EA014669B1

EA014669B1 - Препарат на основе интерферона

Info

Publication number: EA014669B1
Application number: EA200901011A
Authority: EA
Inventors: Владимир Антонович Прокулевич; Вадим Владимирович Шманай; Владимир Тимофеевич Лисицын
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр Белагроген"
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2010-12-30
Also published as: EA200901011A1

Abstract

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, химико-фармацевтической промышленности, биотехнологии и может быть использовано при получении лечебно-профилактических иммунобиологических препаратов, обладающих пролонгированным иммуномодулирующим и противовирусным действием. В частности, изобретение касается биологически активных препаратов на основе рекомбинантных интерферонов. Предложен препарат на основе интерферона, включающий α-интерферон, стабилизатор и воду, который в качестве стабилизатора содержит по меньшей мере один жирорастворимый витамин в виде коллоидных частиц и дополнительно содержит бензоат натрия в качестве консерванта и хлорид натрия в качестве агента, обеспечивающего осмотичность раствора, при следующем содержании ингредиентов на 1 л раствора:В качестве стабилизатора препарат предпочтительно может содержать один жирорастворимый витамин в виде коллоидных частиц, выбранный из группы витаминов A, D, Е, или смесь жирорастворимых витаминов A, D, Е в виде коллоидных частиц, при необходимости, с водорастворимыми витаминами С и В12. Препарат представляет собой стабильный раствор, обладающий улучшенным терапевтическим действием и обеспечивающий сохранение высокого уровня иммуномодулирующей и антивирусной активности в организме в течение длительного времени, а также более быстрое и более эффективное действие интерферона на ранних стадиях после введения в организм.

Description

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, химико-фармацевтической промышленности, биотехнологии и может быть использовано при получении лечебно-профилактических иммунобиологических препаратов, обладающих пролонгированным иммуномодулирующим и противовирусным действием. В частности, изобретение касается биологически активных препаратов на основе рекомбинантных интерферонов.

В настоящее время для лечения инфекционных заболеваний человека и животных наиболее перспективными являются лекарственные препараты на основе иммуномодуляторов, в том числе интерферонов. Интерферон представляет собой белковый цитокин, регулирующий иммунную реакцию инфицированных организмов и таким образом ингибирующий размножение вирусов. Альфа-интерферон проявляет высокую эффективность при лечении различных вирусных заболеваний животных и человека. Основные требования, предъявляемые к препаратам интерферона, - стабильность при хранении, максимальная активность и длительность действия.

В ветеринарии широкое распространение нашел препарат для инъекций на основе рекомбинантных α-интерферонов - Миксоферон [1], который обладает прямым антивирусным действием, стимулирует иммунные процессы, а также повышает неспецифическую резистентность организма животных.

Большинство белков легко подвергаются денатурации и утрачивают биологическую активность в процессе хранения в виде водных растворов. Миксоферон также малостабилен в водных растворах. Другой его недостаток - короткий период полураспада активного вещества в тканях и кровотоке, что препятствует достижению максимального лечебного действия.

По этой причине многие фармацевтические компании разработали лиофилизованные формы препаратов интерферонов. Однако и эти формы имеют ряд недостатков. В сухом виде белковые цитокины хранятся намного лучше, но теряют часть активности непосредственно в процессе лиофилизации. Кроме того, необходимость разведения препарата перед применением создает неудобства в его использовании.

Известно использование водной композиции интерферона, в которой стабилизирующим фактором является сывороточный альбумин человека [2]. Однако сывороточный альбумин человека может содержать инфекционные патогены и может вызывать иммунные реакции, из-за чего в последнее время его не рекомендуется применять.

Для стабилизации интерферона в различных жидких лекарственных формах применяли дисахариды [3], неионные детергенты [4, 5], витамины С и Е (ацетат α-токоферола) [6], тяжелую воду [7]. Для пролонгирования действия интерферона использовали синтетические и природные полимеры (поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу) и их комбинации [8, 9] Для получения препарата интерферона в виде мази применяли полиэтиленоксид [10].

Известно, что витамины, в частности витамин Е, могут усиливать действие белковых цитокинов. Для усиления терапевтического действия в препараты интерферона добавляли также витамин В12 [11, 12]. Существуют препараты интерферона в виде свечей, содержащие добавки витаминов А, Е, С [13].

Известен пролонгированный раствор α-2-интерферона [8] для медицинского применения. Отличие данного лекарственного препарата от других известных лекарственных форм [14-18] состоит в использовании наряду с α-2-интерфероном антиоксидантов (лимонная кислота и унитиол), антимикробных веществ (борная кислота и тетраборат натрия), а также в качестве наполнителя - стабилизатора эфиров целлюлозы в концентрации 0,5-5,0%. Препарат представляет собой прозрачный вязкий раствор, который может быть использован в медицине для местного применения.

Недостатками известного пролонгированного раствора α-2-интерферона является использование в качестве антимикробных веществ борной кислоты и тетрабората натрия, которые являются антисептиками поверхностного действия, характеризуются слабо выраженным терапевтическим действием по сравнению с антибиотиками, относятся к классу малотоксичных веществ и разрешены в ветеринарии и медицине только для наружного применения [19].

Известно также, что для получения терапевтического эффекта интерферон и витамин Е обычно вводят раздельно, так как витамин Е нерастворим в воде.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является препарат интерферона, содержащий интерферон α-2, буферобразующие соли, стабилизирующую смесь ацетата α-токоферола и органические кислоты [6].

Недостатком этого комплексного препарата интерферона является низкое содержание ацетата α-токоферола (0,1 мг на 1-100 млн МЕ интерферона), результатом чего является лишь его стабилизирующее действие. Кроме того, недостатком прототипа является также то, что витамины в его составе содержатся в виде лиофилизированного или высушенного спиртового раствора, что приводит к потере части активности цитокина и требует тщательного контроля остаточного содержания спирта. Авторы не сообщают о том, как восстанавливается раствор после прибавления воды к лиофилизату, поскольку в воде витамин Е нерастворим, а его присутствие в форме масла нежелательно, так как может вызывать воспаление в месте инъекции.

- 1 014669

Задачей изобретения является получение препарата на основе интерферона в виде стабильного раствора, обладающего улучшенным терапевтическим действием и обеспечивающего сохранение высокого уровня иммуномодулирующей и антивирусной активности в организме в течение длительного времени. Дополнительным положительным качеством препарата является более быстрое и более эффективное действие интерферона на ранних стадиях после введения в организм.

Поставленная задача достигается тем, что препарат на основе интерферона, включающий α-интерферон, стабилизатор и воду, в качестве стабилизатора содержит по меньшей мере один жирорастворимый витамин в виде коллоидных частиц и дополнительно содержит бензоат натрия в качестве консерванта и хлорид натрия в качестве агента, обеспечивающего осмотичность раствора, при следующем содержании ингредиентов на 1 л раствора: а-интерферон хлорид натрия бензоат натрия по меньшей мере, один жирорастворимый витамин из расчета содержания 1 · 10² -1 · 10¹⁰ МЕ

8.8- 9,1 г

1.8- 2,2 г

1,0- 100 г вода остальное.

Заявляемый препарат в различных предпочтительных формах реализации в качестве стабилизатора может содержать жирорастворимый витамин А в виде коллоидных частиц в количестве из расчета содержания 1-10⁷-5-10⁸ МЕ;

жирорастворимый витамин I) в виде коллоидных частиц в количестве из расчета содержания 5-10⁶-1-10⁸ МЕ;

жирорастворимый витамин Е в виде коллоидных частиц в количестве 1-100 г;

смесь жирорастворимых витаминов А, I), Е в виде коллоидных частиц в указанных выше количествах, а также водорастворимые витамины С в количестве 10-100 г/л и В12 в количестве 0,01-1,0 г/л.

Количественное содержание α-интерферона и жирорастворимых витаминов А и И в единицах массы (мг, мкг и т.д.) может быть определено специалистом в данной области в каждом конкретном случае из расчета указанного выше содержания в МЕ с учетом конкретно используемого препарата (в частности, в зависимости от степени его очистки и т.п.).

Использование идентичных или сходных ингредиентов или количественного состава для решаемой задачи из уровня техники неизвестно.

Результатами заявленного изобретения являются улучшение сохранения активности цитокина (α-интерферона) в жидкой лекарственной форме и повышение эффективности его лечебного действия за счет содержащихся в растворе витаминов, в частности за счет находящихся в виде коллоидных частиц жирорастворимых витаминов, которые одновременно выполняют функцию стабилизатора, обусловливающего возможность пролонгирования действия препарата.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что в состав иммуномодулирующего противовирусного средства входят усиливающие действие интерферона жирорастворимые витамины в виде коллоидных частиц, стабилизированных неионным поверхностно-активным веществом и содержащих на поверхности остатки полиэтиленоксида, оказывающие стабилизирующее действие на интерферон и усиливающие его иммуномодулирующую и противовирусную активность с пролонгированным способом действия;

бензоат натрия в качестве консерванта, обладающего антимикробной активностью и хлорид натрия в качестве агента, обеспечивающего осмотичность раствора.

