EA036949B1 - Биологически расщепляемые тетрапептидные связывающие агенты - Google Patents

Биологически расщепляемые тетрапептидные связывающие агенты Download PDF

Info

Publication number
EA036949B1
EA036949B1 EA201792101A EA201792101A EA036949B1 EA 036949 B1 EA036949 B1 EA 036949B1 EA 201792101 A EA201792101 A EA 201792101A EA 201792101 A EA201792101 A EA 201792101A EA 036949 B1 EA036949 B1 EA 036949B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
peg
tetrapeptide
polyamine
aena
Prior art date
Application number
EA201792101A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201792101A1 (ru
Inventor
Джеффри С. Карлсон
Андрей В. Блохин
Original Assignee
Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201792101A1 publication Critical patent/EA201792101A1/ru
Publication of EA036949B1 publication Critical patent/EA036949B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Описаны тетрапептидные линкеры для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению. Также описаны соединения, содержащие тетрапептидные линкеры, и способы применения тетрапептидных линкеров.

Description

Уровень техники
Физиологически лабильные линкеры или модификаторы являются подходящими для множества процессов, включая доставку терапевтических лекарственных средств. Практическая ценность линкера или модификатора может быть дополнительно усилена, если в результате расщепления линкера образуется по меньшей мере один из исходных компонентов в немодифицированном состоянии, не содержащий малейшего количества линкера или модификатора.
В клинических и доклинических условиях было исследовано несколько стратегий обратимого связывания или модификации соединения. Такие обратимые конъюгаты применяют для уменьшения токсичных эффектов и улучшения фармакологических свойств соединения. Для того чтобы являться эффективным, обратимый конъюгат должен оставаться стабильным в сосудистом русле и при этом обеспечивать высвобождение соединения после взаимодействия конъюгата с клеткой-мишенью. Кроме того расщепление линкера или модификатора должно происходить таким образом, при котором соединение может достичь своей биохимической мишени и эффективно с ней взаимодействовать. Часто необходимо высвобождение соединения в немодифицированном состоянии.
Примеры обратимых конъюгатов включают пролекарства - производные лекарственных средств, которые остаются неактивными в своей прототипной форме, но метаболизируются в организме с получением активных лекарственных средств, и носители, такие как конъюгаты антитела с лекарственным средством. Было показано, что образование обратимых конъюгатов является подходящим при разработке противоопухолевых химиотерапевтических лекарственных средств и при доставке нуклеотидов.
Rozema с соавт. (патент США 8137695) продемонстрировали обратимую модификацию полиаминов с применением диметилмалеиновых ангидридов, которые образуют pH-чувствительные малеамидные связи. Доставка модифицированного полимера в клетки и интернализация приводит к расщеплению малеамидной связи в условиях пониженного pH эндосом с регенерацией полимерных аминов.
Помимо pH-чувствительных связей были разработаны пептидсодержащие связи, которые активируются протеазами in vivo. Rozema с соавт. (патент США 8426554) предложили способ обратимой регуляции активности мембраноактивных полиаминов по разрушению мембран с применением стерических стабилизаторов или нацеливающих групп, конъюгированных с полимерными аминосодержащими боковыми цепями посредством дипептидного спейсера п-амидобензил-карбамата (РАВС). Согласно опубликованному дизайну в присутствии протеолитических ферментов гидролиз анилидовой связи запускает каскад 1,6-отщепления, который приводит к получению немодифицированного поликатионного полимера с восстановленными мембранолитическими свойствами.
Применение саморасщепляющегося спейсера РАВС при разработке пролекарств впервые было предложено Carl с соавт. (1981). В данной стратегии объединяют расщепление ковалентной анилидовой связи со спонтанным высвобождением целевого субстрата. Спейсеры РАВС интенсивно исследовали в отношении контролируемого высвобождения лекарственного средства из терапевтического агента, в особенности, в случае противораковой терапии (Dorywalska et al., 2015, Zhang et al., 2014, Florent et al., 1998, Toki et al., 2002, Shamis et al., 2004, Amir et al., 2005, Amir et al., 2005, Gopin et al., 2006, Zhang et al., 2013, Zhang et al., 2013). Однако существует опасение, что аза-хинонметид, также известный как хинониминметид (QIM), образующийся в процессе отщепления РАВС, может являться источником токсичности в связи с его свойством вступать в реакцию с N-, О- и S-нуклеофилами (Reboud-Ravaux et al., 2009).
1,6-отщепление /=\ --------ην=( ύ= + со2 + H2N—r2 хинониминметид
Были описаны определенные пептидные пролекарства, поддающиеся протеолизу, в которых отсутствует спейсер PABC (Zhong et al., 2013, Cho KY et al., 2012). Однако ограничение ранее описанных пептидных пролекарств, поддающихся протеолизу, заключается в том, что компонент родительского лекарственного средства, который представляет собой первичный амин, не высвобождается из данных пролекарств со скоростью, сравнимой с таковой аналогов на основе саморасщепляющегося PABC. Отщепление С-концевого аминокислотного остатка эндопептидазами в течение протеолиза пролекарства, как представляется, является стадией, лимитирующей скорость реакции (Masquelier et al. 1980, Schmid et al., 2007, Schmid et al., 2007, Elsadek et al., 2010, Trouet et al., 1982).
Краткое описание изобретения
В настоящей заявке описаны тетрапептидные линкеры для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению. Физиологически расщепляемые линкеры содержат тетрапептид, имеющий общую формулу: -А4-А3-А2-А1-, где А4 представляет собой гидрофобную Lаминокислоту, А3 представляет собой гидрофильную L-аминокислоту, А2 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, и А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин. Тетрапептидные линкеры расщепляются (перерабатываются) протеолитическими ферментами, такими как эндоген
- 1 036949 ные протеазы, присутствующие в организме, в особенности, млекопитающего, в ткани, клетке или внутриклеточном компартменте или органелле. Кроме того протеолитические ферменты легко и быстро расщепляют пептидную связь с С-концевой стороны А1 с высвобождением аминосодержащего второго соединения. Также описаны композиции, содержащие описанные тетрапептидные линкеры, и способы применения тетрапептидов для обратимого присоединения двух фрагментов или обратимой модификации амина или аминосодержащего соединения. Описанные обратимые линкеры и модификаторы обеспечивают возможность модификации, стабильной в сыворотке, и могут расщепляться in vivo.
В настоящей заявке описаны тетрапептидные связывающие агенты, содержащие: R5-A4-A3-A2-A1R7, где R5 содержит первое соединение, А4 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, А3 представляет собой гидрофильную L-аминокислоту, А2 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, и А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин, и R7 представляет собой аминореактивную группу. R7 выбирают таким образом, что в результате реакции с амином или аминосодержащим соединением образуется амидная связь с А1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А3 представляет собой полярную незаряженную L-аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрапептидные связывающие агенты можно использовать для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему соединению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрапептидные связывающие агенты можно использовать для обратимой модификации аминосодержащего соединения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрапептидные связывающие агенты можно использовать для обратимой модификации полиамина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полиамин представляет собой мембраноактивный полиамин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения авторы настоящего изобретения описали композиции, содержащие первое соединение, присоединенное ко второму соединению посредством тетрапептидного связывающего агента, причем тетрапептидный связывающий агент состоит из A4A3A2A1, где А4 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, А3 представляет собой гидрофильную L-аминокислоту, А2 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин, и А1 присоединен ко второму соединению посредством амидной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А3 представляет собой полярную незаряженную L-аминокислоту. Расщепление (переработка) тетрапептида протеолитическими ферментами in vitro или in vivo приводит к расщеплению между А1 и вторым соединением с высвобождением второго соединения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения A4A3A2A1 содержит последовательность: FCitFP (SEQ ID NO: 12), VCitFP (SEQ ID NO: 19), ACitFP (SEQ ID NO: 3), FKFP (SEQ ID NO: 16), FCitVP (SEQ ID NO: 13), FCitFL (SEQ ID NO: 11), FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9) или FCitAP (SEQ ID NO: 8), где F представляет собой L-фенилаланин, Cit представляет собой L-цитруллин, P представляет собой L-пролин, V представляет собой L-валин, А представляет собой L-аланин, K представляет собой L-лизин, L представляет собой L-лейцин, (Nme)A представляет собой L-N-метилаланин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны композиции, содержащие обратимо модифицированные полиамины. Полиамины модифицированы посредством обратимой модификации множества аминов в полиамине описанными в настоящей заявке тетрапептидными связывающими агентами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полиамин представляет собой амфипатический мембраноактивный полиамин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит триггер РНКи. Полиамин может быть присоединен к триггеру РНКи ковалентным способом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связь для ковалентного присоединения полиамина к триггеру РНКи включает физиологически лабильную связь, такую как дисульфидная связь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полиамин не присоединен к триггеру РНКи ковалентным способом, и триггер РНКи присоединен ковалентным способом к нацеливающей группе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны способы присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению, причем указанные способы включают: присоединение первого соединения к аминоконцу тетрапептида и образование амидной связи между карбоксиконцом тетрапептида и аминосодержащим вторым соединением, причем тетрапептид содержит аминокислотную последовательность A4A3A2A1, где А4 представляет собой гидрофобную Lаминокислоту, А3 представляет собой гидрофильную L-аминокислоту, А2 представляет собой гидрофобную L-аминокислоту, и А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А4 представляет собой фенилаланин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А3 представляет собой полярную незаряженную L-аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полярная незаряженная аминокислота представляет собой L-цитруллин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А2 представляет собой фенилаланин. Согласно некоторым вариантам реализа
- 2 036949 ции настоящего изобретения А1 представляет собой пролин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрапептидный линкер или связывающий агент содержит последовательность из четырех аминокислот, которая выбрана из группы, состоящей из: FCitFP (SEQ ID NO: 12), VCitFP (SEQ ID NO: 19), ACitFP (SEQ ID NO: 3), FKFP (SEQ ID NO: 16), FCitVP (SEQ ID NO: 13), FCitFL (SEQ ID NO: 11), FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9), FCitAP (SEQ ID NO: 8), где F представляет собой L-фенилаланин, Cit представляет собой L-цитруллин, P представляет собой L-пролин, V представляет собой L-валин, А представляет собой L-аланин, K представляет собой Lлизин, L представляет собой L-лейцин, (Nme)A представляет собой L-N-метилаланин.
В настоящей заявке описано применение тетрапептида фенилаланин-цитруллин-фенилаланинпролин (FCitFP (SEQ ID NO: 12)) для получения физиологически расщепляемого линкера. Линкер FCitFP быстро расщепляется протеолитическими ферментами в организме млекопитающего, ткани млекопитающего, клетке млекопитающего или внутриклеточном компартменте или органелле млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминосодержащее соединение присоединено к пролину посредством амидной связи. С-концевая амидная связь пролина эффективно расщепляется протеазами in vivo с высвобождением аминосодержащего соединения.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первое соединение может быть выбрано из группы, состоящей из: нацеливающей группы, лиганда рецептора клетки, лиганда интегрина, лиганда RGD, миметика RGD, лиганда асиалогликопротеинового рецептора (ASGPr), галактозы, производного галактозы, N-ацетилгалактозамина, фолата, стерического стабилизатора, полиэтиленгликоля (PEG), полинуклеотида, полимера, полиамина, антитела, лекарственного средства, гаптена, дигоксигенина, витамина, биотина, флуорофора, антитела, моноклонального антитела и фрагмента антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминосодержащее второе соединение может быть выбрано из группы, состоящей из: нацеливающей группы, лиганда рецептора клетки, лиганда интегрина, лиганда RGD, миметика RGD, лиганда асиалогликопротеинового рецептора (ASGPr), галактозы, производного галактозы, N-ацетилгалактозамина, фолата, стерического стабилизатора, полиэтиленгликоля (PEG), полинуклеотида, полимера, полиамина, антитела, лекарственного средства, гаптена, дигоксигенина, витамина, биотина, антитела, моноклонального антитела и фрагмента антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны композиции для доставки триггера РНКи в клетку in vivo.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Структуры некоторых компонентов, использованных для получения или исследования описанных тетрапептидных линкеров.
Фиг. 2. График, иллюстрирующий: А) скорость ферментативного расщепления соединения 39 и В) скорость ферментативного расщепления соединения 29.
Фиг. 3. График, иллюстрирующий кинетику реакции для соединений 29 и 39, скорости образования промежуточных продуктов (%) в течение времени (ч) (С=цитруллин).
Подробное описание изобретения
Описаны тетрапептидные линкеры и тетрапептидные связывающие агенты, подходящие для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению и/или для обратимой модификации аминосодержащего второго соединения. Описанные тетрапептидные линкеры де монстрируют улучшенную кинетику расщепления по сравнению с ранее описанными пептидными линкерами, использованными для доставки пролекарств (Rejmanova et al., 1983, Malugin et al., 2007, Miller et al., 2009, Soler et al., 2015, Chu et al., 2012). Тетрапептидные линкеры являются стабильными в отношении гидролиза при отсутствии протеолитических ферментов. В присутствии протеолитических ферментов (также называемых протеиназами, протеазами или пептидазами) тетрапептид легко расщепляется in vitro или in vivo. Более конкретно, описанные тетрапептидные линкеры и тетрапептидные связывающие агенты быстро расщепляются между карбоксиконцевой аминокислотой тетрапептида и аминосодержащим вторым соединением с высвобождением аминосодержащего второго соединения.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны тетрапептидные линкеры, причем указанные тетрапептидные линкеры содержат структуру, представленную формулой:
- 3 036949 где
R4 представляет собой R-группу (боковую цепь) природной, неприродной изомерной или синтетической гидрофобной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
R3 представляет собой R-группу (боковую цепь) незаряженной гидрофильной или основной гидрофильной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет -28 или менее, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы), и
R2 представляет собой R-группу (боковую цепь) природной, неприродной изомерной или синтетической гидрофобной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из: -СНз, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -СН(СНз)СН2СНз и -CH2C6H6 (фенилаланин).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R3 выбран из группы, состоящей из: -(CH2)3NHC(=O)NH2, -CH2CONH2, -(CHW и -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R3 представляет собой -(CH2)3NHC(=O)NH2.
После воздействия протеаз in vivo, например, в лизосоме, С-концевая амидная связь тетрапептида быстро расщепляется (перерабатывается).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрапептидные линкеры содержат структуру, представленную формулой:
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны биологически лабильные соединения, причем указанные биологически лабильные соединения содержат первое соединение, присоединенное к аминосодержащему второму соединению посредством тетрапептидного линкера, содержащего:
R5-A4-A3-A2-A1-R6 (формула IV), где
R5 представляет собой первое соединение,
R6 представляет собой аминосодержащее второе соединение,
А4 представляет собой природную, неприродную изомерную или синтетическую гидрофобную Lаминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
А3 представляет собой незаряженную или основную гидрофильную L-аминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет -28 или менее, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
А2 представляет собой природную, неприродную изомерную или синтетическую гидрофобную Lаминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин, и
А1 присоединен к R6 посредством амидной связи.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -СН(СНз)СН2СНз или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3+ или -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 представляют собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-цитруллин (FCitFP (SEQ ID NO: 12)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-лизин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FKFP (SEQ ID NO: 16)).
- 4 036949
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-валин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой Lфенилаланин (FCitVP (SEQ ID NO: 13)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-валин (VCitFP (SEQ ID NO: 19)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-аланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitAP (SEQ ID NO: 8)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-аланин (ACitFP (SEQ ID NO: 3)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой лейцин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-фенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -СН(СНз)СН2СНз или -C^CeHe, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин, или L-лизин, или L-аргинин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3+, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lлейцин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitFL (SEQ ID NO: 11)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -CH(CH3)CH2CH3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин, L-лизин, L-аргинин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, или -(CH2)4NH3 +, или -(CH2)4NH3 +, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R5 содержит соединение, которое выбрано из перечня, включающего стерический стабилизатор, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O0i-(CH2)o-2-, PEGi-ιοο» нацеливающую группу, лиганд рецептора клетки, интегрин-связывающий лиганд, лиганд RGD, миметик RGD, лиганд асиалогликопротеинового рецептора (ASGPr), галактозу, производное галактозы, N-ацетилгалактозамин, фолат, полинуклеотид, полимер, полиамин, антитело, лекарственное средство, гаптен, дигоксигенин, витамин, биотин, флуорофор, антитело, иммуноглобулин, моноклональное антитело и фрагмент антитела.
R6 представляет собой соединения, содержащие первичный амин, которые выбраны из группы, состоящей из: стерического стабилизатора, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O0-1-(CH2)0-2-, PEG1.100, нацеливающей группы, лиганда рецептора клетки, интегрин-связывающего лиганда, лиганда RGD, миметика RGD, лиганда асиалогликопротеинового рецептора (ASGPr), галактозы, производного галактозы, Nацетилгалактозамина, фолата, полинуклеотида, аминомодифицированного полинуклеотида, полимера, аминосодержащего полимера, полиамина, амфипатического мембраноактивного полиамина, антитела, лекарственного средства, гаптена, дигоксигенина, витамина, биотина, флуорофора, антитела, моноклонального антитела и фрагмента антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны тетрапептидные модифицирующие агенты для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению посредством биологически лабильного тетрапептидного линкера, причем указанные тетрапептидные модифицирующие агенты содержат:
где
R5 представляет собой первое соединение,
А4 представляет собой природную, неприродную изомерную или синтетическую гидрофобную Lаминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
А3 представляет собой незаряженную или основную гидрофильную L-аминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет -28 или менее, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
А2 представляет собой природную, неприродную изомерную или синтетическую гидрофобную Lаминокислоту, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
- 5 036949
А1 представляет собой L-пролин, L-лейцин или L-N-метилаланин, и
R7 содержит аминореактивную группу, такую как, но не ограничиваясь указанными: активированные сложные эфиры TFP (тетрафторфенила) или NHS (N-гидроксисукцинимида) 2-МТ (2меркаптотиазолина).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой пролин, А2 и А4 независимо представляют собой аланин, валин, лейцин, изолейцин или фенилаланин (боковые цепи -CH3, -СН(СН3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой цитруллин или аспарагин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2 или -CH2CONH2, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой пролин, А2 и А4 представляют собой фенилаланин, и А3 представляет собой цитруллин (FCitFP (SEQ ID NO: 12)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой пролин, А2 представляет собой фенилаланин, А3 представляет собой цитруллин, и А4 представляет собой аланин (ACitFP (SEQ ID NO: 3)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СН3)2, -СН2СН(СН3)2, -СН(СН3)СН2СН3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3 +, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 представляют собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-цитруллин (FCitFP (SEQ ID NO: 12)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-лизин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FKFP (SEQ ID NO: 16)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-валин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой Lфенилаланин (FCitVP (SEQ ID NO: 13)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-валин (VCitFP (SEQ ID NO: 19)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-аланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitAP (SEQ ID NO: 8)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-аланин (ACitFP (SEQ ID NO: 3)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой лейцин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-фенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СН3)2, -СН2СН(СН3)2, -СН(СН3)СН2СН3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3 +, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lлейцин, А2 представляет собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-лизин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FKFL (SEQ ID NO: 15)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lлейцин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitFL (SEQ ID NO: 11)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СН3)2, -CH2CH(CH3)2, -СН(СН3)СН2СН3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3 +, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 представляет собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R5 содержит соединение, которое выбрано из перечня, включающего стерический стабилизатор, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O01-(CH2)0-2-, PEG1-100, нацеливающую группу, лиганд рецептора клетки, интегрин-связывающий лиганд, лиганд RGD, миметик RGD, лиганд асиалогликопротеинового рецептора (ASGPr), галактозу, производное галактозы, N-ацетилгалактозамин, фолат, полинуклеотид, полимер, полиамин, липид, липосому, антитело, лекарственное средство, гаптен, дигоксигенин, витамин, биотин, флуорофор, антитело, иммуноглобулин, моноклональное антитело и фрагмент антитела.
- 6 036949
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающая группа включает лиганд рецептора поверхности клетки. Рецептор поверхности клетки может включать, но не ограничен указанными, асиалогликопротеиновый рецептор и рецептор интегринов. Лиганд асиалогликопротеинового рецептора может включать, но не ограничен указанными, галактозу, галактозамин, Nформилгалактозамин, N-ацетилгалактозамин, N-пропионилгалактозамин, N-n-бутаноилгалактозамин и N-изо-бутаноилгалактозамин или димер, тримеры или тетрамеры указанных соединений. Рецептор интегринов может включать, но не ограничен указанными, рецептор интегрина αγβ3 и интегрина αγβ 6. Лиганд рецептора интегринов может включать, но не ограничен указанными, RGD или миметик RGD (см., например, публикацию патента США US-2015-0045573 A1, включенную в настоящую заявку посредством ссылки).
Стерический стабилизатор может включать, но не ограничен указанным, полиэтиленгликоль (PEG). PEG содержит 1-120 этиленовых единиц, 3-30 этиленовых единиц или 3-24 этиленовые единицы.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны соединения для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению посредством биологически лабильного тетрапептидного линкера, причем указанные соединения содержат структуру, представленную формулой:
где
R5 представляет собой первое соединение,
R4 представляет собой R-группу (боковую цепь) природной, неприродной изомерной или синтетической гидрофобной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1,319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы),
R3 представляет собой R-группу (боковую цепь) незаряженной гидрофильной или основной гидрофильной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет -28 или менее, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы), и
R2 представляет собой R-группу (боковую цепь) природной, неприродной изомерной или синтетической гидрофобной L-аминокислоты, индекс гидрофобности (Monera et al., J. Protein Sci. 1995, 1, 319) которой при pH 7 составляет 41 или более, нормированный к глицину, поскольку таковой относится к составу боковой цепи аминокислоты (R-группы).
R7 содержит аминореактивную группу.
R7 выбирают таким образом, что в результате реакции с амином или аминосодержащим соединением образуется амидная связь с А1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминореактивная группа представляет собой TFP (тетрафторфенил) или NHS (N-гидроксисукцинимид).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из: -CH3, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -СН(СНз)СН2СНз и -CH2C6H6.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R3 выбран из группы, состоящей из: -(CH2)3NHCONH2 и -CH2CONH2.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны соединения для обратимого присоединения первого соединения к аминосодержащему второму соединению посредством биологически лабильного тетрапептидного представленную формулой:
линкера, причем указанные соединения содержат структуру,
- 7 036949 где R5 представляет собой первое соединение, и R7 содержит аминореактивную группу. R7 выбирают таким образом, что в результате реакции с амином или аминосодержащим соединением образуется амидная связь с А1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминореактивная группа представляет собой TFP (тетрафторфенил) или NHS (N-гидроксисукцинимид).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны обратимо модифицированные полиамины, причем указанный обратимо модифицированный полиамин содержит:
(R5-A4-A3-A2-A1)n-P (формула X), где каждый R5, А4, А3, А2 и А1 является таким, как описано выше,
P содержит полиамин, n представляет собой целое число, большее или равное 1, и каждый А1 присоединен к амину в полиамине посредством амидной связи.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полиамин представляет собой мембраноактивный полиамин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мембраноактивный полиамин представляет собой амфипатический мембраноактивный полиамин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СН3)2, -СН2СН(СН3)2, -CH(CH3)CH2CH3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3+, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 и А4 представляют собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-цитруллин (FCitFP (SEQ ID NO: 12)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-лизин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FKFP (SEQ ID NO: 16)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-валин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой Lфенилаланин (FCitVP (SEQ ID NO: 13)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-валин (VCitFP (SEQ ID NO: 19)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-аланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitAP (SEQ ID NO: 8)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lпролин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-аланин (ACitFP (SEQ ID NO: 3)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой лейцин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-фенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СН3)2, -СН2СН(СН3)2, -СН(СН3)СН2СН3 или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3+, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lлейцин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-лизин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FKFL (SEQ ID NO: 15)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой Lлейцин, А2 представляет собой L-фенилаланин, А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitFL (SEQ ID NO: 11)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 и А4 независимо представляют собой L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или Lфенилаланин (боковые цепи -CH3, -CHCH3, -СН(СНз)2, -СН2СН(СНз)2, -СН(СНз)СН2СНз или -CH2C6H6, соответственно), и А3 представляет собой L-цитруллин, L-аспарагин или L-лизин (боковые цепи -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2 или -(CH2)4NH3 +, соответственно).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А1 представляет собой L-Nметилаланин, А2 представляет собой L-фенилаланин, и А3 представляет собой L-цитруллин, и А4 представляет собой L-фенилаланин (FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9)).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обратимо модифицированный полиамин образуется в результате осуществления реакции полиамина с множеством описанных тетрапептидных модифицирующих агентов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присоединение тетрапептидных модифицирующих агентов к мембраноактивному полиамину мас- 8 036949 кирует мембранную активность мембраноактивного полиамина посредством образования маскированного полиамина или полимера для доставки.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 50% аминов в полиамине являются модифицированными (значение n составляет более 50% от количества аминов в полиамине). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 60% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 70% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 75% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 80% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 85% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 90% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 95% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 100% аминов в полиамине являются модифицированными.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R5 содержит нацеливающую группу, и обратимо модифицированный полиамин дополнительно конъюгирован с триггером РНКи. Конъюгат триггера РНКи с обратимо модифицированным полиамином можно использовать для доставки триггера РНКи в клетки in vivo с целью нокаутирования экспрессии гена-мишени. Конъюгат получают и вводят пациенту. Введение может представлять собой, но не ограничено указанными, внутрисосудистую инъекцию и подкожную инъекцию. Расщепление (ферментативное расщепление) тетрапептидов протеолитическими ферментами in vitro или in vivo приводит к расщеплению между А1 и полиамином с высвобождением полиамина. Скорость высвобождения полиамина является достаточной для обеспечения доставки лекарственного средства или триггера РНКи.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описаны обратимо модифицированные полиамины, причем указанный обратимо модифицированный полиамин содержит:
(R9-A4-A3-A2-A1)n-P-(A1'-A2'-A3'-A4'-R8)m (формула XI), где каждый А4, А3, А2 и А1 является таким, как описано выше,
А1, А2, А3 и А4 независимо являются такими, как описано выше, для А1, А2, А3 и А4, соответственно, R9 содержит нацеливающую группу,
R8 содержит стерический стабилизатор,
Р содержит полиамин, каждый n и m представляет собой целое число, большее или равное 1, и каждый из А1 и А1 присоединен к аминам в полиамине посредством амидных связей.
Обратимо модифицированный полиамин образуется в результате осуществления реакции полиамина с множеством описанных тетрапептидных модифицирующих агентов.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полиамин представляет собой мембраноактивный полиамин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мембраноактивный полиамин представляет собой амфипатический мембраноактивный полиамин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 50% аминов в полиамине являются модифицированными (значение n+m составляет более 50% от количества аминов в полиамине). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 60% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 70% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 75% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 80% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 85% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 90% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 95% аминов в полиамине являются модифицированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 100% аминов в полиамине являются модифицированными.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обратимо модифицированный полиамин дополнительно конъюгирован с триггером РНКи. Конъюгат триггера РНКи с обратимо модифицированным полиамином можно использовать для доставки триггера РНКи в клетки in vivo с целью нокаутирования экспрессии гена-мишени. Конъюгат получают и вводят пациенту. Введение может представлять собой, но не ограничено указанными, внутрисосудистую инъекцию и подкожную инъекцию. Расщепление (ферментативное расщепление) тетрапептидов протеолитическими ферментами in vitro или in vivo приводит к расщеплению между А1 и полиамином с высвобождением полиамина. Скорость высвобождения полиамина является достаточной для обеспечения доставки лекарственного средства или
- 9 036949 триггера РНКи.
