EA034088B1 - Ген r2r1/2 для лечения и диагностики сердечных и легочных заболеваний или состояний, а также рака - Google Patents

Ген r2r1/2 для лечения и диагностики сердечных и легочных заболеваний или состояний, а также рака Download PDF

Info

Publication number
EA034088B1
EA034088B1 EA201300880A EA201300880A EA034088B1 EA 034088 B1 EA034088 B1 EA 034088B1 EA 201300880 A EA201300880 A EA 201300880A EA 201300880 A EA201300880 A EA 201300880A EA 034088 B1 EA034088 B1 EA 034088B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
gene
expression
conditions
diseases
cells
Prior art date
Application number
EA201300880A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300880A1 (ru
Inventor
Ерун Марсел Мария Рогер Арсенс
Роналд Карел Луиза Ван Бремпт
Питер Йохан Петерс
Роналд Антониус Де Хогт
Маркус Корнелис Де Рёйтер
Original Assignee
Академис Зикенхёйс Лейден А/Ю Лейден Юни Медикал Ктр
Жансен Фармасетика Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Академис Зикенхёйс Лейден А/Ю Лейден Юни Медикал Ктр, Жансен Фармасетика Нв filed Critical Академис Зикенхёйс Лейден А/Ю Лейден Юни Медикал Ктр
Publication of EA201300880A1 publication Critical patent/EA201300880A1/ru
Publication of EA034088B1 publication Critical patent/EA034088B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к применению полинуклеотида, содержащего регенеративный ген для респираторных клеток R2R; применению белка, кодируемого геном R2R; применению антисмыслового олигонуклеотида, способного модулировать экспрессию гена R2R; применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способных к связыванию с белком, кодируемым геном R2R, и к соответствующим фармацевтическим композициям для лечения сердечных и легочных заболеваний или состояний, а также рака. Кроме того, изобретение относится к способу диагностики указанных заболеваний или состояний, основанному на выявлении уровня экспрессии гена R2R, и способу тестирования соединения на способность модулировать экспрессию гена R2R. Изобретение также относится к животной модели для исследования сердечного и легочного заболеваний или состояний, а также рака.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение обеспечивает новые гены, поддерживающие развитие/сохранение тонкой трехмерной архитектуры легких, а также медикаменты и композиции для лечения заболеваний и/или состояний легких.
Предшествующий уровень техники
Экспрессия генов промежуточного филамента (Krt6), EDC (комплекса эпидермальной дифференцировки) и SCC (генного комплекса белков, секретируемых многослойным эпителием) обеспечивает выживание клеток в неблагоприятном окружении. Этот профиль экспрессии приводит к плоскоклеточной дифференцировке, и является признаком эпителиальных клеток кожи. Авторы изобретения установили, что эта программа транскрипции также является жизненно важной для доработки легочной архитектуры (позднего морфогенеза ветвления): клеткам в дистальных воздухоносных путях и кровеносных сосудах нужно приобрести плоскую форму и механическую гибкость в среде, богатой кислородом. Белки, кодируемые группой генов промежуточного филамента и связанных генов EDC и SCC, обеспечивают этот тип формы и гибкости клеток. В то же самое время, легким необходимо поддерживать клеткипредшественники, способные дифференцироваться в клетки, способные к синтезу таких белков. Эти предшественники или базальные клетки типично экспрессируют ген промежуточного филамента Krt14.
Легкие подвергаются сильному воздействию механического и окислительного стресса, и в этом отношении подобны коже. Программа плоскоклеточной дифференцировки, как упомянуто выше, является первичной линией защиты. Клетки, выстилающие дистальные воздухоносные пути и кровеносные сосуды легких, должны выдерживать этот стресс, и нуждаются в замене в случае клеточной гибели с помощью пула клеток-предшественников.
При нарушении этой системы возникают два вида патологий человека.
1. Бронхолегочная дисплазия (БЛД): легкие недоношенных новорожденных особо восприимчивы к повреждению легких, такому как механический стресс. Кроме того, легкие недоношенных новорожденных, перенесших повреждение легких, часто заживают с существенным рубцеванием или бронхолегочной дисплазией (БЛД). Такие легкие обладают ограниченным или недоразвитым регенеративным потенциалом.
2. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ): легкие взрослых больных ХОБЛ по всей видимости неадекватно отвечают на вредоносные стимулы, такие как курение. Хотя они развивают барьер против этих стимулов, отсутствие регенеративных способностей в случае гибели клеток ведет к деформации легочных воздухоносных путей и кровеносных сосудов. Как БЛД, так и ХОБЛ приводят к значительной заболеваемости и смертности.
Изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что два гена играют важные роли в развитии тканей и биологии рака. В частности, авторы настоящего изобретения открыли, что эти два гена экспрессируются в клетках легких и необходимы для позднего морфогенеза легочного эпителия и эндотелия, и поддержки развития/сохранения тонкой трехмерной архитектуры легких. Эти гены необходимы в программе плоскоклеточной дифференцировки, и в развитии/сохранении клеточного пула предшественников (экспрессирующих Krt14). Далее, авторы настоящего изобретения установили критические роли этих генов в биологии рака, в частности в процессах, связанных с приобретением бессмертного и метастатического фенотипа (включая прогрессирование и метастазирование рака), и развитии сердца.
Авторы настоящего изобретения определили последовательности мышиных и человеческих форм этих генов. С учетом их координированной экспрессии и функции в качестве регенеративных генов для респираторных клеток, авторы изобретения обозначили эти гены как R2R1 и R2R2 Для простоты, в данном описании применение термина R2R1/2 предназначено для обозначения более длинного выражения R2R1 и/или R2R2.
Соответственно, необходимо понять, что ссылки на R2R1/2 охватывают все формы этих генов у млекопитающих, включая, например, формы человека и грызунов (мыши, кролика, морской свинки, крысы, и т.д.). Далее, в добавление к охвату всех последовательностей генов R2R1 и/или R2R2, необходимо понять, что эти обозначения также охватывают фрагменты, части, мутанты, производные и/или гомологи/ортологи любого из этих генов, описанных здесь. В этом отношении, необходимо понять, что термин R2R1 охватывает мышиную последовательность, кодированную кДНК последовательностями, обозначенными как 22QQ001I15Rik или RIKEN кДНК 2200001115, а также семь человеческих гомологов, обозначенных как FAM25A, FAM25B, FAM25C, FAM25D, FAM25E, FAM25G и FAM25HP.
Кроме того, где это уместно, термин R2R1/2 охватывает белковые продукты генов R2R1 и/или R2R2, или их фрагменты или части.
В частности, термин R2R1/2, или любой из терминов R2R1 или R2R2, охватывает последовательности, указанные в SEQ ID №:1-12 ниже, или их фрагменты, части, аналоги, варианты или производные.
Ниже приведена последовательность примерного транскрипта мышиного гена R2R1 как SEQ ID №:1.
SEQ ID №: 1
- 1 034088 acactgacacggaccgaaggagtggaaaaagctttacctgtcactgtctgctgccatacgAJOCTGGGAGGCCnG
GGGAAGCTGGCGGCCGAGGGCCTGGCCCACCGCACAGAGAAAGCCACTGGGGGAG
CAGTTCACGCAGTGGAAGAGGTGGTGAGCGAGGTGGTGGGCCACGCCAAGGAGGTT GGAGAGAAGACCATTAATGACGCCCTAAAGAAAGCCCAAGAATCAGGAGACAGGG TGGTGAAGGAGGTCACTGAGAAGGTCACCCACACCATCACTGATGCTGTTACCCAT GCGGCAGAAGGCCTGGGAAGACTGGGACAGtgagcctgcctaccagcatggctggcccttcctgaaggtcaa taaagagtgtgaaacgtgaaaaaaaaaaaaaaaataacaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Кодирующая или транслируемая часть этой последовательности выделена подчеркиванием и содержит примерно 267 нуклеотида. Эта конкретная часть SEQ ID №:1 обозначена как SEQ ID №:2.
Специалисту в данной области техники понятно, что 267 транслируемых нуклеотидов дают белок, содержащий 89 аминокислот, и имеющий следующую последовательность (обозначенную SEQ ID №:3). SEQ ID №:3
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATGGAVHAVEEVVSEVVGHAKEVGEKTINDALK
KAQESGDRVVKEVTEKVTHTITDAVTHAAEGLGRLGQ
В дополнение, авторы изобретения установили полную последовательность примерного человеческого транскрипта гена R2R1, приведенного в SEQ ID №:4 ниже.
SEQ ID №:4 actgtctgctgccacacgATGCTGGGAGGCCTGGGGAAGCTGGCTGCCGAAGGCCTGGC CCACCGCACCGAGAAGGCCACCGAGGGAGCCATTCATGCCGTGGAAGAAGTGGTGA AGGAGGTGGTGGGACACGCCAAGGAGACTGGAGAGAAAGCCATTGCTGAAGCCAT AAAGAAAGCCCAAGAGTCAGGGGACAAAAAGATGAAGGAAATCACTGAGACAGTG ACCAACACAGTCACAAATGCCATCACCCATGCAGCAGAGAGTCTGGACAAACTTGG ACAGtgagtgcacctgctaccacggcccttccccagtctcaataaaaagccatgacatgtg
Кодирующая или транслируемая часть этой последовательности выделена подчеркиванием и содержит примерно 267 нуклеотида. Эта конкретная часть SEQ ID №:4 обозначена как SEQ ID №:5.
Специалисту в данной области техники понятно, что 267 транслируемых нуклеотидов дают белок, содержащий 89 аминокислот, и имеющий следующую последовательность (обозначенную SEQ ID №:6). SEQ ID №:6
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATEGAIHAVEEVVKEVVGHAKETGEKAIAEAIKK AQESGDKKMKEITETVTNTVTNAITHAAESLDKLGQ
Последовательность примерного транскрипта мышиного гена R2R2 приведена ниже как SEQ ID №:7.
SEQ ID №:7
Gtgactggctgctgtctctagttgttgaggcctcttgggatctyggcgctmacmccwtgctytagwgactccgatagctcccr mggctccagtgsasmcctcggkcggnggnagggaaaaggcacttgctggtagctctgctcacccgcactgggacctggagctggagg actaagaagacagacggctgctgcttgccacagcctggaccATGGACCCCCATGAGATGGTTGTGAAGAAT CCATATGCCCACATCAGCATTCCTCGGGCTCACCTGCGCTCTGACCTGGGGCAGCAG TTAGAGGAGGTTCCTTCTTCATCTTCCTCCTCTGAGACTCAGCCTCTGCCTGCAGGAA CATGTATCCCAGAGCCAGTGGGCCTCTTACAAACTACTGAAGCCCCTGGGCCCAAA GGTATCAAGGGCATCAAGGGTACTGCTCCTGAGCACGGCCAGCAGACCTGGCAGTC ACCCTGCAATCCCTATAGCAGTGGGCAACGTCCATCGGGACTGACTTATGCTGGCCT GCCACCTGTAGGGCGTGGTGATGACATTGCCCACCACTGCTGCTGCTGCCCTTGCTG CTCCTGCTGCCACTGTCCTCGCTTCTGCCGTTGTCACAGCTGTTGTGTTATCTCCtagctg actattgaacctccagggctgtgcagcccaggttcctgctcaatgccaaagtgttgctggacatcaggagcagccgttgtcatgagcatcag ccatttcctgccctgagcaggggagcctgtccaccagcgttcagctgtagccttctggaatagggttccagccactagccatgttggcaaca acagggacacccttcacgtcctgcaagactttggcaataaagcaggatgagcgttgctgnncctgntgaaaanaaamwaaawacwgc cgttgtcacarcygttrtgttatctmmkagstgacwattgtaammtycagrgctgtrmagcccrggkksckgctcaatgccaaagtgttg mtgsmcmtcrggrgsrgccaagctttacgcggtacccgggattttttttgtacaaaaaggggccccctattagg
- 2 034088
Кодирующая или транслируемая часть этой последовательности выделена подчеркиванием и содержит примерно 426 нуклеотида. Эта конкретная часть SEQ ID №:7 обозначена как SEQ ID №:8.
Специалисту в данной области техники понятно, что 426 транслируемых нуклеотидов дают белок, содержащий 142 аминокислоты, и имеющий следующую последовательность (обозначенную SEQ ID №:9).
SEQ ID №:9
MDPHEMVVKNPYAHISIPRAHLRSDLGQQLEEVPSSSSSSETQPLPAGTCIPEPVG LLQTTEAPGPKGIKGIKGTAPEHGQQTWQSPCNPYSSGQRPSGLTYAGLPPVGRGDDIA HHCCCCPCCSCCHCPRFCRCHSCCVIS
Кроме того, авторы настоящего изобретения установили полную последовательность примерного человеческого транскрипта гена R2R2, приведенного как SEQ ID №: 10 ниже.
SEQ ID №:10 cttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgcgcagctgcactccagcctgggcaacagagcaagactccat ctcagaaaagaagcagaaagcctccaagagccaatggctctcaagcatcttggtctctgctaagaagaggctcagaggcttagaagccct gcctcgccggggctttgaggtgtgtgagcaatggctggggactgcaggcccgggaatctgagggcctcaccccacttcctttccagagcc gtgacctcaggctcacctcctgccctcctctcaggcaagctgcagatgccctttagggcccaggccatgccccggatgtgaggggctgagt cactggtttggcagtgcccctcagagcccaggcctgggctgccacccacctgaggacgagggctgggccagctgtcgtgctccagttgct ggggcctcttgggatcttgggaaccccatctctgagccccgccccATGGCCCCGCCCCTCCCAAGGAGGGAAA AGGCGGCTGCCAGTCGCTCAACTCAGGCACTGGGACCTAGAGCTCAGAAGACCGAG AGGACAGACTGCCGTGTTGCCACCACAGGCTGGACCATGGACCCCCAAGAGATGGT CGTCAAGAACCCATATGCCCACATCAGCATCCCCCGGGCTCACCTGCGGCCTGACCT GGGGCAGCAGTTAGAGGTGGCTTCCACCTGTTCCTCATCCTCGGAGATGCAGCCCCT GCCAGTGGGGCCCTGTGCCCCAGAGCCAACCCACCTCTTGCAGCCGACCGAGGTCC CAGGGCCCAAGGGCGCCAAGGGTAACCAGGGGGCTGCCCCCATCCAGAACCAGCA GGCCTGGCAGCAGCCTGGCAACCCCTACAGCAGCAGTCAGCGCCAGGCCGGACTGA CCTACGCTGGCCCTCCGCCCGCGGGGCGCGGGGATGACATCGCCCACCACTGCTGCT GCTGCCCCTGCTGCCACTGCTGCCACTGCCCCCCCTTCTGCCGCTGCCACAGCTGCTG CTGCTGTGTCATCTCCtagcccagcccaccctgccagggccaggacccagacttcagcaaatgtggctcacacagtgccg ggacatgccgggacatgcggggtggctgttgtcatgggcgtctgccccttcacaccaggcactggggctcagacccaccaggaaggtgg ccgttcagcccgagctcctgaaacggaatcccaggtcctggctggagagggacacccctgattaccttaaggcccaggcaataaagcag ggtgatcttc
Кодирующая или транслируемая часть этой последовательности выделена подчеркиванием и содержит примерно 552 нуклеотида. Эта конкретная часть SEQ ID №: 10 обозначена как SEQ ID №: 11.
Специалисту в данной области техники понятно, что 552 транслируемых нуклеотида дают белок, содержащий 184 аминокислоты, и имеющий следующую последовательность (обозначенную SEQ ID №:12).
SEQ ID №:12
MAPPLPRREKAAASRSTQALGPRAQKTERTDCRVATTGflTMDPQEMVVKNPYA
HISIPRAHLRPDLGQQLEVASTC S S S SEMQPLP VGPC APEPTHLLQPTEVPGPKGAKGNQ GAAPIQNQQAWQQPGNPYSSSQRQAGLTYAGPPPAGRGDDIAHHCCCCPCCHCCHCPP FCRCHSCCCCVIS
Как таковое, настоящее изобретение относится к генам, кодируемым последовательностями, обозначенными как SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, а также любым их фрагментам, частям, мутантам, вариантам, производным и/или гомологам/ортологам. Как правило, фрагменты, части, мутанты, варианты, производные и/или гомологи/ортологи являются функциональными или активными, то есть они сохраняют функцию генов R2R1/2 дикого типа.
Термин мутанты может охватывать встречающиеся в природе мутанты или искусственно созданные путем добавления, делеции, замещения или инверсии одной или нескольких аминокислот.
Специалисту в данной области техники понятно, что гены, гомологичные человеческим и мыши
- 3 034088 ным R2R1/2 генам, перечисленным выше, можно найти у ряда различных видов, включая, например, другие виды млекопитающих. Гомологичные гены могут обладать всего примерно 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% гомологии с различными нуклеотидными последовательностями, приведенными выше. Как таковые, гомологичные гены от других видов подлежат включению в объем настоящего изобретения.
С применением различных нуклеиново-кислотных и аминокислотных последовательностей, описанных здесь, специалист в данной области техники может быстро идентифицировать родственные последовательности у других видов, таких как другие млекопитающие, и пр. Например, нуклеиновую кислоту, полученную у конкретных видов, можно исследовать с применением зондов, описанных здесь, для гомологичных или близкородственных последовательностей.
Кроме того, необходимо понять, что настоящее изобретение также относится к продуктам генов, охватываемых изобретением, и в частности, к пептидам, кодированным SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12. Кроме того фрагменты, части, аналоги, варианты, производные любых из них, или гомологи и/или идентичные белки также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Как правило, фрагменты, части, производные, варианты и/или гомологи являются функциональными или активными, то есть они сохраняют функцию белка R2R1/2 дикого типа.
