EA019599B1

EA019599B1 - Способ диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена phf10, диагностический набор

Info

Publication number: EA019599B1
Application number: EA201001297A
Authority: EA
Inventors: Наталия Валерьевна Сошникова; Александр Викторович Бречалов; Елена Николаевна Набирочкина; София Георгиевна Георгиева
Original assignee: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук; Российская Федерация в лице Министерства образования и науки Российской Федерации
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2014-04-30
Also published as: EA201001297A1

Abstract

Изобретение относится к способу диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена PHF10 в клетках пациента, причем сниженный уровень экспрессии гена PHF10 в клетках образца морфологически опухолевой ткани по сравнению с таковым в клетках образца морфологически нормальной ткани свидетельствует о наличии у пациента меланомы. Также раскрыт набор для проведения диагностики меланомы человека, содержащий по меньшей мере две пары праймеров, специфичных к гену PHF10, и по меньшей мере одну пару контрольных праймеров.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области генной диагностики, в частности к диагностике меланомы с использованием олигонуклеотидов.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Меланома является трудно диагностируемым заболеванием с плохим прогнозом и широким распространением в мире. В настоящее время ведутся активные поиски биологических маркеров меланомы.

В одном из исследований сыворотку больных меланомой и здоровых людей исследовали с целью идентификации белковых маркеров меланомы с помощью серологического протеомного подхода. Небольшое количество белков клеток 0361, разделенных с помощью двумерного гель-электрофореза и перенесенных на мембрану, инкубировали с сывороткой пациентов. Позитивные сигналы, которые взаимодействовали более чем с 5 образцами сыворотки, идентифицировали с помощью световой массспектрофотометрии. Было обнаружено 12 положительных сигналов и определено 5 белков: эукариотический фактор-2 элонгации (ЕЕЕ2), энолаза-1 (ΕΝΟ1), альдолаза (ΑΕΌΟΑ), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа (0ΑΡΌΗ) и гетерогенный ядерный рибонуклеотид (ΗΝΒΝΡ) А2В1. мРНК четырех белков (ЕЕЕ2, ΕΝΟ1, ΑΕΌΟΑ и ΗΝΚΝΡ А2В1) интенсивно экспрессировались в клетках 0361 по сравнению с меланоцитами. мРНК ЕЕЕ2, ΕNΟ1 и ΑΕΌΟΑ также часто экспрессировались в других культурах клеток меланомы (8ι.ιζι.ι1<ί Α., 1)хика Α., Коттуата М., Ките Α., Та1 8., ΟΙΜιίΙα С., Кигики Α., №1капшга Α., Уатото1о Α., Υ;·ιιη;·ιζ;·ι1<ί Ν., УккЫкауа 8., Кгуобата Υ., Αίάναιηα Υ. 1бепйГ1сайоп о! Ме1апота Αηΐί^ηδ Ик1пд а 8ето1од1са1 Рто1еоте Αρρ^оасй. Сапсег Оепот1ск Рго1еот1ск. 2010. 7(1):17-23).

Возникновение злокачественных опухолей обычно является следствием утраты контроля за интегрированностью генома, что приводит к его злокачественным изменениям. Сравнительная геномная гибридизация (СОН) является методом, который может быть осуществлен на ДНК из фиксированных тканей для определения полного генома на предмет изменения количества копий ДНК. Анализ по методу СОН позволил определить, что меланома отличается от невусов наличием часто повторяющихся хромосомных аберраций (Ваиег 1, Вак1а1п ВС. В1к1тдшкЫпд те1апосуйс пеу| Ггот те1апота Ьу ΌΝΑ сору питЬег сбапдек: сотратабуе депотю йуЬп^айоп ак а гекеагсб апб б1адпокИс 1оо1. Оегта1о1оду Тбегару. 2006. 19:40-49).

С развитием наследственной меланомы ассоциирован ген ингибитора клеточного цикла ί.'ΌΙ<Ν2Α (р161М<4а1р11а). Было показано, что в спорадических меланомах происходят изменения уровня экспрессии р16. Проведены иммуногистохимические исследования с целью изучения ассоциации экспрессии р16 с клеточной пролиферацией, опухолевой пролиферацией и выживаемостью пациентов. Обнаружено, что для первичных опухолей характерно отсутствие окрашивания белка р16. Также отсутствие экспрессии р16 обнаружено и в метастазах. Отсутствие/минимальное окрашивание ядра по р16 позволяет предсказывать низкую выживаемость пациентов (81таите О., 8\Иапб Ь., Αккеη ΕΑ. Ьокк оГ пис1еаг р16 рто1еш ехргеккюп сотте1а!ек \\Й11 тстеакеб 1итог се11 ртоИГетабоп (К1-67) апб роог ртодпобк ш райеШк \\Й11 уетйса1 дтоМй рбаке те1апота.С11шса1 Сапсег Кекеагсб. 2000. 6:1845-1853).

