EA018686B1 - Method for determining functional condition of biologic tissue and use of this method for determining viability and/or necrotization rate thereof - Google Patents
Method for determining functional condition of biologic tissue and use of this method for determining viability and/or necrotization rate thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA018686B1 EA018686B1 EA201200925A EA201200925A EA018686B1 EA 018686 B1 EA018686 B1 EA 018686B1 EA 201200925 A EA201200925 A EA 201200925A EA 201200925 A EA201200925 A EA 201200925A EA 018686 B1 EA018686 B1 EA 018686B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sample
- intensity
- aeration
- tissue
- medium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области медицины, биологии, фармакологии, токсикологии и может быть использовано для определения функционального состояния биологической ткани, в частности для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации.The invention relates to the field of medicine, biology, pharmacology, toxicology and can be used to determine the functional state of biological tissue, in particular to determine its viability and / or degree of necrotization.
Предшествующий уровеь техникиBACKGROUND OF THE INVENTION
До настоящего времени ни один из методов определения жизнеспособности биологических тканей не нашел широкого применения в практике. Главными причинами этого являются недостаточная точность существующих методов, дороговизна используемого оборудования, косвенный характер получаемых результатов, а также длительность исследований.To date, none of the methods for determining the viability of biological tissues has not been widely used in practice. The main reasons for this are the lack of accuracy of existing methods, the high cost of the equipment used, the indirect nature of the results, as well as the duration of the research.
В хирургической практике основным способом определения жизнеспособности органов и тканей является визуальная оценка по цвету, консистенции, кровенаполнению и другим параметрам. В частности, известен способ определения жизнеспособности кишки, основанный на визуальной оценке цвета серозной оболочки, пульсации брыжеечных сосудов и перистальтики кишечной петли (патент РФ № 2043750).In surgical practice, the main way to determine the viability of organs and tissues is a visual assessment of color, texture, blood filling and other parameters. In particular, a known method for determining intestinal viability, based on a visual assessment of the color of the serous membrane, pulsation of the mesenteric vessels and intestinal loop motility (RF patent No. 2043750).
В последнее время появляются способы определения жизнеспособности, основанные на изменении физико-химических свойств биологических ткани. Известны способы определения жизнеспособности нервной и мышечной ткани посредством измерения межэлектродного электрического сопротивления (импеданса), изменяющегося при повреждении ткани (патенты РФ № 2103914 и 2161307 соответственно).Recently, methods for determining viability have been emerging based on changes in the physicochemical properties of biological tissues. Known methods for determining the viability of nervous and muscle tissue by measuring interelectrode electrical resistance (impedance), which changes with tissue damage (RF patents No. 2103914 and 2161307, respectively).
Известен способ определения жизнеспособности тканей сердца посредством измерения индуцированной лазерным излучением флюоресценции, который позволяет оценить снижение содержания флюоресцирующих веществ при повреждении ткани (патент РФ № 2181486).A known method for determining the viability of heart tissue by measuring laser-induced fluorescence, which allows to evaluate the decrease in the content of fluorescent substances in case of tissue damage (RF patent No. 2181486).
Существующие способы определения жизнеспособности биологических тканей основаны на выявлении изменений в клеточной структуре или в химическом составе тканей. Однако такие изменения всегда являются следствием функциональных нарушений, т.е. являются вторичными. Снижение жизнеспособности биологической ткани начинается с нарушения функций клеток, но при этом еще не происходит нарушения структуры и состава ткани. Невысокая точность существующих способов связана с тем, что они не позволяют определить начальные этапы функциональных нарушений и снижения жизнеспособности ткани.Existing methods for determining the viability of biological tissues are based on the detection of changes in the cellular structure or in the chemical composition of tissues. However, such changes are always the result of functional disorders, i.e. are secondary. Reducing the viability of biological tissue begins with a violation of the functions of cells, but at the same time there is no violation of the structure and composition of the tissue. The low accuracy of existing methods is due to the fact that they do not allow to determine the initial stages of functional disorders and reduce tissue viability.
Целью настоящего изобретения является преодоление вышеописанных недостатков известных способов и повышение точности определения сохранности биологических тканей.The aim of the present invention is to overcome the above disadvantages of the known methods and increase the accuracy of determining the safety of biological tissues.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Задача изобретения состоит в создании экспрессного и несложного в реализации способа определения функционального состояния биологической ткани, свободного от влияния субъективных факторов.The objective of the invention is to create an express and easy to implement method for determining the functional state of biological tissue, free from the influence of subjective factors.
