EA017730B1

EA017730B1 - Enterococcus and streptococcus strains, producing bacteriocins, and methods of using bacteriocins and strains

Info

Publication number: EA017730B1
Application number: EA200801995A
Authority: EA
Inventors: Норман Стерн; Джон Лайн; Эдуард Светоч; Борис Ерусланов; Владимир Перелыгин; Евгений Мицевич; Ирина Мицевич; Владимир Левчук
Original assignee: Де Юнайтед Стэйтс Оф Америка Эз Репрезентид Бай Де Секретэри Оф Агрикалчэ; Государственный Научный Центр Прикладной Микробиологии И Биотехнологии
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2006-04-19
Publication date: 2013-02-28
Also published as: EP2032150A4; WO2007120151A1; EA200801995A1; CN101426515B; AU2006342396B2; AP2409A; CA2649847A1; EP2032150A1; CN101426515A; MX2008013429A; AP2008004650A0; BRPI0621581A2; AU2006342396A1

Abstract

The invention relates to bacteriocins produced by novel Enterococcus or Streptococcus strains. Bacteriocins are used for reducing the levels of colonization by at least one target bacteria in animals, especially poultry.

Description

Предшествующий уровень техникиState of the art

Область изобретенияField of Invention

Данное изобретение относится к борьбе с заболеванием у животных, в частности у домашней птицы, посредством применения новых штаммов Еп!егососсик или 8!гер!ососсик, продуцирующих бактериоцины, и/или новых бактериоцинов, продуцируемых этими штаммами. Оно также относится к новым бактериоцинам, аминокислотным последовательностям новых бактериоцинов, к штаммам Еп!егососсик или 81гер!ососсик, продуцирующим эти новые бактериоцины, и к штаммам-индукторам Ьас!ососси8. Кроме того, изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим новые бактериоцины и/или штаммы ЕпЮгососсик или 81тер!ососси8, продуцирующие их, и к применениям этих терапевтических композиций.This invention relates to the control of disease in animals, in particular in poultry, by the use of new strains of Ep! Egossossic or 8! Gerossossicis producing bacteriocins and / or new bacteriocins produced by these strains. It also relates to new bacteriocins, amino acid sequences of new bacteriocins, to Ep! Egossossic or 81erossossic strains producing these new bacteriocins, and to Lac !ossoss8 inducer strains. In addition, the invention relates to therapeutic compositions containing new bacteriocins and / or EpYugossossic or 81ter! Ossossi8 strains producing them, and to the uses of these therapeutic compositions.

Описание релевантного уровня техникиDescription of Related Art

Потребление неправильно приготовленных продуктов из домашней птицы привело в результате к кишечным заболеваниям человека. Давно известно, что возбудителями таких заболеваний являются 8а1топе11а крр., а позже вовлеченность в них также была признана для Сашру1оЬас1ег крр., в частности Сатру1оЬас!ег )сщпг Оба микроорганизма могут колонизировать желудочно-кишечный тракт домашней птицы без каких-либо вредных эффектов на птицу, и хотя некоторые колонизированные птицы могут быть выявлены, бессимптомные носители могут свободно распространять микроорганизмы в процессе производства и переработки, приводя в результате к дальнейшему заражению как живых птиц, так и тушек. Домашняя птица служит в качестве первичного резервуара для 8а1топе11а и Сашру1оЬас1ег в пищевых ресурсах (1опек е! а1., 1оита1 о! Еооб Рто!ес!юп, Уо1ите 54, Ыо. 7, 502-507, 1и1у, 1991). Предотвращение колонизации у живой домашней птицы в процессе производственного выращивания может ослабить проблему заражения домашней птицы.The consumption of improperly prepared products from poultry resulted in human intestinal diseases. It has long been known that the causative agents of such diseases are 8A1Top11a crr., And later involvement in them was also recognized for Sashrublobacrr., In particular Satrublobacrrc) ccbg. Both microorganisms can colonize the gastrointestinal tract of poultry without any harmful effects on the bird. , and although some colonized birds can be detected, asymptomatic carriers can freely spread microorganisms during production and processing, resulting in further infection of both live birds and carcasses . Poultry serves as the primary reservoir for Saltopodiaceae and Caspian bacillus in food resources (Peculosum, Papillon, Papilonum, Papilonum 54, Pap. 7, 502-507, Papi, 1991). Prevention of colonization in live poultry during production can reduce the problem of poultry infection.

Ряд факторов вносит вклад в колонизацию и постоянное присутствие бактерий в пищеварительном тракте животных. Обширный обзор этих факторов сделан 8ауаде (Ргодгекк ш Еооб апб Ыи1п!юп 8с1епсе, Уо1ите 7, 65-74, 1983). В число таких факторов включены: (1) кислотность желудка (ОйШапб, 1оита1 о! Еооб Ртобисйоп, Уо1ите 42,164-167, 1979); (2) соли желчных кислот (8йатре & МаШск, МПсйМккепксйай, Уо1ите 12, 348-349, 1967; Е1осй е! а1., Атепсап 1оигпа1 о! С11шса1 ЫШгШоп, Уо1ите 25,1418-1426, 1972; Ье\\35 & ОогЬасй, АгсШуек о! !п(егпа1 Мебкше, Уо1ите 130, 545-549, 1972; ОйШапб апб 8реск, 1оита1 о! Еооб Рго1есбоп, Уо1ите 40, 820-823, 1977; Нидбай1 е! а1., 1пЕес!юп апб 1ттиш1у, Уо1ите 56, 1560-1566, 1988); (3) перистальтика; (4) пищеварительные ферменты (Магтиг, 1оитпа1 о! Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 3, 208-218, 1961); (5) иммунный ответ и (6) собственные микроорганизмы и антибактериальные соединения, которые они продуцируют. Первые четыре фактора зависят от фенотипа хозяина и могут не являться поддающимися практическому контролю переменными. Иммунный ответ в желудочно-кишечном (ЖК) тракте непросто модулировать. Факторы, включающие собственные микроорганизмы и их метаболиты, являются зависимыми от нормальной флоры ЖК тракта.A number of factors contribute to the colonization and constant presence of bacteria in the digestive tract of animals. An extensive review of these factors was made by the 8th Academy of Sciences (Rogodgeck and Eob apb Ul1n! Np 8c1epse, Wojite 7, 65-74, 1983). Among these factors are included: (1) the acidity of the stomach (OyShapb, 1oita1 o! Eob Rtobisyop, Uoite 42.164-167, 1979); (2) bile salts (8yatra & Mashsk, MPsMkKepksyay, UO1ite 12, 348-349, 1967; E1osy e! A1., Atepsap 1ooppa1 o! C11shca1 Hibrzop, Uoite 25,1418-1426, 1972; Bb eac 35 & , AgsShueuk o!! N (eGP1 Mebkshe, Uo1ite 130, 545-549, 1972; OyShapb apb 8resk, 1oita1 o! Eob Rgo1sbop, Uoite 40, 820-823, 1977; Needby 1 e! A1., 1pEes! Upp apb 1ttish1 Wojite 56, 1560-1566, 1988); (3) peristalsis; (4) digestive enzymes (Magtig, Wojtów! Mo1ee Wyodu, Wojite 3, 208-218, 1961); (5) the immune response and (6) own microorganisms and the antibacterial compounds that they produce.The first four factors depend on the phenotype zyain and may not be practical variables. The immune response in the gastrointestinal (GI) tract is not easy to modulate. Factors, including their own microorganisms and their metabolites, are dependent on the normal flora of the GI tract.

Одним из потенциальных способов борьбы с колонизацией Сатру1оЬас!ег и/или 8а1топе11а является способ с использованием конкурентного исключения (КИ). Νιιηηί и К.ап1а1а (Ыа!иге, Уо1ите 241, 210211, 1973) продемонстрирован эффективный контроль инфекции 8а1топе11а путем принудительного скармливания бактерий из кишечных материалов здоровой домашней птицы цыплятам, микрофлора которых еще не установилась, против колонизации 8а1топе11а. Введение неопределенных КИ препаратов цыплятам ускоряет созревание кишечной флоры у только что вылупившихся цыплят и обеспечивает замену естественного процесса передачи микрофлоры от взрослой курицы к ее потомству. Результаты лабораторных и полевых исследований обеспечивают данные о преимуществах борьбы с Сатру1оЬас!ег посредством введения нормальной микрофлоры цыплятам; имеются сообщения о сниженной частоте стад, инфицированных Сатру1оЬас!ег (Ми1бег апб Во1бег, ΙΝ: С’о1ошха1юп Соп1го1 о! йитап Ьас!епа1 еп(егорабюдепк ш рои1!гу; Ь.С. В1апкеп§Ыр (еб.), Асабетю Ргекк, 8ап И1едо, СаШ., 359-363, 1991), и сниженных уровнях Сатру1оЬас!ег )сщш (С. )сщш) в фекалиях колонизированных птиц (8!ет, РоиШу 8с1епсе, Уо1ите 73, 402-407, 1994).One of the potential ways of combating the colonization of Satrucebac and / or 8a1topa11a is the method using competitive exclusion (CI). Νιιηηί and K. ap1a1a (Ba! Ighe, Wojite 241, 210211, 1973) demonstrated effective control of 8a1tope11a infection by forcing bacteria from intestinal materials of healthy poultry to be fed to chickens whose microflora has not yet been established, against 8a1tope11a colonization. The introduction of undefined CI drugs to chickens accelerates the maturation of the intestinal flora in newly hatched chickens and provides a replacement for the natural process of transferring microflora from an adult chicken to its offspring. The results of laboratory and field studies provide data on the benefits of combating Satroxobas by introducing normal microflora to chickens; There are reports of a reduced incidence of herds infected with Satrucebas! e (Miu run apb Boi run, ΙΝ: '1 1 ош ха п Соп Соп 1 1 го 1 ((его его его его раб В В ро ((((((((((()) (. , 8ap H1edo, CaSH., 359-363, 1991), and reduced levels of Satrucobacterium (C.) congener) in the feces of the colonized birds (8th, Poixu 8c1epse, Wolite 73, 402-407, 1994).

8сйоеш и \Уопд (Арр1. Епу1гоп. М1сгоЬю1., Уо1ите 60, 1191-1197, 1994) сообщали о значимом снижении колонизации бройлеров С. )сщш посредством применения углеводных пищевых добавок вместе с тремя идентифицированными антагонистами: СйтоЬас!ет бгуеткик 22, К1еЬк1е11а рпеитошае 23 и Ексйепсйна сой 25. Также имеются данные о значимом снижении С. )сщш в кишечных пробах от инфицированных бройлеров после обработки выделенными из домашней птицы культурами Ьас!оЬасШи8 ас1борйбик и 81тер!ососсик !аесшт (Мопкййа е! а1., Ау1ап Ощеакек, Уо1ите 41, 850-855,1997).Soyoesh and Wopd (Arp1. Epuloptera. M1goBu1., Wojite 60, 1191-1197, 1994) reported a significant decrease in the colonization of C. broilers) using carbohydrate food additives along with three identified antagonists: 23 and Ekseypsyna soi 25. There is also evidence of a significant decrease in C.) in intestinal samples from infected broilers after treatment with cultures of poultry bacillas bacillas and 81ter! Ossossiccensis (Mopkya e! A1. 41, 850-855.1997).

8поеуепЬок е! а1. (патент США № 4335107, июнь 1982) разработана методика конкурентного исключения (КИ) микрофлоры для предупреждения колонизации 8а1топе11а путем лиофилизации посевов фекалий и анаэробного культивирования этого препарата. М1ко1а е! а1. (патент США № 4657762, апрель 1987) использовали кишечное фекальное содержимое и содержимое слепой кишки в качестве источника КИ микрофлоры для предупреждения колонизации 8а1топе11а. 8!ет е! а1. (патент США № 5451400, сентябрь 1995, и патент США № 6241335, апрель 2001) раскрыта слизистая КИ композиция для защиты домашней птицы и домашнего скота против колонизации 8а1топе11а и Сатру1оЬас!ег, где муциновый слой предварительно промытой слепой кишки соскабливают, и эти соскобы, выдержанные в среде без кисло- 1 017730 рода, культивируют в анаэробных условиях. ΝίδόοΙ е! а1. (патент США № 5478557, декабрь 1996) раскрыт конкретный пробиотик, который может быть получен от ряда домашних животных, получаемый путем непрерывного культивирования периодической культуры, полученной непосредственно из посевов фекалий, содержимого слепой кишки и/или толстого кишечника взрослого целевого животного.8 wow! a1. (US patent No. 4335107, June 1982) developed a method of competitive exclusion (CI) of microflora to prevent the colonization of 8a1tope11a by lyophilization of feces and anaerobic cultivation of this drug. M1ko1a e! a1. (US Patent No. 4,657,762, April 1987) used intestinal fecal contents and cecal contents as a source of CI microflora to prevent colonization of 8a1tope11a. 8! Uh e! a1. (US Patent No. 5451400, September 1995, and US Patent No. 6241335, April 2001) disclosed a mucous KI composition for protecting poultry and livestock against the colonization of 8a1tope11a and Satru1oac! e, where the mucin layer of the pre-washed caecum is scraped off, and these scrapings, sustained in an environment without acid - 017730 genus, cultivated under anaerobic conditions. ΝίδόοΙ e! a1. (US Patent No. 5,478,557, December 1996) discloses a specific probiotic that can be obtained from a number of domestic animals obtained by continuous cultivation of a batch culture obtained directly from feces, cecal contents and / or large intestine of an adult target animal.

Микроорганизмы продуцируют ряд соединений, которые проявляют антибактериальные свойства. Одна группа этих соединений, бактериоцины, состоит из бактерицидных белков с механизмом действия, подобным ионофорным антибиотикам. Бактериоцины часто активны против видов, которые являются близкородственными продуценту. Их широкая распространенность в бактериальных видах, выделенных из сложных сообществ микроорганизмов, таких как кишечный тракт, ротовая или другие эпителиальные поверхности, позволяет предположить, что бактериоцины могут играть регуляторную роль в отношении динамики популяции внутри бактериальных экосистем. Бактериоцины определены как соединения, продуцируемые бактериями, имеющие биологически активную белковую группировку и обладающие бактерицидным действием (Тадд е! а1., Вас(сг1о1од1са1 Рс\зс\\'5. Уо1ите 40, 722-256, 1976). Другие характеристики могут включать: (1) узкий спектр ингибиторной активности, сконцентрированной на близкородственных видах; (2) присоединение к специфичным клеточным рецепторам и (3) генетические детерминанты продуцирования бактериоцинов плазмидного происхождения и иммунитет клетки-хозяина к бактериоцину. Не полностью определенные антагонистические вещества называют бактериоциноподобными веществами. Некоторые бактериоцины, эффективные против грамположительных бактерий в противоположность грамотрицательным бактериям, обладают более широким спектром активности. Предложено, чтобы термин бактериоцин при его использовании для описания ингибиторных агентов, продуцируемых грамположительными бактериями, соответствовал следующим минимальным критериям: (1) представлял собой пептид и (2) обладал бактерицидной активностью (Тадд е! а1., см. выше).Microorganisms produce a number of compounds that exhibit antibacterial properties. One group of these compounds, bacteriocins, consists of bactericidal proteins with a mechanism of action similar to ionophore antibiotics. Bacteriocins are often active against species that are closely related to the producer. Their widespread occurrence in bacterial species isolated from complex communities of microorganisms, such as the intestinal tract, oral or other epithelial surfaces, suggests that bacteriocins may play a regulatory role in relation to population dynamics within bacterial ecosystems. Bacteriocins are defined as compounds produced by bacteria, having a biologically active protein group, and having a bactericidal effect (Tadde e! A1., Bac (cr1o1od1ca1 Pc \ ss \\ '5. Woite 40, 722-256, 1976). Other characteristics may include: (1) a narrow spectrum of inhibitory activity concentrated on closely related species; (2) attachment to specific cellular receptors and (3) genetic determinants of the production of bacteriocins of plasmid origin and the immunity of the host cell to bacteriocin. antagonistic substances are called bacteriocin-like substances.Some bacteriocins effective against gram-positive bacteria as opposed to gram-negative bacteria have a wider spectrum of activity.It is proposed that the term bacteriocin when used to describe inhibitory agents produced by gram-positive bacteria meets the following minimum criteria: (1) it was a peptide and (2) had bactericidal activity (Tadd e! A1., see above).

Молочно-кислые бактерии относятся к числу важнейших пробиотических микроорганизмов. Они являются грамположительными, неспорообразующими, отрицательными по каталазе организмами без цитохромов. Они являются анаэробными, но аэротолерантными, требовательными к питательным средам, кислототолерантными, и конечным продуктом ферментации сахара при их культивировании является молочная кислота. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, включают виды Ьас1оЬасШи8, виды ВШбоЬас!етшт, Еи!етососси8 ГаесаШ, Еи!етососси8 Гаесшт, Ьас!ососси8 1ас!ю, 8!гер!ососси5 спсеШк, Ьеисопо^Юс те8еи1его1бе8, Ребюсоссш аабйасйа, 8рото1ас1оЬасШи5 ши1ши8, 8!гер!ососси5 1йетторЫ1и8 и т.д. Эти виды представляют особый интерес в отношении широкой распространенности бактериоцинов внутри этой группы, а также имеют широкое применение в промышленном производстве кисломолочных продуктов, в пищевой и мясоперерабатывающей промышленности. Их роль в консервировании и вкусовых качествах пищевых продуктов хорошо документирована. Большинство бактериоцинов, продуцируемых этой группой, активно только против других молочно-кислых бактерий, но некоторые проявляют антибактериальную активность по отношению к филогенетически более отдаленным грамположительным бактериям и в определенных условиях по отношению к грамотрицательным бактериям.Lactic acid bacteria are among the most important probiotic microorganisms. They are gram-positive, non-spore-forming, catalase negative organisms without cytochromes. They are anaerobic, but aerotolerant, demanding on nutrient media, acid tolerant, and the final product of sugar fermentation during their cultivation is lactic acid. Bacteria producing lactic acid include Lactobacillus spp., Bacterial bacillus bacillus species, Ebacterium bacillus bacillus bacillus, Cactus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacillus bacidae 8! Ger! Ossossi5 1yettorY1i8, etc. These species are of particular interest in relation to the wide prevalence of bacteriocins within this group, and are also widely used in the industrial production of dairy products, in the food and meat processing industries. Their role in the preservation and palatability of foods is well documented. Most bacteriocins produced by this group are active only against other lactic acid bacteria, but some exhibit antibacterial activity against phylogenetically more distant gram-positive bacteria and, under certain conditions, against gram-negative bacteria.