Неожиданно авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что вставка С-концевого остатка L-пролина в тетрапептидный линкер в значительной степени улучшает характеристики расщепления линкера. Регенерация H2N-R6 (H2N-P из формул X и XI) происходит при значительно более высокой скорости, когда в положении А1 присутствует L-пролин. Не опираясь на какую-либо теорию, считают, что эндогенные ферменты, как представляется, быстро расщепляют тетрапептид между А3 и А2 с получением первого соединения, присоединенного к дипептиду А4-А3 (R5-A4-A3-CO2H), и второго соединения, присоединенного к дипептиду А2-А1 (H2N-A2-A1-N(H)-R6). Присутствие пролина в положении А1 подавляет расщепление между А2 и А1. Если в положении А1 присутствует несколько аминокислот, отличных от пролина, эндогенные экзопротеазы, как представляется, быстро отщепляют А2 от (H2N-A2-A1-N(H)-R6) с получением H2N-A2-CO2H плюс H2N-A'-N(H)-R6. Отщепление одной аминокислоты от второго соединения, как представляется, является медленным и приводит к медленной регенерации исходного аминосодержащего соединения (H2N-R6). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при отсутствии пролина в положении А1 конъюгаты с одной аминокислотой (H2N-A1-N(H)-R2) легко образовывались в результате исходного расщепления между А2 и А1 или в результате расщепление между А3 и А2 с последующим расщеплением между А2 и А1. Напротив, если в положении А1 присутствует пролин, тогда дипептид A2-A1, как представляется, быстро расщепляется эндогенными дипептидазами с получением H2NA2-Pro-CO2H и высвободившегося второго соединения H2N-R6. Аналогичные результаты были получены с L-лейцином или N-метилаланином и положением А1.
В настоящей заявке мембраноактивные полиамины представляют собой поверхностно-активные амфипатические полимеры, способные вызывать один или несколько из следующих эффектов в отношении биологической мембраны: изменение или разрушение мембраны, которое позволяет молекулам, не проникающим через мембраны, поступать в клетку или пересекать мембрану, образование пор в мембране, фрагментацию мембран или разрушение или растворение мембраны. В настоящей заявке мембрана или мембрана клетки содержит липидный бислой. Изменение или разрушение мембраны можно функционально определить на основании активности полимера по меньшей мере в одном из следующих анализов: лизиса красных кровяных клеток (гемолиза), утечки из липосомы, слияния липосом, слияния клеток, лизиса клеток и высвобождения из эндосомы. Мембраноактивные полимеры, которые могут вызывать лизис мембран клеток, также называют мембранолитическими полимерами. Полимеры, которые, предпочтительно, вызывают разрушение эндосом или лизосом по сравнению с плазматической мембраной, считают эндосмолитическими. Эффект мембраноактивных полимеров в отношении мембраны клетки может являться временным. Мембраноактивные полимеры обладают аффинностью в отношении мембраны и вызывают денатурацию или деформацию структур бислоя. Мембраноактивные полимеры могут являться синтетическими или неприродными амфипатическими полимерами.
Доставка полинуклеотида в клетку опосредуется мембраноактивным полимером, разрушающим или дестабилизирующим плазматическую мембрану или мембрану внутренней везикулы (такой как эндосома или лизосома), в том числе посредством образования поры в мембране или разрушения эндосомальных или лизосомальных везикул, что делает возможным высвобождение содержимого везикулы в цитоплазму клетки.
В настоящей заявке стерический стабилизатор представляет собой неионный гидрофильный полимер (природный, синтетический или неприродный), который предотвращает или ингибирует внутримолекулярные или межмолекулярные взаимодействия молекулы, к которой присоединен данный стерический стабилизатор, по сравнению с молекулой, не содержащей стерического стабилизатора. Стерический стабилизатор препятствует вовлечению молекулы, к которой присоединен данный стерический стабилизатор, в электростатические взаимодействия. Электростатическое взаимодействие представляет собой нековалентное связывание двух или нескольких веществ вследствие сил притяжения между положительным и отрицательным зарядами. Стерические стабилизаторы могут ингибировать взаимодействие с компонентами крови и вследствие этого опсонизацию, фагоцитоз и поглощение ретикулоэндотелиальной системой. Таким образом, стерические стабилизаторы могут увеличивать время циркуляции молекул, к которым присоединены данные стерические стабилизаторы. Стерические стабилизаторы также могут ингибировать агрегацию молекул. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения стерический стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль (PEG) или производное PEG. Подходящие молекулы PEG содержат приблизительно 1-120 мономеров этиленгликоля.
Нацеливающие группы (также нацеливающие лиганды) используют для нацеливания или доставки соединений к клеткам- или тканям-мишеням либо к конкретным типам клеток. Нацеливающие группы усиливают связывание молекул с клеткой-мишенью. Таким образом, нацеливающие группы могут усиливать фармакокинетические свойства или свойства биораспределения конъюгата, к которому присоединены данные нацеливающие группы, для улучшения распределения конъюгата в клетке и поглощения клетками. Связывание нацеливающей группы, такой как лиганд, с клеткой или рецептором клетки может запустить эндоцитоз. Нацеливающие группы могут быть выбраны из группы, состоящей из: соединений, обладающих аффинностью в отношении молекулы поверхности клетки, лигандов рецепторов клетки и антител, фрагментов антитела и миметиков антител, обладающих аффинностью в отношении молекул
- 10 036949 поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающая группа включает лиганд рецептора клетки. Множество лигандов использовали для нацеливания лекарственных средств и генов в клетки и к конкретным рецепторам клетки. Лиганды рецепторов клетки могут быть выбраны из группы, состоящей из: углеводов, гликанов, сахаридов (включая, но не ограничиваясь указанными: галактозу, производные галактозы, маннозу и производные маннозы), витаминов, фолата, биотина, аптамеров, пептидов (включая, но не ограничиваясь указанными: RGD-содержащие пептиды, инсулин, EGF и трансферрин) и миметиков RGC.
В настоящей заявке лиганд ASGPr (или лиганд ASGPr) включает галактозу и производное галактозы, которое характеризуется аффинностью в отношении ASGPr, равной или большей, чем таковая галактозы. Связывание нацеливающих групп галактозы с ASGPr облегчает клеткоспецифичное нацеливание пептида для доставки к гепатоцитам и эндоцитоз пептида для доставки в гепатоциты. Лиганды ASGPr могут быть выбраны из группы, состоящей из: лактозы, галактозы, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), галактозамина, N-формилгалактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-nбутаноилгалактозамина и N-изобутаноилгалактозамина (Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 277, 6686). Лиганды ASGPr могут являться мономерными (например, могут содержать один галактозамин) или мультимерными (например, могут содержать несколько галактозаминов).
Триггеры РНКи (также называемые триггерами дсРНКи) ингибируют экспрессию гена посредством биологического процесса РНК-интерференции (РНКи). Триггеры РНКи включают двуспиральную РНК или РНК-подобные структуры, как правило, содержащие 15-50 пар оснований или 18-26 пар оснований и содержащие последовательность нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 90% комплементарную в пределах коровой области кодирующей последовательности в экспрессированном гене-мишени в клетке. Триггеры РНКи включают, но не ограничены указанными: малую интерферирующую РНК (миРНК), двуспиральную РНК (дсРНК), микроРНК, малую шпилечную РНК (мшРНК) и дайсер-субстраты (патенты США №№ 8084599, 8349809 и 8513207).
Под ингибированием, понижающей регуляцией или нокдауном экспрессии генов подразумевают, что экспрессия гена, которую измеряют по уровню мРНК, транскрибированной с гена, или по уровню полипептида, белка или субъединицы белка, транслированной с мРНК, уменьшается ниже уровня, наблюдаемого при отсутствии блокирующих конъюгатов полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке. Ингибирование, понижающая регуляция или нокдаун экспрессии генов с помощью полинуклеотида, доставляемого посредством композиций, описанных в настоящей заявке, находится ниже уровня, наблюдаемого в присутствии контрольной неактивной нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты со скремблированной последовательностью или с инактивирующими ошибками спаривания, или при отсутствии конъюгации полинуклеотида с обратимо модифицированным полимером.
В фармакологии и токсикологии путь введения представляет собой путь, посредством которого осуществляется контакт лекарственного средства, жидкости, яда или другого вещества с организмом. Как правило, способы введения лекарственных средств и нуклеиновых кислот для лечения млекопитающего хорошо известны в данной области техники, и данные способы можно применять для введения композиций, описанных в настоящей заявке. Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть введены посредством любого подходящего пути, включая парентеральный, в препарате, соответствующим образом приспособленном к данному пути. Таким образом, соединения, описанные в настоящей заявке, могут быть введены посредством инъекции, например, внутривенным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или интраперитонеальным путем. Соответственно, композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть включены в фармацевтические композиции и/или могут образовывать часть фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества.
Парентеральные пути введения включают внутрисосудистые (внутривенные, внутриартериальные), внутримышечные, интрапаренхимальные, интрадермальные, субдермальные, подкожные, внутриопухолевые, интраперитонеальные, интратекальные, субдуральные, эпидуральные и внутрилимфатические инъекции, для которых используют шприц и иглу или катетер.
Описанные композиции инъецируют в растворах фармацевтически приемлемого носителя. Фармацевтически приемлемый относится к таковым свойствам и/или веществам, которые являются приемлемыми для млекопитающего с фармакологической/токсикологической точки зрения. Фраза фармацевтически приемлемый означает молекулярные объекты, композиции и свойства, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, не вызывают аллергической или другой нежелательной или токсичной реакции при введении млекопитающему. Термин фармацевтически приемлемый означает подлежащий одобрению регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или приведенный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у людей.
В настоящей заявке фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество активной фармацевтической субстанции (АФС, также терапевтического продукта, например, триггера РНКи), фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества (вспомогательные вещества) представляют собой вещества, отличные от АФС, безопасность
- 11 036949 которых была соответствующим образом оценена и которые целенаправленно были включены в систему для доставки лекарственного средства. Вспомогательные вещества не оказывают или не предназначены для оказания терапевтического эффекта в предусмотренной дозе. Вспомогательные вещества могут выступать для а) способствования обработке системы доставки лекарственного средства в процессе производства, b) защиты, поддержания или усиления стабильности, биодоступности или переносимости АФС пациентом, с) способствования обнаружению продукта и/или d) усиления другого свойства общей безопасности, эффективности, доставки АФС в процессе хранения или применения.
Вспомогательные вещества включают, но не ограничены указанными: вещества, способствующие всасыванию, антиадгезивные вещества, противовспенивающие вещества, антиоксиданты, связывающие вещества, буферные вещества, носители, покрывающие вещества, красители, вещества, способствующие доставке, декстран, декстрозу, разбавители, разрыхлители, эмульгирующие вещества, наполнители, вещества-наполнители, вкусоароматические вещества, вещества, способствующие скольжению, смачивающие вещества, смазывающие вещества, масла, полимеры, консерванты, солевой раствор, соли, растворители, сахара, суспендирующие средства, матрицы с замедленным высвобождением, подсластители, загустители, вещества, регулирующие тоничность, вещества основы, водоотталкивающие вещества и увлажняющие вещества. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой инертное вещество или может не представлять собой инертное вещество.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, могут содержать другие дополнительные компоненты, обычно присутствующие в фармацевтических композициях. Фармацевтически активные вещества могут включать, но не ограничены указанными: противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства (например, антигистамин, дифенгидрамин и т.д.). Также предусмотрено, что клетки, ткани или выделенные органы, которые экспрессируют или содержат определенные в настоящей заявке триггеры РНКи, можно использовать в качестве фармацевтических композиций. В настоящей заявке фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество означает такое количество триггера РНКи, которое обеспечивает предусмотренный фармакологический, терапевтический или профилактический результат.
Лекарственные средства, содержащие тетрапептидный линкер, также являются объектом настоящего изобретения, как и способы производства таких лекарственных средств, причем указанные способы включают приведение одного или нескольких соединений, содержащих тетрапептидный линкер и, при необходимости, одно или несколько других терапевтически ценных веществ, в галеновую лекарственную форму для введения.
Примеры
Пример 1. Синтез тетрапептидных линкеров и конъюгатов, содержащих тетрапептидные линкеры.
А) Синтез пептида и пептидов, меченных AENA.
Смола Fmoc-A1O-(2-CI)Trt-----!-----RE-A4-A3-A2-A1-OH ---А1 = Pro, Ala, (Nme)Ala, Leu 01a, 01b, 02-07, 08a,
09-14, 15a, 15b, 16-21 r^4-A3-A2-A1-AENA ----Щ► Re-A4-A3-A2-A1-AENA
22-43, 22a, 24a, 25a, 32a, 34a 22b, 24b, 25b, 32b, 34b (i) Твердофазный синтез соединений 1-21: Пептидные кислоты синтезировали из коммерчески доступной смолы 2-Cl-Trt (EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс), предварительно нагруженной пролином, лейцином, аланином или N-метилаланином. Пошаговое добавление проводили с применением стандартных способов области техники твердофазного синтеза. Сочетание проводили с применением PYBOP (4 экв.), аминокислоты (4 экв.) и DIEA (8 экв.). Снятие защиты Fmoc проводили с помощью 20% пиперидина в DMF.
После синтеза пептида с N-концевой аминокислоты снимали защиту и сочетали с указанной группой R5. Сочетание проводили с применением 2 экв. активированных NHS сложных эфиров NAG(OAc)3 (как получено в публикациях US 8802773 и Rozema et al., 2015) или PEG12 (Quanta Biodesign, ПлейнСити, Огайо, № CAS: 756525-94-7) в DMF, содержащем 4 экв. DIEA. Другие группы R5 можно присоединить с применением аналогичного синтеза. После присоединения R5 пептиды отщепляли от смолы с применением HFIP (30%) в DCM в течение 0,25 ч. После удаления растворителя осадок растирали с Et2O. Субстраты впоследствии использовали без дополнительной очистки.
(ii) Общая схема получения соединений 22-43 (22а, 24а, 25а, 32а, 34а): К раствору неочищенного пептидного субстрата (1-21) добавляли РуВОР (2 экв.), DIEA (2 экв.), затем AENA (2 экв.) и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. После завершения растворитель удаляли в вакууме. Соединения 24а, 25а, 32а и 34а впоследствии использовали без дополнительной очистки. Все другие субстраты очищали с применением метода ВЭЖХ с колонкой с обращенной фазой Thermo Scientific Aquasil C18 (250x21,2, Уолтем, Массачусетс) при элюировании градиентом ацетонитрила и воды, забуференной
- 12 036949
0,1% муравьиной кислотой. После очистки все соединения высушивали посредством лиофилизации.
