EA023080B1 - Способ получения ингаляционной липосомальной формы рифабутина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтике, а именно к получению липосом, содержащих антибиотик рифабутин, для ингаляционного введения при лечении туберкулеза. Способ включает создание композиции фосфолипидов и рифабутина, высушивание смеси, её эмульгирование в водной среде, диспергирование эмульсии, гомогенизацию, дробное добавление криопротектора, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание. Способ позволяет достигнуть стандартности и стабильности содержащих рифабутин липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), высокой инкапсуляции рифабутина в липосомы, стабильности рифабутина в процессе хранения и снижении токсического действия липосомального рифабутина (в частности, более чем в три раза по сравнению с нелипосомальным аналогом).

Description

Изобретение относится к фармацевтике, а именно к получению липосом, содержащих антибиотик рифабутин, для ингаляционного введения при лечении туберкулеза.

Туберкулез (ТБ) - инфекционное заболевание с высоким уровнем смертности (10%), от которого умирает ежегодно более миллиона человек. В настоящее время наиболее распространен туберкулез легких, т.к. заражение человека туберкулезом происходит в большинстве случаев (в 95%) через дыхательные пути. Для лечения туберкулеза разработана схема терапии, согласно которой лечение проводят длительно в течение 4-6 мес., в сочетании приема (внутривенным введением и пероральным путем) нескольких препаратов первого ряда, в том числе рифампицином (РМ) или его производным рифабутином. Эффективность лечения больных ТБ может быть увеличена при использовании наиболее короткого пути попадания антибиотики в очаг поражения - легкие при ингаляционном введении.

Рифабутин (РБ) или 4-дезоксо-3,4-[2-спиро-И-изобутил-4-пиперидил] 2,5-дигидро-1Н-имидазол]рифамицин δ (С₄₆Н₆₂Ы₄О₁₁)-полусинтетический антибиотик рифамицинового ряда, гидрофобное соединение, плохо растворимое в воде (растворимость равна 0,19 мг/мл) со следующей химической формулой:

О

Длительное применение рифабутина в виде капсул или инъекций оказывает выраженные побочные эффекты (тошнота, рвота, нарушение функции печени). Разработка новой лекарственной формы препарата, обеспечивающей повышенную растворимость рифабутина в воде, и направленное введение в легкие снизит его гепатотоксичность.

В следующих источниках описаны липосомальные композиции на основе рифабутина.

В частности, известна работа Шакиной Ю.Н., Вострикова В.В., Сорокоумовой Г.М., Селищевой А.А., Швеца В.И. Зависимость свойств рифабутина и его включения в липосомы от рН среды // Антибиотики и химиотерапия, 2005, т. 50, № 7, стр. 3-7, в которой проведено систематическое изучение физико-химических свойств рифабутина и показано, что включение РБ в липосомы является максимальным в кислой среде. В данной работе не приводятся значения эффективности включения рифабутина в липосомы, а рассчитывается связывание его с липосомальным фосфатидилхолином.

Известен патент КИ 2420287 Способ получения капсулированной формы противотуберкулезных препаратов рифамицинового ряда (опубликован 10.06.2011). Авторы для получения липосом использовали смесь липидов следующего состава: гликосфинголипиды 60%; фосфолипиды - 37% холестерин и триацилглицериды - 3%. Липосомы получали путем наслаивания порошка смеси липидов на поверхность водного раствора антибиотика с последующим диспергированием при слабом перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течении 30 мин. Эффективность включения РБ в липосомы составляла 33%. В работе не определялась стабильность данного препарата при хранении и не предлагался путь их дальнейшего введения в организм при лечении.