Эпигенетический контроль динамики хроматина в процессе синтеза ДНК, репликации и репарации является фундаментальным для правильной последовательности клеточной пролиферации. Фактор-1 сборки хроматина (ί.ΆΕ-1) действует как главный регулятор этого процесса. Как было показано, его субъединица р60 является новым пролиферативным и прогностическим маркером для нескольких типов опухолей. С помощью иммуногистохимического метода, выполненного на парафиновых срезах первичной меланомы, было показано, что СΑΡ-1/р60 усиленно экспрессируется во всех изучаемых образцах (130 образцов), что позволяет рассматривать его как новый прогностический маркер для меланомы (Максо1о М., УессЫопе М.Ь., 11агб1 О., 8са1уе1Ш М., Мо1еа О., Όί Вепебейо М., Мщпек Ь., 81апо М., Ое Кока О., 81а1Ьапо 8. Ονе^еxр^екк^оη оГ Сйтотайп ΑккетЬ1у Еас1ог- 1/р60 бе1рк 1о ртебю! 1йе ртодпобк оГ те1апота райейк. ВМС Сапсег. 2010. 24:63-69).

Полноразмерный М1ТЕ-М (ассоциированный с микрофтальмией транскрипционный фактор М) и кДНК его сплайс-варианта были клонированы из клеток меланомы 624те1 с помощью ОТ-ПЦР. Его экспрессию исследовали с помощью обычной ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в нормальных меланоцитах (ЫНЕМ), в клеточных линиях меланомы, в образцах тканей меланомы, в крови здоровых доноров и в клеточных линиях опухолей, отличных от меланомы. Был идентифицирован новый сплайс-вариант, названный М1ТЕ-Мбе1, который широко экспрессировался в меланоцитах, клеточных линиях и тканях меланомы, но полностью отсутствовал в немеланомных клеточных линиях и в крови здоровых доноров. Обе изоформы значительнее экспрессируются в тканях меланомы по сравнению с другими клеточными линиями (^апд Υ., КабГаг 8., Ьш 8., К1кег Α.Ε., Кбопд Н.Т. МйГ-Мбе1, а поуе1 те1апосу!е/те1апотакресШс 1коГогт оГ т1сгорййа1т1а-аккос1а1еб йапкспрбоп Гас1ог-М, ак а сапб1ба!е Ыотаткет Гог те1апота. ВМС Мебкте. 2010. 8:14-20).

В одном из исследований проводили флуоресцентную т кйи гибридизацию на невусах слизистой оболочки глаза и меланомах. Были использованы зонды к 6р25 (ККЕВ1), 6с.|23 (МТВ), 11д13 (ΟΟΝΌ1) и центромере 6 (СЕР6). Хромосомные перестройки были выявлены только в меланомах (Викат К., Еапд Υ., Л1апк\\аг 8.С., Ри1йает М.Р., Магг В., ΑЬ^аткоη Ό.Η. О1кйпсйоп оГ соп)ипсйуа1 те1апосуйс пеу| Ггот те1апотак Ьу Диогексепсе ш кйи йуЬ^^б^ζайоη. 1оитпа1 Си1апеоик Ра1йо1оду. 2010. 37:196-203).

- 1 019599

Ранее белок 8ОХ-9 рассматривали только как регуляторный белок, который играет роль в дифференцировке мезенхимальных клеток в хондроциты. В настоящее время к его функциям относят и регуляцию транскрипции в ходе меланогенеза. Была проанализирована экспрессия 8ОХ-9 на срезах метастазирующей меланомы и проведено сравнение с 3 используемыми маркерами меланоцитов (МАКТ-1, антигеном НМВ-45 и белком 8-100). Опухоли, негативные по двум или трем маркерам, были позитивны по 8ОХ-9. Было показано, что 8ОХ-9 экспрессируется практически во всех меланомах (Као Р., Ри11ег 6.Ν., Рпе1о ν.6. Ехргеккюп оГ 8ОХ-9 ίη Ме1ак1а6с Ме1апота-А Ро1еп11а1 Э1адпок11с ΡίίίαΙΙ. Лтепеап 1онгпа1 Эегта1ора1йо1оду. 2010. 1: 16-21).

Также было показано, что в развитие рака вовлечена аберрантная экспрессия хроматинремодулирующего комплекса 8\νΐ/8ΝΡ. Обнаружено, что 8ΝΡ5, основная субъединица комплекса 8^Ι/8ΝΡ, участвует в регуляции клеточной дифференцировки, контроле клеточного цикла и апоптоза. С помощью иммуногистохимических методов изучали экспрессию 8ΝΡ5 в диспластических невусах, первичных меланомах и метастатических меланомах. Оказалось, что экспрессия 8ΝΡ5 в меланомах значительно редуцирована по сравнению с таковой в невусах. Таким образом, 8ΝΡ5 является важным маркером развития меланомы (Ьт Н., \Уопд К.Р., Майтка М., Ь1 6. Ьокк оГ 8ΝΡ5 ехргеккюп еотте1а1ек \\йй роог раБеп1 кшУ1уа1 ίη те1апота. Сйп. Сапсег Кекеагсй. 2009. 15:6404-6411).

Регуляция клеточного цикла имеет большое значение в развитии опухоли. Это послужило основанием для проведения исследования взаимосвязи изменения уровня экспрессии циклина Ό1, р14, СИК4 и ВВ с пролиферацией опухолевых клеток и прогрессированием опухоли. Иммуногистохимическим методом было выявлено, что в опухолевых клетках происходит усиление экспрессии этих белков (Вайтапп Ι.Μ., 8йаите О., Акк1еп Ь.А. АЙегеб ехргеккюп оГ се11 сус1е гещйаЮгк Сусйп Ό1, р14, р16, СИК4 апб КЬ т поби1аг те1апотак. ΝΤ 1оигпа1 Опсо1оду. 2004. 25(6): 1559-1565).

В одном из исследований с помощью иммуногистохимических методов был изучен профиль экспрессии белков, участвующих в апоптозе, регуляции клеточного цикла, транскрипции и репарации ДНК. Было обнаружено, что белки 8-100, НМВ45, те1ап А, специфические циклины (циклин А, циклин Ό1, циклин Ό3), белки клеточного цикла КВ, рКВ, НЭМ-2, К1-67, Сус Ό3, белок апоптоза сурвивин, транскрипционный фактор 8ТАТ-1, белок репарации ДНК МЬН-1 характеризуются более высоким уровнем экспрессии в меланомах по сравнению с таковым в невусах, тогда как уровень экспрессии белков клеточного цикла Сус Ό1, СИК2, СЭК6, р16, р27, мембранного рецептора С-ΚΙΤ, транскрипционных факторов РКСВ, МИМ-1 в меланомах ниже (А1опко 8., ОгБх Р., Ро11ап М., Регех-Сотех В., 8апсйех Ь., Асипа М., Ра)агек К., Майтех-Те11о Р., Нойе1апо С., Ршк М., Кобпдиех-РеггаЮ ί. Ртодтеккюп ш сШапеоик тайдпап1 те1апота 1к аккос1а1еб \\йй б1к!1пс1 ехргеккюп ргоГПе. Атепсап 1оигпа1 оГ Ра!йо1оду. 2004. 164: 193203).

Первичные меланомы исследовали методом микромассивов кДНК. Было показано, что в меланомах изменен уровень экспрессии 174 генов. Среди них гены белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла (СК82, СЭС2. ССИВ1. СЕИРР. ИНРК) и митоз (НСАР-С, 8ТК6), ингибирующих (В1КС5) и стимулирующих (СРК105) апоптоз, регулирующих репликацию ДНК (ТОР2А, ККМ2, ТУМ8, РСЫА, МСМ4, МСМ6), изменяющих уровень экспрессии в ответ на стресс (СЬКХ2, ОКАЗАЙ Н8РА4, Н8РА5, Н8РИ1, ТХМР), передающих сигнал внутри клетки (8ТМЫ2), ингибирующих сигнальный путь \Уп1 (СТЫХВ1Р1), ингибирующих экспрессию М1ТР (ЕМХ2), регулирующих протеолиз СТЛА), подавляющих метастазирование (ХМЕ1) (ХУтперепшпскх V., йахаг V., М1сй1е1к 8. е1 а1. Сепе ехргеккюп ртоййпд оГ рптагу сШапеоик те1апота апб сйшса1 оШсоте. Зонгпа1 №111 Сапсег 1пкй 2006. 98:472-482).

Методом микромассивов кДНК, Вестерн-блот анализа, количественной ПЦР в режиме реального времени было показано, что в линиях клеток меланомы происходит снижение уровня транскрипции генов, участвующих в развитии, таких как М1ТР, ЕИХКО, ИСТ и ТУК, и увеличение уровня транскрипции генов, участвующих во взаимодействии с клеточным окружением, таких как РЕАИК, VСЛN, Н1Ра (беГГк А.К., С1оует А.С., 81оЬЬе ЬЭ., \Уапд И., Не 8., Нах1е11 ТА., Атак!й А., \Уоо11еу А.С., Магкйа11 Е.8., .Токерй ^.К., Рпп1 С.С., Вади1еу В.С., Есс1ек М.К. А депе ехргеккюп кщпаШге оГ шуаыуе ро!еп11а1 ш те1ак1аБс те1апота се11к. РЬокОпе. 2009. 4(12):е8461).

С использованием микромассивов кДНК из образцов рака прямой кишки было показано, что у больных изменена экспрессия 8 генов, кодирующих белки 1ТСВ2, МКР8И, №К1, ТХХЬ2, РНР10, РК888, КСМО 1АК3. Уровень экспрессии РНК измеряли методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. (СауаИеп Ό., Ио1ата Р., М1ш Е., Бисен С., Сайадшш С., Той 8., Мас1ас.| К., Эе Р1йрро С., №ЬШ 8., Мотдапй М., №1роК С., Тошш С., Васаш М., Вщдеп А., ТопеШ Р., Vа1аζаηο К., Ог1апбо С., Се1ш1ш 8., С1апсй1 Р., Меккепш Ь., БиххаНо Ь. Апа1ук1к оГ депе ехргеккюп ртоГбек теуеа1к поуе1 соггейДюпк \νίΐ1ι 1йе сйшса1 соигке оГ со1огес1а1 сапсег. Опсо1оду Кекеагсй. 2007. 16:535-548).

Было показано, что ингибирование пути 1АК-8ТАТ приводит к ингибированию роста раковых клеток и к их апоптозу (ВготЬегд, Т, апб Иатпей, ί. Е., 1т. Тйе го1е оГ 8ТАТк ш йапкспрЦопа1 соп1го1 апб 1йе1г нпрас! оп се11и1аг Гипсбоп. Опсодепе, 2000. ν.19:2468-2473; Сабей-Ра1сопе К., ИаЙоп ^.8., апб 1оуе К. 8ТАТ рго1етк ак поуе1 1агде1к Гог сапсег 1йегару. 81дпа1 йапкбисег апб асбуаЮг оГ йапкспрБоп. Снггеп! Орт. Опсо1оду, 1999. 11: 490-496; Во^тап, Т. Сагаа К., Тигккоп I., апб 1оуе К. 8ТАТк т опсодепещк. Опсодепе, 2000. 19: 2474-2488; Ьт Т. 8., Майа_)ап, 8., апб Ргапк, И.А. 8ТАТ к1дпа1тд т 1йе ра1йодепек1к апб

- 2 019599

1гса1шсп1 οί 1еикеш1а8. Опсодепе, 2000. 19: 2496-2504). При этом ингибирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ в нормальных фибробластах хотя и вызывает прекращение роста клеток, но не вызывает их апоптоз. Одно из объяснений этого эффекта заключается в том, что раковые клетки становятся необратимо связанными с работой пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ для поддержания своего существования, в то время как в нормальной клетке ингибирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ просто приводит к ее выходу из митотического цикла. Таким образом, ингибиторы пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ приводят к гибели только раковых клеток, что делает их важным потенциальным средством терапии опухолей.

Также были обнаружены селективные ингибиторы тирозинкиназ, что дает возможность воздействовать на первый этап пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ. Было показано, что подавление функции ΙΆΚ-киназы приводит к гибели клеток миеломы, рака предстательной и молочной желез и т.д. Тем не менее, недостатком ингибирования тирозинкиназ является неспецифичность этого воздействия. Кроме 1ΑΚ-8ΤΑΤ, оно влияет и на многие другие пути и, таким образом, может негативно влиять и на нормальные клетки.

Более специфическим является репрессирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ с помощью ингибирования экспрессии белков 8ΤΑΤ. Так, было показано, что воздействие на экспрессию 8ΤΑΤ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводит к блокированию роста и жизнеспособности клеток ряда опухолей (Ер1шд-Вигпейе, Ρ.Κ., Ыи 1. Н., СаЙе11-Ра1сопе, е! а1. 1п1иЬйюп οί 8ΤΑΤ3 81дпа11пд 1еабк ΐο ορορίοδίδ οί 1еикет1с 1агде дгапи1аг 1утр1юсу1е8 апб бесгеакеб Мс1-1 ехргеккюп. Ιοί-ΐη-κΕ С1йпс 1пуе8Йда1юп8. 2001. 107: 351-362). Ингибирование 8ΤΑΤ с помощью белкового ингибитора (доминантно-негативный вариант 8ΤΑΤ) приводит к ингибированию роста опухоли и ее регрессии. Хотя только 15% опухолевых клеток были транформированы доминантно-негативным вариантом 8ΤΑΤ, результатом воздействия была массовая гибель клеток меланомы.

Новый транскрипционный фактор эукариот РНР10, открытый и охарактеризованный в ИБГ РАН (Ν.Ε. Vο^οЬуеνа, Ν.ν. 8ο8йπ^кονа, 1.Ь. Κиζт^ηа, М.В. ^раШ^уа, IV. N^кο1еηкο. Ε.Ν. НпЫгосНкта, 8.С. Сеο^д^еνа. апб Υ.ν. 8Εί61ον8Κίί. Τίκ ηονе1 геди1аГОг οί теίаζοаη беуеФртеп! 8ЛУР ο^даπ^ζе8 а пис1еаг тоасбгаЮг 8ире^сοтр1еx. Се11 Сус1е. 2009. 8: 2152-2156), является регулятором клеточного цикла и взаимодействует с путем 1ΑΚ-8ΤΑΤ. Учитывая, что нарушение работы генов пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ в клетках человека связано с развитием различных злокачественных новообразований, в частности меланом, было сделано предположение о том, что вероятность образования меланомы значительно увеличивается при возникновении мутации гена РНР10.

Белок РНР10 входит в состав комплекса 8νΐ/8ΝΡ, ремоделирующего хроматин. В пролиферирующих нервных стволовых клетках, а также их предшественниках РНР10 в составе этого комплекса регулирует промоторы генов компонентов сигнальных путей, таких как ΝοΚίκ 8НН (1. Ьеккагб, II. ^и, 1.Л. Вишкй, М. ^ап, М.М. \V^η81ο\ν. Β.Τ. 81ааЫ, Н.^и, В. ΑеЬе^8ο1б. Ι.Α. СгаеГ, С.В. СгаЫгее. Ап еккепшй 8\\йс11 1п киЬипй сοтрο8^ί^οη οί а сйготабп ^етοбе1^ηд оттр1ех бшгпд пеига1 беуеФртепк №игоп. 2007. 55: 201-215). Эти сигнальные пути играют большую роль в развитии организма, отвечают за правильную дифференцировку клеток и тканей. Как только нервная стволовая клетка начинает дифференцироваться, РНР10 в комплексе 8\νΐ/8Νί заменяется другой субъединицей. Экспрессия РНР10 полностью не прекращается, но в дифференцированных клетках значительно снижена. В большом количестве РНР10 содержится и в других пролиферирующих клетках, например в иммортализованных фибробластах человека. Выключение РНР10 с помощью РНК-интерференции приводило к уменьшению пролиферативной способности этих клеток, что доказывает важную функцию РНР10 в правильном росте клеток (8.8. Вапда, Ь. Репд, Т. Эа8дир1а, V. Ра1е_)теа1а, Н.Ь. Охег. РНР10 ίκ гецштеб Γογ се11 р^ο1^ίе^аί^οη ш 1югта1 апб 8V40-^ттο^ιа1^ζеб йитап ВЬгоЫак! се11к. СуГОдепебс апб дегюте гекеагсй. 2009. 126: 227-242). Также было показано, что изменение экспрессии РНР10 коррелирует с ростом опухолевых клеток рака желудка. В частности, уменьшение количества РНР10 приводило к апоптозу этих клеток ш νίίτο и ш νίνο. После выключения же РНР10 происходило повышение индукции каспазы-3, важнейшего модулятора апоптоза. РНР10 локализуется на промоторе каспазы-3 и ингибирует его, являясь репрессором экспрессии каспазы3 (М. Vе^. В. Ыи, 1. Ь1 е! а1. А ηονе1 р1ап! йοтеοбοта^η йпдег 10 -теб1а!еб аηΐ^арοрΐοΐ^с тесйашкт ίπνο1νшд гергеккюп οί сакраке-3 ш дак!г1с сапсег се11к. Мο1еси1а^ Сапсег таегареийск. 2010. 9:1764-1774).

РНР10 содержит два РНЭ-домена, которые также называются ассоциированными с лейкозом доменами.

Таким образом, изменение экспрессии РНР10 негативно влияет на нормальный рост клеток, а снижение количества РНР10 приводит к разбалансировке и нарушению нормального функционирования клеток. Это позволило авторам настоящего изобретения предположить, что изменение экспрессии РНР10 может служить диагностическим критерием состояния, при котором у пациента имеет место нарушение клеточного деления, в частности злокачественной опухоли, например меланомы.

- 3 019599

Раскрытие настоящего изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена РНР10 в клетках пациента, предусматривающему следующие стадии:

а) получение у пациента с подозрением на меланому образцов морфологически опухолевой и нормальной тканей;

б) выделение мРНК из клеток указанных образцов;

в) синтез кДНК на матрице указанной мРНК;

г) проведение количественной ПЦР на матрице полученной кДНК с использованием по меньшей мере двух пар праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одной пары контрольных праймеров;

д) интерпретация полученных данных об уровне экспрессии гена РНР10 в клетках пациента таким образом, что сниженный уровень экспрессии гена РНР10 в клетках образца морфологически опухолевой ткани по сравнению с таковым в клетках образца морфологически нормальной ткани свидетельствует о наличии у пациента меланомы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для диагностики меланомы человека, содержащему по меньшей мере две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одну пару контрольных праймеров и необязательно содержащему другие компоненты для проведения диагностики.

Другие компоненты для проведения диагностики меланомы человека, которые могут входить в состав набора, например, могут включать в себя отличные от праймеров реагенты, необходимые для проведения количественной ПЦР, такие как буфер для ПЦР, дезоксинуклеотидтрифосфаты, флуоресцентный краситель (например, 8ΥΒΚ-6ΚΕΕΝ х100) и полимераза Тад с горячим стартом.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения две пары праймеров, специфичных к гену РНЕ10, могут представлять собой РНЕ-1_£от, РНЕ-1_геу, РНЕ-2_£от и РНЕ-2_геу. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения пара контрольных праймеров может представлять собой НорМ_£от и НорМ_гсу.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведены кривые амплификации. При обработке результатов использовались данные достижения кривыми порогового значения, установленного на уровне 0,025. Проекция точки пересечения кривых с пунктиром на ось абсцисс в каждом случае соответствует значению е(1).

На фиг. 2 проиллюстрированы уровни экспрессии РНЕ10, измеренные методом количественной ПЦР на праймерах РНЕ-1. В качестве контроля использовали материал невусов и мышечной ткани. По оси ординат отложены значения уровней экспрессии РНЕ10 относительно уровня экспрессии нормировочного (контрольного) гена актина в процентах. Из фигуры наглядно видна разница между уровнями экспрессии РНЕ10 в клетках различных меланом, уровнями экспрессии в клетках доброкачественных невусов и уровнем экспрессии в клетках мышечной ткани.

На фиг. 3 проиллюстрированы уровни экспрессии РНЕ10, измеренные методом количественной ПЦР на праймерах РНЕ-2. В качестве контроля использовали материал невусов и мышечной ткани. По оси ординат отложены значения уровней экспрессии РНЕ10 относительно уровня экспрессии нормировочного (контрольного) гена актина в процентах. Из фигуры наглядно видна разница между уровнями экспрессии РНЕ10 в клетках различных меланом, уровнями экспрессии в клетках доброкачественных невусов и уровнем экспрессии в клетках мышечной ткани.

Описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения

Пример 1. Конструирование праймеров для амплификации методом количественной ПЦР.

Для определения уровня экспрессии гена человека РНЕ10 в нормальных и злокачественных клетках были сконструированы олигонуклеотидные последовательности для их последующего использования в амплификации методом количественной ПЦР.

Конструирование проводили с помощью программы Усе1ог ΝΤΙ Циуйгодеи, США).

В результате для дальнейшего анализа были выбраны пары праймеров, указанные в табл. 1.

Таблица 1

Название	Последовательность	Температура отжига
РНР-1_£ог	5’-ССОО<ЗААСССАТООААОАААО	63°С
ΡΗΡ-1_Γβν	5 ’ -САСС АТСАСТОТСТАОАОСАОСОАОС	63°С
рнг-2Дог	5 ’-ССАОССААОАСАО АААТСААААСАС	63°С
РНР-2_геу	5 ’-ССАТТОТСАТАТССАООСААОААОО	63°С
Норм_Гог	5 ’-<ЗСАСАТСАОА<ЗСАСгСОАТТААСС	63°С
Норм_геу	5 ’-СЮАОТОАТТТСАОССАССААОТС	63°С
Ро!уА	5’-ТТТТТТТТТГТТТТТТТТТТ

- 4 019599

Праймеры РНЕ-1 и РНЕ-2 отжигаются на разные фрагменты транскрипта РНЕ10: РНЕ-1 в районе 720, и длина продукта составляет 228 п.н.; РНЕ-2 в районе 1100, и длина продукта составляет 233 п.н. Для достоверной оценки количества РНЕ10 в тканях необходимо проводить ПЦР в режиме реального времени с обеих пар праймеров и результаты обсчитывать относительно нормировочных (контрольных) праймеров (НорМ_Гог, НорМ_геу) отдельно.

В качестве нормировочных (контрольных) были использованы праймеры к транскрипту гена ΕΝΥ2, экспрессия которого постоянна в разных типах клеток и тканей на разных стадиях развития и клеточного цикла.

Пример 2. Проведение амплификации методом количественной ПЦР.

Выделение мРНК из культур клеток меланомы, полученных от пациентов ΙΙΙ-ΐν стадий меланомы (примерно из 5 млн. клеток каждой линии: меланома 1Ь, меланома МЕ, меланома Р, меланома С, меланома КОВ) и тканей (объемом ~100 мкл мышечной ткани и невусов) производили по следующему протоколу. Образец ткани в керамической ступке заливали жидким азотом и растирали в порошок. Жидкий азот доливали и добавляли 10 объемов буфера СТВ. Полученную смесь заливали жидким азотом и растирали в порошок. Лизат переносили в пробирку и расплавляли. Добавляли 0,1 объема раствора ацетата натрия, рН 5,0 (3 М). Компоненты смешивали (и заодно раздробляли ДНК), несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19С иглу. К смеси добавляли 1 объем водонасыщенного фенола и перемешивали. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем добавляли 0,2 объема хлороформа и интенсивно перемешивали на вортексе (в течение 3-4 мин). Смесь центрифугировали при ~1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5-10 мин, а затем при >4000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин. Водную фазу переносили в пробирку, содержащую 1 объем водонасыщенного фенола, и перемешивали. Смесь центрифугировали при >4000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем смесь экстрагировали добавлением хлороформа. Добавляли 1 объем изопропанола, перемешивали и выдерживали при -20°С в течение 1 ч. Смесь центрифугировали при >4000 об/мин при 4°С в течение 10-20 мин. Осадок промывали 75%-ным этанолом, растворяли в не содержащей РНКаз Н₂О и хранили при -70°С.

Затем реакцию синтеза кДНК проводили с использованием выделенной мРНК каждой линии (~1 мкг/мкл). Смесь мРНК (1 мкг), праймера ро1уА 10 мМ (1 мкл) и воды (9 мкл) прогревали в течение 5 мин при 65°С, затем быстро охлаждали до 4°С и добавляли реакционную смесь (общий объем 20 мкл), содержащую 5х буфер М-Ми^ ВТ (4 мкл, ЕегшеШаб), ингибитор РНКаз В1ЬоЬоскВ№бе 1п1иЬбог (0,5 мкл, ЕегшеШаб), обратную транскриптазу ВеуейАгб М-Ми^ ВТ (1 мкл, ЕегтеШаз), 6ΝΊΒ 10 мМ (2 мкл), воду, не содержащую РНКаз (0,5 мкл). Синтез кДНК проводили на программируемом амплификаторе фирмы ЕррепбогГ в режиме: 42°С, 90 мин; затем 70°С, 10 мин.

Полученную кДНК (разведенную в 5 раз) использовали в качестве матрицы для определения уровня экспрессии РНЕ10 в линиях клеток методом количественной ПЦР. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала кДНК (3 мкл), 10 х буфер для ПЦР (Ти8С1, рН 8,6, КС1 0,5 М, МдС1₂ 15 мМ, Т\\ееп 20 1%) (3 мкл), бNТР 10 мМ (0,6 мкл), праймер_Гог 10 мкМ (0,9 мкл), праймер_геу 10 мкМ (0,9 мкл), флуоресцентный краситель 8ΥΒΒ-ΟΒΕΕΝ х100 (0,06 мкл), полимераза Тад Но!81ай (5 ед/мкл, Сибэнзим) (0,15 мкл), воду (21,4 мкл). Каждый образец амплифицировали в двух повторностях с двух пар праймеров для определения количества транскриптов РНЕ10 (РНЕ-1_Гог & РНЕ-1_геу, РНЕ-2_Гог & РНЕ-2_геу), используя нормировочные (контрольные) праймеры к (НорМ_Гог & НорМ_геу).

Реакцию проводили на программируемом амплификаторе фирмы Вю-Ваб для количественной ПЦР в следующем режиме: плавление 94°С, 2 мин; амплификация 50 циклов с шагами -94°С, 20 с; 63°С, 20 с; 70°С, 20с; считывание сигнала флуоресценции; заключительный синтез 70°С, 10 мин.

Данные повторностей усредняли и количество транскриптов вычисляли по следующей формуле: Количество транскриптов (%) = 2^<с^^Норм’^с(1)^р|,,7> х 100%, где с(!)НорМ - среднее значение достижения кривыми амлификации порогового цикла продукта с нормировочных (контрольных) праймеров;

с(!)РНЕ - среднее значение достижения кривыми амлификации порогового цикла РНЕ-1 или РНЕ-2.

Пороговый цикл был установлен на уровне 0,025. Полученные кривые амплификации приведены на фиг. 1.

Результаты анализа экспрессии РНЕ10 представлены на фиг. 2 и 3 и в табл. 2. В нормальной мышечной ткани экспрессия РНЕ10 находится на достаточно высоком уровне: для праймеров РНЕ-1 и РНЕ2 соответственно 93% и 55% относительно экспрессии нормировочного (контрольного) гена. Экспрессия РНЕ10 в невусах снижена примерно в два раза по сравнению с мышечной тканью. Экспрессия же РНЕ10 в клетках линий меланом снижена по сравнению с экспрессией в невусах в среднем в два-три раза, а по сравнению с мышечной тканью в 5-10 раз.

- 5 019599

Таблица 2

Название ткани	РНР-1	РНГ-2
Меланома Н,	10,29489	5,310531
Меланома МЕ	8,105247	4,02463
Меланома Р	15,33606	10,5477
Меланома КОК	8,362047	9,672281
Невус 1	46,65165	20,80497
Невус 2	35,97334	25,88162
Мышцы	93,62722	55,78654

Таким образом, анализ уровня экспрессии РНР10 возможно использовать в качестве одного из способов диагностики меланомы, а РНР10 - в качестве маркера.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН <120> СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РНЕ10, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР <160> 7 <210> 1 <211> 21 <212> 2ΝΑ <220> Праймер РНГ-1_£ог <400> 1 ссдддаасдсаЬддаадааад 21 <210> 2 <211> 26 <212> ϋΝΑ <220> Праймер ?НГ-1_ ге··.’ <400> 2 сассаисасидбсРададсадддадс 26 <210> 3 <211> 25 <212> ОМА <220> Праймер РНЕ-2_£ог <400> 3 ссадддаадасадаааисаааадас 25 <210> 4 <211> 25 <212> ОНА <220> Праймер РНЕ-2_г<эу <4 00> 4 ссаТРдисакаиссаддсаадаадд 25 <210> 5 <211> 23 <212> ЭМА <220> Праймер Норм_£ог <400> 5 дсадаОдададсадсдаЫзаасс 23 <210> 6 <211> 23 <212> 0ΝΑ <220> Праймер ΗορΜ_τβν

- 6 019599 <400> 6 ддад£да££6садссассаад£с 23 <210> 7 <211> 20 <212> ОКА <220> Праймер Ро1уА <400> 7 бб£бббб£бб6£б£б66б6б 20

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена РНР10 в клетках пациента, предусматривающий следующие стадии:

а) получение у пациента с подозрением на меланому образцов морфологически опухолевой и нормальной тканей;

б) выделение мРНК из клеток указанных образцов;

в) синтез кДНК на матрице указанной мРНК;

г) проведение количественной ПЦР на матрице полученной кДНК с использованием по меньшей мере двух пар праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одной пары контрольных праймеров;

д) интерпретация полученных данных об уровне экспрессии гена РНР10 в клетках пациента таким образом, что сниженный уровень экспрессии гена РНР10 в клетках образца морфологически опухолевой ткани по сравнению с таковым в клетках образца морфологически нормальной ткани свидетельствует о наличии у пациента меланомы.
2. Способ по п.1, в соответствии с которым две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, представляют собой РНР-1_Гог. РНР-1_геу, РНР-2_Гог и РНР-2_геу, которым соответствуют последовательности БЕЦ ГО N0: 1-4 соответственно.
3. Набор для диагностики меланомы человека по сниженному уровню экспрессии гена РНР10, выполняемой согласно способу по п.1, включающий по меньшей мере две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одну пару контрольных праймеров.
4. Набор по п.3, в котором две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, представляют собой РНР-1_Гог, РНР-1_геу, РНР-2_Гог и РНР-2_геу, которым соответствуют последовательности БЕЦ ГО N0: 1-4 соответственно.
5. Набор по п.3, который дополнительно содержит другие компоненты для проведения диагностики меланомы человека, такие как отличные от праймеров реагенты, необходимые для проведения количественной ПЦР, включающие буфер для ПЦР, дезоксинуклеотидтрифосфаты, флуоресцентный краситель (например, БУВК.-ΟΚΕΕΝ х100) и/или полимеразу Тад с горячим стартом.