EA041830B1

EA041830B1 - BISPECIFIC ANTIBODY BINDING GLYPICAN 3 AND CD3ε (VERSIONS), PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING IT, AND METHOD FOR PRODUCING THIS ANTIBODY

Info

Publication number: EA041830B1
Application number: EA201790674
Authority: EA
Inventors: Дзюнити НЕДЗУ; Ацуси Нарита; Такахиро Исигуро; Мика САКУРАИ; Хиротаке СИРАИВА; Наока ХИРОНИВА; Томоюки ИГАВА; Юмико КАВАИ
Original assignee: Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2022-12-07

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs

Настоящее изобретение относится к мультиспецифическим антигенсвязывающим молекулам, их применениям и т.п.The present invention relates to multispecific antigen binding molecules, their uses, and the like.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention

Антитела привлекают внимание в качестве терапевтических средств благодаря их высокой стабильности в плазме и небольшому количеству нежелательных реакций (непатентные документы 1 и 2). Известно, что антитела индуцируют не только антигенсвязывающую активность, агонистическое действие и антагонистическое действие, но также и опосредуемые эффектором виды цитотоксической активности (которые называют также эффекторными функциями), такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), и обладают противоопухолевыми действиями в отношении раковых клеток (непатентный документ 3). ADCC представляет собой обусловленную эффекторными клетками цитотоксичность в отношении нагруженных антителом раковых клеток-мишеней посредством связывания Fc-области антитела с Fc-рецептором, присутствующим на эффекторных клетках, таких как NKклетки и макрофаги. Комплекс системы комплемента связывается с комплементсвязывающим сайтом, присутствующим в структуре антитела. CDC является вредной для клеток в результате клеточной деструкции, при которой приток воды и ионов в клетки усиливается благодаря образованию пор на клеточной мембране нагруженных антителом клеток с помощью компонентов комплемента, присутствующих в комплексе. Создан ряд терапевтических антител с установленными очень высокими противоопухолевыми действиями в качестве фармацевтических средств для лечения рака (непатентный документ 4).Antibodies are attracting attention as therapeutic agents due to their high plasma stability and few adverse reactions (Non-Patent Documents 1 and 2). Antibodies are known to induce not only antigen-binding activity, agonistic action, and antagonistic action, but also effector-mediated cytotoxic activities (also referred to as effector functions), such as antibody-mediated cell-dependent cytotoxicity (ADCC), antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), and complement dependent cytotoxicity (CDC), and have antitumor activities against cancer cells (Non-Patent Document 3). ADCC is effector cell-mediated cytotoxicity against antibody-loaded target cancer cells by binding the Fc region of an antibody to an Fc receptor present on effector cells such as NK cells and macrophages. The complement system complex binds to a complement binding site present in the antibody structure. CDC is detrimental to cells as a result of cellular degradation, in which the influx of water and ions into cells is enhanced by the formation of pores in the cell membrane of antibody-loaded cells by the complement components present in the complex. A number of therapeutic antibodies with very high antitumor activities have been developed as pharmaceuticals for the treatment of cancer (Non-Patent Document 4).

Для того чтобы антитело обусловливало ADCC, ADCP и CDC, необходимо наличие Fc-области в антителе и присутствие рецептора для антитела (FcyR) на эффекторных клетках, таких как NK-клетки и макрофаги, и различных компонентов комплемента, пригодных для связывания. У человека описаны изоформы FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa и FcyRIIIb в качестве семейства белка FcyR, кроме того, описаны соответствующие аллотипы (непатентный документ 5). Среди указанных изоформ FcyRIa, FcyRIIa и FcyRIIIa несут активирующий мотив на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) во внутриклеточном домене и передают сигналы активации. С другой стороны, только FcyRIIb несет домен, известный как ингибирующий мотив на основе рецептора тирозина (ITIM), во внутриклеточном домене и передает сигналы ингибирования. Известно, что каждый из FcyR передает сигналы посредством перекрестного сшивания иммунными комплексами и т.п. (непатентный документ 6). Когда антитела фактически проявляют эффекторную функцию на раковых клетках, FcyR на мембране эффекторной клетки образуют кластеры на Fc-областях нескольких антител, связанных на мембране раковой клетки, и сигналы активации передаются эффекторными клетками. В результате проявляется цитоцидное действие, но поскольку FcyR перекрестно сшиваются только на эффекторных клетках, которые в это время присутствуют вблизи раковых клеток, установлено, что активация иммунитета происходит локально в раковых клетках (непатентный документ 7).For an antibody to mediate ADCC, ADCP and CDC, there must be an Fc region in the antibody and the presence of a receptor for the antibody (FcyR) on effector cells such as NK cells and macrophages and various complement components suitable for binding. In humans, FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, and FcyRIIIb isoforms are described as an FcyR protein family, and corresponding allotypes are also described (Non-Patent Document 5). Among these isoforms, FcyRIa, FcyRIIa and FcyRIIIa carry an immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) in the intracellular domain and transmit activation signals. On the other hand, only FcyRIIb carries a domain known as the tyrosine receptor-based inhibitory motif (ITIM) in the intracellular domain and transmits inhibition signals. Each of the FcyRs is known to signal through cross-linking with immune complexes and the like. (non-patent document 6). When the antibodies actually exhibit effector function on cancer cells, the FcyRs on the effector cell membrane cluster on the Fc regions of several antibodies bound on the cancer cell membrane, and activation signals are transmitted by the effector cells. As a result, a cytocidal effect is exhibited, but since FcyRs are cross-linked only on effector cells that are present near cancer cells at this time, it is found that the activation of immunity occurs locally in cancer cells (Non-Patent Document 7).

Встречающиеся в естественных условиях иммуноглобулины связываются с антигенами в их вариабельных областях и связываются с рецепторами, такими как FcyR, FcRn, FcaR и FcεR, и комплементами в их константных областях. FcRn является одной из связывающихся молекул, которые взаимодействуют с Fc-областью IgG, и установлено, что, поскольку каждая из тяжелых цепей антитела связывается с одной молекулой FcRn, две молекулы FcRn связываются с одном молекулой антитела IgG-типа. Однако в отличие от FcRn и др., FcyR взаимодействует с шарнирной областью антитела и СН2-доменом, и только одна молекула FcyR связывается с одной молекулой антитела IgG-типа (непатентный документ 8). Кроме того, каноническое встречающееся в естественных условиях антитело IgG-типа распознает и связывает единичный эпитоп через его вариабельную область (Fab); поэтому оно может связываться только с одним антигеном. С другой стороны, известно, что с раком и воспалением связано много типов белков и поэтому может иметь место перекрестная помеха между белками. Например, известно, что несколько воспалительных цитокинов (TNF, IL1 и IL6) могут участвовать в иммунологических заболеваниях (непатентный документ 9). Кроме того, известно, что одним из механизмов приобретения устойчивости рака к лекарственным средствам является активация других рецепторов (непатентный документ 10). В таких случаях канонические антитела, которые распознают единичный эпитоп, не могут ингибировать несколько белков.Naturally occurring immunoglobulins bind to antigens in their variable regions and bind to receptors such as FcyR, FcRn, FcaR and FcεR and complements in their constant regions. FcRn is one of the binding molecules that interact with the Fc region of IgG, and it has been found that since each of the heavy chains of an antibody binds to one FcRn molecule, two FcRn molecules bind to one IgG-type antibody molecule. However, unlike FcRn and others, FcyR interacts with the antibody hinge region and the CH2 domain, and only one FcyR molecule binds to one IgG-type antibody molecule (Non-Patent Document 8). In addition, a canonical naturally occurring IgG-type antibody recognizes and binds a single epitope through its variable region (Fab); therefore, it can only bind to one antigen. On the other hand, many types of proteins are known to be associated with cancer and inflammation and therefore cross-talk between proteins may occur. For example, several inflammatory cytokines (TNF, IL1 and IL6) are known to be involved in immunological diseases (Non-Patent Document 9). In addition, it is known that one of the mechanisms for acquiring drug resistance of cancer is the activation of other receptors (Non-Patent Document 10). In such cases, canonical antibodies that recognize a single epitope cannot inhibit multiple proteins.

Антитела (биспецифические антитела), одна молекула которых связывается с двумя или большим количеством типов антигенов, изучены в качестве молекул, которые ингибируют несколько мишеней. Можно получать связывающие активности с двумя различными антигенами (первый антиген и второй антиген) путем модификации встречающихся в естественных условиях антител IgG-типа (непатентный документ 11). Таким образом, можно не только нейтрализовать два или большее количество типов антигенов с помощью одной молекулы, но также усиливать противоопухолевую активность с помощью перекрестных связей между клетками, которые обладают цитотоксической активностью, и раковыми клетками. К настоящему времени в качестве молекулярных форматов биспецифического антитела описаны молекула, содержащая антигенсвязывающий сайт, добавленный к N- или С-концу антитела (DVD-Ig и scFv- 1 041830Antibodies (bispecific antibodies), one molecule of which binds to two or more types of antigens, have been studied as molecules that inhibit multiple targets. It is possible to obtain binding activities with two different antigens (first antigen and second antigen) by modifying naturally occurring IgG-type antibodies (Non-Patent Document 11). Thus, it is possible not only to neutralize two or more types of antigens with a single molecule, but also to enhance antitumor activity by cross-linking between cells that have cytotoxic activity and cancer cells. To date, a molecule containing an antigen-binding site added to the N- or C-terminus of the antibody has been described as molecular formats of a bispecific antibody (DVD-Ig and scFv-1 041830

IgG), молекула, имеющая различные последовательности двух Fab-областей антитела (содержащее общую L-цепь биспецифическое антитело и гибридная гибридома), молекула, в которой одна область Fab распознает два антигена (IgG два-в-одном), и молекула, имеющая петлю CH3-области в качестве нового антигенсвязывающего сайта (Fcab) (непатентный документы 12 и 13). Поскольку все биспецифические антитела взаимодействуют на их Fc-областях с FcyR, эффекторные функции антитела сохраняются. Таким образом, биспецифическое антитело связывается с любым антигеном, который оно распознает, и одновременно связывается с FcyR, и обусловливает ADCC-активность в отношении клеток, экспрессирующих антиген.IgG), a molecule having different sequences of two Fab regions of an antibody (containing a common L-chain bispecific antibody and hybridoma), a molecule in which one Fab region recognizes two antigens (IgG two-in-one), and a molecule having a loop CH3 region as a new antigen-binding site (Fcab) (Non-Patent Documents 12 and 13). Since all bispecific antibodies interact on their Fc regions with FcyR, the effector functions of the antibody are preserved. Thus, the bispecific antibody binds to any antigen it recognizes and simultaneously binds to FcyR and confers ADCC activity on cells expressing the antigen.

Если все антигены, распознаваемые биспецифическим антителом, специфически экспрессируются при раке, то биспецифическое антитело обладает цитотоксическим действием в отношении раковых клеток, когда оно связывается с любым из антигенов. Таким образом, по сравнению с каноническим фармацевтическим антителом, которое распознает один антиген, можно ожидать, что указанное антитело будет обладать более эффективным противоопухолевым действием. Однако в случае, когда любой один из антигенов, распознаваемых биспецифическим антителом, экспрессируется в здоровых тканях или клетках, экспрессируемых на иммуноцитах, то имеет место повреждение здоровых тканей или высвобождение цитокинов в результате перекрестного связывания с FcyR. (непатентный документ 14). В результате индуцируются сильные нежелательные реакции.If all of the antigens recognized by the bispecific antibody are specifically expressed in cancer, then the bispecific antibody has a cytotoxic effect on cancer cells when it binds to any of the antigens. Thus, compared to a canonical pharmaceutical antibody that recognizes a single antigen, said antibody can be expected to have a more effective antitumor effect. However, when any one of the antigens recognized by the bispecific antibody is expressed in healthy tissues or cells expressed on immunocytes, damage to healthy tissues or release of cytokines as a result of cross-linking with FcyR occurs. (non-patent document 14). As a result, strong undesirable reactions are induced.

Перенаправляющее Т-клетку антитело, которое использует цитотоксичность, активируя Т-клетки в качестве эффекторных клеток, что является механизмом его противоопухолевого действия, известно с 1980-х годов (непатентные документы 15, 16 и 17). В отличие от антител, которые используют ADCC, активируя NK-клетки или макрофаги в качестве эффекторных клеток, что является механизмом их противоопухолевого действия, перенаправляющее Т-клетки антитело представляет собой антитело против любой одной из субъединиц, из которых состоит комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) на Т-клетках, и представляет собой специфическое биспецифическое антитело, которое содержит антитело, связывающееся с эпсилон-цепью CD3, и антитело, связывающееся с антигеном на раковой клетке-мишени. Тклетки приходят в контакт с раковыми клетками посредством одновременного связывания эпсилон-цепи CD3 и ракового антигена с помощью перенаправляющего Т-клетки антитела. Это в результате приводит к противоопухолевому действию в отношении раковых клеток благодаря цитотоксической активности, обусловленной Т-клетками.A T cell redirecting antibody that exploits cytotoxicity by activating T cells as effector cells, which is its antitumor mechanism, has been known since the 1980s (Non-Patent Documents 15, 16 and 17). Unlike antibodies that use ADCC to activate NK cells or macrophages as effector cells, which is the mechanism of their antitumor action, a T cell redirecting antibody is an antibody against any one of the subunits that make up the T cell receptor complex ( TCR) on T cells, and is a specific bispecific antibody that contains an antibody that binds to the CD3 epsilon chain and an antibody that binds to an antigen on a target cancer cell. The cells come into contact with the cancer cells by the simultaneous binding of the CD3 epsilon chain and the cancer antigen by a T-cell redirecting antibody. This results in an antitumor effect on cancer cells due to cytotoxic activity mediated by T cells.

Катумаксомаб, известный в качестве перенаправляющего Т-клетки антитела, связывается на посредством двух Fab с раковым антигеном (ЕрСАМ) и с CD3ε- (CD3-эпсилон) цепью, экспрессируемой на Т-клетках. Катумаксомаб индуцирует опосредуемую Т-клетками цитотоксическую активность путем одновременного связывания с раковым антигеном и CD3ε и индуцирует цитотоксическую активность, опосредуемую антигенпрезентирующими клетками, такими как NK-клетки и макрофаги, путем одновременного связывания с раковым антигеном и FcyR. Благодаря указанным двум видам цитотоксической активности катумаксомаб обладает высоким терапевтическим действием в отношении злокачественных асцитов при внутрибрюшинном введении и поэтому его применение разрешено в Европе (непатентный документ 18). Кроме того, известны случаи, когда по имеющимся сведениям введение катумаксомаба приводит к образованию реактивных в отношении раковых клеток антител, что четко демонстрирует индукцию приобретенного иммунитета (непатентный документ 19). С учетом указанного результата привлекли внимание антитела, которые обладают как опосредуемой Т-клетками цитотоксической активностью, так и опосредуемыми FcyR действиями таких клеток как NK-клетки или макрофаги (указанные антитела обозначают как трифункциональные антитела), поскольку для них можно ожидать сильное противоопухолевое действие и индукцию приобретенного иммунитета.Catumaxomab, known as a T cell redirecting antibody, binds via two Fabs to the cancer antigen (EpCAM) and to the CD3ε- (CD3-epsilon) chain expressed on T cells. Catumaxomab induces T-cell mediated cytotoxic activity by concurrent binding to cancer antigen and CD3ε and induces cytotoxic activity mediated by antigen presenting cells such as NK cells and macrophages by concurrent binding to cancer antigen and FcyR. Due to these two types of cytotoxic activity, catumaxomab has a high therapeutic effect against malignant ascites when administered intraperitoneally, and therefore its use is allowed in Europe (non-patent document 18). In addition, there are cases where administration of catumaxomab is reported to result in cancer-reactive antibodies, which clearly demonstrate the induction of adaptive immunity (Non-Patent Document 19). In view of this result, antibodies that have both T-cell-mediated cytotoxic activity and FcyR-mediated actions of cells such as NK cells or macrophages (these antibodies are referred to as trifunctional antibodies) have attracted attention, since they can be expected to have a strong antitumor effect and induction acquired immunity.

Однако трифункциональные антитела связываются одновременно с CD3ε и FcyR даже в отсутствии ракового антигена и поэтому обеспечивают перекрестное сшивание экспрессирующих CD3ε Т-клеток с экспрессирующими FcyR клетками даже при отсутствии в окружении раковых клеток, что приводит к производству в больших количествах различных цитокинов. Указанная независящая от ракового антигена индукция производства различных цитокинов в настоящее время ограничивает применение трифункциональных антител внутрибрюшинным путем (непатентный документ 20). Трифункциональные антитела очень трудно вводить системно из-за серьезных напоминающих цитокиновый шторм нежелательных реакций. Фактически, на фазе I клинического испытания было установлено, что максимальной переносимой дозой при системном введении катумаксомаба пациентам с немелкоклеточным раком легкого является очень низкая доза, составляющая 5 мкг/организм, и что введение более высокой дозы вызывает серьезные нежелательные реакции (непатентный документ 21).However, trifunctional antibodies bind simultaneously to CD3ε and FcyR even in the absence of a cancer antigen and therefore cross-link CD3ε expressing T cells with FcyR expressing cells even in the absence of cancer cells in the environment, leading to the production of large amounts of various cytokines. This cancer antigen-independent induction of the production of various cytokines currently limits the use of trifunctional antibodies by the intraperitoneal route (Non-Patent Document 20). Trifunctional antibodies are very difficult to administer systemically due to severe cytokine storm-like adverse reactions. In fact, in a phase I clinical trial, it was found that the maximum tolerated dose for systemic administration of catumaxomab to patients with non-small cell lung cancer is a very low dose of 5 μg/body, and that administration of a higher dose causes serious adverse reactions (Non-Patent Document 21).

Так, созданные с помощью общепринятых методик биспецифические антитела могут связываться с обоими антигенами, при этом первый антиген представляет собой раковый антиген (ЕрСАМ), а второй антиген представляет собой CD3ε, одновременно с этим они связываются с FcyR; и поэтому с учетом их молекулярной структуры невозможно избежать нежелательных реакций, вызываемых одновременным связыванием с FcyR и вторым антигеном CD3ε.Thus, conventionally generated bispecific antibodies can bind to both antigens, with the first antigen being a cancer antigen (EpCAM) and the second antigen being CD3ε, while simultaneously binding to FcyR; and therefore, due to their molecular structure, it is not possible to avoid unwanted reactions caused by simultaneous binding to FcyR and the second CD3ε antigen.

При этом, в отличие от катумаксомаба, BiTE (биспецифический активатор (проводник) Т-клеток) неAt the same time, unlike catumaxomab, BiTE (a bispecific activator (conductor) of T cells) does not

- 2 041830 содержит сайт связывания Fcγ-рецептора и поэтому у него отсутствует перекрестное сшивание с рецепторами, которые экспрессируются на Т-клетках и таких клетках, как NK-клетки и макрофаги, зависимым от ракового антигена образом. Так, было продемонстрировано, что BiTE не вызывает независимую от ракового антигена индукцию цитокинов, которая обнаружена при введении катумаксомаба. Однако, поскольку BiTE представляет собой модифицированную низкомолекулярную молекулу антитела без Fcобласти, проблема заключается в том, что время его полужизни в крови после введения пациенту, существенно короче, чем в случае антител IgG-типа, которые обычно применяют в качестве терапевтических антител. Фактически, согласно опубликованным данным время полужизни в крови BiTE при его применении in vivo составляет примерно несколько часов (непатентные документы 22 и 23). При проведении клинических испытаний блинатумомаба его вводили путем непрерывной внутривенной инфузии с помощью мининасоса. Такой метод введения не только чрезвычайно неудобен для пациентов, но также имеет потенциальный риск медицинских осложнений, связанных с неисправностью устройства или т.п. Таким образом, нельзя считать, что указанный метод введения является желательным.- 2 041830 contains an Fcγ receptor binding site and therefore lacks cross-linking with receptors that are expressed on T cells and cells such as NK cells and macrophages in a cancer antigen-dependent manner. Thus, it was demonstrated that BiTE does not cause cancer-antigen-independent cytokine induction, which is found with the introduction of catumaxomab. However, since BiTE is a modified low molecular weight antibody molecule without an Fco region, the problem is that its half-life in blood after administration to a patient is significantly shorter than for IgG-type antibodies that are commonly used as therapeutic antibodies. In fact, according to the published data, the blood half-life of BiTE when used in vivo is about several hours (Non-Patent Documents 22 and 23). In clinical trials, blinatumomab was administered by continuous intravenous infusion using a minipump. Such an administration method is not only extremely inconvenient for patients, but also has the potential risk of medical complications due to device malfunction or the like. Thus, this method of administration cannot be considered desirable.

В последние годы применение Fc-области с пониженной способностью связываться с FcyR позволило сохранять сильную противоопухолевую активность, свойственную BiTE, и очень хорошие характеристики безопасности без индукции цитокинового шторма зависимым от ракового антигена образом, и обеспечило создание новых полипептидных структур с продолжительным временем полужизни в крови (патентный документ 1).In recent years, the use of an Fc region with a reduced ability to bind to FcyR has made it possible to maintain the strong antitumor activity inherent in BiTE and very good safety characteristics without inducing a cytokine storm in a cancer antigen-dependent manner, and has provided the creation of new polypeptide structures with a long half-life in blood ( patent document 1).

С другой стороны, когда происходит экспрессия созданного с помощью общепринятых методик биспецифического антитела, то экспрессируются два типа H-цепей и два типа L-цепей, что может приводить к получению десяти комбинаций. Из них только одна из полученных комбинаций обладает представляющей интерес специфичностью связывания. Таким образом, для получения представляющего интерес биспецифического антитела одно представляющее интерес антитело должны быть выделено из десяти типов антител, такой путь является очень неэффективным и сложным.On the other hand, when a conventionally generated bispecific antibody is expressed, two types of H chains and two types of L chains are expressed, which can result in ten combinations. Of these, only one of the resulting combinations has binding specificity of interest. Thus, to obtain a bispecific antibody of interest, one antibody of interest must be isolated from ten types of antibodies, such a route is very inefficient and complicated.

В качестве решения указанной проблемы был описан метод, заключающийся в предпочтительном секретировании IgG с гетеродимерной комбинацией H-цепей, например с комбинацией H-цепи против антигена А и Н-цепи против антигена Б, посредством интродукции аминокислотных замен в CH3область H-цепи IgG (патентные документы 2, 3, 4, 5, 6, 7 и непатентные документы 24 и 25). В качестве таких методов описаны методы на основе физического нарушения, т.е. выступа и впадины, и метод на основе отталкивания электрических зарядов.As a solution to this problem, a method has been described that preferentially secretes IgG with a heterodimeric combination of H chains, for example, a combination of an H chain against antigen A and an H chain against antigen B, by introducing amino acid substitutions into the CH3 region of the IgG H chain (patent documents 2, 3, 4, 5, 6, 7 and non-patent documents 24 and 25). As such methods, methods based on physical disturbance are described, i.e. protrusions and depressions, and a method based on the repulsion of electric charges.

Для получения представляющей интерес молекулы с повышенной эффективностью, описаны методы, основанные на применении L-цепей, которые могут связываться с двумя различными антигенами, даже хотя L-цепи имеют одинаковую аминокислотную последовательность (патентные документы 8 и 9). Однако аффинность к антигену может значительно уменьшаться при применении общих L-цепей и трудно найти общие L-цепи, при использовании которых сохраняется аффинность к антигену.In order to obtain a molecule of interest with increased potency, methods have been described based on the use of L chains that can bind to two different antigens even though the L chains have the same amino acid sequence (Patent Documents 8 and 9). However, affinity for an antigen can be significantly reduced when using common L chains and it is difficult to find common L chains that retain affinity for the antigen.

Перечень перечисленных документовList of listed documents

Патентные документы.Patent Documents.

Патентный документ 1. WO2012/073985.Patent Document 1. WO2012/073985.

Патентный документ 2. WO96/27011.Patent document 2. WO96/27011.

Патентный документ 3. WO2006/106905.Patent document 3. WO2006/106905.

Патентный документ 4. WO2007/147901Patent document 4. WO2007/147901

Патентный документ 5. WO2009/089004.Patent document 5. WO2009/089004.

Патентный документ 6. WO2010/129304.Patent document 6. WO2010/129304.

Патентный документ 7. WO2013/065708.Patent Document 7. WO2013/065708.

Патентный документ 8. WO98/050431.Patent document 8. WO98/050431.

Патентный документ 9. WO2006/109592.Patent document 9. WO2006/109592.

Непатентные документы.non-patent documents.

Непатентный документ 1. Nat. Biotechnol. 23, 2005, с. 1073-1078.Non-Patent Document 1. Nat. Biotechnol. 23, 2005, p. 1073-1078.

Непатентный документ 2. Eur J Pharm Biopharm. 59 (3), 2005, с. 389-396.Non-Patent Document 2. Eur J Pharm Biopharm. 59 (3), 2005, p. 389-396.

Непатентный документ 3. Drug Des Devel Ther 3, 2009, с. 7-16.Non-Patent Document 3. Drug Des Devel Ther 3, 2009, p. 7-16.

Непатентный документ 4. Clin Cancer Res. 16 (1), 2010, с. 11-20.Non-Patent Document 4. Clin Cancer Res. 16 (1), 2010, p. 11-20.

Непатентный документ 5. Immunol. Lett. 82, 2002, с. 57-65.Non-Patent Document 5. Immunol. Lett. 82, 2002, p. 57-65.

Непатентный документ 6. Nat. Rev. Immunol. 8, 2008, с. 34-47.Non-Patent Document 6. Nat. Rev. Immunol. 8, 2008, p. 34-47.

Непатентный документ 7. Ann. Rev. Immunol. 6, 1988, с. 251-281.Non-Patent Document 7. Ann. Rev. Immunol. 6, 1988, p. 251-281.

Непатентный документ 8. J. Bio. Chem., 276, 2001, с. 16469-16477.Non-Patent Document 8. J. Bio. Chem., 276, 2001, p. 16469-16477.

Непатентный документ 9. Nat. Biotech., 28, 2011, с. 502-510.Non-Patent Document 9. Nat. Biotech., 28, 2011, p. 502-510.

Непатентный документ 10. Endocr Relat Cancer 13, 2006, с. 45-51.Non-Patent Document 10. Endocr Relat Cancer 13, 2006, p. 45-51.

Непатентный документ 11. MAbs. 1 марта 2012 г., 4(2).Non-Patent Document 11. MAbs. March 1, 2012, 4(2).

Непатентный документ 12. Nat. Rev. 10, 2010, с. 301-316.Non-Patent Document 12. Nat. Rev. 10, 2010, p. 301-316.

Непатентный документ 13. Peds 23(4), 2010, с. 289-297.Non-Patent Document 13. Peds 23(4), 2010, p. 289-297.

Непатентный документ 14. J. Immunol. 163(3), 1 августа 1999 г., с. 1246-1252.Non-Patent Document 14. J. Immunol. 163(3), 1 August 1999, p. 1246-1252.

- 3 041830- 3 041830

Непатентный документ 15. Nature 314 (6012), 1985, с. 628-631.Non-Patent Document 15. Nature 314 (6012), 1985, p. 628-631.

Непатентный документ 16. Int J Cancer 41 (4), 1988, с. 609-615.Non-Patent Document 16. Int J Cancer 41 (4), 1988, p. 609-615.

Непатентный документ 17. Proc Natl Acad Sci USA 83 (5), 1986, с. 1453-1457.Non-Patent Document 17. Proc Natl Acad Sci USA 83 (5), 1986, p. 1453-1457.

Непатентный документ 18. Cancer Treat Rev. 36(6), октябрь 2010 г., с. 458-467.Non-Patent Document 18. Cancer Treat Rev. 36(6), October 2010, p. 458-467.

Непатентный документ 19. Future Oncol. 8(1), январь 2012 г., с. 73-85.Non-Patent Document 19. Future Oncol. 8(1), January 2012, p. 73-85.

Непатентный документ 20. Cancer Immunol Immunother. 56(9), 2007, с. 1397-1406.Non-Patent Document 20. Cancer Immunol Immunother. 56(9), 2007, p. 1397-1406.

Непатентный документ 21. Cancer Immunol Immunother. 56 (10), 2007, с. 1637-1644.Non-Patent Document 21. Cancer Immunol Immunother. 56 (10), 2007, p. 1637-1644.

Непатентный документ 22. Cancer Immunol Immunother. 55(5), 2006, с. 503-514.Non-Patent Document 22. Cancer Immunol Immunother. 55(5), 2006, p. 503-514.

Непатентный документ 23. Cancer Immunol Immunother. 58(1), 2009, с. 95-109.Non-Patent Document 23. Cancer Immunol Immunother. 58(1), 2009, p. 95-109.

Непатентный документ 24. Protein Engineering, т.9, 1996, с. 617-621.Non-Patent Document 24. Protein Engineering, vol. 9, 1996, p. 617-621.

Непатентный документ 25. Nature Biotechnology, т.16, 1998, c. 677-681.Non-Patent Document 25. Nature Biotechnology, Vol. 16, 1998, c. 677-681.

Краткое изложение сущности изобретения Задачи, положенные в основу изобретенияBrief summary of the invention Objectives underlying the invention

Настоящее изобретение было создано с учетом вышеуказанных обстоятельств. В основу настоящего изобретения была положена задача создать мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые обладают способностью приводить в контакт Т-клетки с раковыми клетками-мишенями и которые можно применять для лечения рака, используя цитотоксическую активность Т-клеток против раковых тканей-мишеней, которые содержат экспрессирующие глипикан 3 клетки, и представляют собой молекулярные форматы, которые можно получать с высокой эффективностью; разработать способы получения антигенсвязывающих молекул; и фармацевтические композиции, которые содержат антигенсвязывающие молекулы в качестве действующего вещества.The present invention has been made in view of the above circumstances. The object of the present invention was to provide multispecific antigen-binding molecules that have the ability to bring T cells into contact with cancer target cells and that can be used to treat cancer using the cytotoxic activity of T cells against cancer target tissues that contain expressing glypican 3 cells, and are molecular formats that can be produced with high efficiency; develop methods for obtaining antigen-binding molecules; and pharmaceutical compositions that contain antigen-binding molecules as an active ingredient.

Средства решения указанных задачMeans for solving these problems

При создании настоящего изобретения описана L-цепь, общая с доменом, который содержит вариабельную область связывающегося с глипиканом 3 антитела, и доменом, который содержит вариабельная область антитела, связывающегося с комплексом Т-клеточного рецептора, при этом общая L-цепь обладает способностью повышать аффинность к обоим антигенам. Это обеспечивает получение молекулярных форм с высокой эффективностью, и дополнительно описаны новые мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые сохраняют сильную противоопухолевую активность, характерную для перенаправляющих Т-клетки антител, таких как BiTE, и обладают очень хорошими характеристиками безопасности, не индуцируя цитокиновый шторм в зависимости от ракового антигена, а также обладают продолжительным временем полужизни в крови. Кроме того, при создании настоящего изобретения установлено, что мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые содержат общие Lцепи, нацелены на экспрессирующие глипикан 3 раковые клетки и вызывают повреждение клеток. На основе указанного открытия при создании настоящего изобретения установлено, что мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, вызывают повреждение раковых тканей, которые содержат экспрессирующие глипикан 3 раковые клетки.When creating the present invention, an L chain is described that is shared with a domain that contains the variable region of an antibody that binds to glypican 3, and a domain that contains the variable region of an antibody that binds to the T-cell receptor complex, while the common L chain has the ability to increase affinity to both antigens. This allows for high potency molecular forms, and further described are novel multi-specific antigen-binding molecules that retain the potent anti-tumor activity of T-cell redirecting antibodies such as BiTE and have very good safety characteristics without inducing a cytokine storm depending on the cancer. antigen, and also have a long half-life in the blood. In addition, the present invention has found that multispecific antigen-binding molecules that contain common L chains target glypican 3 expressing cancer cells and cause cell damage. Based on this discovery, the present invention found that the multispecific antigen-binding molecules of the present invention cause damage to cancer tissues that contain glypican 3 expressing cancer cells.

Более конкретно, в настоящем изобретении предложено следующее.More specifically, the present invention provides the following.

1. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая содержит:1. Multispecific antigen-binding molecule, which contains:

(1) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, (2) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и (3) домен, содержащий Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcyрецептора, в которой вариабельные области L-цепи, содержащиеся в вариабельной области, указанной в подпункте (1), и в вариабельной области, указанной в подпункте (2), имеют общую аминокислотную последовательность; где мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула обладает цитотоксической активностью, эквивалентной или более высокой по сравнению с активностью биспецифического антитела GPC3_ERY22_rCE115, которое содержит домен, связывающий глипикан 3, содержащий SEQ ID NO: 47 и 48, и домен, связывающий комплекс Т-клеточного рецептора, содержащий SEQ ID NO: 49 и 50.(1) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for glypican 3, (2) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for the T-cell receptor complex, and (3) a domain containing Fc- a region with reduced Fcy receptor binding activity, in which the variable regions of the L chain contained in the variable region indicated in subparagraph (1) and the variable region indicated in subparagraph (2) have a common amino acid sequence; where the multispecific antigen-binding molecule has a cytotoxic activity equivalent to or greater than the activity of the bispecific antibody GPC3_ERY22_rCE115, which contains a glypican 3 binding domain containing SEQ ID NOs: 47 and 48, and a T-cell receptor complex binding domain containing SEQ ID NO: 49 and 50.

2. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по п.1, цитотоксическая активность которой представляет собой зависимую от Т-клетки цитотоксическую активность.2. The multispecific antigen-binding molecule according to claim 1, the cytotoxic activity of which is a T-cell dependent cytotoxic activity.

3. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по п.1 или 2, в которой связывающая активность в отношении комплекса Т-клеточного рецептора представляет собой связывающую активность в отношении Т-клеточного рецептора.3. The multispecific antigen-binding molecule according to claim 1 or 2, wherein the T-cell receptor complex binding activity is T-cell receptor binding activity.

4. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-3, в которой связывающая активность в отношении комплекса Т-клеточного рецептора представляет собой связывающую активность в отношении CD3ε-цепи.4. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 3, wherein the T-cell receptor complex binding activity is CD3ε chain binding activity.

5. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельная область антитела, указанная в подпункте (1) в п.1, представляет собой вариабельную область антитела, которая содержит любую одну из комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3 H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (a1)-(a5), или функционально эквивалентную вариабельную область антитела:5. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable region specified in subparagraph (1) of claim 1 is an antibody variable region that contains any one of combinations of CDR1, CDR2, and CDR3 H- a chain selected from those listed in subparagraphs (a1)-(a5) below, or a functionally equivalent variable region of an antibody:

- 4 041830 (al) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и- 4 041830 (al) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of CDR1-, CDR2- and

CDR3-y4acTKoe, которые содержатся в SEQ ID NO: 40;CDR3-y4acTKoe contained in SEQ ID NO: 40;

(a2) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и(a2) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of CDR1-, CDR2- and

CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197;CDR3 regions as contained in SEQ ID NO: 197;

(а3) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206;(a3) CDR1, CDR2, and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3 y regions contained in SEQ ID NO: 206;

(а4) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; и (а5) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215.(a4) CDR1, CDR2, and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3 y regions contained in SEQ ID NO: 211; and (a5) CDR1, CDR2, and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3 y regions contained in SEQ ID NO: 215.

6. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельная область антитела, указанная в подпункте (2) в п.1, представляет собой вариабельную область антитела, которая содержит любую одну из комбинаций аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (б1)-(б15), или функционально эквивалентную вариабельную область антитела:6. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable region specified in subparagraph (2) of claim 1 is an antibody variable region that contains any one of combinations of the amino acid sequences CDR1, CDR2, and CDR3 An H chain selected from (b1) to (b15) below, or a functionally equivalent antibody variable region:

(б1) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 52;(b1) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 52;

(б2) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103;(b2) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 103;

(б3) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 122;(b3) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 122;

(б4) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128;(b4) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 128;

(б5) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 129;(b5) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 129;

(б6) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 132;(b6) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 132;

(б7) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142;(b7) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 142;

(б8) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 144;(b8) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 144;

(б9) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 164;(b9) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 164;

(б10) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 168;(b10) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 168;

(б11) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 421;(b11) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 421;

(б12) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 424;(b12) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 424;

(б13) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 426;(b13) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 426;

(б14) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 429; и (б15) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным последовательностям CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 430.(b14) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 429; and (b15) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid sequences of the CDR3 y regions contained in SEQ ID NO: 430.

CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2и иCDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2i and

и иand and

и и иand and and

7. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельные области антитела, указанные в подпунктах (1) и (2) в п.1, представляют собой вариабельные области антитела, которые содержат любую одну из комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3 H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (в1)-(в19), или функционально эквивалентные вариабельные области ан титела:7. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable regions specified in subparagraphs (1) and (2) in paragraph 1 are antibody variable regions that contain any one of combinations of CDR1, CDR2 and an H chain CDR3 selected from (c1) to (c19) below, or a functionally equivalent antibody variable region:

(в1 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 40; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 52;(c1) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 40; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 52;

(в2 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 40; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 421;(c2) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 40; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 421;

(в3) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков,(c3) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions,

- 5 041830 которые содержатся в SEQ ID NO: 40; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям- 5 041830 which are contained in SEQ ID NO: 40; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences

CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 426;CDR1, CDR2 and CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 426;

(в4) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 40; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 429;(c4) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 40; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 429;

(в5) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 40; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 430;(c5) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 40; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 430;

(в6) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128;(c6) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 197; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 128;

(в7) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142;(c7) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 142;

(в8) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 144;(c8) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 144;

(в9) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 164;(c9) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 164;

(в10 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 168;(c10) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 168;

(в 11) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142;(in 11) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 142;

(в12 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 144;(c12) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 144;

(в13 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 164;(c13) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 164;

(в14 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 168;(c14) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 168;

(в15 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последова-(c15) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical amino acid sequences

- 6 041830 тельностям CDR1-, CDR2- и CDR3-y4acTKoe, которые содержатся в SEQ ID NO: 103;- 6 041830 to the values of CDR1-, CDR2- and CDR3-y4acTKoe contained in SEQ ID NO: 103;

(в16 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 122;(c16) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 122;

(в17 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 129;(c17) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 129;

(в18 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 132; и (в19 ) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастков, которые содержатся в SEQ ID NO: 424.(c18) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 132; and (c19) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3-regions, which are contained in SEQ ID NO: 424.

8. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.5-7, в которой CDR1, CDR2 и CDR3 представляют собой CDR1-, CDR2- и CDR3-yчастки, определенные на основе нумерации по Кэботу.8. A multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 5 to 7, wherein CDR1, CDR2 and CDR3 are CDR1, CDR2 and CDR3 regions determined based on Cabot numbering.

9. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельная область антитела, указанная в подпункте (1) в п.1, представляет собой вариабельную область антитела, которая содержит любую одну из вариабельных областей H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (a1)-(a5), или функционально эквивалентную вариабельную область антитела:9. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable region specified in subparagraph (1) of claim 1 is an antibody variable region that contains any one of the H chain variable regions selected from specified in subparagraphs (a1)-(a5) below, or a functionally equivalent antibody variable region:

(a1) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40;(a1) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;

(а2) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197;(a2) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197;

(а3) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206;(a3) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206;

(а4) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211; и (а5) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215.(a4) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; and (a5) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215.

10. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельная область антитела, указанная в подпункте (2) в п.1, представляет собой вариабельную область антитела, которая содержит любую одну из вариабельных областей H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (б1)-(б15), или функционально эквивалентную вариабельную область антитела:10. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable region specified in subparagraph (2) of claim 1 is an antibody variable region that contains any one of the H chain variable regions selected from specified in subparagraphs (b1)-(b15) below, or a functionally equivalent variable region of the antibody:

(б1) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52;(b1) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52;

(б2) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103;(b2) an H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103;

(б3) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122;(b3) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122;

(б4) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128;(b4) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128;

(б5) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129;(b5) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129;

(б6) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132;(b6) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132;

(б7) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142;(b7) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142;

(б8) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144;(b8) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144;

(б9) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164;(b9) an H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164;

(б10) вариабельная область H-цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168;(b10) an H chain variable region which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168;

- 7 041830 (б11) вариабельная NO: 421;- 7 041830 (b11) variable NO: 421;

(612) вариабельная NO: 424;(612) variable NO: 424;

(613) вариабельная NO: 426;(613) variable NO: 426;

(б14) вариабельная NO: 429; и (б15) вариабельная NO: 430.(b14) variable NO: 429; and (b15) variable NO: 430.

область H-цепи, которая область H-цепи, которая область H-цепи, которая область H-цепи, которая область H-цепи, которая имеет аминокислотную имеет аминокислотную имеет аминокислотную имеет аминокислотную имеет аминокислотную последовательность SEQ ID последовательность SEQ ID последовательность SEQ ID последовательность SEQ ID последовательность SEQ IDH chain region which is an H chain region which is an H chain region which is an H chain region which is an H chain region which has an amino acid has an amino acid has an amino acid has an amino acid has an amino acid sequence SEQ ID sequence SEQ ID sequence SEQ ID sequence SEQ ID sequence SEQ ID

11. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельные области антитела, указанные в подпунктах (1) и (2) в п.1, представляют собой вариабельные области антитела, которые содержат любую одну из комбинацией вариабельных областей H-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (в1)-(в19), или функционально эквивалентные вариабельные области антитела:11. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable regions specified in subparagraphs (1) and (2) in paragraph 1 are antibody variable regions that contain any one of a combination of H variable regions a chain selected from those listed in subparagraphs (c1) to (c19) below, or functionally equivalent antibody variable regions:

(в1) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52;(c1) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52;

(в2) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 421;(c2) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 421;

(в3) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 426;(c3) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 426;

(в4) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 429;(c4) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 429;

(в5) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 430;(c5) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 430;

(в6) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128;(c6) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128;

(в7) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142;(c7) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142;

(в8) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144;(c8) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144;

(в9) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164;(c9) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164;

(в10) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168;(c10) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168;

(в11) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142;(c11) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142;

(в12) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте(c12) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph

- 8 041830 (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144;- 8 041830 (2) in claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144;

(в13) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164;(c13) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164;

(в14) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168;(c14) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168;

(в15) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103;(c15) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103;

(в16) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122;(c16) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122;

(в17) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129;(c17) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129;

(в18) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; и (в19) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215; и вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 424.(c18) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; and the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132; and (c19) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; and an H chain variable region which is contained in the antibody variable region specified in subparagraph (2) in paragraph 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 424.

12. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-11, в которой общая Lцепь, указанная в п.1, представляет собой общую L-цепь, которая содержит любую одну из комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3, выбранную из указанных ниже в подпунктах (г1)-(г11), или функциональный эквивалент общей L-цепи:12. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 11, wherein the total L chain of claim 1 is a general L chain that contains any one of the combinations of CDR1, CDR2, and CDR3 selected from those listed in sub-clauses below. (r1)-(r11), or the functional equivalent of the general L-chain:

(г1) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53;(d1) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 53;

(г2) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(d2) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 223;

(г3) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 299;(d3) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 299;

(г4) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 301;(d4) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 301;

(г5) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 302;(d5) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 302;

(г6) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 304;(d6) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 304;

(г7) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 306;(d7) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 306;

(г8) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 307;(d8) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 307;

(г9) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 309;(d9) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 309;

(г10) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 310; и (г11) CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные аминокислотным CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 319.(d10) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 310; and (d11) CDR1, CDR2 and CDR3 identical to the amino acid CDR3 regions contained in SEQ ID NO: 319.

последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностям последовательностямsequences sequences sequences sequences sequences sequences sequences sequences sequences sequences

CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2и иCDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2CDR1-, CDR2 and

и иand and

и и иand and and

13. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-11, в котором вариа бельная область L-цепи, указанная в п.1, представляет собой вариабельную область любой одной из аминокислотных последовательностей L-цепи, выбранных из указанных ниже в подпунктах (г1)-(г11):13. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 11, wherein the variable region of the L chain specified in claim 1 is the variable region of any one of the amino acid sequences of the L chain selected from those indicated in subparagraphs (d1) below. )-(r11):

(г1) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(d1) an L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(г2) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(d2) an L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(г3) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299;(d3) an L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 299;

(г4) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 301;(d4) an L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 301;

- 9 041830 (г5) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 302;- 9 041830 (g5) L-chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 302;

(г6) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304;(d6) L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 304;

(г7) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306;(d7) L-chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 306;

(г8) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307;(d8) L-chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 307;

(г9) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309;(d9) L-chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 309;

(г10) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310; и (г11) L-цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319.(d10) L-chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 310; and (d11) an L chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 319.

14. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельные области антитела, указанные в подпунктах (1) и (2) в п.1, и вариабельная область общей L-цепи представляют собой вариабельные области антитела, содержащие любую одну из комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3 H-цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 L-цепи, выбранную из указанных ниже в подпунктах (д1)(д25), или функционально эквивалентные вариабельные области антитела:14. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable regions of subparagraphs (1) and (2) of claim 1 and the common L chain variable region are antibody variable regions containing any one of the combinations of CDR1, CDR2 and CDR3 of the H chain and CDR1, CDR2 and CDR3 of the L chain selected from the following in subparagraphs (e1)(e25), or functionally equivalent variable regions of the antibody:

(д1) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53;(e1) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 128; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 53;

(д2) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 299;(e2) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 128; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the common L chain of the antibody and are identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 299;

(д3) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 310;(e3) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 128; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 310;

(д4) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 128; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 319;(e4) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 128; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 319;

(д5) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e5) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 142; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д6) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 144; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e6) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 144; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д7) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 164; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e7) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 164; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д8) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в под(e8) CDR1, CDR2, and CDR3 that are contained in the variable region of an antibody listed under

- 10 041830 пункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 168; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;- 10 041830 paragraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 168; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д9) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e9) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 142; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д10) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 142; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 299;(e10) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 142; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 299;

(д11) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 144; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e11) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 144; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д12) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 164; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 223;(e12) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 164; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L-chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of SEQ ID NO: 223;

(д13) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 168; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 223;(e13) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 168; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 223;

(д14) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53;(e14) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 53;

(д15) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 299;(e15) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 299;

(д16) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 301;(e16) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 301;

- 11 041830 (д17) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 302;- 11 041830 (e17) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215 ; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 302;

(д18) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 304;(e18) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 304;

(д19) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 306;(e19) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 306;

(д20) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 307;(e20) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 307;

(д21) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 103; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 309;(e21) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 103; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 309;

(д22) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 122; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53;(e22) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 122; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 53;

(д23) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 129; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53;(e23) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 129; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 53;

(д24) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 132; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 53; и (д25) CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентичные аминокислотным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-участков, которые содержатся в SEQ ID NO: 424; и CDR1, CDR2 и CDR3, которые содержатся в вариабельной области общей L-цепи антитела, и идентичные аминокислот- 12 041830 ным последовательностям CDR1-, CDR2- и CDR3-y4acTKoe, которые содержатся в SEQ ID NO: 53.(e24) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 132; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the general L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 53; and (e25) CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1-, CDR2- and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, which are contained in SEQ ID NO: 424; and CDR1, CDR2 and CDR3, which are contained in the variable region of the common L chain of the antibody, and identical to the amino acid sequences of CDR1-, CDR2-, and CDR3-y4acTKoe, which are contained in SEQ ID NO: 53.

15. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-4, в которой вариабельные области антитела, указанные в подпунктах (1) и (2) в п.1, и вариабельная область общей L-цепи представляют собой вариабельные области антитела, содержащие любую одну из комбинаций вариабельных областей, выбранные из указанных ниже в подпунктах (e1)-(e26), или функционально эквивалентные вариабельные области антитела:15. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 4, wherein the antibody variable regions of subparagraphs (1) and (2) of claim 1 and the common L chain variable region are antibody variable regions containing any one of the combinations of variable regions selected from those listed in subparagraphs (e1)-(e26) below, or functionally equivalent antibody variable regions:

(e1) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53;(e1) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53;

(е2) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 299;(e2) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 299;

(е3) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 310;(e3) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 310;

(е4) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 319;(e4) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 319;

(е5) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 142; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e5) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е6) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 144; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e6) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е7) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 164; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e7) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е8) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 168; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e8) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е9) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 142; и вариабельная область общей L-цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e9) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142; and the variable region of the general L-chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е10 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211; вариабель-(e10 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; variable-

- 13 041830 ная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в- 13 041830 nay region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in

п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 142; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 299;1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 299;

(e11 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 144; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e11 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(e12 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 164; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e12 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(е13 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 168; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 223;(e13) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 223;

(e14 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53;(e14) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53;

(e15 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 299;(e15 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 299;

(e16 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 301;(e16 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 301;

(e17 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 302;(e17 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 302;

(e18 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 304;(e18 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 304;

(e19 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 306;(e19 ) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 306;

(е20 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей L-(e20) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and variable region of common L-

- 14 041830 цепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 307;- 14 041830 antibody chain identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 307;

(е21 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 309;(e21) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 309;

(е22 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 122; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53;(e22) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53;

(е23 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 129; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53;(e23) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53;

(е24 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 132; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53;(e24) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53;

(е25 ) вариабельная область H-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (1) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 215; вариабельная область Н-цепи, которая содержится в вариабельной области антитела, указанной в подпункте (2) в п.1, и идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 424; и вариабельная область общей Lцепи антитела, идентичная аминокислотной последовательности вариабельной области, которая содержится в SEQ ID NO: 53; и (е26 ) мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая связывается с эпитопом, перекрывающимся с каждым из эпитопов глипикана 3, и комплекса Т-клеточного рецептора, который связывается мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, указанной в одном из подпунктов (e1)(e25), и которая имеет общую L-цепь.(e25) the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (1) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215; the variable region of the H chain, which is contained in the variable region of the antibody specified in subparagraph (2) in paragraph 1, and identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 424; and the variable region of the general L chain of the antibody, identical to the amino acid sequence of the variable region, which is contained in SEQ ID NO: 53; and (e26) a multispecific antigen-binding molecule that binds to an epitope overlapping with each of the epitopes of glypican 3 and a T-cell receptor complex that binds to the multispecific antigen-binding molecule specified in one of subparagraphs (e1)(e25) and which has a common L-chain.

16. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-15, в которой Fcобласть, указанная в подпункте (3) в п.1, представляет собой Fc-область с аминокислотной мутацией любой из образующих Fc-область аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-26 (IgG1-IgG4).16. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 15, wherein the Fc region specified in subparagraph (3) of claim 1 is an Fc region with an amino acid mutation of any of the amino acid sequences forming the Fc region of SEQ ID NO: 23 -26 (IgG1-IgG4).

17. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по п.16, в которой Fc-область, указанная в подпункте (3) в п.1, представляет собой Fc-область с мутацией по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в следующих аминокислотных положениях, указанных согласно EUнумерации: положение 220, положение 226, положение 229, положение 231, положение 232, положение 233, положение 234, положение 235, положение 236, положение 237, положение 238, положение 239, положение 240, положение 264, положение 265, положение 266, положение 267, положение 269, положение 270, положение 295, положение 296, положение 297, положение 298, положение 299, положение 300, положение 325, положение 327, положение 328, положение 329, положение 330, положение 331 и положение 332.17. The multispecific antigen-binding molecule according to claim 16, wherein the Fc region specified in subparagraph (3) of claim 1 is an Fc region with a mutation of at least one amino acid selected from the amino acids at the following amino acid positions specified according to EU numbers: position 220, position 226, position 229, position 231, position 232, position 233, position 234, position 235, position 236, position 237, position 238, position 239, position 240, position 264, position 265, position 266, position 267, position 269, position 270, position 295, position 296, position 297, position 298, position 299, position 300, position 325, position 327, position 328, position 329, position 330, position 331 and position 332.

18. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по п.16, в которой Fc-область, указанная в подпункте (3) в п.1, представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из указанных ниже аминокислот, согласно EU-нумерации: Arg в аминокислотном положении 234, Ala или Arg в аминокислотном положении 235, Lys в аминокислотном положении 239 и Ala в аминокислотном положении 297.18. The multispecific antigen-binding molecule according to claim 16, wherein the Fc region specified in subparagraph (3) of claim 1 is an Fc region that contains at least one amino acid selected from the following amino acids according to EU- numbering: Arg at amino acid position 234, Ala or Arg at amino acid position 235, Lys at amino acid position 239, and Ala at amino acid position 297.

19. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.16-18, в которой Fcобласть, указанная в подпункте (3) в п.1, дополнительно содержит аминокислотную мутацию, усиливающую образование гетеродимерной Fc-области.19. The multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 16 to 18, wherein the Fc region specified in subparagraph (3) of claim 1 further comprises an amino acid mutation that enhances the formation of a heterodimeric Fc region.

20. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по п.19, в котором гетеродимерная Fcобласть представляет собой указанную ниже комбинацию (ж1) или (ж2) аминокислотных последовательностей:20. The multispecific antigen-binding molecule according to claim 19, wherein the heterodimeric Fco region is the following combination of (g1) or (g2) amino acid sequences:

(ж1) комбинация аминокислотной последовательности, идентичной константной области Fcобласти, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и аминокислотной последовательности, идентичной константной области Fc-области, которая содержит аминокислотную по- 15 041830 следовательность SEQ ID NO: 58; и (ж2) комбинация аминокислотной последовательности, идентичной константной области Fcобласти, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62, и аминокислотной последовательности, идентичной константной области Fc-области, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.(g1) a combination of an amino acid sequence identical to the constant region of the Fc region, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57, and an amino acid sequence identical to the constant region of the Fc region, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; and (g2) a combination of an amino acid sequence identical to the constant region of the Fc region, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62, and an amino acid sequence identical to the constant region of the Fc region, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.

21. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула по одному из пп.1-20, где мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело.21. The multispecific antigen binding molecule according to one of claims 1 to 20, wherein the multispecific antigen binding molecule is a bispecific antibody.

22. Биспецифическое антитело по одному из указанных ниже подпунктов (з1)-(з25):22. A bispecific antibody according to one of the following subparagraphs (h1)-(h25):

(з1) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 424, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h1) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 424 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з2) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h2) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з3) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299;(h3) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 299;

(з4) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 301;(h4) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 301;

(з5) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 302;(h5) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 302;

(з6) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304;(h6) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 304;

(з7) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, кото-(h7) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103, and a constant region that

- 16 041830 рая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306;- 16 041830 Paradise has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 306;

(з8) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307;(h8) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 307;

(з9) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309;(h9) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and a common L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 309;

(з10) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h10) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з11) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h11) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з12) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 215, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h12) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з13) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299;(h13) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 299;

(з14) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310;(h14) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 310;

(з15) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активно-(h15) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; H chain of an antibody that has a binding active

- 17 041830 стью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319;- 17 041830 with respect to the T-cell receptor complex, containing the variable region of the H chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, and the constant region, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 319;

(з16) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;(h16) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;

(з17) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299;(h17) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the general L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 299;

(з18) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(h18) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з19) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(h19) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з20) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(h20) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з21) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(h21) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з22) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;(h22) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity against glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з23) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет(h23) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, containing an antibody H chain variable region that has

- 18 041830 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223;- 18 041830 amino acid sequence of SEQ ID NO: 206, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(з24) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223; и (з25) биспецифическое антитело, имеющее H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 211, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, содержащую вариабельную область H-цепи антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168, и константную область, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или 62; и общую L-цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 223.(h24) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and the total L-chain of the antibody, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; and (h25) a bispecific antibody having an antibody H chain that has binding activity for glypican 3, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211, and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; An antibody H chain that has binding activity for a T cell receptor complex, comprising an antibody H chain variable region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168 and a constant region that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or 62 ; and a common antibody L chain which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223.

23. Нуклеиновая кислота, которая кодирует мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу по одному из пп.1-20 или биспецифическое антитело по п.21 или 22.23. A nucleic acid that encodes a multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 20 or a bispecific antibody according to claim 21 or 22.

24. Вектор, в который интродуцирована нуклеиновая кислота по п.23.24. A vector into which the nucleic acid of claim 23 has been introduced.

25. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.23 или вектор по п.24.25. A cell containing a nucleic acid according to claim 23 or a vector according to claim 24.

26. Способ получения мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы по одному из пп.1-20 или биспецифического антитела по п.21 или 22, заключающийся в том, что культивируют клетку по п.25.26. A method for producing a multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 20 or a bispecific antibody according to claim 21 or 22, which consists in culturing the cell according to claim 25.

27. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула или биспецифическое антитело, полученная/полученное способом по п.26.27. Multispecific antigen-binding molecule or bispecific antibody obtained/obtained by the method of claim 26.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу по одному из пп.1-20 или биспецифическое антитело по п.21 или 22 и фармацевтически приемлемый носитель.28. A pharmaceutical composition containing a multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1 to 20 or a bispecific antibody according to claim 21 or 22 and a pharmaceutically acceptable carrier.

29. Фармацевтическая композиция по п.28, которая индуцирует цитотоксичность.29. A pharmaceutical composition according to claim 28 which induces cytotoxicity.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, где цитотоксичность представляет собой зависимую от Т-клеток цитотоксичность.30. The pharmaceutical composition of claim 29, wherein the cytotoxicity is T-cell dependent cytotoxicity.

31. Фармацевтическая композиция по п.28, которая предназначена для введения пациенту, нуждающемуся в этом, мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы по одному из пп.1-20 или биспецифического антитела по п.21 или 22.31. A pharmaceutical composition according to claim 28, which is intended for administration to a patient in need of it, a multispecific antigen-binding molecule according to one of claims 1-20 or a bispecific antibody according to claim 21 or 22.

Настоящее изобретение относится также к набору, предназначенному для применения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, который содержат мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, или мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, полученную с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится также к применению мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, или мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, полученной с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, для приготовления фармацевтической композиции для активации цитотоксической активности. Настоящее изобретение относится также к мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в настоящем изобретении, или мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, полученной с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, для применения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении. В контексте настоящего описания мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы включают биспецифические антитела, предлагаемые в настоящем изобретении.The present invention also relates to a kit for use in the method of the present invention, which contains a multispecific antigen-binding molecule of the present invention, or a multispecific antigen-binding molecule obtained using the method of the present invention. The present invention also relates to the use of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention or the multispecific antigen-binding molecule obtained by the method of the present invention for preparing a pharmaceutical composition for activating cytotoxic activity. The present invention also relates to a multispecific antigen-binding molecule of the present invention or a multispecific antigen-binding molecule obtained by the method of the present invention for use in the method of the present invention. As used herein, multispecific antigen-binding molecules include the bispecific antibodies of the present invention.

Кроме того, настоящее изобретение относится к мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, которая содержит следующие домены:In addition, the present invention relates to a multispecific antigen-binding molecule that contains the following domains:

(1) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, (2) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора;(1) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for glypican 3; (2) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for a T-cell receptor complex;

в которой вариабельные области L-цепи, входящие в вариабельные области, указанные в подпунктах (1) и (2), имеют общую аминокислотную последовательность. Настоящее изобретение относится также к домену, указанному в подпункте (1), который более конкретно представляет собой домен, содержащий вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела, которые обладают связыin which the variable regions of the L chain included in the variable regions specified in subparagraphs (1) and (2) have a common amino acid sequence. The present invention also relates to the domain specified in subparagraph (1), which is more specifically a domain containing variable regions of the heavy chain and/or light chain of the antibody, which have binding

- 19 041830 вающей активностью в отношении глипикана 3, и которые входит в состав мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение относится также к домену, указанному в подпункте (2), который более конкретно представляет собой домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и который входит в состав мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы. Компоненты доменов, указанных в подпунктах (1) и (2), могут включать указанные выше в пп.1-22. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула может представлять собой биспецифическое антитело. Кроме того, мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула может содержать домен, включающий Fc-область и Fc-область может обладать пониженной активностью в отношении связывания Fcγ-рецептора. Компоненты домена, содержащего Fc-область, могут включать указанные выше в пп.1-22. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу или домены, вектору, в который интродуцирована нуклеиновая кислота, клетке, которая содержит нуклеиновую кислоту или вектор, способу получения мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, заключающемуся в том, что культивируют клетки, и мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле или доменам, которые содержат вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3 или связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, полученным с помощью способа. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может индуцировать повреждение клеток, повреждение клеток может быть обусловлено зависимой от Т-клеток клеточной цитотоксичностью, и композицию можно вводить пациенту, который нуждается в применении мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы.- 19 041830 activity against glypican 3, and which is part of a multispecific antigen-binding molecule. The present invention also relates to the domain specified in subparagraph (2), which is more specifically a domain containing the variable region of an antibody that has binding activity against the T-cell receptor complex, and which is part of a multispecific antigen-binding molecule. Components of the domains specified in subparagraphs (1) and (2) may include those specified in paragraphs 1-22 above. The multispecific antigen binding molecule may be a bispecific antibody. In addition, the multispecific antigen-binding molecule may contain a domain including an Fc region, and the Fc region may have reduced Fcγ receptor binding activity. Components of the domain containing the Fc region may include those mentioned in paragraphs 1-22 above. The present invention relates to a nucleic acid encoding a multispecific antigen-binding molecule or domains, a vector into which the nucleic acid is introduced, a cell that contains the nucleic acid or a vector, a method for producing a multispecific antigen-binding molecule, which consists in culturing the cells, and the multispecific antigen-binding molecule or domains that contain an antibody variable region that has glypican 3 binding activity or T-cell receptor complex binding activity obtained by the method. In addition, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a multispecific antigen-binding molecule and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition may induce cell injury, the cell injury may be due to T-cell dependent cellular cytotoxicity, and the composition may be administered to a patient in need of a multispecific antigen-binding molecule.

Настоящее изобретение относится также к мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, которая связывается с эпитопами, перекрывающимися и/или конкурирующими с эпитопами и глипикана 3, и комплекса Т-клеточного рецептора, связывающимися мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, указанной выше в одном из подпунктов (д1)-(д25) в п.14, мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, которая связывается с эпитопами, перекрывающимися и/или конкурирующими с эпитопами и глипикана 3, и комплекса Т-клеточного рецептора, связывающимися мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, указанной выше в одном из подпунктов (e1)-(e25) в п.15.The present invention also relates to a multispecific antigen-binding molecule that binds to epitopes overlapping and/or competing with both glypican 3 epitopes and the T-cell receptor complex bound by the multispecific antigen-binding molecule indicated in one of subparagraphs (e1) to (e25) above. in claim 14, a multispecific antigen-binding molecule that binds to epitopes overlapping and/or competing with epitopes of both glypican 3 and the T-cell receptor complex bound by the multispecific antigen-binding molecule specified in one of subparagraphs (e1)-(e25) above in paragraph 15.

Касательно двух Fc-областей, описанных выше в подпунктах (ж1) и (ж2) в п.20, первая Fc-область может быть включена в H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, а вторая Fc-область может быть включена в H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора; или первая Fc-область может быть включена в H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Тклеточного рецептора, а вторая Fc-область может быть включена в H-цепь антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3.With regard to the two Fc regions described in subparagraphs (g1) and (g2) of paragraph 20 above, the first Fc region may be included in the H chain of an antibody that has binding activity for glypican 3, and the second Fc region may be included in the H chain of an antibody that has binding activity for the T-cell receptor complex; or the first Fc region may be included in an antibody H chain that has binding activity for the T cell receptor complex, and the second Fc region may be included in an antibody H chain that has binding activity for glypican 3.