Кроме того, белки, полипептиды/пептиды, гомологичные/идентичные любым белкам, кодируемым SEQ ID NO:3, 6, 9 и 12, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Белковые или полипептидные/пептидные последовательности, считающиеся гомологичными или идентичными любой последовательности, описанной здесь, могут быть всего на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными или идентичными. В той мере, в которой изобретение относится к фрагментам любой из белковых или полипептидных/пептидных последовательностей, описанных здесь, необходимо понять, что фрагмент может содержать любое число аминокислот, находящееся между 10 и n-1 аминокислотами (где п является числом аминокислот в полной последовательности). Например, фрагмент может содержать примерно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 или около 125 аминокислот (максимальное число аминокислот определяется числом аминокислот в полной последовательности) - такие фрагменты/части могут обозначаться как пептидные фрагменты. В одном варианте осуществления пептидные фрагменты могут быть антигенными и/или иммуногенными -то есть, они сохраняют способность к связыванию с антителами, проявляющими специфичность, аффинность и/или селективность в отношении нативного (полного) антигена - такого как кодированный SEQ ID NO:3, 6, 9 и 12.
Специалисту в данной области техники понятно, что для различных нуклеиново-кислотных последовательностей и полипептидов, описанных здесь, могут существовать природные вариации, обусловленные, например, полиморфизмом, среди R2R1/2 генов и белков, выделенных у любых из имеющихся видов. Кроме того, в данной области техники хорошо известно, что вырожденность генетического кода обеспечивает замещение одного или нескольких оснований в кодоне без нарушения первичной аминокислотной последовательности. Как таковую, генетическую вырожденность можно применять для получения вариантов нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих пептидные или белковые последовательности, по существу идентичные антигенным последовательностям, описанным здесь. Действительно, варианты последовательности, обеспеченные настоящим изобретением, могут проявляться как белки, и/или гены, которые содержат одну или несколько аминокислотных/нуклеиново-кислотных замен, добавлений, делеций и/или инверсий, по отношению к референсной последовательности (например, любой из последовательностей, описанных выше).
Таким образом, необходимо понять, что все такие варианты, в особенности те, что являются функциональными или проявляют необходимую активность, подлежат включению в объем настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления изобретение относится к производным любой из R2R1/2 последовательностей, описанных здесь. Термин производные может охватывать R2R1/2 гены или пептидные последовательности, которые, по сравнению с описанными здесь, содержат одну или несколько аминокислотных замен, делеций, добавлений и/или инверсий.
В дополнение или альтернативно, аналоги различных пептидов, описанных здесь, могут быть получены путем введения одной или нескольких консервативных аминокислотных замен в первичной последовательности. Специалисту в данной области техники понятно, что термин консервативная замена предназначен для охвата акта замещения одной или нескольких аминокислот в белке или пептиде альтернативной аминокислотой с подобными свойствами, и которая существенно не изменяет физикохимических свойств и/или структуры или функции нативного белка (или белка дикого типа). Аналоги данного типа также охватываются объемом настоящего изобретения.
Как хорошо известно в данной области техники, свойство вырожденности генетического кода позволяет заменить одно или несколько оснований в кодоне без изменения первичной аминокислотной последовательности. Соответственно, хотя последовательности, описанные в данной заявке, как известно, кодируют R2R1/2 белки, описанные здесь, вырожденность кода может применяться для получения вариантов последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих те же самые первичные аминокислотные последовательности.
- 4 034088
Повторяем, что термины R2R1, R2R2 и R2R1/2 охватывают не только полные генные/пептидные последовательности, как описано выше, но также их фрагменты, аналоги, гомологи, ортологи, варианты и производные.
Как указано, авторы настоящего изобретения установили, что R2R1/2 гены (и их белковые продукты) участвуют в событиях легочного и сердечного морфогенеза (таком как передача клеточных сигналов/развитие клетки), и поддерживают развитие трехмерной архитектуры легких и сердца.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения обеспечивает применение полинуклеотида, содержащего регенеративный ген для респираторных клеток R2R1 или R2R2 (R2R1/2) либо оба, гена для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где гены R2R имеют последовательности, идентичные по меньшей мере на 70% последовательностям, выбранным из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение белка, кодируемого геном R2R1/2, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где белок, кодируемый геном R2R, имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12.
В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение антисмыслового олигонуклеотида, способного модулировать экспрессию гена R2R1/2, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний; и (c) рака, где ген R2R имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антиген-связывающий фрагмент, способные к связыванию с белком, кодируемым геном R2R1/2, имеющим последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний; и (c) рака.
В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний;
(c) рака; и (d) предрасположенности к любому из (а)-(с);
где указанный способ включает этап выявления уровня экспрессии гена R2R1/2 в образце, полученном от исследуемого субъекта, причем выявление аберрантного уровня гена R2R в образце является показателем одного или нескольких указанных выше заболеваний и/или состояний и/или предрасположенности к ним, где ген R2R имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, где аберрантным уровнем является уровень, повышенный или сниженный по сравнению с уровнем экспрессии в образце, полученном от субъекта, не страдающего указанными выше заболеваниями и/или состояниями.
Причем выявление уровня экспрессии гена R2R1/2 включает гибридизацию в жестких условиях олигонуклеотидного зонда и/или праймера со всей или частью последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
В седьмом аспекте изобретение обеспечивает способ тестирования соединения на способность модулировать экспрессию гена R2R1/2, включающий обеспечение контакта гена R2R с тестируемым соединением и детекцию модуляции экспрессии гена R2R, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%, причем детекция модуляции заключается в определении того, является ли уровень экспрессии гена R2R таким же, меньшим или большим, чем уровень экспрессии, детектированный в отсутствие тестируемого соединения, и если уровень меньше или больше, то тестируемое соединение может быть пригодно в качестве модулятора экспрессии гена R2R, а также пригодно для лечения заболеваний и/или состояний, указанных в пункте 1.
В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую ген R2R, имеющий последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70% последова
- 5 034088 тельности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, а также фармацевтически пригодный наполнитель, носитель или разбавитель, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, указанных в п.1.
В девятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую белок, кодируемый геном R2R и имеющий последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12, или, а также фармацевтически пригодный наполнитель, носитель или разбавитель, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, указанных в пункте 1.
В десятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает животную модель для исследования сердечного и/или легочного заболевания или состояния, или рака, где животную модель получают путем модуляции или нарушения гена R2R, который имеет последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
При этом в отдельных частных случаях R2R1/2 гены и/или R2R1/2 белки применяют в лечении заболеваний и/или состояний, влияющих на развитие/структуру, дифференцировку, пролиферацию и/или морфогенез клеток/тканей сердца, например, влияющих на развитие и/или формирование межжелудочковой перегородки, или в производстве медикамента для лечения таких заболеваний и/или состояний.
В других частных случаях R2R1 ген и/или белок применяют в лечении онкологического заболевания, например, поражающих различные ткани, включая, например, легочную и/или сердечную ткань, или, поскольку R2R1/2 гены и/или R2R1/2 белки можно применять в модуляции событий клеточного перехода, например, таких как события мезенхимально-эпителиального перехода (МЭП) и события в обратном процессе эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), в лечении любого онкологического заболевания, связанного с аберрантными/дефективными процессам МЭП/ЭМП. Примеры некоторых онкологических заболеваний, которые можно лечить с применением генов и/или белков в соответствии с настоящим изобретением, подробно описаны ниже.
Термины легочное заболевание или легочное состояние могут включать патологии легких, такие как те, что влияют на развитие легких или трехмерную архитектуру легочных тканей. Например, легочные заболевания могут включать заболевания и/или состояния, влияющие на эпителиальные клетки, выстилающие воздухоносные пути легкого, эндотелиальные клетки легочной сосудистой сети, и/или на дифференцировку и/или рост этих клеток. Как таковые, легочные заболевания могут включать заболевания, влияющие на пути и события легочного морфогенеза. Легочные заболевания и/или состояния, влияющие на дифференцировку некоторых типов клеток легких (например, клетки плоского эпителия) или на создание и/или поддержание популяций клеток-предшественников (базальных), также можно лечить соединениями, медикаментами и способами, описанными здесь. В качестве специфического примера, такие заболевания, как бронхо-легочная дисплазия (БЛД) и/или хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), можно лечить с применением соединений, описанных здесь. В других вариантах осуществления, термин легочное заболевание или легочное состояние может включать расстройства клеточной пролиферации или неопластические расстройства, такие как рак, включая, например немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и/или мелкоклеточный рак легкого (МРЛ).
Термин сердечное заболевание или сердечное состояние может включать такие патологии сердца, которые влияют на развитие сердца или трехмерную архитектуру сердечных тканей. Сердечные заболевания могут включать заболевания, влияющие на пути и события морфогенеза сердца, в частности, мехзенхимально-эпителиальный и эпителиально-мезенхимальный переход. В качестве специфического примера, такие заболевания, как дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородки, дефекты атриовентрикулярного канала, деформации сердечных (атриовентрикулярных) клапанов и коронарных артерий, можно лечить с применением соединений, описанных здесь.
Также необходимо понять, что поскольку описанные здесь R2R1/2 гены/белки как было показано играют роль в процессах морфогенеза (таких как передача сигналов клетками, и т.д.) и поддержки развития трехмерной структуры сложных тканей, таких как легкие и/или сердце, они также могут найти применение в регенеративной медицине. В качестве примера, когда стволовые клетки (например, взрослые, эмбриональные или перепрограммированные соматические клетки (такие как iPS клетки)) применяются для восстановления или реконструкции, например, поврежденной или больной ткани, белки и/или гены, обеспеченные настоящим изобретением, можно применять для облегчения развития ткани.
R2R1/2 белок и гены играют важную роль в событиях морфогенеза в легких и сердце, в качестве регуляторов эпителиально-мезенхимального и мехенхимально-эпителиального перехода. Таким образом, они могут найти приложение в онкобиологии и лечении онкологических заболеваний. В качестве примера, такие заболевания, как трансформация локализованного рака в метастазы рака, можно лечить с применением соединений, описанных здесь.
Там, где сердечное или легочное заболевание или состояние возникает в результате, или связано с отсутствием или дефектом экспрессии/функции R2R1/2 гена и/или белка, применение R2R1/2 гена и/или белка, как описано выше, может обеспечить средства восстановления функции нормального (или дикого типа) R2R1/2 гена/ белка так, чтобы лечить и/или облегчать симптомы заболевания или состояния.
Необходимо понять, что применения, медикаменты и способы лечения, описанные здесь, могут
- 6 034088 требовать создания рекомбинантных R2R1/2 генов/белков, и таким образом, настоящее изобретение дополнительно подразумевает способы создания и/или экспрессии рекомбинантных R2R1/2 генов и/или белков. Специалисту в данной области техники понятно, что ПЦР методики можно применять для избирательного получения R2R1/2 генных последовательностей из различных источников, включая, например, легочную ткань. Эти последовательности могут быть связаны с различными последовательностями контроля экспрессии или регуляции, например, такими как промоторные, операторные, индукторные, энхансерные и/или сайленсерные элементы, участки связывания с рибосомой и/или терминирующие последовательности. Подходящие регуляторные последовательности или последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны специалистами в данной области техники для любого имеющегося хозяина. В другом варианте осуществления генные последовательности R2R1/2, полученные с помощью ПЦР, можно ввести в вектор (такой как плазмида или кассета экспрессии). В одном варианте осуществления вектор может дополнительно включать нуклеотидную последовательность с маркером или меткой для облегчения процедур очистки белка.
Клетка-хозяин может быть трансформирована вектором, и поддерживаться в условиях, пригодных для индукции экспрессии генной последовательности R2R1/2 и продукции рекомбинантного R2R1/2 Векторы, в которых клонируют генные последовательности R2R1/2 (или их фрагменты), можно ввести или трансфицировать в клетки с применением различных методик - такие методики могут быть иначе обозначены как процедура трансфекции. В процедуре трансфекции применяются условия, которые делают клеточные мембраны проницаемыми для таких соединений, как нуклеиновые кислоты. В качестве примера, можно облегчить трансфекцию векторов, включая векторы экспрессии, в клетки с применением электропорации, теплового шока, химических соединений, например, таких как фосфат кальция, фосфат стронция, методики микроинъекции и/или генные пушки.
Методики, используемые для очистки рекомбинантных белков, полученных данным способом, известны, если рекомбинантный белок мечен или маркирован, они могут включать применение, например, методик аффинной хроматографии.
В свете вышеизложенного, четвертый и пятый аспекты настоящего изобретения обеспечивают экспрессирующийся вектор, содержащий генную последовательность R2R1/2, и клетку-хозяина, трансформированную им, соответственно.
В дополнение к обеспечению R2R1/2 генов и/или белков как средства лечения различных заболеваний и/или состояний (например, сердечных и/или легочных заболеваний и/или состояний), настоящее изобретение также обеспечивает соединения, способные модулировать экспрессию R2R1/2 генов, которые можно применять в лечении состояний, возникающих в результате, или связанных с избыточной экспрессией R2R1/2 гена/белка. Такие соединения могут быть олигонуклеотидами, предпочтительно, антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут принимать форму, например, ДНК и/или РНК. В другом варианте осуществления олигонуклеотиды являются молекулами РНК, известным специалистам в данной области техники как малая/короткая интерферирующая РНК и/или РНК сайленсинга, которая далее обозначается как миРНК. Такие миРНК олигонуклеотиды могут принимать форму нативных РНК дуплексов, или дуплексов некоторым образом модифицированных (например, посредством химической модификации) для придания устойчивости к нуклеазе. В дополнение или альтернативно, миРНК олигонуклеотиды могут принимать форму малой шпилечной РНК (мшРНК), экспрессирующихся или плазмидных конструкций, которые соответствуют или содержат миРНК, описанные здесь.
Олигонуклеотиды, обеспеченные настоящим изобретением, могут быть предназначены для модуляции экспрессии R2R1/2 генов. При анализе R2R1/2 последовательностей нативного или дикого типа с помощью алгоритмов, таких как BIOPREDsi, специалист в данной области техники сможет легко определить или спрогнозировать с помощью компьютера нуклеиново-кислотную последовательность, обладающую оптимальным эффектам нокдауна этих генов (см., например, http://www.biopredsi.org/start.html). Соответственно, специалист в данной области техники может создать и проанализировать массив или библиотеку различных нуклеотидов для определения того, способны ли они модулировать экспрессию R2R1/2 генов.
В свете вышеизложенного, антисмысловые нуклеотиды и/или миРНК молекулы, описанные здесь, можно применять (i) для лечения любых заболеваний и/или состояний, описанных здесь, в частности (ii) для лечения легочных заболеваний и/или состояний, (iii) для лечения сердечных заболеваний и/или состояний и (iv) для лечения рака. Далее, антисмысловые нуклеотиды и/или миРНК молекулы, описанные здесь, можно применять в производстве медикаментов для лечения заболеваний, указанных в пунктах (i)(iv) выше, или в способах лечения субъектов, страдающих такими заболеваниями или расстройствами.
Кроме того, антитела (или их антиген-связывающие фрагменты), способные связывать R2R1/2 белки, можно применять в лечении заболеваний и/или состояний, описанных здесь, включая, например, сердечные и/или легочные заболевания и/или состояния. Антитела, которые блокируют или нейтрализуют функцию R2R1/2 белков, могут быть особо пригодными, если заболевание и/или состояние возникает в результате избыточной экспрессии R2R1/2 белка. Методики, используемые для создания моноклональных антител (мАТ), хорошо известны, и легко могут применяться для создания мАт, специфичных для R2R1 и/или R2R2 белков иди их фрагментов. Подобным образом, способы, используемые для создания поли
- 7 034088 клональных антител, также хорошо известны, и могут применяться для создания антител, специфичных для R2R1 и/или R2R2 белков иди их фрагментов.
Другие соединения, пригодные в лечении заболеваний и/или состояний, описанных здесь (например, сердечных и/или легочных состояний и/или заболеваний, или рака), могут включать, например, белки, пептиды, аминокислоты, углеводы и другие малые органические молекулы.
В дополнение к вышеизложенному, изолированные нуклеотидные и/или белковые последовательности R2R1/2 можно применять в качестве основы для конструкции зондов и/или праймеров для применения в исследованиях по детекции и экспрессии ex vivo и/или in situ. Типичные исследования по детекции включают, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), гибридизационные исследования, процедуры секвенирования и методики иммунологической детекции и саузерн-нозерн блоттинга.
В принципе, любой полинуклеотидный (или олигонуклеотидный) или полипептидный фрагмент, сконструированный из последовательностей, описанных выше, можно применять в указанных исследованиях по детекции и/или экспрессии.
Как правило, полинуклеотидные фрагменты для применения в качестве зондов и/или праймеров, включают 10-30 нуклеотидов (хотя в некоторых приложениях можно применять другую длину), и проявляют определенную степень специфичности к конкретной последовательности, и не связываются с неродственными последовательностями. Подобным образом, полипептидные фрагменты для применения в качестве зондов могут также быть относительно короткими, и как правило могут содержать 5-20 аминокислот (хотя в некоторых приложениях может применяться другая слегка более короткая или продолжительная длина).
Легко понять, что тщательный выбор последовательности праймера/зонда и применение жестких (предпочтительно очень жестких) условий гибридизации сведет к минимуму любое неизбирательное связывание.
Соответственно, олигонуклеотидные последовательности зонда и/или праймера, имеющие по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% комплементарность, а также те, которые имеют полную (т.е. 100%) комплементарность ко всем частям нуклеотидных последовательностей, описанных здесь, находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Гибридизацию между зондом/праймером и нуклеиново-кислотной последовательностью (такой как любые, описанные здесь), можно проводить при температуре около 40°С-75°С в 2-6 х SSC буферном растворе (т.е. растворе 2-6 х NaCl 17,5 г/л и цитрата натрия (SC) 8,8 г/л), содержащем 0,1% додецилсульфат натрия (ДСН). Конечно, в зависимости от степени сходства между зондом/праймером и последовательностью, можно применять буферные растворы с уменьшенной концентрацией SSC (т.е. 1 х SSC, содержащий 0,1% ДСН; 0,5 х SSC, содержащий 0,1% ДСН; и 0,1 х SSC, содержащий 0,1% ДСН).
Полипептидные зонды, обладающие по меньшей мере 30, 50, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичностью, а также обладающие полной (т.е. 100%) идентичностью ко всей или к части последовательности, раскрытой здесь, входят в объем настоящего изобретения.
Как таковой, дополнительный аспект настоящего изобретения обеспечивает олигонуклеотидные зонды и/или праймеры, предназначенные для гибридизации всей или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11. Кроме того, другой аспект обеспечивает полипептидные зонды, сконструированные для связывания со всей или с частью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики легочного заболевания или состояния, и/или восприимчивости к нему, где способ включает определение того, отмечается ли аберрантная экспрессия генов R2R1 и/или R2R2 у субъекта.
У субъектов с диагнозом, например, рака и/или сердечного и/или легочного заболевания может проявляться аберрантная (т.е. повышенная или сниженная) экспрессия гена/белка R2R1 и/или R2R2. Термин аберрантная экспрессия нужно понимать, как охватывающий уровень экспрессии гена как повышенный и/или сниженный, по сравнению с образцом, полученным у здорового субъекта или субъекта, не страдающего заболеванием и/или состоянием (а именно, сердечным или легочным заболеванием и/или состоянием или раком).
Термин образец необходимо понимать как включающий образцы жидкостей организма, такие как цельная кровь, плазма, сыворотка, слюна, пот и/или сперма. В других случаях могут применяться такие образцы, как биоптаты и/или соскобы тканей. В частности, можно применять биоптаты и/или соскобы легочной ткани. Кроме того, образец может содержать ткань или секрет железы, и могут применяться процедуры промывания для получения образца жидкости, секретируемой, например, в легком. Подходящие процедуры промывания могут включать процедуру бронхо-альвеолярного лаважа. Специалисту в данной области техники понятно, что образцы, описанные выше, могут обеспечивать большие количества нуклеиновой кислоты R2R1/2 (т.е. ДНК или РНК) и/или R2R1/2 белков, пептидов (или их фрагментов). Далее, эти способы могут содержать первый этап обеспечения образца от субъекта, предположительно страдающего легочным заболеванием и/или состоянием, или подверженного риску развития легочного заболевания и/или состояния.
- 8 034088
Повышение уровня экспрессии гена/белка R2R1 и/или R2R2 может быть связано с любым из заболеваний и/или состояний, описанных выше, или восприимчивостью к ним. Например, повышение экспрессии R2R1/2 гена/белка может указывать на избыточную клеточную пролиферацию и/или дифференцировку, и может быть связано, например, с неопластическим состоянием, таким как рак (т.е. рак легких). Снижение экспрессии гена/белка R2R1 и/или R2R2 может указывать на патологические состояния, характеризующиеся плохим или нарушенным развитием сердца/легкого. Такие условия могут приводить к повреждению тканей (из-за механического стресса в сердце/легких), рубцеванию, потере структурной целостности сердца/легких, и деформации или повреждению структуры воздухоносных путей легких или сердца.
Специалисту в данной области техники известны методики, которые можно применять для идентификации уровней белков и/или генов, таких как R2R1/2 гены и/или белки, в таких образцах, как перечислено выше.
Такие методики могут включать, например, методики на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как ПЦР в режиме реального времени (иначе известная как количественная ПЦР). В данном случае, ПЦР в режиме реального времени можно применять для определения уровня экспрессии генов, кодирующих R2R1 и/или R2R2 белки. Как правило, для количественного определения уровня экспрессии конкретной нуклеиново-кислотной последовательности, можно применять ПЦР с обратной транскриптазой для обратного транскрибирования соответствующей мРНК в комплементарную ДНК (кДНК). Предпочтительно, в процедуре обратной транскрипции можно применять праймеры, предназначенные для специфической амплификации последовательности интересующей мРНК. Далее, ПЦР можно применять для амплификации кДНК, образуемой при обратной транскрипции.
Как правило, кДНК амплифицируют с применением праймеров, предназначенных для специфической гибридизации с определенной последовательностью, а нуклеотиды, используемые для ПЦР, могут быть помечены флюоресцентными или радиоактивными соединениями.
Специалисту в данной области техники известны методики применения меченых нуклеотидов для количественного определения ДНК, полученной во время ПЦР. Вкратце, и в качестве примера, количество меченой амплифицированной нуклеиновой кислоты можно определить путем мониторинга количества включенного меченого нуклеотида во время циклов ПЦР.
Дополнительную информацию, касающуюся методик на основе ПЦР, описанных здесь, можно найти, например, в PCR Primer: A Laboratory Manual, Second Edition Edited by Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler: Cold Spring Harbour Laboratory Press (ПЦР праймер: Лабораторное руководство) и Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook & David Russell: Cold Spring Harbour Laboratory Press (Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство).
Другие методики, которые можно применять для определения уровня экспрессии гена R2R1 и/или R2R2 в образце, включают, например, методики нозерн-блоттинга и/или саузерн-блоттинга. Нозернблоттинг можно применять для определения количества конкретной ДНК, присутствующей в образце, и таким образом, можно использовать для определения количества экспрессии R2R1 и/или R2R2 гена. Вкратце, мРНК можно экстрагировать, например, из основанной на клетках или бесклеточной системы, модифицированной для включения экспрессируемых R2R1 и/или R2R2 генов, с применением методик, известных специалистам в данной области техники, и подвергнуть электрофорезу. Нуклеиновокислотный зонд, предназначенный для гибридизации (т.е. комплементарный) интересующей последовательности мРНК, в данном случае мРНК, кодирующей R2R1 и/или R2R2 белки, можно применять для детекции и количественного определение конкретной мРНК, присутствующей в образце.
В дополнение или альтернативно, уровень экспрессии R2R1 и/или R2R2 гена можно выявить с помощью микроматричного анализа. Такой способ включает применение ДНК микроматрицы, содержащей нуклеиновую кислоту, полученную из R2R1 и/или R2R2 генов. Для идентификации уровня экспрессии R2R1 и/или R2R2 генов, специалист в данной области техники может экстрагировать нуклеиновую кислоту, предпочтительно мРНК из системы (основанной на клетках или бесклеточной), подвергнутой способу, описанному в первом аспекте настоящего изобретения, и подвергнуть её процедуре амплификации, такому как ПЦР с обратной транскриптазой, для создания кДНК. Предпочтительно, можно применять праймеры, специфичные для определенной последовательности мРНК, в данном случае последовательности, кодирующие R2R1 и/или R2R2 гены.
Амплифицированную R2R1 и/или R2R2 кДНК можно подвергать этапу дополнительной амплификации, необязательно в присутствии меченых нуклеотидов (как описано выше). Затем можно контактировать амплифицированную кДНК, которая необязательно помечена, с микроматрицей в условиях, обеспечивающих ее связывание с ДНК микроматрицы. Таким образом, можно идентифицировать уровень экспрессии R2R1 и/или R2R2 генов.
Дополнительную информацию, касающуюся вышеописанных методик, можно найти, например, в PCR Primer: A Laboratory Manual, Second Edition Edited by Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler: Cold Spring Harbour Laboratory Press (ПНР праймер: Лабораторное руководство) и Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook & David Russell: Cold Spring Harbour Laboratory Press (Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство).
- 9 034088
Для определения уровня R2R1/2 белков в образце можно применять иммунологические методики с применением агентов, способных связывать R2R1/2 белки.
В одном варианте осуществления диагностические способы, описанные выше, могут включать этап контакта субстрата (или его части) с исследуемым образцом, в условиях, обеспечивающих ассоциацию, взаимодействие, связывание и/или иммобилизацию любого R2R1/2 белка, присутствующего в образце, с указанным субстратом.
Подходящие субстраты могут включать, например, стекло, нитроцеллюлозу, бумагу, агарозу, и/или пластики. Такой субстрат, например, пластиковый материал, может иметь форму планшета для микротитрования.
Альтернативно, субстрат для контакта с исследуемым образцом может содержать агент, способный связываться с R2R1/2 белком(ами). Предпочтительно, агент, способный связываться с R2R1/2 белками, сам связан с субстратом (или по меньшей мере с его частью). Подходящие связывающие агенты могут включать, например, антитела, такие как моноклональные или поликлональные антитела, и/или другие типы пептидов или малых молекул, способных связываться с R2R1/2 белками. Необходимо понять, что это определение применяется ко всем типам связывающих агентов, упоминаемых здесь. Таким образом, субстрат (или его часть) может контактировать с анализируемым образцом в условиях, обеспечивающих связывание или взаимодействие между агентами, способными связывать R2R1/2 белок, и любым R2R1/2 белком, присутствующим в образце.
Любой R2R1/2 белок, связанный с субстратом или агентами, способными к связыванию R2R1/2 белка(ов), можно определить с применением дополнительного агента, способного связываться с R2R1/2 белком(ами) (далее обозначаемого как первичный связующий агент). В дополнение или альтернативно, первичные связующие агенты могут обладать аффинностью к, или связываться с комплексами R2R1/R2R2 белок: субстрат или комплексами, содержащими R2R1/2 белки и вышеупомянутые агенты, способные связываться с R2R1/2 белками.
Первичные связующие агенты могут быть конъюгированы с компонентами, обеспечивающими их детекцию (далее обозначаемыми как детектируемые компоненты). Например, первичные связующие агенты могут быть конъюгированы с ферментом, уровень которого можно определить с помощью колориметрической хемилюминесцентной реакции. Такие конъюгированные ферменты могут включать пероксидазу хрена (ПХ) и щелочную фосфатазу (ЩФ), но не ограничиваются ими. В дополнение или альтернативно, первичные связующие агенты могут быть конъюгированы с флюоресцентной молекулой, например, флюорофором, таким как ФИТЦ, родамин, или краситель техасский красный. Другие типы молекул, которые могут быть конъюгированы со связующими агентами, включают меченые радиоактивно компоненты.
Альтернативно, любой R2R1/2 белок, связанный с субстратом или агентами, способными связываться с R2R1/2 белками, можно определить посредством еще одного связующего агента (далее обозначаемого как вторичный связующий агент), обладающего аффинностью к первичным связующим агентам. Предпочтительно, вторичные связующие агенты конъюгированы с детектируемыми компонентами.
Количество первичного связующего агента (или вторичного связующего агента, соединенного с ним), связанного с R2R1/2 белком(ами), может отражать уровень R2R1/2 белка(ов), присутствующего в исследуемом образце.
В одном варианте осуществления способы идентификации уровня R2R1/2 белка могут иметь форму анализа с тест-полоской, где субстрат (или его часть) приводят в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих связывание какого-либо R2R1/2 белка(ов), присутствующего в образце, с субстратом или связующим агентом, присоединенным или иммобилизованным на нем.
В другом варианте осуществления способы могут иметь форму иммунологического анализа, например, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). ELISA может иметь форму ELISA с захватом, в котором анализируемый образец приводят в контакт с субстратом, и любой R2R1/2 белок(и), присутствующий в образце, захватывается или связывается связующим агентом (способным к связыванию с R2R1/2 белками), связанным или иммобилизованным на субстрате. Альтернативно, образец может контактировать с субстратом в условиях, обеспечивающих прямое связывание между любым R2R1/2 белком(ами), присутствующим в образце, и субстратом.
Каждый из способов ELISA, описанных выше, может включать этап прямого выявления R2R1/2 белка, или этап непрямой идентификации. ELISA, включающий такие этапы, можно обозначить как прямой ELISA или непрямой ELISA.
Прямой ELISA может включать обеспечение контакта исследуемого образца с субстратом в условиях, обеспечивающих связывание любого R2R1/2 белка, присутствующего в образце, с субстратом и/или связующим агентом, соединенным с ним. После необязательного этапа блокирования, связанный R2R1/2 белок(и) можно выявить с помощью агента, способного связываться с R2R1/2 белками (т.е. первичного связующего агента). Предпочтительно, первичные связующие агенты конъюгированы с детектируемым компонентом.
Непрямой ELISA может включать дополнительный этап, после контакта с R2R1/2 белка(ов) с первичным связующим агентом, с применением дополнительного связующего агента (вторичного связую
- 10 034088 щего агента), обладающего аффинностью или специфичностью в отношении первичного связующего агента. Предпочтительно, вторичный связующий агент может быть конъюгирован с детектируемым компонентом.
Другие иммунологические методики, которые можно применять для идентификации уровня R2R1/2 белка в образце, включают, например, иммуногистохимический анализ, при котором связующие агенты, такие как антитела, способные связывать R2R1/2 белок(и), приводят в контакт с образцом, предпочтительно, образцом ткани, в условиях, обеспечивающих связывание между любым R2R1/2 белком(ами), присутствующим в образце, и агентом, связывающим R2R1/2 белок. Как правило, перед контактом образца со связующим агентом, образец обрабатывают, например, детергентом, таким как Тритон X100. Такая методика может обозначаться как прямое иммуногистохимическое окрашивание.
Альтернативно, анализируемый образец можно подвергать процедуре непрямого иммуногистохимического окрашивания, в котором после контакта образца с агентом, связывающим R2R1/2 белок, применяют дополнительный связующий агент (вторичный связующий агент), который специфичен, обладает аффинностью, или способен связываться с агентом, связывающим R2R1/2 белок, для выявления комплексов R2R1/2 белок/связующий агент.
Специалисту в данной области техники понятно, что в прямых и непрямых иммуногистохимических методиках связующий агент может быть конъюгирован с детектируемым компонентом. Предпочтительно, связующий компонент или вторичный связующий агент конъюгирован с компонентом, способным обеспечить определение уровня присоединенного связующего агента или вторичного связующего агента, с помощью колориметрической хемилюминесцентной реакции.
Для идентификации уровней R2R1/2 белка(ов), присутствующих в образце, можно сравнить результаты иммуногистохимического окрашивания с результатами имммуногистохимического окрашивания эталонного образца. В качестве примера, образец, содержащий больше или меньше агента, связующего R2R1/2 белок (или вторичного связующего агента), чем в эталонном образце, может быть получен у субъекта с конкретным заболеванием и/или состоянием.
Другие методики, включающие применение агентов, способных связывать R2R1/2 белки, включают, например, такие методики, как вестерн-блоттинг или дот-блот. Вестерн-блоттинг может включать электрофорез образца для разделения или разложения на составляющие компонентов образца, например, белковых компонентов. Разделенные компоненты можно затем перенести на субстрат, такой как нитроцеллюлоза. Для идентификации какого-либо R2R1/2 белка(ов), присутствующих в образце, можно обеспечить контакт субстрата со связующим агентом, способным связывать R2R1/2 белок(и) в условиях, обеспечивающих связывание между любым R2R1/2 белком(ами), присутствующим в образце, и агентами, способными связывать R2R1/2 белок(и).
Предпочтительно, агент, способный связывать R2R1/2 белок(и), может быть конъюгированным с детектируемым компонентом.
Альтернативно, субстрат может контактировать с другим связующим агентом, обладающим аффинностью к связующему агенту(ам), способному связывать R2R1/2 белок(и). Предпочтительно, дополнительный связующий агент может быть конъюгирован с детектируемым компонентом.
В случае дот-блота можно обеспечить контакт образца или его части с субстратом, так чтобы любой R2R1/2 белок(и), присутствующий в образце, связывался с субстратом или иммобилизовался на субстрате. Идентификацию связанного или иммобилизованного R2R1/2 белка(ов) можно проводить, как описано выше.
В любой из вышеупомянутых методик количество обнаруживаемого первичного или вторичного связующего агента представляет или является пропорциональным количеству R2R1/2 белка, присутствующего в образце. Далее, результаты, полученные в любом или во всех диагностических способах, описанных выше, можно сравнить с результатами, полученными для эталонного или контрольного образцов, полученных у здоровых субъектов, которые, как известно, не страдают и не подвержены развитию конкретного заболевания или расстройства (например, такого как сердечное и/или легочное заболевание или расстройство, и/или рак).
Дополнительный аспект настоящего изобретения включает способ идентификации или получения агентов, модулирующих экспрессию R2R1 и/или R2R2 генов, включающий этапы контакта R2R1 и/или R2R2 генов с агентом тестирования, и выявление модуляции экспрессии R2R1/2 гена.
Специалисту в данной области техники понятно, что такой способ, как описан в 9-м аспекте настоящего изобретения, может быть проведен в таких системах, как например, системы на основе клеток или бесклеточных системах, модифицированные для включения R2R1 и/или R2R2 генов. В качестве примера, клетки можно трансфицировать нуклеиновой кислотой, содержащей R2R1 или R2R2 ген. В одном варианте осуществления нуклеиновую кислоту можно взять в форме вектора (например, плазмиды или кассеты экспрессии, как описано выше).
В одном варианте осуществления результаты, полученные из способов, описанных выше, можно сравнить с результатами, полученными от контрольного способа, в котором R2R1 и/или R2R2 гены не контактировали с исследуемым агентом. Таким образом, можно определить, способен ли указанный агент модулировать экспрессию R2R1 и/или R2R2 генов. Если уровень экспрессии R2R1 и/или R2R2 генов
- 11 034088 меньше или больше уровня экспрессии, выявленного в контрольном способе, исследуемый агент может быть пригоден в качестве модулятора экспрессии R2R1 и/или R2R2 генов. Если уровень экспрессии является таким же, как в контрольных способах, исследуемый агент, вероятно, не способен модулировать экспрессию R2R1 и/или R2R2 генов.
Подходящие исследуемые агенты могут иметь форму нуклеиновых кислот, например, антисмысловых нуклеотидов, описанных выше, белков, пептидов, аминокислот, антител (и их фрагментов), углеводов и других малых органических молекул.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие R2R1/2 гены/белки, описанные выше, антисмысловые олигонуклеотиды (ДНК или РНК), как описано выше, и/или любые агенты, обеспеченные в способах, обеспеченных в 9-м аспекте настоящего изобретения, способные модулировать экспрессию или функцию R2R1 и/или R2R2 генов/белков, в ассоциации с фармакологически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем. Такие композиции могут найти применение, например, в лечении различных заболеваний и/или состояний, описанных здесь, включая сердечные и/или легочные заболевания и/или рак, как описано выше.
Предпочтительно, фармацевтические композиции, обеспеченные настоящим изобретением, являются стерильными фармацевтическими композициями. Подходящие наполнители, носители или разбавители могут включать, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстрозу, глицерин, этанол, ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин; сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин; буферные вещества, такие как фосфаты; глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных жирных кислот растительного происхождения, водные соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрия гидрофосфат, калия гидрофосфат, натрия хлорид, соли цинка, коллоидный кварц, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрия карбоксиметлцеллюлозу, полиакрилаты, воски, и ланолин и тому подобное, или их комбинации.
Указанная фармацевтическая рецептура может быть в форме, например, пригодной для перорального, парентерального или местного применения. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть в форме, предназначенной для ингаляции. Композиции, предназначенные для применения путем ингаляции, могут быть в форме мелких порошков или растворов, которые можно применять в виде аэрозоля, или вдыхать в виде капелек. Специалисту в данной области техники известны устройства, которые можно применять для доставки композиций непосредственно в легкие, например, посредством ингаляции. Размер капелек конкретной композиции можно изменить так, чтобы лекарство было доступно для различных участков легких. Например, при ингаляции малые частицы или капельки могут глубоко проникать в легочную ткань, и в некоторых случаях могут достигать альвеол.
Фармацевтические композиции для местного применения могут быть представлены в форме мази, раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде эмульсии масло-в-воде.
Соединения, способные модулировать R2R1 и/или R2R2 гены, например, такие как гены, выявленные с помощью способов, описанных здесь, или фрагменты R2R1/2 генов/белков, антисмысловые олигонуклеотиды и антитела, описанные здесь, могут найти дополнительное применение в качестве модуляторов клеточной дифференцировки. Как указано, авторы изобретения определили, что R2R1 и R2R2 гены и их продукты вовлечены в пути модуляции дифференцировки эпителиальных клеток легких, в частности клеток плоского эпителия, образуемых из популяции клеток-предшественников легочного эпителия или базальных клеток (т.е. Krt14+ve клеток).
Соединения, модулирующие дифференцировку клеток (например, эпителиальных клеток легких), могут быть особо пригодными для лечения таких заболеваний, как БЛД, приводящих к повреждению и рубцеванию легких со сниженным или недоразвитым регенеративным потенциалом. Таким образом, при применении или использовании соединения, модулирующего дифференцировку клеток, можно улучшить или восстановить регенеративный потенциал легкого. Специалисту в данной области техники понятно, что соединения, способные усилить или стимулировать экспрессию R2R1 и/или R2R2 генов, или восстановить функцию этих генов, могут быть особо полезными.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает животную модель для изучения процессов развития ткани и/или клеточного перехода, а также некоторых заболеваний и/или состояний (включая сердечные и/или легочные заболевания и/или состояния, и рак). В одном варианте осуществления животная модель может быть создана путем манипуляции или модуляции (т.е. повышающей или понижающей регуляции) экспрессии R2R1/2 генов/белков. В дополнение или альтернативно, животная модель может быть создана путем нарушения экспрессии R2R1/2 генов/белков. Как описано выше, открытие ряда последовательностей R2R1/2 генов/белков человека и мыши обеспечивает для специалиста в данной области техники возможность простой манипуляции этими последовательностями in situ для создания животных моделей. Например, можно создать нокаутных животных, т.е. снизить или по существу устранить экспрессию последовательности R2R1/2 генов. Такие модели пригодны для применения с целью тестирования эффектов лекарств, потенциально пригодных для лечения заболеваний и/или расстройств, описанных здесь, и/или для определения функции или роли конкретного гена. Альтернативно, можно также создать животные модели с повышающей регуляцией экспрессии R2R1/2 генов/белков. Таким об
- 12 034088 разом, можно анализировать эффективность и функцию лекарств, нацеленных на супрессию повышающей регуляции экспрессии R2R1/2 генов/белков. Также можно исследовать эффект повышающей регуляции экспрессии R2R1/2 генов/белков у этих животных.
В других вариантах осуществления замены, добавления, делеции и/или инверсии можно ввести в последовательности R2R1/2 генов для изменения активности белков и для выявления функции некоторых доменов, аминокислот и тому подобного. В дополнение или альтернативно, нокаутных животных, таких как те, что описаны выше, можно трансформировать с любой из последовательностей генов, описанных здесь. Это особенно полезно, если нужно изучать эффект вариантного или мутантного R2R1/2 гена, или эффективность лекарства или соединения, способного подавлять экспрессию или функцию указанной вариантной или мутантной последовательности.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагается применение полинуклеотида, содержащего регенеративный ген для респираторных клеток R2R1 или R2R2 (R2R1/2) для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из (a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где ген R2R1/2 имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%.
Также предложено применение белка, кодируемого геном R2R1/2, антисмыслового олигонуклеотида, способного модулировать экспрессию гена R2R1/2, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где белок, кодируемый геном R2R1/2, имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%.
Следующим объектом настоящего изобретения является антитело или его антиген-связывающий фрагмент, способные к связыванию с белком, кодируемым геном R2R1/2 и имеющим последовательность, выбранную из обозначенных SEQ ID NO: 3, 6, 9 и/или 12, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака.
Для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака может быть использована фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически пригодный наполнитель, носитель или разбавитель, а также либо ген R2R1/2, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательность, идентичную им по меньшей мере на 70%, либо белок, кодируемый геном R2R1/2 и имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и/или 12, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%.
Выявление уровня экспрессии гена R2R1/2 может быть полезно для диагностики сердечных, легочных заболеваний и/или состояний, рака и предрасположенности к указанным заболеваниям и состояниям.
Поэтому еще один объектом настоящего изобретения является способ диагностики одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний;
(c) рака;
(d) предрасположенности к любому из (а)-(с);
где указанный способ включает этап выявления уровня экспрессии гена R2R1/2 в образце, полученном от исследуемого субъекта, причем выявление аберрантного уровня гена R2R1/2 в образце является показателем указанных одного или нескольких заболеваний и/или состояний и/или предрасположенности к ним, где ген R2R1/2 имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%, где аберрантным уровнем является уровень, повышенный и/или сниженный, по сравнению с уровнем экспрессии, обнаруженном в образце, полученном от субъекта, не страдающего заболеванием и/или состоянием.
Указанный способ может быть осуществлен с использованием олигонуклеотидного зонда и/или праймера, предназначенного для гибридизации в жестких условиях, со всей или с частью последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, где олигонуклеотидный зонд и/или пример используют для определения уровня экспрессии гена R2R1/2.
- 13 034088
В соответствии с настоящим изобретением могут быть идентифицированы или получены агенты, которые модулируют экспрессию гена R2R1/2.
Поэтому следующим объектом настоящего изобретения является способ идентификации или получения агентов, которые модулируют экспрессию гена R2R1/2, включающий этапы обеспечения контакта гена R2R1/2 с тестируемым соединением, и детекции любого рода модуляции экспрессии гена R2R1/2, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%, причем детекция любого рода модуляции заключается в определении того, является ли уровень экспрессии гена R2R1/2 таким же, меньшим или большим, чем уровень экспрессии, детектированный в отсутствие тестируемого соединения, и если уровень меньше или больше, то тестируемое соединение может быть пригодно в качестве модулятора экспрессии гена R2R1/2, причем такое протестированное соединение пригодно для лечения заболеваний и/или состояний, указанных в пункте 1.
Для исследования сердечного и/или легочного заболевания или состояния, или рака можно использовать животную модель, полученную путем модуляции или нарушения гена R2R1/2, который имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательности, идентичной им по меньшей мере на 70%.
Поэтому еще одним объектом настоящего изобретения является животная модель для исследования сердечного и/или легочного заболевания или состояния, или рака, которую получают путем модуляции или нарушения гена R2R1/2, который имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и/или 11, или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 70%.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение далее подробно описано со ссылкой на следующие фигуры.
Фиг. 1 - сравнение эндотелиальных и эпителиальных клеток из Vegf+/+ на Е16.5 диаграмме разброса данных демонстрирует на вертикальной оси значение каждого гена при анализе эффекта клеточного происхождения (на основе LIMMA). По горизонтальной оси показано кратное изменение при сравнении 2 тканей. Ker+ клетки экспрессируют архитектурные эпителиальные гены, в то время как il+ клетки транскрибируют репрезентативные эндотелиальные гены. Эндотелиальный Cldn5 и эпителиальный Foxa1 выделены, поскольку они также присутствуют в качестве верхних генов по вертикальной оси (РС2) неконтролируемого анализа спектральных карт (см. фиг. 3).
Фиг. 2 - схематическое представление процесса лазерной захватывающей микродиссекции. Грудные клетки эмбрионов (А) нарезали на секции по 8 мм и помещали на слайды (В). Двойное иммуногистохимическое окрашивание этих тканевых срезов (С) антителами к панкератину и GS-IB4 изолейцином разделяло клетки легочных воздухоносных путей с эпителиальной (D) дифференцировкой от окружающих клеток с эндотелиальными (Е) характеристиками. Специфические группы клеток, выделенные с помощью лазерной захватывающей микродиссекции, показаны на F и G (L - легкое, Н-сердце).
Фиг. 3 - анализ спектральной карты с первым основным компонентом (РС1 по Х-оси) и вторым основным компонентом (РС2 по Y-оси. Влияние времени или возраста эмбрионов оценивали по РС1 (с учетом 35% вариации в наборе данных). Генетические зонды или гены, экспрессируемые позднее в эмбриональной жизни, такие как Sftpc, расположены дальше по Х-оси. Различие в клеточном происхождении (клетки il+ против ker+) было установлено в РС2. Генетические зонды эпителиальных генов ('EPI') были расположены дальше по Y-оси, по сравнению с генетическими зондами семейств эндотелиальных генов ('ENDO'). Различные группы образцов разделяли на спектральной карте по РС1 (возрасту эмбрионов) и РС2 (клеточному происхождению). Ker+ образцы собраны на эпителиальной стороне Y-оси, a il+ образцы сгруппированы на эндотелиальной стороне. Образцы также распределены по Х-оси в соответствии с возрастом эмбрионов. Образцы с более поздним возрастом располагаются дальше по X-оси. На панели ниже показаны 3 профиля экспрессии: (1) показывающий разницу между эпителиальными и эндотелиальными клетками по экспрессии Foxa1, (2) показывающий эффект возраста эмбриона в отношении экспрессии Afp и (3) показывающий профиль зависимости от генотипа и возраста эмбрионов для экспрессии Hmr.
Фиг. 4 - сравнение эпителиальных клеток генотипов Vegf+/+ и Vegf120/120. A. Диаграмма разброса данных показывает на Y-оси значение каждого гена для анализа различия профиля отличия в зависимости от возраста эмбриона между генотипами Vegf+/+ и Vegf120/120 (на основе LIMMA). По Х-оси показана кратность изменения индукции при сравнении 2 генотипов, Vegf+/+ против Vegf120/120 при Е16.5. Повышающая регуляция Krt6a, EDC и SCC генов в клетках дикого типа ker+ выделена. В. Эпителиальные клетки воздухоносных путей в Е16.5 Vegf+/+ легких определены окрашиванием антителами к цитокератину 4, 5, 6, 8, 10, 13 и 18. Клетки дистальных воздухоносных путей имеют морфологию плоских клеток (желтая стрелка), в отличие от их проксимальных соседей (белая стрелка). С. Распределение дифференциальной экспрессии по хромосоме 3. Это подчеркивает понижающую регуляцию генов EDC из Vegf120/120 по сравнению с диким типом.
Фиг. 5А - группа IF= кератинов промежуточных филаментов (красные), прикрепленная к десмосоме (оранжевой), содержащей Dsc1. Pkp1 (фиолетовый) связывает промежуточные кератиновые филаменты с кадгериновыми белками соединений типа адгезионных контактов (желтый). Pkpl также регулирует со
- 14 034088 держание белков в десмосоме. EDC и SCC кластеры генов взаимодействуют с кератинами промежуточных филаментов. Звездочкой выделены гены и кластеры генов с повышающей регуляцией в сети промежуточных филаментов. Повышающая регуляция Eps8l1 (кодирующего актин-кэппирующий белок), координирует ремоделирование промежуточных филаментов и актина.
Фиг. 5В - диаграмма разброса данных показывает по Y-оси значение каждого гена для определения того, отличается ли профиль экспрессии на протяжении эмбрионального возраста для эндотелиальных клеток генотипов Vegf+/+ и Vegf120/120 (на основе LIMMA). По Х-оси показана кратность изменения индукции при сравнении двух генотипов, Vegf+/+ против Vegf120/120 на Е16.5. Выделены кластеры генов Krt, Dsc1, Pkp1, EDC и SCC. Krt гены, подвергшиеся повышающей регуляции в клетках дикого типа Vegf+/+ il+, отличаются от Krt генов, экспрессированных в эквивалентных клетках дикого типа ker+. Krt14 и Krt1 являются генами, характерными для базальных клеток.
Фиг. 5С - иммунофлюоресцентное изображение (увеличение х 40) клеток, окрашенных GS-IB4 изолектином (il+ клеток) в легких эмбриона Е16.5 дикого типа. У Il+ отмечается такая же самая архитектура, как у ker+ клеток из дистальных воздухоносных путей.
Фиг. 6 - диаграмма разброса данных на основе LIMMA анализа для группы клеток, окрашенных антителами к цитокератину 4-5-6-8-10-13-18. (Линейные модели для данных микроматричного анализа: Анализировали различия между Vegf120/120 нокаутными животными и однопометными животными дикого типа в профилеэкспрессии на протяжении эмбрионального возраста, с помощью парного взаимодействия Vegf генотипа и времени). Выделены RIKEN cDNA 2200001I15 ген и RIKEN cDNA 2310002J15 ген.
Фиг. 7 - диаграмма разброса данных на основе LIMMA анализа для группы GS-IB4-связывающих клеток. (Линейные модели для данных микроматричного анализа: Анализировали различия между Vegf120/120 нокаутными животными и однопометными животными дикого типа в профиле экспрессии на протяжении эмбрионального возраста, с помощью парного взаимодействия Vegf генотипа и времени). Выделены RIKEN cDNA 2200001I15 ген и RIKEN cDNA 2310002J15 ген.
Фиг. 8 - выравнивание последовательности кДНК человеческого hR4RA транскрипта ( = человеческий R2R1) против мышиного R4Ra транскрипта ( = мышиный R2R1 ). Необходимо отметить, что наибольший контиг, сконструированный из последовательностей клонов RIKEN cDNA 2200001I15 гена, обозначается как мышиный R4Ra транскрипт ( = мышиный R2R1).
Фиг. 9 - выравнивание белковой последовательности транслированного человеческого hR4RA (= человеческого R2R1) транскрипта против транслированного мышиного R4Ra (= мышиного R2R1) транскрипта.
Фиг. 10 - выравнивание последовательности кДНК человеческого hR4RD (= человеческого R2R2) транскрипта против транслированного мышиного R4Rd (= мышиного R2R2) транскрипта. Необходимо отметить, что наибольший контиг, сконструированный из секвенированных клонов RIKEN cDNA 2310002J15 гена, обозначается как мышиный R4Rd транскрипт (= мышиный R2R2).
Фиг. 11 - выравнивание белковой последовательности транслированного человеческого hR4RD (= человеческого R2R2) транскрипта против транслированного мышиного R4Rd (= мышиного R2R2) транскрипта.
Фиг. 12 - VEGF-A (VEGF164) - зависимая повышающая регуляция R2R1 при развитии межжелудочковой перегородки мышиного эмбриона. Красный - дикий тип, синий - VEGF120/120 нокаутной мыши, не имеющей VEGF164 изоформы.
Фиг. 13 - экспрессия человеческого R2R2 гомолога (=C9orf196) на протяжении времени (24-72 часа) в первичных эпителиальных клетках легких взрослого человека.
Фиг. 14 - нокдаун миРНК VEGF165 приводит к нокдауну генов, ответственных за программу базальных клеток и программу плоскоклеточной дифференцировки. Нокдаун с помощью миРНК первичных клеток бронхиального эпителия (РВЕС) человека надежно моделирует эффект от нокдауна интересующих генов, а) Количественная ОТ-ПЦР: миРНК-опосредованный нокдаун экспрессии VEGFA и VEGF165 приводит к нокдауну экспрессии KRT14 (маркера базальных клеток). Относительная экспрессия KRT14 (PGK1 - нормализованная), VEGFA и VEGF165 построена против миРНК. Включены два отрицательных контроля (обозначенные №№10 и 11). Экспрессия миРНК, направленной против KRT14, включена как положительный контроль. миРНК VEGFA направлена против всех изоформ VEGFA.
Фиг. 15A-J - глобальные изменения экспрессии генов, обусловленные миРНК-опосредованным нокдауном VEGFA в РВЕС. Изменения в глобальной экспрессии генов точно соответствуют изменениям, наблюдающимся у Vegf120/120 нокаутной мыши. На графиках (а) - (j) изображено значение изменений экспрессии генов после применения миРНК, направленной против VEGF в течение 24 ч. График (a)-(j) созданы автоматизированным следовым анализом. Все пути вовлечены в дифференцировку кератиноцитов: регенерацию базальных клеток и плоскоклеточную дифференцировку.
Фиг. 16А-С - миРНК против гомологов человеческих R2R1 и R2R2. Гомолог(и) R2R1 человека включает семейство FAM25, охватывающее семь человеческих паралогов, обозначенных FAM25A, FAM25B, FAM25C, FAM25D, FAM25E, FAM25G и FAM25HP. Они являются человеческими гомологами мышиных последовательностей, кодированных последовательностями кДНК, обозначенными
- 15 034088
2200001I15Rik или RIKEN cDNA 2200001I15. Сходство FAM25 паралогов исключает проведение специфической количественной ПЦР с обратной транскриптазой различных паралогов. FAM25 паралоги также отсутствуют на биочипах экспрессирующихся генов человека Affymetrix, таких как НТ HG-U133 или НТ HG-U219. Мы выбрали для количественной ОТ-ПЦР набор праймер-зонд Hs04194072_m1 (Applied Biosystems) для определения дифференциальной экспрессии генов семейства FAM25. Applied Biosystems установил, что этот набор праймер-зонд не обеспечивает дифференцировки между различными паралогами. Три миРНК, сконструированные против семейства FAM25, были выбраны по их способности к понижающей регуляции Hs04194072_m1 экспрессии в РВЕС. Мы обозначили миРНК номерами 18, 20 и 22, соответственно. График (а) иллюстрирует понижающую регуляцию экспрессии FAM25 (Hs04194072_m1) (PGK1 нормализованной) спустя 24 ч после применения соответствующих миРНК в РВЕС. Гомолог R2R2 человека: две миРНК (номер 15 и 17), сконструированные против C9orf169 (в концентрациях 5 и 20 нм, соответственно), были выбраны на основе их способности к понижающей регуляции экспрессии C9orf169 в РВЕС. Экспрессию C9orf169 оценивали микроматричным анализом и количественной ОТ-ПЦР. Зонды для C9orf169 присутствуют на Affymetrix HT HG-U219 биочипе экспрессирующихся генов человека. График (b) иллюстрирует понижающую регуляцию (оцениваемую микроматричным анализом) экспрессии C9orf169 спустя 24 ч применения соответствующей миРНК в РВЕС. Применение миРНК, направленной против семейства FAM25 или VEGFA, не влияло на экспрессию C9orf169. миРНК, направленная против R2R1 (семейства FAM25 человека) и R2R2 (человеческого C9orf169), обеспечивала понижающую регуляцию экспрессию KRT14, что являлось ответом, подобным ответу, наблюдаемому после применения миРНК, направленной против VEGFA и VEGF165.Опосредованный миРНК нокдаун семейства FAM25 и C9orf169 приводил к понижающей регуляции экспрессии гена KRT14 (маркера базальных клеток). Этот ответ является наиболее очевидным после применения миРНК, направленной против C9orf169. График (с) иллюстрирует понижающую регуляцию экспрессии KRT14 (PGK1 нормализованной) спустя 24 часа после применения соответствующий миРНК в РВЕС. Включены также миРНК, направленные против VEGFA и KRT14, для сравнения.
Фиг. 17 - является схематическим представлением эффектов R2R гомологов. Экспрессия R2R гомологов ведет к одновременной модуляции передачи HIF1A сигналов (обеспечивая толерантность к кислороду) (блок 5), и модуляции специфического (PERP) анти-апоптотического пути (блок 4). Это обеспечивает (ре) генерацию здоровых эпителиальных клеток (с основным защитным барьером от стресса), без установки неограниченного ростового потенциала. Другими словами, модуляция специфического антиапоптотического пути не вызывает общей толерантности к апоптозу. Общая толерантность к апоптозу может приводить к опасной ситуации иммортализации клеток -превращению клеток в раковые клетки. Путь был построен на основе микроматричного анализа миРНК - опосредованного нокдауна человеческого R2R1 гомолога (семейство FAM25) и человеческого R2R2 гомолога (C9orf169).
Фиг. 18 - R2R гомологи необходимы для регенерации и дифференцировки кератиноцитов (блок 1) и модуляции апоптоза (блок 2) в VEGFA - VEGF165 пути. Влияние на экспрессию генов R2R гомологов для регенерации и дифференцировки кератиноцитов (блок 1) очевидно из фиг. 18А и 18В. Влияние на экспрессию генов R2R гомологов для модуляции апоптоза (блок 2) очевидно из фиг. 18С. Они являются окончательными эффектами из квадратов 3, 4 и 5.
Фиг. 19А-В - влияние на клеточное дыхание (см. Блок 3 на фиг. 17) является высоко специфичным: миРНК-опосредованный нокдаун R2R гомологов обеспечивает понижающую регуляцию окислительного фосфорилирования. Экспрессия R2R обеспечивает повышающую регуляцию окислительного фосфорилирования. Мы можем наблюдать этот эффект наиболее выраженным в отношении экспрессии митохондриальной АТР5А1 - АТФ-синтазы (транспорта Н+) (фиг. 19А). миРНК, направленная на R2R гомологи, обеспечивает понижающую регуляцию экспрессии АТР5А1. Фиг. 19В иллюстрирует экспрессию АТР5А1 среди глобальных изменений экспрессии генов пути окислительного фосфорилирования.
Фиг. 20 - влияние R2R гомологов на передачу сигналов Р53-Р63 (см. Блок 4 на фиг. 17). Осуществляется понижающая регуляция PERP (TP53 эффектора апоптоза) посредством миРНК-опосредованного нокдауна человеческих R2R гомологов. PERP является р63-регулируемым геном, необходимым для целостности эпителия. Р63 является главным регулятором развития многослойного эпителия, необходимым и достаточным для определения этой многоаспектной программы. Perp, мембранный белок из семейства тетраспанинов, который исходно был идентифицирован как апоптоз-ассоциированная мишень р53 супрессора опухоли, является первой прямой мишенью р63, явно опосредующего эту программу развития in vivo - это было продемонстрировано Rebecca A. Ihrie et al. in 2005 (Cell, Vol. 120, 843-856, March 25, 2005) (курсивом показан автор в реферате данной статьи). График демонстрирует понижающую регуляцию экспрессии PERP после миРНК опосредованного нокдауна человеческих R2R гомологов.
Фиг. 21 - обзор экспрессии PERP среди глобальных изменений экспрессии генов Р53 пути после применения FAM25 №20 (направленного на человеческий гомолог R2R1).
Фиг. 22 - обзор экспрессии PERP среди глобальных изменений экспрессии генов Р53 пути после применения FAM25 №18 (направленного на человеческий гомолог R2R1).
Фиг. 23 - обзор экспрессии PERP среди глобальных изменений экспрессии генов Р53 пути после
- 16 034088 применения C9orf169 №15 (направленного на человеческий гомолог R2R2).
Фиг. 24 - обзор экспрессии PERP среди глобальных изменений экспрессии генов Р53 пути после применения C9orf169 №17 (направленного на человеческий гомолог R2R2).
Фиг. 25А-С - экспрессия HIF1A (см. блок 5 на фиг. 17) сильно регулируется экспрессией человеческих R2R гомологов. миРНК-опосредованный нокдаун человеческих R2R гомологов обеспечивает понижающую регуляцию HIF1A экспрессии (фиг. 25А). Влияние HIF1A на последующие звенья клеточного дыхания (окислительного фосфорилирования) описано в 3 (см. фиг. 17, Клеточное дыхание). R2R гомологи направляют экспрессию PERP типа р53-р63 и HIF1A. Таким образом, жесткие эпителиальные клетки, оснащенные HIF1A арсеналом, могут развить неограниченный ростовой потенциал под влиянием VEGFA/VEGF165. Однако мы наблюдаем в то же самое время, что эпителиальные клетки защищены от перехода в бессмертное состояние. Экспрессия R2R гомологов нарушает экспрессию генов, которые могут иммортализовать клетки. Это особенно явно в случае BCL2A1 (фиг. 25В), анти-апоптотического гена, чья экспрессия вызывает резистентность к терапии у раковых клеток. миРНК-опосредованный нокдаун R2R ведет к повышающей регуляции экспрессии BCL2A1. R2R гомологи разрушают экспрессию BCL2A1. R2R также стимулируют экспрессию генов, обеспечивающих апоптоз клеток при необходимости. Это демонстрируется миРНК-опосредованным нокдауном R2R гомологов: нокдаун вызывает понижающую регуляцию МАР2^ (фиг. 25С) супрессора опухоли в аденокарциноме легких.
Табл. 1. RIKEN cDNA 2200001I15 ген и RIKEN cDNA 2310002J15 ген среди основного списка генов при SAM анализе дифференциальной экспрессии генов в Е16.5 в клетках дикого типа и нокаутных Vegf120/120 клетках при окраске с антителами к цитокератинам 4-5-6-8-10-13-18.
Табл. 2. RIKEN cDNA 2200001I15 ген и RIKEN cDNA 2310002J15 ген среди основного списка генов при SAM анализе дифференциальной экспрессии генов в Е16.5 в клетках дикого типа и нокаутных Vegf120/120 клетках при окраске GS-IB4.
Табл. 3. Распределение эмбрионов по возрасту и генотипу Vegf. дт/дт = гомозиготный дикий тип (Vegf+/+), 120/дт = гетерозиготный Vegf120/+ тип, и 120/120 = гомозиготный, Vegf120/120 нокаутный тип. (NG = не генотипирован из-за плохой морфологии эмбриона).
Таблица 1
№ пробы вариант '[ ϋΠίΟβΠβ ID Выравнивания [Название гена Символ гена
1448745 s at 44.327( Mm. 1121 chi3:92166199-9216906lJiopiiiqHiii Lor
1451613 at 25.931 !Mm.208047 C hr3:93406151-93418973хорнернн Hmr
1449986 at 21.731IMm. 160339 chr16:88647705-8864865 RIKEN cDNA 2310034009 ·« 2310034C09Rlk
1440186 s at 19.595(Mm.44242 Chr5:36523188-3652342^ RIKEN cDNA 2310020A21 2310020A21Rik
1421575 at 18.532! Mm.358728 chr16:88666693-886676<RIKEN CDNA 2310057N15 « 2310057N15Rik
1453218 at 16.908( Mm.292458 chr3:92764649-9276632) RIKEN cDNA 1110014K05 re.. 1110014K05Rik
1459897 a at 16.677: Mm.250717 chr7:30460230-30464892 сунрн'-мгиш Sbsn
1420676 at 16.402 Mm.41969 C hr3:92731934-9273371 ^мальш г^ю.шш-обогащетю-подобш-п! 3 Sprrl3
1420358 at 13.819 Mm.353193 ChH6:88647705-8870935керапш иссишшривишшш бедок 13 Krtap13
1437019 at 13.44:Mm. 27156 chr14:33180971-331844^ RIKEN cDNA 2200001115 ren 2200001115Rik
1456248 at 12.776! Mm.46390 chr3:93078529-93078825RIKEN cDNA 2310002A05 ///!2310002A05Rik /// LOC630971
1434227 at 12.373'Mm.268157 С11Г7:30496664-3049985бстш™тптт.ги с диффсрсшт. ксрапшопптоп Krtdap
1420677 x at 12.3121 Mm.41969 Chf3* 92731934-9273371 ^малый пролвш-фбогашешю-пфлобпый -3 Sprri3
1439630 x at 12.212'Mm.250717 chr7:30463567-30464893 супрабаяш Sbsn
[1420350 at 11.873! Mm. 279773 Chr3:92754015-9275571 ^мялый пролин-обогащеино-подобпый -2 Spn12
I1428781 at 11.64! Mm.30138 сhr7:30485165-30489826 RIKEN cDNA 1110014F24 1110014F24Rik
1452732 at 11.02 Mm. 183043 chr6:86593812-86595336 RIKEN cDNA 2300003P22 «и 2300003P22Rik
1419394 s at 10.266! Mm.21567 Chr3:90754997-9075596'(S100 клгп.пий-свпя.тмлппй белок A8 (С S100a8
1453092 at 10.127iMm.35806 chr3:93099607-9310107^RIKEN cDNA 2300002G24 2300002G24Rik
1435111 at 9.396! Mm.32861 chr7:24063581-2406386/RIKEN cDNA 2310011E23 ™ 2310011E23Rik
1419709 at 9.22(Mm.136573 chr16:36369769-363746^ ст.ф.ш A3 Stfa3
1435761 at 9.202( Mm.383370 chr16:36196367-3620461< <*.» A3 Stfa3
1422784 at 7.244I Mm.302399 chrl5:101517949-101522керятннокын комплекс, основной. i сн 6a Krt2-6a
1435760 at 7.165( Mm. 300592 сЬг18:42299151-422997ушсттп. д Csta
1448756 at 6.71iMm.2128 chr3:90778558-9078122fiS100K>i4i.4trit-fnmi.niliTonnrii6c.n«K А9 (с S100a9
1447669 s at 6.627( Mm.215394 Chr13:13619774-1362001гуяшш нуклеотид связывающий белок | Gng4
1425336 x at 5.61 Mm.422886 Chr17:33606481-336107^ ιικιοιοημι-ιιιιμιηιιι 2, К1, К регион H2-K1
1437145 s at 5.455 Mm.46431 с hr2:25060827-25061091 RIKEN cDNA 2310002J15 ген 2310002J15Rik
1420741 x at 5.247 Mm.291782 chr3:92862612-92864302RIKEN cDNA 2310069N01 >' 2310069N01Rik
1442339 at 4.062 Mm.187847 Chr16:36076009-360811 q стефпп а2-подпапый i Stfa2l1
1427492_at 3.963 Mm.34964 ChrX 108755370-1087622сиплромистощения тгппткоп IB Poflb
1418722 at 3.693 Mm.236225 Chr9^ 110265012-1Ю268^белоь· нейтрофильных гранул Ngp
1419409 at 3.69 Mm.291769 СЬгЗ:9274Ю51-92741651ма-нын иролин обогащении подобный 5 Spni5
1436936 s at 3.42] Mm.274770 СЬгХ99684922-99685968нсяктпвные X специфичные транскрипты Xist
1427262_at 3.408( Mm.274770 СИгХ:99663093-9968593^пеактшпп,к· Х-спецпфцчцые трапскршпы Xst
- 17 034088
1430567 at 3.377 Mm.35369 |chr18:44114683-441478'|»,i,r,,6uT<4· сер1шо1№йиеш11д>пы,Кага1 πιπ iSpink5
1422667 at 3.336 Mm.38498 ichrl 1:99947848^99520^кгрягин<шыи itoMiuirKc i. u-n«.n..ir<. rm is 15 КШ-15
1448881 at 3.243 Mm.26730 I chr8:112464257-1124682 mum Нр
1423547 at 2.71 M m.45436 ί chr10:116681442-116686 штцш Lyzs
1449586 at 1.939 Mm.4494 i chr1:137687809-137735q илякофн пш -ι Pkp1
1449133 at 1.932 Mm.331191 chr3:92569339-9257128^i'[:| rKni щюлпн-обоглтцсннкт белок ι л Spirla
1449106 at 1.901 а пллл. л л 1.. i j л r- л j л j г л —. Gpx3
1452543 a at 1.862 Mm.2258 Chr19:9150684-9154982 jmqiemjiosim, ia, w· i Scgblal
l450633 at 1.859 Mm.21075 Chr13:3837003-3837919 I 4 Calm4
1459898 at 1.826 Mm.250717 chr7:30460230-30464892 <-уирнв»« Sbsn
1429565 s at 1.815 Mm. 292457 СЬгЗ:93103210-9310446^по;дняя ригивия «бшючкя 5Л Lce5a
1429540 at 1.727 Mm. 34382 сЬг7:25076381-25078481к°1 ,ш1Ф<шш Cnfn
1453801 at 1.597 Mm.180200 chr3:94427502-9443259Qv.'iicPiMeii<,m> ню члгра-ш. член 5 7hem5
1422672 at 1.568 Mm. 140151 С hr3:92522208-92524192 милый пролпп-обогощнпп.т белок ι в Sprrlb
Таблица 2
Номер пробы Вариант UniGene ID Наименование гена Символ гена
1449586 a! 32.877Mm.4494 плако филин 1 Pkpl
1423935_x_at 30.173Mm.6974 Кератиновый комплекс 1, кислый, ген 14 Kril-14
1460347 a! 28.662 Mm.6974 Кератиновый комплекс 1, кислый, ген 14 Kril-14
1438856_x_at 23.207Mm.268618 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В, член 5 Serpinb5
1422667 a! 21.017МШ.38498 Кератиновый комплекс 1, кислый, ген 15 Kril-15
1422481 a! 20.962Mm.l83137 Кератиновый комплекс 2, основной, ген 1 Krt2-1
1424096 a! 20.14Mm.383993 Кератиновый комплекс 2, основной, ген 5 Krt2-5
1451613 a! 20.135Mm.208047 Хорнерин Hmr
1453218 a! 18.792 Mm.292458 RIKEN cDNA 1110014К05 ген 1110014K05Rik
1441941_x_at 18.5Mm.268618 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В, член 5 Serpinb5
1456203 a! 17.757 — RIKEN cDNA 1110020А10 ген 1110020A10Rik
1434227_at 16.95 — Белок, связанный с дифференцировкой кератиноцитов Krtdap
1429067 a! 16.396 — Кальпаин, малая субъединица 2 Capns2
1440186_s_at 16.186Mm.378865 Транскрибируемый локус —
1419709 a! 15.648Mm.l36573 Стефин АЗ Stfa3
1422939 a! 14.807Mm.337362 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В (овальбумин), член ЗВ Serpinb3b
1422308_a_at 14.219Mm.2O973 Лектин, связывающий галактозу, растворимый 7 Lgals7
1437019 a! 13.876Mm.27156 RIKEN cDNA 2200001115 ген 2200001I15Rik
1450633 a! 13.842Mm.21O75 Кальмодулин 4 Calm4
1421117 a! 12.773 Mm.336625 Дистонии Dst
1421752_a_at 12.718Mm.268618 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В, член 5 Serpinb5
1418799_a_at 12.316Mm.1225 протоколлаген, тип XVII, альфа 1 Coll7al
1453801 a! 11.671 Mm. 180200 Член 5 суперсемейства тиоэстеразы Them5
1422940_x_at 11.333 Mm.337362 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В (овальбумин), член ЗВ Serpinb3b
1436392_s_at ll.112Mm.3629 Фактор транскрипции АР-2, гамма Tcfap2c
1452166_a_at 10.901 Mm.22662 Кератиновый комплекс 1, кислый, ген 10 Kril-10
1449938 a! 10.491Mm.1001 Плацентарный белок-11 связанный Ppllr
1421040_a_at 10.27Mm.371562 Глутатион- S-трансфераза, альфа 2 (Yc2) Gsta2
1437232 a! 10.198Mm.l07214 Белок, повышающий бактериальную проницаемость- подобный 2 Bpil2
1424623 a! 9.782Mm.268618 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В, член 5 Serpinb5
1418748 a! 9.085 Mm.20940 Каспаза 14 Caspl4
1418158 a! 9.029 Mm.20894 Белок, связанный с трансформацией 63 ТгрбЗ
143055 l_s_at 8.917Mm.l95937 Липазо-подобный, содержащий домен ab-гидролазы 3 Lipl3
1430550 a! 8.679Mm.l95937 Липазо-подобный, содержащий домен ab-гидролазы 3 Lipl3
1435761 a! 8.652Mm.l36573 Стефин АЗ Stfa3
1448397 a! 8.545 Mm.25652 Белок мещклеточных щелевых контактов мембранного канала бета 6 Gjb6
1459898 a! 8.407Mm.250717 Супрабазин MGL2446326
1422672 a! 8.373 Mm.140151 Малый пролин-обогащенный белок 1В Sprrlb
1459897_a_a! 8.371 Mm.250717 Супрабазин MGL2446326
142878 la! 8.218Mm.30138 RIKEN cDNA 1110014F24 ген 1110014F24Rik
1419492_s_a! 8.128Mm.5341 Дефензин бета 1 Defbl
1439183 a! 8.102Mm.218784 N-ацилсфингозин амидогидролаза (щелочная церамидаза) 3 Asah3
1419491 a! 8.028Mm.5341 Дефензин бета 1 Defbl
1427263 a! 7.99 — Неактивные Х-специфические транскрипты Xis!
1416930 a! 7.471 Mm.878 Лимфоцитарного антигена 6 комплекс, локус D Ly6d MGL3524930 ///
1435760 a! 7.251Mm.3OO592 Цистатин А /// подобный гомологу стефина LOC547252
1439630_x_a! 7.031 Mm.250717 супрабазин MGL2446326
1435639 a! 6.509 — RIKEN cDNA 2610528А11 ген 2610528AllRik
1424976 a! 6.23 Mm. 120274 ras гомолог семейства генов, член V Rhov
1455519_a! 6.163 Mm.383274 Десмоглеин 1 бета Dsglb
1455715_a! 5.932Mm.373656 PREDICTED: Mus musculus RIKEN cDNA 2700099C18 ген (2700099C18Rik), mRNA —
1434534 a! 5.693 — — —
1426048_s_a! 5.603 Mm.85544 Фактор транскрипции АР-2, альфа Tcfap2a
1449500 a! 5.535Mm.66O15 Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, таксон В, член 7 Serpinb7
1430582 a! 5.508Mm.l33101 SNF2 гистон линкер PHD RING геликаза Shprh
1435670 a! 5.464 Mm.137021 Фактор транскрипции АР-2 бета Tcfap2b
1422588 a! 5.427Mm.358617 Кератиновый комплекс 2, основной, ген 6Ь Krt2-6b 9430070013Rik///
1445187 a! 5.408Mm.329504 RIKEN cDNA 9430070013 ген /// модель гена 979, (NCBI) Gm979
1421996 a! 5.28Mm.85544 Фактор транскрипции АР-2, альфа Tcfap2a
1423323 a! 5.278Mm.l54045 Ассоциированный с опухолью трансдуктор кальциевого сигнала 2 Tacstd2
1452228 a! 5.242 Mm.257819 RIKEN cDNA 4930451А13 ген 493045 lA13Rik
1449959_x_a! 5.214Mm.23784 Малый пролин-обогащено-подобный 9 Sprrl9
1419731 a! 5.211Mm.l4098 Цитохром Р450, семейство 2, подсемейство Ь, полипептид 19 Cyp2bl9
1442279 a! 5.14Mm.312133 Усилитель гомолога polycomb 1 (Дрозофила) (Epcl), вариант транскрипта 1, мРНК Epcl
1455408 a! 5.008 Mm.24880 RIKEN cDNA 4732472107 ген 4732472I07Rik
1416271 a! 4.925 Mm.28209 PERP, ТР53 эффектор апоптоза Perp
1418722 a! 4.888Mm.236225 Белок нейтрофильных гранул Ngp
1437351 a! 4.809Mm.224814 Палец с СХХС 4 Cxxc4
1440162_x_a! 4.662 Mm.208144 Г ипотетический белок А630043Р06 A630043P06
1426641 a! 4.647 Mm.266679 Г омолог iribbles 2 (Дрозофила) Trib2
- 18 034088
1442349 at 4.643 Mm.259334 RIKEN cDNA C630028N24 ген C630028N24Rik
1425624_at 4.593 Mm.209005 EPM2A (лафорин) взаимодействующий белок 1 Epm2aipl
1460038_at 4.577Mm.297371 POU домен, класс 3, фактор транскрипции 1 Pou3fl
1440523_at 4.562 Mm.98096 Ретинальной короткоцепочечной дегидрогеназы редуктаза 2 MGL2668443
1431211_s_at 4.438Mm.l80200 Член суперсемейства тиоэстеразы 5 Them5
1447329 at 4.351 — ___ ___
1443687 x at 4.344 — — —
1420988 at 4.306 Mm.311585 ДНК-ποлимераза, эта, (RAD 30 связанная) Polh
1456248 at 4.189Mm.4639O RIKEN cDNA 2310002А05 ген 2310002A05Rik
1430000_at 4.157 — RIKEN cDNA В230117015 ген Белок 2, связывающийся с полипиримидиновым трактом, мРНК (кДНК клон MGC: 1167] B230117O15Rik
1446490_at 4.154Mm.29966 IMAGE:3709255) Ptbp2
1441909 s at 4.1 Mm.225253 RIKEN cDNA 9530066К23 ген 9530066K23Rik
1427747 a at 4.035Mm.9537 Липокаин 2 Lcn2
1437145 s at 3.994Mm.46431 RIKEN cDNA 2310002Л5 ген 2310002J15Rik
1419463_at 3.985 Mm.20897 Активируемый кальцием хлоридный канал 2 Clca2
1441440 at 3.976Mm.277366 Связанный с аутофагией 4С (дрожжи) Atg4c
1437705 at 3.854 — — —
1418028_at 3.846 Mm. 19987 Допахром-таутомераза Det
1442786_s_at 3.804Mm.270469 ДНК сегмент, хромосома 5, Brigham & Women's Genetics 0860 экспрессированный D5Bwg0860e
Таблица 3
Е7734
E7733 E12,5 A дт/дт Е12,5 А 120/120
В дт/120 В дт/120
c 120/120 С дт/120
D дт/120 D дт/120
E дт/120 Е дт/120
F дт/дт F дт/120
G дт/дт G дт/120
H 120/120 Н 120/120
I дт/дт
К 120/120
Е7494
Е7232Е14.5 А 120/дт Е14.5 А 120/120
В 120/дт В дт/дт
С 120/120 С 120/дт
D дт/дт D 120/дт
Е 120/дт Е 120/120
F 120/дт F 120/дт
G дт/дт G 120/дт
Н 120/120 Н 120/дт
I 120/дт I дт/дт
К дт/дт
L дт/дт
Е7477
Е7119Е16.5 А 120/дт Е16.5 А 120/120 Е7478Е16.5 А 120/120
В 120/дт В дт/дт В дт/дт
С 120/120 С ? С 120/дт
D 120/дт D 120/+ D 120/дт
Е 120/дт Е дт/дт Е 120/дт
F 120/дт F дт/дт F 120/120
G 120/120 G ? G дт/дт
Н 120/дт Н 120/дт Н 120/дт
I дт/дт I 120/дт I 120/дт
J 120/дт К 120/дт К дт/дт
К 120/дт L 120/120 L 120/120
L 120/дт М дт/дт
Введение
R2R гены, транскрипты и соответствующие белки были открыты на VEGF мышиной нокаутной модели. Vegf120/120 нокаутные мыши неспособны продуцировать Vegf164 и Vegf188 изоформы (Vegf164 является гомологом человеческого VEGF165). Легкие Vegf120/120 нокаутной мыши являются гипопластическими при рождении, и периферические воздухоносные пути и сосудистая дифференцировка тяжело нарушаются в Vegf120/120 нокаутных эмбриональных легких. Геномный подход привел к открытию того, что Vegf164 у мышей и VEGF165 у человека управляют очень специфической программой экспрессии генов. Эта программа состоит из двух компонентов. Первым компонентом является (ре)генерация базальных клеток эпителия воздухоносных путей: базальные клетки являются источником по меньшей мере популяции клеток в проксимальных воздухоносных путях. Базальные клетки также образуют сильное межклеточное соединение путем построения хемидесмосомы и фокальных адгезионных соединений. Базальные клетки укрепляют внутриклеточную архитектуру посредством белков промежуточных филаментов KRT14 и KRT5. Эти два белка присоединены к (хеми)десмосоме.
Вторым компонентом является программа дифференцировки: это программа укрепления (плоско
- 19 034088 клеточной дифференцировки) клеток, выстилающих воздухоносные пути. Эти клетки должны быть жесткими при рождении, поскольку они будут подвергаться механическому стрессу и воздействию высоких уровней кислорода. Укрепление возможно благодаря семейству белков, усиливающих клеточную архитектуру. Это семейство белков состоит из группы промежуточных филаментов, и белков, укрепляющих промежуточные филаменты (SPRR белков, LOR, HRNR, и т.д.). Эти две программы можно обобщить под заголовками дифференцировка кератиноцитов, дифференцировка эпителиальных клеток, реорганизация промежуточных филаментов, роговая оболочка, кератиновые филаменты, ремоделирующие цитоскелет.
В то как перспективно применять VEGF165 белок для регенерации поврежденных легких у человека, VEGFA и VEGF165 являются важными регуляторами широкого ряда процессов в организме. Следовательно, применение VEGFA or VEGF165 может привести к слишком многим побочным эффектам.
Были открыты два новых гена (R2R1 и R2R2) в программе экспрессии генов, которые управляются Vegf164 у мышей и VEGF165 у человека. Эти новые гены, их транскрипты и транслированные белки не связаны с генами и их продуктами из поздних звеньев программы экспрессии базальных и плоскоклеточных генов.
Были проведены эксперименты для демонстрации того, что эти гены являются важными модуляторами программы базальной и плоскоклеточной дифференцировки. Одной из наиболее важных находок этих экспериментов является то, что эти гены являются важными модуляторами экспрессии HIF1a и PERP в клетках. В наших экспериментах R2R гены являются позитивными регуляторами, и интерференция с данным механизмом открывает терапевтические возможности в лечении рака.
Материалы и методы
Мышиные эмбрионы и обработка тканей.
Все эксперименты на животных были утверждены Этическим Комитетом по исследованиям на животных в Медицинском центре Лейденского университета, и выполнены в соответствии с Руководством по уходу и применению лабораторных животных, опубликованным Национальным институтом здоровья. Гетерозиготных Vegf+/120 мышей скрещивали для получения эмбрионов Vegf120/120 и однопометных мышей дикого типа Vegf+/+. По утрам по вагинальной пробке определяли возраст эмбриона в сутках (Е) 0,5. Беременных самок умерщвляли цервикальной дислокацией. Эмбрионов Е12.5, 14.5 и 16.5 изолировали в стерильном ФБР. Грудные клетки эмбрионов осторожно разрезали в условиях, свободных от рибонуклеазы, помещали в среду для замораживания тканей (TBS, Triangle Biomedical Sciences, Дарем, Северная Каролина), замораживали и хранили при -80°С. Распределение эмбрионов по возрасту и происхождению представлено в табл. S1.
Получали срезы с помощью криостата (8 мкм), и прикрепляли к слайдам для микроскопии SuperFrost Plus (Menzel Gmbh & Co KG, Брауншвейг, Германия). Получение срезов и другую иммуногистохимическую обработку грудных клеток эмбрионов различного возраста проводили произвольно.
Иммуногистохимия и лазерная захватывающая микродиссекция.
Три среза ткани от каждой грудной клетки эмбриона выбирали на уровне вида сердца с двумя желудочками. Срезы подвергали иммуногистохимической обработке в одной партии. Криостатические срезы фиксировали, помещая их в холодный ацетон (4°С) на 2 минуты после извлечения из -80°С морозильника. Все дополнительные иммуногистохимические этапы проводили при 4°С, и все буферные растворы и растворы антител хранили при 4°С. Буферный раствор, не содержащий рибонуклеазы, или D-PBS буферный раствор готовили путем разбавления RNAsecure (25x, AM7006, Ambion TX) до 1х в используемом буферном растворе. Все растворы антител готовили в ФБР, в то время как изолектин GS-IB4 конъюгат разбавляли в D-PBS. Superase.In (AM2696, Ambion, Остин, Техас) добавляли к каждому раствору антител в конечной концентрации 1 Ед/мкл. Слайды сушили на воздухе, и срезы тканей ограничивали карандашом для гидрофобного барьера. После помещения слайдов на холодный металлический блок (4°С), 30 мкл ФБР наносили на каждый тканевой срез, и сушили. Затем 30 мкл анти-кератин (4, 5, 6, 8, 10, 13, 18) моноклональных антител (МАВ1636, Chemicon) в концентрации 10 мкг/100 мкл наносили на образец. Раствор антител высушивали спустя 2 минуты, и срез ткани осторожно промывали 250 мкл ФБР. 30 мкл Alexa-fluor-488 куриного анти-мышиного IgG (H+L) конъюгата (А21200, Invitrogen, Калифорния) в концентрации 10 мкг/100 мкл, наносили затем на 2 мин, затем опять осторожно промывали 250 мкл ФБР. Наконец, третий цикл 2-минутного окрашивания с 30 мкл изолектин GS-IB4 Alexa Fluor 594 конъюгата (121413, Invitrogen, Калифорния) в концентрации 10 мкг/100 мл завершал процедуру окрашивания. Тканевые срезы подвергали дегидратации при комнатной температуре: 75% EtOH (30 с), 95% EtOH (30 с), 100% EtOH (30 с), 100% EtOH (120 с), ксилол (180 сек). Лазерную захватывающую микродиссекцию проводили на приборе для микродиссекции Veritas Microdissection Instrument (Arcturus Bioscience Inc., Маунтин-Вью, Калифорния) немедленно после этапов дегидратации. Мы готовили срезы из 3х 300 - 400 клеток (в виде образцов в трех повторностях) из внутрилегочных воздухоносных путей или кровеносных сосудов в эмбриональных легких на тканевых срезах на уровне обоих желудочков сердца. Клетки, окрашенные моноклональными антителами к мышиному панкератину/куриным анти-мышиным IgG Alexafluor-488 конъюгатом, были идентифицированы как зеленые флюоресцирующие клетки (синий фильтр).
- 20 034088
Эти зеленые флюоресцирующие клетки были определены как эпителиальные клетки воздухоносных путей (ker+ клетки), и были произвольно выделены, независимо от их морфологии характерной для проксимальных или дистальных воздухоносных путей. Клетки, окрашенные изолектин GS-IB4 Alexa-fluor594 конъюгатом, были идентифицированы как красные флюоресцирующие клетки (зеленый фильтр). Эти клетки были определены как мезенхимальные клетки с эндотелиальными характеристиками (il+ клетки). Окрашивание клеток обоими маркерами не наблюдалось на трех точках эмбрионального развития (Е 12.5, 14.5, 16.5). Фактически, зеленые и красные флюоресцирующие клетки можно было наблюдать как позитивное/негативное изображение друг друга. Подвергнутые микродиссекции ker+ или il+ клетки собирали в пробирку Gene Amp (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния), заполненную 75 мкл RNeasy литического буферного раствора (RLT; Qiagen, Хильден, Германия), содержащего 0,14М бета-меркаптоэтанол и 200 нг полиинозиновой кислоты (Sigma).
Выделение, амплификация, маркировка, и микроматричная гибридизация РНК.
Захваченные лазером образцы инкубировали при 42°С в течение 20 мин, а затем охлаждали на льду. Образцы хранили при -80°С перед дальнейшей обработкой. После оттаивания равный объем 70% этанола добавляли в каждый образец, а затем переносили на колонки RNeasy MinElute Spin Columns (Qiagen). РНК очищали в соответствии с инструкциями производителя, элюировали 14 мкл воды, не содержащей рибонуклеазы, и доводили до 4 мкл вакуумной сушкой. Два цикла линейной мРНК амплификации было необходимо для образования достаточных количеств кРНК. Два-цикла синтеза кДНК и синтез биотинмаркированной кДНК проводили в соответствии с руководством GeneChip Eukaryotic Sample and Array Processing Manual (Руководство по обработке генного чипа эукариотического образца и матрицы) (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния). В качестве контроля извлечения использовали контрольный набор GeneChip Poly-A RNA control kit (Affymetrix). MEGAscript T7 kit (Ambion, Остин, Техас) использовали для транскрипции in vitro второй нити кДНК в первом цикле амплификации, получая 112-457 нг аРНК. Во втором цикле амплификации, начиная от 100 нг аРНК из первого цикла, получали 11-86 мкг кРНК с применением набора для маркировки транскрипции in vitro (IVT) GeneChip. Маркированную РНК гибридизовали в мышиных геномных матрицах GeneChip (Affymetrix). Гибридизацию проводили с применением 12,5 мкг маркированной биотином РНК при 45°С в течение 16 часов при непрерывном вращении. Матрицы окрашивали в установках Affymetrix Fluidics stations с применением стрептавидинафикоэритрина (SAPE), с последующим окрашиванием антителами к стрептавидину, и вторым SAPE окрашиванием. Затем матрицы сканировали на инструменте Agilent Laserscanner (Affymetrix).
Статистический анализ.
Данные по уровню зонда Affymetrix обобщали с применением FARMS (Факторного анализа для робастного суммирования микроматриц)1. Необработанные интенсивности подвергали логарифмической трансформации для получения нормального распределения данных. Вначале неконтролируемый многовариантный метод проекции, анализ спектральных карт2, применяли для снижения сложности слишком многомерных данных (n генов против р образцов). Анализ спектральных карт обеспечивал объективную идентификацию преобладающих кластеров генов и предметов, присутствующих в наборе данных. Вовторых, тесты для дифференциальной экспрессии генов между клетками двух видов (ker+ против il+ клеток) проводили в LIMMA (линейных моделях для данных микроматриц)3, поскольку этот анализ использует информацию для совокупности генов, делая анализ стабильным даже в экспериментах с малым количеством матриц3. В-третьих, различия между однопометными Vegf120/120 нокаутными мышами и мышами дикого типа по профилям экспрессии на протяжении эмбрионального периода тестировали с помощью взаимодействия двух факторов, Vegf генотипа и времени, вновь с помощью LIMMA3. Данные по Е12.5 и Е14.5 были собраны, поскольку нас интересовал контрастный временной профиль Е16.5 против Е14.5 и Е12.5. Этот тест проводили на образцах ker+ и il+ по отдельности, поскольку эти две ткани были получены из одних и тех же эмбрионов. Такие модели, как LIMMA обеспечивают произвольный и независимый сбор всех образцов. Коррекция этой зависимости требует более сложной модели, если анализировать ker+ и il+ одновременно. Геномные вариации при единичном взаимодействии типа ткани (образцы ker+ против il+) также обнаруживаются посредством LIMMA анализа. Распределение дифференциальной экспрессии по всему геному определяли с применением МАСТ (инструмента для микроматричного хромосомного анализа).
Результаты/Обсуждение
При рождении необходим обмен О2 и СО2 в легких на большой границе раздела воздухоносных путей и кровеносных сосудов. Эмбриональное развитие легких у мышей подвергается сильному сдвигу при Е (= сутки после зачатия) 16.51. В это время переплетенные воздухоносные пути и сосудистая сеть распускаются путем умножения и усовершенствования их дистальных ветвей. Дистальные воздухоносные пути или респираторные трубки умножаются путем подразделения тонкостенных мешочков перед рождением. Эти мешочки развиваются в итоге в постнатальные альвеолы2. Для тонкостенных воздухоносных путей необходимы плоские клетки для облегчения транспорта газа. Таким образом, фенотипическая дифференцировка в плоские клетки воздухоносных путей, происходящая около Е16.5, является критической фазой эмбрионального развития легких. Эпителиальные клетки, покрывающие воздухоносные пути,
- 21 034088 происходят из разветвленной энтодермы головной кишки. От Е16.5, эпителиальные клетки в дистальных воздухоносных путях начинают уплощаться, в то время как проксимальные клетки сохраняют свою столбчатую форму. Наиболее дистальные из этих клеток будут выстилать мешочки и альвеолы, и развивать плоскую или даже чешуйчатую морфологию на Е18.5. Капилляры выстланы с плоскими эндотелиальными клетками и представляют дистальные кровеносные сосуды сосудистой сети. Эндотелиальные клетки, покрывающие легочные кровеносные сосуды, происходят из мезодермальной мезенхимы. Их рост должен тесно соответствовать росту их эпителиальных аналогов, чтобы обеспечить большую альвеолярно-капиллярную границу раздела, через которую начинается газообмен при рождении. Реципрокное взаимодействие между эпителием воздухоносных путей, произошедшим из энтодермы, и окружающей мезодермальной мезенхимой, начинается в раннем морфогенезе легких3’4. Начиная от Е9.5, Fgf10, продуцируемый мезенхимальными клетками в окружающей мезодерме, является наиболее важным сигналом для разветвления энтодермы. Тесное взаимодействие по меньшей мере с Shh, Bmp, TGF-β, и Wnt факторами передачи сигнала модулирует этот ранний механизм разветвления. Однако, молекулярный механизм, лежащий в основе поздних клеточных фенотипических изменения и эпителиальноэндотелиального взаимодействия при Е16.5 менее изучен.
Для дальнейшего изучения поздней дифференцировки легких после Е12.5, мы разработали основанную на РНК процедуру иммунохимического окрашивания для лазерной захватывающей микродиссекции эпителиальных клеток в развивающихся воздухоносных путях. Мы предположили, что определение профиля экспрессии поздних генов с помощью РНК, выделенной из клеток воздухоносных путей, разделяющих общий эпителиальный антиген в различном эмбриональном возрасте, позволит выяснить их транскрипционные изменения со временем. Эта программа должна по меньшей мере отразить характеристики эпителия, предпочтительно типа воздухоносных путей легких. То же самое предположение проверяли на легочных клетках, маркированных эндотелиальным маркером, универсально экспрессируемым в различном эмбриональном возрасте. Кроме того, мышиную нокаутную модель с поздним аномальным морфогенезом разветвления в легких, включили в данный подход. Мы выбрали Vegf120/120 модель, поскольку периферическая дифференцировка воздухоносных путей и сосудов5,6,7 серьезно повреждается в этих Vegf120/120 нокаутных эмбриональных легких. Эпителиальные и эндотелиальные клетки дикого типа, как ожидалось, экспрессировали набор генов дифференцировки воздухоносных путей и сосудов, не имевшийся у их Vegf120/120 нокаутных аналогов. Vegf120/120 мыши не имели VEGFA изоформ 164 и 188, но экспрессировали изоформу 120. VEGF-A изоформы 164 и 188 (VEGF164 and VEGF188) наиболее тесно связаны с экстрацеллюлярным матриксом, чем более растворимый VEGF120 вариант, и концентрируются локально вокруг дистальных воздухоносных путей. Стандартная точка зрения устанавливает, что легочные эпителиальные клетки секретируют эти VEGF-A изоформы, в то время как VEGF164 и VEGF188 поощряют локальный рост легочных эпителиальных клеток через стимуляцию рецептора тирозин-киназ Flk1 (VEGF рецептор-2) и Flt1 (VEGF рецептор-1). Ограниченная экспансия эндотелиальных клеток совершенствует легочную сосудистую сеть и обеспечивает соответствующий рост эпителиальных клеток8,9. Это эпителиально-эндотелиальное взаимодействие обеспечивает газообмен при рождении путем формирования тесной связи между альвеолами дистальных воздухоносных путей и капиллярами легочной сосудистой сети. Однако, этот тип взаимодействия не может объяснить присутствие VEGF-A в мезенхимальных клетках, окружающих эпителиальные клетки дистальных воздухоносных путей.
Иммунохимическое окрашивание проводили на срезах замороженных тканей из грудных клеток эмбрионов на Е12.5, Е14.5 и Е16.5 (фиг. 2). Геномное распределение эмбрионов показано в табл. S1. Мы выбрали антитела, обеспечивающие достаточную пропускную способность для связывания с эпителиальными или эндотелиальными антигенами в границах эмбрионального периода в нашем исследовании. Анти-цитокератиновые антитела (направленные против цитокератина 4, 5, 6, 8, 10, 13, и 18) были выбраны для маркировки эпителиальных клеток (ker+ клеток), выстилающих воздухоносные пути, поскольку примитивнее и дифференцированные эпителиальные клетки глобально экспрессируют промежуточные филаменты различных кератинов. Эндотелиальные клетки в одном и том же срезе ткани окрашивали изолектин GS-IB4 (Griffonia simplicifolia) Alexa-fluor-594 конъюгатом, который связывается с ранними10 и поздними эндотелиальными клетками11,12 у мышей (il+ клетками). Окрашивание клеток обоими иммуногистохимическими маркерами не наблюдалось в трех моментах времени эмбрионального развития. 300 - 400 ker+ и il+ клеток избирательно изолировали путем лазерной захватывающей микродиссекции. Два цикла линейной мРНК амплификации обеспечили достаточное количество кРНК для гибридизации на матрицах Affymetrix Mouse 430_2.0 Genechips.
Во первых, мы исследовали, отражает ли определение профиля экспрессии генов, регулирующих последующие звенья сигнальных каскадов, дифференцировку с возрастом в зависимости от эпителиального и эндотелиального происхождения. Данные исследовательского, неконтролируемого анализа экспрессии генов установили, что экспрессия генов меняется во время эмбрионального развития с учетом наибольшей вариации (35%) в наборе данных. Эта вариация графически представлена в первом основном компоненте (Х-оси или PC1) спектральной карты13 (фиг. 3). Гены, проявляющие наибольшие изменения экспрессии на протяжении трех стадий эмбрионального развития, находились на краях Х-оси.
- 22 034088
Один из этих генов, сурфактант-ассоциированный белок С (Sftpc), как известно, осуществляет важную физиологическую повышающую регуляцию во время эмбриогенеза, и достаточные количества его белкового продукта необходимы для нормального дыхания при рождении14,15. Второй основной компонент (Y-ось или РС2), объясняющий другие 17% вариации в наборе данных, может быть связан с различиями в экспрессии генов в зависимости от клеточного происхождения. Некоторые из наиболее крайних проб, установленных по РС2 оси, представляют гены, которые, как известно, являются характерными для легочного эпителия или эндотелия. Среди восьми наиболее крайних наборов проб, мы идентифицировали CD 93 антиген (CD93)16 и клаудин 5 (Cldn5)17 в качестве иллюстративных эндотелиальных генов, и на противоположной стороне Y-оси, фактор семейства Forkhead, блок А1 и кератин 8 (Krt8)19 в качестве экспрессируемых эпителиальных генов. Наложение различных образцов на спектральную карту показало их распределение по двум основным компонентам. Группы ker+ и il+ были ясно разделены в соответствии с их клеточным происхождением по РС2 (фиг. 3). Ker+ образцы группировались вместе с генами эпителиального типа, a il+ образцы были собраны вместе с генами эндотелиального типа. Оба вида клеточного происхождения собирались вместе с PC1 в одном и том же эмбриональном возрасте. Это указывало, что общие изменения экспрессии генов развития были подобными для эпителиальных (ker+) и эндотелиальных (il+) клеток. В целом, образцы группировались вместе в зависимости от клеточного происхождения (ker+ против il+ клеток) и эмбрионального возраста, при использовании анализа с неконтролируемыми управляемыми данными. Анализ спектральной карты подчеркивает, что избирательная лазерная захватывающая микродиссекция обеспечивает хорошее разрешение профилей экспрессии генов. Независимый контролируемый одномерный (от гена к гену) анализ влияния тканевого происхождения образцов (ker+ против il+) дополнительно подтвердил, что ker+ и il+ клетки соответствуют на геномном уровне эпителиальным или эндотелиальным клеткам, соответственно (фиг. 1).
Далее, в il+ и ker+ клетках был выявлен транскрипционный профиль, связанный с аномальным морфогенезом разветвления в Vegf120/120 нокаутном фенотипе. Для каждого гена мы анализировали, имеются ли существенные различия профиля экспрессии на протяжении эмбрионального возраста между однопометными мышами Vegf120/120 нокаутного и дикого типа (Vegf+/+). Эти различия в зависимом от возраста профиле экспрессии между Vegf+/+ и Vegf120/120 развертывают геномную карту в трех направлениях. Имеются несколько генов, идентифицированных только при явной повышающей регуляции Vegf+/+ генотипа на протяжении эмбрионального возраста, например, Hmr (фиг. 2). Vegf120/120 генотип ослаблялся при индукции, зависимой от возраста.
Во-первых, причина структурного дефицита в воздухоносных путях Vegf120/120 нокаутных легких становится явной. Клетки дикого типа ker+ экспрессируют избыток 44 эпителиально-специфических генов в Е16.5, по сравнению с их Vegf120/120 нокаутными аналогами. Группа генов комплекса эпидермальной дифференцировки (EDC) преобладаем в профиле экспрессии (фиг. 4). S100a8 и S100a9, изображенные среди этого EDC субнабора, и как известно, являются VEGF-A зависимыми20 хемоаттрактантами. Другие элементы EDC, такие как гены малого пролин-обогащенного участка (Sprr), и поздние компоненты эпидермального рогового конверта, также представлены. Цитоскелетный кератин Krt2-6 совместно экспрессировался с EDC суб-набором в клетках дикого типа ker+ на Е16.5. Ингибиторы сериновыхцистеиновых протеиназ и три гена SCC (гена, кодирующего белок, секретируемый плоскоклеточным эпителием) комплекса, завершали группу генов, подвергающихся повышающей регуляции (фиг. 4).
Исследование взаимодействия между эмбриональным возрастом и генотипом в клетках дикого типа il+ обнаружило выраженную повышающую регуляцию ограниченного набора генов в Е16.5. Этот ответ ведет к приему эпителиально-специфической программы трансформации в клетках дикого типа il+ в Е16.5, по сравнению с Vegf120/120 нокаутными клетками. Как в клетках дикого типа ker+, EDC кластер, SCC кластер, ингибиторы цистеиновых протеиназ и эксклюзивные кератиновые гены явно подвергались повышающей регуляции на протяжении эмбрионального возраста. Riken1110020А10, соответствующий Dsc1 гену, подвергался повышающей регуляции в клетках дикого типа il+ в Е16.5. Далее, Pkp1 (плакофилин 1) отображал идентичный профиль транскрипции в Е16.5 (фиг. 5). Как кажется, высоко логичный режим управляет кластерной повышающей регуляцией этих генов. Кератины и белки промежуточного филамента обеспечивают структурную прочность этих клеток, наиболее типично эпителиальных клеток21. Белки, кодированные EDC и SCC кластером, и ингибиторы сериновых-цистеиновых протеиназ, укрепляют эту кератиновую сеть. Dsc1 (десмоколлин 1) кодирует один из белков, формирующих десмосомы22,23. Промежуточные кератиновые филаменты связаны с межклеточными десмосомами, формирующими клеточное соединение вместе с щелевыми контактами и адгезионными контактами. Белок, кодируемый Pkp1, является основным из позитивных регуляторов содержания десмосомального белка24,25, и сам является компонентом десмосомального комплекса. Pkp1 также связывает промежуточные кератиновые филаменты с кадгериновыми белками в адгезионных контактах. Эти результаты идентифицировали стимуляцию рецептора тирозин-киназы VEGF-A изоформами 164 и 188 в качестве основного переключения в сборке десмосомальной/промежуточной филаментной структуры в легких. Этот механизм добавляет другой строительный блок к цитоскелетной и межклеточной архитектуре наверху Wnt/βкатенин-зависимого адгезионного соединения (Е-кадгерина). Фактически, повышающая регуляция Eps8l1 в E16.5 в клетках дикого типа il+ открывает еще прямую интерференцию с актином, ключевым
- 23 034088 структурным белком, не связанным с системой промежуточных филаментов. Координированная и кластерная экспрессия этих цитоскелетных и десмосомальных генов обеспечивает формирование плоскоклеточной системы в дистальных воздухоносных путях.
Во-вторых, помимо активации генов, кодирующих специфические структурные белки, интригующей находкой оказалась повышающая регуляция Mapkapk3 в клетках дикого типа il+ в Е16.5. Mapkapk3 интегрирует пути передачи ERK и р38 сигналов26 при стрессе и митогенном ответе, таком как при стимуляции VEGF-A эндотелиальных клеток. Cdkn2b (p15ink4b или Ink4b), части Ink4b-ARF-Ink4a локуса супрессии опухоли, одновременно подвергались повышающей регуляции. Надежные данные указывают на супрессию этого локуса связанными репрессорными комплексами группы polycomb (Pcg). Дерепрессия локуса происходит при диссоциации Pcg комплексов путем активации или избыточной экспрессии Mapkapk327. Этот тормозной рычаг в клеточном цикле обеспечивает дифференцировку при пролиферативных стимулах28, и был продемонстрирован здесь вначале in vivo. В сущности, остановка клеточного цикла, обеспечивающая эпителиальную трансформацию il+ клеток, является VEGF164- и VEGF188зависимой в легких. Удивительно, что повышающая регуляция Krt5, Krt14 и Tcfap2c была очень похожа на профиль экспрессии предшественников базальных клеток в эпителии воздухоносных путей29. Фенотип базальных клеток проявляется только при рождении в эпителии воздухоносных путей легких, и обычно связан с изолектином. С другой стороны, экспрессия кластеров генов Krt1, EDC и SCC является программой плоскоклеточной дифференцировки. Белки ANp63 и ТАар63 направляют программу предшественника кератина и программу плоскоклеточной дифференцировки, соответственно. Ген Trp63, кодирующий эти два белка, подвергается повышающей регуляции в клетках дикого типа il+. Как упоминалось, окрашивание клеток антителами к цитокератину (анти-4, 5, 6, 8, 10, 13, и 18) и изолектином GS-IB4 не наблюдалось в исследуемые моменты времени. Отсутствие Krt1 и Krt14 связывания антителами к цитокреатину позволило идентифицировать специфическую программу эпителиальной трансформации клеток дикого типа il+ в Е16.5. Кажется маловероятным, что эпителиальные клетки ker+ генерируют эту эпителиальную транскрипционную программу. Это потребует утраты способности к связыванию антителами к цитокератину, чтобы избежать ker+ маркировки. В то же самое время ker+ клетки должны приобрести исключительное изолектин- GS-IB4 окрашивание. В результате мы предположили, что легочные il+ имеют резервуар клеток, растущих в зрелый эпителий в Е16.5. Другими словами, легочные мезенхимальные il+ клетки охватывают клетки с эндотелиальной и эпителиальной компетенцией.
В третьих, ген, представленный зондом Affymetrix 1437019 at (RIKEN cDNA 2200001I15 ген) и ген, представленный зондом Affymetrix 1437145 s at (RIKEN cDNA 2310002J15 ген), подвергались повышающей регуляции в Е16.5 в эпителиальных клетках дикого типа, окрашенных антителами к цитокератину 4-5-6-8-10-13-18, и клетках дикого типа, связывающих GS-IB4. Мы установили, что эти два гена (не имеющие биологической аннотации) ко-экспрессируются с плоскоклеточной и базально-клеточной транскрипционной программой. Они играют важную роль в продукции и регенерации дифференцированных клеток воздухоносных путей (фиг. 6, фиг. 7, табл. 1, табл. 2). Начиная с самого длинного контига, сконструированного из секвенированных клонов, мы открыли человеческий гомолог транскрипта гена RIKEN cDNA 2200001I15 (фиг. 8) и транскрипта гена RIKEN cDNA 2310002J15 (фиг. 10). Далее, выравнивания белковых последовательностей подтвердили существование человеческого гомологичного белка для соответствующего транслированного белка гена RIKEN cDNA 2200001I15 (фиг. 9) и гена RIKEN cDNA 2310002J15 (фиг. 11). Мы предложили наименование R2R1 для гомологов млекопитающих для гена RIKEN cDNA 2200001I15, транскрипта и белка, и R2R2 для гена RIKEN cDNA 2310002J15, транскрипта и белка, поскольку эти гены и их белковые продукты ответственны за функцию регенерации в респираторной системе.
В-четвертых, мы установили, что VEGF-A экспрессируется в ker+ и il+ клетках, независимо от дикого типа или Vegf120/120 нокаутного статуса. Далее, ген, кодирующий VEGF рецептор 1 (Flk-1 или Kdr), в большом количестве экспрессировался в il+ клетках, но также существенно повышался уже в Е14.5 в ker+ клетках. Этот вид экспрессии VEGF-А и VEGF рецептора меняет классическую точку зрения на то, что мезенхима пассивно ожидает VEGF-A стимул из легочного эпителия. Это по существу подтверждает недавнюю работу, демонстрирующую необходимость эндогенной экспрессии VEGF-A и аутокринной передачи сигналов для выживания эндотелиальных клеток30,31. Из геномного картирования дикого типа против Vegf120/120 нокаутных il+ клеток, также ясно, что il+ cells часто ответственны за отправку стимулов эпителиальной трансформации. Повышающая регуляция Fgfbp1, Lgals7, Lgals3 и Il18 в клетках дикого типа il+ в Е16.5 представляет эти стимулы. Эта повышающая регуляция гена, кодирующего связывающий фактор роста фибробластов белок 1 (Fgfbp1), указывает, что первичное FGFконтролируемое почкование легких также происходит на конечных стадиях легочной дифференцировки. Fgfbpl действует путем концентрирования FGF2, и является тонким модулятором роста и дифференцировки эпителиальных тканей в ответ на FGF стимулы от мезенхимы. Ген рецептора FGF 2 (Fgfr2) был в этом отношении интенсивно экспрессирован в ker+ и il+ компартменте.
В итоге, была проведена избирательная лазерная захватывающая микродиссекция клеток, разделяющих специфический маркер в различном эмбриональном возрасте. Это позволило дифференцировать профили экспрессии генов в отношении эмбрионального возраста, клеточного происхождения и Vegf
- 24 034088 генотипа. Транскрипционная программа, выявленная с помощью этого подхода, подчеркнула важность промежуточных филаментов и десмосомальной сети в доработке легочной архитектуры. Этот механизм добавляет другой строительный блок в цитоскелетную и межклеточную архитектуру наверху Wnt/βкатенин-зависимого адгезионного соединения (Е-кадгерина). Промежуточные филаменты обеспечивают необходимую прочность клеток, подвергающихся сильному воздействию механического и окислительного стресса. Не удивительно, что легочные клетки принимают ту же самую геномную защитную программу, что и клетки кожи, которые подвергаются тем же самым воздействиям. Параллельно усложнению цитоскелета, программа предшественников базальных клеток приобретается il+ клетками позднее в эмбриональной жизни, и является VEGF164-188-зависимой.
Мы продемонстрировали, что понижающая регуляция семейства FAM25 и понижающая регуляция экспрессии гена C9orf169 снижает экспрессию KRT14. Далее, мы знаем, что экспрессия семейства FAM25 (человеческого R2R1 гомолога) и C9orf169 (человеческого R2R2 гомолога) подвергается повышающей регуляции VEGFA/ VEGF165. Как эти гены действуют в VEGFA/ VEGF165 пути? миРНКопосредованный нокдаун R2R гомологов можно применять для исследования специфической роли R2R гомологов в этом пути. Действительно, роль R2R гомологов состоит в модуляции VEGFA/ VEGF165 ответа в клетке. Базальная экспрессия изоформ VEGFA и VEGF165 является высокой в легочном эпителии. Эпителиальные функции и структуры являются гораздо более сложными, чем их эндотелиальные аналоги. Таким образом, типичные VEGFA/ VEGF165 эффекты роста и умножения в эндотелии должны быть более усложненными в эндотелии. Как это реализуется? Экспрессия R2R гомологов ведет к спонтанной модуляции передачи сигналов HTF1A (обеспечивая толерантность к кислороду), и модуляции специфического (PERP) антиапоптотического пути. Это обеспечивает (ре)генерацию прочных эпителиальных клеток (с основным защитным барьером против стресса), без установки неограниченного ростового потенциала. Другими словами, модуляция специфического антиапоптотического пути не позволяет развить общую толерантность к апоптозу. Общая толерантность к апоптозу может привести к опасной ситуации иммортализации клетки -клетка становится раковой клеткой.
Данное исследование пролило свет на некоторые заболевания легких человека. У недоношенных новорожденных позднее эмбриональное развитие легких нарушается при преждевременном рождении ребенка. Недостаточные уровни сурфактантного белка в легочных альвеолах ведут к тяжелому респираторному дистрессу в большой группе недоношенных новорожденных. Инсталляция сурфактанта в легкие новорожденного нацелена на профилактику и лечение дыхательной недостаточности у недоношенных новорожденных. Однако высокий уровень кислорода и стресс из-за напряжения при механической вентиляции ведет к хроническому повреждению легких или бронхолегочной дисплазии (БЛД). Ускорение плоскоклеточной дифференцировки в дистальных воздухоносных путях недоношенных новорожденных может предотвратить это истощающее состояние. Сеть промежуточных филаментов и синхронизированное восполнение пула базальных клеток могут также иметь первостепенное значение в поиске лечения некоторых заболеваний легких у взрослых. Приобретение плоскоклеточного фенотипа с экспрессией некоторых EDC кластеров генов характеризует плоскоклеточную метаплазию в воздухоносных путях взрослых с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Этот механизм защиты от вредоносного стимула, однако, сопровождается потерей регенерирующих базальных клеток32. Напротив, эмбрион следует при развитии программе плоскоклеточной дифференцировки при одновременном построении резервуара базальных клеток с хорошо определенной картой. Эта карта служит в качестве руководства для фармакологического вмешательства в механизм транскрипции для промежуточных филаментов или базальных клеток. Она также указывает на трансформированные il+ клетки как на источник эпителиальных клеток легких.
Функциональные характеристики R2R1 и R2R2
VEGF-A (мышиная изоформа VEGF164 = изоформа VEGF 165) зависимая экспрессия группы генов промежуточных филаментов была подтверждена на мышиных эмбрионах. Экспрессия этих генов промежуточных филаментов ведет к дифференцировке легочных эпителиальных клеток и развитию программы базальных клеток в легочных мезенхимальных клетках.
Далее, VEGF-А (мышиная изоформа VEGF164 = изоформа VEGF 165) зависимая экспрессия генов промежуточных филаментов также была подтверждена первичных эпителиальных клетках взрослых людей. Стимуляция этих клеток VEGF-A изоформой VEGF165 ведет к повышающей регуляции экспрессии гена промежуточных филаментов. Экспрессия гена промежуточных филаментов в этих клетках подвергается понижающей регуляции посредством миРНК, специфических в отношении изоформы VEGF165. В итоге, экспрессия генов промежуточных филаментов служит парадигмой дифференцировки и регенерации воздухоносных путей. R2R1 и R2R2 играют специфическую роль в этой программе экспрессии.
R2R1
Экспрессия R2R1 является VEGF-A (мышиная изоформа VEGF164 = человеческая изоформа VEGF165)-зависимой у мышей. Мезенхимальные клетки легких (клетки с позитивным GS-IB4 окрашиванием) приобретают программу экспрессии генов базальных эпителиальных клеток. Экспрессия R2R1 является необходимой для мезенхимально-эпителиального перехода (МЭП).
Роль R2R1 в МЭП была подтверждена в иной эмбриональной ткани, чем легкие -завершение меж- 25 034088 желудочковой перегородки в сердце совершалось с помощью МЭП. У мышей R2R1 высоко экспрессируется при развитии межжелудочковой перегородки, и является VEGF-A (мышиная изоформа VEGF164 = человеческая изоформа VEGF165)-зависимым. Напротив, экспрессия R2R1 не установлена при развитии выводного тракта правого желудочка: развитие этой структуры, как известно, является МЭПнезависимым (см. фиг. 12).
R2R1 является геном-кандидатом у мыши и человека для мезенхимально-эпителиального перехода экспрессия этого гена преобразует VEGF-A (мышиная изоформа VEGF164 = человеческая изоформа VEGF165)-эффект на МЭП. Обратным процессом для МЭП является ЭМП (эпителиальномезенхимальный переход). ЭМП является важной частью прогрессирования и метастазирования рака. Таким образом, R2R1 может играть важную роль в биологии и терапии рака.
Далее, анализ in silico установил, что белковый продукт R2R1, вероятно, взаимодействует с рибосомой. Помимо научного значения, взаимодействие R2R1 белковой структуры с рибосомой можно применять для разработки лекарств в области биологии рака и МЭП.
R2R2
Было установлено, что R2R2 высоко экспрессируется в первичных легочных эпителиальных клетках взрослого человека. Было установлено, что экспрессия R2R1 in vitro подвергается повышающей регуляции со временем, и является VEGF-A (изоформа VEGF165)-зависимой. Белковый продукт R2R2 является важным для нормальной дифференцировки и поддержки легочного эпителия у взрослых (см. фиг. 13).

Claims (10)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение полинуклеотида, содержащего регенеративный ген для респираторных клеток R2R1 или R2R2 (R2R1/2) либо оба гена, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где гены R2R имеют последовательности, идентичные по меньшей мере на 70% последовательностям, выбранным из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
2. Применение белка, кодируемого геном R2R1/2, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака;
где белок, кодируемый геном R2R, имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12.
3. Применение антисмыслового олигонуклеотида, способного модулировать экспрессию гена R2R1/2, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака, где ген R2R имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные к связыванию с белком, кодируемым геном R2R1/2 и имеющим последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний и (c) рака.
5. Способ диагностики одного или нескольких заболеваний и/или состояний, выбранных из:
(a) сердечных заболеваний и/или состояний;
(b) легочных заболеваний и/или состояний;
(c) рака и (d) предрасположенности к любому из (а)-(с);
где указанный способ включает выявление уровня экспрессии гена R2R1/2 в образце, полученном от исследуемого субъекта, причем выявление аберрантного уровня гена R2R в образце является показателем одного или нескольких указанных выше заболеваний и/или состояний и/или предрасположенности к ним, где ген R2R имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, где аберрантным уровнем является уровень, повышенный или сниженный по сравнению с уровнем экспрессии в образце, полученном от субъекта, не страдающего указанными выше заболеваниями и/или состояниями.
6. Способ по п.5, где выявление уровня экспрессии гена R2R1/2 включает гибридизацию в жестких
- 26 034088 условиях олигонуклеотидного зонда и/или праймера со всей или частью последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
7. Способ тестирования соединения на способность модулировать экспрессию гена R2R1/2, включающий обеспечение контакта гена R2R с тестируемым соединением и детекцию модуляции экспрессии гена R2R, имеющего последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, причем детекция модуляции заключается в определении того, является ли уровень экспрессии гена R2R таким же, меньшим или большим, чем уровень экспрессии, детектированный в отсутствие тестируемого соединения, и если уровень меньше или больше, то тестируемое соединение может быть пригодно в качестве модулятора экспрессии гена R2R, а также пригодно для лечения заболеваний и/или состояний, указанных в п.1.
8. Фармацевтическая композиция, включающая ген R2R, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11, а также фармацевтически пригодный наполнитель, носитель или разбавитель, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, указанных в п.1.
9. Фармацевтическая композиция, включающая белок, кодируемый геном R2R и имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 6, 9 и 12, а также фармацевтически пригодный наполнитель, носитель или разбавитель, для лечения одного или нескольких заболеваний и/или состояний, указанных в п.1.
10. Животная модель для исследования сердечного и/или легочного заболевания, или состояния, или рака, где животную модель получают путем модуляции или нарушения гена R2R, который имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11.
EA201300880A 2011-02-03 2012-02-02 Ген r2r1/2 для лечения и диагностики сердечных и легочных заболеваний или состояний, а также рака EA034088B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11250127 2011-02-03
PCT/IB2012/000177 WO2012127289A1 (en) 2011-02-03 2012-02-02 R2r1/2 in diagnosis and therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300880A1 EA201300880A1 (ru) 2014-02-28
EA034088B1 true EA034088B1 (ru) 2019-12-25

Family

ID=44280642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300880A EA034088B1 (ru) 2011-02-03 2012-02-02 Ген r2r1/2 для лечения и диагностики сердечных и легочных заболеваний или состояний, а также рака

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20140068794A1 (ru)
EP (2) EP3581581A1 (ru)
JP (5) JP2014507943A (ru)
CN (2) CN103649110A (ru)
AU (1) AU2012232830B2 (ru)
CA (1) CA2826490C (ru)
EA (1) EA034088B1 (ru)
ES (1) ES2733369T3 (ru)
PT (1) PT2670769T (ru)
WO (1) WO2012127289A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104756163A (zh) * 2012-11-30 2015-07-01 精工爱普生株式会社 收据发行系统、打印机以及收据发行方法
GB201520258D0 (en) * 2015-11-17 2015-12-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of ciliogenesis
JP6829663B2 (ja) 2017-07-04 2021-02-10 ミネベアミツミ株式会社 アブソリュートエンコーダ
CN112710848B (zh) * 2020-12-17 2022-04-08 温州医科大学慈溪生物医药研究院 Fgf10在制备诊断肺损伤试剂的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067195A2 (en) * 2006-11-17 2008-06-05 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089268A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Gene and cognate protein profiles and methods to determine connective tissue markers in normal and pathologic conditions
US20070072175A1 (en) * 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
US20100144538A1 (en) * 2007-03-08 2010-06-10 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with schizophrenia

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067195A2 (en) * 2006-11-17 2008-06-05 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Geneseq 18 September 2008 (2008-09-18), BELOUCHI A, ET AL: "Human schizophrenia related amino acid sequence SEQ ID:929.", XP002655013 *
DATABASE Geneseq 29 March 2007 (2007-03-29), COOPER M T, ET AL: "DNA fragments of a human Tox gene, 44680.", XP002655017 *
DATABASE Geneseq 5 June 2008 (2008-06-05), BELOUCHI A, ET AL: "Crohn's disease associated polypeptide SEQ ID NO 761.", XP002655012 *
DATABASE UniProt 1 January 2009 (2009-01-01), CORBY N: "SubName: Full=Novel protein;", XP002655018 *
LIN, S. IKEGAMI, M. XU, Y. BOSSERHOFF, A.K. MALKINSON, A.M. SHANNON, J.M.: "Misexpression of MIA disrupts lung morphogenesis and causes neonatal death", DEVELOPMENTAL BIOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 316, no. 2, 15 February 2008 (2008-02-15), AMSTERDAM, NL, pages 441 - 455, XP022576117, ISSN: 0012-1606 *
NG Y-S, ET AL: "Differential expression of VEGF isoforms in mouse during development and in the adult", DEVELOPMENTAL DYNAMICS., WILEY-LISS, INC., NEW YORK, NY., US, vol. 220, no. 2, 1 February 2001 (2001-02-01), US, pages 112 - 121, XP002655177, ISSN: 1058-8388 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017131231A (ja) 2017-08-03
AU2012232830B2 (en) 2017-04-27
JP2021184770A (ja) 2021-12-09
JP2024012525A (ja) 2024-01-30
CN110066867A (zh) 2019-07-30
JP2014507943A (ja) 2014-04-03
US20170198357A1 (en) 2017-07-13
WO2012127289A1 (en) 2012-09-27
CN103649110A (zh) 2014-03-19
EP2670769B1 (en) 2019-03-27
WO2012127289A8 (en) 2012-11-29
AU2012232830A1 (en) 2013-09-05
PT2670769T (pt) 2019-06-28
US10975441B2 (en) 2021-04-13
EP2670769A1 (en) 2013-12-11
US20140068794A1 (en) 2014-03-06
CA2826490C (en) 2020-06-02
CN110066867B (zh) 2024-01-12
JP2019162143A (ja) 2019-09-26
EA201300880A1 (ru) 2014-02-28
CA2826490A1 (en) 2012-09-27
ES2733369T3 (es) 2019-11-28
EP3581581A1 (en) 2019-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024012525A (ja) 診断および治療におけるｒ２ｒ１／２
Gogna et al. Cell competition during growth and regeneration
Hermansand et al. Wnt signaling in cardiac disease
EP2859120A2 (en) Method for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer metastasis
KR102141446B1 (ko) Ｉｇｆｂｐ3 및 이의 용도
CN109680064B (zh) Ythdf2基因在尿路上皮癌诊断、预防和治疗中的应用
Ide et al. Sex differences in resilience to ferroptosis underlie sexual dimorphism in kidney injury and repair
KR102194746B1 (ko) Wnt 억제제와 연관된 마커
Kloska et al. Nrf2 sequesters Keap1 preventing podosome disassembly: a quintessential duet moonlights in endothelium
Simard et al. Alterations in heart looping induced by overexpression of the tight junction protein Claudin-1 are dependent on its C-terminal cytoplasmic tail
Murphy et al. CITED1 expression in liver development and hepatoblastoma
Li et al. p63: a crucial player in epithelial stemness regulation
He et al. Activating NO–sGC crosstalk in the mouse vascular niche promotes vascular integrity and mitigates acute lung injury
Hashimoto et al. Negative impact of recipient SPRED2 deficiency on transplanted lung in a mouse model
Chauhan Genetic and Functional Studies of Hirschsprung Disease
Staniczek Endothelial regulation of liver homeostasis and regeneration
Rana Non-Pyroptotic Gasdermin-B (GSDMB) Regulates Epithelial Restitution and Repair, and is Increased in Inflammatory Bowel Disease
Jones et al. An injury-induced tissue niche shaped by mesenchymal plasticity coordinates the regenerative and disease response in the lung
Cheung Characterization and functional modulation of the cancer stem cell state in colorectal cancer
Zuazo Gaztelu Dual effect of Semaphorin 4D blockade in neuroendocrine tumor malignization: from vessels to macrophages
Hernández Ramírez The role of the aryl hydrocarbon receptor interacting protein (AIP) in pituitary tumorigenesis: A proteomic approach for explaining the clinical behaviour of AIP mutation-associated pituitary adenomas
Tokarew The Role of Norrie Disease Pseudoglioma (Ndp) in Cerebellar Development/Tumorigenesis and Its Relationship with the Sonic Hedgehog Pathway
Zhu et al. THE EFFECTS OF CHROMATIN REMODELING AND PSEUDOKINASE ACTIVITY ON LIVER PATHOPHYSIOLOGY
Merino Azpitarte Role of SOX17 in the regulation of the biliary phenotype and in cholangiocarcinogenesis
Ross Novel Insight Into the Role of Ribosomopathies in Craniofacial Development

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM