EA040305B1

EA040305B1 - POLIOVACCINE COMPOSITION WITH REDUCED DOSE OF ANTIGEN D AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Info

Publication number: EA040305B1
Application number: EA201700187
Authority: EA
Inventors: Раджив Мхаласакант Дхири; Самбхаджи Шанкар Пизал; Джагдиш Камаладжи Зади; Раджендра Нараян Сабали
Original assignee: Серум Инститьют Оф Индиа Прайвит Лимитид
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2022-05-18

Description

Сдерживание распространения полиомиелита в существенной степени объясняется применением пероральной полиомиелитной вакцины (ППВ), созданной на основе живых аттенуированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита. Однако для применения ППВ имеются ограничения в период после ликвидации. Поэтому важную роль в стратегии ВОЗ по ликвидации полиомиелита играет разработка инактивированной полиовакцины Сэбина (сИПВ). Применение аттенуированных штаммов Сэбина вместо диких штаммов Солка вируса полиомиелита позволит обеспечить дополнительную безопасность в период производства вакцины. Кроме того, в целях предотвращения появления циркулирующих полиовирусов вакцинного происхождения (цПВВП), после ликвидации полиомиелита применение ППВ должно быть прекращено, и вместо них следует начать применять ИПВ. Такие цПВВП являются заразными и могут стать нейровирулентными (аналогично диким полиовирусам), что приведет к развитию вакциноассоциированного паралитического полиомиелита. Существует потенциальная вероятность того, что эти штаммы снова засеют мир полиовирусами, что сведет на нет все достижения в области ликвидации полиомиелита.The containment of the spread of polio is largely due to the use of the oral polio vaccine (OPV), based on live attenuated strains of Sabin polio virus. However, there are limitations to the use of PPV in the post-eradication period. Therefore, the development of Sabin inactivated polio vaccine (sIPV) plays an important role in the WHO polio eradication strategy. The use of attenuated Sabin strains instead of wild-type Salk polioviruses would provide additional safety during vaccine production. In addition, in order to prevent the emergence of circulating vaccine-derived polioviruses (cVDPVs), once polio has been eradicated, the use of PPV should be discontinued and IPV should be introduced instead. Such cVDPVs are contagious and can become neurovirulent (similar to wild polioviruses), leading to the development of vaccine-associated paralytic poliomyelitis. There is a potential for these strains to repopulate the world with polioviruses, reversing the gains made in polio eradication.

ИПВ доставляется путем внутримышечных (ВМ) или глубоких подкожных (ГП) инъекций. В настоящее время ИПВ доступен на рынке в виде отдельной безадъювантной композиции или в виде различных комбинаций, в т.ч. ДС-ИПВ (с дифтерийным и столбнячным токсинами) и шестивалентных вакцин КДС-HepB-Hib-ИПВ (дополнительно защищающих от коклюша, гепатита В и гемофилического гриппа b). Текущая допустимая стандартная доза вакцин полиомиелита содержит антигены D трех типов в следующем количестве: 40 единиц инактивированного полиовируса типа 1 (Mahoney), 8 единиц инактивированного полиовируса типа 2 (MEF-I) и 32 единицы инактивированного полиовируса типа 3 (Saukett) (например, Infanrix-IPV™). Существующие препараты отдельных ИПВ не содержат адъювант.IPV is delivered by intramuscular (IM) or deep subcutaneous (DS) injection. Currently, IPV is available on the market as a single non-adjuvanted composition or in various combinations, incl. DS-IPV (with diphtheria and tetanus toxins) and hexavalent DTP-HepB-Hib-IPV vaccines (additional protection against whooping cough, hepatitis B and Haemophilus influenzae b). The current acceptable standard dose of polio vaccines contains three types of D antigens in the following quantities: 40 units of inactivated poliovirus type 1 (Mahoney), 8 units of inactivated poliovirus type 2 (MEF-I), and 32 units of inactivated poliovirus type 3 (Saukett) (for example, Infanrix -IPV™). Existing preparations of individual IPVs do not contain an adjuvant.

Большинство экспертов соглашаются в том, что применение ИПВ в мировом масштабе является предпочтительным в связи с подтвержденной эффективностью и безопасностью. Тем не менее, в сравнении с ППВ, соотношение цена-результат для ИПВ существенно выше. Это объясняется следующими основными причинами: (i) требуется большее количество вируса на дозу; (ii) требуется дополнительная последующая обработка (т.е. концентрация, очистка и инактивация), а также соответствующая проверка качества; (iii) происходит потеря антигена или затрудняется его последующее восстановление; (iv) требуются меры по локализации. До настоящего времени финансовый объект являлся основным препятствием для такого нововведения как ИПВ в странах с доходом среднего уровня и ниже. Стоимость производства сИПВ в настоящее время оценивается как эквивалентная стоимости производства ИПВ, которая в 20 раз превышает аналогичный показатель для ППВ. Будущая мировая потребность в ИПВ после ликвидации полиовирусов может возрасти с текущего уровня 80 млн доз до 450 млн доз в год. Соответственно, с высокой вероятностью потребуются способы расширения поставок ИПВ.Most experts agree that the use of IPV on a global scale is preferable due to proven efficacy and safety. However, compared to the IPV, the cost-benefit ratio for IPV is significantly higher. This is due to the following main reasons: (i) more virus is required per dose; (ii) additional post-treatment (ie concentration, purification and inactivation) is required, as well as appropriate quality control; (iii) there is a loss of antigen or its subsequent recovery is difficult; (iv) containment measures are required. So far, the financial object has been a major barrier to the introduction of the IPV in middle-income countries and below. The cost of producing sIPV is currently estimated to be equivalent to the cost of producing IPV, which is 20 times that of IPV. The future global demand for IPV after poliovirus eradication could increase from the current level of 80 million doses to 450 million doses per year. Accordingly, ways to increase the supply of IPV are likely to be needed.

Эффективные композиции вакцин со сниженной дозой, обеспечивающие защиту от инфекции при сниженной дозе антигена ИПВ, необходимы в том случае, если поставок обычной вакцины недостаточно для удовлетворения мировой потребности, или в случае, когда стоимость изготовления обычной вакцины не позволяет продавать вакцину по цене, доступной для развивающихся стран. Кроме того, воздействие пониженной дозы ИПВ, по сравнению с существующими на рынке композициями, может быть более безопасным. Таким образом, требуется рассмотреть различные стратегии, позволяющие сделать цены на ИПВ более доступными.Effective reduced-dose vaccine formulations that provide protection against infection at a reduced dose of IPV antigen are needed when the supply of a conventional vaccine is insufficient to meet global demand, or when the cost of manufacturing a conventional vaccine does not allow the vaccine to be sold at a price affordable to developing countries. In addition, exposure to a lower dose of IPV, compared to existing formulations on the market, may be safer. Therefore, different strategies need to be considered to make IPV prices more affordable.

В случае с вакцинами от пандемического гриппа применение адъювантов позволило снизить дозы, повысить доступность и снизить стоимость вакцины. В связи с этим, было сделано предположение, что адъювантная композиция вакцины сИПВ снизит стоимость и увеличит количество доступных доз сИПВ в мире.In the case of pandemic influenza vaccines, the use of adjuvants has reduced doses, increased availability, and lowered the cost of the vaccine. In this regard, it has been suggested that an adjuvant formulation of an sIPV vaccine would reduce the cost and increase the number of available doses of sIPV worldwide.

Различные исследовательские группы во всем мире анализировали возможность экономии дозы в вакцинах (вакцины от гриппа, в частности, с применением нескольких адъювантов, а именно, квасцы, эмульсии, агонисты TLR (MPL, CpG, poly-IC, имиквимод), dmLT, 1,25-дигидроксивитамин D3, CAF01, поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] (РСРР) и репликоны частиц венесуэльского лошадиного энцефалита (ВЛЭ). Применение большей части изученных типов адъювантов связано со следующими сложностями: i) отсутствие сведений о безопасности или отнесение к классу токсичных веществ регулятивными органами; (ii) наличие ограничений по способу применения; (iii) недостаточная воспроизводимость при изготовлении; (iv) стабильность адъюванта.Various research groups around the world have been evaluating the possibility of dose savings in vaccines (influenza vaccines, in particular with multiple adjuvants, namely alum, emulsions, TLR agonists (MPL, CpG, poly-IC, imiquimod), dmLT, 1, 25-dihydroxyvitamin D3, CAF01, poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene] (PCPP) and Venezuelan equine encephalitis (VFE) particle replicons Most of the types of adjuvants studied are associated with the following difficulties: i) lack of safety data or classification as toxic substances by regulatory authorities; (ii) the existence of restrictions on the method of application; (iii) insufficient reproducibility in manufacture; (iv) adjuvant stability.

Адъюванты в виде эмульсии (MF-59, AS03, AF3), как сообщалось ранее, дают высокий эффект снижения дозы (более чем в 30 раз) в вакцинах от гриппа и гепатита В. Эти адъюванты действуют посредством создания депо в месте инъекции, что обеспечивает постепенный выпуск антигенного материала и стимулирование продуцирующих антитела плазмоцитов. Однако такие адъюванты считаются слишком токсичными для широкой профилактической вакцинации людей, и обычно их применение ограничивается тяжелыми и (или) неизлечимыми состояниями, такими как рак, с более высокой степенью допустимости побочных эффектов.Emulsion adjuvants (MF-59, AS03, AF3) have previously been reported to give a high dose reduction effect (more than 30-fold) in influenza and hepatitis B vaccines. These adjuvants act by creating a depot at the injection site, which provides gradual release of antigenic material and stimulation of antibody-producing plasma cells. However, such adjuvants are considered too toxic for widespread human prophylactic vaccination and are generally limited to severe and/or incurable conditions such as cancer, with a higher tolerance for side effects.

Кроме того, соли алюминия считаются безопасными и в настоящее время уже используются в комбинированных вакцинах, содержащих сИПВ; для их разработки существует меньше препятствий, и их производство является менее дорогостоящим.In addition, aluminum salts are considered safe and are currently being used in combination vaccines containing sIPV; there are fewer barriers to their development and their production is less costly.

- 1 040305- 1 040305

Однако в настоящее время нет сведений о возможности существенного снижения дозы с помощью адъювантов на основе алюминия.However, there is currently no evidence that significant dose reductions can be achieved with aluminum-based adjuvants.

Одним из наиболее критически важных этапов в производстве вакцин от патогенных микроорганизмов, в частности, вирусных вакцин, является вирусная инактивация. В случае вирусной инактивации в качестве агента инактивации при изготовлении вакцин наиболее часто используется формалин. Формальдегид инактивирует вирус путем необратимого перекрестного сшивания первичных аминогрупп в поверхностных белках с другими близлежащими атомами азота в белке или ДНК посредством СН2связи. Потенциальная проблема, связанная с применением формалина для вирусной инактивации, состоит в том, что при этом применяется ряд химических реакций, приводящих к образованию продуктов, способных вызвать перекрестное сшивание вирусных белков и скопление вирусных частиц. Это может снижать эффективность инактивации и также может привести к частичному разрушению иммуногенности антигена в вакцине. Соответственно, ранее сообщалось, что инактивация полиовирусов формалином может влиять на вирусную иммуногенность, а также на антигенность. (См. Журнал общей вирусологии, Мораг Фергюсон и др. 1993), 74, 685-690. Что еще более важно, ранее описанные способы инактивации формальдегидом частично проводились в присутствии фосфатного буфера, при этом наблюдались существенные потери антигена D наряду с модификацией эпитопа для штаммов Сэбина типов I/II/III (восстановление антигена D после инактивации: 22% для типа I, 15% для типа II, 25% для типа III), таким образом, не удавалось обеспечить соответствие эпитопа. Поэтому возможно, что антитела, произведенные реципиентами инактивированных формалином полиовирусов (в присутствии фосфатного буфера), не способствуют защитной иммунной реакции.One of the most critical steps in the production of vaccines against pathogens, in particular viral vaccines, is viral inactivation. In the case of viral inactivation, formalin is most commonly used as an inactivation agent in the manufacture of vaccines. Formaldehyde inactivates the virus by irreversibly cross-linking the primary amino groups in surface proteins with other nearby nitrogen atoms in the protein or DNA via a CH2 bond. A potential problem with the use of formalin for viral inactivation is that it involves a number of chemical reactions leading to the formation of products that can cause cross-linking of viral proteins and the accumulation of viral particles. This may reduce the effectiveness of the inactivation and may also lead to partial destruction of the immunogenicity of the antigen in the vaccine. Accordingly, formalin inactivation of polioviruses has previously been reported to affect viral immunogenicity as well as antigenicity. (See Journal of General Virology, Morag Ferguson et al. 1993), 74, 685-690. More importantly, the previously described formaldehyde inactivation methods were partly carried out in the presence of phosphate buffer, with significant loss of D antigen along with epitope modification for Sabin strains types I/II/III (recovery of D antigen after inactivation: 22% for type I, 15% for type II, 25% for type III), thus failing to match the epitope. It is therefore possible that antibodies produced by recipients of formalin-inactivated polioviruses (in the presence of phosphate buffer) do not contribute to a protective immune response.

Комбинируя инактивацию формалином с инактивацией ультрафиолетовыми лучами, ученые попытались устранить ограничения, присущие УФ-инактивации и инактивации формалином, взятым по отдельности, соответственно, при инактивации особенно устойчивых полиовирусов. См., например, Опыт производства вакцин от полиовирусов, МакЛин и др., Прогр. Мед. Вирол, т. 1, стр. 122-164 (1958.) 122164 (1958.)By combining formalin inactivation with ultraviolet light inactivation, the scientists attempted to eliminate the limitations inherent in UV and formalin inactivation taken alone, respectively, in inactivating particularly resistant polioviruses. See, for example, Experience in the production of poliovirus vaccines, McLean et al., Prog. Honey. Virol, vol. 1, pp. 122-164 (1958.) 122164 (1958.)

Тейлор и др. (Ж. Иммунол. (1957) 79:265-75) описывают инактивацию вируса полиомиелита формалином и УФ-лучами, взятыми в сочетании. Молнер и др. (Ам. здравоохр. (1958) 48:590-8), описывают создание измеримого уровня циркулирующих антител в крови испытуемых, привитых полиомиелитной вакциной, инактивированной УФ-лучами и формалином. Труфелли и др. (Прикл. микробиол. (1967) 15:516-27) сообщают об инактивации аденовируса и онкогенного обезьяньего вируса 40 у хомяков в процессе трехэтапной инактивации формалином, УФ-лучами и β-пропиолактоном (BPL). Майями (Микробиол. иммунол. (1986) 30:213-23) описывает подготовку иммуногенов вируса Сендай с помощью УФлучей и формалина. Однако ранее рассмотренные перспективные альтернативы для формальдегида, такие как β-пропиолактон (BPL), по сообщениям, давали иммунокомплексную реакцию при комбинировании с другими компонентами антирабической вакцины. Кроме того, было показано, что при этом формировались плоскоклеточные карциномы, лимфомы и гепатомы у мышей.Taylor et al. (J. Immunol. (1957) 79:265-75) describe the inactivation of the polio virus with formalin and UV rays taken in combination. Molner et al. (Am. Health (1958) 48:590-8) describe the creation of a measurable level of circulating antibodies in the blood of subjects vaccinated with a polio vaccine inactivated by UV rays and formalin. Trufelli et al. (Appl. Microbiol. (1967) 15:516-27) report inactivation of adenovirus and oncogenic simian virus 40 in hamsters by a three-step inactivation process with formalin, UV light and β-propiolactone (BPL). Miami (Microbiol. Immunol. (1986) 30:213-23) describes the preparation of Sendai virus immunogens using UV rays and formalin. However, previously considered promising alternatives to formaldehyde, such as β-propiolactone (BPL), have been reported to produce an immunocomplex response when combined with other components of the rabies vaccine. It has also been shown to form squamous cell carcinomas, lymphomas, and hepatomas in mice.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Таким образом, в особенности желательно использовать благоприятные состояния инактивации формальдегидом, позволяющие поддерживать структурную целостность антигенных структур штаммов Сэбина, а также применять безопасные и рентабельные адъюванты, которые могут привести к значительному снижению дозы (т.е. в 8-10 раз) сИПВ (ИПВ Сэбина) в составе вакцины, и тем самым снизить стоимость изготовления, увеличить поставки вакцин и сделать вакцины доступными для развивающихся стран.Thus, it is particularly desirable to use favorable formaldehyde inactivation states to maintain the structural integrity of the antigenic structures of Sabin strains, as well as to use safe and cost-effective adjuvants that can lead to a significant dose reduction (i.e. 8-10-fold) of sIPV (IPV Sabin) in a vaccine, and thereby reduce the cost of manufacturing, increase the supply of vaccines and make vaccines available to developing countries.

На текущий момент авторами изобретения сделано удивительное открытие, состоящее в том, что потери антигена D после инактивации формальдегидом могут вызываться присутствием фосфатного буфера, который вызывает неожиданное нежелательное скопление вирусов полиомиелита. Настоящее изобретение дает усовершенствованный процесс инактивации формальдегидом в присутствии TRIS-буфера, что позволяет обеспечить минимум модификаций эпитопа и соответственно сократить потери антигена D. Впоследствии могут быть получены вакцинные композиции с существенно сниженной дозой ИПВ Сэбина, по меньшей мере, в 8 раз для типа I и в 3 раза для типа III.The inventors have now made the surprising discovery that loss of D antigen after formaldehyde inactivation can be caused by the presence of a phosphate buffer, which causes an unexpected undesirable accumulation of polio viruses. The present invention provides an improved process for inactivation with formaldehyde in the presence of TRIS buffer, which allows for a minimum of epitope modifications and therefore a reduction in the loss of antigen D. Subsequently, vaccine compositions can be obtained with a significantly reduced dose of IPV Sabin, at least 8 times for type I and 3 times for type III.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения композиции, содержащей энтеровирусные частицы, включающий следующие этапы:According to the present invention, a method for preparing a composition containing enterovirus particles is provided, comprising the following steps:

a) производство среды, содержащей энтеровирусные частицы;a) production of media containing enterovirus particles;

b) очищение энтеровирусных частиц от среды;b) purification of enteroviral particles from the environment;

c) стабилизация очищенных энтеровирусных частиц;c) stabilization of purified enteroviral particles;

d) инактивация формалином энтеровирусных частиц, при которой в течение, по меньшей мере, части процесса инактивации используют буфер, отличный от фосфатного буфера, в концентрации, достаточной для предотвращения или уменьшения скопления энтеровирусных частиц в целях снижения потери антигена D после инактивации в 8-10 раз по сравнению с применением фосфатного буфера; иd) formalin inactivation of enterovirus particles, in which a buffer other than phosphate buffer is used during at least part of the inactivation process at a concentration sufficient to prevent or reduce the accumulation of enterovirus particles in order to reduce the loss of antigen D after inactivation in 8-10 times compared with the use of phosphate buffer; And

е) адсорбция энтеровирусных частиц на адъюванте в виде соли алюминия, при которой адсорбция в процентах на алюминии составляет по меньшей мере 95%.e) adsorption of enterovirus particles on an adjuvant in the form of an aluminum salt, in which the adsorption in percent on aluminum is at least 95%.

- 2 040305- 2 040305

Согласно настоящему изобретению буфер на этапе (d) выбирают из группы, состоящей из TRIS,According to the present invention, the buffer in step (d) is selected from the group consisting of TRIS,

TBS, MOPS, HEPES и бикарбонатного буферов.TBS, MOPS, HEPES and bicarbonate buffers.

Согласно настоящему изобретению используют TRIS буфер с рН около 6,8-7,2 и в концентрации в диапазоне 30-70 мМ, предпочтительно 40 мМ.According to the present invention, a TRIS buffer with a pH of about 6.8-7.2 and a concentration in the range of 30-70 mM, preferably 40 mM, is used.

Согласно настоящему изобретению упомянутый адъювант в виде соли алюминия, описанный на этапе (е), выбирают из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, и смеси этих двух веществ.According to the present invention, said aluminum salt adjuvant described in step (e) is selected from the group consisting of aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and a mixture of the two.

Согласно настоящему изобретению упомянутый адъювант в виде соли алюминия является гидроксидом алюминия с концентрацией от 1,5 мг/0,5 мл до 2,5 мг/0,5 мл, предпочтительно от 2,100 мг/0,5 мл до 2,4 мг/0,5 мл при рН около 6,5.According to the present invention, said aluminum salt adjuvant is aluminum hydroxide at a concentration of 1.5 mg/0.5 ml to 2.5 mg/0.5 ml, preferably 2.100 mg/0.5 ml to 2.4 mg/ 0.5 ml at a pH of about 6.5.

Согласно настоящему изобретению общее содержание алюминия в трехвалентной вакцине составляет 0,8-1,2 мг, предпочтительно 0,8 мг Al³⁺ на дозу 0,5 мл, со следующими характерными показателями: по меньшей мере 0,4 мг Al³⁺ для типа 1, по меньшей мере 0,2 мг Al³⁺ для типа 2, по меньшей мере 0,2 мг Al³⁺ для типа 3.According to the present invention, the total aluminum content of the trivalent vaccine is 0.8-1.2 mg, preferably 0.8 mg Al ³⁺ per 0.5 ml dose, with the following characteristics: at least 0.4 mg Al ³⁺ for type 1, at least 0.2 mg Al ³⁺ for type 2, at least 0.2 mg Al ³⁺ for type 3.

Согласно настоящему изобретению композиция, включающая энтеровирусные частицы, является вакциной.According to the present invention, the composition comprising enterovirus particles is a vaccine.

Согласно настоящему изобретению энтеровирусные частицы являются энтеровирусом полиовирусов.According to the present invention, the enterovirus particles are a poliovirus enterovirus.

Согласно настоящему изобретению энтеровирусные частицы содержат полиовирусы Сэбина серотипов 1, 2 и 3.According to the present invention, enterovirus particles comprise Sabin poliovirus serotypes 1, 2 and 3.

Согласно настоящему изобретению энтеровирусные частицы содержат полиовирусы Солка серотипов ИПВ типа 1 (Mahoney), ИПВ типа 2 (MEF-1); и (или) ИПВ типа 3 (Saukett).According to the present invention, enterovirus particles contain Salk polioviruses of serotypes IPV type 1 (Mahoney), IPV type 2 (MEF-1); and/or Type 3 IPV (Saukett).

Согласно настоящему изобретению вакцина является инактивированной полиовакциной (ИПВ) со сниженной дозой.According to the present invention, the vaccine is a reduced dose inactivated polio vaccine (IPV).

Согласно настоящему изобретению противополиомиелитная инактивированная вакцина со сниженной дозой содержит:According to the present invention, the reduced dose polio inactivated vaccine contains:

i) инактивированный полиовирус типа 1 с дозировкой менее 15 единиц антигена D вместо стандартной дозы 42ДЕ; и (или) ii) инактивированный полиовирус типа 2 с дозировкой менее 18 единиц антигена D; и (или) iii) инактивированный полиовирус типа 3 с дозировкой менее 15 единиц антигена D вместо стандартной дозы 32ДЕ.i) inactivated poliovirus type 1 at less than 15 antigen D units instead of the standard dose of 42MU; and/or ii) inactivated poliovirus type 2 at a dosage of less than 18 antigen D units; and/or iii) inactivated poliovirus type 3 at less than 15 antigen D units instead of the standard dose of 32MU.

Согласно настоящему изобретению упомянутая противополиомиелитная инактивированная вакцина со сниженной дозой может быть выбрана из группы:According to the present invention, said reduced dose inactivated polio vaccine may be selected from the group:

i) композиции с однократной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.5-16-10;i) single dose formulations of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from claims 5-16-10;

ii) композиции с двукратной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.5-16-10;ii) compositions with a two-fold dose of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 5-16-10;

iii) композиции с однократной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.2.5-8-5;iii) single dose formulations of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 2.5-8-5;

iv) Композиции с двукратной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.2.5-8-5;iv) Compositions with a two-fold dose of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 2.5-8-5;

v) композиции с однократной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.5-8-10;v) single dose formulations of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from claims 5-8-10;

vi) композиции с двукратной дозой штаммов Сэбина с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.5-8-10;vi) compositions with a two-fold dose of Sabin strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 5-8-10;

vii) композиции с однократной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.7.5-16-10;vii) single dose compositions of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 7.5-16-10;

viii) композиции с двукратной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.7.5-16-10;viii) compositions with a twofold dose of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 7.5-16-10;

ix) композиции с однократной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.8-2-5;ix) single dose compositions of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 8-2-5;

х) композиции с двукратной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.8-2-5;x) compositions with a two-fold dose of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3, selected from paragraphs 8-2-5;

xi) композиции с однократной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.10-2-5;xi) single dose compositions of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 10-2-5;

xii) композиции с двукратной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.10-2-5;xii) compositions with a two-fold dose of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 10-2-5;

xiii) композиции с однократной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.10-2-12;xiii) single dose compositions of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 10-2-12;

xiv) композиции с двукратной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из пп.10-2-12;xiv) compositions with a two-fold dose of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 10-2-12;

xv) композиции с однократной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбран-xv) single dose compositions of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3, selected

- 3 040305 ной из пп.5-2-5;- 3 040305 Noah from paragraphs 5-2-5;

xvi) композиции с двукратной дозой штаммов Солка с комбинацией типа 1, типа 2, типа 3, выбранной из п.5-2-5.xvi) compositions with a twofold dose of Salk strains with a combination of type 1, type 2, type 3 selected from paragraphs 5-2-5.

Согласно настоящему изобретению при приготовлении инактивированной полиовакцины со сниженной дозой, содержащий полиовирусы Солка или Сэбина, выполняют следующие этапы:According to the present invention, in the preparation of a reduced dose inactivated polio vaccine containing Salk or Sabin poliovirus, the following steps are performed:

a) производство среды, содержащей полиовирусы;a) production of media containing polioviruses;

b) очищение полиовирусов от среды;b) purification of polioviruses from the environment;

c) стабилизацию очищенных полиовирусов путем введения среды М-199, содержащей глицин;c) stabilization of the purified polioviruses by introducing M-199 medium containing glycine;

d) инактивацию полиовирусов с помощью формальдегида 0,025% при 37°C в течение 5-13 дней с использованием TRIS буфера в концентрации от 30 до 60 мМ для предотвращения или уменьшения скопления частиц полиовируса, в целях снижения потери антигена D после инактивации в 8-10 раз по сравнению с применением фосфатного буфера; иd) inactivation of polioviruses with formaldehyde 0.025% at 37°C for 5-13 days using TRIS buffer at a concentration of 30 to 60 mM to prevent or reduce the accumulation of poliovirus particles, in order to reduce the loss of D antigen after inactivation at 8-10 times compared with the use of phosphate buffer; And

e) адсорбцию инактивированных полиовирусов на адъюванте гидроксиде алюминия, с концентрацией 2-2,5 мг/доза, где адсорбция на гидроксиде алюминия превышает 95% для типа 1, типа 2 и типа 3.e) adsorption of inactivated polioviruses to aluminum hydroxide adjuvant, at a concentration of 2-2.5 mg/dose, where adsorption to aluminum hydroxide is greater than 95% for type 1, type 2 and type 3.

Согласно настоящему изобретению при приготовлении инактивированной полиовакцины со сниженной дозой, содержащей полиовирусы Солка или Сэбина, выполняют следующие этапы:According to the present invention, the preparation of a reduced dose inactivated polio vaccine containing Salk or Sabin polioviruses involves the following steps:

b) очищение полиовирусов от среды;b) purification of polioviruses from the medium;

e) адсорбцию инактивированных полиовирусов на адъюванте гидроксиде алюминия, с концентрацией 2-2,5 мг/доза, где адсорбция на гидроксиде алюминия превышает 95% для типа 1 и типа 3.e) adsorption of inactivated polioviruses on aluminum hydroxide adjuvant, at a concentration of 2-2.5 mg/dose, where adsorption on aluminum hydroxide exceeds 95% for type 1 and type 3.

Согласно настоящему изобретению упомянутая противополиомиелитная инактивированная вакцина со сниженной дозой штамма Солка или Сэбина не содержит штаммов типа 2.According to the present invention, said reduced-dose Salk or Sabin strain inactivated polio vaccine does not contain type 2 strains.

Согласно настоящему изобретению поливалентная вакцина, состоящая из ИПВ со сниженной дозой, может содержать один или более антигенов из патогена, выбранного из следующего списка: гемофилический грипп (Haemophilus influenza) b, менингококк (Neisseria Meningitidis) типа А, менингококк типа С, менингококк типа W, менингококк типа Y, менингококк типа X, менингококк типа В, стрептококк пневмонии (Streptococcus pneumonia), стрептококк агалактиа (Streptococcus agalactiae), сальмонелла тифи (Salmonella typhi), гепатит А, гепатит В, РС-вирус, гепатит С, дифтерийный токсин, столбнячный токсин, цельноклеточный коклюш, бесклеточный коклюш, золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), сибирская язва, холерный вибрион, вирус Зика, вирус Эбола, чикунгунья, лихорадка денге, малярия, корь, свинка, краснуха, бацилла Кальметта-Герена, японский энцефалит, ротавирус, оспа, шигеллиоз, желтая лихорадка, тиф, вирус мозаики цветной капусты, опоясывающий лишай, ветряная оспа, ВПЧ, ВПГ и ВИЧ.According to the present invention, a polyvalent vaccine consisting of reduced dose IPV may contain one or more antigens from a pathogen selected from the following list: Haemophilus influenza b, Meningococcus (Neisseria Meningitidis) type A, Meningococcus type C, Meningococcus type W , meningococcus type Y, meningococcus type X, meningococcus type B, streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumonia), streptococcus agalactia (Streptococcus agalactiae), salmonella typhi (Salmonella typhi), hepatitis A, hepatitis B, PC virus, hepatitis C, diphtheria toxin, tetanus toxin, whole cell pertussis, acellular pertussis, Staphylococcus aureus, anthrax, vibrio cholerae, Zika virus, Ebola virus, chikungunya, dengue fever, malaria, measles, mumps, rubella, Bacillus Calmette-Guerin, Japanese encephalitis, rotavirus , smallpox, shigellosis, yellow fever, typhoid, cauliflower mosaic virus, herpes zoster, chickenpox, HPV, HSV, and HIV.

Перечень фигур, чертежей и иных материаловList of figures, drawings and other materials

Фиг. 1: алюминия фосфата гель, подготовленный в 0,9%-ном растворе NaCl (Зависимость рН от дзета-потенциала при различных концентрациях алюминия фосфата геля).Fig. 1: aluminum phosphate gel prepared in 0.9% NaCl solution (Dependence of pH on zeta potential at various concentrations of aluminum phosphate gel).

Фиг. 2 - алюминия фосфата гель, подготовленный в WFI (Зависимость рН от дзета-потенциала при различных концентрациях алюминия фосфата геля).Fig. 2 - aluminum phosphate gel prepared in WFI (Dependence of pH on zeta potential at various concentrations of aluminum phosphate gel).

Фиг. 3 - алюминия гидроксида гель, подготовленный в 0,9%-ном растворе NaCl (Зависимость рН от дзета-потенциала при различных концентрациях алюминия гидроксида геля).Fig. 3 - aluminum hydroxide gel prepared in 0.9% NaCl solution (Dependence of pH on zeta potential at different concentrations of aluminum hydroxide gel).