Эффекты изобретения.effects of the invention.

В настоящем изобретении предложены новые мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, имеющие молекулярные формы, которые можно получать с высокой эффективностью, которые сохраняют сильную противоопухолевую активность, характерную для BiTE, и очень хорошие характеристики безопасности, что приводит к отсутствию индукции независимого от ракового антигена цитокинового шторма и т.п., и обладают длительным временем полужизни в крови. Фармацевтические композиции, которые активируют цитотоксическую активность, содержащие в качестве действующего вещества мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, направленно воздействуют на раковые ткани, которые содержат экспрессирующие глипикан 3 раковые клетки, вызывая повреждение клеток, и их можно применять для лечения или предупреждения различных видов рака. Изобретение обеспечивает требуемое лечения, которое не только обладает высоким уровнем безопасности, но и снижает физическую нагрузку на пациентов и является очень удобным для пациентов.The present invention provides novel multispecific antigen-binding molecules having molecular forms that can be produced with high efficiency, which retain the strong antitumor activity characteristic of BiTE and very good safety characteristics, resulting in no induction of a cancer antigen-independent cytokine storm, etc. and have a long half-life in the blood. Pharmaceutical compositions that activate cytotoxic activity, containing the multispecific antigen-binding molecule of the present invention as an active ingredient, target cancer tissues that contain glypican 3 expressing cancer cells to cause cell damage, and can be used to treat or prevent various types of cancer. cancer. The invention provides the desired treatment, which not only has a high level of safety, but also reduces the physical burden on patients and is very convenient for patients.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На чертежах показано:The drawings show:

на фиг 1 - схематическая диаграмма a: ERY22 и б: ERY27;Fig 1 is a schematic diagram of a: ERY22 and b: ERY27;

на фиг. 2 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность GPC3_ERY22_rCE115 и GPC3_ERY27_hCE115 при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446. Закрашенными ромбами (♦) и закрашенными треугольниками (▲) обозначена цитотоксическая активность GPC3_ERY22_rCE115 и GPC3_ERY27_hCE115 соответственно;in fig. 2 is a graph illustrating the cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 and GPC3_ERY27_hCE115 when used as an NCI-H446 target cell. Solid diamonds (♦) and solid triangles (▲) indicate the cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 and GPC3_ERY27_hCE115, respectively;

на фиг. 3 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность GPC3_ERY22_rCE115 и GPC3_ERY27_hCE115 при применении в качестве клетки-мишени РС-10. Закрашенными ромбами (♦) и закрашенными треугольниками (▲) обозначена цитотоксическая активность GPC3_ERY22_rCE115 и GPC3_ERY27_hCE115 соответственно;in fig. 3 is a graph illustrating the cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 and GPC3_ERY27_hCE115 when used as a PC-10 target cell. Solid diamonds (♦) and solid triangles (▲) indicate the cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 and GPC3_ERY27_hCE115, respectively;

на фиг. 4 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител приin fig. 4 is a graph illustrating the cytotoxic activity of optimized antibodies in

- 20 041830 применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;- 20 041830 use as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 5 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 5 is a graph illustrating the cytotoxic activity of the optimized antibodies when used as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 6 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 6 is a graph illustrating the cytotoxic activity of the optimized antibodies when used as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 7 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 7 is a graph illustrating the cytotoxic activity of the optimized antibodies when used as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 8 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 8 is a graph illustrating the cytotoxic activity of the optimized antibodies when used as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 9 - график, иллюстрирующий цитотоксическую активность оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 9 is a graph illustrating the cytotoxic activity of the optimized antibodies when used as an NCI-H446 target cell;

на фиг. 10 - данные о противоопухолевой активности in vivo оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени PC-10;in fig. 10 shows in vivo antitumor activity data of the optimized antibodies when used as a PC-10 target cell;

на фиг. 11 - данные о противоопухолевой активности in vivo оптимизированных антител при применении в качестве клетки-мишени NCI-H446;in fig. 11 shows in vivo antitumor activity data of the optimized antibodies when used as the NCI-H446 target cell;

на фиг. 12 - зависимость между аминокислотными остатками, образующими Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и системой нумерации EU по Кэботу (обозначена в контексте настоящего описания как EUиндекс);in fig. 12 shows the relationship between the amino acid residues forming the Fc regions of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and the EU numbering system according to Cabot (referred to in the context of this description as the EU index);

на фиг. 13-1 - последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и их нумерация согласно Кэботу с соавт.;in fig. 13-1 - sequences of heavy chain variable regions and their numbering according to Cabot et al.;

на фиг. 13-2 - последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и их нумерация согласно Кэботу с соавт.;in fig. 13-2 - sequences of heavy chain variable regions and their numbering according to Cabot et al.;

на фиг. 14 - последовательности вариабельных областей легкой цепи и их нумерация согласно Кэботу с соавт.in fig. 14 - sequences of light chain variable regions and their numbering according to Cabot et al.

Варианты осуществления изобретенияEmbodiments of the invention

Представленные ниже определения даны с целью облегчения понимания настоящего изобретения. Антитело.The following definitions are given to facilitate understanding of the present invention. Antibody.

В контексте настоящего описания антитело относится к встречающемуся в естественных условиях иммуноглобулину или иммуноглобулину, полученному полностью или частично путем синтеза. Антитела можно выделять из встречающихся в естественных условиях источников, таких как встречающиеся в естественных условиях плазма и сыворотка, или из супернатантов культур продуцирующих антитела гибридом. Альтернативно этому, антитела можно частично или полностью синтезировать с использованием таких методик, как генетическая рекомбинация. Предпочтительными антителами являются, например, антитела, принадлежащие к какому-либо изотипу иммуноглобулинов или его подклассу. Известные человеческие иммуноглобулины включают антитела следующих девяти классов (изотипов): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. Из этих изотипов к антителам, предлагаемым в изобретении, относятся IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.In the context of the present description, an antibody refers to a naturally occurring immunoglobulin or an immunoglobulin obtained in whole or in part by synthesis. Antibodies can be isolated from naturally occurring sources, such as naturally occurring plasma and serum, or from culture supernatants of antibody-producing hybridomas. Alternatively, antibodies can be partially or completely synthesized using techniques such as genetic recombination. Preferred antibodies are, for example, antibodies belonging to any immunoglobulin isotype or subclass thereof. Known human immunoglobulins include antibodies of the following nine classes (isotypes): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, and IgM. Of these isotypes, the antibodies of the invention include IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.

Методы получения антитела с требуемой связывающей активностью известны специалистам в данной области. Ниже представлен пример, в котором описан метод получения антитела (антитело к GPC3), связывающегося с глипиканом-3 (ниже в настоящем описании обозначен как GPC3), который принадлежит к семейству GPI-заякоренных рецепторов (Int J Cancer. 103(4), 2003, с. 455-465). Согласно описанному ниже примеру можно получать также антитела, которые связываются с комплексом Т-клеточного рецептора.Methods for obtaining an antibody with the desired binding activity are known to those skilled in the art. The following is an example that describes a method for producing an antibody (anti-GPC3 antibody) that binds to glypican-3 (hereinafter referred to as GPC3), which belongs to the family of GPI-anchored receptors (Int J Cancer. 103(4), 2003 , pp. 455-465). According to the example described below, it is also possible to obtain antibodies that bind to the T-cell receptor complex.

Антитела к GPC3 можно получать в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известных методов. Антитела к GPC3 предпочтительно получали в виде моноклональных антител, происходящих из организма млекопитающих. Указанные происходящие из организма млекопитающих антитела включают антитела, полученные с помощью гибридом или клеток-хозяев, трансформированных экспрессионным вектором, который несет ген антитела, с помощью методов генетической инженерии.Anti-GPC3 antibodies can be obtained as polyclonal or monoclonal antibodies using known methods. Anti-GPC3 antibodies are preferably obtained as monoclonal antibodies derived from a mammalian organism. Said mammalian-derived antibodies include antibodies produced by hybridomas or host cells transformed with an expression vector that carries the antibody gene using genetic engineering techniques.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, можно получать с использованием известных методов, например, описанных ниже. В частности, млекопитающих иммунизируют с помощью общепринятых методов иммунизации, используя белок GPC3 в качестве сенсибилизирующего антигена. Образовавшиеся иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками с помощью общепринятых методов слияния. Затем гибридомы, продуцирующие антитело к GPC3, можно отбирать путем скрининга в отношении продуцирующих моноклональные антитела клеток с помощью общепринятых методов скрининга.Hybridomas producing monoclonal antibodies can be obtained using known methods, such as those described below. In particular, mammals are immunized using conventional immunization methods using the GPC3 protein as a sensitizing antigen. The resulting immune cells are fused with known parental cells using conventional fusion techniques. Anti-GPC3 antibody producing hybridomas can then be selected by screening for monoclonal antibody producing cells using conventional screening methods.

В частности, моноклональные антитела получают согласно описанному ниже методу. Сначала ген GPC3, нуклеотидная последовательность которого представлена в RefSeq под регистрационным номером NM_001164617.1 (SEQ ID NO: 1), можно экспрессировать с получением белка GPC3, последовательность которого представлена в RefSeq под регистрационным номером NP001158089.1 (SEQ ID NO: 2), который можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела. Для этого генную последовательность, кодирующую GPC3, встраивают в известный экспрессионный вектор и соответст- 21 041830 вующие клетки-хозяева трансформируют этим вектором. Требуемый человеческий белок GPC3 очищают из клеток-хозяев или супернатантов культур с помощью известных методов. Например, для получения растворимого GPC3 из супернатантов культур удаляют путем делеции аминокислоты в положениях 564580, которые формируют гидрофобную область, соответствующую GPI-заякоривающей последовательности, применяемой для заякоривания GPC3 на клеточной мембране, из полипептидной последовательности GPC3 SEQ ID NO: 2, а затем образовавшийся белок экспрессируют вместо белка GPC3, имеющего SEQ ID NO: 2. В альтернативном варианте в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять очищенный встречающийся в естественных условиях белок GPC3.In particular, monoclonal antibodies are obtained according to the method described below. First, the GPC3 gene, the nucleotide sequence of which is presented in RefSeq under accession number NM_001164617.1 (SEQ ID NO: 1), can be expressed to obtain a GPC3 protein, the sequence of which is presented in RefSeq under accession number NP001158089.1 (SEQ ID NO: 2), which can be used as a sensitizing antigen to produce an antibody. To do this, the gene sequence encoding GPC3 is inserted into a known expression vector and the appropriate host cells are transformed with this vector. The desired human GPC3 protein is purified from host cells or culture supernatants using known methods. For example, to obtain soluble GPC3 from culture supernatants, it is removed by deleting the amino acid at positions 564580, which form the hydrophobic region corresponding to the GPI anchoring sequence used to anchor GPC3 to the cell membrane, from the GPC3 polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, and then the resulting protein expressed instead of the GPC3 protein having SEQ ID NO: 2. Alternatively, a purified naturally occurring GPC3 protein can be used as the sensitizing antigen.

Очищенный белок GPC3 можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации млекопитающих. В качестве сенсибилизирующих антигенов можно применять также неполные пептиды GPC3. В этом случае неполные пептиды можно получать химическим синтезом на основе аминокислотной последовательности человеческого GPC3. Кроме того, их можно получать также путем встраивания части гена GPC3 в экспрессионный вектор и осуществлять экспрессию в нем. Кроме того, их можно получать путем расщепления белка GPC3 протеазой, однако конкретный вариант осуществления изобретения не накладывает ограничения на длину и область пептида GPC3, применяемого в качестве неполного пептида. В качестве предпочтительной области можно выбирать любую последовательность из аминокислотной последовательности, которая соответствует аминокислотам в положениях 524563, или более предпочтительно любую последовательность из аминокислотной последовательности, которая соответствует аминокислотам в положениях 537-563 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Предпочтительно можно выбирать любую последовательность из аминокислотной последовательности области, не содержащую аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотам в положениях 550-663 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Предпочтительно можно выбирать любую последовательность, соответствующую положениям 544-553, и более предпочтительно можно выбирать любую последовательность из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 546-551, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Количество аминокислот, образующих пептид, который можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена, предпочтительно составляет по меньшей мере пять или более, или предпочтительно, например, шесть или более, или семь или более. Более конкретно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять пептид, состоящий из 8-50 остатков, более предпочтительно из 10-30 остатков.The purified GPC3 protein can be used as a sensitizing antigen for mammalian immunization. Partial GPC3 peptides can also be used as sensitizing antigens. In this case, partial peptides can be obtained by chemical synthesis based on the amino acid sequence of human GPC3. In addition, they can also be obtained by inserting a portion of the GPC3 gene into an expression vector and expressing therein. In addition, they can be obtained by cleavage of the GPC3 protein with a protease, however, a particular embodiment of the invention does not impose restrictions on the length and area of the GPC3 peptide used as a partial peptide. Any sequence from the amino acid sequence that corresponds to the amino acids at positions 524563, or more preferably any sequence from the amino acid sequence that corresponds to the amino acids at positions 537-563 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, can be selected as the preferred region. Preferably, any sequence can be selected from the amino acid sequence of a region that does not contain the amino acid sequence that corresponds to the amino acids at positions 550-663 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Preferably, any sequence corresponding to positions 544-553 can be selected, and more preferably, any sequence can be selected from the amino acid sequence, corresponding to positions 546-551, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The number of amino acids forming a peptide that can be used as a sensitizing th antigen is preferably at least five or more, or preferably, for example, six or more, or seven or more. More specifically, a peptide consisting of 8-50 residues, more preferably 10-30 residues, can be used as the sensitizing antigen.

В альтернативном варианте в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять слитый белок, полученный путем слияния требуемого неполного полипептида или пептида белка GPC3, с другим полипептидом. Например, для получения слитых белков, предназначенных для применения в качестве сенсибилизирующих антигенов, предпочтительно применяют Fc-фрагменты антитела и пептидные метки. Векторы для экспрессии указанных слитых белков можно конструировать путем слияния в рамке считывания генов, кодирующих два или большее количество требуемых полипептидных фрагментов, и встраивания слитого гена в экспрессионный вектор, описанный выше. Методы получения слитых белков описаны в Molecular Cloning, 2-е изд. (Sambrook J. и др., Molecular Cloning, 2-ое изд. 1989, 9.47-9.58, издво Cold Spring Harbor Lab. Press). Методы получения GPC3, предназначенного для применения в качестве сенсибилизирующего антигена, и методы иммунизации с использованием GPC3 конкретно описаны в WO 2003/000883, WO 2004/022754 и WO 2006/006693.Alternatively, a fusion protein obtained by fusing the desired partial polypeptide or GPC3 protein peptide with another polypeptide can be used as the sensitizing antigen. For example, antibody Fc fragments and peptide tags are preferably used to produce fusion proteins for use as sensitizing antigens. Vectors for the expression of these fusion proteins can be constructed by fusing in frame the genes encoding two or more of the desired polypeptide fragments and inserting the fusion gene into the expression vector described above. Methods for making fusion proteins are described in Molecular Cloning, 2nd ed. (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, 2nd ed. 1989, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press). Methods for producing GPC3 for use as a sensitizing antigen and immunization methods using GPC3 are specifically described in WO 2003/000883, WO 2004/022754 and WO 2006/006693.

Конкретное ограничение, касающееся млекопитающих, подлежащих иммунизации с помощью сенсибилизирующего антигена, отсутствует. Однако предпочтительно выбирать млекопитающих с учетом их совместимости с родительскими клетками, применяемыми для клеточного слияния. В целом, предпочтительно применяют грызунов, таких как мыши, крысы, а также хомяки, кролики, и обезьян.There is no particular limitation regarding mammals to be immunized with the sensitizing antigen. However, it is preferable to select mammals based on their compatibility with the parental cells used for cell fusion. In general, rodents such as mice, rats, as well as hamsters, rabbits, and monkeys are preferably used.

Вышеуказанных животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном с помощью известных методов. Общепринятыми методами иммунизации млекопитающих являются, например, внутрибрюшинная или подкожная инъекция сенсибилизирующего антигена. В частности, сенсибилизирующий антиген можно соответствующим образом разводить в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор), физиологическом соляном растворе или т.п. При необходимости с антигеном смешивают общепринятый адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда, и смесь эмульгируют. Затем сенсибилизирующий антиген вводят млекопитающему несколько раз с 4-21-дневными интервалами. При иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать соответствующие носители. В частности, когда в качестве сенсибилизирующего антигена используют низкомолекулярный неполный пептид, то иногда для иммунизации требуется сочетать пептид, представляющий собой сенсибилизирующий антиген, с белком-носителем, таким как альбумин или гемоцианин лимфы улитки.The above animals are immunized with the sensitizing antigen using known methods. Conventional methods for immunizing mammals are, for example, intraperitoneal or subcutaneous injection of a sensitizing antigen. In particular, the sensitizing antigen can be appropriately diluted in PBS (phosphate buffered saline), physiological saline or the like. If necessary, a conventional adjuvant such as Freund's complete adjuvant is mixed with the antigen and the mixture is emulsified. The sensitizing antigen is then administered to the mammal several times at 4-21 day intervals. When immunized with a sensitizing antigen, appropriate carriers may be used. In particular, when a low molecular weight partial peptide is used as the sensitizing antigen, it is sometimes required for immunization to combine the peptide representing the sensitizing antigen with a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.

Альтернативно этому, можно получать продуцирующие требуемое антитело гибридомы с помощью описанной ниже ДНК-иммунизации. ДНК-иммунизация представляет собой метод иммунизации, который обеспечивает иммуностимуляцию посредством экспрессии сенсибилизирующего антигена в организме иммунизированного животного в результате введения ДНК-вектора, сконструированного таким образом, чтобы он обеспечивал экспрессию гена, кодирующего антигенный белок, в организме животного. По сравнению с общепринятыми методами иммунизации, при которых животным, подлежащим иммунизации, вводят белковый антиген, ДНК-иммунизация, по-видимому, имеет следующие преимущест- 22 041830 ва:Alternatively, hybridomas producing the desired antibody can be obtained using the DNA immunization described below. DNA immunization is an immunization method that provides immunostimulation through the expression of a sensitizing antigen in the body of an immunized animal by introducing a DNA vector designed in such a way that it provides the expression of a gene encoding an antigenic protein in the body of an animal. Compared to conventional immunization methods, in which a protein antigen is administered to the animals to be immunized, DNA immunization appears to have the following advantages:

можно осуществлять иммуностимуляцию, сохраняя при этом структуру мембранного белка, такого как GPC3; и отсутствует необходимость в очистке антигена для иммунизации.immunostimulation can be performed while maintaining the structure of a membrane protein such as GPC3; and there is no need to purify the antigen for immunization.

Для получения моноклонального антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, с использованием ДНК-иммунизации сначала вводят животному, подлежащему иммунизации, ДНК, экспрессирующую белок GPC3. ДНК, кодирующую GPC3, можно синтезировать с помощью известных методов, таких как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в соответствующий экспрессионный вектор и затем его вводят животному, подлежащему иммунизации. Предпочтительно применяемые для этой цели экспрессионные векторы включают, например, поступающие в продажу экспрессионные векторы, такие как pcDNA3.1. Векторы можно вводить в организм с помощью общепринятых методов. Например, ДНК-иммунизацию осуществляют с использованием генной пушки для интродукции золотых частиц, покрытых экспрессионным вектором, в клетки тела животного, подлежащего иммунизации. Антитела, распознающие GPC3, можно получать также методами, описанными в WO 2003/104453. После описанной выше иммунизации млекопитающего у него подтверждают в сыворотке повышенный титр GPC3-связывающего антитела. После этого получают из организма млекопитающего иммунные клетки и затем используют их для клеточного слияния. В частности, в качестве иммунных клеток предпочтительно применяют спленоциты.To obtain a monoclonal antibody of the present invention using DNA immunization, DNA expressing the GPC3 protein is first administered to the animal to be immunized. DNA encoding GPC3 can be synthesized using known methods such as PCR. The resulting DNA is inserted into an appropriate expression vector and then it is administered to the animal to be immunized. Preferably used expression vectors for this purpose include, for example, commercially available expression vectors such as pcDNA3.1. Vectors can be introduced into the body using conventional methods. For example, DNA immunization is carried out using a gene gun to introduce gold particles coated with an expression vector into the body cells of an animal to be immunized. Antibodies recognizing GPC3 can also be obtained by the methods described in WO 2003/104453. After immunizing a mammal as described above, an elevated serum titer of GPC3-binding antibody is confirmed in the mammal. Thereafter, immune cells are obtained from the body of a mammal and then used for cell fusion. In particular, splenocytes are preferably used as immune cells.

Клетку миеломы млекопитающих применяют в качестве клетки, подлежащей слиянию с вышеуказанным иммуноцитом. Клетки миеломы предпочтительно содержат приемлемый маркер селекции для скрининга. Маркер селекции придает клеткам характеристики, обеспечивающие их выживание (или гибель) в специфических условиях культивирования. В качестве маркера селекции известны дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (сокращенно обозначенный далее в контексте настоящего описания как дефицит HGPRT) и дефицит тимидинкиназы (сокращенно обозначенный далее в контексте настоящего описания как дефицит ТК). Клетки с дефицитом HGPRT или ТК обладают чувствительностью к гипоксантин-аминоптерин-тимидину (сокращенно обозначена далее в контексте настоящего описания как ГАТ-чувствительность). Клетки с ГАТ-чувствительностью не могут синтезировать ДНК в селекционной ГАТ-среде и в результате погибают. Однако, когда клетки сливают со здоровыми клетками, они могут продолжать синтез ДНК с использованием реутилизационного пути здоровых клеток, и в результате они могут расти даже в селекционной ГАТ-среде.A mammalian myeloma cell is used as a cell to be fused with the above immunocyte. Myeloma cells preferably contain an acceptable selection marker for screening. The selection marker gives the cells characteristics that ensure their survival (or death) under specific culture conditions. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency (abbreviated hereinafter as HGPRT deficiency) and thymidine kinase deficiency (abbreviated hereinafter as TK deficiency) are known as a selection marker. Cells deficient in HGPRT or TK are sensitive to hypoxanthine-aminopterin-thymidine (abbreviated hereinafter as HAT-sensitivity). Cells with GAT-sensitivity cannot synthesize DNA in the GAT selection medium and die as a result. However, when cells are fused with healthy cells, they can continue DNA synthesis using the healthy cell recycling pathway, and as a result, they can grow even in HAT selection media.

Клетки с HGPRT-дефицитом и ТК-дефицитом можно отбирать в среде, содержащей 6-тиогуанин, 8азагуанин (сокращенно обозначенный далее в контексте настоящего описания как 8AG) или 5'бромдезоксиуридин соответственно. Здоровые клетки уничтожаются, поскольку они включают эти пиримидиновые аналоги в их ДНК. При этом клетки с дефицитом этих ферментов могут выживать в селекционной среде, поскольку они не могут включать указанные пиримидиновые аналоги. Кроме того, к маркеру селекции относится устойчивость к G418, которая обеспечивается геном устойчивости к неомицину, придающим устойчивость к 2-дезоксистрептаминовым антибиотикам (аналоги гентамицина). Известны различные типы клеток миелом, которые можно применять для клеточного слияния.HGPRT-deficient and TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6-thioguanine, 8azaguanine (abbreviated hereinafter as 8AG) or 5'bromodeoxyuridine, respectively. Healthy cells are destroyed as they incorporate these pyrimidine analogs into their DNA. However, cells deficient in these enzymes can survive in the selection medium, since they cannot include these pyrimidine analogs. In addition, the selection marker includes resistance to G418, which is provided by the neomycin resistance gene, conferring resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogues). Various types of myeloma cells are known that can be used for cell fusion.

Например, в качестве клеток миеломы предпочтительно можно применять следующие клетки:For example, the following cells can preferably be used as myeloma cells:

P3(P3x63 Ag8.653) (J. Immunol. 123 (4), 1979, сс. 1548-1550);P3(P3x63 Ag8.653) (J. Immunol. 123 (4), 1979, pp. 1548-1550);

P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1978, cc.P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1978, pp.

1-Ό;1-Ό;

NS-l (C. Eur. J. Immunol. 6 (7), 1976, cc. 511-519);NS-l (C. Eur. J. Immunol. 6 (7), 1976, pp. 511-519);

MPC-11 (Cell 8 (3), 1976, cc. 405-415);MPC-11 (Cell 8 (3), 1976, pp. 405-415);

SP2/0 (Nature 276 (5685), 1978, cc. 269-270);SP2/0 (Nature 276 (5685), 1978, pp. 269-270);

FO (J. Immunol. Methods 35 (1-2), 1980, cc. 1-21);FO (J. Immunol. Methods 35 (1-2), 1980, pp. 1-21);

S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. 148 (1), 1978, cc. 313-323);S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. 148(1), 1978, pp. 313-323);

R210 (Nature 277 (5692), 1979, cc. 131-133) и т.д.R210 (Nature 277 (5692), 1979, pp. 131-133), etc.

Клеточное слияние иммуноцитов и клеток миеломы, как правило, осуществляют с помощью известных методов, например метода, описанного у Kohler и Milstein и др. (Methods Enzymol. 73, 1981, с. 346).Cellular fusion of immunocytes and myeloma cells is generally carried out using known methods, for example the method described by Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. 73, 1981, p. 346).

Более конкретно, клеточное слияние можно осуществлять, например, в общепринятой культуральной среде в присутствии усиливающего клеточное слияние агента. Усиливающие клеточное слияние агенты включают, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и вирус Сендай (гемагглютинирующий японский вирус мышей) (HVJ). При необходимости для повышения эффективности слияния добавляют также вспомогательную субстанцию, такую как диметилсульфоксид.More specifically, cell fusion can be performed, for example, in a conventional culture medium in the presence of a cell fusion enhancing agent. Cell fusion enhancing agents include, for example, polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus (mouse haemagglutinating virus of Japan) (HVJ). If necessary, an auxiliary substance, such as dimethyl sulfoxide, is also added to improve the efficiency of the fusion.

Соотношение иммуноцитов и клеток миеломы можно определять по усмотрению исследователя, предпочтительно, например, одна клетка миеломы на каждые 1-10 иммуноцитов. Культуральные среды, применяемые для клеточных слияний, включают, например, среды, пригодные для выращивания клеточных линий миелом, такие как среда RPMI1640 и среда MEM, а также другая общепринятая культуральная среда, применяемая для данного типа клеточной культуры. Кроме того, в культуральную среду пред- 23 041830 почтительно можно добавлять добавки в виде сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (FCS).The ratio of immunocytes to myeloma cells can be determined at the discretion of the investigator, preferably, for example, one myeloma cell for every 1-10 immunocytes. Culture media used for cell fusions include, for example, media suitable for growing myeloma cell lines such as RPMI1640 media and MEM media, as well as other conventional culture media used for this type of cell culture. Additionally, serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can preferably be added to the culture medium.

Для клеточного слияния указанные выше иммунные клетки и клетки миеломы, взятые в предварительно определенных количествах, хорошо перемешивают в указанной выше культуральной среде. Затем к ней добавляют предварительно нагретый до температуры примерно 37°С раствор ПЭГ (например, средняя молекулярная масса которого составляет примерно от 1000 до 6000) в концентрации, составляющей, как правило, от 30 до 60 мас./об.%. Смесь осторожно перемешивают до получения требуемых слитых клеток (гибридомы). Затем указанную выше культуральную среду постепенно добавляют к клеткам и повторно центрифугируют для удаления супернатанта. Таким путем можно удалять агенты для клеточного слияния, которые являются нежелательными для роста гибридом.For cell fusion, the above immune cells and myeloma cells, taken in predetermined amounts, are well mixed in the above culture medium. Then, a PEG solution (eg, average molecular weight of about 1000 to 6000) preheated to about 37° C. is added thereto at a concentration typically between 30 and 60 w/v%. The mixture is gently stirred until the desired confluent cells (hybridomas) are obtained. Then, the above culture medium is gradually added to the cells and centrifuged again to remove the supernatant. In this way, fusion agents that are undesirable for hybridoma growth can be removed.

Полученные таким образом гибридомы можно отбирать путем культивирования, используя общепринятую селективную среду, например ГАТ-среду (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, отличные от требуемых гибридом (неслитые клетки), можно уничтожать путем последующего культивирования в вышеуказанной ГАТ-среде в течение достаточного периода времени. Как правило, период составляет от нескольких дней до нескольких недель. Затем осуществляют скрининг гибридом, продуцирующих требуемое антитело, и по отдельности клонируют с помощью общепринятых методов серийных разведений.The hybridomas thus obtained can be selected by culturing using a conventional selective medium such as HAT medium (culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Cells other than the desired hybridomas (non-fused cells) can be killed by subsequent culturing in the above HAT medium for a sufficient period of time. As a rule, the period is from several days to several weeks. Hybridomas producing the desired antibody are then screened for and individually cloned using conventional serial dilution techniques.

Полученные таким образом гибридромы можно отбирать, используя селекционную среду на основе маркера селекции, который несут клетки миеломы, применяемые для клеточного слияния. Например, клетки с HGPRT-или ТК-дефицитом можно отбирать путем культивирования с использованием ГАТсреды (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). А в частности, когда для клеточного слияния используют чувствительные к ГАТ клетки миеломы, то клетки, для которых характерно успешное слияние со здоровыми клетками, могут избирательно размножаться в ГАТ-среде. Клетки, отличные от требуемых гибридом (неслитые клетки), можно уничтожать путем культивирования в вышеуказанной ГАТ-среде в течение достаточного периода времени. В частности, требуемые гибридомы можно отбирать путем культивирования, как правило, в течение периода времени, составляющего от нескольких дней до нескольких недель. Затем осуществляют скрининг гибридом, продуцирующих требуемое антитело, и по отдельности клонируют с помощью общепринятых методов серийных разведений.The hybridomas thus obtained can be selected using a selection medium based on a selection marker carried by the myeloma cells used for cell fusion. For example, HGPRT- or TK-deficient cells can be selected by culturing using HAT medium (culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). In particular, when HAT-responsive myeloma cells are used for cell fusion, cells that successfully fuse with healthy cells can selectively proliferate in the HAT medium. Cells other than the desired hybridomas (non-fused cells) can be killed by culturing in the above HAT medium for a sufficient period of time. In particular, the desired hybridomas can be selected by culturing, typically for a period of time ranging from several days to several weeks. Hybridomas producing the desired antibody are then screened for and individually cloned using conventional serial dilution techniques.

Требуемые антитела предпочтительно можно отбирать и по отдельности клонировать с помощью методов скрининга, основанных на известной реакции антиген/антитело. Например, GPC3-связывающее моноклональное антитело может связываться с GPC3, экспрессируемым на клеточной поверхности. Можно осуществлять скрининг указанных моноклональных антител с помощью метода разделения клеток на основе возбуждения флуоресценции (FACS). FACS представляет собой систему, которая позволяет оценивать связывание антитела с клеточной поверхностью посредством анализа клеток, контактирующих с флуоресцентным антителом, с использованием лазерного пучка, и путем оценки флуоресценции, испускаемой индивидуальными клетками.Desired antibodies can preferably be selected and individually cloned using screening methods based on a known antigen/antibody reaction. For example, a GPC3-binding monoclonal antibody can bind to GPC3 expressed on a cell surface. You can screen these monoclonal antibodies using the method of cell separation based on fluorescence excitation (FACS). FACS is a system that evaluates antibody cell surface binding by analyzing cells in contact with a fluorescent antibody using a laser beam and by assessing the fluorescence emitted by individual cells.

Для скрининга с использованием FACS в отношении гибридом, которые продуцируют моноклональное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, прежде всего получают экспрессирующие GPC3 клетки. Клетки, которые предпочтительно используют для скрининга, представляют собой клетки млекопитающих, в которых происходит принудительная экспрессия GPC3. В качестве контроля можно избирательно определять с использованием нетрансформированных клеток млекопитающих в качестве клеток-хозяев способность антитела связываться с расположенным на клеточной поверхности GPC3. В частности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к GPC3, можно выделять путем отбора гибридом, которые продуцируют антитело, связывающееся с клетками, принудительно экспрессирующими GPC3, но не с клетками-хозяевами.For FACS screening for hybridomas that produce the monoclonal antibody of the present invention, GPC3 expressing cells are first obtained. Cells that are preferably used for screening are mammalian cells in which GPC3 is forced to be expressed. As a control, the ability of an antibody to bind to cell surface GPC3 can be selectively determined using non-transformed mammalian cells as host cells. In particular, anti-GPC3 monoclonal antibody-producing hybridomas can be isolated by selecting hybridomas that produce an antibody that binds to cells forcibly expressing GPC3 but not to host cells.

Альтернативно этому, способность антитела связываться с иммобилизованными экспрессирующими GPC3 клетками можно оценивать на основе принципа ELISA. Например, экспрессирующие GPC3 клетки иммобилизуют на лунках планшета для ELISA. Супернатанты культур гибридом приводят в контакт с иммобилизованными клетками в лунках и выявляют антитела, которые связываются с иммобилизованными клетками. Когда моноклональные антитела имеют мышиное происхождение, то антитела, связанные с клетками, можно выявлять с помощью антитела к мышиному иммуноглобулину. Гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, которое обладает антигенсвязывающей активностью, отбирают путем описанного выше скрининга, и их можно клонировать методом серийных разведений или аналогичным методом.Alternatively, the ability of an antibody to bind to immobilized GPC3 expressing cells can be assessed based on the ELISA principle. For example, GPC3 expressing cells are immobilized on the wells of an ELISA plate. Hybridoma culture supernatants are brought into contact with the immobilized cells in the wells and antibodies are detected that bind to the immobilized cells. When the monoclonal antibodies are of murine origin, the cell-bound antibodies can be detected with an anti-mouse immunoglobulin antibody. Hybridomas producing the desired antibody that has antigen-binding activity are selected by the screening described above and can be cloned by serial dilution or the like.

Полученные таким путем гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, можно пересевать в общепринятую культуральную среду и хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.Monoclonal antibody-producing hybridomas thus obtained can be subcultured into a conventional culture medium and stored in liquid nitrogen for an extended period of time.

Указанные выше гибридомы культивируют с помощью общепринятого метода и требуемые моноклональные антитела можно получать из супернатантов культур. Альтернативно этому, гибридомы интродуцируют и выращивают в пригодных для этой цели млекопитающих, и моноклональные антитела получают из асцитов. Первый метод пригоден для получения антител с высокой степенью чистоты.The above hybridomas are cultured using a conventional method and the desired monoclonal antibodies can be obtained from culture supernatants. Alternatively, hybridomas are introduced and grown in suitable mammals and monoclonal antibodies are obtained from ascites. The first method is suitable for obtaining antibodies with a high degree of purity.

Предпочтительно можно применять также антитела, кодируемые генами антител, которые клонированы из продуцирующих антитела клеток, таких как указанные выше гибридомы. Клонированный генPreferably, antibodies encoded by antibody genes that are cloned from antibody-producing cells, such as the aforementioned hybridomas, can also be used. cloned gene

- 24 041830 антитела встраивают в соответствующий вектор и его интродуцируют в хозяина для экспрессии кодируемого геном антитела. Методы выделения генов антител, встраивания генов в векторы и трансформации клеток-хозяев разработаны ранее (см., например, Vandamme и др., Eur. J. Biochem. 192(3), 1990, c.- 24 041830 antibodies are inserted into the appropriate vector and introduced into the host for expression of the antibody encoded by the gene. Techniques for isolating antibody genes, inserting genes into vectors, and transforming host cells have been developed (see, for example, Vandamme et al., Eur. J. Biochem. 192(3), 1990, p.

767-775). Методы получения рекомбинантных антител также известны и описаны ниже.767-775). Methods for obtaining recombinant antibodies are also known and are described below.

Например, кДНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела к GPC3, получают из клеток гибридомы, экспрессирующих антитело к GPC3. Для этой цели сначала из гибридом экстрагируют общую РНК. Методы, которые применяют для экстракции мРНК из клеток, включают, например: метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Biochemistry 18(24), 1979, с. 5294-5299) и AGPC-метод (Anal. Biochem. 162(1), 1987, с. 156-159). Экстрагированные мРНК можно очищать с помощью набора для очистки мРНК (фирма GE Healthcare Bioscience) или аналогичного набора. В качестве альтернативы можно применять также поступающие в продажу наборы для экстракции мРНК непосредственно из клеток, такие как набор для очистки мРНК QuickPrep (фирма GE Healthcare Bioscience). мРНК можно получать из гибридом с использованием таких наборов. Кодирующие V-область антитела кДНК можно синтезировать из полученных мРНК с помощью обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК, содержащего обратную транскриптазу AMV (Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit) (фирма Seikagaku Co.) или аналогичного набора. Кроме того, для синтеза и амплификации кДНК можно применять набор для амплификации кДНК SMART RACE (фирма Clontech) и основанный на ПЦР 5'δАСЕ-(быстрая амплификация концов кДНК)метод (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23), 1988, с. 8998-9002; Nucleic Acids Res. 17(8), 1989, с. 2919-2932). При таком процессе синтеза кДНК соответствующие описанные ниже сайты, распознаваемые рестриктазами, можно интродуцировать на оба конца кДНК.For example, cDNA encoding the variable region (V region) of an anti-GPC3 antibody is obtained from hybridoma cells expressing an anti-GPC3 antibody. For this purpose, total RNA is first extracted from hybridomas. Methods that are used to extract mRNA from cells include, for example: the ultracentrifugation method in the presence of guanidine (Biochemistry 18(24), 1979, pp. 5294-5299) and the AGPC method (Anal. Biochem. 162(1), 1987, pp. 156-159). The extracted mRNAs can be purified using an mRNA purification kit (GE Healthcare Bioscience) or a similar kit. Alternatively, commercially available kits for extracting mRNA directly from cells, such as the QuickPrep mRNA purification kit (GE Healthcare Bioscience) can also be used. mRNA can be obtained from hybridomas using such kits. V-region-encoding cDNA antibodies can be synthesized from the resulting mRNAs using reverse transcriptase. cDNA can be synthesized using a Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (AMV) (Seikagaku Co.) or the like. In addition, the SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) and the PCR-based 5'δACE (rapid amplification of cDNA ends) method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(23), 1988, pp. 8998-9002; Nucleic Acids Res. 17(8), 1989, pp. 2919-2932). With this cDNA synthesis process, the appropriate restriction enzyme recognition sites described below can be introduced at both ends of the cDNA.

Представляющий интерес фрагмент кДНК очищают из полученного ПЦР-продукта и затем его встраивают путем лигирования в ДНК-вектор. Таким путем создают рекомбинантный вектор и интродуцируют в Е. coli или подобного хозяина. После селекции колоний требуемый рекомбинантный вектор можно получать из колониеобразующих Е. coli. Затем с использованием известного метода, такого как дидезокси-метод (метод терминации нуклеотидной цепи), определяют, имеет ли рекомбинантный вектор представляющую интерес нуклеотидную последовательность кДНК.The cDNA fragment of interest is purified from the resulting PCR product and then inserted by ligation into the DNA vector. In this way, a recombinant vector is created and introduced into E. coli or a similar host. After colony selection, the desired recombinant vector can be obtained from colony-forming E. coli. Then, using a known method such as the dideoxy method (nucleotide chain termination method), it is determined whether the recombinant vector has a cDNA nucleotide sequence of interest.

5'-RACE-метод, в котором используют праймеры для амплификации гена вариабельной области, как правило, применяют для выделения гена, кодирующего вариабельную область. Сначала конструируют библиотеку кДНК, применяемую для 5'-RACE (5'-RACE-библиотека кДНК) с использованием РНК, экстрагированных из клеток гибридомы, в качестве матрицы. Для синтеза 5'-RACE-библиотеки кДНК можно использовать поступающий в продажу набор, такой как набор для амплификации кДНК SMART RACE.The 5'-RACE method, which uses primers to amplify a variable region gene, is generally used to isolate a gene encoding a variable region. First, a cDNA library used for 5'-RACE (5'-RACE cDNA library) is constructed using RNA extracted from hybridoma cells as a template. A commercially available kit, such as the SMART RACE cDNA amplification kit, can be used to synthesize a 5'-RACE cDNA library.

Ген антитела амплифицируют с помощью ПЦР, используя полученную 5'-RACE-библиотеку кДНК в качестве матрицы. Праймеры для амплификации гена мышиного антитела можно создавать на основе известных генных последовательностей антител. Нуклеотидные последовательности праймеров варьируются в зависимости от подкласса иммуноглобулина. Таким образом, предпочтительно предварительно определять подкласс с помощью доступного набора, такого как набор для изотипирования мышиных моноклональных антител Iso Strip (Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit) (фирма Roche Diagnostics).The antibody gene is amplified by PCR using the resulting 5'-RACE cDNA library as a template. Primers for amplifying a mouse antibody gene can be designed based on known antibody gene sequences. The nucleotide sequences of the primers vary depending on the immunoglobulin subclass. Thus, it is preferable to pre-subclass with an available kit, such as the Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).

В частности, например, для выделения генов, кодирующих мышиный IgG, применяют праймеры, которые обеспечивают амплификацию генов, кодирующих тяжелые цепи γ1, γ2а, y2b и γ3 и легкие цепи к и λ. В целом, праймер, сайт гибридизации (отжига) которого с константной областью расположен вблизи вариабельной области, применяют в качестве 3'-концевого праймера для амплификации гена вариабельной области IgG. При этом праймер, присоединенный к набору конструкций 5'-RACEбиблиотеки кДНК, применяют в качестве 5'-концевого праймера.In particular, for example, to isolate genes encoding mouse IgG, primers are used that allow amplification of genes encoding γ1, γ2a, y2b and γ3 heavy chains and k and λ light chains. In general, a primer whose hybridization (annealing) site with the constant region is located near the variable region is used as a 3'-terminal primer for amplifying the IgG variable region gene. In this case, the primer attached to the set of 5'-RACE constructs of the cDNA library is used as the 5'-terminal primer.

Амплифицированные таким образом ПЦР-продукты применяют для реконструирования иммуноглобулинов, состоящих из комбинации тяжелых и легких цепей. Требуемое антитело можно отбирать, используя в качестве показателя GPC3-связывающую активность реконструированного иммуноглобулина. Например, когда задачей является выделение антитела к GPC3, то более предпочтительно, чтобы связывание антитела с GPC3 являлось специфическим. Можно осуществлять скрининг GPC3-связывающих антител, например, с использованием следующих стадий, на которых:The PCR products thus amplified are used to reconstruct immunoglobulins consisting of a combination of heavy and light chains. The desired antibody can be selected using the GPC3 binding activity of the reshaped immunoglobulin as an indicator. For example, when the goal is to isolate an antibody to GPC3, it is more preferred that the binding of the antibody to GPC3 is specific. You can screen for GPC3-binding antibodies, for example, using the following steps, in which:

(1) приводят в контакт экспрессирующую GPC3 клетку с антителом, содержащим V-область, которая кодируется кДНК, выделенной из гибридомы;(1) contacting a GPC3-expressing cell with an antibody containing a V region encoded by cDNA isolated from the hybridoma;

(2) определяют связывание антитела с экспрессирующей GPC3 клеткой и (3) отбирают антитело, которое связывается с экспрессирующей GPC3 клеткой.(2) determining antibody binding to a GPC3 expressing cell; and (3) selecting an antibody that binds to a GPC3 expressing cell.

Методы определения связывания антитела с экспрессирующими GPC3 клетками, являются известными. В частности, связывание антитела с экспрессирующими GPC3 клетками можно определять с помощью описанных выше методик, таких как FACS. Иммобилизованные образцы экспрессирующих GPC3 клеток можно применять для оценки связывающей активности антитела.Methods for determining antibody binding to GPC3 expressing cells are known. In particular, antibody binding to GPC3 expressing cells can be determined using the techniques described above, such as FACS. Immobilized samples expressing GPC3 cells can be used to assess the binding activity of the antibody.

Предпочтительные методы скрининга антител, в которых используют связывающую активность вPreferred antibody screening methods that use binding activity in

- 25 041830 качестве показателя, включают также методы пэннинга, основанные на использовании фаговых векторов. Методы скрининга с использованием фаговых векторов имеют преимущество, когда гены антитела выделяют из библиотек подкласса тяжелой цепи и легкой цепи из популяции клеток, экспрессирующих поликлональные антитела. Гены, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, можно сшивать с помощью приемлемой линкерной последовательности с образованием одноцепочечного Fv (scFv). Фаги, презентирующие на своей поверхности scFv, можно получать путем встраивания гена, кодирующего scFv, в фаговый вектор. Фаги приводят в контакт с представляющим интерес антигеном. Затем ДНК, кодирующую scFv, который обладает представляющей интерес связывающей активностью, можно выделять путем сбора фагов, связанных с антигеном. Указанный процесс можно повторять при необходимости для обогащения scFv, которые обладают представляющей интерес связывающей активностью.- 25 041830 as an indicator also include panning methods based on the use of phage vectors. Screening methods using phage vectors are advantageous when antibody genes are isolated from heavy chain and light chain subclass libraries from a population of cells expressing polyclonal antibodies. Genes encoding heavy chain and light chain variable regions can be fused with a suitable linker sequence to form a single chain Fv (scFv). Phages presenting scFv on their surface can be obtained by inserting the gene encoding scFv into a phage vector. The phages are brought into contact with the antigen of interest. DNA encoding an scFv that has binding activity of interest can then be isolated by harvesting antigen-bound phages. This process can be repeated as needed to enrich scFvs that have binding activity of interest.

После выделения кДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела к GPC3, кДНК расщепляют рестриктазами, которые распознают сайты рестрикции, интродуцированные в оба конца кДНК. Предпочтительные рестриктазы распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, которая встречается с низкой частотой в нуклеотидной последовательности гена антитела. Кроме того, для встраивания однокопийного расщепленного фрагмента в правильной ориентации предпочтительно интродуцируют в представляющий интерес вектор сайт рестрикции для фермента, который образует липкий конец. Кодирующую V-область антитела к GPC3 кДНК расщепляют согласно описанному выше методу и встраивают в приемлемый экспрессионный вектор для создания экспрессионного вектора антитела. В том случае, когда ген, кодирующий константную область (С-область) антитела, и ген, кодирующий указанную выше V-область, сливают в рамке считывания, то получают химерное антитело. В контексте настоящего описания химерное антитело означает, что константная область и вариабельная область отличаются по своему происхождению. Так, помимо мышиных/человеческих гетерохимерных антител к химерным антителам, предлагаемым в настоящем изобретении, относятся также человеческие/человеческие аллохимерные антитела. Экспрессионный вектор химерного антитела можно создавать путем встраивания указанного выше гена V-области в экспрессионный вектор, который уже содержит константную область. В частности, например, последовательность, распознаваемую рестриктазой, которая вырезает указанный выше ген V-области, предпочтительно следует помещать в 5'-область экспрессионного вектора, несущего ДНК, которая кодирует константную область (С-область) требуемого антитела. Экспрессионный вектор химерного антитела создают путем слияния в рамке считывания двух генов, расщепленных одной и той же комбинацией рестриктаз.After isolation of the cDNA encoding the V region of the anti-GPC3 antibody of interest, the cDNA is digested with restriction enzymes that recognize the restriction sites introduced at both ends of the cDNA. Preferred restriction enzymes recognize and cleave a nucleotide sequence that occurs at low frequency in the nucleotide sequence of an antibody gene. In addition, to insert the one-copy cleavage fragment in the correct orientation, a restriction site for the enzyme that forms the sticky end is preferably introduced into the vector of interest. The cDNA coding for the anti-GPC3 antibody V region is digested as described above and inserted into a suitable expression vector to create an antibody expression vector. When the gene encoding the constant region (C region) of an antibody and the gene encoding the above V region are fused in frame, a chimeric antibody is obtained. In the context of the present description, a chimeric antibody means that the constant region and the variable region differ in their origin. Thus, in addition to murine/human heterochimeric antibodies to chimeric antibodies according to the present invention, human/human allochimeric antibodies are also included. An expression vector for a chimeric antibody can be created by inserting the above V-region gene into an expression vector that already contains the constant region. In particular, for example, a sequence recognized by a restriction enzyme that cuts out the above V region gene should preferably be placed in the 5' region of an expression vector carrying DNA that encodes the constant region (C region) of the desired antibody. An expression vector for a chimeric antibody is created by in-frame fusion of two genes cleaved with the same restriction enzyme combination.

Для получения моноклонального антитела к GPC3 гены антитела встраивают в экспрессионный вектор таким образом, чтобы экспрессия генов происходила под контролем регулирующей экспрессию области. Регулирующая экспрессию область, предназначенная для экспрессии антител, включает, например, энхансеры и промоторы. Кроме того, соответствующую сигнальную последовательность можно присоединять к аминоконцу таким образом, чтобы антитело секретировалось из клеток наружу. В описанных ниже примерах в качестве сигнальной последовательности применяют пептид, который имеет аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3). Наряду с ней можно присоединять другие приемлемые сигнальные последовательности. Экспрессированный полипептид расщепляется на карбоксильном конце указанной выше последовательности и образовавшийся полипептид секретируется из клеток наружу в виде зрелого полипептида. Затем приемлемые клетки-хозяева трансформируют экспрессионным вектором и получают рекомбинантные клетки, экспрессирующие ДНК, которая кодирует антитело к GPC3.To obtain a monoclonal antibody to GPC3, the antibody genes are inserted into an expression vector in such a way that the expression of the genes occurs under the control of the expression regulating region. An expression control region for expressing antibodies includes, for example, enhancers and promoters. In addition, an appropriate signal sequence can be attached to the amino terminus so that the antibody is secreted from the cells to the outside. In the examples described below, a peptide having the amino acid sequence MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3) is used as a signal sequence. Along with it, you can attach other acceptable signal sequences. The expressed polypeptide is cleaved at the carboxyl terminus of the above sequence and the resulting polypeptide is secreted from the cells to the outside as the mature polypeptide. Acceptable host cells are then transformed with an expression vector to produce recombinant cells expressing DNA that encodes an anti-GPC3 antibody.

ДНК, которые кодируют тяжелую цепь антитела (H-цепь) и легкую цепь антитела (L-цепь), встраивают по отдельности в различные экспрессионные векторы для экспрессии гена антитела. Молекулу антитела, имеющую H- и L-цепи, можно экспрессировать, осуществляя для этой цели контрансфекцию одной и той же клетки-хозяина векторами, в которые встроены соответственно гены H-цепи и L-цепи. В качестве альтернативы, клетки-хозяева можно трансформировать одним экспрессионным вектором, в который встроены ДНК, кодирующие H- и L-цепи (см. WO 94/11523).DNAs that encode an antibody heavy chain (H chain) and an antibody light chain (L chain) are inserted separately into different expression vectors to express the antibody gene. An antibody molecule having H and L chains can be expressed by co-transfecting the same host cell for this purpose with vectors into which the H chain and L chain genes are inserted, respectively. Alternatively, host cells can be transformed with a single expression vector into which DNA encoding the H and L chains is inserted (see WO 94/11523).

Известны различные комбинации клеток-хозяев/экспрессионных векторов для получения антитела путем интродукции выделенных генов антител в соответствующих хозяев. Все эти системы экспрессии можно применять для выделения антигенсвязывающих доменов, включая вариабельные области антитела, предлагаемого в настоящем изобретении. Приемлемыми эукариотическими клетками, которые применяют в качестве клеток-хозяев, являются клетки животных, клетки растений и клетки грибов. В частности, клетки животных представляют собой, например, следующие клетки:Various combinations of host cells/expression vectors are known for producing antibodies by introducing isolated antibody genes into appropriate hosts. All of these expression systems can be used to isolate antigen-binding domains, including the variable regions of an antibody of the present invention. Suitable eukaryotic cells that are used as host cells are animal cells, plant cells and fungal cells. In particular, animal cells are, for example, the following cells:

(1) клетки млекопитающих: СНО, COS, миеломы, почки детеныша хомяка (BHK), HeLa, Vero или т.п.;(1) mammalian cells: CHO, COS, myeloma, baby hamster kidney (BHK), HeLa, Vero or the like;

(2) клетки амфибий: ооциты шпорцевой лягушки (Xenopus) или т.п. и (3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 или т.п.(2) amphibian cells: clawed frog (Xenopus) oocytes or the like. and (3) insect cells: sf9, sf21, Tn5 or the like.

Кроме того, в качестве растительной клетки известна система экспрессии генов антитела, в которой используют клетки, полученные из представителей рода Nicotiana, например Nicotiana tabacum. Для трансформации растительных клеток можно применять культивированные клетки каллуса.Further, as a plant cell, an antibody gene expression system is known in which cells derived from members of the genus Nicotiana, such as Nicotiana tabacum, are used. Cultured callus cells can be used to transform plant cells.

- 26 041830- 26 041830

Кроме того, следующие клетки можно применять в качестве грибных клеток: дрожжи рода Saccharomyces, например Saccharomyces cerevisiae, и рода Pichia, например Pichia pastoris, и нитчатые грибы: рода Aspergillus, например Aspergillus niger. Кроме того, известны системы экспрессии генов антитела, в которых используют прокариотические клетки. Например, согласно настоящему изобретению можно применять бактериальные клетки, т.е. клетки Е. coli, клетки Bacillus subtilis и т.п. Экспрессионные векторы, которые несут представляющие интерес гены антитела, интродуцируют в эти клетки путем трансфекции. Трансфектированные клетки культивируют in vitro, и требуемое антитело можно получать из культуры трансформированных клеток.In addition, the following cells can be used as fungal cells: yeasts of the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and the genus Pichia, such as Pichia pastoris, and filamentous fungi: the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger. In addition, antibody gene expression systems are known that use prokaryotic cells. For example, according to the present invention, bacterial cells can be used, i. E. coli cells, Bacillus subtilis cells, and the like. Expression vectors that carry the antibody genes of interest are introduced into these cells by transfection. The transfected cells are cultured in vitro and the desired antibody can be obtained from the culture of the transformed cells.

Помимо указанных выше клеток-хозяев для получения рекомбинантного антитела можно применять также трансгенных животных. Это означает, что антитело можно получать из животного, в организм которого интродуцирован ген, кодирующий представляющее интерес антитело. Например, ген антитела можно создавать в виде слитого гена посредством встраивания в рамке считывания в ген, который кодирует белок, специфически образующийся в молоке. В качестве белка, секретируемого в молоко, можно применять, например, козий β-казеин. ДНК-фрагменты, содержащие слитый ген, в который входит ген антитела, инъецируют в эмбрион козы и затем этот эмбрион интродуцируют в самку козы. Требуемые антитела можно получать в виде белка, слитого с молочным белком из молока трансгенной козы, родившейся от козы, являющейся реципиентом эмбриона (или ее потомства). Кроме того, для увеличения объема молока, содержащего требуемое антитело, которое продуцируется трансгенной козой, трансгенной козе можно при необходимости вводить гормоны (Ebert К.М. и др., Bio/Technology 12 (7), 1994, с. 699-702).In addition to the above host cells, transgenic animals can also be used to produce a recombinant antibody. This means that the antibody can be obtained from an animal into which the gene encoding the antibody of interest has been introduced. For example, an antibody gene can be created as a fusion gene by inserting in frame into a gene that encodes a protein that is specifically produced in milk. As a protein secreted into milk, for example, goat β-casein can be used. DNA fragments containing the fusion gene containing the antibody gene are injected into a goat embryo and then the embryo is introduced into a female goat. The desired antibodies can be obtained as a protein fused to milk protein from the milk of a transgenic goat born from a goat that is the recipient of the embryo (or its offspring). In addition, to increase the volume of milk containing the desired antibody that is produced by the transgenic goat, hormones can be administered to the transgenic goat if necessary (Ebert K. M. et al., Bio/Technology 12 (7), 1994, p. 699-702) .

Когда антигенсвязывающую молекулу, представленную в настоящем описании, вводят человеку, то в качестве домена антигенсвязывающей молекулы можно применять домен, происходящий из антитела, полученного путем генетической рекомбинации, которое искусственно модифицировано для снижения гетерологичной антигенности в отношении человека и других животных. Указанные антитела, полученные путем генетической рекомбинации, включают, например, гуманизированные антитела. Эти модифицированные антитела можно получать с помощью известных методов.When the antigen-binding molecule described herein is administered to a human, a domain derived from an antibody obtained by genetic recombination that is artificially modified to reduce heterologous antigenicity to humans and other animals can be used as the domain of the antigen-binding molecule. These antibodies obtained by genetic recombination include, for example, humanized antibodies. These modified antibodies can be obtained using known methods.

Вариабельная область антитела, применяемая для получения домена антигенсвязывающей молекулы, который включает вариабельную область антитела, представленного в настоящем описании, как правило, состоит из трех гипервариабельных участков (CDR), разделенных четырьмя каркасными участками (FR). CDR представляет собой область, которая в значительной степени определяет специфичность связывания антитела. Для аминокислотных последовательностей CDR характерна высокая степень вариабельности. С другой стороны, образующие FR аминокислотные последовательности часто обладают высокой идентичностью даже среди антител с различными специфичностями связывания. Таким образом, как правило, путем трансплантации CDR специфичность связывания конкретного антитела можно интродуцировать в другое антитело.The variable region of an antibody used to derive the domain of an antigen-binding molecule, which includes the variable region of an antibody provided herein, typically consists of three hypervariable regions (CDRs) separated by four framework regions (FRs). The CDR is a region that largely determines the binding specificity of an antibody. The amino acid sequences of the CDRs are characterized by a high degree of variability. On the other hand, FR-forming amino acid sequences often have high identity even among antibodies with different binding specificities. Thus, in general, by CDR transplantation, the binding specificity of a particular antibody can be introduced into another antibody.

Гуманизированное антитело называют также реконструированным человеческим антителом. В частности, известны гуманизированные антитела, полученные путем трансплантации CDR антитела животного кроме человека, такого как мышиное антитело, в человеческое антитело и т.п. Известны также общепринятые методики генной инженерии, предназначенные для получения гуманизированных антител. В частности, например, ПЦР с перекрывающимися праймерами представляет собой известный метод трансплантации CDR мышиного антитела в человеческий FR. При осуществлении ПЦР с перекрывающимися праймерами нуклеотидную последовательность, которая кодирует CDR мышиного антитела, подлежащий трансплантации, добавляют к праймерам, предназначенным для синтеза FR человеческого антитела. Получают праймеры для каждого из четырех FR. Принято считать, что когда осуществляют трансплантацию мышиного CDR в человеческий FR, то для поддержания функции CDR целесообразно выбирать человеческий FR, обладающий высоким уровнем идентичности с мышиным FR. Таким образом, как правило, является предпочтительным применять человеческий FR, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую высоким уровнем идентичности с аминокислотной последовательностью FR, который примыкает к подлежащему трансплантации мышиному CDR.A humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody. In particular, humanized antibodies are known that are obtained by transplanting the CDR of an antibody of a non-human animal, such as a mouse antibody, into a human antibody, and the like. Conventional genetic engineering techniques for producing humanized antibodies are also known. In particular, for example, PCR with overlapping primers is a known method for transplanting mouse antibody CDRs into human FRs. When performing PCR with overlapping primers, the nucleotide sequence that encodes the CDR of the mouse antibody to be transplanted is added to the primers designed to synthesize the FR of the human antibody. Get primers for each of the four FR. It is generally accepted that when a mouse CDR is transplanted into a human FR, it is advantageous to select a human FR having a high level of identity with the mouse FR to maintain CDR function. Thus, it is generally preferred to use a human FR that contains an amino acid sequence that has a high level of amino acid sequence identity with the amino acid sequence of the FR that is adjacent to the mouse CDR to be transplanted.

Нуклеотидные последовательности, подлежащие лигированию, создают таким образом, чтобы они были соединены друг с другом в рамке считывания. Человеческие FR синтезируют индивидуально с использованием соответствующих праймеров. В результате получают продукты, в которых ДНК, кодирующая мышиный CDR, присоединена к ДНК, кодирующим индивидуальные FR. Нуклеотидные последовательности, кодирующие мышиный CDR каждого продукта, создают таким образом, чтобы они перекрывались друг с другом. Затем осуществляют реакцию синтеза комплементарной цепи для отжига перекрывающихся CDR-участков продуктов, синтезированных с использованием гена человеческого антитела в качестве матрицы. С помощью этой реакции человеческие FR встраивают путем лигирования через мышиные CDR-последовательности.The nucleotide sequences to be ligated are designed to be joined to each other in reading frame. Human FRs are individually synthesized using appropriate primers. As a result, products are obtained in which the DNA encoding the murine CDR is fused to the DNA encoding individual FRs. The nucleotide sequences encoding the mouse CDR of each product are designed to overlap with each other. Then, a complementary chain synthesis reaction is carried out to anneal the overlapping CDRs of the products synthesized using the human antibody gene as a template. With this reaction, human FRs are inserted by ligation through mouse CDR sequences.

Полноразмерный ген V-области, в которую, в конце концов, лигированы три CDR и четыре FR, амплифицируют с использованием праймеров, гибридизующихся с 5'- или 3'-концом, которые добавляют с последовательностями, распознаваемыми приемлемыми рестриктазами. Экспрессионный вектор для гуманизированного антитела можно получать путем встраивания полученной согласно описанному вышеThe full-length V region gene, into which three CDRs and four FRs are finally ligated, is amplified using primers hybridizing to the 5' or 3' end, which are added with sequences recognized by acceptable restriction enzymes. An expression vector for a humanized antibody can be obtained by inserting the

- 27 041830 методу ДНК и ДНК, которая кодирует С-область человеческого антитела, в экспрессионный вектор таким образом, чтобы лигировать их в рамке считывания. После трансфекции хозяина рекомбинантным вектором для создания рекомбинантных клеток рекомбинантные клетки культивируют и ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, экспрессируют с получением гуманизированного антитела в культуре клеток (см. публикацию европейского патента EP 239400 и публикацию международной заявки на патент WO 1996/002576). Путем качественной или количественной оценки и измерения антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела, полученного согласно описанному выше методу, можно отбирать FR человеческого антитела, которые позволяют CDR образовывать предпочтительный антигенсвязывающий центр при лигировании с использованием CDR. Аминокислотные остатки в FR при необходимости можно заменять так, чтобы CDR реконструированного человеческого антитела образовывали приемлемый антигенсвязывающий центр. Например, мутации аминокислотной последовательности можно интродуцировать в FR, используя ПЦР-метод, применяемый для трансплантации мышиного CDR в человеческий FR. Более конкретно, мутации неполной нуклеотидной последовательности можно интродуцировать в праймеры, гибридизующиеся с FR. Мутации нуклеотидной последовательности интродуцируют в FR, синтезированные с использованием указанных праймеров. Мутантные последовательности FR, имеющие требуемые характеристики, можно отбирать путем измерения и оценки активности мутантного антитела с аминокислотной заменой в отношении связывания с антигеном с помощью упомянутого выше метода (Sato K. и др., Cancer Res. 53, 1993, с. 851-856).- 27 041830 method of DNA and DNA, which encodes the C-region of a human antibody, into an expression vector in such a way as to ligate them in reading frame. After the host is transfected with a recombinant vector to create recombinant cells, the recombinant cells are cultured and the DNA encoding the humanized antibody is expressed to produce the humanized antibody in cell culture (see European patent publication EP 239400 and international patent application publication WO 1996/002576). By qualitatively or quantitatively evaluating and measuring the antigen-binding activity of a humanized antibody prepared according to the method described above, human antibody FRs can be selected that allow the CDR to form a preferred antigen-binding site when ligated using the CDR. Amino acid residues in the FR can be changed as needed so that the CDRs of the reshaped human antibody form an acceptable antigen binding site. For example, amino acid sequence mutations can be introduced into FR using the PCR method used to transplant a mouse CDR into a human FR. More specifically, partial nucleotide sequence mutations can be introduced into primers that hybridize to FR. Nucleotide sequence mutations are introduced into FRs synthesized using the indicated primers. Mutant FR sequences having the desired characteristics can be selected by measuring and evaluating the antigen binding activity of the amino acid mutant antibody using the method mentioned above (Sato K. et al., Cancer Res. 53, 1993, pp. 851-856 ).

