EA024077B1 - Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа - Google Patents
Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа Download PDFInfo
- Publication number
- EA024077B1 EA024077B1 EA201200809A EA201200809A EA024077B1 EA 024077 B1 EA024077 B1 EA 024077B1 EA 201200809 A EA201200809 A EA 201200809A EA 201200809 A EA201200809 A EA 201200809A EA 024077 B1 EA024077 B1 EA 024077B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- hiv
- replacement
- pseudo
- enzyme
- seq
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно - к молекулярной биологии, и может быть использовано для скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1. Сущностью изобретения является способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1, включающий добавление исследуемого ингибитора/блокатора репликации ВИЧ-1 к чувствительным клеткам, затем добавление псевдо-ВИЧ-1-частиц к чувствительным клеткам, выявление флуоресценции чувствительных клеток и определение по количеству флуоресцирующих клеток в трансдуцированной популяции эффективности воздействия ингибитора/блокатора репликации ВИЧ-1 на псевдо-ВИЧ-1-частицы. Указанные псевдо-ВИЧ-1-частицы включают белок оболочки G вируса везикулярного стоматита (ВВС), фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1, фермент интегразы ВИЧ-1, структурные белки ВИЧ-1, формирующие белковый каркас вирусной частицы и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), где фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1 и фермент интегразы ВИЧ-1 представляют собой мутантную форму. Для осуществления способа скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 предложен набор, который включает панель псевдо-ВИЧ-1-частиц, включая псевдо-ВИЧ-1-частицы, у которых фермент интегразы и фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1 представляют собой форму дикого типа без лекарственной устойчивости, клетки линий HEK-293, SC-1, Jurkat, CEM-SS и Kasumi-1 и среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина для клеток линий HEK-293 и SC-1, среду RPMI-1640 с добавлением 20% FCS, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина для клеток линий Jurkat, CEM-SS и Kasumi-1; стандартный фосфатный буфер PBS.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно - к молекулярной биологии, и может быть использовано для скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1. Сущностью изобретения является способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1, включающий добавление исследуемого ингибитора/блокатора репликации ВИЧ-1 к чувствительным клеткам, затем добавление псевдо-ВИЧ-1-частиц к чувствительным клеткам, выявление флуоресценции чувствительных клеток и определение по количеству флуоресцирующих клеток в трансдуцированной популяции эффективности воздействия ингибитора/блокатора репликации ВИЧ-1 на псевдо-ВИЧ-1-частицы. Указанные псевдо-ВИЧ-1частицы включают белок оболочки G вируса везикулярного стоматита (ВВС), фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1, фермент интегразы ВИЧ-1, структурные белки ВИЧ-1, формирующие белковый каркас вирусной частицы и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), где фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1 и фермент интегразы ВИЧ-1 представляют собой мутантную форму. Для осуществления способа скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 предложен набор, который включает панель псевдо-ВИЧ-1-частиц, включая псевдо-ВИЧ-1частицы, у которых фермент интегразы и фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1 представляют
собой форму дикого типа без лекарственной устойчивости, клетки линий НЕК-293, SC-1, Jurkat, CEM-SS и Kasumi-1 и среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина для клеток линий НЕК-293 и SC-1, среду RPMI-1640 с добавлением 20% FCS, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина для клеток линий Jurkat, CEM-SS и Kasumi1; стандартный фосфатный буфер PBS.
024077
Изобретение относится к медицине, а именно - к молекулярной биологии, и предназначено для скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1.
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) - возбудитель одного из широко распространенных и наиболее опасных для жизни человека заболеваний - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения, в 2009 году численность ВИЧ-инфицированных в мире составила около 35 млн, из них взрослых - 32 млн, а детей моложе 15 лет 3 млн. Россия занимает одно из первых мест в мире по темпам роста ВИЧ-инфекций.
Исследования природного вируса могут проводиться только в сертифицированных лабораториях и организациях, имеющих необходимые условия, гарантирующие безопасность, и разрешение для работы с инфекционными материалами 3-го класса опасности.
Надо учесть, что при использовании очищенных рекомбинантных ферментов невозможно получить адекватные данные об антиретровирусных свойствах веществ, так как такая система не позволяет определить цитотоксичность этих соединений, эффективность их проникновения в клетку, стабильность и возможные превращения в клетке.