(iii) Получение соединений 22b, 24b, 25b, 32b и 34b: Соединения 24а и 25а обрабатывали 2% гидразином в DMF в течение 15 мин, и впоследствии все растворители удаляли в вакууме. Соединение 32а обрабатывали 50% TFA в DCM в течение 1 ч, и впоследствии все растворители удаляли в вакууме. Соединение 34а обрабатывали чистой муравьиной кислотой в течение 18 ч, и впоследствии все растворители удаляли в вакууме. Часть неочищенного соединения 22а обрабатывали МеОН (25%), H2O (45%) и TEA (35%), перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, и впоследствии все растворители удаляли в вакууме. Все соединения, с которых снимали защиту, как описано, впоследствии очищали методом ВЭЖХ, как описано на стадии (ii).
В. Общая схема получения соединений 44а, 44b, 45а, 45b и 34b, активация пептидных субстратов сложным эфиром (iv):
R5-A4-A3-A2-A1 -О Н ---------► R5-A4-A3-A2-A1 -OS и
01а, 01b, 08а, 08b, 15b, 20 44а, 44b, 45а, 45b, 46, 47
Неочищенные соединения 01a, 01b, 08a, 08b, 15b и 20 сначала очищали методом ВЭЖХ, как описано на стадии (ii). Перед очисткой методом ВЭЖХ соединения 01а и 08а обрабатывали МеОН (25%), H2O (45%) и TEA (35%), как при получении 22b, описанном на стадии (iii). Впоследствии все соединения активировали следующим образом. В высушенную над пламенем колбу к раствору при температуре 0°С, содержащему очищенный субстрат в DMF или DCM в концентрации 0,2 М, добавляли NHS (3 экв.) и DCC (3 экв.) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение ночи. После завершения смесь частично концентрировали, охлаждали до температуры -20°С, фильтровали, а затем все растворители удаляли в вакууме. Осадок растворяли в минимальном количестве DCM и МеОН, преципитировали в холодном Et2O и собирали посредством сцеживания растворителя после центрифугирования. Преципитацию в Et2O повторяли до тех пор, пока перестала обнаруживаться остаточная дициклогексилмочевина, что подтверждали методом ЯМР (ядерного магнитного резонанса). Все полученные соединения впоследствии использовали без дополнительной очистки.
С) Синтез субстратов, меченных EDANS, общая схема получения соединений 48-59:
IСмола H2N-(СН2)2-О-(2-CI)Trt --------► H^N-AMCpEG^GluiEDANSJ-NHiCKVOH
48-49
Каждую пептидную кислоту синтезировали из коммерчески доступной смолы 2-Cl-Trt (EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс), предварительно нагруженной этаноламином. Ступенчатый твердофазный синтез проводили, как описано на стадии (i). После синтеза пептида N-концевой FMOC удаляли, и последовательность отщепляли от смолы с применением 5% TFA, 5% H2O в DCM в течение 0,5 ч и очищали методом ВЭЖХ, как описано на стадии (ii). Перед очисткой соединения 52 и 53 обрабатывали в 50% TFA, 5% TIS, 5% Н2О в DCM в течение 1 ч.
D) Получение соединения 60 (vi), синтез контроля для анализа ферментативного расщепления:
o^nh2
К раствору, содержащему PEG12-ACit-PABC-PNP (0,052 ммоль, 56 мг), полученный, как описано ранее (US 8802733, Rozema et al., 2015, Carlson et al., 2015), и TEA (0,078 ммоль, 10,8 мкл) в DMF (400 мкл), добавляли EDANS (0,052 ммоль, 14 мг) и оставляли перемешиваться в виде суспензии при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение ночи. После завершения все растворители удаляли в вакууме, неочищенный осадок растирали с Et2O и очищали с применением SiO2 при элюировании в градиенте МеОН (10-20%) в CHCl3. Выход составил 58 мг (92%).
- 13 036949
Пептидные линкеры
Таблица 1
Соединение R5 A4 A3 A2 A1 *R6
01а NAG(OAc)3 Phe Cit Phe Pro OH
01b PEGn Phe Cit Phe Pro OH
02 PEGn Phe Lys(dde) Phe Pro OH
03 PEG12 Phe Lys(dde) Phe Leu OH
04 NAG(OAc)3 Phe Cit Val Pro OH
05 PEGn Phe Cit Phe Leu OH
06 NAG(OAc)3 Val Cit Phe Pro OH
07 peg12 Phe Cit Phe (Nme)Ala OH
08а NAG(OAc)3 Phe Cit Ala Pro OH
08b peg12 Phe Cit Ala Pro OH
09 peg12 Ala Cit Phe Pro OH
10 peg12 Phe Asn(dmcp) Phe Pro OH
11 NAG(OAc)3 Phe Cit Ala Ala OH
12 peg12 Phe AspiO'Bu) Phe Pro OH
13 NAG(OAc)3 Ala Cit Ala Ala OH
14 NAG(OAc)3 Cit Ala Ala Ala OH
15а NAG(OAc)3 Ala Cit Ala Pro OH
15b peg12 Ala Cit Ala Pro OH
16 peg12 Gly Phe Leu Gly OH
17 NAG(OAc)3 Phe Cit Phe Ala OH
18 NAG(OAc)3 - Cit Ala Ala OH
19 NAG(OAc)3 - Ala Ala Ala OH
20 peg12 - Cit Ala Pro OH
21 NAG(OAc)3 - Ala Cit Ala OH
22а NAG(OAc)3 Phe Cit Phe Pro AENA
22b NAG(OH)3 Phe Cit Phe Pro AENA
23 peg12 Phe Cit Phe Pro AENA
24а peg12 Phe Lys(dde) Phe Pro AENA
24b peg12 Phe Lys(NH2) Phe Pro AENA
25а PEGn Phe Lys(dde) Phe Leu AENA
25b PEGn Phe Lys(NH2) Phe Leu AENA
26 NAG(OAc)3 Phe Cit Val Pro AENA
27 PEGn Phe Cit Phe Leu AENA
28 NAG(OAc)3 Val Cit Phe Pro AENA
29 PEGn Phe Cit Phe (Nme)Ala AENA
30 NAG(OAc)3 Phe Cit Ala Pro AENA
31 PEGn Ala Cit Phe Pro AENA
32а PEGn Phe Asn(dmcp) Phe Pro AENA
32b PEGn Phe Asn(NH2) Phe Pro AENA
33 NAG(OAc)3 Phe Cit Ala Ala AENA
34а PEGn Phe А8р(О*Ви) Phe Pro AENA
34b PEGn Phe Asp(OH) Phe Pro AENA
35 NAG(OAc)3 Ala Cit Ala Ala AENA
36 NAG(OAc)3 Cit Ala Ala Ala AENA
37 NAG(OAc)3 Ala Cit Ala Pro AENA
38 PEGn Gly Phe Leu Gly AENA
39 NAG(OAc)3 Phe Cit Phe Ala AENA
40 NAG(OAc)3 - Cit Ala Ala AENA
41 NAG(OAc)3 - Ala Ala Ala AENA
42 PEGn - Cit Ala Pro AENA
43 NAG(OAc)3 - Ala Cit Ala AENA
44а NAG(OH)3 Phe Cit Phe Pro OSu
44b PEGn Phe Cit Phe Pro OSu
45а NAG(OH)3 Phe Cit Ala Pro OSu
45b PEGn Phe Cit Ala Pro OSu
46 PEGn Ala Cit Ala Pro OSu
47 PEGn - Cit Ala Pro OSu
48 H2N - - Phe Pro PGA
49 h2n - - Leu Pro PGA
50 h2n - - Val Pro PGA
51 h2n - - Phe (Nme)Ala PGA
52 h2n - - Asn(NH2) Pro PGA
53 h2n - - Ser(OH) Pro PGA
54 h2n - - Phe Leu PGA
55 h2n - - Ala Pro PGA
56 h2n - - Phe Ala PGA
57 h2n - - - Leu PGA
58 h2n - - Gly Pro PGA
59 h2n - - - Ala PGA
60 PEG12 - Ala Cit PABC EDANS
*где R6=-OH, А1 оканчивается карбоксильной группой (т.е. -ОН заменяет -NH-).
Структуры некоторых компонентов показаны на фиг. 1.
Пример 2. Скорость расщепления тетрапептидных линкеров.
Различные комбинации аминокислот, тетрапептиды, использовали для присоединения различных первых фрагментов (R5) к репортерной группе AENA второго соединения (R6) с получением субстратов для анализа (субстратов). Скорости расщепления пептидов оценивали посредством анализа фермента- 14 036949 тивного расщепления субстратов в присутствии лизосомального экстракта крыс.
Репортерные группы сочетали с С-концом пептидных субстратов, как описано выше, для мониторинга методом спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой частях спектра с целью исследования влияния аминокислотной последовательности на кинетику расщепления пептида методом ВЭЖХ. N-(2аминоэтил)-4-нитроанилин (AENA) или N-(аминоэтил)-5-нафтиламин-1-сульфоновую кислоту (EDANS) использовали в качестве репортерных групп для мониторинга методом ВЭЖХ, поскольку в процессе отщепления от пептида или после этого не оказывалось влияние ни на поглощательную способность, ни на максимальную лямбда. N-конец каждого пептидного субстрата модифицировали метоксиполиэтиленгликолем (PEG12) или N-ацетилгалактозамином (NAG(OR)3) (фиг. 1).
Анализ ферментативного расщепления: Эксперименты по протеолитическому расщеплению проводили при постоянной концентрации субстрата (0,51 мкмоль) с применением лизосомального (ферментативного) экстракта печени (0,45 мкг/мкл) в 25 мМ растворе MES, забуференном до pH 5, содержащем 1% CHAPS и 1,8 мМ DTT, который инкубировали при температуре 37°С. Ферментативный экстракт активировали в присутствии DTT в течение 15 мин при температуре 37°С перед добавлением пептидных субстратов, меченных AENA. В различные временные точки вплоть до 26 ч отбирали аликвоты объемом 20 мкл и подкисляли до pH 3 с помощью TFA. Анализ фракций проводили методом ВЭЖХ с колонкой с обращенной фазой Aquasil C18 (250x4,6, Thermofisher, Уолтем, Массачусетс), контролировали при длине волны 390 и 335 нм для AENA и EDANS, соответственно. Элюирование проводили градиентом ацетонитрила и воды, забуференной 0,1% муравьиной кислотой. Измеряли образование немодифицированной репортерной молекулы. Для минимизации количества циклов замораживания - оттаивания лизосомальный экстракт разделяли на несколько аликвот перед хранением при температуре -80°С. Для каждого исследования использовали новую аликвоту немедленно после оттаивания. Лизосомальный экстракт получали от самок крыс линии Вистар посредством дифференциального центрифугирования в градиенте плотности (Graham et al., 2000). Концентрацию белка в экстракте лизосом определяли посредством стандартных протоколов анализа белка с помощью бицинхониновой кислоты. Соединение 60 использовали для нормирования скорости между экспериментами (табл. 2-4). Средняя экспериментальная скорость, наблюдаемая для 60 в ходе нескольких анализов, составила 123,8 нмоль/ч. Нормированную скорость образца рассчитывали в виде: [(средняя скорость соединения 60ьэкспериментальная скорость соединения 60)] xэкспериментальная скорость образца.
Скорость (также называемую быстротой или скоростью расщепления) экстраполировали в течение раннего линейного обмена (табл. 2). В настоящей заявке скорость определяют как линейную скорость образования репортерной группы при завершении, составляющем менее 50% (скорость ферментативного расщепления считали линейной при завершении, составляющем менее 50%). Для субстратов, у которых расщепление отклонялось от последовательной кинетики первого порядка, процент репортерной группы, высвободившийся в конечную точку ферментативного расщепления, использовали в качестве метрики для сравнения.
Данные табл. 2 свидетельствуют, что наиболее высокие скорости расщепления наблюдались в случае тетрапептидов, содержащих объемные гидрофобные аминокислоты в положениях А2 и А4, объемные гидрофильные (полярные) аминокислоты в положении А3 и пролин или лейцин в положении А1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислота в положении А1 представляет собой пролин.
Тетрапептидные линкеры, содержащие пролин в положении А1, характеризуются наивысшими скоростями. Если пролин соединений 30 (FCitAP (SEQ ID NO: 8)) и 23 (FCitFP (SEQ ID NO: 12)) заменяли на аланин, получая соединения 33 (FCitAA (SEQ ID NO: 7)) и 39 (FCitFA (SEQ ID NO: 10)), наблюдалось кардинальное уменьшение скорости и времени завершения ферментативного расщепления. Замена лейцина в положении А1 в соединении 27 пролином, как показано в соединении 23, привела к значительному увеличению скорости в случае содержащего пролин тетрапептида. Небольшое увеличение скорости также наблюдалось в случае содержащего пролин соединения 24b по сравнению с содержащим лейцин соединением 25b.
Тетрапептиды, содержащие более большие (объемные) гидрофобные аминокислоты в положениях А2 и А4, также, как правило, демонстрировали более высокие скорости. Увеличение объема боковой цепи в положении А2 соединений 30, 26 и 23 увеличивало скорость ферментативного расщепления. Аналогично увеличение объема боковой цепи в положении А4 увеличивало скорость ферментативного расщепления, как показано в случае соединений 31, 28 и 23, соответственно.
Тетрапептиды, содержащие объемные полярные (нейтральные или положительно заряженные) аминокислоты в положении А3, демонстрировали более высокие скорости расщепления, см. соединения 23, 24b, 32b и 34b.
N-метилирование соединения 39 в положении А1 с получением соединения 29 привело к более высокой скорости и более быстрому завершению ферментативного расщепления (см. также фиг. 2).
- 15 036949
Таблица 2 Скорость расщепления различных пептидных линкеров.
Синтезировали различные пептиды и определяли скорость расщепления
Субстрат анализа Последовател ьность пептида SEQ ID NO: Скорост ь (60), нмоль/ч Скорост ь образца, нмоль/ч Нормирова иная скорость, нмоль/ч % высвобожд ения в конечной точке(21 ч)
(23) PEGn-FCitFP-AENA FCitFP 12 123,6 192,7 192,9 *99,5
(24b) PEG12-FKFP- AENA FKFP 16 134,7 134,8 123,9 ***98 9
(25b) PEG12-FKFL- AENA FKFL 15 123,5 117,0 117,4 **99,8
(26) NAG(OAc)3-FCitVP- AENA FCitVP 13 144,3 119,5 102,5 97,8
(27) PEGn-FCitFL- AENA FCitFL 11 123,5 94,5 94,7 **99 7
(28) NAG(OAc)3-VCitFP- AENA VCitFP 19 137,8 84,3 75,8 *99,4
(29) PEGi2-FCitF(Nme)A- AENA FCitF(Nme)A 9 123,6 62,5 62,6 *97,3
(30) NAG(OAc)3-FCitAP- AENA FCitAP 8 108,4 54,3 62,0 96,5
(31) PEGn-ACitFP- AENA ACitFP 3 123,6 49,5 49,6 *98,9
(32b) PEG12-FNFP- AENA FNFP 17 134,7 42,0 38,6 ***99 з
(33) NAG(OH)3-FCitAA- AENA FCitAA 7 137,8 - - 68,5
(34b) PEG12-FDFP- AENA FDFP 14 134,7 18,0 16,6 ***66,5
(35) NAG(OAc)3-ACitAA- AENA ACitAA 1 120,0 - - 49,8
(36) NAG(OAc)3-CitAAA- AENA CitAAA 5 100,9 - - **47 7
(37) NAG(OAc)3-ACitAP- AENA ACitAP 2 108,0 И,8 13,5 44,2
(38) PEG12-GFLG- AENA GFLG 18 127,4 10,0 9,7 **47,8
(39) NAG(OAc)3-FCitFA- AENA FCitFA 10 108,4 - - 40,5
(40) NAG(OAc)3-CitAA- AENA CitAA 120,0 3,7 3,9 15,6
(41) NAG(OAc)3-AAA- AENA AAA 120,0 1,6 1,6 8,2
(42) PEGn-CitAP- AENA CitAP 135,2 1,0 0,9 **5,8
(43) NAG(OAc)3-ACA- AENA ACitA 120,0 - - 1,1
* - конечная точка в момент времени 23 ч;
* * - конечная точка в момент времени 24 ч;
* ** - конечная точка в момент времени 26 ч (номера соединения и аминокислоты набраны жирным шрифтом).
В случае данного тетрапептида природа соединения R5 не оказывала существенного влияния на скорость расщепления (скорость высвобождения немодифицированного H2N-R6). Соединения 22а и 23 являлись по существу эквивалентными в отношении скорости протеолитического расщепления (табл. 3). Аналогично было показано, что модифицированный ацетилом NAG(OAc)3, соединение 22а, оказывал незначительный эффект в отношении скорости ферментативного расщепления по сравнению с немодифицированным аналогом, соединением 22b (табл. 3).
Таблица 3
Скорость расщепления линкера FCitFP (SEQ ID NO: 12), содержащего различные N-концевые фрагменты (R5) (соединения 23, 22а и 22b)
Субстрат анализа Скорость, нмоль/ч
Соединение 60 | Образец | Нормированная
(23) PEGn-FCitFP-AENA 123,6 192,7 192,9
(22а) NAG(OAc)3-FCitFP-AENA 144,0 244,9 210,5
(22b) NAG(OH)3-FCitFP-AENA 137,8 223,7 201,0
Пример 3. Эффект аминокислот А1 и А2 в отношении скорости ферментативного расщепления ди пептидов.
Получали дипептидные субстраты, содержащие аминоконец и С-концевые (R6) репортеры EDANS, для последующего анализа эффектов аминокислот А1 и А2 в отношении скорости расщепления. Дипептидные субстраты имитировали тетрапептидные линкеры после первого события расщепления тетрапептида между аминокислотами А2 и А3. Дипептиды обрабатывали экстрактами, и продукты ферментативного расщепления анализировали, как описано выше. Как видно из табл. 4, дипептиды, содержащие пролин в положении А1, демонстрировали самую высокую скорость расщепления. В соответствии с данными табл. 2 скорость расщепления, как было обнаружено, зависела от аминокислоты в положении А1 и от размера и заряда аминокислоты в положении А2 (табл. 4). Пептиды с пролином в положении А1 характеризовались наибольшей скоростью расщепления. Скорость расщепления также увеличивалась с увеличением размера и гидрофобности аминокислоты А2, как наблюдается в случае соединений 48, 49, 50, 52, 55 и 58.
Добавление фенилаланина к соединениям 57 и 59 (с получением соединений 54 и 56, соответственно) привело к значительному увеличению скорости ферментативного расщепления, несмотря на дополнительную аминокислоту.
- 16 036949
Таблица 4
Скорость расщепления дипептидных субстратов, модифицированных С-концевым EDANS
Название соединения Последова тельность субстрата Скорост ь (60), нмоль/ч Скорост образца, нмоль/ч Нормирова иная скорость, нмоль/ч
(48) H2N-FP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- F-P 145,0 448,5 383,0
(СН2)2-ОН
(49) H2N-LP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- L-P 127,6 349,1 338,7
(СН2)2-ОН
(50) H2N-VP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- V-P 135,2 213,5 195,5
(СН2)2-ОН
(51) H2N-F(Nme)A-Glu(EDANS)-NH(СН2)2-ОН (52) H2N-NP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- F-(Nme)A N-P 135,2 127,6 177,6 156,5 162,6 151,9
(СН2)2-ОН
(53) H2N-SP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- S-P 127,6 145,0 140,7
(СН2)2-ОН
(54) H2N-FL-PEG4-G1u(EDANS)-NH- F-L 145,0 155,0 132,4
(СН2)2-ОН
(55) H2N-AP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- А-Р 135,2 125,7 115,1
(СН2)2-ОН
(56) H2N-FA-PEG4-G1u(EDANS)-NH(СН2)2-ОН F-A 135,2 61,3 56,1
(57) H2N-L-PEG4-G1u(EDANS)-NH- L 135,2 58,3 53,3
(СН2)2-ОН
(58) H2N-GP-PEG4-G1u(EDANS)-NH- G-P 127,6 14,4 13,9
(СН2)2-ОН
(59) H2N-A-PEG4-G1u(EDANS)-NH- А 135,2 7,9 7,2
(СН2)2-ОН
Пример 4. Анализ ферментативного расщепления с применением экстрактов из различных источ ников.
Наблюдаемые скорости расщепления не зависели от источника протеолитических ферментов. Порядок увеличения скорости (23>30>37>42) сохранялся при ферментативном расщеплении с применением коммерчески доступного экстракта S9 из печени крысы и человека (Xenotech LLC, Ленекса, Канзас) (табл. 5). Таким образом, скорости расщепления, как ожидается, являются аналогичными среди различных видов и типов клеток.
Таблица 5
Относительная скорость субстратов в различных экстрактах
Название соединения Последовате льность субстрата (SEQ ID NO:) Относительная* скорость
Лизосомаль ный экстракт Экстракт S9 крысы Экстракт S9 человека
(23) PEGi2-FCFP-AENA FCitFP (12) 100,0 100,0 100,0
(30) NAG(OAc)3-FCitAP-AENA FCitAP (8) 32,1 28,3 45,7
(37) NAG(OAc)3-ACitAP-AENA ACitAP (2) 7,0 3,3 7,1
(42) PEGi2-CitAP-AENA CitAP 0,5 0,6 1,7
* - нормированная к соединению 23.
Пример 5. Анализ промежуточных продуктов ферментативного расщепления пептидного линкера.
Затем аликвоты из примеров 2 и 3 анализировали методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для обнаружения промежуточных продуктов ферментативного расщепления. Анализ позволил выявить множество положений, поддающихся расщеплению, для исходного эндопротеолитического события расщепления субстрата. Тетрапептидные линкеры, содержащие пролин в положении А1 (22а, 22b, 23, 24b, 26, 28, 30, 31, 34b, 37 и 42), как представляется, не образовывали значительного количества промежуточного продукта H2N-Pro-R6, т.е., как представляется, значительное ферментативное расщепление между пролином в положении А1 и аминокислотой в положении А2 отсутствовало. Наблюдались исключительно А2-пролин-AENA или свободный AENA. Когда А1 представлял собой аланин или лейцин, стадией, лимитирующей скорость реакции, являлся протеолиз последнего остатка. Промежуточные продукты ферментативного расщепления для соединений 39 (FCitFA (SEQ ID NO: 10)) и 29 (FCitF(Nme)A (SEQ ID NO: 9)) показаны на фиг. 2.
Пример 6. Высвобождение H2N-R6 не нарушалось из-за стерического объема полимерного соединения в положении R6.
Тетрапептидные модифицирующие агенты, содержащие PEG, синтезировали с применением группы PEG в положении R5 и активированного сложного эфира в положении R7 (формула V). Мембраноактивные полиамины (см. ниже) модифицировали миРНК фактора VII, CDM-NAG и указанными тетрапептидными (45b, 46) или контрольными трипептидными (47) модифицирующими агентами, как было описано ранее (патенты США 8137695 и 8426554), с образованием динамического поликонъюгата полимера для доставки. Затем мышам инъецировали 1 мг/кг полимера, конъюгированного с 0,25 мг/кг миРНК. В день 5 образцы отбирали и анализировали в отношении фактора VII. Для нокдауна фактора VII требуется отщепление модифицирующего агента от полиамина при скорости, аналогичной ранее описанным мас
- 17 036949 кирующим агентам на основе CDM и маскирующим агентам на основе дипептида PABC. Как показано в табл. 6, описанные тетрапептидные агенты (45b, 46) являлись эффективными модифицирующими агентами при применении в сочетании с DPC-опосредованной доставкой миРНК (патенты США 8137695 и 8426554), что свидетельствует о быстром расщеплении в клетке для высвобождения мембраноактивного полиамина. Эффективный нокдаун in vitro также свидетельствует, что присутствие группы PEG не оказывало отрицательного влияния на ферментативное расщепление линкера in vivo. Для динамического конъюгата полимеров для доставки, модифицированных тетрапептидами, функционализированными PEG12, порядок увеличения нокдауна in vivo (45b>46>47) коррелировал с результатами кинетики in vitro. Валидация модели для оценки кинетики in vitro была подтверждена результатами, полученными в исследованиях на животных.
Таблица 6
Нормированные уровни фактора VII после инъекции конъюгатов полимера с миРНК, нацеленных с помощью лабильного в отношении кислот CDM-NAG11
Модифицирующий агент PEGпептид Относительная активность F VII
(45b) PEG-FCitAP-OSu 40±06
(46) PEG-ACitAP-OSu 66±28
(47) PEG-CitAP-OSu 97±34
Пример 7. Анализ лабильности in vivo. Тетрапептиды анализировали для определения лабильности и обратимости in vivo посредством исследования линкеров в качестве модифицирующих агентов для DPC-опосредованной доставки миРНК.
А) триггеры РНК-интерференции (миРНК).
Синтез миРНК: Контрольную миРНК следующих последовательностей синтезировали с применением стандартной фосфорамидитной химии.
Смысловая миF7: 5'-(NH2-C6)-GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)-3'SEQ id no: 4
Антисмысловая миF7: 5'dTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT-3'SEQ ID NO: 6 (нижний регистр, замена 2'-ОМе; f, замена 2'-F; d, замена 2'-дезокси; и s, фосфотиоатная связь.)
Модификации амина миРНК дисульфидом DBCO: Модифицированную DBCO миРНК синтезировали посредством реакции 5'-аминомодифицированной миРНК с 1 массовым эквивалентом (мас. экв.) сложного эфира дибензоциклооктин-S-S-N-гидроксисукцинимидила (ALDRICH, каталожный № 761532) и 0,36 мас. экв. NaHCO3 в воде при температуре 4°С в течение 16 ч. Затем модифицированную миРНК преципитировали посредством добавления 9 объемов этанола и инкубации при температуре -80°С в течение 2 ч. Преципитат растворяли в буфере ФБР, не содержащем РНКазу, и количественно определяли посредством измерения поглощения при длине волны 260 нм.
В) Синтез полимера:
RAFT-сополимер N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и втор-бутилакрилата (ЕАВ).
Готовили растворы AIBN (1,00 мг/мл) и RAFT-агента СРСРА (10,0 мг/мл) в бутилацетате. Молярный состав исходной мономерной смеси представлял собой 55% N-Вос-этоксиэтиламинакрилата, 45% втор-бутилакрилата (№ CAS 2998-08-5). Теоретическая ММ (молекулярная масса) составила 100000.
N-Boc-этоксиэтиламинакрилат (0,890 г, 3,43 ммоль), втор-бутилакрилат (0,391 мл, 0,360 г, 2,81 ммоль), раствор СРСРА (0,350 мл, 0,0125 ммоль), раствор AIBN (0,308 мл, 0,00188 ммоль) и бутилацетат (5,3 мл) вносили в стеклянную пробирку объемом 20 мл с магнитной мешалкой. Пробирку запечатывали крышкой с диафрагмой, и через раствор барботировали азот с применением длинного шприца со вторым шприцем в качестве выходного канала в течение 1 ч. Шприцы удаляли, и пробирку нагревали до температуры 80°С в течение 16 ч с применением масляной бани. Раствору позволяли охладиться до комнатной температуры и переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл перед добавлением в раствор гексана (35 мл). Раствор центрифугировали в течение 2 мин при 4400 об/мин. Слой супернатанта аккуратно сцеживали, и нижний слой (твердый или гелеподобный) промывали гексаном. Затем нижний слой повторно растворяли в DCM (7 мл), преципитировали в гексане (40 мл) и еще раз центрифугировали. Супернатант сцеживали, и нижний слой промывали гексаном перед тем как полимер высушивали под пониженным давлением в течение нескольких часов. Выход неочищенного ЕАВ-сополимера составил 0,856 г. Образцы неочищенного полимера отбирали для анализа методом многоуглового рассеяния излучения (multi-angle light scattering, MALS). Высушенный неочищенный сополимер растворяли в DCM (100 мг/мл). Добавляли гексан до момента достижения точки помутнения. Полученный в результате непрозрачный раствор центрифугировали. Нижний слой экстрагировали и полностью преципитировали в гексане. Фракцию центрифугировали, после чего сополимер выделяли и высушивали в вакууме. Выход выделенной фракции ЕАВ-сополимера составил 0,478 г. Образцы фракционированного сополимера отбирали для анализа методом 1Н-ЯМР (протонного ядерного магнитного резонанса) и MALS. Состав, определенный методом 1Н-ЯМР, представлял собой 61% N-Boc-этоксиэтиламина и акрилата, 39% вторбутилакрилата.
Анализ методом MALS: Приблизительно 10 мг сополимера растворяли в 0,5 мл 75% дихлорметана,
- 18 036949
20% тетрагидрофурана, 5% ацетонитрила. Молекулярную массу и полидисперсность (PDI) измеряли с применением детектора мультиракурсного светорассеяния Wyatt Heleos II, присоединенного к аппарату для ВЭЖХ Shimadzu Prominence с применением колонки Jordi 5 мкм 7,8x300 Mixed Bed LS DVB. MM неочищенного полимера: 59000 (PDI 1,3), MM фракционированного полимера: 70000 (PDI:1,1).
Снятие защиты/диализ: Высушенные образцы обрабатывали 2 М HCl в уксусной кислоте (~7 мл) в течение 1 ч для удаления защитных групп ВОС. Затем реакционную смесь разводили 20 мл воды и оставляли перемешиваться в течение 10-15 мин. После этого фракции диализовали с применением трубок для диализа с ММ 3500 при высоком содержании соли, при высоком содержании соли и воды в течение 15 ч, 8 ч и 15ч соответственно. Затем фракции переносили в центрифужные пробирки объемом 50 мл и лиофилизировали в течение 3 дней или досуха. Высушенные образцы восстанавливали до концентрации 20 мг/мл водой для последующего исследования.
С) Образование обратимо модифицированного конъюгата миРНК с полиамином: Полиакрилат ЕАВ в 5 мМ буфере HEPES, pH 8,0 модифицировали 1,5 мас.% азидом PEG4, активированным Nгидроксисукцинимидилом (сложный эфир азидо-dPEG4-NHS от Quanta Biodesign), с целью обеспечения азидных групп для последующего присоединения миРНК. Затем модифицированный азидом полимер разводили до концентрации 5 мг/мл в основном HEPES, 60 мг/мл. К данному раствору добавляли 15 мг/мл (3 мас. экв.) указанных расщепляемых протеазой модифицирующих реактивов PEG (описанных в настоящей заявке тетрапептидных агентов или PEG12-FCit-PABC-PNP (8426554)) для модификации 4050% доступных аминогрупп. Через 1 ч к раствору полимера добавляли модифицированную DBCO миРНК фактора VII грызунов (0,25 мас. экв. относительно полимера). После инкубации в течение ночи конъюгаты дополнительно модифицировали посредством добавления молярного избытка относительно доступных аминогрупп производного N-ацетилгалактозамина CDM-NAG, NAG-A4-A3-A2-A1-NHS или NAG-ACit-PABC-PNP (патент США 8426554, Rozema et al., 2015, Carlson et al., 2015) и инкубировали в течение 30 мин для обратимой модификации оставшихся ЕАВ-аминов полимера.
D) Анализ in vivo.
Мыши и процедуры анализа. Самцов крыс линии Вистар и самок мышей ICR в возрасте от 6 до 8 недель получали в компании Harlan Sprague-Dawley (Индианаполис, Индиана). Животных содержали в соответствии с протоколами по использованию животных, одобренными комитетом по содержанию и использованию животных Arrowhead Madison Inc. Грызунов содержали при цикле 12 ч света/темноты при свободном доступе к воде и пище (Harlan Teklad Rodent Diet, Harlan, Мэдисон, Висконсин). Животным вводили инъекции 1 мг/кг полимера, конъюгированного с 0,25 мг/кг миРНК. Образцы отбирали через 5 дней после инъекции.
Измерения активности FVII в сыворотке. Образцы сыворотки готовили путем забора крови посредством субмандибулярного кровозабора в микроцентрифужные пробирки, содержащие 0,109 М антикоагулянта цитрата натрия (1 объем), согласно стандартным процедурам. Активность FVII в сыворотке измеряли хромогенным способом с применением набора для анализа (BIOPHEN VII, Aniara, Мейсон, Огайо) согласно рекомендациям производителя. Поглощение в результате развития колориметрической реакции измеряли с применением считывающего устройства для микропланшетов Tecan Safire-2 при длине волны 405 нм.
Данные табл. 7 демонстрируют, что полимеры для доставки на основе тетрапептидов, модифицированных DPC, являлись эффективными для доставки миРНК in vivo. Также тетрапептидные агенты являлись настолько же эффективными, как и ранее описанные модифицирующие агенты на основе дипептида PABC. Конъюгаты, несущие 44а и 44b, которые содержат протеолитический тетрамер FCitFP (SEQ ID NO: 12), продемонстрировали активность, эквивалентную активности конъюгатов, в которых для нокдауна применяли расщепление, опосредованное PABC (табл. 7). Эффективная доставка миРНК свидетельствует об эффективной модификации и нацеливании полиамина и успешном ферментативном расщеплении и высвобождении полимера в гепатоцитах после доставки в клетку.
Активность и функция in vivo коррелировали с данными о скорости ферментативного расщепления in vitro, причем полимеры для доставки на основе DPC, модифицированного FCitFP (SEQ ID NO: 12), демонстрировали лучшую доставку миРНК, чем полимеры для доставки на основе DPC, модифицированного FCitAP. Таким образом, данные о скорости ферментативного расщепления in vitro точно прогнозировали данные о ферментативном расщеплении и высвобождении in vivo.
- 19 036949
Таблица 7
Нормированные уровни фактора VII после инъекции конъюгатов полимера с миРНК, нацеленных с помощью лабильных в отношении протеазы реактивов NAG
Модифицирующий агент Относительная активность фактора VII
Активность у мышей
(44а) PEG-FCitFP-OSu/(44b) NAG-FCitFP-OSu 27±06
(45а) PEG-FCitAP-OSu/(45b) NAG-FCitAP-OSu 48±14
PEG-FCit-PABC-PNP/NAG-ACit-PABC-PNP 24±11
Активность у крыс
(44а) PEG-FCitFP-OSu/(44b) NAG-FCitFP-OSu 26±22
(45а) PEG-FCitAP-OSu/(45b) NAG-FCitAP-OSu 48±8
PEG-FCit-PABC-PNP/NAG-ACit-PABC-PNP 30±13
Пример 8. Полимеры для доставки на основе тетрапептидов-миметиков RGD и тетрапептидов DPC, модифицированных PEG.
А) Синтез амфипатических мембраноактивных полиаминов APN 1170-100A (100А) и APN 1203-006 (006). __________________________________________________________________________
Полимер ММ (защищен ный) Теоретическая ММ (после снятия защиты) PDI % Введенн ых аминов % Введенн ых алкилов % Удаления концевых групп Азиды/ Полиме Р
APN 1170-100А 64430 45765 1,22 56 44 0 1,25
APN 1203-006 60330 43578 1,05 56 44 99 1Д4
i) Материалы. 2,2'-Азобис-(2,4-диметилвалеронитрил) (V-65, инициатор радикальной полимеризации) заказывали в компании Wako Pure Chemical Industries. Пропилакрилат заказывали в компании Polysciences Inc. N-Boc-этоксиэтиламинакрилат получали в компании WuXi Inc. 2-(додецилтиокарбонотиоилтио)-2-метилпропионовую кислоту (DDMAT, RAFT-агент), 1,1'-азобис-(циклогексанкарбонитрил) (ACHN), 1-этилпиперидингипофосфит (ЕРНР), пентафторфенол, N,N'дициклогексилкарбодиимид и N,N-диизопропил-этиламин заказывали в компании Sigma Aldrich. О-(2Аминоэтил)-О'-(2-азидоэтил)триэтиленгликоль (азидо-PEG4-амин) заказывали в компании Biomatrik Inc.
ii) RAFT-сополимер N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и пропилакрилата (ЕАР). Готовили растворы V-65 (2 мг/мл) и RAFT-агента DDMAT (10 мг/мл) в бутилацетате. Молярный состав исходной мономерной смеси представлял собой 52% N-Boc-этоксиэтиламинакрилата, 48% пропилакрилата. Теоретическая ММ составила 75000. Молярное соотношение RAFT-агента (DDMAT) к инициатору (V-65) составило 6,67:1. N-Boc-этоксиэтиламинакрилат (1,778 г, 6,86 ммоль), пропилакрилат (0,794 мл, 0,722 г, 6,33 ммоль), раствор DDMAT (1,215 мл, 0,0333 ммоль), раствор V-65 (0,621 мл, 0,005 ммоль) и бутилацетат (10,2 мл) вносили в стеклянную пробирку объемом 20 мл с магнитной мешалкой. Пробирку запечатывали крышкой с диафрагмой, и через раствор барботировали азот с применением длинной иглы со второй иглой в качестве выходного канала в течение 1 ч. Иглы удаляли, и пробирку нагревали до температуры 50°С в течение 24 ч при перемешивании. Раствору позволяли охладиться до комнатной температуры и переносили поровну в две центрифужные пробирки объемом 50 мл до добавления гексана (35 мл) в обе пробирки. Раствор центрифугировали в течение 2 мин при 4400 об/мин. Слой супернатанта аккуратно сцеживали, и нижний слой промывали гексаном. Затем нижний слой из каждой пробирки повторно растворяли в дихлорметане (7 мл), преципитировали в гексане (40 мл) и еще раз центрифугировали. Супернатант сцеживали, и нижний слой промывали гексаном перед тем как слои объединяли в одну центрифужную пробирку объемом 50 мл и полимер высушивали под пониженным давлением в течение нескольких часов. Выход неочищенного ЕАР-сополимера составил 2,1 г. Образцы сополимера отбирали для анализа методом многоуглового рассеяния излучения (MALS) и 1Н-ЯМР.
Полимер 006: Состав, определенный методом 1Н-ЯМР, являлся следующим: 55% N-Bocэтоксиэтиламинакрилата и 45% пропилакрилата. ММ 006, определенная методом MALS, составила 58600 г/моль с индексом полидисперсности (PDI) 1,04.
Полимер 100А: Состав, определенный методом 1Н-ЯМР: 56% N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и 44% пропилакрилата. ММ, определенная методом MALS: 65150, PDI 1,122.
iii) Индуцированное радикалами удаление ω-концевой группы (исключительно полимер 006). Готовили растворы 1,1'-азобис-(циклогексанкарбонитрила) (ACHN, 20 мг/мл) и 1этилпиперидингипофосфита (ЕРНР, 100 мг/мл) в толуоле. ЕАР (2 г, 0,035 ммоль), ACHN (0,213 мл, 0,5 экв., 0,0174 ммоль), ЕРНР (1,25 мл, 20 экв., 0,697 ммоль) и толуол (25,2 мл) вносили в стеклянную пробирку объемом 40 мл с магнитной мешалкой. Пробирку запечатывали крышкой с диафрагмой, и через раствор барботировали азот с применением длинной иглы со второй иглой в качестве выходного канала в течение 1 ч. Иглы удаляли, и пробирку нагревали до температуры 100°С в течение 2 ч. Раствору позволяли охладиться до комнатной температуры, и ~20 мл толуола удаляли посредством ротационного выпа
- 20 036949 ривания. Оставшийся раствор переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавляли гексан (35 мл). Раствор центрифугировали в течение 2 мин при 4400 об/мин. Слой супернатанта аккуратно сцеживали, и нижний слой промывали гексаном. Затем нижний слой повторно растворяли в дихлорметане (7 мл), преципитировали в гексане (40 мл) и еще раз центрифугировали. Супернатант сцеживали, и нижний слой промывали гексаном перед тем как полимер высушивали под пониженным давлением в течение ~1 ч. Полимер растворяли в метил-трет-бутиловом эфире (80 мл) и переносили в делительную воронку. Затем раствор промывали 3x30 мл объемов H2O с последующей промывкой 3x30 мл объемов насыщенного NaCl. Затем раствор полимера высушивали над сульфатом натрия и фильтровали через вакуум-фильтры 0,45 мкм GHP. МТВЕ удаляли посредством ротационного выпаривания в высоком вакууме. Отбирали образец для контроля удаления концевой группы с применением УФ-спектрофотометра. Удаление концевой группы согласно расчету составило 99%. Отбирали образцы для анализа методом MALS, ГХ-ПИД (газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором) и 1Н-ЯМР. Состав 006, определенный методом 1Н-ЯМР, являлся следующим: 55% N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и 45% пропилакрилата. Конверсия 006, определенная методом ГХ-ПИД, составила 81,4% для N-Bocэтоксиэтиламинакрилата и 77,3% для пропилакрилата. Конверсия 100А, определенная методом ГХ-ПИД, составила 87% для N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и 83% для пропилакрилата. ММ полимера 006, определенная методом MALS, составила 57700 г/моль с индексом полидисперсности (PDI) 1,06.
iv) Активация α-концевой группы пентафторфенолом. ЕАР-полимер (2 г, 0,0347 ммоль), пентафторфенол (63,8 мг, 0,3466 ммоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (71,5 мг, 0,3466 ммоль) и дихлорметан (40 мл) вносили в круглодонную колбу объемом 100 мл с магнитной мешалкой. Колбу закупоривали резиновой мембраной, и через систему продували азот в течение 15 мин. Раствор перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Добавляли дополнительный пентафторфенол (63,8 мг, 0,3466 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (71,5 мг, 0,3466 ммоль), колбу закупоривали резиновой мембраной, и через систему продували азот в течение 15 мин. Раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Полимер преципитировали гексаном (~10x объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве дихлорметана, преципитировали гексаном (~10x объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве этилацетата, преципитировали гексаном (~10x объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Преципитат полимера высушивали в высоком вакууме до тех пор, пока твердое вещество не достигло постоянной массы.
v) Функционализация α-концевой группы азидом. В круглодонной колбе объемом 100 мл, оборудованной резиновой мембраной и магнитной мешалкой, полимер с предшествующей стадии (1,9 г, 0,0329 ммоль) растворяли в дихлорметане (38 мл). В колбу при перемешивании добавляли азидо-PEG4-амин (86,4 мг, 0,3293 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (46,8 мг, 63,1 мкл, 0,3622 ммоль). Через систему продували азот в течение 15 мин, и реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи. В колбу добавляли дополнительный азидо-PEG4-амин (86,4 мг, 0,3293 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (46,8 мг, 63,1 мкл, 0,3622 ммоль), через систему продували газообразный N2, и реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Полимер преципитировали гексаном (~10x объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве дихлорметана, преципитировали гексаном (~10x объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Преципитат полимера высушивали в высоком вакууме до тех пор, пока твердое вещество не достигло постоянной массы. Выход функционализированного азидом ЕАР составил 1,77 г. Образцы сополимера отбирали для анализа методом многоуглового рассеяния излучения (MALS) и 1HЯМР.
Полимер 006: Состав, определенный методом 'H-ЯМР. являлся следующим: 56% N-Bocэтоксиэтиламинакрилата и 44% пропилакрилата. ММ, определенная методом MALS, составила 60330 г/моль с индексом полидисперсности (PDI) 1,05.
Полимер 100А: Состав, определенный методом 1Н-ЯМР, являлся следующим: 56% N-Bocэтоксиэтиламинакрилата и 44% пропилакрилата. ММ, определенная методом MALS: 64430 с PDI 1,217.
Моноазид: Термин моноазид или моноазидный полимер указывает, что были проведены стадии D и Е вышеописанных процедур, и азидную группу сочетали с α-концевой группой полимера.
vi) Снятие защиты Boc и фильтрация тангенциальным потоком. В круглодонную колбу объемом 100 мл к функционализированному азидом ЕАР-сополимеру (1,67 г, 0,0277 ммоль) добавляли 2 М HCl в уксусной кислоте (28 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли деионизированную H2O (56 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Затем раствор немедленно заменяли 10 эквивалентными объемами 5 мМ фосфатно-цитратного буфера (pH 5) с применением модуля фильтров mPES 30 кДа 115 см2, оборудованного системой фильтрации тангенциальным потоком (KrosFlo Research). Затем раствор концентрировали с применением аппарата до конечного объема 55 мл. Было зафиксировано значение pH 5,1. Образцы отбирали для определения концентрации методом парофазной газовой хроматографии. Аликвоту лиофилизировали, а затем восстанавливали в 33,3% ацетонитриле-d в оксиде дейтерия до концентрации 10 мг/мл для анализа методом 1H-ЯМР. Рассчитанная теоре
- 21 036949 тическая ММ составила 43026 и 45765 г/моль для 006 и 100А соответственно.
vii) С применением аналогичных методик можно с легкостью получить аналогичные амфипатические мембраноактивные полиамины. В частности, амфипатические мембраноактивные полиамины с молекулярной массой (ММ) 40-120 к (защищенные), от 25 до 85 к (после снятия защиты), с PDI от 1,03 до 1,2 и соотношением мономеров от 35% мономера с амином/65% мономера с гидрофобной группой до 70% мономера с амином/30% мономера с гидрофобной группой.
В) Синтез APN 1095-126 (126)._________________________________________________
мм (защищенные ) Теоретическая ММ (после снятия защиты) PDI % Встраивания амина % Встраивания алкила % Удаления концевой группы Азидов на полимер
66670 47606 1,11 56 44 0 4,1
При синтезе APN 1095-126 использовали дитиобензоатный фрагмент RAFT-агента и RAFTинициатор AIBN вместо тритиокарбонатного фрагмента RAFT-агента и RAFT-инициатора V-65, которые применяли для синтеза 100А и 006. Условия для данной полимеризации требовали отличных температур и времен нагрева. Помимо этого, для данного полимера требовалось фракционное осаждение. Полимер не являлся эндкепированным, но способ добавления азида являлся таким же, что и в случае 100А и 006.
i) Материалы. Пропилакрилат заказывали в компании Polysciences Inc. N-Bocэтоксиэтиламинакрилат получали в компании WuXi Inc. 4-циано-4-(фенилкарбонотиоилтио) пентановую кислоту (СРСРА, RAFT-агент), 2,2'-азобис-(2-метилпропионитрил) (AIBN, инициатор радикальной полимеризации), пентафторфенол, N,N'-дициклогексилкарбодиимид и N,N-диизопропилэтиламин заказывали в компании Sigma Aldrich. О-(2-Аминоэтил)-О'-(2-азидоэтил)триэтиленгликоль (азидо-PEG4-амин) заказывали в компании Biomatrik Inc.
ii) RAFT-сополимер N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и пропилакрилата (ЕАР). Следующую процедуру повторяли 8 раз с получением в совокупности 4,5513 г фракционированного ЕАР-сополимера. Готовили растворы AIBN (1,035 мг/мл) и RAFT-агента СРСРА (50,54 мг/мл) в бутилацетате. Молярный состав исходной мономерной смеси являлся следующим: 52% N-Boc-этоксиэтиламинакрилата, 48% пропилакрилата. Теоретическая ММ составила 75000. Молярное соотношение RAFT-агента (СРСРА) к инициатору (AIBN) составило 6,67:1.
N-Boc-этоксиэтиламинакрилат (1,7879 г, 6,9 ммоль), пропилакрилат (0,774 мл, 0,7121 г, 6,24 ммоль), раствор СРСРА (0,184 мл, 0,0333 ммоль), раствор AIBN (0,793 мл, 0,005 ммоль) и бутилацетат (11,02 мл) вносили в стеклянную пробирку объемом 20 мл с магнитной мешалкой. Пробирку запечатывали крышкой с диафрагмой, и через раствор барботировали азот с применением длинной иглы со второй иглой в качестве выходного канала в течение 1 ч. Иглы удаляли, и пробирку нагревали до температуры 50°С в течение 24 ч при перемешивании. Раствору позволяли охладиться до комнатной температуры и переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл перед добавлением гексана (35 мл). Раствор центрифугировали в течение 2 мин при 4400 об/мин. Слой супернатанта аккуратно сцеживали, и нижний слой промывали гексаном. Затем нижний слой из каждой пробирки повторно растворяли в дихлорметане (7 мл), преципитировали в гексане (40 мл) и еще раз центрифугировали. Супернатант сцеживали, и нижний слой промывали гексаном перед тем как полимер высушивали под пониженным давлением в течение нескольких часов. Выход неочищенного ЕАР-сополимера составил 1,734 г. Образцы неочищенного сополимера отбирали для анализа методом многоуглового рассеяния излучения (MALS) и 1Н-ЯМР. Высушенный неочищенный сополимер растворяли в DCM (100 мг/мл). Добавляли гексан до момента достижения точки помутнения. Полученный в результате непрозрачный раствор центрифугировали. Нижний слой экстрагировали и полностью преципитировали в гексане. Фракцию центрифугировали, после чего сополимер выделяли и высушивали в вакууме. Выход выделенной фракции ЕАР-сополимера составил 0,602 г. Образцы фракционированного сополимера отбирали для анализа методом 1Н-ЯМР и MALS. Состав, определенный методом 1Н-ЯМР, являлся следующим: 56% N-Boc-этоксиэтиламинакрилата и 44% пропилакрилата. ММ, определенная методом MALS, составила 62010 г/моль с индексом полидисперсности (PDI) 1,14.
iii) Активация α-концевой группы пентафторфенолом. ЕАР-полимер (2 г, 0,0347 ммоль), пентафторфенол (63,8 мг, 0,3466 ммоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (71,5 мг, 0,3466 ммоль) и дихлорметан (40 мл) вносили в круглодонную колбу объемом 100 мл с магнитной мешалкой. Колбу закупоривали резиновой мембраной, и через систему продували азот в течение 15 мин. Раствор перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Добавляли дополнительный пентафторфенол (63,8 мг, 0,3466 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (71,5 мг, 0,3466 ммоль), колбу закупоривали резиновой мембраной, и через систему продували азот в течение 15 мин. Раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Полимер преципитировали гексаном (~10х объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве дихлорметана, преципитировали гексаном (~10х объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве этилацетата, преципитировали гексаном (~10х объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Преципитат полимера высушивали в высоком вакууме до тех пор, пока твердое вещество не достигло постоянной массы.
- 22 036949 iv) Функционализация α-концевой группы азидом. В круглодонной колбе объемом 100 мл, оборудованной резиновой мембраной и магнитной мешалкой, полимер с предшествующей стадии (1,9 г, 0,0329 ммоль) растворяли в дихлорметане (38 мл). В колбу при перемешивании добавляли азидо-PEG4амин (86,4 мг, 0,3293 ммоль) и N,N-диизопропил-этиламин (46,8 мг, 63,1 мкл, 0,3622 ммоль). Через систему продували азот в течение 15 мин, и реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи. В колбу добавляли дополнительный азидо-PEG4-амин (86,4 мг, 0,3293 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (46,8 мг, 63,1 мкл, 0,3622 ммоль), через систему продували газообразный N2, и реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Полимер преципитировали гексаном (~10х объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Полимер растворяли в минимальном количестве дихлорметана, преципитировали гексаном (~10х объем), центрифугировали, и растворитель сцеживали. Преципитат полимера высушивали в высоком вакууме до тех пор, пока твердое вещество не достигло постоянной массы. Выход функционализированного азидом ЕАР составил 1,77 г. Образцы сополимера отбирали для анализа методом многоуглового рассеяния излучения (MALS) и 1Н-ЯМР. Состав, определенный методом 1Н-ЯМР, являлся следующим: 56% N-Bocэтоксиэтиламинакрилата и 44% пропилакрилата. ММ, определенная методом MALS, составила 66670 г/моль с индексом полидисперсности (PDI) 1,11.
v) Снятие защиты Boc и фильтрация тангенциальным потоком. В круглодонную колбу объемом 100 мл к функционализированному азидом ЕАР-сополимеру (1,67 г, 0,0277 ммоль) добавляли 2 М HCl в уксусной кислоте (28 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли деионизированную H2O (56 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Затем раствор немедленно заменяли 10 эквивалентными объемами 5 мМ фосфатно-цитратного буфера (pH 5) с применением модуля фильтров mPES 30 кДа 115 см2, оборудованного системой фильтрации тангенциальным потоком (KrosFlo Research). Затем раствор концентрировали с применением аппарата до конечного объема 55 мл. Было зафиксировано значение pH 5,1. Образцы отбирали для определения концентрации методом парофазной газовой хроматографии. Аликвоту лиофилизировали, а затем восстанавливали в 33,3% ацетонитриле-d в оксиде дейтерия до концентрации 10 мг/мл для анализа методом 1Н-ЯМР. Рассчитанная теоретическая ММ составила 43026 г/моль.
С) Синтез агентов и PFGn-FCzTFP-ZFP. Предшественник модифицирую- щего агента (di-Boc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-COOH получали с применением твердофазного синтеза на основе общей химии Fmoc с применением смолы 2-Cl-Trt, предварительно нагруженной Fmoc-пролин-ОН. К смоле-Pro-Fmoc последовательно добавляли (после снятия защиты Fmoc на каждой стадии): FMoc-Phe-ОН, Fmoc-Cit-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-NH-PEGn-COOH, 4-(N-Fmoc-Hаминофенокси)-масляную кислоту (АРВА), Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH и diboc-m-гуанидино бензойную кислоту.
(diboc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-COOH (458 мг, 0,200 ммоль) и TFP (66,5 мг, 0,400 ммоль) растворяли в безводном DCM (5,0 мл) и охлаждали до температуры 0°С на ледяной бане при перемешивании в атмосфере аргона. Добавляли EDC (77 мг, 0,400 ммоль), и реакционную смесь перемешивали на ледяной бане при температуре 0°С в течение 30 мин, прохождение реакции контролировали методом ТСХ (тонкослойной хроматографии, 8,5:1,5 СНС13:МеОН); реакция была завершена через 90 мин, причем какое-либо исходное вещество не обнаруживалось методом ТСХ. Реакционную смесь разводили DCM до общего объема 100 мл, промывали 3х40 мл DI H2O (pH 5) и промывали 1х40 мл водного насыщенного раствора NaCl. Затем органический слой высушивали над Na2SO4 и концентрировали посредством ротационного выпаривания с получением 448 мг (выход 92%) коричнево-оранжевой пены. Структуру подтверждали методом 1Н-ЯМР и МС-ИЭР (масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, реакция показана выше для PEG20 (n=20)).
(diboc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-TFP (показано для η = 20) (diboc)RGD(OtBu)-PEGn-FCitFP-TFP (497 мг, 0,204 ммоль) растворяли в смеси [9,25:0,75:0,50] TFA:Н2О:тиоанизол (5,0 мл) и перемешивали при комнатной температуре в закрытой колбе в течение 45 мин. Завершение реакции подтверждали методом МС, масс-спектрометрии (ИЭР, ионизация электрораспылением, отрицательное сканирование, 300-3000); наблюдаемые массы, относящиеся к исходному ве- 23 036949 ществу или промежуточным продуктам с частично снятой защитой, отсутствовали. Затем реакционную смесь преципитировали в 45 мл диэтилового эфира, центрифугировали, супернатант сливали, промывали 2x10 мл диэтилового эфира и высушивали в высоком вакууме в течение ночи. Конечный продукт очищали методом препаративной ВЭЖХ с применением полупрепаративной колонки Thermo Aquasil C18 5 мкм с подвижными фазами 0,1% TFA в H2O и ACN. Каждая инжекция представляла собой 50 мг неочищенного вещества, растворенного в 3,0 мл 0,1% TFA в [61:39] H2O:ACN, которую анализировали при градиенте (указан в %В) 39-(5)-39-(35)-43-(5)-95-(10)-95-(2)-39-(5)-39. Каждый образец для инжекции готовили (растворяли) в течение 15 мин перед инжектированием, и положительные фракции объединяли в одной колбе и хранили охлажденными в морозильной камере до тех пор, пока не была выполнена последняя инжекция в день. Затем положительные фракции концентрировали на ротационном испарителе при температуре бани 32°С досуха, затем прогоняли 2х ACN/толуол, затем 3x ACN, после чего высушивали в высоком вакууме в течение ночи. Из инжектированных 257 мг неочищенного вещества в виде чистого вещества выделяли 180 мг (70%) (реакция показана выше для PEG20 (n=20)).
N-H
Η
RGD-PEGn-FCitFP-TFP (показано для η = 20)
Синтез 4-(N-Fmoc-n-аминофенокси)-масляной кислоты 1. п-нитрофенол (2) (7,5 г, 53,9 ммоль) объединяли с этил-4-бромбутиратом (8,45 мл, 59 ммоль) и K2CO3 (7,5 г, 54 ммоль) в DMF (75 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч при температуре 100°С. DMF удаляли, и неочищенный продукт разводили в смеси в соотношении 3:1 2 н. NaOH и метанола и перемешивали в течение 4 ч при к.т. Реакционную смесь подкисляли 6 М HCl. Белый преципитат собирали с получением 4-(п-нитрофенилокси)-масляной кислоты 3: (10,9 г, выход 90%).
4-(п-нитрофенилокси)-масляную кислоту 3 (37,1 г, 165 ммоль) растворяли в МеОН (1 л) с формиатом аммония (35 г, 555 ммоль) и добавляли 10% Pd/C (типа Дегусса) (3,5 г). Смесь нагревали в обратном холодильнике при температуре 65°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит с получением красновато-коричневого твердого вещества продукта 4-(п-аминофенилокси)-масляной кислоты 4 (30,5 г, выход 95%).
4-(п-аминофенилокси)-масляную кислоту 4 (5,1 г, 26 ммоль) растворяли в смеси в соотношении 6:4 водного насыщенного NaHCO3 (3,36 г, 40 ммоль) в H2O (450 мл) и THF (300 мл) с получением белой густой суспензии. Добавляли Fmoc-OSu (8,82 г, 26,1 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч. Ацетон удаляли, реакцию подкисляли (HCl), и белый с металлическим оттенком преципитат собирали и растирали в 1 н. HCl с получением 9,6 г продукта 4-(N-Fmoc-n-аминофенокси)-масляной кислоты 1 (выход 88%).
diBoc-m-гуанидино-бензойную кислоту 5 синтезировали согласно публикации Riches AG et al., Tetrahedron (2012) 68, p. 9448-9455.
Модифицирующие агенты PEGn-FCitFP получали с применением аналогичной химии.
D) Маскировка (модификация) полимера. Проводили реакцию моноазидного полимера с RGDагентом, расщепляемым протеазой (RGD-PEG8-ACit-PNP, RDG-PEG8-FCitFP-TFP, RGD-PEG15-FCitFPTFP, RGD-PEG19-FCitFP-TFP или RGD-PEG20-FCitFP-TFP), при массовых соотношениях, составляющих 1:0,125, 1:0,25, 1:0,5, 1:1, 1:1,5, 1:2 (полимер:RGD), в 50 мМ буфере HEPES, pH 8,5 в течение 4 ч при к.т. Затем проводили реакцию модифицированного полимера с RGD-агентом, расщепляемым протеазой (PEG6-ACit-PABC-PNP, PEG12-ACit-PABC-PNP, PEG12-FCit-PABC-PNP, PEG12-FCitFP-TFP), при массовом соотношении 1:8 (полимер:PEG) в 50 мМ буфере HEPES, pH 8,5 в течение 2 ч при к.т. К модифицированному полимеру в 100 мМ буферном растворе ацетата натрия-уксусной кислоты, pH 5,0 добавляли алкин-триггер РНКи при массовом соотношении 1:0,3 (полимер:алкин-триггер РНКи) в течение 5 дней при к.т. Полный конъюгат очищали с помощью TFF и определяли эффективность конъюгации.
E) Оценка доставки in vivo с применением полимеров для доставки на основе DPC, модифицированного тетрапептидом. Мышей, несущих опухоль RCC почки, лечили одной инъекцией в хвостовую вену изотоничной глюкозы (G1) или указанного Hif2a-ITG-DPC (Hif2α-ITG-DPC=конъюгат триггера РНКи Hif2a и полимера для доставки). Полимер для доставки являлся модифицированным лигандом
- 24 036949
RGD и модифицирующими агентами PEG). Мышам проводили эвтаназию через 72 ч после инъекции, и суммарную РНК получали из опухоли почки с применением реактива Trizol согласно рекомендациям производителя. Относительные уровни мРНК HiF2a определяли методом РВ-кПЦР (количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией), как описано ниже, и сравнивали с мышами, получавшими лечение исключительно буфером для доставки (изотоничной глюкозой) (табл. 8).
Таблица 8
Триггер РНКи HiF2a йд^ф. иг номер мкг полимера Агент RGD π Уровень RGD/ Природа , модиф. полимер Агент PEG Относит, экспрессия, день 4 тт Высока Низкая я вероятн средн. вероятн - ость ошибок ошибок
- 1,000 0,060 0,064
AD01031 80 280 RGD-PEG8-HyNic PEG12-AC-PABC 0,300 0,074 0,098
ADO 1031 80 280 RGD-PEG8-AC-PABC 0,4 x PEG6-AC-PABC 0,311 0,055 0,067
AD01214 80 280 RGD-PEG8-HyNic PEG12-FC-PABC 0,489 0,022 0,023
AD01214 80 280 RGD-PEG8-HyNic PEG12-FCFP-TFP 0,210 0,032 0,038
AD01214 80 280 RGD-PEG-AC-PABC PEG6-AC-PABC 0,360 0,019 0,021
AD01214 80 280 RGD-PEG8-ACFP lx PEG6-AC-PABC 0,288 0,005 0,005
AD01214 115 375 RGD-PEG8-HyNic PEG12-FCFP-TFP 0,258 0,033 0,038
AD01214 112,5 375 RGD-PEG15-FCFP-TFP 0,5 x 10,8 PEG12-AC-PABC 0,193 0,046 0,061
AD01214 112,5 375 RGD-PEG15-FCFP-TFP lx 16,1 PEG12-AC-PABC 0,182 0,007 0,008
AD01214 112,5 375 RGD-PEG15-FCFP-TFP 2χ 29,0 PEG12-AC-PABC 0,182 0,031 0,038
AD01214 112,5 375 RGD-PEG19-FCFP-TFP 0,5 x 10,7 PEG12-AC-PABC 0,163 0,023 0,027
AD01214 112,5 375 RGD-PEG19-FCFP-TFP lx 18,5 PEG12-AC-PABC 0,114 0,011 0,012
AD01214 112,5 375 RGD-PEG19-FCFP-TFP 2χ 31,1 PEG12-AC-PABC 0,182 0,047 0,063
AD01214 112,5 375 RGD-PEG15-FCFP-TFP lx PEG12-FCFP-TFP 0,148 0,079 0,169
AD01214 112,5 375 RGD-PEG19-FCFP-TFP lx PEG12-FCFP-TFP 0,188 0,026 0,030
AD01214 112,5 300 RGD-PEG8-HyNic PEG12-AC-PABC 0,357 0,069 0,086
AD01214 112,5 375 RGD-PEG20-FCFP-TFP 0,125x 1,9 PEG12-AC-PABC 0,169 0,052 0,075
AD01214 112,5 375 RGD-PEG20-FCFP-TFP 0,25 x 3,4 PEG12-AC-PABC 0,168 0,029 0,035
AD01214 112,5 375 RGD-PEG20-FCFP-TFP 0,5 x 6,6 PEG12-AC-PABC 0,130 0,004 0,005
AD01214 112,5 375 RGD-PEG20-FCFP-TFP lx 13 PEG12-AC-PABC 0,121 0,016 0,018
AD01214 112,5 375 RGD-PEG20-FCFP-TFP l,5x 20 PEG12-AC-PABC 0,135 0,018 0,020
Пример 9. Дополнительные структуры, иллюстрирующие практическую ценность описанных тетрапептидных линкеров.
R-FcitFP - дигоксин (молекула лекарственного средства)
R5-FcitFP - фолат (лиганд рецептора клетки)
R5-FcitFP - PSMA
RGD-FcitFP - реакционноспособная группа TFT (рецептор клетки (модифицирующий агент, содержащий миметик RGD)).

Claims (7)

1. Тетрапептидный линкер, содержащий структуру, представленную формулой:
где указанный тетрапептидный линкер соединен с:
a) первым соединением, которое содержит нацеливающую группу, содержащую пептид, и
b) вторым соединением, содержащим полинуклеотид.
2. Тетрапептидный линкер по п.1, характеризующийся тем, что указанный тетрапептидный линкер соединен с первым соединением и/или со вторым соединением амидной связью.
3. Тетрапептидный линкер по п.1, характеризующийся тем, что указанный пептид содержит лиганд рецептора клетки, обладающий аффинностью к интегрину.
4. Тетрапептидный линкер по п.3, характеризующийся тем, что интегрин представляет собой интегрин αγβ3.
5. Тетрапептидный линкер по п.3, характеризующийся тем, что интегрин представляет собой интегрин αγβ6.
6. Тетрапептидный линкер по п.3, характеризующийся тем, что лиганд рецептора клетки, обладающий аффинностью к интегрину, содержит RGD-содержащий пептид.
7. Тетрапептидный линкер по п.1, характеризующийся тем, что полинуклеотид представляет собой триггер РНКи.
EA201792101A 2015-05-29 2016-05-27 Биологически расщепляемые тетрапептидные связывающие агенты EA036949B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562168244P 2015-05-29 2015-05-29
US201562235833P 2015-10-01 2015-10-01
PCT/US2016/034517 WO2016196243A1 (en) 2015-05-29 2016-05-27 Biologically cleavable tetrapeptide linking agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201792101A1 EA201792101A1 (ru) 2018-06-29
EA036949B1 true EA036949B1 (ru) 2021-01-19

Family

ID=57398322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792101A EA036949B1 (ru) 2015-05-29 2016-05-27 Биологически расщепляемые тетрапептидные связывающие агенты

Country Status (15)

Country Link
US (2) US10005815B2 (ru)
EP (1) EP3302516B1 (ru)
JP (1) JP6966427B2 (ru)
KR (1) KR102633963B1 (ru)
CN (1) CN107614002B (ru)
AU (1) AU2016270597B2 (ru)
BR (1) BR112017025719A2 (ru)
CA (1) CA2984499A1 (ru)
EA (1) EA036949B1 (ru)
IL (1) IL255999A (ru)
MX (1) MX2017014638A (ru)
SG (1) SG11201708602XA (ru)
TW (1) TWI732761B (ru)
WO (1) WO2016196243A1 (ru)
ZA (1) ZA201707149B (ru)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000047608A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 Glaxo Group Limited Process for the preparation of cyclic tetrapeptide derivatives
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US20080214648A1 (en) * 2003-05-08 2008-09-04 Herman Augustinus De Kock Hiv Prodrugs Cleavable by Cd26
US7589170B1 (en) * 1998-09-25 2009-09-15 The University Of Queensland Synthesis of cyclic peptides
WO2009117531A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001286727A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy
WO2005089287A2 (en) 2004-03-15 2005-09-29 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
CN102614528B (zh) 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US20100227920A1 (en) 2008-09-29 2010-09-09 The Regents Of The University Of California Aldehyde dehydrogenase inhibitors as novel depigmenting agents
US8513207B2 (en) 2008-12-18 2013-08-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
EP2382993A1 (en) * 2010-04-19 2011-11-02 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Combination of drugs with protein-binding prodrugs
EP2658981B1 (en) 2010-12-29 2016-09-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
WO2012138294A1 (en) * 2011-04-05 2012-10-11 Curara Ab Novel peptides that bind to types of mhc class ii and their use on diagnosis and treatment
CN103945870B (zh) 2011-09-07 2016-10-12 普罗林科斯有限责任公司 生物可降解交联的水凝胶
EP2863955B1 (en) 2012-06-26 2016-11-23 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014052650A2 (en) * 2012-09-26 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modification of peptides via snar reactions of thiols with fluorinated aromatics
WO2014134483A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US20160132631A1 (en) * 2013-06-10 2016-05-12 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
EA201690051A1 (ru) 2013-08-07 2016-06-30 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн Поликонъюгаты для доставки триггеров рнк интерференции в клетки опухоли in vivo
WO2015038426A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Asana Biosciences, Llc Self-immolative linkers containing mandelic acid derivatives, drug-ligand conjugates for targeted therapies and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US7589170B1 (en) * 1998-09-25 2009-09-15 The University Of Queensland Synthesis of cyclic peptides
WO2000047608A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 Glaxo Group Limited Process for the preparation of cyclic tetrapeptide derivatives
US20080214648A1 (en) * 2003-05-08 2008-09-04 Herman Augustinus De Kock Hiv Prodrugs Cleavable by Cd26
WO2009117531A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
IL255999A (en) 2018-01-31
US20180258138A1 (en) 2018-09-13
EP3302516A1 (en) 2018-04-11
SG11201708602XA (en) 2017-12-28
ZA201707149B (en) 2019-02-27
JP6966427B2 (ja) 2021-11-17
TW201716426A (zh) 2017-05-16
EP3302516A4 (en) 2019-07-31
CN107614002A (zh) 2018-01-19
AU2016270597A1 (en) 2017-11-09
KR102633963B1 (ko) 2024-02-05
MX2017014638A (es) 2018-01-23
WO2016196243A1 (en) 2016-12-08
EP3302516B1 (en) 2020-12-30
CA2984499A1 (en) 2016-12-08
JP2018517769A (ja) 2018-07-05
US20160347793A1 (en) 2016-12-01
EA201792101A1 (ru) 2018-06-29
US10005815B2 (en) 2018-06-26
CN107614002B (zh) 2022-01-04
BR112017025719A2 (pt) 2018-08-07
TWI732761B (zh) 2021-07-11
AU2016270597B2 (en) 2022-05-26
KR20180010235A (ko) 2018-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8802773B2 (en) In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
AU2002306500C1 (en) Transporters comprising spaced arginine moieties
JP2620517B2 (ja) 重合性薬剤
AU2014306021B2 (en) Polyconjugates for delivery of RNAi triggers to tumor cells in vivo
CA2816041C (en) In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
WO2018085415A1 (en) Alpha-v beta-6 integrin ligands and uses thereof
EA036949B1 (ru) Биологически расщепляемые тетрапептидные связывающие агенты
WO2004082585A2 (en) Water-soluble conjugates of phenytoin
JP2017525678A (ja) 重合エンケファリンプロドラッグ

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM