EA017565B1

EA017565B1 - Термофильный штамм микроводоросли dunaliella bardawil masazir для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма

Info

Publication number: EA017565B1
Application number: EA201000466A
Authority: EA
Inventors: Юсиф Мансур оглы Абдулрагимбеков; Фархад Сабир оглы Омаров
Original assignee: Ооо "Альфа Технолоджис"
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2013-01-30
Also published as: EA201000466A1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к солеустойчивой микроводоросли Dunaliella bardawil и предназначено для получения и переработки биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использовано в фармакологии и косметологии. Термофильный штамм Dunaliella bardawil Masazir CCAP 19/38 в качестве продуцента белково-каротиновой биомассы получен путем прямого выделения из природного водоема (реликтового озера Масазыр) на Апшеронском полуострове Азербайджанской Республики. Способ получения биомассы микроводоросли фотосинтезом в водной питательной среде заключается в выращивании, перемешивании суспензии микроводорослей, периодических подпитке среды питательным раствором и отборе биомассы, после которого водную питательную среду подвергают рекультивации путем обратного осмоса.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к солеустойчивой микроводоросли ИипаБе11а ЬатбаМ1 и предназначено для получения и переработки биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использовано в фармакологии и косметологии.

Изобретение описывает новый штамм одноклеточной микроскопической водоросли ИцпайеНа Ьагба\\И (авторское имя Макахи).

Ицпа11е11а Ьатба^й Макахи - зелёная одноклеточная микроскопическая водоросль, обитающая в гиперсолёных водоемах (озеро Масазыр, Апшеронский п-ов, Азербайджанская Республика). ИипаБе11а Ьагба\\И Макахи обладает невероятно широким диапазоном приспособленности к экстремальным воздействиям внешней среды. Это уникальный организм, который в условиях чрезвычайно высоких концентраций солей (ИаС1) в водоеме способен синтезировать целый ряд полезных соединений, таких как βкаротин (провитамин А), глицерин, ненасыщенные жирные кислоты. В биотехнологии особый интерес представляла биомасса ИипаБе11а Ьатба^Ш как источник β-каротина [7, 8, 14], поскольку это соединение высокоэффективный природный антиоксидант (широко используется в пищевой промышленности при производстве сливочного масла, сыров), в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, а также в лечебно-профилактическом питании при профилактике и лечении онкологических, инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний. Наиболее важным является тот факт, что Иипа11е11а ЬатбаМ1 Макахи как пищевая добавка, является таким же организмом, как и высшие растения (к примеру, морковь), употребление которых в пищу в отличие от искусственных препаратов не влечет за собой никаких побочных эффектов. ИипайеНа ЬатбаМ1 Макахи в определенных условиях способна к гиперсинтезу β-каротина [4]. Его содержание может достигать 9% от сухой массы водорослей [14], что является наиболее высоким показателем по сравнению с другими продуцентами β-каротина (морковь Иаиеик кабуик, гриб В1акек1еа 1пкрота). Это позволяет считать микроводоросль наиболее перспективным источником β-каротина для биотехнологической промышленности.

Систематика Иипа11е11а - это планктонные одноклеточные жгутиковые зеленые солеустойчивые микроводоросли [1]. Согласно альгологической системе классификации [5] таксономическое положение Иипа11е11а отражает схема:

Царство (Ктдбот) Р1ап1ае;

Класс (С1акк) СЫогорБусеае;

Отдел (И1У1кюп) СЫоторБусо1а;

Порядок (Огбег) Уо1уоса1ек;

Семейство (ЕатПу) Иипа11е11асеае;

Род (Оепик) Иипа11е11а;

Вид (8рее1ек) Иипа11е11а Ьатба^И Макахи.

Наиболее близкими к предложенному являются штаммы ИипайеНа из Украины и Израиля. Иипайе11а кайпа Теобогекко ккр. Штамм Маккщк (Масюк) 1962/9 Иктате, Сптеа, как !ас!огу ш 1о\гп 8ак1 (выделенный из соленого прииска, Саки, Украина), СиБиге СоНеебоп о! АШоИорБю Отдашктк (ССАЬА) 1пкП(и(е о! Во1апу, Асабету о! 8аепеек о! 1Пе СхесБ КериЬБс, СеШге о! РБусо1оду. Иике1ккб 135, С2-379 82. Этот штамм обладает типичными морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками, присущими водорослям рода ИипаБеБа. Относительный недостаток известного штамма состоит в сравнительно низком уровне накопления биомассы в условиях культивирования 0,3-0,4 г (абс. сухого вещества) на 1 л суспензии в сутки и в нестабильности в условиях длительной непрерывной культуры (выраженном полиморфизме, значительном снижении продуктивности).