Для проведения скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 были созданы рекомбинантные лентивирусные векторы на основе вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ1 или HIV-1) дикого типа, т.е. их можно рассматривать как псевдо-ВИЧ-1-частицы. Впервые исследования на ВИЧ-1-подобных частицах проводились в 1996 году [1]. Таким образом, такие частицы способны переносить и направлять экспрессию целевых и маркерных генов, но не дают начало новым вирусным частицам. Иными словами, псевдо-ВИЧ-1-частицы являются "вирусами одноразового действия" и не вызывают развития вирусной инфекции, т.е. являются безопасными.
Однако эти псевдо-ВИЧ-1-частицы содержат ферменты (обратную транскриптазу, интегразу и протеазу) ВИЧ-1 дикого типа и не содержат все гены, кодирующие вирусные белки, вместо них такие частицы содержат искусственно сконструированный рекомбинантный РНК-геном, содержащий целевой и маркерный гены. Следовательно, указанные псевдо-ВИЧ-1-частицы невозможно использовать для проведения скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации лекарственно-устойчивых форм ВИЧ-1.
Задачей, которую решает заявленное изобретение, является создание псевдо-ВИЧ-1-частиц и тестнабора для безопасного скрининга антиретровирусных соединений, подавляющих основные этапы репликации ВИЧ-1.
В созданных псевдо-ВИЧ-1-частицах присутствуют вирусные ферменты (обратная транскриптаза, интеграза), сообщающие вирусу лекарственную устойчивость. При этом эти ферменты обеспечивают эффективный перенос и экспрессию маркерного гена в клетках-мишенях, подобно ферментам дикого типа. Так как работа с лекарственно-устойчивым ВИЧ-1, содержащим эти мутантные ферменты, не может проводиться (из соображений биобезопасности) в обычных лабораториях, то предлагаемые псевдоВИЧ-1-частицы являются адекватной и безопасной основой для поиска новых эффективных ингибиторов/блокаторов мутантных ферментов (обратной транскриптазы, интегразы), сообщающих ВИЧ-1 лекарственную устойчивость. В настоящее время уже существующие и постоянно возникающие лекарственноустойчивые формы ВИЧ-1 выявляются у большинства ВИЧ-1-инфицированных пациентов. Поэтому работы с псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими мутантные ферменты, являются системой, позволяющей осуществлять быстрый и безопасный скрининг потенциальных лекарственных препаратов, необходимых для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами ВИЧ-1. Наличие ферментов обратной транскриптазы ВИЧ-1, интегразы ВИЧ-1 обеспечивает возможность синтеза ДНК копии генома ВИЧ-1 и его встраивания в геном клетки-хозяина по тому же механизму, что и у инфекционного ВИЧ-1.
Способ получения плазмид.
Препараты экспрессирующих векторов, несущих мутантные гены обратной транскриптазы ВИЧ-1, были получены с помощью введения точечных мутаций в ген pol, кодирующий обратную транскриптазу, интегразу и протеазу ВИЧ-1 методом сайт-специфического мутагенеза, с использованием набора
"GeneArt® Site-Directed Mutagenesis System" (Invitrogen, США).
Для наработки препаратов плазмидной ДНК использовали метод трансформации компетентных клеток E.coli. Трансформацию клеток E.coli и высев на селективную среду осуществляли согласно стандартному протоколу. Выделение чистой плазмидной ДНК в больших количествах осуществляли с использованием набора колонок и реактивов фирмы Qiagen (Plasmid extraction kit) по методике производителя.
Чистота полученных препаратов плазмидной ДНК была подтверждена электрофорезом в агарозе.
Концентрация исследуемого образца и степень загрязненности белковыми и низкомолекулярными органическими соединениями были определены с помощью спектрофотометра Nano Drop.
Таким образом, были получены следующие плазмиды.
Плазмида, содержащая мутацию гена pol в кодоне AAA в положении 499 (замена на AAT). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутацией K103N.
Плазмида, содержащая мутацию гена pol в кодоне GTA в положении 508 (замена GCA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутацией У106А.