Ьас1оЬас1Ш интенсивно исследовались в отношении продуцирования ими антагонистов. Они включают хорошо охарактеризованные бактериоцины (ИеК1етк, №!ите, Уо1ите 214, 609, 1967; Иртей апб Н1и₅бШ, АибстютоЬ. Адеий СйетоШет., Уо1ите 7, 139-145, 1975; ВагеГоо! аиб К1аепйаттет, АийтютоЬ. Адеий Сйето!йет., Уо1ите 45, 1808-1815, 1983: 1оегдег аиб К1аеийаттет, 1оита1 оГ Вас!епо1о§у, Уо1ите 167, 439-446, 1986), потенциальные бактериоциноподобные вещества (Утсеи! е! а1., 1оита1 оГ Вас!епо1., Уо1ите 78, 479, 1959) и другие антагонисты, не обязательно родственные бактериоцинам (Уакй аиб 8йайаш, Вас!етю1о§у, Ргос. 9, 1965; Натбаи аиб М1ко1а_)с1к, 1оита1 оГ АийЫойск, Уо1ите 8, 631-636, 1974; М|ко1а)сП< аиб Натбаи, СиИигеб Иа1ту Ртобисй, Раде 10, 1975; аиб 8йайаш е! а1., СиИитеб Иа1гу Ртобис18 1оита1, Уо1ите 11, 14-17, 1976).Lactobacillus has been extensively studied in relation to their production of antagonists. They include well-characterized bacteriocins (IeK1etk, number ite, Uo1ite 214, 609, 1967;! Irtey APB N1i ₅ battleships, Aibstyuto Adey SyetoShet, Uo1ite 7, 139-145, 1975;.. VageGoo AIB K1aepyattet, Aiytyuto Adey Syeto!.! . dem, Uo1ite 45, 1808-1815, 1983, AIB 1oegdeg K1aeiyattet, 1oita1 exhaust you epo1o§u, Uo1ite 167, 439-446, 1986), the potential bacteriocin-like substances (Utsei e a1, 1oita1 og epo1 you!!!.! ., Wojite 78, 479, 1959) and other antagonists that are not necessarily related to bacteriocins (Uaky aib 8yayash, Vas! Etiuoigu, Prgos. 9, 1965; Natbai aib M1ko1a_) s1k, 1oita1 oG Aiyuoysk, Uoite 8, 631-636. , 1974; M | ko1a) cP <aib Natbai, SiIigeb Ia1tu Rtobisy, Rade 10, 1975; aib 8yayash e! A1., SiIiteb IA1gu Rtobis18 1oita1, Uo1ite 11, 14-17, 1976).

1<1аег111аттег (РЕМ8, М1сгоЬю1. Кеу., Уо1ите 12, 39-86, 1993) классифицировал бактериоцины молочно-кислых бактерий, известные к настоящему времени, на четыре основные группы.1 <1aeg111atteg (PEM8, M1cogyu1. Keu., Woite 12, 39-86, 1993) classified the bacteriocins of lactic acid bacteria known so far into four main groups.

Группа I: лантибиотики, которые представляют собой небольшие пептиды размером менее 5 кДа, содержащие необычные аминокислоты лантионин и β-метиллантионин. Они представляют особый интерес, поскольку обладают очень широким спектром активности относительно других бактериоцинов. Примеры включают низин, низин Ζ, карноцин и 149, лактицин 481 и лактоцин 5.Group I: lantibiotics, which are small peptides less than 5 kDa in size, containing the unusual amino acids lanthionine and β-methylanthionine. They are of particular interest because they have a very wide spectrum of activity relative to other bacteriocins. Examples include nisin, nisin Ζ, carnocine and 149, lacticin 481 and lactocin 5.

Группа II: небольшие пептиды, не содержащие лантионин: гетерогенная группа небольших пептидов размером менее 10 кДа. Эта группа включает пептиды, активные против БМепа §рр.Group II: small peptides that do not contain lanthionine: a heterogeneous group of small peptides smaller than 10 kDa. This group includes peptides that are active against BMPa §rr.

Группа III: небольшие термолабильные белки размером более 30 кДа. Примером является гельветицин.Group III: small heat-labile proteins larger than 30 kDa. An example is helveticin.

Группа IV: сложные бактериоцины - белки, содержащие дополнительные группировки, такие как липиды и углеводы.Group IV: complex bacteriocins - proteins that contain additional groups, such as lipids and carbohydrates.

Касхек (заявка на патент США И8 2002/0176910, опубликованная 28 ноября 2002 г.) раскрыл применение композиции, которая содержит живые или убитые микроорганизмы, которые секретируют бактериоцины, либо сами бактериоцины, либо их комбинации, для использования с кормами для сельскохозяйственного домашнего скота.Cashek (U.S. Patent Application I8 2002/0176910, published November 28, 2002) disclosed the use of a composition that contains live or killed microorganisms that secrete bacteriocins, or bacteriocins themselves, or combinations thereof, for use with livestock feed.

Различные виды энтерококков и стрептококков, продуцирующие бактериоцины, и их бактериоциныDifferent types of enterococci and streptococci producing bacteriocins and their bacteriocins

- 2 017730 описаны в уровне техники. Однако в настоящем изобретении предложены новые композиции, содержащие по меньшей мере один новый штамм Еп1етососсик или 81гер1ососсик и/или по меньшей мере один новый бактериоцин, продуцируемый этими новыми штаммами; способ применения штамма и/или бактериоцина, новые штаммы, аминокислотные последовательности для новых бактериоцинов и способы применения, все из которых отличны от штаммов, бактериоцинов и способов применения из родственного уровня техники.- 2 017730 described in the prior art. However, the present invention provides new compositions comprising at least one new Ep1etosossic strain or 81er1ossossic strain and / or at least one new bacteriocin produced by these new strains; a method of using a strain and / or bacteriocin, new strains, amino acid sequences for new bacteriocins and methods of use, all of which are different from strains, bacteriocins and methods of use from the related art.

Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention

Таким образом, задачей настоящего изобретения является предложение по меньшей мере одного нового штамма Ейетососсик или 81тер1ососсик, который продуцирует новые бактериоцины.Thus, it is an object of the present invention to provide at least one new Ejetosossic or 81ter1ossossic strain that produces new bacteriocins.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение нового штамма 81гер1ососсик спсеЦ.15. имеющего идентификационные характеристики ΝΚΒΕ В-30745.The present invention also included the proposal of a new strain 81er1ossoss SPEC15. having identification characteristics ΝΚΒΕ B-30745.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение нового штамма Еп1етососсик £аесшт, имеющего идентификационные характеристики ΝΚΒΕ В-30746.The present invention also included the proposal of a new strain Ep1etosossic £ aesst, having identification characteristics ΝΚΒΕ B-30746.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение новых бактериоцинов, продуцируемых новыми штаммами Еп1етососсик или 81гер1ососсик.The present invention also included the proposal of new bacteriocins produced by new strains of Ep1etosossic or 81er1ossossic.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение нового бактериоцина 50-52, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 1.The present invention also included the proposal of a new bacteriocin 50-52 having the amino acid sequence shown in 8EO ΙΌ N0: 1.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение нового бактериоцина 760, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 2.The present invention also included the proposal of a new bacteriocin 760 having the amino acid sequence shown in 8E0 ΙΌ N0: 2.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа, по меньшей мере, снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью у животных путем введения животному терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере один новый штамм Еп1етососсик или 81тер1ососсик, который продуцирует новый бактериоцин, по меньшей мере один новый бактериоцин, продуцируемый новым штаммом Еп1етососсик или 81гер1ососсик, или комбинацию новых штаммов и/или новых бактериоцинов.It was also an object of the present invention to provide a method for at least reducing colonization levels of at least one target bacterium in animals by administering to an animal a therapeutic composition comprising at least one new Ep1etosossic or 81ter1ossoss strain that produces at least a new bacteriocin one new bacteriocin produced by a new strain Ep1etosossic or 81er1ossossic, or a combination of new strains and / or new bacteriocins.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа, по меньшей мере, снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью у животных путем введения животному терапевтической композиции, содержащей новый штамм Еп1етососсик, имеющий идентификационные характеристики ΝΚΚΕ с депозитарным номером В-30746, новый штамм 81тер1ососсик, обладающий идентификационными характеристиками ΝΚΒΕ № В-30745, и их смеси.The present invention also included the proposal of a method for at least decreasing the levels of colonization with at least one target bacterium in animals by administering to the animal a therapeutic composition containing a new strain Ep1etosossic having identification characteristics депозит with deposit number B-30746, a new strain 81ter1ossoss possessing identification characteristics ΝΚΒΕ No. B-30745, and mixtures thereof.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа, по меньшей мере, снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью у животных путем введения животному терапевтической композиции, содержащей новый бактериоцин 50-52, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 1.It was also an object of the present invention to provide a method for at least reducing colonization levels of at least one target bacterium in animals by administering to the animal a therapeutic composition containing a new bacteriocin 50-52 having the amino acid sequence shown in 8E0 ΙΌ N0: 1.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа по меньшей мере снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью у животных путем введения животному терапевтической композиции, содержащей новый бактериоцин 760, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 2.It was also an object of the present invention to provide a method for at least reducing colonization levels of at least one target bacterium in animals by administering to the animal a therapeutic composition containing a new bacteriocin 760 having the amino acid sequence shown in 8E0 ΙΌ N0: 2.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа, по меньшей мере, снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью у животных путем введения животному терапевтической композиции, содержащей бактериоцин, продуцируемый новым штаммом ЕЩегососсик, имеющим идентификационные характеристики ИНКЕ В-30746, новым штаммом 81гер1ососсик, имеющим идентификационные характеристики НИКЕ В-30745, и их смеси.The present invention also included the proposal of a method for at least reducing colonization levels of at least one target bacterium in animals by administering to the animal a therapeutic composition containing bacteriocin produced by a new strain of ELSE-Sossoss, having identification characteristics of INKE B-30746, a new strain of 81er1ossoss having the identification characteristics of NIKE B-30745, and mixtures thereof.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение штамма-индуктора Ьас1ососси8, который повышает продуцирование бактериоцинов штаммами-продуцентами.The present invention also included the proposal of a strain inducer Laclossoss8, which increases the production of bacteriocins by producer strains.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение штамма-индуктора Ьас1ососси8 1асйк, имеющего идентификационные характеристики МККЬ В-30744.The objective of the present invention also included the proposal of a strain of inducer Laclossoss8 1ac, having the identification characteristics of MCCB B-30744.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа повышения продуцирования бактериоцинов штаммами-продуцентами, где штаммы-продуценты культивируют совместно со штаммом-индуктором Ьас1ососси8.The present invention also included the proposal of a method for increasing the production of bacteriocins by producer strains, where producer strains are cultivated together with the Laclossoss8 inducer strain.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа повышения продуцирования бактериоцинов штаммами-продуцентами, где указанные штаммы-продуценты культивируют совместно со штаммом Ьас1ососси8, имеющим идентификационные характеристики МККЬ В-30744.The present invention also included the proposal of a method for increasing the production of bacteriocins by producer strains, where these producer strains were cultivated together with the Lac1ossoss8 strain, having the identification characteristics of MCCB B-30744.

В задачу настоящего изобретения также входило предложение способа очистки бактериоцинов, который включает сбор культуральной жидкости и клеток в виде отдельных образцов, выделение бактериоцина, который адсорбирован на клеточной поверхности штамма-продуцента и штамма-индуктора, посредством элюирования фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия, с последующей одностадийной ионообменной хроматографией, выделение бактериоцина из культуральной жидкости посредством гидрофобной хроматографии.The present invention also included the proposal of a method for purifying bacteriocins, which involves collecting the culture fluid and cells in the form of separate samples, isolating bacteriocin, which is adsorbed on the cell surface of the producer strain and the inducer strain, by elution with phosphate buffer containing sodium chloride, followed by single-stage ion-exchange chromatography, isolation of bacteriocin from the culture fluid by hydrophobic chromatography.

Другие признаки и преимущества изобретения должны стать очевидными на основании приведенного ниже описания.Other features and advantages of the invention will become apparent from the description below.

- 3 017730- 3 017730

Депонирование микроорганизмовDeposition of microorganisms

81гср1ососси8 спссЦ.15. обозначенный ΝΡΡΕ В-30745 (штамм 760); Еп1сгососси5 Гассшт. обозначенный ΝΚΚΕ В-30746 (штамм 50-52) и Ьас1ососси8 1ас118. обозначенный ΝΚΚΕ В-30744 (штамм 320). депонированы в соответствии с условиями Будапештского договора 3 мая 2004 г. в патентной коллекции культур Департамента сельского хозяйства и сельскохозяйственных исследований при Министерстве земледелия США (Национальный Центр по исследованиям сельскохозяйственной утилизации (№11юпа1 Ссп1сг Гог Адпси11ига1 и11Нха(1оп Всксагсй). 1815 Ν. ИшуегШу 81гсс1. Реопа. ШшоЕ 61604).81gsr1osossi8 spssts.15. designated ΝΡΡΕ B-30745 (strain 760); Ep1sgosossi5 Gassst. designated ΝΚΚΕ B-30746 (strain 50-52) and Lac1ossoss8 1ac118. designated ΝΚΚΕ B-30744 (strain 320). deposited in accordance with the terms of the Budapest Treaty on May 3, 2004 in the Patent Collection of Cultures of the Department of Agriculture and Agricultural Research at the US Department of Agriculture (National Center for Agricultural Utilization Research (No. 11yup1 Szp1sg Gog Adpsi11iga1 i11Nkha (1op Vsksagsy). 1815 И. IshuegShu 81ssss1 Reopa, ShawE 61604).

Краткое описание графических материаловA brief description of the graphic materials

Фиг. 1А-1Б представляют собой фотографии. показывающие прямое обнаружение бактериоцина 760 после электрофореза в ДСН-ПААГ (1А) и изоэлектрического фокусирования (1Б);FIG. 1A-1B are photographs. showing direct detection of bacteriocin 760 after electrophoresis in SDS-PAGE (1A) and isoelectric focusing (1B);

фиг. 2А и 2Б представляют собой фотографии. показывающие прямое обнаружение бактериоцина 50-52 после электрофореза в ДСН-ПААГ (2А) и изоэлектрического фокусирования (2Б).FIG. 2A and 2B are photographs. showing direct detection of bacteriocin 50-52 after electrophoresis in SDS-PAGE (2A) and isoelectric focusing (2B).

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Значимость кишечных инфекций у людей имеет возрастающее признание. Взаимосвязь заражения домашней птицы и инфекции у человека четко зарегистрирована. Способность уменьшить вред для здоровья посредством вмешательств на птицеобрабатывающих предприятиях также хорошо известна. В процессе производства и переработки бройлеров фекальные материалы. содержащие патогены. переносятся на мясо и сохраняются в помещениях для переработки пищевых продуктов.The importance of intestinal infections in humans is increasingly recognized. The relationship between poultry infection and human infection is well documented. The ability to reduce health hazards through interventions in poultry farms is also well known. In the process of production and processing of broilers fecal materials. containing pathogens. transferred to meat and stored in premises for food processing.

Метаболиты конкурирующих организмов могут вносить вклад в борьбу с такими патогенами. как Сатру1оЬас1ег )с)ши и 8а1топс11а. Новые антагонистические штаммы были выделены с поверхностей слизистой оболочки слепой кишки и зоба бройлеров. Нативными компонентами охарактеризованных антагонистов являются низкомолекулярные пептиды. бактериоцины. которые обладают широким спектром антагонистической активности.The metabolites of competing organisms can contribute to the fight against such pathogens. like Satru1o6ac1eg) c) si and 8a1tops11a. New antagonistic strains were isolated from the surfaces of the mucous membrane of the cecum and goiter of broilers. The native components of the characterized antagonists are low molecular weight peptides. bacteriocins. which have a wide spectrum of antagonistic activity.

В настоящем изобретении предложены новый штамм ЕгДегососсш. новый штамм 81гср1ососси8. новый штамм БасЮсоссш. новые бактериоцины. аминокислотные последовательности указанных бактериоцинов. терапевтические композиции. содержащие новые бактериоцины и/или штаммы. продуцирующие их. и способы применения этих новых терапевтических композиций. В настоящем изобретении также предложен способ продуцирования и очистки новых бактериоцинов.The present invention provides a new strain of EgDegossoss. new strain 81gsr1ossossi8. a new strain of basususs. new bacteriocins. amino acid sequences of these bacteriocins. therapeutic compositions. containing new bacteriocins and / or strains. producing them. and methods of using these new therapeutic compositions. The present invention also provides a method for producing and purifying new bacteriocins.

Еп1сгососси8 Гассшт. ΝΚΚΕ В-30746. является факультативным аэробом. представляющим собой грамположительные кокки. и способен к росту при примерно 37°С. Этот штамм растет на питательном агаре или на агаре для подсчета колоний. образуя края неправильной формы. Колонии имеют диаметр примерно 2 мм после микроаэрофильного культивирования в течение примерно 24 ч при примерно 37°С.Ep1sgosossi8 Gassst. ΝΚΚΕ B-30746. is an optional aerobic. representing gram-positive cocci. and capable of growth at approximately 37 ° C. This strain grows on nutrient agar or on agar for colony counting. forming irregularly shaped edges. The colonies have a diameter of about 2 mm after microaerophilic cultivation for about 24 hours at about 37 ° C.

