EA040150B1 - Способ получения производных пирроло[3,2-d]пиримидина - Google Patents

Description

Настоящее изобретение относится к производным пирроло[3,2-d]пиримидина, способам их получения, фармацевтическим композициям и их применению в лечении и/или терапии заболеваний.

Настоящее изобретение относится к применению производных пирроло[3,2Щ]пиримидина, более конкретно к применению производных пирроло[3,2Щ]пиримидина в лечении вирусных инфекций, иммунных или воспалительных нарушений, в которые вовлечена модуляция или агонизм толл-подобных рецепторов (TLR). Толл-подобные рецепторы представляют собой основные трансмембранные белки, характеризующиеся внеклеточным доменом, богатым лейцином, и цитоплазматическим расширением, которое содержит консервативную область. Врожденная иммунная система может распознавать патогенассоциированные молекулярные паттерны посредством данных TLR, экспрессируемых на клеточной поверхности определенных типов иммунных клеток. При распознавании чужеродных патогенов активируется выработка цитокинов и повышается экспрессия ко-стимулирующих молекул на фагоцитах. Это приводит к модуляции поведения Т-клеток.

Большинство видов млекопитающих имеют от десяти до пятнадцати типов толл-подобных рецепторов. В общей сложности у человека и мыши было идентифицировано тринадцать TLR (называемых просто TLR1-TLR13), и эквивалентные формы многих из них были обнаружены у других видов млекопитающих. Тем не менее, эквиваленты определенных TLR, обнаруженных у человека, не присутствуют у всех млекопитающих. Например, ген, кодирующий белок, аналогичный TLR10 человека, присутствует у мыши, но, по-видимому, в какой-то момент времени в прошлом был поврежден ретровирусом. С другой стороны, у мыши экспрессируются TLR 11, 12 и 13, ни один из которых не представлен у человека. У других млекопитающих могут экспрессироваться TLR, которые не обнаружены у человека. Другие виды, не являющиеся млекопитающими, могут иметь TLR, отличные от таковых у млекопитающих, о чем свидетельствует TLR14, обнаруженный у рыбы фугу рода Takifugu.

Это может осложнить процедуру использования экспериментальных животных в качестве моделей врожденного иммунитета человека.

Для обзора толл-подобных рецепторов см. следующие публикации в журналах: Hoffmann, J.A., Nature, 426, p.33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., and Kaisho, Т., Annual Rev. Immunology, 21, p.335-376, 2003; Ulevitch, R. J., Nature Reviews: Immunology, 4, p.512-520, 2004.

Ранее были описаны соединения, проявляющие активность в отношении толл-подобных рецепторов, такие как гетероциклические производные в WO 2000/006577, производные аденина в WO 98/01448 и WO 99/28321, а также пиримидины в WO 2009/067081.

При лечении определенных вирусных инфекций могут регулярно вводиться инъекции интерферона (IFN-альфа), как в случае с вирусом гепатита С (HCV). Низкомолекулярные индукторы IFN, доступные для перорального применения, предлагают потенциальные преимущества в виде сниженной иммуногенности и удобства введения. Таким образом, новые индукторы IFN представляют собой потенциально эффективный новый класс лекарственных средств для лечения вирусных инфекций. Пример низкомолекулярного индуктора IFN, обладающего противовирусным эффектом, см. у De Clercq, E.; Descamps, J.; De Somer, P. Science 1978, 200, 563-565.

Интерферон α также вводят пациентам в комбинации с другими лекарственными средствами при лечении определенных типов рака. Агонисты TLR 7/8 также представляют интерес как вакцинные адъюванты благодаря своей способности индуцировать ярко выраженную Th1 реакцию.

Тем не менее, существует острая потребность в новых модуляторах толл-подобных рецепторов, обладающих предпочтительной селективностью, а также улучшенным профилем безопасности, по сравнению с соединениями из известного уровня техники.

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрено соединение формулы (I) и его фармацевтически приемлемая соль, где

R1 представляет собой Н;

R2 представляет собой Н;

R₃ представляет собой C_1-6алкил, замещенный С_1-6алкокси;

или где

R₃ представляет собой СН₂-арил, необязательно замещенный C_1-6алкокси;

R₄ представляет собой С_1-6алкил;

или где

R4 представляет собой СН₂-арил, замещенный С_1-6алкокси, где термин арил означает ароматическую кольцевую структуру, необязательно содержащую один или два гетероатома, выбранных из N, О и S, и указанная ароматическая кольцевая структура может со- 1 040150 держать 5 или 6 атомов в кольце.