- 1 024077
Плазмида, содержащая мутацию гена pol в кодоне ТАТ в положении 733 (замена на TGT). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутацией Y181C.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне AAA в положении 499 (замена на AAT) и в кодоне ТАТ в положении 733 (замена на TGT). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутациями K103N и Y181C.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне GAC в положении 391 (замена на ААС) и в кодоне AAA в положении 400 (замена на AGA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутациями D67N и K70R.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне GAC в положении 391 (замена на ААС), в кодоне AAA в положении 400 (замена на AGA), в кодоне АСС в положении 835 (замена на ТТС) и в кодоне AAA в положении 847 (замена на CAA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутациями D67N, K70R, T215F и K219Q.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне АСС в положении 835 гена pol (замена на ТТС) и в кодоне AAA в положении 847 (замена на CAA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента обратной транскриптазы с мутациями T215F и K219Q.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента интегразы с мутацией Q148K.
Плазмида, содержащая мутацию гена pol в кодоне AAT в положении 2335 (замена на CAT). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента интегразы с мутацией N155H.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA) и в кодоне GGC в положении 2290 (замена на AGC). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента интегразы с мутациями Q148K и G140S.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA) и в кодоне GAA в положении 2284 (замена на AAA). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента интегразы с мутацией Q148K и Е138К.
Плазмида, содержащая мутации гена pol в кодоне AAT в положении 2335 гена pol (замена на CAT) и в кодоне GAG в положении в 2146 гена pol (замена на AAG). Ген pol с этой мутацией направляет синтез фермента интегразы с мутацией N155H и Е92К.
Сборку псевдо-ВИЧ-1-частиц осуществляют в упаковывающих клетках. В качестве упаковывающих клеток, в которых происходит сборка псевдо-ВИЧ-1-частиц, используются клетки HEK-293, которые за 12-14 ч до начала трансфекции высевают на чашки Петри диаметром 100 мм в количестве 3,0-3,5х106 клеток на чашку. ДНК плазмид, кодирующие вирусные структурные и регуляторные белки и ферменты, и вектор, содержащий маркерный ген (в качестве маркерного гена был использован ген усиленного зеленого флуоресцентного белка), вводят в клетки HEK-293 стандартным методом Ca-фосфатной трансфекции согласно протоколу [2]. Непосредственно перед трансфекцией культуральную среду DMEM заменяют на аналогичную, содержащую 25 мкМ хлороквина. Спустя 12 ч после осуществления трансфекции среду заменяют на DMEM с 20 мМ HEPES. Первый сбор псевдо-ВИЧ-1-частиц осуществляют через 24 ч после трансфекции. Последующие три сбора псевдо-ВИЧ-1-частиц осуществляют с интервалом 10-14 ч. Собранную среду, содержащую псевдо-ВИЧ-1-частицы, фильтруют через фильтр Millipore Millex GP с диаметром пор 0,22 мкм, аликвотируют по 1 мл и хранят при -70°С. При таком хранении псевдо-ВИЧ-1-частицы сохраняют способность переносить маркерные гены в клеткимишени без потери эффективности как минимум 8-12 месяцев.
Таким образом, были получены следующие всевдо-ВИЧ-1-частицы, которые включают белок оболочки G вируса везикулярного стоматита (ВВС), обратную транскриптазу ВИЧ-1, интегразу ВИЧ-1, структурные белки ВИЧ-1, формирующие белковый каркас вирусной частицы и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP).
При этом в зависимости от того, с какой мутацией гена pol были использованы плазмиды для сборки псевдо-ВИЧ-1-частиц, получили псевдо-ВИЧ-1-частицы, содержащие одну из следующих мутантных форм следующих ферментов.