81гср1ососси8 спссЦ.15. ΝΡΡΕ В-30745. является факультативным аэробом. представляющим собой грамположительные кокки. и способен к росту примерно при 37°С. Этот штамм растет на питательном агаре или на агаре для подсчета колоний. образуя края правильной формы. Колонии имеют диаметр примерно 1 мм после микроаэрофильного культивирования в течение примерно 24 ч при примерно 37°С.81gsr1osossi8 spssts.15. ΝΡΡΕ B-30745. is an optional aerobic. representing gram-positive cocci. and capable of growth at approximately 37 ° C. This strain grows on nutrient agar or on agar for colony counting. forming the edges of the correct shape. The colonies have a diameter of about 1 mm after microaerophilic cultivation for about 24 hours at about 37 ° C.

Скрининг выделенных штаммов Еп1сгососси8 и 81гср1ососси8 на продуцирование бактериоциновой активности проводят на питательном агаре. засеянном различными целевыми бактериями-мишенями. Другие тестируемые штаммы культивируют в аэробных условиях примерно при 37°С в течение примерно 18-24 ч. УсгЦша сШсгосоййса и Υ. рхсийоШЬсгсЫохЬ культивируют примерно при 28°С в аэробных условиях в течение примерно 18-24 ч. Тесты на активность против Сатру1оЬас1сг )с)ши проводят на агаре для Сатру1оЬас1сг. засеянном С. )с)ши. содержащем примерно 5% лаковой крови. Использование крови соответствует пределам компетенции обычных специалистов в данной области техники и включает. например. овец. лошадей и т.д. Тесты на активность против Сатру1оЬас1сг )с)ши проводят в микроаэробных условиях с примерно 5% О₂. примерно 10% СО₂ и примерно 85% Ν₂ в течение примерно 24-48 ч при примерно 42°С. Примерно 0.1 мл антагонистических бактерий. суспендированных в нормальном физиологическом растворе. высевают на МРС агар (агар Ос Маш. Родоса. 8Еагрс) и инкубируют в течение примерно 24-48 ч. Кубики МРС агара примерно 0.5 см³ вырезают и переносят на агар для Вгисс11а или Сатру1оЬас!сг с добавлением лаковой крови. примерно 10 мкг/мл рифампицина. примерно 2.4 ед./мл полимиксина и засевают примерно 10⁷ клеток Сатру1оЬас1сг )с)ши. Чашки инкубируют при примерно 42°С в течение примерно 24-48 ч в микроаэробных условиях. Активность оценивают путем измерения зон ингибирования роста.The screening of the isolated strains of Ep1gososs8 and 81gsp1ososs8 for the production of bacteriocin activity is carried out on nutrient agar. seeded with various target bacteria. Other test strains were cultured under aerobic conditions at about 37 ° C for about 18-24 hours. Rhysiomycephalus is cultured at about 28 ° C under aerobic conditions for about 18-24 hours. Tests for activity against Satrulobaclc) c) are carried out on agar for Satrulobaclcr. seeded S.) c) shea. containing about 5% of varnish blood. The use of blood meets the limits of competence of ordinary specialists in this field of technology and includes. eg. sheep. horses etc. Tests for activity against Satrulobactylcrc) c) are carried out under microaerobic conditions with approximately 5% O ₂ . about 10% CO ₂ and about 85% Ν ₂ for about 24-48 hours at about 42 ° C. Approximately 0.1 ml of antagonistic bacteria. suspended in normal saline. seeded on MPC agar (agar Os Mash. Rhodes. 8Eagrs) and incubated for about 24-48 hours. Cubes of MPC agar about 0.5 cm ³ are cut out and transferred to agar for Bgiss11a or Satru1obac! g with the addition of varnish blood. approximately 10 μg / ml rifampicin. approximately 2.4 units / ml of polymyxin and inoculate approximately 10 ⁷ cells of Satrulobacillus c) si. The plates are incubated at about 42 ° C for about 24-48 hours under microaerobic conditions. Activity is evaluated by measuring growth inhibition zones.

Изоляты. выявленные как антагонистические. оценивают на продуцирование бактериоцина. Сырые антимикробные препараты (САП) готовят путем осаждения сульфатом аммония из культур антагонистических штаммов. выращенных в примерно 10%-ной среде для Вгисс11а вместе с усиливающим продуцирование бактериоцина количеством БасЮЬасШш 1асЙ8 (штамм 320; ΝΡΡΕ В-30744). используемым в качестве индуктора. при примерно 37°С в течение примерно 14 ч в аэробных условиях. Усиливающее продуцирование бактериоцина. количество индуктора определяют как количество индукторных бактерий. необходимое. по меньшей мере. для усиления продуцирования бактериоцина штаммом-продуцентом по сравнению со штаммом-продуцентом. культивируемым без штамма-индуктора. Примером соотношения концентрации штамма-индуктора к штамму-продуценту в совместной культуре является примерно 10:1Isolates. identified as antagonistic. evaluated for bacteriocin production. Crude antimicrobial agents (SAPs) are prepared by precipitation with ammonium sulfate from cultures of antagonistic strains. grown in an approximately 10% environment for Bgiss11a, together with an increase in the production of bacteriocin, an amount of BasBlAcr1acl8 (strain 320; B-30744). used as an inductor. at about 37 ° C for about 14 hours under aerobic conditions. Enhancing bacteriocin production. the amount of inducer is defined as the number of inducer bacteria. necessary. at least. to enhance the production of bacteriocin by the producer strain compared with the producer strain. cultivated without an inducer strain. An example of a ratio of the concentration of the inducer strain to the producer strain in a co-culture is about 10: 1

- 4 017730 (индуктор: продуцент). Затем культуры центрифугируют при примерно 2500/д в течение примерно 10 мин. Антагонистические пептиды выделяют из супернатанта посредством комбинации осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации с использованием Зирегоке 12 НК, катионообменной хроматографии с использованием Зерйагоке ЗР РР. При совместном культивировании секретируемые бактериоцины могут адсорбироваться на клеточной поверхности клеток как продуцента, так и индуктора. Для сбора бактериоцина клеточный осадок со стадии центрифугирования смешивают с буфером для элюирования, который готовят из фосфатного буфера с примерно 0,7% ΝαΟΊ. рН примерно 8,0. Эту суспензию перемешивают и инкубируют в течение примерно 20 мин, после чего центрифугируют при примерно 10000 д в течение примерно 15 мин. Бактериоцин выделяют из супернатанта посредством ионообменной хроматографии на Зирегоке ЗР РР. Молекулярные массы пептидов определяют с помощью электрофореза в ДСНПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), р1 пептидов определяют с помощью изоэлектрического фокусирования. Аминокислотные последовательности определяют с помощью расщепления по Эдману, используя, например, автоматический секвенатор 491 сЬС (Аррйеб Вюкук1етк, 1пс.).- 4 017730 (inductor: producer). The cultures are then centrifuged at about 2500 / d for about 10 minutes. Antagonistic peptides are isolated from the supernatant through a combination of precipitation with ammonium sulfate, gel filtration using Ziregoke 12 NK, cation exchange chromatography using Zeryagoke ZR PP. When co-cultured, secreted bacteriocins can be adsorbed on the cell surface of cells of both the producer and inducer. To collect bacteriocin, the cell pellet from the centrifugation step is mixed with an elution buffer, which is prepared from a phosphate buffer with about 0.7% Ν αΟΊ. pH is about 8.0. This suspension is mixed and incubated for about 20 minutes, after which it is centrifuged at about 10,000 d for about 15 minutes. Bacteriocin is isolated from the supernatant by ion exchange chromatography on Ziregok ZR PP. The molecular weights of the peptides are determined by electrophoresis in DSNPAAG (polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate), p1 of the peptides is determined by isoelectric focusing. Amino acid sequences are determined by Edman cleavage using, for example, an automatic sequencer 491 cb (Arreb Vukuketk, 1ps.).

Для целей настоящего изобретения термин пептид означает соединение по меньшей мере из двух или более аминокислот или аминокислотных аналогов. Аминокислоты или аминокислотные аналоги могут быть соединены пептидными связями. В другом воплощении аминокислоты могут быть соединены другими связями, например сложноэфирными, эфирными и т.д. Пептиды могут находиться в любой структурной конфигурации, включая линейные, разветвленные или циклические конфигурации. Как используют здесь, термин аминокислоты относится либо к природным, либо к синтетическим аминокислотам, включая как Ό, так и Ь оптические изомеры, и к аминокислотным аналогам.For the purposes of the present invention, the term peptide means a compound of at least two or more amino acids or amino acid analogues. Amino acids or amino acid analogs may be linked by peptide bonds. In another embodiment, the amino acids may be linked by other bonds, for example, ester, ester, etc. The peptides can be in any structural configuration, including linear, branched or cyclic configurations. As used here, the term amino acids refers to either natural or synthetic amino acids, including both Ό and b optical isomers, and amino acid analogues.

Производные и аналоги пептидов по настоящему изобретению включают, но не ограничены ими, те, которые содержат в качестве первичной аминокислотной последовательности всю аминокислотную последовательность пептида или ее часть, включая измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки заменены остатками в пределах последовательности, приводящими в результате к консервативной аминокислотной замене.Derivatives and analogues of the peptides of the present invention include, but are not limited to, those that contain, as a primary amino acid sequence, all or part of the peptide amino acid sequence, including altered sequences in which functionally equivalent amino acid residues are replaced by residues within the sequence resulting in to conservative amino acid substitution.

Например, один или более чем один аминокислотный остаток в пределах последовательности может быть заменен другой аминокислотой подобной полярности, которая действует в качестве функционального эквивалента, приводя в результате к молчащей замене. Замены аминокислот в пределах последовательности могут быть выбраны из других членов того класса, к которому принадлежит эта аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Аминокислотами, содержащими ароматические кольцевые структуры, являются фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Полагают, что такие изменения существенным образом не влияют на среднюю молекулярную массу, определенную с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрической точки.For example, one or more amino acid residues within a sequence may be replaced by another amino acid of a similar polarity, which acts as a functional equivalent, resulting in a silent replacement. Substitution of amino acids within a sequence can be selected from other members of the class to which this amino acid belongs. For example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Amino acids containing aromatic ring structures are phenylalanine, tryptophan and tyrosine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. It is believed that such changes do not significantly affect the average molecular weight determined by polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric point.

Неконсервативные аминокислотные замены могут быть также введены для замены на аминокислоту с особенно предпочтительным свойством. Например, Сук можно вводить в потенциальный сайт для образования дисульфидных мостиков с другим Сук. Рго можно вводить в связи с его особенно плоской структурой.Non-conservative amino acid substitutions may also be introduced to substitute for an amino acid with a particularly preferred property. For example, Suk can be introduced into a potential site for the formation of disulfide bridges with another Suk. Rgo can be introduced in connection with its particularly flat structure.

Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать химическим путем. Синтетические пептиды могут быть получены с использованием хорошо известных методик твердофазной, жидкофазной или пептидной конденсации, либо любой их комбинации, и они могут включать природные и/или синтетические аминокислоты. Аминокислоты, используемые для пептидного синтеза, могут представлять собой стандартную Вос(№-аминозащищенную №-трет-бутоксикарбонилом)аминокислоту на полимерном носителе при использовании стандартных протоколов удаления защиты, нейтрализации, сочетания и отмывки оригинальной твердофазной методики МегпПе1б (1. Ат. Сйет. Зос., Уо1ите 85, 21492154, 1963), либо лабильную к основанию №-аминозащищенную 9-флуоренилметоксикарбонилом (Ртос) аминокислоту (Сатрто апб Нап, 1. Огд. Сйет., Уо1ите 37, 3403-3409, 1972). Кроме того, способ по настоящему изобретению можно использовать с другими ^-защитными группами, которые знакомы специалистам в данной области техники. Твердофазный пептидный синтез можно осуществлять с помощью методик в пределах обычной компетенции специалистов в данной области техники (см., например, З1е\\'аг1 апб Уоипд, Зойб Рйаке Зуп1Нек1к, Зесопб Ебйюп, Р1егсе Сйетюа1 Со., КоскГогб, 111, 1984; Р1е1бк апб №Ые, 1п1. 1. Рер1. Рто1еш Кек., Уо1ите 35, 161-214, 1990), либо путем использования автоматических синтезаторов.The peptides of the present invention can be synthesized chemically. Synthetic peptides can be prepared using well-known methods of solid phase, liquid phase or peptide condensation, or any combination thereof, and they can include natural and / or synthetic amino acids. Amino acids used for peptide synthesis can be a standard Boc (N-amino protected N-tert-butoxycarbonyl) amino acid on a polymer carrier using standard protocols for deprotecting, neutralizing, combining and washing the original solid-phase MegPe1b method (1. At. Sit. Zos. ., Woite 85, 21492154, 1963), or a labile labile amino-protected 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Hg) amino acid (Satrto apb Nap, 1. Ogd. Sit., Wojite 37, 3403-3409, 1972). In addition, the method of the present invention can be used with other ^ -protecting groups that are familiar to those skilled in the art. Solid-phase peptide synthesis can be carried out using techniques within the ordinary competence of specialists in this field of technology (see, for example, S1e \\ ag1 apb Uoipd, Zoib Ryake Zup1Nek1k, Zesopb Ebyup, P1egse Syetuya Co., Koskogogb, 111, 1984; P1е appb No. 2e, 1p1. 1. Pp1. Ptolesh Kek., Woite 35, 161-214, 1990), or by using automatic synthesizers.

В соответствии с настоящим изобретением пептиды и/или новые бактериальные штаммы можно вводить в терапевтически приемлемом носителе местным путем, парентеральным путем, через слизистую оболочку, например перорально, назально, ректально или чрескожно. Пептиды по настоящему изобретению могут быть модифицированы при необходимости для повышения способности пептида к проIn accordance with the present invention, peptides and / or new bacterial strains can be administered in a therapeutically acceptable carrier by local route, parenteral route, through the mucous membrane, for example, orally, nasally, rectally or transdermally. The peptides of the present invention can be modified if necessary to increase the ability of the peptide to pro

- 5 017730 никновению через клеточные мембраны, например путем повышения гидрофобной природы пептида, введения пептида в носитель в виде конъюгата, такого как лиганд к специфичному рецептору и т.д.- 5 017730 through cell membranes, for example, by increasing the hydrophobic nature of the peptide, introducing the peptide into the carrier in the form of a conjugate, such as a ligand to a specific receptor, etc.

В настоящем изобретении также предложена конъюгация нацеливающей молекулы с пептидом по изобретению. Нацеливающие молекулы для целей настоящего изобретения означают молекулу, которая при введении ίη νίνο локализуется в желаемом положении или положениях. В различных воплощениях настоящего изобретения нацеливающая молекула может представлять собой пептид или белок, антитело, пектин, углевод или стероид. Нацеливающая молекула может представлять собой пептидный лиганд рецептора на клетке-мишени или антитело, такое как моноклональное антитело. Для облегчения сшивания антитело может быть редуцировано до двух гетеродимеров тяжелой и легкой цепи, либо фрагмент Н(аЬ')₂может быть редуцирован и сшит с пептидом посредством восстановленного сульфгидрила.The present invention also provides conjugation of a targeting molecule to a peptide of the invention. Targeting molecules for the purposes of the present invention mean a molecule that, when introduced, ίη νίνο is localized in the desired position or positions. In various embodiments of the present invention, the targeting molecule may be a peptide or protein, antibody, pectin, carbohydrate or steroid. The target molecule may be a peptide ligand of a receptor on a target cell or an antibody, such as a monoclonal antibody. To facilitate crosslinking, the antibody can be reduced to two heavy and light chain heterodimers, or the H (ab ') ₂ fragment can be reduced and crosslinked with the peptide via reduced sulfhydryl.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены терапевтические композиции. Эти композиции могут быть предназначены для перорального, назального, легочного введения, инъекции и т.д. Терапевтические композиции включают эффективные количества по меньшей мере одного бактериоцина по настоящему изобретению и их производных и/или по меньшей мере одного нового штамма, по меньшей мере, для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью в сочетании с приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Разбавители могут включать буферы, такие как, например, Трис-НС1, ацетат, фосфат; вспомогательные вещества могут включать, например, детергенты и солюбилизирующие агенты, такие как Твин 80, полисорбат 80 и т.д.; антиоксиданты включают, например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия и т.д.; консерванты могут включать, например, тимерсол, бензиловый спирт и т.д.; и наполнители, такие как лактоза, маннит и т.д.In another aspect of the present invention, therapeutic compositions are provided. These compositions may be intended for oral, nasal, pulmonary administration, injection, etc. Therapeutic compositions include effective amounts of at least one bacteriocin of the present invention and their derivatives and / or at least one new strain, at least to reduce colonization levels of at least one target bacterium in combination with acceptable diluents, preservatives, solubilizers , emulsifiers, adjuvants and / or carriers. Diluents may include buffers, such as, for example, Tris-HC1, acetate, phosphate; excipients may include, for example, detergents and solubilizing agents, such as Tween 80, Polysorbate 80, etc .; antioxidants include, for example, ascorbic acid, sodium metabisulfite, etc .; preservatives may include, for example, thimersol, benzyl alcohol, etc .; and excipients such as lactose, mannitol, etc.