Во втором варианте осуществления представлены соединения формулы (I), где и R3 представляет собой СН2-арильные группы, необязательно дополнительно замещенные, как описано выше, а также R1 и

R2 такие, как описаны выше.

Другими предпочтительными вариантами осуществления являются те соединения формулы (I), где R2 представляет собой водород, а R3 и R4 являются такими, как описано выше.

Наиболее предпочтительным соединением является соединение формулы (II) со следующей химической структурой:

Соединения формулы (I) и (II) и их фармацевтически приемлемая соль, их сольват или полиморф обладают активностью фармацевтических препаратов, в частности как модуляторов активности толлподобного рецептора (в особенности TLR7).

В дополнительном аспекте по настоящему изобретению предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемую соль, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями.

Кроме того, соединение формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемую соль, в соответствии с настоящим изобретением, или фармацевтическую композицию, содержащую указанное соединение формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемую соль можно применять в качестве лекарственного препарата.

Другой аспект настоящего изобретения состоит в том, что соединение формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемую соль, или указанную фармацевтическую композицию, содержащую указанное соединение формулы (I) или (II), или его фармацевтически приемлемую соль можно соответственно применять в лечении какого-либо нарушения, в которое вовлечена модуляция TLR7.

Термин алкил относится к насыщенному алифатическому углеводороду с неразветвленной цепью или разветвленной цепью, содержащему определенное количество атомов углерода.

Термин алкокси относится к алкильной группе (цепи из атомов углерода и водорода), связанной одинарной связью с кислородом, как, например, метоксигруппе или этоксигруппе.

Термин арил означает ароматическую кольцевую структуру, необязательно содержащую один или два гетероатома, выбранных из N, О и S, в частности из N и О. Указанная ароматическая кольцевая структура может содержать 5, 6 или 7 атомов в кольце. В частности, указанная ароматическая кольцевая структура может содержать 5 или 6 атомов в кольце.

Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I) и (II) включают их соли присоединения кислоты и основные соли.

Приемлемые соли присоединения кислоты образуются из кислот, которые образуют нетоксичные соли. Приемлемые основные соли образуются из оснований, которые образуют нетоксичные соли.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде кристаллических или аморфных продуктов. Их можно получать, например, в виде твердой прессованной массы, порошков или пленок посредством таких способов как осаждение, кристаллизация, сушка вымораживанием, сушка распылением или сушка выпариванием. Их можно вводить отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими соединениями по настоящему изобретению или в комбинации с одним или несколькими другими лекарственными средствами. Как правило, их будут вводить в виде состава, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями. Термин наполнитель используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличного от соединения (соединений) в соответствии с настоящим изобретением. Выбор наполнителя в большей степени зависит от таких факторов как конкретный способ введения, влияние наполнителя на растворимость, стабильность и природа лекарственной формы.

Соединения по настоящему изобретению или любая их подгруппа могут быть составлены в различные фармацевтические формы для целей введения. В качестве подходящих композиций могут быть упомянуты все композиции, обычно применяемые для системного введения лекарственных средств. Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению эффективное количество конкретного соединения, необязательно в форме соли присоединения, в качестве активного ингредиента объединяют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, при этом носитель может принимать самые разнообразные формы в зависимости от формы препарата, требуемой для введения.

- 2 040150

Данные фармацевтические композиции предпочтительно представлены в виде единичной лекарственной формы, подходящей, например, для перорального, ректального или чрескожного введения. Например, при получении композиций в виде пероральной лекарственной формы можно использовать любую общепринятую фармацевтическую среду, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п., в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры, эмульсии и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, разбавители, смазывающие вещества, связующие вещества, разрыхлители и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Вследствие простоты их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные формы единиц дозирования для перорального введения, в случае которых, как очевидно, применяют твердые фармацевтические носители. Также включены препараты в твердой форме, которые могут быть преобразованы непосредственно перед применением в препараты в жидких формах. В композициях, приемлемых для чрескожного введения, носитель необязательно содержит средство, повышающее проницаемость, и/или приемлемое смачивающее средство, необязательно объединенное с приемлемыми добавками любой природы в минимальных пропорциях, при этом добавки не оказывают значительного вредного воздействия на кожу. Указанные добавки могут облегчать введение в кожу и/или могут быть полезными при получении необходимых композиций. Данные композиции можно вводить различными путями, например в форме трансдермального пластыря, в форме точечного нанесения, в форме мази. Соединения по настоящему изобретению также можно вводить посредством ингаляции или инсуффляции с помощью способов и составов, применяемых в данной области для введения таким путем. Таким образом, в основном соединения по настоящему изобретению можно вводить в легкие в форме раствора, суспензии или сухого порошка.

