EA022675B1 - Способ выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к ветеринарии, в частности - к методам диагностики инфекционных заболеваний животных. Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота у вакцинированного и невакцинированного поголовья за счёт возможности выявления скрыто больных бруцеллёзом животных. Способ осуществляется следующим образом. Всем животным, в том числе и молодняку, начиная с 2-х дневного возраста, как иммунизированным против бруцеллёза, так и неиммунизированным, вводят внутримышечно бруцеллин, а через 30-40 мин - раствор для инъекций в дозе 4-6 мл на голову. При этом молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову. Раствор для инъекций представляет собой смесь водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов 2-6:994-998, через 10-28 дней после введения препаратов проводят серологические исследования.

Description

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к методам диагностики инфекционных заболеваний животных.

Известен способ выявления бактерионосительства путём постановки серологических реакций с помощью реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) (см., например, Шубина Е.А. Бруцеллез крупного рогатого скота, диагностика, специфическая профилактика./ 1Шр://\у\у\у.ус11ск.ги/агПс1с5/. опуб. 14.02.2011).

Однако эффективность способа невелика, поскольку он не позволяет выявлять инфицированных животных с низкой резистентностью и толерантностью в отношении возбудителя бруцеллёза.

Известен также способ выявления бактерионосительства путём постановки аллергических реакций, т.е. с помощью бруцеллина ВИЭВ (см. Наставление по диагностике бруцеллёза животных, утв. Минсельхозом РФ 29.09.2003 № 13-5-02/0850 и введённое в действие с 1 января 2004 года), заключающийся во внутрикожном введении препарата в дозе 0,2 мл. Данный метод применяют на свиньях с четырёхмесячного возраста, не вакцинированных против бруцеллёза. Реакцию на бруцеллин учитывают через 24 и 48 ч.

Однако данный способ применим только на невакцинированных против бруцеллёза животных (в частности, свиньях).

Метод аллергической диагностики не может применяться на вакцинированных животных из-за возможности получения заведомо положительных результатов.

Наиболее близким к заявляемому является способ выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота (см. патент РФ № 2008918 по кл. МПК⁵ А61К 9/00, опуб. 15.03.1994), заключающийся в аллергическом исследовании невакцинированных животных, при этом животных предварительно иммунизируют вакциной из штамма 82, а аллергические исследования проводят через 3-4 дня.

Однако, способ может применяться только на невакцинированных против бруцеллёза животных. Введение вакцины из штамма 82 приводит к усилению аллергических реакций у невакцинированных животных и не может применяться на вакцинированном поголовье.

Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота у вакцинированного и невакцинированного поголовья за счёт возможности выявления скрыто больных бруцеллёзом животных.

Для решения поставленной задачи в способе выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота, заключающемуся в однократном внутримышечном введении животным специфического бруцеллёзного препарата, проведении иммунологических исследований и оценке бактерионосительства по их результатам, согласно изобретению дополнительно через 30-40 мин после введения специфического бруцеллёзного препарата вводят внутримышечно однократно раствор для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов: 2-6:994-998, а в качестве специфического бруцеллёзного препарата используют бруцеллин, при этом бруцеллин вводят в дозе 2,5-5,0 мл на голову, раствор для инъекций - в дозе 4-6 мл на голову, причём препараты вводят иммунизированным и неиммунизированным против бруцеллёза животным всех возрастных групп, а оценку бактерионосительства осуществляют по результатам серологических исследований.

Молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову.

Серологические исследования проводят через 10-28 дней после введения препаратов.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описан способ выявления бактерионосительства при бруцеллёзе у вакцинированного и невакцинированного поголовья крупного рогатого скота, позволяющий однозначно дифференцировать больных и здоровых животных и эффективно дополнительно выявлять больных бруцеллёзом животных среди всего ранее обследованного поголовья за счёт усиления специфических и снижения неспецифических реакций путём внутримышечного введения бруцеллина и раствора для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида и изотонического раствора натрия хлорида при соотношении весовых частей растворов 2-6:994-998.

Известен препарат, содержащий смесь водного раствора формальдегида с изотоническим раствором хлорида натрия. Этот препарат является холестеринорегулирующим средством и позволяет включать гипермутационный механизм организма, который приводит к повышению аффинности рецепторов, регулирующих, в свою очередь, уровень холестерина (см. патент РФ №2352331 по кл. А61К 31/115, опуб. 20.04.2009).

Известен также препарат на основе формальдегида, хлорида натрия и дистиллированной воды (см. патент РФ № 2077882 по кл. А61К 31/115, опуб. 27.04.1997), который используется в качестве модулятора естественной резистентности организма, обеспечивающего саморегуляцию основных систем макроорганизма.

В заявленном изобретении выявлено неизвестное ранее свойство раствора для инъекций на основе формальдегида и изотонического раствора хлорида натрия - осуществлять диагностику бруцеллёза крупного рогатого скота путём усиления специфических реакций у больных бруцеллёзом животных, особенно у нереагирующих на постановку аллергической пробы на бруцеллин.

- 1 022675

Кроме этого, выявлено свойство данного раствора для инъекций - снижать неспецифические реакции за счёт нормализации иммунного статуса организма животных, что позволяет дифференцировать здоровых животных от больных.

Раствор для инъекций на основе малых концентраций формальдегида способствует провокации латентно протекающих форм бруцеллезной инфекции в организме иммунизированных коров.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии изобретательского уровня в заявляемом изобретении.

Раствор для инъекций представляет собой прозрачный бесцветный раствор без запаха.

Бруцеллин представляет собой стерильный биологический препарат в виде прозрачной жидкости коричневато-жёлтого цвета без опалесценции, которая содержит продукты жизнедеятельности и специфические вещества, извлечённые из бруцелл (см., например, Наставление по диагностике бруцеллёза животных, утв. Минсельхозом РФ 29.09.2003 № 13-5-02/0850 по состоянию на 23 января 2008).

Способ осуществляется следующим образом.

Всем животным, в том числе и молодняку, начиная с 2-х дневного возраста, как иммунизированным против бруцеллёза, так и неиммунизированным, вводят внутримышечно бруцеллин, а через 30-40 мин раствор для инъекций в дозе 4-6 мл на голову.

При этом, молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову.

Через 10-28 дней после введения препаратов проводят серологические исследования.

Пример.

Исследования проводились в крестьянском хозяйстве Акмолинской области сотрудниками лаборатории бруцеллеза ТОО КазНИВИ. Животные были сформированы в 2 группы:

1- группа состояла из 100 голов, отрицательно реагирующих на бруцеллез, взрослых животных (коров и телят прошлого года) и 2-х телят до 9 дней, родившихся от здоровых животных.

Взрослым животным вводили однократно внутримышечно каждому по 5 мл бруцеллина, а через 35 мин - по 5,5 мл раствора для инъекций.

Телятам препарат вводили также однократно внутримышечно по схеме: 3 мл бруцеллина, а через 35 мин - 5 мл раствора.

группа состояла из 58 бычков разных возрастов, которым вводили однократно внутримышечно каждому по 5 мл бруцеллина, а через 35 мин - по 5,5 мл раствора для инъекций.

Серологические исследования коров проводили через 10 и 28 дней, а быков и телят через 28 дней после введения препаратов в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК), постановки пробы роз-бенгал (РБП) и путём постановки иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты проведенных работ представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, из 100 здоровых взрослых коров, исследованных на бруцеллез после введения препаратов, положительно реагировало по всем серологическим тестам при первом исследовании 28 голов (28%), а при повторном - 30 (30%). Данное стадо коров до введения препаратов числилось благополучным по бруцеллезу, т.е. при предварительном диагностическом исследовании животные отрицательно реагировали на бруцеллез.

Таблица 1. Результаты серологических исследований крупного рогатого скота

Вид и возраст животных	Всего иссле- довано	Позитивные показания се	рологических тестов
РБП	РА	РДСК	ИФА	РБП	РА	РДСК	ИФА	Всего абс/%
через 10 дней после иммунизации	через 28 дней после иммунизации
Коровы здоровые	100	14	6	18	28	27	16	22	30	30/30
Бычки здоровые	58	не иссл.	не исс	не иссл	не иссл	8	7	4	8	9/15,5
Телята до 9 дней, рожденные от здоровых животных	2

Появление 28 положительных показаний серологических тестов при исследовании заведомо здоровых коров после первичного и 30 положительных случаев после вторичного введения препаратов обусловлено действием специфического бруцеллезного аллергена совместно с раствором для инъекций на основе малых концентраций формальдегида, что, в конечном итоге, способствовало провокации латентно протекающих форм бруцеллезной инфекции в организме животных.

Раствор готовили следующим образом.

Берут 2-6 вес.ч. 36,5-40%-ного медицинского раствора формальдегида, добавляют его в 998-994 вес.ч. стерильного 0,85-0,95%-ного раствора хлорида натрия для инъекций.

- 2 022675

Раствор хранят в темном месте при температуре 15-35°С.

Например, берут 0,2 мл 37%-ного медицинского раствора формальдегида, добавляют его в 99,8 мл стерильного 0,9%-ного (или 0,95%-ного) изотонического раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают.

Содержание весовых частей раствора для инъекций было подобрано экспериментальным путём.

Для доказательства отсутствия токсического действия раствора для инъекций были проведены эксперименты на мышах.

В опытах было использовано 56 аутбредных мышах 1СК обоего пола массой 18-24 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при одинаковом уходе, на постоянной диете и при свободном доступе к воде и к корму.

Наблюдения за животными проводили в течение 14 суток с момента введения раствора. Оценивали общее состояние животных, двигательную активность, поведение, реакцию на раздражители, рефлексы. В экспериментах, где было необходимо, периодически проводили взвешивание животных, определяли объемы потребляемой пищи и воды. Погибших в ходе исследований животных вскрывали, проводили оценку состояния внутренних органов, определяли их относительные коэффициенты (головной мозг, печень, сердце, селезенка, почки, надпочечники, яички, яичники). Выживших животных по истечении периода наблюдения умерщвляли дислокацией шейных позвонков, проводили вскрытие и оценивали выраженность макроскопических патологоанатомических изменений состояния внутренних органов.

Показатели токсичности определяли методом пробитанализа по ЬйсЫе1б и ^йсохои с использованием номограмм З. Рота.

Препарат с содержанием 0,2 мл раствора 37%-го формальдегида и 99,8 мл 0,9% раствора хлорида натрия вводили внутримышечно однократно в дозах 5, 25 и 50 мл/кг. За период наблюдения животных взвешивали трижды (1, 7 и 14 сутки после введения).

Результаты исследований показали, что после введения препарата в дозе 5,0 мл/кг не выявлено каких-либо изменений в общем состоянии животных и их поведении. Г ибели животных в группе в течение всего периода наблюдения не было. Динамика нарастания массы тела у всех животных оставалась в пределах нормы. Отличий в общем состоянии и поведении в группах самцов и самок не выявлено.

Близкую к вышеописанной картине наблюдали и после введения препарата в дозе 25 мл/кг. Общее состояние, поведение, потребление корма и воды, динамика нарастания массы тела оставались в пределах нормы как в группах самцов, так и самок.

В группе животных, которым вводили препарат в дозе 50,0 мл/кг, отмечали кратковременное (до 1 мин) легкое возбуждение, после чего состояние животных нормализовалось и заметно не отличалось от такового в других опытных группах мышей.

После завершения периода наблюдения (14 сут.) животных вывели из эксперимента дислокацией шейных позвонков, вскрыли и провели макроскопическую оценку внутренних органов, после чего органы удалили, взвесили и определили относительные индексы внутренних органов. Исследованиями установлено, что относительные массы органов во всех опытных группах статистически достоверно не различались и находились в пределах нормы. Местной реакции (наличие инфильтрата, гиперемии, выпадения волосяного покрова и т.д.) не выявлялось.

Провели исследования по введению препарат в дозе, в 10 раз превышающей концентрацию готовой лекарственной формы препарата, т.е. с содержанием 2 мл раствора 37% формальдегида и 98 мл 0,9% концентрации раствора хлорида натрия.

Мышам (самцам и самкам) 1СК препарат вводили внутримышечно в дозах 6, 12,5 и 25 мл/кг.

В течение первых 5-6 ч после введения отмечали умеренное угнетение возбудимости и реактивности животных. Постепенно нарастало учащение дыхания и сердцебиения. Однако гибели животных в течение первых суток после введения вещества не зарегистрировали. Гибель наступила от остановки дыхания на 4-е сутки у одной из мышей, которой ввели субстанцию в дозе 25 мл/кг.

У всех опытных животных развивалась местная реакция в виде уплотнения мышечной ткани. К концу опыта кожный покров на месте инъекции раствора терял шерстяной покров, здесь формировался плотный инфильтрат.

Исследования показали, что начальная токсическая доза препарата не оказала существенного влияния на прирост массы тела животных. Колебания этих показателей в группах самцов и самок не выходят за пределы допустимых отклонений.

В конце эксперимента мыши были умерщвлены, обследованы макроскопически, их внутренние органы взвешены и вычислены относительные коэффициенты.

Результаты эксперимента показали, что у мышей обоего пола, получивших данный препарат в дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую, в конце эксперимента относительная масса мозга, сердца, печени, селезенки, почки, надпочечников, семенников (яичников) существенно не отличалась от таковой для нормальных показателей у животных.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о низкой токсичности раствора для инъекций на основе малых концентраций формальдегида.

Было выявлено, что введение раствора для инъекций с другими соотношениями весовых частей не

- 3 022675 приводит к повышению эффективности диагностических мероприятий.

Дозы введения препаратов также были подобраны экспериментально.

Установлено, что введение раствора для инъекций в дозе менее 4 мл не приводит к решению поставленной задачи, а именно - к эффективному выявлению бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота, а более 6 мл нецелесообразно с экономической точки зрения.

Аналогичным образом и из этих же соображений были подобраны дозы введения бруцеллина для молодняка (2,5-3,0 мл) и взрослого поголовья (4,5-5,0 мл).

Проведение серологических исследований спустя 10-28 дней объясняется следующими соображениями.

Общеизвестно, что иммунитет при бруцеллёзе формируется через три недели после вакцинации (см., например, Инструкцию и ТУ 9384-016-00482915-01 по применению вакцины против бруцеллёза из слабоагглютиногенного штамма Вгисе11а аЬойик 82, Инструкцию и ОСТ 10-08064-41-95 по применению вакцины против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма 19 производства ФГУП Щелковский биокомбинат/ 11ир://\у\у\у.ЬюсотЫпа1.ги/т6ех).

Для доказательства эффективности достигаемого нами результата были проведены серологические исследования до формирования иммунитета (через 10 дней после обработки животных препаратами) и спустя 28 дней после.

Таким образом, способ позволяет эффективно выявлять скрыто больных бруцеллёзом животных, причём как вакцинированного, так и невакцинированного поголовья.

Claims (3)

1. Способ выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота, заключающийся в однократном внутримышечном введении животным специфического бруцеллёзного препарата, проведении иммунологических исследований и оценке бактерионосительства по их результатам, отличающийся тем, что дополнительно через 30-40 мин после введения специфического бруцеллёзного препарата вводят внутримышечно однократно раствор для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов:

2-6:994-998, а в качестве специфического бруцеллёзного препарата используют бруцеллин, при этом бруцеллин вводят в дозе 2,5-5,0 мл на голову, раствор для инъекций - в дозе 4-6 мл на голову, причём препараты вводят иммунизированным и неиммунизированным против бруцеллёза животным всех возрастных групп, а оценку бактерионосительства осуществляют по усилению специфических серологических реакций, исследования на которые проводят через 10-28 дней после введения бруцеллёзного препарата и раствора для ийъейциоб выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота по п.1, отличающийся тем, что молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову.

3. Способ выявления бактерионосительства при бруцеллёзе крупного рогатого скота по п.1, отличающийся тем, что взрослому поголовью бруцеллин вводят в дозе 4,5-5,0 мл на голову.