Терапевтическая композиция по настоящему изобретению может быть включена в дисперсные препараты полимерных соединений, таких как поливинилпирролидон, полимер молочной кислоты, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Липосомная инкапсуляция включает инкапсуляцию различными полимерами. Широкий ряд полимерных носителей можно использовать для содержания и/или доставки одного или более чем одного из терапевтических агентов, обсужденных выше, включая, например, как биоразлагаемые, так и небиоразлагаемые композиции. Репрезентативные примеры биоразлагаемых композиций включают альбумин, коллаген, желатин, гиалуроновую кислоту, крахмал, целлюлозу (метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозы, ацетатсукцинат целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы), казеин, декстраны, полисахариды, фибриноген, поли(П,Б-лактид), поли(П,Б-лактид-когликолид), поли(гликолид), поли(гидроксибутират), поли(алкилкарбонат) и поли(ортоэфиры), полиэфиры, полимеры гидроксивалериановой кислоты, полидиоксанон, поли(этилентерефталат), полимеры яблочной кислоты, полимеры тартроновой кислоты, полиангидриды, полифосфазены, полиаминокислоты и их сополимеры (см. в общем Шит, Ь, Όανίάδ, 8.8. (ебв.) Ро1утегв ίη СоШгоНеб Эгид ОеНуегу Χν^ΙιΡ ΒτίδΙοΙ, 1987; Агвйабу, 1. СогИгоНеб Ке1еаве 17: 1-22, 1991; Ρίΐΐ, Ιηΐ. 1. РБаг. 59: 173-196, 1990; Но11апб е1 а1., 1. СогИгоНеб Ке1еаве 4: 155-0180, 1986).The therapeutic composition of the present invention can be incorporated into dispersed preparations of polymer compounds such as polyvinylpyrrolidone, a lactic acid polymer, polyglycolic acid, etc., or into liposomes. Liposomal encapsulation includes encapsulation of various polymers. A wide variety of polymer carriers can be used to contain and / or deliver one or more of the therapeutic agents discussed above, including, for example, both biodegradable and non-biodegradable compositions. Representative examples of biodegradable compositions include albumin, collagen, gelatin, hyaluronic acid, starch, cellulose (methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, cellulose, polycellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, cellulose, polycellulose, cellulose, cellulose, cellulose, polymethyl cellulose, cellulose, cellulose, polycellulose, lactide), poly (P, B-lactide-co-glycolide), poly (glycolide), poly (hydroxybutyrate), poly (alkyl carbonate) and poly (orthoesters), polyesters, polymers of hydroxyvaleric acid, polyid oxanone, poly (ethylene terephthalate), polymers of malic acid, polymers of tartronic acid, polyanhydrides, polyphosphazenes, polyamino acids and their copolymers (see, in general, Chit, L, Όανίάδ, 8.8. (ebv.) 1987; Agvyabu, 1. SogIGoNeb Ke1eave 17: 1-22, 1991; Ρίΐΐ, Ιηΐ. 1. Rbag. 59: 173-196, 1990; Ho11apb e1 a1., 1. SogGigoNeb Ke1eave 4: 155-0180, 1986).

Репрезентативные примеры небиоразлагаемых полимеров включают сополимеры поли(этиленвинилацетат) (ЕУА), силиконовый каучук, акриловые полимеры (полиакриловую кислоту, полиметилакриловую кислоту, полиметилметакрилат, полиалкилцианоакрилат), полиэтилен, полипропилен, полиамиды (нейлон 6,6), полиуретан, поли(сложный эфир-уретаны), поли(простой эфир-уретаны), поли(сложный эфир-мочевина), полиэфиры (поли(этиленоксид), поли(пропиленоксид), полимеры Р1игоп1е и поли(тетраметиленгликоль)), силиконовые каучуки и виниловые полимеры, такие как поливинилпирролидон, поли(виниловый спирт), поли(винилацетатфталат). Могут быть также разработаны полимеры, которые являются либо анионными (например, альгинат, каррагенин, карбоксиметилцеллюлоза и полиакриловая кислота)), либо катионными (например, хитозан, поли-Ь-лизин, полиэтиленимин и поли(аллиламин)) (см. в общем Бипп е1 а1., 1. Аррйеб Ро1утег 8с1. 50: 353-365, 1993; Савеопе е1 а1., 1. Ма1епа1в 8с1.: Ма1епа1в ίη Мебкте 5: 770-774, 1994; 8ЫгакЫ е1 а1., Вю1. РБагт. Ви11. 16(11): 1164-1168, 1993; ТНасНагоб! аиб Као, Ιηΐ'1 1. РБагт. 120: 115-118, 1995; М|уахак| е1 а1., Ιηΐ'1 1. РНагт. 118: 257-263, 1995).Representative examples of non-biodegradable polymers include copolymers of poly (ethylene vinyl acetate) (EUA), silicone rubber, acrylic polymers (polyacrylic acid, polymethyl acrylic acid, polymethyl methacrylate, polyalkyl cyanoacrylate), polyethylene, polypropylene, polyamides (nylon 6,6), polyurethane urethanes), poly (ether-urethanes), poly (ether-urea), polyesters (poly (ethylene oxide), poly (propylene oxide), P1igop1e polymers and poly (tetramethylene glycol)), silicone rubbers and vinyl polymers such as polyvinyl pyrrolidone, poly (vinyl alcohol), poly (vinilatsetatftalat). Polymers can also be developed that are either anionic (e.g. alginate, carrageenin, carboxymethyl cellulose and polyacrylic acid)) or cationic (e.g. chitosan, poly-L-lysine, polyethyleneimine and poly (allylamine)) (see generally Bipp e1 a1., 1. Arrieb Ro1uteg 8s1. 50: 353-365, 1993; Saveepe e1 a1., 1. Ma1epa1v 8s1 .: Ma1epa1v ίη Mebkte 5: 770-774, 1994; 8Gaky e1 a1., Vyu. RBt. Vi11. .16 (11): 1164-1168, 1993; Tnasnagob! Aib Kao, Ιηΐ'1 1. RBt. 120: 115-118, 1995; M | wahak | e1 a1., Ιηΐ'1 1. Rnag. 118: 257 263, 1995).

Полимерным носителям может быть придан ряд форм с желаемыми характеристиками высвобождения и/или с конкретными желаемыми свойствами. Например, могут быть созданы полимерные носители для высвобождения терапевтического агента под воздействием специфичного запускающего события, такого как рН (см., например, Не11ег е1 а1., СБеткаНу 8е1Г-Кеди1а1еб Эгид БеПуегу 8ув1етв, ίη Ро1утегв ίη Мебкте III, Е1веу1ег Баевсе РиЬНвБегв В. V., Атв1егбат, 1988, рр. 175-188; Канд е1 а1., 1. Аррйеб Ро1утег 8сг 48: 343-354, 1993; Бонд е1 а1., 1. СоШгоНеб Ке1еаве 19: 171-178, 1992; Бонд аиб Нойтащ 1. СогИгоНеб Ке1еаве 15: 141-152, 1991; К1т е1 а1., 1. СогИгоНеб Ке1еаве 28: 143-152, 1994; Сотсщ-Вгауо е1 а1., 1. СоШгоПеб Ке1еаве 33: 223-229,1995; XVи аоб Бее, РНагт. Кев. 10(10): 1544-1547, 1993; 8еггев е1 а1., РНагт. Кев. 13(2): 196-201, 1996; Реррав, Εиηбатеηίа1β оГ рН- аоб Тетре^аΐи^е-8еηβ^ΐ^νе БеПуегу 8ув1етв, ίη Ситу е1 а1. (ебв.), Ри1ваб1е Бгид БеНуегу, \V^ввеηвс11аΠ1^с11е Vе^1адвдевеΗвсΗаГι СтЬН, 81и11дап, 1993, рр. 41-55; Бое1кег Се11и1ове Бегщабуев, 1993, ίη Реррав аиб Баадег (ебв.), Вюро1утегв I, 8рппдегVе^1ад, Вег1т). Репрезентативные примеры рН-чувствительных полимеров включают поли(акриловую кислоту) и ее производные (включая, например, гомополимеры, такие как поли(аминокарбоновая кислоPolymeric carriers can be imparted a number of forms with desired release characteristics and / or with specific desired properties. For example, polymeric carriers can be created to release the therapeutic agent under the influence of a specific triggering event, such as pH (see, for example, He11eg e1 a1. V., Atv1egbat, 1988, pp. 175-188; Kand e1 a1., 1. Arrieb Pöluteg 8sg 48: 343-354, 1993; Bond e1 a1., 1. SosGgoNeb Ke1eave 19: 171-178, 1992; Bond aib Noytasch 1. SogGegoNeb Ke1eave 15: 141-152, 1991; K1t e1 a1., 1. SogGegoNeb Ke1eave 28: 143-152, 1994; Sotsksch-Vgauo e1 a1., 1. SogGoeb Peb Ke1eave 33: 223-229.1995; XVi aob Bey, RNag. Kev. 10 (10): 1544-154 7, 1993; 8eggev e1 a1., PHAut. Kev. 13 (2): 196-201, 1996; RERRAV, Εиηbateηίа1β оГ рН-аоб Тетре ^ аΐи ^ е-8еηβ ^ ΐ ^ νе БеПуегу 8в1етв, ίη Situ e1 a1. (e. 1ad, Veg1t). Representative examples of pH-sensitive polymers include poly (acrylic acid) and its derivatives (including, for example, homopolymers such as poly (aminocarboxylic acid)

- 6 017730 та); поли(акриловая кислота); поли(метилакриловая кислота), сополимеры таких гомополимеров и сополимеры поли(акриловой кислоты) и акрилмономеров, таких как обсужденные выше. Другие рНчувствительные полимеры включают полисахариды, такие как ацетатфталат целлюлозы; фталат гидроксипропилметилцеллюлозы; ацетатсукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы; ацетаттримеллилат целлюлозы и хитозан. Другие рН-чувствительные полимеры включают любую смесь рН-чувствительного полимера и водорастворимого полимера.- 6 017730 ta); poly (acrylic acid); poly (methyl acrylic acid), copolymers of such homopolymers and copolymers of poly (acrylic acid) and acryl monomers, such as those discussed above. Other pH sensitive polymers include polysaccharides, such as cellulose acetate phthalate; hydroxypropyl methylcellulose phthalate; hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate; cellulose acetate trimellate and chitosan. Other pH sensitive polymers include any mixture of a pH sensitive polymer and a water soluble polymer.

Подобным же образом могут быть получены полимерные носители, которые чувствительны к температуре (см., например, С.’кеп с1 а1., Νονοί Нуйгоде1к оГ а ТетрегаГиге-8епк1Г1уе Р1игошс СгаГГей Ю а Вюайкекгуе Ро1уасгу11с Лай ВаскЬопе Гог Уадша1 Эгид Оейуегу, ίη Ргосеей. 1п1егп. 8ушр. Сопко1. Ве1. Вюаск Ма1ег. 22: 167-168, Соп1го11ей Ве1еаке 8ос1е1у. 1пс., 1995; Окапо, Мо1еси1аг Эекди οί 8ΐίιηι.ι1ίВекропк1уе Нуйгоде1к Гог Тетрога1 СопГго11ей Эгид Пекуегу, ίη Ргосеей. 1пГегп. 8ушр. Соп1го1. Ве1. ВюасГ. МаГег. 22: 111-112, СопГго11ей Ве1еаке 8ос1е1у, 1пс., 1995; 1окпкГоп еГ а1., Ркагт. Век. 9(3): 425-433, 1992; Типд, 1пГ'1 1. Ркагт. 107: 85-90, 1994; Нагкк апй Секгке, 1. Соп1го11ей Ве1еаке 17: 175-186, 1991; Вае еГ а1., Ркагт Век. 8(4): 531-537, 1991; Ошагуапй апй П'Етапие1е, 1. Соп1го11ей Ве1еаке 36: 221-227, 1995; Уи апй Сгашдег, Νο\ό1 Ткегто-кепккгуе АтрЫрЫкс Се1к: Ро1у №1коргору1асгу1ат1йе-со-койшт асгу1аГе-со-п-№ а1ку1асгу1ат1йе №1\\όγ1< 8уп1кек1к апй Ркукюоске1шса1 СкагасГек/акоп, Эер1. оГ Скетка1 & Вю1одюа1 8ск, Огедоп СгайиаГе 1пккГиГе оГ 8с1епсе & Тескпо1оду, Веауейоп, ОВ, рр. 820-821; 2кои апй 8т1й, Ркук1са1 Нуйгоде1к оГ Аккошакуе 8Гаг Ро1утегк, Ро1утег Векеагск 1пкГкиГе, Эер1. оГ СкетЦку, Со11еде оГ Епу1гоптеп1а1 8аепсе апй Еогекку, 8(а1е Ищу. оГ №\ν Уогк, 8угасике, Ν.Υ., рр. 822-823; НоГГтап еГ а1., Скагас1епхшд Роге 8|/ек апй ^аГег '8ГгисГиге' ш 8ктик-Векропк1уе Нуйгоде1к, СепГег Гог Вюепдшееппд, Ишу. оГ ^аккшдГоп, 8еак1е, ^акк., р. 828; Υυ апй Сгашдег, Ткегто-кепккгуе 8\уеШпд Векауюг ш Сгокккпкей №1коргору1асгу1ат1йе №1\уогкк: СаГюшс, Ашошс апй Атрко1укс Нуйгоде1к, Эер1. оГ Скетюа1 & Вю1од1са1 8ск, Огедоп СгайиаГе 1пкГкиГе оГ 8аепсе & Тескпо1оду, Веауейоп, ОВ, рр. 829-830; К1т еГ а1., Ркагт Век. 9(3): 283-290, 1992; Вае еГ а1., Ркагт. Век. 8(5): 624-628, 1991; Копо еГ а1., 1. СопГго11ей Ве1еаке 30: 6975,1994; Υοкк^йа еГ а1., 1. СопГго11ей Ве1еаке 32: 97-102, 1994; Окапо еГ а1., 1. Соп1го11ей Ве1еаке 36: 125-133, 1995; Скип апй К1т, 1. СопГго11ей Ве1еаке 38: 39-47, 1996: О'Етапие1е апй Ошагуапй, 1пГ'1 1. Ркагт. 118: 237-242, 1995; КаГопо еГ а1., 1. СопГго11ей Ве1еаке 16: 215-228, 1991; НоГГтап, Ткегта11у Веуегк1Ь1е Нуйгоде1к Соп1ашшд Вю1одюа11у Асйуе 8рес1ек, ш М1дкагек1 еГ а1. (ейк.), Ро1утегк ш Мейюше III, Е1кеу1ег 8с1епсе РиЬкккегк В. V., АткГегйат, 1988, рр. 161-167; НоГГтап, Аррксайопк оГ Ткегта11у Веуегк1Ь1е Ро1утегк апй Нуйгоде1к ш Ткегареийск апй О1адпоккск, ш Ткйй 1пГегпакопа1 8утрокшт оп ВесепГ Айуапсек ш Эгид Оекуегу 8укГетк, 8а1Г Ьаке Ску, И1ак, ЕеЬ. 24-27, 1987, рр. 297-305; СиГо^кка еГ а1., 1. СопГго11ей Ве1еаке 22: 95-104, 1992; Ра1ак1к апй Секгке, 1. Соп1го11ей Ве1еаке 18: 1-12, 1992; Раауо1а еГ а1., Ркагт. Век. 12(12): 1997-2002, 1995).Polymeric carriers that are temperature sensitive can be obtained in a similar way (see, for example, S. ке kep c1 a1., Νονοί Nuigode1k OG and TetregaGige-8epk1G1ue R1igosg SzGGeu u Vuikekguye Ro1uascu11s Laeguegaske. 1p1gp 8shopka Sopko 1.Ve1. Vuask Máleg. 22: 167-168, Sop1go11ey Be1eake 8oc1e1u. Be1. VyuasG. MaGeg. 22: 111-112, SopGgo11ey Be1eake 8os1e1u, 1ps., 1995; 1kpkGop eG a1., Rkagt. Century 9 (3): 425-433, 1992 ; Tipd, 1nG'1 1. Rkagt. 107: 85-90, 1994; Nagkk ap Sekkke, 1. Sop1go11ey Be1eake 17: 175-186, 1991; Bae eG a1., Rkagt Vek. 8 (4): 531-537 , 1991; Oshaguapy apy P'Etapie1e, 1. Sop1go11ey Be1eake 36: 221-227, 1995; Uy apy Sgashdeg, Νο \ ό1 Tkegto-kepkkgee Atryrks Se1k: Ro1u №1 korgoruasguyatu-eiu-eiu-eiu-eiu-eiu-eiu-eiu-eiuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuu. 1 \\ όγ1 <8up1kek1k apy Rkukyuoske1shsa1 SkagasGek / Akop, Eer1. OG Sketka1 & Vyuodeyu1 8sk, Ogedop SgayiaGe 1pkkGiGe oG 8s1epse & Teskpo1odu, Beaureuop, O. 820-821; 2koy apy 8t1y, Rkuk1sa1 Nuigode1k oG Akkoshakue 8Gag Ro1utegk, Ro1uteg Vekeagsk 1pkGkiGe, Er1. OG Skettsku, Sodede oG Epu1gopept1a1 8aepse apy Eogekku, 8 (a1e I am looking for. OG № \ ν Wogk, 8ugasike, Ν.Υ., pp. 822-823; NoGGtap eG a1., Skagas1ephsh Rogue 8 | 's 8ktik-Vekropk1ue Nuigode1k, SepGeg Gog Vuyepdsheppd, Ishu.oG ^ aksdGop, 8eak1e, ^ acc., p. 828; Υυ apy Sgashdeg, Tkegto-kepkkgeue 8 \ uShpd Vekuyogueg1uyoguegusgueg1 apy Atrko1uks Nuigode1k, Eer1. OG Sketuua1 & Vu1od1sa1 8sk, Ogedop SgayiGe 1pkGkGe oG 8aepse & Teskpo1od, Beaueuop, OB, pp. 829-830; K1t eG a1. eG a1., Rkagt. Century 8 (5): 624-628, 1991; Copo eG a1., 1. SopGg o11ey Ve1eake 30: 6975.1994; Υοkk da ^ e T a1 1. SopGgo11ey Ve1eake 32:.. 97-102, 1994; Okapi e T a1 1. Sop1go11ey Ve1eake 36: 125-133, 1995; Skip apy K1t 1. SopGgo11e Beleake 38: 39-47, 1996: O'Etapie1e apy Oshaguapy, 1nG'1 1. Rkag. 118: 237-242, 1995; Kagopo eG a1., 1. SopGgo11e Beeake 16: 215-228, 1991; NOGGtap, Tkegta11u Veuegk1bu Nuigode1k Sop1ashshd Vu1odyuuuu Assyue 8res1ek, w M1dkagek1 eG a1. (nyk.), Rölutegg w Meiüche III, E1keu1eg 8c1epse Rwkkkegk V.V., AtkGegyat, 1988, pp. 161-167; NoGGtap, Arrksaiopk OG Tkegta11u Veuegk1b1e Ro1utegg apy Nuigode1k sh Tkegareiysky apy O1adpokksk, w Tkyy 1nGegpakopa 8 8troksht op VesepG Ayuapsek sh Egid Oekueguu, 8ku. 24-27, 1987, pp. 297-305; CiGo ^ kka eG a1., 1. SopGgo11ey Be1eake 22: 95-104, 1992; Ra1ak1k apy Seckke, 1. Sop1go11ey Be1eake 18: 1-12, 1992; Raauo1a eG a1., Rkagt. Century. 12 (12): 1997-2002, 1995).

Репрезентативные примеры терможелируемых полимеров и их температура желирования (ЬС8Т (нижняя критическая температура растворения, °С)) включают гомополимеры, такие как полиЩ-метилΝ-н-пропилакриламид), 19,8; поли(Ц-н-пропилакриламид), 21,5; поли(№метил-№изопропилакриламид), 22,3; поли(Ц-н-пропилметакриламид), 28,0; поли(№изопропилакриламид), 30,9; полиЩ^диэтилакриламид), 32,0; поли(№изопропилметакриламид), 44,0; поли(№циклопропилакриламид), 45,5; поли(№этилметакриламид), 50,0; поли(№метил-№этилакриламид), 56,0; поли(№циклопропилметакриламид), 59,0; поли(№этилакриламид), 72,0. Кроме того, терможелирующиеся полимеры могут быть изготовлены путем получения сополимеров из мономеров из числа вышеописанных либо путем объединения таких гомополимеров с другими водорастворимыми полимерами, такими как акриловые мономеры (например, акриловая кислота и ее производные, такие как метилакриловая кислота, акрилат и его производные, такие как бутилметакрилат, акриламид и Ν-н-бутилакриламид). Другие репрезентативные примеры терможелирующихся полимеров включают эфирные производные целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, 41°С; метилцеллюлоза, 55°С; гидроксипропилметилцеллюлоза, 66°С и этилгидроксиэтилцеллюлоза, а также Р1игошс, такие как Е-127, 10-15°С; Ь-122, 19°С; Ь-92, 26°С; Ь-81, 20°С и Ь-61, 24°С.Representative examples of thermo-gelable polymers and their gelation temperature (LC8T (lower critical dissolution temperature, ° C)) include homopolymers such as polySH-methylΝ-n-propylacrylamide), 19.8; poly (Cn-propylacrylamide), 21.5; poly (No. methyl-No. isopropylacrylamide), 22.3; poly (Cn-propylmethacrylamide), 28.0; poly (No. isopropylacrylamide), 30.9; polySC ^ diethyl acrylamide), 32.0; poly (No. isopropylmethacrylamide), 44.0; poly (No. cyclopropylacrylamide), 45.5; poly (No. ethyl methacrylamide), 50.0; poly (No. methyl-No. ethyl acrylamide), 56.0; poly (No. cyclopropylmethacrylamide), 59.0; poly (No ethyl acrylamide), 72.0. In addition, thermosettable polymers can be made by preparing copolymers from the monomers described above, or by combining such homopolymers with other water-soluble polymers, such as acrylic monomers (e.g., acrylic acid and its derivatives, such as methyl acrylic acid, acrylate and its derivatives, such like butyl methacrylate, acrylamide and Ν-n-butyl acrylamide). Other representative examples of thermosetting polymers include cellulose ether derivatives such as hydroxypropyl cellulose, 41 ° C; methyl cellulose, 55 ° C; hydroxypropyl methylcellulose, 66 ° C and ethyl hydroxyethyl cellulose, as well as P1igoshs, such as E-127, 10-15 ° C; L-122, 19 ° C; L-92, 26 ° C; B-81, 20 ° C and b-61, 24 ° C.

С помощью полимерных носителей по настоящему изобретению может быть получено большое разнообразие форм, включая, например, устройства палочкообразной формы, гранулы, пеллеты или капсулы (см., например, Соойе11 еГ а1., Ат. 1. Нокр. Ркагт. 43: 1454-1461, 1986; Ьапдег еГ а1., Сопко11ей ге1еаке оГ тасгото1еси1ек Ггот ро1утегк, ш Вютейюа1 Ро1утегк, Ро1утепс МаГека1к апй Ркагтасеикса1к Гог Вютейюа1 Ике, Со1йЬегд, Е.Р., Nакад^т, А. (ейк.) Асайетю Ргекк, рр. 113-137, 1980; ВЫпе еГ а1., 1. Ркагт. 8ск 69: 265-270, 1980; Вго\уп еГ а1., 1. Ркагт. 8ск 72: 1181-1185, 1983; и Ва\га еГ а1., 1. Сопко11ей Ве1еаке 1:259-267, 1985).Using the polymeric carriers of the present invention, a wide variety of forms can be obtained, including, for example, rod-shaped devices, granules, pellets or capsules (see, for example, Sooye11 eG a1., At. 1. No. Rkagt. 43: 1454- 1461, 1986; Lapdeg eG a1., Sopkoye geleke oG tasgoto1esiek Ggot ro1utegk, w Vutejuya1 Rölutegk, Ro1uteps MaGekaq apy Rkagtaseiksa1k Gog Vyuteyua1 Ike, Sölégéd. 113-137, 1980; Vyp eG a1., 1. Proc. 8sk 69: 265-270, 1980; Vgo \ up eG a1., 1. Proc. 8sk 72: 1181-1185, 1983; and Ba \ ha eG a1 ., 1. Sopko11ey Be1eake 1: 259-267, 1985).

Терапевтические агенты могут быть включены путем заключения в матрицы полимера, присоединены посредством ковалентных связей или инкапсулированы в микрокапсулы. В некоторых предпочтительных воплощениях изобретения предложены терапевтические композиции в некапсулярных препаратах, таких как микросферы (в диапазоне от нанометров до микрометров по размеру), пасты и волокна различного размера, пленки и спреи.Therapeutic agents can be incorporated by encapsulation in a polymer matrix, attached via covalent bonds, or encapsulated in microcapsules. In some preferred embodiments of the invention, therapeutic compositions are provided in non-capsular formulations, such as microspheres (ranging from nanometers to micrometers in size), pastes and fibers of various sizes, films and sprays.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена терапевтическая композиция и корм для жиIn another aspect of the present invention, there is provided a therapeutic composition and live food

- 7 017730 вотных. Терапевтическая композиция по настоящему изобретению может быть инкапсулирована с использованием полимерного носителя, как описано выше, а затем добавлена в корм любыми известными способами введения ее в корм, такими как, например, механическое перемешивание, распыление и т.д. Терапевтическая композиция включает, например, количество по меньшей мере одного бактериоцина, эффективное, по меньшей мере, для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактериеймишенью у животного, такое как, например, примерно 0,5 г бактериоцина(ов)/100 г, примерно 1,25 г полимерного носителя, такого как поливинилпирролидон/100 г, и примерно 8,6% разбавителя, такого как вода/100 г, смешанные с любым гранулярным компонентом, который является усвояемым, таким как, например, молотое кукурузное зерно; молотое зерно, такое как, например, овес, пшеница, гречка; измельченные плоды, такие как, например, груши и т.д. Затем терапевтическую композицию добавляют в любой тип корма для животных в количествах, эффективных, по меньшей мере, для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью, например, при отношениях бактериоцина к корму от примерно 1:10 до примерно 1:100. Для целей настоящего изобретения примеры корма для животных включают фураж, силос, сушеный фураж, корни, клубни, сочные фрукты, зерно, семена и отработанный солод, мезга, пивные дрожжи, остатки после перегонки, отходы мукомольного производства, побочные продукты производства сахара, производства крахмала или масла и различные пищевые отходы. Продукт может быть добавлен в корм животных, используемый для разведения крупного рогатого скота, домашней птицы, кроликов, свиней или овец и т.д. Он может быть смешан с другими пищевыми добавками для данного исходного корма.- 7 017730 of those. The therapeutic composition of the present invention can be encapsulated using a polymer carrier as described above, and then added to the feed by any known means of introducing it into the feed, such as, for example, mechanical stirring, spraying, etc. A therapeutic composition includes, for example, an amount of at least one bacteriocin effective at least to reduce colonization levels of at least one target bacterium in an animal, such as, for example, about 0.5 g of bacteriocin (s) / 100 g, about 1.25 g of a polymer carrier, such as polyvinylpyrrolidone / 100 g, and about 8.6% of a diluent, such as water / 100 g, mixed with any granular component that is digestible, such as, for example, ground corn kernels; ground grain, such as, for example, oats, wheat, buckwheat; shredded fruits, such as pears, etc. The therapeutic composition is then added to any type of animal feed in amounts effective at least to reduce colonization levels by at least one target bacterium, for example, with a ratio of bacteriocin to feed of from about 1:10 to about 1: 100. For the purposes of the present invention, examples of animal feed include fodder, silage, dried fodder, roots, tubers, juicy fruits, grains, seeds and spent malt, pulp, brewer's yeast, distillation residues, flour milling waste, sugar by-products, starch production by-products or oils and various food waste. The product can be added to animal feed used for breeding cattle, poultry, rabbits, pigs or sheep, etc. It can be mixed with other nutritional supplements for a given feed source.

Приведенные ниже примеры предназначены только для дополнительной иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, который определен формулой изобретения.The following examples are intended only to further illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention, which is defined by the claims.

Пример 1.Example 1

Два новых антагонистических штамма, Еп1етососси8 Гаесшш штамм 50-52 (ΝΚΚΤ В-30746) и 81тер1ососси8 спсеШ5 штамм 760 (ΝΚΚΤ В-30745), были выделены с поверхности слизистой оболочки примерно 1,0 г слепой кишки бройлеров, которую суспендировали в примерно 10 мл стерильного 0,85%ного (мас./об.) физиологического раствора (нормального физиологического раствора) и нагревали примерно при 80°С в течение примерно 15 мин. Примерно 0,10 мл суспензий примерно 1:50 и 1:2500 высевали распылением либо на агар для подсчета колоний, либо на агар МК8. Чашки инкубировали примерно при 37°С в течение примерно 24 ч в микроаэробных условиях. Колонии с различной морфологией рассевали штрихом на агаре МК8. Эти культуры инкубировали в микроаэробных условиях в течение примерно 24 ч примерно при 37°С.Two new antagonistic strains, Ep1etosossi8 Gaess strain 50-52 (ΝΚΚΤ B-30746) and 81ter1ossossi8 strain 560 strain 760 (ΝΚΚΤ B-30745), were isolated from the surface of the mucous membrane of approximately 1.0 g of the broiler caecum, which was suspended in about 10 ml sterile 0.85% (w / v) physiological saline (normal saline) and heated at about 80 ° C for about 15 minutes. Approximately 0.10 ml of suspensions of approximately 1:50 and 1: 2500 were seeded by spraying either on agar to count the colonies, or on MK8 agar. The plates were incubated at approximately 37 ° C for approximately 24 hours under microaerobic conditions. Colonies with different morphology were scattered by stroke on MK8 agar. These cultures were incubated under microaerobic conditions for about 24 hours at about 37 ° C.

Штамм 760 выращивали примерно при 37°С в течение примерно 24 ч на агаре МК8. Этот штамм является факультативным аэробом с грамположительными кокками и способен к росту между примерно 37 и 45°С. Этот штамм растет на питательном агаре или на агаре для подсчета колоний, образуя округлые слабовыпуклые сероватые колонии правильной формы с волнистыми краями, которые имеют диаметр примерно 2 мм после аэробной инкубации примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Биохимические свойства штамма 760 определяли с помощью системы ЛР1 50 СЬН (Вю-Мепеих, Ртапсе). Этот штамм расщепляет лактозу, маннит, рибозу, салицин, сорбит, трегалозу, арабинозу и мелибиозу. Он слабо гидролизует раффинозу и инулин и не гидролизует аргинин и эскулин. Он не способен к а- и βгемолизу. Он не растет в присутствии примерно 6,5% хлорида натрия. Этот штамм является отрицательным по каталазе.Strain 760 was grown at approximately 37 ° C for approximately 24 hours on MK8 agar. This strain is an optional aerobic with gram-positive cocci and is capable of growing between about 37 and 45 ° C. This strain grows on nutrient agar or on agar for colony counting, forming round, slightly convex grayish colonies of regular shape with wavy edges that have a diameter of about 2 mm after aerobic incubation at about 37 ° C for about 24 hours. The biochemical properties of strain 760 were determined with using the LR1 50 CHN system (Vu-Mepeih, Rtaps). This strain breaks down lactose, mannitol, ribose, salicin, sorbitol, trehalose, arabinose and melibiosis. It weakly hydrolyzes raffinose and inulin and does not hydrolyze arginine and esculin. He is not capable of a - and β hemolysis. It does not grow in the presence of approximately 6.5% sodium chloride. This strain is catalase negative.

Штамм 50-52 выращивали на агаре МК8 примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Этот штамм является факультативным аэробом с грамположительными кокками, способен расти на питательном агаре или на агаре для подсчета колоний, образуя округлые слабовыпуклые сероватые колонии неправильной формы с волнистыми краями, которые имеют диаметр примерно 1 мм после аэробной инкубации примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Биохимические свойства штамма 50-52 определяли с помощью системы тестирования ΕΝ-Соссиз. Этот штамм расщепляет аргинин, арабинозу и маннит и не гидролизует сорбозу, сорбит, мелибиозу, раффинозу и метицитозу. Он растет в присутствии примерно 6,5% хлорида натрия.Strain 50-52 was grown on MK8 agar at about 37 ° C for about 24 hours. This strain is an optional aerobic with gram-positive cocci, able to grow on nutrient agar or on agar for colony counting, forming rounded, slightly convex grayish irregular colonies with wavy edges which have a diameter of about 1 mm after aerobic incubation at about 37 ° C for about 24 hours. The biochemical properties of strain 50-52 were determined using the С-Sossis testing system. This strain breaks down arginine, arabinose and mannitol and does not hydrolyze sorbose, sorbitol, melibiosis, raffinose and methicytosis. It grows in the presence of approximately 6.5% sodium chloride.

Бактерии-мишени для оценки антагонистической активности штаммов 50-52 и 760 включали изоляты Сашру1оЬас1ет _)е.)иш (С. )сщш) N00 11168, 8. еШетйШз и Е. сой 0157:Н7. Культуры С. )ещш выращивали на агаре для Вгисе11а или на агаре для Сашру1оЬас1ет, содержащем примерно 5% частично гемолизированной крови, примерно при 42°С в течение примерно 24-48 ч в микроаэробных условиях с примерно 5% О₂, примерно 10% СО₂ и примерно 85% Ν₂. Другие штаммы культивировали на питательном агаре примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Оценивали антагонистическую активность изолятов против СашруюЬас1ет. Примерно 0,2 мл суспензий в нормальном физиологическом растворе высевали на агар МК8 и инкубировали примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Вырезали кубики агара МК8 объемом примерно 0,5 см³ и переносили на агар для ВтисеИа или агар для Сашру1оЬас1ет с добавлением примерно 5-10% частично гемолизироваиной крови, примерно 10 мкг/мл рифампицина и примерно 2,5 ед./мл полимиксина и инокулировали примерно 10⁷ клеток Сашру1оЬас1ет )сщш на чашку. Чашки инкубировали примерно при 42°С в течение примерно 24-48 ч в микроаэробных условиях, как описано выше.Target bacteria for assessing the antagonistic activity of strains 50-52 and 760 included the isolates Caspulobacteri) e.) Ish (C.) ssch) N00 11168, 8. eSchetius and E. soy 0157: H7. C. cultures were still grown on agar for Bryce11a or on agar for Sashrubacter containing about 5% partially hemolyzed blood, at about 42 ° C for about 24-48 hours under microaerobic conditions with about 5% O ₂ , about 10% CO ₂ and approximately 85% Ν ₂ . Other strains were cultured on nutrient agar at approximately 37 ° C for approximately 24 hours. The antagonistic activity of the isolates against Sashulobact was evaluated. About 0.2 ml of suspensions in normal saline was plated on MK8 agar and incubated at about 37 ° C for about 24 hours. Cubes of MK8 agar were cut out with a volume of about 0.5 cm ³ and transferred onto Bacterium agar or agar for Sachrubacet supplemented with about 5-10% of partially hemolysed blood, about 10 μg / ml of rifampicin and about 2.5 units / ml of polymyxin were inoculated and about 10 ⁷ cells of Sachrubacanth) per cup were inoculated. The plates were incubated at about 42 ° C for about 24-48 hours under microaerobic conditions, as described above.

- 8 017730- 8 017730

Антагонистическую активность оценивали на основании измерения диаметра зон ингибирования С. _)е.Щш.Antagonistic activity was evaluated on the basis of measuring the diameter of the zones of inhibition C. _) e.

Пример 2.Example 2

Сырые противомикробные препараты экстрагировали из культур двух антагонистических штаммов: Еп!етососси8 50-52 и 81тер1ососси5 760. Антагонисты выращивали в примерно 250 мл 10% среды для Вгисе11а совместно со штаммом-индуктором Ьас1оЬасосси8 1асЙ8 штамм 320 (ΝΚΚΕ В-30744, см. выше) примерно при 37°С в течение примерно 14 ч в аэробных условиях. Концентрация штамма-продуцента составляла примерно 10⁶ КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл, а для штамма-индуктора примерно 10⁷КОЕ/мл. Полученные в результате культуры центрифугировали примерно при 2500/д в течение примерно 10 мин, удаляя большую часть жизнеспособных клеток. Декантированный супернатант смешивали с примерно 60%-ным насыщенным раствором сульфата аммония и инкубировали примерно при 4°С в течение примерно 24 ч для осаждения бактериоциновых соединений.Crude antimicrobial preparations were extracted from cultures of two antagonistic strains: Ep! Etosossi8 50-52 and 81ter1ossosi5 760. Antagonists were grown in about 250 ml of 10% Bris11a medium together with the inducer strain Laclocassi8 1aci8 strain 320 (ΝΚΚΕ B-30744, above. at about 37 ° C for about 14 hours under aerobic conditions. The concentration of the producer strain was about 10 ⁶ CFU / ml, and for the inducer strain, about 10 ⁷ CFU / ml. The resulting cultures were centrifuged at about 2500 / d for about 10 minutes, removing most of the viable cells. The decanted supernatant was mixed with about 60% saturated ammonium sulfate and incubated at about 4 ° C for about 24 hours to precipitate bacteriocin compounds.

После центрифугирования при примерно 10000/д в течение примерно 20 мин осадок ресуспендировали в примерно 1,5 мл примерно 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН примерно 7,0, и диализовали в течение ночи против примерно 2,5 л того же буфера. Этот раствор обозначали как сырой антимикробный препарат (САП). Каждый образец препарата стерилизовали путем пропускания через фильтр с порами 0,22 мкм (Мййроте, ВебГогб, МА, ϋ8ΌΑ). В табл. 1 показано продуцирование бактериоцина с использованием и штамма-индуктора и без него.After centrifugation at about 10,000 / d for about 20 minutes, the pellet was resuspended in about 1.5 ml of about 10 mM sodium phosphate buffer, pH about 7.0, and dialyzed overnight against about 2.5 L of the same buffer. This solution was designated as crude antimicrobial preparation (SAP). Each sample of the preparation was sterilized by passing through a 0.22 μm filter with pores (Meyrote, WebGogb, MA, ϋ8ΌΑ). In the table. 1 shows the production of bacteriocin with and without an inducer strain.

Таблица1Table 1

Продуцирование бактериоцина с использованием и без использования штамма-индуктора Ьас1ососси8 1асЙ8 штамм 320The production of bacteriocin with and without the use of the strain inducer Lac1ossoss8 1acJ8 strain 320

Способ культивирования Cultivation method Бактериоцин 760 Bacteriocin 760 Бактериоцин 50-52 Bacteriocin 50-52 Кол-во белка, МГ Amount of protein, MG Активность УЕ/мл Activity UE / ml Удельная активность УЕ/мг The specific activity of UE / mg ДСНПААГ DSNPAAG ИЭФ IEF Кол-во белка, мг Amount of protein, mg Активность УЕ/мл Activity UE / ml Удельная активность УЕ/мг The specific activity of UE / mg ДСНПААГ DSNPAAG ИЭФ IEF Со штамме м-индуктором With strain m-inducer 0,18 0.18 51200 51200 284444 284444 5.5 кДа 5.5 kDa 9.5 9.5 0,04 0.04 12800 12800 320000 320,000 3,9 кДа 3.9 kDa 8,4 8.4 Без штамма-индуктора Without inducer strain 0,04 0.04 6400 6400 160000 160,000 5,5 кДа 5.5 kDa 9,5 9.5 0,015 0.015 3200 3200 213333 213333 3,9 кДа 3.9 kDa 8,4 8.4

Пример 3.Example 3

Спектр антимикробной активности САП определяли, используя капельный тест. Примерно 1 мл стерильных сырых антимикробных препаратов (САП), полученных, как в примере 2 выше, разводили примерно 1 мл натрий-фосфатного буфера (рН примерно 7,0) и стерилизовали, как в примере 2 выше. Примерно 10 мкл каждого образца помещали на чашку с агаром для Сашру1оЬас1ет с добавлением крови или с питательным агаром (МРА или Ме1а Рер1опе Адат), предварительно засеянную клетками бактериймишеней. Чашки, содержащие культуры С. _)е)иш, выращивали примерно при 42°С в микроаэробных условиях, Υ. еШетосойбса и Υ. р8еибо1иЬегси1оЙ8 культивировали в аэробных условиях примерно при 28°С, и другие бактериальные штаммы инкубировали в аэробных условиях примерно при 37°С в течение примерно 24 или 48 ч. Идентификация была основана на областях ингибирования для бактерий-мишеней. Активность САП выражали в условных единицах (УЕ) на 1 мл препарата, когда появлялась видимая зона ингибирования роста культуры (Непбегаоп е1 а1., АтсЫуек оГ Вюсйепийгу апб Вюрйуйск, Уо1ите 295, 512, 1992; включено здесь путем ссылки). Все эксперименты проводили в двух повторах (см. табл. 2 в примере 4 ниже).The spectrum of antimicrobial activity of SAP was determined using a drip test. About 1 ml of sterile crude antimicrobial preparations (SAP) obtained as in Example 2 above was diluted with approximately 1 ml of sodium phosphate buffer (pH about 7.0) and sterilized as in Example 2 above. Approximately 10 μl of each sample was placed on a plate with agar for Sashrubacet with the addition of blood or with nutrient agar (MPA or Meya Papiope Adat), previously seeded with target bacteria cells. Cups containing cultures of C. _) e) ish were grown at about 42 ° C under microaerobic conditions, Υ. eShetosoibsa and Υ. pebiblibeclio8 was cultured under aerobic conditions at about 28 ° C, and other bacterial strains were incubated under aerobic conditions at about 37 ° C for about 24 or 48 hours. Identification was based on inhibition regions for target bacteria. The activity of SAP was expressed in arbitrary units (UE) per 1 ml of the drug when a visible zone of inhibition of growth of the culture appeared (Nepbegaop e1 a1., Atsyuek oG Vusyepiigu apb Vyuryuysk, Uoite 295, 512, 1992; included here by reference). All experiments were performed in duplicate (see table. 2 in example 4 below).

Пример 4.Example 4

Проводили электрофорез САП и бактериоцинов в примерно 15%-ном (по массе) агарозном геле с примерно 1% ДСН (9/12 см) в Трис-глициновом буфере. После электрофореза примерно при 100 мА в течение примерно 4 ч гели фиксировали раствором, содержащим примерно 15% этанола и примерно 1% уксусной кислоты. Затем гели промывали дистиллированной водой в течение примерно 4 ч. Для определения молекулярных масс белковых фракций гель окрашивали раствором, содержащим примерно 0,21% Кумасси синего 0-250, примерно 40% этанола и примерно 7% уксусной кислоты. Промытые гели тестировали против трех бактерий-мишеней, С. )е_)иш ΝΟΤΟ 11168, Е. сой 0157:Н7 904 и 8. еп!егй1б18 204, методом Вйиша е1 а1. (1оитпа1 оГ 1пби81па1 М1стоЬю1оду, Уо1ите 2, 319-322, 1987; включено здесь путем ссылки). Гели помещали в чашки Петри, покрывали полутвердым агаром для Сатру1оЬас1ет с 5% крови (примерно 0,75%) или полутвердым МРА и засевали клетками тестируемых штаммов. Чашки, содержащие С. _)е)иш, инкубировали примерно при 42°С в течение примерно 48 ч в микроаэробных условиях, Е. сой 0157.Н7 и 8. еШепбШбй - примерно при 37°С в течение примерно 24 ч. Оценка была основана наElectrophoresis of SAP and bacteriocins was performed on an approximately 15% (by weight) agarose gel with approximately 1% SDS (9/12 cm) in Tris-glycine buffer. After electrophoresis at about 100 mA for about 4 hours, the gels were fixed with a solution containing about 15% ethanol and about 1% acetic acid. Then the gels were washed with distilled water for about 4 hours. To determine the molecular weights of the protein fractions, the gel was stained with a solution containing about 0.21% Coomassie blue 0-250, about 40% ethanol and about 7% acetic acid. The washed gels were tested against three target bacteria, C.) e_) ish ΝΟΤΟ 11168, E. soi 0157: H7 904 and 8. en! Ery1b18 204, by the method of Vyish e1 a1. (1itp1 oG 1pb81np1 MlstoLyuod, Woit 2, 319-322, 1987; incorporated herein by reference). The gels were placed in Petri dishes, coated with Semi-solid agar for Satru1bac1et with 5% blood (approximately 0.75%) or semi-solid MPA, and seeded with cells of the tested strains. Cups containing C. _) e) ish were incubated at about 42 ° C for about 48 hours under microaerobic conditions, E. Soi 0157. H7 and 8. eShepbShby - at about 37 ° C for about 24 hours. Evaluation was based on

- 9 017730 визуализации зон ингибированного роста тестируемых штаммов в присутствии бактериоцинов.- 9 017730 visualization of zones of inhibited growth of the tested strains in the presence of bacteriocins.

Посредством изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) идентифицировали две отдельные фракции, которые различались по изоэлектрическим точкам (р1). САП 760 содержал фракции с р1, равными примерно 9,2 и примерно 9,5. САП 50-52 содержал фракции с р1, равными примерно 7,7 и 8,4. Антагонистическую активность в отношении С. _)е_)иш наблюдали для фракции с р1, равным примерно 9,5, в препарате 760, тогда как в препарате 50-52 это ингибирование наблюдали для фракции с р1, равным примерно 8,4 (фиг. 1А-Б и 2А-Б, табл. 1 выше).Through isoelectric focusing (IEF), two separate fractions were identified that differed by isoelectric points (p1). SAP 760 contained fractions with p1 equal to about 9.2 and about 9.5. SAP 50-52 contained fractions with p1 equal to about 7.7 and 8.4. Antagonistic activity against C. _) e_) ish was observed for the fraction with p1 equal to about 9.5 in the preparation 760, whereas in the preparation 50-52 this inhibition was observed for the fraction with p1 equal to about 8.4 (Fig. 1A-B and 2A-B, Table 1 above).

Гели, покрытые Сатру1оЬас1ег )е)ипг использовали, чтобы определить, какая(ие) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 1А и 1Б для бактериоцина 760 показана молекулярная масса активной фракции (1А) и изоэлектрическая точка для активной фракции (1Б). Гели покрывали Сашру1оЬас1ет )е)шн для определения антимикробной активности, молекулярной массы и изоэлектрической точки. На фиг. 1А, дорожка 1, показаны маркеры молекулярной массы диапазона низких молекулярных масс (НММ) 14400-94000 (Атегкйат Рйагтааа Вю1ес11): 14000; 20100; 30000; 43000; 67000 и 94000 Да. На дорожке 2 находятся маркеры молекулярной массы для инсулина, цепь β (81дша, И8А): 3500 Да. На дорожке 3 показан чистый бактериоцин 760, который соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста (стрелка) имеет массу примерно 5500 Да. На фиг. 1Б, дорожка 1, показаны стандарты р1 (Рго1еш Тек! М1х1иге, р1 Магкег Рго1ешк, 8егуа). На дорожке 2 показан чистый бактериоцин 760, который соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста (стрелка) имеет р1 примерно 9,5. Другие полосы не проявляли антимикробную активность.The gels coated with SatuObacac e) ipn were used to determine which band (s) corresponds to the antimicrobial activity, molecular weight and isoelectric point. In FIG. 1A and 1B for bacteriocin 760, the molecular weight of the active fraction (1A) and the isoelectric point for the active fraction (1B) are shown. The gels coated Sashrubobacet) e) sn to determine the antimicrobial activity, molecular weight and isoelectric point. In FIG. 1A, lane 1, molecular weight markers of the low molecular weight range (HMM) 14400-94000 (Ategkyat Ryagtaau1es11) are shown: 14000; 20100; 30000; 43,000; 67000 and 94000 Yes. Lane 2 contains molecular weight markers for insulin, β chain (81dsh, I8A): 3500 Da. Lane 3 shows pure bacteriocin 760, which corresponds to antimicrobial activity, the growth inhibition zone (arrow) has a mass of about 5500 Da. In FIG. 1B, lane 1, p1 standards are shown (Rgo1esh Tek! M1x1ige, r1 Magkeg Rgo1eshk, 8egua). Lane 2 shows pure bacteriocin 760, which corresponds to antimicrobial activity, the growth inhibition zone (arrow) has a p1 of about 9.5. Other bands did not show antimicrobial activity.

На фиг. 2А и 2Б показано прямое обнаружение бактериоцина 50-52 с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ (2А) и изоэлектрического фокусирования (2Б). Гель покрывали Сашру1оЬас!ет |е|ип1, чтобы определить, какая(ие) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности и молекулярной массе, как показано на фиг. 2А. На дорожке 1 показаны маркеры молекулярной массы диапазона НММ 1600-26000 (Атегкйат Рйатшас1а Вю1ес11): 1600; 3500; 6500; 14200; 17000 и 26000 Да. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый бактериоцин 50-52, соответствует антимикробной активности, зоне ингибирования роста и имеет массу примерно 3900 Да. На фиг. 2Б дорожка 1 содержит стандарты р1 (Рто!еш Тек! М1х!ите, р1 Магкег Рто!ешк, 8егуа). Полоса на дорожке 2 (чистый бактериоцин 50-52), которая соответствует антимикробной активности, зоне ингибирования роста (стрелка), имеет р1 примерно 8,4. Другие полосы не проявляли антимикробную активность.In FIG. 2A and 2B show the direct detection of bacteriocin 50-52 using SDS-PAGE (2A) and isoelectric focusing (2B). The gel was coated with Casparbacet | e | vn1 to determine which band (s) corresponded to the antimicrobial activity and molecular weight, as shown in FIG. 2A. Lane 1 shows molecular weight markers of the NMM range 1600-26000 (Ategkyat Ryatshas1a Vu1es11): 1600; 3,500; 6500; 14,200; 17000 and 26000 Yes. The strip in lane 2, which contains pure bacteriocin 50-52, corresponds to antimicrobial activity, a zone of growth inhibition, and has a mass of about 3900 Da. In FIG. 2B, track 1 contains the standards p1 (Pto! Yes Tech! M1x! It, p1 Magkeg Pto! Yeshk, 8egua). The lane in lane 2 (pure bacteriocin 50-52), which corresponds to antimicrobial activity, the growth inhibition zone (arrow), has a p1 of about 8.4. Other bands did not show antimicrobial activity.

Образцы бактериоцинов наносили на гели для ИЭФ (рН примерно 4,4-10,0) (Ыоуех, 8ап П1едо, СА). Эти гели подвергали электрофорезу примерно при 100 В в течение примерно 1 ч, 200 В в течение примерно 2 ч и 500 В в течение примерно 30 мин в мини-камере ХСМ11™ (Ыоуех). Гели промывали дистиллированной водой в течение примерно 4 ч без фиксации с последующим окрашиванием Кумасси синим С-250 для определения изоэлектрических точек (р1) бактериоцинов и их способности к ингибированию роста тестируемых образцов, как представлено на фиг. 1 и 2 и в табл. 2.Samples of bacteriocins were applied to IEF gels (pH about 4.4-10.0) (Yueh, 8ap P1edo, CA). These gels were subjected to electrophoresis at about 100 V for about 1 hour, 200 V for about 2 hours, and 500 V for about 30 minutes in an XM11 ™ mini-camera (Boeh). The gels were washed with distilled water for about 4 hours without fixation, followed by Coomassie blue staining with C-250 to determine the isoelectric points (p1) of the bacteriocins and their ability to inhibit the growth of test samples, as shown in FIG. 1 and 2 and in table. 2.

Таблица 2table 2

Антимикробная активность сырых антимикробных препаратов (САП) бактериоцинов, оцененная методами капельного теста, электрофореза в ДСН-ПААГ и изоэлектрического фокусирования (ИЭФ)Antimicrobial activity of crude antimicrobial agents (SAP) of bacteriocins, evaluated by drop test, SDS-PAGE and isoelectric focusing (IEF)

Бактериоцин Bacteriocin Тестируемые штаммы Test strains Ингибиторная активность в капельном тесте (УЕ/мл) Inhibitory activity in the drip test (UE / ml) Ингибиторная активность, измеренная по ДСН-ПААГ Inhibitory activity measured by SDS-PAGE Ингибиторная активность, измеренная по ИЭФ Inhibitory activity measured by IEF 760 760 С. ]θ)υπί ΝΟΤΟ 11168 3. еп1впИсНз 204 Е. соН 0157:Н7 904 C.] θ) υπί ΝΟΤΟ 11168 3. ENPIDIOSNZ 204 E. CON 0157: H7 904 51200 12800 12800 51200 12800 12800 ММ 5,5 «Да ММ 5,5 кДа ММ 5,5 «Да MM 5.5 "Yes MM 5.5 kDa MM 5.5 "Yes полоса 1 ρΙ=9,5 полоса 1 ρΙ=9,5 полоса 1 р!=9,5 lane 1 ρΙ = 9.5 lane 1 ρΙ = 9.5 lane 1 p! = 9.5 50-52 50-52 С. ]ββϊηί АТСС 11168 3. еМепИсИз 204 Е. соЛ0157:Н7 904 C.] ββϊηί ATCC 11168 3. eMepisis 204 E. col0157: H7 904 12800 12800 3200 12800 12800 3200 ММ 3,9 кДа ММ 3,9 кДа ММ 3,9 кДа MM 3.9 kDa MM 3.9 kDa MM 3.9 kDa полоса 1 ρΙ=8,4 полоса 1 р!=8,4 полоса 1 р!=8,4 lane 1 ρΙ = 8.4 lane 1 p! = 8.4 lane 1 p! = 8.4

Пример 5.Example 5

Продуценты Еп1егососсик штамм 50-52 и 8!тер!ососсик штамм 760 культивировали одновременно со штаммом-индуктором бактерий Ьас!ососсик 1асйк (штамм 320; см. выше) в среде для Вгисе11а (Эйсо). Примерно 1,32х10⁷ клеток Ейегососсик Гаесшш или 8!тер!ососик спсеШк помещали совместно с примерно 3,9х 10⁶ клеток Ьас!ососсик 1асйк в колбы емкостью 250 мл и культивировали в течение примерно 24 ч. Концентрации продуцирующих и индукторных штаммов определяли каждые 2 ч параллельно с удельнойThe producers of Epilossossic strain 50-52 and 8! Ter! Ossossic strain 760 were cultured simultaneously with the strain of inducer of bacteria Lac! Ossossic Acac (strain 320; see above) in Brice11a (Eiso) medium. Approximately 1.32 x 10 ⁷ Eyegosossik Gaesssh cells or 8! Ter! Ososik spseSkk were placed together with approximately 3.9 x 10 ⁶ bac! Osossik 1asik cells in 250 ml flasks and cultured for approximately 24 hours. The concentrations of producing and inducer strains were determined every 2 h in parallel with the specific

- 10 017730 активностью бактериоцина, чтобы определить оптимальное время для получения полезных количеств бактериоцина. Бактериоцины выделяли и очищали двумя способами. Первый способ представлял собой осаждение бактериоцина с использованием сульфата аммония с последующей трехстадийной хроматографией: гель-фильтрация на Зирегоке 12 НВ, ионообменная хроматография на Зирегоке ЗРРР и гидрофобной хроматографии на Ос1у1 Зерйагоке 4 РР. Этот способ представляет собой способ А.- 10 017730 bacteriocin activity to determine the optimal time to obtain beneficial amounts of bacteriocin. Bacteriocins were isolated and purified in two ways. The first method was the deposition of bacteriocin using ammonium sulfate, followed by three-stage chromatography: gel filtration on Ziregok 12 HB, ion-exchange chromatography on Ziregok ZRRP and hydrophobic chromatography on Osl1 Zerjagok 4 PP. This method is method A.

Для способа Б при одновременном культивировании штамма-продуцента и индуктора большая часть продуцируемого бактериоцина секретируется в культуральную жидкость. Часть бактериоцина адсорбируется на клетках обоих штаммов, продуцента и индуктора. Для того чтобы избежать потери адсорбированного бактериоцина, бактериоцин элюируют из клеток. Способ Б включает две стадии: (1) выделение бактериоцина из супернатанта культуральной жидкости и (2) выделение бактериоцина из осадка клеток обоих штаммов, продуцента и индуктора. На стадии 1 культуры собирают и разделяют центрифугированием примерно при 10000 д в течение примерно 15 мин для осаждения клеток. Супернатант наносят на колонку Ос1у1 Зерйагоке 4 РР для выделения бактериоцина. Клеточный осадок используют на стадии 2. Осадок суспендировали в фосфатном буфере с примерно 0,7%-ным №1С1. рН (буфер для элюирования) и суспензию перемешивали и инкубировали в течение примерно 20 мин. После инкубации суспензию центрифугировали примерно при 10000д в течение примерно 15 мин. Бактериоцин выделяли из супернатанта, используя ионообменную хроматографию на Зирегоке ЗР РР. Очищенные продукты обоих способов анализировали на их антагонистическую активность против Сашр1у1ойас1ег )сщш. Проводили электрофорез в ДСН-ПААГ и изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). Результаты суммированы ниже в табл. 3 и 4.For method B, while cultivating the producer strain and inducer, most of the bacteriocin produced is secreted into the culture fluid. Part of the bacteriocin is adsorbed on the cells of both strains, producer and inducer. In order to avoid the loss of adsorbed bacteriocin, bacteriocin is eluted from the cells. Method B involves two stages: (1) the isolation of bacteriocin from the supernatant of the culture fluid and (2) the isolation of bacteriocin from the cell pellet of both strains, producer and inducer. In step 1, cultures are harvested and separated by centrifugation at about 10,000 d for about 15 minutes to pellet the cells. The supernatant is applied to a Os1u1 Zeryagoke 4 PP column to isolate bacteriocin. The cell pellet was used in step 2. The pellet was suspended in phosphate buffer with approximately 0.7% No. 1C1. pH (elution buffer) and suspension were mixed and incubated for about 20 minutes. After incubation, the suspension was centrifuged at about 10,000 d for about 15 minutes. Bacteriocin was isolated from the supernatant using ion exchange chromatography on Ziregok ZR PP. The purified products of both methods were analyzed for their antagonistic activity against Sashp1u1oyas1eg). Spent electrophoresis in SDS-PAGE and isoelectric focusing (IEF). The results are summarized below in table. 3 and 4.

Было обнаружено, что удельная активность препаратов, очищенных способом Б, была в 4 раза выше такого же продукта, полученного способом А. Получение препарата способом Б занимало примерно 12,5 ч по сравнению с 52 ч с использованием способа А. Способ Б позволяет уменьшить число стадий, необходимых для очистки бактериоцина из САП за счет отсутствия гель-фильтрации и гидрофобной хроматографии и использования только ионообменной хроматографии.It was found that the specific activity of the preparations purified by method B was 4 times higher than the same product obtained by method A. Obtaining a preparation by method B took about 12.5 hours compared to 52 hours using method A. Method B reduces the number stages necessary for purification of bacteriocin from SAP due to the lack of gel filtration and hydrophobic chromatography and the use of ion-exchange chromatography only.

Таблица 3Table 3

Сравнительные данные по удельной активности бактериоцинов 760 и 50-52, выделенных с использованием способов А и БComparative data on the specific activity of bacteriocins 760 and 50-52 isolated using methods A and B

Способ выделения Allocation Method Бактериоцин 760 Bacteriocin 760 Бактериоцин 50-52 Bacteriocin 50-52 Кол-во белка, мг Amount of protein, mg Активность УЕ/мл Activity UE / ml УД активностъ УЕ/мг UD activity UE / mg ДСНПААГ DSNPAAG ИЭФ IEF Кол-во белка, мг Amount of protein, mg Активность УЕ/мл Activity UE / ml Уд. активность УЕ/мг Beats activity UE / mg ДСНПААГ DSNPAAG ИЭФ IEF Способ А Method A 0.08 0.08 12800 12800 71111 71111 5,5 кДа 5.5 kDa 9,5 9.5 0,075 0,075 6400 6400 85333 85333 3,9 кДа 3.9 kDa 8,4 8.4 Способ Б Method B 0,18 0.18 51200 51200 284444 284444 5,5 кДа 5.5 kDa 9,5 9.5 0,04 0.04 12800 12800 320000 320,000 3,9 кДа 3.9 kDa 8,4 8.4

Таблица 4Table 4

Антимикробная активность очищенных бактериоцинов 760 и 50-52, определенная посредством капельного теста, электрофореза в ДСН-ПААГ и изоэлектрического фокусирования (ИЭФ)Antimicrobial activity of purified bacteriocins 760 and 50-52, determined by drip test, SDS-PAGE and isoelectric focusing (IEF)

Бактериоцин Bacteriocin Тестируемый штамм Test strain Ингибиторная активность, капельный тест (УЕ/мл) Inhibitory activity, drip test (UE / ml) Ингибиторная активность, ДСН-ПААГ (кДа) Inhibitory activity, SDS-PAGE (kDa) Ингибиторная активность, ИЭФ Inhibitory activity, IEF 760 760 С. ίβμιηί C. ίβμιηί 51200 51200 +ПОЛОСЭ 1 ММ=5,5 + POLOSE 1 MM = 5.5 -«полоса 1 р1=9,5 - “lane 1 p1 = 9.5 3. βηΐθήΐίύίδ 204 3. βηΐθήΐίύίδ 204 12800 12800 +ПОЛОСЭ 1 ММ=5,5 + POLOSE 1 MM = 5.5 «полоса 1 р!=9,5 "Lane 1 p! = 9.5 Е. соН 0157.Ή7 E. Con 0157.Ή7 12800 12800 «полоса 1 ММ=5,5 "Lane 1 MM = 5.5 •ι-полоса 1 р)=9,5 • ι-strip 1 p) = 9.5 50-52 50-52 С. ι'θίυηί C. ι'θίυηί 12800 12800 «полоса 1 ММ=3,9 "Lane 1 MM = 3.9 +полоса 1 р!=8,4 + lane 1 p! = 8.4 3. еп1епИсНз 204 3. Envies 204 12800 12800 -«полоса 1 ММ=3,9 - “lane 1 MM = 3.9 «•полоса 1 р!=8,4 "• lane 1 p! = 8.4 Е. соН 0157:Н7 E. Con 0157: H7 6400 6400 -«полоса 1 ММ=3,9 - “lane 1 MM = 3.9 -«полоса 1 р!=8,4 - "lane 1 p! = 8.4

- 11 017730- 11 017730

Аминокислотные последовательности очищенных бактериоцинов определяли с помощью расщепления по Эдману, используя автоматический секвенатор 491 еЬС (Аррйеб Вюкуйету И8А). Бактериоцины гидролизовали в примерно 6М НС1 под вакуумом при примерно 110°С в течение примерно 72 ч. Молекулярные массы бактериоцинов 50-52 и 760 определяли с помощью масс-спектрометрии. используя Уоуадег-ЭЕВР (Регкш-Е1тег. И8А). Систему ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ. систему время-пролетной массспектрометрии с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы. использовали вместе с матрицей. 2-цианогидроксикоричной кислотой. Аминокислотные последовательности представляли собойAmino acid sequences of purified bacteriocins were determined by Edman cleavage using a 491 eC automatic sequencer (Arrieb Vukuietu I8A). Bacteriocins were hydrolyzed in about 6M HCl under vacuum at about 110 ° C for about 72 hours. Molecular weights of bacteriocins 50-52 and 760 were determined by mass spectrometry. using Uouadeg-EEVR (Regksh-E1teg. I8A). The ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ system. time-of-flight mass spectrometry system with ionization by laser desorption from the matrix. used along with the matrix. 2-cyanohydroxycinnamic acid. Amino acid sequences were

50-52: ТТК\¥С1\С1\Г\5\ЛЛ\Г(ХС1\\Л\А5С\1 АТС1СААА1.СК1.А 5ЕО ΙΌ ΝΟ: 150-52: TTK \ ¥ C1 \ C1 \ G \ 5 \ LL \ G (XC1 \\ L \ A5C \ 1 ATC1CAAA1.SC1.A 5EO ΙΌ ΝΟ: 1

760: МВ^УС^ААббУббААУСбЬАбУУбЕАКЕМАбЕУВКб^бМАббЕТНМКА СК8 5ЕО ΙΌ ΝΟ: 2760: MV ^ US ^ AABBUBBAAAUSBABAUBEEKEMABEUVKb ^ bMABBETNMKA SK8 5EO ΙΌ ΝΟ: 2

Рассчитанные молекулярные массы пептидов составляли примерно 3.9 кДа для бактериоцина 50-52 и примерно 5.5 кДа для бактериоцина 760. Анализ с помощью ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ выявил следующие молекулярные массы: примерно 3932 Да для бактериоцина 50-52 и примерно 5362 Да для бактериоцина 760.The calculated molecular weights of the peptides were approximately 3.9 kDa for bacteriocin 50-52 and approximately 5.5 kDa for bacteriocin 760. Analysis using ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ revealed the following molecular weights: approximately 3932 Da for bacteriocin 50-52 and approximately 5362 Da for bacteriocin 760.

Пример 6.Example 6

Определяли влияние ферментов. температуры и рН на активность бактериоцина. Примерно 10 мл одного из приведенных ниже ферментов переносили в пробирки. содержащие примерно 20 мл бактериоцинов: β-химотрипсин - примерно 100 мг/мл. протеиназа К - примерно 200 мг/мл. папаин - примерно 60 мг/мл. лизозим - примерно 750 мг/мл и липаза - примерно 100 мг/мл (все ферменты от фирмы 81дтаΑΐάποίι Согр.. 8ΐ. Ьошк МО). После примерно трехчасового периода инкубации примерно при 37°С смесь бактериоцина и фермента анализировали на антимикробную активность. используя капельный тест. как в примере 3. Необработанные бактериоцины служили в качестве положительных контролей.The effect of enzymes was determined. temperature and pH on the activity of bacteriocin. About 10 ml of one of the following enzymes was transferred into test tubes. containing about 20 ml of bacteriocins: β-chymotrypsin - about 100 mg / ml. proteinase K is approximately 200 mg / ml. papain - about 60 mg / ml. lysozyme - about 750 mg / ml and lipase - about 100 mg / ml (all enzymes from the company 81dtaΑΐάποίι Cons .. 8ΐ. oshk MO). After an approximately three hour incubation period at approximately 37 ° C., the mixture of bacteriocin and enzyme was analyzed for antimicrobial activity. using a drip test. as in example 3. Untreated bacteriocins served as positive controls.

Для исследования термостабильности бактериоцинов образец примерно 2 мг/мл кипятили в водяной бане в течение примерно 15 мин. охлаждали и оценивали на антимикробную активность. Примерно 2 мг/мл бактериоцина использовали для оценки эффекта рН. Примерно 2 мл стерильных растворов. примерно 10 мМ ΝαΟΗ или примерно 10 мМ НС1 добавляли к образцам для тестирования рН от примерно 3 до примерно 10. Образцы инкубировали примерно при 37°С в течение примерно 2 и 24 ч и примерно при 90°С в течение примерно 20 мин. Образцы доводили до рН примерно 7.2 добавлением примерно 4 мМ стерильного фосфатного буфера и анализировали на антимикробную активность. используя капельный тест. как описано выше в примере 3.To study the thermal stability of bacteriocins, a sample of approximately 2 mg / ml was boiled in a water bath for approximately 15 minutes. cooled and evaluated for antimicrobial activity. About 2 mg / ml bacteriocin was used to evaluate the pH effect. Approximately 2 ml of sterile solutions. about 10 mM ΝαΟΗ or about 10 mM HC1 was added to the pH test samples from about 3 to about 10. Samples were incubated at about 37 ° C for about 2 and 24 hours and at about 90 ° C for about 20 minutes. Samples were adjusted to a pH of approximately 7.2 by the addition of approximately 4 mM sterile phosphate buffer and assayed for antimicrobial activity. using a drip test. as described above in example 3.

Бактериоцины 50-52 и 760 потеряли свою антимикробную активность после обработки βхимотрипсином. протеиназой К и папаином. но сохранили ее при обработке лизозимом. липазой или при нагревании примерно до 90°С (табл. 5). Они были стабильны при различных значениях рН в интервале от примерно 3.0 до примерно 9.0. но становились неактивными примерно при рН 10 (табл. 5 и 6).Bacteriocins 50-52 and 760 lost their antimicrobial activity after treatment with β-chemotrypsin. proteinase K and papain. but retained it during lysozyme treatment. lipase or when heated to about 90 ° C (table. 5). They were stable at various pH values in the range from about 3.0 to about 9.0. but became inactive at approximately pH 10 (Tables 5 and 6).

Таблица 5 Влияние ферментов и температуры на антимикробную активность бактериоциновTable 5 The effect of enzymes and temperature on the antimicrobial activity of bacteriocins

Обработка Treatment Активность* Activity* бета-химотрипсин beta chymotrypsin протеиназа К proteinase K папаин papain лизозим lysozyme + + липаза lipase + + 100’С, 15 минут 100’s, 15 minutes + +

* активность определяли с помощью капельного теста с С. _)е_)иш ΝΟΌ 11168 в качестве индикаторного штамма.* activity was determined using a drip test with C. _) e_) ish ΝΟΌ 11168 as an indicator strain.

+ наличие активности.+ the presence of activity.

- отсутствие активности после обработки ферментами или воздействия температуры.- lack of activity after treatment with enzymes or exposure to temperature.

- 12 017730- 12 017730

Таблица 6Table 6

Влияние рН на активность бактериоциновThe effect of pH on the activity of bacteriocins

рН pH Активность, определенная с помощью капельного теста с С./е/ил/ΝΟΤΟ 11168 Activity determined using a drip test with S. / e / il / ΝΟΤΟ 11168 20 мин @ 90°С 20 min @ 90 ° C 2ч @ 37°С 2h @ 37 ° C 24ч @ 37°С 24h @ 37 ° C 3,0 3.0 + + + + 5,0 5,0 + + + + + + 6,2 6.2 + + + + + + 7,0 7.0 ч- h- + + + + 8,4 8.4 + + + + + + 9,1 9.1 + + + + + + 10,0 10.0 - - - - - -

+ наличие активности,+ presence of activity,

- отсутствие активности- lack of activity

Пример 7.Example 7

Чувствительность Сашру1оЬас1ет крр. к очищенным препаратам бактериоцинов 760 и Е50-52 определяли, используя штаммы, выделенные из бройлерных цыплят, как описано выше в примере 1. Антагонистическую активность бактериоцинов оценивали на основании минимальных ингибиторных концентраций (М1С), которые определяли путем диффузии в агаре. В табл. 7 ниже показаны М1С бактериоцинов для тестируемых штаммов. Все протестированные бактериоцины являются высокоантагонистическими в отношении штаммов Сашру1оЬас1ет крр. Штамм 760 является значительно более активным, чем остальные, при М1С между примерно 0,05 и примерно 0,1 мкг/мл.Sensitivity Sashru1obas1et krr. to purified preparations of bacteriocins 760 and E50-52 were determined using strains isolated from broiler chickens, as described above in example 1. The antagonistic activity of bacteriocins was evaluated based on the minimum inhibitory concentrations (M1C), which were determined by diffusion in agar. In the table. 7 below shows M1C bacteriocins for the tested strains. All tested bacteriocins are highly antagonistic to the strains of Caspian bacillus crp. Strain 760 is significantly more active than the rest, with M1C between about 0.05 and about 0.1 μg / ml.

Таблица 7Table 7

М1С бактериоцинов для штаммов Сашру1оЬас1ет крр.M1C bacteriocins for strains of Sashru1obac1et crp.

Штаммы Strains М1С (мкг/мл) M1C (μg / ml) ОК7 OK7 В1580 B1580 В37 B37 760 760 Е50-52 E50-52 Р-24 R-24 1,6 1,6 0,8 0.8 0,8 0.8 0,05 0.05 0,05 0.05 Р-32 R-32 0,08 0.08 0,08 0.08 1,6 1,6 0,05 0.05 0,1 0.1 Р-27 P-27 0,8 0.8 0,8 0.8 0,8 0.8 0,05 0.05 0,1 0.1 ί/υ-1 ί / υ-1 1,6 1,6 0,4 0.4 1,6 1,6 0,05 0.05 0,05 0.05 Р-31 R-31 3,2 3.2 1,6 1,6 0,8 0.8 0,05 0.05 0,1 0.1 Р-28 P-28 0,4 0.4 3,2 3.2 0,8 0.8 0,05 0.05 0,1 0.1 Θ-2 Θ-2 0,8 0.8 1,6 1,6 0,8 0.8 0,05 0.05 0,1 0.1 Θ-1 Θ-1 0,8 0.8 1,6 1,6 0,8 0.8 0,05 0.05 0,05 0.05 ΙΠ018/2 ΙΠ018 / 2 0,4 0.4 1,6 1,6 3,2 3.2 0,05 0.05 0,05 0.05 Сег-4 Seg-4 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,1 0.1 0,1 0.1 Р-21 R-21 0,8 0.8 0,4 0.4 0,4 0.4 0,1 0.1 0,05 0.05 К-10 K-10 0,4 0.4 0,4 0.4 1,6 1,6 0,05 0.05 0,05 0.05 Р-1 R-1 0,2 0.2 0,8 0.8 3,2 3.2 0,05 0.05 0,1 0.1 В-3 IN 3 0,1 0.1 1,6 1,6 0,2 0.2 0,05 0.05 0,05 0.05 Р-2 R-2 0,1 0.1 0,4 0.4 0,4 0.4 0,05 0.05 0,05 0.05

Пример 8.Example 8

Чувствительность грамположительных и грамотрицательных бактерий к бактериоцинам 760 и 50-52 определяли, используя капельный тест, как описано выше в примере 3. Результаты приведены в табл. 8 и 9. Как видно из табл. 8, бактериоцин 760 обладает широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности. Этот бактериоцин ингибирует рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Его М1С (минимальная ингибирующая концентрация) для тестируемых штаммов находится в интервале от примерно 0,1 до примерно 3,2 мкг/мл. Как видно из табл. 9, бактериоцин 50-52 обладает широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности. Этот бактериоцин ингибирует рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Его М1С для тестируемых штаммов находится в интервале от примерно 0,1 до примерно 3,2 мкг/мл.The sensitivity of gram-positive and gram-negative bacteria to bacteriocins 760 and 50-52 was determined using the drip test, as described above in example 3. The results are shown in table. 8 and 9. As can be seen from the table. 8, bacteriocin 760 has a wide spectrum and a high level of antagonistic activity. This bacteriocin inhibits the growth of both gram-positive and gram-negative bacteria. Its M1C (minimum inhibitory concentration) for the tested strains is in the range from about 0.1 to about 3.2 μg / ml. As can be seen from the table. 9, bacteriocin 50-52 has a wide spectrum and a high level of antagonistic activity. This bacteriocin inhibits the growth of both gram-positive and gram-negative bacteria. Its M1C for the tested strains is in the range from about 0.1 to about 3.2 μg / ml.

- 13 017730- 13 017730

Таблица 8Table 8

Антибактериальная активность бактериоцина 760, определенная с помощью капельного тестаAntibacterial activity of bacteriocin 760, determined using a drip test

Тестируемые штаммы Test strains М1С, мкг/мл M1C, μg / ml 5. еп(еп(кНз 1 5. ep (ep (kNz 1 0,2 0.2 3. еп1еп(кПз 4 3. ep1ep (kpz 4 0,4 0.4 3, епГегНкИз 204 3, EPGEGNKIZ 204 0,2 0.2 3. еп(елН<Пз 237 3. ep (elN <Ps 237 0,2 0.2 3. сМегаези/з 434/4 3.c Megahesi / s 434/4 0,4 0.4 3 с1ю1егаези1з 370 3 s1yu1egaesi1z 370 0,4 0.4 3.1урЫтипит 383/60 3.1urUpit 383/60 0,4 0.4 3.1урЫтипит 320 3.1urUpit 320 0,2 0.2 3. даШпагит риНогит 3. Yes, Spagit Rinogit 0,4 0.4 Е. С0ПНВ101 E. S0PNV101 0,1 0.1 Е. соИ С600 E. SOI C600 0,1 0.1 Е. со//0157Н7 Υ-63 E. co // 0157Н7 Υ-63 1,8 1.8 Е. со//0157:Н7 <3-3 E. co // 0157: H7 <3-3 1,6 1,6 Е. соН 0157:Н7 ОЕЭ-3 E. CON 0157: H7 OEE-3 1,6 1,6 Е. со//0157:Н7 1аЬ. 39 E. co // 0157: H7 1ab. 39 1,6 1,6 У. еп(егосоИИса 03 U. EP (EgosoIisa 03 0,1 0.1 У. ел(егосо1Шса 09 U. el (hissooshaSsa 09 0,1 0.1 У. еп(етс.оППса 04 U. EP (ETS.PPSA 04 0,1 0.1 СИгорасПег /геипсИ CIGORASPEG / GEPSI 1.6 1.6 К1еЬз1еИа рлеитол/ае K1e3b1eaa rleitol / ae 3,2 3.2 3/?. Оузеп!епав 3 / ?. Ousep! 0,1 0.1 3(арЬу!ососсиз аигеиз 3 (aryu! Ossossis igeeiz 1,6 1,6 81арЬу1ососсиз ерк/егткИз 81ARBY1OSOSSIS ERK / EGTKZ 1,6 1,6 Υ. рзеи8о1иЬегси1оз<з Υ. Rzey 8o1i and Leggi1oz <s 3,2 3.2 У. рзеи<1о(иЬегси1о81з W. Rzey <1 ° 3,2 3.2 РзеиРотопаз аегидтоза 25583 Rzei Rototase Aegidtosis 25583 0,4 0.4 Рго(еиз лйгаЫНз Rgo 3,2 3.2 МогдапеИа тогдапП Mogodepaia thenp 3,2 3.2 ί. топосу(одепез 9-72 ί. toposu (odepez 9-72 0,1 0.1 С. уеуоп/14 S. yeuop / 14 0,1 0.1

Таблица 9 Антибактериальная активность бактериоцина 50-52, определенная с помощью капельного тестаTable 9 Antibacterial activity of bacteriocin 50-52, determined using the drip test

Тестируемые штаммы Test strains М1С, мкг/мл M1C, μg / ml 3. еп1еп(кПз 1 3. ep1ep (kpz 1 0,1 0.1 5. βηίβπίκίϊΒ 4 5. βηίβπίκίϊΒ 4 0,1 0.1 3. егНепПсПз 204 3. eGNepPsPz 204 0,2 0.2 5. βηίβπίκΙϊΒ 237 5. βηίβπίκΙϊΒ 237 0,1 0.1 8. сЬо1егаези1з 434/4 8.Coboegesius 434/4 0,1 0.1 8. С1ю1егаезшз 370 8. S1yuegaeszs 370 0,1 0.1 8. (урЫтипит 383/60 8. (urtypit 383/60 0,1 0.1 8. (урЫтипит 320 8. (urtypit 320 0,1 0.1 8. даШпатт риНогит 8. Yes, Shpatt Rinogit 0,1 0.1 Е. СОННВ101 E. SONNV101 0,1 0.1 Е. соП С600 E. CoP C600 0,1 0.1 Е. соИ 0157:Н7 Υ-63 E. SOI 0157: H7 Υ-63 0,1 0.1 Е. соП 0157:Н7 <3-3 E. CoP 0157: H7 <3-3 0,1 0.1 Е. соИО157:Н7 00-3 E. SOIO157: H7 00-3 0,1 0.1 Е. соН 0157:Н71аЬ. 39 E. Con 0157: H71a. 39 0,1 0.1 У. еп(егосоНПса 03 W.P. (EGOSNPsa 03 0,1 0.1 У. еп(егосо1Шса 09 U. Ep (Egoso 1 Shsa 09 0,4 0.4 У. вгНегосоППса 04 W. vgNegosoPpsa 04 0,1 0.1 СНгоЬас(ег /геипсН CHGObas (er / geipsn 0,1 0.1 К1еЬз1е/1а рпеитотае K1e3s1e / 1a 0,2 0.2 8Ь. ОузегПепае 8b. OuzegPepae 0,4 0.4 8(арЬу1ососсиз аигеиз 8 (arbisosossis igeeiz 0,4 0.4 8(арГ1у1ососсиз βρίάβπηίε 8 (arG1u1ossoss βρίάβπηίε 3,2 3.2 У. рзеиМиЬегси1оз1з W. Rzey 0,4 0.4 Рзеидотопаз аегидтоза 25583 Rzeidotopaz aegidtosis 25583 3,2 3.2 Рго(еиз ткаЫНз Rgo 1,6 1,6 МогдапеИа тогдапП Mogodepaia thenp 3,2 3.2 1. топосу1одепез 9-72 1. toposu 0,2 0.2 С. ί.4 S. ί.4 0,2 0.2

- 14 017730- 14 017730

Пример 9.Example 9

Минимальные ингибиторные концентрации (М1С) бактериоцинов 760 и 50-52 и метициллина определяли с помощью капельного теста. Различные концентрации очищенных бактериоцинов (мкг/мл) в объеме 10 мкл добавляли к культурам 81арйу1ососси8 аитеик, 81арЬу1ососси5 ерйеттЦщ. РкеиДотоиак аешдшока и НейсоЬас1ет ру1ог1. Культуры инкубировали в течение примерно 24 ч примерно при 37°С в аэробных условиях для всех. кроме НейсоЬас1ет ру1оп. которую инкубировали в микроаэробных условиях. Результаты представлены ниже в табл. 10.The minimum inhibitory concentrations (M1C) of bacteriocins 760 and 50-52 and methicillin were determined using a drip test. Different concentrations of purified bacteriocins (μg / ml) in a volume of 10 μl were added to the cultures of 81 arylossoss8 aiteik, 81 arylossossoss 5 yrtt. Rkei Dotoiak aeshdshoka and Neisoacacet ru1og1. Cultures were incubated for approximately 24 hours at approximately 37 ° C under aerobic conditions for all. except Neysobaset ru1op. which was incubated under microaerobic conditions. The results are presented below in table. 10.

Таблица 10Table 10

М1С бактериоцинов для 81арЬу1ососси5 аитеик. 81арЬу1ососси5 ерйеттйщ. РаеиДотоиаа аетидтоаа и Не11соЬас1ет ру1опM1C bacteriocins for 81 arbylosossi5 aiteik. 81 ayu1osossi5 yertytysch. Raei Dotoiaa aetidoaa and He11sobac1et ru1op

Бактериоцин или антибиотик Bacteriocin or antibiotic М1С очищенных бактериоцинов и антибиотика (мкг/мл) M1C purified bacteriocins and antibiotic (μg / ml) 5. аигеиз 5. aigeez 5. ерк/еппкНа 5. ERK / EPKNA Р. аегидтоза R. aegidtosis Н. ру1оп N. ru1op 760 760 1,6 1,6 1,6 1,6 0,4 0.4 0,2 0.2 50-52 50-52 0,1 0.1 0Λ 0Λ 0,8 0.8 0,8 0.8 Метициллин Methicillin 52,5 52,5 64,8 64.8 78,4 78,4 93,8 93.8

Приведенное выше подробное описание дано в целях иллюстрации. Такие подробности предназначены исключительно для этой цели. и специалисты в данной области техники могут производить вариации без отклонения от сущности и объема изобретения.The above detailed description is for purposes of illustration. Such details are intended solely for this purpose. and those skilled in the art can make variations without departing from the spirit and scope of the invention.

Перечень последовательностей <110> Де Юнайтед Стойте оф Америка эз Репрезентид бай де Секретэри оф Агрикалчэ (США); Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (Россия) <120> НОВЫЕ ШТАММЫ И БАКТЕРИОЦИНЫ ЭНТЕРОКОККА И СТРЕПТОКОККА <130> 300-245ТО <150> РСТ/и806/014938 <15Х> 2006-04-19 <160> 2 <170> РаЛеп1:1п уегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> ПРТ <213> ЕпРегососсиз Гаестипз <400> 1Sequence Listing <110> De United Stand of America ez Representative by de Secret of Agriculche (USA); State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology (Russia) <120> NEW STRAINS AND BACTERIOCINS ENTEROKOKKA AND STREPTOKOKA <130> 300-245TO <150> PCT / i806 / 014938 <15X> 2006-04-19 <160> 2 <170> RaLep1 : 1п вегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> ПРТ <213> ЕпРегососсиз Гестипз <400> 1

Ткг 1 Tkg one Ткг Ьуз Tkg luz Азп Azp Туг 5 Tug 5 СХу SHU Азп Azp С1у УаХ C1u Wah Суз Азп 10 Suz Azp 10 Зег Zeg Уа1 Ya1 Азп Azp Тгр 15 Tgr fifteen Суз Suz СХп SHP Суз Suz СХу SHU Азп 2 0 Azp twenty УаХ Wah Тгр Tgr АХа Aha Зег Zeg Суз 2 5 Suz 2 5 Азп Azp Ьеи Bie А1а A1a ТЬг Tht С1у □ п C1u □ p Суз Suz А1а A1a А1а A1a Тгр Tgr Ьеи 35 Bie 35 Суз Suz Ьуз Bz Ьеи Bie А1а A1a

<210> 2 <211> 53 <212> ПРТ <213> 5£гер£ососсцз сгтсеТиз <400> 2<210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> 5 £ ger £ ossossz sgsceTiz <400> 2

Азп Azp Агд Agd Тгр Tgr Туг Tug Суз Suz Азп Azp Зег Zeg АХа Aha АХа Aha С1у C1u СХу SHU Уа1 Ya1 С1у C1u С1у C1u А1а A1a А1а A1a 1 one 5 5 10 10 15 fifteen Уа1 Ya1 Суз Suz СХу SHU Ьеи Bie АХа Aha С1у C1u Туг Tug Уа1 Ya1 С1у C1u С1и C1 and А1а A1a Ьуз Bz С1и C1 and Азп Azp Не Not А1а A1a 20 twenty 25 25 30 thirty СХу SHU СХи SHi УаХ Wah Агд Agd Ьуз Bz СХу SHU Тгр Tgr СХу SHU МеЬ Me А1а A1a С1у C1u СХу SHU Рке Rke ТЬг Tht НХз NHC Азп Azp 35 35 40 40 45 45 Ьуз Bz А1а A1a Суз Suz Ьуз Bz Зег Zeg 50 fifty

Claims

CLAIM

1. The isolated bacteriocin having the amino acid sequence of ZeO GO N0: 2.

2. A therapeutic composition comprising:

(a) at least one isolated bacteriocin produced by HisHynessosik Haesst ICCA B-30746 strain, or BierHyosossik strain of JSB-30745, or their common culture, in an amount effective to reduce the levels of colonization by at least one target bacterium; and (b) a suitable therapeutic carrier, wherein said bacteriocins have the amino acid sequence Zeo GO N0: 1 and Zeo GO N0: 2, respectively.

3. Therapeutic pet food containing:

(a) at least one isolated bacteriocin produced by HisHynessosik Haesst ICCA B-30746 strain, or BierHyosossik strain of JSB-30745, or their common culture, in an amount effective to reduce the levels of colonization by at least one target bacterium; and (b) a therapeutic carrier, wherein said bacteriocins have the amino acid sequence Zeo GO N0: 1 and Zeo GO N0: 2, respectively.

4. A method of reducing colonization levels of at least one target bacterium in an animal, comprising administering to the animal the therapeutic composition of claim 2 in an amount effective to reduce the colonization levels of at least one target bacterium.

5. The isolated bacterial strain Lasusossik 1as11k INCE B-30744, which increases the level of bacteriocin production by the producer strains ZEerJussossic specimen INCA B-30745 and HisHerossossik Haesst IKK B-30746.

6. A method for increasing bacteriocin production by the bacteria ZEERUSOSSIC SECHICA IEK B30745 and HisHegossosik Haessh IEK B-30746, including:

(a) adding a bacteriocin-enhancing amount of the bacterial strain Las1osssik 1asNk MKKE B-30744 to the culture of these bacteriocin-producing bacteria to form a co-culture and (b) cultivating the said co-culture at about 37 ° C.

7. The method of obtaining a bacteriocin or a mixture of bacteriocins having ZOO GO N0: 1 and ZEO GO N0: 2, including:

(a) the co-cultivation of bacteriocin-producing bacteria Zuerosossik spseUk NKK ^ B-30745 and HisHerossossik Haessh IEK B-30746 with inducer bacterium Bas1osssik Hasc Fk IEK B-30744;

(b) collecting the specified culture medium and cells by centrifuging to obtain the supernatant and cell sediment;

(c) isolating the bacteriocin from said bacteriocin-containing supernatant by hydrophobic chromatography;

(d) incubating said cell pellet from step (b) in an elution buffer;

(e) separating said cell pellet and said buffer by centrifuging;

(e) isolating the bacteriocin from said buffer by ion exchange chromatography.

8. The method according to claim 7, where in the specified ion-exchange chromatography using a column Zireok RR PP.