В качестве альтернативы, требуемые человеческие антитела можно получать путем иммунизации трансгенных животных, имеющих полный спектр генов человеческого антитела (см. WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735), с использованием ДНК-иммунизации.Alternatively, the desired human antibodies can be obtained by immunizing transgenic animals having the full range of human antibody genes (see WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996 /033735), using DNA immunization.

Кроме того, известны методики получения человеческих антител путем пэннинга с использованием библиотек человеческих антител. Например, V-область человеческого антитела экспрессируют в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага с использованием метода фагового дисплея. Можно отбирать фаги, экспрессирующие scFv, который связывается с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующую V-область человеческого антитела, которая связывается с антигеном, можно определять путем анализа генов отобранных фагов. Определяют последовательность ДНК scFv, который связывается с антигеном. Экспрессионный вектор получают путем слияния последовательности V-области в рамке считывания с последовательностью С-области требуемого человеческого антитела и последующего встраивания в приемлемый экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор интродуцируют в клетки, пригодные для указанной выше экспрессии. Человеческое антитело можно получать путем экспрессии гена, кодирующего человеческое антитело, в клетках. Такие методы уже описаны (см. WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).In addition, techniques for producing human antibodies by panning using libraries of human antibodies are known. For example, the V region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage using a phage display technique. You can select phages expressing scFv that binds to the antigen. The DNA sequence encoding the V region of a human antibody that binds to an antigen can be determined by gene analysis of selected phages. The DNA sequence of the scFv that binds to the antigen is determined. An expression vector is prepared by fusing the in-frame V region sequence to the C region sequence of the desired human antibody and then inserting it into a suitable expression vector. The expression vector is introduced into cells suitable for the above expression. A human antibody can be produced by expressing a gene encoding a human antibody in cells. Such methods have already been described (see WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

Домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3 (GPC3).A domain containing the variable region of an antibody that has binding activity for glypican 3 (GPC3).

В контексте настоящего описания фраза домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3 (GPC3) относится к области антитела, которая содержит область, которая специфически связывается с описанным выше белком GPC3 или со всем или с участком неполного пептида белка GPC3, и является также комплементарной ему. Домены, содержащие вариабельную область антитела, можно получать из вариабельных доменов одного или множества антител. Предпочтительно домены, содержащие вариабельную область антитела, содержат вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи (VL и VH) антитела. Приемлемыми примерами таких доменов, содержащих вариабельные области антитела, являются одноцепочечный Fv (scFv), одноцепочечное антитело, Fv, одноцепочечный Fv₂ (scFv₂), Fab, F(ab')₂ и т.д.In the context of the present description, the phrase domain containing the variable region of an antibody that has binding activity against glypican 3 (GPC3) refers to the region of an antibody that contains a region that specifically binds to the GPC3 protein described above or to all or a portion of the partial peptide of the GPC3 protein. , and is also complementary to it. Domains containing the variable region of an antibody can be derived from the variable domains of one or more antibodies. Preferably, the antibody variable domains comprise the light chain and heavy chain variable regions (VL and VH) of the antibody. Suitable examples of such antibody variable domains are single chain Fv (scFv), single chain antibody, Fv, single chain Fv ₂ (scFv ₂ ), Fab, F(ab') ₂ , etc.

Домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора.A domain containing the variable region of an antibody that has binding activity for the T-cell receptor complex.

В контексте настоящего описания фраза домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора относится к области антитела, которая содержит область, которая специфически связывается со всем или с участком комплекса Т-клеточного рецептора, и является также комплементарной ему. Комплекс Т-клеточного рецептора может представлять собой сам Т-клеточный рецептор или адапторную молекулу, которая входит в комплекс Т-клеточного рецептора наряду с Т-клеточным рецептором. Пригодной в качестве адапторной молекулы является CD3.As used herein, the phrase domain containing an antibody variable region that has binding activity for the T-cell receptor complex refers to the region of an antibody that contains a region that specifically binds to all or a portion of the T-cell receptor complex and is also complementary to him. The T cell receptor complex may be the T cell receptor itself or an adapter molecule that is included in the T cell receptor complex along with the T cell receptor. A suitable adapter molecule is CD3.

Домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении Т-клеточного рецептора.A domain containing the variable region of an antibody that has T-cell receptor binding activity.

В контексте настоящего описания фраза домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении Т-клеточного рецептора относится к области антитела, связывающейся с Т-клеточным рецептором, полученной путем включения области, которая специфически связывается со всем или с участком Т-клеточного рецептора и является также комплементарной ему.As used herein, the phrase domain containing an antibody variable region that has T cell receptor binding activity refers to the region of an antibody that binds to a T cell receptor obtained by including a region that specifically binds to all or a portion of a T cell receptor and is also complementary to it.

- 28 041830- 28 041830

Участок Т-клеточного рецептора, с которым связывается домен, предлагаемый в настоящем изобретении, может представлять собой вариабельную область или константную область, но предпочтительным является эпитоп, присутствующий в константной области. Примеры последовательности константной области включают а-цепь Т-клеточного рецептора, которая имеет регистрационный № RefSeq. CAA26636.1 (SEQ ID NO: 4), Р-цепь Т-клеточного рецептора, которая имеет регистрационный № RefSeq C25777 (SEQ ID NO: 5), γ1-цепь Т-клеточного рецептора, которая имеет регистрационный № RefSeq А26659 (SEQ ID NO: 6), γ2-цепь Т-клеточного рецептора, которая имеет регистрационный № RefSeq AAB63312.1 (SEQ ID NO: 7), и 5-цепь Т-клеточного рецептора, которая имеет регистрационный № RefSeq AAA61033.1 (SEQ ID NO: 8).The region of the T cell receptor to which the domain of the present invention binds may be a variable region or a constant region, but an epitope present in the constant region is preferred. Examples of the constant region sequence include the T cell receptor α chain, which has the accession number RefSeq. CAA26636.1 (SEQ ID NO: 4), T cell receptor P chain which has RefSeq Accession No. C25777 (SEQ ID NO: 5), T cell receptor γ1 chain which has RefSeq Accession No. A26659 (SEQ ID NO: 6), T cell receptor γ2 chain which has RefSeq AAB63312.1 (SEQ ID NO: 7), and T cell receptor 5 chain which has RefSeq AAA61033.1 (SEQ ID NO: : 8).

Домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает CD3-связывающей активностью.A domain containing the variable region of an antibody that has CD3-binding activity.

В контексте настоящего описания фраза домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает CD3-связывающей активностью относится к CD3-связывающему участку антитела, который получают путем включения области, которая специфически связывается со всем или с участком CD3, и который является также комплементарным ему.As used herein, the phrase domain containing an antibody variable region that has CD3-binding activity refers to a CD3-binding region of an antibody that is obtained by including a region that specifically binds to all or a portion of CD3, and that is also complementary to it.

Предпочтительно домен содержит вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи (VL и VH) антитела к CD3. Приемлемыми примерами такого домена являются одноцепочечный Fv (scFv), одноцепочечное антитело, Fv, одноцепочечный Fv₂ (scFv₂), Fab, F(ab')₂ и т.д.Preferably, the domain comprises the light chain and heavy chain variable regions (VL and VH) of an anti-CD3 antibody. Suitable examples of such a domain are single chain Fv (scFv), single chain antibody, Fv, single chain Fv ₂ (scFv ₂ ), Fab, F(ab') ₂ , etc.

Предлагаемый в изобретении домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает CD3-связывающей активностью, может представлять собой любой эпитопсвязывающий домен, если эпитоп присутствует в последовательности γ-цепи, δ-цепи или ε-цепи, образующей человеческий CD3. Предпочтительно в настоящем изобретении можно использовать домен, содержащий вариабельную область легкой цепи (VL) антитела к CD3, и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела к CD3, которые связываются с эпитопом, присутствующим во внеклеточной области ε-цепи комплекса человеческого CD3. Помимо вариабельной области легкой цепи (VL) антитела к CD3, и вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела к CD3, которые описаны в разделе Примеры, известные CD3связывающие домены, которые содержат вариабельную область легкой цепи (VL) антитела к CD3, и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела к CD3 и полученные из антитела ОКТ3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, с. 4914-4917), можно применять в качестве указанных доменов. Соответственно можно применять содержащий вариабельную область антитела домен, полученный из антитела к CD3, которое обладает требуемыми свойствами, созданное путем иммунизации требуемого животного с использованием описанного выше метода γ-цепью, δ-цепью или ε-цепью, образующей человеческий CD3. Человеческие антитела и соответствующим образом гуманизированные антитела можно применять соответственно в качестве антитела к CD3 для создания домена, содержащего вариабельную область антитела, который обладает CD3-связывающей активностью. Что касается структуры γ-цепи, δ-цепи или εцепи, образующей человеческий CD3, то их полинуклеотидные последовательности представлены в SEQ ID NO: 9 (NM_000073.2), 10 (NM_000732.4) и 11 (NM_000733.3), а их полипептидные последовательности представлены в SEQ ID NO: 12 (NP_000064.1), 13 (NP_000723.1) и 14 (NP_000724.1) (в скобках указаны регистрационные номера в базе данных RefSeq).An inventive domain containing an antibody variable region that has CD3-binding activity can be any epitope-binding domain so long as the epitope is present in the γ-chain, δ-chain or ε-chain sequence that forms human CD3. Preferably, a domain comprising an anti-CD3 antibody light chain variable region (VL) and an anti-CD3 antibody heavy chain variable region (VH) that bind to an epitope present in the extracellular region of the ε-chain of the human CD3 complex can be preferably used in the present invention. In addition to the anti-CD3 antibody light chain (VL) variable region and the anti-CD3 antibody heavy chain variable region (VH) as described in the Examples section, known CD3 binding domains that comprise the anti-CD3 antibody light chain (VL) variable region and the variable region heavy chain (VH) anti-CD3 antibodies and derived from the OKT3 antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, pp. 4914-4917) can be used as these domains. Accordingly, an antibody variable region-containing domain derived from an anti-CD3 antibody that has the desired properties, generated by immunizing the desired animal using the method described above with a γ-chain, δ-chain or ε-chain forming human CD3, can be used. Human antibodies and suitably humanized antibodies can be used respectively as an anti-CD3 antibody to generate a domain containing an antibody variable region that has CD3-binding activity. With regard to the structure of the γ chain, δ chain or ε chain forming human CD3, their polynucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 9 (NM_000073.2), 10 (NM_000732.4) and 11 (NM_000733.3), and their polypeptide sequences are shown in SEQ ID NOs: 12 (NP_000064.1), 13 (NP_000723.1) and 14 (NP_000724.1) (registration numbers in the RefSeq database are in brackets).

Домены, содержащие вариабельные области антитела, в антигенсвязывающих молекулах, предлагаемых в настоящем изобретении, могут связываться с одним и тем же эпитопом. В контексте настоящего описания один и тот же эпитоп может присутствовать в белке, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 14. Альтернативно этому, домены, содержащие вариабельные области антитела, в антигенсвязывающих молекулах, предлагаемых в настоящем изобретении, могут связываться с различными эпитопами соответственно. В контексте настоящего описания различные эпитопы могут присутствовать в белке, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 14.The antibody variable region domains in the antigen binding molecules of the present invention can bind to the same epitope. In the context of the present description, the same epitope may be present in a protein that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 14. Alternatively, the antibody variable domains in the antigen binding molecules of the present invention may bind to different epitopes respectively. In the context of the present description, various epitopes may be present in a protein that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 14.

Специфичность.Specificity.

Понятие специфичность означает, что одна из молекул, участвующих в специфическом связывании, не обладает какой-либо значимой способностью связываться с молекулами, отличными от одного или нескольких партнеров по связыванию молекул. Кроме того, понятие используют также, когда домен, содержащий вариабельную область антитела, является специфическим в отношении конкретного эпитопа из нескольких эпитопов, входящих в антиген. Когда эпитоп, с которым связывается домен, содержащий вариабельную область антитела, входит в несколько различных антигенов, то антигенсвязывающие молекулы, содержащие домен, включающий вариабельную область, могут связываться с различными антигенами, которые содержат эпитоп.The concept of specificity means that one of the molecules involved in specific binding does not have any significant ability to bind to molecules other than one or more binding partners of the molecules. In addition, the concept is also used when the domain containing the variable region of the antibody is specific for a particular epitope of several epitopes included in the antigen. When the epitope to which the domain containing the variable region of an antibody binds is included in several different antigens, then the antigen-binding molecules containing the domain containing the variable region can bind to different antigens that contain the epitope.

Эпитоп.Epitope.

Эпитоп означает антигенную детерминанту в антигене и относится к антигенному сайту, с которым связывается представленный в настоящем описании домен антигенсвязывающей молекулы, включающий вариабельную область антитела. Так, например, эпитоп можно характеризовать на основе его структуры. Альтернативно этому, эпитоп можно характеризовать на основе антигенсвязывающей актив- 29 041830 ности антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, то эпитоп можно определять по аминокислотным остаткам, образующим эпитоп. Альтернативно этому, когда эпитоп представляет собой сахарную цепь, то эпитоп можно определять по специфической для него структуре сахарной цепи.An epitope means an antigenic determinant in an antigen and refers to an antigenic site to which the domain of an antigen-binding molecule, as provided herein, comprising the variable region of an antibody, binds. Thus, for example, an epitope can be characterized based on its structure. Alternatively, an epitope can be characterized based on the antigen-binding activity of the antigen-binding molecule that recognizes the epitope. When the antigen is a peptide or polypeptide, the epitope can be determined from the amino acid residues that form the epitope. Alternatively, when the epitope is a sugar chain, the epitope can be determined by its specific sugar chain structure.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, у которого распознается первичная аминокислотная последовательность. Указанный линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере три и наиболее часто по меньшей мере 5, например примерно от 8 до 10 или от 6 до 20, аминокислотных остатков в определенной последовательности.A linear epitope is an epitope that contains an epitope in which the primary amino acid sequence is recognized. Said linear epitope typically contains at least three, and most often at least 5, eg about 8 to 10 or 6 to 20, amino acid residues in sequence.

В отличие от линейного эпитопа конформационный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность, образующая эпитоп, не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, не является обязательным, чтобы первичная аминокислотная последовательность конформационного эпитопа распознавалась специфическим в отношении эпитопа антителом). Конформационные эпитопы могут содержать большее количество аминокислотных остатков по сравнению с линейными эпитопами. Распознающее конформационный эпитоп антитело распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда белковая молекула уложена и образует трехмерную структуру, аминокислоты и/или полипептидные основные цепи, которые образуют конформационный эпитоп, выравниваются, и эпитоп становится распознаваемым для антитела. Методы определения конформаций эпитопов включают (но не ограничиваясь только ими), например, рентгеновскую кристаллографию, двухмерный ядерный магнитный резонанс, сайтспецифическое спиновое мечение и электронный парамагнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, под ред. Morris, т. 66, 1996).In contrast to a linear epitope, a conformational epitope is an epitope in which the primary amino acid sequence forming the epitope is not the sole determinant of the recognized epitope (e.g., it is not necessary that the primary amino acid sequence of the conformational epitope be recognized by the epitope-specific antibody). Conformational epitopes may contain more amino acid residues than linear epitopes. An antibody that recognizes a conformational epitope recognizes the three-dimensional structure of a peptide or protein. For example, when a protein molecule is folded into a three-dimensional structure, the amino acids and/or polypeptide backbones that form the conformational epitope align and the epitope becomes recognizable by the antibody. Methods for determining epitope conformations include, but are not limited to, for example, X-ray crystallography, 2D nuclear magnetic resonance, site-specific spin labeling, and electron paramagnetic resonance (see, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, ed. Morris, v. 66, 1996).

Пример метода оценки связывания эпитопа тестируемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую GPC3-связывающей активностью, описан ниже, и метод, подтверждающий связывание с эпитопом тестируемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, можно осуществлять также согласно приведенным ниже примерам.An example of a method for evaluating epitope binding by a test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having GPC3-binding activity is described below, and a method for confirming epitope binding by a test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having binding activity in relation to the T-cell receptor complex, can also be carried out according to the examples below.

Например, для подтверждения того, что тестируемая антигенсвязывающая молекула, содержащая домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую GPC3-связывающей активностью, распознает линейный эпитоп в молекуле GPC3, можно применять описанный ниже метод. Для указанной выше цели синтезируют линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен GPC3. Пептид можно синтезировать химически. Альтернативно этому, его можно получать с помощью методов генной инженерии, используя область в кДНК GPC3, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену. Затем оценивают связывающую активность между линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен, и тестируемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую GPC3связывающей активностью. Например, иммобилизованный линейный пептид можно применять в качестве антигена при осуществлении ELISA для оценки связывающей активности антигенсвязывающей молекулы в отношении пептида. Альтернативно этому, связывающую активность в отношении линейного пептида можно оценивать по уровню ингибирования линейным пептидом связывания антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующими GPC3 клетками. Эти анализы могут демонстрировать связывающую активность антигенсвязывающих молекул в отношении линейного пептида.For example, to confirm that a test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having GPC3-binding activity recognizes a linear epitope in a GPC3 molecule, the method described below can be used. For the above purpose, a linear peptide is synthesized containing the amino acid sequence forming the extracellular domain of GPC3. The peptide can be synthesized chemically. Alternatively, it can be genetically engineered using a region in the GPC3 cDNA that encodes an amino acid sequence corresponding to the extracellular domain. The binding activity between a linear peptide that contains an amino acid sequence forming an extracellular domain and a test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having GPC3 binding activity is then assessed. For example, an immobilized linear peptide can be used as an antigen in an ELISA to evaluate the binding activity of an antigen-binding molecule for the peptide. Alternatively, the binding activity for a linear peptide can be measured by the level of inhibition by the linear peptide of the binding of the antigen-binding molecule to GPC3-expressing cells. These assays can demonstrate the binding activity of antigen-binding molecules to a linear peptide.

Кроме того, для подтверждения того, что тестируемая антигенсвязывающая молекула, содержащая домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую GPC3-связывающей активностью, распознает трехмерную структуру эпитопа, можно применять следующий метод. Для указанной выше цели получают экспрессирующие GPC3 клетки. Считается, что тестируемая антигенсвязывающая молекула, содержащая домен, который содержит вариабельную область антитела, обладающую GPC3связывающей активностью, распознает конформационный эпитоп, если она при контакте отличается сильным связыванием с экспрессирующими GPC3 клетками, но в незначительной степени связывается с иммобилизованным линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен GPC3. В контексте настоящего описания связывается в незначительной степени означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее и наиболее предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессирующими человеческий GPC3.In addition, the following method can be used to confirm that a test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having GPC3-binding activity recognizes the three-dimensional structure of an epitope. For the above purpose, GPC3 expressing cells are obtained. A test antigen-binding molecule containing a domain that contains an antibody variable region having GPC3-binding activity is said to recognize a conformational epitope if, upon contact, it binds strongly to GPC3-expressing cells, but binds little to an immobilized linear peptide that contains the amino acid sequence , which forms the extracellular domain of GPC3. In the context of the present description, binds slightly means that the binding activity is 80% or less, typically 50% or less, preferably 30% or less, and most preferably 15% or less, as compared to the binding activity to human GPC3 expressing cells. .

Методы анализа связывающей активности тестируемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен, который связывается с антигеном GPC3, в отношении экспрессирующих GPC3 клеток, включают, например, методы, описанные в Antibodies: A Laboratory Manual (под ред. Harlow, David Lane, издво Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, с. 359-420). В частности, оценку можно осуществлять на основе принципа ELISA или метода разделения клеток на основе возбуждения флуоресценции (FACS) с использованием в качестве антигена экспрессирующих GPC3 клеток.Methods for assaying the binding activity of a test antigen-binding molecule containing a domain that binds to the GPC3 antigen on GPC3-expressing cells include, for example, those described in Antibodies: A Laboratory Manual (ed. Harlow, David Lane, Published by Cold Spring Harbor Laboratory , 1988, pp. 359-420). In particular, the evaluation can be performed based on the principle of ELISA or fluorescence excitation-based cell separation (FACS) using GPC3-expressing cells as the antigen.

В формате ELISA связывающую активность тестируемой антигенсвязывающей молекулы, содер- 30 041830 жащей домен, который связывается с антигеном GPC3, в отношении экспрессирующих GPC3 клеток, можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигналов, возникающих в процессе ферментативной реакции. В частности, тестируемую антигенсвязывающую молекулу добавляют в планшет для ELISA, на котором иммобилизованы экспрессирующие GPC3 клетки. Затем тестируемую антигенсвязывающую молекулу, связанную с клетками, выявляют с помощью меченного ферментом антитела, которое распознает тестируемую антигенсвязывающую молекулу. Альтернативно этому, когда применяют FACS, приготавливают серийные разведения тестируемой антигенсвязывающей молекулы и титр антитела, связывающегося с экспрессирующими GPC3 клетками, можно определять путем сравнения активности связывания с экспрессирующими GPC3 клетками.In an ELISA format, the binding activity of a tested antigen binding molecule containing a domain that binds to the GPC3 antigen on GPC3 expressing cells can be quantified by comparing the levels of signals generated during the enzymatic reaction. Specifically, the antigen binding molecule to be tested is added to an ELISA plate on which GPC3 expressing cells are immobilized. The cell-bound antigen-binding molecule to be tested is then detected with an enzyme-labeled antibody that recognizes the antigen-binding molecule to be tested. Alternatively, when FACS is used, serial dilutions of the antigen binding molecule to be tested are prepared and the titer of antibody binding to GPC3 expressing cells can be determined by comparing binding activity to GPC3 expressing cells.

Связывание тестируемой антигенсвязывающей молекулы с антигеном, который экспрессируется на поверхности клеток, суспендированных в буфере или в сходной среде, можно выявлять с помощью проточного цитометра. Известными проточными цитометрами являются, например, следующие устройства:The binding of an antigen-binding molecule to be tested to an antigen that is expressed on the surface of cells suspended in buffer or a similar medium can be detected using a flow cytometer. Known flow cytometers are, for example, the following devices:

FACS Canto™ II,FACS Canto II,

FACSAria™,FACSAria™,

FACS Array™,FACS Array™,

FACSVantage™ SE,FACSVantage™ SE,

FACSCalibur (все товарные знаки фирмы BD Biosciences),FACSCalibur (all trademarks of BD Biosciences),

EPICS ALTRA HyPerSort,EPICS ALTRA HyPerSort,

Cytomics FC 500,Cytomics FC 500,

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все товарные знаки фирмы Beckman Coulter).Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (all trademarks of Beckman Coulter).

Предпочтительные методы анализа связывающей активности тестируемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей связывающей антиген GPC3 домен, в отношении антигена включают, например, следующий метод. Сначала экспрессирующие GPC3 клетки подвергают взаимодействию с тестируемой антигенсвязывающей молекулой, а затем ее окрашивают меченным с помощью ФИТЦ вторичным антителом, которое распознает полипептидный комплекс. Тестируемую антигенсвязывающую молекулу соответствующим образом разводят приемлемым буфером с получением комплекса в требуемой концентрации. Например, комплекс можно применять в концентрации, составляющей от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с помощью FACSCalibur (фирма BD). Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализов на основе программы CELL QUEST (фирма BD), а именно, выраженная в виде средних геометрических значений, отражает уровень связывания антитела с клетками. Это означает, что активность связывания тестируемой антигенсвязывающей молекулы, которая характеризуется количеством связанной тестируемой антигенсвязывающей молекулы, можно оценивать, определяя среднее геометрическое значение.Preferred methods for assaying the binding activity of a test antigen-binding molecule containing a GPC3 antigen-binding domain on an antigen include, for example, the following method. GPC3-expressing cells are first reacted with the antigen-binding molecule to be tested and then stained with a FITC-labeled secondary antibody that recognizes the polypeptide complex. The antigen-binding molecule to be tested is appropriately diluted with a suitable buffer to obtain the complex at the desired concentration. For example, the complex can be used at a concentration of 10 μg/ml to 10 ng/ml. Then determine the intensity of fluorescence and the number of cells using FACSCalibur (firm BD). The fluorescence intensity, determined using analyzes based on the CELL QUEST program (company BD), namely, expressed as geometric mean values, reflects the level of antibody binding to cells. This means that the binding activity of a test antigen-binding molecule, which is characterized by the amount of bound test antigen-binding molecule, can be evaluated by determining the geometric mean.

Имеет ли тестируемая антигенсвязывающая молекула, которая содержит домен, связывающий антиген GPC3, общий эпитоп с другой антигенсвязывающей молекулой, можно оценивать по конкуренции между двумя комплексами в отношении одного и того же эпитопа. Конкуренцию между антигенсвязывающими молекулами можно определять путем анализа перекрестной блокады или с помощью сходного анализа. Например, предпочтительным анализом перекрестной блокады является конкурентный ELISAанализ.Whether a test antigen-binding molecule that contains a GPC3 antigen-binding domain shares an epitope with another antigen-binding molecule can be judged by competition between the two complexes for the same epitope. Competition between antigen-binding molecules can be determined by a cross-blockade assay or a similar assay. For example, a preferred cross-blockade assay is a competitive ELISA.

В частности, при осуществлении анализа перекрестной блокады белок GPC3, иммобилизованный в лунках титрационного микропланшета, предварительно инкубируют в присутствии антигенсвязывающей молекулы, рассматриваемой в качестве конкурента-кандидата, или без нее, а затем вносят тестируемую антигенсвязывающую молекулу. Количество связанной с белком GPC3 тестируемой антигенсвязывающей молекулы в лунках находится в обратной корреляции с активностью связывания антигенсвязывающей молекулы, рассматриваемой в качестве конкурента-кандидата, который конкурирует за связывание с одним и тем же эпитопом. Это означает, что чем выше аффинность антигенсвязывающей молекулы, рассматриваемой в качестве конкурента-кандидата, к одному и тому же эпитопу, тем ниже активность связывания тестируемой антигенсвязывающей молекулы с сенсибилизированными белком GPC3 лунками.In particular, when performing a cross-blockade assay, the GPC3 protein immobilized in the wells of a microtiter plate is pre-incubated with or without the antigen-binding molecule considered as a candidate competitor, and then the test antigen-binding molecule is added. The amount of GPC3 protein-bound test antigen-binding molecule in the wells is inversely correlated with the binding activity of the antigen-binding molecule considered as a competitor candidate that competes for binding to the same epitope. This means that the higher the affinity of an antigen-binding molecule considered as a candidate competitor for the same epitope, the lower the binding activity of the tested antigen-binding molecule to GPC3 protein-sensitized wells.

Количество тестируемой антигенсвязывающей молекулы, связанной через белок GPC3 с лунками, легко определять путем предварительного мечения антигенсвязывающей молекулы. Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу оценивают с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестной блокады, в котором применяют в качестве меток ферменты, такие как пероксидаза, называют ELISA-анализом в конкурентных условиях (конкурентный анализ). Антигенсвязывающую молекулу можно метить также с помощью других предназначенных для мечения субстанций, которые можно выявлять или оценивать. В частности, известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.The amount of test antigen-binding molecule bound via the GPC3 protein to the wells is easily determined by prelabeling the antigen-binding molecule. For example, a biotin labeled antigen binding molecule is evaluated using an avidin/peroxidase conjugate and an appropriate substrate. In particular, a cross-blockade assay that uses enzymes such as peroxidase as labels is referred to as a competitive ELISA assay (competitive assay). The antigen-binding molecule can also be labeled with other labeling substances that can be detected or evaluated. In particular, radioactive labels, fluorescent labels, and the like are known.

Когда антигенсвязывающая молекула, рассматриваемая в качестве конкурента-кандидата, может блокировать связывание тестируемой антигенсвязывающей молекулы, которая содержит домен, связывающий антиген GPC3 по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50% и предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению со связывающей активностью, установленной вWhen an antigen-binding molecule considered as a candidate competitor can block the binding of a test antigen-binding molecule that contains a GPC3 antigen-binding domain by at least 20%, preferably by at least 20-50%, and preferably by at least 50% by compared with the binding activity established in

- 31 041830 контрольном эксперименте, который проводят в отсутствии антигенсвязывающей молекулы, рассматриваемой в качестве конкурента, то считается, что для тестируемой антигенсвязывающей молекулы характерна выраженная способность к связыванию с тем же эпитопом, с которым связывается антигенсвязывающая молекула, рассматриваемая в качестве конкурента, или она конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом.- 31 041830 control experiment, which is carried out in the absence of an antigen-binding molecule considered as a competitor, then the tested antigen-binding molecule is considered to have a pronounced ability to bind to the same epitope to which the antigen-binding molecule considered as a competitor binds or competes for binding to the same epitope.

Если структура эпитопа, связанного с тестируемой антигенсвязывающей молекулой, которая содержит домен, связывающий антиген GPC3, уже идентифицирована, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемая и контрольная антигенсвязывающие молекулы один и тот же эпитоп, можно сравнивать связывающие активности двух антигенсвязывающих молекул с пептидом, полученным путем интродукции аминокислотных мутаций в пептид, образующий эпитоп.If the structure of an epitope bound to a test antigen binding molecule that contains a GPC3 antigen binding domain has already been identified, then the binding activities of the two antigen binding molecules to the peptide can be compared to decide whether the test and control antigen binding molecules have the same epitope. obtained by introducing amino acid mutations into the peptide that forms the epitope.

Для оценки указанных выше связывающих активностей, например, сравнивают связывающие активности тестируемой и контрольной антигенсвязывающих молекул с линейным пептидом, в который интродуцирована мутация, с помощью указанного выше формата ELISA. Помимо метода ELISA связывающую активность в отношении мутантного пептида, связанного с колонкой, можно определять, пропуская через колонку тестируемую и контрольную антигенсвязывающую молекулу и затем оценивая количество антигенсвязывающей молекулы, элюированной в раствор для элюции. Известны методы адсорбции мутантного пептида на колонке, например, в форме слитого с GST пептида.To evaluate the above binding activities, for example, the binding activities of the test and control antigen-binding molecules are compared with the linear peptide in which the mutation is introduced using the above ELISA format. In addition to the ELISA method, binding activity for a mutant peptide bound to a column can be determined by passing a test and control antigen-binding molecule through the column and then assessing the amount of antigen-binding molecule eluted into the elution solution. Techniques are known for adsorbing a mutant peptide onto a column, for example in the form of a GST-fused peptide.

Альтернативно этому, когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемая и контрольная антигенсвязывающие молекулы общий эпитоп, можно применять следующий метод. Сначала получают экспрессирующие GPC3 клетки и клетки, экспрессирующие GPC3 с мутацией, интродуцированной в эпитоп. Тестируемую и контрольную молекулы добавляют в клеточную суспензию, полученную путем суспендирования этих клеток в приемлемом буфере, таком как ЗФР. Затем клеточные суспензии соответствующим образом промывают буфером и добавляют меченное с помощью ФИТЦ антитело, которое распознает тестируемую и контрольную антигенсвязывающие молекулы. Определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, используя FACSCalibur (фирма BD). Тестируемый и контрольный полипептидные комплексы соответствующим образом разводят приемлемым буфером и применяют в требуемой концентрации. Например, их можно применять в концентрации от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции определяют с помощью анализа, для оценки результатов которого применяют программу CELL QUEST (фирма BD), а именно, определяют среднее геометрическое значение, которое отражает количество меченого антитела, связанного с клетками. Это означает, что связывающие активности тестируемой и контрольной антигенсвязывающих молекул, которые характеризуются количеством связанного меченого антитела, можно определять, оценивая среднее геометрическое значение.Alternatively, when the identified epitope is a conformational epitope, the following method can be used to decide whether the test and control antigen binding molecules share a common epitope. First, cells expressing GPC3 and cells expressing GPC3 with a mutation introduced into the epitope are obtained. The test and control molecules are added to a cell suspension obtained by suspending the cells in an acceptable buffer such as PBS. The cell suspensions are then washed appropriately with buffer and a FITC-labeled antibody that recognizes the test and control antigen-binding molecules is added. Determine the intensity of fluorescence and the number of cells stained with labeled antibody using FACSCalibur (firm BD). The test and control polypeptide complexes are appropriately diluted with an acceptable buffer and used at the desired concentration. For example, they can be used at a concentration of 10 μg/ml to 10 ng/ml. The fluorescence intensity is determined by an assay whose results are evaluated using the CELL QUEST program (BD), namely, the geometric mean is determined, which reflects the amount of labeled antibody bound to the cells. This means that the binding activities of test and control antigen-binding molecules, which are characterized by the amount of labeled antibody bound, can be determined by evaluating the geometric mean.

При осуществлении описанного выше метода для решения вопроса о том, характерно ли для антигенсвязывающей молекулы незначительное связывание с клетками, которые экспрессируют мутантный GPC3, можно применять, например, следующий метод. Сначала тестируемую и контрольную антигенсвязывающие молекулы, связанные с клетками, которые экспрессируют мутантный GPC3, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции в клетках. Когда для оценки флуоресценции используют проточный цитометр, то интенсивность флуоресценции можно анализировать с помощью программы CELL QUEST. На основе средних геометрических значений в присутствии антигенсвязывающей молекулы и без нее можно рассчитывать согласно приведенной ниже формуле используемое для сравнения значение (AGeo-Mean), характеризующее степень увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания с антигенсвязывающей молекулой:In carrying out the method described above, the following method can be used, for example, to decide whether an antigen-binding molecule exhibits negligible binding to cells that express the mutant GPC3. First, test and control antigen-binding molecules associated with cells that express the mutant GPC3 are stained with labeled antibody. Then determine the intensity of fluorescence in the cells. When a flow cytometer is used to evaluate fluorescence, the fluorescence intensity can be analyzed using the CELL QUEST program. Based on the geometric mean values in the presence of an antigen-binding molecule and without it, the comparative value (AGeo-Mean) can be calculated according to the formula below, which characterizes the degree of increase in fluorescence intensity as a result of binding to an antigen-binding molecule:

AGeo-Mean=Geo-Mean (в присутствии антигенсвязывающей молекулы)/Geo-Mean (в отсутствии антигенсвязывающей молекулы).AGeo-Mean=Geo-Mean (in the presence of an antigen-binding molecule)/Geo-Mean (in the absence of an antigen-binding molecule).

Используемое для сравнения среднее геометрическое значение (значение AGeo-Mean для мутантной молекулы GPC3), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество тестируемой антигенсвязывающей молекулы, связанной с клетками, которые экспрессируют мутантный GPC3, сравнивают с относительным значением AGeo-Mean, которое отражает количество тестируемой антигенсвязывающей молекулы, связанной с экспрессирующими GPC3 клетками. В этом случае концентрации тестируемой антигенсвязывающей молекулы, применяемые для определения относительных значений AGeo-Mean для экспрессирующих GPC3 клеток и клеток, экспрессирующих мутантный GPC3, наиболее предпочтительно регулируют таким образом, чтобы они были одинаковыми или практически одинаковыми. Антигенсвязывающую молекулу, для которой подтверждена способность распознавать эпитоп в GPC3, применяют в качестве контрольной антигенсвязывающей молекулы.The comparative geometric mean value (AGeo-Mean value for the mutant GPC3 molecule) determined by the assay described above, which reflects the amount of test antigen-binding molecule bound to cells that express the mutated GPC3, is compared with the relative AGeo-Mean value, which reflects the amount of test antigen-binding molecule associated with expressing GPC3 cells. In this case, the concentrations of the test antigen-binding molecule used to determine the relative AGeo-Mean values for GPC3 expressing cells and cells expressing mutant GPC3 are most preferably adjusted to be the same or substantially the same. An antigen-binding molecule confirmed to recognize an epitope in GPC3 is used as a control antigen-binding molecule.

Если используемое для сравнения значение AGeo-Mean тестируемой антигенсвязывающей молекулы в отношении клеток, экспрессирующих мутантный GPC3, ниже чем используемое для сравнения значение AGeo-Mean тестируемой антигенсвязывающей молекулы в отношении клеток, экспрессирующих GPC3, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30% и наиболее предпочтительно на 15%, то считают, что тестируемая антигенсвязывающая молекула незначительно связывается с клетками, которые экспрессируют мутантный GPC3. Формула определения значения Geo- 32 041830If the comparative AGeo-Mean of the test antigen-binding molecule against cells expressing the mutant GPC3 is lower than the comparative AGeo-Mean of the test antigen-binding molecule against cells expressing GPC3 by at least 80%, preferably by 50%, more preferably 30% and most preferably 15%, then the antigen binding molecule tested is considered to bind insignificantly to cells that express the mutant GPC3. The formula for determining the value of Geo- 32 041830

Mean (среднее геометрическое значение) описана в руководстве по применению программы CELLMean (geometric mean) is described in the CELL application manual

QUEST (фирма BD biosciences). Когда путем сравнения установлено, что относительные значения являются практически эквивалентными, то можно считать, что тестируемая и контрольная антигенсвязывающие молекулы имеют одинаковый эпитоп.QUEST (BD Biosciences). When the relative values are found to be substantially equivalent by comparison, the test and control antigen-binding molecules can be considered to have the same epitope.

Вариабельный фрагмент (Fv).Variable fragment (Fv).

В контексте настоящего описания понятие вариабельный фрагмент (Fv) относится к минимальной единице полученного из антитела антигенсвязывающего домена, который состоит из пары, включающей вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH). В 1988 г. Skerra и Pluckthun обнаружили, что гомогенные и активные антитела можно получать из периплазматической фракции Е. coli путем встраивания гена антитела по ходу транскрипции относительно бактериальной сигнальной последовательности и индукции экспрессии гена в Е. coli (Science 240(4855), 1988, с. 1038-1041). В Fv, полученном из периплазматической фракции, VH ассоциируется с VL таким образом, чтобы связываться с антигеном.In the context of the present description, the term variable fragment (Fv) refers to the minimum unit derived from an antibody antigen-binding domain, which consists of a pair comprising an antibody light chain variable region (VL) and an antibody heavy chain variable region (VH). In 1988, Skerra and Pluckthun discovered that homogeneous and active antibodies can be obtained from the periplasmic fraction of E. coli by inserting the antibody gene downstream of the bacterial signal sequence and inducing gene expression in E. coli (Science 240(4855), 1988, pp. 1038-1041). In Fv derived from the periplasmic fraction, VH associates with VL in such a way as to bind to antigen.

Согласно настоящему описанию Fv предпочтительно включает, например, пару Fv, которые представляют собой антигенсвязывающую молекулу или т.п., содержащую:According to the present description, Fv preferably includes, for example, a pair of Fv, which is an antigen-binding molecule or the like, containing:

(1) двухвалентный антигенсвязывающий домен, который представляет собой двухвалентный scFv, в котором один одновалентный scFv двухвалентного scFv сцеплен с одним полипептидом, образующим Fc-домен, посредством тяжелой цепи Fv-фрагмента, образующего CD3-связывающий домен, а другой одновалентный scFv сцеплен с другим полипептидом, образующим Fc-домен, посредством легкой цепи Fv-фрагмента, образующего CD3-связывающий домен;(1) a bivalent antigen-binding domain, which is a bivalent scFv in which one bivalent scFv of a bivalent scFv is linked to one Fc domain-forming polypeptide via the heavy chain of an Fv fragment forming a CD3 binding domain, and the other monovalent scFv is linked to another an Fc domain-forming polypeptide via a light chain Fv fragment forming a CD3-binding domain;

(2) домен, содержащий Fc-домен, который не обладает связывающей активностью в отношении Fcγ-рецептора и который получен из аминокислот, образующих Fc-домен IgG1, IgG2a, IgG3 или IgG4, и (3) по меньшей мере один одновалентный CD3-связывающий домен, где легкая цепь и тяжелая цепь Fv-фрагментов в результате ассоциации образуют такой CD3-связывающий домен, который может связываться с антигеном CD3.(2) a domain containing an Fc domain which has no Fcγ receptor binding activity and which is derived from the amino acids forming the Fc domain of IgG1, IgG2a, IgG3, or IgG4, and (3) at least one univalent CD3 binding a domain where the light chain and heavy chain of the Fv fragments associate to form a CD3 binding domain that can bind to the CD3 antigen.

scFv, одноцепочечное антитело и sc(Fv)₂.scFv, single chain antibody and sc(Fv) ₂ .

В контексте настоящего описания понятия scFv, одноцепочечное антитело и sc(Fv)₂ все относятся к фрагменту антитела в виде одной полипептидной цепи, которая содержит вариабельные области, полученные из тяжелой и легкой цепей, но не содержит константную область. Как правило, одноцепочечное антитело содержит также полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, позволяющий образовывать требуемую структуру, которая, вероятно, обеспечивает связывание антигена. Одноцепочечное антитело подробно описано у Pluckthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, с. 269-315 (см. также публикацию международного патента WO 1988/001649; US №№ 4946778 и 5260203). В конкретном варианте осуществления изобретения одноцепочечное антитело может быть биспецифическим и/или гуманизированным.In the context of the present description, the terms scFv, single chain antibody and sc(Fv) ₂ all refer to an antibody fragment in the form of a single polypeptide chain that contains variable regions derived from heavy and light chains, but does not contain a constant region. Typically, a single chain antibody also contains a polypeptide linker between the VH and VL domains, allowing the formation of the desired structure, which is likely to provide antigen binding. The single chain antibody is described in detail by Pluckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, ed. Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, 1994, p. 269-315 (see also International Patent Publication WO 1988/001649; US Nos. 4946778 and 5260203). In a particular embodiment, the single chain antibody may be bispecific and/or humanized.

scFv представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором VH и VL, образующие Fv, сцеплены друг с другом с помощью пептидного линкера (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(16), 1988, с. 58795883). VH и VL могут удерживаться в непосредственной близости с помощью пептидного линкера.scFv is an antigen-binding domain in which VH and VL forming Fv are linked to each other by a peptide linker (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(16), 1988, p. 58795883). VH and VL can be held in close proximity using a peptide linker.

sc(Fv)₂ представляет собой одноцепочечное антитело, в котором четыре вариабельные области двух VL и двух VH сцеплены линкерами такими как пептидные линкеры, с образованием одной цепи (J Immunol. Methods 231(1-2), 1999, с. 177-189). Две VH и две VL можно получать из различных моноклональных антител. Указанные sc(Fv)2 предпочтительно включают, например, биспецифический sc(Fv)2, распознающий два эпитопа, которые присутствуют в одном антигене, что описано в Journal of Immunology 152(11), 1994, с. 5368-5374. sc(Fv)2 можно получать методами, известными специалистам в данной области. Например, sc(Fv)₂ можно получать путем связывания scFv с помощью линкера, такого как пептидный линкер.sc(Fv) ₂ is a single chain antibody in which the four variable regions of two VL and two VH are linked by linkers such as peptide linkers to form one chain (J Immunol. Methods 231(1-2), 1999, pp. 177-189 ). Two VH and two VL can be obtained from various monoclonal antibodies. Said sc(Fv)2 preferably include, for example, a bispecific sc(Fv)2 recognizing two epitopes that are present on the same antigen as described in Journal of Immunology 152(11), 1994, p. 5368-5374. sc(Fv)2 can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, sc(Fv) ₂ can be obtained by linking the scFv with a linker, such as a peptide linker.

Согласно настоящему описанию к форме антигенсвязывающего домена, образующего sc(Fv)2, относится антитело, в котором две единицы VH и две единицы VL организованы в следующем порядке: VH, VL, VH и VL ([VH]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VL]), начиная с N-конца одноцепочечного полипептида. Порядок расположения двух единиц VH и двух единиц VL не ограничен указанной выше формой, и их можно организовывать в любом порядке. Пример порядка расположения в различных формах приведен ниже. [VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL], [VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL]-линкер[VH], [VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL], [VL]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH], [VL]линкер- [VH] - линкер-[VL]-линкер- [VH].According to the present description, the form of the antigen-binding domain forming sc(Fv)2 refers to an antibody in which two VH units and two VL units are organized in the following order: VH, VL, VH and VL ([VH]-linker-[VL]- linker-[VH]-linker-[VL]), starting at the N-terminus of the single chain polypeptide. The arrangement order of the two VH units and the two VL units is not limited to the above shape, and they can be arranged in any order. An example of the arrangement order in various forms is given below. [VL]-linker-[VH]-linker-[VH]-linker-[VL], [VH]-linker-[VL]-linker-[VL]-linker[VH], [VH]-linker-[ VH]-linker-[VL]-linker-[VL], [VL]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VH], [VL]linker-[VH]-linker-[VL ]-linker-[VH].

Молекулярная форма sc(Fv)₂ подробно описана также в WO 2006/132352. Таким образом, согласно указанным описаниям специалисты в данной области могут получать требуемый sc(Fv)2, предназначенный для создания антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем описании.The molecular form of sc(Fv) ₂ is also detailed in WO 2006/132352. Thus, according to these descriptions, specialists in this field can receive the required sc(Fv)2, designed to create antigennegative molecules presented in the present description.

Кроме того, антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно конъюгировать с полимером-носителем, таким как ПЭГ, или органическим соединением, таким как противораковое средство. Альтернативно этому, дополнительную последовательность сахарной цепи предпочтительно встраивают в полипептидные комплексы для того, чтобы сахарная цепь обеспечивала требуемое действие.In addition, the antigen-binding molecules of the present invention can be conjugated with a carrier polymer such as PEG or an organic compound such as an anticancer agent. Alternatively, an additional sugar chain sequence is preferably inserted into the polypeptide complexes in order for the sugar chain to provide the desired effect.

- 33 041830- 33 041830

Линкеры, предназначенные для связывания вариабельных областей антитела, представляют собой произвольные пептидные линкеры, которые можно интродуцировать с помощью генной инженерии, синтетические линкеры и линкеры, описанные, например, в Protein Engineering, 9(3), 1996, с. 299-305. Однако для целей настоящего изобретения наиболее предпочтительными являются пептидные линкеры. Длина пептидных линкеров специально не ограничена, и специалисты в данной области могут выбирать ее в зависимости от поставленной задачи. Предпочтительная длина составляет пять или большее количество аминокислот (при этом, верхний предел составляет (но не ограничиваясь только указанным), как правило, вплоть до 30 аминокислот или менее, предпочтительно 20 аминокислот или менее), и наиболее предпочтительно 15 аминокислот. Когда sc(Fv)₂ содержит три пептидных линкера, то их длина может быть одинаковой или различной. Например, указанные пептидные линкеры включают:Linkers for linking the variable regions of an antibody are arbitrary peptide linkers that can be introduced by genetic engineering, synthetic linkers, and the linkers described, for example, in Protein Engineering, 9(3), 1996, p. 299-305. However, for the purposes of the present invention, peptide linkers are most preferred. The length of the peptide linkers is not specifically limited, and those skilled in the art can choose it depending on the task at hand. The preferred length is five or more amino acids (with the upper limit being (but not limited to) generally up to 30 amino acids or less, preferably 20 amino acids or less), and most preferably 15 amino acids. When sc(Fv) ₂ contains three peptide linkers, their length may be the same or different. For example, said peptide linkers include:

Ser,Ser,

Gly· Ser,Gly Ser,

Gly· Gly· Ser,Gly Gly Ser,

Ser·Gly Gly,Ser Gly Gly,

Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 15),Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 15),

Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 16),Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 16),

Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17),Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17),

Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18),Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18),

Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19),Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19),

Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20),Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20),

Gly· Gly Gly· Gly· Gly· Gly· Ser (SEQ ID NO: 21),Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 21),

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 22), (Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17))n, (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18))n, где n обозначает целое число от 1 или более. Специалисты в данной области могут выбирать длину или последовательности пептидных линкеров в зависимости от поставленной задачи.Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 22), (Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17))n, (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18))n, where n is an integer of 1 or more. Those skilled in the art may choose the length or sequence of the peptide linkers depending on the task at hand.

Как правило, для перекрестного сшивания используют синтетические линкеры (химические перекрестносшивающие агенты), они представляют собой, например:As a rule, synthetic linkers (chemical cross-linking agents) are used for cross-linking, they are, for example:

N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликольбис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис-[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES) и и бис-[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти перекрестносшивающие агенты поступают в продажу.N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS), dithiobis(succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate) ( sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), bis-[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfone (BSOCOES) and and bis-[2-(sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfone (sulfo-BSOCOES). These cross-linking agents are commercially available.

Как правило, требуется три линкера для соединения вместе четырех вариабельных областей антитела. Применяемые линкеры могут быть одного типа или различных типов.Typically, three linkers are required to link together the four variable regions of an antibody. The linkers used may be of the same type or of different types.

Fab, F(ab')2 и Fab'.Fab, F(ab')2 and Fab'.

Fab состоит из одной легкой цепи и СН1-домена и вариабельной области из одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидные мостики с тяжелой цепью другой молекулы.The Fab consists of a single light chain and a CH1 domain and a variable region from a single heavy chain. The heavy chain of a Fab molecule cannot form disulfide bridges with the heavy chain of another molecule.

F(ab')2 или Fab получают обработкой иммуноглобулина (моноклональное антитело) протеазой, такой как пепсин и папаин, и они относятся к фрагменту антитела, получаемого расщеплением иммуноглобулина (моноклональное антитело) вблизи дисульфидных мостиков, присутствующих между шарнирными областями в каждой из двух H-цепей. Например, папаин расщепляет IgG перед дисульфидными мостиками, присутствующими между шарнирными областями в каждой из двух H-цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антитела, в которых L-цепь, содержащая VL (вариабельная область Lцепи), и CL (константная область L-цепи), сцеплены с фрагментом H-цепи, содержащим VH (вариабельная область H-цепи) и CHyI (γ1-область в константной области H-цепи), через дисульфидный мостик в их С-концевых областях. Каждый из указанных двух гомологичных фрагментов антител обозначают как Fab'.F(ab')2 or Fab is produced by treating an immunoglobulin (monoclonal antibody) with a protease such as pepsin and papain and refers to an antibody fragment obtained by cleaving an immunoglobulin (monoclonal antibody) near the disulfide bridges present between the hinge regions in each of the two H -chains. For example, papain cleaves IgG in front of the disulfide bridges present between the hinge regions in each of the two H chains to form two homologous antibody fragments in which the L chain containing VL (the variable region of the L chain) and CL (the constant region of the L chain ) are linked to an H chain fragment containing VH (variable region of the H chain) and CHyI (γ1 region in the constant region of the H chain) via a disulfide bridge at their C-terminal regions. Each of these two homologous antibody fragments is referred to as Fab'.

F(ab')₂ состоит из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, содержащих в константной области СН1-домен и часть СН2-доменов, в результате между двумя тяжелыми цепями образуются дисульфидные мостики. F(ab')₂, образующий антигенсвязывающую молекулу, представленную в настоящем описании, предпочтительно можно получать следующим образом. Полное моноклональное антитело илиF(ab') ₂ consists of two light chains and two heavy chains containing a CH1 domain and a portion of CH2 domains in the constant region, resulting in the formation of disulfide bridges between the two heavy chains. F(ab') ₂ forming antigennegative molecule presented in the present description, preferably can be obtained as follows. Complete monoclonal antibody or

- 34 041830 сходное антитело, содержащее требуемый антигенсвязывающий домен, частично расщепляют протеазой, такой как пепсин; и Fc-фрагменты удаляют путем адсорбции на колонке с белком А. Не существует ограничения касательно конкретной протеазы, если она обладает способностью избирательно расщеплять полное антитело с образованием F(ab')2 в соответствующих для данного фермента реакционных условиях, таких как значение pH. Указанные протеазы представляют собой, например, пепсин и фицин.- 34 041830 a similar antibody containing the desired antigen-binding domain is partially cleaved with a protease such as pepsin; and the Fc fragments are removed by adsorption to a protein A column. There is no limitation on a particular protease as long as it has the ability to selectively cleave a complete antibody to form F(ab')2 under appropriate reaction conditions for the enzyme, such as pH. Said proteases are, for example, pepsin and ficin.

Fc-домен.Fc domain.

Fc-домен, который образует антигенсвязывающую молекулу, представленную в настоящем описании, предпочтительно можно получать следующим образом. Антитело, такое как моноклональное антитело, частично расщепляют протеазой, такой как пепсин. Затем образовавшийся фрагмент адсорбируют на колонке с белком А или белком G и элюируют соответственным буфером для элюции. Не существует ограничения касательно конкретной протеазы, если она обладает способностью избирательно расщеплять антитела, такие как моноклональные антитела, в соответствующих для данного фермента реакционных условиях, таких как значение pH. Указанные протеазы представляют собой, например, пепсин и фицин.The Fc domain that forms the antigen-binding molecule described herein can preferably be obtained as follows. An antibody, such as a monoclonal antibody, is partially cleaved with a protease, such as pepsin. The resulting fragment is then adsorbed onto a protein A or protein G column and eluted with an appropriate elution buffer. There is no limitation on a particular protease as long as it has the ability to selectively cleave antibodies, such as monoclonal antibodies, under appropriate reaction conditions for that enzyme, such as pH. Said proteases are, for example, pepsin and ficin.

Антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, содержат Fc-домен с пониженной способностью связывать Fey-рецептор, которые включают аминокислоты, образующие Fcдомен IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.The antigen-binding molecules provided herein comprise an Fc domain with reduced ability to bind the Fey receptor, which include amino acids forming the Fc domain of IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

Изотип антитела определяют на основе структуры константной области. Константные области изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 обозначают как Cy1, Cy2, Cy3 и Су4 соответственно. Аминокислотные последовательности Fc-домена полипептидов, которые образуют человеческие Cy1, Cy2, Cy3 и Су4, в качестве примера представлены в SEQ ID NO: 23, 24, 25 и 26 соответственно. Взаимосвязь между аминокислотными остатками, образующими каждую аминокислотную последовательность, и EU-нумерацией Кэбота (обозначена в контексте настоящего описания как EU-индекс), представлена на фиг. 12.The isotype of an antibody is determined based on the structure of the constant region. The constant regions of the IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 isotypes are designated as Cy1, Cy2, Cy3, and Cy4, respectively. The amino acid sequences of the Fc domain of the polypeptides that form human Cy1, Cy2, Cy3 and Cy4 are exemplified in SEQ ID NOs: 23, 24, 25 and 26, respectively. The relationship between the amino acid residues constituting each amino acid sequence and Cabot's EU numbering (referred to herein as the EU index) is shown in FIG. 12.

Понятие Fc-домен относится к области вне F(ab')2, которая содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области, которая включает СН1-домен и область между СН1- и СН2-доменами, что позволяет образовываться дисульфидным мостикам между двумя тяжелыми цепями. Fc-домен, образующий антигенсвязывающую молекулу, представленную в настоящем описании, предпочтительно можно получать следующим образом. Моноклональное антитело в виде IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или сходное антитело частично расщепляют протеазой, такой как пепсин, с последующей элюцией фракции, адсорбированной на колонке с белком А. Не существует ограничения касательно конкретной протеазы, если она обладает способностью избирательно расщеплять полное антитело с образованием F(ab')₂ в соответствующих для данного фермента реакционных условиях, таких как значение pH. Указанные протеазы представляют собой, например, пепсин и фицин.The term Fc domain refers to the region outside of F(ab')2 that contains two light chains and two heavy chains, containing part of the constant region that includes the CH1 domain and the region between the CH1 and CH2 domains, which allows the formation of disulfide bridges between two heavy chains. The Fc domain constituting the antigen-binding molecule described herein can preferably be obtained as follows. An IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 monoclonal antibody or similar antibody is partially cleaved with a protease such as pepsin, followed by elution of the fraction adsorbed on the protein A column. formation of F(ab') ₂ under appropriate reaction conditions for the enzyme, such as pH. Said proteases are, for example, pepsin and ficin.

Fcy-рецептор.Fcy receptor.

Понятие Fcy-рецептор относится к рецептору, обладающему способностью связываться с Fcдоменом моноклональных антител в виде IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, и оно включает всех представителей, принадлежащих к семейству белков, которые кодируются главным образом геном Fcy-рецептора. У человека семейство включает FcyRI (CD64), включая изоформы FcyRIa, FcyRIb и FcyRIc; FcyRII (CD32), включая изоформы FcyRIIa (в том числе аллотип Н131 и R131), FcyRIIb (включая FcyRIIb-1 и FcyRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), включая изоформу FcyRIIIa (в том числе аллотипы V158 и F158), и FcyRIIIb (в той числе аллотипы FcyRIIIb-NA1 и FcyRIIIb-NA2); а также все неидентифицированные человеческие FcyR, изоформы FcyR и их аллотипы. Однако Fcy-рецептор не ограничен указанными примерами. FcyR включает (но не ограничиваясь только ими) FcyR, полученные из антител человека, мышей, крыс, кроликов и обезьян. FcyR можно получать из любого организма. Мышиный FcyR включает (но не ограничиваясь только ими) FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) и FcyRIII-2 (CD16-2), а также все неидентифицированные мышиные FcyR, изоформы FcyR и их аллотипы. Указанные предпочтительные Fcyрецепторы включают, например, человеческие FcyI (CD64), FcyIIA (CD32), FcyIIB (CD32), FcyIIIA (CD16) и/или FcyIIIB (CD16). Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcyI представлены в SEQ ID NO: 27 (NM_000566.3) и 28 (NP_000557.1) соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcyIIA представлены в SEQ ID NO: 29 (ВС020823.1) и 30 (ААН20823.1) соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcyIIB представлены в SEQ ID NO: 31 (ВС 146678.1) и 32 (AAI46679.1) соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcyIIIA представлены в SEQ ID NO: 33 (ВС033678.1) и 34 (ААН33678.1) соответственно и полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcyIIIB представлены в SEQ ID NO: 35 (ВС 128562.1) и 36 (AAI28563.1) соответственно (в скобках указан регистрационный номер каждой последовательности в базе данных RefSeq). Обладает ли Fcy-рецептор способностью связываться с Fc-доменом моноклонального антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, можно оценивать с помощью ALPHA Screen®анализа (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)), BIACORE-метода на основе поверхностного плазмонного резонансаThe term Fcy receptor refers to a receptor having the ability to bind to the Fc domain of monoclonal antibodies in the form of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, and it includes all members belonging to the family of proteins that are encoded primarily by the Fcy receptor gene. In humans, the family includes FcyRI (CD64), including the FcyRIa, FcyRIb, and FcyRIc isoforms; FcyRII (CD32), including isoforms FcyRIIa (including allotype H131 and R131), FcyRIIb (including FcyRIIb-1 and FcyRIIb-2) and FcyRIIc; and FcyRIII (CD16), including the FcyRIIIa isoform (including the V158 and F158 allotypes), and FcyRIIIb (including the FcyRIIIb-NA1 and FcyRIIIb-NA2 allotypes); as well as all unidentified human FcyRs, FcyR isoforms and their allotypes. However, the Fcy receptor is not limited to these examples. FcyRs include, but are not limited to, FcyRs derived from human, mouse, rat, rabbit, and monkey antibodies. FcyR can be obtained from any organism. Mouse FcyR includes, but is not limited to, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), and FcyRIII-2 (CD16-2), as well as all unidentified mouse FcyRs, FcyR isoforms, and allotypes thereof. Said preferred Fcy receptors include, for example, human FcyI (CD64), FcyIIA (CD32), FcyIIB (CD32), FcyIIIA (CD16) and/or FcyIIIB (CD16). The polynucleotide sequence and amino acid sequence of FcyI are shown in SEQ ID NOs: 27 (NM_000566.3) and 28 (NP_000557.1), respectively; the polynucleotide sequence and amino acid sequence of FcyIIA are shown in SEQ ID NOs: 29 (BC020823.1) and 30 (AAH20823.1), respectively; the polynucleotide sequence and amino acid sequence of FcyIIB are shown in SEQ ID NOs: 31 (BC 146678.1) and 32 (AAI46679.1), respectively; the polynucleotide sequence and amino acid sequence of FcyIIIA are shown in SEQ ID NOs: 33 (BC033678.1) and 34 (AAH33678.1), respectively, and the polynucleotide sequence and amino acid sequence of FcyIIIB are shown in SEQ ID NOs: 35 (BC 128562.1) and 36 (AAI28563.1) ) respectively (in parentheses is the registration number of each sequence in the RefSeq database). Whether the Fcy receptor has the ability to bind to the Fc domain of an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 monoclonal antibody can be assessed using the ALPHA Screen® assay (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), BIACORE method based on surface plasmon resonance

- 35 041830 (SPR) и др. (Proc. Nail. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, с. 4005-4010), помимо описанных выше форматов- 35 041830 (SPR) and others (Proc. Nail. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, pp. 4005-4010), in addition to the formats described above

FACS и ELISA.FACS and ELISA.

При этом понятие Fc-лиганд или эффекторный лиганд относится к молекуле и предпочтительно полипептиду, который связывается с Fc-доменом антитела, образуя комплекс Fc/Fc-лиганд. Молекулу можно получать из любого организма. Связывание Fc-лиганда с Fc предпочтительно индуцирует одну или несколько эффекторных функций. Указанные лиганды включают (но не ограничиваясь только ими) Fc-рецепторы, FcyR, FcaR, FcεR, FcRn, C1q и C3, маннансвязывающий лектин, маннозный рецептор, белок A Staphylococcus, белок G Staphylococcus и вирусные FcyR. Fc-лиганды включают также гомологи Fc-рецептора (FcRH) (Davis и др., Immunological Reviews 190, 2002, с. 123-136), которые представляют собой семейство Fc-рецепторов, гомологичных FcyR. К Fc-лигандам относятся также неидентифицированные молекулы, которые связываются с Fc.The term Fc ligand or effector ligand refers to a molecule, and preferably a polypeptide, that binds to the Fc domain of an antibody to form an Fc/Fc ligand complex. The molecule can be obtained from any organism. Binding of an Fc ligand to an Fc preferably induces one or more effector functions. These ligands include, but are not limited to, Fc receptors, FcyR, FcaR, FcεR, FcRn, C1q and C3, mannan-binding lectin, mannose receptor, Staphylococcus A protein, Staphylococcus G protein, and viral FcyRs. Fc ligands also include the Fc receptor (FcRH) homologues (Davis et al., Immunological Reviews 190, 2002, pp. 123-136), which are a family of Fc receptors homologous to FcyR. Fc ligands also include unidentified molecules that bind to Fc.