Приготовление заявляемого препарата, обладающего антивирусным и иммуномодулирующим действием и содержащего витамины, будет рассмотрено далее на некоторых предпочтительных, но не ограничивающих примерах.

- 2 014669

Примеры

Пример 1.

В 500 мл воды для инъекций помещают 9,0 г хлорида натрия (точная навеска), 2,0 г бензоата натрия (С₆Н₅СОО№1) и перемешивают до полного растворения. Не прекращая перемешивания, прибавляют 250 мл концентрата коллоидного раствора витамина А с содержанием ретинола ацетата или ретинола пальмитата 1 -10⁵ МЕ/мл. Перемешивают 5 мин и прибавляют субстанцию, содержащую рекомбинантный α-интерферон (человеческий, птичий, свиной, бычий либо их смеси) с активностью 1-10⁸ МЕ. После растворения субстанции объем полученного раствора при перемешивании доводят водой для инъекций до 1000 мл, проводят стерилизующую фильтрацию. Раствор разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 5-100 мл; укупоривают резиновыми пробками с обкаткой металлическими колпачками.

Пример 2.

Приготовление заявляемого препарата, обладающего антивирусным действием и содержащего витамин Е, осуществляют аналогично примеру 1 с содержанием витамина Е в количестве 50,0 г на 1 л раствора.

Пример 3.

Приготовление заявляемого препарата, обладающего антивирусным действием и содержащего витамин Ό, осуществляют аналогично примеру 1 с содержанием витамина И в количестве 5-10⁷ МЕ.

Пример 4.

Приготовление заявляемого препарата, обладающего антивирусным действием и содержащего витамины Α, Ό и Е, осуществляют аналогично примеру 1 с использованием мультивитаминного раствора в указанных выше концентрациях.

Пример 5.

Приготовление заявляемого препарата, обладающего антивирусным действием и содержащего витамины А, В12, С, И и Е, осуществляют следующим образом.

В 500 мл воды для инъекций помещают 9,0 г хлорида натрия (точная навеска), 2,0 г бензоата натрия (СН₅СОО№1). 100 г аскорбата натрия, 0,5 г витамина В12 и перемешивают до полного растворения. Не прекращая перемешивания, прибавляют 250 мл концентрата коллоидного раствора жирорастворимых витаминов Α, Ό, Е при содержании витаминов в количествах согласно примерам 1-3. Перемешивают 5 мин и прибавляют субстанцию, содержащую рекомбинантный α-интерферон (человеческий, птичий, свиной, бычий либо их смеси) с активностью 1-10⁸ МЕ. После растворения субстанции объем полученного раствора при перемешивании доводят водой для инъекций до 1000 мл, проводят стерилизующую фильтрацию. Раствор разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 5-100 мл; укупоривают резиновыми пробками с обкаткой металлическими колпачками.

В заявляемом препарате активность α-интерферона и содержание витаминов определяют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ, НРЬС). Дополнительно контролируют соответствие всем требованиям, предъявляемым к биологически активному препарату для инъекций: отсутствие механических включений, прозрачность, цветность, рН, реологические свойства раствора, стерильность и др.

Пример 6. Исследование иммуномодулирующей активности препарата, содержащего α-интерферон и витамин Е.

Препарат представляет собой бесцветный слегка опалесцирующий раствор. В качестве активного вещества выступают α-интерферон (5,0-10⁵ МЕ/мл) и 5%-ный коллоидный раствор витамина Е.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены результаты исследования фармакокинетики иммуномодулирующей активности коммерческого лиофилизированного и заявляемого препаратов. Иммуномодулирующую активность определяли путем измерения избыточной бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК) белых мышей после инъекций соответствующих доз препаратов.

Из данных, приведенных на чертеже, следует, что наличие в растворе интерферона коллоидных частиц витамина Е (кривая обозначена ♦ ) способствует более раннему проявлению иммуномодулирующей активности препарата и сохранению ее достаточно высокого уровня в течение более длительного времени в сравнении с модельным водным раствором лиофилизированного интерферона (кривая обозначена ).

У лиофилизированного препарата интерферона иммуномодулирующая активность начинает проявляться через 12 ч после введения белым мышам и наблюдается в течение последующих 18 ч, т. е. через 30 ч уже не обнаруживается (табл. 1). Заявляемый препарат проявляет до 19% суммарного иммуномодулирующего действия уже через 8 ч после введения в эквивалентных дозах интерферона, и активность сохраняется в течение 54 ч наблюдения (табл. 1).

Таким образом, приведенное сочетание в составе заявляемого препарата α-интерферона и жирорастворимых витаминов в виде стабилизированного коллоидного раствора приводит к более раннему проявлению активности препарата и пролонгированию его действия

- 3 014669

Таблица 1

Динамика иммуномодулирующей активности препаратов

Препарат	Иммуномодулирующая активность, (%)
Время отбора проб после введения препарата, (час)
4	8	12	24	30	48	54
Заявляемый препарат	0	18,8	16,6	16,6	15,2	17,3	15,5
Лиофилизированный препарат	0	0	44,59	55,4	0	0	0

Пример 7. Исследование стабильности сохранения свойств препарата при хранении.

Препарат хранили в стеклянных пенициллиновых флаконах, укупоренных резиновой пробкой, с алюминиевым колпачком. На протяжении времени хранения отбирались пробы и проводилось исследование на стерильность, иммуномодулирующую и антивирусную активности.

Стерильность сохранялась в течение 18 месяцев наблюдений.

Иммуномодулирующая активность определялась по избыточной бактериоцидной активности сыворотки крови (БАСК) белых мышей весом 20-25 г, измеряемой для заявляемого препарата, через 8 ч, а для миксоферона - через 24 ч после инъекции. Препараты полностью сохраняли иммуномодулирующую активность при хранении в течение 18 месяцев наблюдений (табл. 2).

Таблица 2 Стабильность иммуномодулирующей активности препаратов в процессе хранения

Препарат	Иммуномодулирующая активность, (У.е.)
Время отбора проб, (мес.)
0	6	12	18
Заявляемый препарат	1,22	1,24	1,22	1,20
Лиофилизированный препарат	1,24	1,26	1,25	1,24

Противовирусную активность препаратов определяли по нейтрализации вируса везикулярного стоматита человека с использованием перевиваемой культуры клеток линии А-549. Результаты показывают, что антивирусная активность предлагаемого препарата стабильно сохраняется в течение 18 месяцев хранения (табл. 3).

Таблица 3

Стабильность антивирусной активности препаратов в процессе хранения

Препарат	Антивирусная активность препаратов, (х 10^& МЕ)
Время отбора проб, (мес.)
0	6	12	18
Заявляемый препарат	5,9	5,6	5,4	5,5
Лиофилизированный препарат	5,4	5,5	5,4	5,5

Таким образом, предлагаемый препарат в жидкой форме стабильно сохраняет антивирусную и иммуномодулируюшую активность при хранении в течение 12-18 месяцев.

Источники информации

1. Большая ветеринарная энциклопедия: Миксоферон.

2. Патент ИЗ 4847079.

3. Патент Κϋ 2008017.

4. Патент Κϋ 2113845.

5. Патент Κϋ 2157236.

6. Патент Κϋ 2218934.

7. Патент Κϋ 2218913.

8. Патент Κϋ 2270692.

9. Патент Κϋ 2292907.

10. Патент Κϋ 2165768.

11. Патент ИЗ 20030086901.

12. Патент ИЗ 20050175585.

13. Патент Κϋ 2148988.

14. Ершов Ф.И. Интерферон и их индукторы (от молекул до лекарств). - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2005, 356 с.

- 4 014669

15. Патент №2121364.

16. Патент ЕК2726470.

17. Патент №2236866.

18. Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона а-2В-белка.//Сборник материалов научной конференции для врачей-практиков, Кольцово, 25-29 января 1993 г., с. 15-19.

19. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Вильнюс: ЗАО Гамта, 2004, т. 2, с.348.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Препарат на основе интерферона, включающий α-интерферон, стабилизатор и воду, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора содержит по меньшей мере один жирорастворимый витамин в виде коллоидных частиц и дополнительно содержит бензоат натрия в качестве консерванта и хлорид натрия в качестве агента, обеспечивающего осмотичность раствора, при следующем содержании ингредиентов на 1 л раствора:

ос-интерферон из расчета содержания 1 · 10² - 1 · 10¹⁰ МЕ хлорид натрия 8,8 - 9,1 г бензоат натрия 1,8 - 2,2 г по меньшей мере, один жирорастворимый витамин 1,0 - 100 г вода остальное.
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора содержит жирорастворимый витамин в виде коллоидных частиц, выбранный из группы витаминов А в количестве из расчета содержания 1·10⁷-5·10⁸ МЕ, И в количестве из расчета содержания 5·10⁶-1·10⁸ МЕ, Е в количестве 1-100 г.
3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора содержит смесь жирорастворимых витаминов А, И, Е в виде коллоидных частиц.
4. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора содержит смесь жирорастворимых витаминов А, И, Е в виде коллоидных частиц и дополнительно содержит водорастворимые витамины С в количестве 10-100 г/л и В12 в количестве 0,01-1,0 г/л.