Известен штамм ИипаБе11а Ьагба\гП Ато1х апб Аутоп, АТСС #30861, этот штамм выделен из природного соленого озера рядом с Ватба^й Ьадооп, Северный Синай, Израиль, 1976, штамм депонирован А.Веп-Ато1х, в Международной коллекции Атепсап Туре СиБиге Со11ес1юп (АТСС) Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108, И8А. Этот штамм также имеет более низкую продуктивность.

Наиболее близким к заявляемому способу куьтивирования по изобретению является способ культивирования спирулины, включающий выращивание водоросли на горьковато-соленой воде в условиях естественной освещенности и температуры с барботированием суспензии водоросли воздухом при периодическом отборе биомассы и подкормка среды минеральными солями (патент ИА 34839, МПК(8) А0Ю 33/00). Недостатком данного способа является зависимость от естественного освещения и обогрева в условиях открытых бассейнов.

Задачей изобретения является получение термофильного штамма ИипаБеБа Ьатба^И, обладающего повышенной способностью к накоплению биомассы и обеспечение его крупномасштабного промышленного культивирования на безотходной основе.

Поставленная задача решается заявленным термофильным штаммом микроводоросли ИипаБе11а Ьагба\гП Макахи ССАР 19/38 в качестве продуцента белково-каротиновой биомассы и способом получения биомассы солеустойчивой микроводоросли ИипаБеБа Ьатба^й Макахи фотосинтезом в водной питательной среде, включающим выращивание, перемешивание суспензии микроводорослей механически и/или барботированием воздухом и/или смесью воздуха с СО₂ в соотношении (98-99,8):(0,2-2) соответст

- 1 017565 венно и периодические отбор биомассы и подпитку питательным раствором, в котором после отбора биомассы водную питательную среду подвергают рекультивации путем обратного осмоса. Питательный раствор содержит (г/л): нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - (0,02-0,04); хлорид натрия - (58,0-116,0); сульфат железа(11) 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта - 0,00005. Фотосинтез осуществляют при естественном и/или искусственном освещении, рН питательной среды 612, температуре 10-45°С в течение 5-10 суток.

Изобретение описывает новый штамм (авторское имя Мшааг), выделенный из природного реликтового озера Масазыр (Апшеронский полуостров, Азербайджанская республика) в результате многолетней работы, проводившейся в условиях непрерывного мониторинга природных озер (водоемов) Азербайджана и лабораторной практики. Эти уникальные водоросли за счет массового развития и придают озеру Масазыр бардовый цвет. Предлагаемый штамм водоросли ОипаНеИа Ьагба\\'б Макахи является более продуктивным по сравнению с известным и обладает потенциалом для широкого промышленного применения. Имеются научные данные, что ЭппайеНа участвовала в генезисе (образовании) нефти в Азербайджане.

Штамм ИипайеНа Ьагба\\'б Макахи депонирован в СиНиге Сойеейоп о£ А1дае апб РгоЮхоа 8АМ8 Ке5сагс11 8егу1се5 Ыб. ЗсоИБН А^оаабоп £ог Магте 8е1епее ЗсоИБН Магте БъШШе ИипЬед, Агду11, РА37 1ОА. ик \УеЬ раде: те^^.катк.ас.ик/ Са!а1одие \геЬ раде: 1Шр://\\л\лу.ссар.ас.ик Те1:(44) 1631 559000, Όίгес! б1а1: (44) 1631 559386, Рах: (44) 1631 559001 под номером ССАР 19/38.

Морфологические признаки ОппайеНа Ьагба^й Макахи.