Активность связывания с Fcy-рецептором.Fcy receptor binding activity.

Нарушение активности связывания Fc-домена с любым из Fcy-рецепторов FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA и/или FcyIIIB можно оценивать, используя описанные выше форматы FACS и ELISA, а также ALPHA Screen-анализ (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминисценции, BIACORE-метод на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, с. 4005-4010).Disruption of Fc domain binding activity to any of the Fcy receptors FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA and/or FcyIIIB can be assessed using the FACS and ELISA formats described above, as well as ALPHA Screen analysis (homogeneous analysis of proximity-enhanced luminescence, BIACORE method based on surface plasmon resonance (SPR) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, pp. 4005-4010).

ALPHA Screen-анализ осуществляют на основе технологии ALPHA, которая основана на описанном ниже принципе, с использованием двух типов гранул. Люминисцентный сигнал становится обнаруживаемым только тогда, когда происходит биологическое взаимодействие молекул, связанных с гранулами-донорами, с молекулами, связанными с гранулами-акцепторами, и когда обе гранулы находятся в непосредственной близости друг от друга. Возбужденный лазерным пучком фотосенсибилизатор в гранулах-донорах превращает кислород в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород диффундирует из гранул-доноров и достигает гранул-акцепторов, локализованных в непосредственной близости, то индуцируется хемилюминисцентная реакция в гранулах-акцепторах. В итоге эта реакция приводит к испусканию света. Если молекулы, связанные с гранулами-донорами, не взаимодействуют с гранулами-акцепторами, то синглетный кислород, который продуцируется гранулами-донорами, не достигает гранул-акцепторов и хемилюминисцентная реакция не происходит.ALPHA Screen analysis is carried out on the basis of ALPHA technology, which is based on the principle described below, using two types of beads. The luminescent signal becomes detectable only when there is a biological interaction of the molecules associated with the donor beads with the molecules associated with the acceptor beads, and when both beads are in close proximity to each other. Excited by a laser beam, the photosensitizer in donor granules converts oxygen into excited singlet oxygen. When singlet oxygen diffuses from the donor granules and reaches the acceptor granules located in close proximity, a chemiluminescent reaction is induced in the acceptor granules. As a result, this reaction leads to the emission of light. If the molecules bound to the donor granules do not interact with the acceptor granules, then the singlet oxygen produced by the donor granules does not reach the acceptor granules and the chemiluminescent reaction does not occur.

Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу иммобилизуют на гранулахдонорах, а меченный глутатион-S-трансферазой (GST) Fcy-рецептор иммобилизуют на гранулахакцепторах. В отсутствии антигенсвязывающей молекулы, содержащей конкурирующий мутантный Fcдомен, Fcy-рецептор взаимодействует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-домен дикого типа, индуцируя в результате сигнал с длиной волны от 520 до 620 нм. Антигенсвязывающая молекула, содержащая немеченый мутантный Fc-домен, конкурирует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-домен дикого типа, за взаимодействие с Fcy-рецептором. Относительную аффинность связывания можно оценивать, определяя количественно снижение флуоресценции в результате конкуренции. Методы биотинилирования антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, с помощью сульфо-NHSбиотина или подобных агентов являются известными. Приемлемые методы введения GST-метки в Fcyрецептор включают методы, которые предусматривают слияние полипептидов, кодирующих Fcy и GST, в рамке считывания, экспрессию слитого гена с использованием клеток, в которые интродуцирован вектор, несущий ген, и последующую очистку с помощью содержащей глутатион колонки. Индуцированный сигнал предпочтительно можно анализировать, например, посредством подгонки к односайтовой модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа с использованием такой программы, как GRAPHPAD PRISM (фирма GraphPad; Сан-Диего).For example, a biotin-labeled antigen-binding molecule is immobilized on donor beads, and a glutathione-S-transferase (GST) labeled Fcy receptor is immobilized on acceptor beads. In the absence of an antigen-binding molecule containing a competing mutant Fc domain, the Fcy receptor interacts with an antigen-binding molecule containing a wild-type Fc domain, resulting in a signal with a wavelength of 520 to 620 nm. An antigen-binding molecule containing an unlabeled mutant Fc domain competes with an antigen-binding molecule containing a wild-type Fc domain for interaction with the Fcy receptor. Relative binding affinity can be assessed by quantifying the reduction in fluorescence due to competition. Methods for biotinylating antigen-binding molecules such as antibodies with sulfo-NHSbiotin or the like are known. Acceptable methods for introducing a GST tag into the Fcy receptor include methods that involve in-frame fusion of Fcy and GST-encoding polypeptides, expression of the fusion gene using cells into which a vector carrying the gene has been introduced, and subsequent purification with a glutathione containing column. The induced signal can preferably be analyzed, for example, by fitting to a single site competition model based on non-linear regression analysis using a program such as GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).

Одну из субстанций, предназначенных для исследования их взаимодействия, иммобилизуют в качестве лиганда на тонком слое золота сенсорного чипа. Когда свет проникает на заднюю поверхность сенсорного чипа так, что имеет место полное отражение на границе раздела между тонким слоем золота и стеклом, то интенсивность отраженного света в определенном сайте частично снижается (SPR-сигнал). Другую субстанцию, предназначенную для исследования ее взаимодействия, инъецируют в качестве аналита на поверхность сенсорного чипа. Когда аналит связывается с лигандом, то масса иммобилизованной молекулы-лиганда возрастает. Это изменяет показатель преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа. Изменение показателя преломления вызывает положительный сдвиг SPR-сигнала (и наоборот, диссоциация сдвигает сигнал назад в исходное положение). В Biacore-системе уровень описанного выше сдвига (т.е. изменение массы на поверхности сенсорного чипа) откладывают по вертикальной оси, и таким образом в качестве количественных данных получают график изменения массы в зависимости от времени (сенсограмма). Кинетические параметры (константа скорости ассоциации (k_a) и константа скорости диссоциации (kd)) определяют из представленных в виде кривых сенсограмм, и определяют аффинность (KD) как соотношение указанных двух констант. BIACORE-методы предпочтительно применяют для анализа ингибирования. Примеры такого анализа ингибирования описаны в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, с. 4005-4010.One of the substances intended to study their interaction is immobilized as a ligand on a thin gold layer of the sensor chip. When light enters the rear surface of the sensor chip so that there is total reflection at the interface between the thin layer of gold and glass, then the intensity of the reflected light at a certain site is partially reduced (SPR signal). Another substance intended to study its interaction is injected as an analyte onto the surface of the sensor chip. When an analyte binds to a ligand, the mass of the immobilized ligand molecule increases. This changes the refractive index of the solvent on the surface of the sensor chip. A change in refractive index causes a positive shift in the SPR signal (conversely, dissociation shifts the signal back to its original position). In the Biacore system, the level of the shift described above (i.e., mass change on the surface of the sensor chip) is plotted on the vertical axis, and thus a graph of mass change versus time (sensogram) is obtained as quantitative data. The kinetic parameters (association rate constant (k _a ) and dissociation rate constant (kd)) are determined from the sensorgram curves, and affinity (KD) is determined as the ratio of the two constants. BIACORE methods are preferably used for inhibition assays. Examples of such an inhibition assay are described in Proc. Natl. Acad. sci. USA 103(11), 2006, p. 4005-4010.

В контексте настоящего описания пониженная активность связывания с Fcy-рецептором означает,In the context of the present description, reduced binding activity to the Fcy receptor means

- 36 041830 например, что при использовании описанного выше метода анализа конкурентная активность тестируемой антигенсвязывающей молекулы составляет 50% или менее, предпочтительно 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 20% или менее или 15% или менее и наиболее предпочтительно 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% менее, по сравнению с конкурентной активностью контрольной антигенсвязывающей молекулы.- 36 041830 for example, that when using the assay method described above, the competitive activity of the tested antigen-binding molecule is 50% or less, preferably 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 20% or less, or 15 % or less and most preferably 10% or less, 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less or 1% less than the competitive activity of the control antigen-binding molecule.

Антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-домен моноклонального антитела в виде IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, можно использовать соответственно в качестве контрольных антигенсвязывающих молекул. Структуры Fc-домена представлены в SEQ ID NO: 37 (А добавлен к N-концу последовательности, представленной в RefSeq под регистрационным номером ААС82527.1), SEQ ID NO: 38 (А добавлен к N-концу последовательности, представленной в RefSeq под регистрационным номером ААВ59393.1), SEQ ID NO: 25 (А добавлен к N-концу последовательности, представленной в RefSeq под регистрационным номером САА27268.1) и SEQ ID NO: 39 (А добавлен к N-концу последовательности, представленной в RefSeq под регистрационным номером ААВ59394.1). Кроме того, когда антигенсвязывающую молекулу, содержащую мутантный Fc-домен антитела конкретного изотипа, используют в качестве тестируемой субстанции, то воздействие мутации мутанта на активность связывания с Fcy-рецептором оценивают с использованием в качестве контроля антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-домен такого же изотипа. Как описано выше, соответственно получают антигенсвязывающие молекулы, содержащие мутантный Fc-домен с действительно пониженной активностью связывания с Fcy-рецептором.Antigen-binding molecules containing the Fc domain of a monoclonal antibody in the form of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, respectively, can be used as control antigen-binding molecules. The Fc domain structures are shown in SEQ ID NO: 37 (A added to the N-terminus of the sequence listed in RefSeq accession number AAC82527.1), SEQ ID NO: 38 (A added to the N-terminus of the sequence listed in RefSeq accession number AAB59393.1), SEQ ID NO: 25 (A added to the N-terminus of the sequence listed in RefSeq accession CAA27268.1) and SEQ ID NO: 39 (A added to the N-terminus of the sequence listed in RefSeq accession number AAB59394.1). In addition, when an antigen-binding molecule containing a mutant Fc domain of an antibody of a particular isotype is used as a test substance, the effect of the mutant mutation on Fcy receptor binding activity is evaluated using an antigen-binding molecule containing an Fc domain of the same isotype as a control. As described above, antigen-binding molecules containing a mutant Fc domain with truly reduced Fcy receptor binding activity are suitably prepared.

Такие известные мутанты включают, например, мутанты с делецией аминокислот 231A-238S (EUнумерация) (WO 2009/011941), а также мутанты C226S, C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol 34, 2007, с. 11); C226S и C229S (Hum. Antibod. Hybridomas 1(1), 1990, с. 47-54); C226S, C229S, Е233Р, L234V, и L235A (Blood 109, 2007, с. 1185-1192).Such known mutants include, for example, amino acid deletion mutants 231A-238S (EU numbering) (WO 2009/011941), as well as mutants C226S, C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol 34, 2007, p. 11); C226S and C229S (Hum. Antibod. Hybridomas 1(1), 1990, pp. 47-54); C226S, C229S, E233P, L234V, and L235A (Blood 109, 2007, pp. 1185-1192).

В частности, предпочтительными антигенсвязывающими молекулами являются молекулы, которые содержат Fc-домен с заменой аминокислоты в положении 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 или 332 (EU-нумерация) в аминокислотах, образующих Fc-домен антитела конкретного изотипа. Изобретение не ограничено изотипом антитела, из которого получают Fc-домен, и можно использовать соответствующий Fc-домен, полученный из моноклонального антитела в виде IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Предпочтительно следует применять Fc-домен, полученный из антител в виде IgG1.Particularly preferred antigen-binding molecules are molecules that contain an Fc domain with an amino acid substitution at position 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266 , 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331, or 332 (EU numbering) in the amino acids that form the Fc domain of an antibody of a particular isotype. The invention is not limited to the isotype of the antibody from which the Fc domain is derived, and the corresponding Fc domain derived from an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 monoclonal antibody can be used. Preferably, an Fc domain derived from IgG1 antibodies should be used.

Предпочтительными антигенсвязывающими молекулами являются, например, молекулы, которые содержат Fc-домен, содержащий одну из указанных ниже замен, положение которой определяется согласно EU-нумерации (каждый номер обозначает положение аминокислотного остатка согласно EUнумерации; и однобуквенный символ аминокислоты, который находится перед номером, обозначает аминокислотный остаток до его замены, а однобуквенный символ аминокислоты, расположенный за номером, обозначает аминокислотный остаток после замены), среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG1:Preferred antigen-binding molecules are, for example, molecules that contain an Fc domain containing one of the following substitutions, the position of which is determined according to the EU numbering (each number indicates the position of the amino acid residue according to the EU numbering; and the one-letter amino acid symbol that precedes the number indicates amino acid residue before its substitution, and the one-letter amino acid symbol following the number denotes the amino acid residue after substitution), among the amino acids that form the Fc domain of an IgG1 antibody:

(a) L234F, L235E, P331S;(a) L234F, L235E, P331S;

(б) C226S, C229S, P238S;(b) C226S, C229S, P238S;

(в) C226S, C229S;(c) C226S, C229S;

(г) C226S, C229S, Е233Р, L234V, L235A;(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A;

(д) L234A, L235A или L235R, N297A;(e) L234A, L235A or L235R, N297A;

(е) L235A или L235R, S239K, N297A, а также молекулы, которые содержат Fc-домен с делецией аминокислот в положениях 231-238.(e) L235A or L235R, S239K, N297A, as well as molecules that contain an Fc domain with a deletion of amino acids at positions 231-238.

Кроме того, предпочтительными антигенсвязывающими молекулами являются также молекулы, которые содержат Fc-домен, содержащий одну из указанных ниже замен, положение которой определяют согласно EU-нумерации, среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG2:In addition, preferred antigen-binding molecules are also molecules that contain an Fc domain containing one of the following substitutions, the position of which is determined according to EU numbering, among the amino acids that form the Fc domain of an IgG2 antibody:

(ж) H268Q, V309L, A330S и P331S;(g) H268Q, V309L, A330S and P331S;

(з) V234A;(h) V234A;

(и) G237A;(i) G237A;

(к) V234A и G237A;(j) V234A and G237A;

(л) А235Еи G237A;(k) A235E and G237A;

(м) V234A, А235Е и G237A.(m) V234A, A235E and G237A.

Каждый номер обозначает положение аминокислотного остатка согласно EU-нумерации; и однобуквенный символ аминокислоты, который находится перед номером, обозначает аминокислотный остаток до его замены, а однобуквенный символ аминокислоты, расположенный за номером, обозначает аминокислотный остаток после замены.Each number indicates the position of the amino acid residue according to the EU numbering; and the one-letter amino acid symbol that precedes the number indicates the amino acid residue before it was changed, and the one-letter amino acid symbol that follows the number indicates the amino acid residue after the change.

Кроме того, предпочтительными антигенсвязывающими молекулами являются молекулы, которые содержат Fc-домен, содержащий одну из указанных ниже замен, положение которой определяют согласно EU-нумерации, среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG3:In addition, preferred antigen-binding molecules are molecules that contain an Fc domain containing one of the following substitutions, the position of which is determined according to EU numbering, among the amino acids that form the Fc domain of an IgG3 antibody:

(н) F241A;(n) F241A;

- 37 041830 (о) D265A;- 37 041830 (o) D265A;

(п) V264A.(p) V264A.

Кроме того, предпочтительными антигенсвязывающими молекулами являются молекулы, которые содержат Fc-домен, содержащий одну из указанных ниже замен, положение которой определяют согласно EU-нумерации, среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG4:In addition, preferred antigen-binding molecules are molecules that contain an Fc domain containing one of the following substitutions, the position of which is determined according to EU numbering, among the amino acids that form the Fc domain of an IgG4 antibody:

(р) L235A, G237A и Е318А;(p) L235A, G237A and E318A;

(c) L235E;(c) L235E;

(т) F234A и L235A.(r) F234A and L235A.

Другие предпочтительные антигенсвязывающие молекулы представляют собой молекулы, содержащие Fc-домен, в котором любая аминокислота в положении 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 или 331 (EU-нумерация) среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG1, заменена на аминокислоту, которая находится в соответствующем положении согласно EU-нумерации в соответствующем IgG2 или IgG4.Other preferred antigen binding molecules are molecules containing an Fc domain in which any amino acid at position 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330, or 331 (EU numbering) is among the amino acids that form the Fc domain of an IgG1 antibody , is replaced by an amino acid that is in the corresponding position according to the EU numbering in the corresponding IgG2 or IgG4.

Предпочтительные антигенсвязывающие молекулы представляют собой также молекулы, содержащие Fc-домен, в котором одна или несколько аминокислот в положениях 234, 235 и 297 (EU-нумерация) среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG1, заменена(ы) на другие аминокислоты. Изобретение не ограничено типом аминокислоты после замены; однако наиболее предпочтительными являются антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-домен, в котором одна или несколько аминокислот в положениях 234, 235 и 297 заменена(ы) на аланин.Preferred antigen-binding molecules are also molecules containing an Fc domain in which one or more amino acids at positions 234, 235 and 297 (EU numbering) among the amino acids that form the Fc domain of an IgG1 antibody have been replaced by other amino acids . The invention is not limited to the type of amino acid after the substitution; however, most preferred are antigen-binding molecules containing an Fc domain in which one or more amino acids at positions 234, 235 and 297 have been replaced by alanine.

Предпочтительные антигенсвязывающие молекулы представляют собой также молекулы, содержащие Fc-домен, в котором аминокислота в положении 265 (EU-нумерация) среди аминокислот, образующих Fc-домен антитела в виде IgG1, заменена другой аминокислотой. Изобретение не ограничено типом аминокислоты после замены; однако наиболее предпочтительными являются антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-домен, в котором аминокислота в положении 265 заменена на аланин.Preferred antigen-binding molecules are also molecules containing an Fc domain in which the amino acid at position 265 (EU numbering) among the amino acids that form the Fc domain of an IgG1 antibody has been replaced by another amino acid. The invention is not limited to the type of amino acid after the substitution; however, most preferred are antigen-binding molecules containing an Fc domain in which the amino acid at position 265 is replaced by alanine.

Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула.Multispecific antigen-binding molecule.

Примеры предпочтительных вариантов мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, включают мультиспецифические антитела. Когда Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcy-рецептора применяют в качестве Fc-области мультиспецифического антитела, то соответственно можно применять Fc-область, полученную из мультиспецифического антитела. Биспецифические антитела являются наиболее предпочтительными в качестве мультиспецифических антител, предлагаемых в настоящем изобретении. В этом случае биспецифическое антитело представляет собой антитело, имеющее две различные специфичности. Биспецифические антитела IgG-типа можно секретировать из гибридной гибридомы (квадромы), полученной путем слияния двух типов гибридом, продуцирующих антитело в виде IgG (Milstein С. и др., Nature 305, 1983, с. 537-540).Examples of preferred variants of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention include multispecific antibodies. When an Fc region with reduced Fcy receptor binding activity is used as the Fc region of a multispecific antibody, an Fc region derived from the multispecific antibody can be used accordingly. Bispecific antibodies are most preferred as multispecific antibodies of the present invention. In this case, a bispecific antibody is an antibody having two different specificities. Bispecific IgG-type antibodies can be secreted from a hybridoma (quadroma) obtained by fusing two types of hybridomas producing an IgG antibody (Milstein C. et al., Nature 305, 1983, pp. 537-540).

Кроме того, биспецифические антитела IgG-типа секретируют посредством интродукции в клетки в целом четырех генов, т.е. генов L-цепей и H-цепей, образующих представляющие интерес IgG двух типов, и их коэкспрессии. Однако теоретически существует десять комбинаций H-цепей и L-цепей IgG, которые можно получать такими методами. При этом трудно очищать IgG, состоящий из требуемой комбинации H-цепей и L-цепей из десяти типов IgG. Кроме того, теоретическое количество секретируемого IgG с требуемой комбинацией, также в значительной степени снижено, поэтому требуется осуществлять крупномасштабное культивирование. Это дополнительно увеличивает стоимость производства.In addition, IgG-type bispecific antibodies are secreted by introducing four genes into cells in total, ie. L-chain and H-chain genes forming two types of IgGs of interest, and their co-expression. However, theoretically, there are ten combinations of H chains and L chains of IgG that can be obtained by such methods. However, it is difficult to purify IgG consisting of the required combination of H chains and L chains from ten IgG types. In addition, the theoretical amount of secreted IgG with the desired combination is also greatly reduced, so large-scale cultivation is required. This further increases the cost of production.

Таким образом, для мультиспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых к настоящем изобретении, можно применять методики, усиливающие ассоциацию между H-цепями и между L- и H-цепями, имеющими требуемые комбинации.Thus, for the multispecific antigen-binding molecules of the present invention, techniques can be applied to enhance association between H chains and between L and H chains having the desired combinations.

Например, методики подавления нежелательной ассоциации H-цепей путем интродукции электростатического отталкивания на поверхности раздела второго константного участка или третьего константного участка H-цепи антитела (СН2 или CH3) можно применять для ассоциации мультиспецифического антитела (WO 2006/106905).For example, techniques for suppressing unwanted H chain association by introducing electrostatic repulsion at the interface of the second constant region or the third constant region of the H chain of an antibody (CH2 or CH3) can be used to associate a multispecific antibody (WO 2006/106905).

При осуществлении метода подавления нежелательной ассоциации H-цепей путем интродукции электростатического отталкивания на поверхности раздела СН2 или CH3, примеры аминокислотных остатков, контактирующих на поверхности раздела с другим константным участком H-цепи, включают области, соответствующие остаткам, находящимся согласно EU-нумерации в положениях 356, 439, 357, 370, 399 и 409 в CH3-участке.In a method for suppressing undesirable association of H chains by introducing electrostatic repulsion at the CH2 or CH3 interface, examples of amino acid residues contacting at the interface with another H chain constant site include regions corresponding to residues located at positions 356 according to EU numbering. , 439, 357, 370, 399, and 409 in the CH3 region.

- 38 041830- 38 041830

Более конкретно, примеры включают антитело, содержащее два типа СНЗ-участков H-цепи, в которых 1-3 пары аминокислотных остатков в CH3-участке первой H-цепи, выбранные из пар аминокислотных остатков, указанных ниже в подпунктах (1)-(3), несут одинаковый типа заряда:More specifically, examples include an antibody containing two types of H chain CH3 regions, in which 1-3 amino acid residue pairs in the CH3 region of the first H chain are selected from the amino acid residue pairs specified in subparagraphs (1) to (3) below. ), carry the same type of charge:

(1) аминокислотные остатки в CH3-участке H-цепи, которые находятся согласно EU-нумерации в положениях 356 и 439;(1) amino acid residues in the CH3 region of the H chain, which are according to EU numbering at positions 356 and 439;

(2) аминокислотные остатки в CH3-участке H-цепи, которые находятся согласно EU-нумерации в положениях 357 и 370; и (3) аминокислотные остатки в CH3-участке H-цепи, которые находятся согласно EU-нумерации в положениях 399 и 409.(2) amino acid residues in the CH3 region of the H chain, which are according to EU numbering at positions 357 and 370; and (3) amino acid residues in the CH3 region of the H chain, which are EU numbered at positions 399 and 409.

Кроме того, антитело может представлять собой антитело, в котором пары аминокислотных остатков в CH3-участке второй H-цепи, который отличается от указанного выше CH3-участка первой H-цепи, выбирают из вышеуказанных в подпунктах (1)-(3) пар аминокислотных остатков, в котором 1-3 пары аминокислотных остатков, которые соответствуют вышеуказанным в подпунктах (1)-(3) парам аминокислотных остатков, несущим такой же тип заряда, что и указанный выше для CH3-участка первой Hцепи, несут противоположные заряды относительно соответствующих аминокислотных остатков в указанном выше CH3-участке первой H-цепи.In addition, the antibody may be an antibody in which the pairs of amino acid residues in the CH3 region of the second H chain, which is different from the above CH3 region of the first H chain, are selected from the above amino acid pairs in subparagraphs (1) to (3). residues, in which 1-3 pairs of amino acid residues that correspond to the above pairs of amino acid residues in subparagraphs (1) to (3), bearing the same type of charge as indicated above for the CH3 region of the first H chain, carry opposite charges with respect to the corresponding amino acid residues in the above CH3 region of the first H chain.

Соответствующие аминокислотные остатки, указанные выше в подпунктах (1)-(3), при ассоциации располагаются близко друг к другу. Специалисты в данной области могут установить для требуемого CH3-участка H-цепи или константной области H-цепи сайты, которые соответствуют вышеуказанным остаткам, указанным в подпунктах (1)-(3), посредством моделирования гомологии и т.п., используя поступающую в продажу программу, и аминокислотные остатки этих сайтов можно подвергать при необходимости модификациям.The corresponding amino acid residues mentioned in subparagraphs (1) to (3) above are located close to each other when associated. For a desired H chain CH3 region or an H chain constant region, sites that correspond to the above residues specified in (1) to (3) can be determined by those skilled in the art through homology modeling and the like using sale program, and the amino acid residues of these sites can be subjected to modifications if necessary.

В указанных выше антителах имеющие заряд аминокислотные остатки предпочтительно выбирают, например, из аминокислотных остатков, которые входят в любую одну из указанных ниже групп (а) и ^(б):In the above antibodies, the charged amino acid residues are preferably selected, for example, from amino acid residues that are included in any one of the following groups (a) and ^(b) :

(а) глутаминовая кислота (E) и аспарагиновая кислота (D) и (б) лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H).(a) glutamic acid (E) and aspartic acid (D); and (b) lysine (K), arginine (R) and histidine (H).

Касательно указанных выше антител то, что они имеют одинаковый тип заряда означает, например, что два или большее количество аминокислотных остатков все представляют собой аминокислотные остатки, включенные в любую одну из вышеуказанных групп (а) и (б). Понятие имеют противоположный заряд означает, например, что, когда по меньшей мере один из двух или большего количества аминокислотных остатков представляет собой аминокислотный остаток, включенный в любую одну из вышеуказанных групп (а) и (б), остальные остатки должны представлять собой аминокислотные остатки, включенные в другую группу.With regard to the above antibodies, that they have the same type of charge means, for example, that two or more amino acid residues are all amino acid residues included in any one of the above groups (a) and (b). The term having an opposite charge means, for example, that when at least one of two or more amino acid residues is an amino acid residue included in any one of the above groups (a) and (b), the remaining residues must be amino acid residues, included in another group.

В предпочтительном варианте вышеуказанного антитела CH3-участок первой H-цепи и CH3участок второй H-цепи могут быть перекрестно сшиты дисульфиднымм мостиками.In a preferred embodiment of the above antibody, the CH3 region of the first H chain and the CH3 region of the second H chain may be cross-linked with disulfide bridges.

Согласно настоящему изобретению аминокислотные остатки, подлежащие изменению, не ограничены аминокислотными остатками константной области или вариабельной области описанного выше антитела. Касательно полипептидных мутантов или гетеромультимеров специалисты в данной области могут установить аминокислотные остатки, которые образуют поверхность раздела, посредством моделирования гомологии и т.п., используя поступающую в продажу программу, и аминокислотные остатки этих сайтов можно подвергать при необходимости изменениям для того, чтобы регулировать ассоциацию.According to the present invention, the amino acid residues to be changed are not limited to the amino acid residues of the constant region or variable region of the antibody described above. For polypeptide mutants or heteromultimers, those skilled in the art can determine the amino acid residues that form the interface by homology modeling and the like using a commercially available program, and the amino acid residues of these sites can be modified as necessary to control association. .

Другие известные методики можно применять также для ассоциации мультиспецифических антител, предлагаемых в настоящем изобретении. Полипептиды с различными аминокислотами в Fc-области можно эффективно ассоциировать друг с другом путем замены боковой цепи аминокислоты, присутствующей в одной из вариабельных областей H-цепи антитела, на более крупную боковую цепь (выступ) и замены боковой цепи аминокислоты в соответствующей вариабельной области другой H-цепи на меньшую боковую цепь (впадина) так, что выступ помещается во впадину (WO 1996/027011; Ridgway J.B. и др., Protein Engineering 9, 1996, с. 617-621; Merchant A.M. и др., Nature Biotechnology 16, 1998, с. 677-681 и US 20130336973).Other known techniques can also be applied to the association of multispecific antibodies proposed in the present invention. Polypeptides with different amino acids in the Fc region can be efficiently associated with each other by replacing the side chain of an amino acid present in one of the variable regions of the H chain of an antibody with a larger side chain (overhang) and replacing the amino acid side chain in the corresponding variable region with another H -chain onto a smaller side chain (depression) so that the protrusion fits into the depression (WO 1996/027011; Ridgway J.B. et al., Protein Engineering 9, 1996, p. 617-621; Merchant A.M. et al., Nature Biotechnology 16, 1998, pp. 677-681 and US 20130336973).

Кроме того, другие известные методики можно применять также для ассоциации мультиспецифических антител, предлагаемых в настоящем изобретении. Ассоциацию полипептидов, имеющих различные последовательности, можно эффективно индуцировать путем комплементарной ассоциации CH3областей, используя сконструированный CH3-домен с обменом цепей, полученный путем изменения части CH3 в одной из H-цепей антитела на соответствующую полученную из IgA последовательность и интродукции в комплементарную часть CH3 в другой H-цепи соответствующей полученной из IgA последовательности (Protein Engineering Design & Selection, 23, 2010, с. 195-202). Указанную известную методику можно применять также для эффективного получения представляющих интерес мультиспецифических антител.In addition, other known techniques can also be applied to the association of multispecific antibodies proposed in the present invention. Association of polypeptides having different sequences can be efficiently induced by complementary association of CH3 regions using a constructed CH3 chain exchange domain obtained by changing the CH3 portion of one of the antibody H chains to the corresponding IgA-derived sequence and introducing the CH3 complementary portion into the other. H chain of the corresponding IgA derived sequence (Protein Engineering Design & Selection, 23, 2010, pp. 195-202). This known technique can also be used to efficiently generate multispecific antibodies of interest.

Кроме того, для получения мультиспецифических антител можно применять следующие методики: методики получения антител на основе ассоциации СН1 и CL антитела и ассоциации VH и VL, которыеIn addition, the following techniques can be used to produce multispecific antibodies: techniques for producing antibodies based on the association of CH1 and CL of the antibody and the association of VH and VL, which

- 39 041830 описаны в WO 2011/028952, WO2014/018572 и в Nat Biotechnol. 32(2), февраль 2014 г., с. 191-198; методики получения биспецифических антител с использованием в комбинации полученных по отдельности моноклональных антител (обмен плечей Fab, (Fab arm exchange, FAE), описанные в WO 2008/119353 и WO 2011/131746; методики регуляции ассоциации между CH3-доменом тяжелых цепей антител, описанные в WO 2012/058768 и WO 2013/063702; методики получения биспецифических антител, состоящих из двух типов легких цепей и одного типа тяжелой цепи, описанные в WO 2012/023053; методики получения биспецифических антител с использованием двух штаммов бактериальных клеток, которые индивидуально экспрессируют одну из цепей антитела, содержащего одну H-цепь и одну L-цепь, описанные Christoph и др., Nature Biotechnology т. 31, 2013, с. 753-758).- 39 041830 are described in WO 2011/028952, WO2014/018572 and Nat Biotechnol. 32(2), February 2014, p. 191-198; techniques for producing bispecific antibodies using a combination of single-produced monoclonal antibodies (Fab arm exchange, FAE) described in WO 2008/119353 and WO 2011/131746; techniques for regulating association between the CH3 domain of antibody heavy chains as described in WO 2012/058768 and WO 2013/063702; methods for producing bispecific antibodies consisting of two types of light chains and one type of heavy chain described in WO 2012/023053; methods for producing bispecific antibodies using two strains of bacterial cells that individually express one from antibody chains containing one H chain and one L chain described by Christoph et al., Nature Biotechnology vol. 31, 2013, pp. 753-758).

Альтернативно этому, даже, если представляющее интерес мультиспецифическое антитело нельзя получать эффективно, мультиспецифическое антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно получать путем отделения представляющего интерес мультиспецифического антитела от полученных антител и его очистки. Например, описан метод, позволяющий осуществлять очистку двух типов гомомерных форм и представляющего интерес гетеромерного антитела с помощью ионообменной хроматографии, путем установления различия в изоэлектрических точках в результате интродукции аминокислотных замен в вариабельные области двух типов H-цепей (WO 2007/114325). К настоящему времени в качестве метода для очистки гетеромерных форм описан метод, основанный на применении белка А для очистки гетеродимерного антитела, содержащего H-цепь мышиного IgG2a, которая связывается с белком А, и H-цепь крысиного IgG2b, которая не связывается с белком A (WO 98/050431 и WO 95/033844). Кроме того, гетеродимеризованное антитело само можно эффективно очищать с использованием колонки с белком А путем изменения взаимодействия между каждой из H-цепей и белком А, путем применения Hцепей, в которых аминокислотные остатки в сайте связывания IgG-белок А в положениях 435 и 436 (EUнумерация) заменены на аминокислотные остатки, которые обеспечивают другую аффинность связывания с белком А, такие как Tyr, His или т.п., или с использованием H-цепей с различной аффинностью к белку А, которые получают согласно методу, указанному в приведенном для сравнения примере 5, для изменения взаимодействия каждой из H-цепей с белком А, и последующего применения колонки с белком А.Alternatively, even if the multispecific antibody of interest cannot be efficiently produced, the multispecific antibody of the present invention can be obtained by separating the multispecific antibody of interest from the obtained antibodies and purifying it. For example, a method is described that allows the purification of two types of homomeric forms and a heteromeric antibody of interest using ion exchange chromatography, by establishing a difference in isoelectric points as a result of the introduction of amino acid substitutions in the variable regions of two types of H chains (WO 2007/114325). To date, a method based on the use of protein A to purify a heterodimeric antibody containing a mouse IgG2a H chain that binds to protein A and a rat IgG2b H chain that does not bind to protein A has been described as a method for purifying heteromeric forms ( WO 98/050431 and WO 95/033844). In addition, a heterodimerized antibody can itself be efficiently purified using a protein A column by changing the interaction between each of the H chains and protein A, by using H chains in which the amino acid residues in the binding site of IgG protein A at positions 435 and 436 (EU numbering ) are replaced by amino acid residues that provide a different binding affinity for protein A, such as Tyr, His or the like, or using H chains with different affinities for protein A, which are prepared according to the method indicated in the comparative example 5 to change the interaction of each of the H chains with protein A, and then apply the protein A column.

Альтернативно этому, можно получать общую L-цепь, которая может обеспечивать способность связываться с множеством различных H-цепей, и применять в качестве общей L-цепи мультиспецифического антитела. Для достижения эффективной экспрессии мультиспецифического IgG можно интродуцировать в клетки гены указанной общей L-цепи и множества различных H-цепей и экспрессировать IgG (Nature Biotechnology, 16, 1998, с. 677-681). Метод селекции общей L-цепи, для которой характерна выраженная способность к связыванию с любыми различными H-цепями, можно применять также для селекции общей H-цепи (WO 2004/065611).Alternatively, a common L chain, which can provide the ability to bind to many different H chains, can be prepared and used as the common L chain of a multispecific antibody. To achieve efficient expression of multispecific IgG, genes for this common L chain and many different H chains can be introduced into cells and the IgG expressed (Nature Biotechnology, 16, 1998, p. 677-681). The general L chain selection method, which has a pronounced ability to bind to any of the various H chains, can also be used to select the general H chain (WO 2004/065611).

Кроме того, Fc-область, отличающуюся улучшенной С-концевой гетерогенностью, можно применять в качестве Fc-области, предлагаемой в настоящем изобретении. Более конкретно, предложены Fcобласти, в которых отсутствуют глицин в положении 446 и лизин в положении 447 (EU-нумерация) в аминокислотных последовательностях двух полипептидов, образующих Fc-область, которая происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.Moreover, an Fc region having improved C-terminal heterogeneity can be used as an Fc region according to the present invention. More specifically, Fc regions are provided that lack glycine at position 446 and lysine at position 447 (EU numbering) in the amino acid sequences of two polypeptides forming an Fc region that is derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

Несколько, например, две или большее количество, указанных методик можно применять в сочетании друг с другом. Кроме того, эти методики можно соответствующим образом и раздельно применять к двум H-цепям, подлежащим ассоциации. Кроме того, указанные методики можно применять в комбинации с описанной выше Fc-областью, у которой снижена активность связывания с Fcy-рецептором. Кроме того, антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой молекулу, полученную отдельно на основе антигенсвязывающей молекулы, подвергнутой таким описанным выше модификациям, что она имеет такую же аминокислотную последовательность.Several, for example, two or more, of these techniques can be used in combination with each other. In addition, these techniques can be appropriately and separately applied to the two H-strands to be associated. In addition, these techniques can be used in combination with the Fc region described above, which has reduced binding activity to the Fcy receptor. In addition, the antigen-binding molecule of the present invention may be a molecule obtained separately from an antigen-binding molecule subjected to the modifications described above such that it has the same amino acid sequence.

Приемлемая мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит:A suitable multispecific antigen-binding molecule of the present invention comprises:

(1) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3;(1) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for glypican 3;

(2) домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора; и (3) домен, содержащий указанную Fc-область с пониженной способностью связываться с Fcyрецептором, ее структура не ограничена указанной.(2) a domain containing an antibody variable region that has binding activity for the T-cell receptor complex; and (3) a domain containing the specified Fc region with reduced ability to bind to the Fcy receptor, its structure is not limited to the specified.

Согласно настоящему изобретению каждый из вышеуказанных доменов может быть сшит непосредственно с помощью пептидных связей. Например, когда применяют F(ab')₂ в качестве домена, содержащего вариабельную область антитела, указанного в подпунктах (1) и (2), и указанные Fc-области в качестве домена, содержащего Fc-область с пониженной способностью связываться с Fcy-рецептором, указанного в подпункте (3), то полипептиды, образованные путем сшивания содержащих вариабельных области доменов, указанных в подпунктах (1) и (2), и содержащего Fc-область домена, указанного в подпункте (3), с помощью пептидных связей, могут образовывать структуру антитела. Такие антитела мож- 40 041830 но получать путем очистки из указанной выше культуральной среды гибридомы, а также путем очистки антител из культуральной среды требуемых клеток-хозяев, которые стабильно несут полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, которые образуют антитело.According to the present invention, each of the above domains can be sewn directly using peptide bonds. For example, when F(ab') ₂ is used as the domain containing the variable region of the antibody specified in subparagraphs (1) and (2), and these Fc regions as the domain containing the Fc region with reduced ability to bind to Fcy- receptor specified in subparagraph (3), then polypeptides formed by cross-linking containing the variable regions of the domains specified in subparagraphs (1) and (2) and containing the Fc region of the domain specified in subparagraph (3), using peptide bonds, can form an antibody structure. Such antibodies can be obtained by purification from the above hybridoma culture medium, as well as by purification of antibodies from the culture medium of desired host cells that stably carry polynucleotides encoding polypeptides that form an antibody.

Примеры предпочтительной вариабельной области Н-цепи антитела, предлагаемой в настоящем изобретении, содержащееся в вариабельной области антитела со связывающей активностью в отношении глипикана 3, включают вариабельные области Н-цепи антитела, которые представлены в табл. 1, или вариабельные области Н-цепи антитела, которые имеют последовательности CDR, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 которых являются такими же, что аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащиеся в вариабельных областях Н-цепи, которые указаны в табл. 1, или вариабельные области Н-цепи антитела, которые функционально эквивалентны вышеуказанным вариабельным областям.Examples of the preferred variable region of the H chain of the antibody of the present invention, contained in the variable region of the antibody with binding activity against glypican 3, include the variable regions of the H chain of the antibody, which are presented in table. 1, or antibody H chain variable regions that have CDR sequences whose CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences are the same as the CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences contained in the H chain variable regions shown in Table 1. 1 or antibody H chain variable regions that are functionally equivalent to the above variable regions.

Таблица 1Table 1

Обозначение последовательности Sequence notation SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение последовательности Sequence notation SEQ ID NO: SEQID NO: НОООО NOOOOO 40 40 GCH042 GCH042 193 193 GCH003 GCH003 170 170 GCH043 GCH043 194 194 GCH005 GCH005 171 171 GCH045 GCH045 195 195 GCH006 GCH006 172 172 GCH053 GCH053 196 196 GCH007 GCH007 173 173 GCH054 GCH054 197 197 GCH008 GCH008 174 174 GCH055 GCH055 198 198 GCH010 GCH010 175 175 GCH056 GCH056 199 199 GCH012 GCH012 176 176 GCH057 GCH057 200 200 GCH013 GCH013 177 177 GCH059 GCH059 201 201 GCH014 GCH014 178 178 GCH060 GCH060 202 202 GCH015 GCH015 179 179 GCH061 GCH061 203 203 GCH016 GCH016 180 180 GCH062 GCH062 204 204 GCH019 GCH019 181 181 GCH064 GCH064 205 205 GCH022 GCH022 182 182 GCH065 GCH065 206 206 GCH023 GCH023 183 183 GCH066 GCH066 207 207 GCH025 GCH025 184 184 GCH067 GCH067 208 208 GCH026 GCH026 185 185 GCH068 GCH068 209 209 GCH027 GCH027 186 186 GCH073 GCH073 210 210 GCH029 GCH029 187 187 GCH094 GCH094 211 211 GCH032 GCH032 188 188 GCH098 GCH098 212 212 GCH034 GCH034 189 189 GCH099 GCH099 213 213 GCH035 GCH035 190 190 GCH100 GCH100 214 214 GCH039 GCH039 191 191 Н0610 H0610 215 215 GCH040 GCH040 192 192

Примеры предпочтительной вариабельной области антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клсточного рецептора, предлагаемой в настоящем изобретении, включают вариабельные области антитела, обладающие связывающей активностью в отношении Тклсточного рецептора. Из Т-клеточных рецепторов предпочтительным является СОЗ, а наиболее предпочтительным CD3e. Примеры вариабельной области Н-цепи антитела, содержащейся в указанных вариабельных областях антитела, включают вариабельные области Н-цепи антитела, которые представлены в табл. 2, или вариабельные области Н-цепи антитела, которые имеют последовательности CDR, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 которых являются такими же, что аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащиеся в вариабельных областях Н-цепи, которые указаны в табл. 2, или вариабельные области Н-цепи антитела, которые функционально эквивалентны вышеуказанным вариабельным областям.Examples of the preferred variable region of an antibody that has binding activity for the T cell receptor complex of the present invention include antibody variable regions that have binding activity for the T cell receptor. Of the T cell receptors, POPs are preferred and CD3e is most preferred. Examples of the variable region of the H chain of the antibody contained in these variable regions of the antibody include the variable regions of the H chain of the antibody, which are presented in table. 2, or antibody H chain variable regions that have CDR sequences whose CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences are the same as the CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences contained in the H chain variable regions shown in Table 2. 2 or antibody H chain variable regions that are functionally equivalent to the above variable regions.

-41 041830-41 041830

Таблица 2table 2

Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: ИСЕ115НА ICE115NA 52 52 TR01H036 TR01H036 99 99 TR01H074 TR01H074 135 135 СЕ115НА177 SE115HA177 64 64 TR01H037 TR01H037 100 100 TR01H075 TR01H075 136 136 СЕ115НА178 SE115HA178 65 65 TR01H038 TR01H038 101 101 TR01H076 TR01H076 137 137 СЕ115НА179 SE115HA179 66 66 TR01H039 TR01H039 102 102 TR01H077 TR01H077 138 138 СЕ115НА180 SE115HA180 67 67 TR01H040 TR01H040 103 103 TR01H079 TR01H079 139 139 hCE115HAa hCE115HAa 68 68 TR01H041 TR01H041 104 104 TR01H080 TR01H080 140 140 TR01H006 TR01H006 69 69 TR01H042 TR01H042 105 105 TR01H081 TR01H081 141 141 TR01H007 TR01H007 70 70 TR01H043 TR01H043 106 106 TR01H082 TR01H082 142 142 TR01H008 TR01H008 71 71 TR01H044 TR01H044 107 107 TR01H083 TR01H083 143 143 TR01H009 TR01H009 72 72 TR01H045 TR01H045 108 108 TR01H084 TR01H084 144 144 TR01H010 TR01H010 73 73 TR01H046 TR01H046 109 109 TR01H090 TR01H090 145 145 TR01H011 TR01H011 74 74 TRO1H047 TRO1H047 110 110 TR01H091 TR01H091 146 146 TR01H012 TR01H012 75 75 TR01H048 TR01H048 111 111 TR01H092 TR01H092 147 147 TR01H013 TR01H013 76 76 TR01H049 TR01H049 112 112 TR01H093 TR01H093 148 148 TR01H014 TR01H014 77 77 TR01H050 TR01H050 113 113 TR01H094 TR01H094 149 149 TR01H015 TR01H015 78 78 TR01H051 TR01H051 114 114 TR01H095 TR01H095 150 150 TR01H016 TR01H016 79 79 TR01H052 TR01H052 115 115 TR01H096 TR01H096 151 151 TR01H017 TR01H017 80 80 TR01H053 TR01H053 116 116 TR01H097 TR01H097 152 152 TR01H018 TR01H018 81 81 TR01H054 TR01H054 117 117 TR01H098 TR01H098 153 153 TR01H019 TR01H019 82 82 TR01H055 TR01H055 118 118 TR01H099 TR01H099 154 154 TR01H020 TR01H020 83 83 TR01H056 TR01H056 119 119 TR01H100 TR01H100 155 155 TR01H021 TR01H021 84 84 TR01H057 TR01H057 120 120 TR01H101 TR01H101 156 156 TR01H022 TR01H022 85 85 TR01H058 TR01H058 121 121 TR01H102 TR01H102 157 157 TR01H023 TR01H023 86 86 TR01H061 TR01H061 122 122 TR01H103 TR01H103 158 158 TR01H024 TR01H024 87 87 TR01H062 TR01H062 123 123 TR01H104 TR01H104 159 159 TR01H025 TR01H025 88 88 TR01H063 TR01H063 124 124 TR01H105 TR01H105 160 160 TR01H026 TR01H026 89 89 TR01H064 TR01H064 125 125 TR01H106 TR01H106 161 161 TR01H027 TR01H027 90 90 TR01H065 TR01H065 126 126 TR01H107 TR01H107 162 162 TR01H028 TR01H028 91 91 TR01H066 TR01H066 127 127 TR01H108 TR01H108 163 163 TR01H029 TR01H029 92 92 TR01H067 TR01H067 128 128 TR01H109 TR01H109 164 164 TR01H030 TR01H030 93 93 TR01H068 TR01H068 129 129 TR01H110 TR01H110 165 165 TR01H031 TR01H031 94 94 TR01H069 TR01H069 130 130 TR01H111 TR01H111 166 166 TR01H032 TR01H032 95 95 TR01H070 TR01H070 131 131 TR01H112 TR01H112 167 167 TR01H033 TR01H033 96 96 TR01H071 TR01H071 132 132 TR01H113 TR01H113 168 168 TR01H034 TR01H034 97 97 TR01H072 TR01H072 133 133 TR01H114 TR01H114 169 169 TR01H035 TR01H035 98 98 TR01H073 TR01H073 134 134 TR01H001 TR01H001 420 420 TR01H002 TR01H002 421 421 TR01H003 TR01H003 422 422 TR01H004 TR01H004 423 423 ГСЕ115Н GSE115N 424 424 CE115HA121 CE115HA121 425 425 CE115HA122 CE115HA122 426 426 CE115HA124 CE115HA124 427 427 CE115HA192 CE115HA192 428 428 CE115HA236 CE115HA236 429 429 CE115HA251 CE115HA251 430 430 CE115HA252 CE115HA252 431 431

Взаимосвязь между аминокислотными остатками CDR-участков, образующих аминокислотную последовательность H-цепи антитела, и EU-нумерацией Кэбота, представлена на фиг. 13.The relationship between the amino acid residues of the CDRs forming the amino acid sequence of the antibody H chain and Cabot's EU numbering is shown in FIG. 13.

Касательно вариабельных областей L-цепи антитела, содержащихся в вариабельной области антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, и вариабельной области антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительно следует получать общую L-цепь, которая может придавать связывающую активность H-цепи, которая обладает связывающей активностью в отношении глипикана 3, и связывающую активность H-цепи, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и применять ее в качестве вариабельной области общей Lцепи мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы.With regard to the variable regions of the L chain of the antibody contained in the variable region of the antibody that has a binding activity for glypican 3 and the variable region of the antibody that has a binding activity for the T-cell receptor complex of the present invention, it is preferable to obtain a total L chain that can confer binding activity of an H chain that has binding activity on glypican 3 and binding activity of an H chain that has binding activity on T-cell receptor complex, and use it as the variable region of the common L chain of multispecific antigen binding molecule.

Примеры вариабельной области общей L-цепи, которую можно применять согласно настоящему изобретению, включают вариабельные области L-цепи, указанные в табл. 3, вариабельные области Lцепи антитела, которые имеют последовательности CDR, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 которых являются такими же, что и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащиеся в вариабельных областях L-цепи антитела, указанных в табл. 3, и вариабельные области L-цепи антитела, которые функционально эквивалентны вышеуказанным вариабельным областям.Examples of the common L chain variable region that can be used according to the present invention include the L chain variable regions shown in Table 1. 3, antibody L chain variable regions that have CDR sequences whose CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences are the same as the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 contained in the antibody L chain variable regions shown in Table 3. 3 and antibody L chain variable regions that are functionally equivalent to the above variable regions.

- 42 041830- 42 041830

Таблица 3Table 3

Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: L0000 L0000 53 53 L0002 L0002 217 217 L0003 L0003 218 218 L0006 L0006 219 219 L0007 L0007 220 220 L0008 L0008 221 221 L0009 L0009 222 222 L0011 L0011 223 223 L0012 L0012 224 224 L0013 L0013 225 225 L0014 L0014 226 226 L0015 L0015 227 227 L0016 L0016 228 228 L0032 L0032 229 229 L0038 L0038 230 230 L0039 L0039 231 231 L0041 L0041 232 232 L0042 L0042 233 233 L0043 L0043 234 234 L0044 L0044 235 235 L0045 L0045 236 236 L0046 L0046 237 237 L0047 L0047 238 238 L0062 L0062 239 239 L0063 L0063 240 240 L0064 L0064 241 241 L0065 L0065 242 242 L0066 L0066 243 243 L0069 L0069 244 244 L0075 L0075 245 245 L0079 L0079 246 246 L0082 L0082 247 247 L0085 L0085 248 248 L0089 L0089 249 249 L0090 L0090 250 250 L0091 L0091 251 251 L0093 L0093 252 252 L0104 L0104 253 253 L0106 L0106 254 254 L0107 L0107 255 255 L0109 L0109 256 256 L0113 L0113 257 257 L0115 L0115 258 258 L0117 L0117 259 259 L0120 L0120 260 260 L0122 L0122 261 261 L0123 L0123 262 262 L0124 L0124 263 263

Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение послед-ти Sequence designation SEQ ID NO: SEQID NO: L0125 L0125 264 264 L0214 L0214 312 312 L0126 L0126 265 265 L0215 L0215 313 313 L0127 L0127 266 266 L0216 L0216 314 314 L0129 L0129 267 267 L0217 L0217 315 315 L0132 L0132 268 268 L0218 L0218 316 316 L0134 L0134 269 269 L0219 L0219 317 317 L0136 L0136 270 270 L0220 L0220 318 318 L0137 L0137 271 271 L0222 L0222 319 319 L0138 L0138 272 272 L0223 L0223 320 320 L0139 L0139 273 273 L0224 L0224 321 321 L0140 L0140 274 274 L0226 L0226 322 322 L0141 L0141 275 275 L0227 L0227 323 323 L0143 L0143 276 276 L0228 L0228 324 324 L0144 L0144 277 277 L0229 L0229 325 325 L0145 L0145 278 278 L0230 L0230 326 326 L0147 L0147 279 279 L0231 L0231 327 327 L0148 L0148 280 280 L0232 L0232 328 328 L0149 L0149 281 281 L0233 L0233 329 329 L0151 L0151 282 282 L0234 L0234 330 330 L0152 L0152 283 283 L0235 L0235 331 331 L0154 L0154 284 284 L0236 L0236 332 332 L0155 L0155 285 285 L0237 L0237 333 333 L0157 L0157 286 286 L0238 L0238 334 334 L0160 L0160 287 287 L0239 L0239 335 335 L0161 L0161 288 288 L0240 L0240 336 336 L0163 L0163 289 289 L0241 L0241 337 337 L0167 L0167 290 290 L0242 L0242 338 338 L0168 L0168 291 291 L0243 L0243 339 339 L0173 L0173 292 292 L0246 L0246 340 340 L0175 L0175 293 293 L0247 L0247 341 341 L0180 L0180 294 294 L0248 L0248 342 342 L0181 L0181 295 295 L0249 L0249 343 343 L0186 L0186 296 296 L0250 L0250 344 344 L0187 L0187 297 297 L0258 L0258 345 345 L0200 L0200 298 298 L0259 L0259 346 346 L0201 L0201 299 299 L0260 L0260 347 347 L0202 L0202 300 300 L0261 L0261 348 348 L0203 L0203 301 301 L0262 L0262 349 349 L0204 L0204 302 302 L0263 L0263 350 350 L0205 L0205 303 303 L0264 L0264 351 351 L0206 L0206 304 304 L0265 L0265 352 352 L0207 L0207 305 305 L0266 L0266 353 353 L0208 L0208 306 306 L0267 L0267 354 354 L0209 L0209 307 307 L0268 L0268 355 355 L0210 L0210 308 308 L0269 L0269 356 356 L0211 L0211 309 309 L0270 L0270 357 357 L0212 L0212 310 310 L0271 L0271 358 358 L0213 L0213 311 311 L0272 L0272 359 359

Взаимосвязь между аминокислотными остатками CDR-участков, образующих аминокислотную последовательность L-цепи антитела, и EU-нумерацией Кэбота, представлена на фиг. 14.The relationship between the amino acid residues of the CDRs forming the amino acid sequence of the antibody L chain and Cabot's EU numbering is shown in FIG. 14.

В настоящем изобретении фраза функционально эквивалентный означает, что аффинности связывания с антигеном эквиваленты или в альтернативном варианте означает, что цитотоксическая активность в отношении экспрессирующих глипикан 3 клеток или тканей, содержащих указанные клетки, эквивалентна при применении в качестве мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы. Аффинность связывания и цитотоксическую активность можно измерять с помощью метода, указанного в настоящем описании. Клетки, применяемые для измерения цитотоксической активности, могут представлять собой требуемые экспрессирующие GPC3 клетки или требуемую ткань, содержащую указанные клетки, и, например, можно применять человеческие раковые линии клеток и PC-10 или NCI-H446, которые экспрессируют GPC3. Касательно константных областей антитела фраза может означать, что связывающая активность в отношении FcY-рецептора является эквивалентной.In the present invention, the phrase functionally equivalent means that the binding affinities for an antigen are equivalent, or alternatively means that the cytotoxic activity against glypican 3 expressing cells or tissues containing said cells is equivalent when used as a multispecific antigen binding molecule. Binding affinity and cytotoxic activity can be measured using the method described in the present description. The cells used to measure cytotoxic activity may be the desired GPC3 expressing cells or the desired tissue containing said cells, and for example human cancer cell lines and PC-10 or NCI-H446 that express GPC3 can be used. With respect to the constant regions of an antibody, the phrase may mean that the FcY receptor binding activity is equivalent.

Например, фраза вариабельная область H-цепи антитела, функционально эквивалентная вариабельной области H-цепи антитела, указанной в настоящем описании (т.е. исходной вариабельной области H-цепи), означает, что эта область имеет такую же аффинность связывания, когда ее объединяют с вариабельной областью L-цепи антитела, указанной в настоящем описании, которая образует пару с исходной H-цепью, или в альтернативном варианте означает, что область обладает такой же цитотоксической активностью в отношении экспрессирующих глипикан 3 клеток или тканей, содержащих указанные клетки, когда ее применяют для получения мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы. Кроме того, фраза вариабельная область L-цепи антитела, функционально эквивалентная вариабельной области L-цепи антитела, указанной в настоящем описании (т.е. исходной вариабельной области L-цепи), означает, что эта область имеет такую же аффинность связывания, когда ее объединяют с вариабельнойFor example, the phrase antibody H chain variable region functionally equivalent to the antibody H chain variable region specified herein (i.e., the parent H chain variable region) means that the region has the same binding affinity when combined with an antibody L chain variable region as defined herein that pairs with the parent H chain, or alternatively means that the region has the same cytotoxic activity against glypican 3 expressing cells or tissues containing said cells when it used to obtain a multispecific antigen-binding molecule. In addition, the phrase antibody L chain variable region functionally equivalent to the antibody L chain variable region specified herein (i.e., the original L chain variable region) means that the region has the same binding affinity when its combined with variable

- 43 041830 областью H-цепи антитела, указанной в настоящем описании, которая образует пару с исходной Lцепью, или в альтернативном варианте означает, что область обладает такой же цитотоксической активностью в отношении экспрессирующих глипикан 3 клеток или тканей, содержащих указанные клетки, когда ее применяют для получения мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы.- 43 041830 region of the H chain of the antibody specified in the present description, which forms a pair with the original L chain, or alternatively means that the region has the same cytotoxic activity against expressing glypican 3 cells or tissues containing these cells, when used to obtain a multispecific antigen-binding molecule.

Понятие эквивалентный не обязательно подразумевает наличие такого же уровня активности, и активность может быть повышенной. В частности, антигенсвязывающая аффинность, включает, например, случай, в котором коэффициент (величина KD/величина K_D родительского антитела), полученный путем сравнения с аффинностью связывания вариабельной области антитела, которая служит в качестве контроля (величина K_D родительского антитела) составляет 1,5 или менее. Коэффициент величина K_D/величина K_D родительского антитела предпочтительно составляет 1,3 или менее, более предпочтительно 1,2 или менее, 1,1 или менее, 1,0 или менее, 0,9 или менее, 0,8 или менее, 0,7 или менее, 0,6 или менее, или 0,5 или менее. При этом не существует нижнего предела, примеры включают коэффициенты, составляющие 10^_1,10’²,10’³,10’⁴,10’⁵ или 10^-6. Более конкретно, согласно настоящему изобретения коэффициент величина KD/величина K_D родительского антитела предпочтительно составляет от 10^-6 до 1,5x100, более предпочтительно от 10^-6 до 10^-1, еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-2 и еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-3. Касательно цитотоксической активности, примеры включают случай, в котором коэффициент (скорость ингибирования клеточного роста/скорость ингибирования клеточного роста родительским антителом), полученный путем сравнения со скоростью ингибирования роста клетки мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, которая служит в качестве контроля (скорость ингибирования клеточного роста родительским антителом), составляет 0,7 или более. Концентрацию добавленной мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы можно определять соответствующим образом, но предпочтительно она составляет, например, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 или 1нМ; и предпочтительно измерения осуществляют при концентрации 0,05 или 0,1 нМ. Коэффициент скорость ингибирования клеточного роста/скорость ингибирования клеточного роста родительским антителом предпочтительно составляет 0,8 или более, более предпочтительно 0,9 или более, 1,0 или более, 1,2 или более, 1,5 или более, 2 или более, 3 или более, 5 или более, 10 или более или 20 или более. При этом не существует верхнего предела, коэффициент может составлять 10, 10², 10³, 10⁴, 105 или 106.The concept of equivalent does not necessarily imply the same level of activity, and activity may be increased. In particular, antigen-binding affinity includes, for example, the case in which the ratio (KD value/K _D value of the parent antibody) obtained by comparison with the binding affinity of the variable region of the antibody that serves as a control (K _D value of the parent antibody) is 1 .5 or less. The K _D value/K _D value ratio of the parent antibody is preferably 1.3 or less, more preferably 1.2 or less, 1.1 or less, 1.0 or less, 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, or 0.5 or less. There is no lower limit here, examples include coefficients of 10 ^_1 ,10' ² ,10' ³ ,10' ⁴ ,10' ⁵ , or 10 ^-6 . More specifically, according to the present invention, the ratio KD value/K _D value of the parent antibody is preferably from 10 ^-6 to 1.5x100, more preferably from 10 ^-6 to 10 ^-1 , even more preferably from 10 ^-6 to 10 ^-2 and more more preferably from 10 ^-6 to 10 ^-3 . Regarding the cytotoxic activity, examples include the case in which the ratio (rate of cell growth inhibition/rate of cell growth inhibition by parent antibody) obtained by comparison with the cell growth inhibition rate of the multispecific antigen-binding molecule that serves as a control (rate of cell growth inhibition by parent antibody) , is 0.7 or more. The concentration of the multispecific antigen-binding molecule added can be determined as appropriate, but is preferably, for example, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, or 1nM; and preferably measurements are made at a concentration of 0.05 or 0.1 nM. The cell growth inhibition rate/cell growth inhibition rate ratio of the parent antibody is preferably 0.8 or more, more preferably 0.9 or more, 1.0 or more, 1.2 or more, 1.5 or more, 2 or more, 3 or more, 5 or more, 10 or more, or 20 or more. In this case, there is no upper limit, the coefficient can be 10, 10 ² , 10 ³ , 10 ⁴ , 105 or 106.

Кроме того, касательно цитотоксической активности примеры включают случай, в котором коэффициент (концентрация, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%/концентрация родительского антитела, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%), полученный путем сравнения с концентрацией исходной мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, вызывающей ингибирование клеточного роста на 50% (концентрация родительского антитела, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%), составляет 1,5 или менее. Концентрация, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%, означает концентрацию мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, необходимую для снижения скорости клеточной пролиферации наполовину по сравнению с вариантом, в котором не добавляют мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу. Коэффициент концентрация, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%/концентрация родительского антитела, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50% предпочтительно составляет 1,3 или менее, более предпочтительно 1,2 или менее, 1,1 или менее, 1,0 или менее, 0,9 или менее, 0,8 или менее, 0,7 или менее, 0,6 или менее или 0,5 или менее. При этом не существует нижнего предела, примеры включают коэффициенты, составляющие 10^_1,10’²,10’³,10’⁴,10’⁵ или 10-6.В частности, коэффициент предпочтительно составляет от 10^-6 до 1,5x100, более предпочтительно от 10^-6 до 10^-1, еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-2 и еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-3.In addition, with regard to cytotoxic activity, examples include the case in which the ratio (concentration causing 50% inhibition of cell growth/concentration of parental antibody causing 50% inhibition of cell growth) obtained by comparison with the concentration of the original multispecific antigen-binding molecule causing inhibition of cell growth by 50% (the concentration of the parent antibody that causes inhibition of cell growth by 50%) is 1.5 or less. The concentration causing inhibition of cell growth by 50% means the concentration of the multispecific antigen-binding molecule necessary to reduce the rate of cell proliferation by half compared to the case in which the multispecific antigen-binding molecule is not added. The ratio of concentration causing 50% inhibition of cell growth/concentration of parent antibody causing 50% inhibition of cell growth is preferably 1.3 or less, more preferably 1.2 or less, 1.1 or less, 1.0 or less, 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, or 0.5 or less. Here, ^there ^is no lower limit, examples include coefficients of ^{10_1,10'2,10'3,10'4,10'5} , or ^10-6 . In particular ^, the coefficient is preferably ^10-6 to 1.5x100, more preferably 10 ^-6 to 10 ^-1 , even more preferably 10 ^-6 to 10 ^-2 and even more preferably 10 ^-6 to 10 ^-3 .

Касательно домена, содержащего вариабельную область антитела, которая обладает GPC3связывающей активностью, величина K_D, характеризующая связывание с GPC3 (например, человеческим GPC3) может составлять, например, 5x10-9 М или менее, предпочтительно 4x10-9 М или менее, например 3x10-9 М или менее, 2x10-9 М или менее, 1x10-9 М или менее, 8x10^-10 М или менее, 5x10^-10 М или менее, 4x10^-10 М или менее, 3x10’¹⁰ М или менее, 2x10^-10 М или менее, 1x10^-10 М или менее, 8x10^-11 М или менее, 5x10^-11 М или менее, 4x10^-11 М или менее, 3x10^-11 М или менее, 2x10^-11 М или менее, 1x10^-11 М или менее, 8x10^-12 М или менее, 5x10^-12 М или менее, 4x10^-12M или менее, 3x10^-12 М или менее, 2x10^-12 М или менее, 1x10^-12 М или менее, 8x10^-13 М или менее, 5x10^-13 М или менее, 4x10^-13 М или менее, 3x10^-13 М или менее, 2x10^-13 М или менее или 1x10^-13 М или менее.Regarding the domain containing the variable region of an antibody that has GPC3 binding activity, the K _D value characterizing binding to GPC3 (for example, human GPC3) can be, for example, 5x10-9 M or less, preferably 4x10-9 M or less, for example 3x10- 9 M or less, 2x10-9 M or less, 1x10-9 M or less, 8x10 ^-10 M or less, 5x10 ^-10 M or less, 4x10 ^-10 M or less, 3x10' ¹⁰ M or less, 2x10 ^-10 M or less, 1x10 ^-10 M or less, 8x10 ^-11 M or less, 5x10 ^-11 M or less, 4x10 ^{-11 M or less, 3x10 -11} M or less, ^{2x10 -11} ^M or less, 1x10 ^-11 M or less, 8x10 ^-12M or less, 5x10 ^-12M or less, 4x10 ^-12M or less, 3x10 ^-12M or less, 2x10 ^-12M or less, 1x10 ^-12M or less, 8x10 ^-13M or less less, 5x10 ^-13 M or less, 4x10 ^-13 M or less, 3x10 ^-13 M or less, 2x10 ^-13 M or less, or 1x10 ^-13 M or less.

Касательно домена, содержащего вариабельную область, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, величина K_D, характеризующая связывание с человеческим комплексом Т-клеточного рецептора, такого как человеческий Т-клеточный рецептор или более конкретно, например, человеческий CD3ε может составлять, например, 2x10^-7 М или менее, предпочтительно 1,5x10-7 М или менее, например 1,4x10-7 М или менее, 1,3x10-7 М или менее, 1,2x10-7 М или менее, 1x10^-7 М или менее, 3x10-8 М или менее, 2x10-8 М или менее, 1x10-8 М или менее, 8x10-9 М или менее, 5x10-9 М или менее, 4x10-9 М или менее, 3x10-9 М или менее, 2x10-9 М или менее, 1x10-9 М или менее, 8x10^-10 М или менее, 5x10^-10 М или менее, 4x10’¹⁰ М или менее, 3x10’¹⁰ М или менее, 2x10^-10 М или менее, 1x10’¹⁰ М или менее, 8x10^-11 М или менее, 5x10^-11 М или менее, 4x10^-11 М или менее, 3x10^-11 МWith respect to a domain containing a variable region that has binding activity for a T cell receptor complex, a K _D value indicative of binding to a human T cell receptor complex, such as the human T cell receptor or more specifically, for example, human CD3ε, may be , for example, 2x10 ^-7 M or less, preferably 1.5x10 -7 M or less, for example, 1.4x10 -7 M or less, 1.3x10 -7 M or less, 1.2x10 -7 M or less, 1x10 ^{- 7M} or less, 3x10-8M or less, 2x10-8M or less, 1x10-8M or less, 8x10-9M or less, 5x10-9M or less, 4x10-9M or less, 3x10-9 M or less, 2x10-9 M or less, 1x10-9 M or less, 8x10 ^-10 M or less, 5x10 ^-10 M or less, 4x10' ¹⁰ M or less, 3x10' ¹⁰ M or less, 2x10 ^-10 M or less, 1x10' ^10M or less, 8x10 ^-11M or less, 5x10 ^-11M or less, 4x10 ^-11M or less, 3x10 ^-11M

- 44 041830 или менее, 2х10^-11 М или менее, 1х10^-11 М или менее,, 8х10^-12 М или менее, 5х10^-12 М или менее, 4х10^-12 - 44 041830 or less, 2x10 ^-11 M or less, 1x10 ^-11 M or less, 8x10 ^-12 M or less, 5x10 ^-12 M or less, 4x10 ^-12

М или менее, 3х10^-12 М или менее, 2х10^-12М или менее или 1х10^-12 М или менее.M or less, 3x10 ^-12 M or less, 2x10 ^-12 M or less, or 1x10 ^-12 M or less.

Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно имеют величины KD, характеризующая связывание с человеческим GPC3 и человеческим комплексом Т-клеточного рецептора (например, с человеческой CD3ε-цепью), которые составляют 5х10^-9 М или менее и 2х10^-7 М или менее соответственно и более предпочтительно 1х10^-9 М или менее и5х10^-8 М или менее соответственно.The multispecific antigen-binding molecules of the present invention preferably have KD values indicating binding to human GPC3 and human T-cell receptor complex (e.g., human CD3ε chain) of 5 x 10 ^-9 M or less and 2 x 10 ^-7 M or less, respectively, and more preferably 1x10 ^-9 M or less and 5x10 ^-8 M or less, respectively.

В настоящем изобретении вариабельные области антитела, которые являются функционально эквивалентными не ограничены конкретными областями, если они представляют собой вариабельные области H-цепи и/или L-цепи антитела, которые удовлетворяют вышеуказанным требованиям. Примеры таких вариабельных областей антитела включают области, полученные путем интродукции замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или нескольких аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 10 аминокислот) в аминокислотные последовательности вариабельных областей, которые представлены выше в табл. 1-3. Хорошо известный специалистам в данной области метод интродукции одной или нескольких аминокислотных замен, делеций, добавлений и/или инсерций в аминокислотную последовательность представляет собой метод интродукции мутаций в белки. Например, специалисты в данной области могут получать вариабельные области, которые являются функциональными эквивалентами вариабельных областей антитела, обладающих указанными выше функциями, путем интродукции соответствующих мутаций в аминокислотные последовательности с использованием таких методов как сайтнаправленный мутагенез (Hashimoto-Gotoh Т., Mizuno Т., Ogasahara Y. и Nakagawa M., An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 1995, с. 271-275; Zoller M.J. и Smith M., Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 1983, с. 468-500; Kramer W., Drutsa V., Jansen H.W., Kramer В., Pflugfelder M. и Fritz H.J., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W. и Fritz H.J., Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 1987, с. 350-367 и Kunkel T.A., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad. Sci. USA. 82, 1985, с. 488-492).In the present invention, antibody variable regions that are functionally equivalent are not limited to specific regions as long as they are antibody H chain and/or L chain variable regions that meet the above requirements. Examples of such antibody variable regions include regions obtained by introducing a substitution, deletion, addition, and/or insertion of one or more amino acids (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or 10 amino acids) into the amino acid sequences of the variable regions as set out above in tab. 1-3. A method well known to those skilled in the art for introducing one or more amino acid substitutions, deletions, additions and/or insertions into an amino acid sequence is a method for introducing mutations into proteins. For example, those skilled in the art can generate variable regions that are functional equivalents of antibody variable regions having the above functions by introducing appropriate mutations into amino acid sequences using techniques such as site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh T., Mizuno T., Ogasahara Y. and Nakagawa M., An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis Gene 152, 1995, pp. 271-275 Zoller M. J. and Smith M., Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol 100, 1983, pp. 468-500 Kramer W., Drutsa V., Jansen H.W., Kramer B., Pflugfelder M. and Fritz H.J., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res 12, 9441-9456 Kramer W. and Fritz H. J., Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods Enzymol 154, 1987, pp. 350-367 and Kunkel T. A., Rapid a nd efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad. sci. USA. 82, 1985, p. 488-492).

Когда аминокислотный остаток изменяют, аминокислоту предпочтительно заменяют в результате мутации на другую(ие) аминокислоту(ы), сохраняющую(ие) характеристики боковых цепей аминокислот. Примерами аминокислот с такими характеристиками боковых цепей являются гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y и V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S и T), аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи (G, А, V, L, I и Р), аминокислоты с содержащими гидроксильную группу боковыми цепями (S, T и Y), аминокислоты с содержащими атом серы боковыми цепями (C и M), аминокислоты с содержащими карбоновую кислоту и амид боковыми цепями (D, N, E и Q), аминокислоты с основными боковыми цепями (R, K и H) и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (H, F, Y и W) (в скобках представлены обозначения аминокислот в соответствии с однобуквенным кодом). Аминокислотные замены внутри каждой из указанных групп обозначают как консервативные замены. Хорошо известно, что полипептид, содержащий модифицированную аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков в указанной аминокислотной последовательности подвергнут делеции, добавлен и/или заменен на другие аминокислоты, может сохранять исходную биологическую активность (Mark D.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, с. 5662-5666; Zoller M.J. и Smith M., Nucleic Acids Res. 10, 1982, с. 6487-6500; Wang А. и др., Science 224, 1984, с. 1431-1433; Dalbadie-McFarland G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 79, 1982, с. 6409-6413). Вариабельные области, предлагаемые в настоящем изобретении, содержащие указанные аминокислотные модификации, имеют аминокислотные последовательности, которые идентичны по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% аминокислотным последовательностям CDR-последовательностей, FR-последовательностям вариабельной области или полным вариабельным областям до модификации. В контексте настоящего описания идентичность последовательностей определяют в виде процента остатков, идентичных остаткам в исходной аминокислотной последовательности вариабельной области H-цепи или вариабельной области L-цепи, определенного после выравнивания последовательностей и интродукции соответствующих брешей для увеличения до максимума при необходимости идентичности последовательностей. Идентичность аминокислотных последовательностей можно определять с помощью описанного ниже метода.When an amino acid residue is changed, the amino acid is preferably mutated to another amino acid(s) that retains the characteristics of the amino acid side chains. Examples of amino acids with these side chain characteristics are hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y and V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K , S and T), amino acids containing aliphatic side chains (G, A, V, L, I and P), amino acids with side chains containing a hydroxyl group (S, T and Y), amino acids with side chains containing a sulfur atom (C and M), amino acids with carboxylic acid and amide side chains (D, N, E, and Q), amino acids with basic side chains (R, K, and H), and amino acids with aromatic side chains (H, F, Y, and W) (in parentheses are the designations of amino acids in accordance with the one-letter code). Amino acid substitutions within each of these groups are referred to as conservative substitutions. It is well known that a polypeptide containing a modified amino acid sequence in which one or more amino acid residues in said amino acid sequence is deleted, added and/or replaced with other amino acids can retain its original biological activity (Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, pp. 5662-5666; Zoller M. J. and Smith M., Nucleic Acids Res. 10, 1982, pp. 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224, 1984, p. 1431-1433; Dalbadie-McFarland G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 79, 1982, p. 6409-6413). The variable regions of the present invention containing said amino acid modifications have amino acid sequences that are at least 70% identical, more preferably at least 75%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least at least 85%, even more preferably at least 95% of the amino acid sequences of CDR sequences, FR sequences of the variable region or complete variable regions prior to modification. As used herein, sequence identity is defined as the percentage of residues identical to residues in the original H chain variable region or L chain variable region amino acid sequence, determined after sequence alignment and introduction of appropriate gaps to maximize sequence identity if desired. Amino acid sequence identity can be determined using the method described below.

Кроме того, функционально эквивалентную вариабельную область антитела можно получать, например, из нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновыми кислотами, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области, указанной выше в табл. 1-3. Строгие условия гибридизации, применяемые для выделения нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, которая содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области, включают, например, следующие условия: 6 М мочевина, 0,4% ДСН,In addition, a functionally equivalent antibody variable region can be obtained, for example, from nucleic acids that hybridize under stringent conditions to nucleic acids that contain a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the variable region indicated in Table 1 above. 1-3. The stringent hybridization conditions used to isolate a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid that contains a nucleotide sequence encoding a variable region amino acid sequence include, for example, the following conditions: 6 M urea, 0.4% SDS,

- 45 041830- 45 041830

0,5xSSC и 37°С или условия гибридизации в значительной степени эквивалентные указанным. Выделение нуклеиновых кислот с максимально высокой гомологией можно ожидать при применении более строгих условий, например следующих условий: 6 М мочевина, 0,4% ДСН, 0,1xSSC и 42°С. Условия промывки после гибридизации представляют собой, например, промывку с использованием 0,5xSSC (1xSSC представляет собой 0,15 M NaCl и 0,015 М цитрат натрия, pH 7,0) и 0,1% ДСН при 60°С, более предпочтительно промывку с использованием 0,2xSSC и 0,1% ДСН при 60°С, еще более предпочтительно промывку с использованием 0,2xSSC и 0,1% ДСН при 62°С, еще более предпочтительно промывку с использованием 0,2xSSC и 0,1% ДСН при 65°С и еще более предпочтительно промывку с использованием 0,1xSSC и 0,1% ДСН при 65°С. Последовательности выделенных нуклеиновых кислот можно определять известными методами, которые описаны ниже. Общая гомология нуклеотидной последовательности выделенной нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 50% или выше, предпочтительно 70% или выше и наиболее предпочтительно 90% или выше (например, 95, 96, 97, 98, 99% или выше) при оценке степени идентичности последовательностей.0.5xSSC and 37° C. or hybridization conditions substantially equivalent to those indicated. The selection of nucleic acids with the highest possible homology can be expected when applying more stringent conditions, for example the following conditions: 6 M urea, 0.4% SDS, 0.1xSSC and 42°C. The washing conditions after hybridization are, for example, washing with 0.5xSSC (1xSSC is 0.15 M NaCl and 0.015 M sodium citrate, pH 7.0) and 0.1% SDS at 60°C, more preferably washing with using 0.2xSSC and 0.1% SDS at 60°C, even more preferably washing using 0.2xSSC and 0.1% SDS at 62°C, even more preferably washing using 0.2xSSC and 0.1% SDS at 65°C and even more preferably washing using 0.1xSSC and 0.1% SDS at 65°C. The sequence of the selected nucleic acids can be determined by known methods, which are described below. The overall nucleotide sequence homology of the isolated nucleic acid is at least 50% or greater, preferably 70% or greater, and most preferably 90% or greater (e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater) when assessing the degree of sequence identity.

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области, можно выделять также, применяя вместо описанных выше методов на основе гибридизации, методы амплификации генов, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой используют праймеры, синтезированные на основе информации о нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области.Nucleic acids that hybridize under stringent conditions to a nucleic acid containing a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence for a variable region can also be isolated by using gene amplification methods such as polymerase chain reaction (PCR) instead of the hybridization-based methods described above, in which use primers synthesized based on information about the nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of the variable region.

Идентичность одной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности можно определять с помощью алгоритма BLAST, описанного у Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, с. 5873-5877). На основе этого алгоритма разработаны программы BLASTN и BLASTX (Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, с. 403-410). Для анализа нуклеотидных последовательностей согласно BLASTN на основе BLAST устанавливают параметры, такие, например, как балл=100 и длина слова=12. С другой стороны, параметры, применяемые для анализа аминокислотных последовательностей с помощью BLASTX на основе BLAST, включают, например, балл=50 и длина слова=3. Задаваемые по умолчанию параметры применяют для каждой программы, когда используют программы BLAST и Gapped BLAST. В данной области известны конкретные методики указанных анализов (см. веб-сайт National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).The identity of a single nucleotide sequence or amino acid sequence can be determined using the BLAST algorithm described by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, pp. 5873-5877). Based on this algorithm, the BLASTN and BLASTX programs have been developed (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 1990, pp. 403-410). For analysis of nucleotide sequences according to BLASTN based on BLAST, parameters are set, such as, for example, score=100 and wordlength=12. On the other hand, the parameters used for the analysis of amino acid sequences using BLASTX based on BLAST include, for example, score=50 and word length=3. The default parameters apply per program when using the BLAST and Gapped BLAST programs. Specific techniques for these assays are known in the art (see National Center for Biotechnology Information (NCBI) website, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Комбинация вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении глипикана 3, и вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, входящая в мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, не ограничена конкретной комбинацией, если она обладает указанными выше видами активности. Однако согласно настоящему изобретению цитотоксическая активность мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы предпочтительно эквивалентна или выше, чем активность биспецфического антитела GPC3_ERY22_rCE115, описанного в примере 3. В контексте настоящего описания понятие эквивалентный необязательно подразумевает такую же степень указанной выше активности, и активность может быть более высокой. Молекула является эквивалентной GPC3_ERY22_rCE115, например, когда коэффициент (скорость ингибирования клеточного роста/скорость ингибирования клеточного роста (GPC3_ERY22_rCE115)) относительно скорости ингибирования клеточного роста GPC3_ERY22_rCE115 (скорость ингибирования клеточного роста (GPC3_ERY22_rCE115)) составляет 0,7 или более, предпочтительно 0,8 или более, 0,9 или более, 1,0 или более, 1,2 или более, 1,5 или более, 2 или более, 3 или более, 5 или более, 10 или более или 20 или более. В то время как не существует верхнего предела, показатель может составлять, например, 10, 10², 103, 10⁴, 105 или 106. Концентрацию добавленной мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы можно определять соответствующим образом, но предпочтительно она составляет, например 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 или 1нМ; и предпочтительно измерения осуществляют при концентрации 0,05 или 0,1 нМ.The combination of an antibody variable region having binding activity for glypican 3 and an antibody variable region having binding activity for a T-cell receptor complex included in the multispecific antigen-binding molecule of the present invention is not limited to a particular combination as long as it has the above types of activity. However, according to the present invention, the cytotoxic activity of the multispecific antigen binding molecule is preferably equivalent to or greater than that of the bispecific antibody GPC3_ERY22_rCE115 described in Example 3. In the context of the present description, equivalent does not necessarily mean the same degree of the above activity, and the activity may be higher. The molecule is equivalent to GPC3_ERY22_rCE115, for example, when the ratio (cell growth inhibition rate/cell growth inhibition rate (GPC3_ERY22_rCE115)) relative to the cell growth inhibition rate of GPC3_ERY22_rCE115 (cell growth inhibition rate (GPC3_ERY22_rCE115)) is 0.7 or more, preferably 0.8 or greater than, 0.9 or greater, 1.0 or greater, 1.2 or greater, 1.5 or greater, 2 or greater, 3 or greater, 5 or greater, 10 or greater, or 20 or greater. While there is no upper limit, the index may be, for example, 10, 10 ² , 103, 10 ⁴ , 105, or 106. The concentration of the multispecific antigen-binding molecule added may be determined as appropriate, but is preferably, for example, 0.01, 0 .05, 0.1, 0.5 or 1nM; and preferably measurements are made at a concentration of 0.05 or 0.1 nM.

Кроме того, примеры включают вариант, когда коэффициент концентрация, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%/концентрация (GPC3_ERY22_rCE115), вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%, полученный путем сравнения с концентрацией (GPC3_ERY22_rCE115), которая вызывает ингибирование клеточного роста на 50% (концентрация (GPC3_ERY22_rCE115), вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%), составляет 1,5 или менее. Коэффициент концентрация, вызывающая ингибирование клеточного роста на 50%/концентрация (GPC3_ERY22_rCE115), вызывающая ингибирование клеточного роста на 50% предпочтительно составляет 1,3 или менее, более предпочтительно 1,2 или менее, 1,1 или менее, 1,0 или менее, 0,9 или менее, 0,8 или менее, 0,7 или менее, 0,6 или менее или 0,5 или менее. При этом не существует нижнего предела, примеры включают коэффициенты, составляющие 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 или 10^-6. В частности, коэффициент предпочтительно составляет от 10^-6 до 1,5x10-0, более предпочтительно от 10^-6 до 10^-1, еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-2 и еще более предпочтительно от 10^-6 до 10^-3.In addition, examples include the case where the ratio of concentration causing 50% inhibition of cell growth/concentration (GPC3_ERY22_rCE115) causing inhibition of cell growth by 50%, obtained by comparison with the concentration (GPC3_ERY22_rCE115) that causes inhibition of cell growth by 50% ( the concentration (GPC3_ERY22_rCE115) causing 50% inhibition of cell growth is 1.5 or less. The concentration ratio causing 50% inhibition of cell growth/concentration (GPC3_ERY22_rCE115) causing 50% inhibition of cell growth is preferably 1.3 or less, more preferably 1.2 or less, 1.1 or less, 1.0 or less , 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, or 0.5 or less. There is no lower limit here, examples include factors of 10 ^-1 , 10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 , 10 ^-5 or 10 ^-6 . ^In ^particular , ^the ratio is preferably ¹⁰ ^-6 ^to ^1.5x10 ³ .

Предпочтительные конкретные величины K_D, характеризующие связывание с человеческим GPC3 иPreferred specific K _D values characterizing binding to human GPC3 and

- 46 041830 комплексом человеческого Т-клеточного рецептора (например, с человеческой CD3ε-цепью) также соответствуют указанным выше. Можно применять соответствующие экспрессирующие GPC3 клетки или соответствующую ткань, содержащую указанные клетки, и, например, можно применять человеческие раковые линии клеток PC-10 или NCI-H446, которые экспрессируют GPC3.- 46 041830 complex of the human T-cell receptor (for example, with the human CD3ε chain) also correspond to the above. Appropriate GPC3 expressing cells or appropriate tissue containing said cells can be used, and for example human cancer cell lines PC-10 or NCI-H446 that express GPC3 can be used.

Примеры указанной комбинации вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении глипикана 3, и вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, включают комбинации вариабельных областей Hцепи антитела, которые представлены в табл. 4, комбинации вариабельных областей H-цепи антитела, которые имеют последовательности CDR, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 которых являются такими же, что и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, которые входят в вариабельные области H-цепи антитела, представленные в табл. 4, и комбинации вариабельных областей H-цепи антитела, функционально эквивалентные указанным вариабельным областям. В контексте настоящего описания понятие функционально эквивалентные имеет значение, указанное выше.Examples of said combination of an antibody variable region having glypican 3 binding activity and an antibody variable region having T-cell receptor complex binding activity include combinations of the antibody H chain variable regions shown in Table 1. 4, combinations of antibody H chain variable regions that have CDR sequences whose CDR1, CDR2, and CDR3 amino acid sequences are the same as the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 that are included in the antibody H chain variable regions shown in Table 4. . 4 and combinations of antibody H chain variable regions functionally equivalent to the indicated variable regions. In the context of the present description, the concept of functionally equivalent has the meaning indicated above.

Таблица 4Table 4

Плечо СРСЗ/плечо комплекса Т-клеточного рецептора SR3 arm/T-cell receptor complex arm SEQ ID NO: SEQID NO: H0000/hCE115НА H0000/hCE115HA 40/52 40/52 Н0000/СЕ115НА251 H0000/CE115HA251 40/500 40/500 Н0000/СЕ115НА236 H0000/CE115HA236 40/429 40/429 H0000/TR01Н002 H0000/TR01H002 40/421 40/421 Н0000/СЕ115НА122 H0000/CE115HA122 40/426 40/426 H0610/rCE115Н H0610/rCE115H 215/424 215/424 H0610/TR01H040 H0610/TR01H040 215/103 215/103 H0610/TR01H061 H0610/TR01H061 215/122 215/122 H0610/TR01H068 H0610/TR01H068 215/129 215/129 H0610/TR01Н071 H0610/TR01H071 215/132 215/132 GCH054/TR01H067 GCH054/TR01H067 197/128 197/128 GCH094/TR01H082 GCH094/TR01H082 211/142 211/142 GCH094/TR01H084 GCH094/TR01H084 211/144 211/144 GCH065/TR01H084 GCH065/TR01H084 206/144 206/144 GCH065/TR01H082 GCH065/TR01H082 206/142 206/142 GCH094/TR01H109 GCH094/TR01H109 211/164 211/164 GCH065/TR01H109 GCH065/TR01H109 206/164 206/164 GCH094/TR01H113 GCH094/TR01H113 211/168 211/168 GCH065/TR01H113 GCH065/TR01H113 206/168 206/168

Предпочтительная общая L-цепь для таких комбинаций вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении глипикана 3, и вариабельной области антитела, обладающей связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, включает, например, L0000, L0011, L0201, L0203, L0204, L0206, L0208, L0209, L0211, L0212, L0222 и общую L-цепь, которая имеет последовательности CDR (аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3), идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, указанным выше для общей L-цепи. Конкретные комбинации включают, например, комбинации вариабельных областей H-цепи антитела и общей L-цепи, которые представлены в табл. 5, комбинации вариабельных областей антитела, которые имеют последовательности CDR (аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3), идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3, которые входят в вариабельные области общей L-цепи, представленные в табл. 5, и комбинации вариабельных областей H-цепи антитела и общей L-цепи, функционально эквивалентные указанным вариабельным областям. В контексте настоящего описания понятие функционально эквивалентные имеет значение, указанное выше.A preferred common L chain for such combinations of an antibody variable region having glypican 3 binding activity and an antibody variable region having T cell receptor complex binding activity include, for example, L0000, L0011, L0201, L0203, L0204, L0206, L0208, L0209, L0211, L0212, L0222 and a common L chain which has CDR sequences (amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3) identical to the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 mentioned above for the common L chain. Specific combinations include, for example, combinations of the variable regions of the H chain of the antibody and the total L chain, which are presented in table. 5, combinations of antibody variable regions that have CDR sequences (amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3) identical to the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 that are included in the common L chain variable regions shown in Table 5. 5 and combinations of antibody H chain and common L chain variable regions that are functionally equivalent to said variable regions. In the context of the present description, the concept of functionally equivalent has the meaning indicated above.

- 47 041830- 47 041830

Таблица 5Table 5

Плечо СРСЗ/плечо комплекса Т-клеточного рецептора/общая L-цепь SR3 arm/arm of the T-cell receptor complex/common L chain SEQIDNO: SEQIDNO: H0610/rCE115H/L0000 H0610/rCE115H/L0000 215/424/53 215/424/53 H0610/TR01H040/L0000 H0610/TR01H040/L0000 215/103/53 215/103/53 H0610/TR01H040/L0201 H0610/TR01H040/L0201 215/103/299 215/103/299 H0610/TR01H040/L0203 H0610/TR01H040/L0203 215/103/301 215/103/301 H0610/TR01H040/L0204 H0610/TR01H040/L0204 215/103/302 215/103/302 H0610/TR01H040/L0206 H0610/TR01H040/L0206 215/103/304 215/103/304 H0610/TR01H040/L0208 H0610/TR01H040/L0208 215/103/306 215/103/306 H0610/TR01H040/L0209 H0610/TR01H040/L0209 215/103/307 215/103/307 H0610/TR01H040/L0211 H0610/TR01H040/L0211 215/103/309 215/103/309 H0610/TR01H061/L0000 H0610/TR01H061/L0000 215/122/53 215/122/53 H0610/TR01H068/L0000 H0610/TR01H068/L0000 215/129/53 215/129/53 H0610/TR01H071/L0000 H0610/TR01H071/L0000 215/132/53 215/132/53 GCH054/TR01H067/L0201 GCH054/TR01H067/L0201 197/128/299 197/128/299 GCH054/TR01H067/L0212 GCH054/TR01H067/L0212 197/128/310 197/128/310 GCH054/TR01H067/L0222 GCH054/TR01H067/L0222 197/128/319 197/128/319 GCH054/TR01H067/L0000 GCH054/TR01H067/L0000 197/128/53 197/128/53 GCH094/TR01H082/L0201 GCH094/TR01H082/L0201 211/142/299 211/142/299 GCH094/TR01H082/L0011 GCH094/TR01H082/L0011 211/142/223 211/142/223 GCH094/TR01H084/L0011 GCH094/TR01H084/L0011 211/144/223 211/144/223 GCH065/TR01H084/L0011 GCH065/TR01H084/L0011 206/144/223 206/144/223 GCH065/TR01H082/L0011 GCH065/TR01H082/L0011 206/142/223 206/142/223 GCH094/TR01H109/L0011 GCH094/TR01H109/L0011 211/164/223 211/164/223 GCH065/TR01H109/L0011 GCH065/TR01H109/L0011 206/164/223 206/164/223 GCH094/TR01H113/L0011 GCH094/TR01H113/L0011 211/168/223 211/168/223 GCH065/TR01H113/L0011 GCH065/TR01H113/L0011 206/168/223 206/168/223

Не накладываются конкретные ограничения на Fc-область, входящую в мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, если она представляет собой Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fсу-рецептора, но примеры предпочтительной Fcобласти, предлагаемой в настоящем изобретении, включают комбинацию участка Fc-области E22Hh и участка Fc-области Е22Нк, комбинацию участка Fc-области E2702GsKsc и участка Fc-области E2704sEpsc и комбинацию участка Fc-области E2702sKsc и участка Fc-области E2704sEpsc.There are no particular restrictions on the Fc region included in the multispecific antigen-binding molecule of the invention as long as it is an Fc region with reduced Fcy receptor binding activity, but examples of a preferred Fc region of the present invention include a combination of the Fc region E22Hh region and E22Hk Fc region region, combination of E2702GsKsc Fc region region and E2704sEpsc Fc region region, and combination of E2702sKsc Fc region region and E2704sEpsc Fc region region.

Примеры предпочтительной мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, включают биспецифические антитела, которые содержат вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении глипикана 3, и вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении CD3e. Более предпочтительно цитотоксическая активность является такой же или превышает активность биспецифического антитела GPC3_ERY22_rCEl 15. Примеры указанных биспецифических антител включают биспецифические антитела, содержащие Н- и L-цепи, указанные в табл. 13, и биспецифические антитела, которые связываются с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, связывающимся с указанными выше антителами, и которые содержат Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcy-рецептора.Examples of the preferred multispecific antigen-binding molecule of the present invention include bispecific antibodies that comprise an antibody variable region with glypican 3 binding activity and an antibody variable region with CD3e binding activity. More preferably, the cytotoxic activity is the same as or greater than that of the GPC3_ERY22_rCEl 15 bispecific antibody. 13, and bispecific antibodies that bind to an epitope overlapping with an epitope that binds to the above antibodies and that contain an Fc region with reduced Fcy receptor binding activity.

Распознает ли антитело эпитоп, который перекрывается с эпитопом, распознаваемым другим антителом, можно определять на основе конкуренции между двумя антителами за эпитоп. Конкуренцию между антителами можно оценивать с помощью анализов связывания в условиях конкуренции, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), метод на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и метод на основе технологии флуорометрического микрообъемного анализа (FMAT (зарегистрированный товарный знак)). Количество антитела, связанного с антигеном, косвенно коррелирует со связывающей способностью конкурирующего антитела-кандидата (тестируемое антитело), которое конкурентно связывается с перекрывающимся эпитопом. Другими словами, если количество или аффинность тестируемого антитела к перекрывающемуся эпитопу возрастает, то количество антитела, связанного с антигеном, снижается, а количество антигена, связанного тестируемым антителом, возрастает. В частности, соответствующим образом меченое антитело и антитело, подлежащее изучению, добавляют одновременно к антигену, и антитело, которое в результате связывается, обнаруживают с помощью метки. Количество связанного с антигеном антитела легко можно определять с помощью предварительно меченого антитела. Указанная метка не ограничена конкретной меткой и метод мечения выбирают в зависимости от применяемой методики анализа. В частности метод мечения включает введение флуоресцентной метки, радиоактивной метки, ферментной метки и т.п.Whether an antibody recognizes an epitope that overlaps with an epitope recognized by another antibody can be determined based on competition between the two antibodies for the epitope. Antibody competition can be assessed using competitive binding assays such as ELISA, Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET), and Fluorometric Microvolume Assay (FMAT (registered trademark)) technology. The amount of antibody bound to an antigen indirectly correlates with the binding capacity of a competing candidate antibody (test antibody) that competitively binds to the overlapping epitope. In other words, if the amount or affinity of the test antibody for an overlapping epitope increases, then the amount of antibody bound to the antigen decreases and the amount of antigen bound by the test antibody increases. Specifically, an appropriately labeled antibody and an antibody to be studied are added simultaneously to an antigen, and the antibody that binds as a result is detected by a label. The amount of antibody bound to an antigen can easily be determined using a prelabeled antibody. Said label is not limited to a specific label, and the labeling method is selected depending on the analysis technique used. In particular, the labeling method includes the introduction of a fluorescent label, a radioactive label, an enzyme label, and the like.

Например, флуоресцентно меченое антитело и немеченое антитело или тестируемое антитело одновременно добавляют к гранулам, на которых иммобилизован GPC3 или CD3s, и меченое антитело выявляют с помощью технологии флуорометрического микрообъемного анализа.For example, a fluorescently labeled antibody and an unlabeled antibody or test antibody are simultaneously added to beads immobilized with GPC3 or CD3s, and the labeled antibody is detected using fluorometric microvolume analysis technology.

В контексте настоящего описания ’’антитело, которое связывается с перекрывающимся эпитопом” означает тестируемое антитело, которое может снижать количество связанного меченого антитела по меньшей мере на 50% в концентрации, которая, как правило, выше в 100 раз, предпочтительно выше в 80 раз, более предпочтительно выше в 50 раз, еще более предпочтительно выше в 30 раз и еще более предпочтительно выше в 10 раз концентрации, в которой немеченое антитело снижает на 50% количество связанного меченого антитела (1С₅₀).In the context of the present description, "antibody that binds to an overlapping epitope" means a test antibody that can reduce the amount of bound labeled antibody by at least 50% at a concentration that is typically 100-fold higher, preferably 80-fold higher, more preferably 50 times higher, even more preferably 30 times higher, and even more preferably 10 times higher, the concentration at which the unlabeled antibody reduces by 50% the amount of bound labeled antibody (1C ₅₀ ).

-48041830-48041830

Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые имеют антигенсвязывающие сайты антитела, связывающиеся с эпитопами, которые перекрываются с эпитопами, связывающимися вышеуказанными антителами, могут обладать очень высокой цитотоксической активностью.Multispecific antigen-binding molecules that have antibody antigen-binding sites that bind epitopes that overlap with epitopes that bind the above antibodies can have very high cytotoxic activity.

Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, получают с помощью такой же технологии, которая описана выше в качестве метода получения рекомбинантных антител.The multispecific antigen-binding molecules of the present invention are prepared using the same technology as described above as a method for producing recombinant antibodies.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, и их можно встраивать в требуемые экспрессионные векторы. Приемлемые клетки-хозяева можно трансформировать экспрессионными векторами с получением клеток, которые экспрессируют антигенсвязывающие молекулы. Антигенсвязывающие молекулы, кодируемые полинуклеотидами, можно получать путем культивирования клеток, которые экспрессируют антигенсвязывающие молекулы, и сбора продуктов экспрессии из супернатантов культуры. Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам, которые содержат полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, клеткам, которые несут указанный вектор, и к способам получения антигенсвязывающих молекул, которые заключаются в том, что культивируют клетки и собирают антигенсвязывающие молекулы из супернатантов культуры. Их можно получать с помощью таких же технологий, которые описаны выше для получения рекомбинантных антител.The present invention also relates to polynucleotides encoding the antigen-binding molecules of the present invention and can be inserted into the desired expression vectors. Suitable host cells can be transformed with expression vectors to produce cells that express antigen-binding molecules. Antigen-binding molecules encoded by polynucleotides can be obtained by culturing cells that express antigen-binding molecules and collecting expression products from culture supernatants. Thus, the present invention relates to vectors that contain a polynucleotide encoding an antigen-binding molecule of the present invention, to cells that carry said vector, and to methods for producing antigen-binding molecules, which consist in culturing cells and collecting antigen-binding molecules from supernatants. culture. They can be obtained using the same technologies as described above for the production of recombinant antibodies.

Фармацевтические композиции.pharmaceutical compositions.

Другим объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие в качестве действующего вещества мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая содержит: (1) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении глипикана 3, (2) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и (3) домен, содержащий Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcγ-рецептора. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые индуцируют повреждение клеток, содержащим в качестве действующего вещества антигенсвязывающую молекулу. Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, которые индуцируют требуемое повреждение клеток, прежде всего зависимую от Т-клеток клеточную цитотоксичность, предпочтительно вводят индивидууму, который страдает заболеванием, при котором необходимы указанные виды активности для предупреждения или лечения, или индивидууму, у которого возможен рецидив заболевания.Another object of the present invention are pharmaceutical compositions containing, as an active substance, a multispecific antigen-binding molecule, which contains: (1) a domain containing an antibody variable region having binding activity against glypican 3, (2) a domain containing an antibody variable region having a binding activity against the T cell receptor complex, and (3) a domain containing an Fc region with reduced Fcγ receptor binding activity. In addition, the present invention relates to pharmaceutical compositions that induce cell damage, containing an antigen-binding molecule as an active ingredient. Pharmaceutical compositions of the present invention which induce the desired cell damage, especially T-cell dependent cellular cytotoxicity, are preferably administered to an individual who suffers from a disease in which said activities are needed to prevent or treat, or to an individual who is likely to relapse. diseases.

Кроме того, согласно настоящему изобретению индуцирующие цитотоксичность агенты и ингибирующие рост клеток агенты, и противораковые агенты, которые содержат в качестве действующего вещества мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая содержит:In addition, according to the present invention, cytotoxicity-inducing agents and cell growth-inhibiting agents, and anti-cancer agents, which contain, as an active substance, a multispecific antigen-binding molecule, which contains:

(1) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении глипикана 3, (2) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и (3) домен, содержащий Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcyрецептора, можно применять в способе индукции повреждения клеток, который заключается в том, что содержит стадию, на которой вводят индивидууму антигенсвязывающую молекулу, или можно применять антигенсвязывающую молекулу для приготовления индуцирующего цитотоксичесность агента и ингибирующего роста клеток агента.(1) a domain containing an antibody variable region having binding activity for glypican 3, (2) a domain containing an antibody variable region having binding activity for a T-cell receptor complex, and (3) a domain containing an Fc region with reduced Fcy receptor binding activity can be used in a method for inducing cell damage, which comprises administering an antigen-binding molecule to an individual, or the antigen-binding molecule can be used to prepare a cytotoxicity-inducing agent and a cell growth-inhibiting agent.

В настоящем изобретении фраза содержит в качестве действующего вещества мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая содержит:In the present invention, the phrase contains as an active substance a multispecific antigen-binding molecule, which contains:

(1) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении глипикана 3, (2) домен, содержащий вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, и (3) домен, содержащий Fc-область с пониженной связывающей активностью в отношении Fcyрецептора означает, что композиция содержит антигенсвязывающую молекулу в качестве основного действующего вещества; однако не имеется конкретных ограничений на относительное содержание антигенсвязывающей молекулы.(1) a domain containing an antibody variable region having binding activity for glypican 3, (2) a domain containing an antibody variable region having binding activity for a T-cell receptor complex, and (3) a domain containing an Fc region with reduced Fcy receptor binding activity means that the composition contains an antigen-binding molecule as the main active ingredient; however, there are no specific restrictions on the relative content of the antigen-binding molecule.

При необходимости мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно капсулировать в микрокапсулы (микрокапсулы, изготовленные из гидроксиметилцеллюлозы, желатина, поли(метилметакрилата) и т.п.), и можно включать в компоненты коллоидных систем, предназначенных для введения лекарственных веществ (липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) (например, см. Remington's Pharmaceutical Science 16-ое изд., под ред. Oslo, 1980)). Кроме того, хорошо известны методы приготовления агентов в виде средств с замедленным высвобождением, и их можно применять для мультиспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении (J. Biomed. Mater. Res. 15, 1981, с. 267-277; Chemtech. 12, 1982, с. 98-105; US № 3773719; опубликованные европейские патенты (ЕР) EP 58481 и EPIf desired, the multispecific antigen-binding molecules of the present invention can be encapsulated in microcapsules (microcapsules made from hydroxymethylcellulose, gelatin, poly(methyl methacrylate) and the like) and can be incorporated into components of colloidal drug administration systems (liposomes). , albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) (for example, see Remington's Pharmaceutical Science 16th ed., ed. Oslo, 1980)). In addition, methods for preparing agents in the form of sustained release agents are well known and can be used for multispecific antigen-binding molecules of the present invention (J. Biomed. Mater. Res. 15, 1981, p. 267-277; Chemtech. 12 , 1982, pp. 98-105, US No. 3773719, published European patents (EP) EP 58481 and EP

- 49 041830- 49 041830

133988; Biopolymers 22, 1983, с. 547-556).133988; Biopolymers 22, 1983, p. 547-556).

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, или индуцирующие цитотоксичность агенты и ингибирующие рост клеток агенты можно вводить пациенту орально или парентерально, и предпочтительным является парентеральное введение. Указанные примеры методов введения включают инъекцию, введение в нос, транспульмонарное введение и чрескожное введение. Примеры введения путем инъекции включают, например, внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию. Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, или индуцирующий цитотоксичность агент и ингибирующий рост клеток агент можно применять местно или системно путем инъекции. Метод введения можно выбирать в зависимости от возраста пациента и симптомов. Дозу можно выбирать, например, из следующего диапазона: от 0,0001 до 1000 мг на 1 кг веса тела на каждое введение. Альтернативно этому, дозу можно выбирать, например, из следующего диапазона: от 0,001 до 100000 мг/пациента. Однако дозы фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, или индуцирующего цитотоксичность агента и ингибирующего рост клеток агента не ограничены указанными дозами.Pharmaceutical compositions of the present invention or cytotoxicity-inducing agents and cell growth-inhibiting agents may be administered orally or parenterally to a patient, and parenteral administration is preferred. These examples of administration methods include injection, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration. Examples of administration by injection include, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection. The pharmaceutical composition of the present invention or the cytotoxicity-inducing agent and the cell growth-inhibiting agent can be applied topically or systemically by injection. The method of administration can be selected depending on the patient's age and symptoms. The dose can be selected, for example, from the following range: from 0.0001 to 1000 mg per 1 kg of body weight for each administration. Alternatively, the dose may be selected, for example, from the following range: 0.001 to 100,000 mg/patient. However, the doses of the pharmaceutical composition of the present invention or the cytotoxicity-inducing agent and the cell growth-inhibiting agent are not limited to these doses.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, или индуцирующие цитотоксичность агенты и ингибирующие рост клеток агенты можно приготавливать с помощью общепринятых методов (например, см. Remington's Pharmaceutical Science, последнее изд., изд-во Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.), и они могут содержать также фармацевтически приемлемые носители и добавки. Их примерами являются (но не ограничиваясь только ими) поверхностно-активные вещества, эксципиенты, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, буферы, суспендирующие агенты, придающие изотоничность агенты, связующие вещества, разрыхлители, замасливатели, повышающие текучесть агенты и корригенты и можно применять другие общепринятые носители. Конкретными примерами носителей являются легкая безводная кремниевая кислота, лактоза, кристаллическая целлюлоза, маннит, крахмал, кармеллоза кальция, кармеллоза натрия, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилацетальдиэтиламиноацетат, поливинилпирролидон, желатин, триглицерид со средней длиной цепи, полиоксиэтиленированное гидрогенизированное касторовое масло 60, сахароза, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганическая соль и т.п.Pharmaceutical compositions of the present invention, or cytotoxicity-inducing agents and cell growth-inhibiting agents, can be prepared using conventional methods (for example, see Remington's Pharmaceutical Science, latest ed., Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.), and they may also contain pharmaceutically acceptable carriers and additives. Examples of these include, but are not limited to, surfactants, excipients, colorants, flavors, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, isotonicizing agents, binders, disintegrants, lubricants, flow agents and flavoring agents, and others may be used. common carriers. Specific examples of carriers are light anhydrous silicic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, calcium carmellose, sodium carmellose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl acetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain triglyceride, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salt, and the like.

В настоящем изобретении предложены также способы повреждения экспрессирующих в качестве антигена глипикан 3 клеток или опухолевых тканей, содержащих экспрессирующие антиген клетки, или способы подавления роста указанных клеток или опухолевых тканей путем приведения в контакт клеток, экспрессирующих в качестве антигена глипикан 3, с мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, предлагаемой в настоящем изобретении, которая связывается с антигеном. Мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая связывается с антигеном, описана выше в качестве антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, которая связывается с антигеном, которая содержится в индуцирующих цитотоксичность агентах и ингибирующих рост клеток агентах, предлагаемых в настоящем изобретении. Клетки, с которыми связывается мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, которая связывается с антигеном, не ограничены конкретными клетками, если эти клетки экспрессируют антиген.The present invention also provides methods for damaging glypican 3 antigen-expressing cells or tumor tissues containing antigen-expressing cells, or methods for inhibiting the growth of said cells or tumor tissues by contacting glypican 3 antigen-expressing cells with a multispecific antigen-binding molecule, proposed in the present invention, which binds to the antigen. The multispecific antigen-binding molecule that binds to an antigen is described above as the antigen-binding molecule of the present invention that binds to an antigen, which is contained in the cytotoxicity-inducing agents and the cell growth-inhibiting agents of the present invention. The cells to which the multispecific antigen-binding molecule of the present invention binds, which binds to the antigen, are not limited to specific cells, as long as those cells express the antigen.

Согласно настоящему изобретению приведение в контакт можно осуществлять, например, добавляя мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, которая связывается с антигеном, в культуральную среду экспрессирующих антиген GPC3 клеток, которые культивируют in vitro. В этом случае добавляемую антигенсвязывающую молекулу можно применять в пригодной для этой цели форме, такой как раствор или твердое вещество, полученное путем лиофилизации, или т.п. При добавлении в виде водного раствора он может представлять собой водный раствор, который содержит только мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, или может представлять собой также раствор, содержащий, например, указанные выше поверхностно-активные вещества, эксципиенты, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, буферы, суспендирующие агенты, придающие изотоничность агенты, связующие вещества, разрыхлители, замасливатели, повышающие текучесть агенты и корригенты. На концентрацию добавляемой молекулы не накладывается специальных ограничений; однако конечная концентрация в культуральной среде предпочтительно составляет от 1 пг/мл до 1 г/мл, более предпочтительно от 1 нг/мл до 1 мг/мл и еще более предпочтительно от 1 мкг/мл до 1 мг/мл.According to the present invention, the contacting can be carried out, for example, by adding the multispecific antigen-binding molecule of the present invention, which binds to the antigen, to the culture medium of GPC3 antigen-expressing cells that are cultured in vitro. In this case, the added antigen-binding molecule can be used in a form suitable for this purpose, such as a solution or a solid obtained by lyophilization, or the like. When added as an aqueous solution, it may be an aqueous solution that contains only the multispecific antigen-binding molecule of the present invention, or it may also be a solution containing, for example, the above surfactants, excipients, colorants, flavors, preservatives , stabilizers, buffers, suspending agents, isotonicizing agents, binders, disintegrants, lubricants, flow agents and flavoring agents. The concentration of the added molecule is not subject to special restrictions; however, the final concentration in the culture medium is preferably 1 pg/ml to 1 g/ml, more preferably 1 ng/ml to 1 mg/ml, and even more preferably 1 μg/ml to 1 mg/ml.

Кроме того, согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения приведение в контакт осуществляют также путем обработки животных кроме человека, в организм которых трансплантированы экспрессирующие антиген GPC3 клетки, и животных, у которых эндогенно происходит экспрессия антигена. Метод введения может быть оральным или парентеральным, и предпочтительным является парентеральное введение. Указанные примеры методов введения включают инъекцию, введение в нос, транспульмонарное введение и чрескожное введение. Примеры введения путем инъекции включают, например, внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию. Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, или индуцирующий цитотоксичность агент и ингибирующий рост клеток агент можно применять местно или системно, например, путем инъекции. Метод введения можно выбирать в зависимости от возраста подIn addition, according to another embodiment of the present invention, contacting is also carried out by treating non-human animals into which GPC3 antigen-expressing cells are transplanted and animals in which the antigen is expressed endogenously. The method of administration may be oral or parenteral, and parenteral administration is preferred. These examples of administration methods include injection, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration. Examples of administration by injection include, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection. The pharmaceutical composition of the present invention or the cytotoxicity-inducing agent and the cell growth-inhibiting agent can be applied topically or systemically, for example, by injection. The method of administration can be chosen depending on the age under

- 50 041830 опытного животного и симптомов. При введении в виде водного раствора можно применять водный раствор, содержащий только мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, или можно применять раствор, содержащий также указанные выше поверхностноактивные вещества, эксципиенты, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, буферы, суспендирующие агенты, придающие изотоничность агенты, связующие вещества, разрыхлители, замасливатели, повышающие текучесть агенты и корргиенты и т.п. Дозу можно выбирать из следующего диапазона: от 0,0001 до 1000 мг на 1 кг веса тела на одно введение.- 50 041830 experimental animal and symptoms. When administered as an aqueous solution, an aqueous solution containing only the multispecific antigen-binding molecule of the present invention may be used, or a solution may be used that also contains the above surfactants, excipients, colorants, flavors, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, imparting isotonicity agents, binders, leavening agents, lubricants, flow agents and flavoring agents, and the like. The dose can be selected from the following range: from 0.0001 to 1000 mg per 1 kg of body weight per administration.

Альтернативно этому, дозу можно выбирать, например, из следующего диапазона: от 0,001 до 100000 мг/пациента. Однако вводимое количество мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, не ограничено указанными дозами.Alternatively, the dose may be selected, for example, from the following range: 0.001 to 100,000 mg/patient. However, the amount of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention to be administered is not limited to these doses.

Описанный ниже метод предпочтительно используют в качестве метода оценки или измерения повреждения клетки, индуцированного в клетках, экспрессирующих в качестве антигена глипикан 3, который связывается доменом, который несет вариабельную область антитела, обладающую связывающей активностью в отношении глипикана 3, который входит в антигенсвязывающую молекулу, что является результатом контактирования клеток с мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой, предлагаемой в настоящем изобретении. Примеры метода оценки или измерения цитотоксической активности in vitro включает методы измерения активности цитотоксических Т-клеток или т.п. Обладает ли мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, Т-клеточной цитотоксичностью, можно определять с помощью известных методов (см., например, Current protocols in Immunology, глава 7. Immunologic studies in humans, под ред. John E, Coligan и др., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 1993). При измерении активности антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с антигеном, отличным от глипикана 3, представляющим собой антиген, который не экспрессируется в клетках, применяемых для оценки, можно использовать в качестве контроля, который анализируют таким же образом, что и мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, и активность можно определять, оценивая, обладает ли мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, более выраженной цитотоксической активностью, чем применяемая в качестве контроля антигенсвязывающая молекула.The method described below is preferably used as a method for evaluating or measuring cell damage induced in cells expressing glypican 3 as an antigen, which is bound by a domain that carries an antibody variable region having binding activity against glypican 3, which is included in an antigen-binding molecule, which is the result of contacting cells with a multispecific antigen-binding molecule of the present invention. Examples of a method for evaluating or measuring cytotoxic activity in vitro include methods for measuring cytotoxic T cell activity or the like. Whether a multispecific antigen-binding molecule of the present invention has T-cell cytotoxicity can be determined using known methods (see, for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, ed. John E, Coligan et al. ., John Wiley & Sons, Inc., 1993). When measuring activity, an antigen-binding molecule that binds to an antigen other than glypican 3, which is an antigen that is not expressed in the cells used for evaluation, can be used as a control, which is analyzed in the same way as the multispecific antigen-binding molecule proposed in of the present invention, and activity can be determined by evaluating whether the multispecific antigen-binding molecule of the present invention has more cytotoxic activity than the antigen-binding molecule used as a control.

Для оценки или измерения цитотоксической активности in vivo, например, клетки, экспрессирующие в качестве антигена глипикан 3, внутрикожно или подкожно трансплантируют подопытному животному кроме человека, а затем тестируемую антигенсвязывающую молекулу вводят внутривенно или внутрибрюшинно каждый день или с интервалами в несколько дней, начиная со дня трансплантации или на следующий после него день. Цитотоксическую активность можно определять путем ежедневного измерения размера опухолей, определяя различие в изменении размера опухолей. Аналогично методу, применяемому для оценки in vitro, можно считать, что антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, обладает цитотоксической активностью, если при введении контрольной антигенсвязывающей молекулы обнаружено, что размер опухолей в группе, которой вводили антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, существенно меньшей, чем размер опухолей в группе, которой вводили контрольную антигенсвязывающую молекулу.To assess or measure cytotoxic activity in vivo, for example, cells expressing glypican 3 antigen are intradermally or subcutaneously transplanted into a non-human experimental animal, and then the antigen-binding molecule to be tested is administered intravenously or intraperitoneally every day or at intervals of several days, starting from the day transplantation or the next day after it. Cytotoxic activity can be determined by daily measurement of the size of the tumors, determining the difference in the change in the size of the tumors. Similar to the method used for in vitro evaluation, an antigen-binding molecule of the present invention can be considered to have cytotoxic activity if, upon administration of the control antigen-binding molecule, it is found that the size of the tumors in the group administered with the antigen-binding molecule of the present invention is significantly smaller than the size of the tumors in the group that received the control antigen-binding molecule.

В качестве метода оценки или измерения подавляющего действия на пролиферацию клеток, экспрессирующих в качестве антигена глипикан 3, можно применять метод измерения поглощения меченного изотопом тимидина клетками или МТТ-метод. В качестве метода оценки или измерения подавляющего действия на пролиферацию клеток in vivo, можно применять метод, аналогичный описанному выше для оценки или измерения цитотоксической активности in vivo.As a method for evaluating or measuring an inhibitory effect on the proliferation of cells expressing glypican 3 as an antigen, the thymidine isotopically labeled uptake cell method or the MTT method can be used. As a method for evaluating or measuring an inhibitory effect on cell proliferation in vivo, a method similar to that described above for evaluating or measuring cytotoxic activity in vivo can be used.

В настоящем изобретении предложены также наборы, которые можно применять в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержат мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, или мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, созданную способом получения, предлагаемым в настоящем изобретении. Альтернативно этому, наборы могут быть упакованы вместе с дополнительным фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и инструкциями с описанием метода применения.The present invention also provides kits that can be used in the methods of the present invention, which contain a multispecific antigen-binding molecule of the present invention, or a multispecific antigen-binding molecule created by the production method of the present invention. Alternatively, kits may be packaged with an additional pharmaceutically acceptable carrier, diluent, and instructions for use.

Настоящее изобретение относится также к мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в настоящем изобретении, или мультиспецифической антигенсвязывающей молекуле, полученной способом, предлагаемым в настоящем изобретении, для применения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении.The present invention also relates to a multispecific antigen-binding molecule of the present invention or a multispecific antigen-binding molecule obtained by the method of the present invention for use in the method of the present invention.

Настоящее изобретение относится также к молекулам, обладающим GPC3-связывающей активностью, которые содержат домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает GPC3связывающей активностью, мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекуле, которая обладает GPC3-связывающей активностью, которая содержит вариабельные области H- и L-цепей антитела соответственно, содержащие три CDR H- и L-цепей (всего шесть CDR), которые входят в молекулу. Настоящее изобретение относится также к молекулам, обладающим связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, которые содержат домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора,The present invention also relates to molecules having GPC3-binding activity, which contain a domain containing the variable region of an antibody that has GPC3-binding activity, the multispecific antigen-binding molecule of the present invention. In addition, the present invention relates to a molecule that has GPC3 binding activity, which contains the variable regions of the H and L chains of the antibody, respectively, containing three CDRs of H and L chains (six CDRs in total) that are included in the molecule. The present invention also relates to molecules having binding activity for the T-cell receptor complex, which contain a domain containing an antibody variable region that has binding activity for the T-cell receptor complex,

- 51 041830 мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекуле, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, которая содержит вариабельные области H- и L-цепей антитела соответственно, содержащие три CDR H- и L-цепей (всего шесть CDR), которые входят в молекулу. Указанные молекулы могут представлять собой антитела или полипептиды, содержащие антигенсвязывающие фрагменты антитела. Настоящее изобретение относится также к антителам, которые связываются с эпитопами, перекрывающимися или конкурирующими с указанными молекулами или полипептидами, которые содержат их антигенсвязывающие фрагменты. Приемлемыми примерами таких полипептидов, которые содержат антигенсвязывающие фрагменты антитела, являются scFv, одноцепочечное антитело, Fv, одноцепочечный Fv2 (scFv2), Fab и F(ab')₂. Кроме того, указанные молекулы необязательно должны быть мультиспецифическими (биспецифическими), а могут связываться только либо с GPC3, либо с комплексом Т-клеточного рецептора (например, CD3ε-цепью).- 51 041830 multispecific antigen-binding molecule proposed in the present invention. In addition, the present invention relates to a molecule that has binding activity against the T-cell receptor complex, which contains the variable regions of the H - and L-chains of the antibody, respectively, containing three CDRs of H - and L-chains (six CDRs in total), which enter the molecule. These molecules may be antibodies or polypeptides containing antigen-binding antibody fragments. The present invention also relates to antibodies that bind to epitopes that overlap or compete with said molecules or polypeptides that contain their antigen-binding fragments. Suitable examples of such polypeptides that contain antigen-binding antibody fragments are scFv, single chain antibody, Fv, single chain Fv2 (scFv2), Fab and F(ab') ₂ . In addition, these molecules do not have to be multispecific (bispecific), but can only bind to either GPC3 or T-cell receptor complex (eg, CD3ε chain).

Указанные молекулы включают молекулу, которая содержит домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает GPC3-связывающей активностью, мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, подробное описание которой представлено в разделе Примеры в настоящем описании (которая содержит вариабельные области H-цепи, обладающие GPC3-связывающей активностью и вариабельную область общей L-цепи), молекулу, которая содержит домен, содержащий вариабельную область антитела, которая обладает связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора, мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, подробное описание которой представлено в разделе Примеры в настоящем описании (которая содержит вариабельные области H-цепи, обладающие связывающей активностью в отношении комплекса Т-клеточного рецептора и вариабельную область общей L-цепи), а также молекулу, обладающую способностью связываться с таким же антигенным белком (GPC3 или комплекс Т-клеточного рецептора), которая содержит три CDR каждой из Hи L-цепей (всего шесть CDR), которые входят в указанную выше молекулу.Said molecules include a molecule that contains a domain containing an antibody variable region that has GPC3 binding activity, a multispecific antigen binding molecule detailed in the Examples section of this specification (which contains H chain variable regions that have GPC3 binding activity and variable region of the common L chain), a molecule that contains a domain containing the variable region of an antibody that has binding activity against the T-cell receptor complex, a multispecific antigen-binding molecule, a detailed description of which is presented in the Examples section of the present description (which contains variable regions H chains that have binding activity on the T-cell receptor complex and the variable region of the common L-chain), as well as a molecule that has the ability to bind to the same antigenic protein (GPC3 or T-cell receptor complex), which contains lives three CDRs of each of the H and L chains (six CDRs in total) that are included in the above molecule.

Указанные молекулы имеют CDR, которые являются одинаковыми (общими) с CDR мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении; и поэтому ожидается, что они будут связываться с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении. Таким образом, указанные молекулы могут конкурировать с мультиспецифическими антигенсвязывающими молекулами, предлагаемыми в настоящем изобретении, при их совместном присутствии с мультиспецифическими антигенсвязывающими молекулами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Таким образом, эти молекулы можно применять, например, в качестве регуляторных агентов для подавления различных видов активности (таких как антигенсвязывающая активность, цитотоксическая активность и противоопухолевая активность) мультиспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении. Кроме того, указанная молекула может быть предварительно связана с белком-мишенью (GPC3 или комплекс Т-клеточного рецептора), и после добавления мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, можно выявлять молекулы, диссоциирующие в результате конкуренции. При таком применении молекула пригодна в качестве агента, предназначенного для оценки связывания мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, с белком-мишенью. Согласно настоящему изобретению молекулы можно метить соответствующими флуоресцентными субстанциями или т.п. Альтернативному этому, указанные молекулы можно применять для скрининга новых антител, которые связываются с эпитопами, перекрывающимися с эпитопами, которые связываются мультиспецифическими антигенсвязывающими молекулами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Как указано выше, указанную молекулу можно предварительно связывать с белком-мишенью (GPC3 или комплекс Т-клеточного рецептора), а затем добавлять тестируемое антитело, при этом, если имеет место диссоциация связанных молекул, то тестируемое антитело является перспективным (кандидатом) в качестве антитела, которое связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, с которым связывается мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении. Это позволяет осуществлять эффективный скрининг новых мультиспецифических антигенсвязывающих молекул.These molecules have CDRs that are the same (shared) with the CDRs of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention; and therefore they are expected to bind to an epitope overlapping with that of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention. Thus, these molecules can compete with multispecific antigennegative molecules of the present invention, when they are present together with multispecific antigennegative molecules of the present invention. Thus, these molecules can be used, for example, as regulatory agents to suppress various activities (such as antigen-binding activity, cytotoxic activity and antitumor activity) of the multispecific antigen-binding molecules of the present invention. In addition, the molecule can be pre-bound to a target protein (GPC3 or T-cell receptor complex), and after the addition of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention, competition-dissociated molecules can be detected. In this application, the molecule is useful as an agent for assessing the binding of a multispecific antigen-binding molecule of the present invention to a target protein. According to the present invention, molecules can be labeled with appropriate fluorescent substances or the like. Alternatively, these molecules can be used to screen for new antibodies that bind to epitopes that overlap with epitopes that bind to the multispecific antigen-binding molecules of the present invention. As mentioned above, the specified molecule can be previously associated with a target protein (GPC3 or T-cell receptor complex), and then the test antibody is added, while if there is a dissociation of the bound molecules, then the test antibody is promising (candidate) as an antibody , which binds to an epitope that overlaps with the epitope to which the multispecific antigen-binding molecule of the present invention binds. This allows efficient screening of new multispecific antigen-binding molecules.

Приведенные в настоящем описании в качестве примеров комбинации в виде комбинаций каждого CDR мультиспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять непосредственно в качестве конкретных комбинаций CDR вариабельных областей Hцепи и L-цепи этих молекул. Аффинность к антигену этих молекул (величины K_D) предпочтительно характеризуется величинами, приведенными в качестве примера KD мультиспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, но не ограничена этими величинами.The exemplary combinations of each CDR of the multispecific antigen-binding molecules of the present invention can be used directly as specific combinations of the H chain and L chain variable region CDRs of these molecules. The antigen affinity of these molecules (K _D values) is preferably exemplified by the KD values of the multispecific antigen-binding molecule of the present invention, but is not limited to these values.

Настоящее изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти молекулы, векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, клеткам, содержащим нуклеиновые кислоты или векторы, способам получения молекул путем культивирования клеток и молекулам, полученным с помощью этих способов.The present invention also relates to nucleic acids encoding these molecules, vectors containing nucleic acids, cells containing nucleic acids or vectors, methods for obtaining molecules by cell culture and molecules obtained using these methods.

Все процитированные в настоящем описании документы, характеризующие известный уровень техники, включены в настоящее описание в качестве ссылки.All prior art documents cited herein are incorporated herein by reference.