Мутантные формы фермента обратной транскриптазы, обладающие лекарственной устойчивостью к нуклеозидным ингибиторам фермента обратной транскриптазы ВИЧ-1:
D67N, K70R (замена аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 67, замена лизина на аргинин в положении 70) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPQMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLrEAVQKITTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:1)
- 2 024077
D67N, K70R, T215F, K219Q (замена аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 67, замена лизина на аргинин в положении 70, замена треонина на фенилаланин в положении 215, замена лизина на
глутамин в положении 219) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA
IKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR
KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQOWKGSPAIFQSSMTKJLEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS
DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLFTPDQKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTV
NDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYY
DPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIW
GKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID
N0:2)
T215F, K219Q (замена треонина на фенилаланин в положении 215, замена лизина на глутамин в положении 219) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLFTPDQKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTV NDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYY DPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIW GKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:3)
Мутантные формы фермента обратной транскриптазы, обладающие лекарственной устойчивостью к ненуклеозидным ингибиторам фермента обратной транскриптазы ВИЧ-1:
K103N (замена лизина на аспарагин в положении 103) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKD
STKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKNKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAF
TIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWK0SPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIV1YQYMDDLYVGSDLEIGQ
HRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKL
VGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLI
AEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGIiTPKFK
LPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:4)
V106A (замена валина на аланин в положении 106) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKD
STKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSATVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAF
TIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQ
HRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKL
VGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLI
AEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFK
LPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:5)
Y181C (замена тирозина на цистеин в положении 181) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVI£QYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPG1KVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:6)
- 3 024077
K103N, Y181C (замена лизина на аспарагин в положении 103, замена тирозина на цистеин в положении 181) следующей структуры:
PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISK1GPENPYNTPVFA IKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKNKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVICQYMDDLYVGS DLEIGQHRTK.IEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSK.DLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWET'WWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ГО N0:7)
Мутантные формы фермента интегразы, обладающие лекарственной устойчивостью к ингибиторам фермента интегразы ВИЧ-1:
Q148K (замена глутамина на лизин в положении 148) следующей структуры:
FLDG1DKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGIKQEFGIPYNPQSKGVVESMNKELKKnGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKWPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:8)
N155H (замена аспарагина на гистидин в положении 155) следующей структуры:
FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP
GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVK'nHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGKQEFG1PYNPQSQGVVESMHKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAVV1 QDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:9)
Q148K, G140S (замена глутамина на лизин в положении 148, замена глицина на серин в положении
140) следующей структуры:
FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGIKQEFSIPYNPQSKGVVESMNKELKKEGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAWI QDNSDIKWPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:10)
Q148K, Е138К (замена глутамина на лизин в положении 148, замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 138) следующей структуры
FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP
GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG
ATVRAACWWAGIKQKFGIPYNPQSKGWESMNKELK.KIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK
RKGGIGGYSAGERlVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAWI
QDNSDIKWPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:11)
N155H, E92K (замена в 155 положении аспарагина на гистидин, замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 92) следующей структуры:
FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAKTGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFT GATVRAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVVESMHKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNF KRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAW IQDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ГО N0:12)
Полученные псевдо-ВИЧ-1-частицы были применены для скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1.
Для скрининга ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 был получен набор, включающий панель описанных выше псевдо-ВИЧ-1-частиц, клетки линий HEK-293 (клетки эмбриональной почки человека), SC-1 (эмбриональные фибробласты мыши), Jurkat (T-лифобластный лейкоз человека). CEM-SS (Т-лимфобластный лейкоз человека) и Kasumi-1 (острый миелоидный лейкоз человека) и среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Fetal calf Serum, FCS), 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина для клеток линий HEK-293 и SC-1, среду RPMI-1640 с добавлением 20% FCS, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл
- 4 024077
стрептомицина для клеток линий Jurkat, CEM-SS и Kasumi-1; стандартный фосфатный буфер PBS.
Скрининг потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 осуществляют следующим образом.
Предварительно чувствительные клетки высевают на 24-луночные культуральные планшеты в количестве 4х104. Через 24 ч к клеткам добавляют раствор анализируемых соединений в воде и через 2-8 ч (в зависимости от ингибитора и его скорости проникновения в клетку) трансдуцируют ПВЧ. Для повышения эффективности трансдукции культуральные планшеты центрифугируют в течение 1 ч при 1000g, 20°C. Относительный уровень трансдукции определяют методом проточной цитофлуориметрии на приборе Epics 4XL Beckman Coulter (США) через 48 ч после трансдукции.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутацию в кодоне AAA в положении 499, соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутацией K103N.
Фиг. 2. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутацию в кодоне GTA в положении 508 (замена GCA), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутацией У106А.
Фиг. 3. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутацию в кодоне ТАТ в положении 733 (замена на TGT), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутацией Y181C.
Фиг. 4. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне AAA в положении 499 (замена на AAT) и в кодоне ТАТ в положении 733 (замена на TGT), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутациями K103N u Y181C.
Фиг. 5. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне GAC в положении 391 (замена на ААС) и в кодоне AAA в положении 400 (замена на AGA), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутациями D67N и K70R.
Фиг. 6. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне GAC в положении 391 (замена на ААС), в кодоне AAA в положении 400 (замена на AGA), в кодоне АСС в положении 835 (замена на ТТС) и в кодоне AAA в положении 847 (замена на CAA), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутациями D67N, K70R, T215F u K219Q.