Технический результат состоит в повышении точности определения функционального состояния тканей.The technical result consists in increasing the accuracy of determining the functional state of tissues.
Поставленная задача решена благодаря тому, что в способе определения функционального состояния биологической ткани согласно настоящему изобретению образец упомянутой ткани инкубируют при физиологически приемлемых условиях в среде, содержащей активатор хемилюминесценции, аэрируют среду с упомянутым образцом кислородсодержащей газовой смесью с разной интенсивностью, упомянутый образец фотометрируют, а функциональное состояние биологической ткани определяют по изменению интенсивности свечения при разной интенсивности аэрации.The problem is solved due to the fact that in the method for determining the functional state of a biological tissue according to the present invention, a sample of said tissue is incubated under physiologically acceptable conditions in a medium containing a chemiluminescence activator, the medium with said sample is oxygenated with a gas mixture of different intensities, the said sample is photometric, and the functional the state of biological tissue is determined by the change in the intensity of the glow at different intensities of aeration.
Как будет понятно среднему специалисту в данной области техники, повышение точности измерений в способе по изобретению по сравнению с аналогами обеспечивается главным образом благодаря тому, что вместо широко применяющихся косвенных показателей функционального состояния тканей и клеток предлагаемый способ направлен на измерение показателей активности процессов утилизации клетками кислорода, которые являются наиболее достоверными индикаторами их состояния.As it will be clear to the average person skilled in the art, increasing the accuracy of the measurements in the method according to the invention compared to analogs is mainly due to the fact that instead of widely used indirect indicators of the functional state of tissues and cells, the proposed method is aimed at measuring the activity indicators of the utilization of oxygen by cells which are the most reliable indicators of their condition.
В одном из частных вариантов осуществления среду с упомянутым образцом аэрируют с постоянной интенсивностью, затем на предварительно заданный период времени (анаэробный период) полностью прекращают аэрацию, после чего возобновляют аэрацию с прежней интенсивностью.In one particular embodiment, the medium with said sample is aerated at a constant intensity, then aeration is completely stopped for a predetermined period of time (anaerobic period), and then aeration is resumed with the same intensity.
В еще одном частном варианте осуществления среду с упомянутым образцом аэрируют с постоянной интенсивностью, затем на предварительно заданный период времени (анаэробный период) уменьшают интенсивность аэрации, после чего возобновляют аэрацию с прежней интенсивностью. О функциональной активности клеток в исследуемом образце ткани судят по изменению интенсивности свечения образца в анаэробном периоде (утилизация кислорода живыми клетками в анаэробном периоде резко уменьшается, чему соответствует провал на фотометрической кривой).In yet another particular embodiment, the medium with said sample is aerated with constant intensity, then the aeration intensity is reduced for a predetermined period of time (anaerobic period), and then aeration is resumed with the same intensity. The functional activity of cells in the test tissue sample is judged by the change in the intensity of the luminescence of the sample in the anaerobic period (oxygen utilization by living cells in the anaerobic period decreases sharply, which corresponds to a dip in the photometric curve).
В другом частном варианте осуществления среду с упомянутым образцом аэрируют с постоянной интенсивностью, затем на предварительно заданный период времени (анаэробный период) уменьшают интенсивность аэрации, после чего возобновляют аэрацию с прежней интенсивностью и вновь повторяют описанную операцию по меньшей мере один раз с уменьшением интенсивности аэрации в анаэробном периоде на предварительно заданную величину при каждом повторе.In another particular embodiment, the medium with the aforementioned sample is aerated with constant intensity, then the aeration intensity is reduced for a predetermined period of time (anaerobic period), then the aeration is resumed with the same intensity and the described operation is repeated at least once with a decrease in the aeration intensity in anaerobic period by a predetermined amount at each repetition.
В предпочтительном варианте осуществления вышеописанную операцию (процедуру) повторяют,In a preferred embodiment, the above operation (procedure) is repeated,
- 1 018686 по существу, до тех пор, пока сохраняется влияние аэрации на интенсивность свечения упомянутого образца (до полной гибели тканей).- 1 018686 essentially, as long as the influence of aeration on the intensity of the luminescence of the said sample remains (until the tissue is completely dead).
В соответствии со способом по изобретению аэрацию предпочтительно осуществляют воздухом, смесью кислорода и инертного газа или смесью кислорода, инертного газа и 1-5 об.% диоксида углерода.According to the method of the invention, aeration is preferably carried out with air, a mixture of oxygen and an inert gas, or a mixture of oxygen, an inert gas and 1-5 vol.% Carbon dioxide.
В качестве активатора хемилюминесценции предпочтительно используют вещество с высокой специфичностью к супероксидным радикалам, хорошо проникающее через клеточные мембраны и избирательно накапливающееся в областях с отрицательным электрическим зарядом.As a chemiluminescence activator, a substance with a high specificity for superoxide radicals is used that penetrates well through cell membranes and selectively accumulates in areas with a negative electric charge.
В одном из наиболее предпочтительных вариантов активатор хемилюминесценции представляет собой люцигенин.In one of the most preferred embodiments, the chemiluminescence activator is lucigenin.
В предпочтительном варианте осуществления, в качестве образца сравнения используют среду, содержащую активатор хемилюминесценции без образца ткани.In a preferred embodiment, a medium containing a chemiluminescence activator without a tissue sample is used as a reference sample.
В еще более предпочтительном варианте осуществления в качестве образца сравнения используют среду, содержащую активатор хемилюминесценции с образцом полностью некротизированной ткани.In an even more preferred embodiment, a medium containing a chemiluminescence activator with a fully necrotic tissue sample is used as a reference sample.
Фотометрию в соответствии со способом по изобретению могут осуществлять посредством фотометра, флуориметра, спектрофотометра, спектрофлуориметра или хемилюминометра.Photometry in accordance with the method according to the invention can be carried out by means of a photometer, fluorimeter, spectrophotometer, spectrofluorimeter or chemiluminometer.
Для исключения влияния температурных колебаний на интенсивность свечения при осуществлении фотометрии среду с образцом желательно термостатировать.To exclude the influence of temperature fluctuations on the luminous intensity during photometry, it is desirable to thermostat the medium with the sample.
Вышеупомянутый технический результат достигается при использовании вышеописанного способа для определения жизнеспособности тканей, когда осуществляют фотометрию образца интактной и частично некротизированной ткани, а если разность скоростей убывания интенсивности свечения упомянутых образцов в анаэробные периоды превышает предварительно заданную величину, образец частично некротизированной ткани считают нежизнеспособным.The aforementioned technical result is achieved by using the above-described method for determining tissue viability, when a sample of intact and partially necrotic tissue is photographed, and if the difference in the rate of decrease in the luminescence intensity of said samples during anaerobic periods exceeds a predetermined value, the sample of partially necrotic tissue is considered non-viable.
Вышеупомянутый технический результат также достигается при использовании вышеописанного способа для определения степени некротизации тканей, когда осуществляют фотометрию образца интактной и частично некротизированной ткани, а разность скоростей убывания интенсивности свечения упомянутых образцов в анаэробные периоды используют в качестве показателя степени некротизации образца частично некротизированной ткани.The aforementioned technical result is also achieved by using the method described above to determine the degree of tissue necrotization, when a sample of intact and partially necrotic tissue is photographed, and the difference in the rates of decrease in the luminescence intensity of the mentioned samples in anaerobic periods is used as an indicator of the degree of necrotization of the partially necrotic tissue sample.
Предлагаемый способ может быть использован для оценки жизнеспособности органов и тканей при хирургических операциях и трансплантациях, а также для оценки влияния различных факторов (фармакологических, токсических и др.) на функциональное состояние клеточных структур.The proposed method can be used to assess the viability of organs and tissues during surgical operations and transplantations, as well as to assess the influence of various factors (pharmacological, toxic, etc.) on the functional state of cell structures.