Фиг. 4 - алюминия гидроксида гель, подготовленный в WFI (Зависимость рН от дзета-потенциала при различных концентрациях алюминия гидроксида геля).Fig. 4 - aluminum hydroxide gel prepared in WFI (Dependence of pH on zeta potential at various concentrations of aluminum hydroxide gel).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention

Важным объектом настоящего изобретения является тот факт, что вышеупомянутый усовершенствованный процесс инактивации формалином и адсорбции на соли алюминия включает в себя следующие этапы:An important object of the present invention is the fact that the above improved formalin inactivation and aluminum salt adsorption process includes the following steps:

a) добавление очищенного основного вещества ИПВ Сэбина к TRIS буферу (30-50 мМ) с рН от 6,8 до 7,2;a) adding the purified basic substance IPV Sabin to TRIS buffer (30-50 mm) with a pH of 6.8 to 7.2;

b) добавление среды М-199, содержащей глицин (5 г/л), в смесь (а),b) adding M-199 medium containing glycine (5 g/l) to mixture (a),

c) добавление 0,025%-ного формальдегида с помешиванием,c) adding 0.025% formaldehyde with stirring,

d) инкубирование смеси, полученной в этапе (с), при 37°C в течение 5-13 дней на магнитной мешалке,d) incubating the mixture obtained in step (c) at 37°C for 5-13 days on a magnetic stirrer,

е) обработка смеси после инкубирования посредством промежуточной фильтрации (0,22 мкм) на 7 день и конечной фильтрации на 13 день,e) treatment of the mixture after incubation by intermediate filtration (0.22 µm) on day 7 and final filtration on day 13,

f) хранение основного вещества, полученного после этапа (е), при 2-8°C,f) storing the base material obtained after step (e) at 2-8°C,

g) выполнение анализа D-Ag ELISA для определения единиц антигена D,g) performing a D-Ag ELISA to determine antigen D units,

h) взятие требуемого объема, обработанного в автоклаве Al(OH)₃ для получения конечной концен-h) taking the required volume of autoclaved Al (OH) ₃ to obtain the final concentration

- 4 040305 трации Alum (Al+++) 0,8-1,2 мг/доза в контейнере емкостью 50 мл,- 4 040305 Traces Alum (Al+++) 0.8-1.2 mg/dose in a 50 ml container,

i) добавление основного вещества сИПВ со скорректированным D-Ag, и доведение до нужного объема разбавителем (10х М-199+0,5% глицина),i) addition of base substance sIPV with corrected D-Ag, and making up to volume with diluent (10x M-199 + 0.5% glycine),

j) корректировка конечного рН в композиции и получение конечной композиции с рН от 6 до 6,5,j) adjusting the final pH in the composition and obtaining a final composition with a pH of 6 to 6.5,

k) обработка основного вещества композиции посредством магнитного перемешивания в течение ночи при 2-8°C, где инактивация формалином в этапе (а) не происходит в присутствии фосфатного буфера.k) treatment of the main substance of the composition by magnetic stirring overnight at 2-8°C, where the formalin inactivation in step (a) does not occur in the presence of a phosphate buffer.

Первый вариант осуществления настоящего изобретения состоит в том, что упомянутый буфер, используемый при инактивации формальдегидом, может быть выбран из группы, состоящей из TRIS-, TBS-, MOPS-, HEPES- и бикарбонатного буферов.The first embodiment of the present invention is that said buffer used in the formaldehyde inactivation may be selected from the group consisting of TRIS-, TBS-, MOPS-, HEPES- and bicarbonate buffers.

Преимущественный объект первого варианта осуществления состоит в том, что указанная инактивация формальдегидом может происходить в присутствии TRIS-буфера или TBS (TRIS-забуференный раствор) с концентрацией, выбранной из следующих значений: 30, 40 и 50 мм, предпочтительно 40 мм, и с показателем рН, выбранным из следующих значений: 6,8; 6,9; 7; 7,1 и 7,2, предпочтительно от 6,8 до 7,2, где для указанной инактивации не используется фосфатный буфер.An advantageous object of the first embodiment is that said formaldehyde inactivation can take place in the presence of TRIS buffer or TBS (TRIS buffered solution) with a concentration selected from the following values: 30, 40 and 50 mm, preferably 40 mm, and with an exponent pH selected from the following values: 6.8; 6.9; 7; 7.1 and 7.2, preferably 6.8 to 7.2, where no phosphate buffer is used for said inactivation.

Второй вариант осуществления настоящего изобретения состоит в том, что адсорбция инактивированного формалином сИПВ может быть произведена на гидроксиде алюминия, с концентрацией, выбранной из следующих значений: 1,5 мг/доза, 1,8 мг/доза, 2,2 мг/доза, предпочтительно от 2 до 2,4 мг/доза, и с показателем рН, выбранным из следующих значений: 6,2; 6,3; 6,4 и 6,5, предпочтительно 6,5.The second embodiment of the present invention is that adsorption of formalin-inactivated sIPV can be carried out on aluminum hydroxide, with a concentration selected from the following values: 1.5 mg/dose, 1.8 mg/dose, 2.2 mg/dose, preferably 2 to 2.4 mg/dose, and with a pH selected from the following values: 6.2; 6.3; 6.4 and 6.5, preferably 6.5.

Третий вариант осуществления настоящего изобретения состоит в том, что упомянутый усовершенствованный процесс инактивации формалином и адсорбции на гидроксиде алюминия может приводить к восстановлению антигена D после инактивации в диапазоне от 50 до 80%, а процентный показатель адсорбции на гидроксиде алюминия может находиться в диапазоне от 85 до 99%. Одним из объектов третьего варианта осуществления является то, что настоящее изобретение обеспечивает усовершенствованный процесс инактивации формалином и адсорбции на гидроксиде алюминия, что приводит к снижению дозы, по меньшей мере, в 8 раз для штамма Сэбина типа I, и, по меньшей мере, в 3 раза для типа III по сравнению со стандартной дозой 40ДЕ-8ДЕ-32ДЕ. Второй объект третьего варианта осуществления состоит в том, что настоящее изобретение обеспечивает усовершенствованные способы инактивации формальдегидом и адсорбции на гидроксиде алюминия, в результате чего вакцинная композиция содержит:The third embodiment of the present invention is that said improved process of formalin inactivation and adsorption to aluminum hydroxide can result in recovery of D antigen after inactivation in the range of 50 to 80%, and the percentage adsorption to aluminum hydroxide can be in the range of 85 to 99%. One object of the third embodiment is that the present invention provides an improved formalin inactivation and aluminum hydroxide adsorption process that results in a dose reduction of at least 8-fold for the Sabin type I strain, and at least 3 times for type III compared with the standard dose of 40DE-8DE-32DE. The second object of the third embodiment is that the present invention provides improved methods for formaldehyde inactivation and aluminum hydroxide adsorption, whereby the vaccine composition contains:

i) инактивированный полиовирус типа 1 в дозировке по меньшей мере 5 единиц антигена D;i) inactivated poliovirus type 1 at a dosage of at least 5 antigen D units;

ii ) инактивированный полиовирус типа 2 в дозировке по меньшей мере 8 единиц антигена D; и iii) инактивированный тип полиовируса 3 в дозировке по меньшей мере 10 единиц антигена D.ii) inactivated poliovirus type 2 at a dosage of at least 8 units of antigen D; and iii) inactivated poliovirus type 3 at a dosage of at least 10 antigen D units.

Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения состоит в том, что упомянутый адъювант из соли алюминия является гидроксидом алюминия с концентрацией в диапазоне от 1,5 мг/0,5 мл до 2,5 мг/0,5 мл, предпочтительно от 2,100 мг/0,5 мл до 2,4 мг/0,5 мл при рН приблизительно 6,5.The fourth embodiment of the present invention is that said aluminum salt adjuvant is aluminum hydroxide with a concentration ranging from 1.5 mg/0.5 ml to 2.5 mg/0.5 ml, preferably from 2.100 mg/0. 5 ml to 2.4 mg/0.5 ml at a pH of approximately 6.5.

Одним из объектов четвертого варианта осуществления является то, что общее содержание алюминия в трехвалентной вакцине (типа 1, 2 и 3) может составлять 800-1000 мкг, предпочтительно 800 мкг A³⁺ на дозу 0,5 мл, со следующими характерными показателями: по меньшей мере, 400 мкг Al³⁺ для типа 1, по меньшей мере, 200 мкг Al³⁺ для типа 2, по меньшей мере, 200 мкг Al³⁺ для типа 3.One object of the fourth embodiment is that the total aluminum content of the trivalent vaccine (types 1, 2 and 3) can be 800-1000 μg, preferably 800 μg A ³⁺ per 0.5 ml dose, with the following characteristics: at least 400 µg Al ³⁺ for type 1, at least 200 µg Al ³⁺ for type 2, at least 200 µg Al ³⁺ for type 3.

Другой объект четвертого варианта осуществления состоит в том, что указанная композиция полиомиелитной вакцины со сниженной дозой может состоять из штаммов типа 1 и типа 3 без типа 2, при этом дозовый объем может составлять от 0,1 до 0,4 мл.Another object of the fourth embodiment is that said reduced dose polio vaccine composition may consist of type 1 and type 3 strains without type 2, wherein the dose volume may be from 0.1 to 0.4 ml.

Композиции вакцин со сниженной дозой, приготовленные описанными в изобретении способами, могут быть следующими: i) Отдельная сИПВ, в которой антигены могут включать сИПВ типа 1 или сИПВ типа 2, или сИПВ типа 3, или сИПВ типа 1 и 2, или сИПВ типа 1 и 3, или сИПВ типа 2 и 3, или сИПВ типа 1, 2 и 3, или ii) Комбинированные вакцины, содержащие сИПВ, в которых указанные отличные от ИПВ антигены комбинированных вакцин могут быть выбраны из следующего списка, без ограничения: дифтерийный токсин, столбнячный токсин, антиген(ы) цельноклеточного коклюша, антиген(ы) бесклеточного коклюша, поверхностный антиген гепатита В, антиген(ы) гемофилического гриппа, антиген(ы) менингококка (Neisseria meningitidis) А, антиген(ы) менингококка С, антиген(ы) менингококка W-135, антиген(ы) менингококка Y, антиген(ы) менингококка X, буллы или очищенные антиген(ы) менингококка В, антиген(ы) гепатита А, антиген(ы) сальмонеллы тифи, антиген(ы) стрептококка пневмонии.Reduced dose vaccine compositions prepared by the methods described herein may be as follows: i) A single sIPV in which the antigens may include type 1 sIPV or type 2 sIPV or type 3 sIPV or type 1 and 2 sIPV or type 1 sIPV and 3, or sIPV types 2 and 3, or sIPV types 1, 2 and 3, or ii) Combination vaccines containing sIPV, in which said combination vaccine antigens other than IPV can be selected from the following list, without limitation: diphtheria toxin, tetanus toxin, whole cell pertussis antigen(s), acellular pertussis antigen(s), hepatitis B surface antigen, haemophilus influenzae antigen(s), meningococcus (Neisseria meningitidis) A antigen(s), meningococcus C antigen(s), antigen(s) ) meningococcus W-135, meningococcus Y antigen(s), meningococcus X antigen(s), bullae or purified meningococcus B antigen(s), hepatitis A antigen(s), salmonella typhi antigen(s), streptococcus pneumoniae antigen(s) .

Отличные от ИПВ антигены могут быть адсорбированы на соли алюминия, такой как гидроксид алюминия, на соли алюминия, такой как фосфат алюминия, или на смеси гидроксида алюминия с фосфатом алюминия, либо могут быть не адсорбированы.Antigens other than IPV may be adsorbed on an aluminum salt such as aluminum hydroxide, on an aluminum salt such as aluminum phosphate, or on a mixture of aluminum hydroxide and aluminum phosphate, or may not be adsorbed.

Полиовирус может быть выращен в клеточной культуре. Клеточная культура может быть клеточной линией VERO или PMKC (стабильная клеточная линия, полученная из обезьяньей почки). Клетки VERO могут быть удобными микроносителями культуры. После выращивания вирионы могут быть очищены с применением различных способов, таких как ультрафильтрация, диафильтрация и хроматография. До введения пациентам вирусы должны быть инактивированы и это может быть достигнуто посредством обработки формальдегидом.Poliovirus can be grown in cell culture. The cell culture can be a VERO or PMKC cell line (stable cell line derived from monkey kidney). VERO cells can be convenient micro culture carriers. Once grown, the virions can be purified using various methods such as ultrafiltration, diafiltration, and chromatography. Prior to administration to patients, the viruses must be inactivated and this can be achieved by treatment with formaldehyde.

- 5 040305- 5 040305

Композиции могут быть представлены во флаконах, либо в готовых заполненных шприцах. Шприцы могут поставляться с иглами или без игл. Шприц будет содержать одну дозу состава, в то время как флакон может содержать одну или несколько доз (например, 2 дозы).The compositions may be presented in vials or pre-filled syringes. Syringes can be supplied with or without needles. A syringe will contain a single dose of the formulation, while a vial may contain one or more doses (eg 2 doses).

В одном варианте осуществления доза предназначена для человека. В дальнейшем варианте осуществления доза будет предназначена для взрослого, подростка, ребенка старшего или младшего возраста, младенца младше года, при этом она может вводиться посредством инъекции.In one embodiment, the dose is for a human. In a further embodiment, the dose will be for an adult, adolescent, older or younger child, infant under one year of age, and may be administered by injection.

Вакцины, приготовленные по настоящему изобретению, могут быть упакованы в форме однократной дозы или в форме многократной дозы (например, 2 дозы).Vaccines prepared according to the present invention may be packaged in single dose form or in multiple dose form (eg 2 doses).

Упомянутая композиция с многократной дозой может быть выбрана из группы, состоящей из 2 доз, 5 доз и 10 доз. Для форм с многократной дозой более предпочтительны флаконы, чем заполненные шприцы. Эффективные дозовые объемы могут быть установлены по традиционной схеме, но стандартная для человека доза в композиции для инъекции имеет объем 0,5 мл.Said multiple dose composition may be selected from the group consisting of 2 doses, 5 doses and 10 doses. For multiple dose forms, vials are preferred over prefilled syringes. Effective dosage volumes can be set according to the conventional scheme, but the standard human dose in the composition for injection has a volume of 0.5 ml.

ПримерыExamples

Пример 1. Очищение ИПВ Сэбина (сИПВ).Example 1 Purification of Sabin IPV (sIPV).

1) Тангенциальная проточная фильтрация вдоль потока (TFF).1) Tangential flow filtration along the flow (TFF).

Очищенный пул был доведен до концентрации 10Х посредством тангенциальной проточной фильтрации вдоль потока с помощью кассет 100 Kda (0,5 м²) и затем подвергнут диафильтрации в объеме, в 3 раза превышающем полученный объем, фосфатным буфером (40 мМ, рН: 7.0).The purified pool was brought to a concentration of 10X by tangential flow filtration along the flow using cassettes 100 Kda (0.5 m ² ) and then subjected to diafiltration in a volume of 3 times the obtained volume with phosphate buffer (40 mM, pH: 7.0).

2) Колоночная хроматография.2) Column chromatography.

Очищение было проведено методом ионообменной хроматографии (IEC). 10-кратный TFFконцентрат был пропущен через DEAE сефарозу быстрого потока (слабоосновный анионит), в колонке xk-26 с использованием Akta Explorer (GE Healthcare). Отрицательно заряженные примеси, как было обнаружено, оставались на колонке, в то время как вирус полиомиелита собирался в потоке через фосфатный буфер 40 мМ.Purification was carried out by ion exchange chromatography (IEC). The 10x TFF concentrate was passed through a fast flow DEAE Sepharose (weak base anion exchange resin) in an xk-26 column using an Akta Explorer (GE Healthcare). Negatively charged impurities were found to remain on the column while the polio virus was collected in a stream through 40 mM phosphate buffer.

3) Замена на TRIS-буфер.3) Replacement with a TRIS buffer.

В целях сведения к минимуму потерь антигена в достаточно трудоемкой процедуре инактивации (13 дней), для очищенного вирусного пула была произведена замена фосфатного буфера на TRIS-буфер (40 мМ, рН: 7) с помощью системы TFF (100 KDa; 0,1 м²) для очищенного вирусного пула была произведена замена тремя объемами TRIS-буфера.In order to minimize the loss of antigen in a rather laborious inactivation procedure (13 days), the purified viral pool was replaced by phosphate buffer with TRIS buffer (40 mM, pH: 7) using the TFF system (100 KDa; 0.1 m ² ), the purified viral pool was replaced with three volumes of TRIS buffer.

Таблица 1Table 1

Содержание антигена D (Фосфатный буфер 40 мМ при инактивации) Antigen D content (Phosphate buffer 40 mM at inactivation) Содержание антигена D (TRIS-буфер 40 мМ при инактивации) Content of antigen D (TRIS buffer 40 mM at inactivation) Тип 1 Type 1 52,70 ДЕ/мл 52.70 MU/ml 408,19 ДЕ/мл 408.19 MU/ml Тип 2 Type 2 22,63 22.63 180,20 180.20 Тип 3 Type 3 4,21 4.21 21,50 21.50

В случае, когда способы инактивации формальдегидом, в частности производились в присутствии фосфатного буфера, существенные потери антигена D наблюдались для штамма Сэбина типа I. Между тем было обнаружено, что инактивация формальдегидом в присутствии TRIS-буфера привела к минимальной потере антигена D.In the case where formaldehyde inactivation methods, in particular, were carried out in the presence of a phosphate buffer, significant losses of D antigen were observed for Sabin strain type I. Meanwhile, it was found that formaldehyde inactivation in the presence of TRIS buffer resulted in minimal loss of D antigen.

Таблица 2. При инактивации используются различные концентрации TRIS-буфераTable 2. Various concentrations of TRIS buffer are used during inactivation

ЗОмМ ZOMM 40мМ 40mM 50мМ 50mM Тип 1 Type 1 500ДЕ/мл 500 IU/ml 576,80 ДЕ/мл 576.80 MU/ml 585 ДЕ/мл 585 MU/ml Тип 2 Type 2 140 ДЕ/мл 140 MU/ml 165,16 ДЕ/мл 165.16 MU/ml 155 ДЕ/мл 155 MU/ml Тип Type 16 ДЕ/мл 16 DU/ml 21,17 ДЕ/мл 21.17 MU/ml 19 ДЕ/мл 19 MU/ml

TRIS-буфер при концентрации 40 мМ оказался наиболее эффективным в объекте сохранения содержания антигена D для сИПВ 1, 2 и 3.TRIS buffer at a concentration of 40 mM proved to be the most effective in preserving the content of antigen D for sIPV 1, 2 and 3.

С) Определение содержания антигена D посредством анализа ELISA.C) Determination of the content of antigen D by ELISA analysis.

День 1. Нанесение на планшет:Day 1. Application to the tablet:

1. В физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) пипеткой вносилось 100 мкл бычьей антиполиомиелитной сыворотки на лунку.1. Phosphate buffered saline (PBS) was pipetted with 100 µl of bovine anti-polio serum per well.

2. Титрационный микропланшет был запечатан и инкубирован в течение ночи при комнатной температуре.2. The microtiter plate was sealed and incubated overnight at room temperature.

День 2. Блокировка:Day 2. Blocking:

1. Планшеты были промыты (Промывочный/разбавляющий буфер -0,05% твин 20 в PBS с концентрацией 1Х) 3 раза.1. The plates were washed (Wash/dilution buffer -0.05% Tween 20 in PBS at 1X) 3 times.

2. Блокирующий буфер (1% BSA в PBS) вносился пипеткой, по 300 мкл на лунку.2. Blocking buffer (1% BSA in PBS) was pipetted, 300 µl per well.

- 6 040305- 6 040305

3. Планшет был запечатан и инкубирован в течение 45 мин при 37±1°C.3. The plate was sealed and incubated for 45 minutes at 37±1°C.

Введение пробы:Sample introduction:

1. Планшет был промыт 3 раза.1. The plate was washed 3 times.

2. Разбавитель проб вносился по 100 мкл во все лунки, кроме лунки ряда А.2. Sample diluent was applied at 100 µl to all wells except row A.

3. Стандарт вносился по 100 мкл в первые две лунки в колонках 2 и 3.3. The standard was applied at 100 µl to the first two wells in columns 2 and 3.

4. Проба вносилась по 100 мкл в первые две лунки в колонках 4-12.4. The sample was added at 100 µl to the first two wells in columns 4-12.

5. Предварительное разбавление пробы до надлежащей концентрации.5. Pre-dilute the sample to the proper concentration.

6. Разбавитель проб вносился по 100 мкл в первые две лунки в колонке 1.6. Sample diluent was added at 100 µl to the first two wells in column 1.

Последовательное двукратное разбавление в колонке было произведено путем передачи 100 мкл из каждой лунки в соседнюю лунку той же колонки и вывода 100 мкл из последней лунки.A 2-fold serial dilution in a column was made by transferring 100 µl from each well to an adjacent well of the same column and withdrawing 100 µl from the last well.

8. Инкубирование при 37°C в течение 2 ч.8. Incubation at 37°C for 2 hours.

9. Планшеты были оставлены на ночь при 4°C.9. The plates were left overnight at 4°C.

День 3. Введение моноклональных антител:Day 3. Introduction of monoclonal antibodies:

2. Были введены моноклональные антитела по 100 мкл, разбавленные (1:240) для конкретного типа.2. Monoclonal antibodies were injected at 100 µl, diluted (1:240) for a specific type.

3. Планшеты были запечатаны и инкубированы в течение 2 ч при 37°C.3. The plates were sealed and incubated for 2 hours at 37°C.

Конъюгаты:Conjugates:

2. Были введены конъюгаты по 100 мкл, разбавленные (тип 1 - 1:2400, тип 2 - 1:1500, тип 3 1:4800).2. Conjugates were injected at 100 µl, diluted (type 1 - 1:2400, type 2 - 1:1500, type 3 1:4800).

3. Планшет был запечатан и инкубирован в течение 1 ч при 37°C.3. The plate was sealed and incubated for 1 hour at 37°C.

Введение субстрата:Substrate introduction:

1. Был введен ТМВ субстрат по 100 мкл во все лунки.1. TMB substrate was injected at 100 µl into all wells.

2. Смесь была инкубирована при комнатной температуре в течение 10 мин.2. The mixture was incubated at room temperature for 10 minutes.

3. Реакция была остановлена путем введения 100 мкл 2 М H2SO4.3. The reaction was stopped by introducing 100 µl of 2 M H2SO4.

4. Чтение планшета было произведено на 450/630 нм.4. The plate was read at 450/630 nm.

5. Была вычислена концентрация антигена D, с помощью программного обеспечения KC4.5. The D antigen concentration was calculated using the KC4 software.

Пример 3. Адсорбция сИПВ.Example 3 Adsorption of sIPV.

1. 1% А1(ОН)₃ и AlPO₄, обработанные в автоклаве, использовались для подготовки композиций.1. 1% A1(OH) ₃ and AlPO ₄ autoclaved were used to prepare the compositions.

2. Требуемый объем А1(ОН)₃/А1РО₄ был взят для получения необходимой концентрации алюминия в стеклянном флаконе 100 мл.2. The required volume of A1(OH) ₃ /A1PO ₄ was taken to obtain the required concentration of aluminum in a 100 ml glass vial.

3. Была введена основная часть инактивированного полиовируса с известным показателем D-Ag, затем объем был доведен до требуемого разбавителем.3. The bulk of inactivated poliovirus with a known D-Ag was injected, then the volume was adjusted to the required diluent.

4. рН конечной композиции был скорректирован до 6,5 с помощью 1N HCl/NaOH.4. The pH of the final formulation was adjusted to 6.5 with 1N HCl/NaOH.

5. Основная часть композиции была выдержана на магнитной мешалке в течение ночи при 2-8°C.5. The main part of the composition was kept on a magnetic stirrer overnight at 2-8°C.

Пример 4. Исследования предварительной композиции.Example 4 Precomposition Studies.

Различные концентрации А1(ОН)₃ и AlPO4 были подготовлены в 0,9% солевом растворе и в WFI для проверки размера и дзэта-потенциала в зависимости от изменения рН.Various concentrations of A1(OH) ₃ and AlPO4 were prepared in 0.9% saline and in WFI to test size and zeta potential as a function of pH change.

Было отмечено, что дзета-потенциал AlPO4 уменьшается (отрицательное направление) с увеличением рН от 5 до 7,5 в присутствии WFI, а также в солевом растворе (см. фиг. 1 и 2).The zeta potential of AlPO4 was observed to decrease (negative direction) with increasing pH from 5 to 7.5 in the presence of WFI as well as in saline (see FIGS. 1 and 2).

В то же время, дзета-потенциал А1(ОН)₃ в солевом растворе остается неизменным независимо от рН, и концентрации соли А1(ОН)₃ (см. фиг. 3 и 4).At the same time, the zeta potential of A1(OH) ₃ in saline remains unchanged regardless of pH, and the concentration of salt A1(OH) ₃ (see Fig. 3 and 4).

Пример 5. Исследования адсорбции сИПВ на фосфате алюминия и гидроксиде алюминия.Example 5 Adsorption studies of sIPV on aluminum phosphate and aluminum hydroxide.

- 7 040305- 7 040305

Таблица 3. Адсорбция штаммов Сэбина типа 1, 2 и 3 (Титр 1060/доза) на солях алюминия (фосфат алюминия и гидроксид алюминия)Table 3. Adsorption of Sabin strains type 1, 2 and 3 (titer 1060/dose) on aluminum salts (aluminum phosphate and aluminum hydroxide)

Проба Try Титр (на дозу) Titer (per dose) Вирусные частицы (в К) Viral particles (in K) % свобод ных в SUP % free in SUP % адсорбированных на геле % adsorbed on gel Тип 1, АЮНз Type 1, AUNz Контроль Control 5,45 5.45 284 284 НП NP А1+++ 125 мкг/доза A1+++ 125 mcg/dose 4,15 4.15 14 14 4,98 4.98 95,02 95.02 А1++ + 250 мкг/доза A1++ + 250 mcg/dose 3,85 3.85 7 7 2,49 2.49 97,51 97.51 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 3,8 3.8 6,3 6.3 2,24 2.24 97,78 97.78 Тип 1, А1РО₄ Type 1, A1PO ₄ Контроль Control 5,84 5.84 691 691 НП NP А1++ + 125 мкг/доза A1++ + 125 mcg/dose 3,49- 3.49- 3 3 0,43 0.43 99,57 99.57 А1++ + 250 мкг/доза A1++ + 250 mcg/dose 3,09 3.09 1,2 1.2 0,17 0.17 99,83 99.83 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 2,94 2.94 0,87 0.87 0,12 0.12 99,87 99.87 Тип 2, АЮНз Type 2, AUNZ Контроль Control 5,49 5.49 309 309 НП NP А1++ + 125 мкг/доза A1++ + 125 mcg/dose 3,59 3.59 3,89 3.89 1,25 1.25 98,75 98.75 А1++ + 250 мкг/доза A1++ + 250 mcg/dose 3,49 3.49 3,09 3.09 1 1 99 99 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 3,49 3.49 3,09 3.09 1 1 99 99 Тип 2, А1РО₄ Type 2, A1PO ₄ Контроль Control 5,49 5.49 309 309 НП NP А1++ + 125 мкг/доза A1++ + 125 mcg/dose 3,15 3.15 1,41 1.41 0,45 0.45 99,5 99.5 А1++ + 250 мкг/доза A1++ + 250 mcg/dose 3,09 3.09 1,23 1.23 0,39 0.39 99,6 99.6 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 3,09 3.09 1,23 1.23 0,39 0.39 99,6 99.6 Тип 3, АЮНз Type 3, AUNz Контроль Control 5,59 5.59 389 389 НП NP А1++ + 125 мкг/доза A1++ + 125 mcg/dose 4,14 4.14 13,8 13.8 3,54 3.54 96,47 96.47 А1++ + 250 мкг/доза A1++ + 250 mcg/dose 3,94 3.94 8,7 8.7 2,23 2.23 97,77 97.77 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 3,54 3.54 3,4 3.4 0,87 0.87 99,13 99.13 Тип 3, А1РО₄ Type 3, A1PO ₄ Контроль Control 5,59 5.59 389 389 НП NP А1++ + 125 мкг/доза A1++ + 125 mcg/dose 5,34 5.34 218 218 56,04 56.04 43,96 43.96 А1++ + 250 мкг/лоза A1++ + 250 mcg/vine 5,24 5.24 173 173 44,47 44.47 55,53 55.53 А1++ + 500 мкг/доза A1++ + 500 mcg/dose 5,16 5.16 144 144 37,01 37.01 62,9 62.9

НП - неприменимо.NP - not applicable.

- 8 040305- 8 040305

Было обнаружено, что полиовирус Сэбина типа 3 подвергается адсорбции только на 50-60% с использованием алюминия фосфата (AlPO₄). При этом, полиовирус Сэбина типа 3 адсорбируется, по меньшей мере, на 90% с использованием А1(ОН)₃. Таким образом, гидроксид алюминия оказывается более эффективным по сравнению с фосфатом алюминия в отношении адсорбции штаммов Сэбина типа 1, и 3.Sabin type 3 poliovirus has been found to be only 50-60% adsorbed using aluminum phosphate (AlPO ₄ ). At the same time, Sabin type 3 poliovirus is adsorbed by at least 90% using A1(OH) ₃ . Thus, aluminum hydroxide is more effective than aluminum phosphate in terms of adsorption of Sabin strains type 1 and 3.

Пример 6. Исследования иммуногенности сИПВ, адсорбированных на солях алюминия.Example 6 Studies on the immunogenicity of sIPV adsorbed on aluminum salts.

Для проверки иммунной реакции адъювантного сИПВ на крысах был выполнен тест SNT (тест нейтрализации сыворотки). Сыворотка была отделена и использована для проверки присутствия нейтрализующих антител для полиовируса определенного типа. Для подтверждения использовалась контрольная сыворотка. Также было выполнено обратное титрование, чтобы определить число добавленных критических вирусных частиц.To test the immune response of adjuvant sIPV in rats, the SNT test (serum neutralization test) was performed. Serum was separated and used to test for the presence of neutralizing antibodies for a certain type of poliovirus. Control serum was used for confirmation. A back titration was also performed to determine the number of critical viral particles added.

Экспериментальная модель на животных: крысы породы Вистар (возраст 8 недель, масса около 200 г), с соотношением самцов и самок в группе 50%/50%).Animal model: Wistar rats (age 8 weeks, weight about 200 g), with a ratio of males and females in the group 50%/50%.

Способ инокуляции: внутримышечно.Method of inoculation: intramuscularly.

Объем: 0,5 мл.Volume: 0.5 ml.

Забор крови: на 21 день.Blood sampling: on day 21.

Место забора: ретрорбитальный синус.Place of sampling: retroorbital sinus.

Таблица 4. Тип 1Table 4. Type 1

№ кр ыс ы Rat No. Группа 1 Group 1 Группа 2 Group 2 Группа 3 Group 3 Группа 4 Group 4 Группа 5 Group 5 Группа 6 Group 6 Группа? Group? Г руппа 15 Group 15 ком. ИПВ com. IPV 5ДЕ 1,15 мг ОН 5DE 1.15 mg OH 2,5 ДЕ 1,15 мг ОН 2.5 DE 1.15 mg OH 1ДЕ 1,15 мг ОН 1DE 1.15 mg OH 5ДЕ 1,8 мгР04 5DE 1.8 mg P04 2,5 ДЕ 1,8 мгР04 2.5 DE 1.8 mg P04 1ДЕ 1,8 мгРО 1DE 1.8 mgRO Контроль -ve Control -ve SN Т +ve SN T +ve Сыворо точный титр Serum accurate titer SNT SNT Сыв орот очны й титр Syv orot full-time titer SN Т SN T Сыво рото чный титр Serum titer SNT SNT Сыворо точный титр Serum accurate titer SNT SNT Сыво роточ ный титр Serum titer SNT +ve SNT+ve Сыво роточ ный титр Serum titer SN SN Сывор оточн ый титр Whey final titer SN SN Сыво рото чный титр Serum titer 1 1 1 1 (Г2) (G2) 8 8 (1:25 6) (1:25 6) 1 1 (1:2) (1:2) 4 4 (1:16 (1:16 5 5 (1:32) (1:32) 5 5 (1:32) (1:32) 2 2 (1:4) (1:4) 0 0 (<1:2 ) (<1:2 ) 2 2 1 1 (1:2) (1:2) 5 5 (1:32 ) (1:32) 1 1 (1:2) (1:2) 7 7 (1:12 (1:12 8 8 (1:25 6) (1:25 6) 4 4 (1:16) (1:16) 1 1 (1:2) (1:2) 0 0 (<1:2 1 (<1:2 1 3 3 0 0 (<1:2) (<1:2) 7 7 (1:12 8) (1:12 8) 3 3 (1:8) (1:8) 0 0 (<1:2) (<1:2) 4 4 (1:16) (1:16) 6 6 (1:64) (1:64) 0 0 (<1:2) (<1:2) 0 0 (<1:2 (<1:2 4 4 0 0 (<1:2) (<1:2) 11 eleven (1:20 48) (1:20 48) 2 2 (1:4) (1:4) 2 2 (1:4) (1:4) 1 1 (1:2) (1:2) 5 5 (1:32) (1:32) 0 0 (<1:2) (<1:2) 0 0 (<1:2 ) (<1:2 ) 5 5 7 7 (1:128) (1:128) 3 3 (1:8) (1:8) 7 7 (1:12 8) (1:12 8) 5 5 (1:32) (1:32) 6 6 (1:64) (1:64) 4 4 (1:16) (1:16) 1 1 (1:2) (1:2) 0 0 (<1:2 ) (<1:2 ) 6 6 4 4 (1:16) (1:16) 7 7 (1:12 8) (1:12 8) 7 7 (1:12 8) (1:12 8) 1 1 (1:2) (1:2) 5 5 (1:32) (1:32) 6 6 (1:64) (1:64) 3 3 (1:8) (1:8) 0 0 (<1:2 (<1:2 7 7 3 3 (1:8) (1:8) 5 5 (1:32 ) (1:32) 4 4 (1:16 (1:16 1 1 (1:2) (1:2) 8 8 (1:25 (1:25 7 7 (1:128 1 (1:128 1 0 0 (<1:2) (<1:2) 0 0 (<1:2 (<1:2 8 8 1 1 (1:2) (1:2) 7 7 (1:12 (1:12 3 3 (1:8) (1:8) 2 2 (1:4) (1:4) 6 6 (1:64) (1:64) 0 0 (<1:2) (<1:2) 0 0 (<1:2) (<1:2) 0 0 (<1:2 (<1:2 9 9 3 3 (1:8) (1:8) 8 8 (Г.25 (G.25 2 2 (1:4) (1:4) 3 3 (Г.8) (D.8) 8 8 (Г.25 (G.25 4 4 (1:16) (1:16) 4 4 (1:16) (1:16) 0 0 (<1:2 (<1:2 10 10 3 3 (1:8) (1:8) 7 7 (1:12 8) (1:12 8) 4 4 (1:16 ) (1:16 ) 5 5 (1:32) (1:32) 6 6 (1:64) (1:64) 2 2 (1:4) (1:4) 2 2 (1:4) (1:4) 0 0 (<1:2 ) (<1:2 )

Был обнаружен удивительный факт, что ИПВ Сэбина типа 1 адъювантные с использованием гидроксида алюминия с показателем 5ДЕ/доза давали лучшие показатели конверсии сыворотки по сравнению с ИПВ Солка с показателем 40ДЕ/доза и ИПВ Сэбина типа 1 адъювантными с использованием фосфата алюминия с показателем 5ДЕ/доза.Surprisingly, Sabin type 1 IPV adjuvanted with aluminum hydroxide at 5 DU/dose produced better serum conversion rates compared to Salk IPV at 40 DU/dose and Sabin type 1 IPV adjuvanted with aluminum phosphate at 5 DU/dose. .

- 9 040305- 9 040305

Таблица 5. Тип 2Table 5. Type 2

№ крысы Rat No. Группа 1 Group 1 Группа 2 Group 2 Группа 3 Group 3 А1(ОН)₃ адъювантныйA1(OH) ₃ adjuvant 4ДЕ (0,6 мг ОН) 4DE (0.6 mg OH) 8ДЕ (0,6 мг ОН) 8DE (0.6 mg OH) 16ДЕ 0,6 мг ОН 16DE 0.6 mg OH SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer 1 1 3 3 (1:8) (1:8) 4 4 (1:16) (1:16) 7 7 (1:128) (1:128) 2 2 4 4 (1:16) (1:16) 6 6 (1:64) (1:64) 5 5 (1:32) (1:32) 3 3 0 0 (<1:2) (<1:2) 3 3 (1:8) (1:8) 5 5 (1:32) (1:32) 4 4 3 3 (1:8) (1:8) 4 4 (1:16) (1:16) 6 6 (1:64) (1:64) 5 5 (1:32) (1:32) 7 7 (1:128) (1:128) 6 6 (1:64) (1:64) 6 6 6 6 (1:64) (1:64) 4 4 (1:16) (1:16) 9 9 (1:512) (1:512) 7 7 4 4 (1:16) (1:16) 7 7 (1:128) (1:128) 4 4 (1:16) (1:16) 8 8 5 5 (1:32) (1:32) 3 3 (1:8) (1:8) 8 8 (1:256) (1:256) 9 9 7 7 (1:128) (1:128) 8 8 (1:256) (1:256) 8 8 (1:256) (1:256) 10 10 5 5 (1:32) (1:32) 3 3 (1:8) (1:8) 8 8 (1:256) (1:256)

сИПВ типа 2 адъювантные с показателем 8ДЕ/доза давали показатели конверсии сыворотки, эквивалентные ИПВ Солка с показателем 8ДЕ/доза.Type 2 sIPV adjuvanted at 8 DU/dose produced serum conversion rates equivalent to Salk IPV at 8 DU/dose.

Таблица 6. Тип 3Table 6. Type 3

№ крысы Rat No. Г руппа 1 Group 1 Группа 2 Group 2 Группа 3 Group 3 А1(ОН)₃ адъювантныйA1(OH) ₃ adjuvant 10ДЕ 0,6 мг ОН 10DE 0.6 mg OH 5ДЕ 0,6 мг ОН 5DE 0.6 mg OH 2.5ДЕ 0,6 мг ОН 2.5DE 0.6 mg OH SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer SNT +ve SNT+ve Сывороточный титр Serum titer 1 1 3 3 (1:8) (1:8) 2 2 (1:4) (1:4) 0 0 (<1:2) (<1:2) 2 2 0 0 (<1:2) (<1:2) 5 5 (1:32) (1:32) 1 1 (1:2) (1:2) 3 3 2 2 (1:4) (1:4) 3 3 (1:8) (1:8) 1 1 (1:2) (1:2) 4 4 4 4 (1:16) (1:16) 2 2 (1:4) (1:4) 0 0 (<1:2) (<1:2) 5 5 4 4 (1:16) (1:16) 2 2 (1:4) (1:4) 1 1 (1:2) (1:2) 6 6 4 4 (1:16) (1:16) 1 1 (1:2) (1:2) 1 1 (1:2) (1:2) 7 7 9 9 (1:512) (1:512) 0 0 (<1:2) (<1:2) 2 2 (1:4) (1:4) 8 8 7 7 (1:128) (1:128) 2 2 (1:4) (1:4) 2 2 (1:4) (1:4) 9 9 1 1 (1:2) (1:2) 0 0 (<1:2) (<1:2) 1 1 (1:2) (1:2) 10 10 5 5 (1:32) (1:32) 7 7 (1:128 (1:128 1 1 (1:2) (1:2)

Было обнаружено, что сИПВ типа 3 адъювантные с показателем 10ДЕ/доза, дают показатель конверсии сыворотки, эквивалентный ИПВ Солка с показателем 32ДЕ/доза.Type 3 adjuvant sIPV of 10 DU/dose was found to produce a serum conversion rate equivalent to Salk's IPV of 32 DU/dose.

Таблица 7. Максимальное снижение дозы для сИПВ типа 1, 2 и 3, наблюдаемое после проведения исследованийTable 7. Maximum Dose Reductions for Type 1, 2, and 3 siPV Observed Post-Study

сИПВ siPV • Стандартная доза • Standard dose *Доза SIIL *Dose of SIIL Снижение дозы Dose reduction Тип 1 Type 1 40ДЕ 40DE 5 ДЕ 5 DE ~8-кратное ~8 times Тип 2 Type 2 8ДЕ 8DE 8ДЕ 8DE эквивалентное equivalent Тип 3 Type 3 32ДЕ 32DE 10ДЕ 10DE ~3-кратное ~3 times

SIIL: препарат ИПВ со сниженной дозой, произведенный компанией Serum Institute of India.SIIL: A reduced dose IPV formulation manufactured by the Serum Institute of India.

Ввиду множества возможных вариантов осуществления, к которым могут быть применены принципы раскрываемого изобретения, следует понимать, что приведенные ниже описания, содержащие пред- 10 040305 почтительные варианты осуществления, приводятся в качестве примера, но не в качестве исчерпывающего перечня. Множество изменений и модификаций может быть внесено в рамках вариантов осуществления, упомянутых здесь, без отступления от существа таковых. Варианты осуществления, упомянутые в настоящем документе, включают в себя все такие модификации.In view of the many possible embodiments to which the principles of the disclosed invention may be applied, it should be understood that the following descriptions, containing preferred embodiments, are by way of example and not an exhaustive list. Many changes and modifications can be made within the scope of the embodiments mentioned here, without departing from the essence of those. The embodiments mentioned herein include all such modifications.

Имунный ответ адъювантных полиовирусов СэбинаImmune response of adjuvanted Sabin polioviruses

Авторами изобретения установлено, что в случае адъювантных вирусов, когда применяются адъювант в виде гидроокиси алюминия А1(ОН)₃, наблюдается превосходный эффект снижения дозы.The inventors have found that in the case of adjuvanted viruses, when aluminum hydroxide Al(OH) ₃ adjuvant is used, an excellent dose reduction effect is observed.

Если рассматривать режим однократной дозы для проведения иммунизации, то наилучшей комбинацией единиц антигена D для полиовирусов Сэбина типов 1, 2 и 3, соответственно, является комбинация 5-16-10.When considering a single dose regimen for immunization, the best combination of D antigen units for Sabin poliovirus types 1, 2 and 3, respectively, is the combination 5-16-10.

Если рассматривать режим введения двух доз для проведения иммунизации, то наилучший иммунитет обеспечивает комбинация 2,5-8-5 единиц антигена D.Considering a two-dose regimen for immunization, the combination of 2.5-8-5 units of antigen D provides the best immunity.

Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Единицы антигена D штамма Сэбина Sabin strain D antigen units 5 5 16 16 10 10 2.5 2.5 8 8 5 5 7.5 7.5 16 16 10 10

5-16-10 с добавл. А1(ОН)з5-16-10 with added. A1(OH)s

Подтверждающие экспериментальные данные применительно к штамму СэбинаSupportive experimental data for the Sabin strain

2.5-8-5 с добавл. А1(ОН)з2.5-8-5 with added A1(OH)s

Стандарт.доз.Standard dose

Двойн. доз.Double doses.

Стандарт, доз.Standard, doses.

Двойн. доз.Double doses.

7.5 - 16 - 10 с добавл. А1(ОН)з7.5 - 16 - 10 s added. A1(OH)s

Стандарт, доз.Standard, doses.

Двойн. Доз.Double Dos.

No Кры сы no Rats Положит, контроль - Тривал. Солк ИПВ Put control - Trival. Salk IPV Отрицат. контроль Negative control Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. Доз. Double Dos. Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. Доз. Double Dos. Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 1 1 1 1 4 4 2 2 4 4 7 7 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 3 3 0 0 3 3 4 4 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 0 0 5 5 4 4 2 2 4 4 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 0 0 5 5 3 3 6 6 7 7 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 Н/д N/A Н/д N/A Н/д N/A Н/д N/A Н/д N/A Н/д N/A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 2 2 6 6 5 5 1 1 7 7 6 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 7 0 0 6 6 2 2 7 7 10 10 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 8 0 0 5 5 1 1 5 5 8 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 0 0 4 4 2 2 5 5 7 7 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 4 4 5 5 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Имунный ответ адъювантных полиовирусов СолкаImmune response of adjuvanted Salk polioviruses

Если рассматривать режим однократной дозы для проведения иммунизации, то наилучшей комбинацией единиц антигена D для полиовирусов Солка типов 1, 2 и 3, соответственно, является комбинация 8-2-5.When considering a single dose regimen for immunization, the best combination of D antigen units for Salk poliovirus types 1, 2 and 3, respectively, is the 8-2-5 combination.

- 11 040305- 11 040305

Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Единицы антигена D штамма Солка Salk strain D antigen units 8 8 2 2 5 5 5 5 2 2 5 5

Подтверждающие экспериментальные данные применительно к штамму СолкаSupporting experimental data for the Salk strain

Солк 8-2-5 с добавл. А1(ОН)₃ Salk 8-2-5 with added. A1(OH) ₃ Солк 5-2-5 с добавл. А1(ОН)₃ Salk 5-2-5 with added A1(OH) ₃ Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. доз. Double doses. Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. доз. Double doses. Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 3 3 8 8 1 1 9 9 10 10 6 6 2 2 8 8 1 1 10 10 11 eleven 12 12 5 5 6 6 2 2 9 9 12 12 8 8 2 2 6 6 2 2 10 10 10 10 10 10 4 4 7 7 5 5 12 12 11 eleven 12 12 4 4 5 5 2 2 9 9 10 10 И AND 7 7 5 5 6 6 11 eleven И AND 10 10 6 6 7 7 1 1 12 12 12 12 9 9 8 8 6 6 3 3 10 10 12 12 11 eleven 5 5 5 5 5 5 8 8 9 9 6 6 5 5 8 8 4 4 10 10 10 10 9 9 2 2 8 8 4 4 11 eleven 10 10 8 8 2 2 7 7 2 2 8 8 9 9 8 8 3 3 6 6 6 6 8 8 12 12 8 8 4 4 5 5 1 1 9 9 12 12 7 7 6 6 9 9 2 2 9 9 9 9 9 9 5 5 6 6 2 2 8 8 9 9 6 6 2 2 8 8 1 1 10 10 8 8 10 10 3 3 9 9 1 1 12 12 10 10 10 10 1 1 7 7 3 3 12 12 12 12 11 eleven Положит, контроль - Тривал. Солк ИПВ Put control - Trival. Salk IPV Отрицат. контроль Negative control Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. доз. Double doses. Стандарт, доз. Standard, doses. Двойн. доз. Double doses. Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 2 2 8 8 2 2 2 2 6 6 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 10 10 0 0 4 4 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 7 7 3 3 5 5 7 7 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 7 7 5 5 7 7 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 5 5 4 4 3 3 9 9 11 eleven 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 3 3 8 8 9 9 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 10 10 2 2 7 7 8 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Н/п N/A Н/п N/A Н/п N/A 9 9 10 10 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 8 8 4 4 3 3 7 7 6 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 9 9 6 6 3 3 8 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1. Подтверждающие экспериментальные данные применительно к штамму Солка (10-2-5) стандарт. доз.1. Confirming experimental data in relation to the Salk strain (10-2-5) standard. doses.

Полно вакцина Солка 10-2-5 с добавл. адъюванта Fully Salk vaccine 10-2-5 with added. adjuvant Тип 1 Type 1 Тип 2 Type 2 Тип 3 Type 3 1 1 5 5 7 7 3 3 5 5 6 6 4 4 9 9 3 3 4 4 8 8 2 2 3 3 9 9 5 5 1 1 7 7 7 7 3 3 9 9 7 7 3 3 11 eleven 6 6 2 2 9 9 5 5 1 1 10 10 6 6

- 12 040305- 12 040305

2. Подтверждающие экспериментальные данные применительно к штамму2. Confirming experimental data in relation to the strain

4. Подтверждающие экспериментальные данные применительно к штамму Солка (7,5-16-10) стандарт. доз.4. Confirming experimental data in relation to the Salk strain (7.5-16-10) standard. doses.

5.5.

Claims

1. A method for producing a polio vaccine composition with a reduced dose of antigen D containing poliovirus particles of serotypes 1, 2 or 3 in various combinations, while this method contains the following steps:

(a) obtaining poliovirus particles in cell culture using serotypes 1, 2 or 3 alone as inoculum;

(b) separating said poliovirus particles from the culture medium by concentration using tangential flow filtration, as well as diafiltration and ion exchange chromatography on phosphate buffer;

(c) replacing the phosphate buffer with a buffer selected from the group consisting of TRIS, TBS, MOPS, HEPES and bicarbonate buffers, said TRIS buffer being used at a concentration of 3070 mM at a pH of about 6.8 to 7.2;

(d) diluting the said poliovirus particle concentrate thus obtained by introducing into it an M-199 medium containing glycine in an amount of 0.5%;

(e) inactivating said poliovirus particles by introducing 0.025% formaldehyde and incubating the resulting mixture at 37° C. for 13 days, said incubating mixture being filtered using a filter having a pore size of 0.22 µm on day 7 of incubation and after incubation;

(f) determining the titer of antigen D units for poliovirus particles of each serotype;

(g) adsorbing poliovirus particles of various serotypes with an efficiency of at least 95% using an aluminum salt or aluminum hydroxide adjuvant, said aluminum hydroxide being used at a concentration of 1.5 mg per 0.5 ml dose to 2.5 mg per 0.5 ml dose at pH about 6.5;

(h) combining said adsorbed poliovirus particles to form a vaccine composition of a specific valence.

2. The method of claim 1 wherein said poliovirus particles comprise Sabin poliovirus serotypes 1, 2 and 3.

3. The method of claim 1, wherein said poliovirus particles comprise Salk polioviruses of IPV serotype 1 (Mahoney strain), IPV serotype 2 (MEF-1 strain) and/or IPV serotype 3 (Saukett strain).

4. The method of claim 1 wherein said TRIS buffer is used in step (c) at a concentration of preferably 40 mM at a pH of about 6.8 to 7.2.

5. The method of claim 1, wherein said aluminum hydroxide is used in step (g) at a concentration of preferably 2.1 mg per 0.5 ml dose to 2.4 mg per 0.5 ml at a pH of about 6.5.

6. The method according to claim 1, characterized in that said phosphate buffer is replaced with a TRIS buffer in step (c) at a concentration of 30 to 60 mmol, and said aluminum hydroxide is used in step (g) as said adjuvant at a concentration of 2, 0 to 2.5 mg per dose of trivalent vaccine.

7. The method according to claims 1 or 6, characterized in that the total aluminum content in said trivalent vaccine is from 0.8 to 1.2 mg Al ³⁺ , preferably 0.8 mg Al ³⁺ per 0.5 ml dose, wherein the Al ³⁺ content is at least 0.4 mg Al ³⁺ for serotype 1, at least 0.2 mg Al ³⁺ for serotype 2, and at least 0.2 mg Al ³⁺ for serotype 3 of the Sabin strain.

8. The method according to claim 1, characterized in that said TRIS buffer is used in step (c) at a concentration of from 30 to 60 mmol, and said aluminum hydroxide is used in step (g) as said adjuvant at a concentration of from 2.0 to 2.5 mg per dose of bivalent vaccine containing Sabin serotype 1 and serotype 3 poliovirus particles.

9. Polio vaccine composition obtained by the method according to claims 1 to 8, intended for administration using a single dose or double dose regimen, containing from 2.5 to 5 MU of the poliovirus strain of Sabin serotype 1, 8 to 16 MU of the poliovirus strain of Sabin serotype 2 and 5 to 10 IU of Sabin serotype 3 poliovirus per vaccine dose.

10. A polio vaccine composition according to claim 9, characterized in that it contains 5 IU of poliovirus serotype 1, 16 IU of poliovirus serotype 2 and 10 IU of poliovirus serotype 3 per vaccine dose.

11. A polio vaccine composition according to claim 9, characterized in that it contains 2.5 IU of poliovirus serotype 1, 8 IU of poliovirus serotype 2 and 5 IU of poliovirus serotype 3 per vaccine dose.

12. A polio vaccine composition according to claim 9, characterized in that it contains 5 IU of poliovirus serotype 1, 8 IU of poliovirus serotype 2 and 10 IU of poliovirus serotype 3 per vaccine dose.

13. A polio vaccine composition according to any one of claims 9 to 12, characterized in that it further comprises one or more antigens from a pathogen selected from the group consisting of Haemophilus influenza b, meningococcus (Neisseria Meningitidis) type A, meningococcus type C, meningococcus type W, meningococcus type X, meningococcus type Y, meningococcus type B, streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumonia), Salmonella typhi (Salmonella typhi), hepatitis A or hepatitis B, diphtheria toxin, tetanus toxin, pertussis antigen, or contains whole cell pertussis vaccine.