Фиг. 7. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне ACC в положении 835 гена pol (замена на ТТС) и в кодоне AAA в положении 847 (замена на CAA), соответствующая мутантной форме обратной транскриптазы с мутациями T215Fu K219Q.
Фиг. 8. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутацию в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA), соответствующая мутантной форме интегразы с мутацией Q148K.
Фиг. 9. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутацию в кодоне AAT в положении 2335 (замена на CAT), соответствующая мутантной форме интегразы с мутацией N155H.
Фиг. 10. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA) и в кодоне GGC в положении 2290 (замена на AGC), соответствующая мутантной форме интегразы с мутациями Q148K и G140S.
Фиг. 11. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне CAA в положении 2314 (замена на AAA) и в кодоне GAA в положении 2284 (замена на AAA), соответствующая мутантной форме интегразы с мутацией Q148K u E138K.
Фиг. 12. Последовательность ДНК гена pol ВИЧ-1, содержащая мутации в кодоне AAT в положении 2335 гена pol (замена на CAT) и в кодоне GAG в положении в 2146 гена pol (замена на AAG), соответствующая мутантной форме интегразы с мутацией N155H u E92K.
Фиг. 13. График, на котором показано действие невирапина на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, лекарственно-устойчивые к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Фиг. 14. График, на котором показано действие невирапина на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, лекарственно-устойчивые к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Фиг. 15. График, на котором показано действие эфавиренца на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, лекарственно-устойчивые к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Фиг. 16. График, на котором показано действие АЗТ на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа или ее мутантные формы, лекарственно-устойчивые к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Фиг. 17. График, на котором показано действие ЗТС на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа или ее мутантные формы, лекарственно-устойчивые к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Фиг. 18. График, на котором показано действие ралтегравира на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat под действием ПВЧ, содержащих интегразу дикого типа или ее мутантные формы, лекарственно-устойчивые к ингибиторам интегразы ВИЧ-1.
Приведенные далее примеры иллюстрируют данное изобретение без его ограничения только этими примерами.
- 5 024077
Пример 1. Оценка антиретровирусной активности невирапина.
Наиболее широко используемым ненуклеозидным ингибитором ОТ ВИЧ-1 является невирапин. Утвержденное в качестве лекарственного средства в 1996 г. это анти-ВИЧ-1 соединение способно подавлять развитие ВИЧ-1-инфекции в клетках, зараженных природным вирусом, в концентрации 10-8-10-7 М.
Невирапин был использован против ПВЧ, содержащих ОТ дикого типа или мутантные формы ОТ, несущие как мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1, к которым относится невирапин (фиг. 13), так и мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1, для проверки специфичности мутаций ОТ ВИЧ-1 (фиг. 14).
Как показано на фиг. 13, невирапин проявляет анти-ВИЧ-1 активность только в отношении контрольных ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, но совершенно не эффективен против ПВЧ, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Как показано на фиг. 14, невирапин проявляет одинаковую анти-ВИЧ-1 активность в отношении как контрольных ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, так и ПВЧ, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
Проведенная серия экспериментов показывает, что невирапин эффективно подавляет перенос гена зеленого флуоресцентного белка в клетки-мишени, в случае трансдукции клеток ПВЧ, в состав которых входит ОТ дикого типа. ПВЧ, содержащие ОТ, несущую мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1, были устойчивы к действию ненуклеозидного ингибитора ОТ ВИЧ-1 невирапина. В то же время, ПВЧ, содержащие ОТ, несущую мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1, не обладали лекарственной устойчивостью к ненуклеозидному ингибитору ОТ ВИЧ-1 невирапину.
Пример 2. Оценка антиретровирусной активности эфавиренца.
Эфавиренц также относится к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1, это более новый препарат, чем невирапин. Эфавиренц был использован против ПВЧ, содержащих ОТ дикого типа или мутантные формы ОТ, несущие мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1 (фиг. 15).
Как показано на фиг. 15, эфавиренц проявляет анти-ВИЧ-1 активность как в отношении ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, так и в отношении ПВЧ, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1. Однако, в случае ОТ дикого типа, эфавиренц эффективен в более низких концентрациях. Это соответствует известным данным, препарат в клинических условиях демонстрирует устойчивую эффективность и против мутантных форм ВИЧ-1.
Пример 3. Оценка антиретровирусной активности азидотимидина.