Известна работа Сакраг М.М., Сги/ А., Реийа А.Р.,Кеутао 1., 8ои§а А.С., Е1еи1егю С.У., Иоттдиек δ.Α., Ргада А.С., Ьоидайо Р.А., Сги/ М.Е.М., Ребгока 1. КйаЪийи еиеаркиШеб ίη Прокотек ехИЪПк ίηсгеакеб ШегареиПс асЛуйу ίη а тобе1 оГ ШккеттаЮб ШЪегсШоык // 1йетаПопа1 1оита1 оГ АпПт1егоЫа1 АдеШк, 2008, 31, рр. 37-45. Авторами работы была создана и изучена ίη νί\Ό модель диссеминированного туберкулеза на мышах, органами-мишенями которого являются в основном печень, селезенка и легкие. Популяция мышей была инфицирована 5х10⁴ КОЕ штамма М. 1иЪегси1ок1к Η37Κν. Были приготовлены и охарактеризованы липосомальные препараты с РБ, различающиеся липидным составом. Получали и исследовали действие РБ в составе липосом из фосфатидилхолина и фосфатидилглицерина (ФХ:ФГ), димиристоилфосфатидилхолина и димиристоилфосфатидилглицерина (ДМФХ:ДМФГ), дипальмитоилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилглицерина (ДПФХ:ДПФГ) и пегелированного дипальмитоифосфатидилхолина (ДПФХ:ПЭГ).

Сравнительный анализ профилей распределения свободного РБ и различных липосомальных препаратов в организме мышей при внутривенном введении показал, что главными органами-мишенями липосом являются печень, легкие и особенно селезенка. Оказалось, что наиболее эффективную доставку препарата в ткани-мишени обеспечивали липосомы с РБ состава ДПФХ:ДПФГ. Оказалось, что в рассмотренной модели лечения диссеминированного туберкулеза липосомальным РБ большее снижение бактериальной нагрузки наблюдалось в селезенке и печени, а не в легких. Было показано, что для лече- 1 023080 ния легочного туберкулеза внутривенный путь введения липосомального препарата не имеет больших преимуществ перед свободным РБ.

По мнению авторов, в качестве наиболее близкого аналога данного изобретения возможно рассматривать исследования, описанные в работе Сакраг ММ, Νονα 8, Ройаек Р, Рейгана Τ δίίνα МТ, Сти/ МЕ Тйегареийс еГПсасу оГ Йро8ота1 йГаЪийи ίη а МусоЪасЮгшт гтит тойе1 оГ 1иГесйои. // Аийт1сгоЪ Аден® Сйето1йег. 2000 8ер;44(9):24,) в которой получение липосом с инкапсулированным в них РБ проводили в две стадии: вначале получали дисперсию мультиламмелярных везикул (МЛВ) путём диспергирования плёнки высушенных липидов в физиологическом или буферном растворах, а затем получали липосомы путём продавливания образцов через ядерный фильтр. Содержание РБ в липосомах определяли во фракции липосом после отделения свободного РБ от фракции липосом методом гель-фильтрации. Включение РБ в липосомы рассчитывали как отношение включенного РБ к фосфолипидам липосом, в которых он находился. Было показано, что отрицательно заряженные фосфолипиды увеличивают включение РБ. Установлено, что при внутривенном введении липосомы с РБ преимущественно накапливаются в печени и селезенке, а их накопление в легких незначительно. Это происходит потому, что липосомы легко фагоцитируются клетками ретикулоэндотелиальной системы (например, клетками Купфера), из-за чего эффективность их действия резко снижается. В данном исследовании нашли незначительное повышение эффективности действия липосом с РБ по сравнению с водным раствором РБ. Оценку стабильности компонентов, входящих в состав препарата (фосфолипидов и рифампицина), не проводили.

Вместе с тем, при заражении туберкулезом клетки микобактерий туберкулеза после попадания в легкие и закрепления на сурфактанте способны проникать по механизму фагоцитоза в альвеолярные макрофаги, где происходит их размножение. Липосомы размером более 0,1 мкм также легко фагоцитируются альвеолярными макрофагами, и таким образом может быть осуществлена направленная доставка в макрофаги лекарственного препарата, находящегося в липосомах. Размер липосом важен для эффективности действия препарата. С одной стороны, чем больше размер частиц, тем эффективнее они захватываются альвеолярными макрофагами. С другой стороны, крупные частицы (около микрона в диаметре) осаждаются в носоглотке, и только небольшие частицы (не более 0,3-0,5 мкм) достигают альвеол. Кроме того, при лечении туберкулеза легких возможно местное применение препарата липосом с антибиотиком в виде ингаляций, при котором лекарственный препарат сразу попадет в место поражения.

Исходя из сказанного, для терапии легочного туберкулеза предпочтителен ингаляционный путь введения липосомального РБ, в следствии чего существует потребность в создании липосомального препарата РБ, обладающего высоким включением активного ингредиента в липосомы и стабильностью при хранении, который можно было бы применять местно для лечения туберкулеза легких. Результат, полученный при создании заявленного способа, состоит в возможности получения липосомального препарата рифабутина (РБ), характеризующегося максимально возможной степенью включения РБ в липосомы (до 73-75%), стабильным при хранением (не менее одного года) и пригодным для ингаляционной формы введения. В качестве такой лекарственной формы в данном изобретении предложена липосомальная форма рифабутина, т.к. на одной из начальных стадий получения липосом происходит солюбилизация малорастворимого РБ, за счет чего можно значительно (в десятки раз) повысить содержание антибиотика в водной фазе.

Задачей заявленного способа является упрощение процесса получения и повышение качества липосомального препарата по показателям стабильности как липосомальной структуры так и стабильности фармакологически активной субстанции рифабутина, при этом результат, полученный при решении поставленной задачи, состоит в достижении стандартности и стабильности содержащих рифабутин липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), высокой инкапсуляции рифабутина в липосомы, стабильности рифабутина в процессе хранения и снижении токсического действия липосомального рифабутина (в частности, более, чем в три раза по сравнению с нелипосомальным аналогом).

Для достижения поставленного результата предлагается способ получения липосомального препарата, включающий создание композиции фосфатидилхолина и рифабутина, высушивание смеси, её эмульгирование в водной среде, диспергирование эмульсии, гомогенизацию, добавление криопротектора, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание, при этом эмульгирование проводят в водной среде, гомогенизацию проводили в два этапа: первоначальный при 500 атм, последующий при 8001000 атм, добавление криопротектора (лактозы, трегалозы, сахарозы или маннита) проводили первоначально при эмульгировании, а затем в процессе или после гомогенизации, при этом соотношение компонентов в полученном препарате рифабутин : фосфолипиды : криопротектор находится в переделах 7 : (10,0-700,0) : (28-120), соответственно, а в качестве фосфолипида используют фосфатидилхолин или фосфатидилхолин : отрицательно заряженные фосфолипиды в соотношении 1:1.

В общем виде процессе практической реализации способ предусматривает использование яичного фосфатидилхолина и рифабутина в органических растворителях, удаление растворителя упариванием в вакууме, диспергирование полученной массы в водной среде с рН 6,3-7,3, диспергирование многослойных липосом при возрастающем давлении, добавление криопротектора до, во время или после гомогенизации, получение липосом размером 80-140 нм, стерилизующую фильтрацию полученной липосомальной эмульсии, разлив во флаконы, лиофилизацию и герметизацию в атмосфере инертного газа (или азо- 2 023080 та).

Способ иллюстрируется графиками фармакокинетических профилей рифабутина в печени, мозге, почках и сердце крыс (рис. 1-4, соответственно).

Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте липидного компонента - фосфатидилхолина оцененивали методом тонкослойной хроматографии на пластинках по хроматограмме раствора целевого продукта в метаноле, на которой основное пятно желтого цвета находится на уровне основного пятна раствора стандартного образца фосфатидилхолина;

индекс окисленности липидов проводили УФ-спектроскопией при двух длинах волн: 233 нм и 215нм.

Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте рифабутина оцененивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили для количественного определения посторонних примесей и содержания рифабутина в образцах препарата. Использовали хроматограф 5>1итай/и. колонка 11,0 см х 4,6 мм ос4у18т1у1 51Йса де1 £ог сйгота!одгарЬу К (5 рт) или аналогичная, подвижные фазы: раные объемы ацетонитрила и калия дигидрофосфата; скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 254 нм.

Оценивали физико-химические свойства полученного липосомального препарата.

Определением величины частиц липосом проводили на наносайзере 2е1а51/ег Иаио Ζδ, Ма1уеги методом фотонной корреляционной спектроскопии. Размер частиц измеряли при помощи полупроводникового лазера при длине волны 375 нм.

Нижеследующие примеры иллюстрируют способ получения липосомального препарата Рифабутина, а также варианты получения. Подразумевается, что хотя в подробном описании и конкретных примерах раскрыты предпочтительные варианты осуществления изобретения, они приведены лишь для наглядности, поскольку из описания, а также формулы изобретения для специалиста в данной области техники станут очевидными различные изменения и усовершенствования, не выходящие за пределы существа и объема изобретения.

Пример 1. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 4000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 3,5 г трегалозы (из 10 необходимых). Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900-1000 атм до размера частиц не более 150 нм. При достижении заданного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор трегалозы (6,5 г). Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 148,4 нм - 100%. Включение антибиотика после стерилизующей фильтрации 77,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение рифабутина не менее 75,4%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:40:100). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.

Пример 2. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин сои в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл этанола. Кардиолипин в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл хлороформа. Хлороформный раствор и этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин, кардиолипин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,0, в которой находилось 7,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомо- 3 023080 генизацию при 800 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 138,0 нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 87,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН-6,15. Включение антибиотика не менее 87,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: кардиолипин : трегалоза - (7:20:20:70). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.

Пример 3. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилглицерин в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл хлороформа. Хлороформный раствор и этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин, фосфатидилглицерин и рифабутин, добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,5, в которой находилось 12,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 141,8, нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 83,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение рифабутина не менее 82,5%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: кардиолипин : трегалоза - (7:20:20:120). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.

Пример 4. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин сои в количестве 70000 мг растворяли в 200 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,0, в которой находилось 12,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 1000 атм до размера частиц не более 220 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 20 мин (с заменой фильтров). Размер частиц после стерилизующей фильтрации 198,4 нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 80,4%. Объем стерильной эмульсии 79 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение не менее 80,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:700:120). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.

Пример 5. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 1000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтро- 4 023080 вали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,2, в которой находилось 2,8 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 143,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 72,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 7,05. Включение не менее 70,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:7:28). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.

Пример 6. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 600 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 10 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 130 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила не удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 20 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 118,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 47,4%. Объем стерильной эмульсии 65,0 мл (потери за счет необходимости замены фильтров для отделения не включенного антибиотика).

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,55. Включение рифабутина не менее 48,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин : трегалоза - (7:5:100). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов. Как видно из приведенных ланных снижение в составе липосом фосфатидилхолина приводит к снижению включения рифабутина в липосомы, к трудностям при проведении стерилизующей фильтрации из-за присутствия в образцах свободного антибиотика.

Пример 7. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 85000 мг растворяли в 200 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 10 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 1000 атм до размера частиц не более 150 нм. При содержании в 1 мл эмульсии 800 мг фосфатидилхолина нам не удалось получить липосомы размером менее 400 нм. Эмульсию не удалось профильтровать через 0,22 мкм. Таким образом, увеличение соотношения рифабутин : фосфатидилхолин до 7 : 850 не позволило получить липосомы размером менее 200 нм.

- 5 023080

Пример 8. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 4000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С в течение 90 мин. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 0,5 ч до полного удаления этанола.

К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 2,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 148,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 79,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.

Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение не менее 75,4%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:40:20). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлено, что после лиофилизации размер частиц значительно увеличился до 250 нм, обнаружено также нестабильность стабильность липосомальной формы рифабутина, что может быть сязано с уменьшением содержания в препарате криопоотектора лактозы.

Пример 9.

При исследовании фармакокинетики липосомального и нелипосомального рифабутина при однократном инъекционном введении крысам наблюдается его быстрое выведение из плазмы крови с максимальной концентрацией около 375 нг/мл, что согласуется с данными инструкции по медицинскому применению оригинального препарата рифабутина.

Существенные различия наблюдались при определении рифабутина в печени крыс. С_тах для липосомальной формы составляла около 77,5 мкг/г (Т_тах - 0,25 ч), для нелипосомальной - около 217 мкг/г (Т_тах - 8 ч). Липосомальный рифабутин практически полностью выводился из печени к 72 ч, в отличие от нелипосомального, который сохраняется в печени к 72 ч после введения на уровне 173,6 мкг/г, причем наблюдается тенденция к его кумуляции. Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 183 мкг-ч/мл, период полувыведения - 11,1 ч, МКТ - 16 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 9173 мкг-ч/мл.

Также различия наблюдались для мозга - липосомальный рифабутин практически не проникал через ГЭБ и обнаруживался в небольших (до 1900 нг/г) не позднее 1,5 ч после введения. Нелипосомальный рифабутин обнаруживался в мозге крыс даже спустя 72 ч после введения в диапазоне концентраций 1600-7200 нг/г).

Схожие фармакокинетические профили наблюдались для почек: для липосомального рифабутина С_тах составила около 118 мкг/г, для нелипосомального - 93 мкг/г (Т_тах - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 210 мкг-ч/мл, период полувыведения 18,1 ч, МКТ - 31,2 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 651 мкг-ч/мл.

Аналогичная как и для почек картина наблюдалась и для сердца. Для липосомального рифабутина С_тах составила около 56 мкг/г, для нелипосомального - 34,1 мкг/г (Т_тах - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 487 мкг-ч/мл, период полувыведения 27,4 ч, МКТ - 36,9 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 700 мкг*ч/мл, период полувыведения - 19,9 ч, МКТ - 46,4 ч.

Таким образом, в связи с низким проникновением липосомального рифабутина в печень и мозг, можно предположить о его потенциально низкой гепатотоксичности и нейротоксичности.

Подытоживая, полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что продукт, полученный согласно заявленному способу - гомогенизация в два цикла: первоначально при 500 атм и последующая при 800-900 атм до указанного размера; и соотношение компонентов в итоговом препарате: рифабутин : фосфолипиды : трегалоза - 7 : (10,0-700,0) : (28-120) (см. примеры 1-5), обеспечивают стабильность композиции липосом с включенным в них рифабутином и обладают низкой гепатотоксичностью и нейротоксичностью. Воспроизведение заявленного способа при изменении параметров влечет трудности в реализации собственно способа и снижение качества целевого продукта, а именно увеличение размера и неоднородность дисперсионного состава липосом (пример 7); уменьшение включения рифабутина в липосомы и нестабильность размеров липосом (пример 6);

- 6 023080 существенное увеличение времени стерилизующей фильтрации или невозможность фильтрации липосомальной эмульсии (пример 6);

нестабильность липосом после лиофилизации (пример 8).

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было проведено изучение стабильности рифабутина после лиофилизации образцов липосом по сравнению с исходной субстанцией. Подтверждена идентичность качественного и количественного состава рифабутина после высушивания и последующей регидратации образцов липосом. Содержание примесей и время их удерживания не изменились, что может свидетельствовать о стабильности рифабутина в процессе получения липосом и их последующего сублимационного высушивания.

Таким образом, использование наночастиц, представляющих собой искусственные мембраны - липосомы, нагруженные рифабутином, представляют несомненный интерес для дальнейшего изучения.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Способ получения липосомального препарата, включающий создание композиции фосфолипидов и рифабутина, высушивание смеси, её эмульгирование в водной среде, диспергирование эмульсии, гомогенизацию, дробное добавление криопротектора, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание, при этом гомогенизацию проводят по меньшей мере в два этапа: первоначальный при 500 атм, последующий при 800-1000 атм, добавление криопротектора трегалозы проводят первоначально при эмульгировании, а затем в процессе или после гомогенизации, при этом массовое соотношение компонентов в полученном препарате рифабутин : фосфолипиды : криопротектор находится в пределах 7:(10,0-700,0):(28-120) соответственно, а в качестве фосфолипида используют фосфатидилхолин или смесь фосфатидилхолина и отрицательно заряженного фосфолипида (дифосфатидилглицерина или фосфатидилглицерина) в соотношении 1:1.