Особенно предпочтительным является составление вышеуказанных фармацевтических композиций в виде единичной лекарственной формы для простоты введения и равномерности дозирования. Единичная лекарственная форма, как используется в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз, при этом каждая единица содержит заранее установленное количество активного ингредиента, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных лекарственных форм являются таблетки (в том числе делимые или покрытые оболочкой таблетки), капсулы, пилюли, пакетики с порошком, пластинки, суппозитории, растворы или суспензии для инъекций и т.п., а также их отдельные множества.

Специалисты в области лечения инфекционных заболеваний смогут определить эффективное количество, исходя из результатов тестов, представленных далее в данном документе. В целом полагают, что эффективное суточное количество будет составлять от 0,01 до 50 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 0,1 до 10 мг/кг массы тела. Может быть целесообразным введение необходимой дозы в виде двух, трех, четырех или более частей дозы через соответствующие интервалы на протяжении дня. Указанные части дозы могут быть составлены в виде единичных лекарственных форм, например, содержащих 1-1000 мг, и в частности 5-200 мг активного ингредиента на единичную лекарственную форму.

Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного используемого соединения формулы (I), конкретного состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, подлежащего лечению, возраста, веса и общего физического состояния конкретного пациента, а также другого медикаментозного лечения, которое может получать индивидуум, что хорошо известно специалистам в данной области. Более того, очевидно, что эффективное количество может быть снижено или увеличено в зависимости от реакции подвергаемого лечению субъекта и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению. Таким образом, вышеупомянутые диапазоны эффективного количества являются только рекомендациями и не предназначены для ограничения в той или иной мере объема или применения настоящего изобретения.

Экспериментальная часть

Схема 1. Общая схема реакции.

С О

Соединения типа А на схеме 1 могут быть функционализированы с помощью спиртов с использованием условий реакции Мицунобу в полярном апротонном растворителе, например THF. Расщепление

- 3 040150 метилкарбамата осуществляли при основных условиях в 1,4-диоксане с образованием промежуточного соединения С. Осуществляли замещение хлора в С спиртом или основанием (например, NaH) в полярном апротонном растворителе (например, NMP) с образованием соединений типа D.

Получение промежуточного продукта А.

Разделяли 3-амино-2-этоксикарбонилпиррола гидрохлорид (25,8 г, 135,3 ммоль) между дихлорметаном и насыщ. NaHCO₃. Органический слой высушивали над MgSO₄, твердую фазу удаляли путем фильтрации и растворитель фильтрата выпаривали досуха. Остаток растворяли в метаноле (500 мл) вместе с 1,3-бис(метоксикарбонил)-2-метил-2-тиопсевдомочевиной (32,1 г, 156 ммолей) и уксусной кислотой (39 мл, 677 ммоль) и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Появлялся осадок, и перемеши вание продолжали в течение ночи.

Добавляли метилат натрия (73,1 г, 1353 ммоль). Наблюдали экзотермическую реакцию и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Доводили рН смеси до 5 с помощью уксусной кислоты и осадок выделяли посредством фильтрации, растирали на фильтре с водой (2x350 мл), ацетонитрилом (1x350 мл) и диизопропиловым эфиром (1x350 мл). Полученный метил-N-(4-гидрокси-5Н-пирроло[3,2-d]пиримидин2-ил)карбамат сушили в печи.

Метил-N-(4-гидрокси-5Н-пирроло[3,2-d]пиримидин-2-ил)карбамат (25 г, 120 ммоль) распределяли в 350 мл ацетонитрила в 500 мл колбе с несколькими горлышками, оснащенной верхнеприводной мешалкой (300 об/мин) при комнатной температуре. Добавляли POCl₃ (22,1 мл, 238,2 ммоль) и затем реакционную смесь нагревали до 70°С при перемешивании. Добавляли по каплям диизопропилэтиламин (41,4 мл, 240,2 ммоль) с помощью шприцевого насоса при скорости потока 0,2 мл/мин.

Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выливали в перемешиваемый раствор ацетата натрия (78,8 г, 961 ммоль) в воде (500 мл) при 45°С. Органические вещества выпаривали, оставшуюся жидкость перемешивали и охлаждали на ледяной бане. Образовавшееся твердое вещество выделяли посредством фильтрации, промывали ацетонитрилом и растирали с диизопропиловым эфиром с получением промежуточного соединения А, которое сушили в вакууме. LC-MS масса/заряд = 227 (М+Н).

Получение промежуточного соединения В.

Способ 1.

А _В

К суспензии А (500 мг, 2,2 ммоль), бензилового спирта (0,28 мл, 2,6 ммоль) и трифенилфосфина (0,69 г, 2,6 ммоль) в безводном THF (15 мл) добавляли DIAD (0,64 мл, 3,3 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с использованием градиента гептан/этилацетат; от 100-0 до 90-10. Фракции продукта собирали и концентрировали при пониженном давлении. Продукт растирали в порошок в диизопропиловом эфире, выделяли посредством фильтрации и сушили в вакууме до получения В в виде бледно-желтого твердого вещества. LC-MS масса/заряд = 317 (М+Н)

Способ 2 со смолосвязанным трифенилфосфином.

К суспензии А (700 мг, 3,1 ммоля), бензилового спирта (0,39 мл, 3,7 ммоля) и трифенилфосфиновой смолы (2,6 г, 7,7 ммоля) в безводном THF (21 мл) добавляли DIAD (0,90 мл, 4,6 ммоля) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь фильтровали через уплотненный декалит и промывали метанолом. Фильтрат концентрировали in vacuo. Продукт растирали в порошок в диизопропиловом эфире, выделяли посредством фильтрации и сушили в вакууме до получения бледно-желтого твердого вещества, В. LC-MS масса/заряд = 317 (М+Н)

- 4 040150

Получение промежуточного соединения С.

В (738 мг, 2,3 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (11 мл) в 50 мл стеклянной пробирке и добавляли NaOH (5,6 мл, 1 н водн.). Смесь нагревали до 60°С в течение 5 ч. Смесь охлаждали и концентрировали in vacuo. Остаток обрабатывали водой и осадок выделяли посредством фильтрации и сушили в вакууме с получением С в виде твердого вещества. Продукт применяли как таковой на следующем этапе. LC-MS масса/заряд = 259 (М+Н).

Получение 1 и 2.

Способ 1.

Промежуточное вещество С (240 мг, 0,93 ммоль), n-бутиловый спирт (3,2 мл, 35 ммоль) и 4 н HCl в диоксане (0,46 мл, 1,9 ммоль) помещали во флакон на 7 мл для реакций под действием микроволнового излучения. Флакон запечатывали и смесь нагревали в микроволнах при 120°С в течение 10 мин. Смесь охлаждали и концентрировали in vacuo. Остаток нейтрализовали с помощью насыщ. раствора NaHCO₃ и экстрагировали с помощью дихлорметана. Органический слой отделяли, высушивали (MgSO₄), твердые вещества удаляли посредством фильтрации и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Продукт очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле с использованием дихлорметан-метанола с градиентом от 100-0 до 95-5. Лучшие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении. Продукт растирали в диизопропиловом эфире, твердое вещество выделяли посредством фильтрации и сушили в вакууме с получением 1 в виде белого твердого вещества.

Способ 2.

Промежуточное вещество С2 (250 мг, 1,1 ммоль) и 3-гидроксиметил-5-метилизоксазол (0,16 мл, 1,65 ммоль) растворяли в NMP (3 мл) во флаконе на 7 мл. Смесь охлаждали на водяной бане и добавляли NaH (66 мг, 1,65 ммоль, 60% дисперсия в минеральном масле) в условиях N2, смесь перемешивали при 05°С в течение 30 мин, затем смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 2 ч. Затем неочищенную реакционную смесь очищали препаративной HPLC (стационарная фаза: RP Vydac Denali C18 10 мкм, 200 г, 5 см), подвижная фаза: 0,25% раствор NH₄OAc в воде, CH₃CN), необходимые фракции собирали и концентрировали in vacuo. Продукт кристаллизовали из CH₃CN, выделяли посредством фильтрации и высушивали в вакууме с получением белого твердого вещества, 2.

Табл. 1: соединения формулы (I) и соответствующие данные анализа. Соединения получали в соответствии со способами, описанными в экспериментальной части.

- 5 040150

Таблица 1

№	СТРУКТУРА	Щ ЯМР	Способ LC, Rt (минуты)	LC-MS Полученная масса (М+Н)
1	О >=о X X м	Щ ЯМР (400 МГц, DMS0d6) δ ppm 0,85 (t, J=7,37 Гц, ЗН) 1,26 (dq, J=15,02, 7,39 Гц, 2 Η) 1,56-1,63 (m, 2H) 4,30 (t, J=6,38 Гц, 2H) 5,39 (s, 2H) 5,72 (s, 2H) 6,08 (d, J=3,08 Гц, 1H) 7,037,08 (m, 2H) 7,19-7,25 (m, 1H) 7,26-7,32 (m, 2H) 7,48 (d, J=3,08 Гц, 1H)	В, 1,98	297
2	см эЧ о=< Д О z К	Щ ЯМР (400 МГц, DMSOd6) δ ppm 2,41 (d, J=0,66 Гц, 3H) 3,17 (s, 3H) 3,57 (t, J=5,50 Гц, 2H) 4,29 (t, J=5,50 Гц, 2H) 5,50 (s, 2H) 5,82 (s, 2H) 6,03 (d, J=2,86	A, 0,69	304

- 6 040150

		Гц, 1Η) 6,37 (d, J=0,88 Гц, 1H) 7,35 (d, J=2,86 Гц, 1H)
3	°\ ι	ЯМР (400 МГц, DMSOde) δ ppm 2,33-2,38 (m, 3H) 3,79 (s, 3H) 5,34 (s, 2H) 5,38 (s, 2H) 5,75 (s, 1H) 5,86 (s, 2H) 6,12 (d, J=3,08 Гц, 1H) 6,40-6,47 (m, 1H) 6,78 (td, J=7,48, 0, 66 Гц, 1H) 7,00 (d, J=7,92 Гц, 1H) 7,24 (td, J=7,80, 1,80 Гц, 1H) 7,43 (d, J=2,86 Гц, 1H)	B, 1,62	366
4		% ЯМР (400 МГц, DMSOd6) δ ppm 0,77 (t, J=7,4 Гц, 3H) , 1, 12 (dq, J=15,0, 7,4 Гц, 2H), 1,40-1,50 (m, 2H) , 4,21 (t, J=6,4 Гц, 2H), 5,49 (s, 2H), 5,736 (s, 2H), 6,11 (d, J=2,9 Гц, 1H) , 6, 65 (d, J=7, 9 Гц, 1H), 7,21-7,28 (m, 1H), 7,47 (d, J=3,l	A, 0,81	298

- 7 040150

		Гц, 1Н) , 7,69 (td, J=7,7, 1,8 Гц, 1Н), 8,47-8,53 (m, 1Н)
5	χχ 0 0 Ν ™н2	Х ЯМР (400 МГц, DMS0de) δ ppm 2,35 (s, ЗН) 5,37 (s, 2H) 5,47 (s, 2H) 5, 84-5, 90 (m, ЗН) 6,14 (d, J=2,86 Гц, 1H) 6,72 (d, J=7,92 Гц, 1H) 7,24 (dd, J=6,93, 4,95 Гц, 1H) 7,52 (d, J=3,08 Гц, 1H) 7,65 (td, J=7,70, 1,76 Гц, 1H) 8,47 (d, J=4,18 Гц, 1H)	B, 1,29	337
6	сч /Ч Сн Д О к к	X ЯМР (400 МГц, DMSOd6) δ ppm 2,57 (s, 3H) 5,45 (s, 2H) 5,51 (s, 2H) 5,85 (s, 2H) 6,13 (d, J=2,86 Гц, 1H) 6,85 (d, J=7,70 Гц, 1H) 7,22 (dd, J=7,04, 5,06 Гц, 1H) 7,52 (d, J=3, 08 Гц, 1H) 7, 64 (td, J=7,65, 1,65 Гц, 1H) 8,43 (d, J=4,18 Гц, 1H)	B, 1,14	338

- 8 040150

7	__0 J Г} 0^n^nh2 oz |	Щ ЯМР (400 МГц, DMSOde) δ ppm 2,3 6 (s, 3H) 3,74 (s, 3H) 3,71 (s, 3H) 5,29 (s, 2H) 5,40 (s, 2H) 5,85 (s, 2H) 5,93 (s, 1H) 6,12 (d, J=3,08 Гц, 1H) 6,29 (d, J=7,92 Гц, 1H) 7,11 (d, J=7,92 Гц, 1H) 7,50 (d, J=3,08 Гц, 1H)	B, 1,45	397
8	/°ΥΛ 4 < О z Mj r	ЯМР (400 МГц, DMSOd6) δ ppm 2,3 6 (s, 3H) 3,80 (s, 3H) 5,31 (s, 2H) 5,48 (s, 2H) 5,755,81 (m, 3H) 6,07 (d, J=2,86 Гц, 1H) 7,25 (dd, J=8,25, 4,73 Гц, 1H) 7,36-7,41 (m, 2H) 7,90 (dd, J=4,73, 0,99 Гц, 1H)	A, 0,72	367
9	5% P^o^nAh2	Щ ЯМР (400 МГц, DMSOd6} δ ppm 2,23 (d, J=l,10 Гц, 3H) 3,77 (s, 3H) 5,32 (s, 2H) 5,45 (s, 2H) 5,77 (s, 2H) 6,07 (d, J=2,86 Гц, 1H) 6,79 (d, J=l,10 Гц, 1H) 7,21 (dd, J=8,25, 4,73 Гц, 1H) 7,33 (dd, J=8,36,	B, 1,26	367

- 9 040150

		1,32 Гц, 1Н) 7,37 (d, J=2,86 Гц, 1Н) 7,88 (dd, J=4,73, 1,21 Гц, 1Н)
10	я °>=О н кэ	ЯМР (400 МГц, DMSOde) δ ppm 2,34-2,41 (m, ЗН) 5,49 (s, 2H) 5,58 (s, 2H) 5,88 (s, 2H) 6,15 (d, J=2,86 Гц, 1H) 6,72 (d, J=7,92 Гц, 1H) 7,20-7,25 (m, 1H) 7,43 (d, J=l,10 Гц, 1H) 7,52 (d, J=2,86 Гц, 1H) 7,63 (td, J=7,70, 1,76 Гц, 1H) 8,46 (dd, J=4,73, 0,77 Гц, 1H)	B, 1,28	353
11	кэ	гН ЯМР (400 МГц, DMSOd6) δ ppm 2,2 4 (s, 3H) 5,39 (s, 2H) 5,43 (s, 2H) 5,85 (s, 2H) 6,13 (d, J=2,86 Гц, 1H) 6,76 (d, J=7,70 Гц, 1H) 6,81 (s, 1H) 7,21 (dd, J=6,93, 5,17 Гц, 1H) 7,52 (d, J=2,86 Гц, 1H) 7,62 (td, J=7,65, 1,43 Гц, 1H) 8,40-8,45 (m, 1H)	B, 1,18	337

Аналитические методы

LCMS. Общая процедура.

Измерения в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) проводили с помощью насоса для LC, детектора на диодной матрице (DAD) или УФ-детектора и колонки, как определено в соответствующих способах. При необходимости включали дополнительные детекторы (см. приведенную ниже таблицу способов).

Поток из колонки направляли в масс-спектрометр (MS), который был оснащен источником ионизации атмосферного давления. В компетенции специалиста в данной области находилась установка настраиваемых параметров (например, диапазона сканирования, минимального времени измерения и т.п.) с целью получения ионов, обеспечивающих определение номинального моноизотопного молекулярного веса (MW) соединения. Сбор данных проводили с помощью соответствующего программного обеспечения.

Соединения описывали по их экспериментальному времени удерживания (Rt) и ионам. Если не указано иное, в таблице данных указанный молекулярный ион соответствует [М+Н]+ (протонированная молекула) и/или [М-Н]- (депротонированная молекула). В случае если соединение не было непосредственно способно к ионизации, указывали тип аддукта (т.е. [M+NH₄]+, [М+НСОО]- и т.п.). Для молекул со сложными изотопными распределениями (Br, Cl..) описанное значение является таковым, которое получено для наименьшей изотопной массы. Все результаты получали с экспериментальными погрешностями, которые обычно ассоциированы с применяемым способом.

Далее в настоящем документе SQD означает одиночный квадрупольный детектор, MSD означает масс-селективный детектор, к.т. означает комнатную температуру, ВЕН означает мостиковый гибрид этилсилоксан/диоксид кремния, DAD означает детектор на диодной матрице, HSS означает ди- 10 040150 оксид кремния повышенной прочности, Q-Tof означает квадрупольные времяпролетные массспектрометры, CLND, означает хемилюминесцентный азотный детектор, ELSD означает испарительный детектор светорассеяния,

Коды способов LC-MS (поток выражен в мл/мин; температура колонки (Col T) в °С; время анализа в минутах).

Код спосо ба	Прибор	Колонка	Подвижная фаза	Градиент	Пото к Т коло нки	Время анализа
А	Waters: Acquity® UPLC® -DAD и SQD	Waters : ВЕН C18 (1,7 MKM, 2,1*50 mm)	A: 10 мМ ch3coonh4 в 95% H2O + 5% CH3CN B: CH3CN	От 95% A до 5% A за 1,3 мин., выдержив ание в течение 0,7 мин.	0, 8 55	2
В	Waters : Acquity® UPLC® -DAD и SQD	Waters : HSS T3 (1,8 MKM, 2,1*100 mm)	A: 10 мМ ch3coonh4 в 95% H2O + 5% CH3CN B: CH3CN	От 100% А до 5% А за 2,10 мин., до 0% А за 0, 90 мин., до 5% А за 0,5 мин.	0, 8 55	3,5

Биологическая активность соединений формулы (I) и (II) Описание биологических анализов

Оценка активности TLR7 и TLR8.

Способность соединений активировать TLR7 и/или TLR8 человека оценивали в клеточном анализе репортерного гена с использованием клеток HEK293, временно трансфицированных вектором экспрессии TLR7 или TLR8 и репортерной конструкцией NFkB-luc.

Вкратце, клетки HEK293 выращивали в культуральной среде (DMEM, дополненной 10% FCS и 2 мМ глутамина). Для трансфекции клеток в 15 см чашках клетки отделяли трипсином-EDTA, трансфицировали смесью плазмиды CMV-TLR7 или TLR8 (1700 нг), плазмиды NFkB-luc (850 нг) и трансфекционного реагента и инкубировали в течение 48 ч при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Трансфицированные клетки затем отмывали в PBS, отделяли трипсином-EDTA и ресуспендировали в среде с плотностью 1,25x105 клеток/мл. Затем распределяли в каждую лунку 40 мкл клеток в 384-луночных планшетах, где уже содержалось 200 нл соединения в 100% DMSO. После 6 ч инкубации при 37°С, 5% СО₂, определяли люциферазную активность путем добавления в каждую лунку 15 мкл субстрата Steady Lite Plus (Perkin Elmer) и выполняли считывание показаний на устройстве для визуализации микропланшетов ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Кривые зависимости доза-эффект строили на основе измерений, выполненных в четырех повторностях. Для каждого соединения определяли значения наиболее низких эффективных концентраций (LEC), определяемых как концентрация, которая индуцирует эффект по меньшей мере в два раза превышающий стандартное отклонение анализа.

Токсичность соединений определяли параллельно в 384-луночных планшетах с использованием аналогичной серии разведений соединения с клетками, трансфицированными только конструкцией CMV-TLR7 (1,25x105 клеток/мл), из расчета 40 мкл на лунку. Жизнеспособность клеток измеряли после 6 ч инкубации при 37°С, 5% СО₂, путем добавления 15 мкл ATP lite (Perkin Elmer) на лунку и считывания показаний на устройстве для визуализации микропланшетов ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Данные отмечали в виде CC₅₀.

- 11 040150

Параллельно использовали аналогичную серию разведения соединения (200 нл соединения в 100% DMSO) с клетками, трансфицированными только репортерной конструкцией NFkB-luc (1,25x105 клеток/мл), из расчета 40 мкл на лунку. Через 6 ч после инкубации при 37°С, 5% СО₂, определяли люциферазную активность путем добавления 15 мкл субстрата Steady Lite Plus (Perkin Elmer) в каждую лунку и выполняли считывание показаний на устройстве для визуализации микропланшетов ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Данные обратного скрининга отмечали в виде LEC.

Активация промоторных элементов ISRE

Способность соединений индуцировать IFN-I также оценивали посредством определения активации интерферон-зависимых регуляторных элементов (ISRE) при использовании кондиционированных сред от РВМС. Элемент ISRE с последовательностью GAAACTGAAACT высокочувствителен к фактору транскрипции STAT1-STAT2-IRF9, активируемому после связывания IFN-I с его рецептором IFNAR (Clontech, PT3372-5W). Плазмида pISRE-Luc от Clontech (№ по кат. 631913) содержит 5 копий данного элемента ISRE, за которыми следует ORF люциферазы светлячка. Получали клеточную линию HEK293, стабильно трансфицированную pISRE-Luc (HEK-ISREluc), для анализа кондиционированных сред клеточной культуры РВМС.

Вкратце, РВМС получали из лейкоцитарных пленок по меньшей мере двух доноров с применением стандартного протокола центрифугирования с фиколлом. Выделенные РВМС ресуспендировали в среде RPMI, дополненной 10% сыворотки АВ человека, и 2x105 клеток/лунка распределяли в 384-луночных планшетах, содержащих соединения (общий объем 70 мкл). После инкубации в течение ночи 10 мкл надосадочной жидкости переносили в 384-луночные планшеты, содержащие 5x103 клеток HEKISREluc/лунка в 30 мкл (высеянных за день до этого). После 24 ч инкубации активацию элементов ISRE измеряли посредством проведения анализа люциферазной активности с использованием 40 мкл/лунка субстрата Steady Lite Plus (Perkin Elmer) и измеряли с помощью устройства для визуализации микропланшетов ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Стимулирующую активность каждого соединения в отношении клеток HEK-ISREluc отмечали в виде величины LEC, определяемой как концентрация соединения, вносимая на РВМС, которая приводит к люциферазной активности, превышающей по меньшей мере в два раза стандартное отклонение анализа. LEC, в свою очередь, указывает на степень активации ISRE при переносе определенного количества культуральной среды РВМС. Рекомбинантный интерферон а-2а (Roferon-A) использовали в качестве стандартного контрольного соединения.

Табл. 2: активность соединений формулы (I).

Все соединения демонстрировали СС₅₀>24 мкМ.

Таблица 2

№	TLR 7 человека (LEC), мкМ	TLR 8 человека (LEC) мкМ	HEK-ISRE luc (LEC) мкМ
1	0, 6	>25	0,4
2	2,7	>25	0,5
3	0, 1	>25	0, 03
4	1,4	>25	0, 6
5	0, 4	>25	0, 1
6	3, 9	>25	2
7	0, 08	>25	0, 03
8	0, 03	>25	0, 01
9	0, 07	>25	NA
10	0, 5	>25	NA
11	0, 6	>25	NA

NA = данные отсутствуют

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения соединения формулы (I)

   и его фармацевтически приемлемой соли, где

   - 12 040150

   R₁ представляет собой Н;

   R₂ представляет собой Н;

   R₃ представляет собой C₁.₆алкил, замещенный С1.₆алкокси;

   или R₃ представляет собой СН₂-арил, необязательно замещенный С1.₆алкокси; и

   R4 представляет собой С1.₆алкил;

   или R4 представляет собой СН₂-арил, замещенный C₁.₆αлкилом;

   где термин арил означает ароматическую кольцевую структуру, необязательно содержащую один или два гетероатома, выбранных из N, О и S, и указанная ароматическая кольцевая структура может содержать 5 или 6 атомов в кольце;

   включающий

   1) взаимодействие соединения формулы (А)

   с R3-OH, с получением соединения формулы (В)
2. 2) взаимодействие соединения формулы В с основанием, с получением соединения формулы (С)
3. 3) взаимодействие соединения формулы С с R4-OH, с получением соединения формулы (I).

   2. Способ по п.1, где R₃ представляет собой

   необязательно замещенный алкокси.

   3. Способ по п.1, где R4 выбирают из группы, включающей

   4. Способ по п.1, где соединение формулы (I) выбирают из группы, включающей

   - 13 040150

   5. Способ по п.1, где соединение формулы (I) имеет следующую химическую структуру:

   6. Способ по п.1, где стадия 1 включает взаимодействие соединения формулы (А) и R₃-OH с диизопропиловым эфиром азодикарбоновой кислоты (DIAD) и трифенилфосфином.

   7. Способ по п.1, где стадия 3 включает взаимодействие соединения формулы (С) и R4-OH с кислотой при нагревании.

   8. Способ по п.1, где стадия 3 включает взаимодействие соединения формулы (С) и R4-OH с основанием.

   Евразийская патентная организация, ЕАПВ