Первое и наиболее известное анти-ВИЧ-1-соединение - 3'-азидо-3'-дезокситимидин (Зидовудин, АЗТ), в наномолярных концентрациях способно ингибировать репликацию вируса дикого типа. В настоящее время азидотимидин используется редко, поскольку он неэффективен против лекарственноустойчивых форм ВИЧ-1.
Азидотимидин был использован против ПВЧ, содержащих мутантные формы ОТ, несущие мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ1, к которым относится азидотимидин (фиг. 16).
Как показано на фиг. 16, азидотимидин проявляет анти-ВИЧ-1 активность только в отношении ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, но малоэффективен против ПВЧ, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1. Сравнение противовирусной активности АЗТ в отношении ПВЧ с мутантными формами ОТ показало, что препарат гораздо слабее влиял на эффективность трансдукции мутантными частицами, причем падение ингибирующего эффекта коррелировало с увеличением числа мутаций.
Пример 4. Оценка антиретровирусной активности ЗТС.
2',3'-Дидезокси-3'-тиоцитидин (ЗТС), как и АЗТ, представляет собой нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ-1.
ЗТС был использован при испытаниях ПВЧ, содержащих мутантные формы ОТ, несущие мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1 (фиг. 17).
Как показано на фиг. 17, ЗТС проявляет анти-ВИЧ-1 активность только в отношении ПВЧ, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, и значительно менее эффективен против ПВЧ, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ ВИЧ-1.
- 6 024077
Пример 5. Оценка антиретровирусной активности ралтегравира.
Ралтегравир - первый из ингибиторов интегразы, ставший лекарственным препаратом, он был разрешен к применению в клинической практике с октября 2007 г. Несмотря на его недолгое использование в качестве лекарственного препарата, к настоящему времени уже распространены лекарственноустойчивые формы ВИЧ-1, против которых ралтегравир не эффективен.
Ралтегравир был использован при испытаниях ПВЧ, содержащих мутантные формы интегразы, несущие мутации, сообщающие лекарственную устойчивость к ингибиторам интегразы ВИЧ-1 (фиг. 18).
Как показано на фиг. 18, ралтегравир проявляет анти-ВИЧ-1 активность только в отношении контрольных ПВЧ, содержащих интегразу дикого типа, но малоэффективен или совершенно не эффективен против ПВЧ, содержащих интегразу с мутациями, сообщающими лекарственную устойчивость к ингибиторам интегразы ВИЧ-1.
В работе использовали культуральную среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки
крупного рогатого скота (Fetal Calf Serum, FCS), 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина; культуральную среду RPMI-1640 с добавлением 20% FCS, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина; 1 М буфер HEPES; стандартный раствор трипсин-ЭДТА, содержащий 0,12% трипсина и 0,02% ЭДТА; 25 мМ хлороквин; набор для проведения Ca-фосфатной трансфекции Promega ProFection; фосфатный буфер PBS; диметилсульфоксид (DMSO); растворы ингибиторов в воде или в DMSO.
Список литературы
1. Luigi Naldini, Ulrike Blomer, Philippe Gallay, Daniel Ory.Richard Mulligan, Fred H. Gage, Inder M. Verma, Didier Trono. 1996. In Vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Nondividing Cells by a Lentiviral Vector. SCIENCE. Vol. 272, 263-267.
2. www.LentiGO-Vectors.de.
3. M.M. Прокофьева, П.В. Спирин, Д.В. Январев, А.В. Иванов, М.С. Новиков, О.А. Степанов, М.Б. Готтих, С.Н. Кочетков, В. Fehse, С. Stocking, В.С. Прасолов. 2011. Скрининг потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 с помощью безопасной лентивирусной системы in vitro. Acta naturae. Т. 3, № 4(11), 61-71
Claims (6)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Псевдо-ВИЧ-1-частица, включающая белок оболочки G вируса везикулярного стоматита (ВВС), фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1, фермент интегразы ВИЧ-1, структурные белки ВИЧ-1, формирующие белковый каркас вирусной частицы и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), где фермент обратной транскриптазы ВИЧ-1 и фермент интегразы ВИЧ-1 представляют собой мутантную форму.