- 52 041830- 52 041830

ПримерыExamples

Ниже настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные примеры, которые не ограничивают объем изобретения.Below, the present invention is described with reference to specific examples, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1. Получение GPC3 ERY22 rCE115 и измерение цитотоксической активности.Example 1 Preparation of GPC3 ERY22 rCE115 and measurement of cytotoxic activity.

(1-1) Получение GPC3 ERY22 rCE115.(1-1) Preparation of GPC3 ERY22 rCE115.

Молекулу, в которой один из Fab заменяли на домен, связывающий CD3 эпсилон, получали, используя IgG против ракового антигена (GPC3) в качестве основной структуры. В этом случае Fc-область IgG, которую применяли в качестве основной структуры, представляла собой молчащую Fc с ослабленной аффинностью к FcgR ( Fey- (Fc-гамма) рецептор). Антитело к GPC3 Н0000 (SEQ ID NO: 40)/GL4 (SEQ ID NO: 41) применяли в качестве GPC3-связывающего домена. Антитело к CD3 rCE115H/rCE115L (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 43) применяли в качестве CD3-связывающего домена.A molecule in which one of the Fab was replaced with a CD3 epsilon binding domain was obtained using anti-cancer antigen IgG (GPC3) as the main structure. In this case, the IgG Fc region that was used as the main structure was a silent Fc with reduced affinity for FcgR (Fey-(Fc-gamma) receptor). Anti-GPC3 antibody H0000 (SEQ ID NO: 40)/GL4 (SEQ ID NO: 41) was used as the GPC3 binding domain. The anti-CD3 antibody rCE115H/rCE115L (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 43) was used as the CD3 binding domain.

Конструкцию G1d, полученную удалением Gly и Lys на С-конце IgG1, применяли в качестве константной области H-цепи антитела и ее применяли в комбинации с H0000/GL4 и rCE115H/rCE115L. Когда константную область Н-цепи антитела обозначали как H1, последовательность, соответствующую Нцепи антитела, несущую Н0000 в вариабельной области, обозначали как Н0000-Н1. В настоящем описании аминокислотное изменение обозначали, например, как D356K. Первый алфавитный символ (соответствует D в D356K) представляет собой однобуквенный код аминокислотного остатка до модификации, следующий за ним номер (соответствует 356 в D356K) обозначает положение модификации согласно EU-нумерации, а последний алфавитный символ (соответствует K в D356K) представляет собой однобуквенный код аминокислотного остатка после модификации. G1dh (SEQ ID NO: 44), полученную путем удаления Gly и Lys на С-конце IgG1, ERY22_Hk (SEQ ID NO: 45), созданную путем интродукции мутаций L234A/L235A/Y349C/T366W в G1dh, a ERY22_Hh (SEQ ID NO: 46), созданную путем интродукции мутаций L234A/L235A/D356C/T366S/L368A/Y407V в G1dh, получали согласно методу, описанному в приведенном для справки примере 1. Мутации L234A и L235A интродуцировали в соответствующие Hцепи для ослабления аффинности к FcgR (Fcy-рецептор), а мутации Y349C/T366W и D356C/T366S/L368A/Y407V интродуцирлвали для эффективного образования гетеромеров каждой Hцепи при получении гетеродимерных антител, содержащих два типа H-цепей.The G1d construct, obtained by removing Gly and Lys at the C-terminus of IgG1, was used as the antibody H chain constant region and was used in combination with H0000/GL4 and rCE115H/rCE115L. When the constant region of the H chain of an antibody was designated as H1, the sequence corresponding to the H chain of the antibody bearing H0000 in the variable region was designated as H0000-H1. In the present description, the amino acid change is referred to, for example, as D356K. The first alphabetic character (corresponds to D in D356K) is the one-letter code for the amino acid residue before the modification, the following number (corresponds to 356 in D356K) denotes the position of the modification according to the EU numbering, and the last alphabetic character (corresponds to K in D356K) is the one-letter code amino acid residue after modification. G1dh (SEQ ID NO: 44) generated by removing Gly and Lys at the C-terminus of IgG1, ERY22_Hk (SEQ ID NO: 45) generated by introducing mutations L234A/L235A/Y349C/T366W into G1dh, and ERY22_Hh (SEQ ID NO: : 46) created by introducing mutations L234A/L235A/D356C/T366S/L368A/Y407V in G1dh was obtained according to the method described in Example 1 for reference. receptor), and mutations Y349C/T366W and D356C/T366S/L368A/Y407V were introduced to efficiently form heteromers of each H chain in the production of heterodimeric antibodies containing two types of H chains.

Гетеродимерное антитело GPC3_ERY22_rCE115, полученной заменой VH-и VL-доменов Fab против GPC3, создавали согласно методу, описанному в приведенном для справки примере 1 (фиг. 1а).The heterodimeric antibody GPC3_ERY22_rCE115 obtained by replacing the VH and VL domains of the anti-GPC3 Fab was generated according to the method described in Reference Example 1 (FIG. 1a).

Серии экспрессионных векторов со встроенным полинуклеотидом, кодирующим каждую из конструкций GL4-ERY22_Hk (SEQ ID NO: 47), H0000-ERY22L (SEQ ID NO: 48), rCE115H-ERY22_Hh (SEQ ID NO: 49) и rCE115L-k0 (SEQ ID NO: 50), получали с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как методы на основе ПЦР с использованием добавленных праймеров, которые имели соответствующие последовательности, аналогичные применяемым в описанном выше методе.A series of expression vectors with an inserted polynucleotide encoding each of the constructs GL4-ERY22_Hk (SEQ ID NO: 47), H0000-ERY22L (SEQ ID NO: 48), rCE115H-ERY22_Hh (SEQ ID NO: 49), and rCE115L-k0 (SEQ ID NO: 50) were obtained using methods well known to those skilled in the art, such as PCR-based methods using added primers that had corresponding sequences similar to those used in the method described above.

Следующую комбинацию экспрессионных векторов интродуцировали в клетки FreeStyle 293-F для кратковременной экспрессии каждой молекулы-мишени.The following combination of expression vectors was introduced into FreeStyle 293-F cells to transiently express each target molecule.

Молекула-мишень: GPC3_ERY22_rCE115.Target molecule: GPC3_ERY22_rCE115.

Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, встроенными в экспрессионные векторы: GL4ERY22_Hk, H0000-ERY22L, rCE115Н-ERY22_Hh, rCE115L-k0.Polypeptides encoded by polynucleotides inserted into expression vectors: GL4ERY22_Hk, H0000-ERY22L, rCE115H-ERY22_Hh, rCE115L-k0.

(1-2) Очистка GPC3 ERY22 rCE115.(1-2) Purification of GPC3 ERY22 rCE115.

Полученный супернатант культуры добавляли в колонку с антителом к FLAG M2 (фирма Sigma) и затем колонку промывали, после чего элюировали, используя пептид FLAG (фирма Sigma) в концентрации 0,1 мг/мл. Фракции, содержащие представляющую интерес молекулу, добавляли в колонку HisTrap HP (фирма GE Healthcare), а затем колонку промывали, после чего элюировали с использованием концентрационного градиента имидазола. Фракцию, содержащую представляющую интерес молекулу, концентрировали с использованием метода ультрафильтрации и затем концентрат вносили в колонку, заполненную Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), и каждую из очищенных представляющих интерес молекул собирали только в виде мономерных фракций из элюированного раствора.The resulting culture supernatant was added to an anti-FLAG M2 antibody column (Sigma), and then the column was washed and then eluted using FLAG peptide (Sigma) at a concentration of 0.1 mg/ml. Fractions containing the molecule of interest were added to a HisTrap HP column (GE Healthcare) and then the column was washed and then eluted using an imidazole concentration gradient. The fraction containing the molecule of interest was concentrated using an ultrafiltration method and then the concentrate was applied to a column packed with Superdex 200 (GE Healthcare) and each of the purified molecules of interest was collected only as monomeric fractions from the eluted solution.

(1-3) Измерение цитотоксической активности GPC3_ERY22_rCE115 с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека.(1-3) Measurement of the cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 using human peripheral blood mononuclear cells.

Оценивали in vitro цитотоксическую активность GPC3_ERY22_rCE115.The cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 was evaluated in vitro.

(1-3-1) Получение раствора мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС).(1-3-1) Obtaining a solution of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Получали образцы по 50 мл периферической крови здоровых добровольцев (взрослых) с использованием шприцев, предварительно заполненных 100 мкл (1000 ед./мл) раствора гепарина (Novo-Heparin 5000 ед. на инъекцию; фирма Novo Nordisk). Эту периферическую кровь двукратно разводили ЗФР(-), разделяли на четыре аликвоты и добавляли в пробирки для разделения лимфоцитов Leucosep (каталожный № 227290; фирма Greiner bio-one), в которые предварительно вносили 15 мл фиколл-пак PLUS и центрифугировали. После центрифугирования пробирок для разделения (2150 об/мин, 10 мин, комнатная температура) собирали фракции мононуклеарных клеток. Клетки во фракции мононуклеарных клеток однократно промывали с использованием модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (фирма SIGMA), содержащей 10% FBS (далее в контексте настоящего описания обозначена как 10%FBS/D- 53 041830Received samples of 50 ml of peripheral blood of healthy volunteers (adults) using syringes pre-filled with 100 μl (1000 units/ml) of heparin solution (Novo-Heparin 5000 units per injection; Novo Nordisk). This peripheral blood was diluted twice with PBS(-), divided into four aliquots, and added to Leucosep Lymphocyte Separation Tubes (catalog no. 227290; Greiner bio-one), which were preloaded with 15 ml of Ficoll-Pak PLUS and centrifuged. After centrifuging the separation tubes (2150 rpm, 10 min, room temperature), mononuclear cell fractions were collected. Cells in the mononuclear cell fraction were washed once using Dulbecco's Modified Eagle's Medium (SIGMA) containing 10% FBS (referred to hereinafter as 10% FBS/D-53 041830

MEM), а затем плотность клеток доводили до 4х10⁶ клеток/мл с помощью 10% FBS/D-MEM. Полученную таким образом клеточную суспензию применяли в качестве раствора человеческих РВМС в последующих экспериментах.MEM) and then the cell density was adjusted to 4x10 ⁶ cells/ml with 10% FBS/D-MEM. The cell suspension thus obtained was used as the human PBMC solution in subsequent experiments.

(1-3-2) Анализ цитотоксической активности.(1-3-2) Analysis of cytotoxic activity.

Цитотоксическую активность оценивали на основе степени ингибирования клеточного роста с помощью анализатора клеток в реальном времени xCELLigence (фирма Roche Diagnostics). Применяемые клетки-мишени представляли собой клеточную линию рака человека NCI-H446 или клеточную линию рака человека PC-10, экспрессирующую GPC3. Клетки NCI-H446 или РС-10 отделяли от чашек и высевали в планшет E-Plate 96 (фирма Roche Diagnostics) в виде аликвот 100 мкл/лунку, регулируя их количество на уровне 1х10⁴, и начинали анализ жизнеспособных клеток с помощью анализатора клеток в реальном времени xCELLigence. На следующий день планшет удаляли из анализатора клеток в реальном времени xCELLigence и в планшет добавляли по 50 мкл каждого соответствующего полученного антитела в различных концентрациях (0,004, 0,04, 0,4 и 4нМ). После осуществления реакции в течение 15 мин при комнатной температуре добавляли 50 мкл раствора человеческих РВМС (2х10⁵ клеток/лунку), полученного согласно методу, описанному в разделе (1-2) и клетки вновь помещали в анализатор клеток в реальном времени xCELLigence и начинали анализ жизнеспособных клеток. Реакцию проводили в атмосфере 5% газообразного диоксида азота при 37°С и степень ингибирования роста клеток (%) определяли с помощью приведенной ниже формулы с использованием величины клеточного индекса, определенной через 72 ч после добавления человеческих РВМС. Применяемую для расчета величину клеточного индекса стандартизовали таким образом, что величину клеточного индекса, определенную непосредственно перед добавлением антитела, принимали за 1.Cytotoxic activity was evaluated based on the degree of inhibition of cell growth using a real-time cell analyzer xCELLigence (Roche Diagnostics). The target cells used were the human cancer cell line NCI-H446 or the human cancer cell line PC-10 expressing GPC3. NCI-H446 or PC-10 cells were detached from the plates and seeded in an E-Plate 96 (Roche Diagnostics) as aliquots of 100 μl/well, adjusted to 1 x 10 ⁴ , and analysis of viable cells was started using a cell analyzer in real time xCELLigence. The next day, the plate was removed from the xCELLigence real-time cell analyzer and 50 μl of each corresponding antibody produced at different concentrations (0.004, 0.04, 0.4, and 4 nM) was added to the plate. After reacting for 15 min at room temperature, 50 µl of human PBMC solution (2x10 ⁵ cells/well) prepared according to the method described in section (1-2) was added and the cells were again placed in the xCELLigence real-time cell analyzer and analysis was started. viable cells. The reaction was carried out in an atmosphere of 5% nitrogen dioxide gas at 37°C, and the degree of cell growth inhibition (%) was determined using the following formula using the cell index value determined 72 hours after the addition of human PBMC. The cell index value used for the calculation was standardized in such a way that the cell index value determined immediately before the addition of the antibody was taken as 1.

Степень ингибирования роста клеток (%) = (А-Б) х 100/(А-1)Degree of cell growth inhibition (%) = (A-B) x 100/(A-1)

А обозначает среднюю величину клеточного индекса в лунках без добавления антитела (только клетки-мишени и человеческие РВМС), а Б обозначает среднюю величину клеточного индекса в каждой лунке. Измерение осуществляли в трех повторностях.A is the average cell index in wells without antibody addition (target cells and human PBMCs only), and B is the average cell index in each well. The measurement was carried out in triplicate.

Когда мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), полученные из человеческой крови, применяли в качестве эффекторных клеток для анализа цитотоксичности GPC3_ERY22_rCE115, обнаружена очень сильная активность (фиг. 2).When peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from human blood were used as effector cells for the GPC3_ERY22_rCE115 cytotoxicity assay, very strong activity was found (FIG. 2).

Пример 2. Гуманизация H-цепи антитела к CD3, rCE115 и совместное использование общей Lцепи.Example 2 Humanization of the H chain of the anti-CD3 antibody, rCE115, and sharing of the common L chain.

(2-1) Создание hCE115HA, гуманизированной вариабельной области Н-цепи антитела rCE115.(2-1) Creation of hCE115HA, a humanized H chain variable region of the rCE115 antibody.

Гуманизировали вариабельную область H-цепи антитела rCE115 к CD3 (SEQ ID NO: 42). CDR и FR определяли по Кэботу (нумерация Кэбота).The variable region of the H chain of the anti-CD3 antibody rCE115 (SEQ ID NO: 42) was humanized. CDR and FR were determined according to Cabot (Cabot numbering).

Сначала выбирали последовательность человеческого FR путем сравнения последовательностей вариабельных областей человеческих антител в базе данных с крысиной последовательностью вариабельной области rCE115. В качестве базы данных применяли базу данных IMGT (http://www.imgt.org/) и NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Гуманизированную последовательность вариабельной области H-цепи создавали, сшивая последовательность CDR вариабельной области H-цепи rCE115 с выбранной последовательностью человеческого FR. Таким путем получали гуманизированную последовательность вариабельной области H-цепи, hCE115HL(SEQ ID NO: 51).First, the human FR sequence was selected by comparing the human antibody variable region sequences in the database with the rat rCE115 variable region sequence. The IMGT database (http://www.imgt.org/) and NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) were used as the database. A humanized H chain variable region sequence was generated by ligating the rCE115 H chain variable region CDR sequence to a selected human FR sequence. In this way, a humanized H chain variable region sequence, hCE115HL (SEQ ID NO: 51), was obtained.

Аминокислотный остаток в положении 93 согласно нумерации Кэбота представляет собой Ala в выбранной последовательности человеческого FR3 Н-цепи, но представляет собой Arg в последовательности вариабельной области rCE115. При использовании базы данных последовательностей крысиных и человеческих зародышевых линий (база данных IMGT (http://www.imgt.org/)) обнаружено лишь несколько последовательностей, которые содержат в этом сайте Arg. Известно, что аминокислотный остаток в положении 94 согласно нумерации Кэбота принимает участие в стабилизации структуры антитела путем образования верхнего ядра (Ewert и др., Methods 34(2) октябрь 2004 г., с. 184-199). На основе указанной информации создавали новую последовательность гуманизированной вариабельной области H-цепи, в которой аминокислотные остатки в положениях по Кэботу 93 и 94 в FR3 H-цепи заменяли на остатки, присутствующие в последовательности вариабельной области rCE115. Таким путем получали гуманизированную последовательность вариабельной области H-цепи hCE115HA (SEQ ID NO: 52).The amino acid residue at position 93 according to Cabot numbering is Ala in the selected human FR3 H chain sequence, but is Arg in the rCE115 variable region sequence. Using the database of rat and human germline sequences (IMGT database (http://www.imgt.org/)) found only a few sequences that contain Arg in this site. It is known that the amino acid residue at position 94 according to Cabot numbering is involved in the stabilization of the structure of the antibody by the formation of the upper core (Ewert and others, Methods 34(2) October 2004, pp. 184-199). Based on this information, a new humanized H chain variable region sequence was generated in which amino acid residues at Cabot positions 93 and 94 in the FR3 H chain were replaced with residues present in the rCE115 variable region sequence. In this way, a humanized hCE115HA H chain variable region sequence was obtained (SEQ ID NO: 52).

(2-2) Создание общей L-цепи L0000 для антитела к CD3 rCE115 и антитела к GPC3.(2-2) Construction of the common L chain L0000 for the anti-CD3 antibody rCE115 and the anti-GPC3 antibody.

Осуществляли перестановку FR/CDR вариабельной области L-цепи rCE115L (SEQ ID NO: 43) антитела к CD3 rCE115 и вариабельной области L-цепи GL4 (SEQ ID NO: 41) антитела к GPC3.The FR/CDRs of the rCE115L L chain variable region (SEQ ID NO: 43) of the rCE115 anti-CD3 antibody and the GL4 L chain variable region (SEQ ID NO: 41) of the anti-GPC3 antibody were shuffled.

Выбирали последовательность FR GL4 в качестве последовательности FR L-цепи. CDR2 L-цепи был одинаковым в rCE115L и GL4. CDR1 L-цепи выбирали из последовательностей CDR GL4, a CDR3 Lцепи выбирали из последовательностей CDR rCE115L соответственно. Кроме того, вновь создавали CDR3 L-цепи путем замены аминокислотного остатка Asp в положении 94 по Кэботу выбранного CDR3 L-цепи на остаток Val, присутствующий в GL4.The GL4 FR sequence was chosen as the L chain FR sequence. The CDR2 of the L chain was the same in rCE115L and GL4. L chain CDR1s were selected from GL4 CDR sequences and L chain CDR3s were selected from rCE115L CDR sequences, respectively. In addition, the L chain CDR3 was recreated by replacing the Asp amino acid residue at Cabot position 94 of the selected L chain CDR3 with the Val residue present in GL4.

Гуманизированную последовательность вариабельной области L-цепи создавали, сшивая отобранные FR и CDR, описанные выше. В результате получали гуманизированную последовательность вариа- 54 041830 бельной области L-цепи, L0000 (SEQ ID NO: 53).A humanized L chain variable region sequence was generated by ligation of the selected FRs and CDRs described above. This resulted in a humanized L chain variable region sequence, L0000 (SEQ ID NO: 53).

(2-3) Оценка аффинности к человеческому GPC3.(2-3) Affinity assessment for human GPC3.

Оценивали связывающую активность в отношении человеческого GPC3 при применении GL4 (SEQ ID NO: 41) и L0000 (SEQ ID NO: 53) в качестве вариабельных областей L-цепей. Для осуществления этого применяли молекулярную форму антитела с одним плечом, несущего один Fab, гетеродимеризованный в Fc-области человеческого IgG1 с помощью технологии knobs-into-hole. H0000 (SEQ ID NO: 40) применяли в качестве вариабельной области H-цепи антитела к GPC3.The binding activity for human GPC3 was evaluated using GL4 (SEQ ID NO: 41) and L0000 (SEQ ID NO: 53) as L chain variable regions. To accomplish this, a single arm molecular form of an antibody carrying a single Fab heterodimerized in the Fc region of human IgG1 using knobs-into-hole technology was used. H0000 (SEQ ID NO: 40) was used as the variable region of the H chain of an anti-GPC3 antibody.

Константны аффинности и связывания антитела к GPC3 в отношении антигена измеряли с помощью метода многоциклической кинетики на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства Biacore™-Т200 (фирма GE Healthcare Japan). В качестве подвижного буфера применяли HBS-EP+ (фирма GE Healthcare Japan) и набор для аминного сочетания (фирма GE Healthcare Japan) применяли для ковалентного связывания белка A/G с СМ5-чипом (чип, покрытый карбоксиметилдекстраном). Каждое антитело к GPC3 приготавливали таким образом, чтобы примерно 100 RU захватывалось белком A/G. Человеческий GPC3, применяемый в качестве аналита, приготавливали в концентрации 8, 16, 32, 64 и 128 нМ, используя HBS-EP+. При осуществлении измерений сначала давали белку A/G связываться с раствором антитела, а затем инъецировали раствор человеческого GPC3 со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 3 мин, давая пройти реакции. Затем раствор заменяли на буфер HBS-EP+ и осуществляли оценку фазы диссоциации в течение 15 мин. После завершения оценки фазы диссоциации сенсорный чип регенерировали, промывая 10 мМ Gly-HCl при pH 1,5. Аналогично осуществляли измерение при концентрации 0, давая белку A/G осуществлять захват в растворе антитела, осуществляя инъекцию HBS-EP+ в течение 3 мин, давая пройти реакции, и затем заменяя раствор на HBS-EP+ для оценки фазы диссоциации в течение 15 мин. После завершения оценки фазы диссоциации сенсорный чип регенерировали, промывая 10 мМ Gly-HCl при pH 1,5. Для анализа данных применяли только программу для Biacore-анализа, программу Biacore T200 Evaluation, версия 1.0 применяли для осуществления кинетического анализа для расчета константы скорости реакции связывания (k_a), константы скорости реакции диссоциации (kd) и соотношения констант скорости на основе полученных сенсограмм. Результаты представлены в табл. 6.The affinity and binding constants of the anti-GPC3 antibody for the antigen were measured by surface plasmon resonance multicyclic kinetics using a Biacore™-T200 device (GE Healthcare Japan). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) was used as a running buffer, and an amine coupling kit (GE Healthcare Japan) was used to covalently bind the A/G protein to the CM5 chip (chip coated with carboxymethyl dextran). Each anti-GPC3 antibody was prepared so that approximately 100 RU was captured by the A/G protein. Human GPC3 used as analyte was prepared at 8, 16, 32, 64 and 128 nM using HBS-EP+. When performing measurements, protein A/G was first allowed to bind to the antibody solution, and then the human GPC3 solution was injected at a flow rate of 30 μl/min for 3 minutes, allowing the reaction to proceed. The solution was then replaced with HBS-EP+ buffer and the dissociation phase was evaluated for 15 minutes. After completion of the dissociation phase evaluation, the sensor chip was regenerated by washing with 10 mM Gly-HCl at pH 1.5. Similarly, a measurement was made at 0 concentration, allowing the A/G protein to capture in the antibody solution, injecting HBS-EP+ for 3 min, allowing reactions to proceed, and then replacing the solution with HBS-EP+ to evaluate the dissociation phase for 15 min. After completion of the dissociation phase evaluation, the sensor chip was regenerated by washing with 10 mM Gly-HCl at pH 1.5. Only Biacore analysis software was used for data analysis, Biacore T200 Evaluation software version 1.0 was used to perform kinetic analysis to calculate binding reaction rate constant (k _a ), dissociation reaction rate constant (kd) and rate constant ratio based on the obtained sensorgrams. The results are presented in table. 6.

Таблица 6Table 6

Вариабельная область Variable region Аффинность в отношении человеческого CD3 Affinity for human CD3 Вариабельная область Нцепи Variable region of Nchain Вариабельная область Lцепи Variable region of the L chain KD (М) KD (M) ka (1/Мс) ka (1/ms) kd (1/с) kd (1/s) НОООО NOOOOO GL4 GL4 4,2х10'⁹ ^4.2x10'9 4,3*10⁵ 4.3* ¹⁰⁵ 1,8х10’³ ^1.8x10'3 НОООО NOOOOO L0000 L0000 3,6х10'⁸ ^3.6x10'8 3,0х10⁵ 3.0x10 ⁵ Ι,ΙχΙΟ'² Ι,ΙχΙΟ' ²

(2-4) Оценка аффинности к человеческому CD3.(2-4) Assessing affinity for human CD3.

Оценивали связывающую активность в отношении человеческого CD3 при применении hCE115HA (SEQ ID NO: 52) в качестве вариабельной области Н-цепи и L0000 (SEQ ID NO: 53) в качестве вариабельной области L-цепи. Для осуществления этого применяли молекулярную форму антитела с одним плечом, несущего один Fab, гетеродимеризованный в Fc-области человеческого IgG1 с помощью технологии knobs-into-hole.Human CD3 binding activity was evaluated using hCE115HA (SEQ ID NO: 52) as the H chain variable region and L0000 (SEQ ID NO: 53) as the L chain variable region. To accomplish this, a single arm molecular form of an antibody carrying a single Fab heterodimerized in the Fc region of human IgG1 using knobs-into-hole technology was used.

Константы аффинности и связывания антитела к CD3 в отношении антигена измеряли с помощью метода одноциклической кинетики на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства Biacore™-F200 (фирма GE Healthcare Japan). В качестве подвижного буфера применяли HBSEP+ (фирма GE Healthcare Japan) и набор для аминного сочетания (фирма GE Healthcare Japan) применяли для ковалентного связывания человеческого CD3 с СМ5-чипом (чип, покрытый карбоксиметилдекстраном). Антитело к CD3, применяемое в качестве аналита, приготавливали в концентрациях 5 и 20 мкг/мл, используя HBS-EP+. Измерения осуществляли путем первой инъекции каждого из растворов антитела к CD3 в концентрациях 5 и 20 мкг/мл в течение 3 мин при скорости потока 20 мкл/мин, давая пройти реакции. Затем раствор заменяли на HBS-EP+ и осуществляли оценку фазы диссоциации в течение 3 мин. После завершения оценки фазы диссоциации сенсорный чип регенерировали, промывая 10 мМ Gly-HCl при pH 1,5. Для анализа данных применяли только программу для Biacore-анализа, программу Biacore T200 Evaluation, версия 1.0 применяли для осуществления кинетического анализа для расчета константы скорости реакции связывания (k_a), константы скорости реакции диссоциации (k_d) и соотношения констант скорости на основе полученных сенсограмм. Результаты представлены в табл. 7.The affinity and binding constants of the anti-CD3 antibody for the antigen were measured by the single-cycle kinetics method based on surface plasmon resonance using a Biacore™-F200 device (GE Healthcare Japan). HBSEP+ (GE Healthcare Japan) was used as a running buffer, and an amine coupling kit (GE Healthcare Japan) was used to covalently bind human CD3 to a CM5 chip (carboxymethyl dextran coated chip). Anti-CD3 antibody used as analyte was prepared at concentrations of 5 and 20 μg/ml using HBS-EP+. Measurements were made by first injecting each of the anti-CD3 antibody solutions at concentrations of 5 and 20 μg/ml for 3 minutes at a flow rate of 20 μl/min, allowing the reaction to proceed. The solution was then replaced with HBS-EP+ and the dissociation phase was evaluated for 3 minutes. After completion of the dissociation phase evaluation, the sensor chip was regenerated by washing with 10 mM Gly-HCl at pH 1.5. Only Biacore analysis software was used for data analysis, Biacore T200 Evaluation software version 1.0 was used to perform kinetic analysis to calculate binding reaction rate constant (k _a ), dissociation reaction rate constant (k _d ) and ratio of rate constants based on obtained sensorgrams . The results are presented in table. 7.

Таблица 7Table 7

Вариабельная область Variable region Аффинность в отношении человеческого CD3 Affinity for human CD3 Вариабельная область Нцепи Variable region of Nchain Вариабельная область Lцепи Variable region of the L chain KD (M) KD(M) ka (1/Мс) ka (1/ms) kd (1/с) kd (1/s) ГСЕ115Н GSE115N rCE115L rCE115L Ι,ΟχΙΟ⁷ Ι,ΟχΙΟ ⁷ 5,9х10⁴ 5.9x10 ⁴ 6,0х10’³ 6.0x10' ³ hCE115HA hCE115HA L0000 L0000 1,2х10⁷ 1.2x10 ⁷ 1,9х10⁵ 1.9x10 ⁵ 2,ЗхЮ'² 2,3xu' ²

(2-5) Получение GPC3 ERY27 hCE115.(2-5) Preparation of GPC3 ERY27 hCE115.

IgG4 к раковому антигену (GPC3) применяли в качестве основной структуры для получения молекулы ERY27 (фиг. 16), в которой вариабельную область H-цепи одного из Fab заменяли на домен, связы- 55 041830 вающий CD3 эпсилон, а L-цепь была общей для обоих Fab. В этом случае Fc IgG4, которую применяли в качестве основной структуры, представляла собой молчащую Fc с ослабленной аффинностью к FcgR (Fey- (Fc-гамма) рецептор). Н0000 (SEQ ID NO: 40) применяли в качестве вариабельной области H-цепи GPC3-связывающего домена, a hCE115HA (SEQ ID NO: 52) применяли в качестве вариабельной области H-цепи CD3-связывающего домена. L0000 (SEQ ID NO: 53) применяли в качестве вариабельной области L-цепи. Мутации D356K и К439Е интродуцировали в соответствующие H-цепи для эффективного образования гетеромеров каждой H-цепи при получении гетеродимерных антител, содержащих два типа Hцепей (WO 2006/106905). H435R представляет собой модификацию, которая нарушает связывание с белком А, и ее интродуцировали для эффективного разделения гетеромера и гомомера (WO 2011/078332).Anti-cancer antigen IgG4 (GPC3) was used as a base structure to generate the ERY27 molecule (FIG. 16), in which the H chain variable region of one of the Fab was replaced with a CD3 epsilon binding domain and the L chain was shared. for both Fab. In this case, the IgG4 Fc that was used as the main structure was a silent Fc with reduced affinity for FcgR (Fey-(Fc-gamma) receptor). H0000 (SEQ ID NO: 40) was used as the H chain variable region of the GPC3 binding domain, and hCE115HA (SEQ ID NO: 52) was used as the H chain variable region of the CD3 binding domain. L0000 (SEQ ID NO: 53) was used as the variable region of the L chain. Mutations D356K and K439E were introduced into the respective H chains to efficiently form heteromers of each H chain to produce heterodimeric antibodies containing two types of H chains (WO 2006/106905). H435R is a modification that disrupts protein A binding and has been introduced to efficiently separate heteromer and homomer (WO 2011/078332).

Серии экспрессионных векторов со встроенным полинуклеотидом, кодирующим каждую из конструкций f H0000-ERY27HK (SEQ ID NO: 54), hCE115HA-ERY27_HE (SEQ ID NO: 55) и L0000-k0 (SEQ ID NO: 56), получали хорошо известными методами.A series of expression vectors with an inserted polynucleotide encoding each of constructs f H0000-ERY27HK (SEQ ID NO: 54), hCE115HA-ERY27_HE (SEQ ID NO: 55) and L0000-k0 (SEQ ID NO: 56) were prepared by well-known methods.

Молекула-мишень: GPC3_ERY27_hCE115.Target molecule: GPC3_ERY27_hCE115.

Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, встроенными в экспрессионные векторы: H0000ERY27HK, hCE115HA-ERY27HE и L0000-k0 (2-6) Очистка GPC3 ERY27 hCE115.Polypeptides encoded by polynucleotides inserted into expression vectors: H0000ERY27HK, hCE115HA-ERY27HE and L0000-k0 (2-6) Purification of GPC3 ERY27 hCE115.

Каждую представляющую интерес молекулу очищали методом, описанным в примере 1-2.Each molecule of interest was purified by the method described in Example 1-2.

(2-7) Измерение цитотоксической активности с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека.(2-7) Measurement of cytotoxic activity using human peripheral blood mononuclear cells.

(2-7-1) Получение раствора мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС).(2-7-1) Obtaining a solution of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Раствор приготавливали согласно методу, описанному в примере 1-3-1.The solution was prepared according to the method described in example 1-3-1.

(2-7-2) Оценка цитотоксической активности.(2-7-2) Assessment of cytotoxic activity.

Цитотоксическую активность оценивали согласно методу, описанному в примере 1-3-2.Cytotoxic activity was evaluated according to the method described in example 1-3-2.

Когда РВМС, полученные из человеческой крови, применяли в качестве эффекторных клеток для оценки цитотоксичности GPC3_ERY27_hCE115, было обнаружено снижение активности в результате гуманизации H-цепи rCE115 и совместного использования общей L-цепи (фиг. 2).When PBMCs derived from human blood were used as effector cells to evaluate the cytotoxicity of GPC3_ERY27_hCE115, a decrease in activity was found as a result of the humanization of the H chain of rCE115 and the sharing of the common L chain (FIG. 2).

Пример 3. Получение и оценка гуманизированных вариантов биспецифических антител для улучшения различных свойств.Example 3 Generation and evaluation of humanized variants of bispecific antibodies to improve various properties.

Зависимая от Т-клеток цитотоксическую активность (TDCC-активность) биспецифического гуманизированного антитела к CD3-цепи (CD3 эпсилон) и к GPC3, полученного согласно методу, описанному в примере 2, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NO: 54, 55 и 56), оказалась ниже, чем зависимая от Т-клеток цитотоксическая активность GPC3_ERY22_rCE115 (SEQ ID NO: 47, 48, 49 и 50). Это может являться результатом ослабления аффинности к GPC3 и CD3ε-цепи в результате гуманизации и совместного использования общей L-цепи. Касательно антигенов, таких как GPC3 и CD3ε-цепи, которые имеют независимые друг от друга последовательности, к настоящему времени отсутствуют данные о гуманизированных биспецифических антителах с повышенной зависимой от Т-клеток цитотоксической активностью и улучшенной аффинностью к обоим антигенам при использовании общей L-цепи антитела. Таким образом, представляется сложным получение гуманизированных антител с двойной специфичностью, обладающих эффективностью в качестве лекарственных средств, эквивалентной или более высокой, чем у антитела GPC3_ERY22_rCE115.The T cell dependent cytotoxic activity (TDCC activity) of a bispecific humanized anti-CD3 chain (CD3 epsilon) and anti-GPC3 antibody prepared according to the method described in Example 2, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NOS: 54, 55 and 56), was found to be lower than the T-cell dependent cytotoxic activity of GPC3_ERY22_rCE115 (SEQ ID NOS: 47, 48, 49 and 50). This may be the result of weakened affinity for GPC3 and the CD3ε chain as a result of humanization and sharing of the common L chain. Regarding antigens such as GPC3 and CD3ε chains, which have sequences independent of each other, there is currently no evidence of humanized bispecific antibodies with increased T-cell dependent cytotoxic activity and improved affinity for both antigens using a common antibody L chain. . Thus, it is difficult to obtain dual specificity humanized antibodies that have drug efficacy equivalent to or greater than that of the GPC3_ERY22_rCE115 antibody.

С учетом указанных обстоятельств при создании изобретения получали модифицированные гуманизированные биспецифические антитела с модифицированной аффинностью к человеческому GPC3 и человеческой CD3ε-цепи с помощью методов, известных специалистам в данной области, которые включали обширную замену аминокислотных остатков, кодируемых геном антитела, с получением вариантов антител против обоих антигенов, а именно человеческого GPC3 и человеческой CD3ε-цепи, осуществление различных оценок с помощью скрининга. Кроме того, аналогичные методы применяли для получения модифицированных гуманизированных биспецифических антител с модифицированными физикохимическими свойствами. Кроме того, путем объединения замен аминокислотных остатков, обладающих эффективностью в отношении модификации аффинности и физико-химических свойств, получали оптимизированные биспецифические антитела с TDCC-активностью, эквивалентной или более высокой, чем зависимая от Т-клеток клеточная цитотоксичность GPC3_ERY22_rCE115 до гуманизиации.With these circumstances in mind, when creating the invention, modified humanized bispecific antibodies with modified affinity for the human GPC3 and human CD3ε chain were obtained using methods known to specialists in this field, which included extensive replacement of the amino acid residues encoded by the antibody gene, obtaining variants of antibodies against both antigens, namely human GPC3 and human CD3ε-chain, the implementation of various assessments using screening. In addition, similar methods were used to obtain modified humanized bispecific antibodies with modified physicochemical properties. In addition, by combining amino acid residue substitutions that are effective in modifying affinity and physicochemical properties, optimized bispecific antibodies with TDCC activity equivalent to or greater than GPC3_ERY22_rCE115 T-cell dependent cellular cytotoxicity prior to humanization were obtained.

Интродукцию точечных мутаций, экспрессию и очистку антител, оценку аффинности к антигену и определение зависимой от Т-клеток клеточной цитотоксичности при оптимизации гуманизированных биспецифических антител осуществляли согласно методам, аналогичным описанным в примерах 1 и 2. CDR и FR определяли согласно Кэботу (нумерация Кэбота).Point mutation introduction, antibody expression and purification, antigen affinity assessment, and determination of T-cell dependent cellular cytotoxicity while optimizing humanized bispecific antibodies were performed according to methods similar to those described in Examples 1 and 2. CDR and FR were determined according to Cabot (Cabot numbering).

В зависимости от цели следующие конструкции применяли в качестве константных областей Hцепи антитела (номера соответствуют EU-нумерации): E22Hh (SEQ ID NO: 57), которую получали путем интродукции мутаций L234А/L235А/N97А/D356С/Т366S/L368А/Y407V/G446-делеция/K447-делецияв человеческий IgG1; E22Hk (SEQ ID NO: 58), которую получали путем интродукции мутацийDepending on the purpose, the following constructs were used as constant regions of the antibody H chain (numbers correspond to EU numbering): E22Hh (SEQ ID NO: 57), which was obtained by introducing mutations L234A/L235A/N97A/D356C/T366S/L368A/Y407V/G446 -deletion/K447-deletion in human IgG1; E22Hk (SEQ ID NO: 58), which was obtained by introducing mutations

- 56 041830- 56 041830

L234А/L235А/N97А/Y349С/Т366W/G446-делеция/K447-делеция, и инсерционной мутации Ser-Ser непосредственно перед положением 118 в человеческом IgG1; G1dh получали путем интродукции мутацийL234A/L235A/N97A/Y349C/T366W/G446-deletion/K447-deletion, and Ser-Ser insertion mutation just before position 118 in human IgG1; G1dh was obtained by introducing mutations

D356С/Т366S/L368А/Y407V/G446-делеция/K447-делеция в человеческий IgG1; none-Hi-Kn010G3 получали путем интродукции делеции 118-215 и мутаций C220S/Y349C/T366W/H435R в человеческий IgG1;D356C/T366S/L368A/Y407V/G446-deletion/K447-deletion in human IgG1; none-Hi-Kn010G3 was generated by introducing the 118-215 deletion and C220S/Y349C/T366W/H435R mutations into human IgG1;

E2702GsKsc (SEQ ID NO: 60) получали путем интродукции мутацийE2702GsKsc (SEQ ID NO: 60) was obtained by introducing mutations

L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/H435R/L445P/G446-делеция/K447-делеция в человеческий IgG4; E2704sEpsc (SEQ ID NO: 61) получали путем интродукции мутацийL235R/S239K/N297A/E356K/R409K/H435R/L445P/G446-deletion/K447-deletion in human IgG4; E2704sEpsc (SEQ ID NO: 61) was obtained by introducing mutations

K196Q/L235R/S239K/N297A/R409K/K439Е/l445Р/G446-делеция/K447-делеция в человеческий IgG4; и E2702sKsc (SEQ ID NO: 62) получали путем интродукции мутацийK196Q/L235R/S239K/N297A/R409K/K439E/l445P/G446-deletion/K447-deletion in human IgG4; and E2702sKsc (SEQ ID NO: 62) were obtained by introducing mutations

L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/L445P/G446-делеция/K447-делеция в человеческий IgG4. Кроме того, человеческую к-цепь (каппа-цепь) k0 (SEQ ID NO: 63) и E22L (SEQ ID NO: 432) получали путем интродукции мутаций R108A/T109S в человеческую к-цепь, применяемую в качестве константных областей L-цепи антитела.L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/L445P/G446-deletion/K447-deletion in human IgG4. In addition, human k chain (kappa chain) k0 (SEQ ID NO: 63) and E22L (SEQ ID NO: 432) were obtained by introducing R108A/T109S mutations into the human k chain used as L chain constant regions antibodies.

Мутация, приводящая к замене Asp на Cys в положении 356 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к замене The на Ser в положении 366 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к замене Leu на Ala в положении 368 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к заменам Tyr на Val в положении 407 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к замене Tyr на Cys в положении 349 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к замене Thr на Tip в положении 366 согласно EU-нумерации, и мутация, приводящая к вставке Ser-Ser непосредственно перед положением 118 согласно EU-нумерации, представляют собой мутации, предназначенные для эффективного образования гетеродимерных молекул каждой H-цепи при создании гетеромерных антител. Аналогично этому, мутация, приводящая к замене Glu на Lys в положении 356 согласно EU-нумерации, и мутация, приводящая к замене Lys на Glu в положении 439 согласно EU-нумерации, также представляют собой мутации, предназначенные для эффективного образования гетеродимерных молекул каждой H-цепи при создании гетеромерных антител. Как ожидается, они должны повышать эффективность производства биспецифических антител.Mutation resulting in the replacement of Asp by Cys at position 356 according to the EU numbering, mutation resulting in the replacement of The by Ser at position 366 according to the EU numbering, mutation resulting in the replacement of Leu by Ala at position 368 according to the EU numbering, mutation, a Tyr to Val substitution at EU position 407, a Tyr to Cys substitution at EU position 349, a Thr to a Tip substitution at EU position 366, and a mutation resulting in to the Ser-Ser insert just before position 118 according to the EU numbering, are mutations designed to efficiently form heterodimeric molecules of each H chain when creating heteromeric antibodies. Similarly, a mutation resulting in the replacement of Glu with Lys at position 356 according to the EU numbering, and a mutation resulting in the replacement of Lys by Glu at position 439 according to the EU numbering, are also mutations designed to efficiently form heterodimeric molecules of each H- chains when creating heteromeric antibodies. As expected, they should increase the efficiency of production of bispecific antibodies.

Мутация, приводящая к замене Leu на Ala в положение 234 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к заменам Leu на Ala или Arg в положение 235 согласно EU-нумерации, мутация, приводящая к замене Ser на Lys в положение 239 согласно EU-нумерации, и мутация, приводящая к замене Asn на Ala в положение 297 согласно EU-нумерации, представляют собой мутации, предназначенные для ослабления аффинности к Fcy-рецептору и комплементу (C1q). Как ожидается, они должны подавлять связывание Fab с CD3 и опосредуемое Fc перекрестное сшивание Fcy-рецептора или комплемента и позволять избегать синдрома высвобождения цитокинов, который сопровождает повышение неспецифических эффекторных функций.Mutation resulting in the substitution of Leu for Ala at position 234 according to the EU numbering, mutation resulting in the substitution of Leu for Ala or Arg at position 235 according to the EU numbering, mutation resulting in the replacement of Ser for Lys at position 239 according to the EU numbering, and a mutation resulting in a substitution of Asn for Ala at position 297 according to the EU numbering are mutations designed to reduce affinity for the Fcy receptor and complement (C1q). They are expected to suppress Fab binding to CD3 and Fc-mediated Fcy receptor or complement cross-linking and avoid the cytokine release syndrome that accompanies an increase in non-specific effector functions.

H-цепь, в которую интродуцированы делеционные мутации в положениях 118-215 согласно EUнумерации, можно объединять с полноразмерной последовательностью H-цепи с получением антитела, которое имеет только один Fab (одновалентное антитело), и ее можно применять для оценки аффинности.An H chain introduced with deletion mutations at positions 118-215 according to EU numbering can be combined with the full length H chain sequence to produce an antibody that has only one Fab (monovalent antibody) and can be used to evaluate affinity.

Мутация, приводящая к замене Arg на Lys в положении 409 согласно EU-нумерации, и мутация, приводящая к замене His на Arg в положении 435 согласно EU-нумерации, представляют собой мутации, приводящие к модификации свойства антитела, приближая их к свойствам человеческого IgG1 и человеческого IgG3 соответственно.A mutation resulting in the change of Arg to Lys at position 409 according to the EU numbering, and a mutation resulting in the change of His to Arg at position 435 according to the EU numbering, are mutations that lead to a modification of the property of the antibody, bringing them closer to the properties of human IgG1 and human IgG3, respectively.

(3-1) Модификация аффинности гуманизированного антитела к CD3 с помощью точечных мутаций.(3-1) Modification of the affinity of a humanized anti-CD3 antibody by point mutations.

Сначала интродуцировали точечные мутации в последовательность FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2 и CDR3 гуманизированного антитела к человеческой CD3ε-цепи, полученного согласно методу, описанному в примере 2, hCE115HA-ERY27HE (SEQ ID NO: 55), для получения модифицированных антител. Затем определяли аффинность указанных модифицированных антител к растворимой человеческой CD3ε-цепи. Объединяя сайты, которые обладают способностью повышать аффинность модифицированных антител, получали модифицированные антитела, аффинности которых представлены в табл. 8.First, point mutations were introduced into the sequence of FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2, and CDR3 of a humanized anti-human CD3ε chain antibody prepared according to the method described in Example 2, hCE115HA-ERY27HE (SEQ ID NO: 55), to obtain modified antibodies. The affinity of these modified antibodies to the soluble human CD3ε chain was then determined. By combining sites that have the ability to increase the affinity of the modified antibodies, modified antibodies were obtained, the affinities of which are presented in table. 8.

- 57 041830- 57 041830

Таблица 8Table 8

Название антитела Name of the antibody KD (человеческий CD3) KD (human CD3) hC Е115HA-E22Hh//-Hi-KoO10G3/L0000-k0 hC Е115HA-E22Hh//-Hi-KoO10G3/L0000-k0 1.43E-07 1.43E-07 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 5.86E-11 5.86E-11 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/^ TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/^ 2.17E-O9 2.17E-O9 TROlH002-E22Hh/GLS3l08-kO/GL4-E22Hk/H0610-E22L TROlH002-E22Hh/GLS3l08-kO/GL4-E22Hk/H0610-E22L 2.04E-09 2.04E-09 TR01H040-E22Hh^one-Hi-Kn010G3/L0212-k0 TR01H040-E22Hh^one-Hi-Kn010G3/L0212-k0 2.17Е-Я9 2.17E-Z9 TR0lH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0235-k0 TR0lH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0235-k0 2.81 E-09 2.81 E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0238-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0238-k0 2.91 E-09 2.91 E-09 TR01H040-E22Hh>none-Hi-Kn010G3/TR01L015-kD TR01H040-E22Hh>none-Hi-Kn010G3/TR01L015-kD 2.52E-O9 2.52E-O9 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/La262-k0 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/La262-k0 2.45E-09 2.45E-09 TR01H04O-E22Hh/none-Hi-Kri010G3/L0207-k0 TR01H04O-E22Hh/none-Hi-Kri010G3/L0207-k0 2.6OE-O9 2.6OE-O9 TR0lH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0241-k0 TR0lH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0241-k0 3.48E-09 3.48E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0242-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0242-k0 Э.58Е-09 E.58E-09 TRQ1HO4O-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LQ2O6-kO TRQ1HO4O-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LQ2O6-kO 2.9QE-Q9 2.9QE-Q9 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L019-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L019-k0 3.20ΕΌ9 3.20ΕΌ9 TR01H080-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 TR01H080-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 3.25E-09 3.25E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0211-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0211-k0 3.22ΕΌ9 3.22ΕΌ9 TRO1HOO2-E22Hh//-Hi-KnD10G3/GLC31O8-kO TRO1HOO2-E22Hh//-Hi-KnD10G3/GLC31O8-kO 4.61 E-09 4.61 E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0209-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0209-k0 4.25E-09 4.25E-09 TR01HC40-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L020S-W TR01HC40-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L020S-W 4.16E-09 4.16E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0224-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0224-k0 5.06E-09 5.06E-09 TR01H040-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/LQ236-k0 TR01H040-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/LQ236-k0 5.64E-O9 5.64E-O9 TR01H083-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/L0201-k0 TR01H083-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/L0201-k0 4.42E-09 4.42E-09 TR01H084-E2702GsKsc/none-Hi-E2704sE/L0011 -kO TR01H084-E2702GsKsc/none-Hi-E2704sE/L0011-kO 4.14E-09 4.14E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L02l0-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L02l0-k0 5.06E-09 5.06E-09 TR01H114.E2702GsKsc/nQne.H!-E2704sE/L0011-kO TR01H114.E2702GsKsc/nQne.H!-E2704sE/L0011-kO 4.22E-09 4.22E-09 CE115HA236-E22Hh/GLS3108-кО/СЕ4-Е22Нк/Н06Ю-Е22Е CE115HA236-E22Hh/GLS3108-KO/CE4-E22Hk/H06U-E22E 6.08E-09 6.08E-09 TR01H077-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 TR01H077-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 6.12E-09 6.12E-09 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 6.13E-09 6.13E-09 TR01H111-E2702GsKsc/none-Hi-E2704sE/L0011 -k0 TR01H111-E2702GsKsc/none-Hi-E2704sE/L0011-k0 4.91 E-09 4.91 E-09 TR01H081-E22Hh/none-Hj-Kn010G3/L0262-k0 TR01H081-E22Hh/none-Hj-Kn010G3/L0262-k0 5.76E-09 5.76E-09 TR01H001-E22Hh/AHi-Kn010G3/GLC3108-kO TR01H001-E22Hh/AHi-Kn010G3/GLC3108-kO 8.22E-O9 8.22E-O9 CE115HA179-G1dh/M4l-Kn010G3/L0Q00-k0 CE115HA179-G1dh/M4l-Kn010G3/L0Q00-k0 8.35E-09 8.35E-09 TR01H112-E2702GsKsc/nore-Hf-E2704sE/L0011-k0 TR01H112-E2702GsKsc/nore-Hf-E2704sE/L0011-k0 5.12E-O9 5.12E-O9 TR01H113-E2702GsKsc/none-Ht-E2704sE/L0011-k0 TR01H113-E2702GsKsc/none-Ht-E2704sE/L0011-k0 5.14E-09 5.14E-09 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 4.75E-09 4.75E-09 CE115HA236-E22Hh//-Hi-Kn010G3/GLC3108-k0 CE115HA236-E22Hh//-Hi-Kn010G3/GLC3108-k0 9.10E-09 9.10E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0231-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0231-k0 7.75E-09 7.75E-09 TR0lH037-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 TR0lH037-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 6.93E-09 6.93E-09 CE115H A252-E22Hh//-Hi-KnO WG3/LQOOO-kO CE115H A252-E22Hh//-Hi-KnO WG3/LQOOO-kO 9.48E-09 9.48E-09 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kO TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kO 6.70E-09 6.70E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0223-kO TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0223-kO 8.15E-09 8.15E-09 Τ^01Ηΰθ3-£22ΗΜ/ηοηθ-ΗρΚη0ΐ0ΰ3/10ΰ00-ω Τ^01Ηΰθ3-£22ΗΜ/ηοηθ-ΗρΚη0ΐ0ΰ3/10ΰ00-ω 6.83E-O9 6.83E-O9 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 Э.85Е-09 E.85E-09 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 5.88E-O9 5.88E-O9 CE115HA178-G1dh//-Hi-Kn010G3/L0000-k0 CE115HA178-G1dh//-Hi-Kn010G3/L0000-k0 1.09E-08 1.09E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0237-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0237-k0 1.02E-0B 1.02E-0B TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 TR01H083-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 9.42E-09 9.42E-09 TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 8.51E-O9 8.51E-O9 TR0lH071-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0215-k0 TR0lH071-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0215-k0 9.51 E-09 9.51 E-09 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G30218-kO TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G30218-kO 8 20E-09 8 20E-09 TRQ1HO81-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L02O1-kO TRQ1HO81-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L02O1-kO 9.46E-09 9.46E-09 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 1.04E-08 1.04E-08 TR01H040-E22Kh/none-Hi“Kri010G3/L0220“k0 TR01H040-E22Kh/none-Hi“Kri010G3/L0220“k0 9.15E-O9 9.15E-O9 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L018-k0 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L018-k0 1.09E-08 1.09E-08 TRO1HOO2-E22Hh/GLS31384<O/GL4-E22Hk/HD0OO-E22L TRO1HOO2-E22Hh/GLS31384<O/GL4-E22Hk/HD0OO-E22L 4.78E-09 4.78E-09 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR0U019-k0 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR0U019-k0 1.21E-08 1.21E-08 TRO1HO38-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO TRO1HO38-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO 1.24E-08 1.24E-08 TR01H06l-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 TR01H06l-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 1.27E-08 1.27E-08 TR01H082-E2702GsKsc/nQne-Ht-E27Q4sE/L(X!11 -k0 TR01H082-E2702GsKsc/nQne-Ht-E27Q4sE/L(X!11 -k0 1.01 E-08 1.01 E-08 CE115HA18O-G1dh/AHi-KnO1OG3/LD0OO-kO CE115HA18O-G1dh/AHi-KnO1OG3/LD0OO-kO 1.68E-08 1.68E-08 CE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L CE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L 1.37E-08 1.37E-08 TROlHl0O-E2702GsKsc/nore-Hi-E2704sE/L00l1-k0 TROlHl0O-E2702GsKsc/nore-Hi-E2704sE/L00l1-k0 1.11 E-08 1.11 E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0228-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0228-k0 1.60E-08 1.60E-08 TR01H081-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 TR01H081-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 1.35E-08 1.35E-08 TR01H061-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0 TR01H061-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0 1.54E-08 1.54E-08 TR01H110-E2702GsKsG/none-Ht-E2704sE/L0011-kO TR01H110-E2702GsKsG/none-Ht-E2704sE/L0011-kO 1.26E-O8 1.26E-O8 TR0lH043-E22Hh/non©-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 TR0lH043-E22Hh/non©-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 1.52E-08 1.52E-08 TR01H081-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000^ TR01H081-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000^ 1.56E-08 1.56E-08 CE115HA251 -E22Hh//-Hi-Kn010G3/L000D-k0 CE115HA251-E22Hh//-Hi-Kn010G3/L000D-k0 2.23E-08 2.23E-08 TR01H091-E27Q2GsKsc/none-Ht-E2704sE/LQ011-k0 TR01H091-E27Q2GsKsc/none-Ht-E2704sE/LQ011-k0 1.Э9Е-08 1.E9E-08 CE115HA236-E22Hh/GLS31 D8-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L CE115HA236-E22Hh/GLS31 D8-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L S.95E-09 S.95E-09 TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0201-№ TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0201-No. 1.65E-08 1.65E-08 TRO1HO72-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO TRO1HO72-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO 2.03E-0S 2.03E-0S TR01H099-E2702GsKsc/nons>HHE2704sE/L0011 -kO TR01H099-E2702GsKsc/nons>HHE2704sE/L0011-kO 1 4SE-08 14SE-08 TR01H061-E22Hh/non©-Hi-Kn010G3/L0222-kO TR01H061-E22Hh/non©-Hi-Kn010G3/L0222-kO 1.88E-08 1.88E-08 TR01HW0-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0239-k0 TR01HW0-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0239-k0 2.31 E-08 2.31 E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-kO TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-kO 1.81 E-08 1.81 E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0234-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0234-k0 2.40E-08 2.40E-08 TRO1HO12-E22Hh/nane-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO TRO1HO12-E22Hh/nane-Hi-KnO1OG3/L0OOO-kO 7 94E-D9 794E-D9 TR01H061-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 TR01H061-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 1.71 E-08 1.71 E-08 TRO1HO4O-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0243-kO TRO1HO4O-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/L0243-kO 2.4SE-08 2.4SE-08 TR0lH109-E2702GsK8c/none-Hi-E2704sE/L0011-k0 TR0lH109-E2702GsK8c/none-Hi-E2704sE/L0011-k0 1.84E-08 1.84E-08 TR01H047-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 TR01H047-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 2.04E-08 2.04E-08 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0267-k0 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0267-k0 2.29E-08 2.29E-08 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0266-k0 TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0266-k0 2.29E-08 2.29E-08 TR01H064-E22Hh/none-Hi“Kri010G3/L0011-kO TR01H064-E22Hh/none-Hi“Kri010G3/L0011-kO 1.98E-08 1.98E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0250-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0250-k0 2.15E-08 2.15E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 2.21E-08 2.21E-08 TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0 TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0 2.13E-08 2.13E-08 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LD213-k0 TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LD213-k0 2.01E-08 2.01E-08

- 58 041830 ^iCEDSHA^gHh^^^________- 58 041830 ^iCEDSHA^gHh^^^________

TR01H040-E22Hh/n0ne-Hi-Kn010G3/L0214-k0TR01H040-E22Hh/n0ne-Hi-Kn010G3/L0214-k0

TRD1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0217-k0TRD1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0217-k0

TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0226-k0TR01H071-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0226-k0

ТКО1Н040-Е22НП/попе-НкКп0ЮОЗ/к0200-к0TKO1N040-E22NP/pope-NcKp0UOZ/k0200-k0

TRO1H074-E22Hh/none'Hi'Kn010G3/LO000’k0TRO1H074-E22Hh/none'Hi'Kn010G3/LO000'k0

TR01 H039-E22Hh/none-HI-Kn010G3/LO00G-kQTR01 H039-E22Hh/none-HI-Kn010G3/LO00G-kQ

CE115HA177-G1 dh/AHi-KnO1OG3/LOOOO-kOCE115HA177-G1dh/AHi-KnO1OG3/LOOOO-kO

TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kri010G3/L0201-k0TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kri010G3/L0201-k0

TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L02S3-k0TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L02S3-k0

ТКО1Н040-Е22НЬ/попе-НкКп010СЗЛ_0000-к0TKO1N040-E22N/pope-NcKp010SZL_0000-k0

ТК01Н040Е22НП/ПОПе-НкКп010ОЗ/к0216-к0TK01N040E22NP/POPE-NcKp010OZ/k0216-k0

TR01H051 -E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01H051-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0

TR01 H003-E22Hh/AHi-Kn01 OG3/LOOOO-kOTR01 H003-E22Hh/AHi-Kn01 OG3/LOOOO-kO

TR01 Η082Έ22ΗΚ/ποπδΉί·Κη010Ο3/10264-Κ0TR01 Η082Έ22ΗΚ/ποπδΉί Κη010Ο3/10264-Κ0

TR01 H04Q-E22Hh>none-Hi-Kn010G3/L0232 k0TR01 H04Q-E22Hh>none-Hi-Kn010G3/L0232 k0

TRO1H041 -E22Hh/rK»ne-Hi-KnO1OG3/LO0OO'kOTRO1H041 -E22Hh/rK»ne-Hi-KnO1OG3/LO0OO'kO

CE115HA122-E22Hh//-Hi-KnO1 DG3/L000D-k0CE115HA122-E22Hh//-Hi-KnO1 DG3/L000D-k0

TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0233-k0TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0233-k0

TRD1H04G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0TRD1H04G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0

TRDlH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0203-k0TRDlH040-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/L0203-k0

TRO1HO15-E27O2GsKsc/GCHO19-E27iMsEpsG/L0OOO-kO TR01H04C-E22Hh/rt0n6-Hi-Kn010G3/TR01 L008-k0TRO1HO15-E27O2GsKsc/GCHO19-E27iMsEpsG/L0OOO-kO TR01H04C-E22Hh/rt0n6-Hi-Kn010G3/TR01 L008-k0

TR01H040-E22Hh/none.Hi-Kn010G3?L0205-kOTR01H040-E22Hh/none.Hi-Kn010G3?L0205-kO

TR01H015-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22LTR01H015-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L

TR01H064-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01H064-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0

TR01HO44-E22HIVnone-Hi-Kn010G3/LQ000-k0TR01HO44-E22HIVnone-Hi-Kn010G3/LQ000-k0

TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0

TR01H062-E22Hh/none-HhKn010G3/LO000-k0TR01H062-E22Hh/none-HhKn010G3/LO000-k0

CE115HA251 -E22HhiL0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22LCE115HA251-E22HhiL0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L

TR01H040-E22Hh/rK>ne-Hi-Kn010G3/L0011-kOTR01H040-E22Hh/rK>ne-Hi-Kn010G3/L0011-kO

TRO1 HQ40-E22Hh/rtone-Hi-Kn010G3/L0222-k0TRO1 HQ40-E22Hh/rtone-Hi-Kn010G3/L0222-k0

CE115HA192-E22Hh/FHi-KnO10G3/L0000-k0CE115HA192-E22Hh/FHi-KnO10G3/L0000-k0

TR01H04G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 LOIO-kOTR01H04G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 LOIO-kO

TR01H025-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01H025-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0

TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3rTR01 L023-kDTR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3rTR01 L023-kD

TR01H040-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/TR01L015-k3TR01H040-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/TR01L015-k3

TRO1H055-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LtXl00-k0TRO1H055-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LtXl00-k0

TR0lH082*E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0260-k0TR0lH082*E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0260-k0

TR01 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 L009-k0TR01 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 L009-k0

TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRCHLC11-kOTR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRCHLC11-kO

TR01 HOI 7.E22Hhinone-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01 HOI 7.E22Hhinone-Hi-Kn010G3/L0000-k0

CE115HA122*E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22LCE115HA122*E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L

TR01H076-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO000-k0TR01H076-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO000-k0

TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0258-k0TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0258-k0

TR01H046-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 rCE115H-G1dW-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01H046-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 rCE115H-G1dW-Hi-Kn010G3/L0000-k0

TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/TR0l L024-k0TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/TR0l L024-k0

TR01H016-E22HtVnone-Hi-Kn010G3/L000O-k0TR01H016-E22HtVnone-Hi-Kn010G3/L000O-k0

TR01H040-E22Hh/none-Hi-KnOlOG3?TR01 LGl8kOTR01H040-E22Hh/none-Hi-KnOlOG3?TR01LGl8kO

TR01 H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0271-k0TR01 H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0271-k0

TRO1HO84-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LO27O-kOTRO1HO84-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LO27O-kO

TRCl1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000vk1-k0TRCl1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000vk1-k0

TRO1HO4G-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LO219-kOTRO1HO4G-E22Hh/none-Hi-KnO1OG3/LO219-kO

TR01 HOI 4-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO000-k0TR01 HOI 4-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO000-k0

TRO1H061 -E22Hh(none-Hi-Kn010G3/L0226-k0TRO1H061-E22Hh(none-Hi-Kn010G3/L0226-k0

TR01H048-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0TR01H048-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0

TRD1H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0TRD1H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0

ТН01Н028^22НК/гюпе-НнКп010ЙЭ/1СКЮ0-к0TN01N028^22NK/gupe-NnKp010YE/1SKU0-c0

TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0TR01H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0

TRD1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 L013-k0TRD1H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01 L013-k0

TR01H033-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0a00-k0 hCEl 15HA-G1 dh//-HbKn010G3rLC00CM<0TR01H033-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0a00-k0 hCEl 15HA-G1 dh//-HbKn010G3rLC00CM<0

TR01H040-E22Hh?none-Hi-Kn010G3/TR0U012-k0TR01H040-E22Hh?none-Hi-Kn010G3/TR0U012-k0

TR01HQ65-E22H^non^Hi-Kn010G30000-kOTR01HQ65-E22H^non^Hi-Kn010G30000-kO

TRD1H079-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0TRD1H079-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0

TR01 H042-E22Hh<none’Hi’Kn010G3/L0a00'-k0TR01 H042-E22Hh<none’Hi’Kn010G3/L0a00'-k0

TRO1 НО63^22НЬ/ПОПе-НнКпО1ОСЗ/1.СЮ0О-к0TRO1 HO63^22Hb/POPE-NnKpO1OSZ/1.SIO0O-k0

TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0272-k0TR01H084-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0272-k0

CE115HA121 -E22Hh//-Hi-KnD1 DG3/LOOOD-kOCE115HA121 -E22Hh//-Hi-KnD1 DG3/LOOOD-kO

TR01H026-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO00-k0TR01H026-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO00-k0

TR01H067-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/LQ262-k0TR01H067-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/LQ262-k0

TR01H073*E22Hh/none-Hi-Kn010G3/Lt)000-kOTR01H073*E22Hh/none-Hi-Kn010G3/Lt)000-kO

7R01H045-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k07R01H045-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0

TR01H007-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LtXK)0-k0TR01H007-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LtXK)0-k0

TR01H082Έ22Hh/πone-Hl·Kn010GЗ/L0203-k0TR01H082Έ22Hh/πone-Hl Kn010GЗ/L0203-k0

TR01H032-E22Hh/none-HI-Kn010G3/LCK}00-k0TR01H032-E22Hh/none-HI-Kn010G3/LCK}00-k0

TR01H006-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0TR01H006-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0

TRO1 HOI 3-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0TRO1 HOI 3-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LM00-k0

TR01H05G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOa00-k0TR01H05G-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOa00-k0

TR01H067-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/L0200-k0TR01H067-E22Hh/nane-Hi-Kn010G3/L0200-k0

TR01 HOI 5-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 hCEl 15HA-E22Hh/LOOOO-kO/GL4-E22Hk/HQOOO-E22L hCE115ΗΑ-Ε22δΐΗη/ηοη&-Ηΐ·&ίΚη010Ώ3/Ι00004:0TR01 HOI 5-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 hCEl 15HA-E22Hh/LOOOO-kO/GL4-E22Hk/HQOOO-E22L hCE115ΗΑ-Ε22δΐΗη/ηοη&-Ηΐ·&ίΚηη0003/04:0

TR01H069-E22Hh/none’HhKn010G3/L0000-k0TR01H069-E22Hh/none'HhKn010G3/L0000-k0

TRO1 HOI 5*Е22НЬ/папе-НкКпО1ОСЗ/ТНО1 L003-k0TRO1 HOI 5*E22Hb/male-NkKpO1OSZ/TNO1 L003-k0

TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0202-k0TR01H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0202-k0

TRO1H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0TRO1H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0

TRO1 H02G-E22Hh/non^Hi-Kn010G3/L0000-k0TRO1 H02G-E22Hh/non^Hi-Kn010G3/L0000-k0

TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kri01QG3/L0011-k0TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kri01QG3/L0011-k0

43E-07 2 02E-O8 207E-08 2.51E-0B 287E-08 2.91E-08 2.61ΕΌ8 3 55E-08 2.81E-08 309E-08 3 60E-0B 253ΕΌ8 2.91E-0B 403E-08 3.44ΕΌΒ 386ΕΌ843E-07 2 02E-O8 207E-08 2.51E-0B 287E-08 2.91E-08 2.61EΌ8 3 55E-08 2.81E-08 309E-08 3 60E-0B 253EΌ8 2.91EΕΌΕ 403E-08 3.44

16E-08 428E-0816E-08 428E-08

4.01E-084.01E-08

3.37E-08 3 24E-0& 2.96E-08 2.93E-083.37E-08 3 24E-0& 2.96E-08 2.93E-08

42E-O8 357E-0842E-O8 357E-08

3.07E-0B 352E-08 39SE-O83.07E-0B 352E-08 39SE-O8

13ΕΌ8 1 48ΕΌ813ΕΌ8 1 48ΕΌ8

48E-08 465E-08 50&E-0B Э28Е-08 386E-0848E-08 465E-08 50&E-0B E28E-08 386E-08

4.25E-084.25E-08

3.95E-O&3.95E-O&

3.Θ8Ε-08 453E-O8 356E-O8 357E-083.Θ8Ε-08 453E-O8 356E-O8 357E-08

3.50E-0B3.50E-0B

69ΕΌ8 478E-08 4.70E-08 423E-O869ΕΌ8 478E-08 4.70E-08 423E-O8

5.76E-OB 476E-08 369E-0B 451E-0&5.76E-OB 476E-08 369E-0B 451E-0&

2.76E-082.76E-08

2.76E-08 4.69ΕΌ8 3.94ΕΌ8 387E-08 471E-08 452E-08 5.07E-08 480E-08 449E-08 4.15E-O8 4.88ΕΌ8 6.50E-08 422E-08 431E-08 505E-082.76E-08 4.69ΕΌ8 3.94ΕΌ8 387E-08 471E-08 452E-08 5.07E-08 480E-08 449E-08 4.15E-O8

4.48E-0&4.48E-0&

4.35ΕΌ8 3 10E-08 678E-084.35ΕΌ8 3 10E-08 678E-08

5.12E-0B5.12E-0B

92ΕΌ8 597ΕΌ8 5.22E-O8 2.17E-0892ΕΌ8 597ΕΌ8 5.22E-O8 2.17E-08

4.07E-0B 573E-08 230E-0& 4.94E-084.07E-0B 573E-08 230E-0& 4.94E-08

5.76E-08 603E-085.76E-08 603E-08

13E-08 6 16E-0813E-08 6 16E-08

5.17E-O85.17E-O8

7.11ΕΌ87.11ΕΌ8

6.34ΕΌ86.34ΕΌ8

6.19E-086.19E-08

93E-08 6.48E-0B 595E-0B93E-08 6.48E-0B 595E-0B

- 59 041830- 59 041830

hCE115HA-E22Hh//-Hi-KnO10G3/LM00-k0 hCE115HA-E22Hh//-Hi-KnO10G3/LM00-k0 1.43E-07 1.43E-07 TRC1H0B2-E22Hh/none-Hi-Kn010G37TR0lL018-k0 TRC1H0B2-E22Hh/none-Hi-Kn010G37TR0lL018-k0 4.72E-08 4.72E-08 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G34R01L005-k0 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G34R01L005-k0 6.53E-08 6.53E-08 TRG1 Н052-Е22НИ/поге-НьКп01 OG3/LOOOO-kO TRG1 H052-E22NI/poge-NnKp01 OG3/LOOOO-kO 6.27Ε-0Θ 6.27Ε-0Θ TR01 H036-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3A0000-k0 TR01 H036-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3A0000-k0 6.50E-08 6.50E-08 TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0203-kO TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0203-kO 4.79E-C6 4.79E-C6 TR01 H03G-E22Hh/none-HiKn01 GG3/L0000-kG TR01 H03G-E22Hh/none-HiKn01 GG3/L0000-kG 6.54E-08 6.54E-08 TR01H0l5-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/TR0lL001-k0 TR01H0l5-E22Hh/none-Hi-Kn0l0G3/TR0lL001-k0 6.56E-08 6.56E-08 TRG1 Hl00-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO11-kO TRG1 Hl00-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO11-kO 6.25E-08 6.25E-08 TR01 H029-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/LOOOO-kO TR01 H029-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/LOOOO-kO 6.70E-08 6.70E-08 TR01 H019-E22Hh/none-Hi-Kn01 QG3/L0000-kG TR01 H019-E22Hh/none-Hi-Kn01 QG3/L0000-kG 6.&5E-08 6.&5E-08 TRG1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0000-kG TRG1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0000-kG 7.37E-08 7.37E-08 TRG1 H0l8-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/LOOOO-kO TRG1 H0l8-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/LOOOO-kO 6.93E-08 6.93E-08 TR01 H027-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H027-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 6.95E-08 6.95E-08 TR01 H049-E22Hh/rwe-Hi-Kn010G3/L000frk0 TR01 H049-E22Hh/rwe-Hi-Kn010G3/L000frk0 6.79E-08 6.79E-08 TR01 H066-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0000-kG TR01 H066-E22Hh/none-Hi-Kn0l GG3/L0000-kG 6.02E-08 6.02E-08 TR01 H091-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/L0011-kO TR01 H091-E22Hh/none-Hi-Kn0l OG3/L0011-kO 6.67E-08 6.67E-08 rCE115H-E22Hh/ncne-Hi-Kn010G3/L0000-k0 rCE115H-E22Hh/ncne-Hi-Kn010G3/L0000-k0 8.00E-08 8.00E-08 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L002-k0 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TR01L002-k0 7.14E-08 7.14E-08 TR01 H040-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0226-kO TR01 H040-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0226-kO 8.01E-08 8.01E-08 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3HR0lL018-k0 TR01H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3HR0lL018-k0 5.26E-08 5.26E-08 TRG1 H093-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TRG1 H093-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 6.80E-08 6.80E-08 TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-kO TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0215-kO 7.41E-08 7.41E-08 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRC1L004-k0 TR01H015-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRC1L004-k0 7.34Ε-0Θ 7.34Ε-0Θ TR01 H107-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 H107-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 6.91E-08 6.91E-08 TR01 H105-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 H105-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 6.95E-08 6.95E-08 TR01 HQ90-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 HQ90-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 6.95E-08 6.95E-08 TR01 H108-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 H108-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 6.98Ε-0Θ 6.98Ε-0Θ TR01 H094-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 H094-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 7.00E-08 7.00E-08 TR01 HI 09-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TR01 HI 09-E22Hh/nore-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO 7.06E-08 7.06E-08 TR01 H056-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H056-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 7.32E-08 7.32E-08 TR01 H031-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H031-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 7.55E-08 7.55E-08 TR01 H022-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H022-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 7.58E-08 7.58E-08 TR01 H092-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L001 FkO TR01 H092-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L001 FkO 7.21E-08 7.21E-08 TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 7.15E-08 7.15E-08 TR01 H067-E22Hh/nore-Hi-Kn010G3A0Q1 FkO TR01 H067-E22Hh/nore-Hi-Kn010G3A0Q1 FkO 7.1 BE-08 7.1 BE-08 TR01 H040-E22Hh/nore-Hi-Kn010G3A.O248-k0 TR01 H040-E22Hh/nore-Hi-Kn010G3A.O248-k0 7.89E-08 7.89E-08 TR01 Η009Έ22ΗΗ/πογθ-Ηϊ-Κπ01 OG3/LOOOO-kO TR01 Η009Έ22ΗΗ/πογθ-Ηϊ-Κπ01 OG3/LOOOO-kO 3.15E-08 3.15E-08 TR01 H023-E22Hh/rone-Hi-Kn01 0G3/L00OT-k0 TR01 H023-E22Hh/rone-Hi-Kn01 0G3/L00OT-k0 7.94E-08 7.94E-08 TR01 Н096'Е22НЬ/попеНйКп01 OG3/L0011-kO TR01 7.47E-08 7.47E-08 TR01 H040E22Hh/none-Hi-Kn010G34RD1LDO7-kO TR01 H040E22Hh/none-Hi-Kn010G34RD1LDO7-kO 6.B2E-08 6.B2E-08 TR01 Н054-Е22НЬ/попе-НьКп01 OG3/LOOOO-kO TR01 H054-E22Hb/pope-NbKp01 OG3/LOOOO-kO 7.79E-08 7.79E-08 TR01 Η021Έ22ΗΜποπβ-Ήϊ-Κπ01 OG3/LOOOO-kO TR01 Η021Έ22ΗΜποπβ-Ήϊ-Κπ01 OG3/LOOOO-kO 8.05E-08 8.05E-08 TR01H W3-E22Hh/rore-Hi-Kn010G3/L0011-kO TR01H W3-E22Hh/rore-Hi-Kn010G3/L0011-kO 7.72E-08 7.72E-08 TRG1 Н09>Е22НЬ/гопе-НьКп01 0G3/L0Q1 FkO TRG1 H09>E22Hb/Gope-HnKp01 0G3/L0Q1 FkO 7.74E-08 7.74E-08 гСЕ115Н-Е22НМпоп<^НйКп010СЗЛ_0000¥к1-к0 gSE115N-E22NMpop<^NyKp010SZL_0000¥k1-k0 8.52E-08 8.52E-08 TR01H101-E22Hh/none-Hi-Kn01OG3/L0011 -kO TR01H101-E22Hh/none-Hi-Kn01OG3/L0011-kO 7.B7E-08 7.B7E-08 TR01 Н0БЗ-Е22НЬ/гопе-НкКп01 OG3A.OOOO-kO TR01 N0BZ-E22N/gope-NkKp01 OG3A.OOOO-kO Β.23Ε-Ό8 Β.23Ε-Ό8 TR01 H03S-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3AOOOO-kO TR01 H03S-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3AOOOO-kO B.49E-Q8 B.49E-Q8 TRG1H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRQ1L015-k0 TRG1H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/TRQ1L015-k0 B.64E-08 B.64E-08 TR01 Η104-Ε22Ηή/ΓθΓθΉί-Κη01 OG3/L0011-kO TR01 Η104-Ε22Ηή/ΓθΓθΉί-Κη01 OG3/L0011-kO B.26E-08 B.26E-08 TR01 Н075-Е22НИ/попе-НйКп01 OG3/LOOOO-kO TR01 H075-E22NI/pope-NyKp01 OG3/LOOOO-kO 9.BBE-08 9.BBE-08 TR01 HD40-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/1.0227-k0 TR01 HD40-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/1.0227-k0 1.01E-07 1.01E-07 TR01H1D2-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 TR01H1D2-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 B.54E-Q8 B.54E-Q8 TR01 Η034-Ε22ΗΜ/ΓΟΓ&Ήί-Κη01 OG3/LOOOD-kO TR01 Η034-Ε22ΗΜ/ΓΟΓ&Ήί-Κη01 OG3/LOOOD-kO 9.11E-08 9.11E-08 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 1.01E-07 1.01E-07 rCE115H-E22HhirCE115L-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-£22L rCE115H-E22HhirCE115L-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-£22L 9.37E-08 9.37E-08 TRQ1 Н015-Е22НЬ/попе-Н|-Кл01063/ТК01Е006-к0 TRQ1 H015-E22Hb/pope-N|-Kl01063/TK01E006-k0 9.30E-0B 9.30E-0B TRG1 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3A_0246-k0 TRG1 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3A_0246-k0 9 2ВЁ-С0 9 2ВЁ-С0 TRG1 H097-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO TRG1 H097-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0011-kO B.76E-08 B.76E-08 TRG1 HOI 1-E22Hh/rore-Hi-Kn01 OGS/tOOOO-kO TRG1 HOI 1-E22Hh/rore-Hi-Kn01 OGS/tOOOO-kO 3.71E-0B 3.71E-0B TR01 H010-E22Hh/none-Hi-KnD1 OG3/L0000-RO TR01 H010-E22Hh/none-Hi-KnD1 OG3/L0000-RO 3.73E-08 3.73E-08 TRG1 H095-E22Hh/none-Hi-KnGl OG3/L0011-kG TRG1 H095-E22Hh/none-Hi-KnGl OG3/L0011-kG 9.09Ё-08 9.09ё-08 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-KnD1 OG37TROt LO2O-kO TR01 H082-E22Hh/none-Hi-KnD1 OG37TROt LO2O-kO 1.08E-07 1.08E-07 TR01 H098-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO11-ktJ TR01 H098-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LOO11-ktJ 9.14E-08 9.14E-08 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01QG3/TR01L017-k0 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01QG3/TR01L017-k0 1.09E-07 1.09E-07 TR01 H04CbE22Hh/mna-Hi-Kn010G3/L0247-kD TR01 H04CbE22Hh/mna-Hi-Kn010G3/L0247-kD 1.00E-07 1.00E-07 ГСЕ115H-E22Hh/ncne-Hi-KnO1OG3/fCE115L-k0 GSE115H-E22Hh/ncne-Hi-KnO1OG3/fCE115L-k0 1.24E-07 1.24E-07 TRQ1 H004-E22Hh//-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TRQ1 H004-E22Hh//-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 1.35E-07 1.35E-07 TR01 Н067-Е22НЬ/попе-Н|-Кл01 OG3fl_0222-kO TR01 H067-E22Hb/pope-N|-Kl01 OG3fl_0222-kO 7.63E-08 7.63E-08 rCE115H-E22HM-HE-KriO1OG3/rCE115L-kO rCE115H-E22HM-HE-KriO1OG3/rCE115L-kO 1.38E-07 1.38E-07 TRD1 H008-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3A_OQOO-kO TRD1 H008-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3A_OQOO-kO 4.22E-08 4.22E-08 TR01 HO70-E22HMnora-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 HO70-E22HMnora-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 1.20E-07 1.20E-07 TR01 H106-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3A0011-kO TR01 H106-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3A0011-kO 1.00E-07 1.00E-07 TR01 H024-E22Hh/mns-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H024-E22Hh/mns-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 1.OSE-07 1.OSE-07 CE115HA124-E22HW/-Hi-Kn010G3/L0000-k0 CE115HA124-E22HW/-Hi-Kn010G3/L0000-k0 1.43E-07 1.43E-07 TR01 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO249-k0 TR01 H040-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/LO249-k0 1.11E-07 1.11E-07 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-KnD10G3/LO271-k0 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-KnD10G3/LO271-k0 8.82E-08 8.82E-08 TR01 H057-E22Hh/non&-Hi-Kn01 OG37LOOOO-kO TR01 H057-E22Hh/non&-Hi-Kn01 OG37LOOOO-kO 1.12E-07 1.12E-07 TRD1 HO58-E22Hh/mne-Hi-KnO1 OG3/LOO<JO-kO TRD1 HO58-E22Hh/mne-Hi-KnO1 OG3/LOO<JO-kO 1.15E-07 1.15E-07 TR01 H068-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO TR01 H068-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/LOOOO-kO 1.01E-07 1.01E-07 TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0270-kO TR01 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0270-kO 7.42E-08 7.42E-08 TRC1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0272-kO TRC1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L0272-kO 7.44E-08 7.44E-08 hCE115HA-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 hCE115HA-E22Hh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 1.24E-07 1.24E-07 TRC1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L026&-kO TRC1 H082-E22Hh/none-Hi-Kn01 OG3/L026&-kO 1.36E-07 1.36E-07 hCE115HAa-E22Hh/none-Hi-KnC1CG3/L0000-k0 hCE115HAa-E22Hh/none-Hi-KnC1CG3/L0000-k0 1.08E-07 1.08E-07 TR01 H067-E22Hh/norre-Hi-Kn01 OG3A0226-kO TR01 H067-E22Hh/norre-Hi-Kn01 OG3A0226-kO 1.32E-07 1.32E-07 TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3A024B-k0 TR01 H067-E22Hh/none-Hi-Kn010G3A024B-k0 1.39E-07 1.39E-07

(3-2) Модификация аффинности гуманизированного антитела к GPC3 с помощью точечных мутаций.(3-2) Modification of the affinity of a humanized anti-GPC3 antibody by point mutations.

Сначала интродуцировали точечные мутации в последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 биспецифического антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 2, H0000-ERY27HK (SEQ ID NO: 54), для получения модифицированных антител. Затем определяли аффинность указанных модифицированных антител к растворимому человеческому GPC3. Объединяя сайты, которые обладают способностью повышать аффинность модифицированных антител, получали модифицированные антитела, аффинности которых представлены в табл. 9.First, point mutations were introduced into the sequence of CDR1, CDR2 and CDR3 of the bispecific antibody prepared according to the method described in Example 2, H0000-ERY27HK (SEQ ID NO: 54), to obtain modified antibodies. The affinity of these modified antibodies to soluble human GPC3 was then determined. By combining sites that have the ability to increase the affinity of the modified antibodies, modified antibodies were obtained, the affinities of which are presented in table. 9.

- 60 041830- 60 041830

Таблица 9Table 9

Название антитела Name of the antibody KD (человеческий GPC3) KD (human GPC3) H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 3.&7E-09 3&7E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222k0 1.40E-13 1.40E-13 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0 3.52E-13 3.52E-13 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 5.25E-13 5.25E-13 GCH060-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 GCH060-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 6.42E-13 6.42E-13 H06W-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0246-k0 H06W-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0246-k0 1.21E-12 1.21E-12 GCH0&7-Gldh/none-Hi^n0l0G3/L0222-k0 GCH0&7-Gldh/none-Hi^n0l0G3/L0222-k0 1.B5E-12 1.B5E-12 GCH054-G1dh/nons-Hi-Kn010G3/L0249-k0 GCH054-G1dh/nons-Hi-Kn010G3/L0249-k0 3.31 ΕΊ 2 3.31 EC 2 GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0222-k0 3.90E-12 3.90E-12 GCH094-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0248-k0 GCH094-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0248-k0 4.12E-12 4.12E-12 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0249-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0249-k0 6.86E-12 6.86E-12 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3HR01L017-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3HR01L017-k0 8.27E-12 8.27E-12 H0610-G1 dh/none-Hi-Kn010GM0265-k0 H0610-G1 dh/none-Hi-Kn010GM0265-k0 8.70E-12 8.70E-12 H06l0-G1d№one-Hi-Kn010G3A026l-k0 H06l0-G1d№one-Hi-Kn010G3A026l-k0 1.07E-11 1.07E-11 GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0262-k0 1.18E-11 1.18E-11 GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3iL0262-kD GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3iL0262-kD 1.19E-11 1.19E-11 H0610-G1dh/none-Hi-Kn0WG3/L026a-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn0WG3/L026a-k0 1.69E-11 1.69E-11 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3nR01L020-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3nR01L020-k0 2.24E-11 2.24E-11 GCH0M-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L024S-k0 GCH0M-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L024S-k0 3.15ΕΊ1 3.15ΕΊ1 ССН054-С1йЬ/попе-НкКп010йЗ/Ю222-к0 SSN054-S1yb/pope-NcKp010yZ/Yu222-k0 3.15ΕΊ1 3.15ΕΊ1 GCH073-G1dh/none-Hi-Kn0l0G3/L020l-k0 GCH073-G1dh/none-Hi-Kn0l0G3/L020l-k0 3.50E-11 3.50E-11 H0610-G1dh/none-HhKn010G3/L0248k0 H0610-G1dh/none-HhKn010G3/L0248k0 5.55E-11 5.55E-11 GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L020l-k0 GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L020l-k0 7.74E-11 7.74E-11 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L022S-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L022S-k0 9.ЗОЕ-11 9.ZOE-11 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0093-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0093-k0 1.06E-10 1.06E-10 GCH098-G1dh/none-Hi-Kn010G3)L0201-k0 GCH098-G1dh/none-Hi-Kn010G3)L0201-k0 1.11E-10 1.11E-10 H0610-G1dh/non&-Hi-Kn010G3/LC267-k0 H0610-G1dh/non&-Hi-Kn010G3/LC267-k0 179E-10 179E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0228-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0228-k0 2.O2E-10 2.O2E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LD262-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LD262-k0 2.11Е-Ю 2.11E-Yu H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0266-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0266-k0 2.13E-10 2.13E-10 H0619-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0264-k0 H0619-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0264-k0 2.19E-10 2.19E-10 HO6 W-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0224-k0 HO6 W-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0224-k0 2.43E-10 2.43E-10 H0610’Gldh/noneHi-Kn010G3/L0167-k0 H0610'Gldh/noneHi-Kn010G3/L0167-k0 2.11E-10 2.11E-10 CE115HA251-E22Hh/LOOOO-kO/GL4’E22Hk/HD6lO-E22L CE115HA251-E22Hh/LOOOO-kO/GL4’E22Hk/HD6lO-E22L 2.36ЕЛ0 2.36EL0 TROlHOl5-E22Hh/LOOOOAO/GL4-E22Hk/H06lO-E22L TROlHOl5-E22Hh/LOOOOAO/GL4-E22Hk/H06lO-E22L 2.S3E-10 2.S3E-10 CE116HA236-E22Hh/GLS3l 0&-kO/GL4-E22Hk/H0610-E22L CE116HA236-E22Hh/GLS3l 0&-kO/GL4-E22Hk/H0610-E22L 2.67E-10 2.67E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0259-k0 3.34ЕЛ0 3.34EL0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0227-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0227-k0 4.08E-1O 4.08E-1O GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0272-k0 GCH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0272-k0 3.93E-10 3.93E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0269-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0269-k0 4.59E-10 4.59E-10 HQ610-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0223-k0 HQ610-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0223-k0 4.75E-10 4.75E-10 TR01 HC02-E22Hh/GLS3108-kC/GL4-E22Hk/H0610-E22L TR01 HC02-E22Hh/GLS3108-kC/GL4-E22Hk/H0610-E22L 475Е-Ю 475E-S GCH054-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/LC212-k0 GCH054-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/LC212-k0 5.17Е-Ю 5.17E-S H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0208-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0208-k0 5.30E-10 5.30E-10 H0610-G1db/none-Hi-Kn010G3/L0263-k0 H0610-G1db/none-Hi-Kn010G3/L0263-k0 5.84E-10 5.84E-10 H0610-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0231 -k0 H0610-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0231-k0 5.89E-10 5.89E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0143-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0143-k0 5.73E-10 5.73E-10 GCH055-G1 dh/Wie-Hi-KnO1OG3iLO212-k0 GCH055-G1dh/Wie-Hi-KnO1OG3iLO212-k0 6.14E-10 6.14E-10 H0610-Gidh/none-Hi-Kn0i0G3/L0211-k0 H0610-Gidh/none-Hi-Kn0i0G3/L0211-k0 6.47E-10 6.47E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LQ238-kO H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LQ238-kO 6.37E-10 6.37E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0214-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0214-k0 6.57E-10 6.57E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0243-kD H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0243-kD 6.49E-10 6.49E-10 GCH025-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 GCH025-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 6.70E-10 6.70E-10 GCH054-G1 dh/none-Hi-Kn010G3HR01 L016-kO GCH054-G1 dh/none-Hi-Kn010G3HR01 L016-kO 7.63E-10 7.63E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L016S-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L016S-k0 6.99E-10 6.99E-10 GCH094-G1db/none-Hi-Kn0l0G3/L0271-k0 GCH094-G1db/none-Hi-Kn0l0G3/L0271-k0 6.92E-10 6.92E-10 GCH054-G1 dh/none-Hi-KnOIOGO/TROI L019-k0 GCH054-G1 dh/none-Hi-KnOIOGO/TROI L019-k0 8.71 ЕЛО 8.71 ELO H0610-G1db/nons-Hi-Kn010G3/L0234-k0 H0610-G1db/nons-Hi-Kn010G3/L0234-k0 7.78E-10 7.78E-10 GCH098-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011 -k0 GCH098-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 8.O2E-10 8.O2E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0204-k0 7.27E-10 7.27E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0240-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0240-k0 8.48E-10 8.48E-10 H3610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0239-k0 H3610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0239-k0 8.74E-10 8.74E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0212-k0 9.94E-10 9.94E-10 GCH065-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011 -kO GCH065-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kO 8.S4E-10 8.S4E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 1.O4E-O9 1.O4E-O9 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0124-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0124-k0 9.72E-10 9.72E-10 GCH073-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011 -kO GCH073-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kO 9.10E-10 9.10E-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3HR01L016-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3HR01L016-k0 1.08E-O9 1.08E-O9 GCH054-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 GCH054-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 1.08ΕΌ9 1.08ΕΌ9 H06l0-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0090-k0 H06l0-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0090-k0 1.12E-09 1.12E-09 Н9610-С^Мпопе-НьКп010СЗА0209-к0 N9610-S^Mpope-NnKp010SZA0209-c0 1.12E-09 1.12E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 1.1 ЗЕ-09 1.1 SE-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0161-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0161-k0 9.73Е-10 9.73Е-10 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0206-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0206-k0 8.65Е-10 8.65Е-10 H06l0-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0186-k0 H06l0-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0186-k0 1Ό8Ε-09 1Ό8Ε-09 H06l0-G1db/none-Hi-KnO10G3/TR01L019-kQ H06l0-G1db/none-Hi-KnO10G3/TR01L019-kQ 1.15Е-09 1.15E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0085-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0085-k0 1.17Е-09 1.17E-09 GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-kD GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-kD 1.13Е-09 1.13E-09 H0ei0-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0154-k0 H0ei0-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0154-k0 1.01Е-09 1.01Е-09 H0610-G1dh/none'Hi-Kn010G3/L0229-k0 H0610-G1dh/none'Hi-Kn010G3/L0229-k0 1.2ОЕ-09 1.2OE-09 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-k0 1.18Е-09 1.18E-09 GCH094-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 GCH094-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0201-k0 1.17Е-09 1.17E-09

- 61 041830- 61 041830

H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L000C^0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L000C^0 3.97ΕΌ9 3.97ΕΌ9 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0205-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0205-k0 1.01E-09 1.01E-09 GCHC99-G1dh/ncne-Hi-KnCHOG3/LO2O1-kQ GCHC99-G1dh/ncne-Hi-KnCHOG3/LO2O1-kQ 1.29Е-0Э 1.29E-0E H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0242-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0242-k0 1.19E-09 1.19E-09 GCH056-G1dh/none-Hi-KnGlOG3/L0201-kO GCH056-G1dh/none-Hi-KnGlOG3/L0201-kO 1 16E-09 1 16E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0213-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0213-k0 1.25E-09 1.25E-09 GCH060-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-kO GCH060-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0200-kO 1.34E-09 1.34E-09 GOH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GOH065-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 1 41E-O9 1 41E-O9 GCHWO-G1dh/ncne-Hi-KnD1OG3/LO201-kO GCHWO-G1dh/ncne-Hi-KnD1OG3/LO201-kO 1.37E-09 1.37E-09 H0310-G1dhinone-Hi‘Kn010G3/L00154<0 H0310-G1dhinone-Hi‘Kn010G3/L00154<0 1.31 E-09 1.31 E-09 HQ610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0151-k0 HQ610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0151-k0 1.25E-09 1.25E-09 H0S10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0237-k0 H0S10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0237-k0 1.31 E-09 1.31 E-09 H0Sl0-Gldhinone-Hi-Kn0lOG3/LO220-k0 H0Sl0-Gldhinone-Hi-Kn0lOG3/LO220-k0 1.36E-09 1.36E-09 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0155-k0 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0155-k0 1.28E-09 1.28E-09 GCH055-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0215-kO GCH055-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0215-kO 1.52E-09 1.52E-09 H0B10-Gldh/none-Hi-Kn01OG3/LO202-k0 H0B10-Gldh/none-Hi-Kn01OG3/LO202-k0 1.22E-09 1.22E-09 GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0215-kO GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0215-kO 1.59E-09 1.59E-09 H0510-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0012-k0 H0510-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0012-k0 1.55E-O9 1.55E-O9 GCH054-G1dhincne-HkKnD10G3/L0215-kO GCH054-G1dhincne-HkKnD10G3/L0215-kO 1.62E-09 1.62E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0215-k0 1.84E-09 1.84E-09 GCHC98-G1dhrnone-HkKnOlOG3/LOOOO-kO GCHC98-G1dhrnone-HkKnOlOG3/LOOOO-kO 1.77E-09 1.77E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0125-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0125-k0 1.71 E-09 1.71 E-09 GCH057-G1dh/non©-Hi-Kn010G3/L0215-k0 GCH057-G1dh/non©-Hi-Kn010G3/L0215-k0 1.83E-09 1.83E-09 HQ610-G1dh/none-Hi-Kii010G3/L0217-k0 HQ610-G1dh/none-Hi-Kii010G3/L0217-k0 1.79E-09 1.79E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0014-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0014-k0 1.82E-09 1.82E-09 HO610-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0216-k0 HO610-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0216-k0 1.86E-O9 1.86E-O9 TR01HQ15-E2702GsKsc/GCHO19-E2704sEpSC/LO0OQ-k0 TR01HQ15-E2702GsKsc/GCHO19-E2704sEpSC/LO0OQ-k0 1.64E-09 1.64E-09 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/TR01L015-k0 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/TR01L015-k0 2.16E-09 2.16E-09 H06l0-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/TRO1L0l8-k(> H06l0-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/TRO1L0l8-k(> 2.17E-09 2.17E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0218-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0218-k0 1.99E-09 1.99E-09 HO610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000vk1-k0 HO610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000vk1-k0 2.16E-09 2.16E-09 H0B10'G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0160'k0 H0B10'G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0160'k0 2.12E-09 2.12E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0047-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0047-k0 2.23E-09 2.23E-09 GCH073-G1dh/ncne-HkKnO1OG3/L0OD0-kO GCH073-G1dh/ncne-HkKnO1OG3/L0OD0-kO 2.00E-09 2.00E-09 GCH054-G1dh/ncne-Hi-Kn010G3/TRC1L015-kO GCH054-G1dh/ncne-Hi-Kn010G3/TRC1L015-kO 2.45E-09 2.45E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0219-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0219-k0 2.28E-09 2.28E-09 GCHQ94-G1dh/none-Hi-KnO1OG3/LO272-kO GCHQ94-G1dh/none-Hi-KnO1OG3/LO272-kO 2.ЮЕ-09 2.YUE-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0149-K0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0149-K0 2.16E-09 2.16E-09 GCHO54-Gldh/none-HkKn010G3/TR0lL018*k0 GCHO54-Gldh/none-HkKn010G3/TR0lL018*k0 2.59E-09 2.59E-09 GCHC54-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0203-kC GCHC54-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0203-kC 2.48E-09 2.48E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0122-k0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0122-k0 2.42E-09 2.42E-09 HOBlO-Gldh/none-Hi-KnOlOG3/LOl34-kO HOBlO-Gldh/none-Hi-KnOlOG3/LOl34-kO 2.53E-09 2.53E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0152-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0152-k0 2.36E-09 2.36E-09 HO610G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0203-k0 HO610G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0203-k0 2.11E-09 2.11E-09 HO610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0075-K0 HO610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0075-K0 2.85E-09 2.85E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0038-k0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0038-k0 2.75E-09 2.75E-09 H0Sl0-Gldh/none-Hi-Kn0lOG3/L0011-k0 H0Sl0-Gldh/none-Hi-Kn0lOG3/L0011-k0 2.76E-09 2.76E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0157-K0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0157-K0 2.60E-09 2.60E-09 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0145-k0 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0145-k0 2.66E-09 2.66E-09 HO610-Gldh/norie-Hi-Kr010G3/TR01LOl0-kC HO610-Gldh/norie-Hi-Kr010G3/TR01LOl0-kC 2.92E-09 2.92E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0009-k0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0009-k0 2.99E-09 2.99E-09 GCH099-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kD GCH099-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-kD 2.78E-09 2.78E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0006-K0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0006-K0 3.04E-09 3.04E-09 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0173-k0 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0173-k0 2.83E-09 2.83E-09 H0810-G1dh/none-Hi-KnQ10G3/L0127-kO H0810-G1dh/none-Hi-KnQ10G3/L0127-kO 3.12E-09 3.12E-09 HO610-G1dhinone-Hi-Kr01QG3/L0082A0 HO610-G1dhinone-Hi-Kr01QG3/L0082A0 3.43E-09 3.43E-09 H0S10-Gldhinone-Hi-Kn010G3/L0064-k0 H0S10-Gldhinone-Hi-Kn010G3/L0064-k0 Э.37Е-09 E.37E-09 H0B10-G1dhinone-Hi4<n010G3/L0008-k0 H0B10-G1dhinone-Hi4<n010G3/L0008-k0 3.30E-09 3.30E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0013-kD H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0013-kD 3.35E-09 3.35E-09 H0610-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0140-kO H0610-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0140-kO 3.38E-09 3.38E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0039-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0039-k0 3.41 E-09 3.41 E-09 GCHO43-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0O00-kO GCHO43-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0O00-kO 3.74E-09 3.74E-09 H0610'G1dh/none’Hi'Kr010G3/TR01LOQ8'k(} H0610'G1dh/none'Hi'Kr010G3/TR01LOQ8'k(} 3.48ΕΌ9 3.48ΕΌ9 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L01484;0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L01484;0 3.28E-09 3.28E-09 GOH062-G1dh/none-HkKn010G3/L0000-k0 GOH062-G1dh/none-HkKn010G3/L0000-k0 3.73E-09 3.73E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0163-kD H0610-G1dh/none-Hi-Kr010G3/L0163-kD 3.38ΕΌ9 3.38ΕΌ9 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0233-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0233-k0 3.55E-09 3.55E-09 HQ610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L.O230-k0 HQ610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L.O230-k0 4 00E-09 400E-09 GCH006-G1dh/ncne-Hf-KnD10G3/L0030-kQ GCH006-G1dh/ncne-Hf-KnD10G3/L0030-kQ 4.06ΕΌ9 4.06ΕΌ9 H0610-G1dh/none-Hi*Kn010G3/L0032-k0 H0610-G1dh/none-Hi*Kn010G3/L0032-k0 3.72E-09 3.72E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0181-k0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0181-k0 3.51 E-09 3.51 E-09 HO610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/TR01L009-k0 HO610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/TR01L009-k0 3.81 E-09 3.81 E-09 H06l0-Gldhinone-Hi*Kn010G3/L0l4l-k0 H06l0-Gldhinone-Hi*Kn010G3/L0l4l-k0 3.86E-09 3.86E-09 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0079-k0 H0610-G1dhinone-Hi-Kn010G3/L0079-k0 4.23E-09 4.23E-09 GCH094-G1dh/nono-Hi-Kn010G3/L0270-k0 GCH094-G1dh/nono-Hi-Kn010G3/L0270-k0 3.60E-09 3.60E-09 GCH066-Gldh/ncne-Hi-KnO1OG3/L0O00-kC GCH066-Gldh/ncne-Hi-KnO1OG3/L0O00-kC 4.2SE-09 4.2SE-09 GCHO64-G1dh/ncne-Hi-KnO1OG3/LOO00-kO GCHO64-G1dh/ncne-Hi-KnO1OG3/LOO00-kO 4.14E-09 4.14E-09 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L00S6-k0 H0B10-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L00S6-k0 4.20E-09 4.20E-09 GCH027’G1dh/noneHkKnD10G3/LOOQO'kO GCH027'G1dh/noneHkKnD10G3/LOOQO'kO 3.83E-09 3.83E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0003-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0003-k0 4.01 E-09 4.01 E-09 H05l0-G1dMnone-Hi-Kfi010G3/LQ042-k0 H05l0-G1dMnone-Hi-Kfi010G3/LQ042-k0 427E-09 427E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/TRD1L011-kO H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/TRD1L011-kO 4.02E-09 4.02E-09

- 62 041830- 62 041830

H0610-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0000-k0 H0610-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0000-k0 3.97Е-09 3.97E-09 GCH015-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH015-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 4 14Е-09 4 14E-09 H0610-G1dh/none-H(-KnC10G3/L0175-kC H0610-G1dh/none-H(-KnC10G3/L0175-kC 3.84Е-09 3.84Е-09 GCH100-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/LO011 -kC GCH100-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/LO011-kC 3.81 Е-09 3.81 E-09 GCH014-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L00D0-k0 GCH014-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L00D0-k0 4.20Е-09 4.20E-09 GCH053-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH053-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 4.05Е-09 4.05Е-09 hCE115HA-E22Hh/LOOQO-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L hCE115HA-E22Hh/LOOQO-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L 428Е-09 428E-09 GCH094-G1dh/none-H-Kn010G3/L0G11-kC GCH094-G1dh/none-H-Kn010G3/L0G11-kC 3.8ΘΕ-09 3.8ΘΕ-09 GCH045-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 GCH045-Gldh/none-Hi-Kn0l0G3/L0000-k0 4.63Е-09 4.63E-09 H0Sl0-GldWnone4TKnCl0G3^R01L012di0 H0Sl0-GldWnone4TKnCl0G3^R01L012di0 4.25ЕД9 4.25ED9 H0610-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0115-k0 H0610-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0115-k0 4.34Е-09 4.34Е-09 H0610-G1dh/none-H>Kn010G3/L0044-k0 H0610-G1dh/none-H>Kn010G3/L0044-k0 4.57Е-09 4.57E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0107-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0107-k0 438Е-09 438E-09 H0510-G1dh/none-Hf-KnC10G3/LC007-k0 H0510-G1dh/none-Hf-KnC10G3/LC007-k0 4.39Е-09 4.39E-09 GCH0l3-Gldh/none-HkKn0l0G3/L0000-kC GCH0l3-Gldh/none-HkKn0l0G3/L0000-kC 4 44Е-09 4 44E-09 H0610-G1dh/none4d^Kn010G3/L0045-k0 H0610-G1dh/none4d^Kn010G3/L0045-k0 4 66Е-09 4 66E-09 GCH010-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH010-G1 dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 4.12Е-09 4.12E-09 GCH04O-G1 dh/none-Hi-KnOI 0G3/L0G00-kG GCH04O-G1 dh/none-Hi-KnOI 0G3/L0G00-kG 4Θ0Ε-09 4Θ0Ε-09 H0S10-G1dh/none-HFKn010G3/L0G02-k0 H0S10-G1dh/none-HFKn010G3/L0G02-k0 443ΕΌ9 443ΕΌ9 H06W-Gldh/none^H^KnG10G3/LGG16-kO H06W-Gldh/none^H^KnG10G3/LGG16-kO 4.44Е-09 4.44Е-09 GCH3O7Gldh/noneHKnClOG3/LOCOO0O GCH3O7Gldh/noneHKnClOG3/LOCOO0O 4.93Е-09 4.93E-09 GCH042-G1dh/none4d^n010G3/L0000-k0 GCH042-G1dh/none4d^n010G3/L0000-k0 4 89Е-09 4 89E-09 rCE115H-E22Hh/rCE115L-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L rCE115H-E22Hh/rCE115L-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L 4.57Е-09 4.57E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0120-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0120-k0 4.54Е-09 4.54Е-09 H0610-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0065-k0 H0610-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0065-k0 4.79Е-09 4.79E-09 GCH016-G1 dh/none-Hi-KnO 10G3/L0CQ0-kC GCH016-G1 dh/none-Hi-KnO 10G3/L0CQ0-kC 4.59Е-09 4.59Е-09 GCH035 G1dh/noneHKn0l0G3/L0G00kC GCH035 G1dh/noneHKn0l0G3/L0G00kC 4.94Е-09 4.94Е-09 GCH039-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH039-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 4.95Е-09 4.95E-09 GCH099-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH099-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 424Е-09 424E-09 H0610-G1dh/non^H^Kn010G3/L0041-k0 H0610-G1dh/non^H^Kn010G3/L0041-k0 4.85Е-09 4.85E-09 GCH019-G1dh/none-HI-Kn010G3/L0000-k0 GCH019-G1dh/none-HI-Kn010G3/L0000-k0 4.36Е-09 4.36Е-09 GCH029-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0O00-k0 GCH029-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0O00-k0 501Е-09 501E-09 GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 GCH056-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 4.31 Е-09 4.31 E-09 H061D-G1 dh/nona-Ht-Kn010G3/L0147-k0 H061D-G1 dh/nona-Ht-Kn010G3/L0147-k0 4.38Е-09 4.38E-09 GCH034-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH034-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.О9Е-09 5.O9E-09 GCH0O3-G1 dh/none-H-KnC 10G3/L0G00-kG GCH0O3-G1 dh/none-H-KnC 10G3/L0G00-kG 520Е-09 520E-09 HOSlO-Gldh/none-Hs-KnOlOGa/LOiag-kC HOSLO-Gldh/none-Hs-KnOlOGa/LOiag-kC 4 78Е-09 4 78E-09 H0610-Gldh/none-HF-Kn010G3/L0C89-kC H0610-Gldh/none-HF-Kn010G3/L0C89-kC 524Е‘О9 524E'O9 H0610-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0113-kO H0610-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0113-kO 4.82Е-09 4.82E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0180-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0180-k0 44ΘΕ-09 44ΘΕ-09 GCH005-G1dh/none^HKn010G3/L0000-k0 GCH005-G1dh/none^HKn010G3/L0000-k0 532Е-09 532E-09 GCH067-G1dh/none-HI-KnC10G3/L0000-K0 GCH067-G1dh/none-HI-KnC10G3/L0000-K0 524ΕΌ9 524ΕΌ9 H06i0-G1dh/none-Hr-Kn0l0G3/LCl87-k0 H06i0-G1dh/none-Hr-Kn0l0G3/LCl87-k0 4 92Е-09 4 92E-09 H0610-G1dh/none-H^Kn010G3/L0043-k0 H0610-G1dh/none-H^Kn010G3/L0043-k0 5.14Е-09 5.14Е-09 H0610-G1dh/nona-Ht-Kn010G3/L0117-kG H0610-G1dh/nona-Ht-Kn010G3/L0117-kG 4.92Е-09 4.92E-09 GCH061-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0000-k0 GCH061-G1dh/none-Hf-Kn010G3/L0000-k0 5.1 ЗЕ-09 5.1 SE-09 GCH022-G1 d h/none-H-KnC 1OG3/LOGOO0O GCH022-G1d h/none-H-KnC 1OG3/LOGOO0O 4.92ΕΌ9 4.92ΕΌ9 Н06Ю-б1йГ/попе-НьКп010йЗ/1.С091-к0 N06Yu-b1yG/pope-NnKp010yZ/1.S091-k0 5.43Е-09 5.43E-09 GCH023-G1dh/none-Ht-Kn0l0G3/L0000-k0 GCH023-G1dh/none-Ht-Kn0l0G3/L0000-k0 4.94Е-09 4.94Е-09 H0610-G1dh/none-HFKn010G3/L0G62~k0 H0610-G1dh/none-HFKn010G3/L0G62~k0 5.28Е-09 5.28E-09 H0810-G1dh/nona-Hf-Kn010G3/L0136-k0 H0810-G1dh/nona-Hf-Kn010G3/L0136-k0 5.04Е-09 5.04Е-09 H0610-G1 dh/none-Ηί-ΚηΟ 10G3/TR01 L003-k0 H0610-G1 dh/none-Ηί-ΚηΟ 10G3/TR01 L003-k0 5О8Е-09 5O8E-09 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0069-k0 H0610-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0069-k0 532Е-09 532E-09 Н0610-СШ/ПОПе-НьКп010СЗ/10123-к0 N0610-SSH/POPE-NnKp010SZ/10123-k0 5 08Е-09 5 08E-09 GCH025-G1 dh/none-HrKnO 10G3/L0000‘k0 GCH025-G1 dh/none-HrKnO 10G3/L0000‘k0 5.О5Е-09 5.O5E-09 GCH100-G1dh/nona-Hj-Kn010G3/L0000*k0 GCH100-G1dh/nona-Hj-Kn010G3/L0000*k0 539Е-09 539E-09 H0810-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LG046-k0 H0810-G1dh/none-Hi-Kn010G3/LG046-k0 545Е-09 545E-09 H0610-G1dh/none-HF-KnC10G3/L0144-k0 H0610-G1dh/none-HF-KnC10G3/L0144-k0 4.84Е-09 4.84Е-09 GCH026-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH026-Gldh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.17Е-09 5.17E-09 HO6W-Gidh/none-Ht-KnCiOG3/LOi30-kO HO6W-Gidh/none-Ht-KnCiOG3/LOi30-kO 5 24Е-09 5 24E-09 GCHO56-G1dh/npne-Hi-KnC1OG3/L0GO0-kO GCHO56-G1dh/npne-Hi-KnC1OG3/L0GO0-kO 5Q3E-09 5Q3E-09 H061D-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0129-k0 H061D-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0129-k0 5.2SE-09 5.2SE-09 GCH032-G1dh/none’Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH032-G1dh/none'Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.74Е-09 5.74Е-09 HOBTO-Gldh/none-HLKnCIOGa/TROILOOS-kG HOBTO-Gldh/none-HLKnCIOGa/TROILOOS-kG 537ΕΌ9 537ΕΌ9 GCH012-G1 dh/none-Hi-KnO l0G3/L0G00-kG GCH012-G1 dh/none-Hi-KnO l0G3/L0G00-kG &.40Е-09 &.40E-09 GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-kG GCH055-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-kG 5 63Е09 5 63E09 H06i0-G1dh/nona4-h-Kn010G3/L0104-k0 H06i0-G1dh/nona4-h-Kn010G3/L0104-k0 590Е-09 590E-09 GCH059-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH059-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.70Е-09 5.70E-09 GCH054-G1 dh/none-Hi-ΚπΟ 1CG3/LOOOO-kO GCH054-G1 dh/none-Hi-ΚπΟ 1CG3/LOOOO-kO 530Е-09 530E-09 GCH0G8-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-kC GCH0G8-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-kC 555Е-09 555E-09 H06l0-G1dh/none-Hi-KnCl0G3/LC232-k0 H06l0-G1dh/none-Hi-KnCl0G3/LC232-k0 5.33Е-09 5.33E-09 H0610-G1dh/none-Hi-KnC10G3/L0126-k0 H0610-G1dh/none-Hi-KnC10G3/L0126-k0 5.62Е-09 5.62E-09 GCH0S4-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH0S4-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.89Е-09 5.89E-09 H0610-G1dh/none-H4Kn010G3/L0132-k0 H0610-G1dh/none-H4Kn010G3/L0132-k0 5.65Е-09 5.65E-09 H0S1D-G1dWnone^Ht-KnC10G3/LC106-kG H0S1D-G1dWnone^Ht-KnC10G3/LC106-kG 56SE-09 56SE-09 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn0l0G3/L0011-k0 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn0l0G3/L0011-k0 5.25Е-09 5.25E-09 Н0610-СШ/попе-НьКп010СЗ/1С109-кС N0610-SSh/pope-NnKp010SZ/1X109-cS 5.70Е-09 5.70E-09 H0810-G1 dh/nona-Hr-Kn010G3/L0083-k0 H0810-G1 dh/nona-Hr-Kn010G3/L0083-k0 6ОЗЕ-09 6OSE-09 GCH068-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH068-G1dh/nona-Hi-Kn010G3/L0000-k0 623Е-09 623E-09 GCH057-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 GCH057-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0000-k0 5.61Е-09 5.61E-09 H0610-G1 dh/none-НнКп010G3/L0137-kO____________________________________ (3-3) Модификация pI с помощью точечных мутаций. H0610-G1 dh/none-HnKp010G3/L0137-kO____________________________________ (3-3) Modification of pI with point mutations. 587Е-09________ 587E-09_________ При коммерческом производстве биспецифических антител In the commercial production of bispecific antibodies требуется высокой уровень чистоты. a high level of purity is required. При использовании ионообменной хроматографии эффективной When using ion-exchange chromatography, the effective является модификация изоэлектриче- is a modification of the isoelectric ской точки (pI) молекул (PLoS One. 2013;8(2):e57479). По этой причине интродуцировали мутации для point (pI) of molecules (PLoS One. 2013;8(2):e57479). For this reason, mutations have been introduced for модификаций pI в последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 гуманизированного антитела к человече- pI modifications to the sequence of CDR1, CDR2 and CDR3 of a humanized anti-human antibody скому GPC3, полученного согласно методу, описанному в примере 2, H0000-ERY27_HK (SEQ ID NO: GPC3 obtained according to the method described in example 2, H0000-ERY27_HK (SEQ ID NO: 54), для получения модифицированных антител. Затем определяли аффинность указанных модифицированных антител к растворимому человеческому GPC3. 54) to obtain modified antibodies. The affinity of these modified antibodies to soluble human GPC3 was then determined. В результате установлено, что аминокислотным модификациям, которые могут приводить к сниже- As a result, it was found that amino acid modifications, which can lead to a decrease in

нию pI, сохраняя при этом аффинность к человеческому GPC3, следует подвергать аминокислоты в положениях 19, 43, 53 и 61 согласно нумерации Кэбота.pI reduction while maintaining affinity for human GPC3 should be subjected to amino acids at positions 19, 43, 53 and 61 according to Cabot numbering.

Объединяя сайты, которые обладают способностью поддерживать аффинность к человеческому GPC3 и снижать pI, получали антитела, аффинности и pI которых представлены в табл. 10.Combining sites that have the ability to maintain affinity for human GPC3 and reduce pI, antibodies were obtained, affinities and pI of which are presented in table. 10.

- 63 041830- 63 041830

Таблица 10Table 10

Название антитела Рассчит. величина PI Название антитела KD человеч. GPC3 (гомомерное антитело) (гомомерное антитело (одноцепоч. антитело) (одноцеп. антитело)Antibody name Calc. PI value Antibody name KD human. GPC3 (homomeric antibody) (homomeric antibody (single chain antibody) (single chain antibody)

Сайты мутации на основе H0610-E2704sEpscMutation sites based on H0610-E2704sEpsc

H0610-E27D4sEp5C/L00OD-k0 7.8 HO61(Wdh/non^Hi4<naiOG3/LO№ 4.16Е-09H0610-E27D4sEp5C/L00OD-k0 7.8 HO61(Wdh/non^Hi4<naiOG3/LO# 4.16E-09

GCH054-E2704sEpsc/LCD11-k0 6.2 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 5.25E-09 K19T/O43E/P52aG/K53E/G55P/Q61EGCH054-E2704sEpsc/LCD11-k0 6.2 GCH054-G1dh/none-Hi-Kn010G3/L0011-k0 5.25E-09 K19T/O43E/P52aG/K53E/G55P/Q61E

GCH065-E2704sEpsc/LOQ11 -kO 6.4 GCH06&G1dh/n_Qne-Hi-KnO1 QG3/L0011-kO 8.84E-10 K19T/Q43E/P52aG/K53P/G55P/Q61 EGCH065-E2704sEpsc/LOQ11 -kO 6.4 GCH06&G1dh/n _Q ne-Hi-KnO1 QG3/L0011-kO 8.84E-10 K19T/Q43E/P52aG/K53P/G55P/Q61 E

GCH094432704sEpsc^0114cO 6_;2 GCH094_;G1d!Vn^^ (3-4) Модификация способности связывать внеклеточный матрикс с помощью точечной мутации.GCH094432704sEpsc^0114cO 6 _; 2 GCH094 _; G1d!Vn^^ (3-4) Modification of the ability to bind the extracellular matrix using a point mutation.

Известно, что неспецифическое связывание с внеклеточным матриксом (ЕСМ) и т.п. может оказывать влияние на фармакокинетику (MAbs. 4(6), ноябрь-декабрь 2012 г., с. 753-760). Таким образом, ЕСМсвязывающую способность модифицированных антител, полученных согласно описанным в примерах методам, определяли с помощью метода, представленного в приведенном для справки примере 4. В результате было подтверждено, что гуманизированное биспецифическое антитело к человеческой CD3εцепи и к человеческому GPC3, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NO: 54, 55 и 56), обладало высокой ЕСМсвязывающей способностью. Таким путем изучали любую из оцененных в примерах 3-1, 3-2 и 3-3 точечных мутаций в последовательности гуманизированного антитела к человеческой CD3ε-цепи hCE115HAERY27HE (SEQ ID NO: 55) в качестве комбинации для снижения ЕСМ-связывающей способности. В результате было установлено, что аминокислоты в положениях 11, 16, 52а, 53, 98 и 100 согласно нумерации Кэбота участвуют в поддержании аффинности к CD3ε и могут влиять на снижение ЕСМсвязывающей способности, и получали антитела с пониженной ЕСМ-связывающей способностью по сравнению со способностью варианта гуманизированного биспецифического антитела к человеческой CD3ε-цепи и к человеческому GPC3, GPC3_ERY27_hCE115 (табл. 11).It is known that non-specific binding to the extracellular matrix (ECM) and the like. may influence pharmacokinetics (MAbs. 4(6), Nov-Dec 2012, pp. 753-760). Thus, the ECM-binding capacity of the modified antibodies obtained according to the methods described in the Examples was determined using the method shown in Reference Example 4. As a result, it was confirmed that the humanized anti-human CD3ε chain and anti-human GPC3 bispecific antibody, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NO : 54, 55 and 56) had a high ECM binding capacity. In this way, any of the point mutations assessed in Examples 3-1, 3-2 and 3-3 in the sequence of the humanized anti-human CD3ε chain antibody hCE115HAERY27HE (SEQ ID NO: 55) were studied as a combination to reduce ECM binding capacity. As a result, it was found that the amino acids at positions 11, 16, 52a, 53, 98 and 100 according to Cabot numbering are involved in maintaining affinity for CD3ε and can affect the decrease in ECM-binding ability, and antibodies with reduced ECM-binding ability compared to the ability to humanized bispecific antibody variant to human CD3ε chain and to human GPC3, GPC3_ERY27_hCE115 (Table 11).

Таблица 11Table 11

Название антитела Name of the antibody Соотношение связывания ЕСМ (стандарт = 1) ECM binding ratio (standard = 1) GPC3 ERY22 СЕ115 (rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L) GPC3 ERY22 CE115 (rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L) 4.0 4.0 GPC3 ERY27 (hCE115HA-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L) GPC3 ERY27 (hCE115HA-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L) 50.9 50.9 СЕ 115НА236-Е22 Hh/G LS3108-k0/G L4-E22Hk/H0610-E 22L CE 115HA236-E22 Hh/G LS3108-k0/G L4-E22Hk/H0610-E 22L 429.9 429.9 CE 115HA236-E22 Hh/G LS3108-k0/G L4-E22Hk/H0000-E 22L CE 115HA236-E22 Hh/G LS3108-k0/G L4-E22Hk/H0000-E 22L 414.8 414.8 CE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L CE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L 346.9 346.9 CE 115HA251 -E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L CE 115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L 334.4 334.4 TR01 H002-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L TR01 H002-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L 301.1 301.1 TR01H002-E22H h/GLS 3108-k0/GL4-E22 Hk/H0000-E22 L TR01H002-E22H h/GLS 3108-k0/GL4-E22 Hk/H0000-E22 L 216.9 216.9 TR01H015-E22H h/L0000-k0/GL4-E22Hk/ H0610-E22L TR01H015-E22H h/L0000-k0/GL4-E22Hk/ H0610-E22L 185.7 185.7 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0208-k0 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0208-k0 50.4 50.4 CE115HA122-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L CE115HA122-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L 47.0 47.0 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps C/L0211 -kO TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps C/L0211-kO 15.5 15.5 TR01H040-E2702Gs Ksc/H0610-E2704s E ps c/L0206-k0 TR01H040-E2702Gs Ksc/H0610-E2704s E ps c/L0206-k0 15.4 15.4 TR01H040-E2702Gs Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0209-k0 TR01H040-E2702Gs Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0209-k0 7.4 7.4 rCE 115H-E22H h/rCE 115L-k0/GL4-E22Hk/ H0610-E 22L rCE 115H-E22H h/rCE 115L-k0/GL4-E22Hk/ H0610-E 22L 4.6 4.6 TR01H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0204-k0 TR01H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0204-k0 4.4 4.4 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0212-k0 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0212-k0 3.3 3.3 TR01H113-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 TR01H113-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 2.5 2.5 TR01 H082-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kO TR01 H082-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kO 1.7 1.7 TR01H113-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kO TR01H113-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kO 1.6 1.6 rCE 115H-E22Hh/rCE 115L-k0/L0000-E22Hk/H0610-E22L rCE 115H-E22Hh/rCE 115L-k0/L0000-E22Hk/H0610-E22L 1.4 1.4 TR01 H084-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kO TR01 H084-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kO 1.3 1.3 TR01 H084-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0 TR01 H084-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0 1.2 1.2 TR01H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0201-k0 TR01H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0201-k0 1.1 1.1 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/LOOOO-kO TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/LOOOO-kO 0.8 0.8 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps C/L0201 -kO TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps C/L0201-kO 0.8 0.8 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0203-k0 TR01H040-E2702GS Ksc/H0610-E2704S E ps c/L0203-k0 0.8 0.8 TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kO TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kO 0.7 0.7 TR01H109-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 TR01H109-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 0.7 0.7 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0222-k0 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0222-k0 0.6 0.6 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0201-k0 TR01H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0201-k0 0.5 0.5 TR01 H109-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0 TR01 H109-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0 0.4 0.4 TR01H113-E2702S Ksc/GCH065-E2704s E psc/L0011 -kO TR01H113-E2702S Ksc/GCH065-E2704s E psc/L0011-kO 0.3 0.3 МРАН-С1с1/МРАЕ-к01(стандарт) MRAN-S1s1/MRAE-k01(standard) 1 1

(3-5) Модификации способности связываться с лигандом SuRe с помощью точечных мутаций.(3-5) Modifications in the ability to bind to the SuRe ligand by point mutations.

Известен пример того, что связывание антитела с белком А зависит от последовательности вариабельной области (VH3) (J Biomol Tech. 22(2), июль 2011 г., с. 50-52). При очистке на белке А гуманизированного биспецифического антитела к человеческой CD3ε-цепи и к человеческому GPC3, удаление гомомерного антитела к CD3 являлось важным для подавления неспецифических реакцией посредством CD3. Таким образом, представляется желательным подавлять связывание гомомерного антитела к CD3 с белком А.An example is known that the binding of an antibody to protein A depends on the sequence of the variable region (VH3) (J Biomol Tech. 22(2), July 2011, pp. 50-52). When purified on protein A humanized bispecific antibodies to human CD3ε chain and to human GPC3, the removal of homomeric anti-CD3 antibody was important to suppress non-specific reactions by CD3. Thus, it seems desirable to suppress the binding of a homomeric anti-CD3 antibody to protein A.

Вероятно, лиганд SuRe™ можно применять при коммерческом производстве и поэтому точечные мутации, влияющие на связывание с лигандом SuRe™, интродуцировали в CDR2 H-цепи вариантов гуманизированного антитела к CD3, TR01H082-E2702GsKsc и TR01H084-E2702GsKsc (SEQ ID NO: 398 и399), для получения модифицированных антител. Связывающую способность этих модифицированных антител с лигандом SuRe™ определяли с помощью метода, представленного в приведенном для справки примере 5. В результате было установлено, что аминокислоты в положениях 19, 57 и 59 согласно нумерации Кэбота участвуют в поддержании аффинности к CD3ε и могут влиять на способность связываться с лигандом Sure™, и получали антитела с пониженной способностью связываться с лигандом Sure поIt is likely that the SuRe™ ligand can be used commercially and therefore point mutations affecting binding to the SuRe™ ligand have been introduced into the CDR2 H chain of the humanized anti-CD3 antibody variants, TR01H082-E2702GsKsc and TR01H084-E2702GsKsc (SEQ ID NOS: 398 and 399) , to obtain modified antibodies. The binding capacity of these modified antibodies to the SuRe™ ligand was determined using the method presented in reference Example 5. As a result, it was found that the amino acids at positions 19, 57 and 59 according to Cabot numbering are involved in maintaining affinity for CD3ε and may affect the ability bind to the Sure™ ligand, and received antibodies with a reduced ability to bind to the Sure ligand by

- 64 041830 сравнению со способностью антител TR01H082-E2702GsKsc/L0011-k0 (SEQ ID NO: 398 и 410) или- 64 041830 compared with the ability of antibodies TR01H082-E2702GsKsc/L0011-k0 (SEQ ID NOS: 398 and 410) or

TR01H084-E2702GsKsc/L0011-k0 (SEQ ID NO: 399 и 410) (табл. 12).TR01H084-E2702GsKsc/L0011-k0 (SEQ ID NOS: 399 and 410) (Table 12).

Таблица 12Table 12

Название антитела Name of the antibody Связывание SuRe™ (RU) Bonding SuRe™ (RU) Сайты связывания на основе СЕ115НА000 Binding sites based on CE115HA000 TR01H084-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H084-E2702GsKsc/L0011-k0 5065.8 5065.8 R16G/A52aD/N53Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l R16G/A52aD/N53Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l TR01H082-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H082-E2702GsKsc/L0011-k0 4469.2 4469.2 V11 UA52aD/N53Q/G98A/Y 100G V11 UA52aD/N53Q/G98A/Y 100G TR01H090-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H090-E2702GsKsc/L0011-k0 3606.3 3606.3 V11L/ R16G/A52aD/N53Q/G98A/Y 100G V11L/ R16G/A52aD/N53Q/G98A/Y 100G TR01H093-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H093-E2702GsKsc/L0011-k0 2459.7 2459.7 V11 L/A52aD/N53Q/K64Q/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/K64Q/G98A/Y 100G TR01H094-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H094-E2702GsKsc/L0011-k0 2351.9 2351.9 V11 L/A52aD/N53Q/K64S/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/K64S/G98A/Y 100G TR01H114-E2702GS Ks C/L0011 -k0 TR01H114-E2702GS Ks C/L0011-k0 1485.5 1485.5 R16G/A52aD/N53Q/T57S/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l R16G/A52aD/N53Q/T57S/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l TR01H092-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H092-E2702GsKsc/L0011-k0 1159.5 1159.5 V11L/A52aD/N53Q/K64A/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/K64A/G98A/Y100G TR01H100-E2702Gs Ks c/L0011 -kO TR01H100-E2702Gs Ks c/L0011-kO 383.0 383.0 V11 L/A52aD/N53Q/T57S/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/T57S/G98A/Y 100G TR01H111 -E2702Gs Ks c/L0011 -kO TR01H111-E2702Gs Ks c/L0011-kO 50.7 50.7 R16G/R19K/A52aD/N53Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l R16G/R19K/A52aD/N53Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l TR01H110-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H110-E2702GS Ks C/L0011-kO 29.5 29.5 R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G TR01H091-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H091-E2702GsKsc/L0011-k0 27.5 27.5 V11L/R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G V11L/R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G TR01H091-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H091-E2702GS Ks C/L0011-kO 15.0 15.0 V11L/R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G V11L/R19K/A52aD/N53Q/G98A/Y100G TR01H112-E2702GS Ks c/LOO11 -kO TR01H112-E2702GS Ks c/LOO11 -kO 8.8 8.8 R16G/A52aD/N53Q/T57Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l R16G/A52aD/N53Q/T57Q/D72A/L78l/G98A/Y100G/A102l TR01H113-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H113-E2702GS Ks C/L0011-kO 7.0 7.0 R16G/A52a D/N53Q/Y59V/D72A/L78I/G98A/Y100G/A1021 R16G/A52a D/N53Q/Y59V/D72A/L78I/G98A/Y100G/A1021 TR01H096-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H096-E2702GsKsc/L0011-k0 2.7 2.7 V11 L/A52aD/N53Q/T57G/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/T57G/G98A/Y100G TR01H109-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H109-E2702GS Ks C/L0011-kO 2.2 2.2 V11L/A52aD/N53Q/Y59V/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/Y59V/G98A/Y100G TR01H098-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H098-E2702GsKsc/L0011-k0 1.6 1.6 V11 L/A52aD/N53Q/T57P/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/T57P/G98A/Y 100G TR01H107-E2702GSKSC/L0011-k0 TR01H107-E2702GSKSC/L0011-k0 1.4 1.4 V11 L/A52aD/N53Q/Y59Q/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/Y59Q/G98A/Y 100G TR01H103-E2702Gs Ks c/L0011 -kO TR01H103-E2702Gs Ks c/L0011-kO 1.4 1.4 V11 L/A52aD/N53Q/Y59G/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/Y59G/G98A/Y 100G TR01H104-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H104-E2702GS Ks C/L0011-kO 1.0 1.0 V11 UA52aD/N53Q/Y59l/G98A/Y100G V11 UA52aD/N53Q/Y59l/G98A/Y100G TR01H105-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H105-E2702GS Ks C/L0011-kO 0.8 0.8 V11 L/A52aD/N53Q/Y59L/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/Y59L/G98A/Y 100G TR01H099-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H099-E2702GsKsc/L0011-k0 0.6 0.6 V11 L/A52aD/N53Q/T57Q/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/T57Q/G98A/Y100G TR01H102-E2702Gs Ks c/L0011 -kO TR01H102-E2702Gs Ks c/L0011-kO 0.5 0.5 V11 L/A52aD/N53Q/Y59F/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/Y59F/G98A/Y100G TR01H101-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H101-E2702GS Ks C/L0011-kO 0.5 0.5 V11 L/A52aD/N53Q/T57 V/G98A/Y1 DOG V11 L/A52aD/N53Q/T57 V/G98A/Y1 DOG TR01H108-E2702GS Ks C/L0011 -kO TR01H108-E2702GS Ks C/L0011-kO 0.4 0.4 V11 L/A52aD/N53Q/Y59T/G98A/Y 100G V11 L/A52aD/N53Q/Y59T/G98A/Y 100G TR01H097-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H097-E2702GsKsc/L0011-k0 0.1 0.1 V11L/A52aD/N53Q/T57UG98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/T57UG98A/Y100G TR01H106-E2702Gs Ks c/L0011 -kO TR01H106-E2702Gs Ks c/L0011-kO 0.0 0.0 V11L/A52aD/N53Q/Y59P/G98A/Y100G V11L/A52aD/N53Q/Y59P/G98A/Y100G TR01H095-E2702GsKsc/L0011-k0 TR01H095-E2702GsKsc/L0011-k0 -0.2 -0.2 V11 UA52aD/N53Q/T57F/G98A/ Y100G V11 UA52aD/N53Q/T57F/G98A/ Y100G

(3-6) Получение оптимизированных биспецифических антител путем объединения точечных мутаций, приводящих к улучшению различных свойств.(3-6) Obtaining optimized bispecific antibodies by combining point mutations leading to the improvement of various properties.

Оптимизированные модифицированные антитела можно получать, объединяя точечные мутации, которые приводят к улучшению различных свойств, описанных в примерах 3-1-3-5. В качестве примеров указанных модифицированных антител получали антитела, представленные в табл. 13, и у них оценивали зависимую от Т-клеток клеточную цитотоксичность (TDCC) с помощью методов, аналогичных описанным в примере 1. Результаты представлены на фиг. 4-9. В результате получали оптимизированные гуманизированные биспецифические антитела к человеческой CD3ε-цепи и к человеческому GPC3, обладающие эквивалентной или более высокой зависимой от Т-клеток клеточной цитотоксичностью, чем GPC3_ERY22_rCE115 до его гуманизации.Optimized modified antibodies can be obtained by combining point mutations that lead to an improvement in the various properties described in examples 3-1-3-5. As examples of these modified antibodies, the antibodies shown in Table 1 were obtained. 13 and tested for T-cell dependent cellular cytotoxicity (TDCC) using methods similar to those described in Example 1. The results are shown in FIG. 4-9. This resulted in optimized humanized anti-human CD3ε chain and anti-human GPC3 bispecific antibodies having equivalent or higher T-cell dependent cellular cytotoxicity than GPC3_ERY22_rCE115 prior to its humanization.

Таблица 13Table 13

Номер образца в анализе TDCC Название антителаSample number in TDCC assay Antibody name

GPC3_ERY22_CE115 (rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L)GPC3_ERY22_CE115 (rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L)

GPC3_ERY27 (hCE115HA-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L)GPC3_ERY27 (hCE115HA-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L)

CE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22LCE115HA251-E22Hh/L0000-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L

CE115HA236-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22LCE115HA236-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L

TR01H002-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22LTR01H002-E22Hh/GLS3108-k0/GL4-E22Hk/H0000-E22L

CE115HA122-E22Hh/LOOOO-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L rCE115H-E22Hh/rCE115L-kO/LO0OO-E22Hk/HO61O-E22L rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22LCE115HA122-E22Hh/LOOOO-kO/GL4-E22Hk/HOOOO-E22L rCE115H-E22Hh/rCE115L-kO/LO0OO-E22Hk/HO61O-E22L rCE115H-E22Hh/rCE115L-k0/GL4-E22Hk/H0610-E22L

TR01 HMO-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L(X}00-k0TR01 HMO-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L(X}00-k0

TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0201-k0TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0201-k0

TR01H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0203-k0TR01H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0203-k0

TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0204-k0TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0204-k0

TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0206-k0TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0206-k0

TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0208-k0TR01 H04O-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0208-k0

TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0209-k0TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0209-k0

TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0211 -kO rCEH5H-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0000-k0TR01 H040-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0211-kO rCEH5H-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0000-k0

TR01 H061-E2702GsKso/H0610-E2704sEpsc/L0000-k0TR01 H061-E2702GsKso/H0610-E2704sEpsc/L0000-k0

TR01 H068-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0O00-k0TR01 H068-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0O00-k0

TR01 H071-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0O00-k0TR01 H071-E2702GsKsc/H0610-E2704sEpsc/L0O00-k0

TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0201-k0TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0201-k0

TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0212-k0TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0212-k0

TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0222-k0TR01 H067-E2702GsKsc/GCH054-E2704sEpsc/L0222-k0

TR01H067-E2702GsKsc/ GCH054-E2704sEpsc/L0000-k0TR01H067-E2702GsKsc/ GCH054-E2704sEpsc/L0000-k0

TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0201-k0TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0201-k0

TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H082-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01 H084-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H084-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01 H084-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H084-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01 H082-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H082-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01 H109-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H109-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01 H109-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0TR01 H109-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0

TR01H113-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kOTR01H113-E2702GsKsc/GCH094-E2704sEpsc/L0011-kO

TR01H113-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 ______________38______________TR01H113-E2702sKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kQ____________________TR01H113-E2702GsKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-k0 ______________38______________TR01H113-E2702sKsc/GCH065-E2704sEpsc/L0011-kQ____________________

В примерах 3-1-3-6 продемонстрировано, что указанные ниже аминокислотные остатки, например, являются важными для поддержания свойств оптимизированных биспецифических антител к человеческой CD3ε-цепи и к человеческому GPC3, которые обладали эквивалентной или более высокой зависимой от Т-клеток клеточной цитотоксичностью, чем GPC3_ERY22_rCE115 до его гуманизации.Examples 3-1-3-6 demonstrate that the following amino acid residues, for example, are important for maintaining the properties of optimized anti-human CD3ε chain and anti-human GPC3 bispecific antibodies that have equivalent or higher T-cell dependent cellular cytotoxicity than GPC3_ERY22_rCE115 before it was humanized.

В антителах к человеческой CD3ε-цепи присутствуют, например, Leu в положении 11, Gly в положении 16, Asp в положении 52а, Gln в положении 53, Ala в положении 72, Не в положении 78, Ala в положении 98, Gly в положении 100 и Ile в положении 102. В антителах к человеческому GPC3 присутст- 65 041830 вуют, например, Thr в положении 19, Glu в положении 43, Gly в положении 52а, Pro или Glu в положении 53, Pro в положении 55 и Glu в положении 61. Кроме того, в общих L-цепях присутствуют, например, Pro в положении 25, Pro в положении 27а, Pro в положении 27b, Не в положении 33, Gln в положении 34, Arg или Trp в положении 56 и Tyr в положении 89 (все положения обозначены согласно нумерации Кэбота).In antibodies to the human CD3ε chain, for example, Leu at position 11, Gly at position 16, Asp at position 52a, Gln at position 53, Ala at position 72, He at position 78, Ala at position 98, Gly at position 100 and Ile at position 102. Anti-human GPC3 antibodies have, for example, Thr at position 19, Glu at position 43, Gly at position 52a, Pro or Glu at position 53, Pro at position 55, and Glu at position 61 In addition, common L strands present, for example, Pro at position 25, Pro at position 27a, Pro at position 27b, Not at position 33, Gln at position 34, Arg or Trp at position 56, and Tyr at position 89 ( all positions are designated according to Cabot numbering).

Пример 4. Оценка эффективности in vivo.Example 4 Evaluation of In Vivo Efficacy.

Эффективность некоторых из описанных выше антител оценивали in vivo с использованием несущих опухоли модельных животных.The efficacy of some of the antibodies described above was evaluated in vivo using tumor-bearing model animals.

Оценку эффективности in vivo осуществляли для репрезентативных антител из представленных в табл. 13, для которых продемонстрировано наличие цитотоксической активности при оценке с использованием анализа in vitro, описанного в примерах 3-6. При оценке эффективности in vivo следует принимать во внимание любое влияние, вызываемое различиями в микроокружении из-за образования агрегатов опухолей, на результаты оценки. Для изучения использовали два типа клеточных линий человеческого рака с различной чувствительностью к действию применяемых в качестве лекарственных средств антител, т.е. линии РС-10 и NCI-H446, несмотря на то, что уровни экспрессии GPC3 в этих клетках были практически одинаковыми. Клеточные линии трансплантировали мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD scid) и мышам NOD scid, у которых было подтверждено образование опухолей, трансплантировали Т-клетки, выращенные культивированием in vitro человеческих РВМС. Мышей (которых обозначали как модель с инъецированными Т-клетками) обрабатывали путем введения оптимизированных биспецифических антител к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3.Evaluation of in vivo efficiency was carried out for representative antibodies from those presented in table. 13, which demonstrated the presence of cytotoxic activity when assessed using the in vitro assay described in examples 3-6. When evaluating in vivo efficacy, any influence caused by differences in the microenvironment due to the formation of tumor aggregates on the results of the assessment should be taken into account. For the study, two types of human cancer cell lines with different sensitivity to the action of antibodies used as drugs were used, i.e. lines PC-10 and NCI-H446, despite the fact that the levels of GPC3 expression in these cells were almost the same. The cell lines were transplanted into severely combined immunodeficient (NOD scid) mice and NOD scid mice that were confirmed to have tumors were transplanted with T cells grown by in vitro culture of human PBMCs. Mice (designated as the T cell injected model) were treated with optimized bispecific antibodies to human CD3ε chain and human GPC3.

Более конкретно, в опытах по оценке эффективности в качестве лекарственных средств оптимизированных биспецифических антител к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3, в которых применяли клетки линии РС-10 на модели с инъецированными Т-клетками, осуществляли описанные ниже опыты. Т-клетки размножали культивированием с использованием РВМС, выделенных из крови здоровых доноров, и набора для активации/экспансии человеческих Т-клеток (Т cell activation/expansion kit/human) (фирма MACS Miltenyi biotec). Смешивали клеточную линию человеческого рака РС-10 (1 х 10⁷клеток) с матриксом базальной мембраны Matrigel (фирма BD) и трансплантировали подкожно в паховую область мышей NOD scid (фирма CLEA Japan, самки возрастом 6 недель). День трансплантации обозначали как день 0. За 1 день до трансплантации мышам внутрибрюшинно вводили антитело к асиалоганглиозиду M1 (асиало-GM1) (фирма Wako Pure Chemical Industries) из расчета 0,2 мг/мышь. Через 1315 дней после трансплантации мышей разделяли на группы в зависимости от веса тела и размера опухолей и вновь внутрибрюшинно вводили антитело к асиало-GM1 из расчета 0,2 мг/мышь. На следующий день внутрибрюшинно трансплантировали Т-клетки, полученные вышеописанным методом размножения культивированием, из расчета 3х10⁷ клеток/мышь. Через 4 ч после трансплантации Т-клеток внутривенно через каудальную вену вводили оптимизированные биспецифические антитела к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3 из расчета 1 мг/кг. Оптимизированные биспецифические антитела к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3 вводили только один раз.More specifically, in experiments evaluating the efficacy as drugs of optimized bispecific antibodies to human CD3ε chain and human GPC3, in which PC-10 cells were used in a model with injected T cells, the experiments described below were carried out. T cells were expanded by culturing using PBMCs isolated from the blood of healthy donors and a T cell activation/expansion kit/human (MACS Miltenyi biotec). The PC-10 human cancer cell line (1 x 10 ⁷ cells) was mixed with basement membrane matrix Matrigel (BD) and transplanted subcutaneously into the groin of NOD scid mice (CLEA Japan, 6 weeks old females). The day of transplantation was designated as day 0. Anti-asialoganglioside M1 (asialo-GM1) antibody (Wako Pure Chemical Industries) was intraperitoneally injected 1 day before transplantation at a rate of 0.2 mg/mouse. 1315 days after transplantation, mice were divided into groups depending on body weight and tumor size, and anti-asialo-GM1 antibody was again injected intraperitoneally at a rate of 0.2 mg/mouse. The next day, T cells obtained by the above-described culture propagation method were transplanted intraperitoneally at a rate of 3×10 ⁷ cells/mouse. 4 hours after transplantation of T cells, optimized bispecific antibodies to the human CD3ε chain and human GPC3 were injected intravenously through the caudal vein at a rate of 1 mg/kg. Optimized bispecific antibodies to human CD3ε chain and human GPC3 were administered only once.

В результате установлена более выраженная противоопухолевая активность в группе, обработанной оптимизированными биспецифическими антителами к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3, по сравнению с группой, обработанной растворителем (фиг. 10а, б).As a result, a more pronounced antitumor activity was found in the group treated with optimized bispecific antibodies to the human CD3ε chain and human GPC3, compared with the solvent-treated group (Fig. 10a, b).

Аналогичными методами осуществляли опыты по оценке эффективности в качестве лекарственных средств оптимизированных биспецифических антител к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3, в которых применяли клетки линии NCI-H446, на модели с инъецированными Т-клетками. Для оценки воздействия на NCI-H446 оптимизированные биспецифические антитела к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3 вводили один раз через каудальную вену из расчета 5 мг/кг.Similar methods were used to evaluate the efficacy as drugs of optimized bispecific antibodies to human CD3ε chain and human GPC3, in which NCI-H446 cells were used, in a model with injected T cells. To assess the impact on NCI-H446, optimized bispecific antibodies to human CD3ε chain and human GPC3 were administered once via the caudal vein at a rate of 5 mg/kg.

В результате установлена более выраженная противоопухолевая активность в группе, обработанной оптимизированными биспецифическими антителами к человеческой CD3ε-цепи и человеческому GPC3, по сравнению с группой, обработанной растворителем (фиг. 11а, б).As a result, a more pronounced antitumor activity was found in the group treated with optimized bispecific antibodies to the human CD3ε chain and human GPC3, compared to the solvent treated group (Fig. 11a, b).

Приведенные для справки примеры.Examples provided for reference.

Приведенный для справки пример 1. Получение экспрессионных векторов антител и экспрессия и очистка антител.Reference Example 1 Preparation of antibody expression vectors and expression and purification of antibodies.

Аминокислотные замены интродуцировали методами, известными специалистам в данной области, например, с использованием набора для сайтнаправленного мутагенеза QuikChange (фирма Stratagene), ПЦР или набора для ПЦР-клонирования In-fusion Advantage (фирма TAKARA), для создания экспрессионных векторов. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли с помощью метода, известного специалистам в данной области. Полученные плазмиды кратковременно интродуцировали в клетки клеточной линии, полученной из почки человеческого эмбриона HEK293H (фирма Invitrogen) или FreeStyle293 (фирма Invitrogen) для экспрессии антител. Из полученных супернатантов культуры антитела очищали с использованием колонки rProtein A Sepharose Fast Flow (фирма GE Healthcare) с помощью метода, известного специалистам в данной области. Измеряли абсорбцию при 280 нм растворов очищенных антител с помощью спектрофотометра, и концентрацию антител рассчитывалиAmino acid substitutions were introduced by methods known to those skilled in the art, eg using the QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene), PCR, or the In-fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA) to generate expression vectors. The nucleotide sequences of the resulting expression vectors were determined using a method known to those skilled in the art. The resulting plasmids were briefly introduced into cells of a cell line derived from human embryonic kidney HEK293H (Invitrogen) or FreeStyle293 (Invitrogen) for antibody expression. From the resulting culture supernatants, antibodies were purified using an rProtein A Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare) using a method known to those skilled in the art. The absorbance at 280 nm of the purified antibody solutions was measured with a spectrophotometer and the antibody concentration was calculated

- 66 041830 на основе определенных величин, применяя коэффициент абсорбции, рассчитанный с помощью метода- 66 041830 on the basis of determined values, applying the absorption coefficient calculated using the method

РАСЕ (Protein Science 4, 1995, с. 2411-2423).PACE (Protein Science 4, 1995, pp. 2411-2423).

Приведенный для справки пример 2. Определение ADCC-активности каждого из тестируемых антител с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека в качестве эффекторных клеток ADCC-активность каждого из тестируемых антител определяли с помощью описанного ниже метода.Reference Example 2 Determination of the ADCC activity of each of the test antibodies using human peripheral blood mononuclear cells as effector cells The ADCC activity of each of the test antibodies was determined by the method described below.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (обозначены далее как человеческие РВМС) применяли в качестве эффекторных клеток для измерения ADCC-активности каждого из тестируемых антител согласно описанному ниже методу.Human peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as human PBMCs) were used as effector cells to measure the ADCC activity of each of the tested antibodies according to the method described below.

(1) Получение раствора человеческих РВМС.(1) Preparation of human PBMC solution.

Получали образцы по 50 мл периферической крови здоровых добровольцев (взрослые мужчины) с использованием шприцев, предварительно заполненных 200 мкл (1000 ед./мл) раствора гепарина (NovoHeparin 5000 ед. на инъекцию; фирма Novo Nordisk). Эту периферическую кровь двукратно разводили ЗФР(-), разделяли на четыре аликвоты и добавляли в пробирки для разделения лимфоцитов Leucosep (фирма Greiner bio-one), в которые предварительно вносили 15 мл фиколл-пак PLUS и центрифугировали. После центрифугирования пробирок для разделения, содержащих аликвоты периферической крови, при 2150 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре собирали фракции мононуклеарных клеток. Клетки в каждой фракции однократно промывали с использованием модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (фирма SIGMA), содержащей 10% FBS (далее в контексте настоящего описания обозначена как 10%FBS/D-MEM), а затем плотность клеток доводили до 5х10⁶ клеток/мл с помощью 10% FBS/D-MEM. Клеточную суспензию в приведенных ниже экспериментах использовали в качестве клетки-мишени.Received samples of 50 ml of peripheral blood of healthy volunteers (adult men) using syringes pre-filled with 200 μl (1000 units/ml) of heparin solution (NovoHeparin 5000 units per injection; Novo Nordisk). This peripheral blood was diluted twice with PBS(-), divided into four aliquots, and added to Leucosep lymphocyte separation tubes (Greiner bio-one), which were previously filled with 15 ml of Ficoll-Pak PLUS and centrifuged. After centrifugation of separation tubes containing peripheral blood aliquots at 2150 rpm for 10 minutes at room temperature, mononuclear cell fractions were collected. Cells in each fraction were washed once with Dulbecco's Modified Eagle's Medium (SIGMA) containing 10% FBS (hereinafter referred to as 10% FBS/D-MEM), and then the cell density was adjusted to 5x10 ⁶ cells/ ml with 10% FBS/D-MEM. The cell suspension was used as the target cell in the experiments below.

(2) Анализ высвобождения хрома (ADCC-активность).(2) Chromium release assay (ADCC activity).

ADCC-активность оценивали по удельной скорости высвобождения хрома, определенной методом определения высвобождения хрома. Сначала растворы антитела в каждой из приготовленных концентраций (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 и 40 мкг/мл) добавляли в 96-луночный планшет с U-образным дном из расчета 50 мкл на лунку. Затем высевали клетки-мишени из расчета 50 мкл на лунку (1х10⁴ клеток/лунку) и давали выстояться при комнатной температуре в течение 15 мин. Раствор человеческих РВМС, приготовленный согласно методу, описанному в подпункте (1), добавляли из расчета 100 мкл на лунку (5x105 клеток/лунку) и планшет выдерживали в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода, при 37°С в течение 4 ч, после чего центрифугировали. Радиоактивность в 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке планшета измеряли с помощью гамма-счетчика. Удельную скорость высвобождения хрома определяли по следующей формуле:ADCC activity was evaluated from the specific chromium release rate determined by the chromium release method. First, antibody solutions at each of the prepared concentrations (0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, and 40 μg/ml) were added to a 96-well U-bottomed plate at a rate of 50 μl per well. Target cells were then plated at 50 μl per well (1 x 10 ⁴ cells/well) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. A solution of human PBMC prepared according to the method described in subparagraph (1) was added at the rate of 100 μl per well (5x105 cells/well) and the plate was incubated in an atmosphere containing 5% carbon dioxide at 37°C for 4 hours and then centrifuged. The radioactivity in 100 μl of the culture supernatant in each well of the plate was measured using a gamma counter. The specific release rate of chromium was determined by the following formula:

удельная скорость высвобождения хрома (%)=(А-Б)х100/(Б-В), где А представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке; Б представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткам-мишеням добавляли 100 мкл 2%-ного водного раствора NP-40 (Nonidet Р-40, фирма Nacalai Tesque) и 50 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM; и В представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткаммишеням добавляли 150 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM. Эксперименты осуществляли в трех повторностях и по результатам вышеуказанного эксперимента вычисляли среднее значение и стандартное отклонение удельной скорости высвобождения хрома (%), отражающей ADCC-активность, для каждого из тестируемых антител.specific chromium release rate (%)=(A-B)x100/(B-C), where A is the average radioactivity (cpm) of 100 μl culture supernatant in each well; B is the mean radioactivity (cpm) of 100 µl of culture supernatant in wells in which 100 µl of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) and 50 µl of 10%- FBS/D-MEM environment; and B is the mean radioactivity (cpm) of 100 μl of culture supernatant in wells in which 150 μl of 10% FBS/D-MEM medium was added to target cells. The experiments were carried out in triplicate, and from the results of the above experiment, the mean value and standard deviation of the specific chromium release rate (%), reflecting ADCC activity, were calculated for each of the tested antibodies.

Приведенный для справки пример 3. Определение T_m модифицированных антител с помощью дифференциальной сканирующей флуорометрии.Reference Example 3 Determination of T _m of modified antibodies by differential scanning fluorometry.

При такой оценке определяли величину T_m (температура тепловой денатурации) модифицированных антител с помощью дифференциальной сканирующей флуорометрии с использованием устройства Rotor-Gene Q (фирма QIAGEN). Известно, что этот метод обеспечивает предпочтительную корреляцию с величиной T_m, установленной с использованием дифференциального сканирующего калориметра, что является широко известным методом оценки термостабильности антител (Journal of Pharmaceutical Science 4, 2010, с. 1707-1720).In this assessment, the T _m (heat denaturation temperature) of the modified antibodies was determined by differential scanning fluorometry using a Rotor-Gene Q device (QIAGEN). This method is known to provide a favorable correlation with the T _m value determined using a differential scanning calorimeter, which is a well-known method for assessing the thermal stability of antibodies (Journal of Pharmaceutical Science 4, 2010, pp. 1707-1720).

5000-кратный концентрат SYPRO оранжевого (фирма Molecular Probes) разводили ЗФР (фирма Sigma) и затем смешивали с растворами антител с получением образцов для измерения. Аликвоты по 20 мкл каждого образца вносили в измерительные пробирки и температуру повышали с 30 до 99°С со скоростью повышения температуру 240°С/ч. Изменения флуоресценции, сопровождающие повышение температуры, определяли при 470 нм (длина волны возбуждения)/555 нм (длина волны флуоресцентного испускания).SYPRO orange 5000x concentrate (Molecular Probes) was diluted with PBS (Sigma) and then mixed with antibody solutions to obtain measurement samples. Aliquots of 20 μl of each sample were added to measuring tubes and the temperature was raised from 30 to 99°C at a temperature increase rate of 240°C/h. Changes in fluorescence accompanying a rise in temperature were determined at 470 nm (excitation wavelength)/555 nm (fluorescent emission wavelength).

Данные анализировали с использованием программы Rotor-Gene Q Series (фирма QIAGEN) для расчета температуры, при которой наблюдается переход флуоресценции, и эту температуру принимали за Tm.The data were analyzed using Rotor-Gene Q Series software (QIAGEN) to calculate the temperature at which the fluorescence transition occurs, and this temperature was taken as Tm.

- 67 041830- 67 041830

Приведенный для справки пример 4. Определение ЕСМ-связывающей способности.Reference Example 4. Determination of ECM binding capacity.

Определение осуществляли согласно методу, описанному в WO 2012/093704. В целом, метод состоял в следующем: BD-Matrigel (фирма BD Biosciences, № 356237) получали в концентрации 2 мг/мл с использованием TBS (фирма Takara, № Т903) и переносили в 96-луночный планшет для измерения (фирма Meso Scale Discovery, № L15XB-3(High Bind, высокая способность связываться)) из расчета 5 мкл на лунку и затем давали выстояться в течение ночи в холодном месте. Затем в каждую лунку планшета вносили по 150 мкл блокирующего ECL-буфера (ЗФР, содержащий 0,05% Твин20, 0,5% БСА и 0,01% азида натрия) и давали выстояться при комнатной температуре в течение 2 ч или более.The determination was carried out according to the method described in WO 2012/093704. In general, the method was as follows: BD-Matrigel (BD Biosciences, no. 356237) was prepared at a concentration of 2 mg/ml using TBS (Takara, no. T903) and transferred to a 96-well measurement plate (Meso Scale Discovery , No. L15XB-3 (High Bind, high binding capacity)) at a rate of 5 μl per well and then allowed to stand overnight in a cold place. Then, 150 µl of ECL blocking buffer (PBS containing 0.05% Tween20, 0.5% BSA and 0.01% sodium azide) was added to each well of the plate and allowed to stand at room temperature for 2 hours or more.

Козий античеловеческий IgG(y) (фирма Invitrogen, № 628400) метили рутением с использованием сложного эфира NHS, меченного MSD-SULFO (фирма Meso Scale Discovery, №R91AN-2) согласно прилагаемым инструкциям. Его разводили ECL-буфером для разведения (ЗФР, содержащий 0,01% Твин20, 0,1% БСА и 0,01% азида натрия) до конечной концентрации 2 мкг/мл. Кроме того, стандартное антитело и тестируемые антитела разводили ЗФР-Т (ЗФР, содержащий 0,05% Твин20 и 0,01% азида натрия) до получения конечной концентрации 3 мкг/мл.Goat anti-human IgG(y) (Invitrogen, No. 628400) was labeled with ruthenium using an NHS ester labeled with MSD-SULFO (Meso Scale Discovery, No. R91AN-2) according to the instructions provided. It was diluted with ECL dilution buffer (PBS containing 0.01% Tween20, 0.1% BSA and 0.01% sodium azide) to a final concentration of 2 μg/ml. In addition, the standard antibody and test antibodies were diluted with PBS-T (PBS containing 0.05% Tween20 and 0.01% sodium azide) to a final concentration of 3 μg/ml.

В 96-луночный планшет для проведения реакции (фирма Thermo scientific, Nunc № 145399), последовательно добавляли 10 мкл ECL-буфера для разведения, 20 мкл стандартного антитела и тестируемого антитела (3 мкг/мл) и 30 мкл меченного рутением антитела (2 мкг/мл), и давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании в темноте.To a 96-well reaction plate (Thermo scientific, Nunc No. 145399), 10 µl of ECL dilution buffer, 20 µl of standard antibody and test antibody (3 µg/ml), and 30 µl of ruthenium-labeled antibody (2 µg /ml), and allowed to react for 1 h at room temperature with stirring in the dark.

Блокирующий ECL-буфер удаляли из 96-луночного планшета для измерения путем опрокидывания, добавляли 50 мкл раствора образца из 96-луночного реакционного планшета и давали выстояться в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого удаляли раствор образца из 96-луночного планшета для измерения (измерительный планшет) путем опрокидывания и немедленно добавляли 150 мкл 2хТ-буфера (4х MSD Т-буфер для считывания (фирма Meso Scale Discovery), двукратно разведенный с помощью ECL-буфера для разведения), осуществляли измерения ECL. Для измерений использовали устройство SECTOR Imager 2400 (фирма Meso Scale Discovery).The blocking ECL buffer was removed from the 96-well measurement plate by tipping, 50 μl of the sample solution from the 96-well reaction plate was added and allowed to stand in the dark at room temperature for 1 hour. measurement (measuring plate) by inversion and immediately add 150 μl of 2xT buffer (4xMSD T-reading buffer (Meso Scale Discovery) 2-fold diluted with ECL dilution buffer), ECL measurements were performed. For measurements, a SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery) was used.

Анализы осуществляли путем деления интенсивности флуоресценции тестируемого антитела на интенсивность флуоресценции стандартного антитела, для расчета и сравнения интенсивностей, принимая величину для стандартного антитела за 1.The analyzes were performed by dividing the fluorescence intensity of the test antibody by the fluorescence intensity of the standard antibody, to calculate and compare the intensities, taking the value for the standard antibody as 1.

Приведенный для справки пример 5. Определение способности связывать лиганд SuRe™.Reference Example 5 Determination of SuRe™ Ligand Binding Ability.

Способность связываться с лигандом SuRe оценивали, используя Biacore™-Т200 (GE Healthcare Japan). В качестве подвижного буфера применяли HBS-EP+ (фирма GE Healthcare Japan) и набор для аминного сочетания (фирма GE Healthcare Japan) применяли для ковалентного связывания лиганда Mab Select SuRe™ (фирма GE Healthcare Japan) с СМ5-чипом (чип, покрытый карбоксиметилдекстраном). Антитело, применяемое в качестве аналита, приготавливали в концентрации 5 мкг/мл с использованием HBS-EP+. Для осуществления измерений сначала инъецировали раствор с концентрацией антитела 5 мкг/мл со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 3 мин, затем аналит заменяли на HBS-EP+ и оценивали ответ (RU) после пропускания потока в течение 0,5 мин. После завершения измерений сенсорный чип регенерировали, промывая 10 мМ Gly-HCl при pH 1,5. В контрольной проточной ячейке осуществляли такой же эксперимент без ковалентного связывания лиганда с чипом, и аффинность к лиганду SuRe™ анализировали на основе различия между ответами (RU).The ability to bind to the SuRe ligand was evaluated using Biacore™-T200 (GE Healthcare Japan). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) was used as a running buffer and an amine coupling kit (GE Healthcare Japan) was used to covalently bind the Mab Select SuRe™ ligand (GE Healthcare Japan) to the CM5 chip (carboxymethyl dextran coated chip) . The antibody used as analyte was prepared at a concentration of 5 μg/ml using HBS-EP+. To carry out measurements, a solution with an antibody concentration of 5 μg/ml was first injected with a flow rate of 10 μl/min for 3 min, then the analyte was replaced with HBS-EP+ and the response (RU) was evaluated after passing the flow for 0.5 min. After the measurements were completed, the sensor chip was regenerated by washing with 10 mM Gly-HCl at pH 1.5. In a control flow cell, the same experiment was carried out without covalent binding of the ligand to the chip, and the affinity for the SuRe™ ligand was analyzed based on the difference between responses (RU).

Последовательности, соответствующие упомянутым выше номерам последовательностей (SEQ ID NO: ), представлены ниже в таблице.The sequences corresponding to the sequence numbers mentioned above (SEQ ID NO: ) are shown in the table below.

- 68 041830- 68 041830

Таблица 14Table 14

SEQ ID NO: название SEQ ID NO: title SEQ ID МО:ц_азван_ие SEQ _ID MO: _Title SEQ ID NO SEQID NO ^;название ^; Name 1 1 нуклеотидная последовательность GPC3 (NP_991164617.1) nucleotide sequence of GPC3 (NP_991164617.1) 81 81 TROT H018 TROT H018 154 154 TR01H099 TR01H099 2 2 аминокислотная последовательность GPC3 (NP_991158089.1) amino acid sequence of GPC3 (NP_991158089.1) 82 82 TROT H019 TROT H019 155 155 TR01H100 TR01H100 3 3 сигнальная последовательность signal sequence 83 83 TR01H020 TR01H020 156 156 TR01H101 TR01H101 4 4 пептид α-цепи Т-клеточного рецептора (САА 26636.1) α-chain peptide of the T-cell receptor (САА 26636.1) 84 84 TR01H021 TR01H021 157 157 TR01H102 TR01H102 5 5 пептид β-цепи Т-клеточного рецептора (С25777) β-chain peptide of the T-cell receptor (С25777) 85 85 TR01H022 TR01H022 158 158 TR01H103 TR01H103 6 6 пептид γΐ-цепи Т-клеточного рецептора (А26659) peptide of the γΐ chain of the T-cell receptor (А26659) 86 86 TR01H023 TR01H023 159 159 TR01H104 TR01H104 7 7 пептид у2-цепи Т-клеточного рецептора (ААВ633 12.1) y2-chain peptide of the T-cell receptor (AAB633 12.1) 87 87 TR01H024 TR01H024 160 160 TR01H105 TR01H105 8 8 пептид δ-цепи Т-клеточного рецептора (ААА61033.1) δ-chain peptide of the T-cell receptor (AAA61033.1) 88 88 TR01H025 TR01H025 161 161 TR01H106 TR01H106 9 9 нуклеотид γ-цепи CD3 (NM_000073.2) CD3 γ-chain nucleotide (NM_000073.2) 89 89 TR01H026 TR01H026 162 162 TR01H107 TR01H107 10 10 нуклеотид δ-цепи CD3 (NM_000732.4) nucleotide of the CD3 δ-chain (NM_000732.4) 90 90 TR01H027 TR01H027 163 163 TR01H108 TR01H108 11 eleven нуклеотид ε-цепи CD3 (NM_000733.3) nucleotide of the CD3 ε-chain (NM_000733.3) 91 91 TR01H028 TR01H028 164 164 TR01H109 TR01H109 12 12 пептид γ-цепи CD3 (NP_000064.1) CD3 γ-chain peptide (NP_000064.1) 92 92 TR01H029 TR01H029 165 165 TR01H110 TR01H110 13 13 пептид δ-цепи CD3 (NP_000723.1) CD3 δ-chain peptide (NP_000723.1) 93 93 TR01H030 TR01H030 166 166 TR01H111 TR01H111 14 14 пептид ε-цепи CD3 (NP_000724.1) CD3 ε-chain peptide (NP_000724.1) 94 94 TR01H031 TR01H031 167 167 TR01H112 TR01H112 15-22 15-22 пептидный линкер peptide linker 95 95 TR01H032 TR01H032 168 168 TR01H113 TR01H113 23 23 человеческий Cyl human cyl 96 96 TR01H033 TR01H033 169 169 TR01H114 TR01H114 24 24 человеческий Су2 human su2 97 97 TR01H034 TR01H034 170 170 GCH003 GCH003 25 25 человеческий СуЗ human SuZ 98 98 TR01H035 TR01H035 171 171 GCH005 GCH005 26 26 человеческий Су4 human su4 99 99 TR01H036 TR01H036 172 172 GCH006 GCH006 27 27 нуклеотид FcyR! (NM_000566.3) nucleotide FcyR! (NM_000566.3) 100 100 TR01H037 TR01H037 173 173 GCH007 GCH007 28 28 пептид FcyRI (NM_000557.1) FcyRI peptide (NM_000557.1) 101 101 TR01H038 TR01H038 174 174 GCH008 GCH008 29 29 нуклеотид FcyRIIA (ВС020823.1) FcyRIIA nucleotide (BC020823.1) 102 102 TR01H039 TR01H039 175 175 GCH010 GCH010 30 thirty пептид FcyRIIA (ААН20823.1) FcyRIIA peptide (AAH20823.1) 103 103 TR01H040 TR01H040 176 176 GCH012 GCH012 31 31 нуклеотид FcyRIIB (ВС146678.1) FcyRIIB nucleotide (BC146678.1) 104 104 TR01H041 TR01H041 177 177 GCH013 GCH013 32 32 пептид FcyRIIB (AAI46679.1) peptide FcyRIIB (AAI46679.1) 105 105 TR01H042 TR01H042 178 178 GCH014 GCH014 33 33 нуклеотид FcyRIIIA (ВС033678.1) nucleotide FcyRIIIA (BC033678.1) 106 106 TR01H043 TR01H043 179 179 GCH015 GCH015 34 34 пептид FcyRIIIA (ААН033678.1) peptide FcyRIIIA (AAN033678.1) 107 107 TR01H044 TR01H044 180 180 GCH016 GCH016 35 35 нуклеотид FcyRIIIB (ВС128562.1) nucleotide FcyRIIIB (BC128562.1) 108 108 TR01H045 TR01H045 181 181 GCH019 GCH019 36 36 пептид FcyRIIIB (AAI28563.1) peptide FcyRIIIB (AAI28563.1) 109 109 TR01H046 TR01H046 182 182 GCH022 GCH022 37 37 Fc-обл. (доб. А к N-концу RefSeq per. номер ААС82527.1) Fc region (add. A to the N-terminus of RefSeq per. number AAC82527.1) 110 110 TR01H047 TR01H047 183 183 GCH023 GCH023 38 38 Fc-обл. (доб. А к N-концу RefSeq per. номер ААВ59393.1) Fc region (add. A to the N-terminus of RefSeq per. number AAB59393.1) 111 111 TR01H048 TR01H048 184 184 GCH025 GCH025 39 39 Fc-обл. (доб. А к N-концу RefSeq per. номер ААВ59394.1) Fc region (add. A to the N-terminus of RefSeq per. number AAB59394.1) 112 112 TR01H049 TR01H049 185 185 GCH026 GCH026 40 40 НОООО, вариабельная область Н-цепи GPC3 NOOOOO, GPC3 H chain variable region 113 113 TR01H050 TR01H050 186 186 GCH027 GCH027 41 41 GL4, вариабельная область L-цепи GPC3 GL4, GPC3 L chain variable region 114 114 TR01H051 TR01H051 187 187 GCH029 GCH029 42 42 гСЕ115Н, вариабельная область Н-цепи СЕ115 rSE115H, variable region of the CE115 H chain 115 115 TR01H052 TR01H052 188 188 GCH032 GCH032 43 43 rCE115L, вариабельная область L-цепи СЕ115 rCE115L, CE115 L chain variable region 116 116 TR01H053 TR01H053 189 189 GCH034 GCH034 44 44 G1dh G1dh 117 117 TR01H054 TR01H054 190 190 GCH035 GCH035 45 45 ERY22_Hk ERY22_Hk 118 118 TR01H055 TR01H055 191 191 GCH039 GCH039 46 46 ERY22_Hh ERY22_Hh 119 119 TR01H056 TR01H056 192 192 GCH040 GCH040 47 47 GL4-ERY22_Hk GL4-ERY22_Hk 120 120 TR01H057 TR01H057 193 193 GCHO42 GCHO42 48 48 H0000-ERY22L H0000-ERY22L 121 121 TR01H058 TR01H058 194 194 GCHO43 GCHO43 49 49 rCE115H-ERY22_Hh rCE115H-ERY22_Hh 122 122 TR01H061 TR01H061 195 195 GCH045 GCH045 50 50 rCE115L-kO rCE115L-ko 123 123 TR01H062 TR01H062 196 196 GCH053 GCH053 51 51 hCE115HL (тяжелая цепь гуманизированного CE115) hCE115HL (humanized CE115 heavy chain) 124 124 TR01H063 TR01H063 197 197 GCH054 GCH054 52 52 hCE115HA (тяжелая цепь гуманизированного CEllS) hCE115HA (humanized CEllS heavy chain) 125 125 TR01H064 TR01H064 198 198 GCH055 GCH055 53 53 L0000 (легкая цепь гуманизированного СЕ115) L0000 (humanized CE115 light chain) 126 126 TR01H065 TR01H065 199 199 GCH056 GCH056 54 54 H0000-ERY27_HK H0000-ERY27_HK 127 127 TR01H066 TR01H066 200 200 GCH057 GCH057 55 55 hCEl 15HA-ERY27_HE hCEl 15HA-ERY27_HE 128 128 TR01H067 TR01H067 201 201 GCH059 GCH059 56 56 LOOOC-kO LOOOC-ko 129 129 TR01H068 TR01H068 202 202 GCH060 GCH060 57 57 E22Hh E22Hh 130 130 TRO1H069 TRO1H069 203 203 GCH061 GCH061 58 58 E22Hk E22Hk 131 131 TR01H070 TR01H070 204 204 GCH062 GCH062 59 59 Hi-Kn010G3 Hi-Kn010G3 132 132 TR01H071 TR01H071 205 205 GCH064 GCH064 60 60 E2702GsKsc E2702GsKsc 133 133 TR01H072 TR01H072 206 206 GCH065 GCH065 61 61 E2704sEpsc E2704sEpsc 134 134 TR01H073 TR01H073 207 207 GCH066 GCH066 62 62 E2702SKSC E2702SKSC 135 135 TR01H074 TR01H074 208 208 GCH067 GCH067 63 63 kO kO 136 136 TR01H075 TR01H075 209 209 GCH068 GCH068 64 64 CE115HA177 CE115HA177 137 137 TR01H076 TR01H076 210 210 GCH073 GCH073 65 65 CE115HA178 CE115HA178 138 138 TR01H077 TR01H077 211 211 GCH094 GCH094 66 66 CE115HA179 CE115HA179 139 139 TR01H079 TR01H079 212 212 GCH098 GCH098 67 67 CE115HA180 CE115HA180 140 140 TR01H080 TR01H080 213 213 GCH099 GCH099 68 68 hCE115HAa hCE115HAa 141 141 TR01H081 TR01H081 214 214 GCH100 GCH100 69 69 TR01H006 TR01H006 142 142 TR01H082 TR01H082 215 215 H0610 H0610 70 70 TR01H007 TR01H007 143 143 TR01H083 TR01H083 216 216 LOOOOvkl LOOOOvkl 71 71 TR01H008 TR01H008 144 144 TR01H084 TR01H084 217 217 L0002 L0002 72 72 TR01H009 TR01H009 145 145 TR01H090 TR01H090 218 218 L0Q03 L0Q03 73 73 TR01H010 TR01H010 146 146 TR01H091 TR01H091 219 219 L0006 L0006 74 74 TR01H011 TR01H011 147 147 TR01H092 TR01H092 220 220 L0007 L0007 75 75 TR01H012 TR01H012 148 148 TR01H093 TR01H093 221 221 L0008 L0008 76 76 TR01H013 TR01H013 149 149 TR01H094 TR01H094 222 222 L0009 L0009 77 77 TR01H014 TR01H014 150 150 TR01H095 TR01H095 223 223 LO011 LO011 78 78 TR01H015 TR01H015 151 151 TR01H096 TR01H096 224 224 L0012 L0012 79 79 TR01H016 TR01H016 152 152 TR01H097 TR01H097 225 225 LO013 LO013 80 80 TR01H017 TR01H017 153 153 TR01H098 TR01H098 226 226 L0014 L0014

- 69 041830- 69 041830

SEQ ID NO: SEQID NO: название Name SEQ ID NO: SEQID NO: название Name SEQ ID 1®:_наз_вание SEQ ID 1® _: _name 227 227 L0015 L0015 300 300 L0202 L0202 373 373 TR01L015 TR01L015 228 228 L0016 L0016 301 301 L0203 L0203 374 374 TR01L016 TR01L016 229 229 L0032 L0032 302 302 L0204 L0204 375 375 TR01L017 TR01L017 230 230 L0038 L0038 303 303 L0205 L0205 376 376 TR01L018 TR01L018 231 231 L0039 L0039 304 304 L0206 L0206 377 377 TR01L019 TR01L019 232 232 L0041 L0041 305 305 L0207 L0207 378 378 TR01L02O TR01L02O 233 233 L0042 L0042 306 306 L020B L020B 379 379 TR01L023 TR01L023 234 234 L0043 L0043 307 307 L0209 L0209 380 380 TR01L024 TR01L024 235 235 L0O44 L0O44 308 308 LO210 LO210 381 381 CE115HA122-E22Hh CE115HA122-E22Hh 236 236 L0045 L0045 309 309 L0211 L0211 382 382 CE115HA236-E22Hh CE115HA236-E22Hh 237 237 L0046 L0046 310 310 L0212 L0212 383 383 CE115HA251-E22Hh CE115HA251-E22Hh 238 238 L0047 L0047 311 311 L0213 L0213 384 384 GCH054-E2704sEpsc GCH054-E2704sEpsc 239 239 L0062 L0062 312 312 L0214 L0214 385 385 GCH065-E2704sEpsc GCH065-E2704sEpsc 240 240 L0O63 L0O63 313 313 L0215 L0215 386 386 GCH094-E2704sEpsc GCH094-E2704sEpsc 241 241 L0064 L0064 314 314 L0216 L0216 387 387 HQ610-E2704sEpsc HQ610-E2704sEpsc 242 242 L0065 L0065 315 315 L0217 L0217 388 388 hCE115HA-E22Hh hCE115HA-E22Hh 243 243 L0066 L0066 316 316 L0218 L0218 389 389 rCE115H-E22Hh rCE115H-E22Hh 244 244 L0069 L0069 317 317 L0219 L0219 390 390 r0E115H-E2702GsKsc r0E115H-E2702GsKsc 245 245 L0O75 L0O75 318 318 LO220 LO220 391 391 TR01Η002Έ22ΗΊ TR01Η002Έ22ΗΊ 246 246 L0079 L0079 319 319 L0222 L0222 392 392 TR01H015-E22Hh TR01H015-E22Hh 247 247 L0082 L0082 320 320 L0223 L0223 393 393 TR01H040-E2702GSKSC TR01H040-E2702GSKSC 248 248 L0085 L0085 321 321 L0224 L0224 394 394 TR01H061-E2702GsKsC TR01H061-E2702GsKsC 249 249 L0089 L0089 322 322 L0226 L0226 395 395 TR01 H067-E2702GsKsc TR01 H067-E2702GsKsc 250 250 L0090 L0090 323 323 L0227 L0227 396 396 TR01 H06B-E2702GsKsc TR01 H06B-E2702GsKsc 251 251 L0091 L0091 324 324 L0228 L0228 397 397 TR01 H071-E2702GsKsc TR01 H071-E2702GsKsc 252 252 L0093 L0093 325 325 L0229 L0229 398 398 TR01H082-E2702GSKSC TR01H082-E2702GSKSC 253 253 L0104 L0104 326 326 L023D L023D 399 399 TR01 H034-E2702GsKsc TR01 H034-E2702GsKsc 254 254 L0106 L0106 327 327 L0231 L0231 400 400 TR01 H109-E2702GsKsc TR01 H109-E2702GsKsc 255 255 L0107 L0107 328 328 L0232 L0232 401 401 TR01H113-E2702GsKsc TR01H113-E2702GsKsc 256 256 L0109 L0109 329 329 L0233 L0233 402 402 TR01H113-E2702sKsc TR01H113-E2702sKsc 257 257 L0113 L0113 330 330 L0234 L0234 403 403 GL4-E22Hk GL4-E22Hk 258 258 L0115 L0115 331 331 L0235 L0235 404 404 LOOOO-E22Hk LOOOO-E22Hk 259 259 L0117 L0117 332 332 L0236 L0236 405 405 H0000-E22L H0000-E22L 260 260 L0120 L0120 333 333 L0237 L0237 406 406 H0610-E22L H0610-E22L 261 261 L0122 L0122 334 334 L0238 L0238 407 407 rCE115L-kO rCE115L-ko 262 262 L0123 L0123 335 335 L0239 L0239 408 408 GLS3108-k0 GLS3108-k0 263 263 L0124 L0124 336 336 L0240 L0240 409 409 LOOOO-kO LOOOO-ko 264 264 L0125 L0125 337 337 L0241 L0241 410 410 L0011-k0 L0011-k0 265 265 L0126 L0126 338 338 L0242 L0242 411 411 L0201-k0 L0201-k0 266 266 L0127 L0127 339 339 L0243 L0243 412 412 L0203-k0 L0203-k0 267 267 L0129 L0129 340 340 L0246 L0246 413 413 L0204-k0 L0204-k0 268 268 L0132 L0132 341 341 L0247 L0247 414 414 L0206-k0 L0206-k0 269 269 L0134 L0134 342 342 L024B L024B 415 415 L0208-k0 L0208-k0 270 270 L0136 L0136 343 343 L0249 L0249 416 416 L0209-k0 L0209-k0 271 271 L0137 L0137 344 344 L0250 L0250 417 417 L0211-k0 L0211-k0 272 272 L0138 L0138 345 345 L0258 L0258 418 418 L0212-k0 L0212-k0 273 273 L0139 L0139 346 346 L0259 L0259 419 419 L0222-k0 L0222-k0 274 274 L0140 L0140 347 347 L0260 L0260 420 420 TR01H001 TR01H001 275 275 L0141 L0141 348 348 L0261 L0261 421 421 TR01H002 TR01H002 276 276 L0143 L0143 349 349 L0262 L0262 422 422 TR01H003 TR01H003 277 277 L0144 L0144 350 350 L0263 L0263 423 423 TR01H004 TR01H004 278 278 L0145 L0145 351 351 L0264 L0264 424 424 ГСЕ115Н GSE115N 279 279 L0147 L0147 352 352 L0265 L0265 425 425 CE115HA121 CE115HA121 280 280 L0148 L0148 353 353 L0266 L0266 426 426 CE115HA122 CE115HA122 281 281 L0149 L0149 354 354 L0267 L0267 427 427 CE115HA124 CE115HA124 282 282 L0151 L0151 355 355 L0268 L0268 428 428 CE115HA192 CE115HA192 283 283 L0152 L0152 356 356 L0269 L0269 429 429 CE115HA236 CE115HA236 284 284 L0154 L0154 357 357 L0270 L0270 430 430 CE115HA251 CE115HA251 285 285 L0155 L0155 358 358 L0271 L0271 431 431 CE115HA252 CE115HA252 286 286 L0157 L0157 359 359 L0272 L0272 432 432 E22L E22L 287 287 L0160 L0160 360 360 TR01L001 TR01L001 288 288 L0161 L0161 361 361 TR01L002 TR01L002 289 289 L0163 L0163 362 362 TR01L003 TR01L003 290 290 L0167 L0167 363 363 TR01L004 TR01L004 291 291 L0168 L0168 364 364 TR01L005 TR01L005 292 292 L0173 L0173 365 365 TR01L006 TR01L006 293 293 L0175 L0175 366 366 TR01L007 TR01L007 294 294 L0180 L0180 367 367 TR01L008 TR01L008 295 295 L0181 L0181 368 368 TR01L009 TR01L009 296 296 L0186 L0186 369 369 TR01L010 TR01L010 297 297 L0187 L0187 370 370 TR01L011 TR01L011 298 298 L0200 L0200 371 371 TR01L012 TR01L012 299 299 L0201 L0201 372 372 TR01L013 TR01L013

Промышленная применимостьIndustrial Applicability

В настоящем изобретении предложены новые мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые сохраняют сильную противораковую активность, свойственную BiTE, и обладают очень высокой безопасностью, что проявляется в отсутствии индукции независимого от ракового антигена цитокинового шторма, а также обладают продолжительным временем полужизни в крови. Индуцирующие цитотоксичность агенты, которые содержат в качестве действующего вещества антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, могут направленно воздействовать на экспрессирующие глипикан 3 клетки и опухолевые ткани, которые содержат такие клетки, и индуцировать повреждение клеток. Введение мультиспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении, пациентам позволяет осуществлять требуемое лечение, которое не только отличается высоким уровнем безопасности, но также снижает физическую нагрузку на пациентов и является очень удобным.The present invention provides novel multi-specific antigen-binding molecules that retain the potent anti-cancer activity of BiTE and have very high safety, as evidenced by no induction of a cancer-antigen-independent cytokine storm, and have a long blood half-life. Cytotoxicity-inducing agents that contain the antigen-binding molecule of the present invention as an active ingredient can target glypican 3 expressing cells and tumor tissues that contain such cells and induce cell damage. Administration of the multispecific antigen-binding molecules of the present invention allows patients to receive the desired treatment, which not only has a high level of safety, but also reduces the patient's physical burden and is very convenient.

--

Claims

CLAIM

(1) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical light chains having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 410;

(1) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical antibody light chain variable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; And

- 74 041830 (2) a bispecific antibody which has an antibody heavy chain comprising the heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical antibody light chain variable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; and (3) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising the heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical antibody light chain variable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; and (4) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising the heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; and two antibody light chain variable regions identical, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(5) a bispecific antibody which has an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical light chain variable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; and (6) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising the heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical antibody light chain variable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223.

8. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε selected from the group consisting of:

(1) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity has a variable region

- 73 041830 heavy chain, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206;

variable region having CD3ε binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity have a common light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(1) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-57 (CDR2) and 97-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-59 (CDR2) and 99111 (CDR3) of SEQ ID NO: 142, respectively; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity, so. and having CD3ε binding activity, include common light chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) of SEQ ID NO: 223, respectively;

(1) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) and 99-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-68 (CDR2) and 101111 (CDR3) of SEQ ID NO: 142, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

1. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε, which contains an antibody variable region having glypican 3 binding activity, an antibody variable region having CD3ε binding activity selected from (1)-(5):

(2) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising the heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and two identical light chains having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 410;

(2) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206;

the variable region having CD3ε binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity, share a common light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(3) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206;

a variable region having CD3ε binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity, share a common light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(4) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211;

a variable region having CD3ε binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity, share a common light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223;

(5) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211;

a variable region having CD3ε binding activity has a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity, share a common light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223.

5. A bispecific antibody according to any one of claims 1 to 4, wherein the bispecific antibody further has an Fc region with at least one amino acid mutation of any of the amino acid sequences forming the Fc region of SEQ ID NOs: 23-26 (IgG1-IgG4), where at least one mutation is selected from amino acids in the following amino acid positions according to the EU numbering: position 220, position 226, position 229, position 231, position 232, position 233, position 234, position 235, position 236, position 237, position 238 , position 239, position 240, position 264, position 265, position 266, position 267, position 269, position 270, position 295, position 296, position 297, position 298, position 299, position 300, position 325, position 327, position 328, regulation 329, regulation 330, regulation 331 and regulation 332.

6. The bispecific antibody of claim 5, wherein the Fc region of the bispecific antibody is an Fc region that contains at least one amino acid selected from the following amino acids according to EU numbering: Arg at amino acid position 234, Ala, or Arg at amino acid position 235, Lys at amino acid position 239 and Ala at amino acid position 297.

7. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε selected from the group consisting of:

(2) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 47-59 (CDR2) and 97-103 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 4761 (CDR2) and 99-110 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 35-41 (CDR1), 51-56 (CDR2) and 94- 101 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(3) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 47-59 (CDR2) and 97-103 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 4761 (CDR2) and 99-110 (CDR3) of SEQ ID NO: 168, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 35-41 (CDR1), 51-56 (CDR2) and 94- 101 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(4) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity that includes CDR1, CDR2, and CDR3 heavy chain regions identical to the amino acid sequences of positions 3035 (CDR1), 47-59 (CDR2) and 97-103 (CDR3) of SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 4761 (CDR2) and 99-110 (CDR3) of SEQ ID NO: 142, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 35-41 (CDR1), 51-56 (CDR2) and 94- 101 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(5) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 47-59 (CDR2) and 97-103 (CDR3) SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 4761 (CDR2) and 99-110 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 35-41 (CDR1), 51-56 (CDR2) and 94- 101 (CDR3) SEQ ID NO: 223, respectively, wherein the heavy chain numbering of CDR1, CDR2 and CDR3 and the light chain of CDR1, CDR2 and CDR3 are based on pin numbering.

4. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε, which contains an antibody variable region having glypican 3 binding activity and an antibody variable region having CD3ε binding activity selected from (1)-(5):

(2) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-57 (CDR2) and 97-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-59 (CDR2) and 99111 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions, both having glypican 3 binding activity, so. and having CD3ε binding activity, include common light chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) of SEQ ID NO: 223, respectively;

(3) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-57 (CDR2) and 97-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-59 (CDR2) and 99111 (CDR3) of SEQ ID NO: 168, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common light chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94- 102 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(4) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity comprises heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-57 (CDR2) and 97-104 (CDR3) SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-59 (CDR2) and 99111 (CDR3) of SEQ ID NO: 142, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(5) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-57 (CDR2) and 97-104 (CDR3) SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 26-32 (CDR1), 52-59 (CDR2) and 99111 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) SEQ ID NO: 223, respectively, wherein the heavy chain numbering of CDR1, CDR2 and CDR3 and the light chain of CDR1, CDR2 and CDR3 are based on Chothia numbering.

3. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε, which contains an antibody variable region having glypican 3 binding activity and an antibody variable region having CD3ε binding activity selected from (1)-(5):

- 72 041830 (1) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes CDR1, CDR2 and

Heavy chain CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 30-35 (CDR1), 47-59 (CDR2) and 97-103 (CDR3) of SEQ ID NO: 206, respectively;

2. A bispecific antibody that binds glypican 3 and CD3ε, which contains an antibody variable region having glypican 3 binding activity and an antibody variable region having CD3ε binding activity selected from (1)-(5):

(2) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity comprises heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) and 99-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-68 (CDR2) and 101111 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions, like. having glypican 3 binding activity, so. and having CD3ε binding activity, include common light chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94-102 (CDR3) of SEQ ID NO: 223, respectively;

(3) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) and 99-104 (CDR3) SEQ ID NO: 206 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-68 (CDR2) and 101-111 (CDR3) of SEQ ID NO: 168, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94 -102 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(4) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) and 99-104 (CDR3) SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 5068 (CDR2) and 101-111 (CDR3) of SEQ ID NO: 142, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common CDR1, CDR2 and CDR3 light chain regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94 -102 (CDR3) SEQ ID NO: 223 respectively;

(5) a bispecific antibody, wherein the variable region having glypican 3 binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) and 99-104 (CDR3) SEQ ID NO: 211 respectively;

the variable region having CD3ε binding activity includes heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 31-35 (CDR1), 5068 (CDR2) and 101-111 (CDR3) of SEQ ID NO: 164, respectively; and both variable regions having glypican 3 binding activity and having CD3ε binding activity include common light chain CDR1, CDR2 and CDR3 regions identical to the amino acid sequences of positions 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) and 94- 102 (CDR3) SEQ ID NO: 223, respectively, wherein the heavy chain numbering of CDR1, CDR2 and CDR3 and the light chain of CDR1, CDR2 and CDR3 are based on Cabot numbering.

- 71 041830

(3) a bispecific antibody that has an antibody heavy chain comprising a heavy chain variable region of an antibody with glypican 3 binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; an antibody heavy chain comprising an antibody heavy chain variable region with CD3ε binding activity having the amino acid sequence of SEQ ID

-