Клетки микроводоросли водоросли ОппайеНа Ьагба^й Макахи разнообразной формы: овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, иногда шаровидные, цилиндрические или веретеновидные; радиально- или билатерально-симметричные, редко дорсивентральные или слегка ассиметричные. После длительной экспозиции на солнечном свете клетки ЭипайеНа Ьагба^й Макахи приобретают практически шаровидную форму. Длина может колебаться от 6 до 30 мк, ширина от 5 до 20 мк; объём клеток от 65 до 4500 куб.мк. Хлоропласт по цвету чаще всего красный (красно-бурый) или другой оттенок красного цвета (при произрастании на естественном солнечном освещении). Иногда зеленый (желто-зеленый) или другой оттенок зеленого цвета. По форме хлоропласт обычно чашевидный с пиреноидом и глазком (красного цвета), реже без них. По обе стороны от папиллы, на выпуклом апикальном конце клетки прикреплены два жгутика. Обычно жгутики одинаковой длины, равной или превышающей длину клетки. Для ОипайеНа Ьагба^й Макахи характерны вегетативный, бесполый и половой типы размножения. Первый является преобладающим и происходит путём продольного деления клеток.

Физиолого-биохимические свойства ИипайеНа Ьагба\уб Макахи.

Химический состав ОипайеНа Ьагба^б Макахи по органическим и неорганическим показателям. Состав, %: белок - 10-57;

углеводы - 10-32;

липиды - 7-30;

зольность - 5-7;

нуклеиновые кислоты - 6-7;

хлорофиллы - 0,01-6; каротиноиды - 0,03-10.

Состав, г/100 г массы:

углерод - 45,4; водород - 6,3; азот - 10,71;

фосфор - 3,3.

Применение ИипайеНа Ьагба\уб Макахи.

Биомасса предназначена для непосредственного применения во многих отраслях (фармацевтика, пищевая индустрия, сельское хозяйство [3, 9, 10, 11, 12, 13].

Условия хранения.

Штамм хранится на агаризованных питательных средах и в обедненной питательной среде (унифицированные среды ΟΝ) (г/л): нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - (0,02-0,04); хлорид натрия - (58,0-116,0); сульфат железа(11) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта 0,00005.

Штамм ОппайеНа Ьагба\уб Макахи имеет широкий спектр температуры культивирования (10-45°С). Отсутствует сезонность в его размножении. Штамм не требователен к питательной среде.

ОипайеПа Вагба^й Макахи продуцент β-каротина и глицерина для фармакологии, косметологии,

- 2 017565 производства биоактивных витаминных добавок для сельскохозяйственных кормов. Эта микроводоросль пригодна для употребления в пищу, а также для введения в качестве компонента в другие продукты. По функциональной активности ОипаНеИа ЬатбаетШ может быть отнесена к группе нутрицевтиков. Эши-ШеИа Ьатбаетй Макахи - уникальный организм [2], способный синтезировать β-каротин, который является мощным антиоксидантом. В пищевой промышленности β-каротин используется как краситель. Кроме того, солеустойчивые экстремофильные микроводоросли ЭипайеНа являются источником не только β-каротина, но и целого ряда биологически ценных веществ (например, жирных кислот высокой степени ненасыщенности, которые не синтезируются пресноводными видами).

Способ получения биомассы ОипаНеИа Ьатба^й Макахи (фактически аквакультура) включает выращивание (фотосинтез) биомассы микроводоросли в питательном растворе неорганических солей, обеспечение освещения и режима термостатирования (нагревания) культивируемой питательной среды для получения заданного состава; конструктивные и строительные особенности биореакторов; проектные решения, состав культивируемой среды; сушку и упаковку. Основное сооружение для получения биомассы - биореактор - представляет собой бетонный резервуар с глубиной жидкости 0,55 м, шириной 4 м и длиной 10 м. Бассейн разделен продольной перегородкой высотой 0,5 м, толщиной 0,2 м и длиной 8 м. Он имеет систему сдвижного накрытия прозрачной полимерной пленкой (дугообразная конструкция, в случае необходимости может быть автоматизирована). Перемешивание суспензии микроводорослей осуществляют механически и/или барботированием воздухом.

Термостатирование (подогрев) суспензии (культивируемой жидкости) обеспечивают за счет солнечного освещения, а также резервной системой электрообогрева. Сооружения представляют собой резервуары, насосы, коммуникации, модули для разведения солей, блок маточной культуры (чистого посевного материала). Способ получения биомассы предусматривает поглощение углекислого газа из воздуха. Полученная биомасса отделяется от культивируемой среды при помощи сепарации через марлевые поддоны или при помощи проточной центрифуги. Биомасса сушится на специальных поддонах или же в распылительной сушилке. В среднем способ получения биомассы водорослей ЭипайеНа Ьагба\\'П Макахи и применения в пищевой индустрии, фармакологии и сельском хозяйстве составляет 7-10 дней. Главной отличительной особенностью предложенного способа является рекультивирование питательной среды, которое осуществляется путем обратного осмоса на установке соответствующего объема. Таким образом, данный способ становится полностью безотходным. И, соответственно, практически полностью (9698%) обеспечивается возврат всей воды, применяемой в получении биомассы. Способ культивирования штамма ПипайеНа Ьатба^й Макахи представлен на конкретных примерах его исполнения.

Пример 1. Штамм ЭипайеНа Ьагба\\/1 Макахи выращивают в конических колбах вместимостью 1000 мл на среде в накопительном режиме, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - 16,0; хлорид кальция - 0,03; хлорид натрия - 58,0; сульфат железа(11) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта 0,00005. Культивирование проводят при рН среды 8,0, температуре 25°С и естественном солнечном освещении (продолжительность светового дня 12 ч) в течение 5 суток. Температурный режим день-ночь обеспечивает колебания порядка 5°С (разница между дневной и ночной температурами). По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Выход биомассы составил 0,3 г асв/л.

Пример 2. Штамм ЭипайеНа Ьатба^й Макахи выращивают в специальных стеклянных лотках (на культиваторе) объемом 10,0 л в накопительном режиме на среде, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - 0,04; хлорид натрия - 106,0; сульфат железа(11) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта - 0,00005. Культивирование проводят при рН среды 7,0, температуре 30°С и естественном солнечном освещении (продолжительность светового дня 12 ч) в течение 5 суток. Температурный режим день-ночь колебания порядка 5°С. Процесс перемешивания осуществлялся микрокомпрессорами (в режиме 1 ч работы /15 мин барботажа на 45 мин покоя). По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Выход биомассы составил 0,4 г/л.

Пример 3. Штамм ОипаНеИа Ьагба\\/1 Макахи выращивают в стеклотрубном культиваторе объемом 15 л на среде в проточном (непрерывном) режиме, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0, двузамещенный фосфат калия - 0,2, сульфат магния - 0,5, бикарбонат натрия - 16,0, хлорид кальция - 0,02, хлорид натрия 116,0, сернокислое железо - 0,001, натриевая соль ЭДТА - 0,03, борная кислота - 0,0029, хлористый марганец - 0,0018, сернокислый цинк - 0,0002, молибденовокислый аммоний - 0,00003, хлористый кобальт 0,00005. Культивирование проводят при рН среды 10,0, температуре 45°С и при постоянной облученности лампами Т3 8ЫМ 8ΡΙΚΑΕ Е27 в проточном режиме. Процесс перемешивания осуществлялся микрокомпрессорами. Интенсивность воздухообмена 70 г/л суспензии/ч. Насыщение СО₂ (углекислым газом) осуществляют барботированием смесью воздух:СО₂ 99,5:0,5. Отбор биомассы начинается с 3-го дня

- 3 017565 культивирования. Средний уровень накопления биомассы 0,3-0,5 г асв/л в сутки. По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации.

Представленные данные свидетельствуют о значительных физиолого-морфологических отличиях предлагаемого термофильного штамма Иипа11е11а Ьагба^й Макахи от известных и о его технологических преимуществах перед известными штаммами [4, 5]. Широкий спектр применимости Эипайейа Ьагба^й Макахи складывается из двух основных направлений: использование самой биомассы и использование биомассы как сырья для получения каких-либо ценных веществ [7, 8, 9].

Литература

1. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. Интенсивная культура одноклеточных водорослей.//М.: Издво АН СССР, 61 стр., 1962.

2. Юрина Е.В. Сравнительно-физиологическая характеристика двух видов гипергалинных водорослей.//М.: Наука, 320 стр., 1965.

3. Ьее Уиап-Кип М1сго а1да1 такк сиИше кук1етк апб тейюбк: Тйе1г йтйайоп апб ро1епйа1//Т Арр1. Рйусо1., уо1. 13, р. 307-315, 2001.

4. 1к1ег О. Саго1епо1бк.//Ваке1; 81ийдай: Викйаикег уег1ад. 905 р., 1971.

5. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Иипа11е11а Теоб. - Киев: Наук., думка, 242 стр., 1973.

6. Рамазанов 3.М., Клячко-Гурвич Г.Л., Ксенофонтов А.Л., Семененко В.Е. Влияние субоптимальной температуры на содержание бета-каротина и липидов у галофильной водоросли Эипайейа ка1ша//Физиология растений. 35, вып. 5, стр. 864-869, 1988.

7. Веп Ато1х А., 8йа1кй О., Аугоп М. Мобе о! асйоп о! 1йе такк1уе1у ассити1а1еб (1-саго1епе о! Иипайейа Вагба\\й т рго1есйпд 1йе а1да ада1пк1 батаде Ьу ехсекк пгаШайоп II Р1ап1 РЫкю1. Уо1. 9, № 3, р. 1040-1043, 1989.

8. МсСаик1апб М.А., Вго\уп М.В. е1 а1. Еуа1иайоп о! Буе тюгоа1дае апб ийсгоа1да1 рак1ек ак кирр1етеШагу !ооб !ог _щуеш1е РасШс оук1егк (Сгаккокйеа д|дак)//Ас.|иаси11иге. 174, № 3 - 4, р. 323-342, 1999.

9. Вого\\йхка М.А. Соттегаа1 ргобисйоп о! ткгоа1дае: ропбк, 1апкк, 1иЬек апб !егтеп1егк//к Вю1есйпо1оду. - 70, р. 313-321, 1999.

10. Опта Е. Мойпа, Ааеп Еегпапбех Е.С., Сагаа Сатасйо Е., Сатасйо ВиЬю Е., СЫкй Υ. 8са1е-ир о! 1иЬи1аг рйоЮйюгеасЮгк//! Арр1. Рйусо1. 12: р. 355-368, 2000.

11. Сагаа-Сопха1ех М., Могепо I., Сапауа1е ЕР. е1 а1. Сопбйюпк !ог ореп-ай ои1боог сиНиге о! Иипайейа ка1ша т коШйегп 8раш//1. Арр1. Рйусо1. уо1. 15, р. 177-184, 2003.

12. Геворгиз Р.Г., Боровков А.Б. Динамика биомассы Эппайейа кайпа в условиях непрерывного культивирования//Экология моря. т. 67, стр. 35-37, 2005.

13. Мойаттаб Веха ЕахеШ. Ноккеш ТойдЫ, Иакпп 8атаб1, Ноккет 1ата11!аг, Айтаб Еахей. Саго1епо1бк Ассити1айоп Ьу ПиИАиЕЕЕА ТЕВТЮЬЕСТА (Баке Игт1а 1ко1а1е) апб ОиИАЫЕЙЕА 8АЙ1ИА (ССАР19/18 &\УТ) ипбег кйекк сопбйюпк, ИАВИ Уо1ите 14, Ио. 3, 2006.

14. Ат1 Веп-Ато1х, Вю-Еие1 апб СО₂ С’арШге Ьу А1дае, 1кгае1, АИВ Меейпд оп Тййб депегайоп Вю!ие1к, 5!й ЕеЬгиагу, 2009.

Claims

1. Термофильный штамм микроводоросли Эипайейа ЬагбаЮ1 Макахи ССАР 19/38 продуцент белково-каротиновой биомассы.

2. Способ получения белково-каротиновой биомассы термофильного штамма микроводоросли Иипайейа Ьагба\\И Макахи ССАР 19/38 в условиях, обеспечивающих фотосинтез при естественном солнечном и/или искусственном освещении, при рН питательной среды 6-12, температуре 10-45°С путем культивирования штамма в течение 5-10 суток с периодическим отделением биомассы от жидкой фазы, направляемой на рекультивацию путём обратного осмоса, в перемешиваемой среде, содержащей, г/л: нитрата натрия - 3,0; гидрофосфата калия - 0,2; сульфата магния - 0,5; гидрокарбоната натрия - 1,0-16,0; хлорида кальция - 0,02-0,04; хлорида натрия - 58,0-116,0; сульфата железа(11) - 0,001; натриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борной кислоты - 0,0029; хлорида марганца - 0,0018; сульфата цинка - 0,0002; аммония молибденовокислого - 0,00003, хлорида кобальта - 0,00005.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что перемешивание суспензии осуществляют механически и/или барботированием воздухом или смесью воздуха с СО₂ в соотношении (98-99,8):(0,2-2) соответственно.