- 2. Псевдо-ВИЧ-1-частица по п.1, в которой мутантная форма фермента обратной транскриптазы обладает лекарственной устойчивостью к нуклеозидным ингибиторам фермента обратной транскриптазы ВИЧ-1 и имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей:D67N, K70R (замена аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 67, замена лизина на аргинин в положении 70) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWK.GSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSKDLIAE1QKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:1)D67N, K70R, T215F, K219Q (замена аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 67, замена лизина на аргинин в положении 70, замена треонина на фенилаланин в положении 215, замена лизина на глутамин в положении 219) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLFTPDQKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:2)T215F, K219Q (замена треонина на фенилаланин в положении 215, замена лизина на глутамин в положении 219) следующей структуры:- 7 024077PISPIETVPVKEKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLFTPDQKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTV NDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYY DPSKBLIAEIQKQGQGQWTYQ1YQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIW GK.TPRFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPI,VKLWYQLEKEPIVCAETF (SEQ ID N0:3)
- 3. Псевдо-ВИЧ-1-частица по п.1, в которой мутантная форма фермента обратной транскриптазы обладает лекарственной устойчивостью к ненуклеозидным ингибиторам фермента обратной транскриптазы ВИЧ-1 и имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей:K103N (замена лизина на аспарагин в положении 103) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALWICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKNKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPF.WEFVNTPPLVKLWYQLF.KEPIVGAETF (SEQ IDN0:4)V106A (замена валина на аланин в положении 106) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSATVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTK1LEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSKDLIAEIQKQGQGQWTYQ1YQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQK1TTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETF (SEQ ID N0:5)Y181C (замена тирозина на цистеин в положении 181) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVICQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHINDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWF-FVNTPPLVKLWYQLEKEPrVGAETF (SEQ IDN0:6)K103N, Y181C (замена лизина на аспарагин в положении 103, замена тирозина на цистеин в положенин 181) следующей структуры:PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFA IKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKIQSKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFR KYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVICQYMDDLYVGS DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPrVLPEKDSWTVN DIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYD PSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTOKYARMRGAHTNDVK.QLTEAVQKITTESIVIWG KTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEREPIVGAETF (SEQ ID N0:7)
- 4. Псевдо-ВИЧ-1-частица по п.1, в которой мутантная форма фермента интегразы обладает лекарственной устойчивостью к ингибиторам фермента интегразы ВИЧ-1 и имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей:Q148K (замена глутамина на лизин в положении 148) следующей структуры:- 8 024077FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKV1LVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGIKQEFGIPYNPQSKGWESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERIVDHATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:8)N155H (замена аспарагина на гистидин в положении 155) следующей структуры:FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGWESMHKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:9)Q148K, G140S (замена глутамина на лизин в положении 148, замена глицина на серин в положении140) следующей структуры:FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGKQEFSIPYNPQSKGWESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERrVDnATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAWI QDNSDIKWPRRKAK1IRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:10)Q148K, Е138К (замена глутамина на лизин в положении 148, замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 138) следующей структуры:FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPWAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTG ATVRAACWWAGIKQKFGIPYNPQSKGWESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFK RKGGIGGYSAGERTVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKVVPRRKAKI[RDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID NO: 11)N155H, Е92K (замена аспарагина на гистидин в положении 155, замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 92) следующей структуры:FLDGIDKAQDEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSP GIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAKTGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFT GATVRAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVVESMHKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNF KRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRNPLWKGPAKLLWKGEGAW IQDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED (SEQ ID N0:12)
- 5. Плазмида, направляющая в упаковывающих клетках сборку псевдо-ВИЧ-1-частицы по пп.1-4, в состав которой входят гены gag ВИЧ-1 и pol ВИЧ-1, содержащая один из вариантов мутации гена pol, придающих ВИЧ-1 лекарственную устойчивость.