Перечень фигурList of figures
На фиг. 1 представлена схема осуществления способа, где (1) - исследуемый материал, (2) - среда инкубации, (3) - трубка для подачи воздуха, (4) - фоточувствительный элемент; на фиг. 2 показано влияние аэрации на интенсивность (I) свечения исследуемого материала; стрелками указаны моменты изменения интенсивности аэрации, цифрами указаны значения интенсивности аэрации (грт); на фиг. 3 показано влияние ингибитора дыхательной цепи митохондрий на интенсивность (I) свечения исследуемого материала, где (1) - инкубация без ингибитора, (2) - инкубация с ингибитором; на фиг. 4 показано влияние длительности анаэробной инкубации исследуемого материала на интеграл интенсивности свечения (8).In FIG. 1 is a diagram of the method, where (1) is the test material, (2) is the incubation medium, (3) is an air supply tube, (4) is a photosensitive element; in FIG. 2 shows the effect of aeration on the intensity (I) of the luminescence of the test material; the arrows indicate the moments of change in the intensity of aeration, the numbers indicate the values of the intensity of aeration (grt); in FIG. Figure 3 shows the effect of a mitochondrial respiratory chain inhibitor on the intensity (I) of the luminescence of the test material, where (1) is incubation without an inhibitor, (2) is incubation with an inhibitor; in FIG. Figure 4 shows the effect of the duration of anaerobic incubation of the test material on the integral of the glow intensity (8).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления избретенияInformation confirming the possibility of making an election
Как описано выше, предлагаемый способ определения функционального состояния и жизнеспособности биологической ткани заключается в регистрации свечения исследуемого материала при его инкубации в физиологической среде, содержащей активатор хемилюминесценции, при аэрации этой среды кислородсодержащей газовой смесью.As described above, the proposed method for determining the functional state and viability of biological tissue consists in registering the luminescence of the test material when it is incubated in a physiological medium containing a chemiluminescence activator during aeration of this medium with an oxygen-containing gas mixture.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Выполняют забор материала. В качестве исследуемого материала могут быть использованы биоптаты (кусочки) тканей и органов, полученные хирургическим путем, участки трансплантируемых органов, культивируемые клеточные культуры и др. Затем, как показано на фиг. 1, исследуемый материал в физиологически приемлемых условиях инкубируют в среде, содержащей активатор хемилюминесценции, т.е. вещество, излучающее квант электромагнитного излучения при взаимодействии со свободными радикалами и обладающее высоким квантовым выходом. Наибольшей информативностью обладают результаты, полученные с высокоспецифичными к супероксидным радикалам активаторами, легко проникающими через клеточные мембраны и преимущественно накапливающимися в областях с отрицательным электрическим зарядом. В качестве одного из таких активаторов может быть использован люцигенин (нитрат бис-Ы-метилакридиния). Среду с образцом аэрируют кислородсодержащей газовой смесью. Для этого в среду погружают трубку, через которую подают воздух или другую кислородсодержащую газовую смесь от насоса или любого другого подобного устройства. При этом избегают прямого контакта исследуемого образца с пузырьками воздуха на конце трубки. Стараются добиться умеренной интенсивности аэрации и обеспечить постоянный уровень насыщения среды инкубации кислородом. Фотометрию образца осуществляют с помощью фотоприемного устройства при постоянной аэрации. В качестве аналитического параметра могут использовать интенсивность свечения и/или интеграл интенсивности свечения (светосумму).Perform material sampling. As a test material, biopsy samples (pieces) of tissues and organs obtained by surgery, sections of transplanted organs, cultured cell cultures, etc. can be used. Then, as shown in FIG. 1, the studied material is incubated under physiologically acceptable conditions in a medium containing a chemiluminescence activator, i.e. a substance that emits a quantum of electromagnetic radiation in the interaction with free radicals and has a high quantum yield. The most informative are the results obtained with activators highly specific to superoxide radicals, which easily penetrate cell membranes and predominantly accumulate in areas with a negative electric charge. As one of these activators can be used lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate). The medium with the sample is aerated with an oxygen-containing gas mixture. To do this, a tube is immersed in the medium through which air or another oxygen-containing gas mixture is supplied from a pump or any other similar device. This avoids direct contact of the test sample with air bubbles at the end of the tube. They try to achieve moderate aeration intensity and ensure a constant level of saturation of the incubation medium with oxygen. Photometry of the sample is carried out using a photodetector with constant aeration. As an analytical parameter, the luminosity intensity and / or the luminescence intensity integral (light sum) can be used.
- 2 018686- 2 018686
Вышеописанный способ основан на регистрации хемилюминесценции, вызванной химическими реакциями свободных радикалов, образующихся в митохондриях живых клеток. Как известно, митохондрии представляют собой специализированные органеллы, выполняющие функцию преобразования энергии химических связей различных субстратов в энергию фосфодиэфирной связи АТФ при их окислении кислородом. Поскольку нарушение работы митохондрий приводит к быстрой гибели клеток, их функционирование является надежным показателем жизнеспособности ткани в целом.The above method is based on the registration of chemiluminescence caused by chemical reactions of free radicals formed in the mitochondria of living cells. As is known, mitochondria are specialized organelles that perform the function of converting the energy of chemical bonds of various substrates into the phosphodiester bond energy of ATP during their oxidation with oxygen. Since disruption of the mitochondria leads to rapid cell death, their functioning is a reliable indicator of the viability of the tissue as a whole.
Окисление различных химических субстратов, локализованное на внутренней мембране митохондрии, сопровождается переносом электронов. В процессе окислительного фосфорилирования часть электронов выходит из дыхательной цепи и вместе с молекулярным кислородом образует супероксид анионрадикалы (САР). Появление свободных радикалов, в том числе САР, можно детектировать с помощью светочувствительной аппаратуры, так как часть энергии неспаренных электронов в свободных радикалах растрачивается на излучение кванта света. Таким образом, функциональное состояние клеток и тканей можно определять по уровню свечения, связанного с генерацией свободных радикалов в митохондриях.The oxidation of various chemical substrates localized on the inner mitochondrial membrane is accompanied by electron transfer. In the process of oxidative phosphorylation, some of the electrons exit the respiratory chain and, together with molecular oxygen, form superoxide anion radicals (ATS). The appearance of free radicals, including ATS, can be detected using photosensitive equipment, since part of the energy of unpaired electrons in free radicals is wasted on the emission of a quantum of light. Thus, the functional state of cells and tissues can be determined by the level of luminescence associated with the generation of free radicals in mitochondria.
Однако образование свободных радикалов происходит не только в митохондриях, но и в других частях клетки, а также во внеклеточном пространстве. Свободные радикалы могут образовываться в реакциях с участием пероксида водорода и оксида азота (II) и при окислении липидов клеточных мембран. Фагоцитарные клетки также способны генерировать свободные радикалы для нейтрализации чужеродных объектов. Определение уровня САР непосредственно в митохондриях осложняется разнообразием форм и источников свободных радикалов в живой ткани.However, the formation of free radicals occurs not only in the mitochondria, but also in other parts of the cell, as well as in the extracellular space. Free radicals can form in reactions involving hydrogen peroxide and nitric oxide (II) and in the oxidation of lipids in cell membranes. Phagocytic cells are also able to generate free radicals to neutralize foreign objects. Determining the level of ATS directly in mitochondria is complicated by a variety of forms and sources of free radicals in living tissue.
Для направленного определения интенсивности образования свободных радикалов внутри клетки или в отдельных компартментах клетки в способе по изобретению предлагается использовать активаторы хемилюминесценции. Активаторы хемилюминесценции усиливают интенсивность свечения при взаимодействии со свободными радикалами. При этом предпочтительно, когда активатор удовлетворяет следующим требованиям: во-первых, обладает хорошей проницаемостью через клеточные мембраны, чтобы проникать в клетку и в митохондрии; во-вторых, обладает преимущественным накоплением в области с отрицательным электрическим зарядом, т.е. на внутренней мембране митохондрий; в-третьих, обладает высокой специфичностью к САР, чтобы усиливать свечение, связанное с генерацией именно этих радикалов. Всем этим требованиям удовлетворяет, в частности, нитрат бис-И-метилакридиния (люцигенин). Люцигенин избирательно усиливает свечение, связанное с генерацией САР в функциональных митохондриях.For the directed determination of the intensity of formation of free radicals inside the cell or in individual cell compartments, the method of the invention proposes the use of chemiluminescence activators. Chemiluminescence activators enhance the luminosity when interacting with free radicals. Moreover, it is preferable when the activator satisfies the following requirements: firstly, it has good permeability through cell membranes in order to penetrate into the cell and into mitochondria; secondly, it has predominant accumulation in a region with a negative electric charge, i.e. on the inner mitochondrial membrane; thirdly, it has high specificity for SAR in order to enhance the glow associated with the generation of precisely these radicals. In particular, bis-I-methylacridinium nitrate (lucigenin) satisfies all these requirements. Lucigenin selectively enhances the luminescence associated with the generation of ATS in functional mitochondria.
Для нормального функционирования клеток при осуществлении предлагаемого способа обеспечивают физиологические условия среды инкубации. К этим физиологическим условиям относится состав среды, обеспечивающий жизнедеятельность клеток, и физические факторы, такие как температура и давление. Кроме того, для поддержания функционального состояния ткани при осуществлении способа обеспечивают постоянный уровень содержания кислорода в среде инкубации. Живые клетки являются активным потребителем кислорода, так как процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях протекает только при постоянном поступлении кислорода в клетки. При извлечении участков ткани из живого организма поступление кислорода в ткань прекращается и наступает состояние гипоксии, характеризующееся остановкой процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях. При помещении извлеченного участка ткани в среду инкубации процесс окислительного фосфорилирования кратковременно возобновляется за счет потребления растворенного в среде инкубации кислорода. Для обеспечения полноценного функционирования биологической ткани необходимо поддерживать постоянный уровень содержания кислорода в среде инкубации путем аэрации воздухом или кислородсодержащей газовой смесью.For the normal functioning of the cells in the implementation of the proposed method provide physiological conditions of the incubation medium. These physiological conditions include the composition of the environment, which ensures the vital activity of cells, and physical factors, such as temperature and pressure. In addition, to maintain the functional state of the tissue during the implementation of the method provide a constant level of oxygen content in the incubation medium. Living cells are an active consumer of oxygen, since the process of oxidative phosphorylation in mitochondria proceeds only with a constant supply of oxygen to the cells. When tissue sites are removed from a living organism, the flow of oxygen to the tissue stops and a state of hypoxia occurs, characterized by a halt in the process of oxidative phosphorylation in mitochondria. When the extracted tissue site is placed in the incubation medium, the oxidative phosphorylation process is briefly resumed due to the consumption of oxygen dissolved in the incubation medium. To ensure the full functioning of biological tissue, it is necessary to maintain a constant level of oxygen in the incubation medium by aeration with air or an oxygen-containing gas mixture.
Пример 1. Определение прогностической способности способа по изобретению.Example 1. Determination of the prognostic ability of the method according to the invention.
Для определения прогностической способности способа по изобретению изучают свечение кусочков биологической ткани при инкубации в физиологической среде с активатором хемилюминесценции люцигенином и аэрации этой среды воздухом. Схема проведения исследований показана на фиг. 1. В качестве исследуемого материала (1) используют кусочки печени и срезы мозга лабораторных мышей. Исследуемый материал сразу после выделения из организма животного помещают в кювету со средой инкубации (2), включающей раствор Хенкса с глюкозой (для кусочков печени) или раствор КребсаРингера (для срезов мозга), а также активатор хемилюминесценции люцигенин в концентрации 60 мкМ. Емкости со средой и образцами термостатируют при температуре 37°С. Для осуществления постоянной аэрации среды инкубации в кювету опускают тонкую трубку (3), через которую подают воздух с помощью перистальтического насоса. Свечение исследуемого материала регистрируют посредством хемилюминометра (4).To determine the prognostic ability of the method according to the invention, the luminescence of pieces of biological tissue is studied during incubation in a physiological medium with an activator of chemiluminescence lucigenin and aeration of this medium with air. The research scheme is shown in FIG. 1. As the test material (1) using pieces of the liver and brain sections of laboratory mice. The test material immediately after isolation from the body of the animal is placed in a cuvette with an incubation medium (2), including Hanks solution with glucose (for pieces of the liver) or Krebs-Ringer solution (for brain sections), as well as an activator of chemiluminescence lucigenin at a concentration of 60 μM. Tanks with medium and samples are thermostated at a temperature of 37 ° C. To achieve continuous aeration of the incubation medium, a thin tube (3) is lowered into the cuvette, through which air is supplied using a peristaltic pump. The luminescence of the test material is recorded by means of a chemiluminometer (4).
Как показано на фиг. 2, аэрация среды инкубации приводит к появлению интенсивного свечения исследуемого материала. Через 10-15 мин после начала аэрации интенсивность свечения выходит на максимальный уровень. Постепенный рост интенсивности свечения в начале инкубации связан с проникновением активатора хемилюминесценции в клетки и в митохондрии. В дальнейшем при прекращении аэрации интенсивность свечения стремительно падает до начального фонового уровня, а при возобновлении аэрации интенсивность свечения также стремительно возрастает до прежних значений. ТакимAs shown in FIG. 2, aeration of the incubation medium leads to the appearance of an intense glow of the studied material. 10-15 minutes after the start of aeration, the luminous intensity reaches its maximum level. A gradual increase in the intensity of luminescence at the beginning of incubation is associated with the penetration of the chemiluminescence activator into cells and into mitochondria. Subsequently, when the aeration is stopped, the luminous intensity rapidly decreases to the initial background level, and when the aeration is resumed, the luminous intensity also rapidly increases to the previous values. So
- 3 018686 образом, свечение биологической ткани возможно только в присутствии кислорода и требует постоянной аэрации среды инкубации. Однако увеличение интенсивности аэрации в 4 раза (окружную частоту вращения ротора перистальтического насоса увеличивают с 5 до 20 грт) приводит к незначительному увеличению интенсивности свечения на 20-30%. Это связано с тем, что интенсивность свечения в большей степени зависит от скорости потребления кислорода биологической тканью, чем от абсолютного содержания кислорода в среде инкубации.- 3 018686 thus, the glow of biological tissue is possible only in the presence of oxygen and requires constant aeration of the incubation medium. However, a 4-fold increase in the intensity of aeration (the peripheral rotational speed of the rotor of the peristaltic pump is increased from 5 to 20 gig) leads to a slight increase in the intensity of the glow by 20-30%. This is due to the fact that the luminescence intensity is more dependent on the rate of oxygen consumption by the biological tissue than on the absolute oxygen content in the incubation medium.
Пример 2.Example 2
Для выявления вклада митохондрий в кислородзависимое свечение биологической ткани проводят эксперименты по методике примера 1 с использованием ингибиторов дыхательной цепи митохондрий, в частности 2,4-динитрофенола и ротенона.To identify the contribution of mitochondria to the oxygen-dependent glow of biological tissue, experiments are carried out according to the procedure of Example 1 using mitochondrial respiratory chain inhibitors, in particular 2,4-dinitrophenol and rotenone.
Как показано на фиг. 3, ингибиторы дыхательной цепи митохондрий подавляют интенсивность свечения на 80% и более. Таким образом, кислородзависимое свечение биологической ткани определяется функциональным состоянием митохондрий.As shown in FIG. 3, mitochondrial respiratory chain inhibitors suppress luminosity by 80% or more. Thus, the oxygen-dependent glow of biological tissue is determined by the functional state of mitochondria.
Пример 3.Example 3
Для определения жизнеспособности биологической ткани изучают влияние длительности предварительной инкубации в бескислородных (анаэробных) условиях на светосумму, т.е. интеграл интенсивности свечения.To determine the viability of biological tissue, the effect of the duration of preliminary incubation in anoxic (anaerobic) conditions on the light sum is studied, i.e. luminescence intensity integral.
Как показано на фиг. 4, светосумма свечения снижается пропорционально длительности анаэробной инкубации. Снижение светосуммы при анаэробной инкубации связано с нарушением функций митохондрий и снижением жизнеспособности биологической ткани, вызванных длительным отсутствием кислорода.As shown in FIG. 4, the light sum of the glow decreases in proportion to the duration of the anaerobic incubation. The decrease in light sum during anaerobic incubation is associated with impaired mitochondrial function and a decrease in the viability of biological tissue caused by a prolonged lack of oxygen.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет достоверно определить функциональное состояние митохондрий клеток, активность которых является надежным показателем их (клеток) жизнеспособности. Предлагаемый способ позволяет быстро определять функциональное состояние биологической ткани, не требует применения сложных методов химического и морфологического анализа.Thus, the proposed method allows to reliably determine the functional state of the mitochondria of cells, the activity of which is a reliable indicator of their (cells) viability. The proposed method allows you to quickly determine the functional state of biological tissue, does not require the use of complex methods of chemical and morphological analysis.
Claims (14)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201200925A EA201200925A1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | METHOD FOR DETERMINING THE FUNCTIONAL STATE OF BIOLOGICAL TISSUE AND THE APPLICATION OF THIS METHOD TO DETERMINE ITS VIABILITY AND / OR EXTENT OF NECROTIZATION |
| PCT/RU2013/000532 WO2014007676A2 (en) | 2012-07-04 | 2013-06-24 | Method for determining the functional status of biological tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201200925A EA201200925A1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | METHOD FOR DETERMINING THE FUNCTIONAL STATE OF BIOLOGICAL TISSUE AND THE APPLICATION OF THIS METHOD TO DETERMINE ITS VIABILITY AND / OR EXTENT OF NECROTIZATION |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA018686B1 true EA018686B1 (en) | 2013-09-30 |
| EA201200925A1 EA201200925A1 (en) | 2013-09-30 |
Family
ID=49232860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201200925A EA201200925A1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | METHOD FOR DETERMINING THE FUNCTIONAL STATE OF BIOLOGICAL TISSUE AND THE APPLICATION OF THIS METHOD TO DETERMINE ITS VIABILITY AND / OR EXTENT OF NECROTIZATION |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA201200925A1 (en) |
| WO (1) | WO2014007676A2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2662997C2 (en) * | 2016-11-22 | 2018-07-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Method for rapid evaluation of viability of cells in tissue engineering structures |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA028733B1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-12-29 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Method of determination of binding parameters of fluorescent drug compounds by walls of blood vessels ex vivo and device for implementation thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2289138C2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-12-10 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Method for allergodiagnostics by the values of chemiluminescent phosphorescence of neutrophils |
| RU2389020C2 (en) * | 2008-07-14 | 2010-05-10 | Министерство Сельского Хозяйства И Продовольствия Омской Области | Method of life-time exclusion of tuberculosis |
| US20100221767A1 (en) * | 2008-10-16 | 2010-09-02 | Morris Frank Manolson | Diagnostic method and prognostic tool for osteoarthritis |
| RU2408019C1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) | Instant severity diagnosis of ischemic heart damage in patient with chronic heart disease and propensity for progressing atherosclerosis |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6587701B1 (en) * | 1997-04-03 | 2003-07-01 | Miroslaw F. Stranc | Method of assessing tissue viability using near-infrared spectroscopy |
| RU2181486C2 (en) * | 1999-12-02 | 2002-04-20 | Научно-исследовательский институт патологии кровообращения | Method for determining heart tissues viability |
| US7657293B2 (en) * | 2005-09-08 | 2010-02-02 | Vioptix Inc. | Method for monitoring viability of tissue flaps |
| RU2354294C1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА) | Method of lower limb tissue analysis for viability in diabetic gangrene |
-
2012
- 2012-07-04 EA EA201200925A patent/EA201200925A1/en not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-24 WO PCT/RU2013/000532 patent/WO2014007676A2/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2289138C2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-12-10 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Method for allergodiagnostics by the values of chemiluminescent phosphorescence of neutrophils |
| RU2389020C2 (en) * | 2008-07-14 | 2010-05-10 | Министерство Сельского Хозяйства И Продовольствия Омской Области | Method of life-time exclusion of tuberculosis |
| US20100221767A1 (en) * | 2008-10-16 | 2010-09-02 | Morris Frank Manolson | Diagnostic method and prognostic tool for osteoarthritis |
| RU2408019C1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) | Instant severity diagnosis of ischemic heart damage in patient with chronic heart disease and propensity for progressing atherosclerosis |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Владимиров Ю.А. и др. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. Успехи биологической химии, т. 49, 2009, с. 364-372, 376 * |
| Матвеева Н.С. и др. Активированная люцегенином хемилюминесценция тканей животных. БИОФИЗИКА, 2007, том 52, вып.6, с. 1120-1127, реферат, с. 1122-1123, рис. 1 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2662997C2 (en) * | 2016-11-22 | 2018-07-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Method for rapid evaluation of viability of cells in tissue engineering structures |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014007676A2 (en) | 2014-01-09 |
| WO2014007676A3 (en) | 2014-02-27 |
| EA201200925A1 (en) | 2013-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peng et al. | A novel SERS nanoprobe for the ratiometric imaging of hydrogen peroxide in living cells | |
| US10750985B2 (en) | Continuous analyte sensor | |
| JP6868774B2 (en) | Biosensor system using UV-LED light source | |
| US10281451B2 (en) | Method of determining the viability of at least one cell | |
| JPS6287135A (en) | Implantable gas-containing biosensor and measurement of substance to be analyzed such as glucose | |
| CN103805170A (en) | Specific fluorescent probe for identifying hydrogen sulfide and application of probe | |
| CN112432981A (en) | Single-cell electrochemical sensor based on functionalized nanoprobe and application thereof | |
| CN109054824A (en) | Specific recognition Cr6+With the preparation method and applications of ascorbic fluorescent carbon point | |
| CN110243794A (en) | A kind of fluorescence probe for detecting sulfur dioxide and its application based on graphene quantum dot | |
| Peniche Silva et al. | A new non-invasive technique for measuring 3D-oxygen gradients in wells during mammalian cell culture | |
| EA018686B1 (en) | Method for determining functional condition of biologic tissue and use of this method for determining viability and/or necrotization rate thereof | |
| Lindahl | Contributions to the physiology of form generation in the development of the sea urchin | |
| Lloyd et al. | Avoid excessive oxygen levels in experiments with organisms, tissues and cells | |
| Hu et al. | In situ electrochemical monitoring of reactive oxygen and nitrogen species released by single MG63 osteosarcoma cell submitted to a mechanical stress | |
| CN114478513B (en) | Glutathione fluorescent probe and application thereof | |
| Ghebremariam et al. | Characterization of a fluorescent probe for imaging nitric oxide | |
| CN106872430B (en) | Cysteine fluorescence analysis method | |
| CN104316582A (en) | Working electrode biological reactant and application and electrode-type test strip thereof | |
| RU2662997C2 (en) | Method for rapid evaluation of viability of cells in tissue engineering structures | |
| JP2015084757A (en) | Method for evaluating activity of neutrophil cell | |
| CN113416540A (en) | Carbon dots applied to reagent for detecting drug-induced deafness and preparation method thereof | |
| CN106153664B (en) | A kind of method, test solution and method for preparing test solution for detecting marine polysaccharide antioxidation | |
| CN109705110A (en) | A kind of high specific detects fluorescence probe and the application of GSH | |
| Potter et al. | Monitoring of Extracellular and Intracellular O2 on a Time-resolved Fluorescence Plate Reader | |
| Sud et al. | Measurement of intracellular oxygen levels using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |