluted in 5% BSA/PBS assay buffer (1:2, or 1:50, or 1:100) and ELISA assayed using the Verikine Human IFN alpha kit (Pb1 assay science) following the manufacturer's protocol.

Концентрации секретированного IFNa определяли путем интерполяции по стандартным кривым. Экспрессию IFNa, которая повышалась в кондиционированных клетками супернатантах в ходе инфекции, обнаружили в обеих линиях клеток НТ-29 и А549.Secreted IFNa concentrations were determined by interpolation from standard curves. IFNa expression, which was upregulated in cell-conditioned supernatants during infection, was found in both HT-29 and A549 cell lines.

Для CD4+ Т-клеток, экспрессию IFNy обнаружили только в супернатантах совместных культур с инфицированными NG-348 клетками А549 и не смогли обнаружить ни для EnAd, ни для необработанных контролей (фиг. 13А). Для CD8+ Т-клеток, экспрессию IFNy обнаружили на значительно более высоких уровнях для инфицированных NG-348 клеток А549, чем для EnAd или необработанных контролей (фиг. 13В), демонстрируя, что активность вируса NG-348 в линиях опухолевых клеток может активировать секрецию IFNy как CD8, так и CD4 клетками.For CD4+ T cells, IFNy expression was only detected in co-culture supernatants with NG-348 infected A549 cells and could not be detected for either EnAd or untreated controls (FIG. 13A). For CD8+ T cells, IFNy expression was found at significantly higher levels for NG-348 infected A549 cells than for EnAd or untreated controls (Figure 13B), demonstrating that NG-348 virus activity in tumor cell lines can activate IFNy secretion. both CD8 and CD4 cells.

Пример 8.Example 8

Клетки карциномы легкого человека А549 и клетки фибробластов человека MRC5 культивировали с вирусами EnAd, NG-347 или NG-348 (при 10 вч/к), чтобы сравнить репликацию генома вируса, экспрессию гексона вируса и трансгена данными типами клеток. После 72 ч культивирования либо окрашивали клетки для анализа FACS маркеров на их поверхности, либо получали супернатанты и лизаты клеток для анализов репликации генома вируса (количественная ПЦР, кПЦР) или экспрессии мРНК гексона или трансгена (количественная ПЦР с обратной транскрипцией, ОТ-кПЦР).A549 human lung carcinoma cells and MRC5 human fibroblast cells were cultured with EnAd, NG-347 or NG-348 viruses (at 10 hs/k) to compare virus genome replication, virus hexon and transgene expression by these cell types. After 72 h of culture, cells were either stained for analysis of FACS markers on their surface, or supernatants and cell lysates were prepared for analysis of viral genome replication (quantitative PCR, qPCR) or hexon or transgene mRNA expression (quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR).

Репликация генома вируса и экспрессия мРНК гексона для двух несущих трансген вирусов NG-347 и NG-348 были эквивалентны таковым для исходного вируса EnAd (фиг. 14). Для NG-348 (фиг. 15) уровни экспрессии трансгенной мРНК CD80 и ScFv к CD3 человека были высокими для опухолевых клеток А549, при этом для неопухолевых клеток MRC5 наблюдали лишь низкий уровень сигнала. Экспрессию белка CD80 на поверхности клеток, которую оценивали с помощью FACS, обнаружили на большинстве обработанных NG-348 клеток А549, но не смогли обнаружить на клетках MRC5, при этом CD80 не обнаружили ни на оставленных необработанными клетках, ни на обработанных EnAd клетках. Аналогично, экспрессия трансгенной мРНК и белка CD80 после обработки NG-347 была обнаружена только в опухолевых клетках А549, но не в клетках MRC5 (фиг. 16).Viral genome replication and hexon mRNA expression for the two transgene-carrying viruses NG-347 and NG-348 were equivalent to those for the parent EnAd virus (FIG. 14). For NG-348 (FIG. 15), expression levels of anti-human CD3 CD80 and ScFv transgenic mRNA were high for A549 tumor cells, while only a low signal level was observed for non-tumor MRC5 cells. Cell surface expression of CD80 protein, as assessed by FACS, was detected on most of the NG-348 treated A549 cells, but could not be detected on MRC5 cells, and CD80 was not detected on either the left untreated cells or the EnAd treated cells. Similarly, expression of transgenic mRNA and CD80 protein after treatment with NG-347 was found only in A549 tumor cells, but not in MRC5 cells (FIG. 16).

Для обработанных EnAd и NG-347 культур клеток, уровни мРНК MIP1a и IFNa в клеточных лизатах и секретированных белков в супернатантах измеряли с помощью ОТ-кПЦР и специфических ELISA, соответственно. Результаты (фиг. 17) показали селективную экспрессию обоих трансгенов опухолевымиFor EnAd and NG-347 treated cell cultures, MIP1a and IFNa mRNA levels in cell lysates and secreted proteins in supernatants were measured by RT-qPCR and specific ELISAs, respectively. The results (Fig. 17) showed selective expression of both transgenes by tumor cells.

- 44 042321 клетками А549, при этом не смогли обнаружить хемокин MIP-1a или цитокин IFNa в супернатантах- 44 042321 A549 cells, but failed to detect MIP-1a chemokine or IFNa cytokine in supernatants

MRC5.MRC5.

Пример 9.Example 9

Селективность/активность вирусов EnAd, NG-347 и NG-348 с Т-клетками человека оценивали путем культивирования изолированных CD3+ Т-клеток в течение 3 дней либо с 500 вч/к, либо с 5000 вч/к каждого вируса. Селективность/активность оценивали путем а) анализа методом проточной цитометрии Т-клеток, окрашенных антителами, направленными на CD69, CD4, CD80, CD25 и CD3, b) анализа секреции белков MIP-1a, IFNa и IFNy человека с помощью ELISA, с) анализа репликации вируса с помощью кПЦР и d) анализа экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР.The selectivity/activity of EnAd, NG-347 and NG-348 viruses with human T cells was assessed by culturing isolated CD3+ T cells for 3 days with either 500 hs/q or 5000 hs/q of each virus. Selectivity/activity was assessed by a) flow cytometry analysis of T cells stained with antibodies directed to CD69, CD4, CD80, CD25 and CD3, b) analysis of the secretion of human MIP-1a, IFNa and IFNy proteins by ELISA, c) analysis virus replication by qPCR; and d) analysis of gene expression by RT-qPCR.

На фиг. 18 показано, что Т-клетки не поддерживали репликацию генома любого из исследуемых вирусов: в анализе ОТ-кПЦР гексона вируса наблюдали лишь фоновые сигналы. Опухолевые клетки А549 поддерживали высокие уровни экспрессии мРНК гексона. В анализах ОТ-кПЦР экспрессии трансгенной мРНК Т-клетками выявили лишь фоновые сигналы (<1 копии/клетку) CD80 для обоих вирусов NG-347 и NG-348, и аналогичное отсутствие значительной экспрессии мРНК scFv к CD3 вирусом NG348, несмотря на высокий уровень воздействующего вируса (5000 вч/к). Высокие уровни экспрессии обоих трансгенов были обнаружены для обработанных (10 вч/к) опухолевых клеток А549 (фиг. 19 и 20). Экспрессию трансгенной мРНК IFNa и MIP-1a также селективно обнаружили в обработанных NG-347 (но не EnAd) опухолевых клетках А549 (при 10 вч/к), но не в Т-клетках, обработанных 5000 вч/к (фиг. 21). Кроме того, экспрессию белка CD80 на поверхности клеток обнаружили только с клетками А549, но не с Т-клетками как для NG-347, так и для NG-348 (фиг. 19 и 20). Обработка EnAd не приводила к экспрессии CD80 ни в одном типе клеток, и гибель клеток А549 (которую оценивали по поглощению красителя) была сходно высокой для всех трех вирусов; низкий уровень неспецифической гибели Т-клеток был вызван всеми вирусами вследствие очень высоких уровней вирусных частиц, используемых в данном эксперименте (фиг. 19 и 20). Аналогичные результаты экспрессии мРНК и белка трансгена получали, когда вирусы использовали при 500 вч/к (результаты не представлены).In FIG. 18 shows that T cells did not support genome replication of any of the tested viruses: only background signals were observed in the RT-qPCR analysis of the hexon of the virus. A549 tumor cells maintained high levels of hexon mRNA expression. RT-qPCR assays of transgenic mRNA expression by T cells revealed only background signals (<1 copy/cell) of CD80 for both NG-347 and NG-348 viruses, and a similar lack of significant expression of anti-CD3 scFv mRNA by NG348 despite high levels the influencing virus (5000 vh/k). High expression levels of both transgenes were found in treated (10 hs/q) A549 tumor cells (FIGS. 19 and 20). Expression of transgenic IFNa and MIP-1a mRNA was also selectively detected in NG-347 (but not EnAd) treated A549 tumor cells (at 10 hs/q), but not in T cells treated with 5000 hs/q (FIG. 21). In addition, expression of CD80 protein on the cell surface was found only with A549 cells but not with T cells for both NG-347 and NG-348 (FIGS. 19 and 20). EnAd treatment did not result in CD80 expression in any cell type, and A549 cell death (as measured by dye uptake) was similarly high for all three viruses; a low level of non-specific T cell death was caused by all viruses due to the very high levels of viral particles used in this experiment (FIGS. 19 and 20). Similar results for mRNA and protein expression of the transgene were obtained when the viruses were used at 500 hs/k (results not shown).

В отсутствие опухолевых клеток очищенные Т-клетки человека не активировались с повышением экспрессии маркеров активации CD25 или CD69 при культивировании с любым из вирусов.In the absence of tumor cells, purified human T cells did not upregulate the activation markers CD25 or CD69 when cultured with either virus.

Отсутствие экспрессии маркеров активации CD25 и CD69 очищенными CD3+ Т-клетками человека, обработанными 5000 вч/к различных вирусов.________________________________________No expression of activation markers CD25 and CD69 by purified human CD3+ T cells treated with 5000 hs/c of various viruses.

Необработанные Raw EnAd EnAd NG-347 NG-347 NG-348 NG-348 CD25+ CD4 Т-клеткиCD25 + CD4 T cells 30,7 30.7 24,6 24.6 23,4 23.4 23,3 23.3 CD69+ CD4 Т-клеткиCD69 + CD4 T cells ОД OD 0,4 0.4 о,з oh, s 0,7 0.7 CD25+ CD8 Т-клеткиCD25 + CD8 T cells 5,9 5.9 4,7 4.7 4,1 4.1 4,1 4.1 CD69+ CD8 Т-клеткиCD69 + CD8 T cells 0,5 0.5 1,0 1.0 0,9 0.9 1,3 1.3

Пример 10.Example 10

Эксперимент по селективности вируса, аналогичный таковому, описанному в примере 9, проводили, применяя неразделенные МКПК человека вместо очищенных Т-клеток, включая такую же оценку активности. Аналогично Т-клеткам человека в примере 9, результаты данного исследования в совокупности демонстрируют отсутствие репликации вируса и экспрессии трансгена МКПК человека. На фиг. 12-14 показаны результаты для применения 5000 вч/к EnAd, NG-347 или NG-348, но сходные результаты были получены для применения 500 вч/к (не показано). На фиг. 12 показана репликация генома вируса и экспрессия мРНК гексона и на фиг. 13 и 14 показана экспрессия мРНК трансгена. Фоновые уровни для анализа устанавливали в соответствии с сигналами, полученными в данном анализе при добавлении соответствующего вируса в культуральные среды, а затем обработке таким же способом, как и для образцов клеточного лизата. Не обнаружили экспрессию трансгена CD80 на CD3+ Т-клетках или CD40+ клетках (главным образом, В-клетках) в данных культурах МКПК с любым из вирусов (не показано).A virus selectivity experiment similar to that described in Example 9 was performed using unresolved human PBMCs instead of purified T cells, including the same activity score. Similar to the human T cells in Example 9, the results of this study collectively demonstrate the absence of viral replication and expression of the human PBMC transgene. In FIG. 12-14 show results with 5000 hs/c EnAd, NG-347, or NG-348, but similar results were obtained with 500 hs/c (not shown). In FIG. 12 shows viral genome replication and hexon mRNA expression and FIG. 13 and 14 show mRNA expression of the transgene. Background levels for the assay were set according to the signals obtained in this assay by adding the appropriate virus to culture media and then processing in the same manner as for cell lysate samples. No CD80 transgene expression was found on CD3+ T cells or CD40+ cells (mainly B cells) in these PBMC cultures with any of the viruses (not shown).

Опосредованная вирусными частицами NG-347 и NG-348 активация клеток врожденного иммунитета (моноциты, ДК) в культурах МКПК была аналогична таковой для EnAd, что видно на фиг. 15 и 16 по снижению экспрессии CD14 и повышению экспрессии HLA-DR и эндогенного CD80 на поверхности клеток, а также секреции MIP1a и IFNa (стоит отметить, что несмотря на то, что NG-347 кодирует обе данные молекулы в своем геноме, не наблюдали повышения уровней продукции над таковыми для EnAd и NG-348, которые не кодируют трансгены).NG-347 and NG-348 mediated activation of innate immune cells (monocytes, DCs) in PBMC cultures was similar to that of EnAd, as seen in FIG. 15 and 16 to reduce CD14 expression and increase expression of HLA-DR and endogenous CD80 on the cell surface, as well as the secretion of MIP1a and IFNa (it should be noted that despite the fact that NG-347 encodes both of these molecules in its genome, no increase was observed production levels above those for EnAd and NG-348, which do not code for transgenes).

Пример 11.Example 11.

Данный пример аналогичен по дизайну экспериментам, описанным в примерах 9 и 22 10 в данных исследованиях: МКПК человека или очищенные Т-клетки совместно культивировали с предварительно обработанными (48 ч) вирусом опухолевыми клетками А549 или фибробластами MRC5. Клетки А549 или MRC5 обрабатывали 10 вч/к EnAd, NG-347, NG-348 или оставляли необработанными (НОК) и куль- 45 042321 тивировали в течение 48 ч, чтобы обеспечить достаточное время для репликации вируса и экспрессии любого трансгена. МКПК или Т-клетки затем добавляли в культуры и оставляли на 24 или 48 ч, чтобы оценить способность обработанных вирусом клеток активировать Т-клетки.This example is similar in design to the experiments described in Examples 9 and 22-10 in these studies: Human PBMC or purified T cells were co-cultured with pre-treated (48 h) A549 tumor cells or MRC5 fibroblasts. A549 or MRC5 cells were treated with 10 hs/k EnAd, NG-347, NG-348 or left untreated (NOC) and cultured for 48 h to allow sufficient time for virus replication and expression of any transgene. PBMCs or T cells were then added to the cultures and allowed to stand for 24 or 48 hours to assess the ability of the virus-treated cells to activate T cells.

На фиг. 17 представлены результаты репликации генома вируса, показывающие сравнимую репликацию трех указанных вирусов в МКПК или Т-клетках, совместно культивированных с обоими типами клеток, уровни репликации были высокими для опухолевых клеток А549 и низкими для фибробластов MRC5.In FIG. 17 shows the results of viral genome replication showing comparable replication of these three viruses in PBMCs or T cells co-cultured with both cell types, replication levels were high for A549 tumor cells and low for MRC5 fibroblasts.

Активация Т-клеток, которую измерили по повышению экспрессии CD25 на поверхности, и дегрануляция CD8 эффекторных Т-клеток, которую измерили по повышению экспрессии CD107а на поверхности клеток, и продукция IFNy, измеренная по внутриклеточному окрашиванию цитокинов, - все избирательно стимулировали обработанные NG-348 клетки А549 по сравнению с EnAd, при этом стимуляция не опосредовалась совместными культурами MRC.T cell activation, as measured by increased surface expression of CD25, and degranulation of CD8 effector T cells, as measured by increased surface expression of CD107a, and IFNy production, as measured by intracellular cytokine staining, all selectively stimulated treated NG-348 A549 cells compared to EnAd, with no stimulation mediated by MRC co-cultures.

Анализы методом проточной цитометрии активации CD3+ Т-клеток человека в совместных культурах Т-клеток и МКПК с вирусами. _______________________________________Flow cytometry analyzes of human CD3+ T-cell activation in co-cultures of T-cells and PBMCs with viruses. _______________________________________

Клетки Cells Обработка Treatment %CD25+ %CD25 + %CD8+ CD107a+ %CD8 + CD107a + %IFNy+ %IFNy + А549 + Т-клетки A549 + T cells Необработанные Raw 37,5 37.5 0,1 0.1 0,1 0.1 А549 + Т-клетки A549 + T cells EnAd EnAd 38,4 38.4 0,1 0.1 0,2 0.2 А549 + Т-клетки A549 + T cells NG-348 NG-348 88,2 88.2 17,9 17.9 12,0 12.0 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells Необработанные Raw 38,8 38.8 0,3 0.3 0,4 0.4 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells EnAd EnAd 38,9 38.9 0,2 0.2 0,4 0.4 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells NG-348 NG-348 39,1 39.1 0,3 0.3 0,3 0.3 А549 + МКПК A549 + MKPC Необработанные Raw 28,3 28.3 h/o h/o h/o h/o А549 + МКПК A549 + MKPC EnAd EnAd 29,4 29.4 h/o h/o h/o h/o А549 + МКПК A549 + MKPC NG-348 NG-348 73,7 73.7 h/o h/o h/o h/o MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC Необработанные Raw 23,0 23.0 h/o h/o h/o h/o MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC EnAd EnAd 23,3 23.3 h/o h/o h/o h/o MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC NG-348 NG-348 21,7 21.7 h/o h/o h/o h/o

н/о=не определяли.n/a=not determined.

Секрецию IFNy в супернатантах совместной культуры также оценивали количественно с помощью ELISA. Результаты (фиг. 28) сходным образом демонстрируют селективную активацию Т-клеток, совместно культивированных с обработанными NG-348 опухолевыми клетками А549, но не фибробластами MRC5, при этом в анализах использовали либо очищенные Т-клетки, либо МКПК.IFNy secretion in co-culture supernatants was also quantified by ELISA. The results (FIG. 28) similarly demonstrate selective activation of T cells co-cultured with NG-348 treated A549 tumor cells, but not MRC5 fibroblasts, using either purified T cells or PBMCs in the assays.

Способность NG-347 активировать Т-клетки также оценивали путем измерения уровней CD69 на Тклетках из совместных культур либо очищенных Т-клеток, либо МКПК с опухолевыми клетками А549 или фибробластами MRC5. В табл. 8 показано, что небольшое увеличение количества положительных по CD69 Т-клеток наблюдали при обработке NG-347 опухолевых клеток А549 по сравнению с EnAd, который сам по себе приводил к увеличению экспрессии данного раннего маркера активации. Данные эффекты не наблюдали в совместных культурах MRC5. На Т-клетках не обнаружили экспрессию CD80 (не показано).The ability of NG-347 to activate T cells was also assessed by measuring CD69 levels on T cells from co-cultures of either purified T cells or PBMCs with A549 tumor cells or MRC5 fibroblasts. In table. 8 shows that a slight increase in CD69 positive T cells was observed when A549 tumor cells were treated with NG-347 compared to EnAd, which itself resulted in increased expression of this early activation marker. These effects were not observed in MRC5 co-cultures. No CD80 expression was found on T cells (not shown).

- 46 042321- 46 042321

Экспрессия CD69 на Т-клетках из обработанных NG-347 или EnAd совместных культур.Expression of CD69 on T cells from NG-347 or EnAd treated co-cultures.

Клетки Cells Обработка Treatment %CD69+ %CD69+ А549 + Т-клетки A549 + T cells Необработанные Raw 2,1 2.1 А549 + Т-клетки A549 + T cells EnAd EnAd 18,7 18.7 А549 + Т-клетки A549 + T cells NG-348 NG-348 35,0 35.0 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells Необработанные Raw 3,8 3.8 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells EnAd EnAd 3,6 3.6 MRC5 + Т-клетки MRC5 + T cells NG-348 NG-348 4,4 4.4 А549 + МКПК A549 + MKPC Необработанные Raw 1,2 1.2 А549 + МКПК A549 + MKPC EnAd EnAd 19,1 19.1 А549 + МКПК A549 + MKPC NG-348 NG-348 28,7 28.7 MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC Необработанные Raw 2,6 2.6 MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC EnAd EnAd 2,7 2.7 MRC5 + МКПК MRC5 + MCPC NG-348 NG-348 3,9 3.9

В отдельном эксперименте клетки А549, обработанные NG-347 и совместно культивированные с CD3+ Т-клетками человека, привели к повышению экспрессии маркера активации CD69 на Т-клетках и секреции IFNy (см. фиг. 41 и 42).In a separate experiment, A549 cells treated with NG-347 and co-cultured with human CD3 + T cells resulted in increased expression of the activation marker CD69 on T cells and secretion of IFNy (see FIGS. 41 and 42).

Пример 12.Example 12.

CD14+ моноцитарные клетки выделяли из МКПК путем разделения на покрытых антителом магнитных гранулах и культивировали с IL-4 и GM-CSF человека, чтобы дифференцировать их в дендритные клетки. После 3 дней культивирования клетки обрабатывали EnAd, NG-347 или NG-348 при 5000 вч/к или оставляли необработанными. В качестве положительного контроля активации некоторые клетки стимулировали LPS. Через два дня отбирали супернатанты для анализа цитокинов с помощью ELISA, окрашивали клетки для выявления экспрессии поверхностных маркеров активации и анализировали с помощью проточной цитометрии. В таблице 9 показано, что все вирусы вызывали повышение экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86, указывая на то, что данный обнаруженный ранее эффект опосредованной частицами активации клеток врожденного иммунитета не изменялся при встраивании трансгена в геномы NG-347 и NG-348. Все вирусы также стимулировали секрецию сходных уровней ΜΙΡ-Ια и IFNa (фиг. 29).CD14 + monocytic cells were isolated from PBMCs by separation on antibody-coated magnetic beads and cultured with human IL-4 and GM-CSF to differentiate them into dendritic cells. After 3 days of culture, cells were treated with EnAd, NG-347 or NG-348 at 5000 vh/q or left untreated. As a positive activation control, some cells were stimulated with LPS. Two days later, supernatants were collected for cytokine analysis by ELISA, cells were stained for expression of surface activation markers, and analyzed by flow cytometry. Table 9 shows that all viruses upregulated the co-stimulatory molecules CD80 and CD86, indicating that this previously observed effect of particle-mediated activation of innate immune cells was not altered by insertion of the transgene into the NG-347 and NG-348 genomes. All viruses also stimulated the secretion of similar levels of ΜΙΡ-Ια and IFNa (FIG. 29).

Опосредованная частицами EnAd, NG-347 и NG-348 активация дендритных клеток человека.EnAd, NG-347 and NG-348 particle-mediated activation of human dendritic cells.

Обработка ДК DC processing %CD80+ %CD80 + %CD86+ %CD86 + Необработанные Raw 3,0 3.0 10,4 10.4 EnAd EnAd 81,6 81.6 99,3 99.3 NG-347 NG-347 82,1 82.1 99,4 99.4 NG-348 NG-348 62,5 62.5 99,5 99.5 Положительный контроль LPS Positive control LPS 97,5 97.5 98,5 98.5

Пример 13.Example 13

В серии экспериментов клетки JurkatDual использовали в совместных культурах с опухолевыми клетками в качестве репортерного анализа активации Т-клеток для оценки функциональности экспрессии трансгена вирусами NG-347, NG-348 и NG-420, при этом EnAd служил в качестве отрицательного контроля. Клетки JurkatDual стабильно экспрессируют два различных репортерных гена: репортерный ген NFkB, продуцирующий секретируемую форму люциферазы, которая чувствительна к передаче сигналов через комплекс Т-клеточного рецептора, и репортерный ген чувствительной к IFNa секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP). Клетки А549 предварительно культивировали с вирусами при концентрации 10 вч/к в течение двух дней, затем добавляли клетки JurkatDual для совместного культивирования вIn a series of experiments, JurkatDual cells were used in co-cultures with tumor cells as a T cell activation reporter assay to assess the functionality of transgene expression by NG-347, NG-348, and NG-420 viruses, with EnAd serving as a negative control. JurkatDual cells stably express two different reporter genes: an NFkB reporter gene that produces a secreted form of luciferase that is responsive to signaling through the T-cell receptor complex, and an IFNa-responsive secreted alkaline phosphatase (SEAP) reporter gene. A549 cells were pre-cultured with viruses at a concentration of 10 hs/q for two days, then JurkatDual cells were added for co-cultivation in

-47042321 течение ночи (18-24 ч), а затем собирали супернатанты для анализа люциферазы и активности SEAP. На фиг. 43 показано, что инфицированные NG-347 клетки А549 селективно вызывали продукцию SEAP, что согласуется с продукцией ими IFNa (см. фиг. 7), но не стимулировали активность люциферазы. Напротив, NG-348, который экспрессирует связанный с мембраной scFv к CD3 для активации комплекса Тклеточного рецептора, стимулировал люциферазу, но не SEAP.-47042321 overnight (18-24 hours), and then collected supernatants for analysis of luciferase and SEAP activity. In FIG. 43 shows that NG-347-infected A549 cells selectively caused SEAP production, consistent with their production of IFNa (see FIG. 7), but did not stimulate luciferase activity. In contrast, NG-348, which expresses membrane-bound scFv to CD3 to activate the T cell receptor complex, stimulated luciferase but not SEAP.

В другом эксперименте клетки карциномы легкого А549 и клетки карциномы толстого кишечника НСТ-116, НТ-29 и DLD предварительно культивировали в течение 48 ч с 10 вч/к вирусов EnAd, NG-347, NG-348 или NG-420 перед совместным культивированием с клетками JurkatDual в течение ночи, и исследовали уровни люциферазы в супернатантах, чтобы определить вызванный уровень активации. На фигуре 31 показано, что все четыре типа клеток опухоли, культивированные с вирусами NG-348 или NG-420, которые кодируют scFv к CD3 на поверхности клетки, активировали клетки JurkatDual, тогда как EnAd и NG-347 не активировали, при этом уровни люциферазы были сходны с таковыми для неинфицированных контрольных опухолевых клеток (НИК).In another experiment, A549 lung carcinoma cells and HCT-116, HT-29, and DLD colon carcinoma cells were pre-cultured for 48 h with 10 hs/c of EnAd, NG-347, NG-348, or NG-420 viruses before co-culture with JurkatDual cells overnight, and examined the levels of luciferase in the supernatants to determine the level of activation evoked. Figure 31 shows that all four tumor cell types cultured with NG-348 or NG-420 viruses, which encode scFv to CD3 on the cell surface, activated JurkatDual cells, while EnAd and NG-347 did not, with luciferase levels were similar to those for uninfected control tumor cells (NEC).

В другом эксперименте опухолевые клетки А549 или НТ-29 предварительно культивировали с различными количествами NG-348 или NG-420 перед добавлением клеток JurkatDual и измерением секреции ими люциферазы. Результаты, представленные на фиг. 32, показывают, что активация NFkB в клетках JurkatDual зависит от дозы вируса, используемой для обработки опухолевых клеток.In another experiment, A549 or HT-29 tumor cells were pre-cultured with varying amounts of NG-348 or NG-420 before adding JurkatDual cells and measuring their luciferase secretion. The results shown in FIG. 32 show that NFkB activation in JurkatDual cells is dependent on the dose of virus used to treat tumor cells.

Пример 14.Example 14

Сравнивали фармакокинетику, биораспределение и опосредованную частицами EnAd и NG-348 активность системной индукции цитокинов in vivo после в/в введения дозы иммунокомпетентным мышам CD1. Мышам вводили внутривенно дозу 5x109 частиц EnAd либо NG-348 и брали у них кровь через 2, 10, 30, 60 и 120 мин после введения дозы. Из цельной крови выделяли ДНК и анализировали в ней уровни генома вируса с помощью кПЦР (фиг. 33). Клиренс обоих вирусов из крови подчинялся сходной кинетике. Аналогично, индукция ответа цитокинаМСР-1 (мера опосредованной частицами активации клеток врожденного иммунитета, таких как клетки Купфера в печени) также была сходна для обоих вирусов, как и паттерны биораспределения по тканям (фиг. 33).The pharmacokinetics, biodistribution, and EnAd and NG-348 particle-mediated activity of systemic cytokine induction in vivo after i.v. dosing in immunocompetent CD1 mice were compared. Mice were intravenously dosed with 5x109 EnAd or NG-348 particles and bled at 2, 10, 30, 60 and 120 minutes post-dose. DNA was isolated from whole blood and analyzed for virus genome levels by qPCR (FIG. 33). The clearance of both viruses from the blood followed similar kinetics. Similarly, induction of the cytokine MCP-1 response (a measure of particle-mediated activation of innate immune cells such as Kupffer cells in the liver) was also similar for both viruses, as were tissue biodistribution patterns (Fig. 33).

Пример 15.Example 15

Мышам СВ 17 SCID имплантировали подкожно клетки НСТ116 и вводили путем инъекции внутрь опухоли (в/о) или внутривенно (в/в) вирусы EnAd, NG-347 или NG-348 (5x109 вирусных частиц) или контроль, после того как размер опухолей превысил 70 мм3. Для мышей, которым вводили дозу в/в, образцы крови брали у трех мышей из каждой группы через 3, 15 и 30 мин после в/в введения дозы, выделяли ДНК и оценивали уровень геномов вируса в крови с помощью кПЦР (анализ фармакокинетики [ФК]). Результаты (фиг. 34) показали, что у NG-347 и NG-348 сходная ФК с EnAd (и друг с другом). Через 6 ч опухоли, печени, легкие и селезенки иссекали из 3 мышей из каждой группы. Из гомогенизированных тканей выделяли ДНК и анализировали уровень геномов вируса с помощью кПЦР (анализ биораспределения). Результаты (фиг. 35А) показали сходное биораспределение по тканям для трех указанных вирусов. Через 7 дней или 14-21 день опухоли иссекали из трех мышей из каждой группы и гомогенизировали для получения лизата опухоли, который использовали для получения как ДНК, так и РНК. Уровень геномов вируса в опухолях в два указанных момента времени измеряли с помощью анализа кПЦР выделенной ДНК. Результаты (фиг. 35В) показали, что опухоли из мышей, которым вводили дозу в/в и в/о, содержали более высокие уровни геномов вируса, чем количество вируса в введенной дозе, что свидетельствовало о репликации вируса в ткани, при этом в/о введение дозы приводило к более высоким уровням геномов, чем в/в в день 7, но оба уровня были аналогично высокими в промежуток времени 14 21 день. Все три вируса реплицировались на сходных уровнях.CB17 SCID mice were implanted subcutaneously with HCT116 cells and injected intratumorally (i.v.) or intravenously (i.v.) with EnAd, NG-347, or NG-348 viruses (5x109 virus particles) or control after tumors exceeded 70 mm 3 . For IV dosed mice, blood samples were taken from three mice from each group 3, 15, and 30 minutes after the IV dose, DNA was isolated, and the level of virus genomes in the blood was assessed by qPCR (pharmacokinetic analysis [PK ]). The results (FIG. 34) showed that NG-347 and NG-348 had similar PK to EnAd (and to each other). After 6 hours, liver, lung and spleen tumors were excised from 3 mice from each group. DNA was isolated from homogenized tissues and the level of virus genomes was analyzed by qPCR (biodistribution analysis). The results (FIG. 35A) showed similar tissue biodistribution for the three indicated viruses. After 7 days or 14-21 days, tumors were excised from three mice from each group and homogenized to obtain a tumor lysate, which was used to obtain both DNA and RNA. The level of virus genomes in tumors at the two indicated time points was measured by qPCR analysis of isolated DNA. The results (FIG. 35B) showed that tumors from both IV and IV dosed mice contained higher levels of viral genomes than the amount of virus dosed, indicative of viral replication in tissues, with IV o Dosing resulted in higher levels of genomes than iv on day 7, but both levels were similarly high between days 14-21. All three viruses replicated at similar levels.

Аналогично, уровни мРНК гексона вируса в лизатах опухоли, обнаруженные с помощью ОТ-кПЦР, были сопоставимы между EnAd, NG-347 и NG-348 в оба исследованных момента времени (фиг. 36 и 37). Сходные уровни мРНК scFv к CD3 и CD80 были обнаружены в оба момента времени и при обоих путях введения доз при обработке NG-348, при этом после введения дозы EnAd наблюдали лишь фоновые для данного анализа уровни (фиг. 37 и 38). Уровни мРНК MIP-1a и IFNa также селективно обнаруживали после либо в/о, либо в/в введения дозы NG-347 (фиг. 39).Similarly, virus hexon mRNA levels in tumor lysates detected by RT-qPCR were comparable between EnAd, NG-347 and NG-348 at both time points examined (FIGS. 36 and 37). Similar levels of anti-CD3 and CD80 scFv mRNA were detected at both time points and both dosing routes with NG-348 treatment, with only baseline levels observed for this assay after EnAd dosing (Figures 37 and 38). MIP-1a and IFNa mRNA levels were also selectively detected following either iv or iv dosing of NG-347 (FIG. 39).

Уровни белка CD80, кодируемого обоими NG-347 и NG-348, и белка MIP-1a, кодируемого NG-347, измеряли в лизатах опухоли с помощью специфических ELISA. Результаты на фигуре 40 показывают, что после однократного в/в введения дозы вируса оба белка также можно было селективно обнаружить в экстрактах опухоли. Ни один из белков не был обнаружен в образцах крови из тех же мышей.Levels of the CD80 protein encoded by both NG-347 and NG-348 and the MIP-1a protein encoded by NG-347 were measured in tumor lysates using specific ELISAs. The results in Figure 40 show that after a single iv dose of virus, both proteins could also be selectively detected in tumor extracts. None of the proteins were detected in blood samples from the same mice.

Пример 16.Example 16

Для того чтобы оценить активность и зависимость опухолевых клеток от вируса NG-348 in vivo, различные комбинации МКПК человека (5x107 клеток), опухолевых клеток А549 человека (5x106) и либо EnAd, либо NG-348 (при концентрации 5x109 вч/к) вводили путем инъекции в брюшную полость мышей с иммунодефицитом SCID-beige, при этом вирусы или контроль (солевой раствор) вводили в течение 15 мин после инъекции клеток. Через 3 дня брюшную полость промывали 5 мл солевого раствора и полученные клетки анализировали с помощью анализа методом проточной цитометрии с панелью маркеровIn order to assess the activity and dependence of tumor cells on NG-348 virus in vivo, different combinations of human PBMC (5x10 7 cells), human A549 tumor cells (5x106) and either EnAd or NG-348 (at 5x109 hs/q) was administered by intraperitoneal injection of SCID-beige immunodeficient mice, with viruses or control (saline) administered within 15 minutes of cell injection. After 3 days, the abdomen was flushed with 5 ml of saline and the resulting cells were analyzed by flow cytometry analysis with a marker panel.

--

Claims (22)

активации Т-клеток (CD25, CD69 и HLA-DR), чтобы оценить уровни активации Т-клеток после установления окон дискриминации для популяции CD3+ Т-клеток. Результаты двух отдельных экспериментов (таблица 10) продемонстрировали, что NG-348 избирательно приводит к активации Т-клеток человека in vivo зависимым от опухолевых клеток образом.T cell activation (CD25, CD69 and HLA-DR) to assess T cell activation levels after establishing discrimination windows for the CD3+ T cell population. The results of two separate experiments (table 10) demonstrated that NG-348 selectively leads to the activation of human T cells in vivo dependent on tumor cells. Активация in vivo Т-клеток человека в несущих опухоль А549 мышах вирусом NG-348.In vivo activation of human T cells in A549 tumor-bearing mice by NG-348 virus. Груп па Вирус Опухоль N %CD25 + %CD69 + %DR+ %CD25+, CD69+ %CD25+, DR+ Group Virus Tumor N %CD25 + %CD69 + %DR + %CD25 + , CD69 + %CD25 + , DR + Эксперимент 1Experiment 1 1 EnAd Солевой раствор 2 1,9 2,3 1,6 3,0 7,7 9,1 0,2 0,5 0,3 0,61 EnAd saline solution 2 1.9 2.3 1.6 3.0 7.7 9.1 0.2 0.5 0.3 0.6 2 EnAd 5х10б клеток А549 2 4,2 2,9 6,2 5,5 8,4 8,4 0,8 0,3 1,4 0,42 EnAd 5x10 b A549 cells 2 4.2 2.9 6.2 5.5 8.4 8.4 0.8 0.3 1.4 0.4 3 NG-348 Солевой раствор 1 3,4 2,6 9,2 0,5 0,83 NG-348 saline solution 1 3.4 2.6 9.2 0.5 0.8 4 NG-348 5х10б клеток А549 2 35,8, 36,6 50,4 42,2 26,3 19,2 22,4 18,0 16,4 12,24 NG-348 5x10 b cells A549 2 35.8, 36.6 50.4 42.2 26.3 19.2 22.4 18.0 16.4 12.2 Эксперимент 2Experiment 2 1 Солевой раствор Солевой раствор 1 25,6 37,3 14,8 14,1 7,081 Saline solution saline solution 1 25.6 37.3 14.8 14.1 7.08 2 EnAd Солевой раствор 2 6,5 7,3 17,8 18,2 5,50 6,1 3,58 3,46 1,01 1,492 EnAd saline solution 2 6.5 7.3 17.8 18.2 5.50 6.1 3.58 3.46 1.01 1.49 3 NG-348 Солевой раствор 2 10,2 6,5 26,7, 18,3 7,7 6,0 6,73 3,61 2,16 1,443 NG-348 saline solution 2 10.2 6.5 26.7, 18.3 7.7 6.0 6.73 3.61 2.16 1.44 4 Солевой раствор 5х10б клеток А549 2 28,4 22,7 54,4, 51,1 13,3 15,0 22,3 17,5 8,54 7,724 Salt solution 5x10 b A549 cells 2 28.4 22.7 54.4, 51.1 13.3 15.0 22.3 17.5 8.54 7.72 5 EnAd 5х10б клеток А549 1 13,2 29,4 5,1 7,84 1,625 EnAd 5x10 b A549 cells 1 13.2 29.4 5.1 7.84 1.62 34,4 58,9, 12,5 27,2 9,0734.4 58.9, 12.5 27.2 9.07 6 NG-348 5х10б клеток А549 3 29,6 59,2, 9,8 23,3 7,56 NG-348 5x10 b cells A549 3 29.6 59.2, 9.8 23.3 7.5 56,4 85,0 17,0 52,7 14,256.4 85.0 17.0 52.7 14.2 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способный реплицироваться онколитический аденовирус группы В, выбранный из группы, состоящей из Ad11 и enadenotucirev (EnAd), при этом указанный вирус содержит трансген, расположенный между геном L5 аденовируса и геном Е4 аденовируса под контролем эндогенного главного позднего промотора, где указанный трансген кодирует:1. A replicable group B oncolytic adenovirus selected from the group consisting of Ad11 and enadenotucirev (EnAd), said virus containing a transgene located between the adenovirus L5 gene and the adenovirus E4 gene under the control of an endogenous major late promoter, where said transgene encodes: антитело или связывающий фрагмент указанного антитела, которые специфичны к белку CD3 комплекса Т-клеточного рецептора (TCR); и трансмембранный домен или GPI-якорь;an antibody or binding fragment of said antibody that is specific for the CD3 protein of the T cell receptor (TCR) complex; and a transmembrane domain or GPI anchor; причем указанный вирус кодирует по меньшей мере один дополнительный трансген, при этом указанный дополнительный трансген кодирует цитокин, выбранный из группы, включающей суперсемейство TNF, суперсемейство TGF бета, семейство IL-1, семейство IL-10, семейство IL17 и семейство интерферона, и указанный один или более дополнительных трансгенов расположены между областью Е4 и белком фибриллы L5 под контролем главного позднего промотора, и при этом указанное экспрессированное антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела оказывают агонистическое действие и активируют Т-клетки, и при этом указанное антитело к CD3 или связывающий фрагмент указанного антитела и белок, кодируемый указанным дополнительным трансгеном, независимо экспрессируются заякоренными на поверхности раковой клетки, и при этом указанный вирус не кодирует белок В7 или его активный фрагмент.wherein said virus encodes at least one additional transgene, wherein said additional transgene encodes a cytokine selected from the group consisting of TNF superfamily, TGF beta superfamily, IL-1 family, IL-10 family, IL17 family, and interferon family, and said one or more additional transgenes are located between the E4 region and the L5 fibril protein under the control of a major late promoter, wherein said expressed anti-CD3 antibody or binding fragment of said antibody exerts an agonistic effect and activates T cells, and wherein said anti-CD3 antibody or binding fragment said antibody and the protein encoded by said additional transgene are independently expressed anchored on the surface of the cancer cell, and said virus does not encode B7 protein or an active fragment thereof. 2. Аденовирус согласно п.1, отличающийся тем, что указанный вирус представляет собой Ad11.2. Adenovirus according to claim 1, characterized in that said virus is Ad11. 3. Аденовирус согласно п.1, отличающийся тем, что указанный вирус представляет собой EnAd.3. Adenovirus according to claim 1, characterized in that said virus is EnAd. 4. Аденовирус согласно любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный вирус является компетентным по реплицикации.4. Adenovirus according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said virus is competent for replication. 5. Аденовирус согласно любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный трансмембранный домен выбран из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10-14.5. Adenovirus according to any one of claims 1-4, characterized in that said transmembrane domain is selected from the sequence shown in SEQ ID NOs: 10-14. - 49 042321- 49 042321 6. Аденовирус согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанное антитело или связывающий фрагмент антитела выбраны из группы, включающей полноразмерное антитело, Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, однодоменные антитела, scFv, би-, три- или тетравалентные антитела, бис-scFv, диатела, триатела, тетратела, хуматела, дисульфидностабилизированные формы любого из перечисленного и их связывающие эпитоп фрагменты.6. Adenovirus according to any one of claims 1 to 5, characterized in that said antibody or antibody binding fragment is selected from the group consisting of full length antibody, Fab, modified Fab, Fab', modified Fab', F(ab') 2 , Fv , single domain antibodies, scFv, bi-, tri-, or tetravalent antibodies, bis-scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, humatelas, disulfide-stabilized forms of any of the foregoing, and epitope-binding fragments thereof. 7. Аденовирус согласно любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный связывающий фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fv.7. Adenovirus according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said antibody binding fragment is a single chain Fv. 8. Аденовирус согласно любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный онколитический вирус кодирует по меньшей мере два дополнительных трансгена.8. Adenovirus according to any one of claims 1 to 7, characterized in that said oncolytic virus encodes at least two additional transgenes. 9. Аденовирус согласно п.8, отличающийся тем, что по меньшей мере один дополнительный трансген кодирует связанный с мембраной белковый лиганд для рецепторов на поверхности иммунной клетки, выбранный из группы, включающей CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, В7-Н4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT или CD160, например CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b и галектин-3, FLT-3, лиганд FLT-3, TLR, лиганды TLR, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, лиганд GITR, IFN-a2, IL12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, рецептор TSLP, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 и CD304, OX40, лиганд ОХ40, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганд CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS и лиганд ICOS.9. Adenovirus according to claim 8, characterized in that at least one additional transgene encodes a membrane-bound protein ligand for receptors on the surface of the immune cell, selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD- L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT, or CD160, such as CTLA-4, PD-1, PD -L1, PD-L2, CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b and galectin-3, FLT-3, FLT-3 ligand, TLR, TLR ligands, CCR7, CD1a , CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR ligand, IFN-a2, IL12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP receptor, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 and CD304, OX40, OX40 ligand, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 ligand, CD70, CD137, GITR, 4 -1BB, ICOS and ICOS ligand. 10. Аденовирус согласно п.8, отличающийся тем, что второй дополнительный трансген кодирует цитокин.10. Adenovirus according to claim 8, characterized in that the second additional transgene encodes a cytokine. 11. Аденовирус согласно п.10, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из суперсемейства TNF-альфа (TNFSF включает TNF-альфа, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, лиганд 4-1ВВ, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, лиганд GITR, EDA-A, EDA-A2), суперсемейства TGF-бета, семейства IL-1 (т.е. IL-1 и IL-18), семейства IL-2, семейства IL-10, семейства IL-17, семейства интерферона.11. Adenovirus according to claim 10, characterized in that said encoded cytokine is independently selected from the TNF-alpha superfamily (TNFSF includes TNF-alpha, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, ligand 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligand, EDA-A, EDA-A2), TGF-beta superfamily, IL-1 family ( i.e. IL-1 and IL-18), the IL-2 family, the IL-10 family, the IL-17 family, the interferon family. 12. Аденовирус согласно п.10 или 11, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из TNF-альфа, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, интерферона, LIGHT, Tl1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 и EDA-A2.12. Adenovirus according to claim 10 or 11, characterized in that said encoded cytokine is independently selected from TNF-alpha, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, interferon, LIGHT, Tl1A, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3 and EDA-A2. 13. Аденовирус согласно п.10 или 11, отличающийся тем, что указанный кодируемый цитокин независимо выбран из TNF-C, OX40L, CD154, FasL, CD70, CD153, лиганда 4-1ВВ и EDA-A.13. Adenovirus according to claim 10 or 11, characterized in that said encoded cytokine is independently selected from TNF-C, OX40L, CD154, FasL, CD70, CD153, ligand 4-1BB and EDA-A. 14. Аденовирус согласно любому из п.10 или 11, отличающийся тем, что указанный цитокин независимо выбран из группы, включающей IL-2, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, лиганд Flt3, GM-CSF, IL15 и IL-12.14. Adenovirus according to any one of claims 10 or 11, wherein said cytokine is independently selected from the group consisting of IL-2, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, Flt3 ligand, GM-CSF, IL15 and IL -12. 15. Аденовирус согласно п.8, отличающийся тем, что по меньшей мере один дополнительный трансген кодирует хемокин.15. Adenovirus according to claim 8, characterized in that at least one additional transgene encodes a chemokine. 16. Аденовирус согласно п.15, отличающийся тем, что хемокин независимо выбран из группы, включающей MIP-1-альфа, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 и CCL21.16. Adenovirus according to claim 15, wherein the chemokine is independently selected from the group consisting of MIP-1 alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2 , CCL19 and CCL21. 17. Аденовирус согласно п.16, отличающийся тем, что указанный кодируемый хемокин представляет собой MIP-1-альфа.17. Adenovirus according to claim 16, characterized in that said encoded chemokine is MIP-1-alpha. 18. Аденовирус согласно п.8, отличающийся тем, что указанный вирус содержит трансгены, кодирующие комбинацию цитокина и хемокина, выбранную из i) MIP-1a и Flt3 и ii) MIP-1a и IFNa.18. Adenovirus according to claim 8, characterized in that said virus contains transgenes encoding a combination of a cytokine and a chemokine selected from i) MIP-1a and Flt3 and ii) MIP-1a and IFNa. 19. Аденовирус согласно любому из пп.1-18, отличающийся тем, что указанное антитело к CD3 ИЛИ связывающий фрагмент указанного антитела содержит по меньшей мере связывающий домен, содержащий области VH и VL из муромонаба-CD3 (OKT3), отеликсизумаба, теплизумаба или визилизумаба.19. Adenovirus according to any one of claims 1 to 18, characterized in that said anti-CD3 antibody OR the binding fragment of said antibody comprises at least a binding domain containing VH and VL regions from muromonab-CD3 (OKT3), telixumab, teplizumab, or vizilizumab . 20. Аденовирус согласно п.19, отличающийся тем, что указанный вирус содержит SEQ ID NO: 117.20. Adenovirus according to claim 19, characterized in that said virus contains SEQ ID NO: 117. 21. Аденовирус согласно любому из пп.1-20, отличающийся тем, что указанный вирус кодирует саморасщепляющиеся с высокой эффективностью пептиды 2А различными последовательностями ДНК, чтобы получить множество белков или пептидов путем посттрансляционной модификации кодируемого полипептида.21. An adenovirus according to any of claims 1 to 20, characterized in that said virus encodes highly efficient self-cleaving 2A peptides with different DNA sequences to produce a plurality of proteins or peptides by post-translational modification of the encoded polypeptide. 22. Способ лечения имеющего рак пациента, включающий этап введения терапевтически эффективного количества способного реплицироваться онколитического аденовируса группы В согласно любому из пп.1-21.22. A method of treating a patient with cancer, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of a replicable group B oncolytic adenovirus according to any one of claims 1-21. --
EA201891021 2015-12-17 2016-12-19 GROUP B ADENOVIRUS ENCODING AN ANTIBODY TO THE TCR COMPLEX OR A FRAGMENT OF THE SPECIFIED ANTIBODY EA042321B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1522334.0 2015-12-17
GB1607463.5 2016-04-29
GB1617207.4 2016-10-10
GB1617206.6 2016-10-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA042321B1 true EA042321B1 (en) 2023-02-03

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240247061A1 (en) Group b adenovirus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment
US20210338753A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding a b7 protein
US12049513B2 (en) Oncolytic group B adenovirus expressing a stroma-targeted bispecific t-cell engager
WO2018083258A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
WO2018083257A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding transgenes
US20200140563A1 (en) Oncolytic virus and method
EA042321B1 (en) GROUP B ADENOVIRUS ENCODING AN ANTIBODY TO THE TCR COMPLEX OR A FRAGMENT OF THE SPECIFIED ANTIBODY