- 6. Плазмида по п.5, содержащая мутацию гена pol в кодоне AAA в положении 499, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201200809A EA024077B1 (ru) | 2012-06-27 | 2012-06-27 | Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201200809A EA024077B1 (ru) | 2012-06-27 | 2012-06-27 | Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201200809A1 EA201200809A1 (ru) | 2014-07-30 |
| EA024077B1 true EA024077B1 (ru) | 2016-08-31 |
Family
ID=51226734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201200809A EA024077B1 (ru) | 2012-06-27 | 2012-06-27 | Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA024077B1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1923468A1 (en) * | 2006-11-16 | 2008-05-21 | Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Präsidenten des Paul-Ehrlich-Instituts Prof. Dr. Johannes Löwer | Lentiviral vectors for gene transfer in quiescent (G0) cells |
| EP2047861A1 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-15 | Institut Pasteur | Lentiviral gene transfer vectors suitable for iterative administration and their medicinal applications |
| US20100189690A1 (en) * | 2006-09-27 | 2010-07-29 | Bundesrepublik Deutschland, Letztvertreten Durch D En Prasidenten Des Paul-Ehrich-Instituts | Pseudotyping of retroviral vectors, methods for production and use thereof for targeted gene transfer and high throughput screening |
-
2012
- 2012-06-27 EA EA201200809A patent/EA024077B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100189690A1 (en) * | 2006-09-27 | 2010-07-29 | Bundesrepublik Deutschland, Letztvertreten Durch D En Prasidenten Des Paul-Ehrich-Instituts | Pseudotyping of retroviral vectors, methods for production and use thereof for targeted gene transfer and high throughput screening |
| EP1923468A1 (en) * | 2006-11-16 | 2008-05-21 | Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Präsidenten des Paul-Ehrlich-Instituts Prof. Dr. Johannes Löwer | Lentiviral vectors for gene transfer in quiescent (G0) cells |
| EP2047861A1 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-15 | Institut Pasteur | Lentiviral gene transfer vectors suitable for iterative administration and their medicinal applications |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NALDINI, L. et al. "In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector". Science, 1996 Apr 12; 272(5259), p. 263-267 (реферат) [ он-лайн ] [найдено 12.02.2014]. Найдено из PubMed, PMID: 8602510 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201200809A1 (ru) | 2014-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Nef proteins from simian immunodeficiency viruses are tetherin antagonists | |
| Hill et al. | The packaging and maturation of the HIV-1 Pol proteins | |
| US20190367924A1 (en) | Gene editing therapy for hiv infection via dual targeting of hiv genome and ccr5 | |
| Postler et al. | The cytoplasmic domain of the HIV-1 glycoprotein gp41 induces NF-κB activation through TGF-β-activated kinase 1 | |
| Jiang et al. | The interdomain linker region of HIV-1 capsid protein is a critical determinant of proper core assembly and stability | |
| KR20200083550A (ko) | ACE-tRNA에 의한 유전자 재지정을 통해 정지 코돈을 구조하는 방법 | |
| Antzin-Anduetza et al. | Increasing the CpG dinucleotide abundance in the HIV-1 genomic RNA inhibits viral replication | |
| Radetskyy et al. | ADAR1 and PKR, interferon stimulated genes with clashing effects on HIV-1 replication | |
| Strebel | HIV accessory genes Vif and Vpu | |
| Lassen et al. | Identification of Two APOBEC3F Splice Variants Displaying HIV-1 Antiviral Activity and Contrasting Sensitivity to Vif*[S] | |
| Nishizawa et al. | A carboxy-terminally truncated form of the Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 retards cell proliferation independently of G2 arrest of the cell cycle | |
| Mansky et al. | Interaction of human immunodeficiency virus type 1 Vpr with the HHR23A DNA repair protein does not correlate with multiple biological functions of Vpr | |
| EA024077B1 (ru) | Способ скрининга ингибиторов/блокаторов репликации вич-1, псевдо-вич-1-частицы и набор для осуществления способа | |
| Zotova et al. | HIV restriction factors and their ambiguous role during infection | |
| Baier-Bitterlich et al. | Structure and function of HIV-1 and SIV Tat proteins based on carboxy-terminal truncations, chimeric Tat constructs, and NMR modeling | |
| Kim | HIV-1 Evasion of Human TRIM5α via Cyclophilin A | |
| Evans | HIV-1 Viral Infectivity Factor Recruitment of Cellular Protein Complexes to Counter Host Antiviral Response | |
| Kmieć | The role of Vpu-mediated tetherin antagonism in HIV-1 fitness | |
| Yamaguchi et al. | Human immunodeficiency virus type 1 Vpr modifies cell proliferation via multiple pathways | |
| Gawanbacht-Ramhormose | Identification of potential HIV restriction factors by combining evolutionary signatures with functional analyses | |
| Güney | Innate Immune Sensing of HIV-1 RNA in Human Myeloid Cells | |
| Cenker | Differential HIV-1 Susceptibility of Primary Macrophage Populations | |
| Dai | SERINC5: Its Sensitivity to Nef and Restriction of HIV-1 | |
| Davis | Let us know how access to this document benefits you. | |
| Song | Characterisation of a novel member of the Trim family as a novel pantropic viral inhibitor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |